CN1298860C - γ－氨基丁酸的酶法转化制备方法 - Google Patents
γ－氨基丁酸的酶法转化制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种γ-氨基丁酸的酶法转化制备方法。该制备方法用L-谷氨酸和L-天冬氨酸两种混合酸性氨基酸作为原料，将具有高活力L-谷氨酸脱羧酶的埃希氏菌Escherichia.coli AS1.505的菌体细胞与含有L-谷氨酸和L-天冬氨酸混合物的转化液混合，28-45℃下进行酶促反应，然后用等电点结晶法或等电点结晶与离子交换树脂相结合的方法分离转化产物，得到高纯度的γ-氨基丁酸和L-天冬氨酸。该方法解决了两种酸性混合氨基酸高效分离的难题，得到了附加值较高的γ-氨基丁酸，并具有原料价格低廉，操作简便，转化时间短，生产成本低等优点。
Description
一、技术领域
本发明涉及生化制药技术领域，具体地说是涉及γ-氨基丁酸的酶法转化制备方法。
二、技术背景
γ-氨基丁酸是一种临床上常用的药物，它可以降低人体的血氨，治疗各种类型的肝昏迷，同时又被广泛地用于治疗各种脑疾病，还可以作为儿童智力的营养补充剂和促进剂，老年人的营养剂。另外，L-天冬氨酸是L-赖氨酸及嘌呤、嘧啶碱基的合成前体，作为K+、Mg2+离子载体向心肌输送电解质，改善心肌功能，它还是新型甜味剂Aspartame的主要原料。
根据目前文献报导，γ-氨基丁酸的制备方法主要有以下两种：
1、酶法
1961年，陈志民等(生物化学与生物物理学报，Vol.1，No.2，1961)利用大肠杆菌E1、E2、E3、E4菌株产生的脱羧酶将L-谷氨酸及其钠盐脱羧制备得γ-氨基丁酸。1989年，阿诺·舒尔茨等人(中国专利，CN1250101，1989)从E.coli DH-1中分离出一种氨基转移酶将L-谷氨酸的氨基转移至琥珀酸半醛得到γ-氨基丁酸。1997年，Darijel等人(RU 2143002，1997)用E.coliVKPM B-7460或B-7452产生的转氨酶将L-谷氨酸或其钠盐转化为γ-氨基丁酸。2002年，江波等人(中国专利，CN1392262，2002)用乳酸菌或乳酸菌和酵母菌混用产生的脱羧酶将L-谷氨酸或其钠盐转化为γ-氨基丁酸。
2、化学合成法
2001年，Abbjasovale等人(RU 2202538，2001)将α-吡咯烷酮和氢氧化钾作用生成的γ-氨基丁酸钾盐转化为γ-氨基丁酸。
混合氨基酸高效分离技术是现代生物化工领域的一大难题，目前L-谷氨酸和L-天冬氨酸的分离方法主要采用离子交换树脂法，分离时间长，设备利用率低，成本居高不下。1989年，何炳林等人(离子交换与吸附，1989，5(3)，161-165)采用D371树脂分离L-谷氨酸和L-天冬氨酸，再用0.1NHAc和0.1NHCl洗脱。1993年，纪庆芳等人(氨基酸杂志，1993，(1)4-7)采用等电点沉淀和离子交换树脂相结合的方法分离L-谷氨酸和L-天冬氨酸，工艺复杂，得率低，分离不完全。
三、发明内容
1、发明目的
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，从而提供一种高效、低成本的制备γ-氨基丁酸的方法，而且能同时生产出L-天冬氨酸。
2、技术方案
目前我国氨基酸工业副产大量的L-谷氨酸和L-天冬氨酸混合物，不能直接用于食品和医药工业。本发明采用L-谷氨酸和L-天冬氨酸混合物作为酶法制备γ-氨基丁酸原料，反应条件温和，L-谷氨酸脱羧酶专一性强，转化率高，可以达到分离两种混合酸性氨基酸的目的，实现了γ-氨基丁酸和L-天冬氨酸的同时生产。
本发明利用γ-氨基丁酸和L-天冬氨酸理化性质的差异，用简单的等电点结晶方法就可以分离制备L-天冬氨酸，成本低，工艺流程简单，适合工业化生产。
本发明的目的可以通过以下的技术方案来达到：
一种γ-氨基丁酸的酶法转化制备方法，其步骤为：
(1)埃希氏菌属E.coli AS1.505菌株，在含有L-谷氨酸的培养基中培养，诱导产生高活力的L-谷氨酸脱羧酶；
(2)采用游离细胞法，将含酶细胞和含有L-谷氨酸与L-天冬氨酸混合物的转化液混合后，再加入缓冲液和表面活性剂，在28-45℃条件下进行酶促反应。
(3)将反应生成物进行分离，得到高纯度的γ-氨基丁酸，同时还得到L-天冬氨酸。
上述步骤(1)中的培养基的碳源采用牛肉膏，葡萄糖，麦芽糖，蔗糖，果糖，乳糖，其浓度为5～20g/L，氮源采用有机氮源，如酵母膏，玉米浆，蛋白栋，豆饼水解液或蛋白质水解物，其浓度为5～50g/L，加入L-谷氨酸诱导，其浓度为0.1～10g/L。
上述步骤(2)的转化液中L-谷氨酸和L-天冬氨酸混合物的比例为5∶95～95∶5，最适比例为30∶70～70∶30，在转化液中加入醋酸缓冲液，柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，Macllvaine缓冲液使转化液pH2～7，最适转化液pH4～5；在转化液中加入表面活性剂，如吐温-80，十六烷三甲基溴化铵(CTAB)，聚乙二醇辛基苯基醚(OP)，其浓度为0.005～5％。培养液的L-谷氨酸脱羧酶活性为每小时每克湿细胞转化1×103～1×105μmol L-谷氨酸。100ml转化液中湿细胞重量为1～2g，28～45℃反应1～48h。
上述步骤(3)中分离反应体系中的γ-氨基丁酸及L-天冬氨酸的方法是采用等电点结晶法或等电点结晶与离子交换树脂分离相结合的方法。
3、有益效果
本发明与现有技术相比具有如下优点：
(1)本发明采用E.coli AS1.505菌株，在优选的培养基中培养可以高产率的生成L-谷氨酸脱羧酶，使反应有高的转化率和高的反应速率，γ-氨基丁酸及L-天冬氨酸产物的纯度为99.3％。
(2)本发明采用L-谷氨酸和L-天冬氨酸混合物作为制备原料，反应条件温和，L-谷氨酸脱羧酶专一性强，转化率高，解决了两种混合酸性氨基酸高效分离的难题，实现了γ-氨基丁酸和L-天冬氨酸的同时生产。
(3)γ-氨基丁酸和L-天冬氨酸的理化性质差异很大，用简单的等电点方法就可以分离制备，成本低，工艺流程简单，适合工业化生产。
(4)具有原料来源丰富，价格低廉，转化时间短，操作简便，生产成本低等优点。
四、具体实施方式
实施例一
γ-氨基丁酸的酶法转化制备方法，其制备步骤如下：
1.将E.coli AS 1.505菌株培养在如下1000mL培养基中：蛋白胨1％，NaCl0.5％，牛肉膏0.3％，L-谷氨酸0.1％，pH7.2。35℃摇瓶振荡培养12h，4000rpm离心15min得湿细胞。
2.将细胞加入到600mL的转化液中，转化液含10％的L-谷氨酸和L-天冬氨酸混合物(比例为50∶50)，6mL 0.5％吐温-80、600mL pH4.8醋酸缓冲液，35℃反应36h。反应液中L-天冬氨酸浓度为5％，γ-氨基丁酸浓度为3.5％，对L-谷氨酸摩尔转化率为100％。
3.将反应液用6N NaOH调pH5.5，搅拌升温到60℃，加活性炭脱色除菌体，滤液用5NHCl调pH至2.8，减压浓缩到120mL，冷却结晶，析出的结晶过滤后用少量纯水洗涤，烘干得25.8g L-天冬氨酸。L-天冬氨酸结晶母液加水稀释，上JK008阳离子树脂柱吸附L-天冬氨酸和γ-氨基丁酸，吸附饱和后，用3％的氨水洗脱，收集含有γ-氨基丁酸和L-天冬氨酸洗脱液(pH6.2)，升温脱色，减压浓缩到50mL，加三倍体积95％酒精，搅拌均匀，放冰箱静置过夜，析出的结晶过滤后用酒精反复洗涤得14.9gγ-氨基丁酸，结晶母液循环使用。
实施例二
γ-氨基丁酸的酶法转化制备方法，其制备步骤如下：
1.将E.coli AS 1.505菌株培养在如下1000mL培养基中：蛋白胨1％，NaCl0.5％，牛肉膏0.3％，乳糖1.5％，L-谷氨酸0.1％，pH7.0。35℃摇瓶振荡培养12h，4000rpm离心15min得湿细胞。
2.将细胞加入到600mL的转化液中，转化液含10％的L-谷氨酸和L-天冬氨酸混合物(比例为60∶40)，6mL 0.5％CTAB、600mL pH4.7的Macllvaine缓冲液，35℃反应36h。反应液中L-天冬氨酸浓度为4％，γ-氨基丁酸浓度为4.2％，对L-谷氨酸摩尔转化率为100％。
3.将反应液用6N NaOH调pH5.5，搅拌升温到60℃，加活性炭脱色除菌体，滤液用5NHCl调pH至2.8，减压浓缩到130mL，冷却结晶，析出的结晶过滤后用少量纯水洗涤，烘干得21.3g L-天冬氨酸。L-天冬氨酸结晶母液加水稀释，用6N NaOH调pH5上D201大孔弱碱树脂柱吸附L-天冬氨酸，含有γ-氨基丁酸流出液，用5NHCl调pH至6.0，加热脱色，减压浓缩到40mL，加三倍体积95％酒精，搅拌均匀，放冰箱静置过夜，析出的结晶过滤后用酒精洗涤得17.6gγ-氨基丁酸，结晶母液循环套用。
实施例三
γ-氨基丁酸的酶法转化制备方法，其制备步骤如下：
1.将E.coli AS 1.505菌株培养在如下1000mL培养基中：玉米浆0.5％，NaCl0.5％，牛肉膏2％，麦芽糖0.5％，L-谷氨酸0.1％，pH7.2。36℃摇瓶振荡培养12h，4000rpm离心15min得湿细胞。
2.将细胞加入到600mL的转化液中，转化液含10％的L-谷氨酸和L-天冬氨酸混合物(比例为40∶60)，6mL 0.5％OP、600mL pH4.5柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，35℃反应36h。反应液中L-天冬氨酸浓度为6％，γ-氨基丁酸浓度为2.8％，对L-谷氨酸摩尔转化率为100％。
3.将反应液用6N NaOH调pH5.5，搅拌升温到60℃，加活性炭脱色除菌体，滤液用5NHCl调pH至2.8，酸化析出的结晶真空过滤，用少量纯水洗涤，烘干得27.8g L-天冬氨酸。结晶母液真空减压浓缩到100mL，冷却结晶，析出的结晶过滤后用少量纯水洗涤，烘干得3.3g L-天冬氨酸，合并得31.1g L-天冬氨酸。L-天冬氨酸结晶母液用6N NaOH调pH至6，减压浓缩到50mL，加三倍体积95％酒精搅拌均匀，放冰箱静置过夜，析出的结晶过滤后用酒精反复洗涤得11.3gγ-氨基丁酸。
Claims (7)
1、一种γ-氨基丁酸的酶法转化制备方法，其步骤为：
(1)埃希氏菌属E.coli AS1.505菌株，在含有L-谷氨酸的培养基中培养，诱导产生高活力的L-谷氨酸脱羧酶；
(2)采用游离细胞法，将含酶细胞和含有L-谷氨酸与L-天冬氨酸混合物的转化液混合后，再加入pH4～5的缓冲液和表面活性剂，在28-45℃条件下进行酶促反应；
(3)通过等电点结晶法或等电点结晶法与离子交换树脂分离相结合的方法将反应生成物进行分离，得到高纯度的γ-氨基丁酸，同时还得到L-天冬氨酸。
2、根据权利要求1所述的γ-氨基丁酸的酶法转化制备方法，其特征在于步骤(1)所用的培养基碳源采用牛肉膏，葡萄糖，麦芽糖，蔗糖，果糖，乳糖，其浓度为5～20g/L；氮源采用有机氮源，如酵母膏，玉米浆，蛋白胨，豆饼水解液或蛋白质水解物，其浓度为5～50g/L，加入L-谷氨酸诱导，其浓度为0.1～10g/L。
3、根据权利要求1所述的γ-氨基丁酸的酶法转化制备方法，其特征在于步骤(2)的转化液中L-谷氨酸和L-天冬氨酸混合物的比例为30∶70～70∶30。
4、根据权利要求1所述的γ-氨基丁酸的酶法转化制备方法，其特征在于步骤(2)所述的缓冲液包括醋酸缓冲液，柠檬酸—柠檬酸钠缓冲液，Macllvaine缓冲液使转化液pH4～5。
5、根据权利要求1所述的γ-氨基丁酸的酶法转化制备方法，其特征在于步骤(2)所述的表面活性剂包括吐温-80，十六烷三甲基溴化铵，聚乙二醇辛基苯基醚，其浓度为0.005～5％。
6、根据权利要求1所述的γ-氨基丁酸的酶法转化制备方法，其特征在于步骤(2)培养液的L-谷氨酸脱羧酶活性为每小时每克湿细胞转化1×103～1×105μmol L-谷氨酸。
7、根据权利要求1所述的γ-氨基丁酸的酶法转化制备方法，其特征在于步骤(3)分离L-天冬氨酸及γ-氨基丁酸的方法为等电点结晶法或等电点结晶与离子交换树脂分离相结合的方法。
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