JP2008517614A - Ｓ−アデノシルメチオニン（ｓａｍ）の生産と分泌の増加を示す遺伝子修飾酵母株 - Google Patents

Abstract

本発明は、Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）を生産する目的で、アデノシン・キナーゼをコードする遺伝子を遺伝子修飾によって不活性化させた、遺伝子修飾酵母株に関する。

Description

発明の詳細な説明

本発明はＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）の生産と分泌の増加を示す遺伝子修飾酵母株、ＳＡＭの生産のためのその使用、及びそれを含む医薬組成物に関する。

Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）（前記の化学式参照）は、全ての生きている生物の中間代謝において必須の化合物である。この代謝産物はメチオニン及びアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）から合成される。ＳＡＭ合成酵素（ＡＴＰ：Ｌ−メチオニンＳ−アデノシルトランスフェラーゼ、ＥＣ ２．５．１．６）によって触媒されるこの合成は、硫黄含有アミノ酸代謝の最終段階であると考えることができる。この反応は、使用したＡＴＰ分子の完全な脱リン酸化（メチオニン＋ＡＴＰ→ＳＡＭ＋ＰＰｉ＋Ｐｉ）を伴っているために、やや例外的であり、従って特別に高いエネルギーの消費を意味している。

ＳＡＭはＡＴＰを伴いながら、間違いなく非常に多くの細胞の反応に関与している分子である。事実、ＳＡＭは、タンパク質、核酸、脂質などのメチル基転移反応におけるメチル基の供与体としてのほぼ普遍的な役割を担っている。また、ＳＡＭはリボソームＲＮＡの塩基の修飾反応ないし転移反応において、あるいはまた、ジフタミドの合成の中の真核生物の伸長因子ＥＦ２に見出されるヒスチジン残基の翻訳後修飾において、カルボキシ−アミノプロピル基の供与体としての、機能を果たしている。また、ＳＡＭは微生物のビオチン生合成においてアミン基供与体としての機能を果たしている。また、ＳＡＭはポリアミン、スペルミン及びスペルミジン合成における前駆物質として利用されており、ここでは、それは最初の脱炭酸の段階後でアミノプロピル基の供与体としての役割を果たしている（Cantoni, 1982, “The biochemistry of S-adnosylmehionine”, Columbia University Press, NY）。この非包括的なＳＡＭの異なる代謝機能に関する記載は、中間代謝においてこの分子が中心的役割を果たしていることを示している。

ヒトの医薬では、Ｓ−アデノシルメチオニンがうつ病の治療に使用されることが示されている（ＳＡＭＹＲ（商標））。また、それは男性の不妊（Piacentino et al. (1991) Minerva Gynecol. 43:191−193）、変形性関節症（Najm et al. (2004) BMC Muscoskeletal Disord. 5: 6−21）及び線維筋痛症（Tavoni et al. (1998) Clin. Exp. Rheumatol. 16:106−107）の治療に関わっている。

現在のところ、市場に出せる価格で、医薬品としての質を備えた十分な収量のＳＡＭを得るための、ＳＡＭ化学合成の可能性はない。産業におけるＳＡＭの製造方法には、酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにより行われる微生物による製造が含まれる。

先行技術に関するいくつかの文献は、遺伝子修飾した酵母株でＳＡＭの生産が高まることを記載している。

すなわち、米国出願特許（the Patent Application US 2002/0192784）は、部分的なＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ酵素と部分的な酵母の酵素からなるメチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素（ＭＴＨＦＲ）をコードするキメラ遺伝子を導入することによる遺伝子修飾された、ＳＡＭの生産が増加したＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ酵母株に関する。

しかしながら、ＳＡＭはこれら酵母株から分泌されることはないようで、そのためにＳＡＭをこれらの株から得るプロセスは、ＳＡＭを酵母細胞から抽出することになるとそれは比較的長くまた高価なプロセスであり、工業生産の観点からはほとんど興味を持たれていない。対照的に、酵母株の培地から精製するのはとりわけ容易である。更に、この文献に記載の酵母株は異種の核酸配列を導入されることで、遺伝子修飾されており、これらの新規核酸配列及びそれによりコードされるタンパク質の作用が、特にヒトにおいて、未知であるため、生物学的な安全性の問題が提起されている。

Shiomi et al.（1995）の文献、Appl. Microbiol. Biotechnol. 42：730−733は、エチオニン耐性遺伝子の追加コピーを導入することで遺伝子修飾された酵母株Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅによるＳＡＭ生産の増加を記載している。

Yu et al.（2003）の文献、Sheng Wu Hua Xue Yu Sheng Wu Wu Li Xue Bao 35：127−132は、Ｓ−アデノシルメチオニン合成酵素２（ＳＡＭ２）をコードする遺伝子の追加コピーを導入することで遺伝子修飾された酵母株Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓによるＳＡＭ生産の増加を記載している。

これら二つの文献では、ＳＡＭは酵母株からは分泌されていないらしく、更に、これらの株によるＳＡＭの生産は、産業上の応用には不十分と思われる。

従って、本発明の課題は、先行技術の酵母株より多量のＳＡＭの生産及び／又は分泌を示す、遺伝子修飾された酵母株を提供することである。

本発明の他の課題は、異種の、すなわち酵母以外の生物種由来の、核酸配列を含まない遺伝子修飾された酵母株を提供することである。

更に、本発明の他の課題は、本発明の遺伝子修飾された酵母株をＳＡＭの工業生産に使用することである。

最後に、本発明の他の課題は、本発明の遺伝子修飾された酵母株を含む医薬品組成物を提供することである。

本発明は、特に、酵母アデノシン・キナーゼをコードするＡＤＯ１遺伝子を不活性化した酵母株は、対応する野生株に比較してＳ−アデノシルメチオニンの生産と分泌が増加するという、本発明者の証明に基づいている。

本発明は、遺伝子修飾によりアデノシン・キナーゼをコードする遺伝子が不活性化された遺伝子修飾された酵母株の、Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）の生産のための使用に関する。

用語「酵母」は、任意の単細胞型の真菌を示すのに用いられる。酵母は、特に、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、及びＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、の属を含む。

また、アデノシン・キナーゼはアデノシン５リン酸基転移酵素とも呼ばれる。

酵母Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいては、アデノシン・キナーゼをコードする遺伝子は、オープン・リーディング・フレームＹＪＲ１０５ｗ（Lecoq et al. (2001) Yeast 18：335−342）に相当し、特に、配列番号１に示されるＡＤＯ１遺伝子である。更に、一例として、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓでは、それは、レファレンスＥＭＢＬ ＣＲ３８２１２４に、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅではそれは、レファレンスＥＭＢＬ ＳＰＣＣ３３８に示される。

従って、特定の実施態様では、本発明はＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）を生産するためにアデノシン・キナーゼをコードするＡＤＯ１遺伝子が遺伝子修飾により不活性化された、遺伝子修飾酵母株の使用に関する。

酵母遺伝子がコードしている産物が前記の酵母において発現されていない時には、その酵母遺伝子は「不活性化されている」と記載される。アデノシン・キナーゼをコードしている遺伝子の場合には、もしアデノシン・キナーゼが発現されてなければ、この遺伝子は不活性化されていると記載される。

当業者であれば、特定の遺伝子を不活性化するための多数の方法を知っており、それを挙げることができる。
問題となる遺伝子のコード配列への点変異の導入、例えば：
フォールス・センス（遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸の変換により不活性化される）を導くヌクレオチドの置換、又はナンセンス（終止コドン）変異；
前記の遺伝子のオープン・リーディング・フレームを障害に導くヌクレオチドの挿入ないし欠失；
不活性化されるべき遺伝子のコード配列内への、例えば、選択遺伝子をコードしているヌクレオチド配列の挿入；
不活性化されるべき遺伝子のコード配列における本質的部分の、例えば、選択遺伝子をコードしているヌクレオチド配列との置換；
ＴＡＴＡボックスのような、特にコンセンサス配列レベルでの、不活性化されるべき遺伝子のプロモータ配列の修飾；
不活性化されるべき遺伝子のメッセンジャーｍＲＮＡに対するアンチ・センスをコードしている配列の、酵母ゲノムへの導入。

選択遺伝子とは、通常抗生物質耐性遺伝子（例えば、ジェネティシン耐性遺伝子）又は、修飾されるべき酵母において、変異及び不活性化されている酵母代謝の一段階をコードする野生型の遺伝子のコピー（例えば、ＵＲＡ３、ＴＲＰ１、ＬＥＵ２、又はＨＩＳ３）、である。

これらの全ての方法を実施するのは当業者にとっては、特に容易であり、不活性化すべき遺伝子配列が既知の場合には、特に容易である。

酵母株のアデノシン・キナーゼをコードする遺伝子を不活性化することにより、前記株によるＳ−アデノシルメチオニンの生産と分泌の増加が、有利にもたらされる。

未だ同定されていない、酵母のアデノシン・キナーゼをコードする遺伝子配列を決定することは、当業者にとっては容易である。同定すべきアデノシン・キナーゼをコードする遺伝子配列の対象となる酵母ゲノムの部分、又は完全な配列決定がなされている場合には、求める遺伝子によりコードされている酵素名、例えばアデノシン・キナーゼ、又はその遺伝子、ＡＤＯ１、の既知配列との相同性により、ソフトウェア、例えばＢＬＡＳＴ（Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389−3402）を用いて、データベースで適切な配列を探索することが可能である。また、代わりの方法としては、既知の遺伝子配列、例えばＡＤＯ１、に由来するプローブを用いて問題の酵母の、ｃＤＮＡあるいはゲノムＤＮＡバンクをスクリーニングすることが可能であり、これは当業者であれば周知のことである；この目的のためには、例えば、Sambrook and Russel (2000) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press、といった参考文献にあたることができる。

本発明の特定の実施態様によれば、酵母のアデノシン・キナーゼをコードする遺伝子配列は変異により遺伝的修飾を受けている。

用語「変異」は、所定のヌクレオチド配列、前記ヌクレオチド配列において一つ又はそれ以上のヌクレオチドの挿入、置換及び／又は抑制を指すために用いられる。

本発明の好適な実施態様に従えば、前記定義の遺伝子修飾された株のアデノシン・キナーゼをコードする遺伝子配列は破壊されている。

遺伝子配列の「破壊」という用語は、コード配列内へのヌクレオチド配列の導入により、前記の遺伝子のコード配列に障害を与えることを指すのに用いられる。一般に、この導入は、挿入された配列によりコード配列の実質的な部分の置換や、全コード配列の置換さえ伴う。この導入される配列は通常、選択遺伝子である。

当業者であれば多数の破壊方法を利用できるが、例えば、Rothstein (1991) Methods Enzymol. 194:281−301; Wach et al. （1994） Yeast 10:1793−1808、又はGuldener et al. (1996) Nucleic Acids Res. 24:2519−254.に記載の方法が挙げられる。

本発明の特定の実施態様によれば、前記定義の遺伝子修飾された株は、
Ｓ−アデノシルメチオニンの高親和性トランスポータをコードする遺伝子、Ｓ−アデノシルメチオニン−ホモシステインメチル基転移酵素をコードする遺伝子、Ｓ−メチルメチオニン−ホモシステインメチル基転移酵素をコードする遺伝子、及びユビキチンリガーゼ複合体ＳＣＦ^{Ｍｅｔ３０}のＭｅｔ３０レセプター・サブユニットをコードする遺伝子を含む群から選択される一つの遺伝子の不活性化；
Ｓ−アデノシルメチオニン合成酵素１をコードする遺伝子、Ｓ−アデノシルメチオニン合成酵素２をコードする遺伝子、低親和性メチオニン透過酵素をコードする遺伝子、高親和性メチオニン透過酵素をコードする遺伝子、超低親和性メチオニン透過酵素をコードする遺伝子、メチオニンの輸送が可能な広域スペクトル透過酵素をコードする遺伝子の群から選択される一つの遺伝子配列の追加コピーの、前記の株ゲノムへの導入；及び、
Ｓ−アデノシルメチオニン合成酵素１をコードする遺伝子、Ｓ−アデノシルメチオニン合成酵素２をコードする遺伝子、低親和性メチオニン透過酵素をコードする遺伝子、高親和性メチオニン透過酵素をコードする遺伝子、超低親和性メチオニン透過酵素をコードする遺伝子、メチオニンの輸送が可能な広域スペクトル透過酵素をコードする遺伝子、を含む群から選択される一つの遺伝子のプロモータ配列の変異；
を含む群から選択される少なくとも他の一つの遺伝子修飾を受ける。

酵母のＳ−アデノシルメチオニン合成酵素１をコードする遺伝子は、特に、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＳＡＭ１遺伝子（Thomas and Surdin−Kerjan (1987) J. Biol. Chem, 262: 16704−16709）で代表される。

酵母のＳ−アデノシルメチオニン合成酵素２をコードしている遺伝子は、特に、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＳＡＭ２遺伝子（Thomas et al.(1998 Mol. Cell. Biol. 8: 5132−5139）により代表される。

Ｓ−アデノシルメチオニンの高親和性トランスポータをコードする遺伝子は、特に、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＳＡＭ３遺伝子（Rouillon et al., J. Biol. Chem. 274: 28096−28105）で代表される。

Ｓ−アデノシルメチオニン−ホモシステインメチル基転移酵素をコードする遺伝子は、特に、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＳＡＭ４遺伝子（Thomas et al. (2000) J. Biol. Chem. 275： 40718−40724）で代表される。

Ｓ−メチルメチオニン−ホモシステインメチル基転移酵素をコードする遺伝子は、特に、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＭＨＴ１遺伝子（Thomas et al. (2000) J. Biol. Chem. 275: 40718−40724）で代表される。

ユビキチンリガーゼ複合体ＳＣＦ^{Ｍｅｔ３０}のＭｅｔ３０レセプター・サブユニットをコードする遺伝子は、特に、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＭＥＴ３０遺伝子（Patton et al. (1998) Genes Dev. 12: 692−705）で代表される。

低親和性メチオニン透過酵素をコードする遺伝子は、特に、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＡＧＰ１遺伝子（Iraqui et al. (1999) Mol. Cell. Biol. 19: 989−1001）で代表される。

高親和性メチオニン透過酵素をコードする遺伝子は、特に、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＭＵＰ１遺伝子（Isnard et al. (1996) J. Mol. Biol. 262:473−484）で代表される。

超低親和性メチオニン透過酵素をコードする遺伝子は特に、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＭＵＰ３遺伝子（Isnard et al. （1996） J. Mol. Biol. 262： 473−484）で代表される。

メチオニンの輸送が可能な広域スペクトル透過酵素をコードする遺伝子は、特に、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＢＡＰ２遺伝子又はＢＡＰ３遺伝子（Regenberg et al. (1999) Curr. Genet. 36: 317−328）で代表される。

本発明の更に特定の実施態様によれば、前記定義の遺伝子修飾された株は、
ＳＡＭ３、ＳＡＭ４、ＭＨＴ１、及びＭＥＴ３０を含む群から選択される一つの遺伝子の不活性化；
ＳＡＭ１、ＳＡＭ２、ＡＧＰ１、ＭＵＰ１、ＭＵＰ３、ＢＡＰ２、及びＢＡＰ３を含む群から選択される一つの遺伝子配列の追加コピーの、前記の株ゲノムへの導入；及び
ＳＡＭ１、ＳＡＭ２、ＡＧＰ１、ＭＵＰ１、ＭＵＰ３、ＢＡＰ２、及びＢＡＰ３を含む群から選択される一つの遺伝子のプロモータ配列の変異；
を含む群から選択される少なくとも他の一つの遺伝子修飾を有する。

酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＳＡＭ１遺伝子配列（配列番号３）及びその翻訳産物、タンパク質Ｓａｍ１ｐ（配列番号４）、はＥＭＢＬデータベースに、識別名は“ＳＣＳＡＭ１”、寄託番号はＪ０３４７７として寄託された。

酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＳＡＭ２遺伝子配列（配列番号５）及びその翻訳産物、タンパク質Ｓａｍ２ｐ（配列番号６）、はＥＭＢＬデータベースに寄託され、識別名は“ＳＣＳＡＭ２ＳＡ”、寄託番号はＭ２３３６８である。

酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＳＡＭ３遺伝子配列（配列番号７）及びその翻訳産物、タンパク質Ｓａｍ３ｐ（配列番号８）、はＥＭＢＬデータベースに寄託され、識別名は“ＳＣＹＰＬ２７４Ｗ”、寄託番号はＺ７３６３０である。

酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＳＡＭ４遺伝子配列（配列番号９）及びその翻訳産物、タンパク質Ｓａｍ４ｐ（配列番号１０）、はＥＭＢＬデータベースに寄託され、識別名は“ＳＣＹＰＬ２７３Ｗ”、寄託番号はＺ７３６２９である。

酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＭＨＴ１遺伝子配列（配列番号１１）及びその翻訳産物、タンパク質Ｍｈｔ１ｐ（配列番号１２）、はＥＭＢＬデータベースに寄託され、識別名は“ＳＣＹＬＬ０６２Ｃ”、寄託番号はＺ７３１６７である。

酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＡＧＰ１遺伝子配列（配列番号１３）及びその翻訳産物、タンパク質Ａｇｐ１ｐ（配列番号１４）、はＯＲＦ ＹＣＬ０２５Ｃ配列に対応し、これはＥＭＢＬデータベースに寄託された配列に含まれ、識別名は“ＳＣＣＨＲＩＩＩ”、寄託番号はＸ５９７２０である。

酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＢＡＰ２遺伝子配列（配列番号１５）及びその翻訳産物、タンパク質Ｂａｐ２ｐ（配列番号１６）、はＥＭＢＬデータベースに寄託され、識別名は“ＳＣＹＢＲ０６８Ｃ”、寄託番号はＺ３５９３７である。

酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＢＡＰ３遺伝子配列（配列番号１７）及びその翻訳産物、タンパク質Ｂａｐ３ｐ（配列番号１８）、はＥＭＢＬデータベースに寄託され、識別名は“ＳＣ９６０９Ｘ”、寄託番号はＺ４９２０９である。

前記の遺伝子配列の他の種の酵母での決定は当業者にとっては容易であり、例えば、前記のアデノシン・キナーゼをコードする遺伝子ように実施することができる。

Ｓ−アデノシルメチオニンの高親和性トランスポータ、Ｓ−アデノシルメチオニン−ホモシステインメチル基転移酵素、Ｓ−メチルメチオニン−ホモシステインメチル基転移酵素、及びユビキチンリガーゼ複合体ＳＣＦ^{Ｍｅｔ３０}のＭｅｔ３０レセプター・サブユニットをコードする遺伝子を酵母株で不活性化することで、前記の株によるＳＡＭの生産及び／又は分泌を、有利に増加させることができる。

更に、Ｓ−アデノシルメチオニン合成酵素１、Ｓ−アデノシルメチオニン合成酵素２、低親和性メチオニン透過酵素、高親和性メチオニン透過酵素、超低親和性メチオニン透過酵素、メチオニン輸送の可能な広域スペクトル透過酵素をコードしている遺伝子の転写の増強を、これら遺伝子のプロモータ配列を修飾するか、あるいは酵母株中でのそのコピー数を増やすとにより達成することで、やはり前記の株によるＳＡＭの生産及び／又は分泌を増加させることができる。

遺伝子配列の追加コピーを前記定義の遺伝子修飾された株のゲノムに導入するときには、このコピーはプラスミドのような自己複製型のベクター、又は人工染色体により運ぶこともできるし、又は遺伝子修飾された前記の株の１つ又はそれ以上の染色体に直接挿入することもできる。

本発明の特定の実施態様においては、前記定義の遺伝子修飾された株は、メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素をコードする修飾された遺伝子コピーを保持しており（MET13 for Saccharomyces cerevisiae, Raymond et al. (1999) Arch. Biochem. Biophys. 372: 300−308）、対応する酵素はもはやＳＡＭによる阻害を受けない。

本発明の他の特定の実施態様においては、前記定義の遺伝子修飾された株の少なくとも一つの遺伝子の配列は、Ｓ−アデノシルメチオニンの高親和性トランスポータをコードする遺伝子、Ｓ−アデノシルメチオニン−ホモシステインメチル基転移酵素をコードする遺伝子、Ｓ−メチルメチオニン−ホモシステインメチル基転移酵素をコードする遺伝子、及びユビキチンリガーゼ複合体ＳＣＦ^{Ｍｅｔ３０}のＭｅｔ３０レセプター・サブユニット、をコードする遺伝子を含む群から選択され、それは破壊された。

本発明の他の特定の実施態様においては、Ｓ−アデノシルメチオニン合成酵素１をコードする遺伝子、Ｓ−アデノシルメチオニン合成酵素２をコードする遺伝子、低親和性メチオニン透過酵素をコードする遺伝子、高親和性メチオニン透過酵素をコードする遺伝子、超低親和性メチオニン透過酵素をコードする遺伝子、メチオニンの輸送が可能な広域スペクトル透過酵素をコードする遺伝子の群から選択された、前記定義の遺伝子修飾された株の少なくとも一つの遺伝子の少なくとも一つのプロモータ配列は、酵母の強力なプロモータ配列と置換された。

「強力なプロモータ」という表現は、その制御下にある遺伝子、すなわち、一般にプロモータ配列のすぐ下流に位置する遺伝子に、平均的転写レベルに比較してより高い酵母遺伝子の転写レベルを賦与するようなプロモータを指す。酵母の強力なプロモータは、特に、Velculescu et al. (1997) Cell 88： 243−251に記載されている。

これらは、特に、ＰＧＫ１、ＡＤＨ１、ＴＤＨ３、ＴＥＦ１、ＰＨＯ５、ＬＥＵ２、及びＧＡＬ１遺伝子の天然のプロモータである。

本明細書で用いられた後述の酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＧＡＬ１遺伝子のプロモータ配列は、特に、Johnston and Davis (1984) Mol. Cell. Biol. 4: 1440−1448.、に記載の配列に対応する。

本明細書で用いられた後述の酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＴＥＦ１遺伝子のプロモータ配列は、特に、Schaaff−Gerstenschlager et al. (1993) Eur. J. Biochem. 217: 487−492、に記載の配列に対応する。

本明細書で用いられた後述の酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＰＧＫ１遺伝子のプロモータ配列は、特に、Bonneau et al. (1991) Yeast 87: 609− 615、に記載の配列に対応する。

本明細書で用いられた後述の酵母Sａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＰＨＯ５遺伝子のプロモータ配列は、特に、Feldmann et al. (1994) EMBO J. 13： 5795−5809、に記載の配列に対応する。

好都合なことに、強力なプロモータを使用することによりその制御下におかれた遺伝子の転写レベルを増加させ、ひいては対応するタンパク質の翻訳レベルを高めることが可能で、その結果ＳＡＭの合成の増加を誘導する。

本発明の好適な実施態様においては、ユビキチンリガーゼ複合体ＳＣＦ^{Ｍｅｔ３０}のＭｅｔ３０レセプター・サブユニット、Ｓ−メチルメチオニン−ホモシステインメチル基転移酵素、アデノシン・キナーゼ、及びＳ−アデノシルメチオニン−ホモシステインメチル基転移酵素をコードする、前記定義の遺伝子修飾された株の遺伝子が、特に、前記の遺伝子の配列を破壊することで、不活性化されている。

本発明の他の好適な実施態様においては、Ｓ−アデノシルメチオニン合成酵素２をコードし、強力プロモータを連結した遺伝子配列の追加コピーが、前記定義の遺伝子修飾された株のゲノムに導入されている。

本発明の他の好適な実施態様においては、前記定義の遺伝子修飾された株の低親和性メチオニン透過酵素をコードする遺伝子のプロモータ配列が、強力プロモータ配列と置換されている。

本発明の他の好適な実施態様においては、前記の株のＳ−アデノシルメチオニンの高親和性トランスポータをコードする遺伝子及びＳ−アデノシルメチオニン−ホモシステインメチル基転移酵素をコードする遺伝子が、強力プロモータと連結したＳ−アデノシルメチオニン合成酵素２をコードする遺伝子コピーが前記の遺伝子配列と置換することで、不活性化されている。

本発明の有利な実施態様においては、前記定義の強力プロモータは、前記定義の遺伝子修飾された株の、ＰＧＫ１、ＡＤＨ１、ＴＤＨ３、ＴＥＦ１、ＰＨＯ５、ＬＥＵ２、ＧＡＬ１遺伝子の天然型プロモータを含む群から選択される。

他の特に好適な実施態様においては、前記定義の遺伝子修飾された株はアデニンに対する原栄養菌株である。

「アデニンに対する原栄養菌株」という表現は、前記定義の菌株がその生育のために外からアデニンの供給を必要としないということを意味し、またその生存及び／又は成長に必要なアデニンの生産を自分で確保できるということを意味する。このことは、アデニン合成経路に関与する遺伝子が機能していることを示す。特に、前記定義の株では、野生型、すなわち、変異していないホスホリボシルアミノイミダゾール・カルボキシラーゼ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＡＤＥ２）をコードする遺伝子の対立遺伝子を有している。

本発明の他の特定の実施態様においては、前記定義の遺伝子修飾された酵母株は半数体である。

本発明の選択的な実施態様においては、前記定義の遺伝子修飾された酵母株は二倍体である。

本発明の他の特定の実施態様によれば、本発明による遺伝子修飾を受ける酵母株は、遺伝子修飾が染色体でなされる場合には、前記の遺伝子修飾は二つの相同染色体のそれぞれで実施されることを特徴とする。

本発明の好適な実施態様においては、本発明の遺伝子修飾された酵母株は異種のヌクレオチド配列を含まない。

用語「異種」は、対象と考えているのと同種の酵母に属する自然状態の酵母細胞には見出されないようなヌクレオチド配列を示す。

本発明の他の好適な実施態様においては、本発明の遺伝子修飾された酵母株は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、及びＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属の酵母を含む群から選択され、特に、前記の株はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ種の酵母から選択される。

本発明の特定の実施態様においては、株はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ種に属し、前記の株のユビキチンリガーゼ複合体ＳＣＦ^{Ｍｅｔ３０}のＭｅｔ３０レセプター・サブユニットをコードする遺伝子（ＭＥＴ３０）の不活性化は、特にＭＥＴ３０ 遺伝子配列の破壊により行こなわれ、次いで、前記の株のＭＥＴ４遺伝子及び／又は前記の株のＭＥＴ３２遺伝子の不活性化もまた、特に対応する遺伝子配列の破壊により実施される。

ＭＥＴ４遺伝子は、酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの硫黄含有アミノ酸代謝の主要な転写活性因子をコードする（Thomas et al. (1992) Mol. Cell. Biol. 12: 1719−1727）。

ＭＥＴ３２遺伝子は、酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの硫黄含有アミノ酸代謝の制御に関わる転写因子をコードする（Blaiseau et al. (1997) Mol. Cell. Biol. 17: 3640−3648）。

野生酵母株においてはＭＥＴ３０遺伝子の不活性化はそれがなされる株にとり致死的である。あらかじめＭＥＴ４及び／又はＭＥＴ３２の不活性化により、ＭＥＴ３０の不活性化による致死効果を、有利に除くことが可能である（Patton et al. (2000) EMBO J. 19: 1613−1624）。

酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＭＥＴ４遺伝子配列（配列番号１９）及びその翻訳産物、タンパク質Ｍｅｔ４ｐ（配列番号２０）は、ＥＭＢＬデータベースに寄託され、識別名は“ＳＣＭＥＴＢＬＺＰ”、寄託番号はＭ８４４５５である。

酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＭＥＴ３２遺伝子配列（配列番号２１）及びその翻訳産物、タンパク質Ｍｅｔ３２ｐ（配列番号２２）は、ＥＭＢＬデータベースに寄託され、識別名は“ＡＹ５５７７２９”、寄託番号はＡＹ５５７７２９である。

また、本発明は、対応する非修飾酵母株に比べてＳ−アデノシルメチオニンの産生及び分泌の増加を示す遺伝子修飾された酵母株、すなわち前記定義の前記の遺伝子修飾された株に関する。

また、本発明は、
前記定義の遺伝子修飾された酵母株の培地における培養；
培地上清及び／あるいは遺伝子修飾された酵母細胞より得られたＳ−アデノシルメチオニンの精製、
の段階を含むことを特徴とする、Ｓ−アデノメチオニンの製造方法に関する。

本発明の遺伝子修飾された酵母株は大量のＳＡＭを培地に分泌し、そのことにより、細胞壁が特に障害となる酵母からの抽出を必要としないで、この生産物の回収が、有利に可能になる。

前記定義の方法に関する特定の実施態様によれば、培養はケモスタットを用いてなされる。

有利なことに、ケモスタットにより酵母の連続培養が可能になる。事実、用語「ケモスタット」は、特に、バイオリアクターを指すのに用いられ、培地を回収している間、培養の物理化学的パラメータを基本的に一定に保つことを目的とし、栄養培地の供給及び酵母を含む培地の分離を連続的に行う。

また、本発明は、医薬品として許容される賦形剤と共に前記定義の酵母株を活性成分として、少なくとも一つ含むことを特徴とする医薬組成物に関する。

酵母はヒトの腸に容易に存在できることが知られており、本発明による酵母株細胞を、場合により凍結乾燥して、摂取することにより、酵母の腸への定着期間におおよそ相当する、比較的長い期間にわたり十分な量のＳＡＭを必要とする個人に供給することが可能になる。

また、本発明は、Ｓ−アデノシルメチオニンの供給増加を必要とするうつ病、関節炎、線維筋痛症又は男性不妊の治療を目的とした薬剤の調製のための、前記定義の遺伝子修飾された酵母株の使用に関する。

また、本発明は、Ｓ−アデノシルメチオニンで強化した食物又は飲物の調製のための、前記定義の遺伝子修飾された酵母株の使用に関する。

本発明の遺伝子修飾された酵母株を特定の食物又は飲物（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの場合にはパンあるいはビールなど）に使用することで、これらのものをＳＡＭで自然に強化することができる。

また、本発明は、前記定義の遺伝子修飾された酵母株少なくとも一つを含むことを特徴とするヒト又は動物での消費用の食物調製品又は飲物に関する。

Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＭＨＴ遺伝子のクローニングの段階を示す図である。 ＰＧＫ１遺伝子の強力プロモータの制御下にあるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＳＡＭ２遺伝子のクローニングを示す図である。 ＰＧＫ１遺伝子のプロモータの制御下にあるＳＡＭ２遺伝子コピーとの置換による、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＳＡＭ３及びＳＡＭ４遺伝子の破壊の段階を示す図である。 ＰＧＫ１遺伝子の強力プロモータの制御下にあるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＡＧＰ１遺伝子のクローニングを示す図である。

《方法と材料》
［使用用語］
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａの遺伝子を示すために用いられる本研究での使用用語は、当業者にとっては周知の標準の用語である：それぞれの遺伝子は三つのイタリックの文字と続く番号で、例えば、ＡＤＯ１、のように示される。優勢対立遺伝子（この場合は、野生型対立遺伝子）はイタリックの大文字で表示され、一方小文字は劣勢対立遺伝子を表示するのに用いられる（この場合は、変異対立遺伝子）。シンボルａｄｏ１：：ＵＲＡ３は、遺伝子ＵＲＡ３がＡＤＯ１遺伝子座に挿入されていることを表示し、ここではＵＲＡ３が機能を有し、ａｄｏ１は障害されている。特定の遺伝子によりコードされているタンパク質は、最初の文字は大文字で、他の文字は小文字で、最後に「ｐ」がつく形の遺伝子で表示され、例えばＡＤＯ遺伝子産物については、Ａｄｏ１ｐ、のように表示される。

［使用株］
今後記載される研究は半数体の、幾種類かのアミノ酸あるいは塩基に対して栄養要求性の株Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを用いて行われた。これらの株は次の株と同系である：
−Cherest et al. (2000) J. Biol. Chem. 275: 14056−14063、に記載のCC788−2B（MATa、his3 leu2、ura3、trp1）、及び
−Cherest et al. (2000) J. Biol. Chem. 275: 14056−14063、に記載のCC788−2D（MATα、his3、leu2、ura3、trp1）。
これら二つの株はそれ自身、Bailis A. M. et al., 1990, Genetics 126, 535-547に記載の酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのレファレンス株Ｗ３０３のＡＤＥ２＋派生株（アデニンについて原栄養株）である。株Ｗ３０３は、番号ＡＴＣＣ２０１２３９として、ＡＴＣＣに寄託されている。

［使用遺伝子操作方法］
株間交配及び子嚢解離は、Sherman et al., 1979, “Methods in Yest Genetics: a Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor, N.Y.に記載の方法を用いた。
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの遺伝子操作用の標準プロトコルが使用され、酵母の形質転換はGietz et al., 1992, Nucleic Acids Res. 20, 1425.の方法により実施された。遺伝子置換はＲｏｔｈｓｔｅｉｎ（Rothstein, 1991, Methods Enzymol. 194, 281−301）に記載の方法によって実施された。挿入の正しさは、それぞれの場合に、「サザンブロッティング」又はポリメラーゼ連鎖増幅（ＰＣＲ）により証明された。
遺伝子操作における戦略は、Ｅ．Ｃｏｌｉ ＤＮＡ断片が酵母ゲノムに残存しないように策定された。従って、得られた株はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＤＮＡ配列のみを含む。

［高圧クロマトグラフィーによるＳＡＭの蓄積と分泌の測定］
高圧クロマトグラフィーによる培養上清あるいは細胞抽出物のＳＡＭの濃度測定は、Wise et al., 1997, J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl., 696.145−152の方法に基づき、Wａｔｅｒｓ Ｓｐｈｅｒｉｓｏｂ ＯＤＳ２樹脂上で、既知の濃度のＳＡＭ標準品を用いて実施された。

《微生物学的手法によるＳＡＭ分泌の測定》
この測定のために、「栄養共生」によるＳＡＭの迅速測定方法が開発された。この方法はテスト株を用いるが、これはＭＡＴａ、ｈｉｓ３、ｌｅｕ２、ｕｒａ３、ａｄｅ２、ｔｒｐ、ｓａｍ１：：ＬＥＵ２、ｓａｍ２：：ＨＩＳ３の遺伝子型を有するＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの特定株であり、ＳＡＭ合成酵素をコードする二つのＳＡＭ１及びＳＡＭ２の遺伝子が破壊され、そのためにその成長には外部からのＳＡＭの供給が必須である。ＳＡＭの分泌を測定するために、テストにかける株の培養上清濃度を段階的に増やしながら加えた培地で、この株を培養する。従って、このようにして得られる培養収量は培養上清に存在するＳＡＭの量に比例することになる。各実験でＳＡＭを用いた検量線を作成する。テストにかける株は５ｍＬの完全ＹＰＤ培地で２４時間培養する（Kuras et al. 2002, 2002, Mol. Cell 10, 69−80）。遠心分離後、すべての細胞は５ｍＬの産生培地に移し、攪拌しながら２４時間、３０℃でインキュベートした。培養上清は遠心分離で細胞を除き、その後で０．４５ミクロンのフィルターを通して回収し、それからこの培養上清の一定分量をテスト株の培養に加える。

《実施例１：不活性化によりＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）の産生と分泌の増量をもたらす酵母株の取得を可能にさせる遺伝子の同定：ＡＤＯ１遺伝子の破壊》
高い濃度の有機硫黄含有化合物、特にＳＡＭ、を合成できる新規株の特徴を明らかにするために、本発明者は培地に大量のＳＡＭあるいはその前駆物質の一つであるメチオニンないしシステインが存在することでその増殖が著しく変化を受けると思われる酵母株を研究した。野生型で半数体の株Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｗ３０３−１Ａ）をエチルメタンスルホン酸で突然変異を起こさせ、高濃度の有機硫黄含有化合物では増殖阻害を示すが、これと同じ化合物でも低濃度ではまだ成長可能なコロニーを研究した。
この研究により、暫定的にｃｙｓ５−１及びｃｙｓ６−１と命名された、二つの遺伝的に独立した点突然変異の性質を、特に明らかにすることができた。これらの各変異の存在はこれらの細胞が５ｍＭのＬ−システインを含む最少培地で培養されるときに、増殖停止現象を示す。対照的に、ｃｙｓ５−１及びｃｙｓ６−１の変異株は硫黄源としての０．２ｍＭのＬ−システイン存在下で増殖できる。従って、後者の表現型により、ｃｙｓ５−１及びｃｙｓ６−１の変異が、今のところシステイン存在下で増殖停止が誘導されることが知られているただ二つの変異であるｓｔｒ１及びｓｔｒ４（それぞれ、ｃｙｓ１及びｃｙｓ４とも命名されている）の変異とは異なることが示される（Cherest and Surdin−Kerjan, 1992, Genetics 130、51−58）。
これら変異の分子的な性質を理解するために、これら変異に対応する遺伝子は機能的相補性を利用してクローニングした。シャトル・ベクターｐＥＭＢＬＹｅ２３（Baldari and Cesarini, 1985, Gene 35, 27−32）にクローニングされた野生型株Ｘ２１８０−１ＡＡのＤＮＡのＨｉｎｄＩＩＩで部分消化断片より構成されるゲノム・ライブラリーが採用され、ｃｙｓ５−１及びｃｙｓ６−１の変異株の５ｍＭシステイン存在下での増殖を回復させることのできるプラスミドを調べるために用いられた。これらの研究により、酵母の第Ｖ染色体の右腕に位置し、ｃｙｓ５−１株の増殖欠陥を相補できるオープン・リーディング・フレームＹＥＲ０４３ｗを含むＤＮＡ断片と、酵母の第Ｘ染色体の右腕に位置し、ｃｙｓ６−１株の増殖欠陥を相補できるオープン・リーディング・フレームＹＪＲ１０５ｗを含むＤＮＡ断片を、包含するプラスミドを単離することができた。ＣＹＳ５及びＣＹＳ６遺伝子がＹＥＲ０４３ｗ及びＹＪＲ１０５ｗのオープン・フレームとそれぞれ同一性を有することを確認するために、その遺伝子座への組込み技術が使用され、これらの指名の正しさが確認された。
これらの二つのオープン・フレームより推定されたペプチド配列の分析は次の結果を示した：
ｉ）ＣＹＳ５遺伝子（ＹＥＲ０４３ｗ）はＳ−アデノシルホモシステイン（ＳＡＨ）加水分解酵素を特定する、ＳＡＨ１と命名されている遺伝子に対応する。二倍体株Ｗ３０３におけるこの遺伝子の不活性化及び得られた二倍体（ｓａｈ１：：ＵＲＡ３／ＳＡＨ１）の胞子形成に由来する胞子の分析は、四分子のうち二つの胞子のみが生存可能であり、すべての生存胞子はウラシルについて栄養要求性であることを示したが、このことはＳＡＨ１遺伝子の不活性化は半数体Ｗ３０３遺伝子の場合には致死的であることを意味している。
ｉｉ）ＣＹＳ６遺伝子（ＹＪＲ１０５ｗ）はＡＤＯ１遺伝子と同等であり、アデノシン・キナーゼ（Lecoq et al., 2001, 酵母 18, 335−342）をコードしている。ＡＤＯ１遺伝子は二倍体Ｗ３０３では不活性化しており、得られた二倍体（ａｄｏ１：：ＵＲＡ３／ＡＤＯ１）の胞子形成に由来する胞子の分析は、調べた４０胞子の半数のみが５ｍＭのＬ−システインを含む最少培地で生存可能であった。５ｍＭのシステイン存在下で増殖できないすべての胞子はウラシルについて原栄養菌種であり、従って、不活化したＡＤＯ１対立遺伝子を有する胞子に対応する。これらの実験はＡＤＯ１遺伝子を破壊することで、最初に単離されたｃｙｓ６−１変異を有する細胞と同じ表現型がもたらされることを示した。

ＡＤＯ１遺伝子は、ＡＤＯ１遺伝子に変異を有する株の機能的相補性によりクローニングされた。使用されたバンクは、Ｘ２１８０−１Ａ株より単離された染色体ＤＮＡのＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素による部分消化産物をプラスミドｐＥＭＢＬＹｅ２３のＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入することで構築された（Baldari and Cesarini, 1985, Gene 35, 27−32）。機能的相補性によりこのようにして単離されたプラスミドは、オープン・リーディング・フレームの最初の１７６塩基対を欠いたＡＤＯ１遺伝子を含む１６９０ｂｐ断片を有していた。このＡＤＯ１領域を有するプラスミドは制限酵素ＥｃｏＲＩにより消化され、自動的にライゲーションされ、結果としてプラスミドｐＥＭＢＬＹｅ２３から２ミクロンの断片が除かれ（Baldari and Cesarini, 1985, Gene 35, 27−32）、酵母で複製不可能なプラスミドがもたらされた。次いで、オープン・リーディング・フレーム内のＡｓｐ７１８−Ａｓｐ７１８（４６０ｂｐ）断片は、ＵＲＡ３選択遺伝子と置換された。これによりＡｄｏ１ｐの１１８から２７１のコドンに限定される部分が削除された。このようにして得られたプラスミドのＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片によるＣＣ５７２二倍体株（Ｗ３０３−１ＡｘＷ３０３−１Ｂ交配に由来）の形質転換及びウラシル原栄養形質転換体の選択により、一段階破壊方法によるＡＤＯ１遺伝子の染色体コピーの一つを置換がもたらされる（Rothstein, 1991, Methods in Enzymology, 194, 281−301）。このようにして得られた、ａｄｏ１：：ＵＲＡ３変異に関して異型接合体である二倍体株（ＣＤ２１５）の子孫の分析により、この破壊は致死的でないことがわかった。破壊はＰＣＲにより証明された。

従って、ｃｙｓ５−１及びｃｙｓ６−１変異に対応する遺伝子のクローニングにより、これらの二つの変異はＳＡＭの異化に関係する２つの酵素に影響し、更に特定すると、ＳＡＭを用いたメチル化反応において放出される産物であるＳＡＨの異化に関与する。従って、ＳＡＨ１あるいはＡＤＯ１遺伝子に影響する変異は、ＳＡＭを主に利用するメチルトランスフェラーゼを阻害するＳＡＨの蓄積をもたらすことで、メチル・サイクルを妥協することになる。これらの変異は結果としてメチオニンからのシステインの、あるいはシステインの合成を行う反応の収率に変化を与えることができる（Thomas and Surdin-Kerjan, 1997, Microbiol. Mol. Biol. Rev. 61, 503-532）。

次いで、ＡＤＯ１遺伝子の不活性化変異を有する株のＳＡＭ分泌能能力を分析した。
従って、それぞれＭＡＴａ、ｈｉｓ３、ｌｅｕ２、ｕｒａ３、ｔｒｐ１、ａｄｏ１：：ＵＲＡ３及びＭＡＴα、ｈｉｓ３、ｌｅｕ２、ｕｒａ３、ｔｒｐ１、ａｄｏ１：：ＵＲＡ３の遺伝子型をもつＣＹ７８−３Ｂ及びＣＹ７８−８Ｂ株を作製するために、前記のようにＣＣ７８８−２Ｂ及びＣＣ７８８−２Ｄ株でＡＤＯ１遺伝子を破壊した。
これらのＡＤＯ１遺伝子が破壊された株は、それぞれの親株に比較して、ＳＡＭを約１０倍以上合成し、約４０倍以上分泌する（表１参照）。

《実施例２：ＳＡＭの異化の減少を示す株の取得：ＳＡＭ４及びＭＨＴ１遺伝子の破壊》
従って、ＡＤＯ１遺伝子を不活性化することでＳＡＭの異化の減少を達成したが、これによりメチル・サイクルの機能が修飾され、このＳＡＭの異化の減少はＳＡＭの過剰生産と分泌の増大を伴った。しかしながら、メチル・サイクルはＳＡＭのリサイクルの唯一の経路ではないことに注目するのは重要である。事実、ＳＡＭのリサイクルは、ＳＡＭをメチル基供与体に用いたホモシステインのメチル化反応を介して起きることが示されている。この二番目のサイクルの存在は、ＳＡＭ−ホモシステインメチル基転移酵素及びＳ−メチルメチオニン−ホモシステインメチル基転移酵素をコードする二つの新しい遺伝子、ＳＡＭ４及びＭＨＴ１、のそれぞれの機能性を明らかにする過程で示された（Thomas et al., 2000, J. Biol.Chem. 275, 40718−40724）。酵素Ｓａｍ４ｐは非常に特異的で、ＳＡＭを唯一のメチル供与体基質として利用しているようであり、酵素Ｍｈｔ１ｐはＳ−メチルメチオニン及びＳＡＭをメチル供与体基質に使用しているが、しかしこの二番目の基質に対するその親和性はＳ−メチルメチオニンに対する親和性より１０倍弱い（Thomas et al., 2000, J. Biol.Chem. 275, 40718−40724）。酵母株によるＳＡＭ生産を増やすために、ＳＡＭ４及びＭＨＴ１遺伝子の不活性化を引き起こす変異を、ＭＡＴａ／α、ｈｉｓ３、ｌｅｕ２、ｕｒａ３、ｔｒｐ１、ａｄｏ１：：ＵＲＡ３の遺伝子型を有する実施例１のＣＹ７８−３Ｂ及びＣＹ７８−８Ｂ株に導入した。

［ＭＨＴ１遺伝子のクローニング及び破壊］
「ギャップ修復」法によりＭＨＴ１遺伝子をクローニングした（Rothstein (1991) Methods Enzymol. 194: 281−301; Mallet and Jacquet (1996) Yest12: 1351−1357; 図1参照）。
ＭＨＴ１遺伝子の５’（Ａ）及び３’（Ｂ）領域に含まれるＤＮＡ断片をＰＣＲにより、Ｃｌａ１及びＥｃｏＲ１（Ａ）あるいはＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ（Ｂ）サイトを有するｄオリゴヌクレオチドを用いて増幅した。
Ｏｌｉ１：ＣＣＡＴＣＧＡＴＧＧＣＡＣＡＧＡＧＣＡＴＡＧＡＴＧＣＧＣＣＧＡＣＣ（配列番号２３）（ＣｌａＩサイトは太字（下線）タイプ）
Ｏｌｉ２：ＧＧＡＡＴＴＣＣＧＡＡＧＧＴＴＴＧＣＴＧＴＡＴＴＣＧＧＡＧＣ（配列番号２４）（ＥｃｏＲＩは太字（下線）タイプ）
Ｏｌｉ３：ＧＧＡＡＴＴＣＣＣＣＣＣＴＴＧＣＴＧＴＧＧＣＡＴＧＣＴＡＧ（配列番号２５）（ＥｃｏＲＩは太字（下線）タイプ）
Ｏｌｉ４：ＣＧＧＧＡＴＣＣＣＧＧＴＡＴＡＧＣＧＡＡＧＧＴＴＧＴＴＧＴＣＣＣ（配列番号２６）（ＢａｍＨＩは太字（下線）タイプ）
増幅により２３２ｂｐ（Ａ）及び３４４ｂｐ（Ｂ）断片を得て、これらはＥｃｏＲＩ及びＣｌａＩ（Ａ）、あるいはＢａｍＨＩ（Ｂ）のいずれかにより消化した。このような消化で得られた断片は、前記の図に示すようにＣｌａＩ及びＢａｍＨＩで消化したプラスミドｐＲＳ３１４と結合した。このようにして得たプラスミドはＥｃｏＲＩにより開環し、Ｗ３０３−１Ａ株の染色体遺伝子の「ギャップ修復」実験に用いた。

ＭＨＴ１遺伝子を破壊するために、プラスミドｐＲＳ３１４−ＭＨＴ１のＮｃｏＩ−ＨｐａＩ断片は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＨＩＳ３選択遺伝子（pRS314：Sikorski and Hieter (1989) Genetics122：19−27；プラスミドpＲＳ３１４の配列はＥＭＢＬデータベース、識別名ＰＲＳ３１４、寄託番号Ｕ０３４４０として寄託されている）を有するＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩ断片と置換された。この結果Ｍｈｔ１ｐのコドン１２８からコドン２３６までが除かれた。次いで、このプラスミドをＣｌａＩ及びＢａｍＨＩで消化し、得られた断片は、ＣＹ２５１−１７Ｄ株（Ｍａｔ−ａ、ｈｉｓ３、ｌｅｕ２、ｕｒａ３、ｔｒｐ１、ｍｅｔ３２：：ＴＲＰ１、ａｄｏ１：：ＵＲＡ３、ｓａｍ４：：ｐｒｏＳＡＭ４−ＳＡＭ２）の形質転換及びヒスチジン原栄養形質転換体の選択による一段階破壊に使用された。この破壊はＯＲＦ ＭＥＴ３２に隣接する相補的プライマー配列を用いたＰＣＲを用いて証明された。

ＳＡＭ４遺伝子のクローニングと不活性化はThomas et al. (2000) J. Biol. Chem. 275: 40718−40724、に記載された方法によった。

従って、得られた三重変異株ＭＡＴａ／α、ｈｉｓ３、ｌｅｕ２、ｕｒａ３、ｔｒｐ１、ａｄｏ１：：ＵＲＡ３、ｍｈｔ１：：ＨＩＳ３、ｓａｍ４：：ＵＲＡ３は、メチル基供与体の利用に関連するＳＡＭ異化については完全に欠損している。表１に見られるとおり、これら三つの変異が同時に存在することにより、酵母細胞により産生、分泌されるＳＡＭの量は著しく増大している。
ＣＹ７８−３Ｂ株（Ｍａｔａ、ｈｉｓ３、ｌｅｕ２、ｕｒａ３、ｔｒｐ１、ａｄｏ１：：ＵＲＡ３）とＣＹ５５−５Ａ株（Ｍａｔα、ｈｉｓ３、ｌｅｕ３、ｕｒａ３、ａｄｅ２、ｔｒｐ１、ｓａｍ４：：ＵＲＡ３、ｍｈｔ１：：ＨＩＳ３）を交配し、得られた二倍体で胞子形成を行い、次いで得られた四分子を、求める遺伝子組換えを有する胞子を選択する目的で分析して、ＣＹ１６８−１４Ａ及びＣＹ１６８−１Ｃ株を取得した。このような交配では、ａｄｏ１：：ＵＲＡ３、ｓａｍ４：：ＵＲＡ３の二重の破壊を有する胞子は、２ＵＲＡ^＋胞子及び２ＵＲＡ⁻胞子を有する四分子（すなわち、３ＵＲＡ^＋、１ＵＲＡ⁻のテトラタイプの四分子に対して、組換えジタイプ）、の中からＵＲＡ＋胞子を特異的に選択することで得られる。

《実施例３：ＳＡＭ合成に作用する負の転写制御が不活性化した株の取得：ＭＥＴ３０遺伝子の破壊》
有機硫黄含有化合物である、メチオニン、システイン及びＳＡＭの合成は特異的な負の制御を受けるが、これは転写レベルで作用し、また細胞内の有機硫黄含有化合物の濃度の上昇により引き金を引かれる。ＳＡＭの合成に必要な、減少した硫黄の流れを増やすことでＳＡＭ合成を顕著に増大させるために、この負の制御を抑制し、この抑制のための遺伝子修飾は、前記のＳＡＭの異化及びＳＡＭの輸送を不活性化させる変異と共に同一株で一緒に実施された。
ユビキチンリガーゼ複合体ＳＣＦ^{Ｍｅｔ３０}のＭｅｔ３０レセプター・サブユニットをコードするＭＥＴ３０遺伝子を不活性化することで、ＳＡＭ生合成の負の制御を修飾することが可能であった（Patton et al., 1998, Genes Dev., 12, 692−705）。この不活性化を実現するためには、まず不活性化したＭＥＴ４遺伝子あるいは不活性化したＭＥＴ３２遺伝子を有する株を使用する必要があった。事実、タンパク質Ｍｅｔ３０ｐは酵母細胞の生存維持に必須な酵素であり、ＭＥＴ３０遺伝子の不活性化は致死的である。しかし、酵母がタンパク質Ｍｅｔ４ｐあるいはタンパク質Ｍｅｔ３２ｐタンパク質のいずれかを同時に発現しなければ、タンパク質Ｍｅｔ３０ｐは酵母にとって必須ではないことが示されている（Patton et al., 2000, The Embo J. 19, 1613−1624）。

［ＭＥＴ３０遺伝子の破壊］
ＭＥＴ３０遺伝子を含むＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩ ＤＮＡ断片は、Thomas et al. (1995) Mol. Cell. Biol. 15 : 6526−6534.、に記載に従いプラスミドｐＵＣ１９でクローニングされた。得られたプラスミドはＥｃｏＲＶで消化され、そして脱リン酸化された。末端がフリーのＵＲＡ３遺伝子を有するＢｇｌＩＩ−ＢｇｌＩＩ断片をＥｃｏＲＶ消化−脱リン酸化処理したプラスミドｐＵＣ１９に結合した結果、ＵＲＡ３遺伝子により破壊されたＭＥＴ３０遺伝子を有するプラスミドが得られた。この結果、Ｍｅｔ３０ｐのコドン２６４から４４８までが除かれた。次いで、二倍体株Ｗ３０３はＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ断片で形質転換され、そしてウラシル原栄養菌種である形質転換体が選択された（一段階破壊、Rothstein, 1991, Methods in Enzymology, 194, 281−301）。このようにして、相同組換えによりＭＥＴ３０遺伝子の染色体コピーの一つをＵＲＡ３遺伝子により妨害することができた。この結果は、ＵＲＡ３遺伝子に対応する放射性標識プローブを用いた「サザンブロッティング」により証明された。このようにして得られた二倍体の子孫（ＣＤ１２６）、これは変異ｍｅｔ３０：：ＵＲＡ３に関しては異型接合体であるが、の解析によりすでに前記で示したように、四分子は二つの生存胞子のみを含んでいた（Thomas et al., 1995, Mol. Cell. Biol., 15, 6526−6534）。その後に、ｍｅｔ３０Δ、ｍｅｔ４Δ、又はｍｅｔ３０Δ、ｍｅｔ３２Δの二つの変異を有する株は生存可能であることが示された（Patton et al., 2000, The Embo J. 19, 1613−1624）。

［ＭＥＴ３２遺伝子の破壊］
ＭＥＴ３２遺伝子を有するＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ ＤＮＡ断片はプラスミドｐＵＣ９でクローニングされた。次いで、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＴＲＰ１遺伝子はＭＥＴ３２遺伝子のオープン・リーディング・フレームに唯一存在するＳｗａＩサイトに挿入された（Blaiseau et al., （1997） Mol. Cell. Biol. 17： 3640−3648）。このようにして修飾されたプラスミドはＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩで消化され、得られた断片（３６８０ｂｐ）は、Ｗ３０３−１Ａ株の形質転換及びウラシル原栄養菌種である形質転換体の選択による、一段階破壊に使用された（Rothstein, 1991, Methods in Enzymolog, 194, 281−301）。(Rothstein 1991, Methods in Enzymology 194, 281-301)破壊は、ポリメラーゼ連鎖増幅（ＰＣＲ）により証明された。

株ＣＹ８２−７Ｃ（目的の遺伝子型；ｍｅｔ３２Δ、ａｄｏ１Δ）、株ＣＹ１１７−３Ａ（目的の遺伝子型；ｍｅｔ３０Δ、ｍｅｔ４Δ、ａｄｏ１Δ）及び株ＣＹ１５４−１７Ａ（目的の遺伝子型；ｍｅｔ３０Δ、ｍｅｔ３２Δ、ａｄｏ１Δ）に関してなされた分析によれば、ＡＤＯ１遺伝子の不活性化と共にＭＥＴ４及びＭＥＴ３０遺伝子の二重不活性化を伴う株は、野生型株に比較しＳＡＭを過剰発現していることが示された。更に、同様の分析により、ＡＤＯ１遺伝子の不活性化と共にＭＥＴ３０及びＭＥＴ３２遺伝子の二重不活性化を伴う細胞は、ＡＤＯ１遺伝子一つのみが不活性された細胞に比較し、より多くのＳＡＭを発現していることが示された（表１参照）。
株ＣＹ８２−７Ｃは、株ＣＣ８６７−１Ｄ（Ｍａｔα、ｈｉｓ３、ｌｅｕ２、ｕｒａ３、ａｄｅ２、ｔｒｐ１、ｍｅｔ３２：：ＴＲＰ１、ｍｅｔ３０：：ＵＲＡ３）及び株ＣＹ７８−３Ｂ（Ｍａｔａ、ｈｉｓ３、ｌｅｕ２、ｕｒａ３、ｔｒｐ１、ａｄｏ１：：ＵＲＡ３）の増殖、及び得られた二倍体の胞子形成、次いで求める遺伝子組換えを有する胞子を選択する目的による得られた四分子の分析、により取得された。
株ＣＹ１５４−１７Ａは、株ＣＣ８６７−１Ｄ（Ｍａｔα、ｈｉｓ３、ｌｅｕ２、ｕｒａ３、ａｄｅ２、ｔｒｐ１、ｍｅｔ３２：：ＴＲＰ１、ｍｅｔ３０：：ＵＲＡ３）及び株ＣＹ８２−７Ｃ（Ｍａｔａ、ｈｉｓ３、ｌｅｕ２、ｕｒａ３、ｔｒｐ１、ａｄｏ１：：ＵＲＡ３、ｍｅｔ３２：：ＴＲＰ１）を増殖させることで得た。
従って、このＭＥＴ３０及びＭＥＴ３２遺伝子の二重不活性化により、この二重変異を持ち、特定の栄養要求性の表現型を示す株を用いることなく、無機硫黄の代謝の負の転写制御の不活性化を引き起こすことが可能になった。このことは、細胞生存維持をするのであればメチオニン栄養要求性の表現型を結果として伴うｍｅｔ４Δ、ｍｅｔ３０Δの二重変異の存在と比較されるべきである。従って、ＭＥＴ３０及びＭＥＴ３２遺伝子を同時に不活性化することは、この株を経済的に有利な培地で増殖させることに適合する。

《実施例４：ＳＡＭ合成酵素活性増加を示す株の取得：ＳＡＭ２遺伝子の過剰発現》
序論で示したように、ＳＡＭの生合成を限定する段階の一つは、この化合物をメチオニン及びＡＴＰから合成するのに必要な反応である。事実、この反応はＡＴＰ分子の全ての脱リン酸を伴うこと点で特別である。酵母では、ＳＡＭ１及びＳＡＭ２遺伝子によりコードされる二つのアイソザイムがこの反応を触媒する。ＳＡＭ合成酵素により触媒される反応の酵素作用機構は二段階機構である。ＳＡＭ及び三リン酸塩を生成するためにＡＴＰ及びメチオニン分子が反応し、次いで二段階目で、三リン酸塩がＰｉ及びＰＰｉに分割される。ＳＡＭ合成を増加させるために、本発明者は、ＰＧＫ１及びＴＥＦ１遺伝子プロモータのような、異なる酵母の強力プロモータにより、ＳＡＭ１及びＳＡＭ２遺伝子を過剰に発現させることを探究した。
ＳＡＭ１及びＳＡＭ２遺伝子の内在性のコピーが、それぞれ融合ｐｒｏＰＧＫ１−ＳＡＭ１及びｐｒｏＰＧＫ１−ＳＡＭ２、又は融合ｐｒｏＴＥＦ１−ＳＡＭ１及びｐｒｏＴＥＦ１−ＳＡＭ２と置換された株が構築された。それぞれに対応する株におけるＳＡＭ生産の分析は、これらの遺伝子置換により、ＳＡＭ生産の僅かにしか増加しないことが示めされた。従って、代わりとなる戦略がとられ、ＳＡＭ２遺伝子の追加のコピーを加えることになり、これは酵母の第ＸＶＩ染色体の、二つのＳＡＭ３及びＳＡＭ４Ａ遺伝子に隣接する位置に挿入された。このような株におけるＳＡＭ生産の解析は、この遺伝子座へのこのようなＳＡＭ２遺伝子の追加コピーの存在がこの酵母細胞によるＳＡＭ生産の有意な増大をもたらすことを示した。

［ｐｒｏＰＧＫ１−ＳＡＭ２融合遺伝子の構築］
ＳＡＭ２遺伝子は、「ギャップ修復」実験によりＰＧＫ１遺伝子プロモータの制御下におかれた。この目的で、プラスミドｐＦＬ６１（Bonneau et al. (1991) Yeast 87: 609−615）が有するＰＧＫ遺伝子プロモータは、２つの二機能性のオリゴヌクレオチドを用いて増幅された。Ｏｌｉ−５’−ＳＡＭ２−ＰＧＫは標的配列に相同のＳＡＭ２遺伝子の５’領域に位置する４２ヌクレオチド（−２２２から−１８１、下の太字（下線）タイプ）、とそれに続くＰＧＫ１遺伝子プロモータに相同の２４ヌクレオチド（−７７１から−７４７）を含む。二番目のオリゴヌクレオチド（Ｏｌｉ−３’−ＳＡＭ２−ＰＧＫ）は翻訳開始のＡＴＧを含むＳＡＭ２遺伝子に相同の４５ヌクレオチド（４４から１、下の太字（下線）のタイプ）とそれに続くＰＧＫ１遺伝子プロモータの３０相同ヌクレオチド（−２から−３１）により構成されている。これらのヌクレオチドは各遺伝子の翻訳開始のＡＴＧのＡより数えられている。

Ｏｌｉ−５’ＳＡＭ２−ＰＧＫ：
ＧＣＴＣＴＴＧＴＡＡＡＣＧＡＣＧＴＣＡＡＡＴＣＴＴＣＡＴＡＴＧＣＡＡＧＧＡＧＡＴＣＴＧＡＴＴＣＣＴＧＡＣＴＴＣＡＡＣＴＣＡＡＧＡＣＧ（配列番号２７）
Ｏｌｉ−３’−ＳＡＭ２−ＰＧＫ：
ＣＣＧＡＣＧＧＡＴＴＣＡＧＡＧＧＴＡＡＡＴＡＡＧＡＡＡＧＴＴＴＴＧＣＴＣＴＴＧＧＡＣＡＴＴＧＴＴＴＴＡＴＡＴＴＴＧＴＴＧＴＡＡＡＡＡＧＴＡＧＡＴＡＡＴ（配列番号２８）

増幅により得られた断片は、プラスミドｐＳＡＭ２−３を用いたＷ３０３−１Ａ株の「ギャップ修復」実験に使用された（Thomas et al., 1988, Mol. Cell. Biol., 8, 5132−5139）。この実験で得られたプラスミドはＰＧＫ１遺伝子プロモータの制御下にあるＳＡＭ２遺伝子を有している（図２Ａ参照）。
得られたプラスミドはＨｉｎｄＩＩＩで消化し、生じた断片は、Ｗ７４４−１Ａ株を形質転換、そしてＳＡＭの原栄養形質転換体の選択による遺伝子一段階破壊実験に用いた（Rothstein, 1991, Methods in Enzymology, 194, 281−301）。破壊はＰＣＲにより証明した。

［ｐｒｏＰＧＫ１−ＳＡＭ２融合遺伝子によるＳＡＭ３及びＳＡＭ４遺伝子の置換］
本発明に記載の方法を実施するうえで好都合な方法においては、酵母細胞が一旦分泌したＳＡＭを再び取込こむことを有意に減らすために、ＳＡＭ４遺伝子を、隣接する高親和性ＳＡＭトランスポータをコードするＳＡＭ３遺伝子と同時に不活性化した。
本発明記載の方法を実施するうえで好都合な他の方法においては、このＳＡＭ３及びＳＡＭ４遺伝子の二重不活性化は、強力構成的プロモータＰＧＫ１の制御下で酵素Ｓａｍ２ｐ（ＳＡＭ合成酵素２）を過剰発現する融合遺伝子をこれら遺伝子座に挿入することで、実施された。このようにして構築した酵母細胞は、このゲノムに施された特異的な修飾の結果による低減したＳＡＭの異化、追加ＳＡＭ２遺伝子による不活性化したＳＡＭの高親和性輸送システム及びＳＡＭ合成酵素活性の発現増加、並びに強力構成的プロモータによる過増殖（一方、天然のＳＡＭ１及びＳＡＭ２遺伝子プロモータは内在性の有機硫黄含有化合物の濃度上昇により負の制御を受ける、Thomas and Surdin−Kerjan, 1997, Microbiol. Mol. Biol. Rev. 61, 503−532）、という利点を備えている。第ＸＶＩ染色体左腕レベルのＳＡＭ３及びＳＡＭ４遺伝子座に挿入されたｐｒｏＰＧＫ１−ＳＡＭ２融合遺伝子（構築はｓａｍ３−ｓａｍ４：：ｐｒｏＰＧＫ１−ＳＡＭ２などの株の遺伝子型に示される）を有する株は、その親株に比較してＳＡＭ生産が増加していることが十分に示された。
前記で得られた、ＰＧＫ１遺伝子プロモータの制御下にあるＳＡＭ２遺伝子を有するプラスミドは、ｐｒｏＰＧＫ−ＳＡＭ２遺伝子を含む断片の増幅のために、二機能性オリゴヌクレオチドと共に用いれらた。オリゴヌクレオチドＳＡＭ３−ＰＧＫは、標的である５’領域のＳＡＭ３遺伝子配列（−８０から−３、下に太字（下線）タイプで示す）に相同の７７ヌクレオチド及びそれに続づくＰＧＫ１遺伝子プロモータ領域（−７７１から−７４８）に相同の２４ヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドＳＡＭ４−ＳＡＭ２は、標的である３’領域のＳＡＭ４遺伝子配列（１０４３から９７４、下に太字（下線）タイプで示す）に相同の７０ヌクレオチド、及びそれに続くＳＡＭ２遺伝子末端（１１５５から１１３４）に相同の２１ヌクレオチドを含む。ヌクレオチドは各遺伝子の翻訳開始のＡＴＧより番号が振られている。

Ｏｌｉ−ＳＡＭ３−ｐｒｏＰＧＫ：
ＴＧＡＴＧＴＴＡＴＧＴＣＧＡＧＡＧＣＴＣＴＧＡＡＡＡＣＣＡＡＴＴＡＴＴＴＴＧＡＡＡＧＣＴＡＡＣＡＴＴＴＣＡＡＡＡＧＧＣＴＡＴＴＴＣＴＴＣＴＧＡＡＡＴＡＴＣＧＡＴＴＣＣＴＧＡＣＴＴＣＡＡＣＴＣＡＡＧＡＣＧ（配列番号２９）
Ｏｌｉ−ＳＡＭ４−ＳＡＭ２：
ＧＴＧＴＡＡＣＡＴＧＣＴＧＣＴＴＴＴＡＧＣＡＴＡＴＡＴＡＴＡＡＴＧＴＴＡＡＧＡＡＴＴＡＴＴＴＡＡＣＴＴＣＴＴＴＡＡＡＡＡＣＧＣＡＴＴＴＡＣＧＴＴＡＡＡＡＴＴＣＣＡＡＴＴＴＣＴＴＴＧＧ（配列番号３０）

増幅により得られた断片は、Ｗ７４４−１Ａ株を形質転換、そしてＳＡＭに関する原栄養形質転換体の選択による、一段階破壊実験に用いた（Rothstein, 1991, Methods in Enzymology, 194, 281−301）（図２Ｂ参照）。
ｐｒｏＰＧＫ−ＳＡＭ２遺伝子によるＳＡＭ３及びＳＡＭ４遺伝子の同時置換はＰＣＲにより証明した。
ＣＹ２７３株は、株ＣＹ２７０−７Ｄ（Ｍａｔａ、ｈｉｓ３、ｌｅｕ２、ｕｒａ３、ｔｒｐ１、ｍｅｔ３２：：ＴＲＰ１、ａｄｏ１：：ＵＲＡ３、ｓａｍ３−ｓａｍ４：：ｐｒｏＰＧＫ１−ＳＡＭ２）及び株ＣＹ２５８−１０Ｄ（Ｍａｔα、ｈｉｓ３、ｌｅｕ２、ｕｒａ３、ｔｒｐ１、ｍｅｔ３２：：ＴＲＰ１、ｍｅｔ３０：：ＵＲＡ３、ａｄｏ１：：ＵＲＡ３、ｓａｍ３−ｓａｍ４：：ｐｒｏＳＡＭ４−ＳＡＭ２、ｍｈｔ１）を交配し、得られた二倍体に胞子を形成させ、次いで、求める遺伝子組換えを有する胞子を選択するするために得られた四分子を分析することで、取得された。

《実施例５：亢進したメチオニン輸送能力を示す株の取得：遺伝子ＡＧＰ１の過剰発現》
本発明により実施される方法の一つは、大量のＳＡＭを生産するために行われる遺伝子修飾された酵母細胞の培養に関する。実施された方法の好適な実施態様においては、酵母細胞の培地は、安価な物質であり、ＳＡＭの直接の前駆物質であるメチオニンを、高い濃度で含む。このような条件下でＳＡＭの生産を増やすために、培地中の細胞の、細胞質へのメチオニン輸送能力を改善した。細胞外の培地に存在するメチオニンを除くために、酵母は、酵素的に特徴の異なる少なくとも三つの輸送システムを有している。これらの輸送システムは、特に、メチオニンに対する親和性、及びこの硫黄含有アミノ酸の輸送能力の点で異なる。これらのシステムは、ＭＵＰ１遺伝子によりコードされる高親和性メチオニン透過酵素、ＡＧＰ１遺伝子（そしておそらくは他の遺伝子）によってコードされる低親和性メチオニン透過酵素、及びＭＵＰ３遺伝子によりコードされる超低親和性メチオニン透過酵素と呼ばれる（Isnard et al., 1996, J. Mol. Biol. 262, 473−484）。これらの異なる遺伝子の発現は、複雑な制御の支配及びを受け、従って、メチオニン輸送能力は増殖条件により幅広く変化する。細胞外の培地からのメチオニン除去を増強し、これが環境変化になるべく依存しないようにするために、低親和性メチオニン透過酵素をコードするＡＧＰ１遺伝子を強力構成的プロモータＰＧＫ１の制御下に置くように酵母株は構築された。ｐｒｏＰＧＫ１−ＡＧＰ１融合遺伝子は、内在性のＡＧＰ１遺伝子コピーと置換するために用いられた。ａｇｐ１：：ｐｒｏＰＧＫ１−ＡＧＰ１変異はｍｅｔ３０Δ、ｍｅｔ３２Δ、ｓａｍ４Δ、ｍｈｔ１Δ、ａｄｏ１Δの変異を示す株の中に導入され、そして対応するＣＹ２０８−７Ｂ株の分析は、ｐｒｏＰＧＫ１−ＡＧＰ１融合遺伝子のＡＧＰ１遺伝子座への導入により産生されるＳＡＭの量が増加することを示している。

［ｐｒｏＰＧＫ１−ＡＧＰ１融合遺伝子によるＡＧＰ１遺伝子の置換］
ＡＧＰ１遺伝子は、「ギャップ修復」実験によりＰＧＫ１遺伝子プロモータの制御下におかれた。この目的のために、プラスミドｐＦＬ６１の有するＰＧＫ１遺伝子プロモータを２つの二機能性オリゴヌクレオチドを用いて増幅した。Ｏｌｉ−５’−ＡＧＰ１−ＰＧＫは、ＡＧＰ１遺伝子（−３８７から−３４２、下の太字（下線）タイプ）の５’領域に位置する標的配列に相補的な４５ヌクレオチド、そして続くＰＧＫ１遺伝子プロモータ（−７７１から−７４７）に相同な２４ヌクレオチドを含む。二番目のオリゴヌクレオチド（Ｏｌｉ−３’−ＡＧＰ１−ＰＧＫ）は、翻訳開始のＡＴＧを含むＡＧＰ１遺伝子に相同な４５ヌクレオチド（４５から１、下の太字（下線）タイプ）と、それに続くＰＧＫ１遺伝子プロモータに相補的な３０ヌクレオチド（−１から−３０）により構成されている。ヌクレオチドはそれぞれの遺伝子の翻訳開始のＡＴＧｓのＡより数えられた。

Ｏｌｉ−５’−ＡＧＰ１−ＰＧＫ：
ＣＡＣＧＴＣＣＡＧＣＧＧＡＴＴＧＣＴＧＣＴＣＣＴＴＡＧＴＡＧＴＣＣＡＣＡＧＴＴＣＴＴＡＡＧＧＡＴＴＣＣＴＧＡＣＴＴＣＡＡＣＴＣＡＡＧＡＣＧ（配列番号３１）
Ｏｌｉ−３’−ＡＧＰ１−ＰＧＫ：
ＡＴＴＴＴＴＣＡＡＧＴＣＴＴＴＣＡＧＴＴＣＧＴＡＴＡＧＡＧＡＣＴＴＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＡＴＴＧＴＴＴＴＡＴＡＴＴＴＧＴＴＧＴＡＡＡＡＡＧＴＡＧＡＴＡＡＴ（配列番号３２）

次いで、増幅により得られた断片は、Ｗ３０３−１Ａ株でのプラスミドｐＩＩ４０６（ＡＧＰ１遺伝子を含む３ｋｂ断片を有するベクターｐＦＬ３８、Iraqui et al., 1999, Mol. Cell. Biol., 19, 989−1001）を用いた「ギャップ修復」実験に使用された。この実験で得られたプラスミドは、ＰＧＫ１遺伝子プロモータの制御下にあるＡＧＰ１遺伝子を有している（図３参照）。
このプラスミドは、ＢｓｓＨＩＩ及びＢａｍＨＩにより消化し、生じた断片は、ＥＫ０１１株を形質転換（Iraqui et al. (1999) Mol. Cell. Biol. 19: 989−1001）及び１ｍＭのイソロイシンを含む培地で増殖できる形質転換体の選択による、一段階破壊実験（Rothstein, 1991, Methods in Enzymology, 194, 281−301）に用いた（ＧＡＰ１遺伝子の欠失とＡＧＰ１遺伝子破壊を同時に含むＥＫ０１１株の増殖は、高い濃度のイソロイシン（１ｍＭ）の存在下では非常に遅い）。更に、この株ではＡＧＰ１遺伝子の破壊がＫａｎＭＸ遺伝子を用いて行われ、従ってこの株はジェネティシンに対して耐性である（Iraqui et al., 1999, Mol. Cell. Biol, 19, 989−1001）。１ｍＭイソロイシン存在下で増殖可能であり、並行してジェネティシンに感受性の形質転換体ＣＤ２２５は、保存された。ｐｒｏＰＧＫ−ＡＧＰ１遺伝子によるＡＧＰ１遺伝子の置換は、ＰＣＲにより証明された。

株ＣＹ１３１は、株ＣＣ８６７−１Ｄ（Ｍａｔα、ｈｉｓ３、ｌｅｕ２、ｕｒａ３、ａｄｅ２、ｔｒｐ１、ｍｅｔ３２：：ＴＲＰ１、ｍｅｔ３０：：ＵＲＡ３）及び株ＣＹ１２１−３Ｄ（Ｍａｔａ、ｈｉｓ３、ｕｒａ３、ｔｒｐ１、ｍｅｔ３２：：ＴＲＰ１、ａｄｏ１：：ＵＲＡ３、ａｇｐ１：：ｐｒｏＰＧＫ１−ＡＧＰ１）を交配し、得られた二倍体に胞子を形成させ、次いで求める遺伝子組換え体を選択するために得られた四分子を解析することで取得された。
株ＣＹ２０８は、株ＣＹ１８８−９Ａ（Ｍａｔａ、ｈｉｓ３、ｔｒｐ１、ｕｒａ３、ｍｅｔ３２：：ＴＲＰ１、ａｄｏ１：：ＵＲＡ３、ｍｅｔ３０：：ＵＲＡ３、ｓａｍ４：：ＵＲＡ３、ｍｈｔ１：：ＨＩＳ３）及び株ＣＹ１２１−１Ｃ（Ｍａｔα、ｈｉｓ３、ｕｒａ３、ｔｒｐ１、ｍｅｔ３２：：ＴＲＰ１、ａｄｏ１：：ＵＲＡ３、ａｇｐ１：：ｐｒｏＰＧＫ１−ＡＧＰ１）を交配し、得られた二倍体に胞子を形成させ、次いで求める遺伝子組換え体を選択するために得られた四分子を解析することで取得された。
株ＣＹ２８４は、株ＣＹ２７３−２Ｂ（Ｍａｔａ、ｈｉｓ３、ｌｅｕ２、ｕｒａ３、ｔｒｐ１、ｍｅｔ３２：：ＴＲＰ１、ｍｅｔ３０：：ＵＲＡ３、ａｄｏ１：：ＵＲＡ３、ｓａｍ３−ｓａｍ４：：ｐｒｏＰＧＫ１−ＳＡＭ２）及び株ＣＹ１２１−１Ｃ（Ｍａｔα、ｈｉｓ３、ｌｅｕ２、ｕｒａ３、ｔｒｐ１、ｍｅｔ３２：：ＴＲＰ１、ａｇｐ１：：ｐｒｏＰＧＫ１−ＡＧＰ１）を交配し、得られた二倍体に胞子を形成させ、次いで求める遺伝子組換え体を選択するために得られた四分子を解析することで取得された。

《実施例６：ＳＡＭの生産に対するＡＤＥ２変異の効果の分析》
本発明のために構築された株におけるＳＡＭの生産と分泌に関する分析により、正確に同等の遺伝子型ではあるが野生型のＡＤＥ２遺伝子（ホスホリボシルアミノイミダゾール・カルボキシラーゼをコードし、第ＸＶ染色体に位置する遺伝子）の対立遺伝子を保持する株に比較して、ＡＤＥ２遺伝子を不活性化させる変異を有した株では、ＳＡＭの生産及び分泌の体系的な低下を観察することが可能になった。この変異はプリンの生合成に影響を与えるが、酵母細胞がＳＡＭを過剰生産する能力への影響を説明するのは困難である。これにも拘わらず、得られた結果を考慮して、本発明で構築される株は野生型のＡＤＥ２遺伝子に変異のない対立遺伝子を有したものになるであろう。

《実施例７：本発明の遺伝子修飾された酵母株の経済的に好適な培地での培養》
遺伝子型ＣＹ２０８−７ＢとＣＹ２０８−１１Ｂ、ＣＹ２７３−９ＤとＣＹ２７３−２Ｂ、ＣＹ２８４−９ＢとＣＹ２８４−２Ｂの半数体株、及び遺伝子型ＣＹ３０３−１とＣＹ３０３−４、及びＣＹ３０４−１とＣＹ３０４−２の二倍体株（表１参照）の、経済的に好適な培地（３と１０％の間のリン酸アンモニウム、０．５と５％の間の硫酸アンモニウム、０．１％と１％の間の硫酸マグネシウム、０．５と４％の間のクエン酸ナトリウム５と１０％の間のブドウ糖、及び０．１と２％の間のＤＬ−メチオニンを含む）における培養では、平均してリットルあたり８ｇのＳＡＭを２４時間のうちに得ることが可能である（表１参照）。この生産されたＳＡＭの約４０％は培地に分泌され、従って細胞を破裂させることなく精製することができる。

ＣＹ２０８株は、株（Ｍａｔａ、ｈｉｓ３、ｔｒｐ１、ｕｒａ３、ｍｅｔ３２：：ＴＲＰ１、ａｄｏ１：：ＵＲＡ３、ｍｅｔ３０：：ＵＲＡ３、ｓａｍ４：：ＵＲＡ３、ｍｈｔ１：：ＨＩＳ３）と株ＣＹ１２１−１Ｃ（Ｍａｔα、ｈｉｓ３、ｌｅｕ２、ｕｒａ３、ｔｒｐ１、ｍｅｔ３２：：ＴＲＰ１、ａｇｐ１：：ｐｒｏＰＧＫ１−ＡＧＰ１）を交配し、得られた二倍体に胞子を形成させ、次いで求める遺伝子組換え体を選択するために得られた四分子を解析することで取得された。

株ＣＹ２７３は、株ＣＹ２７０−７Ｄ（Ｍａｔａ、ｈｉｓ３、ｌｅｕ２、ｕｒａ３、ｔｒｐ１、ｍｅｔ３２：：ＴＲＰ１、ａｄｏ１：：ＵＲＡ３、ｓａｍ３−ｓａｍ４：：ｐｒｏＰＧＫ１−ＳＡＭ２）と株ＣＹ２５８−１０Ｄ（Ｍａｔα、ｈｉｓ３、ｌｅｕ２、ｕｒａ３、ｔｒｐ１、ｍｅｔ３２：：ＴＲＰ１、ｍｅｔ３０：：ＵＲＡ３、ａｄｏ１：：ＵＲＡ３、ｓａｍ３−ｓａｍ４：：ｐｒｏＳＡＭ４−ＳＡＭ２、ｍｈｔ１）を交配し、得られた二倍体に胞子を形成させ、次いで求める遺伝子組換え体を選択するために得られた四分子を解析することで取得された。

株ＣＹ２８４は、株ＣＹ２７３−２Ｂ（Ｍａｔａ、ｈｉｓ３、ｌｅｕ２、ｕｒａ３、ｔｒｐ１、ｍｅｔ３２：：ＴＲＰ１、ｍｅｔ３０：：ＵＲＡ３、ａｄｏ１：：ＵＲＡ３、ｓａｍ３−ｓａｍ４：：ｐｒｏＰＧＫ１−ＳＡＭ２）と株ＣＹ１２１−１Ｃ（Ｍａｔα、ｈｉｓ３、ｌｅｕ２、ｕｒａ３、ｔｒｐ１、ｍｅｔ３２：：ＴＲＰ１、ａｇｐ１：：ｐｒｏＰＧＫ１−ＡＧＰ１）を交配し、得られた二倍体に胞子を形成させ、次いで求める遺伝子組換え体を選択するために得られた四分子を解析することで取得された。

Claims (24)

1. Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）の製造のために、アデノシン・キナーゼをコードする遺伝子が遺伝子修飾により不活化された、遺伝子修飾された酵母株の使用。
2. 前記株のアデノシン・キナーゼをコードする遺伝子配列が破壊されていることを特徴とする、請求項１に記載の遺伝子修飾された酵母株の使用。
3. 前記株が、
   −Ｓ−アデノシルメチオニンの高親和性トランスポータをコードする遺伝子、Ｓ−アデノシルメチオニン−ホモシステインメチル基転移酵素をコードする遺伝子、Ｓ−メチルメチオニン−ホモシステインメチル基転移酵素をコードする遺伝子、及びユビキチンリガーゼ複合体ＳＣＦ^{Ｍｅｔ３０}のＭｅｔ３０レセプター・サブユニットをコードする遺伝子、の群から選択される遺伝子の不活性化、
   −Ｓ−アデノシルメチオニン合成酵素１をコードする遺伝子、Ｓ−アデノシルメチオニン合成酵素２をコードする遺伝子、低親和性メチオニン透過酵素をコードする遺伝子、高親和性メチオニン透過酵素をコードする遺伝子、超低親和性メチオニン透過酵素をコードする遺伝子、メチオニンの輸送が可能な広域スペクトル透過酵素をコードする遺伝子、を含む群から選択される遺伝子配列の追加コピーの、前記株のゲノムへの導入、及び
   −Ｓ−アデノシルメチオニン合成酵素１をコードする遺伝子、Ｓ−アデノシルメチオニン合成酵素２をコードする遺伝子、低親和性メチオニン透過酵素をコードする遺伝子、高親和性メチオニン透過酵素をコードする遺伝子、超低親和性メチオニン透過酵素をコードする遺伝子、メチオニンの輸送が可能な広域スペクトル透過酵素をコードする遺伝子、を含む群から選択される遺伝子のプロモータ配列の変異、
   を含む群から選択される少なくとも一つの他の遺伝子修飾を有する、請求項１又は２に記載の遺伝子修飾された酵母株の使用。
4. Ｓ−アデノシルメチオニンの高親和性トランスポータをコードする遺伝子、Ｓ−アデノシルメチオニン−ホモシステインメチル基転移酵素をコードする遺伝子、Ｓ−メチルメチオニン−ホモシステインメチル基転移酵素をコードする遺伝子、及びユビキチンリガーゼ複合体ＳＣＦ^{Ｍｅｔ３０}のＭｅｔ３０レセプター・サブユニットをコードする遺伝子を含む群から選択される少なくとも一つの遺伝子配列が破壊されていることを特徴とする、請求項３に記載の遺伝子修飾された酵母株の使用。
5. Ｓ−アデノシルメチオニン合成酵素１をコードする遺伝子、Ｓ−アデノシルメチオニン合成酵素２をコードする遺伝子、低親和性メチオニン透過酵素をコードする遺伝子、高親和性メチオニン透過酵素をコードする遺伝子、超低親和性メチオニン透過酵素をコードする遺伝子、メチオニンの輸送が可能な広域スペクトル透過酵素をコードする遺伝子、を含む群から選択される前記株の一つの遺伝子の少なくとも一つのプロモータ配列が、酵母の強力プロモータ配列と置換されていることを特徴とする、請求項３又は４に記載の遺伝子修飾された酵母株の使用。．
6. ユビキチンリガーゼ複合体ＳＣＦ^{Ｍｅｔ３０}のＭｅｔ３０レセプター・サブユニット、Ｓ−メチルメチオニン−ホモシステインメチル基転移酵素、アデノシン・キナーゼ、及びＳ−アデノシルメチオニン−ホモシステインメチル基転移酵素、をコードする前記の酵母の遺伝子を不活性化すること、特に前記遺伝子の配列を破壊することを特徴とする請求項３〜５のいずれか一項に記載の遺伝子修飾された酵母株の使用。
7. 強力プロモータと連結した、Ｓ−アデノシルメチオニン合成酵素２をコードする遺伝子配列の追加コピーが、前記株のゲノムに導入されていることを特徴とする、請求項３〜６のいずれか一項に記載の遺伝子修飾された酵母株の使用。
8. 前記株の低親和性メチオニン透過酵素をコードする遺伝子のプロモータ配列が強力プロモータ配列と置換されていることを特徴とする、請求項３〜７のいずれか一項に記載の遺伝子修飾された酵母株の使用。
9. 前記株のＳ−アデノシルメチオニンの高親和性トランスポータをコードする遺伝子及びＳ−アデノシルメチオニン−ホモシステインメチル基転移酵素をコードする遺伝子が、前記遺伝子の配列が、強力プロモータと連結したＳ−アデノシルメチオニン合成酵素２をコードする遺伝子の配列のコピーと置換されることで不活性化されることを特徴とする、請求項３〜８のいずれか一項に記載の遺伝子修飾された酵母株の使用。
10. 前記株のＰＧＫ１、ＡＤＨ１、ＴＤＨ３、ＴＥＦ１、ＰＨＯ５、ＬＥＵ２、及びＧＡＬ１遺伝子の天然プロモータを含む群から強力プロモータが選択されることを特徴とする、請求項５〜９のいずれか一項に記載の遺伝子修飾された酵母株の使用。
11. それがアデニンに関する原栄養菌種であることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の遺伝子修飾された酵母株の使用。
12. それが半数体であることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の遺伝子修飾された酵母株の使用。
13. それが二倍体であることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の遺伝子修飾された酵母株の使用。
14. 遺伝子修飾が染色体でなされる場合に、前記遺伝子修飾が二つの相同染色体のそれぞれで実施されることを特徴とする、請求項１３に記載の遺伝子修飾された酵母株の使用。
15. 前記株が異種ヌクレオチド配列を含まないことを特徴とする、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の遺伝子修飾された酵母株の使用。
16. 前記株が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、及びＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属の酵母を含む群から選択されること、特に前記株がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの種の酵母であることを特徴とする、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の遺伝子修飾された酵母株の使用。
17. 前記株がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ種に属すること、及び前記株のユビキチンリガーゼ複合体ＳＣＦ^{Ｍｅｔ３０}のＭｅｔ３０レセプター・サブユニットをコードする遺伝子（ＭＥＴ３０）を不活性化する、特にＭＥＴ３０ 遺伝子を破壊することで不活性化する場合に、それに引き続き前記株のＭＥＴ４遺伝子及び／又はＭＥＴ３２遺伝子もまた不活性化する、特に対応する遺伝子配列を破壊することで不活性化することを特徴とする、請求項３〜１０のいずれか一項に記載の遺伝子修飾された酵母株の使用。
18. 対応する非修飾酵母株に比較してＳ−アデノシルメチオニンの製造と分泌の増大がみられる、請求項３〜１７のいずれか一項で定義された前記遺伝子修飾された株。
19. 請求項１〜１７のいずれか一項で定義された、遺伝子修飾された酵母株の培地における培養；
    培地上清から、及び／又は遺伝子修飾された酵母細胞からの、Ｓ−アデノシルメチオニンの精製、
    を含むことを特徴とする、Ｓ−アデノシルメチオニンの製造方法。
20. 前記培養がケモスタットで行われることを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
21. 有効成分として請求項１〜１７のいずれか一項に定義された酵母株の少なくとも一つを、薬学的に許容可能な賦形剤と一緒に含むことを特徴とする医薬組成物。
22. Ｓ−アデノシルメチオニンの供給増を必要とする疾病、例えばうつ病、関節炎、線維筋痛症又は男性不妊の治療を目的とした薬剤の製造のための、請求項１〜１７のいずれか一項で定義された酵母株の使用。
23. Ｓ−アデノシルメチオニンを強化した食物又は飲物の製造のための、請求項１〜１７のいずれか一項で定義した酵母株の使用。
24. 請求項１〜１７のいずれか一項で定義した遺伝子修飾された酵母株、少なくとも一つを含むことを特徴とする、ヒト又は動物による消費用の食物調製品又は飲物。

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