CN105018403B - 一种产生四氢嘧啶的基因工程菌及其构建方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种产生四氢嘧啶的基因工程菌及其构建方法与应用，所述基因工程菌为具有特定基因型的大肠杆菌，包含来源于伸长盐单胞菌ectABC基因；lysA、thrA、iclR三个基因缺陷型；具有lac启动子控制的谷氨酸棒状杆菌lysC基因；trc启动子控制的ppc基因；使用该菌利用葡萄糖发酵生产四氢嘧啶能够克服化学合成法反应条件苛刻、能耗大等不足；能够克服伸长盐单胞菌发酵或酶催化法存在的工艺复杂、生产成本高等不足。发酵20‑28h后，四氢嘧啶产量达到了12‑18g/L，具有较好的工业应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及化合物生物技术生产领域，尤其是一种产生四氢嘧啶的基因工程菌及其构建方法与应用。
背景技术
目前四氢嘧啶的生产方法包括发酵法和酶催化法。其中，
嗜盐微生物中具有四氢嘧啶的合成途径，因此广泛应用于四氢嘧啶的发酵法生产中。Sauer T等采用“细菌挤奶法”高密度发酵获得了较高产量的四氢嘧啶，即高渗透压下培养细菌、然后低渗冲击释放溶质、再将菌体重新高渗培养、低渗冲击释放溶质，依次循环多至8-9次，获得产物。朱皖宜(201310416404.4)等公开了一种可用于生产四氢嘧啶的新的盐单胞菌Halomonas sp.HS-2255及其突变株，保藏号为CGMCCNo.6248。该菌株在含有可同化的碳源和氮源且较低的NaCl含量的培养基中具有较高的四氢嘧啶产量，并且副产物羟基四氢嘧啶的含量较低。
酶催化法是通过在大肠杆菌中表达四氢嘧啶合成基因簇ectABC以获得具有相应酶活性的全细胞或粗酶液，以天冬氨酸为前体物催化合成四氢嘧啶的过程。董志扬等(201310518176.1，201310534045.2)采用利用E.coli BW-pBAD-ectABC，保藏编号为CGMCCNO.8334，将L-天冬氨酸钠经生物转化反应后即得。该菌体重复使用五次每升发酵菌体共可以合成胞外四氢嘧啶87.5g,合成效率达到11.67g/L.d。
以上两种方法中，嗜盐菌发酵生产四氢嘧啶的不足在于培养过程中均需要高的NaCl浓度来刺激菌体积累更多的产物，发酵周期较长，而且高浓度的NaCl溶液对发酵设备腐蚀严重，不适合大规模的工业化生产，同时高盐的发酵废液对环境造成了较大压力；酶催化法生产四氢嘧啶的底物为天冬氨酸钠，酶需要诱导表达并提取，因此操作比较复杂，生产成本较高。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种产生四氢嘧啶的基因工程菌。
本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述产生四氢嘧啶的基因工程菌的构建方法。
本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述产生四氢嘧啶的基因工程菌的应用，用于制备四氢嘧啶。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
一种产生四氢嘧啶的基因工程菌(E.coliECT06)，为具有特定基因型的大肠杆菌，包含来源于伸长盐单胞菌ectABC基因；lysA、thrA、iclR三个基因缺陷型；具有lac启动子控制的谷氨酸棒状杆菌lysC基因；trc启动子控制的ppc基因，其中，
所述编码基因ectA的核苷酸序列为序列表400<1>所示序列；
所述编码基因ectB的核苷酸序列为序列表400<2>所示序列；
所述编码基因ectC的核苷酸序列为序列表400<3>所示序列；
所述编码基因thrA的核苷酸序列为序列表400<4>所示序列；
所述编码基因lysA的核苷酸序列为序列表400<5>所示序列；
所述编码基因lysC的核苷酸序列为序列表400<6>所示序列；
所述编码基因ppc的核苷酸序列为序列表400<7>所示序列；
所述编码基因iclR的核苷酸序列为序列表400<8>所示序列。
优选的，上述产生四氢嘧啶的基因工程菌，是由下述方法构建得到的：
(1)以pTrc99a质粒为载体克隆伸长盐单胞菌(CGMCC 1.6329)中的三个基因ectABC到大肠杆菌E.coliW3110中，所述大肠杆菌保藏号ATCC 27325，构建出L-天冬氨酸-β-半醛到四氢嘧啶的代谢途径，所述三个基因ectABC分别表达氨基丁酸乙酰基转移酶、二氨基丁酸氨基转移酶和四氢嘧啶合成酶；
(2)敲除编码高丝氨酸脱氢酶I和二氨基更二酸脱羧酶的基因thrA和lysA；在基因组arsB位置整合由lac启动子控制的谷氨酸棒状杆菌的天冬氨酸激酶基因lysC，所述谷氨酸棒状杆菌保藏号ATCC 13032；
(3)将磷酸烯醇式丙酮酸激酶编码基因ppc的启动子替换为trc启动子，并敲除乙醛酸循环控制基因iclR以打开乙醛酸循环，最终获得产生四氢嘧啶的基因工程菌，其中，
所述编码基因arsB的核苷酸序列为序列表400<9>所示序列。
一种产生四氢嘧啶的基因工程菌的构建方法(E.coli ECT06)，具体方法为：
(1)以pTrc99a质粒为载体克隆伸长盐单胞菌Halomonas elongateCGMCC1.6329中的三个基因ectABC到大肠杆菌E.coli W3110(ATCC27325)中，构建出L-天冬氨酸-β-半醛到四氢嘧啶的代谢途径，所述三个基因ectABC分别表达氨基丁酸乙酰基转移酶、二氨基丁酸氨基转移酶和四氢嘧啶合成酶；
(2)敲除编码高丝氨酸脱氢酶I和二氨基更二酸脱羧酶的基因thrA和lysA，削弱了L-天冬氨酸-β-半醛到赖氨酸和苏氨酸的代谢，但由于E.coli W3110中thrA基因同时编码天冬氨酸激酶，thrA的敲除会导致天冬氨酸到L-天冬氨酸-β-半醛的合成受阻；在基因组arsB位置整合由lac启动子控制的谷氨酸棒状杆菌Corynebacterium glutamicumATCC13032的天冬氨酸激酶基因lysC，保证了前体物L-天冬氨酸-β-半醛的供应；
(3)将磷酸烯醇式丙酮酸激酶编码基因ppc的启动子替换为trc启动子，并敲除乙醛酸循环控制基因iclR以打开乙醛酸循环，增强了葡萄糖到L-天冬氨酸的代谢通量，最终获得产生四氢嘧啶的基因工程菌；其中，
所述编码基因ectA的核苷酸序列为序列表400<1>所示序列；
所述编码基因ectB的核苷酸序列为序列表400<2>所示序列；
所述编码基因ectC的核苷酸序列为序列表400<3>所示序列；
所述编码基因thrA的核苷酸序列为序列表400<4>所示序列；
所述编码基因lysA的核苷酸序列为序列表400<5>所示序列；
所述编码基因lysC的核苷酸序列为序列表400<6>所示序列；
所述编码基因ppc的核苷酸序列为序列表400<7>所示序列；
所述编码基因iclR的核苷酸序列为序列表400<8>所示序列；
所述编码基因arsB的核苷酸序列为序列表400<9>所示序列。
一种四氢嘧啶的制备方法，应用上述产生四氢嘧啶的基因工程菌(E.coliECT06)，具体步骤如下：
(1)种子培养，将所述产生四氢嘧啶的基因工程菌经斜面活化后接种至装有种子培养基的500mL圆底三角瓶中，其中接种环每刮取一环使用种子培养基30mL，于35-39℃，100-200rpm摇床培养6-8h；
(2)发酵培养，以5-10％的接种量将步骤(1)的种子培养物接种至装有30mL发酵培养基的500mL挡板三角瓶中，35-39℃，150-250rpm进行发酵培养，通过微量进样器补加氨水维持pH在6.8-7.2，补加1-5mL，60％(m/v)葡萄糖溶液维持发酵进行，发酵周期20-28h，即得。
上述步骤(2)所得四氢嘧啶的产量可达到12-18g/L。
上述四氢嘧啶的制备方法，所得发酵液中四氢嘧啶的检测方法为：发酵液经13000rpm高速离心2min后取上清，并用去离子水稀释到一定浓度后使用高效液相色谱法测定四氢嘧啶含量；检测条件为：TSK-GEL C18色谱柱，流动相为2％乙腈溶液，柱温30℃，流速1mL/min，进样量20μl，紫外检测波长210nm，保留时间5min。
优选的，上述四氢嘧啶的制备方法，所述种子培养基成分为：蔗糖20-40g，(NH4)2SO4 1-5g，KH2PO4 1-5g，MgSO4·7H2O 0.2-2g，酵母粉5-20g，玉米浆0.2-2mL，FeSO4·7H2O1-5mg，MnSO4·H2O 1-5mg，用去离子水定容到1L。上述培养基均可采用标准方法制备获得。
优选的，上述四氢嘧啶的制备方法，所述种子培养基成分为：蔗糖25g，(NH4)2SO42g，KH2PO4 2g，MgSO4·7H2O 1g，酵母粉10g，玉米浆1mL，FeSO4·7H2O 2.8mg，MnSO4·H2O2.8mg，用去离子水定容到1L。
优选的，上述四氢嘧啶的制备方法，所述发酵培养基成分为：葡萄糖20-40g，(NH4)2SO41-5g，KH2PO41-5g，MgSO4·7H2O 0.2-2g，酵母粉0.1-1g，玉米浆1-5mL，FeSO4·7H2O 50-200mg，MnSO4·H2O 50-200mg，用去离子水定容到1L。
优选的，上述四氢嘧啶的制备方法，所述发酵培养基成分为：葡萄糖40g，(NH4)2SO41.8g，KH2PO43g，MgSO4·7H2O 2g，酵母粉0.1g，玉米浆2mL，FeSO4·7H2O 80mg，MnSO4·H2O 80mg，用去离子水定容到1L。
上述培养基均可采用标准方法制备获得。
本发明的有益效果是：
上述产生四氢嘧啶的基因工程菌是通过合理的基因工程手段构建出的一株以葡萄糖为底物直接发酵生产四氢嘧啶的工程菌株，在不需要高盐浓度的常规发酵条件下，24-28h发酵液中能够大量积累四氢嘧啶，经检测它们的产率均比现有工艺有所提升；整个发酵过程控制与现有的发酵法和酶催化法生产四氢嘧啶盐工艺相比，原料成本较低，培养条件简单，设备损耗小，发酵周期短，操作简便，无需收集菌体提取酶液，四氢嘧啶生产效率较高。
附图说明
图1为菌株代谢改造图；
图2为四氢嘧啶标准品的液相色谱峰图；
图3为四氢嘧啶发酵液的液相色谱峰图。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合具体实施方式对本发明所述技术方案作进一步的详细说明。
实施例1
产生四氢嘧啶的基因工程菌E.coli ECT06的构建
(1)L-天冬氨酸-β-半醛到四氢嘧啶的代谢途径的构建。
①采用PCR技术以伸长盐单胞菌(CGMCC 1.6329)基因组为模板，根据ectABC基因序列设计一对引物，扩增获取ectABC片段。所述一对引物分别包含酶切位点EcoR I和BamHI。
②使用Takara限制性内切酶EcoR I和BamH I双酶切步骤①中获得目的片段及pTrc99a载体质粒，获得带有相同粘性末端的ectABC和pTrc99a线性片段。
③使用Takara T4DNA连接酶连接步骤②中获得的两个目的片段，得到目的载体pTrc99a-ectABC。
④将步骤③中获得的载体转化入E.coli W3110(ATCC 27325)中，获得E.coliECT01
(2)thrA基因的敲除
①采用Red同源重组技术敲除上述基因。采用PCR技术以E.coli W3110(ATCC27325)基因组为模板，根据thrA基因序列，在基因两端设计同源臂引物，扩增获取thrA基因的上下游同源臂。
②采用PCR技术以pKD3为模板，设计引物，扩增氯霉素抗性基因片段。
③以步骤①和步骤②中获得的扩增片段为模板，通过重叠PCR技术获得thrA基因敲除片段。所述基因敲除片段由thrA基因上下游同源臂基因片段及氯霉素抗性基因片段组成。
④将上述基因敲除片段导入含有pKD46质粒的E.coli ECT01中获得阳性转化子，消除阳性转化子中的氯霉素抗性基因后获得thrA基因敲除菌E.coliECT02。
(3)lysA基因的敲除
以步骤(2)中的方法敲除lysA基因，获得阳性转化子并消除氯霉素抗性基因后获得thrA和lysA基因敲除菌E.coliECT03
(4)iclR基因的敲除
以步骤(2)中的方法敲除iclR基因，获得阳性转化子并消除氯霉素抗性基因后获得thrA、lysA、iclR基因敲除菌E.coli ECT04。
(5)谷氨酸棒状杆菌lysC基因的引入
①采用PCR技术以谷氨酸棒状杆菌(ATCC13032)基因组为模板，根据lysC基因序列设计一对引物扩增lysC基因片段；
②采用PCR技术扩增pSTV28上的lac启动子；
③采用PCR技术扩增pKD3上的氯霉素抗性片段；
④采用PCR技术以E.coli W3110(ATCC27325)基因组为模板，根据arsB基因序列设计同源臂引物，上下游同源臂均位于arsB基因内部；
⑤以步骤①、②、③、④获得的扩增片段为模板通过重叠PCR获得lysC整合片段，所述片段由arsB基因上游同源臂、arsB基因下游同源臂、lac启动子片段、氯霉素抗性基因片段、lysC基因片段组成；
⑥将上述基因片段导入含有pKD46的E.coli ECT04中，获得阳性转化子，消除转化子中的氯霉素抗性基因后获得arsB基因替换为lac启动子控制的lysC基因的E.coliECT05。
(6)ppc基因启动子的替换
①采用PCR技术以E.coli W3110(ATCC 27325)基因组为模板，根据ppc基因序列设计同源臂引物，上游同源臂位于ppc启动子上游，下游同源臂位于ppc结构基因前600bp范围内；
②采用PCR技术扩增pTrc99a载体质粒上的trc启动子；
③采用PCR技术扩增pKD3质粒上的氯霉素抗性片段；
④以步骤①、②、③获得的扩增片段为模板通过重叠PCR获得ppc启动子替换片段，所述片段由ppc基因启动子上游同源臂、ppc基因下游同源臂、trc启动子片段、氯霉素抗性基因片段组成；
⑤将上述基因片段导入含有pKD46的E.coli ECT05中，获得阳性转化子，消除转化子中的氯霉素抗性基因后获得ppc启动子替换为trc启动子的E.coli ECT06。
可见，本发明所述产生四氢嘧啶的基因工程菌：
1)敲除编码高丝氨酸脱氢酶I和二氨基更二酸脱羧酶的基因thrA和lysA，削弱了L-天冬氨酸-β-半醛到赖氨酸和苏氨酸的代谢。
2)E.coliW3110中thrA基因同时编码天冬氨酸激酶，thrA的敲除会导致天冬氨酸到L-天冬氨酸-β-半醛的合成受阻，因此在基因组整合来自谷氨酸棒状杆菌的天冬氨酸激酶编码基因lysC，保证L-天冬氨酸-β-半醛的充分合成。
3)将磷酸烯醇式丙酮酸激酶编码基因的ppc启动子替换为trc启动子，并敲除乙醛酸循环控制基因iclR以打开乙醛酸循环，增强了葡萄糖到L-天冬氨酸的代谢通量。
通过上述一系列的改造增强了葡萄糖到L-天冬氨酸-β-半醛的代谢通量，减弱了L-天冬氨酸-β-半醛的支路代谢，使得工程菌可以直接利用葡萄糖发酵生产四氢嘧啶，发酵28h后四氢嘧啶的产量达到了18g/L，具体生产四氢嘧啶的方法见实施例2。
实施例2
产生四氢嘧啶的基因工程菌E.coliECT06的发酵培养及检测，具体步骤如下：
(1)使用细菌完全培养基活化产生四氢嘧啶的基因工程菌(E.coli ECT06工程菌)，37℃恒温培养12h；
(2)将上述活化斜面转接二代活化斜面，37℃恒温培养10h；
(3)使用接种环刮取一环菌种到装液量为30mL的500mL圆底三角瓶中，37℃，200rpm培养7h；
(4)使用移液管按照10％接种量接种发酵摇瓶，发酵瓶为装液量为30mL的500mL挡板三角瓶，37℃，200rpm培养28h；苯酚红作为指示剂，通过微量进样器补加氨水维持pH在7.2，补加3mL，60％(m/v)葡萄糖溶液维持发酵进行，发酵周期24h；
(5)收集发酵液，13000rmp离心，收集上清液相检测四氢嘧啶含量；
(6)使用去离子水将上清稀释200倍，经0.22μm微孔过滤膜过滤后待测；
(7)使用UltiMate 3000(Thermo Scientific)高效液相色谱仪测定四氢嘧啶。上述制备样品使用微量进样针，进样量20μl，色谱柱为TSK-GEL C18色谱柱，柱温30℃，流动相为2％乙腈，流速1mL/min，紫外检测波长210nm，出峰时间约2.9min。经液相色谱检测，如图2和图3所示，发酵液中的四氢嘧啶含量约18g/L。
种子培养基成分为：蔗糖25g，(NH4)2SO4 2g，KH2PO4 2g，MgSO4·7H2O 1g，酵母粉10g，玉米浆1mL，FeSO4·7H2O 2.8mg，MnSO4·H2O 2.8mg，用去离子水定容到1L。
发酵培养基成分为：葡萄糖40g，(NH4)2SO41.8g，KH2PO43g，MgSO4·7H2O2g，酵母粉0.1g，玉米浆2mL，FeSO4·7H2O 80mg，MnSO4·H2O 80mg，用去离子水定容到1L。
可见，针对背景技术中所述问题，本发明提了供一株能够生产四氢嘧啶的工程菌，所述工程菌具有特定基因型的大肠杆菌，包含来源于伸长盐单胞菌ectABC基因；lysA、thrA、iclR三个基因缺陷型；具有lac启动子控制的谷氨酸棒状杆菌lysC基因；trc启动子控制的ppc基因(见图1)。在上述基因型的共同作用下该四氢嘧啶工程菌可以以葡萄糖为底物发酵生产四氢嘧啶，能够克服化学合成法反应条件苛刻、能耗大等不足；能够克服伸长盐单胞菌发酵或酶催化法存在的工艺复杂、生产成本高等不足。
上述参照具体实施方式对该一种产生四氢嘧啶的基因工程菌及其构建方法与应用进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种产生四氢嘧啶的基因工程菌，其特征在于：为具有特定基因型的大肠杆菌，包含伸长盐单胞菌ectABC基因；lysA、thrA、iclR三个基因缺陷型；具有lac启动子控制的谷氨酸棒状杆菌lysC基因；trc启动子控制的ppc基因，其中，
所述编码基因ectA的核苷酸序列为序列表SEQ NO.1所示序列；
所述编码基因ectB的核苷酸序列为序列表SEQ NO.2所示序列；
所述编码基因ectC的核苷酸序列为序列表SEQ NO.3所示序列；
所述编码基因thrA的核苷酸序列为序列表SEQ NO.4所示序列；
所述编码基因lysA的核苷酸序列为序列表SEQ NO.5所示序列；
所述编码基因lysC的核苷酸序列为序列表SEQ NO.6所示序列；
所述编码基因ppc的核苷酸序列为序列表SEQ NO.7所示序列；
所述编码基因iclR的核苷酸序列为序列表SEQ NO.8所示序列。
2.根据权利要求1所述的产生四氢嘧啶的基因工程菌，其特征在于：是由下述方法构建得到的：
(1)以pTrc99a质粒为载体克隆伸长盐单胞菌中的三个基因ectABC到大肠杆菌E.coliW3110中，其中，伸长盐单胞菌的保藏号为CGMCC 1.6329，所述大肠杆菌保藏号为ATCC27325，构建出L-天冬氨酸-β-半醛到四氢嘧啶的代谢途径，所述三个基因ectABC分别表达氨基丁酸乙酰基转移酶、二氨基丁酸氨基转移酶和四氢嘧啶合成酶；
(2)敲除编码高丝氨酸脱氢酶I和二氨基庚二酸脱羧酶的基因thrA和lysA；在基因组arsB位置整合由lac启动子控制的谷氨酸棒状杆菌的天冬氨酸激酶基因lysC，所述谷氨酸棒状杆菌保藏号为ATCC 13032；
(3)将磷酸烯醇式丙酮酸激酶编码基因的ppc启动子替换为trc启动子，并敲除乙醛酸循环控制基因iclR以打开乙醛酸循环，最终获得产生四氢嘧啶的基因工程菌，其中，
所述编码基因arsB的核苷酸序列为序列表SEQ NO.9所示序列。
3.一种产生四氢嘧啶的基因工程菌的构建方法，其特征在于：具体方法为：
(1)以pTrc99a质粒为载体克隆伸长盐单胞菌中的三个基因ectABC到大肠杆菌E.coliW3110中，所述伸长盐单胞菌保藏号为CGMCC 1.6329，所述大肠杆菌保藏号为ATCC 27325，构建出L-天冬氨酸-β-半醛到四氢嘧啶的代谢途径，所述三个基因ectABC分别表达氨基丁酸乙酰基转移酶、二氨基丁酸氨基转移酶和四氢嘧啶合成酶；
(2)敲除编码高丝氨酸脱氢酶I和二氨基庚二酸脱羧酶的基因thrA和lysA；在基因组arsB位置整合由lac启动子控制的谷氨酸棒状杆菌的天冬氨酸激酶基因lysC，所述谷氨酸棒状杆菌保藏号为ATCC 13032；
(3)将磷酸烯醇式丙酮酸激酶编码基因的ppc启动子替换为trc启动子，并敲除乙醛酸循环控制基因iclR以打开乙醛酸循环，最终获得产生四氢嘧啶的基因工程菌；其中，
所述编码基因ectA的核苷酸序列为序列表SEQ NO.1所示序列；
所述编码基因ectB的核苷酸序列为序列表SEQ NO.2所示序列；
所述编码基因ectC的核苷酸序列为序列表SEQ NO.3所示序列；
所述编码基因thrA的核苷酸序列为序列表SEQ NO.4所示序列；
所述编码基因lysA的核苷酸序列为序列表SEQ NO.5所示序列；
所述编码基因lysC的核苷酸序列为序列表SEQ NO.6所示序列；
所述编码基因ppc的核苷酸序列为序列表SEQ NO.7所示序列；
所述编码基因iclR的核苷酸序列为序列表SEQ NO.8所示序列；
所述编码基因arsB的核苷酸序列为序列表SEQ NO.9所示序列。
4.一种四氢嘧啶的制备方法，其特征在于：应用权利要求1所述的产生四氢嘧啶的基因工程菌，具体步骤如下：
(1)种子培养，将所述产生四氢嘧啶的基因工程菌经斜面活化后接种至装有种子培养基的500mL圆底三角瓶中，其中接种环每刮取一环使用种子培养基30mL，于35-39℃，100-200rpm摇床培养6-8h；
(2)发酵培养，以5-10％的接种量将步骤(1)的种子培养物接种至装有30mL发酵培养基的500mL挡板三角瓶中，35-39℃，150-250rpm进行发酵培养，通过微量进样器补加氨水维持pH在6.8-7.2，补加1-5mL，60％(m/v)葡萄糖溶液维持发酵进行，发酵周期20-28h，即得。
5.根据权利要求4所述的四氢嘧啶的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中种子培养基成分为：蔗糖20-40g，(NH4)2SO4 1-5g，KH2PO4 1-5g，MgSO4·7H2O 0.2-2g，酵母粉5-20g，玉米浆0.2-2mL，FeSO4·7H2O 1-5mg，MnSO4·H2O 1-5mg，用去离子水定容到1L。
6.根据权利要求4或5所述的四氢嘧啶的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中种子培养基成分为：蔗糖25g，(NH4)2SO4 2g，KH2PO4 2g，MgSO4·7H2O 1g，酵母粉10g，玉米浆1mL，FeSO4·7H2O 2.8mg，MnSO4·H2O 2.8mg，用去离子水定容到1L。
7.根据权利要求4所述的四氢嘧啶的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中发酵培养基成分为：葡萄糖20-40g，(NH4)2SO41-5g，KH2PO41-5g，MgSO4·7H2O 0.2-2g，酵母粉0.1-1g，玉米浆1-5mL，FeSO4·7H2O 50-200mg，MnSO4·H2O 50-200mg，用去离子水定容到1L。
8.根据权利要求4或7所述的四氢嘧啶的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中发酵培养基成分为：葡萄糖40g，(NH4)2SO41.8g，KH2PO43g，MgSO4·7H2O 2g，酵母粉0.1g，玉米浆2mL，FeSO4·7H2O 80mg，MnSO4·H2O 80mg，用去离子水定容到1L。
9.根据权利要求4所述的四氢嘧啶的制备方法，其特征在于：步骤(2)中最终四氢嘧啶的产量达到了12-18g/L。
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