CN117305200A - 一种重组菌及其在合成3,4-二羟基苯乙胺中的应用 - Google Patents
一种重组菌及其在合成3,4-二羟基苯乙胺中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种重组菌及其在合成3,4‑二羟基苯乙胺中的应用。该重组菌同时表达O‑脱甲基酶、加氧酶和转氨酶，其可作为生物催化剂将底物丁香酚和L‑丙氨酸转化为3,4‑二羟基苯乙胺。丁香酚及L‑丙氨酸来源广、制备过程简单且价格低廉，是一种理想的底物，而且本发明选择的酶具有活性高、光学专一性强等优势，因此，利用本发明的重组菌转化生产3,4‑二羟基苯乙胺，生产效率高、绿色环保且成本低，具有良好的工业化应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种重组菌及其在合成3,4-二羟基苯乙胺中的应用。
背景技术
3,4-二羟基苯乙胺，又名多巴胺，是去甲肾上腺素及肾上腺素的合成前体，可作为神经递质调控中枢神经系统的多种生理功能，也可作为急救药，用于临床各种类型休克治疗，此外，随着材料表面工程在电子及生物医学领域的应用，3,4-二羟基苯乙胺也被用于物质的表面修饰。
目前，国内外学者报道了多种3,4-二羟基苯乙胺的生物法制备路线，例如Aruangshu等通过大肠杆菌表达源于猪肾细胞的多巴脱羧酶(DDC)及源于大肠杆菌的4-羟基苯乙酸-3-羟化酶(HpaBC)，转化L-酪氨酸制备3,4-二羟基苯乙胺，经24h摇瓶转化，获得的3,4-二羟基苯乙胺最大浓度达27mg/L。例如Akira等以甘油为碳源，通过大肠杆菌发酵转化制备3,4-二羟基苯乙胺，经90h的发酵，共消耗90g/L的甘油，获得的3,4-二羟基苯乙胺产量约为2.15g/L，产率为3.8％。
现有技术中，3,4-二羟基苯乙胺制备路线普遍具有生产效率低、产量低、成本高等缺点，因此，创建一条效率较高的3,4-二羟基苯乙胺制备方法迫在眉睫。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种重组菌及其在合成3,4-二羟基苯乙胺中的应用，该重组菌可作为生物催化剂将底物丁香酚和L-丙氨酸转化为3,4-二羟基苯乙胺。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明提供了一种合成3,4-二羟基苯乙胺的重组菌，其包含编码O-脱甲基酶(O-demethylases)、加氧酶(COO)及转氨酶(ATE)的基因；
其中，O-脱甲基酶包括SsOdem和SmOdem；SsOdem的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，SmOdem的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
加氧酶包括CsCOO和BsCOO；CsCOO的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，BsCOO的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；
转氨酶包括PsATE和ScATE；PsATE的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，ScATE的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
本发明设计了一条以丁香酚和L-丙氨酸为原料，利用全细胞转化法合成3,4-二羟基苯乙胺的新路线，首先通过O-脱甲基酶催化丁香酚反应生成4-烯丙基儿茶酚，随后利用加氧酶催化4-烯丙基儿茶酚和Fe2+生成3,4-二羟基苯乙醛，最终利用转氨酶催化3,4-二羟基苯乙醛和L-丙氨酸生成3,4-二羟基苯乙胺，在此过程中，所需辅酶由菌体代谢葡萄糖来提供。具体的合成路线如图1所示。
在一些实施例中，上述O-脱甲基酶SsOdem源自Sphingobium sp.，Genbank编号BBD02022.1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
在一些实施例中，上述O-脱甲基酶SmOdem源自Stenotrophomonas maltophilia，Genbank编号AAV53699.1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
发明人在获得O-脱甲基酶SsOdem和SmOdem的氨基酸序列后，依据大肠杆菌偏好性进行密码子优化，以全合成的方法合成两条优化后的核苷酸序列。
在一些实施例中，上述加氧酶CsCOO源自Caulobacter segnis，Genbank编号ADG12013.1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
在一些实施例中，上述加氧酶BsCOO源自Burkholderia sp.，Genbank编号ASL46149.1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。
发明人在获得加氧酶CsCOO和BsCOO的氨基酸序列后，依据大肠杆菌偏好性进行密码子优化，以全合成的方法合成两条优化后的核苷酸序列。
在一些实施例中，上述转氨酶PsATE源自Pseudomonas，Genbank编号WP_012722053.1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
在一些实施例中，上述转氨酶PsATE源自Saccharomyces cerevisiae，Genbank编号DAA12410.1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。
发明人在获得转氨酶PsATE和PsATE的氨基酸序列后，依据大肠杆菌偏好性进行密码子优化，以全合成的方法合成两条优化后的核苷酸序列。
在一些实施例中，上述重组菌的构建方法为：将O-脱甲基酶、加氧酶和转氨酶的基因连接到表达载体上，然后将获得的重组表达载体导入至宿主菌株中，即获得上述重组菌。
在一些实施例中，上述表达载体包括pET28a(+)质粒和pCDFDuet-1质粒。
在一些实施例中，上述重组菌的宿主为大肠杆菌。在其他实施方式中，重组菌的宿主可以是其他细菌，本发明不对其进行具体的限定。
在一些实施例中，上述大肠杆菌包括Escherichia coli BL21(DE3)、Escherichiacoli DH5α、Escherichia coli XL-Blue。
本发明重组的大肠杆菌通过双质粒共表达3个酶的编码基因，可选地，pET28a(+)装载O-脱甲基酶，pCDFDuet-1装载加氧酶及转氨酶，然后将两个重组质粒转化到宿主菌株，得到重组菌。
第二方面，本发明提供了一种全细胞催化剂，其含有上述的重组菌。
第三方面，本发明提供了一种核酸分子，其编码具有将丁香酚和L-丙氨酸转化为3,4-二羟基苯乙胺功能的蛋白，上述核酸分子包括编码O-脱甲基酶、加氧酶和转氨酶的基因；
其中O-脱甲基酶包括SsOdem和SmOdem；SsOdem的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，SmOdem的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；
加氧酶包括CsCOO和BsCOO；CsCOO的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，BsCOO的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；
转氨酶包括PsATE和ScATE；PsATE的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，ScATE的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。
第四方面，本发明提供了一种表达载体，该表达载体携带上述核酸分子。
第五方面，本发明提供了含有上述核酸分子或表达载体的微生物细胞。
第六方面，本发明提供了上述重组菌、全细胞催化剂、核酸分子、表达载体或微生物在合成3,4-二羟基苯乙胺及其下游产物中的应用。
第七方面，本发明提供了一种合成3,4-二羟基苯乙胺的方法，其包括将上述重组菌加入含丁香酚和L-丙氨酸的溶液中进行全细胞转化，获得3,4-二羟基苯乙胺。
在一些实施例中，在进行全细胞转化前对重组菌进行诱导培养，该诱导培养过程为：将重组菌接种至含30-60mg/L氯霉素和30-60mg/L链霉素的LB培养基中，培养后获得种子液，然后将种子液接种至新鲜的LB培养基中，至菌浓OD600nm达0.6-0.8，添加诱导剂，诱导后分离、清洗即得湿菌体。
在一些实施例中，上述重组菌的培养条件为：温度为32-38℃，转速为150-250rpm，培养时间为10-16h。
在一些实施例中，上述种子液的培养条件为：温度为32-38℃，转速为150-250rpm。
在一些实施例中，上述诱导条件为：诱导剂0.2-0.6mM IPTG，温度为25-30℃，时间为10-16h。
在一些实施例中，全细胞转化的生产体系中包括：丁香酚1-50g/L，L-丙氨酸1-70g/L，葡萄糖10-80g/L，磷酸吡哆醛0.02-0.1g/L，重组菌体量1-20g/L。
在一些实施例中，全细胞转化的生产体系的pH为6.0-9.0，温度为15-40℃，反应时间为6-24h。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种新的生产3,4-二羟基苯乙胺的方法，该方法是以丁香酚及L-丙氨酸为底物，利用一种能够同时表达O-脱甲基酶、加氧酶和转氨酶的大肠杆菌重组菌生产3,4-二羟基苯乙胺。丁香酚及L-丙氨酸来源广、制备过程简单且价格低廉，是一种理想的底物，而且本发明选择的酶具有活性高、光学专一性强等优势，因此，利用本发明的重组菌转化生产3,4-二羟基苯乙胺，生产效率高、产量高、底物转化率高、绿色环保且成本低，具有良好的工业化应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明3,4-二羟基苯乙胺的合成路线。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明重组菌能够同时表达三种酶：O-脱甲基酶(O-demethylases)、加氧酶(COO)及转氨酶(ATE)，利用上述酶合成,4-二羟基苯乙胺的反应原理为：通过O-脱甲基酶将丁香酚转化为4-烯丙基儿茶酚，通过COO将4-烯丙基儿茶酚及Fe2+转化为3,4-二羟基苯乙醛，在ATE的作用下，以L-丙氨酸为氨基供体，将3,4-二羟基苯乙醛转化为3,4-二羟基苯乙胺，反应过程中所需辅酶由菌体代谢葡萄糖来提供。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
1.菌及质粒的选择
购自Novagen公司的pET28a(+)质粒、pCDFDuet-1质粒、Escherichia coli BL21、Escherichia coli DH5α、Escherichia coli XL-Blue。
2.酶的选择
(1)O-脱甲基酶的选择
从NCBI数据库中获得O-脱甲基酶SsOdem及SmOdem的氨基酸序列，依据大肠杆菌偏好性进行密码子优化，通过基因工程常规操作以全合成的方法合成两条核苷酸序列，分别如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示。编码酶的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示。在核苷酸序列两端加入酶切位点EcoRI及HindIII。
(2)加氧酶的选择
从NCBI数据库中获得加氧酶CsCOO及BsCOO的氨基酸序列，依据大肠杆菌偏好性进行密码子优化，通过基因工程常规操作以全合成的方法合成两条核苷酸序列，分别如SEQID NO.9、SEQ ID NO.10所示。编码酶的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示。在核苷酸序列两端加入酶切位点EcoRI及HindIII。
(3)转氨酶的选择
从NCBI数据库中获得转氨酶PsATE及ScATE的氨基酸序列，依据大肠杆菌偏好性进行密码子优化，通过基因工程常规操作以全合成的方法合成两条核苷酸序列，分别如SEQID NO.11、SEQ ID NO.12所示。编码酶的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示。在核苷酸序列两端加入酶切位点NdeI及XhoI。
3.三酶共表达体系的构建及菌体培养
将以上选择的O-脱甲基酶、加氧酶及转氨酶中每类任选一个酶，进行三酶组合共表达。采用pET28a(+)和pCDFDuet-1双质粒共表达3个酶的编码基因；pET28a(+)装载O-脱甲基酶，pCDFDuet-1装载加氧酶及转氨酶。得到共表达重组质粒后，将两种重组质粒同时转入大肠杆菌Escherichia coli BL21感受态细胞中，利用含有卡那霉素和链霉素平板筛选得到阳性转化子，即得到重组大肠杆菌。将获得的重组菌接种至新鲜的液体培养基中，诱导培养，离心，获得湿菌体。
4.全细胞转化丁香酚及L-丙氨酸制备3,4-二羟基苯乙胺
转化体系：丁香酚浓度为1-50g/L，L-丙氨酸1-70g/L，葡萄糖浓度10-80g/L，磷酸吡哆醛0.02-0.1g/L，调节pH在6.0-9.0之间，新鲜菌体量为1-20g/L，然后于15-40℃，100-250rpm，转化6-24h。转化结束后液相色谱测定3,4-二羟基苯乙胺产量。
5.样品的检测分析
通过岛津2030C高效液相色谱仪(HPLC)分析转化液，色谱条件为：流动相是甲醇：水(V/V＝1:1)、采用Inertsustain C18色谱柱(4.6×250mm，5μm)，流速1mL/min，柱温30℃，进样量20μL，检测波长280nm。
实施例1
重组大肠杆菌的构建
通过限制性内切酶EcoRI及HindIII对全合成的Odem重组质粒及pET28a(+)载体分别进行双酶切，通过T4DNA连接酶将不同来源的Odem连接至pET28a(+)载体上，获得重组质粒1；通过限制性内切酶EcoRI及HindIII对全合成的COO重组质粒及pCDFDuet-1载体分别进行双酶切、通过限制性内切酶NdeI及XhoI对全合成的ATE重组质粒及pCDFDuet-1载体分别进行双酶切，通过T4DNA连接酶将不同来源的COO及ATE两两组合连接至pCDFDuet载体上，获得重组质粒2；将不同重组质粒1与2两两组合转化至E.coli BL21(DE3)感受态中，获得重组大肠杆菌。
实施例2
重组大肠杆菌的诱导培养
将重组大肠杆菌接种至含50mg/L卡那霉素及50mg/L链霉素的LB培养基中，37℃、200rpm培养12h，获得种子液。将种子液以2％的接种量接种至新鲜的LB培养基中，37℃、200rpm培养至菌浓OD600nm达0.7，添加0.5mM IPTG及0.1g/L的氯化亚铁，28℃条件下诱导15h后，8000rpm离心10min，弃上清，用0.9％的生理盐水清洗两遍湿菌体，离心，备用。
实施例3
各种重组大肠杆菌转化能力的比较
将收集完的重组大肠杆菌重悬于50mL体系中，细胞终浓度为20g/L，丁香酚浓度为50g/L，L-丙氨酸70g/L，葡萄糖80g/L，磷酸吡哆醛0.1g/L，pH8.0，于30℃条件下反应，摇床转速200rpm，转化时间为24h。转化结束后通过HPLC测定3,4-二羟基苯乙胺的产量。
表1各种重组菌对应3,4-二羟基苯乙胺产量的比较
根据上述表1数据可知，最优酶组的重组工程菌为E.coliBL21(DE3)/pET28a-SmOdem+pCDFDuet-CsCOO-PsATE。
实施例4
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pET28a-SmOdem+pCDFDuet-CsCOO-PsATE诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重1g/L，丁香酚1g/L，L-丙氨酸1g/L，葡萄糖10g/L，磷酸吡哆醛0.02g/L，pH8.0，温度30℃，摇床转速200rpm，转化时间24h。HPLC测定结果，3,4-二羟基苯乙胺产量为0.9g/L。
实施例5
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pET28a-SmOdem+pCDFDuet-CsCOO-PsATE诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重3g/L，丁香酚5g/L，L-丙氨酸7g/L，葡萄糖10g/L，磷酸吡哆醛0.02g/L，pH8.0，温度35℃，摇床转速200rpm，转化时间24h。HPLC测定结果，3,4-二羟基苯乙胺产量为4.6g/L。
实施例6
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pET28a-SmOdem+pCDFDuet-CsCOO-PsATE诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重5g/L，丁香酚8g/L，L-丙氨酸10g/L，葡萄糖20g/L，磷酸吡哆醛0.05g/L，pH8.0，温度30℃，摇床转速200rpm，转化时间24h。HPLC测定结果，3,4-二羟基苯乙胺产量为7.3g/L。
实施例7
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pET28a-SmOdem+pCDFDuet-CsCOO-PsATE诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重8g/L，丁香酚12g/L，L-丙氨酸15g/L，葡萄糖20g/L，磷酸吡哆醛0.05g/L，pH8.0，温度30℃，摇床转速200rpm，转化时间24h。HPLC测定结果，3,4-二羟基苯乙胺产量为10.9g/L。
实施例8
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pET28a-SmOdem+pCDFDuet-CsCOO-PsATE诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重10g/L，丁香酚20g/L，L-丙氨酸24g/L，葡萄糖40g/L，磷酸吡哆醛0.05g/L，pH8.0，温度30℃，摇床转速200rpm，转化时间24h。HPLC测定结果，3,4-二羟基苯乙胺产量为17.9g/L。
实施例9
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pET28a-SmOdem+pCDFDuet-CsCOO-PsATE诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重15g/L，丁香酚40g/L，L-丙氨酸55g/L，葡萄糖60g/L，磷酸吡哆醛0.1g/L，pH8.0，温度30℃，摇床转速200rpm，转化时间24h。HPLC测定结果，3,4-二羟基苯乙胺产量为36.2g/L。
实施例10
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pET28a-SmOdem+pCDFDuet-CsCOO-PsATE诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重18g/L，丁香酚45g/L，L-丙氨酸60g/L，葡萄糖70g/L，磷酸吡哆醛0.1g/L，pH8.0，温度30℃，摇床转速200rpm，转化时间24h。HPLC测定结果，3,4-二羟基苯乙胺产量为41.3g/L。
实施例11
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pET28a-SmOdem+pCDFDuet-CsCOO-PsATE诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重20g/L，丁香酚30g/L，L-丙氨酸36g/L，葡萄糖50g/L，磷酸吡哆醛0.1g/L，pH8.0，温度30℃，摇床转速200rpm，转化时间12h。HPLC测定结果，3,4-二羟基苯乙胺产量为27.6g/L。
实施例12
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pET28a-SmOdem+pCDFDuet-CsCOO-PsATE诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重20g/L，丁香酚15g/L，L-丙氨酸20g/L，葡萄糖30g/L，磷酸吡哆醛0.1g/L，pH8.0，温度30℃，摇床转速200rpm，转化时间6h。HPLC测定结果，3,4-二羟基苯乙胺产量为13.6g/L。
实施例13
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pET28a-SmOdem+pCDFDuet-CsCOO-PsATE诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重15g/L，丁香酚10g/L，L-丙氨酸14g/L，葡萄糖20g/L，磷酸吡哆醛0.1g/L，pH8.0，温度30℃，摇床转速200rpm，转化时间8h。HPLC测定结果，3,4-二羟基苯乙胺产量为9.2g/L。
实施例14
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pET28a-SmOdem+pCDFDuet-CsCOO-PsATE诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重12g/L，丁香酚20g/L，L-丙氨酸25g/L，葡萄糖40g/L，磷酸吡哆醛0.05g/L，pH8.0，温度30℃，摇床转速200rpm，转化时间15h。HPLC测定结果，3,4-二羟基苯乙胺产量为18.2g/L。
实施例15
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pET28a-SmOdem+pCDFDuet-CsCOO-PsATE诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重10g/L，丁香酚15g/L，L-丙氨酸21g/L，葡萄糖30g/L，磷酸吡哆醛0.05g/L，pH6.0，温度35℃，摇床转速200rpm，转化时间12h。HPLC测定结果，3,4-二羟基苯乙胺产量为13.5g/L。
实施例16
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pET28a-SmOdem+pCDFDuet-CsCOO-PsATE诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重15g/L，丁香酚25g/L，L-丙氨酸35g/L，葡萄糖50g/L，磷酸吡哆醛0.05g/L，pH7.0，温度35℃，摇床转速200rpm，转化时间12h。HPLC测定结果，3,4-二羟基苯乙胺产量为22.9g/L。
实施例17
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pET28a-SmOdem+pCDFDuet-CsCOO-PsATE诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重13g/L，丁香酚20g/L，L-丙氨酸26g/L，葡萄糖40g/L，磷酸吡哆醛0.05g/L，pH7.5，温度35℃，摇床转速200rpm，转化时间12h。HPLC测定结果，3,4-二羟基苯乙胺产量为18.1g/L。
实施例18
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pET28a-SmOdem+pCDFDuet-CsCOO-PsATE诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重7g/L，丁香酚7g/L，L-丙氨酸9g/L，葡萄糖20g/L，磷酸吡哆醛0.02g/L，pH8.5，温度35℃，摇床转速200rpm，转化时间12h。HPLC测定结果，3,4-二羟基苯乙胺产量为6.4g/L。
实施例19
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pET28a-SmOdem+pCDFDuet-CsCOO-PsATE诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重4g/L，丁香酚5g/L，L-丙氨酸6g/L，葡萄糖10g/L，磷酸吡哆醛0.02g/L，pH9.0，温度35℃，摇床转速200rpm，转化时间12h。HPLC测定结果，3,4-二羟基苯乙胺产量为4.5g/L。
实施例20
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pET28a-SmOdem+pCDFDuet-CsCOO-PsATE诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重16g/L，丁香酚40g/L，L-丙氨酸50g/L，葡萄糖60g/L，磷酸吡哆醛0.1g/L，pH7.5，温度15℃，摇床转速200rpm，转化时间24h。HPLC测定结果，3,4-二羟基苯乙胺产量为36.8g/L。
实施例21
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pET28a-SmOdem+pCDFDuet-CsCOO-PsATE诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重10g/L，丁香酚25g/L，L-丙氨酸30g/L，葡萄糖50g/L，磷酸吡哆醛0.1g/L，pH7.5，温度25℃，摇床转速200rpm，转化时间24h。HPLC测定结果，3,4-二羟基苯乙胺产量为22.8g/L。
实施例22
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pET28a-SmOdem+pCDFDuet-CsCOO-PsATE诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重11g/L，丁香酚30g/L，L-丙氨酸40g/L，葡萄糖50g/L，磷酸吡哆醛0.1g/L，pH7.5，温度40℃，摇床转速200rpm，转化时间24h。HPLC测定结果，3,4-二羟基苯乙胺产量为27.2g/L。
对比例1
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pET28a-SmOdem+pCDFDuet-CsCOO-PsATE诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重30g/L，丁香酚60g/L，L-丙氨酸80g/L，葡萄糖80g/L，磷酸吡哆醛0.15g/L，pH7.5，温度35℃，摇床转速200rpm，转化时间36h。HPLC测定结果，3,4-二羟基苯乙胺产量为6.5g/L。
对比例2
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pET28a-SmOdem+pCDFDuet-CsCOO-PsATE诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重25g/L，丁香酚40g/L，L-丙氨酸55g/L，葡萄糖80g/L，磷酸吡哆醛0.15g/L，pH5.5，温度35℃，摇床转速200rpm，转化时间36h。HPLC测定结果，3,4-二羟基苯乙胺产量为4.3g/L。
对比例3
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pET28a-SmOdem+pCDFDuet-CsCOO-PsATE诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重15g/L，丁香酚55g/L，L-丙氨酸75g/L，葡萄糖90g/L，磷酸吡哆醛0.1g/L，pH9.5，温度35℃，摇床转速200rpm，转化时间36h。HPLC测定结果，3,4-二羟基苯乙胺产量为5.8g/L。
对比例4
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pET28a-SmOdem+pCDFDuet-CsCOO-PsATE诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重20g/L，丁香酚40g/L，L-丙氨酸50g/L，葡萄糖80g/L，磷酸吡哆醛0.1g/L，pH7.5，温度10℃，摇床转速200rpm，转化时间36h。HPLC测定结果，3,4-二羟基苯乙胺产量为3.8g/L。
对比例5
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pET28a-SmOdem+pCDFDuet-CsCOO-PsATE诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重30g/L，丁香酚50g/L，L-丙氨酸70g/L，葡萄糖90g/L，磷酸吡哆醛0.1g/L，pH8.0，温度45℃，摇床转速200rpm，转化时间36h。HPLC测定结果，3,4-二羟基苯乙胺产量为5.2g/L。
对比例6
根据实施例2所述的诱导表达方法，将E.coli BL21(DE3)/pET28a-SmOdem+pCDFDuet-CsCOO-PsATE诱导表达完成后收集菌体，于50mL体系中，细胞湿重0.5g/L，丁香酚0.5g/L，L-丙氨酸0.7g/L，葡萄糖5g/L，磷酸吡哆醛0.01g/L，pH8.0，温度30℃，摇床转速200rpm，转化时间36h。HPLC测定结果，3,4-二羟基苯乙胺产量为0.1g/L。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种合成3,4-二羟基苯乙胺的重组菌，其特征在于，所述重组菌包含编码O-脱甲基酶、加氧酶和转氨酶的基因。
2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述O-脱甲基酶包括SsOdem和SmOdem；所述SsOdem的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述SmOdem的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
优选地，所述加氧酶包括CsCOO和BsCOO；所述CsCOO的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述BsCOO的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；
优选地，所述转氨酶包括PsATE和ScATE；所述PsATE的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述ScATE的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
3.一种全细胞催化剂，其特征在于，含有权利要求1或2所述的重组菌。
4.一种核酸分子，编码具有将丁香酚和L-丙氨酸转化为3,4-二羟基苯乙胺功能的蛋白，其特征在于，所述核酸分子包括编码O-脱甲基酶、加氧酶和转氨酶的基因；
所述O-脱甲基酶包括SsOdem和SmOdem；所述SsOdem的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述SmOdem的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；
所述加氧酶包括CsCOO和BsCOO；所述CsCOO的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述BsCOO的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；
所述转氨酶包括PsATE和ScATE；所述PsATE的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，所述ScATE的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。
5.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体携带权利要求4所述的核酸分子。
6.含有权利要求4所述的核酸分子或权利要求5所述表达载体的微生物细胞。
7.权利要求1或2所述的重组菌，或权利要求3所述的全细胞催化剂，或权利要求4所述的核酸分子，或权利要求5所述的表达载体或权利要求6所述的微生物细胞在合成3,4-二羟基苯乙胺及其下游产物中的应用。
8.一种合成3,4-二羟基苯乙胺的方法，其特征在于，其包括将权利要求1或2所述的重组菌加入含有丁香酚和L-丙氨酸的溶液中进行全细胞转化，获得3,4-二羟基苯乙胺。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述全细胞转化的生产体系中包括：丁香酚1-50g/L，L-丙氨酸1-70g/L，葡萄糖10-80g/L，磷酸吡哆醛0.02-0.1g/L，重组菌体量1-20g/L。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述全细胞转化的生产体系的pH为6.0-9.0，温度为15-40℃，反应时间为6-24h。
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