JPH0284179A - 新規トランスアミナーゼおよびその製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 Ｌ−２−アミノー４−メチルホスフィノ酪酸（以下Ｌ−
ホスフィノスリシンまたはＬ−Ｐ）’Ｔと称する）また
はその塩は西ドイツ特許公開第２．９３９．２６９号の
記載からも知られているように化学合成で容易に入手し
うるラセミ化合物の活性成分である。

ラセミ化合物は西ドイツ特許公開第２．７１７．４４０
号の記載によれば多数の単子葉および双子葉の、−年生
および多年生雑草に対して非常に良好で幅広い除草活性
を有する。Ｌ　−ｐｐ’ｒおよびその前記した誘導体は
ラセミ化合物に比較して約２倍の活性を有するので、Ｌ
−ＰＰＴを簡単な方法で比較的大１＜入手しうる方法を
開発することが望まれていた。

Ｌ−ＰＰＴが微生物による酵素法により調製されうろこ
とは既に記載されている（ＥＰＱ、２４８，３５７）。

該明細書中にも、大腸菌ＤＨ−１が適当な前駆物質をＬ
−１１ｉ５０イシンおよびＬ−ホスフィノスリシンに変
換しうるトランスアミナーゼを有することが記載されて
いる。

今、大Ｍｔ菌ＤＨ−１カＬ−ホスフィノスリシンを驚く
ほど高い特異性を以て生成させる特異的なトランスアミ
ナーゼを合成することが見出された。

それゆえ、本発明は １）分子量２へ０００〜２５０，０００ダルトン、ｐＨ
五〇〜ａＯにある等電点、 ５．０〜１α０の範囲内にある最適ｐＨｓおよびアミノ
基供与体としてのＬ−ホスフィノスリシン−％ｒ−アζ
ノ酪酸およびグルタメート、ならびにアミノ基受容体と
しての適当なケト化合物に対する基質特異性、 を有する、大腸菌ＤＨ−１からのトランスアきナーゼ、 ２）大腸菌ＤＨＩを培養しそして前記トランスアミナー
ゼを単離することからなる前記１項の特性を有するトラ
ンスアミナーゼの製法、および ５）ＣＢ−カルボキシ−３−オキソ−プロピル）メチル
ホスフィ／酸のＬ−ホスフィノスリシンへのおよびスク
シネートヘミアルデヒドのｒ−アミノ酪酸への７ミノ交
換反応への前記１項の特性を有する）２ンスアミナーゼ
の使用、 に関する。

以下に本発明を％にその好ましい態様Ｋｉ４して詳細に
説明する。

トランスアミナーゼは大腸菌Ｄｌ’ｆ−１または適当な
突然変異体または変種から単離される。この目的には微
生物をその生育に最適な栄養培地中で培養する。微生物
の培養は例えば、場合により空気または酸素を導入しな
がら振盪フラスフまたを１発＃器中で振盪または攪拌下
に深部培養により好気的に行われる。発酵は約２０〜４
０’Ｃ１好ましくは約２５〜３７℃、特に３ｏ＾３７℃
で実施できる。ｐＨ５〜Ｂ、５、好ましくはｐＨ５，５
〜＆０で培養が行われる。これらの条件下に一般に１〜
３日後に培養プロス中に酵素がかなり蓄積する。トラン
スアミナーゼの合成は対数期の中ごろに始まり、そして
対数期の終わりに向かってその最大に達する。酵素の産
生はＩ（ＰＬＯ分析によるかまたは測光的に追跡できる
。

トランスアミナーゼの生成に用いられる栄養溶液はα２
〜５襲、好ましくはα５〜２−の有機窒素化合物ならび
に無機塩を含有する。有機ｉ！素化合物としては、アミ
ノ酸、はプトン、さらに肉エキス、例えばとうもろこし
、小麦、豆類、大豆または綿花植物の粉砕された種子、
アルコール製造の蒸留残渣、肉荒びき粉または酵母エキ
スが適当である。栄養溶液が含有しうる無機塩の例をあ
げればアルカリ金属またはアルカリ土類金属、鉄、亜鉛
およびマンガンの塩化物、次酸塩、硫酸塩または燐酸塩
、さらにアンモニウム塩および硝酸塩である。

酵素の単＃Ｉ′Ｉ！および精製は古典的方法によりリゾ
チームによる消化、硫酸アンモニウム沈澱、イオン交換
クロマトグラフィーおよびゲル透過り四マトグ２フィー
により行うことができる。

この酵素調製物は分子量２０，０００〜２５０，０００
ダルト／、好ましくは２５，０００〜１０Ｑ、０００ダ
ル）：／＠ｌＩＣ４０，０００〜５０，０００ダルドア
を有し、等電点がｐＨ五〇〜８．０好ましくは五５〜５
．５％に４．０〜５．０にあることを特徴とする。酵素
生成物の最適ｐＨは５，０〜１α（ｌｌｃ８．ｏ〜９０
にある。

精製されたトランスアミナーゼのｌ＆　？７Ｊの３３個
のＮ−末端アミノ酸がガス相シークエンサーにより決定
されておりそしてそれは次のとおりである：Ｍ＠を一人
ａｎ−Ｂ＠ｒ−人５ｎ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌ＠ｕ−Ｍｅ
ｔ−Ｇｌｎ−人ｒｇ−Ａｒｇ−８＠ｒ−Ｇｌｎ−Ａｌａ
−１１＠−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−
Ｇｌｎ−１１ｅ−Ｈｌｓ−Ｐｒｏ−１１ｅ−Ｐｈｅ−人
１ａ−Ａｓｐ−人ｒｇ−Ａ、ｌａ−Ｇｌｕ（Ｔｈｒ）−
Ａｇｎ−Ａｓｎ（Ｇｌｙ）。

このアミノ酸配列はこれまでに文献で知られているトラ
ンスアミナーゼと何らの相同性も有しない。

このトランスアミナーゼは文献上知られたインヒビター
である０−（カルボキシメチル）−ヒドロキシルアミン
により阻害でき、詳細には標準的なアッセイ条件下で（
実施例３、酵素活性ン約［１１〜１　ｐＭの０−（カル
ボキシメチル）−ヒドロキシルアミンにより５０チまで
阻害されつる。

この酵素は高温で驚くほど安定であることが研究により
判明した。従ってｒｎｌｇの精製において７０℃でこの
酵素を１０分間インキュベーションする操作を用いて熱
変性させるととくより他のタンツク質をトランスアミナ
ーゼから分離することができる。

２０種のタンツク性アミノ酸のどれも本発明によるトラ
ンスアミナーゼを用いて調製することはできない。この
ものはただ（３−力ルボキシ−３−オキソ−プロピル）
−メチルホスフィン酸およびスクシネートヘミアルデヒ
ドまたはそれらのエステルに対してのみ特異性を有して
いて、これら化合物から非タンパク性アミノ酸であるＬ
−ホスフィノスリシンおよびｒ−アミノ酪酸がグルタメ
ートからのアミノ基の伝達により調製されうる。適当な
ケト酸エステルとしては４ＨＣ低級アルキル（Ｃ１−Ｃ
６）−エステルが使用できる。

本発明により、有効量のトランスアミナーゼが遊離のま
たは固定化された形態でアミノ交換反応に使用できる。

固定化させるＫは例えば西ドイツ特許公開ｊＫ３．２５
″１３４１号および４２４４５９１号に記載されるよう
な知られた方法が適当である。

その際酢酸ビニルとジビニルエチレン／尿素からなる共
重合体を使用し、その表面のアセテート基を加水分解し
たのちオキシシラン基で修飾したものが特に好都合であ
ることが判明した。

このオキシラン基に本発明によるトランスアミナーゼが
高い効率で結合されうる。担体物質に結合した酵素は非
常に安定であることが判明し、そして長時間にわたり事
実上酵素活性の損失がないことが示された。酵素は必要
に応じ約５μ−の少量のピリドキサール燐酸を用い【再
生させるのが好都合である。

７５ノ交換反応は生理学的緩衝溶液中でｐＨ約４〜１２
好ましくはｐＨ８〜１０で行うことができ、従って酵素
活性が言うに足るほどの不利な影響な受けない。反応温
度は２０〜７０℃の範囲にあることができる。これより
低温では酵素反応が遅くなってゆき、一方これより高い
温度では酵素が漸進的に不活化される。酵素反応は２０
〜６０℃、好ましくは３０〜６０℃、脣＃ｃ４０〜５５
℃で行われる・ グルタメートおよびその塩が７ミノ供与体として用いら
れる。この反応にはアミノ供与体がα−ケト酸またはそ
のエステルに対し等モル量または過剰に用いられるのが
好都合であることが判明した。１：１〜５：１、好まし
くは１：１〜２：１の比率が適切であることが判った。

反応成分は水中における溶液としてまたは固形物質を同
時ｋまたは連続して添加することにより反応混合物に添
加できる。

形成された生成物は知られた方法によりイオン交換り四
マドグラフィーおよび噴霧乾燥を用いて反応溶液から単
離できる。

以下の実施例により本発明をさらに説明する。

−の記載は別に断わりなければ重ｊｌｋよるものとする
。

実施例　１ 大腸菌ＤＩ−１の培養 本発明によるトランスアミナーゼを得るためＫｗｋ生物
学において慣用のように大腸菌ＤＨＩをその菌株の耐久
形の凍結乾燥物から培養した。

培養ははじめ液体滅菌完全培地で行われた。生長した細
菌を次ｉｃ？ｊＩＡ菌ペトリシャーレ中の固形培養基上
で画線接種しモして次に単一コロニーをさらに液体培地
中で培養した。

液体培地２ カゼインにプトン　　　　１５９／を 肉Ｒプトン　　　　　　　五５９／を 塩化ナトリウム　　　　　　　５Ａ９／ＬｐＨ−値　　
　　　　　　　　７．５ 滅菌　　　　　　　　　　１２０℃、２０分固形培地： 液体培地と同じ組成だがさらに１５９／ｌの寒天を含有
する。

本発明によるトランスアミナーゼを得るための細菌のイ
ンキュベーションは振盪日中における、滅菌培地１ｔず
つを含有する５Ｌの三角フラスコ中の液体培地中で、３
７℃および２００ｒ１ｍで行われた。

対数増殖期の終りに遠心分離により細菌を収穫し、液体
窒素中で急速冷凍させそして一８０℃で貯蔵した。

実施例　２ 大腸ＩＤＥ−１からのトランスアミナーゼの単離冷凍さ
れた細菌を２倍量＜２ｄ／９細ｍ）の緩衝浪人（２０ｍ
Ｍ燐酸塩緩衝液、２０μＭピリドキサール燐酸、１０ｍ
Ｍメルカプトエタノール、（ｐＨ７ｏ）　）ＫｌｍＭの
フェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭ８Ｆ　）
を加えたものの中＜ａ濁させ、そして超音波（１５分間
）により崩解させた。

細胞屑を遠心分離により除去しそして透明な上清を硫酸
アンモニウム沈＃ＩＣより分別した。

所望のトランスアミナーゼ活性部分は硫酸アンモニウム
４０５１ｉ飽和と７〇−飽和の間で沈澱しそしてこれを
遠心分離により単離し、緩衝浪人に再懸濁しそして５０
倍量の緩衝浪人で透析した。

この透析物をｉｍＭα−ケトグルタレートの存在下に７
０℃で１０分間加熱しそして変性されたタンパク質を遠
心分離により除去した。透明な上清をα４５μＭメンプ
ランで一過したのち四級アミ７基を有するアガロースか
らなるアニオン交換体（Ｑ　−８＠ｐｈａｒｏａ＊　Ｈ
′ｐ、　Ｐｈａｒｍａｅｉａ　）をａｍｍ大人平衡化し
たちのく加えた。結合されなかったタン２り質を緩衝浪
人で洗うことＫより力２ムから除去し、結合されたタン
パク質は直線状グラジェント（緩衝液Ａ中０−１ＯＭ０
−１Ｏを用いてカラムから溶離しそして分別収集した。

トランスアミナーゼは約α５ＭＫＣｌで力２ムから洗浄
された。

酵素活性含有するフラクションを合し、容量を域中させ
るためにタンパク質を完全に溶液から沈澱させ（硫酸ア
ンモニウム８０チ飽和）＋して分別範囲１０〜４００に
ダルトンを有するゲル濾過カラム（Ｕｌｔｒｏｇｅｌ　
Ａｏ人４４．８ｅｒｖａ　）で分別した。このゲル一過
で用いられる機衝液は２０ｍＭビイ２ジン−ＮＵＮ’　
−（２−エタンスルホン酸）、１０μＭピリドキサール
燐酸、５吐２−メルカプトエタノール、ＣＬＩＭ　ＩＣ
Ｃｔ（ｐＨ７，０）　テアツタｏ　”’ルシ過後に得ら
れた酵素活性を有するフラクシヨンを２５　ｍＭイミダ
ゾール（ｐＨ７，５）で透析しそして得られたタンパク
質をその等電点に従い、Ｐｏ１ｙｂｕｆｆ＠ｒ　７４　
（Ｐｈａｒｍａｅｉａ製）を含有するＰｏＬ）ｒ−ｂｕ
ｆｆ＠ｒ交換体９４　（Ｐｈａｒｍａｏｉａ社）で分別
した。

本発明によるシランスアミナーゼはｐＨ４，３５でカラ
ムから溶離された。酵素活性を有するフラクション中の
タンノ擢り質を溶液から完全に沈澱させ（硫酸アンモニ
ウム８０１）、緩衝浪人で透析しそして四級アミ７基を
有するアガロースからなる高度分解性アニオン交換体（
Ｍｏｎｏ　Ｑ　。

Ｐｈａｒｍａｅｉａ製）でりＯＹトゲラフイーした（Ｑ
−セファ四−スＨＰ　Ｋ記載と同じａ！衝系）。この精
製工程後にトランスアミナーゼからすべての異種タンパ
ク質が除資された。

実施例　３ 酵素の特性化 分子量的４４，０００ダルトン（ポリアクリルアミド８
Ｄ８ゲル電気泳動により測定）、 等電点ｐＨ４，３５（Ｐｈａｒｍａｏｉａ社のＰＢＥ　
９４　／Ｐｏ１７−ｂｕｆｆ會ｒでの等電点クロマトグ
ラフィーにより測定）、 酵素活性。

＃素活性はアミ７基受容体としてのα−ケトグルタレー
トの存在下にＬ　−ＰＰ’Ｉ’のアミン交換反応を測定
することＫよるか（アッセイ１）、またはアきノ基供与
体としてのグルタメートを用いる（３−カルボキシ−６
−オキソ−プロビル）−メチル−ホスフィン酸からのＬ
−ＰＰＴの生成を測定するととくよＦ）（アッセイ２）
ｉｌ定された。

いずれのアッセイからもほぼ等しい結果を生じ、従って
より容易に実施できることからアッセイ１がルーチンに
用いられた。

アッセイ１： １００ｍＭ）リス（ヒドロ午ジメチル）−アミノメタン
（トリス）／１０μＭピリドキサール燐酸（ｐＨ７，５
）中の１０　ｍＭ　ＰＰＴおよび１Ｑ　ｍＭ　ａ−ケト
グルタレートを６０℃で３０分間インキュベートした・
形成されたグルタメートをＭｏｔｈｏｃｌａ　ｉｎｌｎ
ｚｙｍｏｌｏｇｙ、　１１　Ｓ、２４５記載の方法によ
りグルタメートデヒドロゲナーゼと反応させるととくよ
り測定した。

アッセイ２： ＰＰＴおよびａ−ケトグルタレートの代りに１０ｍＭの
（３−カルボキシ−３−オキソープはピル）−メチル−
ホスフィン酸および１０ｍＭのグルタメートを用いる以
外はアッセイ１におけると同様にした。形成されたＬ　
−ＰＰＴはアミノ酸アナライザーを用いて検出した。

これらアッセイを用いて、精製されたタンノ膚り質につ
いての酵素比活性２６５　ｎｋａｔ　／Ｔｑタンパク質
）　（１ｋａｔａｔｍ１秒当り１モル転換）が測定され
た。

かくして測定された酵素反応の最適ｐＨは約９、そして
最適温度は約５５℃であった。

精製されたトランスアミナーゼの最初の４０個のＮ−末
端アミノ酸の配列をガス相シークエンサーで調べると次
のとおりであった：　Ｍ＠ｔ−Ａｓｎ−１３ｏｒ−人ａ
ｎ−Ｌｙａ−Ｇｌｕ−Ｌ＠ｕ−Ｍｅｔ−（）ｌｎ−−Ｖ
ｇ−Ａｒｇ−８＃ｒ−Ｇｌｎ−人１＆−１１ｅ−Ｐｒｏ
−人ｒｇ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｘ　ｌ　
＠−Ｈ１ｔｓ−Ｐｒ　ｏ　−Ｉ　ｌ　ｅ−Ｐｈｅ−Ａｌ
ａ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｕ（’Ｉｈｒ）−Ａ
ｓｎ−Ａｓｎ（Ｇｌｙ）−２０゜ 実施例　４ 精製トランスアミナーゼを用いるＬ　−ＰＰＴの生成 精製トランスアミナーゼを５０ｍＭ）！ｊス／１０μＭ
ピリドキサール燐酸（ｐａ９ｏ）中の１１η／ｄ濃度（
酵素比活性１５０ハ１ン／セク質）で３０り／ｌのナト
リウム（３−カルボキシ−３−オキソ−プロピル）−メ
チルホスフィネートおよび６０り／ｌのＬ−グルタメー
トと５５℃でインキエベートした００〜２４時間のイン
キュベーション期間中試料を採取した。試料採取後酵素
を９５℃で１０分間変性させ、遠心により除去しそして
上清をアミノ酸アナライザー中でＬ−ホスフィノスリシ
ンの形成に関して調べた。その際転換速度は毎時Ｌ−Ｐ
Ｐ’ｒ　１６．６９／ｌＦｃ達した。酵素濃度を高める
ととＫよりこの収量をもつと改良することもできる。

反応終了後、用いられたα−ケト酸の９４．５％がＬ　
−ＰＰＴ　ｋ転換されていたＣ２Ｂ、３９／ｌ）。

実施例　５ トランスアミナーゼの固定 実施例２で部分的に精製された酵素フックシ冒ンをトラ
ンスアミナーゼの固定に用いた。この酵素調製物におい
ては総タンパク質の約２０−がトランスアミナーゼであ
りそして酵素活性は７６．４　ｎ　ｋａｔ／＋＋ｄ　（
１ｋａｔ麿１　ｋａｔａｔｚｌ　％に転換７秒）であっ
た。

１Ｍ燐酸カリウム緩衝液（ｐＨ８，０）中のこのトラン
スアミナーゼ調製物４７ｍを８ｇのポリマー担体ＶＡ−
Ｅｐｏｘｙ　Ｂｉｏａｙｎｔｈ■（Ｒｌｅｄｅｌ　ａｓ
　Ｈａｈｎ社製）ｋ加えこの混合物を室温で２日間揺り
動かした。

下記３１１の緩衝液、すなわち （１）　　５０ｍＭ１＄酸カリウム緩衝液、ｐＨｌ、（
２）１Ｍ燐酸カリウム緩衝液、ｐＨ８，０および（３）
　　５０−燐酸カリウム緩衝液、ｐＨ７，０で洗浄した
のち３１グの湿った樹脂が得られた。

過剰のオキシ２ン晟はこの樹脂を１０ｍＭの２−メルカ
プトエタノー／’（５０ｍＭ燐酸カリウム緩衝液中）と
１時間インキュベーションするととＫより変換させた。

との担体樹脂はカップリング後に酵素活性１９７５ｎｋ
ａｔ　（６４ｍｋａｔ／Ｖ　１Ｍｍ樹脂）を有しており
、これはカップリング収率ＳＳ＊ｌＣ相当する。

このものはα０２−のナトリウムアジドを含有する５０
１ＥＬＭ燐酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，０）中４℃で貯
蔵した。

実施例　６ 固定化トランスアミナーゼを用いるＬ　−ＰＰＴの生成

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）分子量２０，０００〜２５０，０００ダルトン、ｐ
   Ｈ３．０〜８．０にある等電点、５．０〜１０．０の範
   囲内にある最適ｐＨ、およびアミノ基供与体としてのＬ
   −ホスフィノスリシン、γ−アミノ酪酸およびグルタメ
   ート、ならびにアミノ基受容体としての適当なケト化合
   物に対する基質特異性、 を有する、大腸菌ＤＨ−１からのトランスアミナーゼ。 ２）分子量２５，０００〜１００，０００ダルトン、ｐ
   Ｈ３．５〜５．５にある等電点、および ８．０〜９．０の範囲内にある最適ｐＨ、 を有する請求項１記載のトランスアミナーゼ。 ３）大腸菌ＤＨ−１を培養しそしてトランスアミナーゼ
   を単離することからなる請求項１または２記載のトラン
   スアミナーゼの製法。 ４）２０〜４０℃で培養が行われることからなる請求項
   ３記載の方法。 ５）２５〜３７℃で培養が行われることからなる請求項
   ４記載の方法。 ６）ｐＨ５〜８．５で培養が行われることからなる請求
   項３〜５のいずれかに記載の方法。 ７）ｐＨ５．５〜８．０で培養が行われることからなる
   請求項６記載の方法。 ８）（３−カルボキシ−３−オキソ−プロピル）−メチ
   ルホスフィン酸またはそのエステルおよびスクシネート
   ヘミアルデヒドまたはそのエステルのアミノ交換反応へ
   の請求項１または２記載のトランスアミナーゼの使用。 ９）アミノ交換反応が２０〜６０℃で行われることから
   なる請求項８記載の使用。 １０）アミノ交換反応がｐＨ４〜１２で行われることか
   らなる請求項８または９記載の使用。 １１）トランスアミナーゼが固定化された状態で使用さ
   れることからなる請求項８〜１０のいずれかに記載の使
   用。 １２）担体物質として酢酸ビニルとジビニルエチレン−
   尿素からなる共重合体が使用されることからなる請求項
   １１記載の使用。