CN104884621A - 基因工程酵母 - Google Patents

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Abstract

一种基因修饰酿酒酵母，其包含生产3-HP的活性发酵通路，该基因修饰酿酒酵母表达外源性基因，所述外源性基因表达来自蜡状芽孢杆菌AH1272的、催化β-丙氨酸和丙酮酸之间的氨基转移反应以产生丙二酸半醛的转氨酶YhxA。所述酵母也可表达3-羟基异丁酸脱氢酶(HIBADH)、3-羟基丙酸脱氢酶(3-HPDH)和天冬氨酸1-脱羧酶。另外，酵母还可表达丙酮酸羧化酶和天冬氨酸转氨酶。

Description

基因工程酵母
本发明涉及基因工程酵母和它们在生产3-羟基丙酸(3HP)的方法中的用途。
3HP是一种平台化合物，其可转化成丙烯酸、1,3-丙二醇、丙二酸和其他有价值的产品。源自丙烯酸的产品包括用于婴儿尿布和失禁产品、各种塑料、涂料、粘合剂、弹性体和油漆中的超强吸收性聚合物。目前，丙烯酸来自丙烯，丙烯是乙烯和汽油生产中的一种副产物。从葡萄糖或其他可再生碳源建立3HP生产将针对从化石资源的丙烯酸生产提供生物可持续的替代方案。已经描述了几种从葡萄糖生产3HP的方法。但是，具体的教导主要使用细菌大肠杆菌作为宿主。本发明使用酵母作为生产3HP的宿主。这使得能够在低pH下进行该过程并且因此使该过程总体更经济。
US2010/0136638大体描述了在包括酵母的微生物中通过生物催化从β-丙氨酸生产3-HP。据称β-丙氨酸可在细胞中利用具有丙氨酸2,3-氨基变位酶活性的酶由α-丙氨酸合成，并且给出了相关酶的序列。
也公开了使用β-丙氨酸/丙酮酸转氨酶(BAPAT)序列由β-丙氨酸生产3-HP的方法。公开了具有BAPAT活性的转化细胞，其使得细胞能够将β-丙氨酸通过丙二酸半醛中间体转化成3-HP。
尽管提到了在酵母中进行这种工作的可能性，但并没有实践证据。我们发现，在大肠杆菌中有效的该通路中的酶在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中是无效的。尤其是，根据US2010/0136638，具有BAPAT活性的酶可获得自恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)或铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。但是，我们已经发现编码这些酶的基因在酿酒酵母中是无效的。
丙二酸半醛(或丙二酸半醛或3-氧代丙酸)是产生3HP的一个通路中的关键中间体，但是可能有许多生产3HP的不同路径。
US2012135481描述了酵母中的包括编码gabT、3-HPDH和HIBADH基因和其他基因的3HP产生通路。但是，需要其他的和更好的生产3HP的酵母。
我们现已发现，当异源表达来自蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)AH1272的未表征的转氨酶yhxA时，在酵母酿酒酵母中获得了由β-丙氨酸生产的3HP。所述yhxA编码的转氨酶的氨基酸序列列于SEQ ID NO1中，并且DNA序列列于SEQ ID NO2中。SEQ ID NO2针对酿酒酵母进行了密码子优化。
我们认为，来自蜡状芽孢杆菌AH1272的所述转氨酶YhxA催化β-丙氨酸和丙酮酸之间的氨基转移反应，产生L-丙氨酸和丙二酸半醛，在这种情况下，酶应该是β-丙氨酸-丙酮酸转氨酶E.C.2.6.1.18(BAPAT)，而不是gabT(E.C.2.6.1.19)。
US2012/0135481大体公开了一种基因修饰酵母细胞，其包含包括BAAT基因(β丙氨酸氨基转移酶-EC 2.6.1.19)的活性3-HP发酵通路，BAAT基因催化[β]-丙氨酸转化成丙二酸半醛。所以，这里的BAAT与天然存在的或基因修饰的gabT同义。但是，并未表明通过该方法成功生产了3-HP。
WO2005/118719公开了在酵母细胞中使用来自任何生物体的β-丙氨酸/丙酮酸转氨酶(BAPAT)序列由β-丙氨酸生产3-HP的方法，但是并未表明该方法的有效性。这里，经鉴定的BAPAT的来源包括假单胞菌、拟南芥、大鼠和非洲爪蟾。如上所述，我们已经确认，来自假单胞菌的BAPAT基因在酿酒酵母中是无效的。
yhxA的Uniprot条目提供了序列，但并未将该酶鉴定为BAPAT。
因此，本发明现在提供了基因修饰酵母细胞，其包含生产3-HP的活性发酵通路，其中，所述细胞包含并表达编码用于产生酶的外源性基因，所述酶与SEQ ID NO：1具有至少80％的同一性并催化β-丙氨酸和丙酮酸之间的氨基转移反应以产生丙二酸半醛。
优选地，所述酵母也表达3-羟基异丁酸脱氢酶(HIBADH)和/或3-羟基丙酸脱氢酶(3-HPDH)，3-羟基异丁酸脱氢酶适当地来自铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、恶臭假单胞菌(P.putida)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)或白色念珠菌(Candida albicans)，3-羟基丙酸脱氢酶任选地来自勤奋生金球菌(Metallosphaera sedula)、头寇岱硫化叶菌(Sulfolobus tokadaii)或大肠杆菌(E.coli)。
为了能够直接从葡萄糖合成3-羟基丙酸，优选另外重新构建从β-丙氨酸至3-羟基丙酸的通路以表达异源天冬氨酸1-脱羧酶，优选以昆虫合成，优选以红色面粉甲虫(赤拟谷盗(Tribolium castaneum))合成。为了进一步增加朝着3-羟基丙酸的流量，优选过表达丙酮酸羧化酶和/或PEP羧化酶和天冬氨酸转氨酶。另外，缺失丙酮酸脱羧酶活性(PDC1、PDC5、PDC6)或乙醇脱氢酶(ADH)活性会使得进行厌氧发酵而不形成作为副产物的乙醇。
根据本发明的菌株可使用适应性实验室进化方法进化，以改善葡萄糖耐受、去除乙酸酯依赖性并增加3HP的生产。
酵母优选是酿酒酵母，但可以是克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)、产朊假丝酵母(Cyberlindnerajadinii)、小红酵母(Rhodotula minuta)、粘红酵母(Rhodotula glutinis)、戴耳克氏圆孢酵母(Torulaspora delbrueckii)、树干毕赤酵母(Pichia stipitis)、巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)或其他酵母。
适于根据本发明修饰的酵母菌株可根据它们对于在存在3HP的情况下的生长的耐受来选择。
可对蜡状芽孢杆菌AH1272的天然(native)yhxA表达产物的氨基酸序列和编码它的DNA序列进行修饰，以各种方式在本发明中使用。首先，DNA序列可进行密码子优化，用于在适当的酵母中表达。第二，可通过氨基酸的缺失、添加或置换对氨基酸序列进行修饰，而不干扰、或者实际上增加酶的活性。这种经修饰的酶可与天然氨基酸序列具有至少80％的同源性，更优选至少85％、或90％或95％的同源性。
本发明包括生产3HP的方法，其包括培养本发明的酵母细胞和任选地从培养物回收3HP。培养可在包括β-丙氨酸或除所述酵母之外的β-丙氨酸来源的培养基中进行。所述来源可以是另一微生物。但是，本发明的酵母可被工程化以生产β-丙氨酸，例如，适当地通过组入产生天冬氨酸-1-脱羧酶(EC 4.1.1.11)或谷氨酸脱羧酶(EC 4.1.1.15)的外源性基因从L-天冬氨酸生产β-丙氨酸，或利用2,3-丙氨酸氨基变位酶由L-丙氨酸生产β-丙氨酸。由于其在合成泛酸酯中的作用，天冬氨酸1-脱羧酶也称为PanD。野生型酿酒酵母的基因组中不存在该酶的基因。
我们已经发现，使用某些编码天冬氨酸-1-脱羧酶的外源性PanD基因相比其他基因可获得优异的结果。尤其，我们已经发现来自昆虫、尤其面粉甲虫、更尤其红色面粉甲虫(Tribolium castaneum，赤拟谷盗)的PanD基因，与细菌PanD基因相比，提供3-HP的更好的生产滴度和更好的产率。
优选地，通过所述酵母生产3HP的产量为，由每升培养基生产、或从每升所述培养基回收至少100mg 3HP，更优选至少200、或300、或400或500或1000或2000或14000mg/l。
在下述非限制性实施例中进一步描述和阐释本发明，其中，参考了下表。
表1.引物
表2.中间质粒
质粒名 亲本质粒 合成基因序列克隆
pE1-PpBAPAT pE1 SEQ ID NO4
pE1-PaHIBADH pE1 SEQ ID NO6
pE1-CaHIBADH pE1 SEQ ID NO8
pE1-PpHIBADH pE1 SEQ ID NO10
pE1-BcHIBADH pE1 SEQ ID NO12
pE1-MsHPDH pE1 SEQ ID NO14
pE1-StMSR pE1 SEQ ID NO16
pE1-CaGabT pE1 SEQ ID NO18
pE2-MsHPDH pE2 SEQ ID NO14
表3.用于通过PCR产生USER克隆的基因片段的引物和模板
表4.表达质粒
*pTY为通过靶向TY重复区域多重整合入染色体而设计的载体。该载体包含与表4中列举的其他亲本质粒相同的USER克隆盒。
表5.添加了β-丙氨酸的培养中的菌株和3HP滴度
表6.添加了L-天冬氨酸的培养中的菌株和3HP滴度
表7.以葡萄糖作为唯一碳源的培养中的菌株和3HP滴度
表8.具有用于3HP生物合成的染色体整合基因的酵母菌株
在下述实施例中获得的结果部分显示在附图中，其中：
图1显示从丙酮酸经天冬氨酸、β-丙氨酸和丙二酸半醛至3-HP的代谢通路。
图2显示实施例2中获得的NMR结果。
图3显示整合多拷贝的基因和过表达前体供应基因对3HP滴度的影响。通过HPLC法测定培养液中3HP的浓度并以g L-1表示。↑-单拷贝的基因整合至基因组，↑↑-多拷贝的基因整合至基因组(实施例6)。
图4显示pH5时葡萄糖限制补料分批培养中SCE-R2-200的生长和代谢物浓度。三个培养之一的代表图(实施例7)。
如图1中所阐释，利用酶PanD即天冬氨酸1-脱羧酶，天冬氨酸可被转化成β-丙氨酸。β-丙氨酸可利用BAPAT或GabT转化成丙二酸半醛，并且丙二酸半醛可利用HIBADH/HPDH转化成3-HP。本发明使用经BAPAT的路径。
实施例1.克隆异源β-丙氨酸-丙酮酸转氨酶、3-羟基异丁酸脱氢酶和3-羟基丙酸脱氢酶并在酿酒酵母中过表达异源和天然γ-氨基丁酸转氨酶
以针对酵母酿酒酵母进行了密码子优化的版本(对应SEQ ID NO2，SEQ IDNO4，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，SEQ ID NO10，SEQ ID NO12，SEQ ID NO14，SEQ ID NO16，SEQ ID NO18)由GeneArt(Life Technologies)合成编码下述酶的基因：推定的蜡状芽孢杆菌转氨酶yhxA(SEQ ID NO1)、恶臭假单胞菌β-丙氨酸-丙酮酸转氨酶(SEQ ID NO3)、铜绿假单胞菌3-羟基丁酸脱氢酶(SEQ IDNO5)、白色念珠菌3-羟基丁酸脱氢酶(SEQ ID NO7)、恶臭假单胞菌3-羟基丁酸脱氢酶(SEQ ID NO9)、蜡状芽孢杆菌3-羟基丁酸脱氢酶(SEQ ID NO11)、勤奋生金球菌3-羟基丙酸脱氢酶(SEQ ID NO13)、头寇岱硫化叶菌(Sulfolobustokadaii)3-羟基丙酸脱氢酶(SEQ ID NO15)和丙酮丁醇梭菌γ-氨基丁酸转氨酶(SEQ ID NO17)。
有序的基因构建体具有如下的通用结构：GGTACCAAAACAATGNN…NNTGAGTCGAC(SEQ ID NO67)，其中GGTACC是KpnI限制酶切位点，AAAACA是Kozak序列，ATG是起始密码子，NN…NN表示没有起始密码子和终止密码子的蛋白质编码序列，TGA是终止密码子，GTCGAC是SalI限制酶切位点。
使用KpnI和SalI从质粒切下合成基因，凝胶纯化并连接至用相同的酶对消化的质粒pE1(SEQ ID 81)或pE2(SEQ ID82)。使用热激将所得连接混合物转化至化学感受态大肠杆菌DH5α并且在含有100μg/ml氨苄西林的Luria-Bertani(LB)琼脂培养基上对细胞进行选择。
通过菌落PCR鉴定具有正确插入序列的克隆，接种在含有100μg/ml氨苄西林的液体LB培养基中并且分离质粒(表2)。通过测序确认所得质粒。
使用如表3中所示的引物和模板，通过PCR扩增产生用于USER-克隆的带有基因和正确突出的基因片段。PCR混合物包含：28μl水，10μl高保真度聚合酶缓冲液(5x)，5μl 2mM dNTP，1μl聚合酶，2.5μl浓度为10μM的正向引物，2.5μl浓度为10μM的反向引物，以及1μl DNA模板。循环程序是：95℃2min，30个循环的[95℃10sec，50℃20sec，68℃2min]，68℃5min，在10℃暂停。在包含-SAFE(Invitrogen)的1％琼脂糖凝胶上分离基因片段并使用凝胶和PCR清洁试剂盒(PCR Clean-upKit)(Macherey-Nagel)纯化。同样地通过PCR产生启动子片段并随后进行基因纯化(表3)。表达质粒上已存在终止子。
将亲本质粒pESC-Ura-USER(SEQ ID NO 85)、pESC-His-USER(SEQ IDNO 83)和pESC-Leu-USER(SEQ ID NO 84)在37℃用AsiSI(Fermentas)线性化1小时并用Nb.BsmI在37℃处理1小时产生切口。从溶液中纯化所得的线性化且带有切口的DNA并且在5mM pH8.0Tris缓冲液中洗脱。
通过USER-克隆使用下述方案构建表达质粒。将1μl的线性化且带有切口的亲本质粒与1μl的启动子片段、2μl的基因片段、0.5μl Taq聚合酶缓冲液、0.5μl USER酶(NEB)混合。将混合物在37℃温育25min、在25℃温育25min并转化至化学感受态大肠杆菌DH5α。通过菌落PCR鉴定具有正确插入序列的克隆，从大肠杆菌过夜培养物分离质粒并通过测序确认。表达质粒列举在表4中。
使用乙酸锂转化方案将表达质粒转化至酿酒酵母细胞。在缺乏尿嘧啶、组氨酸和亮氨酸的合成完全(SC)琼脂培养基上对细胞进行选择。所得菌株列举在表5中。
实施例2.3-羟基丙酸在以β-丙氨酸培养的酿酒酵母中的生产
在SC ura-his-leu-琼脂平板上划线纯化至少四个独立的酵母转化子。将来自独立的转化子的四个单克隆接种在具有透气盖子的96-深孔微量滴定板中(EnzyScreen)的0.5ml SC ura-his-leu-中。使滴定板在30℃以5cm轨道抛物线的250rpm振荡温育过夜。50μl的过夜培养物用于接种96-深孔板中的0.5ml含有10g/Lβ-丙氨酸的最低矿物质(Delft)培养基。
Delft培养基的组分如下：7.5g(NH4)2SO4、14.4g KH2PO4、0.5gMgSO4·7H2O、22g右旋糖、2mL痕量金属溶液和1mL维生素。将培养基的pH调节至6。每升痕量金属溶液包含：4.5g CaCl2·2H2O、4.5g ZnSO4·7H2O、3g FeSO4·7H2O、1g H3BO3、1g MnCl2·4H2O、0.4g Na2MoO4·2H2O、0.3gCoCl2·6H2O、0.1g CuSO4·5H2O、0.1g KI、15g EDTA。通过将EDTA之外的所有成分溶解在900mL的pH6的超纯水中随后温和加热并添加EDTA来制备痕量金属溶液。最后将痕量金属溶液pH调节至4，将溶液体积调节至1L并高压灭菌(121℃，20min)。痕量金属溶液储存在+4℃。每升维生素溶液包含：50mg生物素、200mg对氨基苯甲酸、1g烟酸、1g泛酸钙、1g盐酸吡哆醇、1g盐酸硫胺素、25g肌醇。将生物素溶解在20mL 0.1M NaOH中并添加900mL水。用HCl将pH调节至6.5并添加其他维生素。就在添加肌醇之前及之后，将pH重新调节至6.5。将维生素溶液的终体积调节至1l并无菌过滤，然后储存在+4℃。
在与上述相同的条件下进行72小时发酵。
在培养结束时测量OD600。将10μl的样品与190μl的水混合并在分光光度计(BioTek)中在600nm波长下测量吸光度。
对培养发酵液进行离心沉降并使用酶试验对上清液的3-羟基丙酸浓度进行分析(表5)。当恶臭假单胞菌β-丙氨酸-丙酮酸转氨酶或丙酮丁醇梭菌γ-氨基丁酸转氨酶与3-羟基丁酸脱氢酶或3-羟基丙酸脱氢酶组合使用时，没有获得3HP的生产。但是，当推定的蜡状芽孢杆菌转氨酶YhxA或酿酒酵母γ-氨基丁酸转氨酶与3-羟基丁酸脱氢酶或3-羟基丙酸脱氢酶(表5：菌株133-147)组合时，观察到由β-丙氨酸的3HP的生产。在测试条件下，最佳的酶组合是表达蜡状芽孢杆菌转氨酶YhxA和大肠杆菌3-羟基丙酸脱氢酶YdfG的菌株147，其中获得2,145±89mg/L 3HP。
如下进行酶试验。将20μl的标准品(Delft培养基中3HP的浓度从0.03至1g/L)和样品添加至96孔平底透明板(Greiner)。使用多通道移液器，将180μl的混合物(14.8ml水、2ml缓冲液(1mM Tris、25mM MgCl2，pH8.8)、1ml NADP+溶液(50mg/ml)和0.2ml PBS缓冲液(1500μg/ml)中的纯化的YdfG酶)添加至每个孔。测量340nm的起始吸光度，密封平板并在30℃孵育1.5小时。此后，再次测量340nm的终吸光度。经背景校正的终值和起始值之间的差异与3HP浓度线性相关。从标准曲线计算样品中3HP的浓度。
通过NMR分析确认最佳样品中的3-羟基丙酸的身份(图2)。通过NMR测量的浓度与通过酶试验发现的值良好相关。
实施例3.在酿酒酵母中克隆天冬氨酸-1-脱羧酶或谷氨酸脱羧酶
编码大肠杆菌天冬氨酸1-脱羧酶(SEQ ID NO50)和谷氨酸棒杆菌天冬氨酸1-脱羧酶(SEQ ID NO52)的基因是由Integrated DNA Technologies合成作为gBLOCKs(针对酵母酿酒酵母进行了密码子优化的版本，对应SEQ ID NO51和SEQ ID NO53)。
编码来自褐家鼠(Rattus norvegicus)谷氨酸脱羧酶(SEQ ID NO58)的基因是由GeneArt(Life Technologies)合成，其是针对酵母酿酒酵母进行了密码子优化的版本(SEQ ID NO59)。
有序的基因构建体具有通用结构：GGTACCAAAACAATGNN…NNTGAGTCGAC(SEQ ID NO67)，其中GGTACC是KpnI限制酶切位点，AAAACA是Kozak序列，ATG是起始密码子，NN…NN表示没有起始密码子和终止密码子的蛋白质编码序列，TGA是终止密码子，GTCGAC是SalI限制酶切位点。
使用如表3中所示的引物和模板通过PCR扩增产生用于USER-克隆的具有基因和正确突出的基因片段。PCR混合物包含：28μl水、10μl高保真度聚合酶缓冲液(5x)、5μl 2mM dNTP、1μl聚合酶、2.5μl浓度为10μM的正向引物、2.5μl浓度为10μM的反向引物，和1μl DNA模板。循环程序是：95℃2min，30个循环的[95℃10sec，50℃20sec，68℃2min]，68℃5min，在10℃暂停。在含有-SAFE(Invitrogen)的1％琼脂糖凝胶上分离基因片段并使用凝胶和PCR清洁试剂盒(PCR Clean-upKit)(Macherey-Nagel)纯化。同样地通过PCR产生启动子片段并随后进行基因纯化(表3)。表达质粒上已存在终止子。
将亲本质粒pESC-Ura-USER、pESC-His-USER和pESC-Leu-USER在37℃用AsiSI(Fermentas)线性化1小时并用Nb.BsmI在37℃处理1小时产生切口。从溶液中纯化所得线性化且带有切口的DNA并且在5mM pH8.0Tris缓冲液中洗脱。
通过USER-克隆使用下述方案制备表达质粒。将1μl的线性化且带有切口的亲本质粒与1μl的启动子片段、2μl的基因片段、0.5μl Taq聚合酶缓冲液、0.5μl USER酶(NEB)混合。将混合物在37℃温育25min，在25℃温育25min并转化至化学感受态大肠杆菌DH5α。通过菌落PCR鉴定具有正确插入序列的克隆，从过夜大肠杆菌培养物分离质粒并通过测序确认。表达质粒列举在表4中。
使用乙酸锂转化方案将表达质粒转化至酿酒酵母细胞。在缺乏尿嘧啶、组氨酸和亮氨酸的合成完全(SC)琼脂培养基上对细胞进行选择。所得菌株列举在表6中。
实施例4.在以L-天冬氨酸培养的酿酒酵母中生产3-羟基丙酸
在SC ura-his-leu-琼脂平板上划线纯化至少四个独立的酵母转化子。将来自独立的转化子的四个单克隆接种在具有透气盖子的96-深孔微量滴定板中(EnzyScreen)的0.5ml SC ura-his-leu-中。使滴定板在30℃以5cm轨道抛物线的250rpm振荡温育过夜。将50μl的过夜培养物用于接种96-深孔板中的0.5ml含有10g/L L-天冬氨酸的Delft培养基。在如上相同的条件下进行72小时发酵。
对培养发酵液进行离心沉降并如实施例2中所描述的那样，使用酶试验对上清液的3-羟基丙酸浓度进行分析(表6)。
仅仅当来自谷氨酸棒杆菌的天冬氨酸1-脱羧酶与将β-丙氨酸转化成3HP的酶组合而进行表达时(推定的蜡状芽孢杆菌氨基转移酶YhxA和大肠杆菌3-羟基丙酸脱氢酶YdfG或勤奋生金球菌3-羟基丙酸脱氢酶)，观察到由L-天冬氨酸的3HP生产。最佳的组合是来自谷氨酸棒杆菌的天冬氨酸1-脱羧酶、推定的蜡状芽孢杆菌氨基转移酶YhxA和大肠杆菌3-羟基丙酸脱氢酶YdfG，其产生269±53mg/L 3HP。
在本说明书中，除非另外明确指出，词语“或”用于指当规定的条件之一或二者都被满足时操作获得真值，这与“排他性或”操作相反，“排他性或”需要仅仅一个条件被满足。词语“包括”用于指“包含”而不是意思是“由……组成”。上面认可的所有现有教导通过引用并入本文。在本文之前公开的任何现有技术文件的认识不应解释为承认或表示在这些现有技术文件公开时其教导在澳大利亚或其他地方为公知常识。
实施例5.来自红色面粉甲虫的天冬氨酸-1-脱羧酶在酿酒酵母中的表达和由葡萄糖生产3HP
编码赤拟谷盗天冬氨酸1-脱羧酶TcPanD(SEQ ID 68)的基因是由GeneArt(LifeTech Sciences)合成，为针对酿酒酵母进行了密码子优化的版本(SEQ ID 69)。
使用引物TcPanD_U1_fw和Tc_PanD_rv(表3)，如实施例1所述使用PCR扩增TcPanD基因以便产生USER-克隆兼容性突出。所得克隆DNA片段TcPanD<-随着TEF1启动子一起被克隆入表达质粒pESC-HIS-USER，产生质粒pESC-HIS-TcPanD(表4)。通过测序确认TcPanD基因和启动子的正确插入。
使用乙酸锂转化方案将质粒转化至酿酒酵母菌株；所得菌株显示在表7中。
将至少三个独立的酵母转化子接种在具有透气盖子的96-深孔微量滴定板中(EnzyScreen)的0.5ml SC ura-his-leu-中。使滴定板在30℃以5cm轨道抛物线的250rpm振荡温育过夜。将50μl的过夜培养物用于接种96-深孔板中用于酿酒酵母(M2P Labs，德国)的0.5ml最低矿物质(Delft)培养基或0.5ml即时进料培养基(FIT)。
以与接种体制备相同的条件进行72小时发酵。对培养发酵液进行离心沉降并使用HPLC对上清液的3-羟基丙酸浓度进行分析(表7)。
在具有Aminex HPX-87H柱(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)的DionexUltiMate 3000系统(Thermo Fisher Scientific)中，在60℃操作，进行HPLC分析。注射体积是20μl。流动相是1mM H2SO4，流速为0.6ml/min。在DAD-3000DiodeArray检测器(Dionex)上使用210nm的读数来检测3HP。使用购买自TCI的3-羟基丙酸制作校准曲线。另外通过与标准品的图谱进行比较来确认3-羟基丙酸的身份。
来自赤拟谷盗的天冬氨酸1-脱羧酶比来自谷氨酸棒杆菌的天冬氨酸1-脱羧酶在Delft中生产几乎3倍更高的3HP滴度，在FIT培养基中生产2倍更高的3HP滴度。因此我们确认了，如果对能够从β-丙氨酸生产3HP的菌株补充来自谷氨酸棒杆菌或最好来自赤拟谷盗的天冬氨酸1-脱羧酶酶，则其可直接由葡萄糖生产3HP。
实施例6.通过前体的过表达来改善3HP生产
一旦在酵母中建立由葡萄糖经β-丙氨酸的3HP的生物合成，接下来的目标就是改善生物合成的基因的表达和增加朝着L-天冬氨酸的流量。因为这需要同时稳定地过表达数个基因，我们使用酵母的EasyClone综合载体。我们测试了过表达天然细胞质天冬氨酸转氨酶Aat2p、丙酮酸羧化酶Pyc1p和Pyc2p及其组合的作用。我们也研究了使得从天冬氨酸生产3HP的关键生物合成基因的多重染色体整合的作用。
使用如表3的引物和如实施例1中的PCR条件，从酿酒酵母CEN.PK113-7D的gDNA扩增编码天冬氨酸转氨酶AAT2和丙酮酸羧化酶PYC1和PYC2的基因。如实施例1所述地对所得DNA片段进行纯化并克隆至EasyClone表达载体(见表4)。
如下构建菌株ST724(PYC1^,PYC2^,ura-his-)：用质粒pXI-1-LoxP-KlLEU2-PYC1<-PTEF1-PPGK1->PYC2转化酿酒酵母CEN.PK102-5B(ura-his-leu-)，在缺乏亮氨酸的SC缺陷培养基上选择转化子并通过对转化子的基因组DNA的PCR来确认质粒的正确整合。菌株ST724用于通过使用LoxP-Cre介导的重组来去环去除KlLEU2选择性标记从而制备菌株ST738(PYC1^,PYC2^,ura-his-leu-)。
根据表8，用表达质粒转化酵母菌株并在缺乏尿嘧啶、组氨酸和亮氨酸的SC缺陷培养基上对转化子进行选择。
培养菌株并如实施例5中所述那样分析3HP浓度。结果显示在图3中。
增加BcBAPAT/EcYdfG或TcPanD的拷贝数使得所有四个测试背景菌株的3HP滴度改善(参考过表达AAT2、过表达PYC1&PYC2和过表达AAT2&PYC1&PYC2)。多重整合TcPanD的作用大于多拷贝BcBAPAT/EcYdfG的作用。
增加的前体供应(通过过表达PYC1/PYC2和/或AAT2)对具有TcPanD或BcBAPAT/EcYdfG基因的多个拷贝的菌株中的3HP生产具有积极作用，但是对仅具有后一基因的单个拷贝的菌株没有积极作用。仅仅在模拟补料分批条件的即时进料培养基中观察到过表达丙酮酸羧化酶基因的积极作用。在矿物质和即时进料培养基中对于菌株SCE-R2-200(AAT2↑PYC1↑PYC2↑BcBAPAT↑EcYdfG↑TcPanD↑↑)获得的最高滴度分别是：1.27±0.28g/L和8.51±1.05g/L。
实施例7.利用酵母在pH5的补料分批培养中生产3HP
将上述菌株SCE-R2-200的最佳分离物在pH5限制葡萄糖进料的有氧补料分批培养中培养三份。
将SCE-R2-200丙三醇保藏菌(0.3ml)接种在500ml带挡板摇瓶中的150mlDelft培养基中并在30℃以250rpm振荡繁殖约24小时。通过以4,000xg离心2min，将培养物浓缩至50ml并用于接种1L-赛多利斯(Sartorius)反应器中的0.5L培养基。反应器中终培养基每升包含：15g(NH4)2SO4、6g KH2PO4、1gMgSO4·7H2O、4ml痕量金属溶液、2ml维生素溶液、0.4ml消泡剂A(Sigma-Aldrich)和44g右旋糖。右旋糖被单独高压灭菌，维生素溶液被无菌过滤并且在高压灭菌之后添加至培养基。痕量金属和维生素溶液与实施例2中描述的相同。
振荡速度是800rpm，温度为30℃，通风是1L min-1空气，并且通过自动添加2N NaOH使pH保持在5.0。通过声学气体分析仪(型号1311，&)监测排出的气体中的二氧化碳浓度。一旦葡萄糖耗尽，则以5g h-1进料，葡萄糖耗尽通过CO2产生的下降观察并且还通过使用葡萄糖试纸GlucoseMQuantTM(Merck Millipore)检测残留的葡萄糖来确认。每升进料包含：45g(NH4)2SO4、18g KH2PO4、3g MgSO4·7H2O、12ml痕量金属溶液、6ml维生素溶液、0.6ml消泡剂A和176g右旋糖。右旋糖被单独高压灭菌，维生素溶液被无菌过滤并在高压灭菌之后添加至进料。
进料开始24小时之后，进料速度提升至10g h-1并在进料开始48小时之后进一步增加至15g h-1。一天对反应器取样两次，以测量生物质干重和代谢物。对于代谢物分析，立即对样品进行离心沉降并将上清液储存在-20℃直到HPLC分析。如实施例5中所描述地进行葡萄糖、琥珀酸、乙酸酯、3HP、丙三醇、乙醇和丙酮酸的HPLC分析。使用RI-101折射率检测器(Dionex)检测葡萄糖、丙三醇和乙醇。用DAD-3000Diode Array检测器(Dionex)在210nm检测3HP、丙酮酸、琥珀酸和乙酸酯。
该菌株以13.7±0.3g·L-1滴度、14±0％C-mol·C-mol-1葡萄糖产率和0.24±0.0g·L-1·h-1产能生产3-羟基丙酸。在发酵结束时，没有检测到大量的副产物，如乙酸酯、乙醇或丙三醇。结果显示在图4中。
在本说明书中，除非另外明确指出，词语“或”用于指当规定的条件之一或二者都被满足时操作获得真值，这与“排他性或”操作相反，“排他性或”需要仅仅一个条件被满足。词语“包括”用于指“包含”而不是意思是“由……组成”。上面认可的所有现有教导通过引用并入本文。在本文之前公开的任何现有技术文件的认识不应解释为承认或表示在这些现有技术文件公开时其教导是当时在澳大利亚或其他地方的公知常识。这里一起提交的序列表的内容构成本发明说明书的一部分。

Claims (15)

1.一种基因修饰酵母细胞，其包含生产3-HP的活性发酵通路，其中所述细胞包含并表达编码用于产生酶的外源性基因，所述酶与SEQ ID NO：1具有至少80％同一性并催化β-丙氨酸和丙酮酸之间的氨基转移反应以产生丙二酸半醛。
2.根据权利要求1所述的基因修饰酵母细胞，其中所述酶是来自蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)AH1272的转氨酶YhxA。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的基因修饰酵母细胞，其表达3-羟基异丁酸脱氢酶即HIBADH。
4.根据权利要求3所述的基因修饰酵母细胞，其中所述HIBADH来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、恶臭假单胞菌(P.putida)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)或白色念珠菌(Candida albicans)。
5.根据前述权利要求中任一项所述的基因修饰酵母细胞，其表达3-羟基丙酸脱氢酶即3-HPDH。
6.根据权利要求5所述的基因修饰酵母细胞，其中所述3-HPDH来自勤奋生金球菌(Metallosphaera sedula)、头寇岱硫化叶菌(Sulfolobus tokadaii)或大肠杆菌(E.coli)。
7.根据前述权利要求中任一项所述的基因修饰酵母细胞，其表达产生天冬氨酸-1-脱羧酶即EC 4.1.1.11的外源性基因，和/或表达产生谷氨酸脱羧酶即EC 4.1.1.15的外源性基因。
8.根据权利要求7所述的基因修饰酵母细胞，其表达来自谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)的天冬氨酸-1-脱羧酶(SEQ ID NO52)或具有天冬氨酸-1-脱羧酶活性且与SEQ ID NO52至少80％同源的酶。
9.根据权利要求7所述的基因修饰酵母细胞，其表达来自赤拟谷盗(Tribolium castaneum)的天冬氨酸-1-脱羧酶(SEQ ID NO68)或具有天冬氨酸-1-脱羧酶活性且与SEQ ID NO68至少80％同源的酶。
10.根据权利要求7所述的基因修饰酵母细胞，其具有增加的丙酮酸羧化酶和/或天冬氨酸转氨酶活性。
11.根据权利要求10所述的基因修饰酵母细胞，其过表达天然丙酮酸羧化酶PYC1或PYC2和/或天然天冬氨酸转氨酶AAT2。
12.根据前述权利要求中任一项所述的基因修饰酵母细胞，其中酵母是酿酒酵母(S.cerevisiae)。
13.一种生产3HP的方法，其包括培养前述权利要求中任一项所述的酵母细胞，和从培养物回收3HP。
14.根据权利要求13所述的方法，其包括为培养物供应β-丙氨酸和/或L-天冬氨酸。
15.根据权利要求13或权利要求14所述的方法，其中每升培养基生产至少100mg 3HP或从每升所述培养基回收至少100mg 3HP。
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