JPH01228468A - ヒドロキサム酸加水分解酵素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、アミダーゼ活性を有するヒドロキサム酸加水
分解酵素、その製造法並びにその応用に関する。

〔従来の技術〕

ヒドロキサム酸は、金属イオンとの親和力が強いこと、
ウレアーゼ等の酵素の阻害剤となることなどから、最近
医薬分野への応用が注目されている。ヒドロキサム酸の
製造方法は、塩基の存在下、無水アルコール中でヒドロ
キシルアミンと酸塩化物、酸無水物あるいはエステルと
加熱反応させることによシ行なわれる〔例えば、日本農
化誌、　ｖｏｌ、２４゜２９１（１９４９）　〕。

ヒドロキサム酸の加水分解反応は、金属−ヒドロキサム
酸錯体から金属イオンの回収、アシル基、カルボキシル
基の保護基としてのヒドロキサム酸官能基の脱着など応
用範囲は広い。従来、このようなヒドロキサム酸の加水
分解反応は、通常、アミドに準じた強塩基性もしくは１
強酸件条件下において加熱するという化学的方法によっ
て行なわれている〔例えば、Ｊ、Ｃｈｅｎ＋、Ｓｏｃ、
　（Ｂ）　（１９７１）　１２３　）。

一方、酵素的手法によるヒドロキサム酸の加水分解反応
は、す／Ｑ−ゼの作用を利用する動物肝臓の破砕抽出液
（Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ。

人ｅｔａ、ｖｏ１．４　、３０１　（１９５０）　）　
、反司動物の胃内微生物無細胞抽出液（Ｊ、Ｄａｉｒｙ
　Ｓｃｉ、。

ｖｏｌ、６６．２３３７（１９８３））を用いた報告が
あるｏ′！たアセトアミドとヒドロキシルアミンをアミ
ダーゼの共存下に反応させるとアセトヒドロキサム酸を
生成するという報告がある（　Ｂｉｏｃｈｓｒｔ＋、Ｊ
、、ｖｏｌ、　９５　、２４Ｃ（１９６５）　〕。

ところでアミダーゼは一般にヒドロキサム酸の加水分解
反応を触媒せず、ヒドロキサム酸がアミダーゼの加水分
解反応の基質となるという報告は、現在までになされて
いない。

〔発明が解決しようとする課題〕

上記したようにヒドロキサム酸の化学的加水分解方法は
、多数提案されているが、このような方法では反応条件
が過酷であり５色、においがつくうえ、生成物と副生成
物との分離に複雑な処理を要し、工業的大量生産、大量
処理を考えだ場合、実用化し得るものではない〇 一方、酵素的手法、すなわちＩＪ、ｔ’−ゼによるヒド
ロキサム酸の加水分解反応は、温和な条件で可能である
が、かかるジノ９−ゼは動物由来であることから入手に
問題があった。

〔課題を解決するだめの手段〕

このような現状に鑑み本発明者らは、ヒドロキサム酸加
水分解酵素を微生物の培養物中から見い出すことを目的
として、アセトヒドロキサム酸を単一窒素源とする培地
を用いてアセトヒドロキサム酸資化能を有する微生物を
スクリーニングしたところ、一定の酵母中にヒドロキサ
ム酸資化能を有するものが存在し、該酵母から採取され
た酵素は優れたヒドロキサム酸加水分解能を有する全く
で「しいタイプの酵素であることを見い出し、本発明を
完成した。

すなわち、本発明はアミダーゼ活性を有するヒドロキサ
ム酸加水分解酵素、その製造法並びにこの酵素を用いる
カルボン酸類およびヒドロキサム酸の製造法を提供する
ものである。

本発明のヒドロキサム酸加水分解酵素は、例えばロドト
ルラ属に属するヒドロキサム酸加水分解酵素生産菌を培
養し、該培養物よりアミダーゼ活性を有するヒドロキサ
ム酸加水分解酵素を採取することによシ製造される。

本発明に使用されるヒドロキサム酸加水分解酵素生産菌
としては、ロドトルラ属に属する酵母であって、ヒドロ
キサム酸加水分解酵素生産能を有すれば特に制限されな
いが、特にロドトルラ　グラミニス（ＲｈｏｄｏＬｏｒ
ｕｌａｇｒａａｏｉｎｉｓ　）がその生産能の点から好
ましい。

かかる微生物としては、ＩＦＯ−０１９０、ＩＦ’０−
１４２２　、ＡＴＣＣ１６７２７、ＡＴＣＣ１６７２８
、ＡＴＣＣ１６７２９，ＡＴＣＣ１６７３０，ＮＲＲＬ
　Ｙ−２４７４、ＮＲＲＬ　　Ｙ−５７９１，ＣＢ５２
８２６、ＣＢ５３０４３、　ＣＢＳ　４６９８、　ＣＢ
５５０１６、ＣＢ５５７１１、ＣＢ５５７７８等として
種々の機関より入手し得る既知の微生物が挙げられるが
、更に本発明者らが土壌より分離した菌株ロドトルラ　
グラミニスＫＳＭ−１８が挙げられる。

ロドトルラ　グラミニスＫＳＭ−１８の菌学的性質は次
の通りである。

（１）　　各培地における生育状態 ■　ＭＹ液体培地・・・・・・良好、出芽によって増殖
■　ＭＹ寒天培地・・・・・・良好、出芽によって増殖
（２）子のう胞子の形成・・・・・・無しく３）　　射
出胞子の形成・・・・・・無しく４）　　各生理学的性
質 ■　最適生育条件　ｐＨ７ 温度　２８°Ｃ （２５’Ｃより２８°Ｃで好適） ■　生育範囲　ｐＨ５よりｐＨ８０間 温度　３０°Ｃ以下 ■　硝酸塩の同化　士 ■　尿素の分解　士 ■　カロチノイドの生成　士 ■　顕著な有機酸の生成　− ■　ゾンデ／様物質の生成　− （５）炭素源の同化性 ■　Ｄ−アラビノース　＋ ■　Ｌ−アラビノース　士 ■　Ｄ−リボース　＋ ■　Ｄ−キシロース　士 ■　Ｄ−グルコース　士　　醗酵性　−■　Ｄ−ガラク
トース　＋ ■　Ｌ−ラムノース　− ■　Ｌ−ツルゴース　＋ ■　麦芽糖、＋ ［相］　ショ糖　十 ０乳糖− Ｇ）　メリビオース　− ０　セロビオース　＋ θタ　トレハロース　士 ［相］　ラフィノース　＋ ［相］　メレゾトース　− ０　α−メチル−Ｄ−グルコシド　− 〇　アルブチン（又はエスクリン）＋ Ｏ可溶性デンプン　− に）イヌリン　− Ｏエタノール　士 ＯＤ−マンニット　＋ Ｏグリセリン　士 ＯＤＬ−乳酸塩　− ＠　コハク酸塩　士 Ｏクエン酸塩　十 以上の菌学的性質が「Ｙａａｇｔ：Ｃｈａｒａｃｔｅｒ
ｉｓ　−ｔｉｃｍ　ａｒｉｄ　１ｄｅｕＬｉｆｉｃａｔ
ｉｏｎ；ＣａＩｔＩｂｒｉｄｇｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔ
ｙＰｒｅｓｓ　Ｊに記載される既知のロドトルラ　グラ
ミニスの特徴的な菌学的性質と一致することによシ５本
菌株はロドトルラ　グラミニスに属するものと判断され
る。そして、上記性質をもとに検索したところ、本菌株
は従来知られていない新規なものであり、ロドトルラグ
ラミニス　ＫＳＭ−１８と命名し、通商産業商工業技術
院微生物工業研究所に微工研菌寄第９９２８号として寄
託した。

次に本発明のヒドロキサム酸加水分解酵素の製造におけ
る菌株の培養について説明する。

栄養培地としては、資化しうる炭素源、窒素源、無機物
などを適当に含有するｌａり、合成培地、半合成培地あ
るいは天然培地のいずれでも使用可能である。

炭素源としては、ヒドロキサム酸加水分解酵素を生産す
るものであれば特に制限されないが、グルコース、フラ
クトース等の単糖類、ラクトース、マルトース等の二糖
類、ピルビン酸等を単独または組み合せて用いるのが好
筐しく、就中グルコースが特に好ましい。その濃度はＱ
５〜ａＯＺ量％（以下単に優で示す）、特にＬＯ〜３０
％が好ましい。

窒素源としては、無機及び有機窒素源が広い範囲で用い
られ、例えばヒドロキシルアミン、硫酸アンモニウム、
リン酸アン舌ニウム。

硝酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、ゾロテオース・ペ
ゾトン、カザミノ酸、ｄ？リペゾトン、カゼイン、大豆
加水分解物、キナコ、各種アミノ酸混合物、ミート・エ
キス、イースト・エキス、　ＮＺアミン、ヒドロキシ尿
素等が単独または組み合せて用いられる。就中、無機窒
素源としてヒドロキシルアミン、有機窒素源としてイー
スト・エキス、ミート・エキス等が好ましい。特にヒド
ロキシルアミンを用いた場合、本発明の酵素の生産量は
著明に向上する。ヒドロキシルアミンの濃度は、００５
〜０４％、特に０．２　％程度が好ましい。

窒素源としてヒドロキシルアミンを用いるのは、一般の
酵母の培養においては、きわめて特異であシ、特徴的で
ある。

また培地にアセトヒドロキサム酸を０１〜０５５）の濃
度となるように添加することにより、酵素の生産量は著
しく向上する。また培地のｐＨは約５．０〜８．０、特
に６．５〜７５が好ましい。

培養法としては、一般の酵母の培養法が採用されるが、
液体培養法、特に深部攪拌培養法が好ましい。培養は好
気的な条件下、２５〜３０℃、特に２７〜２８°Ｃの温
度で行なうのが好ましい。培養時間は２〜１０日で可能
であるが、生産酵素量は３〜４日目が最高となる。

培養物から本発明の酵素を採取するには、例えば菌体を
超音波等により破砕し、遠心分離すればよい０さらに必
要に応じて硫安分画３０〜６０％のフラクションを陰イ
オン交換樹脂、たとえばＤＥＡＥ−セファセル（ファル
マシア）、疎水性樹脂、たとえばフェニルセフ７０−ス
（ファルマシア）、ゲルロ過各カラムをそれぞれ１回も
しくは２回以上通すことにより精製し、電気泳動的に単
一とすることができる。

上記の如くして得られた本発明の酵素は次のような理化
学的性質を有する。

く理化学的性質〉 ■　作用　　　　　　１ −Ｃｏ−Ｎ　　結合を切断し、ヒドロキサム酸を＼ 加水分解する。

■　基質特異性 脂肪族ヒドロキサメート、芳香族ヒドロキサメート、ア
ミノ酸ヒドロキサメートおよび酸アミドを加水分解する
。

オリーブ油、トリブチリンを加水分解しない０■　至適
ｐＨ及び安定ｐＨの範囲 至適ｐＨ約８〜９ 安定ｐＨ範囲　約６．５〜９．０ ■　力価の測定法 アセトヒドロキサム酸５０ｍ９／ＩｄのｐＨ７０、ＱＩ
Ｍのリン酸カリウム緩衝液に酵素を加え、３０℃で反応
させる。このとき生成するヒドロキシルアミンを、　　
Ｗ、Ｅ、Ｍ息ｇｅｅらによって報告されている８−ヒド
ロキシキノリンによる呈色定量法（Ａｍ、Ｊ、ＢｏＬ、
、ｖｏｌ、　４１　、７７７（１９５４））によって定
量する。１μｍｏｌのヒドロキシルアミンを１分間に生
成する酵素量を１ユニツトとする。

（υ　作用適温の範囲 約ｌＯ〜４０℃、好ましく！′ｉ２５〜３５℃■　失活
の条件 ｐＨ１０以上で失活。

温度４５℃以上で失活。

■　保存安定性 −２０’Ｃで６０日以上安定っ （８）　　分子量 １１　ａｏｏｏ　（ＨＰＬＣ（ＴＳＫ　Ｇ−３０００５
Ｗ））６へ５００（５ＤＳ−ＰＡＧＥ）サブユニット（
！り　ｆロチアーゼ活性（カゼイン分解能）、リノＱ−
ゼ活性がない。

以上の性質から本発明の酵素は、ヒドロキサム酸加水分
解活性およびアミダーゼ活性を有する。従来、アミ、ダ
ーゼの中に、ヒドロキサム酸加水分解活性を有する酵素
は知られておらず、本発明酵素は新規なものである。

ヒドロキサム酸に本発明酵素を作用させれば、カルボン
酸類を製造することができる。

この加水分解反応に使用する酵素は、精製品である必要
はなく、部分精製品あるいはロドトルラ属に属するヒド
ロキサム酸加水分解酵素生産菌の休止菌体であってもよ
い。また本発明酵素は、広い範囲のヒドロキサム酸を加
水分解する能力を有するので、用いるヒドロキサム酸は
特に制限されないが、特に次の一般式＜１１ 〔式中、Ｒは置換基を有していてもよい脂肪族基もしく
は芳香族基を、またはＲＣＯとしてアミノ酸残基を示す
〕 で表わされるものが好ましい。さらに一般式（１）中の
基凡の好ましい例としては炭素数１〜２３のアルキル基
もしくはアルケニル基、アリル基またはニコチン酸残基
等の複素環残基が挙げられ、アミノ酸の例としてはアラ
ニン。

アルギニン、クリシン、ヒスチジン、ロイシン、リシン
、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トリシトフ
ァン、チロシン、α−アミノ−ｎ−酪酸、α−アミノイ
ン酪酸、ノルロイシン、ノルバリン等が挙げられる。

加水分解反応は、　ｐＨ６〜１０の緩衝液中、０〜３０
℃の温度で行なうのが好ましい。かかる反応により、原
料として用いたヒドロキサム酸に対応する各種カルボン
酸類が得られる０ また本発明の酵素を用いてヒドロキシルアミンとカルボ
ン酸類とからヒドロキサム酸を製造することができる。

本発明の酵素は加水分解酵素であシ、一般に水中反応で
は平衡が加水分解側にかたよっていると考えられるため
、この合成反応は不利である。しかしながら、目的物で
あるヒドロキサム酸が水に難溶である場合には、ヒドロ
キサム酸は生成と同時に析出し１反応系外にでることか
ら、カルボン酸類からヒドロキサム酸への反応が進行す
る。例えばカルボン酸類として長鎖カルボン酸塩を用い
れば、対応する長鎖ヒドロキサム酸が水に難溶であるた
め反応は容易に進行する。かかる反応は本発明酵素が失
活しない条件、例えばｐＨ６〜１０の緩衝液中で０〜３
０℃の温度で行なうのが好ましい。

〔発明の効果〕

本発明の酵素は優れたヒドロキサム酸加水分解活性を有
する。従って、従来、化学的手段によって行なわれてい
たヒドロキサム酸の加水分解及び合成法が過酷であり、
副生成物が生じる事により、反応後の分離処理が複雑で
あるのに対し、本発明の酵素を用いる方法においては、
温和な条件下で、副生成物の生成をおさえる事が可能で
あり、複雑な分離操作を必要とせず、有利にカルボン酸
類を製造することができる。ｉだ、カルボン酸類とヒド
ロキシルアミンとから温和な条件でヒドロキサム酸の製
造もすることができる。

〔実施例〕

次に実施例を挙げて本発明を説明する。

実施例１ グｋ　コ−ス３　Ｑ　ｆ　、　Ｋ２ＨＰＯ４５ｔ、アセ
トヒドロキサム酸２２．ヒドロキシルアミン塩酸塩２　
ｆ　、　ＮａＣｔｌｆ　、　ＭｇＳＯ４’　７Ｈ２００
，２ｔ、イースト・エキス００５ｔを水道水１０００１
に浴解し、水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ７０に調整し
た後、分注し、オートクレーブによシ滅菌を行ない液体
培地とする。

培養は、上記培地５　ｚｌに対し、スラントよりロドト
ルラ　グラミニス　ＫＳＭ−Ｉｓ　　１白金耳を植菌し
、２日間、２８℃において前培養を行なった後、同様の
培地５００ｔｘｌに仕込み、２８℃において、３日間の
振とり培養を行なう。生育度は０Ｄ６１ｏで測定した結
果、３日間培養でａＯに達し、４目上以降大きな増殖は
みられなかった。

３日間培養した菌体を１００００　ｒｐ＋１１の回転数
で遠心分離（日立、　５ＣＲ２ＯＢ　）　シ、超音波破
砕（久保田ｌＮ５ＯＮＡＴＯ１２０１Ｍ　）を１５分間
行なった後、上清を遠心分離（１１００００ｒｐ。

１５分）シ、粗酵素液として得た。

酵素活性は、休止菌体でも示すが、無細胞抽出粗＃素液
で測定した。この結果５００ｄの培養液よｐ、ｘｌ、３
ユニツトのヒドロキサム酸加水分解酵素を得た。

実施例２ 実施例１と同様の条件で、窒素源を種々変化させてヒド
ロキサム酸加水分解酵素の生産性を検討した。その結果
を第１表に示す。

以下余白 実施例３ アセトヒドロキサム酸ａ　ＯＩＩＱ　（Ｑ　Ｏ７ｍｍｏ
　ｌ　）を０．０２５ユニツトのヒドロキサム酸加水分
解酵素（実施例１で得たもの、無細胞抽出粗酵素液を使
用、以下同じ）存在下、ｐ）ｌ　ａ　Ｏ。

ＱＩＭのトリス塩酸緩衝液１ｄに溶解し、３０°Ｃで８
時間、振とり反応した。反応後、８−ヒドロキシキノリ
ンによるヒドロキシルアミン呈色反応により１．３４１
ｎｇのヒドロキシルアミンを検出し、さらにＯＤＳ逆相
カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーにより、１
．７１■の酢酸を検出した。分解率は、６１．０％であ
った。

実施例４ ブチルヒドロキサム酸ａ　Ｏ１ｔｇ（Ｑ　Ｏ８ｒｎｒｎ
ｏｌ　）をＱＯ５ユニットのヒドロキサム酸加水分解酵
素存在下ｓ　　ｐＨｆ３．ｏ、Ｑｌｙのトリス塩酸緩衝
液ｌＪｌ！／に溶解し、３０℃で８時間、振とり反応さ
せた後、８−ヒドロキシルキノリン法により１．４９１
１９のヒドロキシルアミンを検出した。分解率は、５ａ
Ｏ％であった。

実施例５〜８ 実施例３または４と同様にして種々のヒドロキサム酸を
加水分解した。その結果を第２表に示す。なお、第２表
には実施例３．４の結果も併せて記載した。

以下余白 実施例９ ヒドロキシルアミン塩酸塩６９５嘘（１０ｒ＋＋ｎ＋ｏ
ｌ　）とミリスチン酸ナトリウムＬ２５　ｒ（５ｍｒｎ
ｏｌ　）を００５ユニツトのヒドロキサム酸加水分解酵
素存在下、ｐＨａｏ、　０．１　Ｍ　トリス塩酸緩衝液
２０ｔＪに分散させ３０℃で４８時間反応した。反応後
％酸性としシリカゲル（和光グルＣ−２００）カラムを
用い、クロロホルム／エタノール（９５：５）の溶媒で
分離し、５Ｑｍｇ（Ｑ２５ｎ＋ｎｎｏｌ　）のミリスチ
ン酸ヒドロキサメートを得た。収率は５係であった。

実施例１０ 実施例３または４と同様にして、種々のヒドロキサム酸
、酸アミドを用いて基質特異性を横材した。その結果を
第３表に示す。

第３表　基質特異性

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、アミダーゼ活性を有するヒドロキサム酸加水分解酵
   素。 ２、ロドトルラ属に属するヒドロキサム酸加水分解酵素
   生産菌を培養し、該培養物よりヒドロキサム酸加水分解
   酵素を採取することを特徴とする、アミダーゼ活性を有
   するヒドロキサム酸加水分解酵素の製造法。 ３、培養がアセトヒドロキサム酸含有培地で行なわれる
   ものである請求項第２項記載のアミダーゼ活性を有する
   ヒドロキサム酸加水分解酵素の製造法。 ４、ヒドロキサム酸にアミダーゼ活性を有するヒドロキ
   サム酸加水分解酵素を作用させることを特徴とする、カ
   ルボン酸類の製造法。 ５、カルボン酸類とヒドロキシルアミンをアミダーゼ活
   性を有するヒドロキサム酸加水分解酵素の存在下に反応
   させることを特徴とするヒドロキサム酸の製造法。 ６、ロドトルラ属に属するアミダーゼ活性を有するヒド
   ロキサム酸加水分解酵素生産菌。