CN101084232A - 抗病毒寡核苷酸 - Google Patents

Abstract

本发明描述了具有抗病毒活性的随机序列寡核苷酸，及其作为抗病毒剂的用途。许多情况中，所述寡核苷酸超过40个核苷酸长，并包含化学修饰，比如修饰的核苷酸间连接键和核糖部分中2’位置上的修饰。发明还描述了其预防或者治疗人或动物中病毒感染的用途，以及预防或者治疗人或动物中由致癌病毒导致的癌症的用途。所述用途通常包括将可药用、治疗有效量的至少一种寡核苷酸给予需要这种治疗的人或动物，其中该寡核苷酸是以不依赖于序列的方式发挥作用。

Description

抗病毒寡核苷酸

技术领域

本发明涉及具有抗病毒活性的寡核苷酸，及其作为治疗剂的用途，所述治疗剂可以用于人和动物病毒引起的病毒感染、由致癌病毒引起的癌症、以及病原学是基于病毒的其他疾病。

背景技术

以下讨论是为了协助读者理解本发明，并不意味着承认讨论的任何信息或引用的参考文献构成本发明的现有技术。

许多困扰人类的重要传染病是由病毒引起的。很多这类疾病，包括狂犬病、天花、脊髓灰质炎、病毒性出血热、肝炎、黄热病、免疫缺陷和各种脑炎都是致命的。其他一些的重要性在于其高度传染性，并且会造成急性不适比如流感、麻疹、流行性腮腺炎和水痘，以及呼吸系统或胃肠紊乱。其他比如风疹和巨细胞病毒会导致先天性畸形。最后还有一些病毒，被称为致癌病毒会在人和动物中引发癌症。

在各种病毒中，人们对疱疹病毒科有极大的兴趣。疱疹病毒是广泛存在的一类二十面体双链DNA病毒。在超过100种已被研究过的疱疹病毒科(HHV)成员中，只有八种感染人类。其中最为人们熟悉的是1型单纯疱疹病毒(HSV-1)、2型单纯疱疹病毒(HSV-2)、Varicella zoster(水痘或带状疱疹病毒)、巨细胞病毒(CMV)和EB病毒(Epstein-Barr病毒)(EBV)。疱疹病毒在人类中的发生率非常高，影响到世界人口的至少三分之一；在美国70-80％人口有某种疱疹感染。疱疹感染的病理学通常不危险，象在HSV-1的情况中，一般只会导致嘴周和脸上的短时间损口，但是这些病毒也会引起更危险的症状，从生殖器溃疡和分泌物到胎儿感染，后者会导致大脑炎(15％的死亡率)或祢漫性感染(40％死亡率)。

疱疹病毒在自然界中广泛散布，对人类有很强的致病性。例如，人们已知EB病毒(EBV)会在童年或青少年晚期或者年轻人中导致传染性单核细胞增多。急性传染性单核细胞增多的标志是喉咙痛、发烧、头痛、淋巴结病、扁桃体肿大和外周血中的非典型的分裂淋巴细胞。其他表现经常还包括轻度肝炎、脾肿大和脑炎。EBV还与两种癌症相关：Burkitt′s淋巴瘤(BL)和鼻咽癌(NPC)。在赤道非洲的疫区，BL是最常见的儿童恶性肿瘤，约占儿童中癌症的80％。虽然在北美白种人中并不常见，NPC是中国南部25到55岁人群中最常见的癌症。与巨细胞病毒类似，EBV也和移植后淋巴细胞增生性疾病有关，该病是实体器官或骨髓移植之后发生的慢性免疫抑制的潜在致命并发症。

其他与HSV有关的疾病还包括皮肤和眼部感染，例如脉络膜视网膜炎或角膜结膜炎。在美国每年诊断出的HSV眼部感染大约有300,000例。

AIDS(获得性免疫缺陷综合征)是由人类免疫缺陷病毒(HIV)引起的。通过杀死或损害机体免疫系统细胞，HIV逐渐破坏机体抵抗感染和一些癌症的能力。目前全世界有接近4千2百万人带有HIV/AIDS。2002年总共有三百一十万人死于HIV/AIDS有关的原因。抗HIV药物治疗的最终目的是阻止病毒繁殖和破坏免疫系统。虽然过去15年间在抗HIV方面取得了长足的进展，医学上还没有找到治愈方法。现在医生有分属三个不同药物种类的十几种抗逆转录病毒药物来处理这种疾病。通常，处方是两个或三个种类的药物的多种组合，这称为HAART(高效抗逆转录病毒治疗)。HAART疗法通常包含两种核苷逆转录酶抑制剂药物以及或者是蛋白酶抑制剂或者是非核苷逆转录酶抑制剂的第三种药物。临床研究已证实HAART是最有效的减少病毒载量和降低发生药物抗性的可能性的手段。

尽管HAART已被证实能够减少身体中的HIV数量(通常称为病毒载量)，成千上万的患者在采用这种疗法时遇到严重的问题。一些副作用很严重，包括异常脂肪代谢、肾结石和心脏疾病。其他副作用比如恶心、呕吐和失眠不太严重，但对需要终生进行慢性药物治疗的HIV患者仍是问题。

目前已批准的抗HIV药物作用机理是进入感染HIV的CD4+T细胞，阻断病毒的酶类(逆转录酶或蛋白酶)的功能。HIV需要这两种酶来进行增殖。但是HIV经常发生突变，使得逆转录酶或蛋白酶抑制剂药物对这些抗性株失去效力。一旦出现抗性，病毒载量就会增加，因此需要将无效的药剂换成另一种抗逆转录病毒药物。不幸的是，当病毒对一个类型的某种药物有了抗性，该类型的其他药物的效果可能也会下降。出现这种被称为交叉抗性的现象是因为许多抗HIV药物的作用方式类似。药物交叉抗性的出现非常不受欢迎，因为这样就减少了可供患者选择的治疗方法。

因此迫切需要开发其他能有效抗HIV的抗病毒试剂，这些试剂是通过病毒还未发展出抗性的其他作用机制来发挥作用的。这一点从最近的数据看来显得尤其重要，这些数据表明在欧洲新诊断的HIV患者中每十个就有一个感染的HIV病毒株已经对市场上的至少一种批准药物有抗性。

呼吸道合胞病毒(RSV)会引起上呼吸道和下呼吸道感染。它是一种反义、有包膜的RNA病毒，并且高度传染性。这种病毒一般影响低龄儿童，是婴儿中最常见的下呼吸道疾病诱因。RSV感染通常与中度到严重感冒类似症状相关。但是严重的下呼吸道疾病可能在任何年龄段发生，特别是年老或免疫功能不足的患者。感染严重的儿童可能需要氧气疗法，在一些病例中，可能还需要进行机械通气。据美国医学会报道，越来越多的儿童因为通常由RSV感染引起的细支气管炎住院。RSV感染还造成了骨髓移植中心的患者中将近三分之一的社区相关性呼吸道病毒感染。在老年人群中，RSV感染最近被认定为与流行性感冒病毒感染的严重性非常类似。

流行性感冒(INF)，又称为流感，是由流行性感冒病毒引起的传染性疾病。它攻击人的呼吸道(鼻子、喉咙和肺部)。在美国每年平均有大约36,000人死于流感，每年114,000人因为流感需要住院。由于以前仅见于动物的高致病性病毒株(例如禽流感)的出现，流感在近期成为更多关注所在。

对所有传染病来说，特定疗法的效力经常取决于宿主的免疫反应。这一点尤其适用于疱疹病毒，因为所有疱疹病毒都能建立潜伏感染，导致在免疫功能不足的患者中再激活感染的发生率极高。在肾移植受体中，40％到70％再激活了潜伏的HSV感染，80％到100％再激活了潜伏的CMV感染。在AIDS患者中也观察到这类病毒再激活。

乙型肝炎病毒(HBV)是属于嗜肝病毒科的一种DNA病毒。HBV在人中会导致乙型肝炎。全世界估计有20亿人(即三分之一人口)感染该病毒。大约3亿5千万人处于慢性感染状态，每年有约100万人死于乙型肝炎及其并发症。HBV会组成终生感染、肝硬化、肝癌、肝衰竭和死亡。这种病毒是通过血液和体液进行传播。传播的进行可能是通过直接的血液到血液接触、没有保护的性行为、使用未灭菌针头，以及在生产过程中由被感染的妇女传给她的新生儿。多数健康成人(90％)在被感染后会恢复并产生保护性抗体抵抗以后的乙肝感染。少数(5-10％)无法摆脱该病毒，会发展成慢性感染，而90％的婴儿和达到50％低龄儿童在感染该病毒时会发展成慢性感染。α-干扰素是最常用的治疗。与该项治疗相关的主要副作用包括类似流感症状、抑郁、皮疹、其他反应和异常血细胞计数。其他治疗选项包括同样有许多相关副作用的3TC。过去几年中，越来越多的报道表明用3TC治疗的患者发展出HBV的抗性株。这对共感染了HBV和HIV的患者群尤其成问题。显然急需开发抗该病毒的新的抗病毒疗法。

丙型肝炎病毒(HCV)感染是美国最常见的慢性血液携带传染病，被感染患者数目可能已超过4百万。在美国这种常见病毒感染是肝硬化和肝癌的主要诱因，现在成了肝移植的第一大原因。从感染中康复非常罕见，大约85％被感染的患者成为该病毒的慢性携带者，10％到20％发展成肝硬化。估计现在全世界有1亿7千万人是慢性携带者。据Centers for Disease Controland Prevention报道，慢性丙型肝炎每年仅在美国就造成8,000到10,000例死亡，和大约1000例肝移植。目前没有针对丙型肝炎的疫苗。用α干扰素，或者干扰素结合三氮唑核苷长期治疗只对40％的患者有效，并且会导致严重的副作用。

目前，病毒感染的治疗前景总体来说并不乐观。大体上，针对病毒的治疗效果一般，并且有强的副作用，这一点使得或者不能给予有效剂量或者无法进行长期治疗。能体现这些问题的三个临床实例是嗜肝DNA病毒、HIV和RSV感染。

嗜肝DNA病毒的情况中，目前被批准在临床上使用的有五种主要治疗药物：5-碘脱氧尿苷、阿糖腺苷(vidarabine)、无环鸟苷、膦甲酸(foscarnet)和更昔洛韦(ganciclovir)。尽管效果有限，这些治疗药物也都有副作用。据报道接受碘脱氧尿苷治疗的患者35％有过敏反应；阿糖腺苷在15％患者中导致胃肠不适；无环鸟苷、膦甲酸和更昔洛韦是核苷类似物，会影响宿主细胞的DNA复制。更昔洛韦的情况中，用该药治疗的AIDS患者有40％发生嗜中性白细胞减少症和血小板减少症。

虽然现在有许多不同药物可供治疗HIV感染，但与这些药物相关的副作用太大了，因此需要大量补加药物来保证患者一定水平的生活质量。HIV药物抗性株带来的另一问题(也存在于嗜肝DNA病毒感染的问题)通常需要定期改变治疗药物的混合配方，在一些情况中，使得感染极其难以治疗。

治疗小婴儿RSV感染是另外一个说明我们迫切需要开发新药的例子。在该情况中，治疗的一般过程是在一个隔离帐中利用小颗粒气溶胶通过吸入方式来递送三氮唑核苷。三氮唑核苷只有微弱效果，但其有严重的副作用。此外，由于三氮唑核苷众所周知的致畸性，药物有可能释放出来也给医务人员带来极大的担心。

显然对于任何正在研制的新兴抗病毒药物，人们希望它具备以下三个特征：1-效力提高；2-副作用降低以及3-病毒难以通过突变来脱逃其作用机制。

通过多种反义手段来抑制一些具体病毒已有人进行过尝试。

Zamecnik等利用了特异性靶向到逆转录酶引物位点并剪切供体/受体位点的ON(Zamecnik，et al(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：4143-)(Goodchild&Zamecnik(1989)US Pat 4,806,463)。

Crooke及其合作者(Crooke et al.(1992)Antimicrob.Agents Chemother.36：527-532)描述了一种抗HSV-1的反义物。

Draper等(1993)(US Pat 5,248,670)报道的具有抗HSV活性的反义寡核苷酸含有Cat序列，并能与HSV-1的基因UL13、UL39和UL40杂交。

Kean等(Biochemistry(1995)34：14617-14620)报道过检测反义甲基膦酸酯寡聚物作为抗HSV试剂。

Peyman等(Biol Chem Hoppe Seyler(1995)Mar；376：195-198)报道过测试特异反义寡核苷酸定向抗HSV-1的IE110和UL30mRNA的抗病毒特性。

针对编码IE1、IE2或DNA聚合酶的CMV mRNA的寡核苷酸或寡核苷酸类似物由Anderson等报道过(1997)(US Pat 5,591,720)。

Hanecak等(1999)(US Pat 5,952,490)描述了修饰过的寡核苷酸，其具有一个保守的G四联体序列和足够数目的旁侧核苷酸使病毒(比如HSV-1)活性得到明显的抑制。

Jajrath等(Antiviral Res.(1997)33：201-213)报道过抗RSV的反义寡核苷酸。

Torrence等(1999)(US Pat 5,998,602)报道过这样的化合物，其包含与RSV反基因链(即mRNA链)的一个单链片段互补的反义成分、一段接头以及RNase L的寡核苷酸激活物。

Qi等(Zhonghua Shi Yan He Lin Chuang Bing Du Xue Za Zhi(2000)14：253-256)报道过在柯萨奇(Coxsackie)病毒B3中测试反义PS-寡核苷酸(PS-ON)。国际公开文本WO9203051(Roizman and Maxwell)描述的甲基膦酸酯反义寡聚物与HSV病毒基因组或mRNA转录物的关键区域互补，并表现出抗病毒活性。

有报道称鸟苷/胸苷或者富含尿苷的硫代磷酸酯寡脱氧核苷酸(GT-PS-ON)具有抗病毒活性。该文草说″几个均为26或27nt长的含有PS并富含GT的不同ON(B106-140，1100-12，and G106-57)，在降低HIV-2滴度方面与由36(B106-96，B106-97)或45个nt组成的富含GT的ON一样有效(表4)″(Fennewald et al.，Antiviral Res.(1995)26：37-54)。

美国专利6,184,369描述了高尿苷碱基百分含量的抗HIV、抗HSV和抗CMV的寡核苷酸。在优选实施方案中，该寡核苷酸具有借助鸟苷四联体得以稳定的三维结构。在进一步的实施方案中，该发明的寡核苷酸组合物有两或多轮两段相邻的脱氧鸟苷。该发明有5项权利要求要求保护富含G的寡脱氧核苷酸(ODN)，其至少在两个位置有至少两个G残基。

Cohen等(美国专利5,264,423和5,276,019)描述了对HIV复制进行抑制，尤其是可以用于在有正常活细胞的情况下，阻止外来核酸的复制的PS-ODN。Cohen等描述了针对某个病毒序列的反义PS-ODN的O抗病毒活性。他们还描述了检测14、18、21和28聚体的polyA、polyT和polyC PS-ODN序列，并说明这些PS-ODN具有抗病毒效果。

Matsukura等(Matsukura et al(1987)Proc Natl Acad Sci USA84：7706-7710)后来发表了以上Cohen等的美国专利描述的结果。

Gao等(Gao et al(1989)J Biol Chem 264：11521-11526)描述了通过检测7、15、21和28个核苷酸长的polyA、polyT和polyC PS-ODN序列证明了它们对HSV-2复制的抑制作用。

Archambault、Stein和Cohen(Archambault et al(1994)Arch Virol139：97109)报道了一个有28个核苷酸的PS-ODN polyC对HSV-1无效。

Stein等(Stein et al.(1989)AIDS Res Hum Retrovir 5：639-646)发表的实验结果涉及抗HIV的ODN的其他数据，所述ODN通常长21-28个核苷酸。

Marshal等(Marshall et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：6265-6269)描述了长4-28个核苷酸的硫代磷酸酯和硫代磷酸酯polyC寡聚物的抗HIV-1效果。

Stein和Cheng(Stein et al.(1993)Science 261：1004-1012)在一篇综述文章中提及长28个核苷酸的非特异ODN的抗病毒活性，说到″PS寡聚物的抗HIV特性明显受到非序列特异性效应的影响，即它们的抑制效果不依赖于碱基序列″。

在一篇综述文章中，Lebedeva和Stein(Lebedeva et al(2001)Annul RevPharmacol 41：403-419)报道了PS-ODN的许多非特异性蛋白质结合活性，包括与病毒蛋白质的结合。他们描述说″这些分子的生物活性极高，经常颇为容易地将artifact当成反义物″。

Rein等(US Pat.6,316,190)报道了一种富含GT的ON诱骗物，该诱骗物连接有一个融合伙伴并能结合HIV核壳，可以用作抗病毒化合物。类似的，Campbell等(Campbell et al(1999)J.Virol.73：2270-2279)报道了带有TGTGT基序的PO-ODN能够特异结合HIV的核壳，但没有提及抗病毒活性。

Feng等(Feng et al.(2002)J.Virol.76：11757-11762)描述了A(n)和TG(n)PO-ODNs能够结合到重组HIV核壳上，但没有数据证明也未提及抗HIV活性。

研制出作为抗癌试剂、抗病毒试剂或者治疗其他疾病的反义ODN通常大约20个核苷酸长。在一篇综述文章中(Stein，CA，(2001)J.CHn.Invest.108：641-644)，作者称″反义寡核苷酸的长度必须进行优化：如果反义寡核苷酸太长或太短，其特异性就会失去。目前来说，反义寡核苷酸的最佳长度似乎大概是16-20个核苷酸″。类似的，另一篇综述文章中(Crooke，ST(2000)Methods Enzymol.313：3-45)，提到″与RNA和RNA双链结构相比，硫代磷酸酯寡脱氧核苷酸的Tm大约每单元低2.2℃。这就意味着要在体外有效，硫代磷酸酯寡脱氧核苷酸一般必须有17到20聚体长″。

Caruthers及其同事(Marshall et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：6265-6269)报道过12聚体polycytidine-PS2-ODN和14聚体PS2-ODN的硫代磷酸酯ODNs(PS2-ODNs)的抗HIV活性。他们没有检测其他大小的ODN的抗HIV活性。作者还报道了12、14、20和28聚体polycytidine-PS2-ODN对HIV逆转录酶(RT)的抑制作用。后来，这个研究组(Marshal et al(1993)Science 259：1564-1570)报道的实验结果显示了对HIV RT的序列特异性抑制。该研究小组在多项专利中公开了PS2-ODN的数据。在美国专利5,218,103和5,684.148中描述了PS2-ODN的结构和合成。美国专利5,452,496、5,278,302和5,695,979描述了不超过15个碱基的PS2-ODN对HIV RT的抑制作用。美国专利5,750,666和5,602,244中描述了PS2-ODNs的反义活性。

已有人对核糖2’位置修饰过的寡核苷酸及其在反义策略中的应用进行了评估，例如象下面引用的参考文献中描述的那样。

Inoue及其合作者(Inoue et al.(1985)Nucleic Acids Res.16：165168)描述了寡聚物(2′-O-甲基核糖核苷酸)的合成和特性。同一研究小组(Inoue etal.(1987)FEBS Letter 215：327-330)报道了当寡核苷酸含有的全部是2′-O-甲基核糖核苷酸时，不会发生RNase H介导的mRNA剪切。对于混合的寡核苷酸，即含有未修饰和2′-O-甲基核糖核苷酸的寡核苷酸，他们报道了由RNA和2′-O-甲基核糖核苷酸形成的核酸复合体发生了序列特异性RNase H水解。

不支持RNase H介导的靶mRNA剪切的完全2′-O-甲基化的和硫代磷酸酯化寡核苷酸被用于确定活性反义寡核苷酸是否是通过RNase H依赖性机制来抑制ICAM-1表达的(Chiang et al.，(1991)J.Biol.Chem.266：18162-18171)。作者宣称这些反义寡核苷酸有可能用作治疗剂。

带有2′-糖修饰(包括2′-O-甲基化、2′-O-丙基化、2′-O-戊基化和2′-氟代)的寡核苷酸被分析了其反义活性。对一律2’修饰的寡核苷酸进行的反义活性评价显示这些化合物完全不能抑制基因表达。而如果化合物含有至少5个2′-脱氧核糖核苷酸残基的一段序列，就会恢复反义活性。这个最短脱氧核糖核苷酸长度与RNase H在体外发生有效活化所需要的最小长度完全吻合(Monia et al.，1993，J.Biol.Chem.268：14514)。

Yu等((1996)Bioorganic.Med.Chem.4：1685-1692)报道了含有其部分糖基被2’甲基化修饰的硫代磷酸酯、磷酸二酯或者混合骨架的杂交反义寡核苷酸，通过p24 ELISA定量法测量到特异抗HIV活性。

有报道说，在稳定转化了该突变的人β球蛋白基因的哺乳动物细胞中，当硫代磷酸酯化的2′-O-甲基-寡核糖核苷酸被导靶到在此表达的IVS2-654前mRNA的异常剪切位点时，能够有效地恢复正确的剪切方式(Sierakowska，et al(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：12840-12844)。

Agrawal((1999)Biochim.Biophys.Acta 1489：53-68)在综述文章中提议，为了获得最大活性，反义寡核苷酸不应仅有对核酶稳定性提高或者对靶RNA的高亲和力，而应综合具有多种特性。这类特性包括RNase H的活化。在之后的一篇综述中，Agrawal和Kandimalla((2000)MoI.Med.Today-6：72-81)说，包含2′-O-甲基化修饰的混合骨架寡核苷酸，因其得到改善的特点(包括RNAse H活化)已成为第二代反义寡核苷酸的选择。反义寡聚物应具备一些重要特性，比如在结合到靶RNA上时激活RNAse H的能力(Agrawal and Kandimalla，2001，Current Cancer Drug Target 1：197-209)。对于多数反义方法来说，为了提高反义效力希望靶RNA能被RNAse H剪切(Kurreck，2003，Eur.J.Biochem.270：1628-1644)。

许多研究描述了2′-O-甲氧乙基修饰在反义寡核苷酸中的应用。一个例子是Zellweger等((2001)J.Pharmacol.Experimental Therapeutics298：934-940)描述的一项利用带缺口2′修饰寡核苷酸反义分子进行的研究。另一个例子显示用不依赖于RNase H的2′-O-甲氧乙基化反义分子抑制了翻译起始复合体的形成(Baker et al.1997)J.Biol.Chem.272：1994-12000)。

Kuwasaki等((2003)J.Antimicrob.Chemother.51：813-819)描述了设计一种高核酶抗性、二聚体发夹鸟苷四链体，其核苷含有2′-O-甲基基团，核苷酸之间的键上带有硫基团；及其在培育细胞中的抗HIV-1活性。

Mou和Gray(2002)(Nucleic Acids Res.30：749-758)指出，与典型的硫代磷酸酯DNA寡聚物相比，增加的2′-O-甲基修饰降低了非特异性蛋白质结合性质。对36聚体寡核苷酸的g5p蛋白质结合亲和力提高的顺序为dA₃₆＜rA₃₆＜2′-O-MeA₃₆＜S-rA₃₆″S-2′-O-MeA₃₆＜S-dA₃₆(其中d＝脱氧、r＝核糖、2′-O-Me＝2′-O-甲基、S＝硫代磷酸酯)。这个顺序与Kandimalla等((1998)Bioorganic Med Chem Lett.8：2103-2108)报道的S-RNA″S-2-O-MeRNA＜S-DNA一致，后者是这些寡聚体修饰与血浆蛋白质(比如人血清白蛋白、γ球蛋白和血纤蛋白原)的非特异结合亲和力。

美国专利5,591,623和5,514,788描述了治疗和诊断这样一些疾病的组合物和方法，这些疾病可以通过调节细胞间粘着分子的合成或代谢来进行治疗。与优选实施方案一致的，描述了能够与编码细胞间粘着基因的核酸发生特异性杂交的寡核苷酸。该发明描述了2′-O-甲基硫代磷酸酯寡核苷酸的合成及其作为反义分子的用途。

美国专利5,652,355、6,143,881和6,346,614描述的杂交寡核苷酸(含有脱氧核糖和核糖核苷酸片段)能够抵抗溶核降解、与RNA或DNA形成稳定双链体，并且在与RNA杂交时激活RNase H。文中指出硫代磷酸酯2′-O-甲基-寡核苷酸的特性之一是不激活RNAse H。一方面，该发明提供了能有效抑制病毒、病原生物或细胞基因的表达的杂交寡核苷酸。基于该发明的这个方面，这些寡核苷酸的一个特点是含有脱氧核糖核苷酸。按照该发明的寡核苷酸含有至少一个脱氧核糖核苷酸。按照该发明的这个方面，所述寡核苷酸的核苷酸序列与来自病毒、病原生物或细胞基因的核酸序列互补。

美国专利5,591,721和6,608,035描述了通过口服其核苷酸序列与靶基因互补的寡核苷酸来下调动物的某个基因表达的方法。因此由于该专利中描述的特性，这些寡核苷酸被认为借助它们能够调节或下调动物中特定基因的表达的能力，可以用于治疗。用于该发明所述方法的杂交DNA/RNA寡核苷酸能抗溶核降解、与RNA或DNA形成稳定双螺旋，并优选在杂交了RNA时能激活RNase H。该发明的寡核苷酸据报道能够有效抑制病毒、病原生物中的多种基因的表达，或者抑制细胞基因的表达。因此，按照该发明的方法所述的寡核苷酸，其核苷酸序列与来自病毒、病原生物或细胞基因的核酸序列互补。

美国专利6,608,035提供的数据表明硫代磷酸酯寡核苷酸在胃中6小时后就不稳定，而那些3’和5’末端含有2′-O-甲基核糖核苷酸，内部为脱氧核糖核苷酸组成的杂交硫代磷酸酯寡核苷酸在胃中更稳定，但有部分降解。

发明概述

本发明涉及这样的发现，即寡核苷酸(ON)，例如寡脱氧核苷酸(ODNs)包括高度修饰的寡核苷酸可能具有用途广泛的、不依赖于序列的抗病毒活性。有利的修饰包括修饰的核苷酸之间的键和2′-修饰。为了具备抗病毒活性，寡核苷酸不需要与任何病毒序列互补，或者具有特定的核苷酸分布。这样的寡核苷酸甚至可以制备成随机寡核苷酸(randomer)，从而在制备物中每个特定序列最多有少数拷贝，例如在15微摩尔随机寡核苷酸制备物中，32或更多个核苷酸长。

此外，本发明人发现不同长度的寡核苷酸其抗病毒效果各异。例如，我们的结果表明，在用硫代磷酸酯核苷酸间连接键修饰的情况下，能产生最大抗病毒效果的抗病毒寡核苷酸长度通常在40-120个核苷酸范围内。就本发现涉及的寡核苷酸抗病毒特性而言，本发明提供了具有可抗大量不同病毒的活性的寡核苷酸抗病毒试剂，这些试剂甚至可以作为广谱抗病毒药剂。考虑到现有的抗病毒治疗选择有限，这些抗病毒试剂尤其有利。

因此，本发明的ON(例如ODN)可以用于这样一些治疗，即处置或预防病毒感染，或者处置或预防病毒(比如肿瘤病毒，例如逆转录病毒、乳头瘤病毒和疱疹病毒)诱发的肿瘤或癌症，以及处置或预防其他在病原学上讲由病毒引起的疾病。这类治疗可以应用于许多类型的患者和处置，包括例如，在免疫功能不足的人和动物病患中预防或治疗病毒感染。

本发明第一个方面涉及抗病毒寡核苷酸，例如纯化的寡核苷酸，其中该寡核苷酸主要是以不依赖于序列(例如非序列互补)的方式发挥抗病毒功能的，还涉及含有所述寡核苷酸的制剂。

用于本发明的寡核苷酸可以是各种长度，例如至少6、10、14、15、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、38、40、45、50、60、70、80、90、100、110、120、140、160或更多个核苷酸长。同样的，所述寡核苷酸长度可以是一个核苷酸范围，例如从前面列出的数值中任取两个作为端点(包括这两个端点)所界定的范围，例如10-20、20-30、20-40、30-40、30-50、40-50、40-60、40-80、50-60、50-70、60-70、70-80、60-120和80-120个核苷酸。在具体实施方案中，我们在其中将所述抗病毒寡核苷酸的最小长度或长度范围与寡核苷酸的其他特征描述一起列出。

抗病毒核苷酸可以包括各种修饰，例如使其更稳定的修饰，因此可以包括至少一个在磷酸二酯键和/或糖基，和/或碱基上的修饰。例如所述寡核苷酸可以包括一或多个硫代磷酸酯键、二硫代磷酸酯键，和/或甲基膦酸酯键。可以将不同的化学上兼容的修饰键结合起来，例如其合成条件在化学上兼容的那些修饰。虽然经过修饰的键有用，所述寡核苷酸也可以包括磷酸二酯键，例如包括至少一个磷酸二酯键，或者至少5％、10％、20％、30％或更多的磷酸二酯键。另外有用的修饰包括，但不限于在糖基2’位置进行的修饰，比如2′-O-烷基修饰，象2′-O-甲基修饰、2′-氨基修饰、2′-盐修饰(比如2′-氟代)；无环核苷酸类似物。其他修饰也是本领域已知的，也可以使用。在具体实施方案中，所述寡核苷酸到处都有经过修饰的键，例如硫代磷酸酯；有3′-和/或5′-帽子；包括末端3′-5′连接；该寡核苷酸就是，或者包括由两个或多个通过接头连接在一起的寡核苷酸序列构成的多联体。

本发明进一步提供了寡核苷酸，其中该寡核苷酸在一或多个核苷酸残基上连接或偶联一个能改变该寡核苷酸特性的分子，以便获得1或多种选自以下的特性：更高的稳定性、血清反应下降、更高的细胞吸收、与病毒蛋白相互作用更强、配制成进行递送的制剂的能力改善、有可检测信号、更高的抗病毒活性、更好的药物代谢动力学特性、特异组织分布和毒性减弱。

在一些实施方案中，所述寡核苷酸包括至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、95或100％经过修饰的键，例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯和/或甲基膦酸酯。

在一些实施方案中，至少10、20、30、40、50、60、70、80、90或95％，或者全部核苷酸在核糖的2′-位置被修饰，例如2′-OMe、2′-F和2′-氨基。

在一些实施方案中，寡核苷酸中结合了经过修饰的连接键和2’修饰，例如至少30％经过修饰的连接键和至少30％2′-修饰；或者分别是至少40％和40％、至少50％和50％、至少60％和60％、至少70％和70％、至少80％和80％、至少90％和90％，100％和100％。在一些实施方案中，所述寡核苷酸包括至少30、40、50、60、70、80、90或者100％经过修饰的连接键和至少30、40、50、60、70、80、90，或者100％2′-修饰，这些实施方案包括所列经过修饰连接键百分比和2′-修饰百分比的所有组合(例如，至少50％经过修饰的连接键和至少80％2′-修饰；以及至少80％经过修饰的连接键和100％2′-修饰)。在所述各种百分比组合的具体实施方案中，所述修饰的连接键是硫代磷酸酯键；所述修饰的连接键是二硫代磷酸酯键；所述2′-修饰是2′-OMe；所述2′-修饰是2′-氟代；所述2′-修饰是2′-OMe和2′-氟代的组合；所述修饰的连接键是硫代磷酸酯键，所述2′-修饰是2′-OMe；所述修饰的连接键是硫代磷酸酯键，所述2′-修饰是2′-氟代；所述修饰的连接键是二硫代磷酸酯键，所述2′-修饰是2′-OMe；所述修饰的连接键是二硫代磷酸酯键，所述2′-修饰是2′-氟；所述修饰的连接键是二硫代磷酸酯键，所述2′-修饰是2′-OMe和2′-氟的组合。在一些关于这样的寡核苷酸的实施方案中，所述寡核苷酸如此处所述有特定百分比修饰过的连接键和特定百分比的2′-修饰，这些寡核苷酸至少长15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、110或120个核苷酸，或者其长度在由提及的长度中任取两个作为端点(包括这两个端点)所界定的范围内。

在一些实施方案中，除了1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个之外的全部核苷酸间连接键和/或核糖部分的2′-位置都是经过修饰的，例如以硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或甲基膦酸酯键修饰的连接键和/或2′-OMe、2′-F和/2′-氨基修饰的核糖部分。

在一些实施方案中，所述寡核苷酸包括至少1、2、3或4个核糖核苷酸，或者至少10、20、30、40、50、60、70、80、90％，或甚至100％的核糖核苷酸。

在具体实施方案中，所述寡核苷酸在链中包括非核苷酸基团(即链骨架组成部分)和/或作为侧链部分，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多，或者达到5、10、20％或更多的链部分和/或侧链部分包括非核苷酸基团。

在一些实施方案中，所述寡核苷酸没有超过5、8、10、15、20、25、30个核苷酸长的自身互补序列；该寡核苷酸没有催化活性，例如切割RNA的活性；该寡核苷酸不会诱发RNAi机制。

在具体实施方案中，所述寡核苷酸结合到一或多个病毒蛋白质；该寡核苷酸(或其部分，例如至少20、30、40、50、60、70％或更多)的序列来源于病毒基因组；含有来源于病毒基因组的序列的寡核苷酸，其活性并不比相同长度的随机寡核苷酸寡核苷酸或随机寡核苷酸强；该寡核苷酸包括与病毒序列互补的部分和不与病毒序列互补的部分；寡核苷酸的序列来源于病毒组装序列或其他参与适体性相互作用的病毒序列；除非另外说明，所述寡核苷酸的序列包括A(x)、C(x)、G(x)、T(x)、U(x)、l(x)、AC(X)、AG(X)、AT(X)、AU(x)、CG(x)、CT(x)、CU(x)、GT(x)、GU(x)、TU(x)、Al(x)、IC(x)、IG(X)、IT(x)、lU(x)，其中x是2、3、4、5、6...60...120(在具体实施方案中，寡核苷酸至少有15，20，25，29，30，32，34，35，36，38，40，45，46，50，60，70，80，90，100，110，120，140或160个核苷酸长，或者其长度可以是从前面列出的数值中任取两个作为端点(包括这两个端点)所界定的范围内，或者指定重复序列的长度至少是刚才指定的长度或长度范围内)；所述寡核苷酸包括重复序列(如上文限定的重复序列)的组合，包括例如上述单体的所有组合和/或每次取2、3或4个二聚体重复的组合；该寡核苷酸是单链的(RNA或DNA)；寡核苷酸是双链的(RNA或DNA)；所述寡核苷酸包括至少一个G四联体或CpG部分；寡核苷酸包含与病毒mRNA互补的部分，并且至少有29、37或38个核苷酸长(或是上文指定的其他长度)；所述寡核苷酸包括至少一个非Watson-Crick寡核苷酸，和/或至少有一个核苷酸参与和另一个核苷酸的非Watson-Crick结合，和/或至少有一个核苷酸不能与其他核苷酸形成碱基对；所述寡核苷酸是随机寡核苷酸，寡核苷酸是随机寡核苷酸或包含随机寡核苷酸部分，例如，随机寡核苷酸部分的长度是至少5、10、15、20、25、30、35、40或更多个相连寡核苷酸或者长度如上文指定的寡核苷酸长度，或者至少10、20、30、40、50、60、70、80、90％或全部的核苷酸都是随机寡核苷酸；所述寡核苷酸在一或多个核苷酸残基上连接或偶联一个能改变该寡核苷酸特性的分子，例如更高的稳定性(比如在血清中的稳定性或在特定溶液中的稳定性)、血清反应下降、更高的细胞吸收、与病毒蛋白的相互作用更强、配制成进行递送的制剂的能力改善、有可检测信号、更好的药物代谢动力学特性、特异组织分布和/或毒性减弱。

我们还发现只(或至少主要)含有嘧啶(包括胞嘧啶和/或胸腺嘧啶和/或其他嘧啶)核苷酸的硫代磷酸酯化的ON能够抗低pH，多聚胞苷寡核苷酸显示出对多种核酶抗性提高，从而提供了口服给予抗病毒ON的两个重要特征。因此在一些实施方案中，所述寡核苷酸有至少80、90或95或100％经过修饰的核苷酸间连接键(例如硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯)，并且嘧啶含量超过50％、超过60％、超过70％、超过80％、超过90％或者是100％，即是一个嘧啶寡核苷酸；或者胞嘧啶含量超过50％、超过60％、超过70％、超过80％、超过90％或者是100％，即是一个多聚胞嘧啶寡核苷酸。在一些实施方案中，其长度有至少29、30、32、34、36、38、40、45、50、60、70或80个核苷酸，或者在20-28、25-35、29-40、30-40、35-45、40-50、45-55、50-60、55-65、60-70、65-75或70-80的范围内，或者在通过任取两个所列数值作为端点(包含端点)限定的范围内。在一个具体实施方案中，所述寡核苷酸有至少50，60，70，80或90％的胞嘧啶；至少50，60，70，80或90％的胸腺嘧啶(总的嘧啶含量可能如上所述)。在具体实施方案中，寡核苷酸含有所列举百分比的胞嘧啶或胸腺嘧啶，剩下的嘧啶核苷酸是胞嘧啶和胸腺嘧啶中的另一种。还有一些实施方案，寡核苷酸包括至少10，12，14，16，18，20，25，30，35，40或更多相连嘧啶核苷酸，例如象C核苷酸、T核苷酸、或者CT二核苷酸对。在一些实施方案中，所述嘧啶寡核苷酸仅由嘧啶核苷酸组成；包括至少1，2，3，4，5，6，7，8，9或10个非嘧啶部分；包括1-5，6-10，11-15或至少16个非嘧啶骨架部分；包括至少1个、1-20，1-5，6-10，11-15或16-20个非核苷酸部分；包括至少1个，1-20，1-5，6-10，11-15或16-20嘌呤核苷酸。优选的，在那些存在非核苷酸部分的实施方案中，这些部分之间的连接键或者这些部分与核苷酸之间的连接键对酸性条件的抗性是一个40聚体polyC寡核苷酸中的PS键的抗性的至少25，35，50，70，90或100％，这是在适合该寡核苷酸大小和化学组成的条件下通过凝胶电泳评价得出的。

所述寡核苷酸还可以联合使用，例如做成混合物。这类组合或混合物可以包括例如至少2、3、4、5、10、20、50、100、1000、10000、100000、1000000或更多种不同寡核苷酸，例如文中描述的寡核苷酸的任意组合。这类组合或混合物可以是例如，不同序列和/或不同长度和/或不同修饰和/或连接或偶联的分子不同。在关于这类组合或混合物的具体实施方案中，多条寡核苷酸具有如上文限定的寡核苷酸的最小长度或者长度范围。在关于这类组合或混合物的具体实施方案中，至少1种，多种或每一种寡核苷酸都可以具备文中描述的各个抗病毒寡核苷酸的任何其他特征(这些特征也可以是相容性的组合)。

在一些实施方案中，寡核苷酸的序列与任何相同长度的靶病毒基因组序列不是完全互补的，或者与靶病毒基因组序列中任何同样长度部分互补性低于95，90，80，70，60或50％，该寡核苷酸序列不是基本上由polyA、polyC、polyG、polyT、G四联体或富含TG的序列组成的。

与本发明寡聚物联系在一起使用时，名词″富含TG″表明抗病毒寡核苷酸的序列由至少50％的T和G核苷酸，或者指定至少60，70，80，90或95％T和G，或者甚至100％T和G组成。

在一个相关方面，本发明提供了抗病毒寡核苷酸的混合物，该混合物包括至少两种不同的文中描述的抗病毒寡核苷酸，例如至少2、3、4、5、7、10、50、100、1000、10,000、100,000、1,000,000或更多。

与寡核苷酸或其他物质联系在一起使用时，名词″抗病毒″是指寡核苷酸或其他物质在抑制病毒颗粒产生方面的效果，即在一个本来适合至少一种病毒形成感染性病毒颗粒的系统中，减少所形成的感染性病毒颗粒的数目。在本发明的一些实施方案，所述抗病毒寡核苷酸具有抗多种不同病毒的抗病毒活性。

名词″抗病毒寡核苷酸制剂″是指这样的制品，其包括至少一种抗病毒寡核苷酸并适合用作抗病毒试剂。所述制剂包括一种寡核苷酸或多种寡核苷酸，并含有不影响制剂在体内作为抗病毒试剂使用的其他物质。这些其他物质可以包括，但不限于稀释剂、赋形剂、载体物质和/或其他抗病毒物质。

本文中名词″药用组合物″是指包含生理上或可药用载体或赋形剂的抗病毒寡核苷酸制剂。这类组合物还可以包含其他成分，它们不会使得所述组合物不适合给予目标受试者，例如人。

在本发明的语境中，除非特别限定，名词″寡核苷酸(ON)″表示寡脱氧核苷酸(ODN)或寡脱氧核糖核苷酸或寡核糖核苷酸。因此″寡核苷酸″指核糖核苷酸(RNA)和/或脱氧核糖核苷酸(DNA)和/或它们的类似物的寡聚物或多聚体。这个名词包括由天然核碱基、糖基和共价核苷酸间(骨架)连接键构成的寡核苷酸，也包括功能类似的带有非天然部分的寡核苷酸。人们经常对这类经过修饰和取代的寡核苷酸的倾向超过其天然形式，因为前者具有人们希望的特性，象例如细胞吸收增加、对靶核酸亲和力提高以及在有核酶存在的情况下稳定性提高。可以利用的修饰的例子在文中有描述。包含骨架和/或其他修饰的寡核苷酸也可以被称为寡核苷酸。

在本文的语境中，短语″经过修饰的核苷酸间的连接″是指在寡核苷酸中，核苷酸或核苷酸类似物之间那些与天然多核苷酸中常见的磷酸二酯键所不同的连接。这类例子包括硫代磷酸酯键、二硫代磷酸酯键和甲基膦酸酯键。

关于寡核苷酸具体长度的限定描述，例如至少20个核苷酸长，意味着所述寡核苷酸包含至少20个连在一起的核苷酸。除非清楚地做出相反的说明，所述寡核苷酸可能还包括另外的非核苷酸部分，这些部分可能形成寡核苷酸链的骨架。除非另有说明，当骨架中存在非核苷酸部分时，连在一起的核苷酸中至少有10个是相邻的。

当与抗病毒制剂、药用组合物或其他物质联系在一起使用时，短语″适合用作抗病毒试剂″表示所述物质展示出抗病毒效果，并且不含有使得它不适合用于体内系统中抑制病毒产生的任何成分或物质，例如给予象人受试者这样的受试者。

在本文中与抗病毒寡核苷酸的抗病毒作用联系在一起使用时，″不依赖于序列的作用方式″表明某特定生物活性(例如抗病毒活性)不依赖于寡核苷酸中特定的寡核苷酸序列。例如所述活性不取决于象反义链那样的序列依赖性杂交，或者因为特定序列产生的序列依赖性适体相互作用。类似的，短语″非序列互补性作用方式″表明所述物质展示出抗病毒效果所凭借的机制不是因为与互补核酸序列发生杂交，例如象反义效果那样。相反，″序列互补性作用方式″意味着该物质的抗病毒效果涉及到互补核酸序列的杂交或序列特异性适体相互作用。因此，说某种物质的抗病毒活性是因为“不依赖序列的作用方式”或者其活性″主要不是因为序列互补作用方式″意味着该寡核苷酸的活性满足文中提供的四种检测中的至少一种(常见实施例10)。在具体实施方案中，所述寡核苷酸满足检测1、检测2、检测3、检测4或检测5；所述寡核苷酸满足两种检测的组合，即检测1和2、检测1和3、检测1和4、检测1和5、检测2和3、检测2和4、检测2和5、检测3和4、检测3和5或检测4和5；所述寡核苷酸满足三种检测的组合，即检测1、2和3，检测1、2和4，检测1、2和5，检测1、3和4，检测1、3和5，检测2、3和4，检测2、3和5，检测3、4和5；所述寡核苷酸满足全部检测1、2、3和4。

在文中与给予抗病毒物质联系在一起使用时，名词″受试对象″是指活的高等生物，包括例如动物，比如哺乳动物(例如人、非人灵长动物、牛、猪、羊、马、狗和猫)；鸟(鸟类)；和植物，例如果树。

本发明一个相关的方面涉及抗病毒寡核苷酸随机寡核苷酸或含有至少一种随机寡核苷酸的制剂，其中所述随机寡核苷酸的抗病毒活性主要是通过不依赖于序列的方式发生的，例如非序列互补性作用方式。这类随机寡核苷酸制剂可以例如包括长度不同的随机寡核苷酸的混合物，例如至少2、3、5、20或更多种长度不同的随机寡核苷酸的混合物，或者包括象文中描述的那些其他混合物。

在文中与寡核苷酸序列联系在一起使用时，名词″随机″描述了这样的序列或ON，其不与病毒mRNA互补，并且挑选的核苷酸使得它不会形成发夹结构，也不包含回文序列。当名词″随机″用在描述某寡核苷酸对特定病毒的抗病毒活性这样的语境时，暗示了该寡核苷酸对该特定病毒的病毒mRNA没有互补性。缺乏互补性可以是更广义上的，例如对多种病毒，对特定病毒家族中的病毒，或者对传染性人类病毒都没有互补性。

在本专利申请中，名词″随机寡核苷酸″是指每个位置都是摆动碱基(N)的单链DNA，比如NNNNNNNNNN。每个碱基都被合成为摆动碱基，所以该ON实际上是一群随机产生的大小基本相同的不同序列。我们知道制备这类随机寡核苷酸通常产生的大小是围绕特定长度分布的(主要是短一些长度)；除非清楚地说明是另外的情况，本文语境中这类制品被认为是特定长度的随机寡核苷酸。

名词″来源于病毒基因组″表明某个序列其核苷酸碱基序列与病毒基因组核苷酸序列或其互补链有至少70％同源性(例如相同或与该病毒基因组序列互补)，或者是对应的RNA序列。在本发明的具体实施方案中，该名词表明所述序列与特定病毒中该寡核苷酸所针对的病毒基因组序列，或其互补序列有至少70％同源性。在一些实施方案中，所述同源性是至少80、90、95、98、99或100％。

本发明还提供了抗病毒药用组合物，其包含治疗有效量的可药用文中所述抗病毒寡核苷酸或寡核苷酸的混合物，例如长度至少有6个核苷酸或者是文中列出的其他长度，其中该寡核苷酸的抗病毒活性主要通过不依赖于序列(例如非序列互补性)的作用方式发生；以及可药用载体。在具体实施方案中，所述寡核苷酸或寡核苷酸的组合物或混合物正如上文中具体描述的各个寡核苷酸或寡核苷酸的组合物或混合物。在具体实施方案中，所述药用组合物被批准给予人或非人动物，比如非人灵长动物。

在具体实施方案中，所述药用组合物适用于治疗、控制或预防那些病毒性疾病；适用于治疗、控制或预防朊病毒疾病；适用于通过眼内给药、口服、肠道给药、吸入、经皮肤、皮下、肌内、腹膜内、鞘内、气管内或静脉内注射、或者局部给药来进行递送。

在具体实施方案中，所述药用组合物配制成可以通过这样的方式来进行递送，所述方式选自，但不限于口服；口腔粘膜递送；鼻内滴液或喷雾；眼内注射；结膜下注射；滴眼液；滴耳液；通过吸入；气管内注射或喷雾；支气管内注射或喷雾；胸膜内注射；腹膜内注射、灌注或冲洗；鞘内注射或灌注；颅内注射或灌注；肌内注射；静脉内注射或灌注；动脉内注射或灌注；淋巴内注射或灌注；皮下注射或灌注；皮内注射；局部皮肤施用；通过手术过程中器官灌注、局部施用；肿瘤内注射；局部施用；胃部注射灌注或冲洗；肠道注射或灌注；结肠注射灌注或冲洗；直肠注射灌注或冲洗；通过直肠栓剂或灌肠剂；通过尿道栓剂或注射；膀胱内注射灌注或冲洗；或者关节内注射。

在具体实施方案中，所述组合物包括例如针对特异细胞或组织的递送系统；乳剂制剂；另一种抗病毒药物，例如非核苷酸抗病毒聚合物、反义分子、siRNA或小分子药物。

在具体实施方案中，所述抗病毒寡核苷酸、寡核苷酸制品、寡核苷酸制剂或抗病毒药用组合物对靶病毒(例如文中指出的任何特定的病毒或一组病毒中的病毒)的体外IC₅₀是10、5、2、1、0.50、0.20、0.10、0.09、0.08、0.07、0.75、0.06、0.05、0.045、0.04、0.035、0.03、0.025、0.02、0.015或0.01μM或更低。

在所述制剂、药用组合物、其预防或治疗用途、以及预防或治疗方法的具体实施方案中，所述组合物或制剂适用于治疗、控制或预防那些病毒性疾病；适用于治疗、控制或预防朊病毒疾病；适用于通过选自眼内给药、口服、肠道给药、吸入、或者经皮肤、皮下、肌内、或静脉内注射的方式来进行递送；进一步包含一个递送系统，该系统可以包含能提高和特异细胞亲和力的分子或者与这样的分子连在一起；再进一步包含相结合的至少一种其他抗病毒药物；并且/或者进一步包含相结合的抗病毒聚合物。

在具体实施方案中，所述药用组合物含有至少一种文中描述的多聚嘧啶寡核苷酸。考虑到有关多聚末端寡核苷酸抗低pH的发现；在一些实施方案中，这类组合物适用于递送到酸性体内部位，例如口服或阴道递送。

在关于用于口服的含多聚嘧啶寡核苷酸之组合物和制剂的具体实施方案中，所述组合物或制剂被制备成粉末、颗粒、微粒、纳米粒、在水或其他非水介质中的悬浮液或溶液、乳剂(例如微乳剂)、囊、胶囊、香囊、药片或小药片的形式。在一些实施方案中，还可以包含增稠剂、增味剂、稀释剂、乳化剂、分散剂或粘合剂。在一些实施方案中，所述口服制剂是将本发明的寡核苷酸与一或多种渗透增强剂表面活性剂和/或螯合剂一起来给药，这类表面活性剂和/或螯合剂是例如，但不限于脂肪酸和/或它们的酯或盐(例如花生四烯酸、十一烷酸、油酸、月桂酸、辛酸、癸酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、二癸酸酯、三癸酸酯、油酸单甘油酯、二月桂精、甘油1-单癸酸酯、1-十二烷基氮杂环庚烷-2-酮、脂酰肉碱、脂酰胆碱、或甘油一酸酯、甘油二酯或其可药用盐类(例如钠盐)、胆汁酸和/或其盐(例如，鹅脱氧胆酸(CDCA)和熊脱氧胆酸(UDCA)、胆酸、脱氢胆酸、脱氧胆酸、葡糖胆酸(glucholic acid)、甘氨胆酸、甘氨脱氧胆酸、牛磺胆酸、牛磺脱氧胆酸、牛-24，25-二氢-梭链孢酸钠、甘氨二氢梭链孢酸钠)。一些实施方案包括渗透增强剂组合，例如脂肪酸/盐与胆汁酸/盐结合使用，比如月桂酸、癸酸的钠盐和UDCA结合使用。进一步的示范性渗透增强剂包括聚氧化乙烯-9-月桂乙醚和聚氧化乙烯-20-十六烷乙醚。

在具体实施方案中本发明的寡核苷酸被制备成颗粒形式(包括用于喷雾的干颗粒)或者络合形成微粒或纳米粒，其中使用的络合剂选自，但不限于多聚氨基酸；多聚亚胺；聚丙烯酸酯；聚烷基丙烯酸酯、聚氧乙烷、聚烷基氰基丙烯酸酯；阳离子化的明胶、清蛋白、淀粉、丙烯酸酯、聚乙二醇(PEG)和淀粉；聚烷基氰基丙烯酸酯；DEAE衍生的聚亚胺、pollulans、纤维素，和淀粉，或者更具体地说选自壳聚糖、N-三甲基壳聚糖、聚-L-赖氨酸、聚组氨酸、聚鸟氨酸、聚精胺、鱼精蛋白、聚乙烯吡啶、聚硫代二乙基氨基-甲基乙烯P(TDAE)、聚氨苯乙烯(例如p-氨基)、聚甲基氰基丙烯酸酯、聚乙基氰基丙烯酸酯、聚丁基氰基丙烯酸酯、聚异丁基氰基丙烯酸酯、聚异己基氰基丙烯酸酯、DEAE-异丁烯酸酯、DEAE-己基丙烯酸酯、DEAE-丙烯酰胺、DEAE-清蛋白和DEAE-葡聚糖、聚甲基丙烯酸酯、聚己基丙烯酸酯、聚(D，L-乳酸)、聚DL-乳酸-聚乙醇酸(DL-lactic-co-glycolic acid(PLGA)、褐藻酸盐和聚乙二醇(PEG)。

在具体实施方案中，所述组合物适用于阴道给药。在这类实施方案中，该组合物可以制备成，但不限于药片、溶液、乳膏、凝胶、栓剂的形式。

在具体实施方案中，所述组合物适用于局部给药。

用在本文中，名词″多聚嘧啶寡核苷酸″或者″嘧啶寡核苷酸″意味着含有50％以上的嘧啶核苷酸的寡核苷酸。

与本发明所述寡核苷酸和组合物的体内给药联系在一起使用时，名词″酸性部位″意味着pH低于7的部位。这类的例子包括胃(pH通常在1-2)，阴道(pH通常在4-5，但可能更低)，以及从更轻程度上来说，皮肤(pH通常在4-6)也是。

本文中短语″适用于经口递送″及类似名词表明所述组合物能有效地抵抗酸性pH，从而可以经口给药，而不会在临床上过度损伤活性，例如由胃里酸性环境造成的过度首次通过损失低于50％(或者是指定的，低于40％、30％、20％、10％或5％)。

本文中短语″适用于阴道给药″及类似名词表明所述组合物被制备成在恰当给予时，组合物不会降解到临床上不能接受的程度(例如滞留一定的时间后低于50％、40％、30％、20％、10％或5％)，而是大体上在阴道内(除去已被吸收的物质)保留至少1小时(或者如果指定至少2小时、4小时、8小时、12小时、1天或2天)。这种滞留可能是许多因素之一或几种因素结合在一起导致的，例如因为物理结构或粘性等等。

在文中与抗病毒寡核苷酸和制剂等联系在一起用来指特定病毒或一组病毒时，名词″靶向″表明所述寡核苷酸是选择出来抑制该病毒或病毒组的。与特定组织或细胞型联系在一起使用时，该名词表明所述寡核苷酸、制剂或递送系统优选在特定组织或细胞类型中或者附近存在和/或显示抗病毒效果。

本文中名词″递送系统″是指这样的一种或多种成分，其在与寡核苷酸(例如反义寡聚物、siRNA或文中描述的寡核苷酸)结合时，相比没有该递送系统，能够使得寡核苷酸与预期的体内部位发生接触的量提高例如至少20、50或100％及以上；和/或使它们保留在靶部位的时间延长例如至少20、50或100％及以上；并且/或者能防止或减少所述寡核苷酸引起副作用的相互作用。

在文中与抗病毒剂和其他药物或检测化合物联系在一起使用时，名词″小分子″意味着该分子的分子量是1500道尔顿或更低。在一些情况中，其分子量为1000、800、600、500、400道尔顿或更低。

另一方面，本发明提供了这样的试剂盒，其在带标签的包装中包括至少一种抗病毒寡核苷酸、抗病毒寡核苷酸混合物、抗病毒寡核苷酸制剂或者包含所述寡核苷酸、寡核苷酸混合物或寡核苷酸制剂的抗病毒药用组合物，其中所述寡核苷酸的抗病毒活性主要是通过不依赖于序列，例如非序列互补作用方式发生的，并且包装上的标签表明该抗病毒寡核苷酸可以用于抗至少一种病毒。

在具体实施方案中，所述试剂盒包含的药用组合物包括至少一种文中描述的抗病毒寡核苷酸。在一个实施方案中，所述试剂盒含有至少两种不同抗病毒寡核苷酸的混合物。在一个实施方案中，所述抗病毒寡核苷酸适用于在动物体内使用和/或标签上显示该寡核苷酸或组合物可接受并且/或者批准用于动物；所述动物是哺乳动物(比如人)，或者非人哺乳动物(比如牛、猪、反刍动物、羊或马)；所述动物是非人的动物；所述动物是鸟，该试剂盒是被管理机构(比如U.S.Food and Drug Administration或相当的机构)批准在动物(比如人)中使用的。

另一个方面，本发明提供了选择抗病毒寡核苷酸，例如非序列互补性抗病毒寡核苷酸作为抗病毒剂的方法。所述方法涉及合成多种不同的随机寡核苷酸，测试寡核苷酸抑制病毒产生感染性病毒粒子的能力，以及选择具有可药用活性水平的寡核苷酸作为抗病毒试剂。

在具体实施方案中，所述不同的随机寡核苷酸包含长度不同的随机寡核苷酸；所述随机寡核苷酸可以有不同序列或者有共同序列，比如最短寡核苷酸的序列；和/或不同的随机寡核苷酸包含多种寡核苷酸，这些寡核苷酸含有一个至少5个核苷酸长的随机寡核苷酸片段；或者不同的随机寡核苷酸包括多种不同长度的随机寡核苷酸。其他寡核苷酸，例如象文中描述的抗病毒寡核苷酸，可以在特定系统中进行检测。

再一个方面，本发明提供了一种在受试者中预防或治疗病毒感染的方法，所述方法是给予需要这一治疗的受试者以治疗有效量的至少一种文中描述的可药用寡核苷酸(例如至少6个核苷酸长的非序列互补性寡核苷酸)，或者含有所述寡核苷酸的抗病毒药用组合物或制剂或混合物。在进一步的实施方案中，发明提供了在受试者中预防或治疗病毒感染的用途，所述用途是给予需要这一治疗的受试者以治疗有效量的至少一种文中描述的可药用寡核苷酸(例如至少6个核苷酸长的非序列互补性寡核苷酸)，或者含有所述寡核苷酸的抗病毒药用组合物或制剂或混合物。在具体实施方案中，所述病毒可以是任何文中列出的适合用本发明来进行抑制的病毒；所述感染与文中指出的和病毒感染相关的疾病或状况有关；所述受试者是文中指出的一类受试者，例如人、非人动物、非人哺乳动物、鸟、植物等；所述治疗是针对病毒性疾病或具有病毒病原学的疾病，例如象本文发明背景部分说明的疾病。

再一方面，本发明提供了在受试者体内酸性环境预防或治疗病毒感染的方法，该方法包括将治疗有效量的至少一种发明所述可药用抗病毒药用组合物给予需要这一治疗的受试者，其中所述组合物是适用于给予体内酸性部位的。

还有一个方面，本发明提供了在受试者体内酸性环境预防或治疗病毒感染的用途，该用途包括将治疗有效量的至少一种发明所述可药用抗病毒药用组合物给予需要这一治疗的受试者，其中所述组合物是适用于给予体内酸性部位的。

在具体实施方案中，用本文描述的抗病毒寡核苷酸(或寡核苷酸制剂或药用组合物)进行给药；给药如文中所述；采用了文中描述的递送系统或方法；所述病毒感染是DNA病毒或RNA病毒感染；所述病毒是细小病毒科(parvoviridae)、乳多空病毒科(papovaviridae)、腺病毒科(adenoviridae)、疱疹病毒科(herpesviridae)、痘病毒科(poxviridae)、嗜肝DNA病毒科(hepadnaviridae)或乳头瘤病毒科(popillomaviridae；所述病毒是沙粒病毒科(arenaviridae)、布尼亚病毒科(bunyaviridae)、杯状病毒科(calciviridae)、冠状病毒科(coronaviridae)、线状病毒科(filoviridae)、黄病毒科(flaviridae)、正粘病毒科(orthomyxoviridae)、副粘病毒科(paramyxoviridae)、小RNA病毒科(picornaviridae)、呼肠病毒科(reoviridae)、弹状病毒科(rhabdoviridae)、逆转录病毒科(retroviridae)或披膜病毒科(togaviridae)；所述疱疹病毒是EBV、HSV-1、HSV-2、CMV、VZV、HHV-6、HHV-7或HHV-8；所述病毒是HIV-1或HIV-2；所述病毒是呼吸道合胞病毒(RSV)；所述病毒是副流感病毒病毒；所述病毒是流感病毒，例如甲型流感病毒；所述病毒是HBV；所述病毒是天花病毒(smallpox virus)或痘苗病毒(vaccinia virus)；所述病毒是冠状病毒(coronavirus)；所述病毒是SARS病毒；所述病毒是西尼罗病毒(West NileVirus)；所述病毒是汉坦病毒(Hantavirus)；所述病毒是副流感病毒；所述病毒是柯萨奇病毒(coxsackievirus)；所述病毒是鼻病毒(rhimovirus)；所述病毒是黄热病毒(yellow fever virus)；所述病毒是登革热病毒(dengue virus)；所述病毒是丙型肝炎病毒；所述病毒是埃博拉病毒(Ebola virus)；所述病毒是马尔堡病毒(Marburg virus)；所述病毒是拉沙热病毒(Lassa fever virus)；所述病毒是水痘带状疱疹病毒(Varicella Zoster Virus)；所述病毒是EB病毒；所述病毒是人疱疹病毒6A或6B；所述病毒是HBV病毒；所述病毒是副流感病毒；所述病毒是人类偏肺病毒(metapneumovirus)；所述病毒是裂谷热病毒(Rift Valley fever virus)；所述病毒是克里米亚-刚果出血热病毒(CrimeanCongo Hemorrhagic Fever virus)、所述病毒是西方马脑炎病毒(Western EquineEncephalitis virus)。

在一个具体实施方案中，本发明的寡核苷酸的目标是流感病毒。

在具体实施方案中，所述寡核苷酸是多聚嘧啶寡核苷酸(或含有这种多聚嘧啶寡核苷酸的制剂或药用组合物)，其可能适用于象例如文中描述的那样口服或阴道给药。

类似的，在相关方面，本发明提供了一种在人或动物中预防或治疗由致癌病毒导致的癌症的方法，所述方法是给予需要这一治疗的人或动物以可药用治疗有效量至少一种随机寡核苷酸(至少6个核苷酸长或其他本文描述的长度)，或者含有所述寡核苷酸的制剂或药用组合物。在一个实施方案中，给予的是本发明的寡核苷酸的混合物。

类似的，在相关方面，本发明提供了一种在人或动物中预防或治疗由致癌病毒导致的癌症的方法，所述方法是给予需要这一治疗的人或动物以可药用治疗有效量至少一种随机寡核苷酸(至少6个核苷酸长或其他本文描述的长度)，或者含有所述寡核苷酸的制剂或药用组合物。在一个实施方案中，给予的是本发明的寡核苷酸的混合物。

在具体实施方案中，其中的寡核苷酸是如文中描述的本发明的寡核苷酸，例如其长度如文中所描述；使用了如文中所描述的给药方法；利用了文中描述的用途；采用了文中描述的递送系统。

名词″治疗有效量″是指这样的用量，在给予目标类型中的典型受试者时，这个用量足够使得感染性病毒颗粒的产生从治疗或预防上来说明显减少。在涉及到将抗病毒寡核苷酸给予受试者的方面，通常所述寡核苷酸、制剂或组合物都应当以治疗有效量来进行给药。

在一些涉及到文中描述的寡核苷酸制剂、药用组合物、治疗和预防方法以及/或者治疗和预防用途的实施方案中，所述具有不依赖于序列的作用方式的寡核苷酸与转染剂不相联系；该具有不依赖于序列的作用方式的寡核苷酸没有被包裹在脂质体和/或非脂质体的油脂粒中。在一些实施方案中，所述具有不依赖于序列的作用方式的寡核苷酸含在药用组合物中；或者是与这样的抗病毒寡核苷酸联合(同时或顺序地)给药，后一种寡核苷酸主要是通过序列依赖性作用方式发挥作用，例如反义寡核苷酸或siRNA。其中具有序列依赖性作用方式的寡核苷酸可以连接转染剂，并且/或者包裹在脂质体中和/或非脂质体的油脂粒中。

另一方面，不依赖于序列(例如非序列互补性)的相互作用能产生有效的抗病毒活性这样的发现，提供了一种筛选方法，该方法可以用于鉴定能改变寡核苷酸与象一或多种病毒蛋白质(例如从感染宿主生物的病毒培养物中提取或纯化的，或者通过重组方法制备的)这类的病毒成分之间的结合的化合物。例如，所述方法可能涉及确定被检测化合物是否能减弱寡核苷酸与一或多种病毒成分之间的结合。

本文中名词″筛选″是指对多种化合物进行检验来确定它们是否具备所需特性。所述多种化合物可以是例如至少10、100、1000、10000或更多种被检测化合物。

在具体实施方案中，任何检验形式和探测方法都可以用来鉴定这种结合上的改变，例如通过在有和没有待筛选化合物的情况下(例如在分别的反应中)，将所述寡核苷酸与病毒成分进行接触，并确定与没有该化合物的情况相比，有该化合物时，寡聚物和病毒成分之间的结合是否有所不同。存在不同就表明该化合物改变了随机寡核苷酸与病毒成分的结合。替代地，可以利用竞争置换方法，使寡核苷酸结合到病毒成分上，确定加入待测化合物是否会发生置换，或者反过来，使待测化合物结合上，确定加入的寡核苷酸能否将之取代。

在具体实施方案中，其中的寡核苷酸如文中描述的抗病毒寡核苷酸；该寡核苷酸至少有6，8，10，15，20，25，29，30，32，34，36，38，40，46，50，60，70，80，90，100，110或120个核苷酸长，或者是至少文中指定的抗病毒寡核苷酸的另一个长度，或者是处于任取前面两个数值作为端点(包括这两个端点)构成的范围内；待测化合物时小分子；待测化合物的分子量低于400，500，600，800，1000，1500，2000，2500，或3000道尔顿，或者是处于任取前面两个数值作为端点(包括这两个端点)构成的范围内；所述病毒提取物或成分来自文中列出的病毒；至少筛选了100、1000、10000、20000、50000或100000种化合物；所述寡核苷酸具有的体外IC₅₀等于或低于10，5，2，1，0.500，0.200，0.100，0.075，0.05，0.045，0.04，0.035，0.03，0.025，0.02，0.015或0.01μM。

本发明进一步提供了表21所描述的寡核苷酸。

本发明进一步提供了如REP 1001，REP 2001，REP 3007，REP 2004，REP 2005，REP 2006，REP 2007，REP 2008，REP 2017，REP 2018，REP 2020，REP 2021，REP 2024，REP 2036，A20，G20，C20，REP 2029，REP 2031，REP2030，REP 2033，REP 2055，REP 2056，REP 2057，REP 2060和REP 2107所示的抗病毒寡核苷酸。

本文中名词″病毒成分″是指由病毒编码的，或者因为病毒感染而由被感染宿主细胞产生的产品。这类成分可以包括蛋白质和其他生物分子。这类病毒成分，可以例如得自病毒培养物、被感染生物(例如动物和植物)，或者在重组系统(原核生物和真核生物)中从病毒序列产生，还可以是具有对应于病毒编码的蛋白质的氨基酸序列的合成蛋白。名词″病毒培养物提取物″是指从感染了病毒的细胞得到的提取物，该提取物会包括病毒特异性的产物。类似的，″病毒蛋白质″是指病毒特异性蛋白质，即通常由病毒编码，但因为病毒感染而也可以至少部分由宿主序列编码。

在一个相关方面，本发明提供了通过前面描述的方法鉴定到的抗病毒化合物，例如一种新的抗病毒化合物。

更进一步的方面，本发明提供了从寡核苷酸集合中纯化结合了至少一种病毒成分的寡核苷酸之方法，该方法是通过使所述集合与例如至少一种结合到固定相介质上的病毒成分进行接触，并收集与病毒成分结合的寡核苷酸。通常，收集步骤包括将寡核苷酸从病毒成分上置换下来。所述方法还可以包括对收集到的寡核苷酸(即结合到病毒蛋白质上的寡核苷酸)进行测序和/或检测其抗病毒活性。

在具体实施方案中，通过适当的方法，例如利用离子置换剂从固定相介质上将集合中结合的寡核苷酸置换下来，并收集置换下来的寡核苷酸。对各种置换方法一般来说，可以以严紧性逐渐提高的方式(例如浓度渐高的置换剂，比如逐渐增加盐浓度使之形成阶梯性或连续性梯度)进行置换，因此所述寡核苷酸通常以结合亲和力渐强的顺序被置换。许多情况中，做低严紧性清洗来除去微弱结合的寡核苷酸，然后收集含有被置换下来的结合较强之寡核苷酸的一或多个流份。一些情况中，可能希望挑选出含有结合非常紧密的寡核苷酸流份(例如通过更严紧置换条件得到的流份中的寡核苷酸)留做后用。

类似的，本发明提供了一种从寡核苷酸集合中富集结合了至少一种病毒成分的寡核苷酸之方法，该方法是通过使所述集合与一或多种病毒蛋白质进行接触，扩增结合了病毒成分的寡核苷酸以便得到富集的寡核苷酸集合。接触和扩增步骤可以进行多轮，例如用前一轮得到的富集寡核苷酸集合作为下一轮的寡核苷酸集合来再做至少1，2，3，4，5，10或更多次。该方法还可以包括在一或多轮接触和扩增之后，对富集寡核苷酸集合中的寡核苷酸进行测序和抗病毒活性检测。

所述方法可以包括用任何一种技术从病毒成分(例如结合到固定相介质上的病毒蛋白)上置换寡核苷酸，比如如前所述的例如利用置换剂。如上文提到的，选择结合更紧密的寡核苷酸来进一步利用，例如用于进一步的结合和扩增可能是有利的。所述方法可以进一步包括选择一或多种富集的寡核苷酸(例如高亲和力寡核苷酸)做其他用途。在具体实施方案中，选择过程可以包括除去那些其序列与特定目标病毒的宿主基因组序列(例如人)互补的寡核苷酸。这种去除可以包括将所述寡核苷酸序列与序列数据库中特定宿主的序列进行比较，例如利用序列比对程序(例如BLAST搜索)，并将那些其序列与宿主序列相同或达到某个程度的同源性的寡核苷酸删除。去除这类宿主互补序列和/或挑选一或多种与宿主序列不互补的寡核苷酸也可以在本发明的其他方面进行。

在上述鉴定、纯化或富集寡核苷酸的方法中，所述寡核苷酸可以是本文描述的任何类型的寡核苷酸。以上方法有利于例如从一个寡核苷酸随机寡核苷酸产品中鉴定、纯化或富集高亲和力寡核苷酸。

在相关方面，本发明涉及到包括一或多种寡核苷酸的抗病毒寡核苷酸制品，其中所述寡核苷酸是采用上述鉴定、获取或纯化抗病毒寡核苷酸的方法从一个起始寡核苷酸集合中鉴定到的，并且该寡核苷酸制品中的寡核苷酸对一或多种病毒蛋白的平均结合亲和力比起始寡核苷酸集合中的寡核苷酸与这些蛋白的平均结合亲和力要高。

在具体实施方案的，所述寡核苷酸的平均结合亲和力是起始寡核苷酸集合中的寡核苷酸的平均结合亲和力的至少2倍、3倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍，甚至更多；结合亲和力中值相对起始寡聚物集合的结合亲和力中值要高至少2倍、3倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍，此处中值是指中间数值。

再一个方面，本发明提供了包括至少一种抗病毒寡核苷酸和至少一种非核苷酸抗病毒聚合物的抗病毒聚合物混合体。在具体实施方案中，所述寡核苷酸如文中描述的抗病毒寡核苷酸，并且/或者所述抗病毒聚合物如文中所描述的或者是本领域已知或随后鉴定的。

再一方面，本发明提供了寡核苷酸随机寡核苷酸，其中该随机寡核苷酸至少6个核苷酸长。在具体实施方案中，所述随机寡核苷酸长度如以上限定的抗病毒寡核苷酸的长度；该随机寡核苷酸包括至少一个硫代磷酸酯键，该随机寡核苷酸包括至少一个二硫代磷酸酯键或其他文中列出的修饰；所述随机寡核苷酸寡核苷酸包括至少一个非随机寡核苷酸片段(比如与选定病毒核酸序列互补的片段)，其长度如以上限定的寡核苷酸的长度；所述随机寡核苷酸包含在一种制品或制品集合中，该制品或集合含有至少5、10、15、20、50、100、200、500或700微摩尔，1、5、7、10、20、50、100、200、500或700毫摩尔，或1摩尔随机寡核苷酸，或者是从以上任取两个不同数值作为端点(包括这两个端点)构成的范围，或者是按列举的任一水平或水平范围合成的。

同样的，本发明提供了通过合成至少一种随机寡核苷酸(例如如上所述的随机寡核苷酸)来制备抗病毒随机寡核苷酸的方法。

正如上文指出的，对于任何涉及病毒感染或病毒感染可能性或者靶向到特定病毒的方面，在具体实施方案中，所述病毒如上文列举的那些病毒。

″人和动物病毒″意味着包括，但不限于，通常的DNA和RNA病毒。DNA病毒包括，例如细小病毒、乳多空病毒、腺病毒、疱疹病毒、痘病毒、嗜肝DNA病毒和乳头瘤病毒。RNA病毒包括，例如沙粒病毒、布尼亚病毒、杯状病毒、冠状病毒、线状病毒、黄病毒、正粘病毒、副粘病毒、小RNA病毒、呼肠病毒、弹状病毒、逆转录病毒或披膜病毒。

关系到通过连接或偶联上另一个分子或部分来改变寡核苷酸的特性时，特性的变化要相对于没有连接和偶联分子或部分的相同寡核苷酸来进行评价。

其他实施方案由发明详述和权利要求可以明显看出。

优选实施方案详述

本发明涉及以不依赖于序列的机制发挥作用的抗病毒寡核苷酸的鉴定和使用，还包括这样的发现，即对于许多病毒来说，较大的寡核苷酸其抗病毒活性更高，通常最佳的是有40个或更多个核苷酸长的寡核苷酸。

与本发明相一致地，还提供了包含至少一个经过修饰的核苷酸间连接键的寡核苷酸，其中该寡核苷酸具有抗靶病毒的抗病毒活性，所述活性主要通过不依赖于序列的作用方式进行。

与本发明相一致地，还提供了这样的寡核苷酸，在该寡核苷酸中有至少50％核苷酸在其核糖部分的2′位置被修饰，至少50％的核苷酸间连接键被修饰，其中所述寡核苷酸具有抗靶病毒的抗病毒活性，且所述活性主要以不依赖于序列的作用方式进行的。在一个实施方案中，修饰分别占50％和80％。在一个实施方案中，分别占80％和80％。在一个实施方案中，分别是90％和90％。在一个实施方案中，分别是100％和100％。

长度及非自身互补性

本发明进一步提供的寡核苷酸至少15个核苷酸长。在一个实施方案中，至少20个核苷酸长。在一个实施方案中，至少25个核苷酸长。在一个实施方案中，至少30个核苷酸长。在一个实施方案中，至少35个核苷酸长。在一个实施方案中，至少40个核苷酸长。在一个实施方案中，至少45个核苷酸长。在一个实施方案中，至少50个核苷酸长。在一个实施方案中，至少60个核苷酸长。在一个实施方案中，至少80个核苷酸长。

本发明进一步提供的寡核苷酸有20-30个核苷酸长。在一个实施方案中，30-40个核苷酸长。在一个实施方案中，40-50个核苷酸长。在一个实施方案中，50-60个核苷酸长。在一个实施方案中，60-70个核苷酸长。在一个实施方案中，70-80个核苷酸长。

本发明进一步提供了这样的寡核苷酸，该寡核苷酸不含有超过5个相邻核苷酸长的自身互补序列。在一个实施方案中，不含有超过10个相邻核苷酸长的自身互补序列。在一个实施方案中，不含有超过20个相邻核苷酸长的自身互补序列。

本发明进一步提供了不具有催化活性的寡核苷酸。

随机

本发明进一步提供了具有抗靶病毒抗病毒活性的寡核苷酸，所述寡核苷酸的序列与所述靶病毒的基因组序列中的任何相同长度片段都不互补。

本发明进一步提供了一种寡核苷酸，其中所述寡核苷酸与人病原病毒的基因组序列中的任何相同长度片段都不互补。

本发明进一步提供了一种寡核苷酸，其中所述寡核苷酸与截至2005年1月1日测定的人病原病毒的基因组序列中的任何相同长度片段都不互补。

本发明进一步提供了一种寡核苷酸，其中所述寡核苷酸与人基因组序列中的任何相同长度片段都不互补。

本发明进一步提供了一种寡核苷酸，其中所述寡核苷酸与一或多种动物的基因组序列中的任何相同长度片段都不互补，所述动物选自牛、马、猪、羊、鸟、狗、猫和鱼。

RNA和其他链部分的限定

本发明进一步提供了其至少30％核苷酸是核糖核苷酸的寡核苷酸。在一个实施方案中，至少50％的核苷酸是核糖核苷酸。在一个实施方案中，至少70％的核苷酸是核糖核苷酸。在一个实施方案中，至少80％的核苷酸是核糖核苷酸。在一个实施方案中，至少90％的核苷酸是核糖核苷酸。在一个实施方案中，所有核苷酸都是核糖核苷酸。

本发明进一步提供了包含1-4个非核苷酸链部分的寡核苷酸。

随机寡核苷酸

本发明进一步提供了包含至少10个相邻核苷酸的随机寡核苷酸序列的寡核苷酸。在一个实施方案中，至少20个核苷酸的随机寡核苷酸序列。在一个实施方案中，至少30个核苷酸的随机寡核苷酸序列。在一个实施方案中，至少40个核苷酸的随机寡核苷酸序列。

本发明进一步提供了一种寡核苷酸，其中该寡核苷酸是随机寡核苷酸寡核苷酸。

同聚物(homopolymer)

本发明进一步提供了这样一种寡核苷酸，该寡核苷酸包含一个有至少10个相邻A核苷酸的同聚物序列。在一个实施方案中，有至少10个相邻T核苷酸。在一个实施方案中，至少10个相邻U核苷酸。在一个实施方案中，至少10个相邻C核苷酸。在一个实施方案中，至少10个相邻G核苷酸。在一个实施方案中，至少10个相邻I核苷酸类似物。

异源二聚体(heterodimers)

本发明进一步提供的寡核苷酸，包含一个至少10个核苷酸长的polyAT序列；在一个实施方案中，包含一个至少10个核苷酸长的polyAC序列。在一个实施方案中，包含一个至少10个核苷酸长的polyAG序列。在一个实施方案中，包含一个至少10个核苷酸长的polyAU序列。在一个实施方案中，包含一个至少10个核苷酸长的polyAI序列。在一个实施方案中，包含一个至少10个核苷酸长的polyGC序列。在一个实施方案中，包含一个至少10个核苷酸长的polyGT序列。在一个实施方案中，包含一个至少10个核苷酸长的polyGU序列。在一个实施方案中，包含一个至少10个核苷酸长的polyGI序列。在一个实施方案中.包含一个至少10个核苷酸长的polyCT序列。在一个实施方案中，包含一个至少10个核苷酸长的polyCU序列。在一个实施方案中.包含一个至少10个核苷酸长的polyCI序列。在一个实施方案中.包含一个至少10个核苷酸长的polyTI序列。

经过修饰的连接键，包括ps和ps2

本发明进一步提供了这样的寡核苷酸，其中经过修饰的连接键选自硫代磷酸酯键、二硫代磷酸酯键和硼磷酸酯键。

本发明进一步提供了这样的寡核苷酸，其中至少50％的核苷酸间连接键是经过修饰的连接键。在一个实施方案中，至少80％的核苷酸间连接键是经过修饰的连接键。在一个实施方案中，至少90％的核苷酸间连接键是经过修饰的连接键。在一个实施方案中，所有核苷酸间连接键都是经过修饰的连接键。

本发明进一步提供了这样的寡核苷酸，其中至少50％的核苷酸间连接键是硫代磷酸酯键。在一个实施方案中，至少80％的核苷酸间连接键是硫代磷酸酯键。在一个实施方案中，至少90％的核苷酸间连接键是硫代磷酸酯键。在一个实施方案中，所有核苷酸间连接键都是硫代磷酸酯键。

本发明进一步提供了这样的寡核苷酸，其中至少50％的核苷酸间连接键是二硫代磷酸酯键。在一个实施方案中，至少80％的核苷酸间连接键是二硫代磷酸酯键。在一个实施方案中，所有核苷酸间连接键都是二硫代磷酸酯键。

2′-修饰，结合经过修饰的连接键

本发明进一步提供了一种寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含至少一个硫代磷酸酯键。在一个实施方案中，其中所述寡核苷酸包含至少10％的硫代磷酸酯键。在一个实施方案中，其中所述寡核苷酸包含至少20％硫代磷酸酯键。

在一个实施方案中，其中所述寡核苷酸的至少50％核苷酸在其核糖部分2′位置被修饰。在一个实施方案中，其中所述寡核苷酸的至少60％核苷酸在其核糖部分2′位置被修饰。在一个实施方案中，其中所述寡核苷酸的至少70％核苷酸在其核糖部分2′位置被修饰。在一个实施方案中，其中所述寡核苷酸的至少80％核苷酸在其核糖部分2′位置被修饰。在一个实施方案中，其中所述寡核苷酸的至少90％核苷酸在其核糖部分2′位置被修饰。在一个实施方案中，其中所述寡核苷酸的100％核苷酸在其核糖部分2′位置被修饰。

本发明进一步提供了这样的寡核苷酸，其中至少50％的核苷酸间连接键是经过修饰的，并且所述寡核苷酸中至少50％的核苷酸在其核糖部分的2′位置被修饰。在一个实施方案中，至少60％的核苷酸间连接键是经过修饰的，并且所述寡核苷酸中至少60％的核苷酸在其核糖部分的2′位置被修饰。在一个实施方案中，至少70％的核苷酸间连接键是经过修饰的，并且所述寡核苷酸中至少70％的核苷酸在其核糖部分的2′位置被修饰。在一个实施方案中，至少80％的核苷酸间连接键是经过修饰的，并且所述寡核苷酸中至少80％的核苷酸在其核糖部分的2′位置被修饰。在一个实施方案中，所有核苷酸间连接键都经过修饰，并且所述寡核苷酸中所有核苷酸在其核糖部分的2′位置都被修饰。

本发明进一步提供了这样的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的至少15％核苷酸在其核糖部分2′位置包含2′-OMe部分。在一个实施方案中，其中所述寡核苷酸的至少20％核苷酸在其核糖部分2′位置包含2′-OMe部分。在一个实施方案中，其中所述寡核苷酸的至少30％核苷酸在其核糖部分2′位置包含2′-OMe部分。在一个实施方案中，其中所述寡核苷酸的至少50％核苷酸在其核糖部分2′位置包含2′-OMe部分。在一个实施方案中，其中所述寡核苷酸的至少60％核苷酸在其核糖部分2′位置包含2′-OMe部分。在一个实施方案中，其中所述寡核苷酸的至少70％核苷酸在其核糖部分2′位置包含2′-OMe部分。在一个实施方案中，其中所述寡核苷酸的至少80％核苷酸在其核糖部分2′位置包含2′-OMe部分。在一个实施方案中，其中所述寡核苷酸的至少90％核苷酸在其核糖部分2′位置包含2′-OMe部分。在一个实施方案中，其中所述寡核苷酸的全部核苷酸在其核糖部分2′位置包含2′-OMe部分。

其他特性(Misc.Characteristics)

本发明进一步提供了这样的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸是由两个或更多个通过接头连在一起的寡核苷酸构成的多联体。

本发明进一步提供了这样的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸在一或多个核苷酸残基上连接或偶联一个能改变该寡核苷酸特性的分子，以便获得一或多个选自以下的特性：更高的稳定性、血清反应下降、更高的细胞吸收、与病毒蛋白的相互作用更强、做成用于递送的制剂的能力改善、有可检测信号、更高的抗病毒活性、更好的药物代谢动力学特性、特异组织分布和毒性减弱。

本发明进一步提供了这样的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸是双链的。本发明进一步提供了一种寡核苷酸，该寡核苷酸是双链或单链的，并包含至少一个可以通过非watson-crick相互作用进行杂交的碱基。

本发明进一步提供了一种寡核苷酸，所述寡核苷酸包含与病毒mRNA互补的部分。

本发明进一步提供了一种寡核苷酸，该寡核苷酸能够结合一或多种病毒成分。

本发明进一步提供了一种寡核苷酸，其中所述寡核苷酸能与一或多种宿主成分相互作用，这种相互作用导致病毒活性或病毒的产生被抑制。

本发明进一步提供了一种寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的至少一部分序列来源于病毒基因组。

本发明进一步提供了这样的寡核苷酸，其中该寡核苷酸的至少一部分序列来源于病毒基因组，并且具备主要以非序列互补性作用方式发生的抗病毒活性。

本发明进一步提供了这样的寡核苷酸，该寡核苷酸的至少一部分序列来源于病毒包装序列或其他参与适体相互作用的病毒序列。

本发明进一步提供了一种寡核苷酸，所述寡核苷酸的至少一部分序列参与和病毒成分或者宿主成分或这两者之间的适体相互作用。

活性水平

本发明进一步提供了一种寡核苷酸，该寡核苷酸对靶病毒的IC₅₀是0.10μM或更低。在一个实施方案中，所述寡核苷酸对靶病毒的IC₅₀是0.05μM或更低。在一个实施方案中，所述寡核苷酸对靶病毒的IC₅₀是0.025μM或更低。在一个实施方案中，所述寡核苷酸对靶病毒的IC₅₀是0.015μM或更低。

靶病毒

本发明进一步提供了一种寡核苷酸，其中该寡核苷酸的目标是DNA病毒。在一个实施方案中，目标是RNA病毒。在一个实施方案中，靶病毒是疱疹病毒科的成员。在一个实施方案中，所述病毒是HSV-1。在一个实施方案中，是HSV-2。在一个实施方案中，是CMV。在一个实施方案中，是嗜肝DNA病毒科的成员。在一个实施方案中，是HBV。在一个实施方案中，是乳多空病毒科成员。在一个实施方案中，是痘病毒科的成员。在一个实施方案中，是乳头瘤病毒科成员。在一个实施方案中，是腺病毒科成员。在一个实施方案中，是逆转录病毒科的成员。在一个实施方案中，是HIV-1。在一个实施方案中，HIV-2在一个实施方案中，是副粘病毒科的成员。在一个实施方案中，是RSV。在一个实施方案中，是副流感病毒。在一个实施方案中，是布尼亚病毒科的成员。在一个实施方案中，是汉坦病毒。在一个实施方案中，是小RNA病毒科的成员。在一个实施方案中，是柯萨奇病毒。在一个实施方案中，是鼻病毒。在一个实施方案中，是黄病毒科的成员。在一个实施方案中，是黄热病毒。在一个实施方案中，是登革热病毒。在一个实施方案中，是西尼罗病毒。在一个实施方案中，是丙型肝炎病毒。在一个实施方案中，是线状病毒科的成员。在一个实施方案中，是埃博拉病毒。在一个实施方案中，是马尔堡病毒。在一个实施方案中，是正粘病毒科的成员。在一个实施方案中，是流感病毒。在一个实施方案中，是披膜病毒科的成员。在一个实施方案中，是冠状病毒科的成员。在一个实施方案中，是呼肠病毒科的成员。在一个实施方案中，是弹状病毒科的成员。在一个实施方案中，是沙粒病毒科的成员。在一个实施方案中，是杯状病毒科的成员。在一个实施方案中，是水痘带状疱疹病毒。在一个实施方案中，是EB病毒.在一个实施方案中，是疱疹病毒6A或6B。在一个实施方案中，是嗜肝DNA病毒科的成员。在一个实施方案中，是人类偏肺病毒。在一个实施方案中，是裂谷热病毒。在一个实施方案中，克里米亚-刚果出血热病毒。在一个实施方案中，是西方马脑炎病毒。在一个实施方案中，是拉沙热病毒。

寡核苷酸

本发明进一步提供了包含至少20个连在一起的核苷酸的寡核苷酸，其中至少80％的连接键经过修饰；并且至少80％的核苷酸包含核糖部分的2′修饰。在一个实施方案中，该寡核苷酸具有抗病毒活性。

在一个实施方案中，其中至少90％的核苷酸间连接键是经过修饰的。在一个实施方案中，其中所有核苷酸间连接键是经过修饰的。在一个实施方案中，其中至少90％的核苷酸包含核糖的2′修饰。在一个实施方案中，其中所有核苷酸包含核糖糖基的2′修饰。

本发明进一步提供了一种寡核苷酸，其中所述2′修饰是2′-OMe取代。在一个实施方案中，其中至少90％的核苷酸包含2′-OMe取代。在一个实施方案中，其中所有的核苷酸都包含2′-OMe取代。

本发明进一步提供了一种寡核苷酸，其中所述2′修饰是2′-甲氧乙氧基取代。在一个实施方案中，至少15％的核苷酸包含2′-甲氧乙氧基取代。在一个实施方案中，至少50％的核苷酸包含2′-甲氧乙氧基取代。在一个实施方案中，至少90％的核苷酸包含2′-甲氧乙氧基取代。在一个实施方案中，所有核苷酸都包含2′-甲氧乙氧基取代。

本发明进一步提供了一种寡核苷酸，该寡核苷酸至少有40个核苷酸长。在一个实施方案中，至少50个核苷酸长。在一个实施方案中，至少60个核苷酸长。在一个实施方案中，至少80个核苷酸长。

本发明进一步提供了一种寡核苷酸，其中所述寡核苷酸是30-40个核苷酸长。在一个实施方案中，40-50个核苷酸长。在一个实施方案中，50-60个核苷酸长。在一个实施方案中，60-70个核苷酸长。在一个实施方案中，70-80个核苷酸长。

本发明进一步提供了一种寡核苷酸，其中所述寡核苷酸不含有超过5个相邻核苷酸的自身互补序列。在一个实施方案中，不含有超过10个相邻核苷酸的自身互补序列。在一个实施方案中，不含有超过20个相邻核苷酸的自身互补序列。

本发明进一步提供了一种寡核苷酸，该寡核苷酸不具有催化活性。

对链部分的限定

本发明进一步提供了一种寡核苷酸，另外包含1-4个非核苷酸链部分。

混合物

本发明进一步提供了一种寡核苷酸混合物，其包含至少两种不同的本发明之抗病毒寡核苷酸的混合物。在一个实施方案中，至少10种不同抗病毒寡核苷酸。在一个实施方案中，至少100种不同抗病毒寡核苷酸。在一个实施方案中，至少1000种不同抗病毒寡核苷酸。在一个实施方案中，至少106种不同抗病毒寡核苷酸。

本发明进一步提供了一种混合物，其中所述的多种不同寡核苷酸至少10个核苷酸长。在一个实施方案中，至少20个核苷酸长。在一个实施方案中，至少30个核苷酸长。在一个实施方案中，至少40个核苷酸长。在一个实施方案中，至少50个核苷酸长。在一个实施方案中，至少60个核苷酸长。在一个实施方案中，至少70个核苷酸长。在一个实施方案中，至少80个核苷酸长。在一个实施方案中，至少120个核苷酸长。

药用组合物

本发明进一步提供了一种药用组合物，该组合物包含治疗有效量的至少一种可药用抗病毒寡核苷酸、多聚嘧啶或寡核苷酸混合物，其中所述寡核苷酸或所述混合物中的寡核苷酸的抗病毒活性主要是以不依赖于序列的作用方式发生的；以及可药用载体。

本发明进一步提供了一种抗病毒药用组合物，使用于治疗、控制或预防病毒病原性疾病。

本发明进一步提供了一种抗病毒药用组合物，适用于治疗、控制或预防朊病毒疾病。

本发明进一步提供了一种抗病毒药用组合物，适用于通过选自以下的方式进行递送：眼内给药、口服、肠道给药、吸入、经皮注射、皮下注射、肌内注射、腹膜内注射、鞘内注射、气管内或静脉内注射。

本发明进一步提供了一种抗病毒药用组合物，其中该组合物进一步包含递送系统。在一个实施方案中，所述递送系统靶向到特异细胞或特异组织。在一个实施方案中，所述组合物进一步包含结合使用的另外至少一种抗病毒药物。在一个实施方案中，所述组合物进一步包含结合使用的非核苷酸抗病毒聚合物。在一个实施方案中，所述组合物进一步包含结合使用的抗病毒反义寡核苷酸。在一个实施方案中，所述组合物进一步包含抗病毒RNAi-诱导寡核苷酸。在一个实施方案中，所述抗病毒RNAi-诱导寡核苷酸是一个siRNA。

本发明进一步提供了一种抗病毒药用组合物，该组合物对靶病毒的IC50是0.10μM或更低。在一个实施方案中，对靶病毒的IC50是0.05μM或更低。在一个实施方案中，对靶病毒的IC50是0.025μM或更低。在一个实施方案中，对靶病毒的IC50为0.015μM或更低。

试剂盒

本发明进一步提供了一种试剂盒，其在带标签的包装内包含至少一种抗病毒寡核苷酸、寡核苷酸混合物或抗病毒药用组合物，其中所述寡核苷酸的抗病毒活性主要是以非序列互补性的作用方式发生的，所述包装上的标签显示该抗病毒寡核苷酸可以用于抗至少一种病毒。

本发明进一步提供了一种试剂盒，其中所述试剂盒含有至少两种不同抗病毒寡核苷酸的混合物。

本发明进一步提供了一种被管理机构批准用于人的试剂盒。

本发明进一步提供了一种被管理机构批准用于至少一种非人动物的试剂盒。在一个实施方案中，所述非人动物是灵长动物。在一个实施方案中，所述非人动物是猫科动物。在一个实施方案中，所述非人动物是牛。在一个实施方案中，所述非人动物是绵羊。在一个实施方案中，所述非人动物是犬科动物。在一个实施方案中，所述非人动物是猪。在一个实施方案中，所述非人动物是马。

治疗方法

本发明进一步提供了至少一种发明所述寡核苷酸或者发明所述药用组合物的用途，即用于制备在受试者中预防或治疗病毒感染的药剂。

在一个实施方案中，所述受试者是人。在一个实施方案中，所述受试者是非人的动物。在一个实施方案中，所述非人动物是灵长动物。在一个实施方案中，所述非人动物是猫科动物。在一个实施方案中，所述非人动物是牛。在一个实施方案中，所述非人动物是绵羊。在一个实施方案中，所述非人动物是犬科动物。在一个实施方案中，所述非人动物是猪。在一个实施方案中，所述非人动物是马。在一个实施方案中，所述受试者是植物。

本发明进一步提供了至少一种发明所述寡核苷酸或者发明所述药用组合物的用途，即用于制备在人或非人动物中预防或治疗致癌病毒导致的癌症的药剂。

在一个实施方案中，将所述寡核苷酸给予人。在一个实施方案中，将所述寡核苷酸给予非人动物。在一个实施方案中，所述非人动物是灵长动物。在一个实施方案中，所述非人动物是猫科动物。在一个实施方案中，所述非人动物是牛。在一个实施方案中，所述非人动物是绵羊。在一个实施方案中，所述非人动物是犬科动物。在一个实施方案中，所述非人动物是猪。在一个实施方案中，所述非人动物是马。

多聚嘧啶相关寡聚物(polypyrimidine oligo-related)

本发明进一步提供了一种包含至少50％嘧啶残基的寡核苷酸。在一个实施方案中，至少80％嘧啶残基。在一个实施方案中，至少90％嘧啶残基。在一个实施方案中，只有嘧啶残基。

本发明进一步提供了一种寡核苷酸，其中的嘧啶残基是胞嘧啶残基。在一个实施方案中，嘧啶残基是胸腺嘧啶残基。在一个实施方案中，是胞嘧啶或胸腺嘧啶残基。

本发明进一步提供了抗病毒药用组合物，其包含治疗有效量的至少一种可药用多聚嘧啶寡核苷酸或多聚嘧啶寡核苷酸混合物，其中所述寡核苷酸或混合物中的寡核苷酸的抗病毒活性主要是以不依赖于序列的作用方式发生的；以及可药用载体。在一个实施方案中，所述寡核苷酸包含至少一个经过修饰的核苷酸间连接键。

在一个实施方案中，所述组合物适合给药到体内酸性部位。

在一个实施方案中，所述组合物还包含渗透增强剂。

在一个实施方案中，所述组合物还包含表面活性剂。

在一个实施方案中，所述组合物是粉末的形式。

在一个实施方案中，所述组合物是颗粒的形式。

在一个实施方案中，所述组合物是微粒的形式。

在一个实施方案中，所述组合物是纳米粒子的形式。

在一个实施方案中，所述组合物是悬浮液或溶液的形式。

在一个实施方案中，所述组合物是乳剂的形式。

在一个实施方案中，所述组合物适用于口服。

在一个实施方案中，其中所述组合物适用于阴道给药。

在一个实施方案中，所述组合物包含至少一种polyC寡核苷酸。

在一个实施方案中，所述组合物包含至少一种polyT寡核苷酸。

在一个实施方案中，所述组合物包含至少一种polyCT寡核苷酸。

在一个实施方案中，所述组合物被批准给予人。

在一个实施方案中，所述组合物被批准给予哺乳动物。

在一个实施方案中，所述组合物被批准给予非哺乳动物的动物。本发明进一步提供了该药用组合物之制备在受试者中预防或治疗病毒感染的药剂的用途，其中所述组合物适用于给药到酸性的体内部位，它含有至少一种可药用多聚嘧啶寡核苷酸。

在一个实施方案中，所述受试者是人。在一个实施方案中，所述受试者是哺乳动物。在一个实施方案中，所述受试者是非哺乳动物的动物。

正如发明背景中描述的那样，人们已经检测过许多反义寡核苷酸(ON)的抗病毒活性。但是这些反义ON都是序列特异性的，通常大约16-20个核苷酸长。

如实施例1和2的结果显示，随机PS-ON的抗病毒效果不是序列特异性的。考虑到那些实验中用到的PS-ON的体积和浓度，理论上讲特定随机序列在混合物中不可能超过1个拷贝。这就意味着这些PS-ON随机寡核苷酸不可能具有反义效果。在后面的实施例中，如果抗病毒效果是由PS-ON的序列特异性造成的，则此效果必然是由一个分子产生的，这样的结果不可信。例如，对于一个40个碱基长的ON随机寡核苷酸来说，群体中的任何特定序列在理论上仅代表全部片段的1/4⁴⁰或4.1×10^-41。考虑到1摩尔＝6.022×1023个分子，以及我们目前最大的合成规模是15微摩尔这一事实，不是所有的可能序列都会出现，而存在的每种序列也极可能只有一个拷贝。当然，本领域技术人员根据本发明的教导也可以使用具有这类序列特异性ON的序列的ON，但利用的是本发明发现的非序列依赖性活性。相应地，本发明并不局限于非序列互补ON，但是我们放弃已公开的关于用序列特异性反义和RNAi(例如siRNA)ON来治疗病毒感染的现有技术。

对于适用的病毒(包括例如，数据在文中有描述的那些)来说，长度达到甚至超过40个核苷酸的随机寡核苷酸，随着其大小的提高，抗病毒效力也提高。要指出的是，由于目前基于磷酰胺的寡核苷酸合成的局限性，较大PS-ON(例如80-和120-聚体)会严重污染比需要的小的片段。在较大寡聚物(80和120bp)中观察到的较弱效果(基于每个碱基来看)可能反映了这些群体中全长随机寡核苷酸的浓度较低，还可能反映了在正确部位的可得性下降。如果能合成或纯化出比较合理纯度(例如至少75％是全长)的大随机寡核苷酸(＞40个碱基)，并且/或者利用递送系统(例如提供导靶或缓释功效的递送系统)来协助任何这些ON的递送，就有可能使抗病毒活性有较大的提高。

在本发明中，随机寡核苷酸(或文中描述的其他抗病毒寡核苷酸)可能通过几种机制阻断病毒的复制，这些机制包括，但不限于：1.阻止病毒粒子的吸收或者它和受体的相互作用，从而阻止感染，2.扰乱病毒组装或病毒基因组包装到衣壳中(与病毒DNA或RNA竞争包装)，产生有缺陷的病毒粒子，3.打断和/或阻止包装过程中衣壳的形成或者衣壳蛋白与其他结构蛋白的相互作用，导致病毒释放被抑制或者释放出有缺陷的病毒粒子，4.与关键的病毒成分结合，阻止或降低它们的活性，5.与病毒增殖所需的关键宿主成分结合。

前文指出了有多种可能机制可以解释和/或预测ON抗病毒复制的抑制特性，所以对本发明中产生病毒抑制的机制没有限制。第一个机制是ON的一般的适体效应使得它们能够附着到细胞表面的蛋白质或病毒蛋白质上，从而阻止了病毒吸收和融合。产生这样的效果对片段大小的要求可能是相互作用需要电荷累积到一定程度。

第二个可能机制是ON可能通过阻止病毒的包装和/或组装在细胞内发挥作用。超过一定大小阈值的ON可能与正常衣壳/核酸相互作用发生竞争或干扰，阻止了在新病毒内包装有功能的病毒基因组。替代的，ON可能阻止正常衣壳的形成，从而阻止了正常的病毒芽生，改变病毒稳定性，或者使得病毒内在化时不能正常地进行毒粒分解。

虽然作用机制还没有完全弄清，分析结果表明与临床上使用的相应物质(无环鸟苷(acyclovir)、更昔洛韦(gancyclovir)、利巴韦林(Ribavirin)和蛋白酶抑制剂)相比，本发明的ON展示出更强的病毒抑制功效。因此本发明的ON可以用于治疗或预防病毒感染。所治疗的病毒感染可以是人、动物和植物病毒引起的那些。寡核苷酸的化学修饰可以有利地用于增强本发明抗病毒寡核苷酸的稳定性和/或活性。RNA中核糖2’位置的甲氧化和其他修饰已被证实能够使得RNA对核酸酶稳定，减少在硫代磷酸酯化核酸中观察到的蛋白结合现象，并能提高这些寡聚物与其靶序列的解链温度。目前2′-o甲基化和其他2′-修饰被用来改善反义寡核苷酸的特性，但是当每个核糖上都有这类修饰时，带有该修饰的寡核苷酸不能引发RNase H活性，这使得完全2′-修饰的寡核苷酸是更差的反义活性候选物。因此人们使用2′-o甲基化和其他2′修饰的″gapmers″，它们仅在寡核苷酸末端含有2′修饰，从而保留了寡聚物激活RNase H的能力。就我们所知，没有人报道过这样的非序列特异性抗病毒寡核苷酸，寡核苷酸中含有硫代磷酸酯键并且核糖核苷酸在每个核糖糖基是比如2′-O-甲基或其他2′修饰。

如文中所述，我们发现40个碱基的PS-ON随机寡核苷酸是几种不同病毒的强抑制剂。我们提出的非限制性假说是，硫代骨架赋予ON随机寡核苷酸更高的疏水性，这使它能与病毒融合蛋白的疏水结构域相互作用。这类疏水结构域被认为对许多不同病毒(包括HSV、HIV、流感病毒、RSV和埃博拉病毒)的膜融合活性非常重要。HIV的情况中，这类疏水结构域已被用作研发融合抑制剂的针对对象。

因此，在本发明的寡核苷酸中引入硫代磷酸酯键和包括2′-O-甲基化及其他2′糖基修饰的核糖核苷酸修饰有助于改善非系列特异性抗病毒寡核苷酸的性质。结果显示PS-ON中每个核糖的′2位置的修饰不会明显改变它们的抗病毒活性，但是这类修饰减少了PS-ON与血清蛋白质的一般相互作用，使它们对低pH的抗性显著提高。这些特点预示了药物代谢动力学表现更佳，并能减弱常见于PS-ON的毒性副作用。例如，它们的pH抗性使其更适合口服。同样它们与血清蛋白质的相互作用减少也预示了它们的药物代谢动力学将得到改进，而并不影响其抗病毒活性。因此，含有每个连接键都硫代磷酸酯化，并且每个核糖核苷酸都在核糖的2′位置被修饰(例如，2′-O-甲基化修饰)的寡核苷酸，具有抗病毒活性但不会引发RNase H活性，而RNase H活性是常规反义寡核苷酸需要的，但对本发明描述的活性是完全不必要的。我们的结果还显示PS-ON中每个核糖2’位置的修饰使得ON对核酸酶的抗性比仅在两个末端含有相同修饰的PS-ON(gapmer)的抗性更高。在反义技术中优选Gapmers。在每个核糖2’位置都被修饰的PS-ON的核酸酶抗性应该会表现出有益的特性，比如药物代谢动力学和/或口服可得性提高。

此外，每个核糖2’位置都带有修饰的PS-ON表现出了我们所希望的特点，而那些相当数量的核糖在2’位置有修饰的PS-ON也会呈现预期特点，例如至少50％核糖有修饰，更优选80％或更多核糖被修饰。

正如上文描述的，本发明的寡核苷酸的活性不是通过杂交来靶向到任何核酸的，因为例如随机寡核苷酸没有反义活性。因此，我们相信所述寡核苷酸针对的是蛋白质。因为硫代磷酸酯化寡核苷酸加上2′-O-甲基化核糖修饰降低了它们的蛋白质结合活性(Kandimalla et al.，1998，Bioorganic MedChem Lett.8：2103-2108；Mou et al.，2002，Nucleic Acids Res.30：749-758)，人们会预计这些修饰将降低抗病毒活性。出乎意料的，我们发现硫代磷酸酯寡核苷酸加上2′-O-甲基化核糖修饰不影响抗病毒活性。

文中描述了多种不同寡核苷酸的检验结果。除非另外说明，所测试的寡核苷酸都带有2′-H组分(2′-脱氧)，因此是ODNs。但是，本发明的不依赖于序列的活性不限于有这种2′-H组分的寡核苷酸，也存在于包含带有2′-OH组分和其他2′修饰(例如2’-O-甲基化和2’-氟代)的核苷酸的寡聚物中。

文中的叙述使用了许多缩写，包括下面这些：

部分缩写

ON：寡核苷酸

ODN：寡脱氧核苷酸

PS：硫代磷酸酯5001623

PS2：二硫代磷酸酯

PRA：噬斑减少检测

PFU：噬菌斑形成单位

INF A：甲型流感病毒

HIV：人免疫缺陷病毒(如果没有限定，包括HIV-1和HIV-2)

HSV：单纯疱疹病毒(如果没有限定，包括HSV-2和HSV-3)

RSV：呼吸道合胞病毒

COX：柯萨奇病毒

DHBV：鸭乙肝病毒

广谱抗病毒活性

根据上文讨论的结论和文中报道的数据，随机ON和ON随机寡核苷酸似乎对这样的病毒具有广谱抗病毒活性，在这些病毒中组装和/或包装和/或病毒基因组的壳体化是复制的必要步骤。因此为了检验这个假说，我们挑选了几个大小不同的PS-ON随机寡核苷酸在多种病毒感染的细胞模型中做了检测。实施例中描述了多项这类检测，包括用CMV、HIV-1、RSV1、柯萨奇病毒B2、DHBV、汉坦病毒、副流感病毒和痘苗病毒进行的检测，以及实施例1和2中描述的在HSV-1和HSV-2上进行的测试。

关于广谱抗病毒活性的结论

用不同病毒进行的关于它们的效能的研究表明随机ON和随机寡核苷酸表现出抗多种不同病毒的抑制特性。而且，这些研究支持了较大的随机寡核苷酸比小的随机寡核苷酸对病毒的抑制效力更强的结论。这提示了随机ON或ON随机寡核苷酸在所有壳体化病毒中有一个共同的依赖于大小和/或电荷的活性机制。HSV和CMV都是属于疱疹病毒科的双链DNA病毒，而HIV是逆转录病毒科的RNA病毒，RSV是副粘病毒科的RNA病毒。考虑到ON随机寡核苷酸可以抑制多种不同病毒的病毒功能这一事实，正如上文讨论过的，以下机制都是可能的，但并不限于列举出来的这些机制：A)ON/ON随机寡核苷酸借助适体效应抑制病毒感染，阻止病毒与细胞质膜融合；和/或B)ON/ON随机寡核苷酸阻止或扰乱病毒粒子的组装或者病毒DNA被包装到衣壳内，因此产生有缺陷的病毒粒子；和/或C)ON/ON随机寡核苷酸干扰组装和/或包装和/或病毒基因表达所需的宿主蛋白质或成分。

病毒活性的必须条件

似乎随机的DNA序列就能有效地抑制病毒，所以我们很有兴趣知道如果没有硫代磷酸酯修饰这些DNA序列是否能保持抗病毒活性，以及是否能通过选择随机序列或病毒基因组中的特异序列来加强抗病毒效力。

相应地，我们研究了DNA和RNA修饰对随机寡核苷酸抗病毒效能的影响。因为随机寡核苷酸是通过不依赖于序列(例如非序列互补性)的机制发挥作用的，我们设计了这些实验来检测核酸构型和电荷分布的微弱变化对抗病毒效力的影响。

为了检测具有不同核苷酸/核苷修饰的ON是否能抑制HSV-1，如实施例所述在HSV-1 PRA中测试了REP 2024、2026、2059和2060。REP 2024(该PS-ON在ON的两个末端的4个碱基上的核糖带有2-O-甲基化修饰)，REP2026(该PO-ON在ON的两个末端的4个碱基之间的连接键发生甲基膦酸酯修饰)，REP 2059(20个碱基长的RNA PS-ON随机寡核苷酸)，和REP2060(30个碱基长的RNA PS-ON随机寡核苷酸)表现出抗HSV-1活性。

这项分析是用HSV-1(KOS株)在VERO细胞中以蚀斑减少测定法进行的。测试了浓度逐渐增加的PS-ON。由线性回归计算的IC50值分别是0.14、3.41、1.36和0.80。

在稍后的实施例中，如果抗病毒效果是仅由包含DNA硫代磷酸酯骨架的ON引起的，则这一效果应当是由一个分子造成的。但是其他骨架和修饰也显示了阳性的抗病毒活性。当然，本领域技术人员根据本发明的教导也可以使用不同的化学ON。ON中的修饰(比如，但不限于硫代磷酸酯修饰)似乎是有助于抗病毒活性的。这最可能是由于ON所需要的电荷以及/或者在介质和细胞内保证DNA稳定的要求，也可能是由于PS-ON的手性。

化合物REP 2026的中间部分含有未修饰的PO-核苷酸，在两个末端有4个甲基膦酸酯键使其免于被降解，该化合物显示了抗病毒活性。这表明PO-ON可以作为抗病毒剂，而且免于被降解。这种保护可以通过对末端核苷酸进行修饰和/或使用後文描述的合适的递送系统来达到。

总体来说，所用DNA的序列组成对其总的效力影响很小，无论是随机寡核苷酸、随机序列或特异性HSV-1序列。但是，在中等长度，HSV-1序列被随机序列效力几乎高3倍。这个数据提示，虽然对特异性HSV序列来说存在着特异性反义功能机制，本文阐述的不依赖于序列的机制(非反义机制)可能代表了该活性的主要组成部分。的确，随着ON增加到40个碱基时，基本上抗病毒活性完全归功于不依赖于序列(例如非反义)的效应。

随机寡核苷酸的较低毒性

使用ON随机寡核苷酸的一个目的是降低毒性。我们知道不同的序列可能在动物体内引起不同的反应，比如一般毒性、与血清蛋白质的相互作用以及与免疫系统的相互作用(Monteith et al(1998)Toxicol Sci 46：365-375)。因此ON混合物可能会降低毒性效果，因为任何特定序列的水平都非常低，所以不可能有序列或核苷酸组成导致的显著相互作用。

药用组合物

本发明的ON可以是用于治疗病毒性疾病的药用组合物或制剂的形式，由管理机构批准在人或非人动物中使用，并且/或者抗特定病毒或病毒群。这些ON在与生理和/或可药用载体联用时，可以作为药用组合物的一部分。所述载体的特点取决于给药途径。本发明的药用组合物还可以含有其他活性因子和/或能增强活性的试剂。

可以通过多种常规手段来给予用于药用组合物或制剂的发明所述ON，或者实施发明所述治疗动物的方法，比如经眼内、口服、经肠道、吸入，或者经皮肤、皮下、肌内、腹膜内、鞘内、气管内或静脉内注射。

本发明的药用组合物或寡核苷酸制剂可以进一步含有其他用于治疗病毒性疾病的化疗药物，比如，但不限于利福平、利巴韦林、Pleconaryl、西多福韦(Cidofovir)、无环鸟苷、喷昔洛维(Pencyclovir)、更昔洛韦、伐昔洛韦(Valacyclovir)、泛昔洛韦(Famciclovir)、膦甲酸钠(Foscamet)、阿糖腺苷、金刚胺(Amantadine)、扎那米韦(Zanamivir)、奥司他韦(Oseltamivir)、Resquimod、抗蛋白酶、聚乙二醇干扰素(Pegasys(TM))、抗HIV蛋白酶(例如洛匹尼韦(lopinivir)、沙喹那韦(saquinivir)、安泼那韦(amprenavir)、HIV融合抑制剂、核苷酸类HIV RT抑制剂(例如AZT、拉米夫定(Lamivudine)、阿巴卡韦(Abacavir)、非核苷酸类HIV RT抑制剂、Doconosol、干扰素、丁化羟基甲苯(BHT)和金丝桃素。可以在药用组合物中包括这些附加因子和/或试剂，以便例如与本发明的ON产生协同效应。

本发明的药用组合物或寡核苷酸制剂还可以进一步含有聚合物，比如但不限于，聚阴离子剂、硫酸多糖、肝素、葡聚糖硫酸盐、聚戊糖多硫酸盐、聚乙烯醇硫酸盐、乙酰化甘露聚糖、多羟基羧化物、硫酸纤维素、含有苯磺酸或柰环的聚合物以及柰磺酸聚合物、乙酰邻苯二甲酰纤维素、聚-L-赖氨酸、癸酸钠、阳离子亲水脂分子、胆酸。已知在一些情况中聚合物能够通过自身结合或吸收到病毒粒子上影响病毒粒子进入细胞。抗病毒聚合物的这个特点可以用于与ON竞争结合或吸收到病毒粒子上，结果ON的胞内活性相比胞外活性更高。

脂质包封和递送举例

虽然PS-ON(以及带有其他修饰连接键的寡核苷酸)比天然磷酸二酯键对内源核酸酶抗性更高，它们不是完全稳定的，会在血液和组织中缓慢降解。PS寡核苷酸药物在临床上的应用受到限制是因为在静脉内给药时它们容易激活补体。脂质体和其他递送系统能够提高包括ON在内的药物的治疗指数，这一作用一般来说是通过降低药物毒性、增加在血浆中的停留时间，以及通过载体经超通透性维管结构的外渗给疾病组织递送更多活性药物实现的。而且在PS-ON的情况中，脂类包封防止了在循环系统中与潜在的蛋白结合部位发生相互作用(Klimuk et al.(2000)J Pharmacol Exp Ther292：480-488)。

根据文中描述的我们的研究结果，一个方法是使用递送系统来递送文中描述的ON和/或反义和siRNA寡核苷酸，所述递送系统是比如，但不限于亲脂分子、极性脂类、脂质体、单分子层、双分子层、小泡、程序化融合泡、胶束、环化糊精、PEG、离子电渗法、粉末注射和纳米粒子(比如PIBCA、PIHCA、PHCA、明胶、PEG-PLA)。使用这些递送系统可以，但不限于，提供一或多个以下益处：降低活性化合物在动物和人中的毒性、降低IC50、从药物递送的角度来说延长作用时间，以及使寡核苷酸不与血清蛋白发生非特异性结合。

因此，我们已经证明PS-ON随机寡核苷酸的抗病毒活性随着其大小增加而提高。此外，其抗病毒活性与它对病毒蛋白质的亲和力增加相关。因为本领域公知硫代磷酸酯修饰能够提高蛋白质-DNA相互作用，我们检测了逐渐加大的PS-ON随机寡核苷酸结合胎牛血清(FBS)的能力，所用基于FP的分析法是与测量它和病毒裂解物的相互作用相同的方法。在该项分析中，将250ug非加热灭活的FBS在使得结合(mP值)达到饱和的条件下，络合荧光标记的20个碱基的PS-ON随机寡核苷酸。用逐渐加大的未标记PS-ON随机寡核苷酸(REP 2003、REP 2004、REP 2006和REP 2007)竞争FBS与标记诱饵之间的相互作用。这项检测的结果清楚地显示随着PS-ON随机寡核苷酸大小的增加，其对FBS的亲和力也同样增加。这个结果提示，活性最高的抗病毒PS-ON也就是与蛋白质亲和力最高的那些。

但是，本领域已知硫代磷酸酯反义寡核苷酸的一个主要治疗学问题是它们的副作用，这种副作用主要是如Kandimalla及其同事(Kandimalla et al.(1998)Bioorg.Med.Chem.Lett.8：2103-2108)描述过的它们与蛋白质(特别是血清蛋白)的相互作用增加。因此，在一些情况中，使用合适的递送系统可能是有益的，即所述递送系统能将抗病毒ON递送到作用部位同时阻止ON与血清蛋白的相互作用。此外，使用合适的递送系统可能也利于将本发明的不依赖于序列的ON与其他类型的抗病毒ON(比如反义寡核苷酸和siRNA)联合使用。

为了证明递送系统的一些影响，我们检测了两种不同的基于脂质体的递送技术；细胞转染剂(Cytofectin)和DOTAP。我们在体外基于FP的相互作用分析法中测量了DOTAP和细胞转染剂保护REP2006免于与血清蛋白发生相互作用的能力。未包封的RFP2006能够将结合的荧光寡聚物从血清上竞争下来，但是当REP2006被DOTAP或细胞转染剂包封时，它就不能竞争结合血清了。这些数据表明包封防止寡聚物与血清发生相互作用，因此导致更好的药物代谢动力学表现，并且副作用更少。

我们还在有高浓度血清(50％)的情况下，通过用荧光计测量被标记的REP2006在细胞内的浓度，测定了(用细胞转染剂或DOTAP包封的)PS-ON随机寡核苷酸REP 2006到293A细胞的递送效率。测定结果显示这类递送剂提高了细胞内的REP2006浓度，并且在使用DOTAP包封时，24小时后的胞内REP2006水平显著提高。最后，我们在我们的基于FP的体外相互作用分析法中测量了DOTAP和细胞转染剂保护REP2006免于和血清蛋白发生相互作用的能力。未包封的REP 2006能够将结合的荧光寡聚物从血清上竞争下来，但是当REP2006被DOTAP或细胞转染剂包封时，它就不能竞争结合血清了。这些数据表明包封能防止寡聚物与血清发生相互作用，因此导致更好的药物代谢动力学表现，并且副作用更少。

类似地，为了证明寡核苷酸的脂类包封的效果，我们监测了另外一种PS-ON随机寡核苷酸的吸收，监测是通过使培养细胞与荧光标记的随机寡核苷酸进行接触，然后检验裂解细胞在两轮清洗后的荧光强度。接触了250nM REP2004-FL的细胞在没有递送系统，和用以下基于脂质的递送系统包封后测定了细胞吸收：Lipofectamine(TM)(Invitrogen)、Polyfect(TM)(Qiagen)和Oligofectamine(TM)(Invitrogen)。4小时后，将细胞用PBS洗两次，用MPER裂解剂(PROMEGA)裂解。检测同等数量的接触细胞在有和没有脂类系统时的相对荧光发射。我们观察到在检测的三种试剂均存在的情况下，与没有递送系统相比，胞内PS-ON浓度明显升高。

与测试结果一致，递送系统的使用可以用来保护寡核苷酸不与血清发生反应、减少副作用以及提高组织分布和/或显著提高ON的胞内递送。

使用递送系统的另一个可能的益处是使ON免于与传染性病毒粒子发生相互作用(比如吸收)，这是为了防止病毒感染通过不同的机制发生扩增，比如病毒粒子的细胞渗透增强。

另一个方法是通过将递送系统与某个(一些)分子联系在一起从而实现细胞特异性递送，所述分子能够提高它们与特定细胞的亲和力，这类分子不限于是，抗体、受体配体、维生素、激素和肽。

以下给出了递送系统的其他选择

连接的ON

在一些实施方案中，本发明的ON以多种不会损害其抑制病毒复制的能力的方式进行了修饰。例如ON在其一或多个核苷酸残基上连接或偶联另一个组分。因此，发明所述寡核苷酸的修饰可以包括给这些寡核苷酸化学地连接一或多个成分或偶联物，所述成分或偶联物能够提高寡核苷酸的活性、细胞分布、提高其跨细胞膜的特异或非特异转运、或使其免于被降解或排泄，或者提供其他有利特点。所述有利特点可以，例如包括血清相互作用下降、与病毒蛋白的相互作用更强、易于成剂递送、有可检测信号、更好的药物代谢动力学特性和毒性减弱。这类偶联基团可以共价地结合到功能基团上，比如一级或二级羟基基团。例如，偶联成分可以包括类固醇分子、非芳香族亲脂分子、肽、胆固醇、二胆固醇、抗体、PEG、蛋白质、水溶性维生素、脂溶性维生素、另一种ON，或任何其他能提高ON的活性和/或生物可得性的分子。

更详细地说，示范性的本发明的偶联基团可以包括嵌入剂、报告分子、多胺、聚酰胺、聚乙二醇、聚醚、SATE、t-丁基-SATE，能够提高寡聚物的药物动力学特性的基团，以及提高寡聚物的药物代谢动力学的基团。典型的偶联基团包括胆固醇、脂类、磷脂、生物素、吩嗪、叶酸盐、菲啶、蒽醌、吖啶、荧光素、罗丹明、香豆素、荧光核碱基，和染料。

能够提高药物动力学特性的基团，在本发明的语境中包括那些能提高寡聚物对降解的抗性和/或保护寡聚物免于与血清相互作用的基团。能够提高药物代谢动力学特性的基团，在本发明的语境中包括那些提高寡聚物吸收、分布、代谢或排泄的基团。1992年10月23日递交的国际专利申请PCT/US92/09196描述了示范性的偶联基团，该申请以参考文献的方式全文引入本文。

偶联成分可以包括，但不限于脂类成分，比如胆固醇部分(Letsinger etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1989，86，6553-6556)；胆酸(Manoharan et al.，Bioorg.Med.Chem.Lef.，1994，4，1053-1060)；硫醚键，例如己基-S-三苯甲基硫醇(Manoharan et al.，Ann.N.Y.Acad.Sci.，1992，660，306-309；Manoharanet al.，Bioorg.Med.Chem.Let，1993，3，2765-2770)，硫代胆固醇(Oberhauseret al.，Nucl.Acids Res.，1992，20，533-538)；脂肪族链，例如癸二酸或十一烷基残基(Saison-Behmoaras et at.，EMBO J.，1991，10，1111-1118；Kabanov etal.，FEBS Lett，1990，259，327-330；Svinarchuk et at.，Biochimie，1993，75，49-54)；磷脂，例如甘油双十六烷酸酯(di-hexadecyl-rac-glycerol)或1，2-二铒-氧代-甘油双十六烷酸酯基-S-氢-膦酸酯三乙铵盐(triethyl-ammonium1，2-di-O-hexadecyl-rac-glycero-3-H-phosphonate)(Manoharan et at.，Tetrahedron Lett，1995，36，3651-3654；Shea et al.，Nucl.Acids Res.，1990，18，3777-3783)；多胺或聚乙二醇链(Manoharan et at.，Nucleosides&Nucleotides，1995，14，969-973)，或乙酸金刚烷(Manoharan et at，Tetrahedron Lett.，1995，36，3651-3654)，棕榈酰部分(Mishra et at.，Biochim.Biophys.Acta，1995，1264，229-237)，或者十八胺或己基胺基羰基-羟胆固醇(hexylaminocarbonyl-oxycholesterol)部分(Crooke et al.，J.Pharmacol Exp.Ther.，1996，277，923-937)。

本发明的寡核苷酸还可以偶联上活性药物物质，例如但不限于，阿司匹林、华法林(warfarin)、保泰松(phenylbutazone)、布洛芬(ibuprofen)、舒洛芬(suprofen)、芬布芬(fenbufen)、酮洛芬(ketoprofen)、(S)-(+)-普拉洛芬(pranoprofen)、卡洛芬(carprofen)、dansylsarcosine、2，3，5-三碘苯酸、氟芬那酸(flufenamic acid)、四氢叶酸、benzothiadiazide、氯塞嗪(chlorothiazide)、二氮杂卓(diazepine)、indomethicin、巴比妥盐、头孢霉素、磺胺药、抗糖尿病药物、抗菌剂或抗生素。

描述制备寡核苷酸偶联物实例的美国专利例如，美国专利4,828,979；4,948,882；5,218,105；5,525,465；5,541,313；5,545,730；5,552,538；5,578,717，5,580,731；5,580,731；5,591,584；5,109,124；5,118,802；5,138,045；5,414,077；5,486,603；5,512,439；5,578,718；5,608,046；4,587,044；4,605,735；4,667,025；4,762,779；4,789,737；4,824,941；4,835,263；4,876,335；4,904,582；4,958,013；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,245,022；5,254,469；5,258,506；5,262,536；5,272,250；5,292,873；5,317,098；5,371,241，5,391,723；5,416,203，5,451,463；5,510,475；5,512,667；5,514,785；5,565,552；5,567,810；5,574,142；5,585,481；5,587,371；5,595,726；5,597,696；5,599,923；5,599,928和5,688,941，这些专利每一个都以参考文献的方式全文引入本文。

另一种方法是将抗病毒ON通过用可酶解切除的电荷中和加合物(比如s-乙酰硫-乙基或s-pivasloylthio-乙基)进行修饰，制备成亲脂性前寡核苷酸(Vives et al.，1999，Nucl Acids Res 27：4071-4076)。这类修饰已被证明可以提高ON到细胞中的吸收量，因此有利于那些在细胞内有活性的ON。

设计非特异性ON

在另外一个方法中，设计了与人类(或其他受试生物)基因组的同源性低，优选尽可能最低的抗病毒ON。目的是获得显示最低毒性的ON，这里的毒性是由于所述ON和人或动物基因组序列以及mRNA发生相互作用造成的。第一步是产生所需长度的ON序列，例如通过人工，或者更常见的情况是利用计算机程序将核苷酸A、C、G、T以随机方式进行排列。第二步是将ON序列与人类序列库，比如GenBank和/或Ensemble Human GenomeDatabase进行比较。如果需要可以反复进行序列形成和比较，以便鉴定出与受试者基因组同源性水平低的一或多个序列。我们希望ON序列与整个基因组有尽可能最低的同源性，同时还优选其自身相互作用最小化。

有反义活性的非特异性ON

在另一个方法中，将抗病毒非特异性序列部分与反义序列部分偶联，从而提高最后的ON的活性。本发明中描述了ON的非特异性部分。所述反义部分与病毒mRNA互补。

含有富含G的基序的非特异性ON活性

在另一个方法中，将抗病毒非特异性序列部分与基序部分偶联，以便提高最后的ON的活性。本发明中描述了ON的非特异部分。所述基序部分可以，作为非限制性的例子，包括CpG、G四联体，和/或文献(Agrawal et al.(2001)Curr.Cancer Drug Targets 3：197-209)中描述过的可以作为免疫系统刺激物的CG。

非Watson-Crick ON

另一种方法是使用包含一或多类非Watson-Crick核苷酸的ON。这种ON可以模拟PS-ON，其有以下特点与PS-ON类似：a)总电荷；b)单元间的距离；c)链长；d)负电荷在一端累积形成的净偶极子；e)结合蛋白质的能力；f)结合病毒蛋白质的能力，g)渗透到细胞内的能力，h)可接受的治疗指数，i)抗病毒活性。这种ON优选具有硫代磷酸酯骨架，但不限于该种骨架。非Watson-Crick核苷酸/核苷的例子在Kool，2002，Ace.Chem.Res.35：936-943；和Takeshita et al.，(1987)J.Biol.Chem.262：10171-10179中有描述，后一篇文献描述了含有合成脱碱基位点的ON。

抗病毒聚合物

再一种方法是使用模拟硫代磷酸酯ON活性的聚合物。如文献描述过的，一些阴离子聚合物被证明具有抗病毒抑制活性。这些聚合物归属以下几个类别：(1)多糖的硫酸酯(糊精和葡聚糖硫酸盐；硫酸纤维素)；(2)含有苯磺酸的聚合物或柰环和柰磺酸聚合物；(3)聚羧酸盐(丙烯酸聚合物)；和乙酰邻苯二甲酰纤维素(Neurath et al.(2002)BMC Infect Dis 2：27)；以及(4)脱碱基寡核苷酸(Takeshita et al.，1987，J.Biol.Chem.262：10171-10179)。非核苷酸抗病毒聚合物的其他例子在文献中有描述。这里描述的聚合物模拟本发明所述PS-ON，具有以下类似于PS-ON的特点：a)链长；b)负电荷在一端累积形成净偶极子；c)结合蛋白质的能力；d)结合病毒蛋白的能力，e)可接受的治疗指数，f)抗病毒活性。为了模拟PS-ON的效果，优选所述抗病毒聚合物是这样的聚阴离子，这些聚阴离子单元间的空间与PS-ON的类似。其还可以具有单独或与递送系统联用时渗透到细胞内的能力。

双链PS-ON的抗病毒活性

将随机序列(REP 2017)及其互补序列(PS修饰的或未修饰的)按照其他文献的描述做荧光标记，通过本发明描述的荧光偏振法测试它们结合纯化的HSV-1和HIV-1蛋白的能力。杂交经聚丙烯酰胺凝胶电泳证实。

单链(ss)或双链(ds)的未修饰REP 2017(2017U)在HSV-1或HIV-1裂解液中都没有结合活性。但是，单链(ss)或双链(ds)的PS修饰的REP 2017能够与HSV-1和HIV-1蛋白发生相互作用。

根据我们在文中描述的实验结果，一个方法是使用双链ON作为有效的抗病毒剂。优选这类ON具有硫代磷酸酯骨架，但也可以带有其他和/或另外的修饰，这些修饰会象文中描述的对于单链ON那样，提高其抗病毒活性和/或稳定性和/或递送特性。

用于发现新药的体外测定方法

我们在荧光偏振法的基础上建立了一种体外测定方法用来测量PS-ON结合病毒成分，例如病毒蛋白质的能力。当蛋白质(或其他相互作用物)结合到荧光标记的诱饵时，诱饵在溶液中的三维翻转被阻滞。从被标记诱饵发射的激发光的偏振度发生了固有增加，借助这种增加可以测量出翻转的阻滞。因此，升高的偏振度(报道为无量纲量[mP])与结合增加存在着相关性。

一种方法学是将PS-ON随机寡核苷酸作为诱饵，该随机寡核苷酸用不可弯曲的接头(3′-(6-荧光素)CPG)在3’末端标记了FITC。将所述PS-ON随机寡核苷酸在测定缓冲液(10mM Tris(pH7.2)、80mM NaCl、10mM EDTA、100mM b-巯基乙醇和1％tween 20)中稀释到2nM。然后将寡聚物与合适的相互作用物混匀。在本实验中，我们使用了纯化的HSV-1(Maclntyre株)、HIV-1(Mn株)或RSV(A2株)的蔗糖梯度裂解物，裂解物均悬浮于0.5M KCl和0.5％Triton X-100(HSV-1和HIV-1)或者10mM Tris(pH7.5)、150mMNaCl、1mM EDTA和0.1％Triton X-100(RSV)中。待诱饵发生相互作用后，形成的复合体用各种未标记PS-ON进行攻击来评价这些PS-ON从复合体中置换诱饵的能力。在用分别为6(REP 2032-FL)，10(REP 2003-FL)和20个碱基(REP 2004-FL)的三个大小不同的诱饵进行的预实验中，测试了所述诱饵与HSV-1、HIV-1和RSV裂解物相互作用的能力。与不同大小的诱饵发生结合的病毒裂解物经荧光偏振确认。在有任何所述病毒裂解物的情况下，结合程度均取决于所用诱饵的大小，其中2004-FL在有病毒裂解物时显示出mP(结合)的最大迁移。我们注意到这与PS-ON随机寡核苷酸的大小依赖性抗病毒效力是类似的。然后该诱饵被用来评价不同大小的PS-ON竞争诱饵与裂解物之间的相互作用的能力。

用逐渐增大的PS-ON来攻击REP 2004-FL与HSV-1、HIV-1和RSV裂解物之间的相互作用。PS-ON随机寡核苷酸对病毒裂解物的亲和力通过荧光偏振来确定。将REP 2004-FL作为诱饵，其与HSV-1裂解物、HIV-1裂解物或RSV裂解物形成的复合体用浓度逐渐增加的REP 2003、REP 2004、REP 2006或REP 2007来进行攻击。对于所检测的每种病毒裂解物，我们注意到REP 2003都不能从裂解物上竞争掉诱饵。REP 2004(未标记诱饵)竞争分子引发的竞争相对较弱，揭示了诱饵相互作用极强。但是，据观察，随着竞争物PS-ON的大小增加到20个碱基以上，其置换诱饵的能力变得更强。这表明随着PS-ON随机寡核苷酸大小的增加，它对蛋白成分的亲和力也提高。这一现象反映了较长PS-ON随机寡核苷酸抗HSV-1、HSV-2、CMV、HIV-1和RSV的抗病毒活性也有增强。

PS-ON随机寡核苷酸在竞争诱饵的能力和抗病毒活性效果之间的类似性表明，该检验形式能很好地预测抗病毒活性。这项检测可靠、易于操作并且很稳定的特点使它成为很好的高通量筛选鉴定新的抗病毒分子的候选方法，这种鉴定是不是基于特异靶向鉴定，而是根据这些分子与一或多种成分，例如病毒蛋白发生相互作用的能力进行的。

虽然文中描述的示范性方法利用荧光偏振来测量与病毒裂解物之间的相互作用，有许多已知技术可以监测蛋白质相互作用，它们都可以用于本发明的方法。这些技术包括，但不限于表面等离子共振、荧光共振能量转移(FRET)、酶联免疫吸附法(ELSIA)、凝胶电泳(测量迁移率变动)、等温滴定和差示扫描微量量热法以及柱层析。可以采用另外的这些不同技术来测量ON与病毒裂解物或其成分的相互作用，因此可以用于筛选具有抗病毒活性的化合物。

本文中描述的方法被用来从任何希望的来源中筛选新化合物，例如从通过组合化学合成的，或者通过纯化天然物质分离到的文库中筛选。该方法可以用于a)确定新ON的合适大小、修饰和骨架；b)测试新分子包括新聚合物；预测特定病毒对新ON或新化合物的易感性；或d)确定合适的一组化合物来最大程度地抑制特定病毒。

较大PS-ON随机寡核苷酸对裂解物的亲和力增加的现象提示了这些PS-ON随机寡核苷酸的抗病毒作用机制是基于它们和一或多种病毒蛋白成分之间的相互作用，这种相互作用阻碍了病毒粒子的感染或正确复制。它还提示了这种相互作用是依赖于电荷(大小)的，而非依赖于序列。由于这些PS-ON随机寡核苷酸对覆盖了几个不同科的多种病毒具有依赖于大小的活性，我们认为所述PS-ON随机寡核苷酸干扰的是普通的依赖于电荷的蛋白-蛋白相互作用、蛋白-DNA/RNA相互作用，和/或其他分子-分子相互作用。这些相互作用可能包括，但不限于：

衣壳形成过程中，各个衣壳亚基之间的相互作用；

衣壳/核衣壳蛋白以及病毒基因组之间的相互作用；

出芽过程中，衣壳和糖蛋白之间的相互作用；

感染过程中糖蛋白与其受体间的相互作用；以及

参与病毒复制的其他关键病毒成分间的相互作用。

这些对蛋白-蛋白相互作用的多层次、同时的抑制代表了一种新的抗病毒抑制机制。

PS-ON的序列组成对病毒裂解物相互作用的影响

我们监测了序列不同的PS-ON与几种病毒裂解物发生相互作用的能力。每种情况中，如前文所述将20聚体PS-ON在3’端标记上FITC。所检测的PS-ON由A20、T20、G20、C20、AC10、AG10、TC10、TG10、REP 2004和REP 2017组成。将每个序列在检测缓冲液中稀释到4nM，在有1μg HSV-1、HIV-1或RSV裂解物的情况下保温。经荧光偏振测量相互作用。

在全部病毒裂解物中所有检测序列的相互作用情形类似，这反映了它们的结合相互作用性质非常相似。序列组成不同的20聚体PS-ON(A20，C20，G20，T20，AC10，AGIO，TC10，TG10，REP2004，REP2017)结合病毒裂解物的能力经荧光偏振测量。将3’标记FITC的PS-ON在有1μg HSV-1、HIV-1或RSV裂解物的情况下保温。每种裂解物中，单一组成的PS-ON(A20，G20，T20，C20)是最弱的相互作用物，而A20又是这些分子中明显最弱的。对于其他所检测的PS-ON，除了TG10，全部表现出类似的强烈相互作用。TG10在每种裂解物中都一致表现出最强的相互作用。这些PS-ON的结合情形在所有三种病毒裂解物中是类似的。

鉴定PS-ON随机寡核苷酸在HIV-1中的作用目标

如实施例9所述，经荧光偏振测试PS-ON随机寡核苷酸结合纯化的HIV-1蛋白质的能力。将用量逐渐增加的纯化HIV-1 p24或纯化HIV-1 gp41与REP2004-FL进行反应。我们注意到对于这两种蛋白，荧光偏振均发生了蛋白质浓度依赖性变动，表明与两种蛋白均有相互作用。

不同大小的PS-ON随机寡核苷酸与这些蛋白质发生结合的能力还用荧光标记形式的REP 2032、REP 2003、REP 2004、REP 2006和REP 2007进行了测试。我们观察到对p24来说，不存在大小依赖性相互作用；但是我们的确看到超过20个碱基长的PS-ON随机寡核苷酸与gp41的结合比那些少于20个碱基的随机寡核苷酸增加了。这提示当PS-ON随机寡核苷酸长度超过20个碱基时，各个随机寡核苷酸上会结合多个拷贝的gp41，从而使其偏振值升高。

这是一个很有意义的观察结果，因为它显示了利用较大ON在病毒合成过程中收缴结构蛋白，并限制它们在形成新病毒粒子中的可得性的潜力。

高亲和力寡核苷酸

另一项手段是一种富集或纯化这样的抗病毒ON的方法，所述ON对病毒成分(比如病毒蛋白)的亲和力要高于起始ON集合中的ON的平均亲和力。因此该方法将提供对一或多种病毒成分的亲和力增强的一或多种非序列互补性ON，例如具有造成这种提升的亲和力的三维形状。其原理是虽然ON在与病毒成分结合时是以线性分子发挥作用的，它们也可以折叠成能够促进与这些病毒成分的相互作用的三维形状。高亲和力ON可以通过以下途径，不局限于某种特定技术来纯化或富集。

一种纯化高亲和力ON，或多种高亲和力ON的方法，包括用结合有病毒蛋白的固相介质作为亲和力矩阵来与ON进行结合，然后在严紧度逐渐增加的条件(例如，提高盐或其他离液剂的浓度，和/或提高温度和/或改变pH)下将ON洗脱下来。这一方法可以，例如如下实现：

(a)将ON集合上样到交换柱上，柱中带有结合到固定相上的病毒蛋白或几种病毒蛋白；

(b)通过例如使用置换剂溶液(比如浓度渐增的盐溶液)将结合的ON从柱子上置换(洗脱)下来；

(c)收集不同盐浓度的洗脱ON流份；

(d)将不同流份，优选高盐浓度流份中的洗脱ON进行克隆并测序，因为高盐浓度洗脱的ON与病毒蛋白的结合亲和力更高；以及

(e)在比如结合和/或病毒抑制测定法中测试被测序ON的活性，其中所述测定法是例如文中描述的荧光偏振-结合测定法和/或细胞病毒抑制试验和/或动物病毒抑制分析。

在第二个例子中，可以采用来源并改进自SELEX方法学(Morris et al(1998)Biochemistry 95：2902-2907)的方法来纯化高亲和力ON。该方法的一个实施可以这样进行：

(a)提供起始ON集合材料，例如含有大量序列的合成随机ON，例如10¹⁴到10¹⁶个不同序列。每个ON分子含有一段随机序列，序列的两端侧接了引物结合序列以便协助聚合酶链式反应(PCR)。因为基本上所有分子的核苷酸序列都是独特的，该群体体现了大量的结构形式。这些结构形式决定了每个分子的生化特性，比如结合给定病毒靶分子的能力；

(b)将ON与一或几种病毒蛋白质或病毒裂解物接触；

(c)利用能分开结合和未结合ON的分配技术，比如非变性凝胶阻滞和硝基纤维素滤过来挑选结合到病毒蛋白上的ON。这些方法之一均能物理地将结合种类与非结合种类分开，使得可以优先回收结合最好的序列。同时，为了挑选结合到小蛋白上的ON，最好将靶附着到固体支持物上，用该支持物作为亲和纯化基质。那些未发生结合的分子被洗掉，结合的分子用游离靶洗脱，同样物理地将结合和非结合种类分开了；

(d)利用能与ON的两段旁侧序列杂交的引物，经PCR扩增洗脱下来的结合ON；

(e)步骤(b)、(c)和(d)可以进行多次(即，多循环或多轮富集和扩增)以便优选回收显示出最高的病毒蛋白结合亲和力的ON。几个富集和扩增循环之后，得到的群体主要是表现出预期的生化特性的序列；

(f)将一或多个选自富集循环(例如最后一个富集循环)的ON进行克隆和测序；以及

(g)分析检测测序ON的结合情况和/或活性，分析可以是例如文中描述的荧光偏振结合试验和/或细胞病毒抑制分析法和/或动物病毒抑制分析法。

另一个手段是采用改进的裂分合成方法从而产生象Yang et al(2002)Nucl.Acids Res.30(e132)：1-8描述过的一个珠子一个PS-ON(one-beadone-PS-ON)和一个珠子一个PS2-ON(one-bead one-PS2-ON)文库。可以使特定的珠子与病毒蛋白进行结合和选择。利用挑选出的珠子上的基于PCR的鉴定标记，对核酸碱基以及任何硫代/二硫代连接键的位置进行测序。这个途径使得可以快速和方便地鉴定结合了病毒蛋白，并呈现强抗病毒特性的PS-ON或PS2-ON。

一旦确认了与病毒蛋白结合亲和力高的特异性序列(例如通过对单个序列的扩增和测序)，可以挑选并合成(例如通过化学或酶法合成)一或多种这样的高亲和力序列以便提供高亲和力ON制品，所述制品可以进行修饰来提高其活性，包括改善它们的药物代谢动力学特性。这类高亲和力ON可以用于本发明。

朊病毒疾病

在本发明的替代实施方案中使用了另一种手段来对朊病毒疾病进行治疗、控制其进展或预防。这种致命的神经退行性疾病有传染性，人和动物都可能受其影响。细胞朊病毒蛋白PrPC发生结构变化成为其异常痒病型PrPSC，被认为是朊病毒疾病发病和传播中的必要步骤。淀粉样聚合物与朊病毒疾病的神经病理学有关。

将朊病毒蛋白片段和双链合适在一起培育，导致形成淀粉样纤维(Nandi et al(2002)，J MoI Biol 322：153-161)。用对蛋白质有亲和力的ON，比如硫代磷酸酯来竞争或抑制双链核酸与PrPC的相互作用，从而阻止淀粉样聚合物的形成。不同大小和不同组成的这类ON可以用于以合适的递送形式治疗患有朊病毒疾病的患者或者用于高风险情况中做预防。这类干扰性ON的鉴定可以按照Nandi等(同上)的描述，通过测量在有待测ON的情况下，淀粉样蛋白聚合酶折叠的变化来进行。

假想的病毒病原学

另外一种手段用于在本发明的另一实施方案中治疗或防止以下实施例中描述的(但不限于)那些假定是病毒病原学的疾病或状况。在一些与初级病毒感染不相关的疾病和状况中，病毒是假定的偶然病因。例如，关节炎与HCV(Olivieri et al.(2003)Rheum Dis CHn North Am 29：111-122)、细小病毒B19、HIV、HSV、CMV、EBV和VZV(Stahl et al.(2000)CHn Rheumatol19：281-286)都有关。其他病毒也曾被认定在不同疾病中发挥一些作用。例如，流感A在帕金森病(Takahashi et al.(1999)，Jpn J Infect Dis 52：89-98)；冠状病毒、EBV和其他病毒在多发性硬化中(Talbot et al(2001)Curr TopMicrobiol Immunol 253：247-71)；EBV、CMV和HSV-6在慢性疲劳综合征中(Lerner et al.(2002)Drugs Today 38：549-561)；副粘病毒在哮喘(Walter et al(2002)J CHn Invest 110：165-175)和帕哲氏病中；以及HBV、HSV、和流感病毒在格林-巴利综合征(Guillain-Barre Syndrome)中。

因为这些病原学，利用本发明来抑制相关的病毒可以延迟、减慢或者阻止相应疾病或状况，或者该病的至少一些症状的发展。

寡核苷酸的修饰和合成

正如在上文发明概述指出的，经过修饰的寡核苷酸在本发明中是有用的。所述经过修饰的寡核苷酸包括，例如含有修饰骨架或非天然核苷酸间连接键的寡核苷酸。具有修饰骨架的寡核苷酸包括那些骨架中保留了磷原子，和骨架中没有磷原子的。

所述修饰寡核苷酸骨架包括，例如硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨烷基磷酸三酯、甲基和其他烷基磷酸酯(包括3′-烯烃磷酸酯、5′-烯烃磷酸酯和手性磷酸酯)、亚膦酸酯、亚磷酰胺酯(包括3′-氨基磷酰胺酯和氨烷基磷酰胺酯)、硫逐磷酰胺酯(thionophosphoramidates)、硫逐烷基磷酸酯(thionoalkylphosphonates)、硫逐烷基磷酸三酯、硒代磷酸酯、carboranyl磷酸酯和硼代磷酸酯骨架，其中这些骨架有正常的3′-5′连接，2′-5′连接的这些类似物，以及那些极性颠倒、其中一或多个核苷酸间连接键是3′到3′、5′到5′或2′到2′连接的。极性颠倒的寡核苷酸通常包括位于最3′端的核苷酸间连接键是一个单个的3′到3′连接，即一个单个的可能是脱碱基(核碱基丢失或在此被羟基代替)的颠倒核苷酸残基。还包括各种盐、混合的盐和游离酸形式的。

在例如美国专利3,687,808；4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,196；5,188,897；5,264,423；5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,306；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361；5,194,599；5,565,555；5,527,899；5,721,218；5,672,697和5,625,050中描述了带有含磷连接键的寡核苷酸的制备，这些专利全文以参考文献形式引入本文。

一些不包含硫酸二酯键的修饰寡核苷酸骨架是通过短链烷基或环烷核苷间连接键；混合的杂原子和烷基或环烷基核苷间连接键；或者一或多个短链杂原子或杂环核苷间连接键。这包括以下骨架：含有吗啉连接键(部分由核苷的糖基形成)的；硅氧烷骨架；硫化物、亚砜和砜骨架；formacetyl和thioformacetyl骨架；亚甲formacetyl和thioformacetyl骨架；核糖乙酰基(riboacetyl)骨架；含链烯骨架；氨基磺酸骨架；亚甲亚氨基和亚甲肼骨架；磺酸酯和磺胺骨架；酰胺骨架；以及其他含有混合的N10，S和CH2成分的。特别有益的是包含一或多个带电部分的骨架连接键。描述制备以上寡核苷酸的美国专利的例子包括美国专利5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,264,562；5,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677；5,541,307；5,561,225；5,596,086；5,602,240；5,610,289；5,602,240；5,608,046；5,610,289；5,618,704；5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,677,437；5,792,608；5,646,269和5,677,439，这些专利均全文以参考文献的方式引入本文。

修饰寡核苷酸还可以含有一或多个被取代的糖基。例如，这些寡核苷酸可以包括以下2′-修饰之一：OH；F；O-，S-，或N-烷基；O-，S-，或N-链烯基；O-，S-或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中烷基、链烯基和炔基可以是取代或未取代的C1到C10烷基或C2到C10链烯基和炔基，或者2′-O-(O-carboran-1-yl)甲基。具体例子是O[(CH₂)nO]mCH₃、O(CH₂)-OCH₃、O(CH₂)nNH₂、O(CH₂)nCH₃、O(CH₂)[pi]ONH₂和O(CH₂)nON[(CH₂)nCH₃)]₂)，其中n和m是1到10。其他示范性的寡核苷酸包括以下2′-修饰之一：C1到C10以下烷基、取代的低级烷基、链烯基、炔基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH1、SCH₃、OCN、Cl、Br、CN、CF₃、OCF₃、SOCH₃、SO₂CH₃、ONO₂、NO₂、N₃、NH₂、杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷基氨基、聚烷基氨基、取代的硅烷基、报告基团、嵌入剂、提高寡核苷酸药物代谢动力学特性的基团，或者提高寡核苷酸药物动力学的基团。例子包括2′-甲氧基乙氧基(2′-O-CH₂CH₂OCH₃，又称为2′-O-(2-甲氧乙基)，或2′-MOE)(Martin et al.，HeIv.Chim.Acta，1995，78，486-504)即烷氧基烷氧基基团；2′-二甲基氨基氧乙氧基，即-O(CH₂)₂ON(CH₃)₂基团，又称为2′-DMAOE；以及2′-二甲基氨基乙氧乙氧基(又称为2′-O-二甲基氨基乙氧乙基或2′-DMAEOE)，即2′-O-CH₂-O-CH₂-N(CH₂)₂。

其他修饰包括锁核酸(LNAs)，其中2′-羟基基团连接到糖环的3′或4′碳原子上，从而形成双环糖组分。连接键可以是连接2′氧原子和4′碳原子的亚甲基(-CH2-)基团，其中n是1或2。LNAs及其制备在WO 98/39352和WO 99/14226中有描述，这两项申请全文以参考文献形式引入本文。

其他修饰包括硫-氮桥修饰，比如Orum et al.(2001)Curr.Opin.MoI.Ther.3：239-243中描述的锁核酸。

其他修饰包括2′-甲氧基(2′-O-CH₃)、2′-甲氧乙基(2′O-CH₂-CH₃)、2′-乙基、2′-乙氧基、2′-氨丙氧基(2′-OCH₂CH₂CH₂NH₂)、2′-烯丙基(2′-CH₂-CH＝CH₂)、2′-O-烯丙基(2′-O-CH₂-CH＝CH₂)和2′-氟代(2′-F)。

所述2′-修饰可以是在阿拉伯糖(上)位置或者核糖(下)位置。还可以在寡核苷酸的其他位置做类似修饰，特别是3’末端核苷酸的糖的3’位置，或者在2′-5′连接的寡核苷酸中以及5’末端核苷酸的5’位置。所述寡核苷酸还可以具有比如环丁基组分这样的糖模拟物来代替戊呋喃糖。描述制备这类修饰糖结构的示范性美国专利包括，例如美国专利4,981,957；5,118,800；5,319,080；5,359,044；5,393,878；5,446,137；5,466,786；5,514,785；5,519,134；5,567,811；5,576,427；5,591,722；5,597,909；5,610,300；5,627,053；5,639,873；5,646,265；5,658,873；5,670,633；5,792,747；以及5,700,920，所有这些专利均全文以参考文献形式引入本文。

再一些修饰包括由接头连在一起的多个寡核苷酸序列所构成的ON多联体。所述接头可以，例如由修饰核苷酸或非核苷酸单元构成。在一些实施方案中，所述接头赋予ON多联体柔性。使用这种ON多联体提供了一种简单易行的方法，通过连接小的寡核苷酸构件达到需要的长度，来合成最终分子。例如，可以用12碳的接头(C12磷酰胺)来连接二或多个ON多联体，并能提供长度、稳定性和柔性。

用于本文，″未修饰″或″天然″碱基(核苷碱基)括嘌呤碱基－腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，以及嘧啶碱基－胸腺嘧啶(T)，胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。所述寡核苷酸还可以包括碱基修饰或取代。修饰碱基包括其他的合成和天然碱基，比如5-甲基胞嘧啶(5-Me-C)，5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤；腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其他烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物；2-巯基尿嘧啶，2-巯基胸腺嘧啶和2-巯基胞嘧啶；5-盐尿嘧啶和胞嘧啶；5-丙炔(-C≡C-CH3)尿嘧啶和胞嘧啶以及嘧啶碱基的其他炔基衍生物；6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶；5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-巯基尿嘧啶；8-盐、8-氨基、8-巯基、8-硫代烷基、8-羟基和其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤；5-盐特别是5-溴代、5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶；7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤；2-F-腺嘌呤、2-氨基-腺嘌呤、8-氮鸟嘌呤和8-氮腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤以及3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。其他修饰碱基包括三环嘧啶比如吩噁嗪胞苷(1H-嘧啶[5，4-b][1，4]苯并噁嗪-2(3H)-酮)、吩噻嗪胞苷(1H-嘧啶[5，4-b][1，4]苯并噻嗪-2(3H)-酮)；G-封条比如取代的吩噁嗪胞苷(例如9-(2-氨基乙氧基)-H-嘧啶[5，4-b][1，4]苯并噁嗪-2(3H)-酮)、咔唑胞苷(2H-嘧啶[4，5-b]吲哚-2-酮)、吡啶并吲哚胞苷(H-pyrido[3′，2′：4，5]吡咯[2，3-d]嘧啶-2-酮)。修饰的碱基还可以包括那些以其他杂环替代嘌呤或嘧啶碱基的。例如7-脱氮-腺嘌呤、7-脱氮鸟苷、2-氨基吡啶和2-吡啶酮。其他核碱基包括美国专利3,687,808中描述过的那些、The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering(pages858-859，Kroschwitz，J.I.，ed.John Wiley&Sons，1990)中公开的、Englisch等(Angewandte Chemie，International Edition，1991，30，613)公开的和Sanghvi，Y.S.等(Chapter 15，Antisense Research and Applicatiohs，pages 289-302，Crooke，S.T.and Lebleu，B.，ed.，CRC Press，1993)公开的。

另一种修饰包括二硫代磷酸酯连接键。在知道二硫代磷酸酯ON(PS2-ON)和PS-ON对蛋白质有相似的结合亲和力(Tonkinson et al.(1994)Antisense Res.Dev.4：269-278；Cheng et al.(1997)J.Mol.Recogn.10：101-107)，并且ON的一个可能作用机制是结合到病毒蛋白质上的情况下，会很希望在本发明描述的抗病毒ON中包含二硫代磷酸酯键。

另一种修饰ON的手段是生成专一立体性(stereodefined)或集中立体性的(stereo-enriched)ON，参见Yu等(2000)Bioorg.Med.Chem.8：275-284 andin Inagawa et al.(2002)FEBS Lett.25：48-52。常规方法制备的ON因为参与核苷酸间连接键的磷原子周围的不对称性所以是由非对映异构体混合物构成的。这可能影响到ON和病毒成分(比如病毒蛋白质)结合的稳定性。以前的数据表明蛋白质结合是依赖于立体性的(Yu等)。因此使用立体专一或立体集中的ON可以提高它们的蛋白结合特性以及抗病毒效力。

引入象以上描述的这些修饰可以在许多不同的引入方式和水平上进行。这就是说，一个特定修饰不必包括在寡核苷酸中的每个核苷酸或连接键上，可以在单个寡核苷酸，甚至是单个核苷酸中联合使用不同的修饰。

作为例子，并与以上描述一致，含有硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯连接键的修饰寡核苷酸还可以含有一或多个取代糖组分，特别是在糖组分上的修饰，它们包括，但不限于2′-乙基、2′-乙氧基、2′-甲氧基、2′-氨丙氧基、2′-烯丙基、2′-氟代、2’-戊基、2′-丙基、2′-二甲基氨氧乙氧基和2′-二甲基氨基乙氧乙氧基。所述2′修饰可以发生在阿拉伯糖(上)或核糖(下)位置。优选的2′-阿拉伯糖基修饰是2′-氟代。类似的修饰还可以是在寡核苷酸的其他位置，特别是3’末端核苷酸的糖基3′位置，或者2′-5′连接的寡核苷酸中，以及5’末端核苷酸的5’位置。寡核苷酸还可以含有糖模拟物，比如环丁基组分代替了戊呋喃糖。而且，ON可以具有这样的结构，或者是包含这样的部分，即由含有无环丙二醇磷酸二酯骨架构成的乙二醇核酸(GNA)(Zhang L，et al(2005)J.Am.Chem.Soc.127(12)：4174-5)。这种GNA可以包含硫代磷酸酯连接键，并只含有嘧啶碱基。

寡核苷酸合成

本发明的寡核苷酸可以利用本领域已知的方法来合成。例如，可以用标准磷酰胺化学法以碘进行氧化，在自动DNA合成仪(例如AppliedBiosystems model 380B)上合成未取代和取代磷酸二酯(P＝O)寡核苷酸。硫代磷酸酯(P＝S)可以按照磷酸二酯寡核苷酸的方法合成，只是将标准的氧化瓶换成溶于乙腈的0.2 M的311-1，2-苯基二硫化-3-酮1，1-二氧化物溶液来逐步将亚磷酸酯键硫代。硫化步骤可以增加到68秒，然后进行封闭步骤。从CPG柱子切割寡核苷酸并在浓缩的氢氧化铵中于55℃进行去封闭(18小时)，通过用2.5倍体积的乙醇从0.5M NaCl溶液中沉淀两次来纯化所述寡核苷酸。

磷酸酯寡核苷酸可以如美国专利5,508,270所述来制备；烷基磷酸酯寡核苷酸可以按照美国专利4,469,863来制备；3′-脱氧-3′-亚甲基磷酸酯寡核苷酸可以按照美国专利5,610,289和5,625,050的描述制备；亚磷酰胺寡核苷酸可以按照美国专利5,256,775和5,366,878的描述制备；烷基硫代磷酸酯寡核苷酸可以按照已公开的PCT申请PCT/US94/00902和PCT/US93/06976(分别以WO 94/17093和WO 94/02499出版)的描述制备；3′-脱氧-3′-氨基磷酰胺寡核苷酸可以按照美国专利5,476,925制备；磷酸三酯寡核苷酸可以按照美国专利5,023,243的描述制备；硼代磷酸酯寡核苷酸可以按照美国专利5,130,302和5,177,198的描述制备；亚甲基甲基亚氨基连接的寡核苷酸，又称为MMI连接的寡核苷酸、亚甲基二甲基-腙(methylenedimethyl-hydrazo)连接的寡核苷酸，又称为MDII连接的寡核苷酸、亚甲基羰基氨基连接的寡核苷酸，又称为酰胺-3连接的寡核苷酸、以及亚甲基氨基羰基连接的寡核苷酸，又称为酰胺-4连接的寡核苷酸、和带有例如交替的MMI和P＝O或P＝S连接键的混合骨架化合物可以按照美国专利5,378,825、5,386,023、5,489,677、5,602,240和5,610,289的描述制备；formacetal和硫代formacetal连接的寡核苷酸可以按照美国专利5,264,562和5,264,564的描述制备；氧化乙烯连接的寡核苷酸可以按照美国专利5,223,618的描述制备。提及的这些专利和专利申请均以参考文献的方式全文引入本文。

寡核苷酸制剂和药用组合物

发明所述寡核苷酸可以制备成寡核苷酸制剂或药用组合物。因此本发明的寡核苷酸也可以与其他分子、分子结构或化合物的混合物进行混合、包封、偶联或以其他方式相关联，以便协助摄取、分布和/或吸收，所述分子、结构或混合物的例子有脂质体；受体靶向分子；口服、直肠、局部或其他制剂。描述制备这些摄取、分布和/或吸收协助制剂的示范性美国专利包括例如，美国专利5,108,921；5,354,844；5,416,016；5,459,127；5,521,291；5,543,158；5,547,932；5,583,020；5,591,721；4,426,330；4,534,899；5,013,556；5,108,921；5,213,804；5,227,170；5,264,221；5,356,633；5,395,619；5,416,016；5,417,978；5,462,854；5,469,854；，5,512,295；5,527,528；5,534,259；5,543,152；5,556,948；5,580,575；和5,595,756，这些专利均全文以参考文献方式引入本文。

本发明的寡核苷酸、制剂和组合物包括任何可药用盐、酯或这些酯的盐类，或者任何其他在给予动物(包括人)时，能够(直接或间接)提供有生物活性的代谢物或其残基的化合物。相应的，例如本公开也适用于发明所述化合物的前药和可药用盐，这些前药的可药用盐，及其他生物等同物。

名词″前药″是指这样的医药试剂，其被制备成非活性的形式，在体内或细胞内经过内源酶或其他化学物质和/或条件的作用转变成活性形式(即药物)。在具体实施方案中，按照Gosselin等的WO 93/24510和lmbach等的WO 94/26764和美国专利5,770,713中公开的方法将所述寡核苷酸的前药形式制备成SATE[(S-乙酰-2-硫代乙基)磷酸酯]衍生物，这些专利和申请全文以参考文献形式引入本文。

名词″可药用盐″是指发明所述化合物的生理学和医药学可接受盐类，即保留了发明所述化合物的所需生物活性，而不会带来不想要的毒性作用的盐类。许多这类可药用盐类是已知的，可以用于本发明。

对寡核苷酸来说，有用的可药用盐类的例子包括，但不限于与阳离子，比如钠、钾、铵、镁、钙形成的盐；与多胺，比如精胺和亚精胺等形成的盐；与无机酸，例如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、硝酸等形成的酸加成盐；与有机酸，例如乙酸、草酸、酒石酸、琥珀酸、马来酸、延胡索酸、葡糖酸、柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸、苯甲酸、单宁酸、棕榈酸、褐藻酸、多谷氨酸、柰磺酸、甲磺酸、p-甲苯磺酸、柰二磺酸、多聚半乳糖醛酸等形成的盐；以及由基本阴离子，比如氯、溴和碘形成的盐。

本发明还包括含有发明所述抗病毒寡核苷酸的药用组合物和制剂。这些药用组合物可以通过多种方法给药，具体取决于是否需要局部或系统性治疗，以及治疗的部位。例如，给药可以是局部(包括眼的和粘膜(包括阴道和直肠递送)；肺部，例如借助喷雾剂吸入(inhalation或insufflation)粉末或气雾剂；气管内；鼻内；皮肤和经皮；口服；或肠胃外的。肠胃外给药包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或肌内注射或灌注；或者颅内，例如鞘内或脑室内给药。

用于局部给药(topical administration)的药用组合物和制剂可以包括经皮膜片、软膏、乳液、乳膏、胶、滴液、栓剂、喷雾、液体和粉末。可能还需要或希望含有常规可药用载体(水性、粉末或油基的)、增稠剂等。有包被的橡皮套、手套等可能也有用。优选的局部用制剂包括这样一些制剂，在这些制剂中本发明的寡核苷酸与局部递送剂混合在一起，所述局部递送剂是比如脂类、脂质体、脂肪酸、脂肪酸酯、类固醇、螯合剂和表面活性剂。优选的脂类和脂质体包括中性的(例如二油酯酰磷脂酰DOPE乙醇胺、二豆蔻酰磷脂酰胆碱DMPC、二硬酯酰磷脂酰胆碱)、带负电荷的(例如二豆蔻酰磷脂酰甘油DMPG)和阳离子性(例如二油酯酰四甲基氨丙基DOTAP和二油酯酰磷脂酰乙醇胺DOTMA)。寡核苷酸可以包封在脂质体中或与其形成复合体，特别是阳离子脂质体。替代的，所述寡核苷酸可以与脂类形成复合体，特别是阳离子脂类。优选的脂肪酸和酯包括，但不限于花生四烯酸、油酸、花生酸、月桂酸、辛酸、癸酸、豆蔻酸、棕榈树、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、二癸酸酯、三癸酸酯、油酸单甘油酯、二月桂酸酯、甘油1-单癸酸酯、1-十二烷基氮杂环庚烷-2-酮、酰基肉碱、乙酰胆碱，或C1-10烷基酯(例如异丙基豆蔻酸IPM)-1-甘油单酯、甘油二酯或这些物质的可药用盐。

用于口服的组合物和制剂包括粉末或颗粒、微粒、纳米粒子、水或非水介质的悬浮液或溶液、囊、胶囊、香囊、片剂或微片剂。可能还需要增稠剂、增味剂、稀释剂、乳化剂、分散剂或粘合剂。优选的口服制剂是那些将发明所述寡核苷酸与一或多种渗透增强剂表面活性剂和螯合剂联合给药的制剂。示范性的表面活性剂包括脂肪酸和/或它们的酯或盐，胆汁酸和/或它们的盐。示范性的胆汁酸/盐包括鹅脱氧胆酸(CDCA)和熊脱氧胆酸(UDCA)、胆酸、脱氢胆酸、脱氧胆酸、葡糖胆酸、甘氨胆酸、甘氨脱氧胆酸、牛胆酸、牛脱氧胆酸、牛-24，25-二氢梭链孢酸钠、甘氨二氢梭链孢酸钠。示范性的脂肪酸包括花生四烯酸、十一烷酸、油酸、月桂酸、辛酸、癸酸、豆蔻酸、棕榈树、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、二癸酸酯、三癸酸酯、油酸单甘油酯、二月桂酸酯、甘油1-单癸酸酯、1-十二烷基氮杂环庚烷-2-酮、酰基肉碱、乙酰胆碱，或甘油单酯、甘油二酯或这些物质的可药用盐(例如钠盐)。还优选的是将渗透增强剂，例如脂肪酸/盐与胆汁酸/盐联用。特别优选的联用是将月桂酸、癸酸的钠盐与UDCA联用。其他示范性的渗透增强剂包括聚氧化乙烯-9-月桂乙醚、聚氧化乙烯-20-十六烷乙醚。本发明的寡核苷酸可以以颗粒形式(包括喷雾的干颗粒)，或者络合形成微粒或纳米粒经口递送。寡核苷酸的络合剂包括多聚氨基酸；多聚亚胺；聚丙烯酸酯；聚烷基丙烯酸酯、聚氧乙烷、聚烷基氰基丙烯酸酯；阳离子化的明胶、清蛋白、淀粉、丙烯酸酯、聚乙二醇(PEG)和淀粉；聚烷基氰基丙烯酸酯；DEAE衍生的聚亚胺、pollulans、纤维素，以及淀粉。尤其有利的络合剂包括壳聚糖、N-三甲基壳聚糖、聚-L-赖氨酸、聚组氨酸、聚鸟氨酸、聚精胺、鱼精蛋白、聚乙烯吡啶、聚硫代二乙基氨基-甲基乙烯P(TDAE)、聚氨苯乙烯(例如p-氨基)、聚甲基氰基丙烯酸酯、聚乙基氰基丙烯酸酯、聚丁基氰基丙烯酸酯、聚异丁基氰基丙烯酸酯、聚异己基氰基丙烯酸酯、DEAE-异丁烯酸酯、DEAE-己基丙烯酸酯、DEAE-丙烯酰胺、DEAE-清蛋白和DEAE-葡聚糖、聚甲基丙烯酸酯、聚己基丙烯酸酯、聚(D，L-乳酸)、聚(DL-乳酸-聚-乙醇酸(PLGA)、褐藻酸盐和聚乙二醇(PEG)。

用于阴道递送的组合物可以是多种形式，包括例如，凝胶、乳膏、片剂、药片、胶囊、栓剂、膜或者任何其他能附着在粘膜上，不会轻易冲走的可药用形式。现有技术描述过用于阴道递送的大量不同制剂，例如在美国专利4,615,697和6,699,494中，这两份专利全文以参考文献方式引入本文。

此外，可以在制剂中联合使用添加剂(象专利美国4,615,697描述的那些)以便使递送系统达到最佳或所希望的效果，或者方便患者。这类添加剂包括，例如润滑剂、增塑剂、防腐剂、成胶剂、片剂成形剂、丸剂成形剂、栓剂成形剂、膜成形剂、乳膏成形剂、崩解剂、包衣、粘合剂、媒介物、增色剂、味道和/或气味控制剂、湿润剂、粘度控制剂、pH调节剂及类似试剂。

在一些实施方案中，所述组合物可以包括交联的多元羧酸聚合物制剂，在美国专利4,615,697中有基本描述。一般来说，在这些实施方案中，所述制剂的聚合物中至少80％的单体应当含有至少一个羧基功能团。所述交联剂的量应能提供足够的生物附着，使系统在靶上皮表面附着充足的时间以便达到所需剂量。

用于阴道给药时，所述制剂要在水平表面附着至少大约24小时到48小时。这方面结果可以在不同时间段内，通过检测取自阴道的样品因为聚合物的持续存在而发生pH下降来临床测定。这种优选的生物粘附水平通常当交联剂在聚合物重量的大约0.1-6.0％时可以达到，最优选的情况是大约1.0到2.0重量百分比，只要能得到合适的生物粘附水平。生物粘附还可以经商品表面张力计测量粘附强度来测定。

通过改变聚合物中的交联剂的用量来调节聚合物制剂，使其释放速率得到控制。合适的交联剂包括二乙烯醇、二乙烯苯、N，N-二烯丙丙烯酰胺、3，4-二羟基-1，5-己二烯、2，5-二甲基-1，5-己二烯和类似试剂。

优选用于这类制剂的聚合物是聚卡波菲(Polycarbophil，U.S.P.)，该商品由B.F.Goodrich Speciality Polymers of Cleveland，Ohio生产，以NOVEON.RTM.-AA1的名字销售。The United States Pharmacopeia(1995edition，United States Pharmacopeial Convention，Inc.，Rockville，Md.，at pages1240-41)指出聚卡波菲是以二乙烯醇交联在一起的聚丙烯酸。

其他可能用于这种药物递送系统制剂的有用生物粘附聚合物在专利4,615,697中提到过。例如，它们包括以例如3，4-二羟基-1，5-己二烯交联的聚丙烯酸聚合物，以及以例如二乙烯苯交联的聚甲基丙烯酸聚合物。通常，不会使用这些聚合物的盐形式，因为这会降低它们的生物粘附能力。这类生物粘附聚合物可以利用引发剂，比如过氧化苯甲酰、偶氮二异丁腈等通过常规自由基聚合技术来制备。制备有用生物粘附物的例子在专利4,615,697中提供了。

用于肠胃外、鞘内或脑室内给药的组合物和制剂可以包括无菌水溶液，该溶液中也可以含有缓冲液、稀释剂和其他合适的添加剂，比如，但不限于，渗透增强剂、载体化合物和其他可药用载体或赋形剂。

本发明的药用组合物包括，但不限于，溶液、乳剂和含脂质体制剂。这些组合物可以生产自多种成分，所述成分包括，但不限于，预先制成的液体、自乳化固体和自乳化半固体。

本发明的药用组合物可以方便地以单位剂量的形式呈现，可以按照制药业熟知的常规技术来制备。这些技术包括使活性成分与可药用载体或赋形剂相关联的步骤。一般来说，制剂的制备是使活性成分与液态载体或精细分散的固态载体或这两种载体发生关联，然后根据需要对产品进行震荡。

本发明的组合物可以配制成许多可能剂量形式之一，比如，但不限于，片剂、药囊、胶囊、液体糖浆、软凝胶、栓剂和灌肠剂。本发明的组合物还可以配制成水、非水或混合介质中的悬浮液。水性悬浮液可以进一步含有能提高该悬浮液粘度的物质，包括例如，羧甲基纤维素钠、山梨糖醇和/或葡聚糖。所述悬浮液还可以含有稳定剂。

在本发明的一个实施方案中，所述药用组合物可以配制成医药泡沫剂并以该形式使用。医药泡沫剂包括的制剂，比如，但不限于乳剂、微乳剂、乳膏、油膏和脂质体。这些制剂虽然基本性质类似，但它们在最终产品的成分和稠度上不同。如何制备这些组合物及制剂是制药和成剂工艺技术人员通常已知的，可以应用于配制本发明的组合物。

乳剂

本发明的制剂和组合物可以制备并配置成乳剂。典型的乳剂是一种液体以通常直径超过0.1μm的小滴的形式分散在另一种液体中所形成的异源体系(Idson，in Pharmaceutical Dosage Forms，Lieberman，Rieger and Banker(Eds.)，1988，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，Vol.1，p199；Rosoff，inPharmaceutical Dosage Forms，Lieberman，Rieger and Banker(Eds.)，1988，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，Vol.1，p245；Block in PharmaceuticalDosage Forms，Lieberman，Rieger and Banker(Eds.)，1988，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，Vol.2，p335；Higuchi et al.，in Remington′s PharmaceuticalSciences，Mack Publishing Co.，Easton，Pa.，1985，p301)。乳剂通常是包含两个不可混合液相的两相体系，这两个液相密切混合和分散。一般来说，乳剂或是油包水(w/o)或是水包油(o/w)类型。水相细致地分解成微小液滴并分散到很大体积的油相中时所产生的组合物称为油包水(w/o)乳剂。替代地，如果油相分解成微小液滴并扩散到大体积水相，产生的组合物称为水包油(o/w)乳剂。除了扩散相和活性药物，乳剂还可以含有其他成分，其中活性药物可能是以水相、油相中的溶液形式存在，或者本身自成一相。如果需要，乳剂中还可以有可药用赋形剂，比如乳化剂、稳定剂、染料和抗氧化剂。可药用乳剂还可以是多重乳剂，包含两个以上的液相，比如例如油-水-油(o/w/o)和水-油-水(w/o/w)乳剂。这类复合制剂通常具有一些简单的两相乳剂所没有的优势。o/w乳剂中的单个油滴包裹着小的水滴就构成w/o/w乳剂。同样地，如果油滴被油液中稳定存在的水珠包裹着所构成的体系就是o/w/o乳剂。

乳剂特性在于有很少或没有热动力学稳定性。通常，乳剂的分散或不连续相很好地分散到外相或连续相中，并且借助乳化剂或制剂的粘度而维持这种状态。乳剂的两相都可以是半固体或固体的，比如乳剂形式的软膏基质和乳膏就是这种情况。其他稳定乳剂的手段需要使用到可以引入乳剂的任何一相中的乳化剂。乳化剂可以大概分成4类：合成表面活性剂、天然乳化剂、吸收基质和超细分散固相(Idson，in Pharmaceutical Dosage Forms，Lieberman，Rieger and Banker(Eds.)，1988，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，Vol.1，p199)。

合成表面活性剂(surfactant)，又称为表面活性剂(surface active agents)广泛应用于乳剂制剂，对此已有文献综述(Rieger，in Pharmaceutical DosageForms，Lieberman，Rieger and Banker(Eds.)，1988，Marcel Dekker，Inc.，NewYork，N.Y.，Vol.1，p285；Idson，in Pharmaceutical Dosage Forms，Lieberman，Rieger和Banker(Eds.)，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，1988，Vol.1，p199)。表面活性剂通常是两亲性的，包含一个亲水和一个疏水部分。表面活性剂亲水部分与疏水部分的比率被称为亲水/亲脂平衡值(HLB)，是对表面活性剂进行分类和在制备制剂时选择表面活性剂的有用工具。表面活性剂根据其亲水基团可以分成不同种类：非离子型、阴离子型、阳离子型和兼性型(Rieger，in Pharmaceutical Dosage Forms，Lieberman，Rieger and Banker(Eds.)，1988，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，Vol.1，p285)。

用于配制乳剂的天然乳化剂包括羊毛脂、蜂蜡、磷脂、卵磷脂和金合欢胶。吸附基质具有亲水特性因此它们能够吸收水分形成w/o乳剂，但仍保持它们的半固体稠度，比如无水羊毛脂和亲水凡士林。颗粒极细的固体也可以是很好的乳化剂，尤其是与表面活性剂联用和用于粘性制备物时。这类乳化剂包括极性无机固体，比如重金属氧化物、非膨润性粘土比如皂土、凹凸棒粘土、水辉石(hectorite)、高岭土、蒙脱石(montmorillonite)、胶体硅酸铝和胶体硅酸镁铝、色素以及非极性固体比如碳或甘油三硬脂酸酯。

乳剂制剂中还包括许多影响乳剂特性的非乳化物质。这些物质包括脂肪、油、蜡、脂肪酸、脂肪醇、油酯、湿润剂、亲水胶体、防腐剂和抗氧化剂(Block，in Pharmaceutical Dosage Forms，Lieberman，Rieger and Banker(Eds.)，1988，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，volume 1，p.335；Idson，inPharmaceutical Dosag&Forms，Lieberman，Rieger and Banker(Eds.)，1988，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，volume 1，p.199)。

亲水胶体(Hydrophilic colloids或hydrocolloids)包括天然树胶和合成聚物合比如多糖(例如金合欢胶、琼脂、褐藻酸、角叉藻聚糖、瓜尔豆胶(guargum)、刺梧桐胶(karaya gum)和黄芪胶)、纤维素衍生物(例如羧甲基纤维素和羧丙基纤维素)以及合成聚合物(例如carbomers、纤维素醚和多聚羧乙烯)。这些物质分散到水中或者在水中膨胀形成胶溶液，进而通过在分散相液滴周围形成强的界面膜以及增加外相粘度来稳定乳剂。

因为乳剂经常含有许多适合微生物生长的成分，比如碳水化合物、蛋白质、固醇和磷脂，这类制剂常要加入防腐剂。乳剂制剂中常用的防腐剂包括对羟基苯甲酸甲酯(methyl paraben)、对羟基苯甲酸丙酯(propylparaben)、季胺盐、苯扎氯铵(benzalkonium chloride)、对羟基苯甲酸和硼酸的酯类。乳剂制剂中也经常加入抗氧化剂来防止制剂发生变质。常用抗氧化剂可以是自由基清除剂(比如生育酚、烷基没食子酸盐、丁化羟基苯甲醚、丁化羟基甲苯)，或者还原剂(比如抗坏血酸和焦亚硫酸钠)，以及抗氧化增效剂(比如柠檬酸、酒石酸和卵磷脂)。

乳剂制剂的经皮、口服以及肠胃外途径应用和它们的制备方法已有综述文献(Idson，in Pharmaceutical Dosage Forms，Lieberman，Rieger and Banker(Eds.)，1988，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，volume 1，p.199)。因为成剂方便、吸收效果和生物可得性方面的原因，口服的乳剂制剂应用很广泛(Rosoff，in Pharmaceutical Dosage Forms，Lieberman，Rieger and Banker(Eds.)，1988，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，volume 1，p.245；Idson，inPharmaceutical Dosage Forms，Lieberman，Rieger and Banker(Eds.)，1988，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，volume 1，p.199)。矿物油基质缓泻药、脂溶维生素和高脂营养制是常见的以o/w乳剂形式经口服给予的物质中的例子。

本发明一个实施方案中，寡核苷酸组合物可以制备成微乳剂。微乳剂可以定义为水、油和亲水脂分子体系，它是一个光学上各向同性的、热动力学稳定的液体溶液(Rosoff，in Pharmaceutical Dosage Forms，Lieberman，Rieger and Banker(Eds.)，1988，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，volume 1，p.245)。制备典型的微乳剂是首先将油分散到水性表面活性剂溶液中，然后加入足够量的第四种成分(通常是中等链长的醇)从而形成一个透明体系。因此，微乳剂被描述为是两种不相溶液体构成的热动力学稳定、各向同性的清澈分散体系，其中这两种液体借助表面活性分子的界面膜来稳定(Leungand Shah，in：Controlled Release of Drugs：Polymers and Aggregate Systems，Rosoff，M.，Ed.，1989，VCH Publishers，New York，pages 185-215)。微乳剂通常是将包括油、水、表面活性剂、共表面活性剂和电解质的三到五种成分混合制备的。微乳剂是油包水(w/o)或水包油(o/w)型取决于所用的油和表面活性剂的特性以及表面活性剂分子极性头部和碳氢化合物尾部的结构和几何排列方式(Schott，in Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack PublishingCo.，Easton，Pa.，1985，p.271)。

人们对采用相位图进行的现象学方法已有广泛研究，获取的大量知识可供本领域技术人员用于决定如何配制微乳剂(Rosoff，in PharmaceuticalDosage Forms，Lieberman，Rieger and Banker(Eds.)，1988，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，volume 1，p.245；Block，in Pharmaceutical Dosage Forms，Lieberman，Rieger and Banker(Eds.)，1988，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，volume 1，p.335)。相较传统的乳剂，微乳剂的优点在于使水不溶性的药物能够溶于自发形成的热动力学液滴构成的制剂中。

用于制备微乳剂的表面活性剂包括，但不限于离子型表面活性剂、非离子型表面活性剂、Brij 96、聚氧乙烯油基醚、聚甘油脂肪酸酯、四甘油单月桂酸酯(ML310)、四甘油单油酸酯(MO310)、六甘油单油酸酯(PO310)、六甘油五油酸酯(PO500)、十甘油单癸酸酯(decaglycerol monocaprate(MCA750))、十甘油单油酸酯(MO750)、十甘油异油酸酯(decaglycerolsequioleate(SO750))、十甘油十油酸酯(DAO750)，它们单独或与共表面活性剂联合使用。共表面活性剂通常是能够增加界面流动性的短链醇(比如乙醇、1-丙醇和1-丁醇)，它们实现这一功能是通过渗透到表面活性剂膜内，然后由于表面活性剂分子间产生的空隙而形成无序的膜。但是可以不使用共表面活性剂来制备微乳剂，现有技术中已有无醇自乳化微乳剂。水相一般是，但不限于是水、药物水溶液、甘油、PEG300、PEG400、多聚甘油、丙二醇和乙二醇衍生物。油相包括，但不限于以下物质，比如Captex 300、Captex355、Capmul MCM、脂肪酸酯、中链(C8-C12)单、二和三甘油酯、聚氧乙烯化的甘油脂肪酸酯、脂肪醇、聚乙二醇化的甘油酯、饱和聚乙二醇化的C8-C10甘油酯、植物油和硅酮油。

从药物溶解性和促进药物吸收的角度考虑，人们对微乳剂尤其感兴趣。已有人提议利用脂基微乳剂(o/w和w/o)来增加包括肽在内的药物的口服生物可得性(Constantinides et al.，Pharmaceutical Research，1994，11，1385-1390；Ritschel，Meth.Find.Exp.Clin.Pharmacol.，1993，13，205)。微乳剂具备的优点是能提高药物溶解度、防止药物被酶水解、由于表面活性剂导致的膜流动性和通透性的改变使得药物吸收可能增加、易于制备、比固体剂型更易于口服给药、临床药效提高以及毒性降低(Constantinides et al.，PharmaceuticalResearch，1994，11，1385；Ho et al.，J.Pharm.Sci.，1996，85，138-143)。室温将全部成分放在一起时，微乳剂经常能自发形成。这个特点在配制不耐热的药物、肽或寡核苷酸时尤其有利。微乳剂在化妆品和医药应用中也能有效地透皮递送活性成分。我们预期本发明的微乳剂组合物和制剂能协助提高寡核苷酸和核酸经肠胃道的系统吸收，以及增强肠胃道、阴道、口腔和其他给药部位内寡核苷酸和核酸的局部细胞摄取。

本发明的微乳剂还可以含有其他成分和添加剂，比如失水山梨醇单硬脂酸酯(Grill 3)、Labrasol以及渗透增强剂来改善制剂的特性，并促进发明所述寡核苷酸和核酸的吸收。用于本发明所述微乳剂的渗透增强剂可以划归5大类之一－表面活性剂、脂肪酸、胆汁盐、螯合剂和非螯合非表面活性剂(Lee et al.，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems，1991，p.92)。

脂质体

除了微乳剂，还有许多有序的表面活性剂结构得到研究并被应用于药物成剂。它们包括单分子层、胶束、双分子层和囊泡。囊泡能赋予药物递送特异性和作用持续性。因此，用在本文中，名词“脂质体”是指排列成球形双分子层或双分子层的两亲性脂类构成的囊泡，即脂质体是这样的单层或多层囊泡，其具有由亲油性物质形成的膜和水性内部。水性部分通常含有要递送的组合物。阳离子脂质体的优点是能与细胞壁融合。非阳离子脂质体虽然不能很有效地与细胞壁融合，但能被体内巨噬细胞摄取。为了跨过完整的哺乳动物皮肤，脂类囊泡必须在合适的透皮梯度的影响下，通过一系列直径小于50nm的微孔。所以，最好能使用形状高度可变、能通过这样小的孔道的脂质体。脂质体要考虑的其他因素包括脂表面电荷以及脂质体的水体积。

脂质体的其他优点还包括：由天然磷脂得到的脂质体是生物相容的和生物可降解的；脂质体中可以引入多种水和脂溶性药物；脂质体可以使包封在其内部的药物免于被代谢和降解(Rosoff，in Pharmaceutical DosageForms，Lieberman，Rieger and Banker(Eds.)，1988，Marcel Dekker，Inc.，NewYork，N.Y.，volume 1，p.245)。

对于局部给药来说，有证据表明脂质体比其他剂型更有优势。这些优势包括所给予药物在高系统吸收时造成的副作用降低了；药物在目标部位蓄积增加，以及能够将多种(亲水性和疏水性)药物给予皮内。包括止痛药、抗生素、激素和高分子量DNA在内的化合物都曾被给予皮肤，通常达到了针对上表皮的定向。

脂质体归属两大类。阳离子脂质体是带正电荷的脂质体，它们能与带负电的DNA分子相互作用形成稳定的复合体。带正电的DNA/脂质体复合体结合到带负电荷的细胞表面，并被内在化到内体中。内体中的酸性pH造成脂质体破裂，其内部物质被释放到细胞质内(Wang et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.，1987，147，980-985)。

pH-敏感或带负电荷的脂质体会截获DNA，而不是和它形成复合体。因为DNA和脂类带电荷类似，它们之间会发生排斥而非形成复合体。因此DNA会被截留到脂质体的水性内部。已有人用pH-敏感的脂质体来将编码胸苷激酶基因的DNA递送给培养物中的单层细胞(Zhou et al.，Journal ofControlled Release，1992，19，269-274)。

一类主要的脂质组合物包括除了天然获得的磷脂酰胆碱之外的磷脂。例如可以由二豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)或二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)形成中性脂质组合物。阴离子脂质组合物通常是由二豆蔻酰磷脂酰甘油形成的，而阴离子膜融合脂质体主要是由二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)形成的。另一类脂质组合物是由磷脂酰胆碱(PC)(比如大豆PC和卵PC)形成的。还有一类是由磷脂和/或磷脂酰胆碱和/或胆固醇的混合物形成的。

有些研究对脂质药物制剂到皮肤的局部递送进行了评价。在豚鼠皮肤敷上含有干扰素的脂质体使得皮肤疱疹裂口减少，而经其他方式(例如做成溶液或乳液)递送干扰素则无效(Weiner et al.，Journal of Drug Targeting，1992，2，405-410)。此外，另一项研究测试比较了将干扰素作为脂质制剂的一部分来给药，和用水性体系给予干扰素的效力，得到的结论是脂质体制剂优于水性给药方式(du Plessis et al.，Antiviral Research，1992，18，259-265)。

非离子型脂质系统，特别是包含非离子型表面活性剂和胆固醇的系统也被检验以确定它们在向皮肤递送药物方面的用途。有人用包含Novasone(TM)I(甘油二月桂酸酯/胆固醇/聚氧化乙烯-10-硬脂酰醚)和Novasome(TM)II(甘油二硬脂酸酯/胆固醇/聚氧化乙烯-10-硬脂酰醚)的非离子型脂质制剂将环孢菌素-A递送到小鼠皮肤真皮。实验结果表明这类非离子型脂质系统能够有效地促进环孢菌素沉积到皮肤的不同层中(Hu et al.S.T.P.Pharma.Sci.，1994，4，6，466)。

脂质体还包括″立体稳定的″脂质体，该名词用于本文时，是指含有这样一或多种特化的脂类的脂质体，这些脂类被引入脂质体时，会使其比那些没有这类特化脂类的脂质体在循环系统中的寿命长。立体稳定的脂质体的例子是那些其部分囊泡形成脂类包括一或多种糖脂的脂质体，所述糖脂是比如单唾液酰神经节苷脂GMi，或者是衍生有一或多种亲水聚合物，比如聚乙二醇(PEG)组分。虽然没有具体理论限制，人们相信对于含有神经节苷脂、鞘磷脂、或PEG衍生脂类的立体稳定脂质体来说，这些立体稳定脂质体在循环系统的半寿期延长是由于被摄取到网状内皮系统(RES)细胞内减少了(Allen et at.，FEBS Lett，1987，223，42；Wu et al.，Cancer Research，1993，53，3765)。

Papahadjopoulos et al.，Ann.N.Y.Acad.Sci.，1987，507，64(单唾液酰神经节苷脂GMi、硫酸半乳糖脑苷脂和磷脂酰肌醇)；Gabizon et at.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，1988，85，6949；Allen等，美国专利4,837,028和国际申请公开WO 88/04924 (鞘磷脂和神经节苷脂GM1或半乳糖脑苷脂硫酸酯)；Webb等，美国专利5,543,152(鞘磷脂)；Lim等，WO97/13499(1，2-sn-二豆蔻酰磷脂酰胆碱)中报道了各种包括一或多种糖脂的脂质体。

有些脂质体包含的脂类上衍生出一或多个亲水聚合物，描述其制备方法的有例如Sunamoto et al.Bull.Chem.Soc.Jpn.，1980，53，2768(含有PEG组分的非离子型去污剂)；Illum et al.FEBS Lett.，1984，167，79(用聚乙二醇对聚苯乙烯颗粒进行亲水包被)；Sears，美国专利4,426,330和4,534,899(通过连接上聚亚烃基二醇(例如PEG)的羧基基团被修饰的合成磷脂)；Klibanov et al.FEBS Lett.，1990，268，235(衍生了PEG或PEG硬脂酸酯的磷脂酰乙醇胺(PE))；Blume et al.Biochimica et Biophysica Acta，1990，1029，91(PEG-衍生化的磷脂，例如DSPE-PEG，它是由二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)和PEG组合形成的)；Fisher，欧洲专利EP 0 445 131 B1和WO 90/04384(脂质体外表面上共价结合的PEG组分)；Woodle等，美国专利5,013,556和5,356,633以及Martin等，美国专利5,213,804和欧洲专利EP 0 496 813 B1(含有1-20摩尔百分比的PE发生了PEG衍生化的脂质体组合物)；Martin等，WO91/05545和美国专利5,225,212以及Zalipsky等，WO 94/20073(含有许多其他脂类-聚合物偶联物的脂质体)；Choi等，WO 96/10391(包含PEG修饰的神经酰胺脂类的脂质体在中有描述)。Miyazaki等，美国专利5,540,935和Tagawa等，美国专利5,556,948(含有PEG的脂质体，可以进一步在其表面衍生功能组分)。

描述了包含核酸的脂质体的出版物有例如，Thierry等，WO 96/40062(在脂质体中包封大分子量核酸的方法)；Tagawa等，美国专利5,264,221(结合了蛋白质的含RNA脂质体)。Rahman等，美国专利5,665,710(在脂质体内包封寡脱氧核苷酸的方法)；Love等，WO 97/04787(包含了反义寡核苷酸的脂质体)。

另外一类脂质体——传递体(transfersome)是形状高度可变的脂类聚集体，它们是一种很有吸引力的药物递送载体(Cevc et al.，1998，BiochimBiophys Acta.1368(2)：201-15.)。传递体可以描述为这样的脂类液滴，因为有高度变形能力，所以它们能渗透到比液滴小的孔中。传递体能适应它的使用环境，例如它们形状可变、能自身修复、经常无须分裂就能到达目标、以及经常可自组装。制备传递体可以例如，通过向标准的脂质组合物中加入表面膜软化剂(通常是表面活性剂)。

表面活性剂

表面活性剂广泛应用于制剂中比如乳剂(包括微乳)和脂质体。对大量不同种类天然和合成表面活性剂进行分类和特性划分级别的最常用方法是采用亲水/亲脂平衡值(HLB)。亲水基团(又称为“头部”)的性质是最有用的对制剂中使用的不同表面活性剂进行分类的手段(Rieger，in PharmaceuticalDosage Forms，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，1988，p285)。

如果表面活性剂分子没有离子化，它就划分为非离子表面活性剂。非离子表面活性剂在医药和化妆产品中有广泛应用，它们可以在很宽的pH值范围内使用，并且根据结构，它们的HLB值一般在2到大约18。非离子表面活性剂包括非离子酯类，比如乙二醇酯、丙二醇酯、甘油酯、聚甘油酯、山梨聚糖酯、蔗糖酯和乙氧基化酯；非离子烷醇酰胺和乙醚，比如乙氧基脂肪醇、丙氧基醇和乙氧基/丙氧基嵌段聚合物也包含在这一类中。聚氧乙烯表面活性剂是非离子表面活性剂这一类中最常用的成员。

在溶于或分散于水中时，表面活性剂分子如果携带负电荷，该表面活性剂划分为阴离子型。阴离子表面活性剂包括羧基盐比如肥皂、酰基乳酰酯、氨基酸的酰胺物、硫酸酯类(比如烷基硫酸酯和乙氧基化的烷基硫酸酯)、磺酸酯(比如烷基苯磺酸酯)、酰基羟乙基磺酸酯、酰基牛磺酸酯和磺基琥珀酸酯以及磷酸酯。最常用的阴离子表面活性剂是烷基硫酸酯和肥皂。

在溶于或分散于水中时，表面活性剂分子如果携带正电荷，该表面活性剂划分为阳离子型。阳离子表面活性剂包括季胺盐和乙氧化胺，其中季胺盐是这类中最常用的。

如果表面活性剂分子既能携带阳离子，也可携带阴离子，该表面活性剂就是两性的。两性表面活性剂包括丙烯酸衍生物、取代的烷基胺、N-烷基甜菜碱和磷脂。

表面活性剂在药物制品、制剂和乳剂中的应用在Rieger，inPharmaceutical Dosage Forms，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，1988，p285中已有综述。

渗透增强剂(penetration enhancer)

在一些实施方案中，渗透增强剂被用在组合物中或者与组合物一起来提高核酸、尤其是寡核苷酸到动物皮肤或跨粘膜膜的递送效率。多数药物在溶液中既有离子化也有非离子化形式。但是，通常只有脂溶性或亲脂性的药物可以容易地跨过生物膜。有发现认为，如果将细胞膜用渗透增强剂进行处理，即使非亲脂性药物也可以跨膜。除了促进非亲脂性药物的跨细胞膜扩散，渗透增强剂还可以提高亲脂药物的透性。

渗透增强剂可以划归5大类之一，即表面活性剂、脂肪酸、胆汁盐、螯合剂和非螯合性非表面活性剂之一(Lee et al.，Critical Reviews inTherapeutic Drug Carrier Systems，1991，p92)。以上提到的渗透增强剂种类在下文有更详细的描述。

表面活性剂：与本发明联系在一起时，表面活性剂Surfactants(或″surface-active agents″)是这样一些化学实体，当溶于水溶液时它们能使溶液的表面张力，或水溶液和另一种液体之间的临界面张力降低，从而造成寡核苷酸经粘膜的吸收被提高。这类渗透增强剂包括例如，月桂基硫酸钠、聚氧化乙烯-9-月桂基乙醚和聚氧化乙烯-20-十六烷基乙醚(Lee et al.，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems，1991，p92)；以及全氟化化合物乳剂，比如FC-43(Takahashi et al.，J.Pharm.Pharmacol.，1988，40，252)。这些文章均以参考文献的形式全文引入本文。

脂肪酸：可以用做渗透增强剂的各种脂肪酸及其衍生物包括例如，油酸、月桂酸、癸酸(n-癸酸)、豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、二癸酸酯、三癸酸酯、油酸单甘油酯(1-单油酰-rac-甘油)、二月桂酸甘油酯(dilaurin)、辛酸、花生四烯酸、甘油1-单癸酸酯、1-十二烷基氮杂环庚烷-2-酮、酰基肉碱(acylcarnitines)、酰基胆碱、它们的C1-10碳烷基酯(例如甲基、异丙基和t-丁基)，及其单-和二甘油酯(即油酸酯、月桂酸酯、癸酸酯、豆蔻酸酯、棕榈酸酯、硬脂酸酯、亚油酸酯等)(Lee et al.，Critical Reviews inTherapeutic Drug Carrier Systems，1991，p92；Muranishi，Critical Reviews inTherapeutic Drug Carrier Systems，1990，7，1-33；El Hariri et al.，J.Pharm.Pharmacol.，1992，44，651-654)，这些文章均以参考文献的方式全文引入本文。

胆汁盐：胆汁的生理学作用包括促进脂肪和脂溶性维生素的分散和吸收(Brunton，Chapter 38in：Goodman&Gilman′s The Pharmacological Basis ofTherapeutics，9th Ed.，Hardman et al.Eds.，McGraw-Hill，New York，1996，p934-935)。各种天然胆汁盐及其合成衍生物可以作为渗透增强剂。因此名词″胆汁盐″包括胆汁的所有天然成分以及它们的合成衍生物。本发明的胆汁盐包括例如，胆酸(或其可药用钠盐：胆酸钠)、脱氢胆酸(脱氢胆酸钠)、脱氧胆酸(脱氧胆酸钠)、葡糖胆酸(葡糖胆酸钠)、甘氨胆酸(甘氨胆酸钠)、甘氨脱氧胆酸(甘氨脱氧胆酸钠)、牛磺胆酸(牛磺胆酸钠)、牛磺脱氧胆酸(牛磺脱氧胆酸钠)、鹅脱氧胆酸(鹅脱氧胆酸钠)、熊去氧胆酸(UDCA)、牛-24，25-二氢-梭链孢酸钠(STDHF)、甘氨二氢梭链孢酸钠和聚氧化乙烯-9-月桂基乙醚(polyoxyethylene-9-lauryl ether(POE))(Lee et al.，Critical Reviews inTherapeutic Drug Carrier Systems，1991，p92；Swinyard，Chapter 39 In：Remington′s Pharmaceutical Sciences，18th Ed.，Gennaro Eds.，Mack PublishingCo.，Easton，Pa.，1990，p782-783；Muranishi，Critical Reviews in TherapeuticDrug Carrier Systems，1990，7，1-33；Yamamoto et al.，J.Pharm.Exp.Ther.，1992，263，25；Yamashita et al.，J.Pharm.Sci.，1990，79，579-583)。

螯合剂：在本文的语境中，螯合剂可以认为是这样的化合物，它们能够通过与金属离子形成复合物而将之从溶液中去除，从而使得寡核苷酸经粘膜的吸收增强。就其在本发明中作为渗透增强剂而言，螯合剂另外还有可以作为DNase抑制剂的优点，因为多数已被研究过的DNA核酸酶的催化都需要二价金属离子，所以会被螯合剂抑制(Jarrett，J.Chromatogr.，1993，618，315-339)。本发明的螯合剂包括但不限于乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、柠檬酸、水杨酸盐(例如，水杨酸钠、5-甲氧水杨酸盐和高香草酸盐)、胶原蛋白的N-酰基衍生物、月桂醚-9和β-二酮(烯胺)的N-氨酰基衍生物(Lee et al.，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems，1991，p92；Muranishi，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems，1990，7，1-33；Buur et al.，J.Control Rel.，1990，14，43-51)。

非螯合非表面活性剂：用在本文中，非螯合非表面活性剂渗透增强化合物是这样一些化合物，它们没有明显的螯合剂或表面活性剂活性，但是仍能增强寡核苷酸经消化道粘膜的吸收(Muranishi，Critical Reviews inTherapeutic Drug Carrier Systems，1990，7，1-33)。这类渗透增强剂的例子包括，不饱和环脲、1-烷基-和1-烯基氮环-烷酮衍生物(Lee et al.，CriticalReviews in Therapeutic Drug Carrier Systems，1991，p92)；以及非类固醇抗炎药物比如双氯芬酸钠、吲哚美辛(indomethacin)和苯丁唑啉(phenylbutazone)(Yamashita et al.，J.Pharm.Pharmacol.，1987，39，621-626)。

还可以在发明所述可药用组合物及其他组合物和制剂中加入能够增强寡核苷酸在细胞水平的吸收的试剂。例如，阳离子脂类，比如阳离子脂质体(lipofectin)(Junichi et al.，美国专利5,705,188)、阳离子甘油衍生物和多聚阳离子分子，比如聚赖氨酸(Lollo et al.，PCT申请WO 97/30731)，也能增强寡核苷酸的细胞吸收。

其他可以用来促进所给予核酸的渗透的试剂包括甘醇(比如乙二醇和丙二醇)、吡咯(比如2-吡咯)、月桂氮卓酮和萜(比如柠檬烯和薄荷酮)。

载体(carrier)

本发明的一些组合物还在制剂中加入了载体化合物。用在本文中″载体化合物″或″载体″可以是指一种核酸或其类似物，它是惰性的(即其本身没有生物活性)，但会被那些能减少核酸的生物可得性的体内过程(例如通过降解有生物学活性的核酸或者促进其从循环系统的去除)当作是核酸。将核酸与载体化合物联合给药(通常情况下后者过量)，会使得从肝、肾或其他循环外储存器官回收的核酸量大大减少。例如，如果与多聚肌苷酸、葡聚糖硫酸盐、多聚胞苷酸或4-乙酰氨基-4′-异硫氰-芪-2，2′-二磺酸一起给药时，部分硫代磷酸酯化的寡核苷酸从肝组织中的回收率会下降(Miyao et al.，AntisenseRes.Dev.，1995，5，115-121；Takakura et al.，Antisense&Nucl.Acid Drug Dev.，1996，6，177-183)。

赋形剂(excipient)

与载体化合物不同，″可药用载体″或″赋形剂″是指可药用溶剂、悬浮剂或其他任何用于向动物递送一或多种核酸的药理学上惰性的传递媒介，赋形剂通常是液体或固体。选择可药用载体时，要考虑到计划的给药方式，使它在与核酸和给定药用组合物的其他成分联用时，提供所需的体积、稠度等。典型的可药用载体包括，但不限于粘合剂(例如，预凝胶化糯玉米淀粉(maize starch)、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素等)；填充剂(例如，乳糖和其他糖、微晶纤维素、果胶、明胶、硫酸钙、乙基纤维素、聚丙烯酸酯或磷酸氢钙等)；润滑剂(例如，硬脂酸镁、滑石、硅石、胶体二氧化硅、硬脂酸、金属硬脂酸盐、氢化植物油、玉米淀粉(corn starch)、聚乙二醇、苯甲酸钠、醋酸钠等)；崩解剂(例如淀粉、羧乙酸淀粉钠等)；和润湿剂(例如月桂基硫酸钠等)。

那些不会与核酸发生有害反应的适用于非肠道外给药的可药用有机或无机赋形剂也可以用来配制发明所述组合物。合适的可药用载体包括，但不限于水、盐溶液、醇、聚乙二醇、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘性石蜡、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。

用于将核酸进行局部给药的制剂可以包括灭菌和未灭菌水溶液、溶于常见溶剂(比如醇)的非水溶液、或者是液体或固体油基质中的核酸溶液。这些溶液还可以含有缓冲液、稀释剂或其他合适的添加剂。还可以使用那些不会与核酸发生有害反应的适用于非肠胃外给药的可药用有机或无机赋形剂。

其他药用组合物成分

本发明所述制剂可以另外含有其他药用组合物中常见的辅助成分，参照技术领域已知用量使用。因此，例如所述制剂可以另外含有相容的医药活性物质，比如例如止痒剂、收敛剂、局部麻醉剂或抗炎剂；或者可以另外含有用于物理配制发明所述组合物的各种剂量形式的物质，比如染料、增味剂、防腐剂、抗氧化剂、遮光剂、增稠剂和稳定剂。但是，加入这些物质时，它们不能不适当地干扰发明所述组合物之成分的生物活性。可以将制剂灭菌，如果需要还可以与不会和制剂中的核酸发生有害反应的辅剂混合，所述辅剂是例如润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、影响渗透压的盐、缓冲液、增色剂、增味剂和/或香料等。

水性悬浮液可以含有能增加悬浮液粘度的物质，这类物质包括例如，羧甲基纤维素钠、山梨糖醇和/或葡聚糖，以及稳定剂。

本发明的一些实施方案中提供的药用组合物含有(a)一或多种抗病毒寡核苷酸和(b)一或多种不同作用机制的其他化疗剂。所述化疗剂的例子包括，但不限于柔红霉素(daunorubicin)、daunomycin、放线菌素、阿霉素、表阿霉素(epirubicin)、依达比星(idarubicin)、依索比星(esorubicin)、博莱霉素、马磷酰胺(mafosfamide)、异环磷酰胺(ifosfamide)、阿糖胞苷、二-氯乙基亚硝基脲(bis-chloroethylnitrosurea)、白消安(busulfan)、丝裂霉素C、放线菌素D、普卡霉素(mithramycin)、泼尼松(prednisone)、羟孕酮己酸酯(hydroxyprogesterone)、睾丸酮、它莫西芬(tamoxifen)、达卡巴嗪(dacarbazine)、甲苄肼(procarbazine)、六甲嘧胺(hexamethylmelamine)、pentamethytmetamine、米托蒽醌(mitoxantrone)、安吖啶(amsacrine)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、methylcyclohexylnitrosurea、氮芥、美法仑(melphalan)、环磷酰胺、6-巯嘌呤(mercaptopurine)、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷(cytarabine)、5-阿扎胞苷(azacytidine)、羟脲、脱氧助间型霉素(deoxycoformycin)、4-hydroxyperoxycyclophosphoramide、5-氟尿嘧啶(5-FU)、5-氟脱氧尿嘧啶(5-FUdR)、氨甲蝶呤(MTX)、秋水仙碱(colchicines)、紫杉醇(taxol)、长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、依托泊苷(etoposide)(VP-16)、三甲曲沙(trimetrexate)、伊立替康(irinotecan)、拓扑特肯(topotecan)、吉西他滨(gemcitabine)、替尼泊苷(teniposide)、顺铂和乙烯雌酚(diethylstilbestrol)(DES)。一般可参见The Merck Manual of Diagnosis and Therapy(15th Ed.1987，pp.1206-1228，Berkow et al.，eds.，Rahway，NJ)。当与本发明的化合物一起使用时，这些化疗剂可以单独使用(例如5-FU和寡核苷酸)、顺序使用(例如使用5-FU和寡核苷酸一段时间，然后使用MTX和寡核苷酸)、或者与一或多种其他化疗剂联用(例如5-EU/MTX和寡核苷酸；或者5-FU，放疗和寡核苷酸)。抗炎药物(包括但不限于，非类固醇抗炎药物和皮质类固醇)以及抗病毒药物(包括但不限于，三氮唑核苷、西多福韦、阿糖腺苷、无环鸟苷和更昔洛韦)也可以与本发明的组合物联用。一般可分别参见The MerckManual of Diagnosis and Therapy 15th Ed.，Berkow et al.，eds.，1987，Rahway，NJ.，2499-2506页和46-49页。其他非寡核苷酸化疗剂也在本发明的范围内。两种或更多种联用的化合物可以一起使用或顺序使用。

实施例

实施例1：单纯疱疹病毒

单纯疱疹病毒(HSV)影响到相当大比例的人群。本发明发现随机ON或ON随机寡核苷酸可以抑制病毒，比如HSV的感染性。利用在VERO细胞(对HSV-1(KOS株)和HSV-2(MS2株)感染易感)中进行的细胞HSV复制检测法，我们发现与HSV复制原点互补的单链PS-ON抑制了HSV-1和HSV-2的复制。令人惊讶的是，与人(343 ARS)和质粒(pBR322/pUC)复制原点互补的对照PS-ON也抑制了病毒传染性。以随机序列PS-ON和PS-ON随机寡核苷酸进行的实验显示，对病毒感染的抑制随ON大小的增加而增强。这些数据表明ON是可以用于治疗病毒感染的有力抗病毒剂。

本发明人推论认为，阻断病毒(比如HHV)传播的一个可能机制是阻止病毒DNA的复制。带着这样的想法，我们将与HSV1和HSV2的复制原点互补的硫代磷酸酯寡核苷酸(ON)导入被感染细胞中。这些ON导致在病毒复制原点形成DNA三螺旋，阻断了所需反式作用因子和复制原点进行结合，因此也阻断了病毒DNA复制。文中给出了这些实验令人惊讶的结果，这些结果显示在实验情况中，ON抑制病毒感染的效力随着其大小(长度)的增加而增强。

抑制HSV-1

通过噬斑减少检测(PRA)测量了PS-ON抑制HSV-1的能力。固定化的非洲绿猴肾(VERO)细胞在37℃和5％CO₂的条件下，培养于有10％胎牛血清的MEM(基础培养基)中，该培养基中补充有庆大霉素、万古霉素和两性霉素(amphoterecin)B。细胞以生长4天后能形成铺满的单层细胞的密度接种到12孔板上。待达到汇合生长，将培养基换成只含有5％血清加上前面描述的补充物质，然后在有待测化合物的情况下，使细胞与HSV-1(KOS株，大约总共40-60 PFU)接触90分钟。与病毒进行接触后，将培养基替换成新的″覆盖″培养基，该培养基含有5％血清、1％人免疫球蛋白、与前面相同的补充物以及待测化合物。感染3-4天后，将感染培养物做福尔马林固定和甲酚紫染色，进行噬斑计数。

所有N(除非另有说明)都是在University of Calgary Core DNA Serviceslab合成的。ON(见表21)是以1或15微摩尔合成规模制备的，然后去保护，在50cm Sephadex G-25柱子上脱盐。得到的ON通过UV阴影凝胶电泳分析，确定含有-95％的全长、n-1和n-2寡聚物，以及达到5％的短寡聚物种类(这些估计带有随机删除)。为了实现随机寡聚物合成，将等摩尔的腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶amidites混在一起来最大化合成过程中ON每个位点的随机程度。

为了测试PS-ON是否能抑制HSV-1，在HSV-1 PRA中检测了REP1001、2001和3007。预期情况是只有REP 2001会表现出活性，因为该PS-ON是定向到HSV复制原点的(其他两种定向到人和质粒的复制原点)。但是三种PS-ON均显示出抗HSV-1活性。这项检测是用HSV-1(KOS株)在VERO细胞中通过噬斑减少法进行的。感染细胞以浓度逐渐升高的REP 1001、REP2001或REP 3007处置。由该实验结果线性回归计算的IC₅₀值分别是2.76，0.77和5.33微摩尔。此外，我们发现抗HSV-1的效力取决于寡聚物的大小。

为了确定PS-ON的抗HSV-1活性依赖于大小，而相对来说不依赖于序列，我们将大小不同的PS-ON(REP 2002，2003，2004，2005 and 2006)与抗病毒药物无环鸟苷一起进行了测试。这些PS-ON在序列特异性效果方面是惰性的，因为每个碱基被合成″摆动″碱基(N)，所以每种PS-ON实际上代表了一群相同大小的不同随机序列；这些PS-ON被称为″随机寡核苷酸″。噬斑减少测定用HSV-1(KOS株)在VERO细胞中进行。感染细胞用浓度逐渐增加的REP 2001、REP 2002或REP 3003，REP 2004、REP 2005、REP 2006和无环鸟苷处置。由测定数据的线性回归计算IC₅₀值。通过将IC₅₀数值对每种检测的具有抗HSV-1活性的PS-ON的具体大小做图，来确定PS-ON大小和抗HSV-1 IC₅₀之间的关系。无环鸟苷的IC₅₀值作为临床相关的参照。我们发现有10个或更少个碱基的寡聚物没有可检测的抗HSV-1活性，但是当PS-ON的大小增加到10个碱基，其效力也随之增加(IC₅₀降低)。我们还注意到大于20个碱基的PS-ON的IC₅₀值明显低于临床认可的抗HSV-1药物——无环鸟苷。

为了更好地界定PS-ON抗HSV-1活性的有效大小范围，我们检测了覆盖从10到120个碱基的大小范围内的PS-ON随机寡核苷酸。噬斑减少测定用HSV-1(KOS株)在VERO细胞中进行。检测了浓度逐渐增加的大小范围很广的PS-ON随机寡核苷酸：REP 2003、REP 2009、REP 2010、REP 2011、REP 2012、REP 2004、REP 2006、REP 2007和REP 2008。由线性回归计算IC₅₀值。我们发现有12个或更多碱基的寡聚物具有可检测的抗HSV-1活性，在120个碱基以内，抗HSV-1的效力同样随着PS-ON随机寡核苷酸的长度增加而增加。但是，在大于40个碱基长的PS-ON随机寡核苷酸中，每个增加的碱基的效力提高程度变小。

为了比较非PS-ON随机寡核苷酸、随机序列PS-ON和HSV-1特异序列PS-ON的效力，我们检测了10、20和40个碱基长的三种修饰类型的ON。噬斑减少测定用HSV-1(KOS株)在VERO细胞中进行。检测了浓度逐渐增加的未修饰ON、具有随机序列的PS-ON、以及靶向到HSV-1起始密码子IE110的PS-ON。所述ON是REP 2013、REP 2014、REP 2015、REP 2016、REP 2017、REP 2018、REP 2019、REP 2020和REP 2021。由线性回归计算IC₅₀值。在这个系统中，任何被测大小的未修饰ON随机寡核苷酸都没有可检测的抗HSV-1活性。随机序列和特异性HSV-1序列PS-ON均表现出大小依赖性抗HSV-1活性(这两种修饰在10个碱基长时都未观察到活性)。在随机序列、特异性HSV-1序列和随机寡核苷酸PS-ON之间进行的比较，显示PS-ON在20个碱基长时，特异性HSV-1序列的抗HSV-1活性有提高，但是在40个碱基长时，所有修饰，无论是随机寡核苷酸、随机序列或特异性HSV-1序列能同样有效地抗HSV-1。就我们所知，这是第一次报道PS-ON对HSV-1的IC₅₀低达0.059μM和0.043μM。

实施例2：抑制HSV-2

通过噬斑减少检测(PRA)测量了PS-ON抑制HSV-2的能力。固定化的非洲绿猴肾(VERO)细胞在37℃和5％CO₂的条件下，培养于有10％胎牛血清的MEM(基础培养基)中，该培养基中补充有庆大霉素、万古霉素和两性霉素B。细胞以生长4天后能形成铺满的单层细胞的密度接种到12孔板上。待达到汇合生长，将培养基换成只含有5％血清加上前面描述的补充物质，然后在有待测化合物的情况下，使细胞与HSV-2(MS2株，大约总共40-60PFU)接触90分钟。与病毒接触后，将培养基替换成新的″覆盖″培养基，该培养基含有5％血清、1％人免疫球蛋白、与前面相同的补充物以及待测化合物。感染3-4天后，将感染培养物做福尔马林固定和甲酚紫染色，进行噬斑计数。

为了测试PS-ON是否能抑制HSV-2，在HSV-2 PRA中检测了REP1001、2001和3007。噬斑减少检测是用HSV-2(MS2株)在人成纤维细胞中进行的，其中将感染细胞用浓度逐渐升高的REP 1001、REP 2001或REP3007处置。由线性回归计算IC₅₀值。如果抑制活性是由于反义或其他序列互补性机制，可以预期只有REP 2001会表现出活性，因为该PS-ON是定向到HSV-1/2复制原点的(其他两种分别定向到人和质粒的复制原点)。但是三种PS-ON均显示出了抗HSV-2的活性。由该实验结果线性回归计算的IC₅₀值分别是2.76，0.77和5.33微摩尔。此外，我们发现抗HSV-2的效力取决于PS-ON的大小，而非序列。

为了确定PS-ON的抗HSV-2活性依赖于大小，而不依赖于序列，我们测试了大小不同的PS-ON(REP 2002，2003，2004，2005和2006)。这些PS-ON在序列特异性效果方面是惰性的，因为每个碱基被合成″摆动″碱基(N)，所以每种PS-ON实际上代表了一群相同大小的不同随机序列；这些PS-ON被称为″随机寡核苷酸″。当在HSV-2 PRA中检测这些PS-ON时，我们发现有10个或更少个碱基的寡聚物没有可检测的抗HSV-2活性，但是当PS-ON的大小增加到10个碱基，其效力也随之增加(IC₅₀降低)。我们还注意到大于20个碱基的PS-ON的IC₅₀值明显低于临床认可的抗HSV-2药物——无环鸟苷(TM)。就我们所知，这是第一次报道PS-ON对HSV-2的IC₅₀低达0.012μM。

为了确定非特异性序列的组成是否影响ON抗病毒活性，在HSV-1 PRA中测试了几种大小相当、但序列组成不同的PS-ON的抗HSV1活性。被检测的PS-ON是REP 2006(N20)、REP 2028(G40)、REP 2029(A40)、REP 2030(T40)和REP 2031(C40)。由HSV-1 PRA得到的IC₅₀值显示REP 2006(N40)是被测序列中活性最高的，而REP 2029(A40)是活性最低的。我们还注意到，所有其他PS-ON的活性都明显比N40低，其效力排序是N40＞C40＞T40＞A40″G40。

我们还检测了由两种不同核苷酸组成的序列组成各异的不同PS ON的效力。PS-ON随机寡核苷酸(REP 2006)比AC20(REP 2055)，TC20(REP2056)或AG20(REP 2057)对HSV-1的抗性明显强，它们的效率排序如下：N40＞AG＞AOTC。这一数据提示，虽然抗病毒效果是非序列互补性的，一些非特异性序列组成(即C40和N40)有更强的抗病毒活性。我们建议，该现象可以通过这样的事实得到解释，即虽然能保持天然的蛋白结合活性，象C40，A40，T40和G40这样的序列只能与少数病毒蛋白高亲和力结合，可能是因为这些序列中存在着某种限制性的四级结构。另一方面，基于N40的随机性，它保持了与多种抗病毒蛋白高亲和力结合的能力，这造成了它的强抗病毒活性。

实施例3：抑制CMV

在噬斑减少检测法(PRA)中测量PS-ON抑制CMV的能力。该项检测与测试抗HSV-1和抗HSV-2的相同，除了用CMV(AD169株)作为病毒接种物，人成纤维细胞作为细胞宿主。

为了确定PS-ON的抗CMV活性依赖于大小，而不依赖于序列，我们测试大小不同的PS-ON。噬斑减少测定用CMV(AD169株)在VERO细胞中进行。感染细胞用浓度逐渐增加的REP 2004(a)或REP 2006(b)处置。由测定数据的线性回归计算IC₅₀值，通过用IC₅₀数值对每种被测PS-ON的具体大小做图，来确定PS-ON大小和抗CMV IC₅₀之间的关系。当在CMV PRA中测试这些PS-ON时，我们发现随着PS-ON的大小增加，其效力也随之增加(IC₅₀降低)。

为了更清楚地说明PS-ON抗CMV活性的有效大小范围，我们检测了大小覆盖从10到80个碱基这样宽范围内的PS-ON随机寡核苷酸。我们还包括了几种临床认可的小分子CMV治疗剂(更昔洛韦、膦甲酸钠和西多福韦)，以及2个版本的CMV视网膜炎的商品反义治疗剂(福米韦生(Vitravene(TM))；由University of Calgary合成，销售)。噬斑减少测定用CMV(AD169株)在VERO细胞中进行。测试了三种临床CMV治疗剂：更昔洛韦、膦甲酸钠和西多福韦。也检测了浓度逐渐增加的大小范围很广的PS-ON随机寡核苷酸：REP 2003、REP 2004、REP 2006和REP 2007。最后，检测了自由合成的和商品销售的REP 2036(福米韦生)。由线性回归计算IC₅₀值。我们发现，虽然PS-ON随机寡核苷酸大小增加会导致效力提高，但这一效果在大约40个碱基达到饱和。此外，20、40和80个碱基的PS-ON随机寡核苷酸都比被测的任何小分子治疗剂效率明显更高。而且，40和80个碱基的PS-ON随机寡核苷酸比福米韦生(TM)更有效。

就我们所知，这是第一次报道PS-ON对CMV的IC₅₀低达0.067μM。

实施例4：抑制HIV-1

PS-ON随机寡核苷酸抑制HIV-1的能力通过两种不同检测法测量：

致细胞病变效应(CPE)

利用MTT染料来监测致细胞病变效应，以便报道细胞代谢的程度。将固定化的人淋巴细胞(MT4)于37oC和5％CO2的条件下，在加了10％胎牛血清的MEM中培养，所述培养基中补充有抗生素。将细胞接种到含有适当待测化合物的96孔板中的培养基中，培育2小时。与待测化合物预培育之后，向孔中加入HIV-1(NL 4-3株)(0.0002 TCID50/孔)。经过6天的额外培育，通过MTT转变来监测CPE。通过在没有病毒接种物的情况下，将药物培育6天来测量细胞毒性。为了将MTT吸光度数值转化成存活率，把未感染、未处置细胞的吸光度设置为100％，被感染、未处置细胞的吸光度为0％。

复制试验(RA)

HIV复制的能力在固定化的人胚胎肾细胞(293A)中监测。用两种质粒共转染这些细胞。一种质粒含有重组野生型HIV-1基因组(NL 4-3)，其中env基因被萤光素酶表达盒打断(以CNDO株标识)，另一种质粒含有来自小鼠白血病病毒的env基因(MLV)。这两种质粒可以反式提供所有蛋白因子来产生成熟的嵌合病毒，该病毒具有HIV-1的全部成分，除了由MLV env基因反式提供的蛋白产物。这些细胞产生的病毒粒子有传染性，能够复制，但是它们缺乏env基因产物，所以不能产生下一代的感染性病毒粒子。

转染24小时后，将这些细胞用胰蛋白酶消化，铺96孔板。待细胞粘附后，洗去培养基，替换成含有待测化合物的培养基。使病毒产生再进行24小时。然后收获上清液，用它再感染原初293A细胞。借助萤光素酶基因产物来鉴定被感染的原初细胞。萤光素酶阳性细胞的数量体现了重组HIV-1复制和/或感染的程度。这项检测还适用于通过利用带有几个点突变的HIV-1基因组来测试对许多临床认可的抗HIV-1药物的抗性，其中所述点突变是已知的会诱导对几种不同类型抗HIV药物的抗性的突变。对没有可检测萤光素酶阳性细胞，抑制率设为100％，在被感染的未处置对照中阳性细胞设为0％。

为了验证PS-ON抗HIV-1活性是依赖于大小，而非序列的，我们检测了大小不同的PS-ON随机寡核苷酸。CPE试验用HIV-1(NL4-3株)在MT4细胞中进行。感染细胞用浓度逐渐升高的REP 2004或REP 2006来处置。由线性回归计算IC₅₀值。确定REP 2004和REP 2006在未感染MT4细胞中的细胞毒性状况。我们发现，随着PS-ON大小增加，其效力也增强(IC₅₀下降)。我们还注意到在这项检测中，PS-ON随机寡核苷酸未表现对宿主细胞的明显毒性。

就我们所知，这是第一次报道PS-ON对HIV-1的IC₅₀低达0.011μM。

为了更清楚地说明PS-ON抗HIV-1活性的有效大小范围，我们利用野生型HIV-I(重组NL 4-3(CNDO))，经RA检测了更多大小覆盖从10到80个碱基这样宽范围的PS-ON随机寡核苷酸。复制检测法用重组野生型HIV-1NL4-3(CNDO株)在293A细胞中进行。此外，我们还测试了四种目前在临床上使用的蛋白酶抑制剂(aprenavir、茚地那韦(indinavir)、利托那韦(lopinavir)和沙奎那韦(saquinavir))。感染细胞用浓度逐渐增加的Amprenavir，茚地那韦、利托那韦，沙奎那韦、PEP 2003、REP 2004、REP 2006和REP 2007处置。我们发现，有10个和更多个碱基的PS-ON随机寡核苷酸具有抗HIV-1活性，并且抗HIV-1的效力是随PS-ON随机寡核苷酸的大小增加而提高的，但这一效果在大约40个碱基达到饱和。此外，40和80个碱基的PS-ON随机寡核苷酸与4种临床对照的效力几乎相当。

就我们所知，这是第一次报道PS-ON对HIV-1的IC₅₀低达0.014μM。

为了检测PS-ON随机寡核苷酸抑制HIV药物抗性株的能力，我们用HIV-1的重组MDRC4株重复了以上测试。这个重组株对所有种类的至少16种临床认可的药物由明显抗性：核苷酸RT抑制剂、非核苷酸RT抑制剂以及蛋白酶抑制剂。我们发现所有被测PS-ON随机寡核苷酸对抗性株的抑制和它们对野生型株的一样好。但是，四种蛋白酶抑制剂中的三种的抗突变株效力有所下降，因此40和80碱基的PS-ON随机寡核苷酸比上述药物对抗性株的效力更强。

实施例5：抑制RSV

PS-ON随机寡核苷酸抑制RSV的能力通过监测含有alamar blue的CPE(细胞代谢的间接量度)来测量。人喉癌(Hep2)细胞在37℃和5％CO₂的条件下，培养于含5％胎牛血清的MEM(基础培养基)中。细胞以生长5-6天后能形成铺满的单层细胞的密度接种到96孔板上。铺板的第二天，在体积减少的溶液中，于存在待测化合物的情况下，用RSV(A2株，10^8.2TCID₅₀/ml)感染细胞2小时。接种后，换培养基，并补充待测化合物。感染6天后，通过测量alamar blue的荧光转换率来监测CPE。待测化合物在Hep2细胞中的毒性是这样监测的，将未感染细胞处置7天，然后测量这些细胞中的alamar blue转换率。未感染、未处置细胞中的alamar blue读数设置为100％存活率，感染、未处置细胞中的读数设为0％存活率。

为了确定PS-ON抗RSV活性是大小依赖性，而不依赖于序列的，我们测试了大小不同的PS-ON随机寡核苷酸。此外，我们还检测了临床认可的RSV感染治疗剂—利巴韦林(Virazole(TM))。CPE试验用RSV(A2株)在Hep2细胞中进行。感染细胞用浓度逐渐增加的REP 2004、REP 2006、REP2007或利巴韦林处置。由线性回归计算IC₅₀值，并在每个曲线图中报告。确定REP 2004、REP 2006、REP 2007或利巴韦林在未感染的Hep2细胞中的细胞毒性状况。我们发现，随着PS-ON随机寡核苷酸大小增加，序列也在增加，但是在大约40个碱基大小时达到饱和。我们还注意到20、40和80个碱基长的PS-ON随机寡核苷酸的IC₅₀值比临床认可的抗RSV药物—利巴韦林明显低。PS-ON随机寡核苷酸在Hep2细胞中未呈现毒性，而利巴韦林有明显的毒性(治疗指数＝2.08)。

就我们所知，这是第一次报道PS-ON对RSV-1的IC₅₀低达0.015μM。

实施例6：抑制柯萨奇病毒B2

PS-ON随机寡核苷酸抑制COX B2的能力通过监测含有alamar blue的CPE(细胞代谢的间接指示)来测量。恒河猴肾(LLC-MK2)细胞在37℃和5％CO₂的条件下，培养于含5％胎牛血清的MEM(基础培养基)中。细胞以生长5-6天后能形成铺满的单层细胞的密度接种到96孔板上。铺板的第二天，在体积减少的溶液中，于存在待测化合物的情况下，将细胞用COX B2(Ohio-1株，10^7.8TCID₅₀/ml)感染2小时。接种后，换培养基，并补充待测化合物。感染6天后，通过测量alamar blue的荧光转换率来监测CPE。待测化合物在LLC-MK2细胞中的毒性是这样监测的，将未感染细胞处置7天，然后测量这些细胞中的alamar blue转换率。未感染、未处置细胞中的alamarblue读数设置为100％存活率，感染、未处置细胞中的读数设为0％存活率。

我们在COX B2 CPE检测中验证了REP 2006的抗COX B2活性。所述CPE检测用柯萨奇病毒B2(Ohio-1株)在LLC-MK2细胞中进行。感染细胞用浓度逐渐增加的REP 2006处置。确定REP 2006在LLC-MK2细胞中的细胞毒性状况。我们发现，虽然在LLC-MK2细胞中表现出轻微的毒性，这个PS-ON随机寡核苷酸也能部分地使被感染LLC-MK2细胞免于COX B2感染。

实施例7：抑制痘苗病毒

我们用痘苗感染模型作为我们的化合物抗痘病毒，包括天花病毒的效力的指示。PS-ON随机寡核苷酸抑制痘苗病毒的能力通过用alamar blue(细胞代谢的间接量度)监测CPE来测量。Vero细胞在37℃和5％CO₂的条件下，培养于含5％胎牛血清的MEM中。细胞以生长5-6天后能形成铺满的单层细胞的密度接种到96孔板上。铺板的第二天，在体积减少的溶液中，于存在待测化合物的情况下，将细胞用痘苗病毒(10<79>TCID50/ml)感染2小时。接种后，换培养基，并补充待测化合物(除了西多福韦用50μM，其他全部为10μM)。感染5天后，收集上清液。用1∶100稀释的上清液再感染VERO细胞，再感染7天后通过测量alamar blue的荧光转换率来监测CPE，从而确定出上清液中的病毒载量。

我们测试了大小不同的PS-ON随机寡核苷酸(REP 2004、2006和2007)。此外，我们还测试了一种已知的痘苗病毒感染的有效治疗剂—西多福韦(Vistide(TM))。痘苗感染的VERO细胞的感染上清液之病毒载量是间接确定的，具体说是通过测量由这些上清液在原初细胞中诱导的CPE确定的。REP 2004、2006和2007的检测浓度是10μM，而西多福韦检测浓度是50μM。在痘苗病毒CPE检测法中进行测试时，我们发现用REP 2004、2006和2007进行的处置均表现出抗病毒活性(即产生的上清液在再感染时的CPE下降)，但这一活性比西多福韦的低。

实施例8：抑制DHBV、副流感-3病毒和汉坦病毒

因为DHBV、副流感-3病毒和汉坦病毒不容易形成可测量的噬斑或CPE，我们测试REP 2006在这些病毒中的效力时使用了荧光成焦单位(FFFU)检测法。在这项测试中，将REP 2006(终浓度10μM)与所述病毒混合，然后病毒会吸附到细胞上。吸附完成后，将感染细胞再培育7-14天，即在甲醇中固定。借助免疫荧光显微镜，用合适的病毒抗体来探测病毒复制区。下面表1中描述了被测三种病毒中的每一种的特定实验条件和结果

表1.对DHBV、副流感-3病毒和汉坦病毒的抑制

病毒	细胞宿主	用于检测FFFU的抗体	FFFU计数(无药物)	FFFU计数(10μM REP2006)
					DHBV(HBV替代物)	原代鸭肝细胞	鼠抗DHBV IgG	163+/-38.5	0
副流感-3	LLC-MK2细胞	鼠抗PI3 IgG	288+/-126	0
					汉坦病毒(Prospect Hill株)	VERO  E6细胞	鼠抗SinNombre核蛋白IgG	232.3+/-38.17	0

此原始数据显示，10μM的REP2006能够有效抑制DHBV、副流感病毒2和汉坦病毒。鉴于初步检测中的强烈反应，我们预期的IC₅₀更低。这些数据支持了PS-ON随机寡核苷酸治疗人感染汉坦病毒和乙肝病毒(与DHBV密切相关)的效力，并且为对由RSV和副流感-3引起的儿科细支气管炎可以立即治疗，而不需要先进行鉴别诊断提供了理论基础。

实施例9：目前没有反应的病毒

到目前为止，我们没有在以下表2描述的病毒系统中观察到PS-ON随机寡核苷酸(至10μM)可以在不使用递送系统、药物联用或化学修饰的情况下，有可检测到的抗病毒活性。

表2病毒系统

病毒	病毒株	细胞宿主	检测方法
				冠状病毒	MHV2(小鼠)	NCTC-1496细胞	噬斑减少

(SARS替代物)	MHV-A59(小鼠)HCoV-OC43(人)	DBT细胞HRT-18细胞
				BVDV(HCV替代物)	NA	BT细胞	alamar blue显色的CPE
鼻病毒	HGP	HeLa细胞	alamar blue显色的CPE
				腺病毒	人Ad5	293A细胞	噬斑减少

在目前的检测过程中，我们未观察到有活性。但是，没有表现出抗病毒活性可能是因为所用特定检测方法的局限性。正在进行其他检测来显示对这些病毒的有效结果。

因为我们的证据表明，PS-ON的带电荷特性对于抑制来自几种不同科的病毒非常重要，我们预计这种电荷依赖性抑制病毒活性的机制可能抑制所有进行衣壳化的病毒的活性。由此得到的推论是在实施例9所列的那些病毒中没有可检测到的抗病毒效果提示了，PS-ON与这些病毒的结构蛋白之间的相互作用可能没有强到能阻止病毒复制过程中病毒蛋白间的相互作用。如果是这样，要达到抗病毒效果的一个手段是改变所述DNA或抗病毒聚合物的带电荷特性(例如将DNA中的硫代磷酸酯键替换为二硫代磷酸酯键)，从而提高它们与病毒蛋白的亲和力。

实施例10：抑制流感病毒A

在噬斑减少检测法(PRA)中测量PS-ON抑制流感病毒(INF)A的能力。固定化的犬肾(MDCK)细胞在37℃和5％CO₂的条件下，培养于有10％胎牛血清的MEM(基础培养基)中，该培养基中补充有庆大霉素、万古霉素和两性霉素B。细胞以生长6天后能形成铺满的单层细胞的密度接种到6孔板中。待达到汇合生长，将培养基换成只含有前面描述的补充物质，然后在有待测化合物的情况下，使细胞与INF A(H3N2株，大约总共35-70 PFU)接触60分钟。与病毒进行接触后，将培养基替换成只含有药物的新培养基。感染24小时后，培养基再次换成″覆盖″培养基，该培养基含有4％白蛋白、0.025％DEAE葡聚糖、2mg/ml TPCK处理过的胰蛋白酶和0.8％Seaplaque琼脂糖，与前面相同的补充物，没有待测化合物。感染2-3天后，将感染培养物做福尔马林固定和甲酚紫染色，进行噬斑计数。

我们在INF A PRA检测法中测试了多种PS-ON随机寡核苷酸的抗INFA活性。我们发现，只有REP 2006表现出可测量到的抗病毒活性，但是该活性是明显的(见以下表3)。

表3.PS-ON随机寡核苷酸的抗INF A(H3N2)活性

随机寡核苷酸	IC50(μM)
		REP 2003	＞10
REP 2004	＞10
		REP 2006	～3

因为只有最大的随机寡核苷酸似乎有活性，我们知道随机寡核苷酸在许多其他病毒中的活性都是大小依赖性的，所以我们在更大范围的稀释度内测试了大小分布更广的随机寡核苷酸的抗病毒活性。我们发现，如其他我们检测过的病毒一样，随机寡核苷酸的抗INF A活性随其长度增加而提高，但是对超过40个碱基长的随机寡核苷酸，活性没有明显增加。

表4 PS-ON随机寡核苷酸的大小依赖性抗INF A活性

随机寡核苷酸	IC50(μM)
		REP 2032	＞50
REP 2003	＞50
		REP 2004	～25
REP 2005	～6.25
		REP 2006	～1.25
REP 2007	～0.625

为了确定REP 2006的作用机制，我们试图验证在感染之前、感染中和感染之后的不同时间加入REP 2006(在IC99的浓度)的效果。在本实验中，我们观察到即使是感染后5个小时(300分钟)，加入REP 2006都会产生对INF A完全抑制的活性(见下表)。这些结果表明，至少有相当一部分REP2006抗流感病毒的作用发生在感染之后。因为PS-ON随机寡核苷酸并不能轻易进入细胞，PS-ON随机寡核苷酸可能也会干扰病毒从宿主细胞的芽生现象。

表5加入REP 2006的时间和对INF A活性的影响

REP2006与病毒混合相对开始感染的时间(分钟)	感染性(％)
		不含药物(对照)	100％
-30	0
		-5	0
0	0
		5	0
30	0
		60	0
90	0
		120	0
180	0
		240	0
300	0

实施例11：用于确定寡核苷酸是否主要通过不依赖于序列的方式发挥作用的检测

我们已在文中证实了发明所述ON的抗病毒活性通过不依赖于序列的作用方式发生的。当然，本领域技术人员可以制备序列特异性ON，例如靶向到特定病毒的mRNA的反义ON，并引入所有硫代磷酸酯和2′O-甲基化修饰。但是这样的ON是受益于我们在本文描述的ON修饰以及我们在文中展示的这类修饰ON的活性是不依赖于序列的这一事实。因此，如果满足以下给出的5个检测之一的标准，即它的功能基本上是由于不依赖于序列的活性，则该ON应当被看作是具有不依赖于序列的活性。以下检测中使用的ON可以按照实施例12中描述的合成PS-ON的一般方法学来制备。

检测#1-候选ON的部分简并性对其抗病毒效果的影响

这项检测用于测量候选ON的部分序列具有简并性时它的抗病毒活性。如果如以下所述，候选ON的与它有相同化学属性的简并性版本保持了其活性，该ON被看作是具有不依赖于序列的活性。按照以下原则将候选ON制成简并性的：

L＝候选ON的碱基数目

X＝寡聚物每个末端被变成简并性(但是与候选ON有相同的化学属性)碱基的数目

如果L是偶数，则X＝(L/4)的整数位

如果L是奇数，则X＝((L+1)/4)的整数位

X必须等于或大于4

如果候选ON被宣称具有抗病毒活性，例如对疱疹病毒科病毒、逆转录病毒科或副粘病毒科的成员有抗病毒活性，优选利用指定的病毒株通过本文描述的针对该病毒科的检测方法来得到IC₅₀值。如果候选ON被宣称具有抗病毒活性，是针对上面没有提及的特定病毒科的，则通过医药业认可的测定抗病毒效力的测试来产生IC₅₀值。产生IC₅₀值最少要用化合物的七种浓度，其中三个或更多个处于剂量反应曲线的线性范围中。利用这些检测，应当将候选ON的IC₅₀值与其简并性对应物的进行比较。如果部分简并性的ON的IC₅₀比初始候选ON的高不到5倍(基于最少重复三次的测量值，标准差不能超过平均值的15％)，则所述ON应被认为主要是以不依赖于序列的方式发挥作用的。

检测#2-候选ON与ON随机寡核苷酸的抗病毒活性比较

这项检测是用于将候选ON的抗病毒效果与和它大小相当、化学属性相同的随机寡核苷酸ON在同样病毒中的抗病毒效果进行比较。

如果候选ON被宣称具有抗病毒活性，例如对疱疹病毒科病毒、逆转录病毒科或副粘病毒科的成员有抗病毒活性，优选利用指定的病毒株通过本文描述的针对该病毒科的检测方法来得到IC₅₀值。如果候选ON被宣称具有抗病毒活性，是针对上面没有提及的特定病毒科的，则通过医药业认可的测定抗病毒效力的测试来产生IC₅₀值。产生IC₅₀值最少要用化合物的七种浓度，其中三个或更多个处于剂量反应曲线的线性范围中。利用这些检测，将候选ON的IC₅₀值与和它大小及化学属性相当的ON随机寡核苷酸的IC₅₀值进行比较。如果ON随机寡核苷酸的IC₅₀比候选ON的IC₅₀高不到5倍(基于最少重复三次的测量值，标准差不能超过平均值的15％)，则所述候选ON应被认为主要是以不依赖于序列的方式发挥作用的。

检测#3-候选ON在两种来自同一病毒科但不同源的病毒中的抗病毒活性比较

该项检测用于将候选ON抗第一种靶病毒的效果，与该候选ON抗第二种病毒的效果进行比较，其中所述第一种靶病毒的基因组与候选ON同源，而第二种病毒的基因组与候选ON没有同源性，但它们属于同一病毒科。例如，如果候选ON据说有抗HSV的活性，就比较其抗HSV的活性和它抗CMV或VZV等的活性。候选ON在靶病毒和第二种病毒中的相对活性比较是这样进行的，即利用同样长度和化学属性的ON随机寡核苷酸在两种病毒中的活性来归一化候选ON在两种病毒中得到的IC₅₀值。

因此，如果候选ON宣称具有抗某种病毒的抗病毒活性，则利用文中描述的用于疱疹病毒、逆转录病毒或副粘病毒科的检测方法之一，或者其他已知试验来确定它在该病毒中的IC₅₀。类似的，候选ON对第二种病毒的IC₅₀值也利用文中描述的试验或本领域认可的试验来确定，其中所述的试验是用于其基因组与活性ON序列没有同源性，但来自相同病毒科的病毒。同样要产生大小和化学属性相当的随机寡核苷酸对每种病毒的IC₅₀。按照以下，用ON随机寡核苷酸对这两种病毒的IC₅₀来归一化候选ON对两种病毒的IC₅₀值：

给候选ON和ON随机寡核苷酸在第一种(同源的)病毒中的IC₅₀进行相同的代数变换，因此随机寡核苷酸的IC₅₀现在是1。

给候选ON和ON随机寡核苷酸在第一种(不同源的)病毒中的IC₅₀进行相同的代数变换，因此随机寡核苷酸的IC₅₀现在是1。

候选ON在同源和非同源病毒的IC₅₀差别倍数的计算，是通过将变换过的候选ON在非同源病毒中的IC₅₀除以变换过的候选ON在同源病毒中的IC₅₀值。

如果两种病毒的IC₅₀倍数差小于5，候选ON可以被看作主要是以不依赖于序列的方式发挥作用的。

检测#4：候选ON在不同病毒科中的抗病毒活性

这项检测是用于确定候选ON在某病毒中有类似药物的活性，其中所述候选ON的序列与病毒基因组的任何部分都没有同源性，并且该病毒来自不同的科。因此，应当利用本文描述的用于疱疹病毒、逆转录病毒或副粘病毒的试验之一来检测候选ON，所以被测候选ON的序列与所用的病毒基因组任何部分都不同源。产生IC₅₀值时要使用候选ON的最少七个浓度，其中3个或更多个点处于线性范围。如果得到的剂量反应曲线显示出类似药物的活性(通常是衰退或S形曲线，随候选ON浓度下降抗病毒效果减弱)，由曲线得到的IC₅₀低于10μM，则候选ON应被认为是具有类似药物的活性。如果候选ON被认为在来自不同科的病毒中具有类似药物的活性，其中该候选ON不与所述病毒互补，因此不可能有依赖于序列的反义活性，则该ON应被认为主要是通过不依赖于序列的方式发挥作用的。

检测#5.候选ON的细胞外抗病毒活性

我们目前的实验结果表明，所述ON的不依赖于序列的抗病毒活性是在细胞外发生的。ON技术的现有知识是这样教导的，因为ON无法容易地透过细胞，必须通过合适的载体将它们递送过生物膜从而具有反义活性。因此，反义ON的抗病毒活性从定义上来说是依赖于递送到细胞内以便具有活性的。如果某个序列特异性候选ON在裸用(因此细胞渗透性差)时有体外抗病毒活性，它必然是得益于本发明中描述的ON的不依赖于序列的特性。

如果所述序列特异性候选ON与HSV-1、HIV-1或RSV的基因组部分互补，则候选ON是否具有不依赖于序列的抗病毒活性应当在下面描述的合适试验中进行验证。如果候选ON与HSV-1、HIV-1或RSV之外的病毒互补，则该候选ON的抗病毒活性应当采用医药行业认可的试验来确定。

应当利用合适的试验，将裸候选ON的抗病毒活性与包封(用于转染)的候选ON的活性进行比较(在裸用和包封条件下，使用相同的候选ON浓度)。活性应当通过剂量反应曲线用不少于7个浓度来测量，其中至少3个落在包括病毒活性50％被抑制的线性范围内。IC₅₀(使病毒活性减少50％的浓度)应当通过剂量反应曲线中线性范围的线性回归来计算。如果裸露候选ON的IC₅₀比包封候选ON的IC₅₀高不过5倍，则该候选ON的活性应被看作是主要通过不依赖于序列的发生进行的。

各项检测中使用的阈值

这些检测的目的是要通过合理分析，来确定ON是否可以得益于我们在文中描述的以不依赖于序列的方式发挥作用的ON，或者利用所述ON的不依赖于序列的抗病毒特性。当然，本领域技术人员都会认识到，考虑到所有检测方法学特别是抗病毒检测方法的天然偏差，如果将两种化合物的抗病毒活性之间的差别阈值设在2或3倍，这样确定出的所述化合物的活性差别可能不可靠。原因在于这样的事实，即用相同化合物进行的这些检测中，实验和实验间的偏差会产生在这一范围内变化的IC₅₀。因此，要合理的确信两种化合物(例如两种ON)的活性的确存在差别，我们设置的阈值是所述化合物的IC₅₀之间至少差5倍。这一阈值保证了上述检测中所做的评价的可靠性。

以上检测1到3和5中描述的阈值是缺省阈值。如果特别说明，在检测1到3和5中描述的比较可以使用其他阈值。所以，例如如果特别说明，确定ON是否以不依赖序列的方式发挥作用的阈值可以是10倍、8倍、6倍、5倍、4倍、3倍、2倍、1.5倍或相等。上面检测4中描述的阈值也是缺省阈值。如果特别说明，在测试4中确定ON是否有不依赖于序列的活性时的阈值，可以是低于10μM、5μM、1μM、0.8μM、0.6μM、0.5μM、0.4μM、0.3μM、0.2μM或0.1μM的IC₅₀。

类似的，虽然缺省认为满足以上5项检测中的任何一项就足够了，如果特别说明，可以要求所述ON满足任何两项(例如，检测1和2、1和3、1和4、1和5、2和3、2和4、2和5、3和4以及3和5)、任何三项(例如，检测1和2和3、1和2和4、1和2和5、1和3和4、1和3和5、2和3和4以及2和4和5)、任何四项(例如1和2和3和4、1和2和3和5以及2和3和4和5)的缺省阈值；或者如果特别说明，是上文指出的另一个阈值。

实施例12.方法学

以下方法可以用在实施例11描述的检测中。

寡核苷酸合成

本发明的寡核苷酸可以利用本领域的已知方法来合成。例如，未取代和取代二硫代磷酸酯(P＝O)寡核苷酸可以在自动DNA合成仪(例如Applied Biosystems model 380B或Akta Oligopilot 100)上用标准的phosphoramidite chemistry法，经碘进行氧化来合成。硫代磷酸酯(P＝S)可以按照合成二硫代磷酸酯寡核苷酸的方法来合成，除了其中的标准氧化瓶应换成溶于乙腈的0.2M的311-1，2-苯基二硫化-3-酮1，1-二氧化物溶液来逐步使磷酸酯键被硫代。硫化步骤可以延长到68秒，然后进行封闭步骤。从支撑柱上切割寡核苷酸并在浓缩的氢氧化铵中于55℃进行去封闭(18小时)，通过用2.5倍体积的乙醇从0.5M NaCl溶液中沉淀两次来纯化所述寡核苷酸。

用于疱疹病毒科的抗病毒试验

如下进行疱疹病毒的噬斑减少试验：

对于HSV-1或HSV-2，将VERO细胞(ATCC#CCL-81)在12孔组织培养板(NUNC或类似的)上生长至铺满，培养是于37oC和5％CO2条件下，在补充有10％热灭活的胎牛血清、庆大霉素、万古霉素和两性霉素B的MEM中进行。待细胞铺满时，将培养基换成含有5％胎牛血清和以上描述的抗生素，并补充HSV-1(KOS株，总共40-60 PFU)或HSV-2(MS2株，总共40-60PFU)。病毒吸附进行90分钟，之后将细胞清洗，并换上含有5％胎牛血清和1％人免疫球蛋白的新的″覆盖″培养基。吸附后的3到4天，将细胞用福尔马林固定、甲酚紫染色，然后计数噬斑。

对于CMV，将人成纤维细胞按照HSV-1/2试验中具体描述的VERO细胞的生长方法来培养。培养基成分和吸附/覆盖程序除以下几点都相同：

1.在吸附步骤中，用CMV(AD169株，总共40-60 PFU)来感染细胞。

2.在覆盖培养基中，1％人免疫球蛋白换成4％Seaplaque琼脂糖。

对于其他疱疹病毒，检测是按照上面描述的噬斑试验进行，其中要使用合适的细胞宿主，吸附步骤中用40-60 PFU的病毒。

如果在没有化合物的情况下，检测最后出现了可辨认的噬斑，只有这时该项检测是有效的。

在该项检测中，IC₅₀是与未处置对照相比存在50％噬斑时的浓度。

吸附步骤和覆盖培养基中有待测化合物。

用于逆转录病毒的抗病毒试验

用于逆转录病毒HIV-1的试验是如下经ELISA，通过除去感染HIV-1的细胞的上清液中所有p24来进行的：

从得自筛选供体的新鲜人血中分离PBMC，作为HIV和HBV的替代物。经低速离心将外围血细胞沉淀/清洗2-3次，然后重新悬浮于PBS以便除去污染的血小板。然后将洗过的血细胞用Dulbecco′s磷酸缓冲盐溶液(PBS)1：1稀释，并铺到50ml离心管中的14ml Lymphocyte Separation Medium(LSM；cellgro(R)by Mediatech，Inc.；密度1.078+/-0.002g/ml；Cat.#85-072-CL)上，于600X g离心30分钟。从形成的界面中小心吸出PBMCs条带，随后用PBS经低速离心洗2次。最后一次洗完后，通过台盼蓝排除法(trypan blueexclusion)做细胞计数，并以1×10⁷细胞/ml悬浮于RPMI 1640，后者补充有15％胎牛血清(FBS)、2 mM L-谷胱酰胺、4μg/ml PHA-P。将细胞在37℃培育48-72小时。培育后，将PBMCs离心，重悬于含有15％FBS、2mM L-谷胱酰胺、100U/ml盘尼西林、100μg/ml链霉素、10μg/ml庆大霉素和20U/ml重组人IL-2的RPMI 1640中。PBMC以1-2×10⁶细胞/ml的浓度保留在该培养基中，每两周换一次培养基，直至用于检定实验。由于粘附到组织培育三角瓶上，培养物中的单核细胞被去掉。

进行标准PBMC试验时，收集来自至少两个正常供体的PHA-P刺激过的细胞，在新鲜培养基中稀释到终浓度1×10⁶细胞/ml，以50μl/孔(5×10⁴细胞/孔)的量铺到96孔圆底微孔板的内孔中。在微量滴定管中制备2X浓度的待测药物稀释液，然后按照标准模式从每个浓度取100μl加入适当的孔中。2小时预保温(细胞+药物)后，在每个检测孔中加入50μl病毒储液的稀释液(最终MOI 0.1)。只含有细胞和病毒的孔作为病毒对照。同样方法制备没有病毒的另外的微孔板用于利用MTS检定系统来进行药物的细胞毒性研究(以下有描述)。感染后将PBMC培养物保留7天，即收集无细胞上清液样品，按照以下描述进行逆转录酶活性检测。

P24 ELISA试剂盒购自Coulter Electronics。按照制造商的使用说明进行该项检测。每个检测中都要制作对照曲线以便精确地定量每个样品中的p24抗原。用Molecular Devices Vmax读板仪经450nm分光光度分析获取数据。由光密度数值计算最终浓度。

如果感染、未处理细胞的组织培育上清液中有累积的p24，该项检测才有效。

在这项检测中，IC₅₀是可检测到的p24的量是未处理对照中存在的p24的量的50％时的浓度。

吸附步骤和吸附后使用的培养基中有待测化合物。

用于副粘病毒的抗病毒试验

对于RSV，如下进行CPE的测量：

将Hep2细胞铺在96孔板上，使其在加有5％胎牛血清的MEM中，于37oC和5％CO₂的条件下过夜生长。第二天，用RSV(A2株，10^8.2TCID50/ml，100ul/孔)吸附两小时来感染细胞。吸附后，换培养基，生长7天后，通过Alamar Blue染料被活细胞转换为它的荧光加合物来测量CPE。

如果在没有化合物的情况下感染细胞中测得的CPE(通过Alamar Blue转换测量的)是未感染细胞中测得的转换的10％，只有这时该项检测才是有效的。

为了比较IC₅₀，感染细胞中见到的转换水平设为100％CPE，未感染细胞中的转换水平设为0％CPE。因此，IC₅₀是化合物得到50％CPE时的浓度。

吸附步骤和吸附后使用的培养基中有待测化合物。

实施例13.2′-O甲基化硫代磷酸酯随机寡核苷酸表现出强抗病毒活性，并且pH抗性增加，血清蛋白结合减少

我们在这里证明了PS-ON随机寡核苷酸不是借助序列特异性机制作用的(即它们的活性不不要求它们结合到核酸上，它们的活性也不是因为序列特异性适体效应)。我们进一步在本实施例中显示，联合了未修饰连接键、硫代磷酸酯键、2’-O甲基化修饰核糖以及未修饰核糖核苷酸的寡核苷酸对40个碱基的随机寡核苷酸就其抗病毒活性、血清蛋白相互作用和化学稳定性方面的影响。

所有随机寡核苷酸都是在University of Calgary Core DNA Services lab中用标准固相、批量合成的方法，以1或15μmol的合成规模合成的，去保护后在50cm Sephadex G-25柱上脱盐。

对于甲型流感病毒(INF A)的抗病毒活性检测，固定化的犬肾(MDCK)细胞在37℃和5％CO₂的条件下，培养于有10％胎牛血清的MEM(基础培养基)中，该培养基中补充有庆大霉素、万古霉素和两性霉素B。细胞以生长6天后能形成铺满的单层细胞的密度接种到6孔板中。待达到汇合生长，将培养基换成只含有前面描述的补充物质的培养基，然后使细胞与INF A(H3N2株，总共大约35-70 PFU)接触60分钟。与病毒进行接触后，将培养基替换成只含有药物的新培养基。感染2-3天后，将感染培养物做福尔马林固定和甲酚紫染色，进行噬斑计数。

对于HSV的抗病毒检测，固定化的非洲绿猴肾(VERO)细胞在37℃和5％CO₂的条件下，培养于有10％胎牛血清的MEM(基础培养基)中，该培养基中补充有庆大霉素、万古霉素和两性霉素B。细胞以生长4天后能形成铺满的单层细胞的密度接种到12孔板上。待达到汇合生长，将培养基换成只含有5％血清加上前面描述的补充物质，然后使细胞与HSV-1(KOS株，总共大约40-60 PFU)接触90分钟。与病毒进行接触后，将培养基替换成新的″覆盖″培养基，该培养基含有5％血清、1％人免疫球蛋白、与前面相同的补充物以及待测化合物。感染3-4天后，将感染培养物做福尔马林固定和甲酚紫染色，进行噬斑计数。

为了确定其血清蛋白相互作用情况，将3’端标记FITC(诱饵)的硫代磷酸酯随机寡核苷酸在检测缓冲液(10mM Tris，pH7.2，80mM NaCl，10mMEDTA，100mM b-巯基乙醇和1％tween 20)中稀释到2nM。然后将寡聚物与合适量的非热灭活的FBS混匀。待随机寡核苷酸-FBS发生相互作用后，形成的复合体用各种未标记的随机寡核苷酸进行攻击来评价它们从复合体中置换诱饵的能力。被置换的诱饵通过荧光偏振测量。置换曲线用于确定Kd值。

pH抗性的确定是通过将随机寡核苷酸在用HCl调节到合适pH的PBS中保温。保温24小时后，样品用1M TRIS(pH 7.4)中和，然后在变性聚丙烯酰胺凝胶上包胶，EtBr染色后观察。

对于这些实验，我们比较了修饰方式不同的随机寡核苷酸的表现：REP2006、REP 2024、REP 2107、REp 2086和REP 2060(见本实施例中的表6)。这些随机寡核苷酸的抗病毒活性在HSV和甲型流感病毒中通过噬斑减少试验来检测(见本实施例中的表7)。在这两种病毒中，REP 2006、2024和2107有类似的强抗病毒活性，REP2060显示出明显的抗HSV活性，而REP 2086在这些检测条件下，在HSV-1或甲型流感病毒中都没有可检测到的抗病毒活性。

表6.随机寡核苷酸描述

随机寡核苷酸	描述(N＝A，G，T/U或C)
		REP 2006	NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
REP 2024	NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNN
		REP 2107	NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
REP 2086	NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
		REP 2060	NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN

N＝未修饰的脱氧核糖核苷酸、未修饰连接键

N＝未修饰的脱氧核糖核苷酸、硫代磷酸酯连接键

N＝2′-O甲基化修饰的核糖、未修饰的连接键

N＝2′-O甲基化修饰的核糖+硫代磷酸酯连接键

N＝未修饰的核糖核苷酸+硫代磷酸酯连接键

表7.多种随机寡核苷酸在HSV和甲型流感病毒中的抗病毒活性

随机寡核苷酸	IC50(μM)(HSV)	IC50(μM)(甲型流感病毒)
			REP 2006	0.1	-2
REP 2024	0.14	-1.5
			REP 2107	0.085	-1
REP 2086	无活性	无活性

REP 2060

0.85

未测

如以上描述确定这些随机寡核苷酸对血清蛋白的相对亲和力。这些实验的结果表明REP 2107对血清蛋白的亲和力低于REP 2006或REP 2024(见本实施例中的表8)，没有检测到REP 2086和血清蛋白之间有相互作用。此外，饱和竞争时，REP 2107替换诱饵没有REP 2006或REP 2024有效(见实施例中的表9)。

表8.各种随机寡核苷酸的血清蛋白亲和力

随机寡核苷酸	Kd(nM)(FBS)
		REP 2006	13
REP 2024	13
		REP 2107	27
REP 2086	没有结合

表9.随机寡核苷酸饱和置换诱饵

随机寡核苷酸	被置换诱饵的％
		REP 2006	75
REP 2024	80
		REP 2107	60
REP 2086	没有置换

最后，我们检测了这些随机寡核苷酸在pH 1到pH 7范围内，37℃保温24小时的pH稳定性。REP 2006和REP 2024在pH 3发生明显降解，在pH 2.5完全降解，而REP 2107、2086和2060在pH 1经过24小时保温仍完全稳定。

这些结果印证了我们前面的发现，即ON随机寡核苷酸的硫代磷酸酯化对它们的抗病毒活性非常有帮助。我们在这里进一步展示了在PS-ON随机寡核苷酸中引入2′-O甲基化修饰不会影响这些分子的抗病毒活性，即使是PS-ON随机寡核苷酸中的每个核糖都含有2’-O-甲基修饰。而且，完全2′-O-甲基化、完全硫代磷酸酯化的随机寡核苷酸(REP 2107)与血清蛋白的相互作用更弱，并且对低pH引发的水解的抗性明显增强。

实施例14.PS-ON主要通过细胞外方式发挥作用

现有技术的教导是使用递送剂来提高PS-ON的细胞内浓度对它们的活性有帮助。我们在这里证明PS-ON的抗病毒活性主要是在细胞外发生的，因此不会因为胞内递送剂促进转染而得到大的益处。

在本实施例中，我们使用了由脱氧核糖核苷酸(DNA)制成的PS-ON，其中没有象核糖核苷酸(RNA)或2′-O-甲基修饰这样的修饰。可以合理地认为这个数据能够应用于带有其他修饰的PS-ON，因为本领域已知这些分子不会在没有递送系统或转染剂的协助下轻松地进入细胞内，特别是对于反义活性分子来说。

为了确定细胞递送情况，在标准条件下培养HeLa细胞，然后与荧光标记的REP 2006(FL-REP2006，3′偶联异硫氰酸荧光素的40碱基PS-ON随机寡核苷酸)一起保温，该分子是裸露或用递送剂包封的(这里用的是DOTAP[1，2-二油酰基-3-三甲基氨-丙烷]，一种阳离子脂类)。不同培育时间之后，将细胞用PSB大概地清洗以下除去未内在化的ON，随后裂解细胞。用荧光读板仪确定细胞裂解液中的胞内ON水平。

如上所述确定裸露REP 2006、用DOTAP和PEI(聚乙烯亚胺)包封的REP2006在HSV-1和流感病毒中的抗病毒效力。

确定REP 2006发挥作用是在HSV-1感染周期中的什么时间按照上面的描述进行，但是要在感染前、感染中和感染后的不同时间加入REP 2006。在HIV-1中，确定这一点是通过在感染之前、之中、之后的不同时间向HIV-LTR-β-gal HeLa细胞加入REP 2006。通过利用分光吸光度测量β-gal的生色反应来监测HIV-1感染。

我们首先明确了DOTAP和PEI可以将荧光REP 2006递送到细胞内(见表10)。这些数据显示DOTAP和PEI都能将FL-2006(推论也能将REP 2006)递送到细胞内。

表10.有和没有递送剂时的细胞内FL-REP 2006浓度(pmol/细胞)

保温时间	FL-REP2006	FL-REP2006+DOTAP	FL-REP2006+PEI
				1小时	6×10-5	5×10-4	6×10-5
6小时	6×10-5	9×10-4	3×10-4
				24小时	6×10-5	1.7×10-3	7×10-4

然后我们确定了包封(DOTAP或PEI)REP 2006在HSV-1、甲型流感病毒中的活性(见本实施例中的表11和12)。这些结果显示包封的REP 2006在HSV-1和流感病毒中都没有可检测到的抗病毒活性。

表11.包封REP 2006在HSV-1中的活性(IC₅₀，μM)

REP 2006	REP 2006+DOTAP	REP 2006+PEI
			0.074	无活性	无活性

表12.PEI包封的REP 2006在甲型流感病毒中的活性(％对噬斑形成的抑制)

ON浓度(μM)	REP 2006	REP 2006+PEI
			0	0	0
0.625	0	0
			0.125	50	0
2.5	75	0
			5	100	0
10	100	0

最后，在HSV-1和HIV-1中进行了关于加入时间的研究，其中REP 2006在感染之前、之中和之后加入。这些结果显示在这两种病毒中，REP 2006在感染之前或感染过程中加入是最有效的，说明它是HSV-1和HIV-1的融合/进入抑制剂。

这些结果证明了REP 2006和带有其他修饰的PS-ON的抗病毒活性，所述其他修饰包括，但不限于核糖核苷酸(RNA)或者2′-O-甲基，所述活性主要是在细胞外发生的。

实施例15.REP 2107呈现超强的核酸酶抗性

化学结构不同的40聚体的随机寡核苷酸的抗降解能力是通过在37℃用各种核酸酶处理4小时来评价的(见本实施例中的表13)。虽然多数化学结构都对一种以上的核酸酶呈现出抗性，但只有REP 2107能抗全部检测的4种核酸酶。应当指出的是REP 2024(该分子每个末端的4个核糖都有2′-O-甲基修饰)表现出和它的亲本分子REP 2006一样的抗性特征，都是对S1核酸酶降解敏感，而REP 2107(全部2′-O甲基化修饰)抗该酶。这些结果提示REP 2107将是被测寡核苷酸中最有效的抗血液中的核酸酶降解的。

表13.不同随机寡核苷酸化学结构对各种核酸酶的抗性

随机寡核苷酸	在37℃保温4小时后，敏感(S)或抗性(R)
					磷酸二酯酶II(Sigma P9041)	S1核酸酶(Fermentas#EN0321)	Bal31(NEB M0213S)	外切核酸酶I(NEBM0293S)
	REP 2015REP 2107REP 2006REP 2086REP 2024	RRRRR	SRSRS	SRRSR					SRRRR

实施例16.硫代磷酸酯多聚嘧啶ON显示出酸和核酸酶抗性

为了确定ON的酸抗性程度，将具有不同化学结构和/或序列的多种40碱基ON在pH值不同的PBS缓冲液中于37℃保温24小时。这些ON的降解情况通过尿素-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行评价(见表14)。

这些研究的结果显示，随机寡核苷酸ON(既含有嘧啶也含有嘌呤核苷酸)只有在完全2′-O-甲基化时才抗酸性pH。我们的数据说明，与完全硫代磷酸酯化的ON相比，即使部分2′-O-甲基化的ON(gapmers，REP 2024)在酸抗性方面也没有明显提高。与未修饰ON相比，即使完全硫代磷酸酯化的随机寡核苷酸pH抗性也没有提高。相反，我们注意到硫代磷酸酯化的40聚体ON具有与完全2′-O-甲基化的随机寡核苷酸(硫代磷酸酯化REP 2107或未硫代磷酸酯化REP 2086)相当的酸抗性，其中所述40聚体ON只含有嘧啶核苷酸胞嘧啶(polyC：REP 2031)或胸腺嘧啶(polyT，REP 2030)或polyTC杂聚物(REP 2056)。与多聚嘧啶寡核苷酸的结果不同，只含有嘌呤核苷酸(比如腺嘌呤(polyA，REP 2029)、或任何腺嘌呤或鸟嘌呤核苷酸(REP 2033，2055，2057))的硫代磷酸酯化寡核苷酸与未修饰DNA相比，没有更高的酸抗性。

这些结果意义重大，因为现有技术中描述的要获得比硫代磷酸酯ON对酸的抗性更高，优选方法是加上2′-O-甲基化修饰(或其他2′-核糖修饰)或其他修饰。我们的数据显示如果所述ON是多聚嘧啶(即只含有嘧啶核苷酸[例如胞嘧啶或胸腺嘧啶的同聚物，或者胞嘧啶和胸腺嘧啶的杂聚物])，要达到pH和核酸酶抗性2′-O-甲基化核糖修饰或其2′-核糖修饰不是必须的。即使有嘧啶，嘌呤(A或G)的存在也会使得ON对酸不稳定。

表14.多种40聚体ON的酸稳定性

ON名	序列	修饰	37℃保温24小时后对各种pH的稳定性
										pH1	pH2	pH2.5	pH3	pH4	pH5	pH7
			REP 2015	随机寡核苷酸	无	-	-	-/+	+								+++	+++	+++
REP 2006	随机寡核苷酸	PS								-	-	-/+	+	+++	+++	+++
			REP 2086	随机寡核苷酸	2’OMe	+++	+++	+++	+++								+++	+++	+++
REP 2107	随机寡核苷酸	PS，2’OMe								+++	+++	+++	+++	+++	+++	+++
			REP 2024	随机寡核苷酸	PS，2’OMegapmer	-	-	-/+	+								+++	+++	+++
REP 2031	polyC	PS								+++	+++	+++	+++	+++	+++	+++
			REP 2030	polyT	PS	+++	+++	+++	+++								+++	+++	+++
REP 2029	polyA	PS								-	-	-	-	+++	+++	+++
			REP 2033	polyTG	PS	-	-	-	-								+++	+++	+++
REP 2055	polyAC	PS								-	-	-	-	+++	+++	+++
			REP 2056	polyTC	PS	+++	+++	+++	+++								+++	+++	+++
REP 2057	polyAG	PS								-	-	-	-	++	+++	+++

PII＝磷酸二酯酶II，S1＝S1核酸酶，Exo1＝外切核酸酶1，PS＝所有的连接键。硫代磷酸酯化，2′OMe＝所有的核糖都是2′O-甲基化的，+++＝没有降解，++＝少于5％降解，-/+＝90％以上降解，-＝完全降解。

为了确定ON核苷酸组成和修饰对其核酸酶抗性的影响程度，将核苷酸组成和修饰不同的多种40碱基ON在有各种内切和外切核酸酶的情况下，37℃保温4小时。经尿素-聚丙烯酰胺凝胶电泳评价这些ON的降解长度。

这些研究的结果显示，只有当随机寡核苷酸ON完全硫代磷酸酯化和完全2’-O-甲基化时，它们对所测的四种酶(磷酸二酯酶II[Sigma]、S1核酸酶[Fermentas]、Bal31[New England Biolabs]和外切核酸酶1[New EnglandBiolabs])都有抗性(见表15)。随机寡核苷酸缺少这些修饰中的任何一种都会使它们对一或多种测试的核酸酶的敏感性增加。我们注意到完全硫代磷酸酯化、部分2′-O-甲基化的随机寡核苷酸(REP 2024)与REP 2006对核酸酶的抗性相当，说明硫代磷酸酯化ON的每个核苷酸上都要发生2′-O-甲基化以便达到最佳的核酸酶抗性。但是，我们也注意到硫代磷酸酯化40聚体多聚嘧啶—多聚胞嘧啶(poly C，REP 2031)对核酸酶的抗性与完全硫代磷酸酯化、完全2’-O-甲基化的随机寡核苷酸(REP 2107)相当。

这些结果很有意义，因为现有技术认为增强硫代磷酸酯ON的核酸酶抗性的优选方法是添加2′-O-甲基修饰、其他2′-核糖修饰或其他修饰。我们的新数据证明，如果所述ON是完全硫代磷酸酯化的，并且由嘧啶同聚物组成，则要提高它的核酸酶抗性不需要2′-O-甲基修饰或其他2′-核糖修饰或任何其他修饰。

表15.各种40碱基ON的核酸酶抗性

ON名	序列	修饰	37℃保温24小时后对各种核酸酶的稳定性
							PII	S1	Bal 31	Exo 1
			REP 2015	随机寡核苷酸	无	-					-	-	-
REP 2006	随机寡核苷酸	PS					+++	-	++++	++++
			REP 2086	随机寡核苷酸	2’OMe	++++					++++	-	++++
REP 2107	随机寡核苷酸	PS，2’OMe					++++	++++	++++	++++
			REP 2024	随机寡核苷酸	PS，2’OMegapmer	++++					-	++++	++++
REP 2031	polyC	PS					++++	++++	++++	++++
			REP 2029	polyA	PS	-					-	++++	++++
REP 2030	polyT	PS					-	-	++++	++++
			REP 2033	polyTG	PS	+					-	++++	++++
REP 2055	polyAC	PS					+	-	++++	++++
			REP 2056	polyTC	PS	+					-	++++	++++
REP 2057	polyAG	PS					++	-	-	-

PII＝磷酸二酯酶II，S1＝S1核酸酶，Exo1＝外切核酸酶1，PS＝所有连接键

硫代磷酸酯，2′OMe＝所有核糖都是2′O-甲基化的，-＝完全降解，++++＝没有降解，PS＝硫代磷酸酯，2′OMe＝核糖的2′-O-甲基化修饰

这些结果显示，只含有嘧啶核苷酸(包括胞嘧啶和/或胸腺嘧啶和/或其他嘧啶)的硫代磷酸酯化ON对低pH有抗性，其中仅含胞嘧啶核苷酸的硫代磷酸酯化ON呈现极强的核酸酶抗性，这是口服抗病毒ON的两个重要特点。因此，抗病毒ON的高嘧啶核苷酸含量有利于赋予它对低pH的抗性，并且高胞嘧啶含量有利于赋予它更高的核酸酶抗性。例如，在一些实施方案中，这类寡核苷酸的嘧啶含量超过50％，超过60％，或者超过70％，或者超过80％，或者超过90％，或者是100％。此外，这些结果显示了一种利用口服治疗有效量的至少一种可药用ON的可能治疗方法，其中的ON包含嘧啶核苷酸。这些结果还显示了嘧啶核苷酸含量高的ON作为抗病毒ON制剂的成分的可能性。

实施例17.ON在体内的不依赖于序列的广谱活性

我们在本实施例显示，40碱基的不依赖序列的PS-ON随机寡核苷酸在病毒感染的六种不同动物模型中均有强抗病毒活性(见表16)。将该40碱基的PS-ON随机寡核苷酸通过包括皮下、腹膜内和气溶胶(吸入)的多种给药途径导入动物体内。数据强有力地支持了这些不依赖于序列的ON作为广谱抗病毒剂的治疗前景。

表16.PS-ON随机寡核苷酸具有强的广谱体内抗病毒活性

病毒(株)(动物/感染方式)	病毒滴度的减少(器官)相对于安慰剂而言(途径)	p-值
			埃博拉萨伊(Mayinga)(小鼠/IP，致死模型)	100％存活率(n＝6)(腹膜内)	ND
甲型流感病毒/HW/68(小鼠/IN)	3.8 log10(肺)(气溶胶)	＜0.001
			MCMV(Smith)(Mouse 11V)	2.67 log10(脾)(皮下)	＜0.0001
1.67 log10(脾)(腹膜内)	0.012
		HSV-2(小鼠/阴道用胶)		～70％动物免于HSV-2传播	ND
弗兰德白血症病毒(小鼠IIV)	68％(感染的脾细胞减少)(皮下)		0.0084
		呼吸道合胞病毒(Long)(棉鼠IIN)		1.1 log10(肺)气溶胶	＜0.01

ND＝未测

实施例18.有广谱抗病毒活性的寡核苷酸

我们在本实施例中证明40碱基的PS-ON随机寡核苷酸对13个病毒科有体外抗病毒活性(见表17)。

表17.PS-ON随机寡核苷酸有广谱体外抗病毒活性

病毒科别	病毒(株)	活性(IC50，μM)	使用的试验
				疱疹病毒	HSV-1(KOS)	0.06	噬斑减少
HSV-1	0.2	CPE抑制
			HSV-2(MS2)		0.1	噬斑减少
HSV-2	0.02	CPE抑制
			CMV(AD169)		0.13	噬斑减少
人CMV	0.02	CPE抑制
			VZV		＜0.02	CPE抑制
逆转录病毒	HIV-1(多种临床分离株)	～0.1					P24 ELISA(在人PBMC中)
			HIV-1(NL4-3)	0.011	CPE抑制
	HIV/MLV嵌合体	0.014				基于荧光的感染试验
			嗜肝DNA病毒	HBV	0.007		检测上清液中的病毒粒子
副粘病毒	RSV(A2)	0.019				CPE抑制
			副流感病毒-3	0.125	噬斑减少
	冠状病毒	SARS(Toronto-2)				100	CPE抑制
线状病毒			埃博拉-萨伊(Mayinga)	0.1	感染细胞的FACS分析
	马尔堡(Muskoke)	IC99＜1				荧光噬斑减少
			砂粒病毒	拉沙热(Josiah)	IC99＜1		上清液中病毒减少
布尼亚病毒	汉坦病毒(Prospect Hill)	IC99＜10				荧光噬斑减少
			正痘病毒	痘苗(WR)	～1.5		噬斑减少
痘苗	～0.5	噬斑减少
				缺肢畸形(鼠痘)	～1.5	噬斑减少
黄病毒	西尼罗(NY-99)	3.02					CPE抑制
			黄热	3.47	CPE抑制
	登革(Den-4)	～10				噬斑减少
			披膜病毒	西方马脑炎	0.12		CPE抑制
弹状病毒	狂犬病(ERA)	IC99＜1				荧光噬斑减少
			正粘病毒	甲型流感病毒	～1		噬斑减少

实施例19.PS-ON的体内和体外抗流感病毒活性

为了进一步评价所述ON的抗流感病毒活性，我们利用血细胞凝集试验测试了REP 2006抗不同流感病毒株的活性。如表18所示，REP 2006显示出广谱抗流感病毒活性。

表18.REP 2006抗多种流感病毒株的广谱抗病毒活性

流感病毒株	试验1 IC50(mM)	试验2 IC50(mM)
			A/New Caledonia(H1N1)	0.014	0.055
A/Taiwan(H1N1)	0.014	0.055
			B/Panama	0.038	0.055
B/Singapore	0.038	0.055
			A/PR8(H1N1)	0.055	0.015
A/HK/68(H3N2)	0.008	0.0017
			A/WSN(H1N1)	0.038	未测

为了评价ON作为治疗流感的药物的可能性，在感染流感病毒的动物模型中测试REP 2006。将REP 2006在水中制备成两种浓度用于注射并经喷雾仪气雾化，后者出口连接一个Anderson cascade chamber。使20g Bal b/c小鼠在气溶胶腔中每天与用10ml REP 2006不同浓度的气雾化随机寡核苷酸1接触30分钟。然后用～100TCID的甲型流感病毒(H3N2，A/HongKong/68)鼻内感染小鼠，感染4天后，将动物处死，经血细胞凝集试验确定肺部的病毒滴度。如表19所示，REP 2006显示强的抗流感病毒活性。

表19.REP 2006抗甲型流感病毒的体内效力

处置	剂量mg/ml-SDAmg/kg-IP/SC	方案(天)	病毒滴度(log10/g肺)		ANOVA
							平均值	标准差	参量	非参量
			甲型流感病毒A/IIK/68(n＝5)在Balb/c小鼠中
dH2O	0(SDA)	-1、  0、  1、  2								6.6	0.9	NA	NA
				180(IP)	-1、  0、  1、  2	3.3	0.6	＜0.001	NS
REP 2006	10(SDA)	-1、  0、  1、  2								2.8	0.9	＜0.001	NS
			REP 2006	100(SDA)	-1、  0、  1、  2	＜2.3	0.0	＜0.001	＜0.01
甲型流感病毒A/HK/68(n＝5)在Balb/c小鼠中
							dH2O	0(SDA)	-1、  0、  1、  2	5.8	0.4	＜0.001	NA

REP 2006	10(SDA)	-1、  0、  1、  2	3.9	0.4	＜0.001	NS
							2×10(SDA)	-1、  0、  1、  2	3.3	0.5	＜0.001	＜0.01
	2×100(SDA)	1、  2	1.1	1.5	＜0.001	NS
							20(IP)	1、  2	3.2	0.4	＜0.001	NS
	20(SC)	1、  2	3.9	0.2	＜0.001	NS

SDA＝小滴气溶胶，IP＝腹膜内，SC＝皮下

^**表示相隔12小时每天给药两次

实施例20.硫代磷酸酯化多聚嘧啶ON显示出在体内酸性环境中的抗病毒活性增强

为了评价多聚嘧啶ON对低pH的抗性以及它们在体内低pH环境作为活性药物的能力，在HSV-2阴道小鼠模型中测试了REP 2031(PS polyC)。将0.1ml含有3mg醋酸甲羟孕酮的悬浮液在病毒攻击前7和1天，经皮下注射给予雌性瑞士Webster鼠以便提高小鼠对阴道HSV-2感染的易感性。在阴道穹窿上擦拭两次，第一次用润湿的头上带I型褐藻酸钙的棉拭，然后用的是干燥棉拭。用主动置换移液器将动物用15ml候选溶液或安慰剂对照进行处理。5分钟后，经滴注15ml含有10⁴ pfu的HSV-2(186株)悬浮液来给动物接种。在接种后的第二天从所有动物中收集阴道棉拭样品，冷冻(-80℃)保存直至通过培养来检验病毒的存在。接种后对小鼠每天进行评价，直至第21天，查找症状性感染的证据，例如毛发脱落和会阴周围的红斑、慢性尿失禁、后肢瘫痪，和死亡。如果接种后第二天收集的阴道棉拭样品中分离到了病毒，没有出现症状的动物也定义为被感染了。检测结果显示(表20)，多聚嘧啶REP 2031在酸性环境中有抗病毒活性，比如在这个例子中是阴道，或者是胃。

表20.ON在阴道中的抗HSV-2效力

病毒(株)(动物/感染方式)	化合物	给药途径和给药方案	相对安慰剂，病毒滴度的减少(器官)(log10)
				HSV-2(186)(瑞士Webster鼠/阴道)	REP 2006(PS-随机寡核苷酸)	阴道的单次预防性局部给药(100mg/ml胶)	使8/12动物免于被传染(在未处置动物中是0/12)

REP 2031(PS-polyA)

12/12动物免于传染

说明书中引用的所有专利和其他参考文献代表了发明相关领域的技术人员的水平，它们全文(包括任何表和图)以参考文献的方式引入本说明书，和每个参考文献是单独地全文引入本说明书一样。

本领域技术人员会非常赞同本发明很好地实现了设定的目标和优势，以及天然具有的优势。本文描述的代表优选实施方案的那些方法、变化和组合物是示范性的，而非意在限制本发明的范围。本领域技术人员会想到它们的变化和其他用途，这些也涵盖在本发明的精神内和权利要求所限定的范围。

对本领域的技术人员来说，很显然可以在不脱离本发明的范围和理念的情况下，给本文所公开的发明进行不同替代和修改。例如，可以给寡核苷酸的合成条件和组成做改动。因此，这些其他的实施方案也在本发明和以下权利要求保护的范围内。

本文举例描述的发明可以在缺少任何一种或多种元素、一种或多种限制的情况下适当实施，所述元素和限制没有在文中具体公开。因此，例如在每种情况中，名词″包含″、″基本上由…组成″以及″由…组成″中的每一个均可以用另外两个名词代替。文中采用的名词和表达方式是用于描述而非限制的，我们使用这些名词和表达方式不是试图排除这里描述的属性的等同体或其部分，而是认识到在本发明要求保护的范围内可能进行各种修改。因此，应当理解，虽然本发明是通过优选实施方案特定性地公开的，但是任选的特性、文中公开的发明理念的修改和变化可以由本领域技术人员来实现，而且这类修改和变化被认为是在由附带的权利要求界定的本发明的范围内。

此外，当发明的一些特性或方面是以马库什族式结构或其他替代的族式结构来描述时，本领域技术人员应当意识到，本发明因此也是通过马库什族式结构或其他族式结构的任何单个成员或者成员的亚族群来描述的。

同样，除非另有说明，当实施方案中提供了多个数字值时，另外的实施方案的描述是通过任取两个不同数值作为范围的端点。这类数值范围也在发明的保护范围内。

因此，其他实施方案也在本发明和以下权利要求保护的范围内。

REP 1001  20mer，来自人的自我复制序列

序列      TTGATAAATAGTACTAGGAC

PS        ····················

REP 2001  22mer，来自HSV-1复制起点

序列      GAAGCGTTCGCACTTCGTCCCA

PS        ······················

REP 3007  16mer，来自pUC19/pBR322复制起点

序列      CTTGCGGTATTCGGAA

PS        ················

REP 2002  5mer随机寡核苷酸

序列      NNNNN

PS        ·····

REP 2032  6mer随机寡核苷酸

序列      NNNNNN

PS        ······

REP 2003  10mer随机寡核苷酸

序列      NNNNNNNNNN

PS        ··········

REP 2009  12mer随机寡核苷酸

序列      NNNNNNNNNNNN

PS        ············

REP 2010  14mer随机寡核苷酸

序列      NNNNNNNNNNNNNN

PS        ··············

REP 2011  16mer随机寡核苷酸

序列      NNNNNNNNNNNNNNNN

PS        ················

REP 2012  18mer随机寡核苷酸

序列      NNNNNNNNNNNNNNNNNN

PS        ··················

REP 2004  20mer随机寡核苷酸

序列      NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN

PS        ····················

REP 2005  30mer随机寡核苷酸

序列      NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN

PS        ······························

REP 2006  40mer随机寡核苷酸

序列      NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN

PS        ········································

REP 2007  80mer随机寡核苷酸

序列      NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN 60

PS        ·································· ··············· ···········

序列      NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN 80

PS        ····················

REP 200B  120mer随机寡核苷酸

序列      NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN 60

PS        ····························································

序列      NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN 1 2 0

PS        ······················································· ·····

REP 2013  10mer随机寡核苷酸

序列      NNNNNNNNNN

无修饰

REP 2014  20mer随机寡核苷酸

序列    NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN

无修饰

REP 2015 40mer随机寡核苷酸

序列    NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN

无修饰

REP 2016  10mer随机寡核苷酸序列

序列      TCCGAAGACG

PS        ··········

REP 2017    20mer随机寡核苷酸序列

序列        ACACCTCCGAAGACGATAAC

PS          ····················

REP 2018    40mer随机寡核苷酸序列

序列        CTACAGACATACACCTCCGAAGACGATAACACTAGACATA

PS          ········································

REP 2019    10mer序列，以HSV-1 IE110蛋白起始密码子为中心

            (NCBI  登录号  #X04614)

序列        CCCCC

PS          ··········

REP 2020    20mer序列，以HSV-1 IE110蛋白起始密码子为中心

            (NCBI  登录号    #X04614)

序列        TACGACCCCC

PS          ····················

REP 2021    40mer序列，以HSV-1IE110蛋白起始密码子为中心

            (NCBI  登录号    #X04614)

序列        TCCAGCCGCATACGACCCCC

PS          ········································

REP 2024    40mer随机寡核苷酸

序列        NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN

PS          ········································

2-O Me      ····                                                                ····

REP 2026    40mer随机寡核苷酸

序列        NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN

PCH3        ····    ····

REP 2036    21mer市售抗CMV反义核酸

            (vitravine/fomvirisen)  内部合成

序列        GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCG

PS          ·····················

REP 2036    21mer市售抗CMV反义核酸

            (vitravine/fomvirisen)  市售产品  (cGMP)

序列        GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCG

PS          ·····················

A20          20mer

序列         AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-FITC

PS           ····················

G20          20mer

序列         GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG-FITC

PS           ····················

C20          20mer

序列         CCCCCCCCCCCCCCCCCCCC-FITC

PS           ····················

T20          20mer

序列         TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-FITC

PS           ····················

AC10         20mer

序列         ACACACACACACACACACAC-FITC

PS           ····················

AG10         20mer

序列         AGAGAGAGAGAGAGAGAGAC-FITC

PS           ····················

TC10         20mer

序列         TCTCTCTCTCTCTCTCTCTC-FITC

PS           ····················

TG10         20mer

序列         TGTGTGTGTGTGTGTGTGTG-FITC

PS           ····················

REP 2029     40mer

序列         AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

PS           ········································

REP 2028    40mer

序列        GGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG

PS          ········································

REP 2031    40mer

    序列    CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC

PS          ········································

REP 2030    40mer

序列        TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT

PS        ········································

REP 2033    40mer

序列        TGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTG

PS          ········································

REP 2055    40mer

序列        ACACACACACACACACACACACACACACACACACACACAC

PS          ········································

REP 2056    40mer

序列        TCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTC

PS          ········································

REP 2057    40mer

序列        AGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAG

PS          ········································

REP 205 9    20mer RNA随机寡核苷酸

序列         NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN

PS           ····················

REP 20 60    30mer RNA随机寡核苷酸

序列         NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN

PS           ······························

REP 2107 40mer RNA随机寡核苷酸

序列     NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN

PS       ·························· · ·············

2-O Me   ········································

REP 2086 40mer RNA随机寡核苷酸

序列     NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN

2-O Me   ········································

序列表

<110>里普利科公司(REPLICOR INC.)

     VAILLANT，Andrew

     JUTEAU，Jean-Marc

<120>抗病毒寡核苷酸

<130>16051-14PCT

<150>US 10/969,812

<151>2004-10-19

<150>US 60/668,983

<151>2005-04-07

<160>26

<170>FastSEQ for Windows Version 4.0

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>REP 1001 20mer from human autonomously replicating sequence

<220>

<221>misc_structure

<222>(1)…(20)

<223>硫代磷酸酯键

<400>1

ttgataaata gtactaggac            20

<210>2

<21>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>REP 2001-22mer from HSV-1复制起点

<220>

<221>misc_structure

<222>(1)…(22)

<223>硫代磷酸酯键

<400>2

gaagcgt tcg cact tcgtcc ca    22

<210>3

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>REP 3007-16mer，来自pUC19/pBR322复制起点

<220>

<221>misc_structure

<222>(1)…(16)

<223>硫代磷酸酯键

<400>3

cttgcggtat tcggaa    16

<210>4

<211>10

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>REP 2016-10mer随机寡核苷酸序列

<220>

<221>misc_structure

<222>(1)…(10)

<223>硫代磷酸酯键

<400>4

tccgaagacg    10

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>REP 2017-20mer随机寡核苷酸序列

<220>

<221>misc_structure

<222>(1)…(20)

<223>硫代磷酸酯键

<400>5

acacctccga agacgataac    20

<210>6

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>REP 2018-40mer随机寡核苷酸序列

<220>

<221>misc_structure

<222>(1)…(40)

<223>硫代磷酸酯键

<400>6

ctacagacat acacctccga agacgataac actagacata    40

<210>7

<211>10

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>REP 2019-10mer，以HSV-1 IE110蛋白启示密码子为中心

<220>

<221>misc_structure

<222>(1)…(10)

<223>硫代磷酸酯键

<400>7

cccccatgga    10

<210>8

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>REP 2020-20mer，以HSV-1 IE110蛋白启示密码子为中心

<220>

<221>misc_structure

<222>(1)…(20)

<223>硫代磷酸酯键

<400>8

tacgaccccc atggagcccc    20

<210>9

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>REP 2021-40mer，以HSV-1 IE110蛋白启示密码子为中心

<220>

<221>misc_structure

<222>(1)…(40)

<223>硫代磷酸酯键

<400>9

tccagccgca tacgaccccc atggagcccc gccccggagc    40

<210>10

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>REP 2036-21mer，市售抗CMV反义核酸

<220>

<221>misc_structure

<222>(1)...(21)

<223>硫代磷酸酯键

<400>10

gcgtttgctc ttcttcttgc g    21

<210>11

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>A20寡聚体

<220>

<221>misc_structure

<222>(1)...(20)

<223>硫代磷酸酯键

<220>

<221>misc_feature

<222>(20)…(0)

<223>FITC标记

<400>11

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa    20

<210>12

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>G20寡聚体

<220>

<221>misc_structure

<222>(1)...(20)

<223>硫代磷酸酯键

<220>

<221>misc_feature

<222>(20)...(0)

<223>FITC标记

<400>12

gggggggggg gggggggggg    20

<210>13

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>C20寡聚体

<220>

<221>misc_structure

<222>(1)…(20)

<223>硫代磷酸酯键

<220>

<221>misc_feature

<222>(20)…(0)

<223>FITC标记

<400>13

cccccccccc cccccccccc    20

<210>14

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>T20寡聚体

<220>

<221>misc_structure

<222>(1)…(20)

<223>硫代磷酸酯键

<220>

<221>misc_feature

<222>(20)...(0)

<223>FITC标记

<400>14

tttttttttt  tttttttttt    20

<210>15

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>AC10寡聚体

<220>

<221>misc_structure

<222>(1)…(20)

<223>硫代磷酸酯键

<220>

<221>misc_feature

<222>(20)…(0)

<223>FITC标记

<400>15

acacacacac acacacacac    20

<210>16

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>AG10寡聚体

<220>

<221>misc_structure

<222>(1)…(20)

<223>硫代磷酸酯键

<220>

<221>misc_feature

<222>(20)…(0)

<223>FITC标记

<400>16

agagagagag agagagagag    20

<210>17

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>TC10寡聚体

<220>

<221>misc_structure

<222>(1)...(20)

<223>硫代磷酸酯键

<220>

<221>misc_feature

<222>(20)…(0)

<223>FITC标记

<400>17

tctctctctc tctctctctc    20

<210>18

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>TG10寡聚体

<220>

<221>misc_structure

<222>(1)…(20)

<223>硫代磷酸酯键

<220>

<221>misc_feature

<222>(20)…(0)

<223>FITC标记

<400>18

tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg    20

<210>19

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>REP 2029寡聚体

<220>

<221>misc_structure

<222>(1)…(40)

<223>硫代磷酸酯键

<400>19

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa    40

<210>20

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>REP 2028寡聚体

<220>

<221>misc_structure

<222>(1)…(40)

<223>硫代磷酸酯键

<400>20

gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg    40

<210>21

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>REP 2031寡聚体

<220>

<221>misc_structure

<222>(1)...(40)

<223>硫代磷酸酯键

<400>21

cccccccccc cccccccccc cccccccccc cccccccccc    40

<210>22

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>REP 2030寡聚体

<220>

<221>misc_structure

<222>(1)…(40)

<223>硫代磷酸酯键

<400>22

tttttttttt  tttttttttt  tttttttttt  tttttttttt    40

<210>23

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>REP 2055寡聚体

<220>

<221>misc_structure

<222>(1)…(40)

<223>硫代磷酸酯键

<400>23

acacacacac acacacacac acacacacac acacacacac    40

<210>24

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>REP 2056寡聚体

<220>

<221>misc_structure

<222>(1)...(40)

<223>硫代磷酸酯键

<400>24

tctctctctc tctctctctc tctctctctc tctctctctc    40

<210>25

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>REP 2057寡聚体

<220>

<221>misc_structure

<222>(1)…(40)

<223>硫代磷酸酯键

<400>25

agagagagag agagagagag agagagagag agagagagag    40

<210>26

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Rep 2033寡聚体

<220>

<221>misc_structure

<222>(1)...(40)

<223>硫代磷酸酯键

<400>26

tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg    40

Claims (76)

1.一种寡核苷酸，该寡核苷酸中至少50％核苷酸在其核糖部分2’位置被修饰，至少50％核苷酸间连接键被修饰，其中所述寡核苷酸具有抗靶病毒的抗病毒活性，该活性主要以不依赖于序列的方式作用。

2.权利要求1的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸至少有50％核苷酸在其核糖部分2’位置被修饰，至少80％核苷酸间连接键被修饰，该寡核苷酸具有抗靶病毒的抗病毒活性，该活性主要以不依赖于序列的方式作用。

3.权利要求1的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸至少有80％核苷酸在其核糖部分2’位置被修饰，至少80％核苷酸间连接键被修饰，该寡核苷酸具有抗靶病毒的抗病毒活性，该活性主要以不依赖于序列的方式作用。

4.权利要求1的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸至少有90％核苷酸在其核糖部分2’位置被修饰，至少90％核苷酸间连接键被修饰，该寡核苷酸具有抗靶病毒的抗病毒活性，该活性主要以不依赖于序列的方式作用。

5.权利要求1的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸至少有100％核苷酸在其核糖部分2’位置被修饰，至少100％核苷酸间连接键被修饰，该寡核苷酸具有抗靶病毒的抗病毒活性，该活性主要以不依赖于序列的方式作用。

6.权利要求1到5任一项的寡核苷酸，其中所述被修饰键选自硫代磷酸酯键、二硫代磷酸酯键和硼烷磷酸酯键。

7.权利要求1到5任一项的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸中至少50％核苷酸在核糖部分的2’位置包含2’-OMe组分。

8.权利要求1到5任一项的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸中至少50％核苷酸在核糖部分的2’位置包含2’-甲氧乙氧基取代。

9.权利要求1到8任一项的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸至少长30个核苷酸。

10.权利要求1到9任一项的寡核苷酸，其包含一段同聚物序列，该序列有至少10个连续的选自A、T、U、C、G和I的核苷酸。

11.权利要求1到9任一项的寡核苷酸，包含一段至少10个核苷酸长、选自polyAT、polyAC、polyAG、polyAU、polyAI、polyGC、polyGT、polyGU、polyGI、polyCT、polyCU、polyCI和polyTI的序列。

12.权利要求1到11任一项的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的至少15％核苷酸在其核糖部分的2’位置包含2′-甲氧乙氧基或2′OMe取代。

13.权利要求1到12任一项的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸是由接头连在一起的两个或更多个寡核苷酸序列组成的多联体。

14.权利要求1到13任一项的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸在一或多个核苷酸残基上连接或偶联了能改变该寡核苷酸特性的分子，以便获得一或多种选自以下的特性：更高的稳定性、血清反应下降、更高的细胞吸收、与病毒蛋白的相互作用更强、配制成进行递送的制剂的能力改善、有可检测信号、更高的抗病毒活性、更好的药物代谢动力学特性、特异组织分布和毒性减弱。

15.权利要求1到14任一项的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸是双链的。

16.权利要求1到15任一项的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的目标是DNA病毒或RNA病毒。

17.权利要求1到16任一项的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的目标病毒选自：疱疹病毒科病毒、HSV-1、HSV-2、CMV、水痘带状疱疹病毒、EB病毒、人疱疹病毒6A和6B、嗜肝DNA病毒科病毒、HBV、细小病毒科病毒、痘病毒科病毒、乳头瘤病毒科病毒、腺病毒科病毒、逆转录病毒科病毒、HIV-1、HIV-2、副粘病毒科病毒、RSV、副流感病毒、人类偏肺病毒、布尼亚病毒科病毒、汉坦病毒、裂谷热病毒、克里米亚-刚果出血热病毒、小RNA病毒科病毒、柯萨奇病毒、鼻病毒、黄病毒科病毒、黄热病毒、登革病毒、西尼罗病毒、丙型肝炎病毒、线状病毒科病毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒、正粘病毒科病毒、流感病毒、披膜病毒科病毒、西方马脑炎病毒、冠状病毒、呼肠病毒科病毒、弹状病毒科病毒、沙粒病毒科病毒、拉沙热病毒病毒和杯状病毒科。

18.一种寡核苷酸，为REP 1001、REP 2001、REP 3007、REP 2004、REP 2005、REP 2006、REP 2007、REP 2008、REP 2017、REP 2018、REP 2020、REP 2021、REP 2024、REP 2036、A20、G20、C20、REP 2029、REP 2031、REP 2030、REP 2033、REP 2055、REP 2056、REP 2057、REP 2060和REP2107之一所示。

19.一种寡核苷酸混合物，包含混合在一起的至少两种不同的权利要求1到18任一项所述抗病毒寡核苷酸。

20.一种寡核苷酸混合物，包含混合在一起的至少十种不同的权利要求1到18任一项所述抗病毒寡核苷酸。

21.一种抗病毒药用组合物，包含治疗有效量的可药用的至少一种为权利要求1到18任一项界定的抗病毒寡核苷酸；以及可药用载体。

22.一种试剂盒，其在带标签的包装中包含至少一种权利要求1到18任一项界定的抗病毒寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的抗病毒活性主要是通过非序列互补作用方式发生的，所述包装上的标签表明该抗病毒寡核苷酸可以用于抗至少一种病毒。

23.权利要求22的试剂盒，其中该试剂盒含有至少两种不同抗病毒寡核苷酸的混合物。

24.一种抗病毒药用组合物，其包含治疗有效量的至少一种可药用多聚嘧啶寡核苷酸和可药用载体，其中所述寡核苷酸的抗病毒活性主要是通过不依赖于序列的作用方式发生的。

25.权利要求24的抗病毒药用组合物，其中所述寡核苷酸包含至少一种修饰的核苷酸间连接键。

26.权利要求24或25之一项的组合物，其中该组合物配制成用于向酸性体内部位给药的形式。

27.权利要求24到26任一项的组合物，其中该组合物适用于经口、阴道或局部给药。

28.权利要求24到27任一项的组合物，其中该组合物包含至少一种polyC寡核苷酸。

29.权利要求24到27任一项的组合物，其中该组合物包含至少一种polyT寡核苷酸。

30.权利要求24到27任一项的组合物，其中该组合物包含至少一种polyCT寡核苷酸。

31.一种寡核苷酸，其至少50％核苷酸间连接键被修饰，其中所述寡核苷酸具有抗靶病毒的抗病毒活性，该活性主要以不依赖于序列的方式进行，所述寡核苷酸包含至少80％嘧啶残基。

32.权利要求31的寡核苷酸，其中该寡核苷酸有80％核苷酸间连接键被修饰。

33.权利要求31的寡核苷酸，其中该寡核苷酸有80％核苷酸间连接键被修饰，并且含有100％嘧啶残基。

34.权利要求31的寡核苷酸，其中该寡核苷酸有100％核苷酸间连接键被修饰，并含有至少80％嘧啶残基。

35.权利要求31的寡核苷酸，其中该寡核苷酸有100％核苷酸间连接键被修饰，并含有100％嘧啶残基。

36.权利要求31到35任一项的寡核苷酸，其中所述被修饰的连接键选自硫代磷酸酯键、二硫代磷酸酯键和硼烷磷酸酯键。

37.权利要求31到35任一项的寡核苷酸，其中所述被修饰的连接键是硫代磷酸酯键。

38.权利要求31到37任一项的寡核苷酸，其中所述嘧啶残基是胞嘧啶残基。

39.权利要求31到37任一项的寡核苷酸，其中所述嘧啶残基是胸腺嘧啶残基。

40.权利要求31到37任一项的寡核苷酸，其中所述嘧啶残基是胞嘧啶或胸腺嘧啶残基。

41.权利要求31到40任一项的寡核苷酸，其中该寡核苷酸至少30个核苷酸长。

42.权利要求31到40任一项的寡核苷酸，其中该寡核苷酸至少40个核苷酸长。

43.权利要求31到42任一项的寡核苷酸，其中该寡核苷酸的至少15％核苷酸在其核糖部分的2’位置包含2′-甲氧乙氧基或2′-OMe取代。

44.权利要求31到43任一项的寡核苷酸，其中该寡核苷酸是由接头连在一起的两个或更多个寡核苷酸序列构成的多联体。

45.权利要求31到44任一项的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸在一或多个核苷酸残基上连接或偶联了能改变该寡核苷酸特性的分子，以便获得一或多个选自以下的特性：更高的稳定性、血清反应下降、更高的细胞吸收、与病毒蛋白的相互作用更强、配制成进行递送的制剂的能力改善、有可检测信号、更高的抗病毒活性、更好的药物代谢动力学特性、特异性组织分布和毒性减弱。

46.权利要求31到45任一项的寡核苷酸，其中该寡核苷酸是双链的。

47.权利要求31到46任一项的寡核苷酸，其中该寡核苷酸的目标是DNA病毒或RNA病毒。

48.权利要求31到46任一项的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的目标病毒选自：疱疹病毒科病毒、HSV-1、HSV-2、CMV、水痘带状疱疹病毒、EB病毒、人疱疹病毒6A和6B、嗜肝DNA病毒科病毒、HBV、细小病毒科病毒、痘病毒科病毒、乳头瘤病毒科病毒、腺病毒科病毒、逆转录病毒科病毒、HIV-1、HIV-2、副粘病毒科病毒、RSV、副流感病毒、人类偏肺病毒、布尼亚病毒科病毒、汉坦病毒、裂谷热病毒、克里米亚-刚果出血热病毒、小RNA病毒科病毒、柯萨奇病毒、鼻病毒、黄病毒科病毒、黄热病毒、登革病毒、西尼罗病毒、丙型肝炎病毒、线状病毒科病毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒、正粘病毒科病毒、流感病毒、披膜病毒科病毒、西方马脑炎病毒、冠状病毒科病毒、呼肠病毒科病毒、弹状病毒科病毒、沙粒病毒科病毒、拉沙热病毒和杯状病毒科。

49.一种寡核苷酸混合物，包含混合在一起的至少两种不同的权利要求31到48任一项所述抗病毒寡核苷酸。

50.一种寡核苷酸混合物，包含混合在一起的至少十种不同的权利要求31到48任一项所述抗病毒寡核苷酸。

51.一种抗病毒药用组合物，包含治疗有效量的可药用的至少一种为权利要求31到48任一项界定的抗病毒寡核苷酸；以及可药用载体。

52.权利要求51的组合物，其中该组合物配制成用于向酸性体内部位给药的形式。

53.权利要求51到52任一项的组合物，其中该组合物适用于经口、阴道或局部给药。

54.一种试剂盒，其在带标签的包装中包含至少一种权利要求31到48任一项界定的抗病毒寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的抗病毒活性主要是通过非序列互补的作用方式发生的，所述包装上的标签表明该抗病毒寡核苷酸可以用于抗至少一种病毒。

55.权利要求54的试剂盒，其中该试剂盒含有至少两种不同抗病毒寡核苷酸的混合物。

56.一种抗病毒药用组合物，其包含治疗有效量的至少一种可药用多聚嘧啶寡核苷酸和可药用载体，其中所述寡核苷酸的抗病毒活性主要是通过不依赖于序列的作用方式发生的；以及可药用载体。

57.权利要求56的抗病毒药用组合物，其中所述寡核苷酸包含修饰的核苷酸间连接键。

58.权利要求56或57的组合物，其中该组合物配制成用于向酸性体内部位给药的形式。

59.权利要求56到58任一项的组合物，其中该组合物是粉末的形式。

60.权利要求56到58任一项的组合物，其中该组合物适用于经口、阴道或局部给药。

61.权利要求56到58任一项的组合物，其中该组合物包含至少一种polyC寡核苷酸。

62.权利要求56到58任一项的组合物，其中该组合物包含至少一种polyT寡核苷酸。

63.至少一种可药用寡核苷酸用于制备药剂的用途，该药剂可用于给受试者预防或治疗病毒感染，所述寡核苷酸是权利要求1到18以及31到48任一项所界定的寡核苷酸。

64.至少一种可药用寡核苷酸用于给受试者预防或治疗病毒感染的用途，其中所述寡核苷酸是权利要求1到18以及31到48任一项所界定的寡核苷酸。

65.治疗有效量的至少一种可药用寡核苷酸混合物用于制备药剂的用途，该药剂可用于给受试者预防或治疗病毒感染，所述寡核苷酸混合物是权利要求19、20、49或50所界定的混合物。

66.治疗有效量的至少一种可药用寡核苷酸混合物用于给受试者预防或治疗病毒感染的用途，其中所述寡核苷酸混合物是权利要求19、20、49或50所界定的混合物。

67.治疗有效量的至少一种可药用抗病毒药用组合物用于制备药剂的用途，该药剂可以用于给受试者预防或治疗病毒感染，其中所述药用组合物是权利要求21、24到30、51到53，以及56到62任一项所界定的组合物。

68.治疗有效量的至少一种可药用抗病毒药用组合物用于给受试者预防或治疗病毒感染的用途，其中所述药用组合物是权利要求21、24到30、51到53，以及56到62任一项所界定的组合物。

69.治疗有效量的至少一种可药用寡核苷酸用于制备药剂的用途，该药剂可用于给人或非人动物预防治疗致癌病毒导致的癌症，其中所述寡核苷酸是权利要求1到18和31到48任一项所界定的寡核苷酸。

70.治疗有效量的至少一种可药用寡核苷酸用于给人或非人动物预防治疗致癌病毒导致的癌症的用途，其中所述寡核苷酸是权利要求1到18和31到48任一项所界定的寡核苷酸。

71.治疗有效量的至少一种可药用寡核苷酸混合物用于制备药剂的用途，该药剂可用于给人或非人动物预防治疗致癌病毒导致的癌症，其中所述寡核苷酸混合物是权利要求19、20、49或50所界定的混合物。

72.治疗有效量的至少一种可药用寡核苷酸混合物用于给人或非人动物预防性治疗致癌病毒导致的癌症的用途，其中所述寡核苷酸混合物是权利要求19、20、49或50所界定的混合物。

73.治疗有效量的至少一种可药用抗病毒药用组合物用于制备药剂的用途，该药剂可以用于给人或非人动物预防治疗致癌病毒导致的癌症，其中所述药用组合物是权利要求21、24到30、51到53，以及56到62任一项所界定的组合物。

74.治疗有效量的至少一种可药用抗病毒药用组合物用于给人或非人动物预防性治疗致癌病毒导致的癌症的用途，其中所述药用组合物是权利要求21、24到30、51到53，以及56到62任一项所界定的组合物。

75.治疗有效量的至少一种可药用抗病毒药用组合物用于制备药剂的用途，该药剂用于预防或治疗受试者体内酸性环境的病毒感染，其中所述药用组合物是权利要求51到53任一项所界定的组合物，并且适合向体内酸性部位给药。

76.治疗有效量的至少一种可药用抗病毒药用组合物用于预防或治疗受试者体内酸性环境的病毒感染的用途，其中所述药用组合物是权利要求51到53任一项所界定的组合物，并且适合向体内酸性部位给药。