CN105838747A - 一种生产γ-氨基丁酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种γ‑氨基丁酸的生产工艺，该工艺是通过全细胞转化法减少转化液中的杂质，使用自清式碟片离心机、卷式膜脱色等设备，提高回收率，降低生产生产成本，从而得到高纯度的γ‑氨基丁酸。该工艺不需要过于复杂、昂贵以及分离时间较长的设备情况下得以实施，使其工艺过程简明顺畅、工艺技术条件易于掌握和控制。

Description

一种生产γ-氨基丁酸的方法
技术领域：
本发明属于生物工程领域，具体涉及一种γ-氨基丁酸的生产工艺。
背景技术：
γ-氨基丁酸（GABA）是一种重要的抑制性神经递质，对哺乳动物具有重要的生理调节作用，如降血压、改善睡眠和抗心率失常等。此外，近年发现 GABA对生殖系统有调节作用。因此GABA的市场需求与日俱增，但其天然含量很低，单纯依靠天然物质的提取远远满足不了市场的需求。基于对GABA的生物活性的最新研究成果，富含GABA食品的研究已成为当前研究的热点之一，日本多家研究机构都在积极开发富含GABA的功能性食品。我国卫生部于2009年9月27日批准以微生物发酵法生产获得的γ-氨基丁酸为新资源食品，但对纯度要求仅为20% 。国内对GABA分离纯化的研究尚浅，提取工艺尚不成熟，得到的GABA纯度比较低，阻碍了GABA的工业化生产，因此，对发酵GABA分离纯化工艺的研究，提高GABA的纯度，有利于推动GABA的工业化生产，促进GABA的推广与应用。
微生物法生产γ-氨基丁酸具有反应条件温和，无污染，产量高等优点，广泛应用γ-氨基丁酸的生产，但由于氨基酸发酵液是一个极其复杂的多相体系，含有微生物细胞、代谢产物以及未耗尽的培养基等，给下游分离提纯造成困难。
目前国内对天然发酵的γ-氨基丁酸的提取分离工艺尚不成熟，提取步骤主要为:发酵液预处理（絮凝）、去除菌丝体(离心分离、过滤)、初步分离(吸附、离子交换、萃取)、纯化(结晶、重结晶)、干燥包装。此工艺步骤较多、设备成本较高，且产品得率及纯度较低且不稳定，在工业化生产中遇到了一定困难。专利（公开号CN 102174449 A）公开了一种生产GABA的方法，但采用了树脂脱色除盐、乙醇结晶等工艺，工艺复杂；专利（公开号 CN102242161 A,公开号 CN 103130664 A）都采用了膜分离工艺，工艺简单，但膜设备造价较高，并且对分离菌体有一定的破坏性；专利（公开号 CN 101928736 A）公开了一种分离纯化GABA的工艺，收率高，产品纯度为96%左右，但该方法采用了活性炭脱色、乙醇结晶等工艺，对生产环境和安全有一定的影响。
发明内容：
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种简单的，能大规模的生产并便于分离纯化γ-氨基丁酸的方法。该方法是通过全细胞转化法减少转化液中的杂质，使用自清式碟片离心机、卷式膜脱色等设备，提高回收率，降低生产生产成本，从而得到高纯度的γ-氨基丁酸。该工艺的实施不需要过于复杂、昂贵以及分离时间较长的设备，且工艺过程简明顺畅、工艺技术条件易于掌握和控制。
本发明的工艺包括以下主要步骤：
（1）、转化法生产γ-氨基丁酸：首先于菌体培养液中进行γ-氨基丁酸生产菌的菌体培养，比如大肠杆菌，然后通过自清式碟片离心机收集菌体，离心机转速大于10000r/min，离心后将菌体悬浮在醋酸缓冲液(pH 4.0-5.0)中，加入底物L-Glu，在30-40℃下进行转化反应，直至转化液中γ-氨基丁酸含量大于150g/L。
所述菌体培养液主要成分及其含量为:甘油20-60 g/L,玉米浆10.0-30.0 g/L,棉籽蛋白粉10.0-30.0 g/L, KH2PO4 1.0-10.0 g/L, MgSO4 0.05-5.0 g/L。
（2）、去除菌体：将步骤（1）所得的转化液通过自清式碟片离心机去除菌体，离心机转速大于10000 r/min，收集清液至周转罐中。
（3）、超滤膜脱色：离心处理无法将料液中的色素去除，该工艺采用卷式膜截留分子量大于1000的色素分子及大量蛋白分子，该膜具有耐高温耐酸碱的特性，脱色效果好，脱色过程中控制过滤温度在50-70℃，控制过滤压力10-20bar，当脱色滤液在450nm的光波波长下透光率达90%以上时，停止循环，收集滤液。
（4）、浓缩结晶：对步骤（3）所得的滤液采用三效降膜工艺进行浓缩，浓缩过程控制真空度在-0.08~-0.1Mpa，当γ-氨基丁酸浓缩含量达到500-600g/L时，停止浓缩，得到第一浓缩液，将第一浓缩液打入真空浓缩结晶罐继续浓缩至650-750g/L时，停止浓缩，得到第二浓缩液，而后在常压下降温结晶2h，得到含有γ-氨基丁酸晶体的第二浓缩液。
（5）、干燥：将步骤（4）所得的含有γ-氨基丁酸晶体的第二浓缩液离心，收集得到的γ-氨基丁酸晶体，采用沸腾干燥，干燥温度50-90℃，得到色泽纯净的γ-氨基丁酸成品。
本发明方法具有如下优点：
1、分离设备简单，易操作，简化了γ-氨基丁酸的分离工艺。
2、采用超滤脱色，省去了活性炭脱色的步骤，节约生产成本，并避免了活性炭对生产环境和人的影响。
3、结晶采用三效降膜浓缩工艺，大大节约了蒸汽的用量，并避免了用酒精结晶对生产安全的影响。
4、采用该工艺得到的产品纯度高，纯度大于98.5%，一次结晶的回收率高，大于85%。
附图说明
图1实施例１所采用工艺的流程示意图。
具体实施方式
实施例1
本实施例采用图1所示的工艺流程，首先于菌体培养基中进行大肠杆菌的培养，其中菌体培养基的成分组成为：甘油20 g/L,玉米浆30.0 g/L, 棉籽蛋白粉10.0 g/L, KH2PO410.0 g/L, MgSO4 0.05 g/L,而后通过自清式碟片离心机收集菌体，离心机转速为12000r/min，将所得菌体悬浮在醋酸缓冲液(pH4.0-5.0)中，加入底物L-Glu，在30℃下进行转化反应，当转化液中γ-氨基丁酸含量达到158g/L时，将转化液再次通过自清式碟片离心机去除菌体，离心机转速为12000 r/min，收集清液至周转罐中。而后采用卷式膜截留分子量大于1000的色素分子及大量蛋白分子，脱色过程控制过滤温度在60℃，控制过滤压力10bar，当脱色滤液在450nm波长光波下透光率达90%以上时，停止循环，收集滤液。滤液采用三效降膜浓缩工艺，控制真空度在-0.1Mpa，在产品浓缩含量在500-600g/L时，停止浓缩，得到第一浓缩液，将第一浓缩液打入真空浓缩结晶罐继续浓缩至650-750g/L时，停止浓缩，得到第二浓缩液，常压下降温结晶2h，得到含有γ-氨基丁酸晶体的第二浓缩液。将含有γ-氨基丁酸晶体的第二浓缩液离心后，收集γ-氨基丁酸晶体，对收集得到的γ-氨基丁酸晶体采用沸腾干燥，干燥温度80℃，得到γ-氨基丁酸成品，其色泽纯净，且γ-氨基丁酸回收率86.2%，纯度为98.9%。
实施例2
本实施例和实施例1相同的工艺流程，首先于菌体培养基中进行大肠杆菌的培养，其中菌体培养基的成分组成为：甘油60 g/L,玉米浆10.0g/L, 棉籽蛋白粉30.0 g/L, KH2PO41.0g/L, MgSO45.0 g/L,而后通过自清式碟片离心机收集菌体，离心机转速为12000 r/min，将所得菌体悬浮在醋酸缓冲液(pH4.0-5.0)中，加入底物L-Glu，在40℃下进行转化反应，当转化液中γ-氨基丁酸含量达到158g/L时，将转化液再次通过自清式碟片离心机去除菌体，离心机转速为12000 r/min，收集清液至周转罐中。而后采用卷式膜截留分子量大于1000的色素分子及大量蛋白分子，脱色过程控制过滤温度在60℃，控制过滤压力10bar，当脱色滤液在450nm波长光波下透光率达90%以上时，停止循环，收集滤液。滤液采用三效降膜浓缩工艺，控制真空度在-0.1Mpa，在产品浓缩含量在500-600g/L时，停止浓缩，得到第一浓缩液，将第一浓缩液打入真空浓缩结晶罐继续浓缩至650-750g/L时，停止浓缩，得到第二浓缩液，常压下降温结晶2h，得到含有γ-氨基丁酸晶体的第二浓缩液。将含有γ-氨基丁酸晶体的第二浓缩液离心后，收集γ-氨基丁酸晶体，对收集得到的γ-氨基丁酸晶体采用沸腾干燥，干燥温度80℃，得到γ-氨基丁酸成品，其色泽纯净，且γ-氨基丁酸回收率86.7%，纯度为99.1%。
实施例3
本实施例采用图1所示的工艺流程，首先于菌体培养基中进行大肠杆菌的培养，其中菌体培养基的成分组成为：甘油20g/L,玉米浆30.0 g/L, 棉籽蛋白粉10.0g/L, KH2PO410.0g/L, MgSO4 0.05g/L,而后通过自清式碟片离心机收集菌体，离心机转速为12000 r/min，将所得菌体悬浮在醋酸缓冲液(pH4.0-5.0)中，加入底物L-Glu，在30℃下进行转化反应，当转化液中γ-氨基丁酸含量达到158g/L时，将转化液再次通过自清式碟片离心机去除菌体，离心机转速为12000 r/min，收集清液至周转罐中。而后采用卷式膜截留分子量大于1000的色素分子及大量蛋白分子，脱色过程控制过滤温度在70℃，控制过滤压力20bar，当脱色滤液在450nm波长光波下透光率达90%以上时，停止循环，收集滤液。滤液采用三效降膜浓缩工艺，控制真空度在-0.08Mpa，在产品浓缩含量在500-600g/L时，停止浓缩，得到第一浓缩液，将第一浓缩液打入真空浓缩结晶罐继续浓缩至650-750g/L时，停止浓缩，得到第二浓缩液，常压下降温结晶2h，得到含有γ-氨基丁酸晶体的第二浓缩液。将含有γ-氨基丁酸晶体的第二浓缩液离心后，收集γ-氨基丁酸晶体，对收集得到的γ-氨基丁酸晶体采用沸腾干燥，干燥温度90℃，得到γ-氨基丁酸成品，其色泽纯净，且γ-氨基丁酸回收率86.8%，纯度为99.0%。
实施例4
本实施例采用图1所示的工艺流程，首先于菌体培养基中进行大肠杆菌的培养，其中菌体培养基的成分组成为：甘油20g/L,玉米浆30.0 g/L, 棉籽蛋白粉10.0g/L, KH2PO410.0g/L, MgSO4 0.05/L,而后通过自清式碟片离心机收集菌体，离心机转速为12000 r/min，将所得菌体悬浮在醋酸缓冲液(pH4.0-5.0)中，加入底物L-Glu，在30℃下进行转化反应，当转化液中γ-氨基丁酸含量达到158g/L时，将转化液再次通过自清式碟片离心机去除菌体，离心机转速为12000 r/min，收集清液至周转罐中。而后采用卷式膜截留分子量大于1000的色素分子及大量蛋白分子，脱色过程控制过滤温度在50℃，控制过滤压力20bar，当脱色滤液在450nm波长光波下透光率达90%以上时，停止循环，收集滤液。滤液采用三效降膜浓缩工艺，控制真空度在-0.1Mpa，在产品浓缩含量在500-600g/L时，停止浓缩，得到第一浓缩液，将第一浓缩液打入真空浓缩结晶罐继续浓缩至650-750g/L时，停止浓缩，得到第二浓缩液，常压下降温结晶2h，得到含有γ-氨基丁酸晶体的第二浓缩液。将含有γ-氨基丁酸晶体的第二浓缩液离心后，收集γ-氨基丁酸晶体，对收集得到的γ-氨基丁酸晶体采用沸腾干燥，干燥温度50℃，得到γ-氨基丁酸成品，其色泽纯净，且γ-氨基丁酸回收率86.3%，纯度为98.8%。
实施例5
本实施例采用图1所示的工艺流程，首先于菌体培养基中进行大肠杆菌的培养，其中菌体培养基的成分组成为：甘油60 g/L,玉米浆10.0g/L, 棉籽蛋白粉30.0 g/L, KH2PO41.0g/L, MgSO45.0 g/L,而后通过自清式碟片离心机收集菌体，离心机转速为12000 r/min，将所得菌体悬浮在醋酸缓冲液(pH4.0-5.0)中，加入底物L-Glu，在40℃下进行转化反应，当转化液中γ-氨基丁酸含量达到158g/L时，将转化液再次通过自清式碟片离心机去除菌体，离心机转速为12000 r/min，收集清液至周转罐中。而后采用卷式膜截留分子量大于1000的色素分子及大量蛋白分子，脱色过程控制过滤温度在80℃，控制过滤压力20bar，当脱色滤液在450nm波长光波下透光率达90%以上时，停止循环，收集滤液。滤液采用三效降膜浓缩工艺，控制真空度在-0.08Mpa，在产品浓缩含量在500-600g/L时，停止浓缩，得到第一浓缩液，将第一浓缩液打入真空浓缩结晶罐继续浓缩至650-750g/L时，停止浓缩，得到第二浓缩液，常压下降温结晶2h，得到含有γ-氨基丁酸晶体的第二浓缩液。将含有γ-氨基丁酸晶体的第二浓缩液离心后，收集γ-氨基丁酸晶体，对收集得到的γ-氨基丁酸晶体采用沸腾干燥，干燥温度70℃，得到γ-氨基丁酸成品，其色泽纯净，且γ-氨基丁酸回收率87.0%，纯度为99.2%。

Claims (4)

1.一种生产γ-氨基丁酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）转化法生产γ-氨基丁酸
首先于菌体培养液中进行γ-氨基丁酸生产菌的菌体培养，然后通过自清式碟片离心机收集菌体，离心机转速大于10000r/min，离心后将菌体悬浮在醋酸缓冲液中，加入底物L-Glu，在30-40℃下进行转化反应，直至转化液中γ-氨基丁酸含量大于150g/L，
（2）去除菌体
将步骤（1）所得的转化液通过自清式碟片离心机去除菌体，离心机转速大于10000 r/min，收集清液至周转罐中，
（3）超滤膜脱色
对步骤（2）所得清液采用卷式膜脱色除去分子量大于1000的色素分子及大量蛋白分子，脱色过程中控制过滤温度在50-70℃，控制过滤压力10-20bar，当脱色滤液在450nm的光波波长下透光率达90%以上时，停止循环，收集滤液，
（4）浓缩结晶
对步骤（3）所得的滤液采用三效降膜工艺进行浓缩，浓缩过程控制真空度在-0.08~-0.1Mpa，当γ-氨基丁酸浓缩含量达到500-600g/L时，停止浓缩，得到第一浓缩液，将第一浓缩液打入真空浓缩结晶罐继续浓缩至650-750g/L时，停止浓缩，得到第二浓缩液，而后在常压下降温结晶2h，得到含有γ-氨基丁酸晶体的第二浓缩液，
（5）干燥：将步骤（4）所得的含有γ-氨基丁酸晶体的第二浓缩液离心，收集得到的γ-氨基丁酸晶体，采用沸腾干燥，干燥温度50-90℃，得到色泽纯净的γ-氨基丁酸成品。
2.根据权利要求1所述的一种生产γ-氨基丁酸的方法，其特征在于，步骤（1）中所述的γ-氨基丁酸生产菌为大肠杆菌。
3.根据权利要求1所述的一种生产γ-氨基丁酸的方法，其特征在于，步骤（1）中所述的醋酸缓冲液的pH为4.0-5.0。
4.根据权利要求1所述的一种生产γ-氨基丁酸的方法，其特征在于，步骤（1）中所述的菌体培养液主要成分及其含量为:甘油20-60 g/L,玉米浆10.0-30.0 g/L, 棉籽蛋白粉10.0-30.0 g/L, KH2PO4 1.0-10.0 g/L, MgSO4 0.05-5.0 g/L。
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