JP2883635B2 - 新規トランスアミナーゼおよびその製法 - Google Patents
新規トランスアミナーゼおよびその製法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 Ｌ−２−アミノ−４−メチルホスフイノ酪酸（以下Ｌ
−ホスフイノスリシンまたはＬ−PPTと称する）または
その塩は西ドイツ特許公開第2,939,269号の記載からも
知られているように化学合成で容易に入手しうるラセミ
化合物の活性成分である。ラセミ化合物は西ドイツ特許
公開第2,717,440号の記載によれば多数の単子葉および
双子葉の、一年生および多年生雑草に対して非常に良好
で幅広い除草活性を有する。Ｌ−PPTおよびその前記し
た誘導体はラセミ化合物に比較して約２倍の活性を有す
るので、Ｌ−PPTを簡単な方法で比較的大量に入手しう
る方法を開発することが望まれていた。
−ホスフイノスリシンまたはＬ−PPTと称する）または
その塩は西ドイツ特許公開第2,939,269号の記載からも
知られているように化学合成で容易に入手しうるラセミ
化合物の活性成分である。ラセミ化合物は西ドイツ特許
公開第2,717,440号の記載によれば多数の単子葉および
双子葉の、一年生および多年生雑草に対して非常に良好
で幅広い除草活性を有する。Ｌ−PPTおよびその前記し
た誘導体はラセミ化合物に比較して約２倍の活性を有す
るので、Ｌ−PPTを簡単な方法で比較的大量に入手しう
る方法を開発することが望まれていた。
Ｌ−PPTが微生物による酵素法により調製されうるこ
とは既に記載されている（EP0,248,357）。該明細書中
にも、大腸菌DH−１が適当な前駆物質をＬ−第３ロイシ
ンおよびＬ−ホスフイノスリシンに変換しうるトランス
アミナーゼを有することが記載されている。
とは既に記載されている（EP0,248,357）。該明細書中
にも、大腸菌DH−１が適当な前駆物質をＬ−第３ロイシ
ンおよびＬ−ホスフイノスリシンに変換しうるトランス
アミナーゼを有することが記載されている。
今、大腸菌DH−１がＬ−ホスフイノスリシンを驚くほ
ど高い特異性を以て生成させる特異的なトランスアミナ
ーゼを合成することが見出された。
ど高い特異性を以て生成させる特異的なトランスアミナ
ーゼを合成することが見出された。
それゆえ、本発明は １）分子量20,000〜250,000ダルトン、 pH3.0〜8.0にある等電点、 5.0〜10.0の範囲内にある最適pH、および アミノ基供与体としてのＬ−ホスフイノスリシン、
γ−アミノ酪酸およびグルタメート、ならびにアミノ基
受容体としての適当なケト化合物に対する基質特異性、 を有する、大腸菌DH−１からのトランスアミナーゼ、 ２）大腸菌DH−１を培養しそして前記トランスアミナー
ゼを単離することからなる前記１項の特性を有するトラ
ンスアミナーゼの製法、 および ３）（３−カルボキシ−３−オキソ−プロピル）メチル
ホスフイン酸のＬ−ホスフイノスリシンへのおよびスク
シネートヘミアルデヒドのγ−アミノ酪酸へのアミノ交
換反応への前記１項の特性を有するトランスアミナーゼ
の使用、 に関する。
γ−アミノ酪酸およびグルタメート、ならびにアミノ基
受容体としての適当なケト化合物に対する基質特異性、 を有する、大腸菌DH−１からのトランスアミナーゼ、 ２）大腸菌DH−１を培養しそして前記トランスアミナー
ゼを単離することからなる前記１項の特性を有するトラ
ンスアミナーゼの製法、 および ３）（３−カルボキシ−３−オキソ−プロピル）メチル
ホスフイン酸のＬ−ホスフイノスリシンへのおよびスク
シネートヘミアルデヒドのγ−アミノ酪酸へのアミノ交
換反応への前記１項の特性を有するトランスアミナーゼ
の使用、 に関する。
以下に本発明を特にその好ましい態様に関して詳細に
説明する。
説明する。
トランスアミナーゼは大腸菌DH−１または適当な突然
変異体または変種から単離される。この目的には微生物
をその生育に最適な栄養培地中で培養する。微生物の培
養は例えば、場合により空気または酸素を導入しながら
振盪フラスコまたは発酵器中で振盪または撹拌下に深部
培養により好気的に行われる。発酵は約20〜40℃、好ま
しくは約25〜37℃、特に30〜37℃で実施できる。pH5〜
8.5、好ましくはpH5.5〜8.0で培養が行われる。これら
の条件下に一般に１〜３日後に培養ブロス中に酵素がか
なり蓄積する。トランスアミナーゼの合成は対数期の中
ごろに始まり、そして対数期の終わりに向かつてその最
大に達する。酵素の産生はHPLC分析によるかまたは測光
的に追跡できる。
変異体または変種から単離される。この目的には微生物
をその生育に最適な栄養培地中で培養する。微生物の培
養は例えば、場合により空気または酸素を導入しながら
振盪フラスコまたは発酵器中で振盪または撹拌下に深部
培養により好気的に行われる。発酵は約20〜40℃、好ま
しくは約25〜37℃、特に30〜37℃で実施できる。pH5〜
8.5、好ましくはpH5.5〜8.0で培養が行われる。これら
の条件下に一般に１〜３日後に培養ブロス中に酵素がか
なり蓄積する。トランスアミナーゼの合成は対数期の中
ごろに始まり、そして対数期の終わりに向かつてその最
大に達する。酵素の産生はHPLC分析によるかまたは測光
的に追跡できる。
トランスアミナーゼの生成に用いられる栄養溶液は0.
2〜５％、好ましくは0.5〜２％の有機窒素化合物ならび
に無機塩を含有する。有機窒素化合物としては、アミノ
酸、ペプトン、さらに肉エキス、例えばとうもろこし、
小麦、豆類、大豆または綿花植物の粉砕された種子、ア
ルコール製造の蒸留残渣、肉荒びき粉または酵母エキス
が適当である。栄養溶液が含有しうる無機塩の例をあげ
ればアルカリ金属またはアルカリ土類金属、鉄、亜鉛お
よびマンガンの塩化物、炭酸塩、硫酸塩または燐酸塩、
さらにアンモニウム塩および硝酸塩である。
2〜５％、好ましくは0.5〜２％の有機窒素化合物ならび
に無機塩を含有する。有機窒素化合物としては、アミノ
酸、ペプトン、さらに肉エキス、例えばとうもろこし、
小麦、豆類、大豆または綿花植物の粉砕された種子、ア
ルコール製造の蒸留残渣、肉荒びき粉または酵母エキス
が適当である。栄養溶液が含有しうる無機塩の例をあげ
ればアルカリ金属またはアルカリ土類金属、鉄、亜鉛お
よびマンガンの塩化物、炭酸塩、硫酸塩または燐酸塩、
さらにアンモニウム塩および硝酸塩である。
酵素の単離および精製は古典的方法によりリゾチーム
による消化、硫酸アンモニウム沈澱、イオン交換クロマ
トグラフイーおよびゲル透過クロマトグラフイーにより
行うことができる。
による消化、硫酸アンモニウム沈澱、イオン交換クロマ
トグラフイーおよびゲル透過クロマトグラフイーにより
行うことができる。
この酵素調製物は分子量20,000〜250,000ダルトン、
好ましくは25,000〜100,000ダルトン特に40,000〜50,00
0ダルトンを有し、等電点がpH3.0〜8.0好ましくは3.5〜
5.5特に4.0〜5.0にあることを特徴とする。酵素生成物
の最適pHは5.0〜10.0特に8.0〜9.0にある。
好ましくは25,000〜100,000ダルトン特に40,000〜50,00
0ダルトンを有し、等電点がpH3.0〜8.0好ましくは3.5〜
5.5特に4.0〜5.0にあることを特徴とする。酵素生成物
の最適pHは5.0〜10.0特に8.0〜9.0にある。
精製されたトランスアミナーゼの最初の33個のＮ−末
端アミノ酸がガス相シークエンサーにより決定されてお
りそしてそれは次のとおりである:Met−Asn−Ser−Asn
−Lys−Glu−Leu−Met−Gln−Arg−Arg−Ser−Gln−Ala
−Ile−Pro−Arg−Gly−Val−Gly−Gln−Ile−His−Pro
−Ile−Phe−Ala−Asp−Arg−Ala−Glu（Thr）−Asn−A
sn（Gly）。
端アミノ酸がガス相シークエンサーにより決定されてお
りそしてそれは次のとおりである:Met−Asn−Ser−Asn
−Lys−Glu−Leu−Met−Gln−Arg−Arg−Ser−Gln−Ala
−Ile−Pro−Arg−Gly−Val−Gly−Gln−Ile−His−Pro
−Ile−Phe−Ala−Asp−Arg−Ala−Glu（Thr）−Asn−A
sn（Gly）。
このアミノ酸配列はこれまでに文献で知られているト
ランスアミナーゼと何らの相同性も有しない。
ランスアミナーゼと何らの相同性も有しない。
このトランスアミナーゼは文献上知られたインヒビタ
ーであるＯ−（カルボキシメチル）−ヒドロキシルアミ
ンにより阻害でき、詳細には標準的なアツセイ条件下で
（実施例３、酵素活性）約0.1〜１μＭのＯ−（カルボ
キシメチル）−ヒドロキシルアミンにより50％まで阻害
されうる。
ーであるＯ−（カルボキシメチル）−ヒドロキシルアミ
ンにより阻害でき、詳細には標準的なアツセイ条件下で
（実施例３、酵素活性）約0.1〜１μＭのＯ−（カルボ
キシメチル）−ヒドロキシルアミンにより50％まで阻害
されうる。
この酵素は高温で驚くほど安定であることが研究によ
り判明した。従つて酵素の精製において70℃でこの酵素
を10分間インキユベーシヨンする操作を用いて熱変性さ
せることにより他のタンパク質をトランスアミナーゼか
ら分離することができる。
り判明した。従つて酵素の精製において70℃でこの酵素
を10分間インキユベーシヨンする操作を用いて熱変性さ
せることにより他のタンパク質をトランスアミナーゼか
ら分離することができる。
20種のタンパク性アミノ酸のどれも本発明によるトラ
ンスアミナーゼを用いて調製することはできない。この
ものはただ（３−カルボキシ−３−オキソ−プロピル）
−メチルホスフイン酸およびスクシネートヘミアルデヒ
ドまたはそれらのエステルに対してのみ特異性を有して
いて、これらの化合物から非タンパク性アミノ酸である
Ｌ−ホスフイノスリシンおよびγ−アミノ酪酸がグルタ
メートからのアミノ基の伝達により調製されうる。適当
なケト酸エステルとしては特に低級アルキル（C1−C6）
−エステルが使用できる。
ンスアミナーゼを用いて調製することはできない。この
ものはただ（３−カルボキシ−３−オキソ−プロピル）
−メチルホスフイン酸およびスクシネートヘミアルデヒ
ドまたはそれらのエステルに対してのみ特異性を有して
いて、これらの化合物から非タンパク性アミノ酸である
Ｌ−ホスフイノスリシンおよびγ−アミノ酪酸がグルタ
メートからのアミノ基の伝達により調製されうる。適当
なケト酸エステルとしては特に低級アルキル（C1−C6）
−エステルが使用できる。
本発明により、有効量のトランスアミナーゼが遊離の
または固定化された形態でアミノ交換反応に使用でき
る。固定化させるには例えば西ドイツ特許公開第3,237,
341号および3,243,591号に記載されるような知られた方
法が適当である。その際酢酸ビニルとジビニルエチレン
／尿素からなる共重合体を使用し、その表面のアセテー
ト基を加水分解したのちオキシラン基で修飾したものが
特に好都合であることが判明した。このオキシラン基に
本発明によるトランスアミナーゼが高い効率で結合され
うる。担体物質に結合した酵素は非常に安定であること
が判明し、そして長時間にわたり事実上酵素活性の損失
がないことが示された。酵素は必要に応じ約５μＭの少
量のピリドキサール燐酸を用いて再生させるのが好都合
である。
または固定化された形態でアミノ交換反応に使用でき
る。固定化させるには例えば西ドイツ特許公開第3,237,
341号および3,243,591号に記載されるような知られた方
法が適当である。その際酢酸ビニルとジビニルエチレン
／尿素からなる共重合体を使用し、その表面のアセテー
ト基を加水分解したのちオキシラン基で修飾したものが
特に好都合であることが判明した。このオキシラン基に
本発明によるトランスアミナーゼが高い効率で結合され
うる。担体物質に結合した酵素は非常に安定であること
が判明し、そして長時間にわたり事実上酵素活性の損失
がないことが示された。酵素は必要に応じ約５μＭの少
量のピリドキサール燐酸を用いて再生させるのが好都合
である。
アミノ交換反応は生理学的緩衝溶液中でpH約４〜12好
ましくはpH8〜10で行うことができ、従つて酵素活性が
言うに足るほどの不利な影響を受けない。反応温度は20
〜70℃の範囲にあることができる。これより低温では酵
素反応が遅くなつてゆき、一方これより高い温度では酵
素が漸進的に不活化される。酵素反応は20〜60℃、好ま
しくは30〜60℃、特に40〜55℃で行われる。
ましくはpH8〜10で行うことができ、従つて酵素活性が
言うに足るほどの不利な影響を受けない。反応温度は20
〜70℃の範囲にあることができる。これより低温では酵
素反応が遅くなつてゆき、一方これより高い温度では酵
素が漸進的に不活化される。酵素反応は20〜60℃、好ま
しくは30〜60℃、特に40〜55℃で行われる。
グルタメートおよびその塩がアミノ供与体として用い
られる。この反応にはアミノ供与体がα−ケト酸または
そのエステルに対し等モル量または過剰に用いられるの
が好都合であることが判明した。1:1〜5:1、好ましくは
1:1〜2:1の比率が適切であることが判つた。反応成分は
水中における溶液としてまたは固形物質を同時にまたは
連続して添加することにより反応混合物に添加できる。
られる。この反応にはアミノ供与体がα−ケト酸または
そのエステルに対し等モル量または過剰に用いられるの
が好都合であることが判明した。1:1〜5:1、好ましくは
1:1〜2:1の比率が適切であることが判つた。反応成分は
水中における溶液としてまたは固形物質を同時にまたは
連続して添加することにより反応混合物に添加できる。
形成された生成物は知られた方法によりイオン交換ク
ロマトグラフイーおよび噴霧乾燥を用いて反応溶液から
単離できる。
ロマトグラフイーおよび噴霧乾燥を用いて反応溶液から
単離できる。
以下の実施例により本発明をさらに説明する。％の記
載は別に断わりなければ重量によるものとする。
載は別に断わりなければ重量によるものとする。
実施例 １ 大腸菌DH−１の培養 本発明によるトランスアミナーゼを得るために微生物
学において慣用のように大腸菌DH−１をその菌株の耐久
形の凍結乾燥物から培養した。培養ははじめ液体滅菌完
全培地で行われた。生長した細菌を次に滅菌ペトリシヤ
ーレ中の固形培養基上で画線接種しそして次に単一コロ
ニーをさらに液体培地中で培養した。
学において慣用のように大腸菌DH−１をその菌株の耐久
形の凍結乾燥物から培養した。培養ははじめ液体滅菌完
全培地で行われた。生長した細菌を次に滅菌ペトリシヤ
ーレ中の固形培養基上で画線接種しそして次に単一コロ
ニーをさらに液体培地中で培養した。
液体培地： カゼインペプトン 3.5g/ 肉ペプトン 3.5g/ 塩化ナトリウム 5.1g/ pH−値 7.5 滅菌 120℃、20分 固形培地： 液体培地と同じ組成だがさらに15g/の寒天を含有す
る。
る。
本発明によるトランスアミナーゼを得るための細菌の
インキユベーシヨンは振盪器中における、滅菌培地１
ずつを含有する５の三角フラスコ中の液体培地中で、
37℃および200rpmで行われた。
インキユベーシヨンは振盪器中における、滅菌培地１
ずつを含有する５の三角フラスコ中の液体培地中で、
37℃および200rpmで行われた。
対数増殖期の終りに遠心分離により細菌を収穫し、液
体窒素中で急速冷凍させそして−80℃で貯蔵した。
体窒素中で急速冷凍させそして−80℃で貯蔵した。
実施例 ２ 大腸菌DH−１からのトランスアミナーゼの単離 冷凍された細菌を２倍量（2ml/g細菌）の緩衝液Ａ（2
0mM燐酸塩緩衝液、20μＭピリドキサール燐酸、10mMメ
ルカプトエタノール、（pH7.0））に1mMのフエニルメチ
ルスルホニルフルオライド（PMSF）を加えたものの中に
懸濁させ、そして超音波（15分間）により崩解させた。
0mM燐酸塩緩衝液、20μＭピリドキサール燐酸、10mMメ
ルカプトエタノール、（pH7.0））に1mMのフエニルメチ
ルスルホニルフルオライド（PMSF）を加えたものの中に
懸濁させ、そして超音波（15分間）により崩解させた。
細胞屑を遠心分離により除去しそして透明な上清を硫
酸アンモニウム沈澱により分別した。所望のトランスア
ミナーゼ活性部分は硫酸アンモニウム40％飽和と70％飽
和の間で沈澱しそしてこれを遠心分離により単離し、緩
衝液Ａに再懸濁しそして50倍量の緩衝液Ａで透析した。
酸アンモニウム沈澱により分別した。所望のトランスア
ミナーゼ活性部分は硫酸アンモニウム40％飽和と70％飽
和の間で沈澱しそしてこれを遠心分離により単離し、緩
衝液Ａに再懸濁しそして50倍量の緩衝液Ａで透析した。
この透析物を1mMα−ケトグルタレートの保存下に70
℃で10分間加熱しそして変性されたタンパク質を遠心分
離により除去した。透明な上清を0.45μＭメンブランで
過したのち四級アミノ基を有するアガロースからなる
アニオン交換体（Ｑ−Sepharose HP ,Pharmacia）を緩
衝液Ａで平衡化したものに加えた。結合されなかつたタ
ンパク質を緩衝液Ａで洗うことによりカラムから除去
し、結合されたタンパク質は直線状グラジエント（緩衝
液Ａ中０〜1.0M KCl）を用いてカラムから溶離しそして
分別収集した。トランスアミナーゼは約0.3M KClでカラ
ムから洗浄された。
℃で10分間加熱しそして変性されたタンパク質を遠心分
離により除去した。透明な上清を0.45μＭメンブランで
過したのち四級アミノ基を有するアガロースからなる
アニオン交換体（Ｑ−Sepharose HP ,Pharmacia）を緩
衝液Ａで平衡化したものに加えた。結合されなかつたタ
ンパク質を緩衝液Ａで洗うことによりカラムから除去
し、結合されたタンパク質は直線状グラジエント（緩衝
液Ａ中０〜1.0M KCl）を用いてカラムから溶離しそして
分別収集した。トランスアミナーゼは約0.3M KClでカラ
ムから洗浄された。
酵素活性を有するフラクシヨンを合し、容量を減少さ
せるためにタンパク質を完全に溶液から沈澱させ（硫酸
アンモニウム80％飽和）そして分別範囲10〜400Kダルト
ンを有するゲル過カラム（Ultrogel AoA 44,Serva）
で分別した。このゲル過で用いられる緩衝液は20mMピ
ペラジン−N,N′−（２−エタンスルホン酸）、10μＭ
ピリドキサール燐酸、5mM2−メルカプトエタノール、0.
1M KCl（pH7.0）であつた。ゲル過後に得られた酵素
活性を有するフラクシヨンを25mMイミダゾール（pH7.
5）で透析しそして得られたタンパク質をその等電点に
従い、Polybuffer 74（Pharmacia製）を含有するPolybu
ffer交換体94（Pharmacia社）で分別した。本発明によ
るトランスアミナーゼはpH4.35でカラムから溶離され
た。酵素活性を有するフラクシヨン中のタンパク質を溶
液から完全に沈澱させ（硫酸アンモニウム80％）、緩衝
液Ａで透析しそして四級アミノ基を有するアガロースか
らなる高度分解性アニオン交換体（Mono Q、Pharmacia
製）でクロマトグラフイーした（Ｑ−セフアロースHPに
記載と同じ緩衝系）。この精製工程後にトランスアミナ
ーゼからすべての異種タンパク質が除去された。
せるためにタンパク質を完全に溶液から沈澱させ（硫酸
アンモニウム80％飽和）そして分別範囲10〜400Kダルト
ンを有するゲル過カラム（Ultrogel AoA 44,Serva）
で分別した。このゲル過で用いられる緩衝液は20mMピ
ペラジン−N,N′−（２−エタンスルホン酸）、10μＭ
ピリドキサール燐酸、5mM2−メルカプトエタノール、0.
1M KCl（pH7.0）であつた。ゲル過後に得られた酵素
活性を有するフラクシヨンを25mMイミダゾール（pH7.
5）で透析しそして得られたタンパク質をその等電点に
従い、Polybuffer 74（Pharmacia製）を含有するPolybu
ffer交換体94（Pharmacia社）で分別した。本発明によ
るトランスアミナーゼはpH4.35でカラムから溶離され
た。酵素活性を有するフラクシヨン中のタンパク質を溶
液から完全に沈澱させ（硫酸アンモニウム80％）、緩衝
液Ａで透析しそして四級アミノ基を有するアガロースか
らなる高度分解性アニオン交換体（Mono Q、Pharmacia
製）でクロマトグラフイーした（Ｑ−セフアロースHPに
記載と同じ緩衝系）。この精製工程後にトランスアミナ
ーゼからすべての異種タンパク質が除去された。
実施例 ３ 酵素の特性化 分子量約44,000ダルトン（ポリアクリルアミドSDSゲ
ル電気泳動により測定）、 等電点pH4.35（Pharmacia社のPBE94/Polybufferでの
等電点クロマトグラフイーにより測定）、 酵素活性。
ル電気泳動により測定）、 等電点pH4.35（Pharmacia社のPBE94/Polybufferでの
等電点クロマトグラフイーにより測定）、 酵素活性。
酵素活性はアミノ基受容体としてのα−ケトグルタレ
ートの存在下にＬ−PPTのアミノ交換反応を測定するこ
とによるか（アツセイ１）、またはアミノ基供与体とし
てのグルタメートを用いる（３−カルボキシ−３−オキ
ソ−プロピル）−メチル−ホスフイン酸からのＬ−PPT
の生成を測定することにより（アツセイ２）測定され
た。いずれのアツセイからもほぼ等しい結果を生じ、従
つてより容易に実施できることからアツセイ１がルーチ
ンに用いられた。
ートの存在下にＬ−PPTのアミノ交換反応を測定するこ
とによるか（アツセイ１）、またはアミノ基供与体とし
てのグルタメートを用いる（３−カルボキシ−３−オキ
ソ−プロピル）−メチル−ホスフイン酸からのＬ−PPT
の生成を測定することにより（アツセイ２）測定され
た。いずれのアツセイからもほぼ等しい結果を生じ、従
つてより容易に実施できることからアツセイ１がルーチ
ンに用いられた。
アツセイ1: 100mMトリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン
（トリス）/10μＭピリドキサール燐酸（pH7.5）中の10
mM PPTおよび10mMα−ケトグルタレートを30℃で30分間
インキユベートした。形成されたグルタメートをMethod
s in Enzymology,113、245記載の方法によりグルタメー
トデヒドロゲナーゼと反応させることにより測定した。
（トリス）/10μＭピリドキサール燐酸（pH7.5）中の10
mM PPTおよび10mMα−ケトグルタレートを30℃で30分間
インキユベートした。形成されたグルタメートをMethod
s in Enzymology,113、245記載の方法によりグルタメー
トデヒドロゲナーゼと反応させることにより測定した。
アツセイ2: PPTおよびα−ケトグルタレートの代りに10mMの（３
−カルボキシ−３−オキソ−プロピル）−メチル−ホス
フイン酸および10mMのグルタメートを用いる以外はアツ
セイ１におけると同様にした。形成されたＬ−PPTはア
ミノ酸アナライザーを用いて検出した。
−カルボキシ−３−オキソ−プロピル）−メチル−ホス
フイン酸および10mMのグルタメートを用いる以外はアツ
セイ１におけると同様にした。形成されたＬ−PPTはア
ミノ酸アナライザーを用いて検出した。
これらアツセイを用いて、精製されたタンパク質につ
いての酵素比活性265nkat/mgタンパク質）（1katal＝１
秒当り１モル転換）が測定された。
いての酵素比活性265nkat/mgタンパク質）（1katal＝１
秒当り１モル転換）が測定された。
かくして測定された酵素反応の最適pHは約９、そして
最適温度は約55℃であつた。
最適温度は約55℃であつた。
精製されたトランスアミナーゼの最初の40個のＮ−末
端アミノ酸の配列をガス相シークエンサーで調べると次
のとおりであつた:Met−Asn−Ser−Asn−Lys−Glu−Leu
−Met−Gln−Arg−Arg−Ser−Gln−Ala−Ile−Pro−Arg
−Gly−Val−Gly−Gln−Ile−His−Pro−Ile−Phe−Ala
−Asp−Arg−Ala−Glu（Thr）−Asn−Asn（Gly）−20。
端アミノ酸の配列をガス相シークエンサーで調べると次
のとおりであつた:Met−Asn−Ser−Asn−Lys−Glu−Leu
−Met−Gln−Arg−Arg−Ser−Gln−Ala−Ile−Pro−Arg
−Gly−Val−Gly−Gln−Ile−His−Pro−Ile−Phe−Ala
−Asp−Arg−Ala−Glu（Thr）−Asn−Asn（Gly）−20。
実施例 ４ 精製トランスアミナーゼを用いるＬ−PPTの生成 精製トランスアミナーゼを50mMトリス/10μＭピリド
キサール燐酸（pH9.0）中の0.1mg/ml濃度（酵素比活性1
5U/mgタンパク質）で30g/のナトリウム（３−カルボ
キシ−３−オキソ−プロピル）−メチルホスフイネート
および60g/のＬ−グルタメートと55℃でインキユベー
トした。０〜24時間のインキユベーシヨン期間中試料を
採取した。試料採取後酵素を95℃で10分間変性させ、遠
心により除去しそして上清をアミノ酸アナライザー中で
Ｌ−ホスフイノスリシンの形成に関して調べた。その際
転換速度は毎時Ｌ−PPT 16.6g/に達した。酵素濃度を
高めることによりこの収量をもつと改良することもでき
る。
キサール燐酸（pH9.0）中の0.1mg/ml濃度（酵素比活性1
5U/mgタンパク質）で30g/のナトリウム（３−カルボ
キシ−３−オキソ−プロピル）−メチルホスフイネート
および60g/のＬ−グルタメートと55℃でインキユベー
トした。０〜24時間のインキユベーシヨン期間中試料を
採取した。試料採取後酵素を95℃で10分間変性させ、遠
心により除去しそして上清をアミノ酸アナライザー中で
Ｌ−ホスフイノスリシンの形成に関して調べた。その際
転換速度は毎時Ｌ−PPT 16.6g/に達した。酵素濃度を
高めることによりこの収量をもつと改良することもでき
る。
反応終了後、用いられたα−ケト酸の94.3％がＬ−PP
Tに転換されていた（28.3g/）。
Tに転換されていた（28.3g/）。
実施例 ５ トランスアミナーゼの固定 実施例２で部分的に精製された酵素フラクシヨンをト
ランスアミナーゼの固定に用いた。この酵素調製物にお
いては総タンパク質の約20％がトランスアミナーゼであ
りそして酵素活性は76.4nkat/ml（1kat＝1katal＝１モ
ル転換／秒）であつた。
ランスアミナーゼの固定に用いた。この酵素調製物にお
いては総タンパク質の約20％がトランスアミナーゼであ
りそして酵素活性は76.4nkat/ml（1kat＝1katal＝１モ
ル転換／秒）であつた。
1M燐酸カリウム緩衝液（pH8.0）中のこのトランスア
ミナーゼ調製物47mlを8gのポリマー担体VA−Epoxy Bios
ynth （Riedel de Haｎ社製）に加えこの混合物を室
温で２日間揺り動かした。
ミナーゼ調製物47mlを8gのポリマー担体VA−Epoxy Bios
ynth （Riedel de Haｎ社製）に加えこの混合物を室
温で２日間揺り動かした。
下記３種の緩衝液、すなわち （１） 50mM燐酸カリウム緩衝液、pH7.0、 （２） 1M燐酸カリウム緩衝液、pH8.0および （３） 50mM燐酸カリウム緩衝液、pH7.0 で洗浄したのち31gの湿つた樹脂が得られた。
過剰のオキシラン基はこの樹脂を10mMの２−メルカプ
トエタノール（50mM燐酸カリウム緩衝液中）と１時間イ
ンキユベーシヨンすることにより変換させた。
トエタノール（50mM燐酸カリウム緩衝液中）と１時間イ
ンキユベーシヨンすることにより変換させた。
この担体樹脂はカツプリング後に酵素活性1975nkat
（64mkat/g湿潤樹脂）を有しており、これはカツプリン
グ収率55％に相当する。
（64mkat/g湿潤樹脂）を有しており、これはカツプリン
グ収率55％に相当する。
このものは0.02％のナトリウムアジドを含有する50mM
燐酸カリウム緩衝液（pH7.0）中４℃で貯蔵した。
燐酸カリウム緩衝液（pH7.0）中４℃で貯蔵した。
実施例 ６ 固定化トランスアミナーゼを用いるＬ−PPTの生成 実施例５で得られたカツプリングされたトランスアミ
ナーゼをカラム反応器中でＬ−PPTの生成に用いた。こ
の目的には20mlのクロマトグラフイーカラムに固定化ト
ランスアミナーゼを充填し、このカラムを42℃で平衡化
しそして基質溶液（20g/ 3−カルボキシ−３−オキソ
−プロピル−メチル−ホスフイン酸（ケト−PPT）/60g/
L−グルタミン酸/10μＭピリドキサール燐酸、pH8.
0）を流速0.5ml/分でカラムにポンプで送つた。用いら
れたケトPPTはカラム通過後に90.4％がＬ−PPTに変換さ
れていた。
ナーゼをカラム反応器中でＬ−PPTの生成に用いた。こ
の目的には20mlのクロマトグラフイーカラムに固定化ト
ランスアミナーゼを充填し、このカラムを42℃で平衡化
しそして基質溶液（20g/ 3−カルボキシ−３−オキソ
−プロピル−メチル−ホスフイン酸（ケト−PPT）/60g/
L−グルタミン酸/10μＭピリドキサール燐酸、pH8.
0）を流速0.5ml/分でカラムにポンプで送つた。用いら
れたケトPPTはカラム通過後に90.4％がＬ−PPTに変換さ
れていた。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 クラウス・ザウバー ドイツ連邦共和国デー‐6232バートゾー デン・アム・タウヌス．ケーニヒシユタ イナーシユトラーセ144 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 9/10 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (2)
- 【請求項１】分子量25,000〜100,000ダルトン、 pH3.5〜5.5にある等電点、 8.0〜9.0の範囲内にある最適pH、および アミノ基供与体としてのＬ−ホスフィノスリシン、γ−
アミノ酪酸およびグルタメート、ならびにアミノ基受容
体としての適当なケト化合物に対する基質特異性 を有する、大腸菌DH−１からのトランスアミナーゼ。 - 【請求項２】大腸菌DH−１を培養しそしてトランスアミ
ナーゼを単離することからなる請求項１記載のトランス
アミナーゼの製法。
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| DE3842025A1 (de) * | 1988-12-14 | 1990-07-05 | Hoechst Ag | Verfahren zur herstellung von l-phosphinothricin |
| DE3932015A1 (de) * | 1988-12-15 | 1991-04-04 | Hoechst Ag | Gen und genstruktur, codierend fuer eine aminotransferase, mikroorganismen, die dieses gen exprimieren, und transaminierungsverfahren unter verwendung des expressionsprodukts |
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| DE4026628A1 (de) * | 1990-08-23 | 1992-02-27 | Hoechst Ag | Verfahren zur extraktiven trennung von l-phosphinothricin und l-glutaminsaeure in waessriger loesung |
| DE4030578A1 (de) | 1990-09-27 | 1992-04-16 | Hoechst Ag | Verfahren zur herstellung von l-phosphinothricin durch eine gekoppelte enzymatische reaktion |
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