JP5090910B2 - 光学活性２−（ｎ−置換アミノメチル）−３−ヒドロキシ酪酸エステル類の製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、光学活性な２−（Ｎ−置換アミノメチル）−３−ヒドロキシ酪酸エステル類の製造方法に関する。当該化合物は、例えば光学活性を必要とする医薬品の合成原料及び中間体として有用な化合物である。

光学活性な２−（Ｎ−置換アミノメチル）−３−ヒドロキシ酪酸エステル類、とりわけ、（２Ｓ，３Ｒ）の立体配置を有する化合物は、チエナマイシンに代表されるβ−ラクタム系抗生物質の合成中間体として重要な化合物である。このものの製造方法としては、２−（Ｎ−置換アミノメチル）−３−オキソ酪酸エステルの３位のカルボニル基を、ルテニウム光学活性ホスフィン錯体を用いる水素添加反応によって立体選択的かつ触媒的に還元する方法が知られている（非特許文献１、特許文献１）。しかし、この触媒的還元による方法は、高い立体選択性を得るためには非常に高価な光学活性ホスフィン配位子を用いる必要がある、１〜１０ＭＰａ程度の高い水素圧力を必要とするなど、工業的な製造を考える上では経済性の観点から必ずしも満足できるものではなかった。

一方、酵素や微生物を触媒とする当該エステル類の還元反応についての報告もある。すなわち、２−ベンズアミドメチル−３−ヒドロキシ酪酸エチルをパン酵母を用いて還元した場合には、（２Ｓ，３Ｓ）体と（２Ｒ，３Ｓ）体の混合物が得られる（特許文献２）。また、２−ベンズアミドメチル−３−ヒドロキシ酪酸エチルを微生物の菌体を用いて還元した場合には、使用する微生物の種類によってさまざまな混合比の（２Ｒ，３Ｓ）体と（２Ｓ，３Ｓ）体の混合物が得られる（非特許文献２）。さらに、クルイベロマイセス・マルキアヌス（Kluyveromyces marxianus）由来の還元酵素を用いて２−フタロイルアミノメチル−３−オキソ酪酸エチルを還元した場合には、（２Ｓ，３Ｒ）体の立体配置を有する化合物が検出された（特許文献３、非特許文献３）。
特開平２−１３４３４９号公報 特開昭６３−２９７３６０号公報 米国特許出願公開第２００３／０１３９４６４号明細書 R.Noyoriら，"Stereoselective hydrogenation via dynamic kinetic resolution", J. Am. Chem. Soc., 111, 9134 (1989) Claudio Fugantiら，"Microbial Generation of (2R,3S)- and (2S,3S)-Ethyl 2-Benzamidomethyl-3-hydroxybutyrate, a key intermediate in the synthesis of (3S,1'R)-3-(1'-hydroxyethyl)azetidin-2-one"， J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, (1993) 2247 Joo Hwan Chaら，"Stereochemical control in diastereoselective reduction of α-substituted-β-ketoesters using a reductase purified from Kluyveromyces marxianus"， Biotechnol. Lett. 24, 1695 (2002)

本発明の課題は、光学活性な２−（Ｎ−置換アミノメチル）−３−ヒドロキシ酪酸エステル類、特に（２Ｓ，３Ｒ）の立体配置を有する該化合物を工業的に製造する方法を提供することにある。これらの化合物は、例えばβ−ラクタム系抗生物質の合成中間体として利用される。

本発明者らは、上記課題を解決すべく検討を重ねた結果、２−（Ｎ−置換アミノメチル）−３−オキソ酪酸エステル類のカルボニル基を立体選択的に還元し、（２Ｓ，３Ｒ）の立体配置を有する２−（Ｎ−置換アミノメチル）−３−ヒドロキシ酪酸エステル類に変換する能力を有する酵素源を発見し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、一般式（５）：

（式中、Ｒ¹は置換されていてもよい低級アルキル基、アリル基、置換されていてもよいアリール基、または置換されていてもよいアラルキル基を表し、Ｒ³及びＲ²は、
１）Ｒ³が水素原子で、Ｒ²が置換されていてもよい低級アルキル基、置換されていてもよい低級アルコキシ基、置換されていてもよいアリール基、または置換されていてもよいアラルキルオキシ基を表すか、
２）Ｒ³と−ＣＯＲ²が一体となってフタロイル基を表す。）で示される光学活性２−（Ｎ−置換アミノメチル）−３−ヒドロキシ酪酸エステル類の製造方法であって、一般式（６）：

（式中、Ｒ¹、Ｒ²、及びＲ³は前記と同じ）で示される２−（Ｎ−置換アミノメチル）−３−オキソ酪酸エステルに、該化合物を（２Ｓ，３Ｒ）の立体配置を有する光学活性３−ヒドロキシ酪酸エステルに立体選択的に還元する活性を有する酵素源を作用させることを特徴とする方法に関する。

本発明によって、医薬等の中間体として有用な、（２Ｓ，３Ｒ）の立体配置を有する２−（Ｎ−置換アミノメチル）−３−ヒドロキシ酪酸エステル類を工業的に製造する方法が提供される。

以下、実施形態に基づいて本発明を詳述する。

１．基質及び生成物
本発明での還元反応に使用される基質の例示としての２−（Ｎ−置換アミノメチル）−３−オキソ酪酸エステル類は、一般式（６）：

で表される化合物である。

式中、Ｒ¹は置換されていてもよい低級アルキル基、アリル基、置換されていてもよいアリール基、または置換されていてもよいアラルキル基を表し、Ｒ³及びＲ²は、
１）Ｒ³が水素原子で、Ｒ²が置換されていてもよい低級アルキル基、置換されていてもよい低級アルコキシ基、置換されていてもよいアリール基、または置換されていてもよいアラルキルオキシ基を表すか、
２）Ｒ³と−ＣＯＲ²が一体となってフタロイル基を表す。

即ち、Ｒ³及びＲ²が上記１）の組み合わせの場合には、前記式（６）で示される化合物は、下記式（２）：

（式中、Ｒ¹は前記と同じ、Ｒ²は置換されていてもよい低級アルキル基、置換されていてもよい低級アルコキシ基、置換されていてもよいアリール基、または置換されていてもよいアラルキルオキシ基を表す）で示される化合物となり、また、Ｒ³及びＲ²が上記２）の場合には、前記式（６）で示される化合物は、下記式（４）：

（式中、Ｒ¹は前記と同じ）で示される化合物となる。

「低級」とは、他に示されていない限り、１〜７個の炭素原子を有することを示し、好ましくは、１〜４個の炭素原子を有することを示す。

低級アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、クロロメチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、シクロヘキシル基などが挙げられ、好ましくは、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ブチル基などが挙げられる。これらの基は置換されていてもよい。その場合の置換基としては、本発明の還元反応に悪影響を及ばさない限り特に限定されず、例えば、ハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基、シアノ基等が挙げられる。

置換されていてもよいアリール基としては、特に限定されず、例えば、フェニル基、ｏ−メチルフェニル基、ｍ−メチルフェニル基、ｐ−メチルフェニル基、ｏ−メトキシフェニル基、ｍ−メトキシフェニル基、ｐ−メトキシフェニル基、ｏ−フルオロフェニル基、ｍ−フルオロフェニル基、ｐ−フルオロフェニル基、ｏ−クロロフェニル基、ｍ−クロロフェニル基、ｐ−クロロフェニル基、ｏ−ニトロフェニル基、ｍ−ニトロフェニル基、ｐ−ニトロフェニル基、ｏ−トリフルオロメチルフェニル基、ｍ−トリフルオロメチルフェニル基、ｐ−トリフルオロメチルフェニル基、ナフチル基、アントラセニル基、２−フリル基、２−チオフェニル、２−ピリジル基などが挙げられる。好ましくは、置換されていてもよいフェニル基であり、より好ましくはフェニル基である。

置換されていてもよいアラルキル基としては、特に限定されず、例えばベンジル基、ｐ−ヒドロキシベンジル基、ｐ−メトキシベンジル基などが挙げられる。

低級アルコキシ基としては、特に限定されず、メチルオキシ基、エチルオキシ基、クロロメチルオキシ基、ｎ−プロピルオキシ基、イソプロピルオキシ基、ｎ−ブチルオキシ基、イソブチルオキシ基、ｔ−ブチルオキシ基、ｎ−ペンチルオキシ基、シクロヘキシルオキシ基などが挙げられる、好ましくはメチルオキシ基、エチルオキシ基、ｎ−プロピル基、ブチルオキシ基などが挙げられる。これらの基は置換されていてもよく、その場合の置換基としては、前述のアルキル基の場合と同様の置換基が挙げられる。

置換されていてもよいアラルキルオキシ基としては、ベンジルオキシ基、ｐ−ヒドロキシベンジルオキシ基、ｐ−メトキシベンジルオキシ基などが挙げられ、好ましくは、ベンジルオキシ基である。

上記のなかでも、Ｒ¹としては炭素数１〜４のアルキル基が好ましく、メチル基がより好ましい。Ｒ²としては置換されていてもよいフェニル基が好ましく、フェニル基、ｐ−ニトロフェニル基、ｐ−クロロフェニル基がより好ましく、フェニル基が更に好ましい。また、Ｒ³と−ＣＯＲ²とが一体となって、フタロイル基をなすことも好ましい。更に、Ｒ¹がメチル基であり、かつ、Ｒ²がフェニル基である場合が特に好ましい。

本発明においては、上記式（６）で示される化合物を、該化合物を不斉還元する活性を有する酵素源を作用させて不斉還元することにより、一般式（５）：

で表される光学活性２−（Ｎ−置換アミノメチル）−３−ヒドロキシ酪酸エステル類に変換する。式中、Ｒ¹、Ｒ²、及びＲ³は前記同じである。

言うまでもまく、前記式（６）で示される化合物として、前記式（２）または前記式（４）で示される化合物を用いた場合には、還元生成物はそれぞれ、下記式（１）、下記式（３）で示される化合物となる。

で表される化合物である。

２．酵素源
本発明で使用される酵素源は、２−（Ｎ−置換アミノメチル）−３−オキソ酪酸エステル類を光学活性な２−（Ｎ−置換アミノメチル）−３−ヒドロキシ酪酸エステル類に変換する能力を有する微生物由来のものを用いることができる。ここでいう「微生物由来のもの」としては、該微生物の菌体そのもの、微生物の培養液、あるいは菌体処理物、または該微生物から得られる酵素であってもよいし、さらには該微生物由来の上記還元活性を有する酵素をコードするＤＮＡが導入された形質転換体も含む。これらを単独で用いても、２種類以上組み合わせてもよい。また、これらの酵素源は周知の方法でくり返し使用できるように固定化してもよい。

３．２−（Ｎ−置換アミノメチル）−３−ヒドロキシ酪酸エステル類への変換能力の測定
２−（Ｎ−置換アミノメチル）−３−オキソ酪酸エステル類を光学活性な２−（Ｎ−置換アミノメチル）−３−ヒドロキシ酪酸エステル類に変換する能力を有する微生物は、以下に説明する方法によって見いだすことができる。例えば、以下のようにして行なう。グルコース４０ｇ、酵母エキス３ｇ、リン酸水素二アンモニウム６．５ｇ、リン酸二水素カリウム１ｇ、硫酸マグネシウム７水和物０．８ｇ、硫酸亜鉛７水和物６０ｍｇ、硫酸鉄７水和物９０ｍｇ、硫酸銅５水和物５ｍｇ、硫酸マンガン４水和物１０ｍｇ、塩化ナトリウム１００ｍｇ（いずれも１Ｌ当たり）の組成からなる液体培地（ｐＨ７）５ｍｌを試験管に入れて殺菌後、無菌的に微生物を接種し、３０℃で２〜３日間振とう培養する。その後、菌体を遠心分離により集め、グルコース２〜１０％を含んだリン酸緩衝液０．５〜５ｍｌに懸濁し、あらかじめ２−ベンズアミドメチル−３−オキソ酪酸メチル等（２−（Ｎ−置換アミノメチル）−３−オキソ酪酸エステル類に属する）を０．５〜２５ｍｇいれた試験管に加えて、２〜３日間３０℃で振とうする。この際、遠心分離により得た菌体をデシケーター中またはアセトンにより乾燥したものを用いることもできる。更に、これら微生物もしくはその処理物と２−ベンズアミドメチル−３−オキソ酪酸エステル類を反応させる際に、ＮＡＤ⁺及び／またはＮＡＤＰ⁺と、グルコース脱水素酵素及びグルコース、もしくはギ酸脱水素酵素及びギ酸、を添加してもよい。また、反応系に有機溶媒を共存させてもかまわない。変換反応ののち適当な有機溶媒で抽出を行ない、生成する２−ベンズアミドメチル−３−ヒドロキシ酪酸エステル類を高速液体クロマトグラフィーなどにより分析する。

４．微生物
本発明に使用しうる微生物としては、２−（Ｎ−置換アミノメチル）−３−オキソ酪酸エステル類を（２Ｓ，３Ｒ）−２−（Ｎ−置換アミノメチル）−３−ヒドロキシ酪酸エステル類に変換する能力を有する微生物であればいずれも使用しうるが、例えば、キャンディダ（Candida）属、ゲオトリカム（Geotrichum）属、ガラクトマイセス（Galactomyces）属、サッカロマイコプシス（Saccharomycopsis）属、アクロモバクター（Achromobacter）属、アースロバクター（Arthrobacter）属、バチルス（Bacillus）属、ブレフンディモナス（Brevundimonas）属、キナントモナス（Xanthomonas）属、デボシア（Devosia）属、ラルストニア（Ralstonia）属、ラクトバチルス（Lactobacillus）属、ロイコノストック（Leuconostoc）属、ミクロスポルム（Microsporum）属、モニリエラ（Moniliella）属に属する微生物等が挙げられる。

更に好ましくは、キャンディダ・ケフリ（Candida kefyr）、キャンディダ・オェオフィラ（Candida oleophila）、キャンディダ・マリス（Candida maris）、ゲオトリカム・エリエンス（Geotrichum eriense）、ガラクトマイセス・リエッシ（Galactomyces reessii）、サッカロマイコプシス・マランガ（Saccharomycopsis malanga）、アクロモバクター・キシロソキシダンス（Achromobacter xylosoxidans）、アクロモバクター・デニトリフィカンス（Achromobacter denitrificans）、アースロバクター・パラフィネウス（Arthrobacter paraffineus）、アースロバクター・ニコチアナエ（Arthrobacter nicotianae）、バチルス・アミロリティカス（Bacillus amylolyticus）、バチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）、バチルス・バディウス（Bacillus badius）、バチルス・スファエリカス（Bacillus sphaericus）、ブレフンディモナス・ディミヌータ（Brevundimonas diminuta）、キサントモナス・エスピー（Xanthomonas sp.）、デボシア・リボフラビナ（Devosia riboflavina
）、ラルストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropha）、ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）、ラクトバチルス・ヘルベティクス（Lactobacillus helveticus）、ロイコノストック・シュードモセンテロイデス（Leuconostoc pseudomesenteroides）、ミクロスポルム・コーケイ（Microsporum cookei）、モニリエラ・アセトアバテンス（Moniliella acetoabatens）などがあげられる。

これら微生物は一般に、入手または購入が容易な保存株から得ることができるが、自然界から分離することもできる。なお、これらの微生物に変異を生じさせて、より本反応に有利な性質を有する菌株を得ることもできる。

これらの微生物の培養には、通常これらの微生物が資化しうる栄養源を含む培地であれば何でも使用しうる。例えば、グルコース、シュークロース、マルトース等の糖類、乳酸、酢酸、クエン酸、プロピオン酸等の有機酸類、エタノール、グリセリン等のアルコール類、パラフィン等の炭化水素類、大豆油、菜種油等の油脂類、またはこれらの混合物等の炭素源；硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、尿素、酵母エキス、肉エキス、ペプトン、コーンスチープリカー等の窒素源；更に、その他の無機塩、ビタミン類等の栄養源；を適宜混合・配合した通常の培地を用いることが出来る。これら培地は用いる微生物の種類によって適宜選択すればよい。

微生物の培養は通常一般の条件により行なうことができ、例えば、ｐＨ４．０〜９．５、温度範囲２０℃〜４５℃の範囲で、好気的に１０〜９６時間培養するのが好ましい。２−ベンズアミドメチル−３−オキソ酪酸エステル類に微生物を反応させる場合においては、通常、上記微生物の菌体を含んだ培養液をそのまま反応に使用することもできるが、培養液の濃縮物も用いることができる。また、培養液中の成分が反応に悪影響を与える場合には、培養液を遠心分離等により処理して得られる菌体または菌体処理物を使用することも出来る。

上記微生物の菌体処理物としては特に限定されず、例えば、アセトンや五酸化二リンによる脱水処理またはデシケーターや扇風機を利用した乾燥によって得られる乾燥菌体、界面活性剤処理物、溶菌酵素処理物、固定化菌体または菌体を破砕した無細胞抽出液などをあげることができる。更に、培養物より立体選択的に還元反応を触媒する酵素を精製し、これを使用してもよい。

５．還元反応
還元反応の際には、基質である２−（Ｎ−置換アミノメチル）−３−オキソ酪酸エステル類を反応の初期に一括して添加してもよく、反応の進行にあわせて分割して添加してもよい。反応時の温度は通常１０〜６０℃、好ましくは、２０〜４０℃であり、反応時のｐＨは２．５〜９、好ましくは、５〜９の範囲である。反応液中の酵素源の量はこれらの基質を還元する能力に応じ適宜決定すればよい。また、反応液中の基質濃度は０．０１〜５０％（Ｗ／Ｖ）が好ましく、より好ましくは、０．１〜３０％（Ｗ／Ｖ）である。反応は通常、振とうまたは通気攪拌しながら行なう。反応時間は基質濃度、酵素源の量及びその他の反応条件により適宜決定される。通常、２〜１６８時間で反応が終了するように各条件を設定することが好ましい。

還元反応を促進させるために、反応液にグルコース、エタノール、イソプロパノールなどのエネルギー源を０．５〜３０％の割合で加えると優れた結果が得られるので好ましい。一般に生物学的方法による還元反応に必要とされている還元型ニコチンアミド・アデニンジヌクレオチド（以降ＮＡＤＨと省略する）、還元型ニコチンアミド・アデニンジヌクレオチドリン酸（以降ＮＡＤＰＨと省略する）等の補酵素を添加することにより、反応を促進させることもできる。この場合、具体的には、反応液に直接これらを添加する。

また、還元反応を促進させるために、ＮＡＤ⁺もしくはＮＡＤＰ⁺をそれぞれの還元型へ還元する酵素、及び還元するための基質を共存させて反応を行うと優れた結果が得られるので好ましい。例えば、還元型へ還元する酵素としてグルコース脱水素酵素、還元するための基質としてグルコースを共存させるか、または、還元型へ還元する酵素としてギ酸脱水素酵素、還元するための基質としてギ酸を共存させる。

６．還元反応の変形例
本発明の還元反応を触媒する酵素（還元酵素）のかわりに、該酵素をコードするＤＮＡを含む形質転換体を使用しても、同様に光学活性な２−（Ｎ−置換アミノメチル）−３−ヒドロキシ酪酸エステル類を製造することができる。

また、本発明の還元酵素をコードするＤＮＡ、および、補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの両者を含む形質転換体を使用しても、同様に光学活性な２−（Ｎ−置換アミノメチル）−３−ヒドロキシ酪酸エステル類を製造することができる。とりわけ、本発明の還元酵素をコードするＤＮＡ、および、補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの両者を含む形質転換体を使用した場合には、補酵素を再生するための酵素を別途調製・添加する必要がなく、光学活性３−ヒドロキシ酪酸エステル類の製造をより効率良く行なうことができる。

なお、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを含む形質転換体、若しくは、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡおよび補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの両者を含む形質転換体は、培養菌体は言うまでもなく、その処理物としても光学活性３−ヒドロキシ酪酸エステル類の製造に使用することができる。ここで言う形質転換体の処理物の意味は、前記と同様である。

本発明の還元酵素をコードするＤＮＡ、および、補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの両者を含む形質転換体は、本発明の還元酵素をコードするＤＮＡ、および、補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの両者を、同一のベクターに組み込み、これを宿主細胞に導入することにより得られるほか、これら２種のＤＮＡを不和合性グループの異なる２種のベクターにそれぞれ組み込み、それら２種のベクターを同一の宿主細胞に導入することによっても得られる。

本発明の還元酵素をコードするＤＮＡ、及び、補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの両者が組込まれたベクターの例としては、国際公開第ＷＯ２００４／０２７０５５号公報に記載の発現ベクターｐＮＴＤＲにバシラス・メガテリウム由来のグルコース脱水素酵素遺伝子を導入した、ｐＮＴＤＲＧ１が挙げられる。また、本発明の還元酵素をコードするＤＮＡ、及び、補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの両者を含む形質転換体の例としては、当該ベクターでＥ． ｃｏｌｉ ＨＢ１０１を形質転換して得られる、Ｅ． ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＤＲＧ１）が挙げられる。

本発明の還元酵素をコードするＤＮＡを含む形質転換体の培養、及び、本発明の還元酵素をコードするＤＮＡと補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡとを含む形質転換体の培養は、それらが増殖する限り、通常の、炭素源、窒素源、無機塩類、有機栄養素などを含む液体栄養培地を用いて実施できる。

また更に、トリトン（ナカライテスク株式会社製）、スパン（関東化学株式会社製）、ツイーン（ナカライテスク株式会社製）などの界面活性剤を反応液に添加することも効果的である。更に、基質及び／または還元反応の生成物である３−ヒドロキシ酪酸エステル類による反応の阻害を回避する目的で、酢酸エチル、酢酸ブチル、イソプロピルエーテル、トルエン、ヘキサンなどの水に不溶な有機溶媒を反応液に添加してもよい。更に、基質の溶解度を高める目的で、メタノール、エタノール、アセトン、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホキシドなどの水に可溶な有機溶媒を添加することもできる。

７．生成物の取得
還元反応により生成した光学活性２−（Ｎ−置換アミノメチル）−３−ヒドロキシ酪酸エステル類の採取は、特に限定されないが、反応液から直接、あるいは菌体等を分離後、酢酸エチル、トルエン、ｔ−ブチルメチルエーテル、ヘキサン等の溶剤で抽出し、脱水後、蒸留あるいはシリカゲルカラムクロマトグラフィー等により精製すれば高純度の光学活性２−（Ｎ−置換アミノメチル）−３−ヒドロキシ酪酸エステル類を容易に得ることができる。

以下、実施例により本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。なお、以下の記載において、「％」は特に断らない限り「重量％」を意味する。

以下の各実施例では、還元反応の基質としての２−（Ｎ−置換アミノメチル）−３−オキソ酪酸エステル類に属する化合物の例示として、それぞれ、２−ベンズアミドメチル−３−オキソ酪酸メチル（実施例１−１３）、２−ベンズアミドメチル−３−オキソ酪酸ｔｅｒｔ−ブチル（実施例１４−１６）、２−アセトアミドメチル−３−オキソ酪酸メチル（実施例１７、１８）、２−フタロイルアミドメチル−３−オキソ酪酸メチル（実施例１９、２０）を用いた。形質転換体による反応は、実施例２１に示した。

各実施例においては、所定の微生物、酵素、または酵素及び補酵素再生系酵素等を用いて、還元反応の反応収率及び生成物の光学純度等を測定した。測定結果によれば、いずれの実施例においても、（２Ｓ，３Ｒ）の立体配置を有する３−ヒドロキシ酪酸エステル類が効率良く製造されることがわかった。

（実施例１）表１に示す微生物を用いた反応
グルコース４０ｇ、酵母エキス３ｇ、リン酸水素二アンモニウム６．５ｇ、リン酸二水素カリウム１ｇ、硫酸マグネシウム７水和物０．８ｇ、硫酸亜鉛７水和物６０ｍｇ、硫酸鉄７水和物９０ｍｇ、硫酸銅５水和物５ｍｇ、硫酸マンガン４水和物１０ｍｇ、塩化ナトリウム１００ｍｇ（いずれも１Ｌ当たり）の組成からなる液体培地（ｐＨ７）５ｍｌを大型試験管に分注し、１２０℃で２０分間蒸気殺菌を行った。これらの液体培地に以下の表１に示す微生物を無菌的に一白金耳接種して、３０℃で７２時間振とう培養した。培養後、各培養液を遠心分離にかけて菌体を集め、菌体をグルコース１％を含んだ１００ｍＭリン酸緩衝液０．５ｍｌ（ｐＨ６．５）に懸濁した。

この菌体懸濁液を、あらかじめ２−ベンズアミドメチル−３−オキソ酪酸メチル２．５ｍｇをいれた試験管に加えて、３０℃で２４時間反応させた。反応後、各反応液に１ｍｌの酢酸エチルを加えて良く混合した。有機層の一部をダイセル化学工業株式会社製Ｃｈｉｒａｌｐａｋ ＡＤ−Ｈ（２５０ｍｍ×４．６ｍｍ）を装着したＨＰＬＣによって分析し、反応の収率と生成物の光学純度を求めた。結果を表１にまとめた。

（実施例２）表２に示す微生物を用いた反応
肉エキス１０ｇ、ペプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、塩化ナトリウム３ｇ（いずれも１Ｌ当たり）の組成からなる液体培地（ｐＨ７）７ｍｌを大型試験管に分注し、１２０℃で２０分間蒸気殺菌を行った。これらの液体培地に以下の表２に示す微生物を無菌的に一白金耳接種して、３０℃で７２時間振とう培養した。培養後、各培養液を遠心分離にかけて菌体を集め、菌体をグルコース１％を含んだ１００ｍＭリン酸緩衝液０．５ｍｌ（ｐＨ６．５）に懸濁した。

この菌体懸濁液を、あらかじめ２−ベンズアミドメチル−３−オキソ酪酸メチル２．５ｍｇをいれた試験管に加えて、３０℃で２４時間反応させた。反応後、各反応液に１ｍｌの酢酸エチルを加えて良く混合し、有機層の一部を実施例１に記載する分析条件で分析して、反応の収率と生成物の光学純度を求めた。結果を表２にまとめた。

（実施例３）表３に示す微生物を用いた反応
グルコース１０g、ペプトン１０g、肉エキス１０g、酵母エキス５g、塩化ナトリウム１ｇ、硫酸マグネシウム７水和物０．５ｇ（いずれも１Ｌ当たり）の組成からなる液体培地（ｐＨ７）５ｍｌを大型試験管に分注し、１２０℃で２０分間蒸気殺菌を行った。これらの液体培地に以下の表３に示す微生物を無菌的に一白金耳接種して、２８℃で７２時間振とう培養した。培養後、各培養液を遠心分離にかけて菌体を集め、菌体をグルコース１％を含んだ１００ｍＭリン酸緩衝液１ｍｌ（ｐＨ６．５）に懸濁した。

この菌体懸濁液を、あらかじめ２−ベンズアミドメチル−３−オキソ酪酸メチル１ｍｇをいれた試験管に加えて、３０℃で２４時間反応させた。反応後、各反応液に２ｍｌの酢酸エチルを加えて良く混合し、有機層の一部を実施例１に記載する分析条件で分析して、反応の収率と生成物の光学純度を求めた。結果を表３にまとめた。

（実施例４）２−ベンズアミドメチル−３−オキソ酪酸メチルの還元反応
ＭＳＲ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）５５ｇ（１Ｌ当たり）よりなる液体培地（ｐＨ６.５）１５ｍｌを大型試験管に分注し、１２０℃で２０分間蒸気殺菌を行った。これらの液体培地に以下の表４に示す微生物を無菌的に一白金耳接種して、３０℃で７２時間静置培養した。培養後、各培養液を遠心分離にかけて菌体を集め、菌体をグルコース１％を含んだ１００ｍＭリン酸緩衝液１ｍｌ（ｐＨ６．５）に懸濁した。

この菌体懸濁液を、あらかじめ２−ベンズアミドメチル−３−オキソ酪酸メチル１ｍｇをいれた試験管に加えて、３０℃で２４時間反応させた。反応後、各反応液に２ｍｌの酢酸エチルを加えて良く混合し、有機層の一部を実施例１に記載する分析条件で分析して、反応の収率と生成物の光学純度を求めた。結果を表４まとめた。

（実施例５）アセトン乾燥菌体を用いた反応
１ｍｌの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に、キャンディダ・ケフィア（Candida kefyr）ＮＢＲＣ ０７０６のアセトン乾燥菌体１０ｍｇ、グルコース１０ｍｇ、グルコース脱水素酵素「ＧＬＵＣＤＨ“Ａｍａｎｏ２”」（天野エンザイム株式会社製）１ｍｇ、ＮＡＤ０.２５ｍｇ、ＮＡＤＰ０.２５ｍｇ、２−ベンズアミドメチル−３−オキソ酪酸メチル２.５ｍｇを加えて、３０℃で２４時間反応させた。反応後、各反応液に２ｍｌの酢酸エチルを加えて良く混合し、有機層の一部を実施例１に記載する分析条件で分析したところ、収率は４０％であった。その有機層の一部の光学純度は４６.８％、ジアステレオ選択性は３１.８％であった。

（実施例６）アルコール脱水素酵素を用いた反応
１ｍｌの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に、ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）由来のアルコール脱水素酵素（Julich Fine Chemicals製）１０ｋＵ、ＮＡＤＰＨ２当量、２−ベンズアミドメチル−３−オキソ酪酸メチル１ｍｇを加えて、３０℃で２４時間反応させた。反応後、各反応液に２ｍｌの酢酸エチルにより抽出し、９１％の収率で（２Ｓ，３Ｒ）−２−ベンズアミドメチル−３−ヒドロキシブタン酸メチルを得た。このものの光学純度は９９．９％ｅｅ以上、ジアステレオ選択性は９２％ｄｅであった。

（実施例７）カルボニル還元酵素を用いた反応
３０ｍｌの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に、グルコース３ｇ、デボシア・リボフラビナ（Devosia riboflavina）由来のカルボニル還元酵素ＲＤＲ（国際公開第ＷＯ２００４／０２７０５５号公報参照）１０ｋＵ、グルコース脱水素酵素「ＧＬＵＣＤＨ“Ａｍａｎｏ２”」（天野エンザイム株式会社製）５００ｍｇ、ＮＡＤ５０ｍｇ、２−ベンズアミドメチル−３−オキソ酪酸メチル４.５ｇを加えて、３０℃で攪拌した。その間、反応液のｐＨは６Ｎ−ＮａＯＨによって６．５に維持した。２４時間の反応ののち、反応液を４５ｍｌの酢酸エチルで３回抽出し、得られた有機層をあわせて、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。ろ過によって硫酸ナトリウムを除去し、減圧下有機溶媒を留去したのち、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによって、４.４ｇの（２Ｓ，３Ｒ）−２−ベンズアミドメチル−３−ヒドロキシブタン酸メチルを得た。このものの光学純度は９９％ｅｅ以上、ジアステレオ選択性は８９．８％ｄｅであった。
［α］²⁵ _D ＋２２.８８°（Ｃ＝０.９，酢酸エチル）
¹Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃，δｐｐｍ）：７．８−７．７（ｍ，２Ｈ）、７．６−７．５（ｍ、１Ｈ），７．５−７．４（ｍ、２Ｈ），６．９（ｂｒ，ｓ，１Ｈ），４．２−４．０（ｍ，１Ｈ），４．０−３．９（ｍ，１Ｈ）、３．７（ｓ，３Ｈ），３．６−３．５（ｍ，１Ｈ），２．８（ｍ，１Ｈ），１．２（ｄ，３Ｈ）

（実施例８）カルボニル還元酵素を用いた反応
１ｍｌの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に、グルコース５０ｍｇ、キャンディダ・マリス（Candida maris）由来のカルボニル還元酵素ＦＰＤＨ（国際公開第ＷＯ０１／０５９９６公報参照）１０ｋＵ、グルコース脱水素酵素「ＧＬＵＣＤＨ“Ａｍａｎｏ２”」（天野エンザイム株式会社製）１ｍｇ、ＮＡＤ０．２５ｍｇ、２−ベンズアミドメチル−３−オキソ酪酸メチル５ｍｇを加えて、２４時間、３０℃で振とうした。反応終了後、反応液を２ｍｌの酢酸エチルで抽出し、収率９９％で（２Ｓ，３Ｒ）−２−ベンズアミドメチル−３−ヒドロキシブタン酸メチルを得た。このものの光学純度は９４％ｅｅ、ジアステレオ選択性は８９．３％ｄｅであった。
¹Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃，δｐｐｍ）：７．８−７．７（ｍ，２Ｈ），７．６−７．５（ｍ、１Ｈ）、７．５−７．４（ｍ、２Ｈ）、６．９（ｂｒ，ｓ，１Ｈ），４．２−４．０（ｍ，１Ｈ），４．０−３．９（ｍ，１Ｈ），３．７（ｓ，３Ｈ），３．６−３．５（ｍ，１Ｈ），２．８（ｍ，１Ｈ），１．２（ｄ，３Ｈ）

（実施例９）アセトアセチルＣｏＡ還元酵素を用いた反応
１ｍｌの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に、グルコース５０ｍｇ、ラルストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropha）由来のアセトアセチルＣｏＡ還元酵素ＲＲＥ（国際公開第ＷＯ２００５／０４４９７３公報参照）１０ｋＵ、グルコース脱水素酵素「ＧＬＵＣＤＨ“Ａｍａｎｏ２”」（天野エンザイム株式会社製）１ｍｇ、ＮＡＤ０．２５ｍｇ、２−ベンズアミドメチル−３−オキソ酪酸メチル５ｍｇを加えて、３０℃で振とうした。２４時間の反応ののち、反応液を２ｍｌの酢酸エチルで抽出し、収率５４％で（２Ｓ，３Ｒ）−２−ベンズアミドメチル−３−ヒドロキシブタン酸メチルを得た。このものの光学純度は８４．８％ｅｅ、ジアステレオ選択性は６０％ｄｅであった。

（実施例１０）アセトアセチルＣｏＡ還元酵素を用いた反応
１ｍｌの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に、グルコース５０ｍｇ、アクロモバクター・デニトリフィカンス（Achromobacter denitrificans）由来のアセトアセチルＣｏＡ還元酵素ＲＡＸ（国際公開第ＷＯ２００５／０４４９７３公報参照）１０ｋＵ、グルコース脱水素酵素「ＧＬＵＣＤＨ“Ａｍａｎｏ２”」（天野エンザイム株式会社製）１ｍｇ、ＮＡＤ０．２５ｍｇ、２−ベンズアミドメチル−３−オキソ酪酸メチル５ｍｇを加えて、３０℃で振とうした。２４時間の反応ののち、反応液を２ｍｌの酢酸エチルで抽出し、収率５７％で（２Ｓ，３Ｒ）−２−ベンズアミドメチル−３−ヒドロキシブタン酸メチルを得た。このものの光学純度は５９．７％ｅｅ、ジアステレオ選択性は４９．５％ｄｅであった。

（実施例１１）２−ベンズアミドメチル−３−オキソ酪酸メチルの還元反応
肉エキス１０ｇ、ペプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、塩化ナトリウム３ｇ（いずれも１Ｌ当たり）の組成からなる液体培地（ｐＨ７）７ｍｌを大型試験管に分注し、１２０℃で２０分間蒸気殺菌を行った。これらの液体培地に以下の表５に示す微生物を無菌的に一白金耳接種して、３０℃で７２時間振とう培養した。培養後、各培養液を遠心分離にかけて菌体を集め、菌体をグルコース１％を含んだ１００ｍＭリン酸緩衝液０．５ｍｌ（ｐＨ６．５）に懸濁した。

この菌体懸濁液を、あらかじめ２−ベンズアミドメチル−３−オキソ酪酸エチル０.５ｍｇいれた試験管に加えて、３０℃で２４時間反応させた。反応後、各反応液に１ｍｌの酢酸エチルを加えて良く混合し、有機層の一部をダイセル化学工業株式会社製Ｃｈｉｒａｌｐａｋ ＡＤ−Ｈ（２５０ｍｍ×４．６ｍｍ）を装着したＨＰＬＣによって分析し、反応の収率と生成物の光学純度を求めた。表５に結果をまとめた。

（実施例１２）カルボニル還元酵素を用いた反応
１ｍｌの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に、グルコース５０ｍｇ、デボシア・リボフラビナ（Devosia riboflavina）由来のカルボニル還元酵素ＲＤＲ（国際公開第ＷＯ２００４／０２７０５５公報参照）１０ｋＵ、グルコース脱水素酵素「ＧＬＵＣＤＨ“Ａｍａｎｏ２”」（天野エンザイム株式会社製）１ｍｇ、ＮＡＤ０．２５ｍｇ、２−ベンズアミドメチル−３−オキソ酪酸エチル５ｍｇを加えて、３０℃で振とうした。２４時間の反応ののち、反応液を２ｍｌの酢酸エチルで抽出し、収率１００％で（２Ｓ，３Ｒ）−２−ベンズアミドメチル−３−ヒドロキシブタン酸エチルを得た。このものの光学純度は９６％ｅｅ、ジアステレオ選択性は９１％ｄｅであった。
¹Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃，δｐｐｍ）：７．８−７．３（ｍ，５Ｈ），６．９（ｂｒ，ｓ，１Ｈ）、４．２−４．０（ｍ，３Ｈ），４．０−３．９（ｍ，２Ｈ，２．４（ｓ，３Ｈ），１．２（ｔ，３Ｈ）

（実施例１３）カルボニル還元酵素を用いた反応
１ｍｌの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に、グルコース５０ｍｇ、キャンディダ・マリス（Candida maris）由来のカルボニル還元酵素ＦＰＤＨ（国際公開第ＷＯ０１／０５９９６公報参照）１０ｋＵ、グルコース脱水素酵素「ＧＬＵＣＤＨ“Ａｍａｎｏ２”」（天野エンザイム株式会社製）１ｍｇ、ＮＡＤ０．２５ｍｇ、２−ベンズアミドメチル−３−オキソ酪酸エチル５ｍｇを加えて、３０℃で振とうした。２４時間の反応ののち、反応液を２ｍｌの酢酸エチルで抽出し、収率６１％で（２Ｓ，３Ｒ）−２−ベンズアミドメチル−３−ヒドロキシブタン酸エチルを得た。このものの光学純度は７１．８％ｅｅ、ジアステレオ選択性は７１．４％ｄｅであった。

（実施例１４）表６に示す微生物を用いた反応
肉エキス１０ｇ、ペプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、塩化ナトリウム３ｇ（いずれも１Ｌ当たり）の組成からなる液体培地（ｐＨ７）７ｍｌを大型試験管に分注し、１２０℃で２０分間蒸気殺菌を行った。これらの液体培地に以下の表６に示す微生物を無菌的に一白金耳接種して、３０℃で７２時間振とう培養した。培養後、各培養液を遠心分離にかけて菌体を集め、菌体をグルコース１％を含んだ１００ｍＭリン酸緩衝液０．５ｍｌ（ｐＨ６．５）に懸濁した。この菌体懸濁液を、あらかじめ２−ベンズアミドメチル−３−オキソ酪酸ｔｅｒｔ−ブチル０.５ｍｇいれた試験管に加えて、３０℃で２４時間反応させた。反応後、各反応液に１ｍｌの酢酸エチルを加えて良く混合し、有機層の一部をダイセル化学工業株式会社製Ｃｈｉｒａｌｐａｋ ＡＤ−Ｈ（２５０ｍｍ×４．６ｍｍ）を装着したＨＰＬＣによって分析し、反応の収率と生成物の光学純度を求めた。表６に結果をまとめた。

（実施例１５）カルボニル還元酵素を用いた反応
１ｍｌの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に、グルコース５０ｍｇ、デボシア・リボフラビナ（Devosia riboflavina）由来のカルボニル還元酵素ＲＤＲ（国際公開第ＷＯ２００４／０２７０５５公報参照）１０ｋＵ、グルコース脱水素酵素「ＧＬＵＣＤＨ“Ａｍａｎｏ２”」（天野エンザイム株式会社製）１ｍｇ、ＮＡＤ０．２５ｍｇ、２−ベンズアミドメチル−３−オキソ酪酸ｔｅｒｔ−ブチル５ｍｇを加えて、３０℃で振とうした。２４時間の反応ののち、反応液を２ｍｌの酢酸エチルで抽出し、収率８８％で（２Ｓ，３Ｒ）−２−ベンズアミドメチル−３−ヒドロキシブタン酸ｔｅｒｔ−ブチルを得た。このものの光学純度は、９９．９％ｅｅ以上、ジアステレオ選択性は９５．３％ｄｅであった。
¹Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_3,δｐｐｍ）：７．８−７．３（ｍ，５Ｈ）、６．９（ｂｒ，ｓ，１Ｈ），４．０−３．９（ｍ，４Ｈ），２．４（ｓ，３Ｈ），１．２（ｓ，９Ｈ）

（実施例１６）カルボニル還元酵素を用いた反応
１ｍｌの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に、グルコース５０ｍｇ、キャンディダ・マリス（Candida maris）由来のカルボニル還元酵素ＦＰＤＨ（国際公開第ＷＯ０１／０５９９６公報参照）１０ｋＵ、グルコース脱水素酵素「ＧＬＵＣＤＨ“Ａｍａｎｏ２”」（天野エンザイム株式会社製）１ｍｇ、ＮＡＤ０．２５ｍｇ、２−ベンズアミドメチル−３−オキソ酪酸ｔｅｒｔ−ブチル５ｍｇを加えて、３０℃で振とうした。２４時間の反応ののち、反応液を２ｍｌの酢酸エチルで抽出し、収率１５％で（２Ｓ，３Ｒ）−２−ベンズアミドメチル−３−ヒドロキシブタン酸ｔｅｒｔ−ブチルを得た。このものの光学純度は、９１．４％ｅｅ、ジアステレオ選択性は７７．７％ｄｅであった。

（実施例１７）カルボニル還元酵素を用いた反応
１ｍｌの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に、グルコース５０ｍｇ、デボシア・リボフラビナ（Devosia riboflavina）由来のカルボニル還元酵素ＲＤＲ（国際公開第ＷＯ２００４／０２７０５５公報参照）１０ｋＵ、グルコース脱水素酵素「ＧＬＵＣＤＨ“Ａｍａｎｏ２”」（天野エンザイム株式会社製）１ｍｇ、ＮＡＤ０．２５ｍｇ、２−アセトアミドメチル−３−オキソ酪酸メチル５ｍｇを加えて、３０℃で振とうした。２４時間の反応ののち、反応液を２ｍｌの酢酸エチルで抽出し、収率５９％で（２Ｓ，３Ｒ）−２−アセトアミドメチル−３−ヒドロキシブタン酸メチルを得た。このものの光学純度を、ダイセル化学工業株式会社製Ｃｈｉｒａｌｐａｋ ＡＤ−Ｈ（２５０ｍｍ×４．６ｍｍ）を装着したＨＰＬＣによって分析したところ、９７％ｅｅであり、ジアステレオ選択性は８２．３％ｄｅであった。
¹Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃，δｐｐｍ）： ６．２（ｂｒ，ｓ，１Ｈ），４．０−３．７（ｍ，２Ｈ），３．６（ｓ，１Ｈ），３．４−３．３（ｍ，１Ｈ），２．７−２．５（ｍ，１Ｈ），２．２（ｓ，３Ｈ）、１．２（ｄ，３Ｈ）

（実施例１８）カルボニル還元酵素を用いた反応
１ｍｌの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に、グルコース５０ｍｇ、キャンディダ・マリス（Candida maris）由来のカルボニル還元酵素ＦＰＤＨ（国際公開第ＷＯ０１／０５９９６公報参照）１０ｋＵ、グルコース脱水素酵素「ＧＬＵＣＤＨ“Ａｍａｎｏ２”」（天野エンザイム株式会社製）１ｍｇ、ＮＡＤ０．２５ｍｇ、２−アセトアミドメチル−３−オキソ酪酸メチル５ｍｇを加えて、３０℃で振とうした。２４時間の反応ののち、反応液を２ｍｌの酢酸エチルで抽出し、収率８％で（２Ｓ，３Ｒ）−２−アセトアミドメチル−３−ヒドロキシブタン酸メチルを得た。このものの光学純度は、９６．２％ｅｅ、ジアステレオ選択性は８０．３％ｄｅであった。

（実施例１９）カルボニル還元酵素を用いた反応
１ｍｌの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に、グルコース５０ｍｇ、デボシア・リボフラビナ（Devosia riboflavina）由来のカルボニル還元酵素ＲＤＲ（国際公開第ＷＯ２００４／０２７０５５公報参照）１０ｋＵ、グルコース脱水素酵素「ＧＬＵＣＤＨ“Ａｍａｎｏ２”」（天野エンザイム株式会社製）１ｍｇ、ＮＡＤ０．２５ｍｇ、２−フタロイルアミドメチル−３−オキソ酪酸メチル５ｍｇを加えて、３０℃で振とうした。２４時間の反応ののち、反応液を２ｍｌの酢酸エチルで抽出し、収率９８％で（２Ｓ，３Ｒ）−２−フタロイルアミドメチル−３−ヒドロキシブタン酸メチルを得た。このものの光学純度をダイセル化学工業株式会社製Ｃｈｉｒａｌｐａｋ ＡＤ−Ｈ（２５０ｍｍ×４．６ｍｍ）を装着したＨＰＬＣによって分析したことろ、９９．９％ｅｅ以上であり、ジアステレオ選択性は６２．２％ｄｅであった。
¹Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃，δｐｐｍ）：７．９−７．７（ｍ，４Ｈ），４．２−３．９（ｍ，３Ｈ），３．７（ｓ，３Ｈ）、２．７−２．６（ｍ，１Ｈ），１．２（ｄ，３Ｈ）

（実施例２０）カルボニル還元酵素を用いた反応
１ｍｌの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に、グルコース５０ｍｇ、キャンディダ・マリス（Candida maris）由来のカルボニル還元酵素ＦＰＤＨ（国際公開第ＷＯ０１／０５９９６公報参照）１０ｋＵ、グルコース脱水素酵素「ＧＬＵＣＤＨ“Ａｍａｎｏ２”」（天野エンザイム株式会社製）１ｍｇ、ＮＡＤ０．２５ｍｇ、２−フタロイルアミドメチル−３−オキソ酪酸メチル５ｍｇを加えて、３０℃で振とうした。２４時間の反応ののち、反応液を２ｍｌの酢酸エチルで抽出し、収率２１％で（２Ｓ，３Ｒ）−２−フタロイルアミドメチル−３−ヒドロキシブタン酸メチルを得た。このものの光学純度は９９．９％ｅｅ以上、ジアステレオ選択性は７２．４％ｄｅであった。

（実施例２１）形質転換体を用いた反応
Ｅ． ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＤＲＧ１）（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８４５８：国際公開第ＷＯ２００４／０２７０５５号公報参照）を１２０μｇ／ｍｌアンピシリンを含む２×ＹＴ培地で培養し、得られた培養液３０ｍｌに、グルコース２ｇ、ＮＡＤ５０ｍｇ、２−ベンズアミドメチル−３−オキソ酪酸メチル３ｇを加えて、３０℃で攪拌した。その間、反応液のｐＨは６ＮＮａＯＨによって６．５に維持した。２４時間の反応ののち、反応液を３０ｍｌの酢酸エチルで３回抽出し、得られた有機層をあわせて、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。ろ過によって硫酸ナトリウムを除去し、減圧下有機溶媒を留去したのち、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによって、２．８ｇの（２Ｓ，３Ｒ）−２−ベンズアミドメチル−３−ヒドロキシブタン酸メチルを得た。このものの光学純度は９９％ｅｅ以上、ジアステレオ選択性は８９．８％ｄｅであった。

Claims (11)

1. 一般式（１）：
   

   

   （式中、Ｒ^１は置換されていてもよい低級アルキル基、アリル基、置換されていてもよいアリール基、または置換されていてもよいアラルキル基を表し、
   Ｒ^２は置換されていてもよい低級アルキル基、置換されていてもよい低級アルコキシ基、置換されていてもよいアリール基、または置換されていてもよいアラルキルオキシ基を表し、前記置換基がハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基、又はシアノ基である。）で示される光学活性２−（Ｎ−置換アミノメチル）−３−ヒドロキシ酪酸エステル類の製造方法であって、一般式（２）：
   

   

   （式中、Ｒ^１及びＲ^２は前記と同じ。）で示される２−（Ｎ−置換アミノメチル）−３−オキソ酪酸エステルに、該化合物を（２Ｓ，３Ｒ）の立体配置を有する光学活性３−ヒドロキシ酪酸エステル類に立体選択的に還元する活性を有するキャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ゲオトリカム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ）属、ガラクトマイセス（Ｇａｌａｃｔｏｍｙｃｅｓ）属、サッカロマイコプシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ）属、アクロモバクター（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）属、アースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ブレフンディモナス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ）属、キナントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属、デボシア（Ｄｅｖｏｓｉａ）属、ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）属、ミクロスポルム（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ）属、モニリエラ（Ｍｏｎｉｌｉｅｌｌａ）属からなる群より選ばれた微生物由来の酵素源を作用させることを特徴とする製造方法。
2. 一般式（３）：
   

   

   （式中、Ｒ^１は置換されていてもよい低級アルキル基、アリル基、置換されていてもよいアリール基、または置換されていてもよいアラルキル基を表し、前記置換基がハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基、又はシアノ基である。）で示される光学活性２−（Ｎ−置換アミノメチル）−３−ヒドロキシ酪酸エステル類の製造方法であって、一般式（４）：
   

   

   （式中、Ｒ^１は前記と同じ。）で示される２−（Ｎ−置換アミノメチル）−３−オキソ酪酸エステルに、該化合物を（２Ｓ，３Ｒ）の立体配置を有する光学活性３−ヒドロキシ酪酸エステル類に立体選択的に還元する活性を有するゲオトリカム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ）属、ガラクトマイセス（Ｇａｌａｃｔｏｍｙｃｅｓ）属、サッカロマイコプシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ）属、アクロモバクター（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）属、アースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ブレフンディモナス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ）属、キナントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属、デボシア（Ｄｅｖｏｓｉａ）属、ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）属、ミクロスポルム（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ）属、モニリエラ（Ｍｏｎｉｌｉｅｌｌａ）属からなる群より選ばれた微生物由来の酵素源を作用させることを特徴とする製造方法。
3. 前記酵素源が、キャンディダ・ケフリ（Ｃａｎｄｉｄａ ｋｅｆｙｒ）、キャンディダ・オェオフィラ（Ｃａｎｄｉｄａ ｏｌｅｏｐｈｉｌａ）、キャンディダ・マリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｒｉｓ）、ゲオトリカム・エリエンス（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｅｒｉｅｎｓｅ）、ガラクトマイセス・リエッシ（Ｇａｌａｃｔｏｍｙｃｅｓ ｒｅｅｓｓｉｉ）、サッカロマイコプシス・マランガ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ ｍａｌａｎｇａ）、アクロモバクター・キシロソキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）、アクロモバクター・デニトリフィカンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、アースロバクター・パラフィネウス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｐａｒａｆｆｉｎｅｕｓ）、アースロバクター・ニコチアナエ（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ）、バチルス・アミロリティカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）、バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス・バディウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂａｄｉｕｓ）、バチルス・スファエリカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）、ブレフンディモナス・ディミヌータ（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ ｄｉｍｉｎｕｔａ）、キサントモナス・エスピー（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）、デボシア・リボフラビナ（Ｄｅｖｏｓｉａ ｒｉｂｏｆｌａｖｉｎａ）、ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ）、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、ラクトバチルス・ヘルベティクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）、ロイコノストック・シュードモセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｐｓｅｕｄｏｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ミクロスポルム・コーケイ（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ｃｏｏｋｅｉ）、モニリエラ・アセトアバテンス（Ｍｏｎｉｌｉｅｌｌａ ａｃｅｔｏａｂａｔｅｎｓ）からなる群より選ばれた微生物由来の酵素である、請求項１に記載の製造方法。
4. 前記酵素源が、ゲオトリカム・エリエンス（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｅｒｉｅｎｓｅ）、ガラクトマイセス・リエッシ（Ｇａｌａｃｔｏｍｙｃｅｓ ｒｅｅｓｓｉｉ）、サッカロマイコプシス・マランガ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ ｍａｌａｎｇａ）、アクロモバクター・キシロソキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）、アクロモバクター・デニトリフィカンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、アースロバクター・パラフィネウス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｐａｒａｆｆｉｎｅｕｓ）、アースロバクター・ニコチアナエ（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ）、バチルス・アミロリティカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）、バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス・バディウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂａｄｉｕｓ）、バチルス・スファエリカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）、ブレフンディモナス・ディミヌータ（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ ｄｉｍｉｎｕｔａ）、キサントモナス・エスピー（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）、デボシア・リボフラビナ（Ｄｅｖｏｓｉａ ｒｉｂｏｆｌａｖｉｎａ）、ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ）、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、ラクトバチルス・ヘルベティクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）、ロイコノストック・シュードモセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｐｓｅｕｄｏｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ミクロスポルム・コーケイ（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ｃｏｏｋｅｉ）、モニリエラ・アセトアバテンス（Ｍｏｎｉｌｉｅｌｌａ ａｃｅｔｏａｂａｔｅｎｓ）からなる群より選ばれた微生物由来の酵素である、請求項２に記載の製造方法。
5. 前記酵素源が、ガラクトマイセス・リエッシ（Ｇａｌａｃｔｏｍｙｃｅｓ ｒｅｅｓｓｉｉ）、サッカロマイコプシス・マランガ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ ｍａｌａｎｇａ）、アクロモバクター・キシロソキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）、アクロモバクター・デニトリフィカンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、アースロバクター・パラフィネウス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｐａｒａｆｆｉｎｅｕｓ）、アースロバクター・ニコチアナエ（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ）、バチルス・アミロリティカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）、バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス・バディウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂａｄｉｕｓ）、バチルス・スファエリカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）、ブレフンディモナス・ディミヌータ（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ ｄｉｍｉｎｕｔａ）、キサントモナス・エスピー（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）、デボシア・リボフラビナ（Ｄｅｖｏｓｉａ ｒｉｂｏｆｌａｖｉｎａ）、ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ）、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、ラクトバチルス・ヘルベティクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）、ロイコノストック・シュードモセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｐｓｅｕｄｏｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ミクロスポルム・コーケイ（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ｃｏｏｋｅｉ）、モニリエラ・アセトアバテンス（Ｍｏｎｉｌｉｅｌｌａ ａｃｅｔｏａｂａｔｅｎｓ）からなる群より選ばれた微生物由来の酵素である、請求項１または２に記載の製造方法。
6. 前記Ｒ^１がメチル基、エチル基、プロピル基、またはｎ−ブチル基である請求項１〜５のいずれかに記載の製造方法。
7. 前記Ｒ^１がメチル基である請求項６に記載の製造方法。
8. Ｒ^２がフェニル基、ｐ−ニトロフェニル基、またはｐ−クロロフェニル基である請求項１、３または５に記載の製造方法。
9. Ｒ^２がフェニル基である請求項８に記載の製造方法。
10. Ｒ^１がメチル基、Ｒ^２がフェニル基である請求項１、３または５に記載の製造方法。
11. 酸化型ニコチンアミド・アデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ^＋）、酸化型ニコチンアミド・アデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ^＋）のいずれかまたは両方を、それぞれの還元型へ還元する酵素と、還元するための基質とを、共存させることを特徴とする請求項１〜１０のいずれかに記載の製造方法。