CN106834366B - 一种利用L-谷氨酸脱氢酶催化生产α-酮戊二酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用L‑谷氨酸脱氢酶催化生产α‑酮戊二酸的方法，它是在缓冲溶液中和过氧化氢清除剂的存在下，经辅因子和L‑谷氨酸脱氢酶的催化，L‑谷氨酸或其盐经氧化反应生成α‑酮戊二酸；其中，所述的辅因子依赖有机小分子再生催化剂实现同步催化再生。本发明以依赖有机小分子催化再生的辅因子的L‑谷氨酸脱氢酶催化L‑谷氨酸或其盐发生氧化反应生成α‑酮戊二酸，所用原料低廉，生产成本低，生产过程简单易操作，且没有环境污染，达到了资源循环再生利用的效果，这为工业上高效生产α‑酮戊二酸奠定了理论基础。本发明方法直接以L‑谷氨酸或其盐为原料，通过一步反应，生成α‑酮戊二酸，反应选择性好，产率高。
Description
技术领域
本发明属于生物化学领域，具体涉及一种利用L-谷氨酸脱氢酶催化生产α-酮戊二酸的方法。
背景技术
α-酮戊二酸在三羧酸循环和氨基酸代谢中是一种重要的二羧酸，参与氨基酸的形成和氮的传输，在杂环构建、保健品、输液以及伤口愈合的组成成分中也有广泛的应用。目前一种新的应用领域是α-酮戊二酸和三醇(甘油、1,2,4-丁三醇、1,2,6-己三醇)的热缩聚，生成的聚合物三醇-α-酮戊二酸在生物医药上有潜在的应用。目前α-酮戊二酸的生产方法有三种：(1)化学合成法，以丁二酸二乙酯和草酸二乙酯为原料的多步合成；(2)微生物发酵法，细菌和酵母；(3)生物催化法。过量成产α-酮戊二酸常使用解脂耶氏酵母WSH-Z06，用Y.lipolyticaH355发酵选择超表达的延胡索酸酶、依赖NADP+的异柠檬酸脱氢酶和丙酮酸缩化酶能提高α-酮戊二酸的产量，但是生物发酵法生产周期长，产物提取分离困难，生产成本偏高，不适合工业化生产。目前工业上大规模生产α-酮戊二酸的方法是化学合成法，但是此法产生的有毒的化学物质和溶剂对环境有很严重的污染，基于化学合成法对环境的各方面的影响，新兴的生物催化法生产α-酮戊二酸就具有很好的前景。第一，生物催化法以可再生资源为出发点，可降解、无毒；第二，选择性高、产率高、降低了生产成本；第三，生物催化是在常温常压下进行，更安全。虽然生物催化法比化学合成法有更多潜在的优势，但是有关利用酶法催化生产α-酮戊二酸的报道很少，尤其是L-谷氨酸脱氢酶。
工业上L-谷氨酸产能过剩(2012年，L-谷氨酸的产量大约1200万吨)，因此以廉价的L-谷氨酸为原料生产α-酮戊二酸是最有优势的。在L-谷氨酸脱氢酶催化L-谷氨酸氧化过程中涉及到原位再生辅因子NAD(P)+的过程，但是研究以合成为目的的辅因子再生氧化过程这一领域很少，比较常见的是利用NADH氧化酶，但NADH氧化酶的可用数量仍然是有限的，因此需要一种NADH氧化酶类似物来再生辅因子NAD(P)+，近年来研究发现金属有机配合物比较适合，如铑配合物、铁卟啉，但是其成本高，易导致酶失活，且后处理比较困难，不适合工业生产。
综上所述，随着α-酮戊二酸的应用价值的发现，其市场需求量在不断的上升，但就目前工业上使用的有机合成法所引起的一系列的环境、成本等问题，利用依赖辅因子再生的酶法催化生产α-酮戊二酸具有很好的前景，目前国内利用L-谷氨酸脱氢酶生物催化法生产α-酮戊二酸还未见有报道。
发明内容
本发明公开了一种利用L-谷氨酸脱氢酶催化生产α-酮戊二酸的方法，以解决现有技术存在的污染重、成本高和步骤繁琐等问题。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种利用L-谷氨酸脱氢酶催化生产α-酮戊二酸的方法，它包括如下步骤：
在缓冲溶液中和过氧化氢清除剂的存在下，经辅因子和L-谷氨酸脱氢酶的催化，L-谷氨酸或其盐经氧化反应生成α-酮戊二酸；
其中，所述的辅因子依赖有机小分子再生催化剂实现同步催化再生，辅因子的浓度为0.5～3mmol/L。，优选1mmol/L。
其中，L-谷氨酸或其盐的氧化反应和辅因子的催化再生反应在反应体系中同步进行。
其中，所述的缓冲溶液为0.1mmol/L的磷酸缓冲液、0.1mmol/L的Tris-HCl缓冲液、0.05mmol/L的碳酸盐缓冲液、0.1mmol/L的柠檬酸缓冲液或0.1mmol/L的巴比妥钠-HCl缓冲液；其中，所述的缓冲溶液的pH为8～10，优选pH为9。
其中，所述的过氧化氢清除剂为过氧化氢酶，浓度为500U/ml～3000U/ml，酶活定义为：在25℃下，1min降解1μmol H2O2所需要的过氧化氢酶的酶量定义为一个酶活力单位，优选过氧化氢酶的浓度为500U/ml。
其中，所述的辅因子为NAD+或NADP+，优选NAD+。
其中，所述的辅因子与有机小分子再生催化剂的摩尔比为1：0.5～3，优选1：1。
其中，所述的L-谷氨酸脱氢酶的浓度为5～50U/ml，酶活定义为：在25℃下，1min生成1μmol NADH所需要的L-谷氨酸脱氢酶的酶量定义为一个酶活力单位，优选L-谷氨酸脱氢酶的浓度为5U/ml。
其中，所述的有机小分子再生催化剂为FAD、FMN、7-三氟甲基-1,10-乙撑基异咯嗪氯化盐、7-甲基-1,10-乙撑基异咯嗪氯化盐或8-甲基-1,10-乙撑基异咯嗪氯化盐，优选7-三氟甲基-1,10-乙撑基异咯嗪氯化盐。
其中，所述的L-谷氨酸盐为L-谷氨酸碱金属盐、L-谷氨酸碱性氨基酸盐和L-谷氨酸铵盐中的任意一种或几种的组合。
其中，所述的L-谷氨酸或其盐的初始反应浓度为15～50mmol/L，优选浓度为15mmol/L。
其中，所述的氧化反应的温度为25～35℃，优选30℃；反应时间为24～72h，优选48h。
本发明还要保护一种组合产品，它包括如下组分：
(1)L-谷氨酸脱氢酶；
(2)过氧化氢清除剂；
(3)辅因子；
(4)有机小分子催化剂；
其中，所述的过氧化氢清除剂为过氧化氢酶，所述的辅因子为NAD+或NADP+，所述的有机小分子催化剂为FAD、FMN、7-三氟甲基-1,10-乙撑基异咯嗪氯化盐、7-甲基-1,10-乙撑基异咯嗪氯化盐或8-甲基-1,10-乙撑基异咯嗪氯化盐。
其中，L-谷氨酸脱氢酶和过氧化氢清除剂的浓度之比为1U/ml：100～1500U/ml，辅因子或有机小分子催化剂与L-谷氨酸脱氢酶的用量比为1mmol/L：5～50U/ml。
其中，过氧化氢酶的酶活定义为：在25℃下，1min降解1μmol H2O2所需要的过氧化氢酶的酶量定义为一个酶活力单位；L-谷氨酸脱氢酶酶活定义为：在25℃下，1min生成1μmol NADH所需要的L-谷氨酸脱氢酶的酶量定义为一个酶活力单位。
上述组合产品在制备α-酮戊二酸中的应用也在本发明的保护范围之内。
有益效果：
与现有技术相比，本发明具有如下优势：
本发明以依赖有机小分子催化再生的辅因子的L-谷氨酸脱氢酶催化L-谷氨酸或其盐发生氧化反应生成α-酮戊二酸，所用原料低廉，生产成本低，生产过程简单易操作，且没有环境污染，达到了资源循环再生利用的效果，这为工业上高效生产α-酮戊二酸奠定了理论基础。本发明方法直接以L-谷氨酸或其盐为原料，通过一步反应，生成α-酮戊二酸，反应选择性好，产率高。
附图说明
图1为7-三氟甲基-1,10-乙撑基异咯嗪氯化盐作为辅因子再生催化剂与L-谷氨酸脱氢酶偶联反应的路线图；
图2为L-谷氨酸脱氢酶催化生产α-酮戊二酸的液相图；
图3为α-酮戊二酸标准物的液相图。
具体实施方式
实施例1：L-谷氨酸脱氢酶在不同NAD+浓度下催化生产α-酮戊二酸
30℃下，在10ml pH8Tris-HCl反应体系中，L-谷氨酸15mM，NAD+，7-三氟甲基-1,10-乙撑基异咯嗪氯化盐1mM，过氧化氢酶500U/mL、L-谷氨酸脱氢酶5U/mL，反应液与外界空气相连通。取反应48h的反应液200μL，加入800μL水稀释，液相检测反应进程，结果如表1所示。
表1
| NAD+浓度(mM) | 产率(％) |
| 0.5 | 52.1 |
| 1 | 90.7 |
| 1.5 | 75.2 |
| 2 | 50.5 |
| 2.5 | 46.8 |
| 3 | 43.7 |
实施例2：L-谷氨酸脱氢酶在不同7-三氟甲基-1,10-乙撑基异咯嗪氯化盐浓度下催化生产α-酮戊二酸
30℃下，在10ml pH8Tris-HCl反应体系中，L-谷氨酸15mM，NAD+1mM，7-三氟甲基-1,10-乙撑基异咯嗪氯化盐，过氧化氢酶500U/mL、L-谷氨酸脱氢酶5U/mL，反应液与外界空气相连通。取48h的反应液200μL，加入800μL水稀释，液相检测反应进程，结果如表2所示。
表2
| 7-三氟甲基-1,10-乙撑基异咯嗪氯化盐(mM) | 产率(％) |
| 0.5 | 47.6 |
| 1 | 90.7 |
| 1.5 | 72.7 |
| 2 | 63.7 |
| 2.5 | 58.2 |
| 3 | 54.1 |
实施例3：L-谷氨酸脱氢酶在不同pH种类下催化生产α-酮戊二酸
30℃下，在10ml pH8不同缓冲体系中，L-谷氨酸15mM，NAD+1mM，7-三氟甲基-1,10-乙撑基异咯嗪氯化盐1mM，过氧化氢酶500U/mL、L-谷氨酸脱氢酶5U/mL，反应液与外界空气相连通。取反应48h的反应液200μL，加入800μL水稀释，液相检测反应进程，结果如表3所示。
表3
| pH种类 | 产率(％) |
| Tris-HCl | 90.7 |
| KPi | 50.4 |
| CBS | 60.2 |
| CPBS | 71.8 |
| 巴比妥那-盐酸 | 53.6 |
实施例4：L-谷氨酸脱氢酶在不同pH下催化生产α-酮戊二酸
30℃下，在10ml Tris-HCl反应体系中，L-谷氨酸15mM，NAD+1mM，7-三氟甲基-1,10-乙撑基异咯嗪氯化盐1mM，过氧化氢酶500U/mL、L-谷氨酸脱氢酶5U/mL，反应液与外界空气相连通。取反应48h的反应液200μL，加入800μL水稀释，液相检测反应进程，结果如表4所示。
表4
实施例5：不同来源的L-谷氨酸脱氢酶催化生产α-酮戊二酸
30℃下，在10ml pH9Tris-HCl反应体系中，L-谷氨酸15mM，NAD+1mM，7-三氟甲基-1,10-乙撑基异咯嗪氯化盐1mM，过氧化氢酶500U/mL、L-谷氨酸脱氢酶5U/mL，反应液与外界空气相连通。取反应48h的反应液200μL，加入800μL水稀释，液相检测反应进程，结果如表5所示。
表5
| L-GluDH的来源 | 产率(％) |
| 化学合成 | 97 |
| Proteus sp | 67.8 |
| C.difficile | 54.3 |
| F.nucleatum | 37.2 |
实施例6：不同辅因子再生体系对L-谷氨酸脱氢酶催化生产α-酮戊二酸
30℃下，在10ml pH9Tris-HCl反应体系中，L-谷氨酸15mM，NAD+1mM，有机小分子再生催化剂1mM，过氧化氢酶500U/mL、L-谷氨酸脱氢酶5U/mL，反应液与外界空气相连通。取反应48h的反应液200μL，加入800μL水稀释，液相检测反应进程，结果如表6所示。
表6
| 辅因子再生体系 | 产率(％) |
| FAD | 11.6 |
| FMN | 21.5 |
| 7-三氟甲基-1,10-乙撑基异咯嗪氯化盐 | 97 |
| 7-甲基-1,10-乙撑基异咯嗪氯化盐 | 83.1 |
| 8-甲基-1,10-乙撑基异咯嗪氯化盐 | 76.4 |
实施例7：生产α-酮戊二酸的方法：
本发明的生产方法主要包括步骤：在缓冲溶液中和过氧化氢清除剂的存在下，经依赖有机小分子催化再生的辅因子的L-谷氨酸脱氢酶的催化，L-谷氨酸或其盐发生氧化反应生成α-酮戊二酸。
Claims (2)
1.一种利用L-谷氨酸脱氢酶催化生产α-酮戊二酸的方法，其特征在于，它包括如下步骤：
在缓冲溶液中和过氧化氢清除剂的存在下，经辅因子和L-谷氨酸脱氢酶的催化，L-谷氨酸经氧化反应生成α-酮戊二酸；
其中，所述的辅因子依赖有机小分子再生催化剂实现同步催化再生；
其中，所述L-谷氨酸的浓度为15mM；
其中，所述缓冲溶液为pH为9的Tris-HCl；
其中，所述的过氧化氢清除剂为过氧化氢酶，浓度为500U/ml；
其中，所述辅因子为NAD+，浓度为1mM；
其中，所述L-谷氨酸脱氢酶的浓度为5U/ml；
其中，所述的有机小分子再生催化剂为7-三氟甲基-1,10-乙撑基异咯嗪氯化盐，浓度为1mM；
其中，所述氧化反应的温度为30℃。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的氧化反应的反应时间为24～72h。
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