CN103748108A

CN103748108A - 叶绿体转运肽及其使用方法

Info

Publication number: CN103748108A
Application number: CN201280024904.7A
Authority: CN
Inventors: T.M.布雷; A.L.卢; 加里·C·村
Original assignee: EI Du Pont de Nemours and Co
Current assignee: EIDP Inc
Priority date: 2011-05-23
Filing date: 2012-05-10
Publication date: 2014-04-23
Also published as: MX2013013644A; BR112013029807A2; WO2012161982A1; CA2836775A1; EP2714725A1; US20120304336A1; US9150625B2

Abstract

提供了用于使目标多肽靶向叶绿体的方法和组合物。提供了重组多核苷酸，所述重组多核苷酸包含可操作连接至目标异源多核苷酸的编码嵌合叶绿体转运肽(CTP)的核苷酸序列。在具体实施例中，嵌合CTP包含可操作连接至中央结构域的N端结构域，中央结构域又可操作连接至CTP的C端结构域，从而形成具有CTP活性的嵌合叶绿体转运肽。进一步提供了含有该重组多核苷酸的细胞、植物细胞、植物、种子和编码相同(嵌合CTP)的重组多肽。还提供了多种序列的使用方法。

Description

叶绿体转运肽及其使用方法

对通过EFS-WEB作为文本文件提交的序列列表的引用

通过EFS-Web以电子方式将序列列表的正式文本作为ASCII格式的序列列表提交，该文件名称为414530SEQLIST.txt，创建日期为2012年3月26日，文件大小为34KB，并且该文件与本说明书同时提交。该ASCII格式文档中所含的序列列表是本说明书的一部分，并且全文以引用的方式并入本文。

技术领域

本发明属于分子生物学领域。更具体地讲，本发明涉及通过采用新型叶绿体转运肽使目标序列靶向叶绿体。

背景技术

质体是广泛存在于植物和藻类细胞中的不同细胞器的家族。其中最突出的是叶绿体，其执行诸如光合作用和脂肪酸及氨基酸生物合成之类的基本过程。叶绿体是由如下六种不同亚细胞器区室构成的复合细胞器：三种不同膜(两种包覆膜和内部类囊体膜)和三种区室(包覆膜的内膜空间、基质和内囊体腔)。超过98％的所有质体蛋白在胞浆核糖体上翻译。此类蛋白在翻译后被靶向并输入到细胞器中。如需查看，请参阅Jarvis et al.(2008)NewPhytologist179：257-285(Jarvis等人，2008年，《新植物学家》，第179卷，第257-285页)。此类易位由外和内包覆膜中称为TOC(叶绿体外包覆膜处的易位子)和TIC(叶绿体内包覆膜处的易位子)的多蛋白复合物协调。参见Soil et al.(2004)Nature Reviews.Molecular Cell Biology5：198-208(Soll等人，2004年，《分子和细胞生物学自然评论》，第5卷，第198-208页)，Bedard et al.(2005)Journal of Experimental Botany56：2287-2320(Bedard等人，2005年，《实验植物学杂志》，第56卷，第2287-2320页)，Kessler et al.(2006)Traffic7：248-257(Kessler等人，2006年，《运输》，第7卷，第248-257页)以及Smith et al.(2006)Canadian Journal ofBotany84：531-542(Smith等人，2006年，《加拿大植物学杂志》，第84卷，第531-542页)。一旦叶绿体前体进入基质，转运肽将被切割，留下蛋白的剩余部分，而呈现其最终构象或者参与多种不同排序途径之一。参见Keegstra et al.(1999)Plant Cell11：557-570(Keegstra等人，1999年，《植物细胞》，第11卷，第557-570页)，Jarvis et al.(2004)(Jarvis等人，2004年)以及Gutensohn et al.(2006)Journal of Plant Physiology163：333-347(Gutensohn等人，2006年，《植物生理学杂志》，第163卷，第333-347页)。

需要能使异源多肽靶向叶绿体的方法和组合物。

发明内容

附图说明

图1提供了开发本文所提供的重组叶绿体转运肽的策略。提供了重组叶绿体转运肽的CTP骨架的每一段的起源。

图2提供了源自多种单子叶植物的叶绿体转运肽的氨基酸比对。突出显示了出现最频繁的氨基酸。

具体实施方式

下文将结合附图更详细地描述本发明，其中附图中只显示了本发明的一些实施例，而非全部实施例。事实上，这些发明内容可以多种不同形式实施，不应理解为受限于本文所述的实施例；相反，这些实施例提供的目的是使本发明满足适用的法律要求。类似的编号在全文中是指类似的要素。

借助前面的描述和随附的附图中给出的教导，本发明所属领域的技术人员将会想到本发明的许多修改形式和其他实施例。因此，应当了解，本发明不限于所公开的特定实施例，并旨在将修改形式和其他实施例包括在所附权利要求的范围内。虽然本文采用了特定术语，但它们仅以一般性和描述性含义使用而不出于限制目的。

I.组合物

A.概述

在生产转基因植物时，将外源蛋白引导至特定亚细胞位置，如质体、液泡、线粒体或ER，经常是有用的。当基因被翻译时，所得蛋白具有融合到目标蛋白的氨基端的转运肽，从而将(目标)蛋白引导至期望的亚细胞区室。特别关注的是对会将转运引导至质体的转运肽的鉴定。如本文所用，“质体”是指存在于植物细胞中的细胞器，其储存和制造细胞所用的化合物例如淀粉、脂肪酸、萜烯，并且源自前质体。因此，植物质体通常具有相同的遗传内容。质体包含负责光合作用的叶绿体、淀粉体、有色体、平衡石、白色体、造油体和蛋白体。质体含有光合机构和多种另外的生物合成酶，包含引起脂肪酸、氨基酸、类胡萝卜素、萜类和淀粉生产的那些酶。因此，需要具备将目标多肽靶向质体的能力，以调整或改变这些细胞器中发生的生理学过程。另外，以重组方式表达的有些多肽在细胞质中是有毒的。由于质体是亚区室，因此有可能将目标多肽靶向质体，使其与细胞质隔离，从而允许高表达水平。此外，重组多肽在质体中的表达可有利于多肽的隔离以供多种应用使用。如在本文中更详细讨论的，提供了可用于质体靶向的新型嵌合叶绿体转运肽。

本文所提供的组合物包含重组多核苷酸，所述重组多核苷酸包含编码新型叶绿体转运肽(CTP)的核苷酸序列，所述核苷酸序列可操作连接至编码目标多肽的核苷酸序列。本文所公开的编码CTP的序列在DNA构建体内组装时使得编码CTP的序列可操作连接至编码目标多肽的核苷酸序列，有利于目标肽共翻译转运或翻译后转运至植物细胞的叶绿体。

B.叶绿体转运肽

叶绿体是存在于进行光合作用的植物细胞和真核藻类中的细胞器。叶绿体是由以下三种膜构成的复合细胞器：内包覆膜、外包覆膜和类囊体膜。这三种膜一起包封三种含水区室，称为中间间隙、基质和内囊体腔。虽然叶绿体含有其自身的环状基因组，但多种组成型叶绿体蛋白是由核基因编码的并且在细胞质中合成为前体形式，该前体形式含有称为叶绿体转运肽(CTP)的N端延伸区。如本文所用，术语“叶绿体转运肽”或“CTP”是指叶绿体前体蛋白的N端部分，其影响叶绿体表面的识别并调节前体蛋白穿过叶绿体包覆膜进入叶绿体内多种亚区室(如，基质、类囊体和类囊体膜)的翻译后易位。因此，如本文所用，具有“CTP活性”的多肽包含在可操作连接至目标蛋白的N端区域时有利于目标多肽易位至叶绿体的多肽。

测定本文所提供的CTP序列使目标蛋白靶向叶绿体的效率的测定法是已知的。参见例如Mishkind et al.(1985)J. of Cell.Biol.100：226-234(Mishkind等人，1985年，《细胞生物学杂志》，第100卷，第226-234页)，该文献全文以引用方式并入本文。报告基因例如葡糖苷酸酶(GUS)、氯霉素乙酰基转移酶(CAT)或绿色荧光蛋白(GFP)是可操作连接至CTP序列的。该融合体被置于合适的启动子控制之下，连接到转化载体中并转化进植物或植物细胞中。在表达和定位在叶绿体中一段充足的时间后，提取叶绿体组分并分析报告基因活性。可对CTP序列使报告蛋白靶向并投递至叶绿体的能力与其他已知CTP序列进行比较。参见de Castro Silva Filho et al.(1996)Plant Mol.Biol.30：769-780(de Castro Silva Filho等人，1996年，《植物分子生物学》，第30卷，第769-780页)。还可以通过将蛋白酶添加至隔离的叶绿体组分中，在体外验证蛋白输入。成功输入到叶绿体的蛋白能够耐受外加的蛋白酶，而保留在胞液中的蛋白易被消化。还可以使用标准分子技术通过评估靶向叶绿体的蛋白的表达所得的表型检测叶绿体中功能蛋白的存在，或使用显微镜法，来验证蛋白的输入。

a.嵌合叶绿体转运肽

本文提供了可操作连接至目标异源多核苷酸的编码嵌合CTP的重组多核苷酸。嵌合CTP包含已知或预测的CTP的异源结构域，它们在可操作连接时具有CTP活性。

CTP偏好羟基化氨基酸(S，T，P)并且缺少酸性残基。它们共用共同的结构骨架，所述结构骨架包含不带电荷N端区域(“N端结构域”)、中央区域(“中央结构域”)和富含碱性精氨酸的两亲C端区域(“C端结构域”)。CTP的该结构域骨架结构在图1中提供。因此，本文提供的CTP包含3个结构域，即N端结构域、中央结构域和C端结构域。

如本文所用，“N端结构域”是指包含不带电荷氨基酸的CTP的N端疏水区域。N端结构域可包含来自通常以MA开始和以G/P结束的CTP序列N端的至少5-10、5-11、5-12、5-13、5-14、5-15、5-16、5-17、5-18、5-19、5-20个或更多个氨基酸。N端结构域可包含另外的序列例如接头序列，使得在可操作连接至中央结构域和C端结构域时重构具有CTP活性的CTP。

如本文所用，“中央结构域”是指CTP的中央区域，其包含缺少酸性氨基酸并富含丝氨酸、苏氨酸、赖氨酸和精氨酸的氨基酸序列。中央结构域可包含来自CTP序列中央区域的至少4-5、4-6、4-7、4-8、4-9、4-10、4-11、4-12、4-13、4-14、4-15个或更多个氨基酸。中央结构域还可包含另外的序列例如接头序列，使得在可操作连接至N端结构域和C端结构域时重构具有CTP活性的CTP。

如本文所用，“C端结构域”是指CTP的C端区域，其包含碱性、富含精氨酸并预测会形成两亲β链的氨基酸序列。C端结构域可包含来自CTP序列C端区域的至少5-10、5-15、5-16、5-17、5-18、5-19、5-20、5-21、5-22、5-23、5-24、5-25、5-26、5-27、5-28、5-29、5-30个或更多个氨基酸。C端结构域可包含另外的序列例如接头序列，使得在可操作连接至N端结构域和中央结构域时重构具有CTP活性的CTP。

多种CTP的结构域的非限制性例子以SEQ ID NO：24-43示出并汇总于表4中。

本文所提供的“嵌合CTP”包含来自任何CTP的N端结构域、中央结构域和C端结构域，其中至少一个结构域的序列与其他结构域的序列异源，并且所述结构域因此在可操作连接时重构具有CTP活性的CTP。如本文所用，术语“嵌合”是指具有两条或更多条异源序列连接在一起的序列。如本文所用，针对序列所谓的“异源”为起源于外来物种(例如来自不同CTP)的序列，或者，如果起源于相同物种的话，则通过有意的人为干预对其天然形式在组成和/或基因座方面进行实质性修饰的序列。例如，预期异源结构域中至少一个CTP结构域不是来自相同CTP，但可来自相同植物物种或不同植物物种的不同CTP。本文所提供的嵌合CTP的长度可在约30、35、40、45、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65个或更多个氨基酸残基长度范围内变化，使得其包含N端结构域、中央结构域和C端结构域并保持CTP活性。

嵌合CTP的结构域可来自任何已知或预测的CTP序列。例如，在一些实施例中，嵌合CTP可包含但不限于来自如下酶的CTP的N端结构域、中央结构域或C端结构域：水稻(Oryza sativa)1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶、水稻过氧化物歧化酶、水稻可溶性淀粉合酶、水稻NADP依赖型苹果酸酶、水稻磷酸-2-脱氢-3-脱氧庚糖酸醛缩酶2、水稻L-抗坏血酸过氧化物酶5、水稻磷酸葡聚糖水二激酶、玉米(Zea Mays)ssRUBISCO、玉米β-葡萄糖苷酶、玉米苹果酸脱氢酶、玉米M型硫氧还蛋白或其活性变体。

在具体的非限制性实施例中，嵌合CTP的N端结构域来自如下酶的CTP：水稻1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶、水稻NADP依赖型苹果酸酶、玉米苹果酸脱氢酶或其活性变体。在其他非限制性实施例中，嵌合CTP的中央结构域来自如下酶的CTP：水稻过氧化物歧化酶、水稻磷酸-2-脱氢-3-脱氧庚糖酸醛缩酶2、水稻L-抗坏血酸过氧化物酶5、玉米ssRUBISCO或其活性变体。在另外的非限制性实施例中，嵌合CTP的C端结构域来自如下酶的CTP：水稻可溶性淀粉合酶、水稻过氧化物歧化酶、水稻磷酸葡聚糖水二激酶、玉米M型硫氧还蛋白、玉米β-葡萄糖苷酶或其活性变体。多种CTP、CTP的N端结构域、中央结构域和C端结构域的非限制性例子以SEQ ID NO：13-43示出。

在一个具体实施例中，嵌合CTP包含来自水稻1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶CTP或其活性变体的N端结构域、来自玉米ssRUBISCO CTP或其活性变体的中央结构域、以及玉米β-葡萄糖苷酶CTP或其活性变体的C端结构域。在另一个具体实施例中，嵌合CTP包含来自玉米苹果酸脱氢酶CTP或其活性变体的N端结构域、来自水稻过氧化物歧化酶CTP或其活性变体的中央结构域、以及来自水稻可溶性淀粉合酶CTP或其活性变体的C端结构域。在又一具体实施例中，嵌合CTP包含来自水稻NADP依赖型苹果酸酶CTP或其活性变体的N端结构域、来自水稻磷酸-2-脱氢-3-脱氧庚糖酸醛缩酶2CTP或其活性变体的中央结构域、以及来自玉米M型硫氧还蛋白CTP或其活性变体的C端结构域。

嵌合CTP的例子以SEQ ID NO：1(msCTP1)或其活性变体或片段、SEQID NO：2(msCTP2)或其活性变体或片段和SEQ ID NO：3(msCTP3)或其活性变体或片段的氨基酸序列示出。本文所提供的多种CTP的结构域结构在图1中示出。

本文所提供的嵌合CTP还可包含嵌合结构域。如本文所用，“嵌合结构域”是指CTP的N端结构域、中央结构域或C端结构域，所述CTP包含融合在一起重构完整结构域的两种或更多种异源N端结构域、中央结构域或C端结构域的部分序列。例如，本文所提供的嵌合结构域(即，“嵌合N端结构域”、“嵌合中央结构域”或“嵌合C端结构域”)可包含融合在一起的至少2、3、4条或更多条异源CTP序列，使得嵌合结构域在并入嵌合CTP中时具有CTP活性。

在一些实施例中，嵌合CTP可包含至少1、2或3种嵌合结构域。在具体实施例中，嵌合N端结构域的至少一部分来自水稻NADP依赖型苹果酸酶CTP、玉米苹果酸脱氢酶CTP或其活性变体的N端结构域。在其他实施例中，嵌合中央结构域的至少一部分来自水稻NADP依赖型苹果酸酶CTP、玉米苹果酸脱氢酶CTP或其活性变体的中央结构域。在另外的实施例中，嵌合C端结构域的至少一部分来自水稻可溶性淀粉合酶CTP、玉米M型硫氧还蛋白CTP、水稻过氧化物歧化酶CTP、水稻磷酸葡聚糖水二激酶CTP或其活性变体的C端结构域。

在一个具体实施例中，嵌合CTP包含具有来自玉米苹果酸脱氢酶CTP的一部分N端结构域与水稻NADP依赖型苹果酸酶CTP的一部分N端结构域同框融合的嵌合N端结构域、来自玉米ssRUBISCO CTP的中央结构域、以及具有来自水稻可溶性淀粉合酶CTP的一部分C端结构域与来自玉米M型硫氧还蛋白CTP的一部分C端结构域同框融合的嵌合C端结构域，其中嵌合CTP具有CTP活性。

在另一个具体实施例中，嵌合CTP包含具有玉米苹果酸脱氢酶CTP的一部分与水稻NADP依赖型苹果酸酶CTP的一部分同框融合的嵌合N端结构域、水稻L-抗坏血酸过氧化物酶5CTP的一部分与玉米ssRLBISCO CTP的一部分同框融合的嵌合中央结构域、以及具有水稻过氧化物歧化酶CTP的一部分与水稻磷酸葡聚糖水二激酶CTP的一部分同框融合的嵌合C端结构域，其中嵌合CTP具有CTP活性。

包含嵌合结构域的示例性CTP以SEQ ID NO：4(msCTP4)或其活性片段或变体和SEQ ID NO：5(msCTP5)或其活性变体或片段的氨基酸序列示出。嵌合CTP结构域结构的例子在图1中提供。

b.共有叶绿体转运肽

虽然前一节中描述的嵌合CTP采用了用于CTP设计的结构域方法，但应认识到其他方法也可用来设计具有CTP活性的叶绿体转运肽。本文提供了编码CTP的重组多核苷酸，其具有基于多种已知单子叶CTP序列的比对和每个位置出现最频繁的氨基酸的序列，并可操作连接至编码目标多肽的异源多核苷酸。图2提供了用于确定出现最频繁的氨基酸的多种单子叶CTP序列的比对。基于本文其他地方所述的不同结构域的结构骨架对多种CTP进行比对，并提供共有CTP序列。

在一个实施例中，所提供的CTP包含下列CTP共有序列：

MXXXXVXXAAAXXXXSXPXXRXXXGXXXXXXXXXXXXXXXXXAAXX RXXXX：：(SEQ ID NO：11)

或其活性变体，其中X表示任何氨基酸。

基于共有序列，可构造多种CTP，使得所得CTP具有CTP活性。在一些情况下，主要氨基酸残基可能不明显。在这些情况下，出现最频繁的氨基酸残基之一可选择并入到序列中。应认识到可由本文所公开的共有序列提供多种CTP序列。

在一个非限制性实施例中，所提供的CTP具有下列序列：

MAIASVMAAAAASVVSFPAGRGSGGSSVIRSRALSLAGSRRSAAAVRR LAL：：(SEQ ID NO：6)(msCTP6)

或其活性变体或片段。在另一个非限制性实施例中，所提供的CTP序列具有下列序列：

MAVATVLAAAALAAVSPPGLRSSLGFPVVRRSLPSAARGGSPAATRRCR AA：：(SEQ ID NO：7)(msCTP7)

或其活性变体或片段。

c.本文所提供的CTP的其他组分

应认识到可对本文所公开的多种CTP进行修饰以提高和/或改变目标多肽向叶绿体的易位。例如，CTP可包含另外的区域，所述区域改变或提高与有利于前体从核糖体到叶绿体表面的迁移的胞浆因子的相互作用。参见例如Hiltbrunner et al.(2001)Journal of Cell Biology154：309-316(Hiltbrunner等人，2001年，《细胞生物学杂志》，第154卷，第309-316页)，Jackson-Constan et al.(2001)Biochimica et Biophysica Acta1541：102-113(Jackson-Constan等人，2001年，《生物化学与生物物理学报》，第1541卷，第102-113页)，所述两篇文献均以引用的方式并入本文。其他区域可用来增加叶绿体输入的效率。参见例如May et al.(2000)PlantCell 12：53-64(May等人，2000年，《植物细胞》，第12卷，第53-64页)，Qbadou et al.(2006)EMBO Journal25：1837-1837(Qbadou等人，2006年，《欧洲分子生物学学会杂志》，第25卷，第1837-1837页)和Sohrt et al.(2000)Journalof Cell Biology148：1213-1221(Sohrt等人，2000年，《细胞生物学杂志》，第148卷，第1213-1221页)，所述文献以引用的方式并入本文。此类区域对于本文所提供的可操作连接的CTP可以是天然的(源自与CTP相同的靶向叶绿体的多肽的区域)或异源的。

本文所公开的多种CTP还可包含另外的序列，所述序列调整目标多肽在叶绿体中的最终位置。例如，本文所公开的多种CTP还可包含靶向类囊体腔的结构域。会靶向类囊体腔的蛋白具有另外的可切割靶向信号，该靶向信号与转运肽相同，在完成易位后即被去除。靶向内腔的肽与调节细菌中内膜转运的信号肽极其类似。参见例如Keegstra et al.(1999)Plant Cell 11：557-570(Keegstra等人，1999年，《植物细胞》，第11卷，第557-570页)，Jarvis(2004)Current Biology14：R1064-R1077(Jarvis，2004年，《当代生物学》，第14卷，第R1064-R1077页)，Gutensohn et al.(2006)Journal ofPlant Physiology163：333-347(Gutensohn等人，2006年，《植物生理学杂志》，第163卷，第333-347页)以及Jarvis(2008)New Phytologist179：257-285(Jarvis，2008年，《新植物学家》，第179卷，第257-285页)，所有文献全文均以引用方式并入，这些文献讨论了叶绿体中的多种排序途径。调整目标多肽在叶绿体中的位置的此类区域对于本文所提供的可操作连接的CTP可以是天然的(源自与CTP相同的靶向叶绿体的多肽的区域)或异源的。

术语“叶绿体转运肽切割位点”是指叶绿体加工蛋白酶所作用、以叶绿体为目标的序列中两个氨基酸之间的位点。CTP使所需的蛋白靶向叶绿体并且可有利于蛋白易位到该细胞器中。同时伴随叶绿体加工蛋白酶在合适的转运肽切割位点将转运肽从成熟多肽或蛋白切除。因此，CTP还可包含用于将前体蛋白正确加工成叶绿体内所含的成熟多肽的合适切割位点。在一个非限制性例子中，当msCTP4与IP2-127联合使用时，CTP切割位点处于IP2-127蛋白N端内SEQ ID NO：12中的氨基酸15和16之间。如上所讨论的，切割掉的片段之外的序列可能对于定位/转运效率很重要，并且可与本文所公开的CTP中任一者一起使用。

d.CTP的多核苷酸和多肽片段及变体

本文还涵盖CTP序列(即SEQ ID NO：1-7和13-23)的片段和变体。所谓“片段”是指多核苷酸的一部分或由其编码的氨基酸序列以及蛋白的一部分。多核苷酸片段可编码在CTP中重构的保持CTP活性的蛋白片段，从而能够有利于目标多肽易位到植物的叶绿体中。或者，可用作杂交探针的多核苷酸片段通常不编码保持生物活性的片段蛋白。因此，核苷酸序列的片段可在至少约10、20、30、40、50、60、70、80个核苷酸或直至全长CTP的范围内。

编码CTP多肽的生物活性部分的多核苷酸片段将编码在SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23任一者或本文所公开的多种嵌合CTP中至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60个连续氨基酸或直至全部氨基酸。用作杂交探针或PCR引物的编码CTP的序列的片段通常不必编码CTP的生物活性部分。

“变体”CTP旨在表示通过在CTP中的一个或多个内部位点处缺失(即，5′和/或3′端的截短)和/或缺失或添加一个或多个氨基酸，和/或在CTP中一个或多个位点处置换一个或多个氨基酸，和/或置换CTP的N端、中央或C端结构域中的一者或多者，和/或置换CTP的N端、中央或C端结构域中的一者或多者的一部分而衍生自CTP(即SEQ ID NO：1-7和13-23)的蛋白。所涵盖的变体蛋白为生物活性的，即它们仍然具有CTP的所需生物活性，即在CTP中重构时具有CTP活性。这种变体可例如由遗传多态性或由人类操纵而得到。

对于编码CTP的多核苷酸，变体包含这样的多核苷酸，其具有5′和/或3′端的缺失(即截短)，和/或多核苷酸内一个或多个内部位点处的一个或多个核苷酸的缺失和/或添加，和/或多核苷酸中一个或多个位点处的一个或多个核苷酸的置换，和/或编码CTP的多核苷酸的N端、中央或C端结构域中一者或多者的置换，和/或编码CTP的多核苷酸的N端、中央或C端结构域中一者或多者的一部分的置换。变体多核苷酸还包含通过合成获得的多核苷酸，如那些例如通过使用定点诱变或基因合成产生但仍编码CTP的多核苷酸。

本文所提供的CTP的生物活性变体(和对其编码的多核苷酸)将与SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23中任一者的多肽或与来自SEQ ID NO：1-7、13-43中任一者或本文所公开的其他CTP中任一者的其任何N端结构域或部分、其任何中央结构域或部分或其任何C端结构域或部分具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性。

CTP序列及其活性变体和片段可以多种方式改变，包括氨基酸置换、缺失、截短和插入。这类操纵的方法是本领域公知的。例如，CTP的氨基酸序列变体和片段可通过在DNA中突变来制备。诱变和多核苷酸变更的方法是本领域公知的。参见例如Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82：488-492(Kunkel，1985年，《美国国家科学院院刊》，第82卷，第488-492页)；Kunkel et al.(1987)Methods in Enzymol.154：367-382(Kunkel等人，1987年，《(酶学方法》，第154卷，第367-382页)；美国专利No.4，873，192；Walker and Gaastra，eds.(1983)Techniques in Molecular Biology(MacMillan Publishing Company，New York)(Walker和Gaastra编辑，1983年，《分子生物学技术》，麦克米伦出版公司，纽约)以及其中所引用的参考文献。有关不影响目标蛋白的生物活性的适当氨基酸置换的指导，可见Dayhoff et al.(1978)Atlas of Protein Sequence and Structure(Natl.Biomed.Res.Found.，Washington，D.C.(Dayhoff等人，1978年，《蛋白序列和结构图表集》，美国国家生物医学研究基金会，华盛顿特区)的模型，将该文献以引用方式并入本文。保守置换，如将一个氨基酸用另一具有相似性质的氨基酸进行交换，可能是最佳的。

显然，将在编码该变体的DNA中所作的突变一定不能将序列设置在阅读框外，并且优选将不会生成可能产生二级mRNA结构的互补区。参见专利申请公布EP75,444。

变体多核苷酸和蛋白还涵盖由诱变和重组方法(如DNA改组)获得的序列和蛋白。用这种方法，可操纵一个或多个不同的CTP序列以产生具有所需性质的新CTP。以此方式，从一组相关的多核苷酸序列产生重组多核苷酸的文库，所述相关的多核苷酸序列包含具有实质的序列同一性且可以在体外或体内同源重组的序列区。例如，使用该方法，可在本文所公开的CTP序列和其他已知CTP之间对编码目标结构域的序列基序进行改组，以获得编码具有改善的目标性质(例如改善的转运到叶绿体的效率)的多肽的新多核苷酸。这种DNA改组的策略是本领域已知的。参见例如，Stemmer(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91：10747-10751(Stemmer，1994年，《美国国家科学院院刊》，第91卷，第10747-10751页)；Stemmer(1994)Nature370：389-391(Stemmer，1994年，《自然》，第370卷，第389-391页)；Crameri et al.(1997)Nature Biotech.15：436-438(Crameri等人，1997年，《自然生物技术》，第15卷，第436-438页)；Moore et al.(1997)J.Mol.Biol.272：336-347(Moore等人，1997年，《分子生物学杂志》，第272卷，第336-347页)；Zhang et al.(1997)Proc.Nail.Acad. Sci.USA94：4504-4509(Zhang等人，1997年，《美国国家科学院院刊》，第94卷，第4504-4509页)；Crameriet al.(1998)Nature391：288-291(Crameri等人，1998年，《自然》，第391卷，第288-291页)；以及美国专利No.5,605,793和No.5,837,458。

e.序列比较

以下术语用于描述两个或更多个多核苷酸或多肽之间的序列关系：(a)“参考序列”、(b)“比较窗口”、(c)“序列同一性”以及(d)“序列同一性百分数”。

(a)本文所用的“参考序列”是用作序列比较的基础的确定的序列。参考序列可以是指定序列的子集或全部；例如，为全长cDNA或基因序列的区段，或者完整的cDNA或基因序列或蛋白序列。

(b)如本文所用，“比较窗口”是指多肽序列的连续和指定的区段，其中该比较窗口中的该多肽序列相比于参考序列(不包含添加或者缺失)可包含添加或者缺失(即空位)，以便两条多肽的最佳比对。通常，比较窗口长度为至少5、10、15或20个连续氨基酸，或者其可为30、40、50、100个或更长。本领域技术人员应理解，为避免由于在多肽序列中加入空位所致的与参比序列的高度相似性，通常引入空位罚分并从匹配数扣除空位罚分。

将序列比对以作比较的方法是本领域公知的。因此，可使用数学算法来完成任何两个序列之间序列同一性百分数的确定。此类数学算法的非限制性例子是Myers and Miller(1988)CABIOS4：11-17(Myers和Miller，1988年，《计算机在生物科学中的应用》，第4卷，第11-17页)的算法；Smithet al.(1981)Adv.Appl.Math.2：482(Smith等人，1981年，《应用数学进展》，第2卷，第482页)的局部比对算法；Needleman and Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48：443-453(Needleman和Wunsch，《分子生物学杂志》，第48卷，第443-453页)的全局比对算法；Pearson and Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85：2444-2448(Pearson和Lipman，1988年，《美国国家科学院院刊》，第85卷，第2444-2448页)的搜索局部比对方法；Karlin andAltschul(1990)Proc..Natl.Acad.Sci.USA872264(Karlin和Altschul，1990年，《美国国家科学院院刊》，第872264页)的算法，其在Karlin andAltschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：5873-5877(Karlin和Altschul，1993年，《美国国家科学院院刊》，第90卷，第5873-5877页)中作了修正。

这些数学算法的计算机执行可以用来比较序列以确定序列同一性。此类程序包括、但不限于：PC/Gene程序(可获自Intelligenetics公司，加利福尼亚州山景城(Mountain View，California))中的CLUSTAL；GCG WisconsinGenetics Software Package版本10(可得自美国加利福尼亚州圣地亚哥斯克兰顿路9685号的Accelrys有限公司(Accelrys Inc.，9685Scranton Road，SanDiego，California，USA))中的ALIGN程序(版本2.0)和GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。使用这些程序的序列比对可以使用默认参数进行。以下文献对CLUSTAL程序进行了详细描述：Higgins et al.(1988)Gene73：237-244(1988)(Higgins等人，1988年，《基因》，第73卷，第237-244页，1988年)；Higgins et al.(1989)CABIOS5：151-153(Higgins等人，1989年，《计算机在生物科学中的应用》，第5卷，第151-153页)；Corpet et al.(1988)Nucleic Acids Res.16：10881-90(Corpet等人，1988年，《核酸研究》，第16卷，第10881-10890页)；Huang et al.(1992)CABIOS8：155-65(Huang等人，1992年，《计算机在生物科学中的应用》，第8卷，第155-165页)；以及Pearson et al.(1994)Meth.Mol.Biol.24：307-331(Pearson等人，1994年，《分子生物学方法》，第24卷，第307-331页)。ALIGN程序是基于Myers和Miller(1988)(出处同上)的算法。当比较氨基酸序列时，ALIGN程序可以使用PAM120加权残基表(weight residuetable)、空位长度罚分12和空位罚分4。Altschul et al(1990)J. Mol.Biol.215：403(A1tschul等人，1990年，《分子生物学杂志》，第215卷，第403页)的BLAST程序是基于Karlin和A1tschul(1990)(出处同上)的算法。BLAST核苷酸搜索可以用BLASTN程序、得分(score)＝100、字长(wordlength)＝12来进行，以获得与编码本发明蛋白的核苷酸序列同源的核苷酸序列。BLAST蛋白搜索可以用BLASTX程序、得分＝50、字长＝3来进行，以获得与本发明蛋白或多肽同源的氨基酸序列。BLASTP蛋白搜索可以用默认参数进行。参见blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi.

为了出于比较目的获得带空位的比对结果，可以如A1tschul et al.(1997)Nucleic Acids Res.25：3389(A1tschul等人，1997年，《核酸研究》，第25卷，第3389页)中所描述采用Gapped BLAST(在BLAST2.0中)。或者，PSI-BLAST(在BLAST2.0中)可以用来执行检测分子之间远源关系的迭代搜索。参见Altschul等人，(1997)，出处同上。当采用BLAST、GappedBLAST、或PSI-BLAST时，可以使用各个程序的默认参数(例如BLASTN用于核苷酸序列，BLASTP用于蛋白)。参见www.ncbi.nlm.nih.gov。还可以以手动方式通过检查来进行比对。

在一个实施例中，本文提供的序列同一性/相似性值指使用采用如下参数的GAP版本10：氨基酸序列的％同一性和％相似性采用GAP权重8和长度权重2以及BLOSUM62评分矩阵；或其任何等同程序获得的值。所谓“等同程序”意指任何这样的序列比较程序，其对于任何两个所考虑的序列，相比于GAP版本10所产生的相应比对，能产生出具有相同的核苷酸或氨基酸残基匹配和相同的序列同一性百分数的比对。

GAP使用Needleman and Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48：443-453(Needleman和Wunsch，1970年，《分子生物学杂志》，第48卷，第443-453页)的算法，以找到两个完全序列的比对，该比对能使匹配数最大和使空位数最小。GAP考虑所有可能的比对和空位位置，并产生具有最大数目的匹配碱基和最少的空位的比对。它允许提供以匹配碱基数为单位的空位产生罚分和空位延伸罚分。GAP对于其插入的每个空位，必须利用匹配的空位产生罚分数。如果选择大于零的空位延伸罚分，GAP对于每个插入的空位必须另外利用空位长度乘以空位延伸罚分。对于蛋白序列，GCGWisconsin Genetics Software Package的版本10中的默认空位产生罚分值和空位延伸罚分值分别为8和2。对于核苷酸序列，默认空位产生罚分为50，而默认空位延伸罚分为3。空位产生罚分和空位延伸罚分可以表述为选自0-200的整数。因此，例如，空位产生罚分和空位延伸罚分可以为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65或更大。

GAP给出具有最佳比对的家族中的一个成员。可能存在这个家族的许多成员，但其他成员没有更好的品质。GAP显示用于比对的四个优值因子：品质、比率、同一性和相似性。品质是为了比对序列而最大化的指标(metric)。比率是品质除以较短区段中的碱基数。同一性百分数是实际匹配的符号的百分数。相似性百分数是相似的符号的百分数。将对应于空位的符号忽略。当一对符号的评分矩阵值大于或等于0.50(相似性阈值)时，评定为相似性。GCG Wisconsin Genetics Software Package的版本10中使用的评分矩阵为BLOSUM62(参见Henikoff and Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：10915(Henikoff和Henikoff，1989年，《美国国家科学院院刊》，第89卷，第10915页))。

(c)在两个多核苷酸或多肽序列的情形中，本文所用的“序列同一性”或“同一性”是指当在指定的比较窗口上进行比对以获得最大对应时两个序列中相同的残基。当序列同一性百分数针对蛋白使用时，应认识到，不相同的残基位置往往差别在于保守氨基酸置换，其中氨基酸残基被其他具有相似的化学性质(例如电荷或疏水性)的氨基酸残基置换。当序列差别在于保守置换，则可以上调百分比序列同一性以校正置换的保守性质。差异在于这类保守置换的序列称为具有“序列相似性”或“相似性”。作出这个调整的方法是本领域技术人员公知的。通常，这涉及将保守置换打分为部分错配而不是完全错配，从而提高序列同一性百分数。因而，例如，如果相同的氨基酸给予1分，非保守置换给予0分，则保守置换给予0至1之间的分数。保守置换的评分是例如在程序PC/GENE(加利福尼亚州山景城(Mountain View，California)的Intelligenetics公司)中所执行那样进行计算。

(d)如本文所用，“序列同一性百分数”意指通过在比较窗口上比较两个最佳比对的序列所确定的数值，其中多核苷酸序列在比较窗口中的部分与参考序列(不包含添加或缺失)相比包含添加或缺失(即空位)，以便两条序列的最佳比对。该百分数是这样计算的：确定在两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目以得到匹配的位置的数目，将匹配的位置的数目除以比较窗口中的位置的总数目，然后将结果乘以100以得到序列同一性百分数。

(e)当使用定义的氨基酸置换矩阵(如，BLOSUM62)、空位存在罚分和空位延伸罚分对两条序列进行比对使得到的相似性评分达到该对序列最高可能分数时，这两条序列是“最佳比对的”。氨基酸置换矩阵及其在定量两条序列之间的相似性的用途是本领域熟知的并且在例如以下文献中有所描述：Dayhoff et al.(1978)“A model of evolutionary change in proteins.”In“Atlas of Protein Sequence and Structure,”Vo1.5，Suppl.3(ed.M.O.Dayhoff)，pp.345-352.Natl.Biomed.Res.Found.，Washington，DC(Dayhoff等人，1978年，“蛋白进化变异模型”，载于“蛋白序列和结构图表集”，第5卷，增刊3(M.O.Dayhoff编辑)，第345-352页，美国国家生物医学研究基金会，华盛顿特区)和Henikoff et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：10915-10919(Henikoff等人，1992年，《美国国家科学院院刊》，第89卷，第10915-10919页)。BLOSUM62矩阵通常用作序列比对方案例如Gapped BLAST2.0中的默认评分置换矩阵。对比对序列之一中单个氨基酸空位的引入施以空位存在罚分，并对插入已开放空位中的每个附加空氨基酸位置施以空位延伸罚分。对比对序列之一中单个氨基酸空位的引入施以空位存在罚分，并对插入已开放空位中的每个附加空氨基酸位置施以空位延伸罚分。通过比对开始和终止的每个序列的氨基酸位置，并任选通过在一个或两个序列中插入一个空位或多个空位以达到最高可能分数，来限定比对。虽然可手动完成最佳比对和评分，但使用计算机实现的比对算法如gappedBLAST2.0有利于该过程，该比对算法在Altschul et al.(1997)Nucleic AcidsRes.25：3389-3402(Altschul等人，1997年，《核酸研究》，第25卷，第3389-3402页)中有所描述并且公布于美国国家生物技术信息中心网站(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)。使用例如通过http：//www.ncbi.nlm.nih.gov可获得的及Altschul et al.(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-3402所描述的PSI-BLAST，可制备包括多重比对在内的最佳比对。

如本文所用，采用使用BLOSUM62置换矩阵、空位存在罚分11和空位延伸罚分1的BLAST比对确定相似性分数和比特分数。对于相同对的序列，如果使用一种或另一种序列作为查询序列时获得的分数之间存在数值差异，则选择较大值的相似性分数。

C.目标多核苷酸/多肽

目标任何异源多核苷酸(即，“目标多肽”)可以与本文所公开的编码CTP的序列(即，本文所公开的多种嵌合CTP和/或SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7或其活性变体或片段)一起使用。应认识到，目标任何多肽可可操作连接至本文提供的并且在植物中表达的编码CTP的序列。

此类目标多核苷酸/多肽包括但不限于耐除草剂编码序列、杀昆虫编码序列、杀线虫编码序列、抗细菌编码序列、抗真菌编码序列、抗病毒编码序列、耐非生物和生物胁迫编码序列、或修饰植物性状例如产量、籽粒质量、营养成分、淀粉质量和数量、固氮和/或氮利用、以及含油量和/或油组成的序列。更具体的目标多核苷酸包括但不限于改善作物产量的基因，改善作物合意性的多肽，编码赋予对非生物压力例如干旱、氮、温度、盐度、有毒金属或微量元素的抗性的蛋白或者赋予对毒素例如杀虫剂和除草剂的抗性的那些蛋白或者赋予对生物压力例如真菌、病毒、细菌、昆虫和线虫入侵的抗性及对与这些生物体相关疾病的发展的抗性的那些蛋白的基因。

“抗除草剂蛋白”或由“抗除草剂编码核酸分子”表达生成的蛋白包含这样的蛋白，其赋予细胞耐受与未表达该蛋白的细胞相比更高浓度除草剂的能力，或赋予细胞与未表达该蛋白的细胞相比对某种浓度除草剂耐受更长时间的能力。除草剂抗性性状可通过如下基因引入到植物中：编码对乙酰乳酸合酶(ALS)起到抑制作用的除草剂(特别是磺酰脲类除草剂)的抗性的基因、编码对谷氨酰胺合酶起到抑制作用的除草剂例如膦丝菌素或者basta的抗性的基因(如，bar基因)、对草甘膦的抗性的基因(如，EPSP合酶基因和GAT基因)、对HPPD抑制剂的抗性的基因(如，HPPD基因)或者本领域已知的其他这类基因。参见例如美国专利No.7,626,077、5，310,667、5,866,775、6,225，114、6,248,876、7，169,970、6,867,293和美国临时申请No.61/401,456，所述专利各自以引用的方式并入本文。

改善作物产量的多核苷酸包含矮化基因，例如Rht1和Rht2(Peng et al.(1999)Nature400：256-261(Peng等人，1999年，《自然》，第400卷，第256-261页))以及增加植物生长的那些，例如铵诱导型谷氨酸脱氢酶。改善作物合意性的多核苷酸包含例如允许植物具有减少的饱和脂肪含量的那些多核苷酸、提高植物营养价值的那些多核苷酸、以及增加籽粒蛋白的那些多核苷酸。改善耐盐性的多核苷酸是增加或允许植物在与已引入耐盐基因的植物的天然环境相比更高盐度的环境中生长的那些多核苷酸。

影响氨基酸生物合成的多核苷酸/多肽包含例如邻氨基苯甲酸合酶(AS；EC4.1.3.27)，该酶催化从芳族氨基酸途径分支到植物、真菌和细菌中的色氨酸生物合成的第一反应。在植物中，色氨酸生物合成的化学过程在叶绿体中区室化。参见例如US Pub.20080050506，其以引用的方式并入本文。另外的目标序列包含分支酸丙酮酸裂解酶(CPL)，其是指编码催化分支酸转化为丙酮酸和pHBA的酶的基因。表征最充分的CPL基因已从大肠杆菌(E.coli)中分离出并具有GenBank登录号M96268。参见美国专利No.7,361，811，其以引用的方式并入本文。

这些目标多核苷酸序列可编码涉及提供病害或害虫抗性的蛋白。所谓“病害抗性”或者“害虫抗性”意指植物防止作为植物-病原体相互作用的后果的有害症状发生。病害抗性基因和昆虫抗性基因，如用于抗细菌保护的溶菌酶或天蚕杀菌肽，或者用于抗真菌保护的蛋白如防御素、葡聚糖酶或几丁质酶，或者用于防治线虫或昆虫的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)内毒素、蛋白酶抑制剂、胶原酶、凝集素或糖苷酶，都是有用的基因产物的例子。

在一些实施例中，本文所提供的CTP可操作连接至包含杀昆虫蛋白的目标异源多肽，所述多肽的表达能防治害虫(即，杀昆虫活性)。如本文所用，所谓“防治害虫”或“能防治害虫”意指使害虫造成的损害受到限制的对害虫的任何影响。防治害虫包括但不限于以一定方式杀死害虫、抑制害虫发育、改变害虫繁殖力或生长，使得害虫对植物造成的损害减轻，减少所产生后代的数量，产生适应力较弱的害虫，产生易受捕食者攻击的害虫，或阻止害虫啃食植物。

“害虫”包括但不限于昆虫、真菌、细菌、病毒、线虫、螨虫、壁虱等等。昆虫害虫包括选自以下各目的昆虫：鞘翅目(Coleoptera)、双翅目(Diptera)、膜翅目(Hymenoptera)、鳞翅目(Lepidoptera)、食毛目(Mallophaga)、同翅目(Homoptera)、半翅目(Hemiptera)、直翅目(Orthroptera)、缨翅目(Thysanoptera)、革翅目(Dermaptera)、等翅目(Isoptera)、虱目(Anoplura)、蚤目(Siphonaptera)、毛翅目(Trichoptera)等，特别是鞘翅目、鳞翅目和双翅目。病毒包括但不限于烟草或黄瓜花叶病毒、环斑病毒、坏死病毒、玉米矮花叶病毒等。线虫包括但不限于寄生线虫例如根结、孢囊和根腐线虫，包括孢囊线虫属(Heterodera spp.)、根结线虫属(Meloidogyne spp.)和球孢囊线虫属(Globodera spp.)；特别是孢囊线虫的成员，包括但不限于大豆异皮线虫(Heterodera glycines)(大豆孢囊线虫)；甜菜异皮线虫(Heterodera schachtii)(甜菜孢囊线虫)；禾谷异皮线虫(Heterodera avenae)(禾谷孢囊线虫)；以及马铃薯金线虫(Globoderarostochiensis)和马铃薯白线虫(Globodera pailida)(马铃薯孢囊线虫)根腐线虫包括但不限于短体线虫属(Pratylenchus spp)。真菌害虫包括造成叶锈病、黄锈病、条锈病和秆锈病的那些。

在其他实施例中，目标多肽包含具有杀昆虫活性(即防治害虫)的苏云金芽孢杆菌多肽。苏云金芽孢杆菌毒蛋白的一些例子包含Cry蛋白。其他苏云金芽孢杆菌毒蛋白在如下文献中有所描述：美国专利No.5,366,892、5,747,450、5,737,514、5,723,756、5,593,881；以及Geiser et al.(1986)Gene48：109(Geiser等人，1986年，《基因》，第48卷，第109页)，这些文献以引用的方式并入本文。在具体实施例中，苏云金芽孢杆菌多肽为IP2-127(SEQ ID NO：12)或其活性变体或片段。IP2-127为具有杀昆虫活性的苏云金芽孢杆菌Cry2蛋白。可对IP2-127蛋白进行修饰以包含例如短接头序列或报告基因，从而允许对蛋白进行检测。修饰IP2-127蛋白序列的例子以SEQ ID NO：8或其活性变体或片段示出并且由SEQ ID NO：9或其活性变体或片段所示的多核苷酸序列编码，并且包含IP2-127-AcGFP融合蛋白。

应认识到，可对目标任何多肽进行修饰以包含例如短接头序列或报告基因，从而允许对叶绿体中的蛋白进行检测。

还提供了目标多核苷酸/多肽(即SEQ ID NO：12)的活性变体或片段。此类活性变体与目标天然多核苷酸/多肽具有至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性，其中活性变体保持生物活性并且在叶绿体中是有功能的。活性片段可包含具有目标天然多核苷酸/多肽的至少20、25、30、35、40、50、60、70、80、100、150个或更多个连续核酸/氨基酸的核苷酸/氨基酸序列，其中活性片段保持生物活性并且在叶绿体中是有功能的。如本文所用，“天然”多核苷酸或多肽分别包含天然的核苷酸序列或氨基酸序列。本文其他地方详细描述了确定序列同一性/序列相似性的方法。

D.植物

进一步提供了包含细胞、转基因植物细胞、转基因植物、转基因植物部分和种子、植物外植体和籽粒的组合物，所述细胞、转基因植物细胞、转基因植物、转基因植物部分和种子、植物外植体和籽粒具有可操作连接至编码目标多肽的异源多核苷酸的编码CTP的重组多核苷酸。在一个实施例中，细胞、植物细胞、植物、植物部分和种子、植物外植体和籽粒包含编码可操作连接至目标多肽的本文所提供CTP(即本文所公开的多种嵌合CTP和/或SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7或其活性变体或片段)的至少一种多核苷酸。CTP可包含嵌合CTP、含嵌合结构域的嵌合CTP、或含本文其他地方详细描述的共有序列的CTP。在一些情况下，编码目标多肽的多核苷酸可包含防治害虫的杀昆虫蛋白、具有杀昆虫活性的苏云金芽孢杆菌蛋白、或IP2-127蛋白(即SEQ ID NO：12)或其活性变体或片段。

如本文所用，术语植物包括整株植物、植物器官、植物组织、种子和植物细胞及其子代、植物原生质体、从中可再生出植物的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物团块、以及在植物或植物部分中完好的植物细胞如胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、仁、穗、穗轴、壳、秆、根、根尖、花粉囊等等。籽粒意在表示由商业种植者出于栽培或繁殖物种之外的目的所生产的成熟种子。还包括再生的植物的子代、变体和突变体，前提条件是这些部分包含所引入的重组多核苷酸。

本文所提供的转化植物或转化植物细胞是其中已针对目标基因进行了遗传变更(如转化)的植物或植物细胞，或者是从经如此变更的植物或细胞遗传下来并包含该变更的植物或植物细胞。“转基因”是已经通过转化方法引入基因组中的基因。因此，“转基因植物”是包含转基因的植物，而不论该转基因是通过转化还是通过育种引入该特定植物中的；从而，该定义涵盖了最初转化植物的子代。“受试植物或植物细胞”是其中已针对目标基因进行了遗传变更(如转化)的植物或植物细胞，或者是从经如此变更的植物或细胞遗传下来并包含该变更的植物或植物细胞。“对照”或“对照植物”或“对照植物细胞”提供测量受试植物或植物细胞的表型变化的参考点。对照植物或植物细胞可例如包括：(a)野生型植物或细胞，即具有与用于进行遗传变更的起始材料相同的基因型的植物或细胞，该遗传变更会得到受试植物或细胞；(b)具有与起始材料相同的基因型但已用无效构建体(即，用可操作连接至目标多肽但不表达CTP的构建体，如包含标记基因的构建体)转化的植物或植物细胞；(c)为受试植物或植物细胞的子代中的非转化分离子的植物或植物细胞；(d)在遗传上与受试植物或植物细胞相同但不暴露于会引起重组多核苷酸的表达的条件或刺激因素的植物或植物细胞；或者(e)处于重组多核苷酸不被表达的条件下的受试植物或植物细胞本身。

经转化而具有可操作连接至本文所提供的目标多肽的编码CTP的重组多核苷酸的植物细胞可生长成整株植物。从单一植物原生质体转化体或者从各种转化的外植体再生、发育和培育植株是本领域熟知的。参见例如McCormick et al.(1986)Plant Cell Reports5：81-84(McCormick等人，1986年，《植物细胞报道》，第5卷，第81-84卷)；Weissbach and Weissbach，In：Methods for Plant Molecular Biology，(Eds.)，Academic Press，Inc.San Diego，Calif.，(1988、)(Weissbach和Weissbach，载于《植物分子生物学方法》，(编辑)，学术出版社公司，加州圣地亚哥市，1988年)。这个再生和生长方法通常包括以下步骤：选择经转化的细胞，将那些个体化的(individualized)细胞培养经过胚发育的通常阶段经过生根小植株阶段。转基因胚和种子类似地进行再生。之后将所得的转基因生根苗种植在适当的植物生长培养基如土壤中。优选地，使再生的植株自花授粉以提供纯合的转基因植物。另外，将从再生的植株获得的花粉与农艺上重要的株系的种子培育植株进行杂交。反过来，用来自这些重要株系的植株的花粉对再生的植株进行授粉。可以培育两代或更多代以确保稳定保持和遗传所需表型特性的表达，然后收获种子以确保已经实现所需表型特征的表达。这样，本文所提供的组合物提供了转化种子(也称为“转基因种子”)，其具有本文所提供的多核苷酸，例如稳定整合到其基因组中的可操作连接至目标多肽的编码CTP的重组多核苷酸。

本文所公开的重组多核苷酸可用于转化任何植物物种，包括但不限于单子叶植物(如，玉蜀黍、甘蔗、小麦、水稻、大麦、高粱或裸麦)和双子叶植物(大豆、芸苔(Brassica)、向日葵、棉花或苜蓿)。目标植物物种的例子包括但不限于玉米(Zea mays)、芸苔(Brassica sp.)(如，甘蓝型油菜(B.napus)、芜菁(B.rapa)、芥菜(B.juncea))尤其是可用作种子油来源的那些芸苔属物种、苜蓿(Medicago sativa)、水稻(Oryza sativa)、裸麦(Secale cereale)、高粱(Sorghum bicolor，Sorghum vulgare)、粟(如，珍珠粟(Pennisetum glaucum)、黄米(Panicum miliaceum)、谷子(Setaria italica)、龙爪稷(Eleusine coracana))、向日葵(Helianthus annuus)、红花(Carthamustinctorius)、小麦(Triticumaestivum)、大豆(Glycine max)、烟草(Nicotiana tabacum)、马铃薯(Solanumtuberosum)、落花生(Arachis hypogaea)、棉花(海岛棉(Gossypiumbarbadense)、陆地棉(Gossypium hirsutum))、甘薯(Ipomoea batatus)、木薯(Manihot esculenta)、咖啡(Coffea spp.)、椰子(CocoS nucifera)、菠萝(Ananascomosus)、柑橘(Citrus spp.)、可可(Theobroma cacao)、茶(Camellia sinensis)、香蕉(Musa spp.)、鳄梨(Persea americana)、无花果(Ficus casica)、番石榴(Psidium guajava)、芒果(Mangifera indica)、橄榄(Olea europaea)、木瓜(Caricapapaya)、腰果(Anacardium occidentale)、澳洲坚果(Macadamia integrifolia)、杏树(Prunus amygdalus)、糖用甜菜(Beta vulgaris)、甘蔗(Saccharum spp.)、燕麦、大麦、蔬菜、观赏植物和针叶树。

蔬菜包括但不限于番茄(Lycopersicon esculentum)、莴苣(如，Lactucasativa)、青豆(Phaseolus vulgaris)、利马豆(Phaseolus limensis)、豌豆(Lathyrusspp.)和黄瓜属(Cucumis)的成员如黄瓜(C.sativus)、香瓜(C.cantalupensis)和香甘瓜(C.melo)。观赏植物包括但不限于杜鹃花(Rhododendron spp.)、八仙花(Macrophylla hydrangea)、木槿(Hibiscus rosasanensis)、玫瑰(Rosa spp.)、郁金香(Tulipa spp.)、水仙花(Narcissus spp.)、矮牵牛(Petunia hybrida)、康乃馨(Dianthus caryophyllus)、一品红(Euphorbia pulcherrima)和菊花。

可用于实施本发明的针叶树包括(例如)松树如火炬松(Pinus taeda)、湿地松(Pinus elliotii)、西黄松(Pinus ponderosa)、黑松(PinuS contorta)和辐射松(Pinus radiata)；花旗松(Pseudotsuga menziesii)；西铁杉(Tsuga canadensis)；北美云杉(Picea glauca)；红杉(Sequoia sempervirens)；枞树(true firs)如银枞(Abiesamabilis)和胶枞(Abies balsamea)；以及雪松如西方红雪松(Thuja plicata)和阿拉斯加黄雪松(Chamaecyparis nootkatensis)，以及杨树和桉树。在具体的实施例中，本发明的植物是作物植物(例如玉米、苜蓿、向日葵、芸苔、大豆、棉花、红花、花生、高粱、小麦、稷、烟草等等)。在其他实施例中，玉米和大豆植物是最佳的，在另外其他实施例中，玉米植物是最佳的。

其他的目的植物包括提供目的种子的谷物植物、油料种子植物和豆科植物。目的种子包括谷物种子，例如玉米、小麦、大麦、水稻、高粱、裸麦等。油料种子植物包括棉花、大豆、红花、向日葵、芸苔、玉蜀黍、苜蓿、棕榈、椰子等。豆科植物包括豆类和豌豆。荚果类包括瓜尔豆、槐豆、胡芦巴、大豆、四季豆、豇豆、绿豆、利马豆、蚕豆、小扁豆、鹰嘴豆等等。

在一些实施例中，将包含可操作连接至编码目标多肽的多核苷酸的CTP编码序列的重组多核苷酸工程改造成分子堆叠。因此，本文所公开的多种植物、植物细胞和种子还可具有一种或多种目标性状，并且在更具体的实施例中，植物、植物部分或植物细胞堆叠有目标多核苷酸序列的任何组合以生成具有所需性状组合的植物。如本文所用，术语“堆叠”包括具有存在于同一植物中的多种性状。

这些堆叠的组合可通过任何方法来产生，包括但不限于通过任何常规方法或遗传转化来对植物进行育种。如果序列通过遗传转化植株来堆叠，则目标的多核苷酸序列可在任何时间以任何顺序进行组合。可以用共转化规程将性状与目的多核苷酸同时引入，所述多核苷酸由转化盒的任何组合提供。例如，如果将要引入两条序列，则可将该两条序列包含在单独的转化盒中(反式)或包含在同一转化盒中(顺式)。可通过相同启动子或不同启动子驱动所述序列表达。在某些情况中，可能期望引入会抑制目标多核苷酸的表达的转化盒。这可以与其他抑制盒或过表达盒的任何组合进行组合以在植物中生成所需的性状组合。还认识到可使用位点特异性重组体系在所需的基因组位置堆叠多核苷酸序列。参见(例如)WO99/25821、WO99/25854、WO99/25840、WO99/25855和WO99/25853，将这些文献的全部均以引用的方式并入本文。

根据目标多肽，表达本文所提供的重组多核苷酸的转基因植物、植物细胞或种子可具有表型变化，包括但不限于改变的病原体或昆虫防御机制、对一种或多种除草剂增强的抗性、增强的压力环境条件承受能力、改进的淀粉产生能力、改进的淀粉产生水平、改进的油含量和/或组成、改进的碳水化合物含量和/或组成、改进的氮利用、分配和/或储存能力等等。

E.多核苷酸构建体

还提供了隔离的或重组多核苷酸和核苷酸构建体，其编码本文所公开的CTP(即，本文所公开的多种嵌合CTP和/或SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7或其活性变体或片段)并可操作连接至编码目标多肽的多核苷酸。如本文所用，“编码”或“编码的”是指可经加工而生成RNA和/或多肽的DNA序列。

术语“多核苷酸”、“多核苷酸序列”、“核酸序列”和“核酸片段”在本文可互换使用。这些术语涵盖核苷酸序列等。多核苷酸可以为RNA或DNA的聚合物，其为单链或双链的，并且任选地包含合成、非天然或改变的核苷酸碱基。DNA聚合物形式的多核苷酸可以由一段或多段cDNA、基因组DNA、合成DNA或其混合物构成。术语“多核苷酸”的使用并不旨在将本发明局限于包含DNA的多核苷酸。本领域普通技术人员会认识到，多核苷酸可包含核糖核苷酸以及包含核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的组合。这种脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸既包括天然的分子也包括合成的类似物。本文所提供的多核苷酸还涵盖所有形式的序列，包括但不限于单链形式、双链形式、发夹结构、茎-环结构等。

本文所提供的组合物可包含隔离的或实质上纯化的多核苷酸。“隔离的”或“纯化的”多核苷酸实质上或基本上不含通常在该多核苷酸的天然环境中存在的、与该多核苷酸相伴随或相互作用的成分。因此，隔离的或纯化的多核苷酸，当通过重组技术生产时实质上不含其他细胞物质或培养基，或者当通过化学法合成时实质上不含化学前体或其他化学品。最佳的是，“隔离的”多核苷酸不含在得到该多核苷酸的生物体的基因组DNA中天然位于该多核苷酸的旁侧的序列(即位于该多核苷酸的5′和3′端的序列)(最佳的是蛋白编码序列)。例如，在多个实施例中，隔离的多核苷酸可含有少于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的在得到该多核苷酸的细胞的基因组DNA中天然位于该多核苷酸的旁侧的核苷酸序列。

还提供了包含CTP序列和编码目标多肽的多核苷酸序列的重组多核苷酸。术语“重组多核苷酸”和“重组DNA构建体”在本文可互换使用。重组构建体包含核酸序列(如自然界中不同时存在的调控序列和编码序列)的人工或异源组合。例如，重组多核苷酸可包含可操作连接至编码目标多肽的异源多核苷酸的嵌合CTP。在其他实施例中，重组构建体可包含源自不同来源的调控序列和编码序列，或者源自相同来源、但是以不同于自然界中存在的方式排列的调控序列和编码序列。此类构建体可单独使用或可与载体结合使用。如果使用载体，则载体的选择取决于本领域技术人员熟知的将用于转化宿主细胞的方法。例如，可使用质粒载体。技术人员充分认识到，遗传因子必须存在于载体上以便成功转化、选择和繁殖包含本发明隔离核酸片段中任一者的宿主细胞。技术人员还将认识到，不同的独立转化事件将导致不同的表达水平和表达模式(Jones et al.，EMBO J.4：2411-2418(1985)(Jones等人，《欧洲分子生物学学会杂志》，第4卷，第2411-2418页，1985年)；De A1meida et al.，Mol.Gen.Genetics218：78-86(1989)(De A1meida等人，《分子遗传学和基因组学)》，第218卷，第78-86页，1989年))，因此必须对多个事件进行筛选以获得显示所需表达水平和表达模式的细胞系。此类筛选可以通过DNA的Southern分析、mRNA表达的Northern分析、蛋白表达的免疫印迹分析、或表型分析等等来实现。

本文所公开的重组多核苷酸可以表达盒形式提供，以在植物或其他目标生物体或细胞类型中表达。所述表达盒可包含可操作连接至重组多核苷酸或其活性变体或片段的5′和3′调控序列。“可操作连接”旨在意指两个或更多个元件之间的功能性连接。例如，目标多核苷酸和调控序列(即启动子)之间的可操作连接是可使该目标多核苷酸得以表达的功能连接。可操作连接的元件可以是连续的或非连续的。当用来指两个蛋白编码区域的连接时，所谓可操作连接意指所述编码区域处于相同的阅读框中。表达盒可另外含有至少一个待共转化到该生物体中的额外基因。或者，可在多个表达盒上提供额外的基因。此类表达盒设有多个限制性位点和/或重组位点，以使重组多核苷酸或其活性变体或片段插入处于调控区的转录调控之下。表达盒可另外含有选择性标志物基因。

表达盒按5′-3′转录方向可包含在植物中发挥功能的转录和翻译起始区(即，启动子)、可操作连接至编码目标多肽的多核苷酸的CTP编码序列或其活性变体或片段、以及转录和翻译终止区(即终止区)。调控区(即，启动子、转录调控区和翻译终止区)和/或CTP编码序列和/或编码目标多肽的多核苷酸对于宿主细胞或对于彼此可以是天然/相似的。或者，调控区和/或CTP编码序列和/或编码目标多肽的多核苷酸对于宿主细胞或对于彼此可以是异源的。在具体实施例中，CTP编码序列可操作连接至目标多核苷酸的5’端，使得在所得的重组多肽中，CTP可操作连接至目标多肽的N端区。

如本文所用，针对序列所谓的“异源”为起源于外来物种(例如来自不同CTP)的序列，或者，如果起源于相同物种的话，则通过有意的人为干预对其天然形式在组成和/或基因座方面进行实质性修饰的序列。例如，预期异源结构域中至少一个CTP结构域不来自相同CTP，但可来自相同植物物种或不同植物物种的不同CTP。又如，可操作连接至异源多核苷酸的启动子来自与得到该多核苷酸的物种不同的物种，或者如果来自相同/类似的物种的话，一者或两者实质上从它们的原始形式和/或基因座修饰而得，或者该启动子不是该被可操作连接的多核苷酸的天然启动子。

终止区可以是对于转录起始区而言是天然的，可以对于可操作连接的目标多核苷酸序列而言是天然的，可以对于植物宿主而言是天然的，或者可以衍生自另一来源(即对于该启动子、CTP、目标多核苷酸序列、植物宿主或者它们的任何组合而言是外来的或异源的)。便利的终止区可获自根瘤农杆菌(A.tumefaciens)的Ti质粒，如章鱼氨酸合酶和胭脂氨酸合酶终止区。另参见Guerineau et al.(1991)Mol.Gen.Genet.262：141-144(Guerineau等人，1991年，《分子遗传学和基因组学》，第262卷，第141-144页)；Proudfoot(1991)Cell64：671-674(Proudfoot，1991年，《细胞》，第64卷，第671-674页)；Sanfacon et al.(1991)Genes Dev.5：141-149(Sanfacon等人，1991年，《基因和发育》，第5卷，第141-149页)；Mogen et al.(1990)Plant Cell 2：1261-1272(Mogen等人，1990年，《植物细胞》，第2卷，第1261-1272页)；Munroe et al.(1990)Gene91：151-158(Munroe等人，1990年，《基因》，第91卷，第151-158页)；Ballas et al.(1989)Nucleic Acids Res.17：7891-7903(Ballas等人，1989年，《核酸研究》，第17卷，第7891-7903页)；以及Joshi et al.(1987)Nucleic Acids Res.15：9627-9639(Joshi等人，1987年，《核酸研究》，第15卷，第9627-9639页)。

在制备表达盒时，可对多个DNA片段进行操纵，以提供处于正确取向的DNA序列。为此目的，可应用衔接子或接头将DNA片段连接在一起，或者可涉及其他的操纵以提供便利的限制位点、去除多余的DNA、去除限制位点等。出于这个目的，可涉及到体外诱变、引物修复、限制性酶切、退火、再置换(例如转换和易位)。

如适当的话，可对多核苷酸进行优化以使其在转化的植物中的表达提高。也就是说，可使用植物偏好的密码子来合成多核苷酸，以改进表达。有关宿主优选密码子用法的讨论，参见例如Campbell and Gowri(1990)PlantPhysiol.92：1-11(Campbell和Gowri，1990年，《植物生理学》，第92卷，第1-11页)。本领域可获得用于合成植物优选性基因的方法。参见例如，美国专利No.5，380,831和5,436,391，以及Murray et al.(1989)Nucleic AcidsRes.17：477-498(Murray等人，1989年，《核酸研究》，第17卷，第477-498页)，将该文献以引用方式并入本文。

已知另外的序列修饰增强细胞宿主中的基因表达。这些包括消除以下序列：编码假多腺苷酸化信号、外显子-内含子剪接位点信号的序列、转座子样重复序列以及其他此类充分表征的可能有害于基因表达的序列。可将序列的G-C含量调整到给定的细胞宿主的平均水平，这通过参考在宿主细胞中表达的已知基因计算得到。当可能时，修饰序列以避免预测的发夹二级mRNA结构。

表达盒可以另外含有5′前导序列。此类前导序列可以起到增强翻译的作用。翻译前导序列是本领域已知的并且包括：微RNA病毒前导序列，例如EMCV前导序列(脑心肌炎病毒5′非编码区)(Elroy-Stein et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：6126-6130(Elroy-Stein等人，1989年，《美国国家科学院院刊》，第86页，第6126-6130页))；马铃薯Y病毒前导序列，例如TEV前导序列(烟草蚀纹病毒)(Gallie et al.(1995)Gene165(2)：233-238(Galiie等人，1995年，《基因》，第165卷，第2期，第233-238页))、MDMV前导序列(玉米矮小花叶病毒)(Virology154：9-20(《病毒学》，第154卷，第9-20页))以及人免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)(Macejak et al.(1991)Nature353：90-94(Macejak等人，1991年，《自然》，第353卷，第90-94页))；来自苜蓿花叶病毒的外壳蛋白mRNA(AMV RNA4)的非翻译前导序列(Jobling et al.(1987)Nature325：622-625(Jobling等人，1987年，《自然》，第325卷，第622-625页))；烟草花叶病毒前导序列(TMV)(Gallie et al.(1989)in MolecularBiology of RNA，ed.Cech(Liss，New York)，pp.237-256(Gallie等人，1989年，《RNA的分子生物学》，Cech编辑(Liss，纽约)，第237-256页))；以及玉米褪绿斑驳病毒前导序列(MCMV)(Lommelet al.(1991)Virology81：382-385(Lommel等人，1991年，《病毒学》，第81卷，第382-385页))。还可参见Della-Cioppa et al.(1987)Plant Physiol.84：965-968(Della-Cioppa等人，1987年，《植物生理学》，第84卷，第965-968页)。

多种启动子可用于表达本文所提供的重组多核苷酸。启动子可基于所需的结果来选择。应认识到，可通过在表达构建体中使用不同启动子调整重组多核苷酸表达的时机、位置和/或水平来增强不同的应用。此类表达构建体还可根据需要包含启动子调控区(如赋予诱导型表达、组成型表达、受环境或发育调节的表达、或者细胞或组织特异性/选择性表达的启动子调控区)、转录起始位点、核糖体结合位点、RNA加工信号、转录终止位点、和/或多聚腺苷酸化信号，包括目标多核苷酸序列的天然启动子。

在一些实施例中，本文所提供的表达构建体可以与用于在植物中表达的组成型启动子、组织偏爱型启动子或其他启动子结合。组成型启动子的例子包括例如花椰菜花叶病毒(CaMV)35S转录起始区、源自根癌农杆菌T-DNA的1′-或2′-启动子、泛素1启动子、Smas启动子、肉桂醇脱氢酶启动子(美国专利No.5,683,439)、Nos启动子、pEmu启动子、rubisco启动子、GRP1-8启动子和源自技术人员已知的多种植物基因的其他转录起始区。如果需要低水平表达，可使用弱启动子。弱组成型启动子包括例如Rsyn7启动子的核心启动子(WO99/43838和美国专利No.6,072,050)、核心35S CaMV启动子等。其他组成型启动子包括例如美国专利No.5,608,149、5,608,144、5,604,121、5,569,597、5,466,785、5,399,680、5,268,463、和5,608,142。还可参见美国专利No.6，177,611，其以引用方式并入本文。

诱导型启动子的例子为Adhl启动子(其可由低氧或冷应激诱导)、Hsp70启动子(其可由热应激诱导)、PPDK启动子和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶启动子(两者均可由光诱导)。还可使用的是化学诱导型启动子，例如受安全剂(safener)诱导的In2-2启动子(美国专利No.5,364,780)、受雌激素诱导的ERE启动子、以及受植物生长素诱导、绒毡层特异性且在愈伤组织中有活性的Axigl启动子(PCT US01/22169)。

在发育控制下的启动子的例子包括优先在某些组织(如叶、根、果实、种子或花)中起始转录的启动子。示例性启动子是花药特异性启动子5126(美国专利No.5,689,049和5,689,051)。种子偏爱型启动子的例子包括但不限于27kDγ玉米醇溶蛋白基因启动子和蜡质基因启动子，Boronat，A.et al.(1986)Plant Sci.47：95-102(Boronat，A.等人，1986年，《植物科学》，第47卷，第95-102页)；Reina，M.et al.Nucl.Acids Res.18(21)：6426(Reina，M.等人，《核酸研究》，第18卷，第21期，第6426页)；以及Kloesgen，R.B.et al.(1986)Mol.Gen.Genet.203：237-244(Kloesgen，R.B.等人，1986年，《分子遗传学和基因组学》，第203卷，第237-244页)。在胚、果皮和胚乳中表达的启动子在美国专利No.6,225,529和PCT公布WO00/12733中有所公开。这些专利各自的公开内容全文以引用方式并入本文中。

可将化学调节启动子用于通过施加外源化学调节剂来调控基因在植物中的表达。取决于目标，启动子可以是化学诱导型启动子，其中施用化学物质可诱导基因表达，或者是化学抑制型启动子启动子，其中施用化学物质可抑制基因表达。化学诱导型启动子是本领域已知的，包括但不限于玉蜀黍In2-2启动子(其通过苯磺酰胺除草剂安全剂激活)、玉蜀黍GST启动子(其通过用作前突生(pre-emergent)除草剂的疏水性亲电化合物激活)和烟草PR-1a启动子(其通过水杨酸激活)。其他值得关注的化学调节启动子包括类固醇响应型启动子(参见例如，糖皮质类固醇诱导型启动子，载于Schena et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：10421-10425(Schena等人，1991年，《美国国家科学院院刊》，第88卷，第10421-10425页)；以及McNellis et al.(1998)Plant J.14(2)：247-257(McNellis等人，1998年，《植物杂志》，第14卷，第2期，第247-257页))和四环素诱导型和四环素阻遏型启动子(参见例如，Gatz et al.(1991)Mol.Gen.Genet.)，227：229-237(Gatz等人，1991年，《分子遗传学和基因组学》，第227卷，第229-237页)；以及美国专利No.5,814,618和5,789,156)，这些文献以引用方式并入本文。

组织偏爱型启动子可用于使重组多核苷酸的增强表达靶向特定植物组织内。组织偏爱型启动子是本领域已知的。参见例如，Yamamoto et al.(1997)Plant J.12(2)：255-265(Yamamoto等人，1997年，《植物杂志》，第12卷，第2期，第255-265页)；Kawamata et al.(1997)Plant Cell Physiol.38(7)：792-803(Kawamata等人，1997年，《植物细胞生理学》，第38卷，第7期，第792-803页)；Hansen etal.(1997)Mol.Gen Genet.254(3)：337-343(Hansen等人，1997年，《分子遗传学和基因组学》，第254卷，第3期，第337-343页)；Russell et al.(1997)Transgenic Res.6(2)：157-168(Russell等人，1997年，《转基因研究》，第6卷，第2期，第157-168页)；Rinehart et al.(1996)Plant Physiol.112(3)：1331-1341(Rinehart等人，1996年，《植物生理学》，第112卷，第3期，第1331-1341页)；VanCamp et al.(1996)Plant Physiol.112(2)：525-535(Van Camp等人，1996年，《植物生理学》，第112卷，第2期，第525-535页)；Canevascini et al.(1996)Plant Physiol.112(2)：513-524(Canevascini等人，1996年，《植物生理学》，第112卷，第2期，第513-524页)；Yamamoto et al.(1994)PlantCell Physiol.35(5)：773-778(Yamamoto等人，1994年，《植物细胞生理学》，第35卷，第5期，第773-778页)；Lam(1994)Results Probl.CellDiffer.20：181-196(Lam，1994年，《细胞分化的结果与问题》，第20卷，第181-196页)；Orozco et al.(1993)Plant MolBiol.23(6)：1129-1138(Orozco等人，1993年，《植物分子生物学》，第23卷，第6期，第1129-1138页)；Matsuoka et al.(1993)Proc Natl.Acad.Sci.USA90(20)：9586-9590(Matsuoka等人，1993年，《美国国家科学院院刊》，第90卷，第20期，第9586-9590页)；以及Guevara-Garcia et al.(1993)Plant J.4(3)：495-505(Guevara-Garcia等人，1993年，《植物杂志》，第4卷，第3期，第495-505页)。如有必要，可对这种启动子进行修饰以用于弱表达。

叶偏爱型启动子是本领域已知的。参见例如Yamamoto et al.(1997)Plant J.12(2)：255-265(Yamamoto等人，1997年，《植物杂志》，第12卷，第2期，第255-265页)；Kwon et al.(1994)Plant Physiol.105：357-67(Kwon等人，1994年，《植物生理学》，第105卷，第357-367页)；Yamamoto et al.(1994)Plant Cell Physiol.35(5)：773-778(Yamamoto等人，1994年，《植物细胞生理学》，第35卷，第5期，第773-778页)；Gotoret al.(1993)Plant J.3：509-18(Gotor等人，1993年，《植物杂志》，第3卷，第509-518页)；Orozco et al.(1993)Plant Mol.Biol.23(6)：1129-1138(Orozco等人，1993年，《植物分子生物学》，第23卷，第6期，第1129-1138页)；以及Matsuoka etal.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90(20)：9586-9590(Matsuoka等人，1993年，《美国国家科学院院刊》，第90卷，第20期，第9586-9590页)。此外，还可使用cab和rubisco的启动子。参见例如Simpson et al.(1958)EMBO J4：2723-2729(Simpson等人，1958年，《欧洲分子生物学学会杂志》，第4卷，第2723-2729页)和Timko et al.(1988)Nature318：57-58(Timko等人，1988年，《自然》，第318卷，第57-58页)。

表达盒还可包含用于选择转化细胞的选择性标志物基因。选择性标志物基因被利用于转化细胞或组织的选择。标志物基因包括编码抗生素抗性的基因，如编码新霉素磷酸转移酶II(NEO)和潮霉素磷酸转移酶(HPT)的那些基因，以及赋予对除草化合物的抗性的基因，所述除草化合物为例如草甘膦、草铵膦、溴苯腈、磺酰脲、麦草畏和2,4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)。另外的选择性标志物包括表型标志物如β-半乳醣苷酶和荧光蛋白如绿荧光蛋白(GFP)(Su et al.(2004)Biotechnol Bioeng85：610-9(Su等人，2004年，《生物技术和生物工程》，第85卷，第610-619页)和Fetter et al.(2004)Plant Cell16：215-28(Fetter等人，2004年，《植物细胞》，第16卷，第215-228页))、青色荧光蛋白(CYP)(Bolte et al.(2004)J.Cell Science117：943-54(Bolte等人，2004年，《细胞科学杂志》，第117卷，第943-954页)和Kato et al.(2002)Plant Physiol 129：913-42(Kato等人，2002年，《植物生理学》，第129卷，第913-942页))和黄色荧光蛋白(来自Evrogen的PhiYFP^TM，参见Bolte et al.(2004)J.Cell Science117：943-54(Bolte等人，2004年，《细胞科学杂志》，第117卷，第943-954页))。对于另外的选择性标志物，通常参见Yarranton(1992)Curr.Opin.Biotech.3：506-511(Yarranton，1992年，《生物技术新见》，第3卷，第506-511页)；Christopherson et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：6314-6318(Christopherson等人，1992年，《美国国家科学院院刊》，第89卷，第6314-6318页)；Yao et al.(1992)Cell71：63-72(Yao等人，1992年，《细胞》，第71卷，第63-72页)；Reznikoff(1992)Mol.Microbiol.6：2419-2422(Reznikoff等人，1992年，《分子微生物学》，第6卷，第2419-2422页)；Barkley等人(1980)，载于The Operon(《操纵子》)，第177-220页；Hu et al.(1987)Cell48：555-566(Hu等人，1987年，《细胞》，第48卷，第555-566页)；Brown et al.(1987)Cell49：603-612(Brown等人，1987年，《细胞》，第49卷，第603-612页)；Figge et al.(1988)Cell52：713-722(Figge等人，1988年，《细胞》，第52卷，第713-722页)；Deuschle et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Aci.USA86：5400-5404(Deuschle等人，1989年，《美国国家科学院院刊》，第86卷，第5400-5404页)；Fuerst et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：2549-2553(Fuerst等人，1989年，《美国国家科学院院刊》，第86卷，第2549-2553页)；Deuschle et al.(1990)Science248：480-483(Deuschle等人，1990年，《科学》，第248卷，第480-483页)；Gossen，(1993)，海德尔堡大学博士论文；Reines et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：1917-1921(Reines等人，1993年，《美国国家科学院院刊》，第90卷，第1917-1921页)；Labow etal.(1990)Mol.Cell.Biol.10：3343-3356(Labow等人，1990年，《分子细胞生物学》，第10卷，第3343-3356页)；Zambretti et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：3952-3956(Zambretti等人，1992年，《美国国家科学院院刊》，第89卷，第3952-3956页)；Baim et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：5072-5076(Baim等人，1991年，《美国国家科学院院刊》，第88卷，第5072-5076页)；Wyborski et al.(1991)Nucleic Acids Res.19：4647-4653(Wyborski等人，1991年，《核酸研究》，第19卷，第4647-4653页)；Hillenand-Wissman(1989)Topics Mol.Struc.Biol.10：143-162(Hillenand-Wissman，1989年，《分子和结构生物学专题》，第10卷，第143-162页)；Degenkolb et al.(1991)Antimicrob.AgentsChemother.35：1591-1595(Degenkolb等人，1991年，《抗微生物剂和化学治疗》，第35卷，第1591-1595页)；K1einschnidt et al.(1988)Biochemistry27：1094-1104(K1einschnidt等人，1988年，《生物化学》，第27卷，第1094-1104页)；Bonin，(1993)，海德尔堡大学博士论文；Gossen et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：5547-5551(Gossen等人，1992年，《美国国家科学院院刊》，第89卷，第5547-5551页)；Oliva et al.(1992)Antimicrob.Agents Chemother.36：913-919(Oliva等人，1992年，《抗微生物剂和化学治疗》，第36卷，第913-919页)；H1avka et al.(1985)Handbook ofExperimental Pharmacology，Vol.78(Springer-Verlag，Berlin)(H1avka等人，1985年，《实验药理学手册》，第78卷，第页，斯普林格出版社，柏林)；Gill et al.(1988)Nature334：721-724(Gill等人，1988年，《自然》，第334卷，第721-724页)。将这些公开内容以引用的方式并入本文。上面关于选择性标志物基因的列表并不意指是限制性的。本文可使用任何选择性标志物基因，包括实例2和3中所述的Ac-GFP。

II.引入方法

本文所提供的方法包括向细胞、植物细胞、植物或种子引入可操作连接至编码目标多肽的异源多核苷酸的编码本文所提供的CTP(即，本文所提供的嵌合CTP中任一者和/或SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7或其活性变体或片段)的重组多核苷酸或核酸构建体。

在一些实施例中，引入重组多核苷酸中的CTP可以为嵌合CTP、含至少一个嵌合结构域的嵌合CTP、或含本文其他地方详细描述的共有序列的CTP。CTP可连接至目标任何多肽。例如，目标多肽可包含其表达可防治害虫的杀昆虫蛋白、具有杀昆虫活性的苏云金芽孢杆菌多肽、或IP2-127多肽(即SEQ ID NO：12或其活性变体或片段)。

本文所提供的方法不依赖于将序列引入宿主细胞中的特定方法，只要多核苷酸能进入宿主的至少一个细胞内部即可。用于将多核苷酸引入宿主细胞(即植物)中的方法是本领域已知的，并且包括但不限于稳定转化方法、瞬时转化方法和病毒调节的方法。

术语“引入的”和“引入”旨在表示将核酸(如，重组多核苷酸)或蛋白提供到细胞中。“引入”包括提及核酸整合到真核或原核细胞中，其中核酸可整合到细胞基因组中，并且该术语包括提及核酸或蛋白瞬时提供给细胞。“引入”包括提及稳定或瞬时转化方法以及有性杂交。因此，在将核酸片段(如，重组多核苷酸)插入细胞中的语境中的“引入”意指“转染”或“转化”或“转导”，包括提及核酸片段整合到真核或原核细胞中，其中该核酸片段可整合到细胞的基因组(如，染色体、质粒、质体或线粒体DNA)中、转化成自主复制子或者瞬时表达(如，转染的mRNA)。

“稳定转化”旨在意指被引入到宿主(即植物)中的核苷酸构建体整合到了植物的基因组中，并能够被其子代遗传。“瞬时转化”旨在意指将多核苷酸引入宿主(即植物)中并短暂表达。

转化方案以及将多核苷酸序列引入植物中的方案，可根据要进行转化的植物或植物细胞的类型(即单子叶植物或双子叶植物)而异。将多核苷酸引入到植物细胞中的合适方法包括微注射(Crossway et al.(1986)Biotechniques4：320-334(Crossway等人，1986年，《生物技术》，第4卷，第320-334页))、电穿孔(Riggs et al.(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA83：5602-5606(Riggs等人，1986年，《美国国家科学院院刊》，第83卷，第5602-5606页))、农杆菌介导的转化(Townsend等人，美国专利No.5,563,055；Zhao等人，美国专利No.5,981,840)、直接基因转移(Paszkowski et al.(1984)EMBO J.3：2717-2722(Paszkowski等人，1984年，《欧洲分子生物学学会杂志》，第3卷，第2717-2722页))和弹道粒子加速法(参见例如Sanford等人，美国专利No.4,945,050；Tomes等人，美国专利No.5,879,918；Tomes等人，美国专利No.5,886,244；Bidney等人，美国专利No.5,932,782；Tomes et al.(1995)“Direct DNA Transfer intoIntact Plant Cells via Microprojectile Bombardment,”in Plant Cell，Tissue，andOrgan Culture：Fundamental Methods，ed.Gamborg and Phillips(Springer-Verlag，Berlin)(Tomes等人，1995年，“通过微粒轰击直接将DNA转移进完整植物细胞中”，载于《植物细胞、组织和器官培养：基本方法》，Gamborg和Phillips编辑，(施普林格，柏林))；McCabe et al.(1988)Biotechnology6：923-926)(McCabe等人，1988年，《生物技术》，第6卷，第923-926页)；和Lecl转化(WO00/28058)。另参见Weissinger et al.(1988)Ann.Rev.Genet.22：421-477(Weissinger等人，1988年，《遗传学年评》，第22卷，第421-477页)；Sanford et al.(1987)Particulate Scienceand Technology5：27-37(Sanford等人，1987年，《颗粒科学与技术》，第5卷，第27-37页)(洋葱)；Christou et al.(1988)Plant Physiol.87：671-674(Christou等人，1988年，《植物生理学》，第87卷，第671-674页)(大豆)；McCabe et al.(1988)Bio/Technology6：923-926(McCabe等人，1988年，《生物技术》，第6卷，第923-926页)(大豆)；Finer and McMullen(1991)In Vitro Cell Dev.Biol.27P：175-182(Finer和McMullen，1991年，《体外细胞发育生物学》，第27P卷，第175-182页)(大豆)；Singh etal.(1998)Theor.Appl.Genet.96：319-324(Singh等人，1998年，《理论和应用遗传学》，第96卷，第319-324页)(大豆)；Datta et al.(1990)Biotechnology8：736-740(Datta等人，1990年，《生物技术)》，第8卷，第736-740页)(水稻)；Klein et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：4305-4309(Klein等人，1988年，《美国国家科学院院刊》，第85卷，第4305-4309页)(玉蜀黍)；Klein et al.(1988)Biotechnology6：559-563(Klein等人，1988年，《生物技术》，第6卷，第559-563页)(玉蜀黍)；Tomes，美国专利No.5，240，855；Buising等人，美国专利No.5，322，783和5，324，646；Tomes et al.(1995)“Direct DNA Transfer into Intact P1ant Cells viaMicroproiectile Bombardment，”in Plant Cell，Tissue，and OranCulture：Fundamental Methods，ed.Gamborg(Springer-Verlag，Berlin)(Tomes等人，1995年，“通过微粒轰击直接将DNA转移进完整植物细胞中”，载于《植物细胞、组织和器官培养：基本方法》，Gamborg编辑，(施普林格，柏林))(玉蜀黍)；Klein et al.(1988)Plant Physiol.91：440-444(Klein等人，1988年，《植物生理学》，第91卷，第440-444页)(玉蜀黍)；Fromm et al.(1990)Biotechnology8：833-839(Fromm等人，1990年，《生物技术》，第8卷，第833-839页)(玉蜀黍)；Hooykaas-Van S1ogteren et al.(1984)Nature(London)311：763-764(Hooykaas-Van Slogteren等人，1984年，《自然》(伦敦)，第311卷，第763-764页)；Bowen等人，美国专利No.5,736，369(谷类)；Bytebier et al.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84：5345-5349(Bytebier等人，1987年，《美国国家科学院院刊》，第84卷，第5345-5349页)(百合科)；De Wet et al.(1985)in The ExperimentalManipulation of Ovule Tissues，ed.Chapman et al.(Longman，New York)，pp.197-209(De Wet等人，1985年，载于《胚珠组织的实验操纵》，Chapman等人编辑，(朗文公司，纽约)，第197-209页)(花粉)；Kaeppler et al.(1990)Plant CellReports9：415-418(Kaeppler等人，1990年，《植物细胞报道》，第9卷，第415-418页)以及Kaeppler etal.(1992)Theor.Appl.Genet.84：560-566(Kaeppler等人，1992年，《理论和应用遗传学》，第84卷，第560-566页)(触须调节转化)；D′Halluin et al.(1992)Plant Cell4：1495-1505(D′Halluin等人，1992年，《植物细胞》，第4卷，第1495-1505页)(电穿孔)；Li et al.(1993)Plant Cell Reports12：250-255(Li等人，1993年，《植物细胞报道》，第12卷，第250-255页)以及Christou and Ford(1995)Annals of Botany75：407-413(Christou和Ford，1995年，《植物学年鉴》，第75卷，第407-413页)(水稻)；Osjoda et al.(1996)NatureBiotechnology14：745-750(Osjoda等人，1996年，《自然生物技术》，第14卷，第745-750页)(玉蜀黍，通过根瘤农杆菌)；所有这些文献和专利均以引用方式并入本文。

在具体实施例中，本文所公开的重组多核苷酸可用多种瞬时转化方法提供给植物。此类瞬时转化方法包括但不限于直接将重组多核苷酸或其变体引入到植物中。这类方法包括例如微注射或粒子轰击。参见例如Crosswayet al.(1986)Mol Gen.Genet.202：179-185(Crossway等人，1986年，《分子遗传学和基因组学》，第202卷，第179-185页)；Nomura etal.(1986)Plant Sci.44：53-58(Nomura等人，1986年，《植物科学》，第44卷，第53-58页)；Hepler et al.(1994)Proc.Natl.Acad. Sci.91：2176-2180(Hepler等人，1994年，《美国国家科学院院刊》，第91卷，第2176-2180页)和Hush et al.(1994)The Journal ofCell Sciencel07：775-784(Hush等人，1994年，《细胞科学杂志》，第107卷，第775-784页)，所有文献均以引用的方式并入本文。或者，可使用本领域已知的技术将多核苷酸瞬时转化到植物中。这类技术包括病毒载体系统以及将多核苷酸以避免该DNA随后释放的方式进行的沉淀。因此，可能从粒子结合的DNA发生转录，但将它释放出来以整合到基因组中的频率大大降低。这种方法包括使用包被有聚乙基亚胺(PEl；Sigma#P3143)的粒子。

在其他实施例中，可通过使植物与病毒或病毒核酸接触，将本文所公开的重组多核苷酸引入到植物中。通常，这类方法涉及将本文所提供的核苷酸构建体整合到病毒DNA或RNA分子内部。涉及病毒DNA或RNA分子的用于将多核苷酸引入植物中并表达其中所编码的蛋白的方法是本领域已知的。参见(例如)美国专利No.5,889,191、5,889,190、5,866,785、5,589,367、5,316,931和Porta et al.(1996)Molecular Biotechnology5：209-221(Porta等人，1996年，《分子生物技术》，第5卷，第209-221页)；将这些文献以引用方式并入本文。

用于在植物基因组中特定位置处定向插入多核苷酸的方法是本领域已知的。在一个实施例中，使用位点特异性重组系统，实现在所需的基因组位置处插入多核苷酸。参见(例如)WO99/25821、WO99/25854、WO99/25840、WO99/25855和WO99/25853，将这些文献的全部均以引用的方式并入本文。简而言之，本文所提供的重组多核苷酸可包含于侧接有两个不相同重组位点的转移盒中。将转移盒引入到在其基因组中稳定整合了这样的靶标位点的植物中，该靶标位点侧接有与该转移盒的所述位点对应的两个不相同重组位点。提供适当的重组酶并且将所述转移盒整合在靶位点处。重组多核苷酸因此整合在植物基因组中的特定染色体位置。

转化的细胞可以根据常规方式培育成植株。参见例如McCormick et al.(1986)Plant Cell Reports5：81-84(McCormick等人，1986年，《植物细胞报道》，第5卷，第81-84页)。然后可使这些植物生长，用相同的转化植株或不同的植株进行授粉，所得的子代具有所鉴定的所需表型特征的组成型表达。可以培育两代或更多代以确保稳定保持和遗传所需表型特性的表达，然后收获种子以确保已经实现所需表型特征的表达。这样，提供了具有稳定整合到其基因组中的本文所公开的重组多核苷酸，例如本文所提供的表达盒的转化种子(也称为“转基因种子”)。

III.使用方法

本文提供了将目标多肽靶向叶绿体的方法，所述方法包括在细胞、植物细胞、植物、植物部分或种子中表达可操作连接至编码目标多肽的异源多核苷酸的编码本文所提供的CTP(即本文所提供的嵌合CTP中任一者和/或SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7或其活性变体或片段)的重组多核苷酸。

所述方法还提供CTP，所述CTP包含嵌合CTP、含至少一个嵌合结构域的嵌合CTP、或含本文其他地方详细描述的共有序列的CTP。所述方法中提供的重组多核苷酸还包含连接至目标任何多肽的本文所提供的CTP。例如，目标多肽可包含其表达可防治害虫的杀昆虫蛋白、具有杀昆虫活性的苏云金芽孢杆菌多肽、或IP2-127多肽(即SEQ ID NO：12或其活性变体或片段)。

本发明的方法涉及在植物和植物细胞中在本文所公开的CTP序列的控制下对靶向叶绿体的序列的正确表达、易位和加工。出于本发明的目的，“加工的”靶向叶绿体的蛋白为已移除CTP的蛋白。当靶向叶绿体的蛋白易位至植物细胞的叶绿体中时，通过在CTP和成熟蛋白之间的特定“切割位点”处切割，将CTP从靶向蛋白移除。切割位点可通过实验确定，或可根据序列结构(如，通过将未加工的蛋白与已知切割位点的靶向叶绿体的蛋白进行比对，通过分析序列中特征性CTP结构域的存在性等等)或通过使用用于切割位点预测的一种或多种算法(如，SignalP或PSORT)来预测。

根据目标的靶向叶绿体的多肽，转基因植物可具有表型变化，包括但不限于改变的病原体或昆虫防御机制、对一种或多种除草剂增强的抗性、增强的压力环境条件承受能力、改进的淀粉生产能力、改进的淀粉生产水平、改进的油含量和/或组成、改进的氮利用、分配和/或储存能力等等。这些结果可通过目标多肽表达并靶向至植物中的叶绿体来获得，其中目标多肽在叶绿体中发挥功能。本文所提供的CTP序列可用于靶向植物中的天然序列以及异源(非天然)序列。

本文所公开的方法和组合物的非限制性例子如下：

1.一种可操作连接至编码目标多肽的异源多核苷酸的编码叶绿体转运肽(CTP)的重组多核苷酸，其中所述CTP包含

a)包含SEQ ID NO：6或7的氨基酸的氨基酸序列；

b)与SEQ ID NO：6或7具有至少85％序列同一性的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列具有CTP活性；或者

c)具有SEQ ID NO：6或7的至少17个连续氨基酸的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列具有CTP活性。

2.一种可操作连接至编码目标多肽的异源多核苷酸的编码嵌合叶绿体转运肽(CTP)的重组多核苷酸，其中所述嵌合CTP包含N端结构域、中央结构域和C端结构域或其变体，其中所述N端结构域、所述中央结构域、所述C端结构域或其变体中至少一者对于所述结构域中至少一者是异源的。

3.实施例2的重组多核苷酸，其中所述N端结构域、所述中央结构域或所述C端结构域来自如下酶的CTP：水稻1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶、水稻过氧化物歧化酶、水稻可溶性淀粉合酶、水稻NADP依赖型苹果酸酶、水稻磷酸-2-脱氢-3-脱氧庚糖酸醛缩酶2、水稻L-抗坏血酸过氧化物酶5、水稻磷酸葡聚糖水二激酶、玉米ssRUBISCO、玉米β-葡萄糖苷酶、玉米苹果酸脱氢酶、玉米M型硫氧还蛋白或其活性变体。

4.实施例2或3的重组多核苷酸，其中所述N端结构域来自如下酶的CTP：水稻1-脱氧-D木酮糖-5-磷酸合酶、水稻NADP依赖型苹果酸酶、玉米苹果酸脱氢酶或其活性变体。

5.实施例2或3的重组多核苷酸，其中所述中央结构域来自如下酶的CTP：水稻过氧化物歧化酶、水稻磷酸-2-脱氢-3-脱氧庚糖酸醛缩酶2、水稻L-抗坏血酸过氧化物酶5、玉米ssRUBISCO或其活性变体。

6.实施例2或3的重组多核苷酸，其中所述C端结构域来自如下酶的CTP：水稻可溶性淀粉合酶、水稻过氧化物歧化酶、水稻磷酸葡聚糖水二激酶、玉米M型硫氧还蛋白、玉米β-葡萄糖苷酶或其活性变体。

7.实施例2或3的重组多核苷酸，其中所述N端结构域来自水稻1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶CTP或其活性变体，所述中央结构域来自玉米ssRUBISCO CTP或其活性变体，并且所述C端结构域来自玉米β-葡萄糖苷酶CTP或其活性变体。

8.实施例2或3的重组多核苷酸，其中所述N端结构域来自玉米苹果酸脱氢酶CTP或其活性变体，所述中央结构域来自水稻过氧化物歧化酶CTP或其活性变体，并且所述C端结构域来自水稻可溶性淀粉合酶CTP或其活性变体。

9.实施例2或3的重组多核苷酸，其中所述N端结构域来自水稻NADP依赖型苹果酸酶CTP或其活性变体，所述中央结构域来自水稻磷酸-2-脱氢-3-脱氧庚糖酸醛缩酶2CTP或其活性变体，并且所述C端结构域来自玉米M型硫氧还蛋白CTP或其活性变体。

10.实施例2的重组多核苷酸，其中所述N端结构域、所述中央结构域或所述C端结构域中的至少一者包含嵌合结构域。

11.实施例10的重组多核苷酸，其中所述嵌合N端结构域的至少一部分来自水稻NADP依赖型苹果酸酶CTP、玉米苹果酸脱氢酶CTP或其活性变体的N端结构域。

12.实施例10的重组多核苷酸，其中所述嵌合中央结构域的至少一部分来自水稻L-抗坏血酸过氧化物酶5CTP、玉米ssRUBISCO CTP或其活性变体的中央结构域。

13.实施例10的重组多核苷酸，其中所述嵌合C端结构域的至少一部分来自水稻可溶性淀粉合酶CTP、玉米M型硫氧还蛋白CTP、水稻过氧化物歧化酶CTP、水稻磷酸葡聚糖水二激酶CTP或其活性变体的C端结构域。

14.实施例10的重组多核苷酸，其中所述嵌合CTP包含

a)嵌合N端结构域，其中所述嵌合N端结构域包含来自玉米苹果酸脱氢酶CTP的N端结构域的一部分和与其同框融合的水稻NADP依赖型苹果酸酶CTP的N端结构域的一部分；

b)中央结构域，其中所述中央结构域来自玉米ssRUBISCOCTP；以及

c)嵌合C端结构域，其中所述嵌合C端结构域包含来自水稻可溶性淀粉合酶CTP的C端结构域的一部分和与其同框融合的来自玉米M型硫氧还蛋白CTP的C端结构域的一部分；

其中所述嵌合CTP具有CTP活性。

15.实施例1O的重组多核苷酸，其中所述嵌合CTP包含

b)嵌合中央结构域，其中所述嵌合中央结构域包含来自水稻L-抗坏血酸过氧化物酶5CTP的中央结构域的一部分和与其同框融合的玉米ssRUBISCO CTP的中央结构域的一部分；以及

c)嵌合C端结构域，其中所述嵌合C端结构域包含来自水稻过氧化物歧化酶CTP的C端结构域的一部分和与其同框融合的水稻磷酸葡聚糖水二激酶CTP的C端结构域的一部分；

其中所述嵌合CTP具有CTP活性。

16.实施例3的重组多核苷酸，其中所述嵌合CTP包含

a)包含SEQ ID NO：1、2或3的氨基酸的氨基酸序列；

b)与SEQ ID NO：1、2或3具有至少85％序列同一性的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列具有CTP活性；或

c)具有SEQ ID NO：1、2或3的至少17个连续氨基酸的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列具有CTP活性。

17.实施例14的重组多核苷酸，其中所述嵌合CTP包含

a)包含SEQ ID NO：4的氨基酸的氨基酸序列；

b)与SEQ ID NO：4具有至少85％序列同一性的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列具有CTP活性；或

c)具有SEQ ID NO：4的至少17个连续氨基酸的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列具有CTP活性。

18.实施例15的重组多核苷酸，其中所述嵌合CTP包含

a)包含SEQ ID NO：5的氨基酸的氨基酸序列；

b)与SEQ ID NO：5具有至少85％序列同一性的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列具有CTP活性；或

c)具有SEQ ID NO：5的至少17个连续氨基酸的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列具有CTP活性。

19.实施例1-18中任一项的重组多核苷酸，其中所述目标多肽包含具有杀昆虫活性的苏云金芽孢杆菌多肽。

20.实施例19的重组多核苷酸，其中所述具有杀昆虫活性的苏云金芽孢杆菌多肽包含IP2-127多肽。

21.一种核酸构建体，包含实施例1-20中任一项的重组多核苷酸。

22.实施例21的核酸构建体，还包含可操作连接至所述重组多核苷酸的启动子。

23.一种细胞，包含实施例1-20中任一项的至少一种重组多核苷酸或者实施例21或22中任一项的核酸构建体。

24.实施例23的细胞，其中所述细胞为植物细胞。

25.实施例24的细胞，其中所述多核苷酸或核酸构建体稳定整合到所述植物细胞的基因组中。

26.实施例24或25中任一项的细胞，其中所述植物细胞来自单子叶植物。

27.实施例26的细胞，其中所述单子叶植物是玉蜀黍、小麦、水稻、大麦、高粱、甘蔗或裸麦。

28.实施例24或25中任一项的细胞，其中所述植物细胞来自双子叶植物。

29.实施例28的细胞，其中所述双子叶植物是大豆、芸苔属植物、向日葵、棉花或苜蓿。

30.一种植物，包含实施例24-29中任一项的至少一种植物细胞。

31.一种植物外植体，包含实施例24-29中任一项的至少一种植物细胞。

32.一种由实施例30的植物所产生的转基因种子，其中所述种子包含所述重组多核苷酸。

33.一种由实施例1-20中任一项的多核苷酸编码的重组多肽。

34.一种将目标多肽靶向叶绿体的方法，包括在植物细胞中表达实施例1-20中任一项的重组多核苷酸或者实施例21或22的核酸构建体。

35.一种将目标多肽靶向叶绿体的方法，包括在植物细胞中引入实施例1-20中任一项的重组多核苷酸或者实施例21或22的核酸构建体，以及在植物细胞中表达所述重组多核苷酸。

36.实施例34或35的方法，其中所述方法还包括由所述植物细胞再生转基因植物。

37.实施例34-36中任一项的方法，其中所述植物细胞来自单子叶植物。

38.实施例37的方法，其中所述单子叶植物选自玉蜀黍、小麦、水稻、大麦、高粱、甘蔗或裸麦。

39.实施例34-36中任一项的方法，其中所述植物细胞来自双子叶植物。

40.实施例39的方法，其中所述双子叶植物选自大豆、芸苔属植物、向日葵、棉花或苜蓿。

41.实施例35-40中任一项的方法，其中所述目标多肽包含杀昆虫蛋白并且所述多肽的表达防治害虫。

42.实施例41的方法，其中所述目标多肽包含具有杀昆虫活性的苏云金芽孢杆菌多肽。

43.实施例42的方法，其中所述具有杀昆虫活性的苏云金芽孢杆菌多肽包含IP2-127多肽。

实验

提供以下实例以说明而不是限制所要求保护的本发明。应当理解，本文所述的实例和实施例仅出于举例说明的目的，本领域技术人员将认识到在不脱离本发明的精神或所附权利要求书的范围的情况下可改变多种试剂或参数。

实例1玉蜀黍的新型靶向叶绿体的多肽(CTP)的构造

使用N端转运肽使胞浆中翻译的核编码植物蛋白靶向叶绿体。CTP是正确叶绿体靶向所必要且充分的，这些信号肽具有可变长度和序列。虽然没有共有肽序列，但CTP的确共用相似的结构骨架，所述结构骨架由不带电荷N端、不含酸性残基但富含羟基化氨基酸的中央区域、以及富含碱性精氨酸的两亲C端。

采用两种方法，基于来自单子叶植物物种的一组已知或预测叶绿体转运肽的比对(参见图1)，来开发这些靶向肽。采用的第一种方法是基于上述不同CTP结构域的预测边界来生成嵌合CTP。新CTP可来源于3种或更多种不同植物CTP序列，这些序列在组合在一起时共同重构CTP。基于可见于图1的CTP比对，生成了一组5种不同嵌合CTP。msCTP1(SEQ IDNO：1：MALTTFSISRGGFVGALQGLKSTASLPNNESFSRHHLPSSSPQSSKRRCNLSFTTR)按先后次序由如下的结构域的组合构造：水稻(Os)1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶CTP(aa1-17)、玉米(Zm)ssRUBISCO CTP(aa18-27)和Zm-β-葡萄糖苷酶CTP(aa28-56)。msCTP2(SEQ ID NO：2：MGLSTVYSPAGPRLVPAPASLFQSPSSGCHSCWGPGPGGGRRLPSPRRRPITGTRS)按先后次序由如下的结构域的组合构造：Zm-苹果酸脱氢酶(NADP)CTP(aa1-17)、Os-过氧化物歧化酶(SOD)CTP(aa18-27)和Os-可溶性淀粉合酶CTP(aa28-52)。msCTP3(SEQ ID NO： 3：MLSARAAATAAAAAASPPQPRLAATFLVLPSKRALAPLLSVGRVATRRPRHVCQ)按先后次序由如下的结构域的组合构造：Os-NADP依赖型苹果酸酶CTP(aa1-17)、Os-磷酸-2-脱氢-3-脱氧庚糖酸(PHD)醛缩酶2 CTP(aa18—27)和ZmM型硫氧还蛋白(TRX)CTP(aa28-54)。msCTP4(SEQ ID NO：4：MGLSTVYSPAAAAAASPPQPRSTASLPGCHSCWGPGPLLSVGRVATRRPRHVCQ)按先后次序由如下的结构域的组合构造：Zm-苹果酸脱氢酶(NADP)CTP(aa1-9)、Os-NADP依赖型苹果酸酶CTP CTP(aa 10-21)、zm-ssRUBSICO CTP(aa 22-27)、Os-可溶性淀粉合酶CTP(aa 28-37)和Zm-硫氧还蛋白(TRX)CTP(aa 38-54)。msCTP4的设计整合了源自2个单独CTP的序列以用于第一和第三结构域。msCTP5(SE0 ID NO： 5：MGLSTVYSPAAAAAASPPSLRSTASLPARPFHSLRLAAGRRGFACRGRSAAS)按先后次序由如下的结构域的组合构造：Zm-苹果酸脱氢酶(NADP)CTP(aa 1-9)、Os-NADP依赖型苹果酸酶CTP CTP(aa 10-17)、Os-L-抗坏血酸过氧化物酶5(OsAPx05)(aa 18-21)；Zm-ssRUBSICO CTP(aa22—27)、Os-过氧化物歧化酶(OsSOD)CTP(aa 28-39)和Os-磷酸葡聚糖水二激酉每(OsPGDK)CTP(aa 40-52)。

第二种方法使用基于具有相似大小(50-60 aa)的不同CTP的比对在每个位置出现最频繁的氨基酸。在主要氨基酸残基不明显的一些情况下，选择出现更频繁的氨基酸残基之一整合到序列中。使用该策略构造两种CTP。msCTP6(SEQ ID NO：6：MALASVMAAAAASVVSFPAGRGSGGSSVLRSRALSLAGSRRSAAAVRRLAL)和msCTP7(SEQ ID NO： 7：MAVATVLAAAALAAVSPPGLRSSLGFPVVRRSLPSAARGGSPAATRRCRAA)。

使用该策略构造的不同CTP的氨基酸同一性水平的比较可见于表1。所有CTP之间的同源性在16％-64％范围内。

表1：msCTP同一性表。

msCTP1

msCTP3

msCTP4

msCTP5

msCTP2

msCTP6

msCTP7

msCTP1	16	26	28	16	20	22
							msCTP3	64	38	21	38	36
msCTP4			59	46	31	36
							msCTP5			33	34	44
msCTP2					35	26
							msCTP6					47
msCTP7

实例2.构造载体以便测试新型CTP将杀昆虫毒素靶向叶绿体的能力。

生成了瞬时表达载体以评价新型CTP将杀昆虫毒素IP2-127靶向玉蜀黍叶绿体的能力。该载体包含融合基因，其在N端具有IP2-127、在C端具有AcGFP并被短接头序列分隔(SEQ ID NO：8：ATGGGCAACAGCGTGCTCAACAGCGGACGCACCACCATCTGCGACGCCTACAACGTGGCCGCGCACGACCCGTTCAGCTTCCAGCACAAGAGCCTCGACACCGTGCAGCGCGAGTGGACCGAGTGGAAGAAGAACAACCACAGCCTCTACCTCGACCCGATCGTGGGCACCGTGGCCAGCTTCCTCCTCAAGAAGGTGGGCAGCCTCGTGGGCAAGCGCATCCTCAGCGAGCTGCGCAACCTCATCTTCCCGAGCGGCAGCACCAACCTCATGCAGGACATCCTCCGCGAGACCGAGCAGTTCCTCAACCAGCGCCTCGACACCGACACCCTCGCCAGGGTGAACGCCGAGCTGACCGGCCTCCAGGCCAACGTGGAGGAGTTCAACCGCCAGGTGGACAACTTCCTCAACCCGAACCGCAACGCCGTGCCGCTCAGCATCACCAGCAGCGTGAACACCATGCAGCAGCTCTTCCTCAACCGCCTCCCGCAGTTCCAGATGCAGGGCTACCAGCTCCTGCTCCTGCCGCTCTTCGCCCAGGCCGCCAACCTCCACCTCAGCTTCATCCGCGACGTGATCCTCAACGCCGACGAGTGGGGCATCAGCGCCGCCACCCTCCGCACCTACCGCGACTACCTCAAGAACTACACCCGCGACTACAGCAACTACTGCATCAACACCTACCAGAGCGCCTTCAAGGGCCTCAACACCCGCCTCCACGGCACCCTCGAGTTCCGCACCTACATGTTCCTCAACGTCTTCGAGTACGTGAGCATCTGGAGCCTCTTCAAGTACCAGAGCCTCCTCGTGAGCAGCGGCGCCAACCTCTACGCCAGCGGCAGCGGCCCGCAGCAGACCCAGAGCTTCACCAGCCAGGACTGGCCGTTCCTCTACAGCCTCTTCCAGGTGAACAGCAACTACGTGCTCAACGGCTTCAGCGGCGCCAGGCTCAGCAACACCTTCCCGAACATCGGCGGCCTCCCGGGCAGCACCACCACCCACGCCCTCCTCGCGGCCAGGGTGAACTACAGCGGCGGCATCAGCA GCGGCGACATCGGCGCCAGCCCGTTCAACCAGAACTTCAACTGCAGCACCTTCCTCCCGCCGCTCCTCACCCCGTTCGTGCGCAGCTGGCTCGATAGCGGCAGCGACCGCGAGGGCGTGGCCACCGTGACCAACTGGCAGACCGAGAGCTTCGAGACCACACTCGGGCTCAGGAGCGGCGCCTTCACCGCCCGCGGCAACAGCAACTACTTCCCGGACTACTTCATCCGGAACATCTCCGGCGTTCCGTTGGTGGTCCGTAACGAGGATCTCAGGAGGCCGCTGCACTACAACGAGATCCGCAACATCGCTTCGCCCAGCGGGACCCCAGGTGGAGCACGGGCCTACATGGTGTCCGTGCACAACCGGAAGAACAACATCCACGCGGTCCATGAGAACGGCAGCATGATCCACCTGGCTCCTAACGACTACACGGGGTTCACAATCTCTCCGATCCATGCTACTCAAGTCAACAACCAGACCAGGACGTTCATCTCGGAGAAGTTCGGCAACCAGGGAGACTCCTTGAGGTTCGAGCAGAACAACACAACTGCCCGCTACACCCTTCGGGGCAACGGGAACAGCTACAACCTCTACCTGCGCGTCAGCTCCATCGGCAACTCGACGATCAGGGTCACGATCAACGGAAGGGTCTACACTGCGACCAACGTGAACACGACAACTAACAACGACGGCGTCAACGACAACGGCGCTAGGTTCTCCGACATCAACATCGGGAACGTTGTGGCAAGCTCCAACTCGGATGTCCCTCTTGACATCAACGTCACCTTCAACTCTGGAACGCAGTTCGATCTGATGAACACAATGCTGGTGCCAACTAACATCAGCCCTCTGTACGGTGGAGGCGGCAGCGGTGGCGGAGGCTCCGGAGGCGGTGGCTCCATGGTGAGCAAGGGCGCCGAGCTGTTCACCGGCATCGTGCCCATCCTGATCGAGCTGAATGGCGATGTGAATGGCCACAAGTTCAGCGTGAGCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCTGTGCCCTGGCCCACCCTGGTGACCACCCTGAGCTACGGCGTGCAGTGCTTCTCACGCTACCCCGATCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGAGCGCCATGCCTGAGGGCTACATCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCGAGGATGACGGCAACTACAAGTCGCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGATACCCTGGTGAATCGCATCGAGCTGACCGGCACCGATTTCAAGGAGGATGGCAACATCCTGGGCAATAAGATGGAGTACAACTACAACGCCCACAATGTGTACATCATGACCGACAAGGCCAAGAATGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGATGGCAGCGTGCAGCTGGCCGACCACTACCAGCAGAATACCCCCATCGGCGATGGCCCTGTGCTGCTGCCCGATAACCACTACCTGTCCACCCAGAGCGCCCTGTCCAAGGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGATCTACTTCGGCTTCGTGACCGCCGCCGCCATCACCCACGGCATGGATGAGCTGTACAAGTGA)，此短接头序列编码了IP2-127-AcGFP融合蛋白(SEQ ID NO：9：MGNSVLNSGRTTICDAYNVAAHDPFSFQHKSLDTVQREWTEWKKNNHSLYLDPIVGTVASFLLKKVGSLVGKRILSELRNLIFPSGSTNLMQDILRETEQFLNQRLDTDTLARVNAELTGLQANVEEFNRQVDNFLNPNRNAVPLSITSSVNTMQQLFLNRLPQFQMQGYQLLLLPLFAQAANLHLSFIRDVILNADEWGISAATLRTYRDYLKNYTRDYSNYCINTYQSAFKGLNTRLHGTLEFRTYMFLNVFEYVSIWSLFKYQSLLVSSGANLYASGSGPQQTQSFTSQDWPFLYSLFQVNSNYVLNGFSGARLSNTFPNIGGLPGSTTTHALLAARVNYSGGISSGDIGASPFNQNFNCSTFLPPLLTPFVRSWLDSGSDREGVATVTNWQTESFETTLGLRSGAFTARGNSNYFPDYFIRNISGVPIVVRNEDLRRPLHYNEIRNIASPSGTPGGARAYMVSVHNRKNNIHAVHENGSMIHLAPNDYTGFTISPIHATQVNNQTRTFISEKFGNQGDSLRFEQNNTTARYTLRGNGNSYNLYLRVSSIGNSTIRVTINGRVYTATNVNTTTNNDG VNDNGARF SDINIGNVVAS SNSDVPLDINVTFNSGTQFDLMNTMLVPTNISPLYGGGGSGGGGSGGGGSMVSKGAELFTGIVPILIELNGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLSYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYIQERTIFFEDDGNYKSRAEVKFEGDTLVNRIELTGTDFKEDGNILGNKMEYN YNAHN VYIMTDKAKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMIYFGFVTAAAITHGMDELYK)，该蛋白包含氨基酸1-634的IP2-127、氨基酸635-649的短15aa接头和氨基酸650-888的AcGFP。IP2-127：：AcGFP融合基因受控于载体pSK-UBI-IP2-127：：AcGFP中的强组成型玉蜀黍泛素1启动子-5’UTR-内含子1调控元件，且具有pinII转录终止序列。该载体包含紧邻IP2-127翻译起始密码子上游的独特BamHI和KpnI限制性酶位点，以便于不同CTP序列在融合体N端的同框插入。

通过DNA2.0(加利福尼亚州门洛帕克(Menlo park，CA))合成不同的新型单子叶植物CTP。使用独特BamHI和KpnI限制性位点，将每个CTP亚克隆进pSK-UBI-IP2-127：：AcGFP。基础载体pSK-UBI-IP2-127：：AcGFP用作非CTP靶向的IP2-127：：AcGFP的对照。含有融合至通过基因改组得到的此前表征的CTP(6H1-CTP)(SEQ ID NO：10：MAATTLTSALPGAFSSSQRPSAPFNLQRSPRVLRRFNRKTGRQ

PRGLVRAAKAQ)的IP2-127：：AcGFP的载体用作瞬时表达测定中叶绿体靶向的阳性对照。

实例3：鉴定将IP2-127：：AcGFP有效靶向玉蜀黍叶绿体的新型CTP的瞬时表达测定

通过如下方式在无土人工条件下培育玉蜀黍籽苗：将籽粒埋入卷起来的两层种子萌发纸之间，并使其底部没入0.1mg/ml蔗糖溶液中。在种植后15天在与胶体金粒子进行弹道共轰击转化之前将叶段从籽苗截下。切离叶段的下表皮，并置于100mm培养皿中的滤纸顶部。

使用PDS-1000He生物射弹粒子递送系统(加利福尼亚州赫拉克勒斯的伯乐公司(Bio-Rad，Hercules CA))，将样品与来自DS-RED质粒载体的和单独CTP测试载体的DNA共轰击。按照修改后的Sanford等人(1993)所述的工序，用质粒DNA包被金粒子(直径1.0μm；伯乐公司)。简而言之，将50μl新鲜制备的水中的金粒子(20mg/m1)和20μl DNA混合物(其含有10μg等摩尔量的DS Red辅助质粒和CTP测试质粒)组合，并缓慢添加50μl2.5M CaCl2溶液和20μl新鲜制备的0.1M亚精胺(密苏里州圣路易斯的西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich，St Louis MO))同时温和地涡旋混合。在室温下温育混合物5分钟，在微型离心机中在13,000g条件下沉降5秒造粒。小心去除上清液，并将颗粒重悬于85μl的100％乙醇中。在温和地涡旋混合的同时，抽取6μl等分试样的悬浮液，并分配到巨载体膜的中心。使膜完全风干2-5分钟，然后立即使用。在距1100psi可裂膜9cm的距离处轰击叶段。每个包被制备物执行两次重复的射击。轰击后，将叶样品在28摄氏度的湿室中培养。

在轰击后大约24h用装配有绿光发射(蔡司透镜组10(Zeiss Set10))和红光发射(蔡司透镜组43HE(Zeiss Set43HE))滤光片组的Lumar荧光体视显微镜(纽约州索恩伍德的卡尔蔡司公司(Carl Zeiss Inc.，ThornwoodNY))进行初始检查使AcGFP和DsRed2分别成像。将含有体视显微镜中鉴定的AcGFP阳性细胞的叶段置于0.01％吐温20溶液中，施加真空约10分钟以去除内部空气并润湿叶面。将叶放入同一溶液中的盖玻片腔室(纽约州罗切斯特的纳格·南科国际(Nalge Nunc International，Rochester NY))中，用另外的盖玻片密封并在LSM510(卡尔蔡司公司)中进行检查。使用激发用的488nm氩激光器和500-550nm带通发射滤光片捕获AcGFP荧光。使用激发用的561nm二极管激光器和575-615nm带通发射滤光片，使DsRed荧光成像。通过将561nm激发光与650-710nm带通发射滤光片组合，来捕获叶绿素荧光。

DsRed表达用于评估总体转化率并且对于在共聚焦显微镜中鉴定转化的细胞非常有用。尽管轰击工序能以最高频率转化表皮细胞，但使用叶肉细胞评估质体靶向。质体靶向通过共定位AcGFP信号与叶绿素荧光来确定。质体靶向用共聚焦显微镜通过如下方式定量：将显示靶向质体的AcGFP的叶肉细胞数量计算为占转化细胞(即，呈现DsRed荧光的那些细胞)总数的百分比。

该分析的结果概括于表2中。在非靶向对照中观察到IP2-127：：AcGFP与叶绿体未共定位，其中AcGFP荧光唯一局限于胞浆区室。已发现，来自阳性对照6H1-CTP-IP2-127：：AcGFP的大部分AcGFP来源荧光共定位于叶绿体，得到最高水平+++的分数。msCTP1和msCTP4这两种CTP显示出与6H1CTP所观察到的等同水平的IP2-127：：AcGFP的叶绿体共定位。msCTP2和msCTP6将IP2-127：：AcGFP引导至叶绿体，然而观察到靶向叶绿体的和定位于胞浆的荧光之间具有等同信号。这表明这两种CTP在叶绿体靶向方面效率不如msCTP1或msCTP4。与叶绿体共定位相比，msCTP5引导更多IP2-127：：AcGFP胞浆定位，但观察到可检测水平的叶绿体共定位。msCTP7无法将任何IP2-127：：AcGFP引导至叶绿体，其类似于IP2-127：：AcGFP定位胞浆的非靶向对照。

表2：基于瞬时表达测定中AcGFP荧光与玉蜀黍叶绿体的共定位得出的新型CTP的叶绿体靶向效率。

构建体

与叶绿体共定位

IP2-127：：AcGFP(非靶向对照)	_
		6H1CTP-IP2-127：：AcGFP(靶向对照)	+++
msCTP1-IP2-127：：AcGFP	+++
		msCTP2-IP2-127：：AcGFP	++
msCTP3-IP2-127：：AcGFP	_
		msCTP4-IP2-127：：AcGFP	+++
msCTP5-IP2-127：：AcGFP	+
		msCTP6-IP2-127：：AcGFP	++
msCTP7-IP2-127：：AcGFP	_

+++IP2-127：：AcGFP大部分定位叶绿体

++在叶绿体和胞浆中检测到等同的IP2-127：：GFP。

+一些IP2-127：：AcGFP定位于叶绿体中但大部分定位于胞浆中

IP2-127：：GFP全部定位于胞浆中

实例4.新型CTP的转基因植物评价。

叶绿体靶向的效应从瞬时表达测定扩展至用不同msCTP表达IP2-127的稳定转基因事件。与非靶向时所观察到的相比，IP2-127的叶绿体靶向通常导致IP2-127在植物中有更高的积累量。该积累量差异可能与IP2-127在叶绿体中改善的稳定性相关和／或与转化过程中胞浆中IP2-127的高水平积累量有关的植物毒性问题相关。使用IP2-127和msCTP(mCTP1、mCTP2、msCTP4、msCTP5、msCTP6)的子集(其被选择来表示瞬时测定得出的不同定性结果)来形成转化载体。将重点放在瞬时实验中表现出一定的叶绿体共定位水平的那些msCTP。使用基础载体形成转化载体，所述基础载体包含在紧邻IP2-127翻译起始密码子上游具有独特BamHI和KpnI限制性酶位点的IP2-127基因。将msCTP中每一者亚克隆进BamHI和KpnI位点，产生具有msCTP蛋白序列和IP2-127蛋白序列的N端融合体。将该基因的非靶向形式或msCTP靶向形式置于玉蜀黍泛素1启动子-5’UTR-泛素内含子1控制之下，并终止于来自马铃薯的pinII终止序列，从而形成msCTP测试盒。使用Gateway^TMLR Clonase反应将msCTP测试盒引入二元转化载体中，由于该测试盒侧翼存在attL3和attL4重组位点且目的转化载体中存在attR3和attL4位点，促进了该反应。LR反应的最终产物为转化二元载体，所述转化二元载体包含msCTP-IP2-127测试盒，该盒的上游包含控制PAT选择性标志物基因表达的玉蜀黍泛素1启动子-5’UTR-泛素内含子1，并且含有35S终止序列。

通过ELISA评估来源于该组msCTP测试载体的转基因事件的IP2-127表达。ELISA分析的结果在表3中示出。IP2-127在胞浆中的积累量为511ppm。将6H1-CTP添加至IP2-127的N端使积累量提高了约2.5倍，达到了1294ppm，这证实了有效CTP对植物中IP21-27积累量的作用。msCTP1和msCTP4这两种CTP与非靶向形式相比使IP2-127积累量提高了约7.7倍和5倍，与6H1-CTP引导的积累水平相比提高了2-3倍。msCTP2和msCTP6显示出与6H1-CTP相当的积累水平，两种形式与非靶向IP2-127相比都使积累量提高了约2.5倍。使用msCTP5时未观察到IP2-127积累量的显著提高，因为积累水平与阴性对照相比仅提高约1.5倍。总的来说，转基因植物中IP2-127的积累量与瞬时表达测定中观察到的IP2-127：：AcGFP共定位结果密切相关。结果表明，开发新合成CTP的该策略能够有效提供新型叶绿体靶向肽，并且所开发msCTP中的多种提高了转基因玉蜀黍植物中IP2-127的积累量。

表3.转基因玉蜀黍事件中IP2-127的积累量。

构建体ID	所测试事件的数量	IP2-127表达(PPM)
			UBI-IP2-127	25	511
UBI-6H1-CTP-IP2-127	21	1294
			UBI-msCTP1-IP2-127	23	3931
UBI-msCTP2-IP2-127	24	1408
			UBI-msCTP4-IP2-127	25	2548
UBI-msCTP5-IP2-127	23	802
			UBI-msCTP6-IP2-127	25	1406

表4.CTP结构域汇总。

表5.SEQ ID NO汇总

本文所用的词语“一个”和“一种”指一个(种)或不止一个(种)(即，指至少一个(种))该词语的语法对象。举例说，“一个要素”是指一个或多个要素。

本说明书中提及的所有公布和专利申请指示了本发明所属领域的技术人员的水平。所有公布和专利申请在相同程度上全文以引用方式并入本文，如同每个单独的公布或专利申请被具体地和独立地指出全文以引用方式并入本文一样。

虽然为了清楚地理解而已经通过举例说明和实例较详细地描述了本发明，但显然可以在权利要求书范围内实施一些改变和修饰。

Claims

a)包含SEQ ID NO：6或7的氨基酸的氨基酸序列；

3.根据权利要求2所述的重组多核苷酸，其中所述N端结构域、所述中央结构域或所述C端结构域来自如下酶的CTP：水稻(Oryza sativa)1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶、水稻(Oryza sativa)过氧化物歧化酶、水稻(Oryza sativa)可溶性淀粉合酶、水稻(Oryza sativa)NADP依赖型苹果酸酶、水稻(Oryza sativa)磷酸-2-脱氢-3-脱氧庚糖酸醛缩酶2、水稻(Oryza sativa)L-抗坏血酸过氧化物酶5、水稻(Oryza sativa)磷酸葡聚糖水二激酶(Phosphoglucan water dikinase)、玉米(Zea Mays)ssRUBISCO、玉米(Zea Mays)β-葡萄糖苷酶、玉米(Zea Mays)苹果酸脱氢酶、玉米(Zea Mays)M型硫氧还蛋白或其活性变体。

4.根据权利要求2或3所述的重组多核苷酸，其中所述N端结构域来自如下酶的CTP：水稻(Oryza sativa)1-脱氧-D木酮糖-5-磷酸合酶、水稻(Oryza sativa)NADP依赖型苹果酸酶、玉米(Zea Mays)苹果酸脱氢酶或其活性变体。

5.根据权利要求2或3所述的重组多核苷酸，其中所述中央结构域来自如下酶的CTP：水稻(Oryza sativa)过氧化物歧化酶、水稻(Oryzasativa)磷酸-2-脱氢-3-脱氧庚糖酸醛缩酶2、水稻(Oryza sativa)L-抗坏血酸过氧化物酶5、玉米(ZeaMays)ssRUBISCO或其活性变体。

6.根据权利要求2或3所述的重组多核苷酸，其中所述C端结构域来自如下酶的CTP：水稻(Oryza sativa)可溶性淀粉合酶、水稻(Oryzasativa)过氧化物歧化酶、水稻(Oryza sativa)磷酸葡聚糖水二激酶(Phosphoglucan water dikinase)、玉米(Zea Mays)M型硫氧还蛋白、玉米(Zea Mays)β-葡萄糖苷酶或其活性变体。

7.根据权利要求2或3所述的重组多核苷酸，其中所述N端结构域来自所述水稻(Oryza sativa)1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶CTP或其活性变体，所述中央结构域来自所述玉米(Zea Mays)ssRUBISCO CTP或其活性变体，并且所述C端结构域来自所述玉米(Zea Mays)β-葡萄糖苷酶CTP或其活性变体。

8.根据权利要求2或3所述的重组多核苷酸，其中所述N端结构域来自所述玉米(Zea Mays)苹果酸脱氢酶CTP或其活性变体，所述中央结构域来自所述水稻(Oryza sativa)过氧化物歧化酶CTP或其活性变体，并且所述C端结构域来自所述水稻(Oryza sativa)可溶性淀粉合酶CTP或其活性变体。

9.根据权利要求2或3所述的重组多核苷酸，其中所述N端结构域来自所述水稻(Oryza sativa)NADP依赖型苹果酸酶CTP或其活性变体，所述中央结构域来自所述水稻(Oryza sativa)磷酸-2-脱氢-3-脱氧庚糖酸醛缩酶2CTP或其活性变体，并且所述C端结构域来自所述玉米(ZeaMays)M型硫氧还蛋白CTP或其活性变体。

10.根据权利要求2所述的重组多核苷酸，其中所述N端结构域、所述中央结构域或所述C端结构域中的至少一者包含嵌合结构域。

11.根据权利要求10所述的重组多核苷酸，其中所述嵌合N端结构域的至少一部分来自所述水稻(Oryza sativa)NADP依赖型苹果酸酶CTP、玉米(Zea Mays)苹果酸脱氢酶CTP或其活性变体的所述N端结构域。

12.根据权利要求10所述的重组多核苷酸，其中所述嵌合中央结构域的至少一部分来自所述水稻(Oryza sativa)L-抗坏血酸过氧化物酶5CTP、玉米(Zea Mays)ssRUBISCO CTP或其活性变体的所述中央结构域。

13.根据权利要求10所述的重组多核苷酸，其中所述嵌合C端结构域的至少一部分来自所述水稻(Oryza sativa)可溶性淀粉合酶CTP、玉米(Zea Mays)M型硫氧还蛋白CTP、水稻(Oryza sativa)过氧化物歧化酶CTP、水稻(Oryza sativa)磷酸葡聚糖水二激酶(Phosphoglucan waterdikinase)CTP或其活性变体的所述C端结构域。

14.根据权利要求10所述的重组多核苷酸，其中所述嵌合CTP包含

a)嵌合N端结构域，其中所述嵌合N端结构域包含来自所述玉米(Zea Mays)苹果酸脱氢酶CTP的所述N端结构域的一部分和与其同框融合的所述水稻(Oryza sativa)NADP依赖型苹果酸酶CTP的所述N端结构域的一部分；

b)中央结构域，其中所述中央结构域来自所述玉米(Zea Mays)ssRUBISCO CTP；以及

c)嵌合C端结构域，其中所述嵌合C端结构域包含来自所述水稻(Oryza sativa)可溶性淀粉合酶CTP的所述C端结构域的一部分和与其同框融合的来自所述玉米(Zea Mays)M型硫氧还蛋白CTP的所述C端结构域的一部分；

其中所述嵌合CTP具有CTP活性。

15.根据权利要求10所述的重组多核苷酸，其中所述嵌合CTP包含

b)嵌合中央结构域，其中所述嵌合中央结构域包含来自所述水稻(Oryza sativa)L-抗坏血酸过氧化物酶5CTP的所述中央结构域的一部分和与其同框融合的所述玉米(Zea Mays)ssRUBISCO CTP的所述中央结构域的一部分；以及

c)嵌合C端结构域，其中所述嵌合C端结构域包含来自所述水稻(Oryza sativa)过氧化物歧化酶CTP的所述C端结构域的一部分和与其同框融合的所述水稻(Oryza sativa)磷酸葡聚糖水二激酶(Phosphoglucan water dikinase)CTP的所述C端结构域的一部分；

其中所述嵌合CTP具有CTP活性。

16.根据权利要求3所述的重组多核苷酸，其中所述嵌合CTP包含

a)包含SEQ ID NO：1、2或3的氨基酸的氨基酸序列；

17.根据权利要求14所述的重组多核苷酸，其中所述嵌合CTP包含

a)包含SEQ ID NO：4的氨基酸的氨基酸序列；

18.根据权利要求15所述的重组多核苷酸，其中所述嵌合CTP包含

a)包含SEQ ID NO：5的氨基酸的氨基酸序列；

b)与SEQ ID NO：5具有至少85％序列同一性的氨基酸序列，其中

所述氨基酸序列具有CTP活性；或

c)具有SEQ ID NO：5的至少17个连续氨基酸的氨基酸序列，其中

所述氨基酸序列具有CTP活性。

19.根据权利要求1-18中任一项所述的重组多核苷酸，其中所述目标多肽包含具有杀昆虫活性的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)多肽。

20.根据权利要求19所述的重组多核苷酸，其中所述具有杀昆虫活性的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)多肽包含IP2-127多肽。

21.一种核酸构建体，包含根据权利要求1-20中任一项所述的重组多核苷酸。

22.根据权利要求21所述的核酸构建体，还包含可操作连接至所述重组多核苷酸的启动子。

23.一种细胞，包含根据权利要求1-20中任一项所述的至少一种重组多核苷酸或者根据权利要求21或22中任一项所述的核酸构建体。

24.根据权利要求23所述的细胞，其中所述细胞为植物细胞。

25.根据权利要求24所述的细胞，其中所述多核苷酸或核酸构建体稳定整合到所述植物细胞的基因组中。

26.根据权利要求24或25中任一项所述的细胞，其中所述植物细胞来自单子叶植物。

27.根据权利要求26所述的细胞，其中所述单子叶植物是玉蜀黍、小麦、水稻、大麦、高粱、甘蔗或裸麦。

28.根据权利要求24或25中任一项所述的细胞，其中所述植物细胞来自双子叶植物。

29.根据权利要求28所述的细胞，其中所述双子叶植物是大豆、芸苔属植物、向日葵、棉花或苜蓿。

30.一种植物，包含根据权利要求24-29中任一项所述的至少一种植物细胞。

31.一种植物外植体，包含根据权利要求24-29中任一项所述的至少一种植物细胞。

32.一种由根据权利要求30所述的植物所产生的转基因种子，其中所述种子包含所述重组多核苷酸。

33.一种由根据权利要求1-20中任一项所述的多核苷酸编码的重组多肽。

34.一种将目标多肽靶向至叶绿体的方法，包括在植物细胞中表达根据权利要求1-20中任一项所述的重组多核苷酸或者根据权利要求21或22所述的核酸构建体。

35.一种将目标多肽靶向至叶绿体的方法，包括在植物细胞中引入根据权利要求1-20中任一项所述的重组多核苷酸或者根据权利要求21或22所述的核酸构建体，以及在所述植物细胞中表达所述重组多核苷酸。

36.根据权利要求34或35所述的方法，其中所述方法还包括由所述植物细胞再生转基因植物。

37.根据权利要求34-36中任一项所述的方法，其中所述植物细胞来自单子叶植物。

38.根据权利要求37所述的方法，其中所述单子叶植物选自玉蜀黍、小麦、水稻、大麦、高粱、甘蔗或裸麦。

39.根据权利要求34-36中任一项所述的方法，其中所述植物细胞来自双子叶植物。

40.根据权利要求39所述的方法，其中所述双子叶植物选自大豆、芸苔属植物、向日葵、棉花或苜蓿。

41.根据权利要求35-40中任一项所述的方法，其中所述目标多肽包含杀昆虫蛋白并且所述多肽的表达控制害虫。

42.根据权利要求41所述的方法，其中所述目标多肽包含具有杀昆虫活性的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)多肽。

43.根据权利要求42所述的方法，其中所述具有杀昆虫活性的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)多肽包含IP2-127多肽。