KR20080036098A - 광학 활성 2-(ｎ-치환 아미노메틸)-3-히드록시부티르산에스테르류의 제조 방법 - Google Patents

광학 활성 2-(ｎ-치환 아미노메틸)-3-히드록시부티르산에스테르류의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 광학 활성 2-(N-치환 아미노메틸)-3-히드록시부티르산 에스테르의 제조 방법이며, 2-(N-치환 아미노메틸)-3-옥소부티르산 에스테르에, 상기 화합물을 (2S,3R)의 입체 배치를 갖는 광학 활성 2-(N-치환 아미노메틸)-3-히드록시부티르산 에스테르로 입체 선택적으로 환원하는 활성을 갖는 효소원을 작용시키는 것을 특징으로 하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 의약 등의 중간체로서 유용한 광학 활성 2-(N-치환 아미노메틸)-3-히드록시부티르산 에스테르, 특히, (2S,3R)의 입체 배치를 갖는 상기 화합물을 효율적으로 공업적으로 제조할 수 있다.
광학 활성, 히드록시부티르산 에스테르, 효소원, 환원, NAD, NADP

Description

광학 활성 2-(Ｎ-치환 아미노메틸)-3-히드록시부티르산 에스테르류의 제조 방법 {METHOD FOR PRODUCING OPTICALLY ACTIVE 2-(N-SUBSTITUTED AMINOMETHYL)-3-HYDROXYBUTYRIC ACID ESTER}
본 발명은 광학 활성인 2-(N-치환 아미노메틸)-3-히드록시부티르산 에스테르류의 제조 방법에 관한 것이다. 상기 화합물은, 예를 들면 광학 활성을 필요로 하는 의약품의 합성 원료 및 중간체로서 유용한 화합물이다.
광학 활성인 2-(N-치환 아미노메틸)-3-히드록시부티르산 에스테르류, 특히, (2S,3R)의 입체 배치를 갖는 화합물은, 티에나마이신으로 대표되는 β-락탐계 항생 물질의 합성 중간체로서 중요한 화합물이다. 이것의 제조 방법으로서는, 2-(N-치환 아미노메틸)-3-옥소부티르산 에스테르의 3위치의 카르보닐기를, 루테늄 광학 활성 포스핀 착체를 이용한 수소 첨가 반응에 의해서 입체 선택적이면서 촉매적으로 환원하는 방법이 알려져 있다(비특허 문헌 1, 특허 문헌 1). 그러나, 이 촉매적 환원에 의한 방법은 높은 입체 선택성을 얻기 위해서 매우 고가의 광학 활성 포스핀 배위자를 이용할 필요가 있고, 1 내지 10 MPa 정도의 높은 수소 압력을 필요로 하는 등, 공업적인 제조를 고려함에 있어서는 경제성 측면에서 반드시 만족할 수 있는 것은 아니었다.
한편, 효소나 미생물을 촉매로 하는 상기 에스테르류의 환원 반응에 관한 보고도 있다. 즉, 2-벤즈아미드메틸-3-히드록시부티르산에틸을 빵효모를 이용하여 환원한 경우에는, (2S,3S)체와 (2R,3S)체의 혼합물이 얻어진다(특허 문헌 2). 또한, 2-벤즈아미드메틸-3-히드록시부티르산에틸을 미생물의 균체를 이용하여 환원한 경우에는, 사용하는 미생물의 종류에 따라서 다양한 혼합비의 (2R,3S)체와 (2S,3S)체의 혼합물이 얻어진다(비특허 문헌 2). 또한, 클루이베로마이세스 마르시아누스(Kluyveromyces marxianus) 유래의 환원 효소를 이용하여 2-프탈로일아미노메틸-3-옥소부티르산에틸을 환원한 경우에는, (2S,3R)체의 입체 배치를 갖는 화합물이 검출되었다(특허 문헌 3, 비특허 문헌 3).
특허 문헌 1: 일본 특허 공개 (평)2-134349호 공보
특허 문헌 2: 일본 특허 공개 (소)63-297360호 공보
특허 문헌 3: 미국 특허 출원 공개 제2003/0139464호 명세서
비특허 문헌 1: R. Noyori 등, "Stereoselective hydrogenation via dynamic kinetic resolution", J. Am. Chem. Soc., 111, 9134(1989)
비특허 문헌 2: Claudio Fuganti 등, "Microbial Generation of (2R,3S)- and (2S,3S)-Ethyl 2-Benzamidomethyl-3-hydroxybutyrate, a key intermediate in the synthesis of (3S,1'R)-3-(1'-hydroxyethyl)azetidin-2-one", J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, (1993) 2247
비특허 문헌 3: Joo Hwan Cha 등, "Stereochemical control in diastereoselective reduction of α-substituted-β-ketoesters using a reductase purified from Kluyveromyces marxianus", Biotechnol. Lett. 24, 1695 (2002)
<발명의 개시>
<발명이 해결하고자 하는 기술적 과제>
본 발명의 과제는 광학 활성인 2-(N-치환 아미노메틸)-3-히드록시부티르산 에스테르류, 특히 (2S,3R)의 입체 배치를 갖는 상기 화합물을 공업적으로 제조하는 방법을 제공하는 데에 있다. 이들 화합물은, 예를 들면 β-락탐계 항생 물질의 합성 중간체로서 이용된다.
<과제를 해결하기 위한 수단>
본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해 검토를 거듭한 결과, 2-(N-치환 아미노메틸)-3-옥소부티르산 에스테르류의 카르보닐기를 입체 선택적으로 환원하여, (2S,3R)의 입체 배치를 갖는 2-(N-치환 아미노메틸)-3-히드록시부티르산 에스테르류로 변환하는 능력을 갖는 효소원을 발견하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 화학식 6으로 표시되는 2-(N-치환 아미노메틸)-3-옥소부티르산 에스테르에, 상기 화합물을 (2S,3R)의 입체 배치를 갖는 광학 활성 3-히드록시부티르산 에스테르로 입체 선택적으로 환원하는 활성을 갖는 효소원을 작용시키는 것을 특징으로 하는, 화학식 5로 표시되는 광학 활성 2-(N-치환 아미노메틸)-3-히드록시부티르산 에스테르류의 제조 방법에 관한 것이다.
Figure 112008012312775-PCT00001
(식 중, R1은 치환될 수 있는 저급 알킬기, 알릴기, 치환될 수 있는 아릴기, 또는 치환될 수 있는 아랄킬기를 나타내고, R3 및 R2는
1) R3가 수소 원자이고, R2가 치환될 수 있는 저급 알킬기, 치환될 수 있는 저급 알콕시기, 치환될 수 있는 아릴기, 또는 치환될 수 있는 아랄킬옥시기를 나타내거나,
2) R3과 -COR2가 일체가 되어 프탈로일기를 나타냄)
Figure 112008012312775-PCT00002
(식 중, R1, R2, 및 R3는 상기와 동일함)
<발명의 효과>
본 발명에 의해서, 의약 등의 중간체로서 유용한, (2S,3R)의 입체 배치를 갖 는 2-(N-치환 아미노메틸)-3-히드록시부티르산 에스테르류를 공업적으로 제조하는 방법이 제공된다.
<발명을 실시하기 위한 최선의 형태>
이하, 실시 형태에 기초하여 본 발명을 상술한다.
1. 기질 및 생성물
본 발명에서의 환원 반응에 사용되는 기질의 예시로서의 2-(N-치환 아미노메틸)-3-옥소부티르산 에스테르류는 화학식 6으로 표시되는 화합물이다.
<화학식 6>
Figure 112008012312775-PCT00003
식 중, R1은 치환될 수 있는 저급 알킬기, 알릴기, 치환될 수 있는 아릴기, 또는 치환될 수 있는 아랄킬기를 나타내고, R3 및 R2는
1) R3가 수소 원자이고, R2가 치환될 수 있는 저급 알킬기, 치환될 수 있는 저급 알콕시기, 치환될 수 있는 아릴기, 또는 치환될 수 있는 아랄킬옥시기를 나타내거나,
2) R3과 -COR2가 일체가 되어 프탈로일기를 나타낸다.
즉, R3 및 R2가 상기 1)의 조합인 경우에는, 상기 화학식 6으로 표시되는 화 합물은 하기 화학식 2로 표시되는 화합물로 되고, 또한, R3 및 R2가 상기 2)인 경우에는, 상기 화학식 6으로 표시되는 화합물은 하기 화학식 4로 표시되는 화합물로 된다.
Figure 112008012312775-PCT00004
(식 중, R1은 상기와 동일하고, R2는 치환될 수 있는 저급 알킬기, 치환될 수 있는 저급 알콕시기, 치환될 수 있는 아릴기, 또는 치환될 수 있는 아랄킬옥시기를 나타냄)
Figure 112008012312775-PCT00005
(식 중, R1은 상기와 동일함)
「저급」이란, 달리 설명되어 있지 않는 한, 1 내지 7개의 탄소 원자를 갖는 것을 나타내고, 바람직하게는, 1 내지 4개의 탄소 원자를 갖는 것을 나타낸다.
저급 알킬기로서는, 예를 들면, 메틸기, 에틸기, 클로로메틸기, n-프로필기, 이소프로필기, n-부틸기, 이소부틸기, t-부틸기, n-펜틸기, 시클로헥실기 등을 들 수 있고, 바람직하게는, 메틸기, 에틸기, n-프로필기, 부틸기 등을 들 수 있다. 이들 기는 치환될 수도 있다. 그 경우의 치환기로서는, 본 발명의 환원 반응에 악영향을 미치지 않는 한 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면, 할로겐 원자, 수산기, 아미노기, 니트로기, 시아노기 등을 들 수 있다.
치환될 수 있는 아릴기로서는, 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면, 페닐기, o-메틸페닐기, m-메틸페닐기, p-메틸페닐기, o-메톡시페닐기, m-메톡시페닐기, p-메톡시페닐기, o-플루오로페닐기, m-플루오로페닐기, p-플루오로페닐기, o-클로로페닐기, m-클로로페닐기, p-클로로페닐기, o-니트로페닐기, m-니트로페닐기, p-니트로페닐기, o-트리플루오로메틸페닐기, m-트리플루오로메틸페닐기, p-트리플루오로메틸페닐기, 나프틸기, 안트라세닐기, 2-푸릴기, 2-티오페닐, 2-피리딜기 등을 들 수 있다. 바람직하게는, 치환될 수 있는 페닐기이고, 보다 바람직하게는 페닐기이다.
치환될 수 있는 아랄킬기로서는, 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면 벤질기, p-히드록시벤질기, p-메톡시벤질기 등을 들 수 있다.
저급 알콕시기로서는, 특별히 한정되지 않으며, 메틸옥시기, 에틸옥시기, 클로로메틸옥시기, n-프로필옥시기, 이소프로필옥시기, n-부틸옥시기, 이소부틸옥시기, t-부틸옥시기, n-펜틸옥시기, 시클로헥실옥시기 등을 들 수 있고, 바람직하게는 메틸옥시기, 에틸옥시기, n-프로필기, 부틸옥시기 등을 들 수 있다. 이들 기는 치환될 수도 있고, 그 경우의 치환기로서는, 상술한 알킬기의 경우와 동일한 치환 기를 들 수 있다.
치환될 수 있는 아랄킬옥시기로서는, 벤질옥시기, p-히드록시벤질옥시기, p-메톡시벤질옥시기 등을 들 수 있고, 바람직하게는, 벤질옥시기이다.
상기한 것 중에서도, R1으로서는 탄소수 1 내지 4의 알킬기가 바람직하고, 메틸기가 보다 바람직하다. R2로서는 치환될 수 있는 페닐기가 바람직하고, 페닐기, p-니트로페닐기, p-클로로페닐기가 보다 바람직하고, 페닐기가 더욱 바람직하다. 또한, R3과 -COR2가 일체가 되어, 프탈로일기를 이루는 것도 바람직하다. 또한, R1이 메틸기이면서, R2가 페닐기인 경우가 특히 바람직하다.
본 발명에 있어서는, 상기 화학식 6으로 표시되는 화합물을, 상기 화합물을 비대칭 환원하는 활성을 갖는 효소원을 작용시켜 비대칭 환원함으로써, 화학식 5로 표시되는 광학 활성 2-(N-치환 아미노메틸)-3-히드록시부티르산 에스테르류로 변환한다. 식 중, R1, R2, 및 R3는 상기와 동일하다.
<화학식 5>
Figure 112008012312775-PCT00006
두말할 나위 없이, 상기 화학식 6으로 표시되는 화합물로서, 상기 화학식 2 또는 상기 화학식 4로 표시되는 화합물을 이용한 경우에는, 환원 생성물은 각각 하 기 화학식 1, 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물이다.
Figure 112008012312775-PCT00007
Figure 112008012312775-PCT00008
2. 효소원
본 발명에서 사용되는 효소원은, 2-(N-치환 아미노메틸)-3-옥소부티르산 에스테르류를 광학 활성인 2-(N-치환 아미노메틸)-3-히드록시부티르산 에스테르류로 변환하는 능력을 갖는 미생물에서 유래된 것을 사용할 수 있다. 여기서 말하는 「미생물에서 유래된 것」으로서는, 상기 미생물의 균체 그 자체, 미생물의 배양액, 또는 균체 처리물, 또는 상기 미생물로부터 얻어지는 효소일 수 있고, 나아가서는 상기 미생물 유래의 상기 환원 활성을 갖는 효소를 코딩하는 DNA가 도입된 형질 전환체도 포함한다. 이들을 단독으로 사용할 수도 있고, 2종 이상을 조합할 수도 있다. 또한, 이들 효소원은 주지된 방법으로 반복하여 사용할 수 있도록 고정화할 수 있다.
3. 2-(N-치환 아미노메틸)-3-히드록시부티르산 에스테르류로의 변환 능력의 측정
2-(N-치환 아미노메틸)-3-옥소부티르산 에스테르류를 광학 활성인 2-(N-치환 아미노메틸)-3-히드록시부티르산 에스테르류로 변환하는 능력을 갖는 미생물은 이하에 설명하는 방법에 의해서 발견할 수 있다. 예를 들면, 이하와 같이 하여 행한다. 글루코스 40 g, 효모 추출물 3 g, 인산수소이암모늄 6.5 g, 인산이수소칼륨 1 g, 황산마그네슘 7수화물 0.8 g, 황산아연 7수화물 60 mg, 황산철 7수화물 90 mg, 황산동 5수화물 5 mg, 황산망간 4수화물 10 mg, 염화나트륨 100 mg(모두 1L 당)의 조성을 포함하는 액체 배지(pH 7) 5 ml를 시험관에 넣어 살균한 후, 무균적으로 미생물을 접종하고, 30℃에서 2 내지 3일간 진탕 배양한다. 그 후, 균체를 원심 분리에 의해 모아, 글루코스 2 내지 10％를 포함한 인산 완충액 0.5 내지 5 ml에 현탁하고, 미리 2-벤즈아미드메틸-3-옥소부티르산 메틸 등(2-(N-치환 아미노메틸)-3-옥소부티르산 에스테르류에 속함)을 0.5 내지 25 mg을 넣은 시험관에 가하여, 2 내지 3일간 30℃에서 진탕한다. 이때, 원심 분리에 의해 얻은 균체를 데시케이터 내 또는 아세톤에 의해 건조한 것을 이용할 수도 있다. 또한, 이들 미생물 또는 그 처리물과 2-벤즈아미드메틸-3-옥소부티르산 에스테르류를 반응시킬 때에, NAD+ 및/또는 NADP+와, 글루코스 탈수소효소 및 글루코스, 또는 포름산 탈수소효소 및 포름산을 첨가할 수도 있다. 또한, 반응계에 유기 용매를 공존킬 수도 있다. 변환 반응 후 적당한 유기 용매로 추출을 행하고, 생성되는 2-벤즈아미드메틸-3-히드록시 부티르산 에스테르류를 고속 액체 크로마토그래피 등에 의해 분석한다.
4. 미생물
본 발명에 사용할 수 있는 미생물로서는, 2-(N-치환 아미노메틸)-3-옥소부티르산 에스테르류를 (2S,3R)-2-(N-치환 아미노메틸)-3-히드록시부티르산 에스테르류로 변환하는 능력을 갖는 미생물이면 모두 사용할 수 있는데, 예를 들면, 칸디다(Candida) 속, 게오트리쿰(Geotrichum) 속, 갈락토마이세스(Galactomyces) 속, 사카로마이콥시스(Saccharomycopsis) 속, 아크로모박터(Achromobacter) 속, 아트로박터(Arthrobacter) 속, 바실러스(Bacillus) 속, 브레분디모나스(Brevundimonas) 속, 크산토모나스(Xanthomonas) 속, 데보시아(Devosia) 속, 랄스토니아(Ralstonia) 속, 락토바실러스(Lactobacillus) 속, 류코노스톡(Leuconostoc) 속, 마이크로스포룸(Microsporum) 속, 모닐리엘라(Moniliella) 속에 속하는 미생물 등을 들 수 있다.
더욱 바람직하게는, 칸디다 케피르(Candida kefyr), 칸디다 올레오필라(Candida oleophila), 칸디다 마리스(Candida maris), 게오트리쿰 에리엔스(Geotrichum eriense), 갈락토마이세스 리엣시(Galactomyces reessii), 사카로마이콥시스 말랑가(Saccharomycopsis malanga), 아크로모박터 크실로속시단스(Achromobacter xylosoxidans), 아크로모박터 데니트리피칸스(Achromobacter denitrificans), 아트로박터 파라피네우스(Arthrobacter paraffineus), 아트로박터 니코티아나에(Arthrobacter nicotianae), 바실러스 아밀로리티쿠스(Bacillus amylolyticus), 바실러스 서큘런스(Bacillus circulans), 바실러스 세레우 스(Bacillus cereus), 바실러스 바디우스(Bacillus badius), 바실러스 스파에리쿠스(Bacillus sphaericus), 브레분디모나스 디미누타(Brevundimonas diminuta), 크산토모나스 에스피(Xanthomonas sp.), 데보시아 리보플라비나(Devosia riboflavina), 랄스토니아 유트로파(Ralstonia eutropha), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus), 류코노스톡 슈도메센테로이데스(Leuconostoc pseudomesenteroides), 마이크로스포룸 쿠케이(Microsporum cookei), 모닐리엘라 아세토아바텐스(Moniliella acetoabatens) 등을 들 수 있다.
이들 미생물은 일반적으로 입수 또는 구입이 용이한 보존주로부터 얻을 수 있지만, 자연계로부터 분리할 수도 있다. 또한, 이들 미생물에 이변을 생기게 하여, 보다 본 반응에 유리한 성질을 갖는 균주를 얻을 수도 있다.
이들 미생물의 배양에는, 통상 이들 미생물이 자화할 수 있는 영양원을 포함하는 배지이면 모두 사용할 수 있다. 예를 들면, 글루코스, 수크로스, 말토스 등의 당류, 락트산, 아세트산, 시트르산, 프로피온산 등의 유기산류, 에탄올, 글리세린 등의 알코올류, 파라핀 등의 탄화수소류, 대두유, 채종유 등의 유지류, 또는 이들의 혼합물 등의 탄소원; 황산암모늄, 인산암모늄, 요소, 효모 추출물, 고기 추출물, 펩톤, 콘 스팁 리큐르(corn steep liquor) 등의 질소원; 또한, 그 밖의 무기염, 비타민류 등의 영양원을 적절하게 혼합·배합한 통상의 배지를 이용할 수 있다. 이들 배지는 사용하는 미생물의 종류에 따라서 적절하게 선택할 수 있다.
미생물의 배양은 통상적으로 일반적인 조건에 의해 행할 수 있고, 예를 들 면, pH 4.0 내지 9.5, 온도 범위 20℃ 내지 45℃의 범위에서, 호기적으로 10 내지 96 시간 배양하는 것이 바람직하다. 2-벤즈아미드메틸-3-옥소부티르산 에스테르류에 미생물을 반응시키는 경우에 있어서는, 통상, 상기 미생물의 균체를 포함한 배양액을 그대로 반응에 사용할 수도 있지만, 배양액의 농축물도 사용할 수 있다. 또한, 배양액 내의 성분이 반응에 악영향을 미치는 경우에는, 배양액을 원심 분리 등에 의해 처리하여 얻어지는 균체 또는 균체 처리물을 사용할 수도 있다.
상기 미생물의 균체 처리물로서는 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면, 아세톤이나 오산화이인에 의한 탈수 처리 또는 데시케이터나 선풍기를 이용한 건조에 의해서 얻어지는 건조 균체, 계면 활성제 처리물, 용균 효소 처리물, 고정화 균체 또는 균체를 파쇄한 무세포 추출액 등을 들 수 있다. 또한, 배양물로부터 입체 선택적으로 환원 반응을 촉매하는 효소를 정제하여, 이것을 사용할 수도 있다.
5. 환원 반응
환원 반응시에는, 기질인 2-(N-치환 아미노메틸)-3-옥소부티르산 에스테르류를 반응 초기에 일괄적으로 첨가할 수도 있고, 반응의 진행에 맞추어서 분할하여 첨가할 수도 있다. 반응 시의 온도는 통상 10 내지 60℃, 바람직하게는, 20 내지 40℃이고, 반응 시의 pH는 2.5 내지 9, 바람직하게는, 5 내지 9의 범위이다. 반응액 내의 효소원의 양은 이들 기질을 환원하는 능력에 따라 적절하게 결정할 수 있다. 또한, 반응액 내의 기질 농도는 0.01 내지 50％(W/V)가 바람직하고, 보다 바람직하게는, 0.1 내지 30％(W/V)이다. 반응은 통상, 진탕 또는 통기 하에 교반하면서 행한다. 반응 시간은 기질 농도, 효소원의 양 및 그 밖의 반응 조건에 따라 적절하게 결정된다. 통상, 2 내지 168 시간에 반응이 종료하도록 각 조건을 설정하는 것이 바람직하다.
환원 반응을 촉진시키기 위해서, 반응액에 글루코스, 에탄올, 이소프로판올 등의 에너지원을 0.5 내지 30％의 비율로 가하면 우수한 결과가 얻어지기 때문에 바람직하다. 일반적으로 생물학적 방법에 의한 환원 반응에 필요하다고 여겨지는 환원형 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(이후 NADH로 축약함), 환원형 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 인산(이후 NADPH로 축약함) 등의 보효소를 첨가함으로써, 반응을 촉진시킬 수도 있다. 이 경우, 구체적으로는, 반응액에 직접 이들을 첨가한다.
또한, 환원 반응을 촉진시키기 위해서, NAD+ 또는 NADP+을 각각의 환원형으로 환원하는 효소, 및 환원하기 위한 기질을 공존시켜 반응을 행하면 우수한 결과가 얻어지므로 바람직하다. 예를 들면, 환원형으로 환원하는 효소로서 글루코스 탈수소효소, 환원하기 위한 기질로서 글루코스를 공존시키거나, 또는, 환원형으로 환원하는 효소로서 포름산 탈수소효소, 환원하기 위한 기질로서 포름산을 공존시킨다.
6. 환원 반응의 변형예
본 발명의 환원 반응을 촉매하는 효소(환원 효소) 대신에, 이 효소를 코딩하는 DNA를 포함하는 형질 전환체를 사용하더라도, 마찬가지로 광학 활성인 2-(N-치환 아미노메틸)-3-히드록시부티르산 에스테르류를 제조할 수 있다.
또한, 본 발명의 환원 효소를 코딩하는 DNA, 및, 보효소 재생능을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 둘다 포함하는 형질 전환체를 사용하더라도, 마찬가지로 광학 활성인 2-(N-치환 아미노메틸)-3-히드록시부티르산 에스테르류를 제조할 수 있다. 특히, 본 발명의 환원 효소를 코딩하는 DNA, 및, 보효소 재생능을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 둘 다 포함하는 형질 전환체를 사용한 경우에는, 보효소를 재생하기 위한 효소를 별도로 제조·첨가할 필요가 없어, 광학 활성 3-히드록시부티르산 에스테르류의 제조를 보다 효율적으로 행할 수 있다.
또한, 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 포함하는 형질 전환체, 혹은, 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 및 보효소 재생능을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 둘 다 포함하는 형질 전환체는, 배양 균체는 물론이고, 그 처리물로서도 광학 활성 3-히드록시부티르산 에스테르류의 제조에 사용할 수 있다. 여기서 말하는 형질 전환체의 처리물의 의미는 상기와 마찬가지이다.
본 발명의 환원 효소를 코딩하는 DNA, 및, 보효소 재생능을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 둘 다 포함하는 형질 전환체는, 본 발명의 환원 효소를 코딩하는 DNA, 및, 보효소 재생능을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 둘 다 동일 벡터에 조립하고, 이것을 숙주 세포에 도입함으로써 얻어지는 외에, 이들 2종의 DNA를 불화합성 그룹의 서로 다른 2종의 벡터에 각각 조립하고, 이들 2종의 벡터를 동일 숙주 세포에 도입함으로써도 얻어진다.
본 발명의 환원 효소를 코딩하는 DNA, 및, 보효소 재생능을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA가 둘 다 조립된 벡터의 예로서는, 국제 공개 제WO2004/027055호 공보에 기재된 발현 벡터 pNTDR에 바실러스 메가테리움 유래의 글루코스 탈수소효소 유전자를 도입한 pNTDRG1을 들 수 있다. 또한, 본 발명의 환원 효소를 코딩하는 DNA, 및, 보효소 재생능을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 둘 다 포함하는 형질 전환체의 예로서는, 상기 벡터로 이. 콜라이 HB101을 형질 전환하여 얻어지는, 이. 콜라이 HB101(pNTDRG1)을 들 수 있다.
본 발명의 환원 효소를 코딩하는 DNA를 포함하는 형질 전환체의 배양, 및, 본 발명의 환원 효소를 코딩하는 DNA와 보효소 재생능을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 포함하는 형질 전환체의 배양은, 이들이 증식하는 한, 통상의 탄소원, 질소원, 무기염류, 유기 영양소 등을 포함하는 액체 영양 배지를 이용하여 실시할 수 있다.
또한, 트리톤(나카라이 테스크 가부시끼가이샤 제조), 스판(간토 가가꾸 가부시끼가이샤 제조), 트윈(나카라이 테스크 가부시끼가이샤 제조) 등의 계면 활성제를 반응액에 첨가하는 것도 효과적이다. 또한, 기질 및/또는 환원 반응의 생성물인 3-히드록시부티르산 에스테르류에 의한 반응의 저해를 회피할 목적으로, 아세트산에틸, 아세트산부틸, 이소프로필에테르, 톨루엔, 헥산 등의 물에 불용인 유기 용매를 반응액에 첨가할 수도 있다. 또한, 기질의 용해도를 높일 목적으로, 메탄올, 에탄올, 아세톤, 테트라히드로푸란, 디메틸술폭시드 등의 물에 가용인 유기 용매를 첨가할 수도 있다.
7. 생성물의 취득
환원 반응에 의해 생성된 광학 활성 2-(N-치환 아미노메틸)-3-히드록시부티 르산 에스테르류의 채취는, 특별히 한정되지 않지만, 반응액으로부터 직접, 또는 균체 등을 분리한 후, 아세트산에틸, 톨루엔, t-부틸메틸에테르, 헥산 등의 용제로 추출하고, 탈수 후, 증류 또는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 등에 의해 정제하면 고순도의 광학 활성 2-(N-치환 아미노메틸)-3-히드록시부티르산 에스테르류를 용이하게 얻을 수 있다.
이하, 실시예에 의해 본 발명을 더욱 상세히 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 의해 전혀 한정되는 것이 아니다. 또한, 이하의 기재에 있어서, 「％」는 특별히 언급하지 않는 한 「중량％」를 의미한다.
이하의 각 실시예에서는, 환원 반응의 기질로서의 2-(N-치환 아미노메틸)-3-옥소부티르산 에스테르류에 속하는 화합물의 예시로서, 각각 2-벤즈아미드메틸-3-옥소부티르산 메틸(실시예 1-13), 2-벤즈아미드메틸-3-옥소부티르산 tert-부틸(실시예 14-16), 2-아세트아미드메틸-3-옥소부티르산 메틸(실시예 17, 18), 2-프탈로일아미드메틸-3-옥소부티르산 메틸(실시예 19, 20)을 이용하였다. 형질 전환체에 의한 반응은 실시예 21에 설명하였다.
각 실시예에 있어서는, 소정의 미생물, 효소, 또는 효소 및 보효소 재생계 효소 등을 이용하여 환원 반응의 반응 수율 및 생성물의 광학 순도 등을 측정하였다. 측정 결과에 따르면, 모든 실시예에 있어서, (2S,3R)의 입체 배치를 갖는 3-히드록시부티르산 에스테르류가 효율적으로 제조되는 것을 알 수 있다.
(실시예 1) 표 1에 나타내는 미생물을 이용한 반응
글루코스 40 g, 효모 추출물 3 g, 인산수소이암모늄 6.5 g, 인산이수소칼륨 1 g, 황산마그네슘 7수화물 0.8 g, 황산아연 7수화물 60 mg, 황산철 7수화물 90 mg, 황산동 5수화물 5 mg, 황산망간 4수화물 10 mg, 염화나트륨 100 mg(모두 1L 당)의 조성을 포함하는 액체 배지(pH 7) 5 ml을 대형 시험관에 분주하고, 120℃에서 20분간 증기 살균을 행하였다. 이들 액체 배지에 이하의 표 1에 나타내는 미생물을 무균적으로 1백금이(耳) 접종하고, 30℃에서 72시간 진탕 배양하였다. 배양 후, 각 배양액을 원심 분리에 걸어서 균체를 모으고, 균체를 글루코스 1％를 포함한 100 mM 인산 완충액 0.5 ml(pH 6.5)에 현탁하였다.
이 균체 현탁액을, 미리 2-벤즈아미드메틸-3-옥소부티르산 메틸 2.5 mg을 넣은 시험관에 가하고, 30℃에서 24시간 반응시켰다. 반응 후, 각 반응액에 1 ml의 아세트산에틸을 가하고 잘 혼합하였다. 유기층의 일부를 다이셀 가가꾸 고교 가부시끼가이샤 제조의 Chiralpak AD-H(250㎜×4.6㎜)를 장착한 HPLC에 의해서 분석하여, 반응의 수율과 생성물의 광학 순도를 구하였다. 결과를 표 1에 정리하였다.
Figure 112008012312775-PCT00009
(실시예 2) 표 2에 나타내는 미생물을 이용한 반응
고기 추출물 10 g, 펩톤 10 g, 효모 추출물 5 g, 염화나트륨 3 g(모두 1L 당)의 조성을 포함하는 액체 배지(pH 7) 7 ml를 대형 시험관에 분주하고, 120℃에서 20분간 증기 살균을 행하였다. 이들 액체 배지에 이하의 표 2에 나타내는 미생물을 무균적으로 1백금이 접종하고, 30℃에서 72시간 진탕 배양하였다. 배양 후, 각 배양액을 원심 분리에 걸어서 균체를 모으고, 균체를 글루코스 1％를 포함한 100 mM 인산 완충액 0.5 ml(pH 6.5)에 현탁하였다.
이 균체 현탁액을, 미리 2-벤즈아미드메틸-3-옥소부티르산 메틸 2.5 mg을 넣은 시험관에 가하고, 30℃에서 24시간 반응시켰다. 반응 후, 각 반응액에 1 ml의 아세트산에틸을 가하여 잘 혼합하고, 유기층의 일부를 실시예 1에 기재하는 분석 조건으로 분석하여, 반응의 수율과 생성물의 광학 순도를 구하였다. 결과를 표 2에 정리하였다.
Figure 112008012312775-PCT00010
(실시예 3) 표 3에 나타내는 미생물을 이용한 반응
글루코스 10 g, 펩톤 10 g, 고기 추출물 10 g, 효모 추출물 5 g, 염화나트륨 1 g, 황산마그네슘 7수화물 0.5 g(모두 1L 당)의 조성을 포함하는 액체 배지(pH 7) 5 ml를 대형 시험관에 분주하고, 120℃에서 20분간 증기 살균을 행하였다. 이들 액체 배지에 이하의 표 3에 나타내는 미생물을 무균적으로 1백금이 접종하고, 28℃에서 72시간 진탕 배양하였다. 배양 후, 각 배양액을 원심 분리에 걸어서 균체를 모으고, 균체를 글루코스 1％를 포함한 100 mM 인산 완충액 1 ml(pH 6.5)에 현탁하였다.
이 균체 현탁액을, 미리 2-벤즈아미드메틸-3-옥소부티르산 메틸 1 mg을 넣은 시험관에 가하고, 30℃에서 24시간 반응시켰다. 반응 후, 각 반응액에 2 ml의 아세트산에틸을 가하여 잘 혼합하고, 유기층의 일부를 실시예 1에 기재하는 분석 조건으로 분석하여, 반응의 수율과 생성물의 광학 순도를 구하였다. 결과를 표 3에 정리하였다.
Figure 112008012312775-PCT00011
(실시예 4) 2-벤즈아미드메틸-3-옥시부티르산 메틸의 환원 반응
MSR 배지(Difco사 제조) 55 g(1L 당)을 포함하는 액체 배지(pH 6.5) 15 ml를 대형 시험관에 분주하고, 120℃에서 20분간 증기 살균을 행하였다. 이들 액체 배지에 이하의 표 4에 나타내는 미생물을 무균적으로 1백금이 접종하고, 30℃에서 72시간 정치 배양하였다. 배양 후, 각 배양액을 원심 분리에 걸어서 균체를 모으고, 균체를 글루코스 1％를 포함한 100 mM 인산 완충액 1 ml(pH 6.5)에 현탁하였다.
이 균체 현탁액을, 미리 2-벤즈아미드메틸-3-옥소부티르산 메틸 1 mg을 넣은 시험관에 가하고, 30℃에서 24시간 반응시켰다. 반응 후, 각 반응액에 2 ml의 아세트산에틸을 가하여 잘 혼합하고, 유기층의 일부를 실시예 1에 기재하는 분석 조건으로 분석하여, 반응의 수율과 생성물의 광학 순도를 구하였다. 결과를 표 4에 정리하였다.
Figure 112008012312775-PCT00012
(실시예 5) 아세톤 건조 균체를 이용한 반응
1 ml의 100 mM 인산 완충액(pH 6.5)에, 칸디다 케피르(Candida kefyr) NBRC 0706의 아세톤 건조 균체 10 mg, 글루코스 10 mg, 글루코스 탈수소효소 「GLUCDH"Amano2"」(아마노 엔자임 가부시끼가이샤 제조) 1 mg, NAD 0.25 mg, NADP 0.25 mg, 2-벤즈아미드메틸-3-옥소부티르산 메틸 2.5 mg을 가하고, 30℃에서 24시간 반응시켰다. 반응 후, 각 반응액에 2 ml의 아세트산에틸을 가하여 잘 혼합하고, 유기층의 일부를 실시예 1에 기재하는 분석 조건으로 분석한 바, 수율은 40％였다. 그 유기층의 일부의 광학 순도는 46.8％, 디아스테레오 선택성은 31.8％였다.
(실시예 6) 알코올 탄수소 효소를 이용한 반응
1 ml의 100 mM 인산 완충액(pH 6.5)에, 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) 유래의 알코올 탈수소효소(Julich Fine Chemicals 제조) 10 kU, NADPH 2당량, 2-벤즈아미드메틸-3-옥소부티르산 메틸 1 mg을 가하고, 30℃에서 24시간 반응시켰다. 반응 후, 각 반응액에 2 ml의 아세트산에틸에 의해 추출하여, 91％의 수율로 (2S,3R)-2-벤즈아미드메틸-3-히드록시부탄산 메틸을 얻었다. 이것의 광학 순도는 99.9％ee 이상, 디아스테레오 선택성은 92％de였다.
(실시예 7) 카르보닐 환원 효소를 이용한 반응
30 ml의 100 mM 인산 완충액(pH 6.5)에, 글루코스 3g, 데보시아 리보플라비나(Devosia riboflavina) 유래의 카르보닐 환원 효소 RDR(국제 공개 제WO2004/027055호 공보 참조) 10 kU, 글루코스 탈수소효소 「GLUCDH"Amano2"」(아마노 엔자임 가부시끼가이샤 제조) 500 mg, NAD 50 mg, 2-벤즈아미드메틸-3-옥소부티르산 메틸 4.5 g을 가하고, 30℃에서 교반하였다. 그 동안, 반응액의 pH는 6N-NaOH에 의해서 6.5로 유지하였다. 24시간 반응 후, 반응액을 45 ml의 아세트산에틸로 3회 추출하고, 얻어진 유기층을 합쳐, 무수 황산나트륨으로 건조하였다. 여과에 의해서 황산나트륨을 제거하고, 감압 하에 유기 용매를 증류 제거한 후, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피에 의해서, 4.4 g의 (2S,3R)-2-벤즈아미드메틸-3-히드록시부탄산 메틸을 얻었다. 이것의 광학 순도는 99％ee 이상, 디아스테레오 선택성은 89.8％de였다.
Figure 112008012312775-PCT00013
(실시예 8) 카르보닐 환원 효소를 이용한 반응
1 ml의 100 mM 인산 완충액(pH 6.5)에, 글루코스 50 mg, 칸디다 마리스(Candida maris) 유래의 카르보닐 환원 효소 FPDH(국제 공개 제WO01/05996호 공보 참조) 10 kU, 글루코스 탈수소효소「GLUCDH"Amano2"」(아마노 엔자임 가부시끼가이샤 제조) 1 mg, NAD 0.25 mg, 2-벤즈아미드메틸-3-옥소부티르산 메틸 5 mg을 가하고, 24시간, 30℃에서 진탕하였다. 반응 종료 후, 반응액을 2 ml의 아세트산에틸로 추출하여, 수율 99％로 (2S,3R)-2-벤즈아미드메틸-3-히드록시부탄산 메틸을 얻었다. 이것의 광학 순도는 94％ee, 디아스테레오 선택성은 89.3％de였다.
Figure 112008012312775-PCT00014
(실시예 9) 아세토아세틸 CoA 환원 효소를 이용한 반응
1 ml의 100 mM 인산 완충액(pH 6.5)에, 글루코스 50 mg, 랄스토니아 유트로파(Ralstonia eutropha) 유래의 아세토아세틸 CoA 환원 효소 RRE(국제 공개 제WO2005/044973호 공보 참조) 10 kU, 글루코스 탈수소효소「GLUCDH"Amano2"」(아마노 엔자임 가부시끼가이샤 제조) 1 mg, NAD 0.25 mg, 2-벤즈아미드메틸-3-옥소부티르산 메틸 5 mg을 가하고, 30℃에서 진탕하였다. 24시간 반응 후, 반응액을 2 ml의 아세트산에틸로 추출하여, 수율 54％로 (2S,3R)-2-벤즈아미드메틸-3-히드록시부탄산 메틸을 얻었다. 이것의 광학 순도는 84.8％ee, 디아스테레오 선택성은 60％de였다.
(실시예 10) 아세토아세틸 CoA 환원 효소를 이용한 반응
1 ml의 100 mM 인산 완충액(pH 6.5)에, 글루코스 50 mg, 아크로모박터 데니트리피칸스(Achromobacter denitrificans) 유래의 아세토아세틸 CoA 환원 효소 RAX(국제 공개 제WO2005/044973호 공보 참조) 10 kU, 글루코스 탈수소효소「GLUCDH"Amano2"」(아마노 엔자임 가부시끼가이샤 제조) 1 mg, NAD 0.25 mg, 2-벤즈아미드메틸-3-옥소부티르산 메틸 5 mg을 가하고, 30℃에서 진탕하였다. 24시간 반응 후, 반응액을 2 ml의 아세트산에틸로 추출하여, 수율 57％로 (2S,3R)-2-벤즈아미드메틸-3-히드록시부탄산 메틸을 얻었다. 이것의 광학 순도는 59.7％ee, 디아스테레오 선택성은 49.5％de였다.
(실시예 11) 2-벤즈아미드메틸-3-옥시부티르산 메틸의 환원 반응
고기 추출물 10 g, 펩톤 10 g, 효모 추출물 5 g, 염화나트륨 3g(모두 1L 당)의 조성을 포함하는 액체 배지(pH 7) 7 ml를 대형 시험관에 분주하고, 120℃에서 20분간 증기 살균을 행하였다. 이들 액체 배지에 이하의 표 5에 나타내는 미생물을 무균적으로 1백금이 접종하고, 30℃에서 72시간 진탕 배양하였다. 배양 후, 각 배양액을 원심 분리에 걸어서 균체를 모으고, 균체를 글루코스 1％를 포함한 100 mM 인산 완충액 0.5 ml(pH 6.5)에 현탁하였다.
이 균체 현탁액을, 미리 2-벤즈아미드메틸-3-옥소부티르산에틸 0.5 mg을 넣은 시험관에 가하고, 30℃에서 24시간 반응시켰다. 반응 후, 각 반응액에 1 ml의 아세트산에틸을 가하여 잘 혼합하고, 유기층의 일부를 다이셀 가가꾸 고교 가부시끼가이샤 제조의 Chiralpak AD-H (250㎜ × 4.6㎜)를 장착한 HPLC에 의해서 분석하여, 반응의 수율과 생성물의 광학 순도를 구하였다. 표 5에 결과를 정리하였다.
Figure 112008012312775-PCT00015
(실시예 12) 카르보닐 환원 효소를 이용한 반응
1 ml의 100 mM 인산 완충액(pH 6.5)에, 글루코스 50 mg, 데보시아 리보플라비나(Devosia riboflavina) 유래의 카르보닐 환원 효소 RDR(국제 공개 제WO2004/027055호 공보 참조) 10 kU, 글루코스 탈수소효소「GLUCDH"Amano2"」(아마노 엔자임 가부시끼가이샤 제조) 1 mg, NAD 0.25 mg, 2-벤즈아미드메틸-3-옥소부티르산에틸 5 mg을 가하고, 30℃에서 진탕하였다. 24시간 반응 후, 반응액을 2 ml의 아세트산에틸로 추출하여, 수율 100％로 (2S,3R)-2-벤즈아미드메틸-3-히드록시부탄산에틸을 얻었다. 이것의 광학 순도는 96％ee, 디아스테레오 선택성은 91％de였다.
Figure 112008012312775-PCT00016
(실시예 13) 카르보닐 환원 효소를 이용한 반응
1 ml의 100 mM 인산 완충액(pH 6.5)에, 글루코스 50 mg, 칸디다 마리스(Candida maris) 유래의 카르보닐 환원 효소 FPDH(국제 공개 제WO01/05996호 공보 참조) 10 kU, 글루코스 탈수소효소「GLUCDH"Amano2"」(아마노 엔자임 가부시끼가이샤 제조) 1 mg, NAD 0.25 mg, 2-벤즈아미드메틸-3-옥소부티르산에틸 5 mg을 가하고, 30℃에서 진탕하였다. 24시간 반응 후, 반응액을 2 ml의 아세트산에틸로 추출하여, 수율 61％로 (2S,3R)-2-벤즈아미드메틸-3-히드록시부탄산에틸을 얻었다. 이것의 광학 순도는 71.8％ee, 디아스테레오 선택성은 71.4％de였다.
(실시예 14) 표 6에 나타내는 미생물을 이용한 반응
고기 추출물 10 g, 펩톤 10 g, 효모 추출물 5 g, 염화나트륨 3g(모두 1L 당)의 조성을 포함하는 액체 배지(pH 7) 7 ml를 대형 시험관에 분주하고, 120℃에서 20분간 증기 살균을 행하였다. 이들 액체 배지에 이하의 표 6에 나타내는 미생물을 무균적으로 1백금이 접종하고, 30℃에서 72시간 진탕 배양하였다. 배양 후, 각 배양액을 원심 분리에 걸어서 균체를 모으고, 균체를 글루코스 1％를 포함한 100 mM 인산 완충액 0.5 ml(pH 6.5)에 현탁하였다. 이 균체 현탁액을, 미리 2-벤즈아미드메틸-3-옥소부티르산 tert-부틸 0.5 mg을 넣은 시험관에 가하고, 30℃에서 24시간 반응시켰다. 반응 후, 각 반응액에 1 ml의 아세트산에틸을 가하여 잘 혼합하고, 유기층의 일부를 다이셀 가가꾸 고교 가부시끼가이샤 제조의 Chiralpak AD-H(250㎜× 4.6㎜)를 장착한 HPLC에 의해서 분석하여, 반응의 수율과 생성물의 광학 순도를 구하였다. 표 6에 결과를 정리하였다.
Figure 112008012312775-PCT00017
(실시예 15) 카르보닐 환원 효소를 이용한 반응
1 ml의 100 mM 인산 완충액(pH 6.5)에, 글루코스 50 mg, 데보시아 리보플라비나(Devosia riboflavina) 유래의 카르보닐 환원 효소 RDR(국제 공개 제WO2004/027055호 공보 참조) 10 kU, 글루코스 탈수소효소「GLUCDH"Amano2"」(아마노 엔자임 가부시끼가이샤 제조) 1 mg, NAD 0.25 mg, 2-벤즈아미드메틸-3-옥소부티르산 tert-부틸 5 mg을 가하고, 30℃에서 진탕하였다. 24시간 반응 후, 반응액을 2 ml의 아세트산에틸로 추출하여, 수율 88％로 (2S,3R)-2-벤즈아미드메틸-3-히드록시부탄산 tert-부틸을 얻었다. 이것의 광학 순도는 99.9％ee 이상, 디아스테레오 선택성은 95.3％de였다.
Figure 112008012312775-PCT00018
(실시예 16) 카르보닐 환원 효소를 이용한 반응
1 ml의 100 mM 인산 완충액(pH 6.5)에, 글루코스 50 mg, 칸디다 마리스(Candida maris) 유래의 카르보닐 환원 효소 FPDH(국제 공개 제WO01/05996호 공보 참조) 10 kU, 글루코스 탈수소효소「GLUCDH"Amano2"」(아마노 엔자임 가부시끼가이샤 제조) 1 mg, NAD 0.25 mg, 2-벤즈아미드메틸-3-옥소부티르산 tert-부틸 5 mg을 가하고, 30℃에서 진탕하였다. 24시간 반응 후, 반응액을 2 ml의 아세트산에틸로 추출하여, 수율 15％로 (2S,3R)-2-벤즈아미드메틸-3-히드록시부탄산 tert-부틸을 얻었다. 이것의 광학 순도는 91.4％ee, 디아스테레오 선택성은 77.7％de였다.
(실시예 17) 카르보닐 환원 효소를 이용한 반응
1 ml의 100 mM 인산 완충액(pH 6.5)에, 글루코스 50 mg, 데보시아 리보플라비나(Devosia riboflavina) 유래의 카르보닐 환원 효소 RDR(국제 공개 제WO2004/027055호 공보 참조) 10 kU, 글루코스 탈수소효소「GLUCDH"Amano2"」(아마노 엔자임 가부시끼가이샤 제조) 1 mg, NAD 0.25 mg, 2-아세트아미드메틸-3-옥소부티르산 메틸 5 mg을 가하고, 30℃에서 진탕하였다. 24시간 반응 후, 반응액을 2 ml의 아세트산에틸로 추출하여, 수율 59％로 (2S,3R)-2-아세트아미드메틸-3-히드록시부탄산 메틸을 얻었다. 이것의 광학 순도를, 다이셀 가가꾸 고교 가부시끼가이샤 제조의 Chiralpak AD-H(250㎜× 4.6㎜)를 장착한 HPLC에 의해서 분석한 바, 97％ee이고, 디아스테레오 선택성은 82.3％de였다.
Figure 112008012312775-PCT00019
(실시예 18) 카르보닐 환원 효소를 이용한 반응
1 ml의 100 mM 인산 완충액(pH 6.5)에, 글루코스 50 mg, 칸디다 마리스(Candida maris) 유래의 카르보닐 환원 효소 FPDH(국제 공개 제WO01/05996호 공보 참조) 10 kU, 글루코스 탈수소효소「GLUCDH"Amano2"」(아마노 엔자임 가부시끼가이샤 제조) 1 mg, NAD 0.25 mg, 2-아세트아미드메틸-3-옥소부티르산 메틸 5 mg을 가하고, 30℃에서 진탕하였다. 24시간 반응 후, 반응액을 2 ml의 아세트산에틸로 추출하여, 수율 8％로 (2S,3R)-2-아세트아미드메틸-3-히드록시부탄산 메틸을 얻었다. 이것의 광학 순도는 96.2％ee, 디아스테레오 선택성은 80.3％de였다.
(실시예 19) 카르보닐 환원 효소를 이용한 반응
1 ml의 100 mM 인산 완충액(pH 6.5)에, 글루코스 50 mg, 데보시아 리보플라비나(Devosia riboflavina) 유래의 카르보닐 환원 효소 RDR(국제 공개 제WO2004/027055호 공보 참조) 10 kU, 글루코스 탈수소효소「GLUCDH"Amano2"」(아마노 엔자임 가부시끼가이샤 제조) 1 mg, NAD 0.25 mg, 2-프탈로일아미드메틸-3-옥소부티르산 메틸 5 mg을 가하고, 30℃에서 진탕하였다. 24시간 반응 후, 반응액을 2 ml의 아세트산에틸로 추출하여, 수율 98％로 (2S,3R)-2-프탈로일아미드메틸-3-히드록시부탄산 메틸을 얻었다. 이것의 광학 순도를 다이셀 가가꾸 고교 가부시끼가이샤 제조의 Chiralpak AD-H(250㎜× 4.6㎜)를 장착한 HPLC에 의해서 분석한 바, 99.9％ee 이상이고, 디아스테레오 선택성은 62.2％de였다.
Figure 112008012312775-PCT00020
(실시예 20) 카르보닐 환원 효소를 이용한 반응
1 ml의 100 mM 인산 완충액(pH 6.5)에, 글루코스 50 mg, 칸디다 마리스(Candida maris) 유래의 카르보닐 환원 효소 FPDH(국제 공개 제WO01/05996호 공보 참조) 10 kU, 글루코스 탈수소효소「GLUCDH"Amano2"」(아마노 엔자임 가부시끼가이샤 제조) 1 mg, NAD 0.25 mg, 2-프탈로일아미드메틸-3-옥소부티르산 메틸 5 mg을 가하고, 30℃에서 진탕하였다. 24시간 반응 후, 반응액을 2 ml의 아세트산에틸로 추출하여, 수율 21％로 (2S,3R)-2-프탈로일아미드메틸-3-히드록시부탄산 메틸을 얻었다. 이것의 광학 순도는 99.9％ee 이상, 디아스테레오 선택성은 72.4％de였다.
(실시예 21) 형질 전환체를 이용한 반응
이. 콜라이 HB101(pNTDRG1)(FERM BP-08458:국제 공개 제WO2004/027055호 공보 참조)를 120 ㎍/ml 암피실린을 포함하는 2×YT 배지에서 배양하고, 얻어진 배양액 30 ml에, 글루코스 2 g, NAD 50 mg, 2-벤즈아미드메틸-3-옥소부티르산 메틸 3 g을 가하고, 30℃에서 교반하였다. 그 동안, 반응액의 pH는 6N NaOH에 의해서 6.5로 유지하였다. 24시간 반응 후, 반응액을 30 ml의 아세트산에틸로 3회 추출하고, 얻어진 유기층을 합쳐서, 무수 황산나트륨으로 건조하였다. 여과에 의해서 황산나트륨을 제거하고, 감압 하에 유기 용매를 증류 제거한 후, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피에 의해서, 2.8g의 (2S,3R)-2-벤즈아미드메틸-3-히드록시부탄산 메틸을 얻었다. 이것의 광학 순도는 99％ee 이상, 디아스테레오 선택성은 89.8％de였다.

Claims (11)

  1. 화학식 6으로 표시되는 2-(N-치환 아미노메틸)-3-옥소부티르산 에스테르에, 상기 화합물을 (2S,3R)의 입체 배치를 갖는 광학 활성 3-히드록시부티르산 에스테르류로 입체 선택적으로 환원하는 활성을 갖는 효소원을 작용시키는 것을 특징으로 하는, 화학식 5로 표시되는 광학 활성 2-(N-치환 아미노메틸)-3-히드록시부티르산 에스테르류의 제조 방법.
    <화학식 5>
    Figure 112008012312775-PCT00021
    (식 중, R1은 치환될 수 있는 저급 알킬기, 알릴기, 치환될 수 있는 아릴기, 또는 치환될 수 있는 아랄킬기를 나타내고, R2 및 R3는
    1) R3가 수소 원자이고, R2가 치환될 수 있는 저급 알킬기, 치환될 수 있는 알콕시기, 치환될 수 있는 아릴기, 또는 치환될 수 있는 아랄킬옥시기를 나타내거나,
    2) R3과 -COR2가 일체가 되어 프탈로일기를 나타냄)
    <화학식 6>
    Figure 112008012312775-PCT00022
    (식 중, R1, R2 및 R3는 상기와 동일함)
  2. 제1항에 있어서, 상기 화학식 6으로 표시되는 2-(N-치환 아미노메틸)-3-옥소부티르산 에스테르로서 화학식 2로 표시되는 화합물을 이용하여, 상기 화학식 5로 표시되는 광학 활성 2-(N-치환 아미노메틸)-3-히드록시부티르산 에스테르로서 화학식 1로 표시되는 화합물을 제조하는 제조 방법.
    <화학식 2>
    Figure 112008012312775-PCT00023
    (식 중, R1은 상기와 동일하고, R2는 치환될 수 있는 저급 알킬기, 치환될 수 있는 저급 알콕시기, 치환될 수 있는 아릴기, 또는 치환될 수 있는 아랄킬옥시기를 나타냄)
    <화학식 1>
    Figure 112008012312775-PCT00024
    (식 중, R1, R2는 상기와 동일함)
  3. 제1항에 있어서, 상기 화학식 6으로 표시되는 2-(N-치환 아미노메틸)-3-옥소부티르산 에스테르로서 화학식 4로 표시되는 화합물을 이용하여, 상기 화학식 5로 표시되는 광학 활성 2-(N-치환 아미노메틸)-3-히드록시부티르산 에스테르로서 화학식 3으로 표시되는 화합물을 제조하는 제조 방법.
    <화학식 4>
    Figure 112008012312775-PCT00025
    (식 중, R1은 상기와 동일함)
    <화학식 3>
    Figure 112008012312775-PCT00026
    (식 중, R1은 상기와 동일함)
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효소원이, 칸디다(Candida) 속, 게오트리쿰(Geotrichum) 속, 갈락토마이세스(Galactomyces) 속, 사카로마이콥시스(Saccharomycopsis) 속, 아크로모박터(Achromobacter) 속, 아트로박터(Arthrobacter) 속, 바실러스(Bacillus) 속, 브레분디모나스(Brevundimonas) 속, 크산토모나스(Xanthomonas) 속, 데보시아(Devosia) 속, 랄스토니아(Ralstonia) 속, 락토바실러스(Lactobacillus) 속, 류코노스톡(Leuconostoc) 속, 마이크로스포룸(Microsporum) 속, 모닐리엘라(Moniliella) 속으로 이루어지는 군에서 선택된 미생물 유래의 효소인 제조 방법.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효소원이, 칸디다 케피르(Candida kefyr), 칸디다 올레오필라(Candida oleophila), 칸디다 마리스(Candida maris), 게오트리쿰 에리엔스(Geotrichum eriense), 갈락토마이세스 리 엣시(Galactomyces reessii), 사카로마이콥시스 말랑가(Saccharomycopsis malanga), 아크로모박터 크실로속시단스(Achromobacter xylosoxidans), 아크로모박터 데니트리피칸스(Achromobacter denitrificans), 아트로박터 파라피네우스(Arthrobacter paraffineus), 아트로박터 니코티아나에(Arthrobacter nicotianae), 바실러스 아밀로리티쿠스(Bacillus amylolyticus), 바실러스 서큘런스(Bacillus circulans), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 바실러스 바디우스(Bacillus badius), 바실러스 스파에리쿠스(Bacillus sphaericus), 브레분디모나스 디미누타(Brevundimonas diminuta), 크산토모나스 에스피(Xanthomonas sp.), 데보시아 리보플라비나(Devosia riboflavina), 랄스토니아 유트로파(Ralstonia eutropha), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus), 류코노스톡 슈도메센테로이데스(Leuconostoc pseudomesenteroides), 마이크로스포룸 쿠케이(Microsporum cookei), 모닐리엘라 아세토아바텐스(Moniliella acetoabatens)로 이루어지는 군에서 선택된 미생물 유래의 효소인 제조 방법.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R1이 메틸기, 에틸기, 프로필기 또는 n-부틸기인 제조 방법.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R1이 메틸기인 제조 방법.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 R2가 페닐기, p-니트로페닐기 또는 p-클로로페닐기인 제조 방법.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 R2가 페닐기인 제조 방법.
  10. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 R1이 메틸기, R2가 페닐기인 제조 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 산화형 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NAD+), 산화형 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 인산(NADP+) 중 어느 하나 또는 둘 다를 각각의 환원형으로 환원하는 효소와, 환원하기 위한 기질을 공존시키는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
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