DE4308061A1 - Neue Aminosäure-Deacetylase mit Spezifität für L-N-Acetyl-Phosphinothricin, ihre Herstellung und Verwendung - Google Patents

Neue Aminosäure-Deacetylase mit Spezifität für L-N-Acetyl-Phosphinothricin, ihre Herstellung und Verwendung

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Description

Das Konzept einer chemisch induzierbaren, reversiblen männlichen Sterilität bei Pflanzen durch antherenspezifische Expression einer L-N-Acetyl-Phosphinothricin (L-N-Ac-PPT) spezifischen Deacetylase wird in der Europäischen Patentanmeldung EP-A-0 191 736 beschrieben.
In der Anmeldungen EP-A-0 304 021 werden Mikroorganismen mit Aminosäure- Acylase-Aktivitäten genannt, die zur enantioselektiven Darstellung von L- Aminosäuren aus den entsprechenden D,L-N-Acetyl-Derivaten verwendet werden können. Es wurde kein Enzym identifiziert, das L-PPT aus L-N-Ac-PPT freisetzen kann. Von den in der Literatur beschriebenen Aminosäure-Acylasen ist keine Spezifität für nicht-proteinogene Aminosäuren bekannt.
In der EP-A-0 358 428 wird ein Verfahren zur Herstellung von L-PPT mittels Bakterien der Gattung Serratia, Staphylococcus, Bacillus, Flavobacterium, Achromobacter und Alcaligenes sowie Actinoplanes, Streptosporangium und Sebekia beschrieben. Bei diesem Verfahren wurden jedoch die Mikroorganismen oder deren Fermentationsbrühe eingesetzt.
Für die in der industriellen Herstellung erforderlichen Bedingungen ist es jedoch wesentlich vorteilhafter, ein gereinigtes Enzym einsetzen zu können.
Die vorliegende Anmeldung umfaßt eine neue L-N-Ac-PPT spezifische Deacetylase. ein neues und effektives Verfahren zur Reinigung und Charakterisierung dieses Enzyms aus einer Anreicherungskultur von Bodenmikroorganismen sowie die Verwendung dieser Deacetylase.
Die Erfindung betrifft somit:
  • 1. Eine Deacetylase mit
    • - einem Molekulargewicht von 20 000 bis 100 000 Dalton
    • - einem pH Optimum von pH = 6,5-9,5
    • - einer Substratspezifität gegenüber L-N-Acetyl-Phosphinothricin.
  • 2. Ein Verfahren zur Herstellung einer Deacetylase, das dadurch gekennzeichnet ist, daß ein nicht sporenbildender Mikroorganismus in Krabbenchitin enthaltenden Medium kultiviert wird, und die Deacetylase aus diesen Mikroorganismen isoliert wird.
  • 3. Die Verwendung der unter 1. charakterisierten Deacetylase zur Herstellung männlich steriler Pflanzen sowie zur stereoselektivien Darstellung von L-Phosphinothricin.
Die Erfindung betrifft insbesondere ein Enzym, das ein Temperaturoptimum hat, das zwischen 30°C und 50°C liegt.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung der unter 1. charakterisierten Deacetylase, wird vorzugsweise mit Mikroorganismen durchgeführt, ausgewählt aus der Gruppe, welche aus Variovorax paradoxus (DSM-Hinterlegungsnummer 7470 vom 16.2.1993), Pseudomonas diminuta (ATCC 11568), Nocardia globerula (ATCC 19370), Cellulomonas cartae (ATCC 21681) und Agrobacterium radiobacter (ATCC 19358) besteht.
Krabbenchitin kann wie von Shimahara, Kenzo und Takiguchi, Yasuyuki beschrieben (Methods in Enzymology, Vol 161, Seiten 417-423, 1988) erhalten werden oder ist käuflich bei der Firma Sigma erhältlich. Die Mikroorganismen können als Reinkultur zur Reinigung der Deacetylase eingesetzt werden oder sie werden vorzugsweise gemeinsam kultiviert.
Zur Reinigung der Deacetylase wird der Mikroorganismus in einem für sein Wachstum optimalen Nährmedium kultiviert. Die Anzucht des Mikroorganismus erfolgt aerob, beispielsweise subsmers unter Schütteln oder Rühren in Schüttelkolben oder Fermentern, gegebenenfalls unter Einführung von Luft oder Sauerstoff. Die Fermentation kann in einem Temperaturbereich von etwa 20 bis 40°C, vorzugsweise bei etwa 25 bis 37°C, insbesondere bei 30 bis 37°C, erfolgen. Es wird in einem pH-Bereich zwischen 5 und 8,5, vorzugsweise zwischen 5,5 und 8,0, kultiviert.
Unter diesen Bedingungen zeigen die Mikroorganismen im allgemeinen nach 1 bis 3 Tagen eine nennenswerte Akkumulation des Enzyms. Die Synthese der Deacetylase beginnt in der log-Phase. Die Produktion des Enzyms kann mit Hilfe von Aktivitätstests durch HPLC-Analyse bzw. photometrisch verfolgt werden. Die zur Produktion der Transaminase verwendete Nährlösung enthält 0,2 bis 5%, bevorzugt 0,5 bis 2%, Krabbenchitin sowie anorganische Salze.
An anorganischen Salzen kann die Nährlösung beispielsweise Chloride, Carbonate, Sulfate oder Phosphate der Alkali- oder Erdalkalimetalle, Eisen, Zink und Mangan enthalten, aber auch Ammoniumsalze und Nitrate.
Die Isolierung und Reinigung des Enzyms kann nach klassischen Verfahren über Ammoniumsulfat-Fällung, Ionenaustauscher- und Gelpermeationschromato­ graphie erfolgen.
Das Enzympräparat läßt sich charakterisieren durch ein Molekulargewicht von 20 000 bis 100 000 Dalton, bevorzugt 30 000 bis 80 000, insbesondere 40 000 bis 70 000 Dalton. Das pH-Optimum des Enzymprodukts liegt in dem pH-Bereich 6,0 bis 10,0, insbesondere 7,0 bis 8,0. Das Temperatur-Optimum des Enzyms liegt zwischen 30 und 50°C, insbesondere zwischen 35 und 45°C.
Erfindungsgemäß können wirksame Mengen der Deacetylase in freier oder immobilisierter Form zur Deacetylierung eingesetzt werden.
Das Enzym besitzt eine Substratspezifität für L-N-Acetyl-Phosphinothricin, kann aber auch andere Substrate, wie z. B. L-N-Acetyl-Glutamat, umsetzen.
Für die Fixierung kommen die bekannten Verfahren in Betracht, wie die in den Deutschen Offenlegungsschriften 32 37 341 und 32 43 591 beschriebenen Verfahren.
Die anschließenden Beispiele dienen dazu, die Erfindung weitergehend zu erläutern. Prozentangaben beziehen sich, wenn nicht anders angegeben, auf das Gewicht. Ferner wird die Erfindung in den Patentansprüchen definiert.
1. Anzucht des Mikroorganismus
Eine Mischkultur der folgenden Mikroorganismen
  • 1. Variovorax paradoxus (DSM 7470),
  • 2. Pseudomonas diminuta (ATCC 11568),
  • 3. Nocardia globerula (ATCC 19370),
  • 4. Cellulomonas cartae (ATCC 21681) und
  • 5. Agrobacterium radiobacter (ATCC 19358)
wurde zur Reinigung der Deacetylase eingesetzt. Diese Mischkultur wird im folgenden als K9 bezeichnet. K9 wurde unter Luftzufuhr bei 28°C bis zu Ende der log-Phase in folgendem Medium kultiviert:
10 g/l Krabbenchitin; 1 g/l Ammoniumsulfat; 0.5 g/l MgSO4; 2.5 g/l K2HPO4 pH 7.2; 1 ml/l Standard-Spurenelemente-Lösung.
Diese Standard-Spurenelemente-Lösung enthält:
0,25 g/ml FeSO4
0,05 g/ml H3BO3
0,1 g/ml ZnSO4
0,1 g/ml CaCl2
0,1 g/ml MnSO4
0,1 g/ml Na2MoO4
0,1 g/ml CuSO4
Die Mikroorganismen wurden durch Zentrifugation geerntet.
Die Isolierung und Reinigung des Enzyms kann nach klassischen Verfahren über Aufschluß durch Ultraschall und French-Press, Ammoniumsulfat-Fällung, Ionentauscher, Affinitätschromatographie und Gelpermeation erfolgen.
Nach tryptischer Verdauung der gereinigten Deacetylase konnte mittels Reversed-Phase-HPLC mehrere Peptide isoliert und deren partielle Aminosäuresequenz bestimmt werden:
  • 1. Thr-Gln-Val-Pro-Ala-Ser-Pro-Xaa-Xaa-Thr-Xaa-Xaa-Xaa-Lys-Ala
  • 2. Val-Pro-Val-Tyr-Glu-Met-Tyr-Pro-Tyr
  • 3. Phe-Leu-Val-Thr-Met-Phe-Asn-Glu-Gly-Gln-Lys
  • 4. Val-Met-Ala-Lys
Die Aminosäuresequenz zeigt keine Homologie zu bereits aus der Literatur bekannten Deacetylasen.
2. Kultivierung der Mikroorganismen
K 9 wurde wie in der Anmeldung EP-A 0 191 736 beschrieben gewonnen und in Chitinmedium (s. o.) bei 28°C für etwa 3 bis 4 Tage unter Luftzufuhr kultiviert. Die Deacetylase-Aktivität der Mikroorganismen erreichte nach 3 bis 4 Tagen Kulturdauer ein Maximum und nahm bei fortdauernder Kultur kontinuierlich wieder ab.
3. Isolierung der Deacetylase aus K 9
Die durch Zentrifugation geernteten Zellen von K 9 wurden in dem zweifachen Volumen, d. h. 2 ml/g Mikroorganismen, Puffer A (50 mM Phosphatpuffer pH 8,0; 5 mM Mercaptoethanol, 1 mM Phenylmethylsulfonylchlorid [PMSF]) suspendiert und durch Ultraschall (15 min.) und anschließende Passage durch eine "French Press" aufgeschlossen. Die Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation entfernt und der klare Überstand durch Ammonsulfatfällung fraktioniert. Die gewünschte Deacetylaseaktivität fiel bei einer Sättigung der Lösung zwischen 35 und 60% Ammonsulfat und wurde durch Zentrifugation gewonnen und gegen Puffer-A dialysiert.
Das Dialysat wurde durch eine 0.25 pm Membran filtriert und über eine Anionentauscher-Säule mit quarternären Aminogruppen (Q-Sepharose HP, Pharmacia) gegeben. Das gewünschte Protein befand sich im Durchlauf der Säule und wurde über die Gelpermeationssäule (Superdex 200) in Puffer A, der 0.1 M KCl enthält, getrennt. Die aktiven Fraktionen wurden gegen 10 mM Tris, 5 mM Mercaptoethanol, pH 7,5 dialysiert, an eine Hydroxyapatit Säule (HTP Cartridge; BioRad) gebunden und mit einem Phosphat-Gradienten eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden gegen 10 mM HEPES, 5 mM Mercaptoethanol, pH 7,5 dialysiert und über eine Mono-S-Säure (Kationentauscher, Pharmacia) gegeben. Die Enzymaktivität befand sich wiederum im Durchlauf, wurde gegen 25 mM Imidazol (pH 7,5) dialysiert und über Chromatofocussierung an Mono P (Pharmacia) weiter gereinigt. Als weiterer Reinigungsschritt erfolgte dann eine Chromatographie an Blue Sepharose (Blue Cartridge, BioRad). Nach diesem Reinigungsschritt war das Protein von allen Fremdproteinen abgetrennt.
4. Charakterisierung des Proteins
  • - Molekulargewicht: ca. 50 000 Dalton (bestimmt mittels denaturierender Polyacrylamid Gelelektrophorese)
  • - pH Optimum: pH = 7,5
  • - Temperaturoptimum: 40°C
  • - Substratspezifität gegenüber L-N-Acetyl Phosphinothricin und L-N-Acetyl Glutamat
  • - Enzymaktivität: siehe Beispiel 5
5. Die Bestimmung der Enzymaktivität erfolgte nach zwei verschiedenen Methoden 5.1 Test 1 (Radioaktiver Test)
1-15 µl Enzym (in 50 mM Phosphatpuffer pH 7,5; 5 mM Mercaptoethanol) wurden mit 5 µl 0,25 mM 14C-N-Ac-PPT (150 000 dpm) für 2 h bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden 5 µl des Reaktionsansatzes auf aktivierten Kieselgel-DC-Platten mit dem Laufmittel 2-Propanol : Ammoniak (25%) = 6 : 4 getrennt und die Platten per Autoradiographie analysiert.
5.2 Test 2 (Quantitativer Test)
1-50 µl Enzym (in 50 mM Phosphatpuffer pH 7,5; 5 mM Mercaptoethanol) plus 10 mM N-Ac-PPT wurden bei 40°C inkubiert und die Reaktion durch Ansäuern auf pH 2 gestoppt. Das von der Deacetylase gebildete L- Phosphinothricin wurde im Aminosäureanalysator quantifiziert.
Die Sequenz mehrerer tryptischer Peptide der Deacetylase wurde mittels Gasphasen-Sequenator bestimmt (Xaa bezeichnet nicht eindeutig bestimmte Aminosäuren):
  • 1. Thr-Gln-Val-Pro-Ala-Ser-Pro-Xaa-Xaa-Thr-Xaa-Xaa-Xaa-Lys-Ala
  • 2. Xaa-Val-Pro-Val-Tyr-Glu-Met-Tyr-Prn-Tyr
  • 3. Xaa-Xaa-Phe-Leu-Val-Thr-Met-Phe-Asn-Glu-Gly-Gln-Lys
  • 4. Xaa-Val-Met-Ala-Lys
6. Produktion von L-PPT aus DI-N-Ac-PPT mit der gereinigten Deacetylase
Die gereinigte Deacetylase wurde mit einer Konzentration von 0,1 mg/ml (spez. Enzymaktivität 15 U/mg Protein) in 50 mM Tris Puffer pH 8,0 mit 50 mM DI-N-Ac-PPT bei 37°C inkubiert. Zwischen 0 und 24 Stunden Inkubationszeit wurden Proben entnommen und auf gebildetes L-Phosphinothricin untersucht. Nach Abschluß der Reaktion waren etwa 50% des eingesetzten DL-N-Ac-PPT in L-PPT umgesetzt worden.
7. Nachweis der Deacetylase Aktivität in Antherenextrakten
Aus Tabakblüten wurden je 100 mg reife Antheren isoliert und mit Puffer (50 mM Tris pH 7,2; 10 mM MgCl2; 1 mM EDTA; 10 mM Mercaptoethanol; 1% unlösliches PVP) homogenisiert und anschließend zentrifugiert.
Die löslichen Überstände wurden wie folgt behandelt:
  • A: plus 5 mM DL-N-Ac-PPT
  • B: plus 5 mM DL-N-Ac-PPT; plus 0,1 unit Deacetylase
  • C: ohne Zusatz
und für 15 min bei 28°C inkubiert.
Anschließend wurde in den Ansätzen das gebildete L-PPT bestimmt. Während in den Ansätzen A und C kein L-PPT nachweisbar war, konnte im Ansatz B eine Konzentration von 2 mM L-PPT festgestellt werden.
Des weiteren wurde in den Ansätzen die Aktivität des Enzyms Glutamin- Synthetase (auf der Inhibierung des Enzyms Glutamin-Synthetase durch L-PPT beruht der Wirkmechanismus des Herbizids BASTA.). In den Ansätzen A und C konnte eine Glutaminsynthetase-Aktivität von 2 bzw. 5 nkat/mg Protein nachgewiesen werden. Im Ansatz B war das Enzym nicht mehr aktiv.
Der Versuch zeigt, daß in den Antheren die Glutamin-Synthetase, das Enzym durch das Herbizid Phosphinothricin gehemmt wird, exprimiert wird und die von uns isolierte L-N-Ac-PPT-spezifische Deacetylase in Pflanzengewebe aktiv ist.

Claims (11)

1. Eine Deacetylase aus einem Bodenisolat mit
  • - einem Molekulargewicht von 20 000 bis 100 000 Dalton
  • - einem pH-Optimum in einem Bereich von 6,5 bis 9,5 und
  • - einer Substratspezifität gegenüber N-Acetyl-Phosphinothricin.
2. Ein Verfahren zur Herstellung einer Deacetylase gemäß Anspruch 1, das dadurch gekennzeichnet ist, daß ein nicht sporenbildender Mikroorganismus in Krabbenchitin enthaltenden Medium kultiviert wird, und die Deacetylase aus diesen Mikroorganismen isoliert wird.
3. Deacetylase nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens eine der folgenden Aminosäuresequenzen enthält:
  • - Thr-Gln-Val-Pro-Ala-Ser-Pro-Xaa-Xaa-Thr-Xaa-Xaa-Xaa-Lys-Ala
  • - Val-Pro-Val-Tyr-Glu-Met-Tyr-Pro-Tyr
  • - Phe-Leu-Val-Thr-Met-Phe-Asn-Glu-Gly-Gln-Lys
  • - Val-Met-Ala-Lys.
4. Verfahren zur Herstellung der Transaminase nach Anspruch 1 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß ein Mikroorganismus ausgewählt aus der Gruppe welche aus Variovorax paradoxus (DSM- Hinterlegungsnummer 7470), Pseudomonas diminuta (ATCC 11568), Nocardia globerula (ATCC 19370), Cellulomonas cartae (ATCC 21681) und Agrobacterium radiobacter (ATCC 19358) besteht, in einem Medium, das Krabbenchitin enthält, kultiviert und die Deacetylase isoliert wird.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß bei einer Temperatur zwischen 20 und 40°C kultiviert wird.
6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß bei einer Temperatur zwischen 25 und 37°C kultiviert wird.
7. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 4 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß bei einem pH-Wert von 5 bis 8,5 kultiviert wird.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß bei einem pH-Wert von 5,5 bis 8,0 kultiviert wird.
9. Verwendung der Transaminase nach Anspruch 1 oder 3 zur Deacetylierung von N-Acetyl-Phosphinothricin.
10. Verwendung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Deacetylierungsreaktion zwischen 30 und 50°C durchgeführt wird.
11. Verwendung nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktion bei einem pH-Wert von 6 bis 10 durchgeführt wird.
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