JP2008517614A5 - - Google Patents

Description

本発明の特定の実施態様においては、株はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ種に属し、前記の株のユビキチンリガーゼ複合体ＳＣＦ^{Ｍｅｔ３０}のＭｅｔ３０レセプター・サブユニットをコードする遺伝子（ＭＥＴ３０）の不活性化は、特にＭＥＴ３０遺伝子配列の破壊により行われ、次いで、前記の株のＭＥＴ４遺伝子及び／又は前記の株のＭＥＴ３２遺伝子の不活性化もまた、特に対応する遺伝子配列の破壊により実施される。

［ｐｒｏＰＧＫ１−ＳＡＭ２融合遺伝子によるＳＡＭ３及びＳＡＭ４遺伝子の置換］
本発明に記載の方法を実施するうえで好都合な方法においては、酵母細胞が一旦分泌したＳＡＭを再び取込こむことを有意に減らすために、ＳＡＭ４遺伝子を、隣接する高親和性ＳＡＭトランスポータをコードするＳＡＭ３遺伝子と同時に不活性化した。
本発明記載の方法を実施するうえで好都合な他の方法においては、このＳＡＭ３及びＳＡＭ４遺伝子の二重不活性化は、強力構成的プロモータＰＧＫ１の制御下で酵素Ｓａｍ２ｐ（ＳＡＭ合成酵素２）を過剰発現する融合遺伝子をこれら遺伝子座に挿入することで、実施された。このようにして構築した酵母細胞は、このゲノムに施された特異的な修飾の結果による低減したＳＡＭの異化、追加ＳＡＭ２遺伝子による不活性化したＳＡＭの高親和性輸送システム及びＳＡＭ合成酵素活性の発現増加、並びに強力構成的プロモータによる過増殖（一方、天然のＳＡＭ１及びＳＡＭ２遺伝子プロモータは内在性の有機硫黄含有化合物の濃度上昇により負の制御を受ける、Thomas and Surdin−Kerjan, 1997, Microbiol. Mol. Biol. Rev. 61, 503−532）、という利点を備えている。第ＸＶＩ染色体左腕レベルのＳＡＭ３及びＳＡＭ４遺伝子座に挿入されたｐｒｏＰＧＫ１−ＳＡＭ２融合遺伝子（構築はｓａｍ３−ｓａｍ４：：ｐｒｏＰＧＫ１−ＳＡＭ２などの株の遺伝子型に示される）を有する株は、その親株に比較してＳＡＭ生産が増加していることが十分に示された。
前記で得られた、ＰＧＫ１遺伝子プロモータの制御下にあるＳＡＭ２遺伝子を有するプラスミドは、ｐｒｏＰＧＫ−ＳＡＭ２遺伝子を含む断片の増幅のために、二機能性オリゴヌクレオチドと共に用いられた。オリゴヌクレオチドＳＡＭ３−ＰＧＫは、標的である５’領域のＳＡＭ３遺伝子配列（−８０から−３、下に太字（下線）タイプで示す）に相同の７７ヌクレオチド及びそれに続づくＰＧＫ１遺伝子プロモータ領域（−７７１から−７４８）に相同の２４ヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドＳＡＭ４−ＳＡＭ２は、標的である３’領域のＳＡＭ４遺伝子配列（１０４３から９７４、下に太字（下線）タイプで示す）に相同の７０ヌクレオチド、及びそれに続くＳＡＭ２遺伝子末端（１１５５から１１３４）に相同の２１ヌクレオチドを含む。ヌクレオチドは各遺伝子の翻訳開始のＡＴＧより番号が振られている。

増幅により得られた断片は、Ｗ７４４−１Ａ株を形質転換、そしてＳＡＭに関する原栄養形質転換体の選択による、一段階破壊実験に用いた（Rothstein, 1991, Methods in Enzymology, 194, 281−301）（図２Ｂ参照）。
ｐｒｏＰＧＫ−ＳＡＭ２遺伝子によるＳＡＭ３及びＳＡＭ４遺伝子の同時置換はＰＣＲにより証明した。
ＣＹ２７３株は、株ＣＹ２７０−７Ｄ（Ｍａｔａ、ｈｉｓ３、ｌｅｕ２、ｕｒａ３、ｔｒｐ１、ｍｅｔ３２：：ＴＲＰ１、ａｄｏ１：：ＵＲＡ３、ｓａｍ３−ｓａｍ４：：ｐｒｏＰＧＫ１−ＳＡＭ２）及び株ＣＹ２５８−１０Ｄ（Ｍａｔα、ｈｉｓ３、ｌｅｕ２、ｕｒａ３、ｔｒｐ１、ｍｅｔ３２：：ＴＲＰ１、ｍｅｔ３０：：ＵＲＡ３、ａｄｏ１：：ＵＲＡ３、ｓａｍ３−ｓａｍ４：：ｐｒｏＳＡＭ４−ＳＡＭ２、ｍｈｔ１）を交配し、得られた二倍体に胞子を形成させ、次いで、求める遺伝子組換えを有する胞子を選択するために得られた四分子を分析することで、取得された。

Claims (1)

1. Ｓ−アデノシルメチオニン合成酵素１をコードする遺伝子、Ｓ−アデノシルメチオニン合成酵素２をコードする遺伝子、低親和性メチオニン透過酵素をコードする遺伝子、高親和性メチオニン透過酵素をコードする遺伝子、超低親和性メチオニン透過酵素をコードする遺伝子、メチオニンの輸送が可能な広域スペクトル透過酵素をコードする遺伝子、を含む群から選択される前記株の一つの遺伝子の少なくとも一つのプロモータ配列が、酵母の強力プロモータ配列と置換されていることを特徴とする、請求項３又は４に記載の遺伝子修飾された酵母株の使用。