CN111979208B - 一种l-谷氨酸脱氢酶突变体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种L‑谷氨酸脱氢酶突变体，所述L‑谷氨酸脱氢酶突变体的序列为将SEQ ID NO.1所述序列的第175位氨基酸残基A突变为G，和，第386位氨基酸残基V突变为空间位阻更小的氨基酸残基后的序列。本发明还公开了该L‑氨基酸脱氢酶突变体在制备L‑草铵膦或其盐中的应用。本发明的L‑谷氨酸脱氢酶突变体制备L‑草铵膦或其盐时，与仅在175位或者仅在386突变的L‑谷氨酸脱氢酶突变体相比，比酶活更高，从而酶的作用效率提高，降低了反应的成本，利于工业化生产。

Description

一种L-谷氨酸脱氢酶突变体及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种L-谷氨酸脱氢酶突变体及其应用。
背景技术
草铵膦(2-氨基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸)是由赫斯特公司80年代开发的广谱触杀型除草剂。目前世界上的三大除草剂是草甘膦、草铵膦、百草枯，相对于草甘膦和百草枯，草铵膦具有优异的除草性能及较小的副作用。草铵膦有两种光学异构体，分别为D-草铵膦和L-草铵膦，但是只有L-草铵膦具有除草活性，因此发展L-草铵膦的方法对于提高原子经济性、降低使用成本、减轻环境压力具有重要意义。
目前，制备L-草铵膦的方法主要有手性拆分法，化学合成法和生物催化法。
手性拆分法如CN1053669C公开了利用奎宁生物碱作为拆分剂的方法，重结晶出L-草铵膦奎宁盐，然后用酸中和盐可以得到L-草铵膦。同时利用5-硝基水杨醛或3,5-二硝基水杨醛作为消旋化试剂消旋化未反应的D-草铵膦，得到DL-草铵膦，继续用于拆分反应。但是这种方法需要昂贵的手性拆分试剂，以及多步重结晶，操作繁琐，还不是一种理想的方法。
Figure BDA0002070053130000011
化学合成法如US6936444公开了钌催化剂不对称氢化2-乙酰氨基-4-(羟甲基氧膦基)-2-丁烯酸得到L-2-乙酰氨基-4-(羟甲基氧膦基)-2-丁酸，再经脱乙酰可以得到L-草铵膦。此方法需要昂贵的金属催化剂，成本较高，以及重金属残留，对环境污染严重。
Figure BDA0002070053130000021
相对于手性拆分法，化学合成法，生物催化法具有专一性强，反应条件温和等优点，是生产L-草铵膦的优势方法。
目前有US4389488(A)记载的用N-苯乙酰-DL-草铵膦为底物，来源于大肠杆菌的青霉素-G-酰基转移酶为催化剂，得到L-草铵膦的方法，但是苯乙酰草铵膦的合成成本比较高，且反应结束后得到L-草胺膦，N-苯乙酰-D-草铵膦和苯乙酸的混合溶液，需要采用强酸阳离子交换树脂分离出L-草铵膦，操作比较复杂。
Figure BDA0002070053130000022
EP0382113A记载了利用酰基转移酶对N-乙酰-草铵膦的羧酸酯进行催化裂解得到L-草铵膦的方法，但是此方法中的酶对游离的N-乙酰-草铵膦没有特异性，因此必须对N-乙酰-草铵膦进行酯化，增加了反应的步骤，且相应的增加了生产成本。
另有一部分是采用2-氧代-4-(羟基甲基氧膦基)丁酸(PPO)为底物，经转氨酶催化制备L-草铵膦的方法，其中US5221737A和EP0344683A记载了用谷氨酸作为氨基供体，自相应酮酸4-(羟甲基氧膦基)-2-氧代丁酸通过来源于大肠杆菌的氨基转氨酶作用得到L-草铵膦的方法，反应体系中需要等量或过量的氨基供体谷氨酸，使产物难以纯化。CN1284858C对上述方法进行了改进，采用天冬氨酸作为氨基供体，自相应的酮酸4-(羟甲基氧膦基)-2-氧代丁酸通过天冬氨酸转氨酶作用得到L-草铵膦的方法，此方法中天冬氨酸转变为草酰乙酸，而草酰乙酸在含水介质中不稳定，并自发的脱羧为丙酮酸，丙酮酸可通过酶促反应除去，使得逆反应不能进行，反应只需要等摩尔的氨基供体和氨基受体。但是使用转氨酶的方法中所用的氨基供体多为氨基酸，成本较高。
Figure BDA0002070053130000031
另外还有采用2-氧代-4-(羟基甲基氧膦基)丁酸(PPO)为底物，经氨基酸脱氢酶催化，制备L-草铵膦的方法，如CN106978453A，其采用无机氨基供体，使得产物分离简单，成本降低。但是CN106978453A中酶催化的底物浓度范围仅为10-100mM，酶的催化效率不高。
Figure BDA0002070053130000032
CN108588045A公开了多个谷氨酸脱氢酶突变体在制备L-草铵膦中的应用，发现来源于pseudomonas putida的谷氨酸脱氢酶(NCBI登录号：NP_742836.1)，将其167位丙氨酸突变为甘氨酸，或者将378位缬氨酸突变为丙氨酸，都提高了该酶对PPO的催化能力，继而研究了其它来源的谷氨酸脱氢酶的第167和378位同源位点的突变体，发现这样的突变体同样可以提高谷氨酸脱氢酶对PPO的催化能力；但是并没有对这些其它来源的谷氨酸脱氢酶的同源位点的突变体的组合突变进行研究。此外，虽然该专利申请中将pseudomonas putida的谷氨酸脱氢酶的这两个位点同时进行了突变，所得双突变体的酶活提高的倍数只是与单突变的突变体相当，并且由于生物领域的不可预见性，双突变位点的突变体的效果并不一定优于其各自的单突变的突变体。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是现有的L-谷氨酸脱氢酶在制备L-草铵膦或其盐时催化效率低等缺陷，因此本发明提供一种L-谷氨酸脱氢酶突变体以及其在制备L-草铵膦或其盐中的应用。利用本发明的L-谷氨酸脱氢酶突变体制备L-草铵膦或其盐时与单突变位点(175或386位)的谷氨酸脱氢酶突变体相比，比酶活更高，从而酶的作用效率提高，降低了反应的成本，利于工业化生产。
本发明所用的野生型L-谷氨酸脱氢酶来源是Lysinibacillus sphaericus的谷氨酸脱氢酶，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，Genbank登录号WP_012293812.1。现有技术中并没有将该谷氨酸脱氢酶同时进行两个位点的双突变，并且由于生物领域的不可预见性，双突变位点的突变体的效果并不一定优于其各自的单突变的突变体。而本发明人针对该底物2-氧代-4-(羟基甲基氧膦基)丁酸(PPO)对上述野生型酶的175位和386位进行了组合突变，意外发现当第175位氨基酸残基A突变为G，并且第386位氨基酸残基V突变为空间位阻更小的氨基酸残基后，所得的突变体对底物PPO的比酶活有明显提升。
本发明解决上述技术问题的技术方案之一是：一种L-谷氨酸脱氢酶突变体，所述L-谷氨酸脱氢酶突变体的序列为将如SEQ ID NO.1所述序列的第175位氨基酸残基A突变为G，和，第386位氨基酸残基V突变为空间位阻更小的氨基酸残基后的序列，所述L-谷氨酸脱氢酶突变体具有催化2-氧代-4-(羟基甲基氧膦基)丁酸或其盐的活性。
较佳地，所述L-谷氨酸脱氢酶突变体的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.7或SEQID NO.9所示。
较佳地，所述L-谷氨酸脱氢酶突变体的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.8或SEQID NO.10所示。
根据本发明，所述的空间位阻更小是指突变后的氨基酸残基和野生序列中氨基酸残基相比空间位阻更小。所述的氨基酸可以为修饰或未修饰的天然氨基酸；本发明以天然氨基酸为例。
本发明解决上述技术问题的技术方案之二是：一种分离的核酸，所述核酸编码上述的L-谷氨酸脱氢酶突变体。
较佳地，编码所述核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.10所示。
本发明解决上述技术问题的技术方案之三是：一种包含所述核酸的重组表达载体。
本发明解决上述技术问题的技术方案之四是：一种包含所述核酸或所述重组表达载体的转化体。
本发明解决上述技术问题的技术方案之五是：一种L-草铵膦盐的制备方法，其包括以下步骤：在反应溶剂、L-谷氨酸脱氢酶突变体、无机氨基供体和还原型辅酶NADPH(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)的存在下，将2-氧代-4-(羟基甲基氧膦基)丁酸盐进行氨化反应，即得L-草铵膦盐。
所述制备方法中，除L-谷氨酸脱氢酶突变体为本发明所得，其余原料、反应步骤及条件均可为本领域常规，具体可参见上述CN106978453A以及本申请人的申请号为CN201810162629.4的专利申请。
所述的L-草铵膦盐的制备方法还可进一步包括以下步骤：在D-氨基酸氧化酶(DAAO)的存在下，将D-草铵膦盐进行氧化反应，得到所述的2-氧代-4-(羟基甲基氧膦基)丁酸盐即可。
在所述的氧化反应中，所述的D-草铵膦盐的阳离子可为本领域常规的阳离子，例如铵离子、钠离子和/或钾离子等。又可为所使用的缓冲液的阳离子。
在所述的氧化反应中，所述的D-草铵膦盐可单独存在、或、与L-草铵膦盐共同存在(此时L-草铵膦盐可不发生反应)，例如：D型富集的草铵膦盐(即其中D型对映体的含量＞50％，乃至于纯D-草铵膦盐)、L型富集的草铵膦盐(即其中L-草铵膦的含量＞50％，不包括纯L-草铵膦盐的情况)或消旋体草铵膦盐等。
在所述的氧化反应中，所述的D氨基酸氧化酶(DAAO)的浓度可为本领域常规，较佳地为0.6-6U/mL，更佳地为1.8U/mL。
在所述的氧化反应中，所述D-草铵膦盐的浓度可为本领域常规，较佳地为100-600mM，更佳地为200mM。
所述的氧化反应还可在过氧化氢酶的存在下进行。
所述的氧化反应还可在通气的条件下进行。所述通气较佳地为通入空气或氧气。所述通气的速率较佳地为0.5-1VVM。
本发明中，所述空气可为本领域常规的空气，一般都是含有氧气的，所含氧气的含量也是本领域常规的。在反应时参与反应的是空气中的氧气。
当所述的氧化反应还可在通气的条件下进行时，所述的氧化反应还可在消泡剂的存在下进行。
在所述的氧化反应中，所述反应体系的pH较佳地为7-9，更佳地为8。所述的pH可通过使用缓冲液来实现。所述的pH还可通过使用碱(或碱溶液)调节来实现。所述的缓冲液较佳地为磷酸盐缓冲液或者Tris-HCl缓冲液，所述的磷酸盐缓冲液较佳地为磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液或者磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲液。所述的碱溶液较佳地为氨水。
在所述的氧化反应中，所述反应体系的温度可为本领域常规，较佳地为20-50℃，更佳地为20℃。
所述的氧化反应和所述的氨化反应可分开进行，也可同时(同一反应体系)进行。所述的同时进行例如：在D-氨基酸氧化酶(DAAO)、L-谷氨酸脱氢酶突变体、无机氨基供体和还原型辅酶NADPH的存在下，将D-草铵膦盐进行氧化反应和氨化反应，得到L-草铵膦盐即可。
在所述的氨化反应中，所述的L-草铵膦盐的阳离子可为本领域常规的阳离子，例如铵离子、钠离子和/或钾离子等。又可为所使用的缓冲液的阳离子。
在所述的氨化反应中，所述的2-氧代-4-(羟基甲基氧膦基)丁酸盐的阳离子可为本领域常规的阳离子，例如铵离子、钠离子和/或钾离子等。又可为所使用的缓冲液的阳离子。
在所述的氨化反应中，所述的L-谷氨酸脱氢酶突变体的用量可为本领域常规，所述L-谷氨酸脱氢酶突变体的浓度较佳地为0.05-2.3U/ml，更佳地为0.1-1U/ml，例如为0.23U/ml。
在所述的氨化反应中，所述的无机氨基供体的用量可为本领域常规，所述的无机氨基供体的浓度较佳地为100-2000mM，更佳地为200mM。
在所述的氨化反应中，所述的2-氧代-4-(羟基甲基氧膦基)丁酸盐的浓度较佳地为100-600mM，更佳地为200mM。
在所述的氨化反应中，所述的2-氧代-4-(羟基甲基氧膦基)丁酸盐的用量可为本领域常规，所述还原型辅酶NADPH与所述的2-氧代-4-(羟基甲基氧膦基)丁酸盐的质量比较佳地为1:100-1:20000，更佳地为1:1000-1:15000，进一步更佳地为1:5000。
在所述的氨化反应中，所述的无机氨基供体为氨气、硫酸铵、氯化铵、磷酸氢二铵、乙酸铵、甲酸铵和碳酸氢铵中的一种或多种。
在所述的氨化反应中，所述反应的温度可为本领域常规，为了保证所述的L-谷氨酸脱氢酶突变体的催化效率，进行所述氨化反应的温度较佳地为20-50℃，更佳地为37℃，当所述氨化反应的温度低于20℃时，氨化反应较慢；当所述氨化反应的温度高于50℃时，酶将不可逆变性失活。
在所述的氨化反应中，所述的反应溶剂为水。
在所述的制备方法中，进行所述氨化反应的pH较佳地为7-9，更佳地为8.5。所述的pH可通过使用缓冲液来实现。所述的pH还可通过使用碱(或碱溶液)调节来实现。所述的缓冲液较佳地为磷酸盐缓冲液或者Tris-HCl缓冲液等，所述的磷酸盐缓冲液较佳地为磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液或者磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲液等。所述的碱溶液较佳地为氨水。
所述的L-草铵膦盐的制备方法还包括以下步骤：在脱氢酶(例如葡萄糖脱氢酶、醇脱氢酶或甲酸脱氢酶等)以及供氢体(例如葡萄糖、异丙醇或甲酸盐等)的存在下，将氧化型辅酶NADP+进行还原反应，得到所述的还原型辅酶NADPH即可。
在所述的还原反应中，所述的脱氢酶与所述的供氢体一一对应，例如：
当所述的脱氢酶为醇脱氢酶时，所述的供氢体为异丙醇；
当所述的脱氢酶为葡萄糖脱氢酶时，所述的供氢体为葡萄糖；
当所述的脱氢酶为甲酸脱氢酶时，所述的供氢体为甲酸盐。
在所述的还原反应中，所述的脱氢酶的浓度可为本领域常规，较佳地为0.6-6U/mL，更佳地为2U/mL。
在所述的还原反应中，所述的供氢体的浓度可为本领域常规，较佳地为100-1000mM，更佳地为240mM。
在所述的还原反应中，所述的氧化型辅酶NADP+的浓度可为本领域常规。
在所述的还原反应中，进行所述还原反应的pH较佳地为7-9，更佳地为8.5。所述的pH可通过使用缓冲液来实现。所述的pH还可通过使用碱(或碱溶液)调节来实现。所述的缓冲液较佳地为磷酸盐缓冲液或者Tris-HCl缓冲液等，所述的磷酸盐缓冲液较佳地为磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液或者磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲液等。所述的碱溶液较佳地为氨水。
在所述的还原反应中，所述反应体系的温度可为本领域常规，较佳地为20-50℃，更佳地为37℃。
所述的还原反应和所述的氨化反应可分开进行，也可同时(同一反应体系)进行。所述的同时进行例如本发明较佳实施例中所示：在葡萄糖脱氢酶、葡萄糖、氧化型辅酶NADP+、L-谷氨酸脱氢酶突变体、无机氨基供体的存在下，将2-氧代-4-(羟基甲基氧膦基)丁酸盐进行氨化反应(同时存在着的NADP+的还原反应)，得到L-草铵膦盐即可。
当所述的还原反应和所述的氨化反应同时进行时，所述的氨化反应所用的NADPH可通过所述的还原反应循环生成。所述的氧化型辅酶NADP+的浓度可为本领域常规，为保证所述反应能够正常进行，其与所述的2-氧代-4-(羟基甲基氧膦基)丁酸盐的质量比为1:100-1:20000，较佳地为1:1000-1:15000，更佳地为1:5000。
所述的还原反应、所述的氧化反应和所述的氨化反应可分开进行，也可同时(同一反应体系)进行。所述的同时进行例如本发明较佳实施例中所示：在D-氨基酸氧化酶(DAAO)、脱氢酶、氢供体、氧化型辅酶NADP+、L-谷氨酸脱氢酶突变体、无机氨基供体的存在下，将D-草铵膦盐进行氧化反应和氨化反应(同时存在着的NADP+的还原反应)，得到L-草铵膦盐即可。
当所述的还原反应、所述的氧化反应和所述的氨化反应同时进行时，所述的氨化反应所用的NADPH可通过所述的还原反应循环生成。所述的氧化型辅酶NADP+的浓度可为本领域常规，为保证所述反应能够正常进行，NADP+与所述的2-氧代-4-(羟基甲基氧膦基)丁酸盐的质量比为1:100-1:20000，较佳地为1:1000-1:15000，更佳地为1:5000。
所述制备方法的反应时间在用常规方法进行检测的情况下，以原料的终浓度或产物的终浓度或转化率达到所需目的即可停止；所述常规方法包括柱前衍生化高效液相色谱或离子对色谱等。
本发明解决上述技术问题的技术方案之六是：一种L-草铵膦的制备方法，其包括下述步骤：
(1)按照上述的L-草铵膦盐的制备方法，制得L-草铵膦盐；
(2)将步骤(1)制得的L-草铵膦盐进行酸化反应，得到L-草铵膦。
本发明解决上述技术问题的技术方案之七是：一种上述制得的L-谷氨酸脱氢酶突变体在制备L-草铵膦或其盐中的应用。
所述的应用可包括以下步骤：在L-氨基酸脱氢酶、无机氨基供体和还原型辅酶的存在下，将2-氧代-4-(羟基甲基氧膦基)丁酸盐进行反应，即得L-草铵膦盐。
或者，所述的应用可包括以下步骤：在L-氨基酸脱氢酶、无机氨基供体和还原型辅酶的存在下，将2-氧代-4-(羟基甲基氧膦基)丁酸进行反应，即得L-草铵膦。
或者，所述的应用可包括以下步骤：在L-氨基酸脱氢酶、无机氨基供体和还原型辅酶的存在下，将2-氧代-4-(羟基甲基氧膦基)丁酸盐进行反应，即得L-草铵膦盐，再进行酸化反应，得到L-草铵膦。
本发明中，所述L-草铵膦盐一般可以是以L-草铵膦铵盐的形式存在。
以上化合物所述浓度若无特殊说明，均为反应前所述化合物占整个反应体系的浓度。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
本发明的L-谷氨酸脱氢酶突变体制备L-草铵膦或其盐时与单突变位点(第175位或者第386位)的谷氨酸脱氢酶突变体相比，比酶活更高，从而酶的作用效率提高(例如参与反应时的转化率更高、立体选择性更强)，降低了反应的成本，利于工业化生产。
附图说明
图1：外消旋草铵膦标准品的Marfey试剂柱前衍生化HPLC分析结果，其中最后两个峰是Marfey试剂自身的峰。
图2：制备所得产物中D-草铵膦与L-草铵膦的Marfey试剂柱前衍生化HPLC分析结果。
图3：外消旋草铵膦标准品的离子对HPLC分析结果。
图4：PPO标准品离子对HPLC分析结果。
图5：反应完后反应液的离子对HPLC分析结果。
图6：PPO标准品的质谱图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
本发明中的实验方法如无特别说明均为常规方法，基因克隆操作具体可参加J.萨姆布鲁克等编的《分子克隆实验指南》。
本发明中的氨基酸简写符号如无特殊说明均为本领域常规，具体简写符号对应的氨基酸如表1所示。
表1
氨基酸名称 三字母符号 单字母符号 氨基酸名称 三字母符号 单字母符号
丙氨酸(alanine) Ala A 亮氨酸(leucine) Leu L
精氨酸(arginine) Arg R 赖氨酸(lysine) Lys K
天冬酰胺(asparagine) Asn N 甲硫氨酸(methionine) Met M
天冬氨酸(aspartic acid) Asp D 笨丙氨酸(phenylalanine) Phe F
半胱氨酸(cysteine) Cys C 脯氨酸(proline) Pro P
谷氨酰胺(glutanine) Gln Q 丝胺酸(serine) Ser S
谷氨酸(glutamic acid) Glu E 苏氨酸(threonine) Thr T
甘氨酸(Glicine) Gly G 色氨酸(tryptophan) Trp W
组氨酸(histidine) His H 酪氨酸(tyrosine) Tyr Y
异亮氨酸(isoleucine) Ile I 颉氨酸(valine) Val V
所述氨基酸对应的密码子也为本领域常规，具体氨基酸与密码子的对应关系如表2所示。
表2
Figure BDA0002070053130000111
pET28a购买自Novagen公司；NdeI酶、HindIII酶购买自Thermo Fisher公司，E.coli BL21(DE3)感受态细胞购买自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；过氧化氢酶购买自山东丰泰生物科技有限公司；NADPH购买自深圳邦泰生物工程有限公司；NH4Cl购买自上海泰坦科技股份有限。
产物的手性分析通过柱前衍生化高效液相色谱(High Performance LiquidChromatography，HPLC)进行，具体的分析方法为：
(1)色谱条件：Agilent ZORBAX Eclipse plus C18，3.5μm，150*4.6mm。流动相A：0.1％TFA+H2O，流动相B：0.1％TFA+CAN。检测波长：340nm，流速：1.0mL/min，柱温：30℃。
(2)衍生化试剂：Marfey试剂。准确称取50mg的N-α-(2,4-二硝基-5-氟苯基)-L-丙氨酰胺，用乙腈溶解配置成25ml溶液，备用。
(3)衍生反应：取反应液稀释100倍，加等体积的Marfey试剂衍生。进样10μl进行分析。
转化率＝(反应物-剩余反应物)/反应物×100％
2-氧代-4-(羟基甲基氧膦基)丁酸(简称PPO)通过离子对高效液相色谱(HighPerformance Liquid Chromatography，HPLC)分析，具体的分析方法为：
色谱条件：ULtimate AQ-C18，5μm，4.6*250mm；流动相：0.05mol/L磷酸氢二铵PH＝3.6:10％四丁基氢氧化铵水溶液：乙腈＝91:1:8；检测波长：205nm；流速：1.0ml/min；柱温：25℃。
以下实施例中，所述均为“草铵膦”，但由于“草铵膦”是在反应体系中，技术人员默认将“草铵膦铵盐”称为“草铵膦”，因此实则“草铵膦”是指“草铵膦铵盐”，相应的草铵膦标准品也均是指草铵膦铵盐标准品，相应的生成的PPO也即是PPO铵盐。在检测所得产物草铵膦的旋光度时，则是将草铵膦铵盐进行酸化反应后，得到草铵膦再进行的检测。
实施例1 L-谷氨酸脱氢酶突变体酶的获得
从NCBI检索到来源于Lysinibacillus sphaericus的谷氨酸脱氢酶(以下简称为LsGluDH)序列SEQ ID NO.1，Genbank登录号WP_012293812.1，根据表3中突变体基因的核苷酸序列SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.6，SEQ ID NO.8，SEQ ID NO.10合成基因，基因合成公司为苏州金唯智生物科技有限公司(苏州工业园区星湖街218号生物纳米科技园C3楼)。
然后将突变体基因分别酶连pET28a，酶切位点NdeI&HindIII，将酶连好的载体，转化宿主大肠杆菌BL21感受态细胞。将构建好的菌种接种TB培养基于37℃下，200rpm摇床，IPTG浓度0.1mM诱导过夜，收菌，得到含有谷氨酸脱氢酶基因的工程菌。
将含有谷氨酸脱氢酶基因的工程菌在经平皿划线活化后，挑单菌落接种至含50μg/ml卡那霉素的5ml LB液体培养基中，37℃震荡培养12h。按2％接种量转接至150ml同样含50μg/ml卡那霉素的新鲜LB液体培养基中，37℃震荡至OD600达到0.8左右时，加入IPTG至其终浓度为0.5mM，18℃诱导培养16h。培养结束后，将培养液10000rpm离心10min，弃上清液，收集菌体，置于-80℃超低温冰箱中保存，待用。
将上述收集到的菌体5g，用50mM pH8.5的Tris-HCl缓冲液洗涤两次，之后重悬于30mL pH8.5的Tris-HCl缓冲液中，均质破碎，破碎液12000rpm离心10min去除沉淀，得到含重组谷氨酸脱氢酶的上清液粗酶液。
表3
Figure BDA0002070053130000131
实施例2突变体酶的比酶活检测
底物溶液配置：加入355μL 2.25M PPO(终浓度20mM)(为发明人自制，制备方法参考文献US8017797B，图6为其对应的质谱图)与0.4g NH4Cl(终浓度200mM)，氨水调pH至8.5，用50mM pH8.5的Tris-HCl缓冲液定容至40ml。
酶活检测方法：
反应总体系为1ml，OD340nm处测定吸光值，依次在1ml比色皿中加入940μL底物溶液，调零，然后加入10μL 25mM NADPH，最后加入50μl粗酶液，记录0-10min的数值变化，每隔30s取一个值，以反应时间为横坐标，340nm波长处吸收值为纵坐标做曲线，取斜率，计算NADPH的减少速率，并计算酶活。
单位酶活的定义：在特定反应条件(30℃)下，每分钟减少1μmol NADPH所需要的酶量。
比酶活为每毫克酶蛋白所含的活力单位，计算公式：酶活/蛋白含量，单位是U/mg或U/g。结果如表4所示。
从CN108588045A中可以得知野生型LsGluDH-WT(WP_012293812.1)的酶活比单位点突变体的酶活低很多，本领域技术人员能够得出野生型LsGluDH-WT(WP_012293812.1)的比酶活也比突变体低很多，故本发明中未对野生型LsGluDH-WT(WP_012293812.1)进行检测。
表4
Figure BDA0002070053130000141
Figure BDA0002070053130000151
以下实施例中所用到的L-谷氨酸脱氢酶粗酶液的制备方法均采用上述方法。
实施例3 D氨基酸氧化酶(DAAO)基因的获取
根据专利US9834802B2中记载的AC302DAAO酶的基因序列全合成DAAO酶基因。合成公司为苏州金唯智生物科技有限公司，江苏省南京市江北新区研创园浦滨路211号。
实施例4 D氨基酸氧化酶(DAAO)基因的表达
LB液体培养基组成：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，用去离子水溶解后定容，121℃灭菌20min，待用。
将实施例3合成的DAAO酶基因连pET28a，酶切位点NdeI&HindIII，将酶连好的载体转化至宿主E.coli BL21(DE3)感受态细胞，得到含有DAAO酶的工程菌株。
将含有DAAO酶基因的工程菌株在经平皿划线活化后，挑单菌落接种至含50μg/ml卡那霉素的5ml LB液体培养基中，37℃震荡培养12h。按2％接种量转接至50ml同样含50μg/ml卡那霉素的新鲜LB液体培养基中，37℃震荡至OD600值达到0.8左右时，加入IPTG至其终浓度为0.5mM，18℃诱导培养16h。培养结束后，将培养液10000rpm离心10min，弃上清液，收集菌体，置于-20℃超低温冰箱中保存，待用。
实施例5 D氨基酸氧化酶(DAAO)粗酶液的制备及酶活测定
将实施例4中收集到的菌体，用50mM pH 8.0磷酸缓冲液洗涤菌体两次，之后将菌体重悬于pH 8.0的磷酸缓冲液中，低温高压均质破碎，破碎液离心去除沉淀，得到的上清液为含重组DAAO酶粗酶液。
酶活检测方法：100μL pH 8.0磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(含D-草铵膦50mmol/L和过氧化物酶0.1mg/mL)，加入50μL显示剂(60μg/mL 2,4,6-三溴-3-羟基苯甲酸和1mg/mL 4-氨基安替比林)，50μL的DAAO酶，510nm处检测紫外吸收测定H2O2浓度，计算出PPO的浓度，并计算酶活。
单位酶活的定义：在特定反应条件(30℃)下，每分钟生成1μmol PPO所需要的酶量。
以下实施例中所用到的DAAO酶粗酶液的制备方法均采用以上方法。
实施例6醇脱氢酶基因的获取和表达
根据来源于枯草芽胞杆菌(Lactobacillus brevis KB290)(Genbank登录号为BAN05992.1)的Cyclopentanol dehydrogenase基因序列，全合成醇脱氢酶基因。
LB液体培养基组成：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，用去离子水溶解后定容，121℃灭菌20min，待用。
醇脱氢酶基因连pET28a，酶切位点NdeI&HindIII，将酶连好的载体转化至宿主E.coli BL21(DE3)感受态细胞，得到含有醇脱氢酶基因的工程菌株。将含有醇脱氢酶基因的工程菌在经平皿划线活化后，挑单菌落接种至含50μg/ml卡那霉素的5ml LB液体培养基中，37℃震荡培养12h。按2％接种量转接至50ml同样含50μg/ml卡那霉素的新鲜LB液体培养基中，37℃震荡至OD600达到0.8左右时，加入IPTG至其终浓度为0.5mM，18℃诱导培养16h。培养结束后，将培养液10000rpm离心10min，弃上清液，收集菌体，置于-20℃超低温冰箱中保存，待用。
实施例7醇脱氢酶粗酶液的制备及酶活测定
将实施例6中收集到的菌体，取10g菌泥加50ml 100mM pH7.5磷酸铵缓冲液，搅匀，500bar均质破碎，作为粗酶液，在搅拌条件下滴加10％的絮凝剂(终浓度2-2.5‰)，搅拌5min后，4000rpm离心10min得澄清酶液，取上清测酶活。
酶活检测方法：3ml反应体系，25℃条件下，先加2850μL pH8.0的400mM异丙醇(100mM磷酸缓冲液配制)，再加50μL NADP+(25mM)，紫外分光光度计调零，再加100μL稀释100倍的酶液，紫外分光光度计测定340nm处OD值。
单位酶活定义：在特定反应条件(25℃，pH 7.0)下，每分钟产生1μmolNADPH所需要的酶量，定义为1U。
以下实施例中所用到的醇脱氢酶粗酶液的制备方法均采用以上方法。
实施例8 DAAO酶和L-谷氨酸脱氢酶突变体催化制备L-草铵膦
200g L-谷氨酸脱氢酶突变体菌体(根据实施例1制备得到)用pH为8.0的50mM磷酸盐缓冲液重悬，定容至1L，低温高压均质破碎，离心弃沉淀，留上清，得L-谷氨酸脱氢酶突变体粗酶液。
称取D,L-草铵膦80g，用50mM pH为8.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液完全溶解，加入2.5g 40万U/g的过氧化氢酶，加入150mL根据实施例5方法制备的DAAO酶粗酶液(12U/mL)，氨水调节pH为8.0，50mM pH为8.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液定容至1L。20℃水浴锅中机械搅拌反应，按照1VVM通入空气(每分钟通入1倍反应体积的空气)，加入1mL消泡剂防止起泡，利用离子对HPLC检测PPO的生成浓度，同时利用柱前衍生化高效液相色谱检测剩余L-草铵膦的量和ee值，当ee值大于99％时停止反应。
取4等份50mL上述反应液，分别加入氯化铵0.54g，NADP+0.4mg和异丙醇0.73g，加入1mL实施例7方法制备的醇脱氢酶(300U/mL)，分别加入L-谷氨酸脱氢酶突变体粗酶液1mL，氨水调节pH至8.5，水浴锅磁力搅拌控制反应温度37℃，利用离子对HPLC检测PPO的残余浓度，同时利用柱前衍生化高效液相色谱检测体系中L-草铵膦的量和ee值。反应结束数据表5所示。
反应完后(18h)产物中D-草铵膦与L-草铵膦的HPLC分析结果见图2(附图中均以L-谷氨酸脱氢酶突变体1-4(LsGluDH-A166G-V376A)为例进行说明)，其中，保留时间为13.820min的为L-草铵膦，保留时间为12.469min的D-草铵膦几乎检测不到；外消旋草铵膦标准品(购买自上海阿拉丁生化科技股份有限公司)的Marfey试剂柱前衍生HPLC图谱如图1所示(L-草铵膦的保留时间为13.683min，D-草铵膦的保留时间为12.016min)。该实施例所制备得到的产物的成分与标准品中L-草铵膦的出峰时间基本一致。另外，对得到的产品经酸化处理，浓缩，柱纯化，重结晶得到纯的L-草铵膦，经旋光度测定[a]D25＝+28.2°(C＝1,1NHCl)(现有技术中US4389488已有L-草铵膦旋光度的记载)，说明该实施例制备得到L-草铵膦。
反应完后(18h)反应液的离子对HPLC分析结果见图5，其中，PPO的出峰位置无出峰，3.828min为草铵膦的出峰位置。PPO标准品(本标准品为发明人自制，制备方法参考文献US8017797B，图6为其对应的质谱图)的离子对HPLC图谱如图4所示，其中，PPO标准品的保留时间为9.520min。外消旋草铵膦标准品(购买自上海阿拉丁生化科技股份有限公司)的离子对HPLC图谱如图3所示，其中，外消旋草铵膦标准品的保留时间为3.829min。可见，该实施例中PPO最终被反应转化完全，其产物草铵膦的出峰时间与标准品的出峰时间基本一致。
虽然上述结果图均以L-谷氨酸脱氢酶突变体1-4(LsGluDH-A166G-V376A)为例，但是发明人进行了所有其他突变的实验，也均验证了本发明的这些突变在参与上述反应时能够催化底物，并且均生成了正确的产物。
表5
Figure BDA0002070053130000181
Figure BDA0002070053130000191
对比例：
采用与实施例1同样的方法，获得CN108588045A中公开的Pseudomonas putida(Genbank登录号：NP_742836.1)谷氨酸脱氢酶(以下简称为PpGluDH)的突变体酶，并按实施例2中所述的方法测定比酶活，结果如表6所示：
表6
Figure BDA0002070053130000192
由表6可见，Pseudomonas putida来源的谷氨酸脱氢酶在其同源位点进行突变的突变体的比酶活显著低于本发明所得突变体，并且可见，并不是所有的双位点突变体的效果都比单突变的突变体的效果好。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海弈柯莱生物医药科技有限公司
<120> 一种L-谷氨酸脱氢酶突变体及其应用
<130> P19010451C
<160> 18
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 457
<212> PRT
<213> Lysinibacillus sphaericus
<400> 1
Met Thr Ile Thr Thr Val Ser Asn Glu Gln Leu Ala Lys Glu Tyr Val
1 5 10 15
Asp Gly Val Phe Glu Gln Leu Lys Gln Gln Asn Cys His Gln Ala Glu
20 25 30
Phe Leu Gln Ala Ala Glu Glu Ile Phe Ile Ser Leu Val Pro Val Phe
35 40 45
Val Gln His Pro Glu Tyr Ile Lys Ala Asn Ile Leu Ser Arg Ile Val
50 55 60
Glu Pro Asp Arg Ile Ile Ser Phe Arg Val Ala Trp Gln Asp Asp His
65 70 75 80
Asn Gln Val Gln Val Asn Arg Gly Tyr Arg Val Gln Tyr Ser Asn Val
85 90 95
Met Gly Pro Tyr Lys Gly Gly Leu Arg Phe His Pro Ser Val Asn Glu
100 105 110
Ser Ile Ile Lys Phe Leu Gly Phe Glu Gln Ile Phe Lys Asn Ala Leu
115 120 125
Thr Gly Gln Pro Ile Gly Gly Gly Lys Gly Gly Ser Asn Phe Asp Pro
130 135 140
Lys Gly Lys Ser Asp Ser Glu Ile Met Arg Phe Cys Gln Ala Phe Met
145 150 155 160
Thr Glu Leu Tyr Arg His Ile Gly Pro Asp Val Asp Val Pro Ala Gly
165 170 175
Asp Ile Gly Val Gly Ala Arg Glu Val Gly Tyr Leu Trp Gly Gln Tyr
180 185 190
Lys Arg Leu Thr Lys Ala Ser Glu Ser Gly Val Leu Thr Gly Lys Thr
195 200 205
Pro Gly Tyr Gly Gly Ser Leu Ala Arg Lys Glu Ala Thr Gly Tyr Gly
210 215 220
Thr Val Tyr Phe Val Asn Glu Met Leu Lys Asp Val Asn Asp Ser Phe
225 230 235 240
Glu Gly Lys Thr Val Val Val Ser Gly Ser Gly Asn Val Ser Thr Tyr
245 250 255
Ala Ile Glu Lys Ala Gln Gln Tyr Gly Ala Lys Val Val Ala Cys Ser
260 265 270
Asp Ser Ser Gly Tyr Ile Tyr Asp Pro Glu Gly Leu Asp Leu Asp Val
275 280 285
Ile Lys Glu Ile Lys Glu Val Lys Gly Asp Arg Ile Ser Thr Tyr Val
290 295 300
Ser Tyr Arg Pro Asn Ala Thr Phe Thr Asn Gly Cys Thr Gly Ile Trp
305 310 315 320
Thr Ile Pro Cys Asp Ile Ala Leu Pro Cys Ala Thr Gln Asn Glu Ile
325 330 335
Asn Gly Glu Ser Ala Arg Thr Leu Ile Ser Asn Gly Val Lys Ala Ile
340 345 350
Gly Glu Gly Ala Asn Met Pro Ser Asp Leu Glu Ala Ile Asn Glu Phe
355 360 365
Leu Asn Ala Gly Val Leu Phe Gly Pro Ala Lys Ala Ala Asn Ala Gly
370 375 380
Gly Val Ala Val Ser Ala Leu Glu Met Ala Gln Asp Ser Ser Arg Val
385 390 395 400
Phe Trp Ser Phe Glu Glu Val Asp Ala Lys Leu His Gln Ile Met Lys
405 410 415
Asp Ile Tyr Ser Asp Ser Lys Ala Ala Ala Glu Lys Tyr Gly Phe Pro
420 425 430
Gly Asn Leu Val Met Gly Ala Asn Ile Ala Gly Phe Ile Lys Val Ala
435 440 445
Asp Gly Met Leu Thr Glu Gly Ile Tyr
450 455
<210> 2
<211> 1371
<212> DNA
<213> Lysinibacillus sphaericus
<400> 2
atgaccatca ccaccgtttc taacgaacag ctggctaaag aatacgttga cggtgttttc 60
gaacagctga aacagcagaa ctgccaccag gctgaattcc tgcaggctgc tgaagaaatc 120
ttcatctctc tggttccggt tttcgttcag cacccggaat acatcaaagc taacatcctg 180
tctcgtatcg ttgaaccgga ccgtatcatc tctttccgtg ttgcttggca ggacgaccac 240
aaccaggttc aggttaaccg tggttaccgt gttcagtact ctaacgttat gggtccgtac 300
aaaggtggtc tgcgtttcca cccgtctgtt aacgaatcta tcatcaaatt cctgggtttc 360
gaacagatct tcaaaaacgc tctgaccggt cagccgatcg gtggtggtaa aggtggttct 420
aacttcgacc cgaaaggtaa atctgactct gaaatcatgc gtttctgcca ggctttcatg 480
accgaactgt accgtcacat cggtccggac gttgacgttc cggctggtga catcggtgtt 540
ggtgctcgtg aagttggtta cctgtggggt cagtacaaac gtctgaccaa agcttctgaa 600
tctggtgttc tgaccggtaa aaccccgggt tacggtggtt ctctggctcg taaagaagct 660
accggttacg gtaccgttta cttcgttaac gaaatgctga aagacgttaa cgactctttc 720
gaaggtaaaa ccgttgttgt ttctggttct ggtaacgttt ctacctacgc tatcgaaaaa 780
gctcagcagt acggtgctaa agttgttgct tgctctgact cttctggtta catctacgac 840
ccggaaggtc tggacctgga cgttatcaaa gaaatcaaag aagttaaagg tgaccgtatc 900
tctacctacg tttcttaccg tccgaacgct accttcacca acggttgcac cggtatctgg 960
accatcccgt gcgacatcgc tctgccgtgc gctacccaga acgaaatcaa cggtgaatct 1020
gctcgtaccc tgatctctaa cggtgttaaa gctatcggtg aaggtgctaa catgccgtct 1080
gacctggaag ctatcaacga attcctgaac gctggtgttc tgttcggtcc ggctaaagct 1140
gctaacgctg gtggtgttgc tgtttctgct ctggaaatgg ctcaggactc ttctcgtgtt 1200
ttctggtctt tcgaagaagt tgacgctaaa ctgcaccaga tcatgaaaga catctactct 1260
gactctaaag ctgctgctga aaaatacggt ttcccgggta acctggttat gggtgctaac 1320
atcgctggtt tcatcaaagt tgctgacggt atgctgaccg aaggtatcta c 1371
<210> 3
<211> 457
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LsGluDH-A175G
<400> 3
Met Thr Ile Thr Thr Val Ser Asn Glu Gln Leu Ala Lys Glu Tyr Val
1 5 10 15
Asp Gly Val Phe Glu Gln Leu Lys Gln Gln Asn Cys His Gln Ala Glu
20 25 30
Phe Leu Gln Ala Ala Glu Glu Ile Phe Ile Ser Leu Val Pro Val Phe
35 40 45
Val Gln His Pro Glu Tyr Ile Lys Ala Asn Ile Leu Ser Arg Ile Val
50 55 60
Glu Pro Asp Arg Ile Ile Ser Phe Arg Val Ala Trp Gln Asp Asp His
65 70 75 80
Asn Gln Val Gln Val Asn Arg Gly Tyr Arg Val Gln Tyr Ser Asn Val
85 90 95
Met Gly Pro Tyr Lys Gly Gly Leu Arg Phe His Pro Ser Val Asn Glu
100 105 110
Ser Ile Ile Lys Phe Leu Gly Phe Glu Gln Ile Phe Lys Asn Ala Leu
115 120 125
Thr Gly Gln Pro Ile Gly Gly Gly Lys Gly Gly Ser Asn Phe Asp Pro
130 135 140
Lys Gly Lys Ser Asp Ser Glu Ile Met Arg Phe Cys Gln Ala Phe Met
145 150 155 160
Thr Glu Leu Tyr Arg His Ile Gly Pro Asp Val Asp Val Pro Gly Gly
165 170 175
Asp Ile Gly Val Gly Ala Arg Glu Val Gly Tyr Leu Trp Gly Gln Tyr
180 185 190
Lys Arg Leu Thr Lys Ala Ser Glu Ser Gly Val Leu Thr Gly Lys Thr
195 200 205
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acctctctgc cgatgggtgg tggtaaaggt ggttctgact tcgacccgaa aggtaaatct 420
gacgctgaag ttatgcgttt ctgccaggct ttcatgtctg aactgtaccg tcacatcggt 480
gctgactgcg acgttccggc tggtgacatc ggtgttggtg ctcgtgaaat cggtttcatg 540
ttcggtcagt acaaacgtct ggctaaccag ttcacctctg ttctgaccgg taaaggtatg 600
acctacggtg gttctctgat ccgtccggaa gctaccggtt acggttgcgt ttacttcgct 660
gaagaaatgc tgaaacgtca ggacaaacgt atcgacggtc gtcgtgttgc tgtttctggt 720
tctggtaacg ttgctcagta cgctgctcgt aaagttatgg acctgggtgg taaagttatc 780
tctctgtctg actctgaagg taccctgtac gctgaagctg gtctgaccga cgctcagtgg 840
gacgctctga tggaactgaa aaacgttaaa cgtggtcgta tctctgaact ggctggtcag 900
ttcggtctgg aattccgtaa aggtcagacc ccgtggtctc tgccgtgcga catcgctctg 960
ccgtgcgcta cccagaacga actgggtgct gaagacgctc gtaccctgct gcgtaacggt 1020
tgcatctgcg ttgctgaagg tgctaacatg ccgaccaccc tggaagctgt tgacatcttc 1080
ctggacgctg gtatcctgta cgctccgggt aaagcttcta acgctggtgg tgttgctgtt 1140
tctggtctgg aaatgtctca gaacgctatg cgtctgctgt ggaccgctgg tgaagttgac 1200
tctaaactgc acaacatcat gcagtctatc caccacgctt gcgttcacta cggtgaagaa 1260
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gacgctatgc tggctcaggg tgttgtt 1347
<210> 13
<211> 449
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PpGluDH-A167G
<400> 13
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Gln Arg Asp Pro Gly Gln Pro Glu Phe His Gln Ala Val Glu Glu Val
20 25 30
Leu Arg Thr Leu Trp Pro Phe Leu Glu Ala Asn Pro His Tyr Leu Gln
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Ser Gly Ile Leu Glu Arg Met Val Glu Pro Glu Arg Ala Val Leu Phe
50 55 60
Arg Val Ser Trp Val Asp Asp Gln Gly Lys Val Gln Val Asn Arg Gly
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Tyr Arg Ile Gln Met Ser Ser Ala Ile Gly Pro Tyr Lys Gly Gly Leu
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Arg Phe His Pro Ser Val Asn Leu Ser Val Leu Lys Phe Leu Ala Phe
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Glu Gln Val Phe Lys Asn Ser Leu Thr Ser Leu Pro Met Gly Gly Gly
115 120 125
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130 135 140
Met Arg Phe Cys Gln Ala Phe Met Ser Glu Leu Tyr Arg His Ile Gly
145 150 155 160
Ala Asp Cys Asp Val Pro Gly Gly Asp Ile Gly Val Gly Ala Arg Glu
165 170 175
Ile Gly Phe Met Phe Gly Gln Tyr Lys Arg Leu Ala Asn Gln Phe Thr
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Gly Lys Val Ile Ser Leu Ser Asp Ser Glu Gly Thr Leu Tyr Ala Glu
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Leu Arg Asn Gly Cys Ile Cys Val Ala Glu Gly Ala Asn Met Pro Thr
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Thr Leu Glu Ala Val Asp Ile Phe Leu Asp Ala Gly Ile Leu Tyr Ala
355 360 365
Pro Gly Lys Ala Ser Asn Ala Gly Gly Val Ala Val Ser Gly Leu Glu
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385 390 395 400
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405 410 415
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Ile Ala Gly Phe Val Lys Val Ala Asp Ala Met Leu Ala Gln Gly Val
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Val
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> PpGluDH-A167G
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atgtctacca tgatcgaatc tgttgacaac ttcctggctc gtctgaaaca gcgtgacccg 60
ggtcagccgg aattccacca ggctgttgaa gaagttctgc gtaccctgtg gccgttcctg 120
gaagctaacc cgcactacct gcagtctggt atcctggaac gtatggttga accggaacgt 180
gctgttctgt tccgtgtttc ttgggttgac gaccagggta aagttcaggt taaccgtggt 240
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gaagaaatgc tgaaacgtca ggacaaacgt atcgacggtc gtcgtgttgc tgtttctggt 720
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tctctgtctg actctgaagg taccctgtac gctgaagctg gtctgaccga cgctcagtgg 840
gacgctctga tggaactgaa aaacgttaaa cgtggtcgta tctctgaact ggctggtcag 900
ttcggtctgg aattccgtaa aggtcagacc ccgtggtctc tgccgtgcga catcgctctg 960
ccgtgcgcta cccagaacga actgggtgct gaagacgctc gtaccctgct gcgtaacggt 1020
tgcatctgcg ttgctgaagg tgctaacatg ccgaccaccc tggaagctgt tgacatcttc 1080
ctggacgctg gtatcctgta cgctccgggt aaagcttcta acgctggtgg tgttgctgtt 1140
tctggtctgg aaatgtctca gaacgctatg cgtctgctgt ggaccgctgg tgaagttgac 1200
tctaaactgc acaacatcat gcagtctatc caccacgctt gcgttcacta cggtgaagaa 1260
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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Ser Gly Ile Leu Glu Arg Met Val Glu Pro Glu Arg Ala Val Leu Phe
50 55 60
Arg Val Ser Trp Val Asp Asp Gln Gly Lys Val Gln Val Asn Arg Gly
65 70 75 80
Tyr Arg Ile Gln Met Ser Ser Ala Ile Gly Pro Tyr Lys Gly Gly Leu
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Arg Phe His Pro Ser Val Asn Leu Ser Val Leu Lys Phe Leu Ala Phe
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Glu Gln Val Phe Lys Asn Ser Leu Thr Ser Leu Pro Met Gly Gly Gly
115 120 125
Lys Gly Gly Ser Asp Phe Asp Pro Lys Gly Lys Ser Asp Ala Glu Val
130 135 140
Met Arg Phe Cys Gln Ala Phe Met Ser Glu Leu Tyr Arg His Ile Gly
145 150 155 160
Ala Asp Cys Asp Val Pro Ala Gly Asp Ile Gly Val Gly Ala Arg Glu
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Ile Gly Phe Met Phe Gly Gln Tyr Lys Arg Leu Ala Asn Gln Phe Thr
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210 215 220
Lys Arg Gln Asp Lys Arg Ile Asp Gly Arg Arg Val Ala Val Ser Gly
225 230 235 240
Ser Gly Asn Val Ala Gln Tyr Ala Ala Arg Lys Val Met Asp Leu Gly
245 250 255
Gly Lys Val Ile Ser Leu Ser Asp Ser Glu Gly Thr Leu Tyr Ala Glu
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420 425 430
Ile Ala Gly Phe Val Lys Val Ala Asp Ala Met Leu Ala Gln Gly Val
435 440 445
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Thr Leu Glu Ala Val Asp Ile Phe Leu Asp Ala Gly Ile Leu Tyr Ala
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Val
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Claims (19)

1.一种L-谷氨酸脱氢酶突变体，其特征在于，所述L-谷氨酸脱氢酶突变体的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO. 7或SEQ ID NO. 9所示。
2.一种分离的核酸，其特征在于，所述核酸编码如权利要求1所述的L-谷氨酸脱氢酶突变体。
3.一种包含如权利要求2所述的核酸的重组表达载体。
4.一种包含如权利要求2所述的核酸或如权利要求3所述的重组表达载体的转化体。
5.一种L-草铵膦盐的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：在反应溶剂、L-谷氨酸脱氢酶突变体、无机氨基供体和还原型辅酶NADPH的存在下，将2-氧代-4-（羟基甲基氧膦基）丁酸盐进行氨化反应，即得L-草铵膦盐；其中，所述L-谷氨酸脱氢酶突变体为如权利要求1所述的L-谷氨酸脱氢酶突变体。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述的制备方法还包括以下步骤：在D-氨基酸氧化酶的存在下，将D-草铵膦盐进行氧化反应，得到所述的2-氧代-4-（羟基甲基氧膦基）丁酸盐即可。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述的D-草铵膦盐单独存在或与L-草铵膦盐共同存在；所述的与L-草铵膦盐共同存在的形式为D型富集的草铵膦盐、L型富集的草铵膦盐或消旋体草铵膦盐；
和/或，所述的D-氨基酸氧化酶的浓度为0.6-6 U/mL；
和/或，所述的氧化反应在通气的条件下进行；
和/或，所述的氧化反应在过氧化氢酶的存在下进行；
和/或，所述的D-草铵膦盐的浓度为100-600 mM；
和/或，所述的氧化反应的反应体系的pH为7-9；
和/或，所述的氧化反应的反应体系的温度为20-50℃。
8. 如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述的D-氨基酸氧化酶的浓度为1.8U/mL；
所述通气为通入空气或氧气；所述通气的速率为0.5-1 VVM；
所述的D-草铵膦盐的浓度为200 mM；
所述的氧化反应的反应体系的pH为8.0；和/或，
所述的氧化反应的反应体系的温度为20℃。
9. 如权利要求5~8任一项所述的制备方法，其特征在于，所述的L-谷氨酸脱氢酶突变体的浓度为0.05-3 U/ml；
和/或，所述的无机氨基供体的浓度为100-2000 mM；
和/或，所述的2-氧代-4-（羟基甲基氧膦基）丁酸盐的浓度为100-600 mM；
和/或，所述还原型辅酶NADPH与所述的2-氧代-4-（羟基甲基氧膦基）丁酸盐的质量比为1:100-1:20000；
和/或，所述的无机氨基供体为氨气、硫酸铵、氯化铵、磷酸氢二铵、乙酸铵、甲酸铵和碳酸氢铵中的一种或多种；
和/或，所述的反应溶剂为水；
和/或，所述氨化反应的反应体系的pH为7-9；
和/或，所述氨化反应的反应体系的温度为20-50℃。
10. 如权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述的L-谷氨酸脱氢酶突变体的浓度为0.1-1 U/ml；
所述的无机氨基供体的浓度为200 mM；
所述的2-氧代-4-（羟基甲基氧膦基）丁酸盐的浓度为200 mM；
所述还原型辅酶NADPH与所述的2-氧代-4-（羟基甲基氧膦基）丁酸盐的质量比为1:1000-1:15000；
所述氨气的使用形式为氨水；
所述氨化反应的反应体系的pH为8.5；和/或，
所述氨化反应的反应体系的温度为37℃。
11. 如权利要求10所述的制备方法，其特征在于，所述的L-谷氨酸脱氢酶突变体的浓度为0.23 U/ml；和/或，
所述还原型辅酶NADPH与所述的2-氧代-4-（羟基甲基氧膦基）丁酸盐的质量比为1:5000。
12.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述的制备方法还包括以下步骤：在脱氢酶以及供氢体的存在下，将氧化型辅酶NADP+进行还原反应，得到所述的还原型辅酶NADPH即可。
13.如权利要求12所述的制备方法，其特征在于，所述的脱氢酶为葡萄糖脱氢酶、醇脱氢酶或甲酸脱氢酶；
和/或，所述的供氢体为葡萄糖、异丙醇或甲酸盐。
14.如权利要求13所述的制备方法，其特征在于，当所述的脱氢酶为醇脱氢酶时，所述的供氢体为异丙醇；当所述的脱氢酶为葡萄糖脱氢酶时，所述的供氢体为葡萄糖；当所述的脱氢酶为甲酸脱氢酶时，所述的供氢体为甲酸盐。
15. 如权利要求12所述的制备方法，其特征在于，所述的脱氢酶的浓度为0.6-6 U/mL；
和/或，所述氧化型辅酶NADP+与所述的2-氧代-4-（羟基甲基氧膦基）丁酸盐的质量比为1:100-1:20000；
和/或，所述的供氢体的浓度为100-1000 mM；
和/或，所述还原反应的反应体系的pH为7-9；
和/或，所述还原反应的反应体系的温度为20-50℃。
16. 如权利要求15所述的制备方法，其特征在于，所述的脱氢酶的浓度为2 U/mL；
所述氧化型辅酶NADP+与所述的2-氧代-4-（羟基甲基氧膦基）丁酸盐的质量比为1:1000-1:15000；
所述的供氢体的浓度为240 mM；
所述还原反应的反应体系的pH为8.5；和/或，
所述还原反应的反应体系的温度为37℃。
17.如权利要求16所述的制备方法，其特征在于，所述氧化型辅酶NADP+与所述的2-氧代-4-（羟基甲基氧膦基）丁酸盐的质量比为1:5000。
18.一种L-草铵膦的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括下述步骤：
（1）按照权利要求5~17任一项所述的制备方法，制得L-草铵膦盐；
（2）将步骤（1）制得的L-草铵膦盐进行酸化反应，得到L-草铵膦。
19.一种如权利要求1所述的L-谷氨酸脱氢酶突变体在制备L-草铵膦或其盐中的应用。
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Assignor: Ecolab Biotechnology (Shanghai) Co.,Ltd.

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Denomination of invention: A mutant of L-glutamate dehydrogenase and its application

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