CN102242161B - 一种利用酶工程法生产γ-氨基丁酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用酶工程法生产γ-氨基丁酸的方法,属于发酵法产酶技术领域。本发明以乳糖作为诱导剂,进行诱导产酶,通过陶瓷膜过滤收集菌体并在线洗菌体,然后在菌体中加入乙酸-乙酸钠缓冲液,少量多次加入底物谷氨酸,使谷氨酸转化为γ-氨基丁酸;然后采用陶瓷膜在线过滤除菌体,采用卷式有机膜脱色;最后采用三效浓缩至浓缩产品含量达550~600g/L时,停止浓缩,将浓缩液打入真空浓缩结晶罐,继续浓缩至产品含量达700~900g/L时,停止加热,常压下自然降温养晶1-1.5h,得到柱状或粉末状晶体。一次结晶得到的晶体纯度≥99.0%,收率≥85%。本发明为清洁生产工艺,三废排放少,菌渣可作为饲料蛋白。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用酶工程法生产γ-氨基丁酸的方法,属于发酵法产酶技术领域。
背景技术
γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,简称GABA)又名氨酪酸,化学名4-氨基丁酸,伽玛氨基丁酸。外观为几乎白色结晶或结晶性粉末,微臭,有强引湿性。GABA具有安定、抗惊厥、降血压、增进脑活力、营养神经细胞、促进生长激素分泌以及保肝利肾的作用。对GABA在畜禽养殖业中的应用研究结果表明,GABA对畜禽具有很好的抗热应激和促生长的作用。
γ-氨基丁酸的生产方法主要有化学合成法、固态发酵法和植物提取法。化学合成法是采用吡咯烷酮、氢氧化钠和水按一定比例混合后,在高温下进行反应,然后通过树脂分离纯化,浓缩结晶而成。吡咯烷酮与氢氧化钠都为腐蚀性物质,影响人体健康。特别是吡咯烷酮在高温下,有引起燃烧的危险,且可分解释放有毒的氧化氮烟气,操作过程存在危险性,不利于工业化大规模生产。固态发酵法效率低下,产量仅为0.35mg/g,最终纯度只有45%,制作成本大,没有市场竞争力。植物提取法利用有机溶剂从植物中萃取,有机溶剂危险性大,易燃易爆,而且植物中γ-氨基丁酸的含量较低,而杂质含量高,导致植物提取法生产的γ-氨基丁酸产量低,产品纯度低。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足,提供一种酶工程法生产γ-氨基丁酸的方法。该方法生产工艺简单,生产过程污染小,无危险性,成本低廉,产品纯度高,含量稳定。
本发明是通过如下方式实现:一种利用酶工程法生产γ-氨基丁酸的方法,其特征是,包括以下步骤:
(1)、酶诱导发酵:在培养基中接入大肠杆菌菌种进行常规培养,加入培养基质量0.01-1%的乳糖作为诱导剂,进行诱导产酶,接种量为2-5%,培养温度为35-39℃,pH为4.0-7.0,培养16-24h,得到菌液。
所述大肠杆菌培养基为常规培养液,主要成分及其含量为:玉米浆10.0-30.0g/L,酵母粉5.0-30.0g/L,酵母膏2.0-15.0g/L,KH2PO4 1.0-10.0g/L,MgSO4 0.05-5.0g/L。
(2)、陶瓷膜过滤收集菌体并在线洗菌体:将步骤(1)得到的菌液经陶瓷膜过滤收集菌体,并对菌体进行在线洗涤;由于pH对酶活力影响比较大,在膜内进行菌体循环洗涤菌体时,需用酸(乙酸等)调节洗涤水pH使菌体pH保持在4.0-7.0,控制洗涤温度35-45℃,当透析液透光率在450nm下达到60%时终止洗涤,得到菌体,备用。
(3)、酶催化谷氨酸脱羧转化为γ-氨基丁酸:将步骤(2)陶瓷膜过滤洗涤得到的菌体加入乙酸溶液和乙酸钠溶液,配制成浓度为0.08-1mol/LpH值为3.0-7.0的乙酸-乙酸钠缓冲液(转化液),按膜收集菌体前(陶瓷膜过滤洗涤前菌液)体积与转化液体积比5∶3的比例进行转化缓冲液的配制,进行转化前加入转化液体积0.01-0.1%的吐温80;少量多次加入底物谷氨酸进行转化,使反应体系中谷氨酸含量维持在30-50g/L,所述谷氨酸加入总量为转化液的30-40%(w/v);反应温度为30-40℃,反应时间为30-50h。
(4)、采用陶瓷膜在线过滤除菌体,陶瓷膜孔径50nm,控制膜温度65-90℃,进膜压力1.0-3.1bar。通过膜过滤可将料液中菌体除去。经膜过滤出的菌渣,经浓缩可做菌体蛋白。
(5)、卷式有机膜脱色:经陶瓷膜处理的料液无法将料液中的色素去除,该工艺采用卷式有机膜截留分子量大于800的色素分子及大量蛋白分子,脱色过程控制过滤温度在20-45℃,控制过滤压力10-20bar,在脱色滤液450nm透光率达93%以上时,停止循环,收集滤液。
(6)、三效浓缩与直接浓缩结晶采用三效浓缩,控制一效温度60-95℃,二效温度90-115℃,三效温度50-85℃,控制真空度-0.08Mpa~-0.1Mpa;在浓缩产品含量达550~600g/L时,停止浓缩,将浓缩液打入真空浓缩结晶罐,控制真空浓缩结晶罐真空度-0.08Mpa~-0.1Mpa,温度为60-75℃,在浓缩产品含量达700~900g/L时,停止加热,常压下自然降温养晶1-1.5h,得到柱状或粉末状晶体。
本发明的有益效果是:整个γ-氨基丁酸发酵法为清洁生产工艺,三废排放少(只有少量清洗设备、工具、场地的废水),经过简单污水处理就能达标排放,菌渣可作为饲料蛋白,洗菌水可以以一定比例与发酵用水混合做为发酵之用。本发明一次结晶得到的晶体纯度≥99.0%,收率≥85%。
具体实施方式
实施例1
在培养基中接入菌种进行常规培养,培养基的组成为每升培养液所含组分以g计:玉米浆10.0,酵母粉15.0,酵母膏10.0,KH2PO4 2.0,MgSO4 0.5,诱导剂乳糖以50%浓度单独灭菌(使加入发酵罐中最终浓度为0.01%)。将配制好的培养基加入发酵罐中,121℃,灭菌30min。采用火焰接种法接入菌种,接种量为3%。发酵时间为18h,在12h时逐渐加入诱导剂,制得菌液;
小试酶活检测:取100ml菌液进行离心,将菌体离心出来后倒掉上清,加入0.1mol/L pH为5.0的乙酸-乙酸钠缓冲液,将菌体混匀,加吐温800.1ml,然后加入谷氨酸10g进行转化。反应温度40℃,反应时间36h。检测谷氨酸残留为0.5g/L,将转化液进行提取,得到8.59g氨基丁酸,收率85%,纯度为99.5%(国标法)。
生产处理:将15t菌液过陶瓷膜过滤洗涤菌体,在所得菌体中加入乙酸溶液和乙酸钠溶液,配制成9t 0.1mol/L pH为5.0的乙酸-乙酸钠缓冲液,进行转化前加入3L吐温80;少量多次共加入谷氨酸3t进行转化,使反应体系中谷氨酸含量维持在30-50g/L。反应温度40℃,反应时间36h。检测谷氨酸残留为0.5g/L,将转化液过陶瓷膜,得滤液450nm下透光率9%。滤液经有机膜脱色,透光率上升为95.3%,经三效浓缩产品浓度达580g/L,将浓缩液快速打入真空浓缩罐中,继续浓缩使产品浓度达850g/L,常压下自然降温养晶1.5h,离心烘干得到2.69t氨基丁酸,收率88.7%,纯度为99%(国标法)。
实施例2
在培养基中接入大肠杆菌进行上罐常规培养,培养基的组成为每升培养液所含组分以g计:玉米浆10.0,酵母粉15.0,酵母膏10.0,KH2PO4 2.0,MgSO4 0.5,加入培养基质量0.2%的乳糖作为诱导剂,进行诱导产酶,接种量为3%,培养温度35-39℃,pH为5.0,培养24h,制得菌液,放罐体积为15t。
小试酶活检测:取100ml菌液进行离心,将菌体离心出来后倒掉上清,加入0.1mol/L pH为5.0的乙酸钠-乙酸缓冲液,将菌体混匀,加入吐温80 0.03ml,加入10g谷氨酸进行转化。反反应温度40℃,反应时间36h。检测谷氨酸残留为0.2g/L,将转化液进行提取,得到8.6g氨基丁酸,收率85.1%,纯度为99.5%(国标法)。
生产处理:将15t菌液过陶瓷膜过滤洗涤菌体,在所得菌体中加入乙酸溶液和乙酸钠溶液,配制成9t 0.1mol/L pH为5.0的乙酸-乙酸钠缓冲液,加入吐温80 2.7L。少量多次共加入谷氨酸3t进行转化,使反应体系中谷氨酸含量维持在30-50g/L。反应温度40℃,反应时间38h。检测谷氨酸残留为0.3g/L。将转化液过陶瓷膜,得滤液450nm下透光率11%。滤液经有机膜脱色,透光率上升为97.3%,经三效浓缩产品浓度达550g/L,将浓缩液快速打入真空浓缩罐中,继续浓缩使产品浓度达900g/L,常压下自然降温养晶1.5h,离心烘干得到2.8t氨基丁酸,收率89.1%,纯度为99%(国标法)。
Claims (2)
1.一种利用酶工程法生产γ-氨基丁酸的方法,其特征是,包括以下步骤:
(1)、酶诱导发酵:在培养基中接入大肠杆菌菌种进行常规培养,加入培养基质量0.01-1%的乳糖作为诱导剂,进行诱导产酶;接种量为2-5%,培养温度为35-39℃,pH为4.0-7.0,培养16-24h,得到菌液;
(2)、陶瓷膜过滤收集菌体并在线洗菌体:将步骤(1)得到的菌液经陶瓷膜过滤收集菌体,并对菌体进行在线洗涤;洗涤菌体时用酸调节洗涤水pH使菌体pH保持在4.0-7.0,控制洗涤温度35-45℃;当透析液透光率在450nm下达到60%时终止洗涤,得到菌体,备用;
(3)、酶催化谷氨酸脱羧转化为γ-氨基丁酸:将步骤(2)陶瓷膜过滤洗涤得到的菌体加入乙酸溶液和乙酸钠溶液,配制成浓度为0.08-1mol/L pH值为3.0-7.0的乙酸-乙酸钠缓冲液,所述乙酸-乙酸钠缓冲液即为转化液,所述转化液按陶瓷膜过滤洗涤前菌液体积与转化液体积比5∶3的比例配制,进行转化前加入转化液体积0.01-0.1%的吐温80;然后少量多次加入底物谷氨酸进行转化,使反应体系中谷氨酸含量维持在30-50g/L,所述谷氨酸加入总量为转化液的30-40%(W/V);反应温度为30-40℃,反应时间为30-50h;
(4)、采用陶瓷膜在线过滤除菌体,陶瓷膜孔径50nm,控制膜温度65-90℃,进膜压力1.0-3.1bar;
(5)、卷式有机膜脱色:采用卷式有机膜截留分子量大于800的色素分子及大量蛋白分子,脱色过程中控制过滤温度在20-45℃,控制过滤压力10-20bar;在脱色滤液450nm透光率达93%以上时,停止循环,收集滤液;
(6)、三效浓缩与直接浓缩结晶:采用三效浓缩,控制一效温度60-95℃,二效温度90-115℃,三效温度50-85℃,控制真空度-0.08Mpa~-0.1Mpa;在浓缩产品含量达550~600g/L时,停止浓缩,将浓缩液打入真空浓缩结晶罐,控制真空浓缩结晶罐真空度-0.08Mpa~-0.1Mpa,温度为60-75℃,在浓缩产品含量达700~900g/L时,停止加热,常压下自然降温养晶1-1.5h,得到柱状或粉末状晶体。
2.如权利要求1所述的一种利用酶工程法生产γ-氨基丁酸的方法,其特征是,所述大肠杆菌培养基的主要成分及其含量为:玉米浆10.0-30.0g/L,酵母粉5.0-30.0g/L,酵母膏2.0-15.0g/L,KH2PO4 1.0-10.0g/L,MgSO4 0.05-5.0g/L。
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