ES2873844T3 - Composiciones de complejo de quelato de oligonucleótido y polipéptido y métodos - Google Patents

Abstract

Una composición farmacéutica que comprende un complejo de quelato de oligonucleótido (ON) antivírico, que consiste en dos o más ON antivíricos conectados intermolecularmente por un catión divalente, en donde los dos o más ON antivíricos son polímeros de ácido nucleico (PAN) monocatenarios con fosforotioatos seleccionados de SEQ ID n.º 18 o SEQ ID n.º 11 y al menos un polipéptido antivírico seleccionado del grupo que consiste en el interferón α- 2a PEGilado y la timosina α1 sintética, y en donde la composición farmacéutica está formulada para la administración subcutánea o para la infusión intravenosa.

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones de complejo de quelato de oligonucleótido y polipéptido y métodos

Remisión a solicitudes relacionadas

Esta solicitud reivindica la prioridad sobre la solicitud provisional de los EE. UU. de número de serie 61/695035 registrada el 30 de agosto de 2012 y de la solicitud provisional de los EE. UU. de número de serie 61/648 711 registrada el 18 de mayo de 2012.

Campo de la técnica

La presente descripción se refiere a composiciones que comprenden un complejo de quelato de oligonucleótido (ON) y uno o más polipéptidos o polipéptidos PEGilados diferentes, los métodos para preparar las composiciones que contienen un complejo de quelato de ON y uno o más polipéptidos o polipéptidos PEGilados diferentes, y los métodos de tratamiento de diferentes enfermedades con dichas composiciones.

Antecedentes de la técnica

Los complejos de quelato de oligonucleótidos (ON) son dos o más ON conectados intermolecularmente por un catión de metal divalente o de otro metal multivalente. Los complejos de quelato de ON neutralizan las propiedades de quelación inherentes de los ON que pueden contribuir a los efectos secundarios relacionados con la administración con estos compuestos. La administración de los complejos de quelato de ON es un nuevo método para administrar un ON a un sujeto con el que se mitigan los efectos secundarios relacionados con la administración que llevan asociados los ON sin quelar. Estos efectos secundarios pueden incluir temblor, fiebre y escalofríos cuando la infusión es intravenosa, o endurecimiento, inflamación y dolor en el sitio de la inyección cuando la administración es subcutánea. Además, al preparar los ON como complejos de quelatos, se puede mejorar su comportamiento farmacocinético, lo que proporciona un incremento de su actividad terapéutica con una dosificación similar en comparación con los ON sin quelar. La caracterización y las propiedades de los complejos de quelato de ON se describió anteriormente en la publicación de solicitud de patente internacional n.° WO 2012/021985 y en la publicación de la solicitud de la patente de los EE. UU. n.° 2012/0046348. Los ON como sales se han descrito en la solicitud de patente internacional n.° WO 2007/022642 para el tratamiento de las enfermedades inflamatorias, en la solicitud de patente internacional WO 2007/036016 para la prevención y el tratamiento de los trastornos trombóticos, trastornos relacionados con el colesterol, dislipidemia, osteoporosis y efectos del veneno de las serpientes, y en la solicitud de patente internacional WO 2006/042418 para su uso como antivírico. Se considera que el interferón a modificado con PEG sirve para tratar la infección vírica en la solicitud de patente internacional WO 2004/076474. La solicitud de patente internacional WO 03/037272 describe un conjugado fisiológicamente activo que incluye el péptido a 1 de la timosina (TA1) conjugado a un material que incrementa la semivida del péptido TA1 en el suero de un paciente cuando el conjugado se administra a un paciente. En Muir et al (2010) Hepatology, vol 52, n.° 3, páginas 822-832, se describe un estudio de fase 1b del interferón A 1 PEGilado con o sin ribavirina en los pacientes con infección crónica del virus de la hepatitis C del genotipo 1.

Los complejos de quelato de ON constituyen una mejora del método de administración de los ON al presentar menos efectos secundarios sin afectar a la actividad bioquímica del ON cuando se administra como una simple sal de sodio.

Los complejos de quelato de ON que comprenden un ON que actúa mediante un mecanismo dependiente de la secuencia o un mecanismo independiente de la secuencia pueden tener un efecto terapéutico para un cuadro clínico que puede no garantizar un resultado terapéutico óptimo en el sujeto enfermo que se somete al tratamiento con el complejo de quelato de ON.

En consecuencia, en la técnica existe una necesidad de dar a conocer una nueva composición mejorada que comprende un complejo de quelato de ON, tal como en una formulación de combinación.

Los complejos de quelato de ON antivírico que comprenden un ON antivírico que actúa mediante mecanismos dependientes de la secuencia o independientes de la secuencia pueden tener un efecto antivírico contra diferentes infecciones víricas. Estos efectos antivíricos pueden no garantizar un resultado terapéutico óptimo en el sujeto con una infección vírica existente que se somete al tratamiento con el quelato de ON. Se puede conseguir otro resultado terapéutico mejorado mediante el uso simultáneo de un complejo de quelato de ON antivírico y una inmunoterapia basada en los polipéptidos que se sabe que tienen actividad antivírica.

En consecuencia, en la técnica existe la necesidad de dar a conocer una nueva composición que comprende un complejo de quelato de ON antivírico y un polipéptido o polipéptido PEGilado antivírico en combinación. Idealmente, el polipéptido antivírico tendría también actividad contra la infección vírica en cuestión, bien por afectar a la misma diana/vía bioquímica que el quelato de ON antivírico en cuestión, o bien por afectar una diana/vía bioquímica diferente de la afectada por el complejo de quelato de ON antivírico.

Compendio

De acuerdo con la presente descripción, ahora se da a conocer una composición farmacéutica que comprende un complejo de quelato de ON y uno o más polipéptidos diferentes.

De acuerdo con la presente descripción, ahora se da a conocer una composición farmacéutica antivírica que comprende un complejo de quelato de ON antivírico y uno o más polipéptidos o polipéptidos PEGilados antivíricos. La presente invención es tal y como se define en las reivindicaciones. En concreto, la presente invención da a conocer una composición farmacéutica que comprende un complejo de quelato de oligonucleótido (ON) antivírico, que comprende dos o más ON antivíricos conectados intermolecularmente mediante un catión divalente, en donde los dos o más ON antivíricos son polímeros de ácido nucleico (PAN) monocatenario con fosforotioato seleccionados de la SEQ ID n.° 18 o la SEQ ID n.° 11 y al menos un polipéptido antivírico seleccionado del grupo que consiste en el interferón a-2a PEGilado y timosina a1 sintética, y en donde la composición farmacéutica se formula para la administración subcutánea o para la infusión intravenosa.

Se describe un método para tratar un cuadro clínico que comprende la etapa de administrar una composición farmacéutica que comprende un complejo de quelato de ON y un polipéptido a un sujeto que necesita tratamiento.

Se describe un método para tratar un cuadro clínico que comprende la etapa de administrar composiciones farmacéuticas distintas por las mismas o diferentes vías de administración, en donde la primera composición comprende el complejo de quelato de ON y la segunda el polipéptido, a un sujeto que necesita tratamiento.

Se describe un método para tratar una infección vírica que comprende la etapa de administrar la composición farmacéutica que comprende un quelato de ON antivírico y un polipéptido antivírico a un sujeto que necesita tratamiento.

Se describe un método para tratar una infección vírica que comprende la etapa de administrar, por la misma o diferentes vías de administración, composiciones farmacéuticas distintas, una que comprende el complejo de quelato de ON antivírico y la otra el polipéptido antivírico, a un sujeto que necesita tratamiento.

e describe un método para tratar una infección vírica que comprende la etapa de administrar el complejo de quelato de ON antivírico y el polipéptido antivírico en la misma composición farmacéutica o bien en diferentes composiciones farmacéuticas por la misma vía o por diferentes vías de administración.

Se describe el uso de una composición farmacéutica que comprende un complejo de quelato de ON y un polipéptido para tratar una enfermedad. La presente invención da a conocer una composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención para ser usada en un tratamiento.

Se describe el uso de una composición farmacéutica que comprende un complejo de quelato de ON y un polipéptido en la fabricación de un medicamento para tratar una enfermedad.

Se describe el uso de una primera composición farmacéutica que comprende un complejo de quelato de ON y una segunda composición farmacéutica que comprende un polipéptido para tratar un cuadro clínico, en donde las composiciones se formulan para la misma vía o para diferentes vías de administración.

Se describe el uso de una composición farmacéutica que comprende un quelato de ON antivírico y un polipéptido antivírico para tratar una infección vírica. La presente invención da a conocer una composición farmacéutica que comprende un complejo de quelato de oligonucleótido (ON) antivírico, que consiste en dos o más ON antivíricos conectados intermolecularmente mediante un catión divalente, en donde dos o más ON antivíricos son polímeros de ácido nucleico (PAN) monocatenarios con fosforotioato de SEQ ID n.° 18, y al menos un polipéptido antivírico seleccionado del grupo que consiste en el interferón a-2a PEGilado y la timosina a1 para ser usados en un método para tratar la hepatitis B.

Se describe el uso de una composición farmacéutica que comprende un quelato de ON antivírico y un polipéptido antivírico en la fabricación de un medicamento para tratar una infección vírica.

Se describe el uso de composiciones farmacéuticas, una que comprende el complejo de quelato de ON antivírico y la otra el polipéptido antivírico, formuladas para la administración por la misma vía o por diferentes vías por separado, para tratar una infección vírica.

Se describe el uso de un complejo de quelato de ON antivírico y un polipéptido antivírico, formulados en la misma composición farmacéutica o bien en diferentes composiciones farmacéuticas, para la misma vía o para diferentes vías de administración, para tratar una infección vírica.

Se da a conocer una composición farmacéutica que comprende un complejo de quelato de oligonucleótidos (ON), que consiste en dos o más ON conectados intermolecularmente por un catión divalente, y al menos un polipéptido.

Se da a conocer una composición farmacéutica que comprende un complejo de quelato de ON antivírico, que comprende dos o más ON antivíricos conectados intermolecularmente por un catión divalente, y al menos un polipéptido antivírico.

El polipéptido antivírico puede estar además PEGilado.

El catión divalente puede ser un metal alcalinotérreo con un estado de carga de 2+.

El catión de metal divalente puede ser un metal de transición con un estado de carga de 2+.

El catión de metal divalente puede ser un metal lantánido con un estado de carga de 2+.

El catión de metal divalente puede ser un metal de postransición con un estado de carga de 2+.

El catión de metal divalente puede ser calcio.

El catión de metal divalente puede ser magnesio.

El catión de metal divalente puede ser hierro (2+), manganeso, cobre o zinc.

El catión divalente puede comprender dos o más cationes de metales divalentes diferentes.

El catión divalente puede comprender calcio y magnesio.

El complejo de quelato de ON puede comprender al menos un ON bicatenario.

El complejo de quelato de ON puede comprender al menos un ON con al menos un enlace de tipo fosforotioato. El complejo de quelato de ON puede comprender al menos un ON completamente formado por fosforotioatos. El complejo de quelato de ON puede comprender al menos un ON con una ribosa modificada en 2'.

El complejo de quelato de ON puede comprender al menos un ON que tiene cada ribosa O-metilada en 2'.

El complejo de quelato de ON puede comprender al menos un ON que comprende al menos una 5'-metilcitosina. El complejo de quelato de ON puede comprender al menos un ON en el que cada citosina es además 5'-metilcitosina. El complejo de quelato de ON puede comprender un oligonucleótido seleccionado de las SEQ ID n.os 1 a 6 y 10 a 18. El complejo de quelato de ON puede comprender un oligonucleótido seleccionado de las SEQ ID n.os 7 a 9.

El polipéptido puede ser al menos uno de:

Timosina a1;

Cualquier interferón a o derivados PEGilados del mismo;

Cualquier interferón p o derivados PEGilados del mismo;

Cualquier interferón y o derivados PEGilados del mismo;

Cualquier interferón A o derivados PEGilados del mismo;

interferón a-2a o a-2b o a-N3;

interferón p-1a o p-1 b;

interferón Y-1b;

interferón A1 o A2 o A3;

interferón a-2a o a-2b o A1 o A2 o A3 PEGilado;

bulevirtida;

cualquier citocina antivírica o derivados PEGilados de la misma;

proteína A tímica; y

cualquier polipéptido que se ha demostrado que tiene actividad antivírica o actividad inmunoestimulante. En las realizaciones, el polipéptido es el interferón a-2a PEGilado o la timosina a1 sintética.

En otra realización, la composición farmacéutica se formula para la administración subcutánea.

La composición farmacéutica se puede formular para la infusión intravenosa.

La composición farmacéutica se puede formular para al menos una de las siguientes vías de administración: inhalación de aerosol, intraocular, ingestión oral, entérica, inyección intramuscular, inyección intraperitoneal, inyección intratecal, infusión intratecal, intratraqueal, inyección intravenosa y tópica.

El complejo de quelato de ON puede comprender al menos un ON que consiste en la SEQ ID n.° 2.

En otra realización, el complejo de quelato de ON comprende al menos un ON que consiste en la SEQ ID n.° 11. En otra realización, el complejo de quelato de ON comprende al menos un ON que consiste en la SEQ ID n.° 18. En otra realización, la composición farmacéutica comprende además uno o más de los siguientes: entecavir, tenofovir, telbuvidina, adefovir, lamivudina, ribavirina, telaprevir, boceprevir, GS-7977, tegobuvir, zanamivir, oseltamivir, ganciclovir, foscarnet, aciclovir, zidovudina, abacavir, lopinavir, ritonavir o efavirenz.

En otra realización, la composición farmacéutica comprende además una sustancia de arrastre.

Se da a conocer una composición farmacéutica que comprende un complejo de quelato de ON que comprende un oligonucleótido que consiste en la SEQ ID n.° 3, y un interferón a-2a PEGilado.

Se da a conocer una composición farmacéutica que comprende un complejo de quelato de ON que comprende un oligonucleótido que consiste en la SEQ ID n.° 18, y un interferón a-2a PEGilado.

Se da a conocer una composición farmacéutica que comprende un complejo de quelato de ON que comprende un oligonucleótido que consiste en la SEQ ID n.° 11, y un interferón a-2a PEGilado.

Se da a conocer una composición farmacéutica que comprende un complejo de quelato de ON que comprende un oligonucleótido que consiste en la SEQ ID n.° 3, y la timosina a1.

Se da a conocer una composición farmacéutica que comprende un complejo de quelato de ON que comprende un oligonucleótido que consiste en la SEQ ID n.° 18, y la timosina a1.

Se da a conocer una composición farmacéutica que comprende un complejo de quelato de ON que comprende un oligonucleótido que consiste en la SEQ n.° 11, y la timosina a1.

Se da a conocer una composición farmacéutica que comprende un complejo de quelato de ON que comprende un oligonucleótido que consiste en la SEQ ID n.° 3, y el interferón a-2b.

Se da a conocer una composición farmacéutica que comprende un complejo de quelato de ON que comprende un oligonucleótido que consiste en la SEQ ID n.° 18, y el interferón a-2b.

Se da a conocer una composición farmacéutica que comprende un complejo de quelato de ON que comprende un oligonucleótido que consiste en la SEQ ID n.° 11, y el interferón a-2b.

Se da a conocer una composición farmacéutica que comprende un complejo de quelato de ON que comprende un oligonucleótido que consiste en la SEQ ID n.° 3, y la timosina a1 PEGilada.

Hay una composición farmacéutica que comprende un complejo de quelato de ON que comprende un oligonucleótido que consiste en la SEQ ID n.° 18, y la timosina a1 PEGilada.

Se da a conocer una composición farmacéutica que comprende un complejo de quelato de ON que comprende un oligonucleótido que consiste en la SEQ ID n.° 11, y la timosina a1 PEGilada.

Se da a conocer una composición farmacéutica que comprende un complejo de quelato de ON que comprende un oligonucleótido que consiste en la SEQ ID n.° 3, y el interferón a-2b PEGilado.

Hay una composición farmacéutica que comprende un complejo de quelato de ON que comprende un oligonucleótido que consiste en la SEQ ID n.° 18, y el interferón a-2b PEGilado.

Hay una composición farmacéutica que comprende un complejo de quelato de ON que comprende un oligonucleótido que consiste en la SEQ ID n.° 11, y el interferón a-2b PEGilado.

Se da a conocer una composición farmacéutica que comprende un complejo de quelato de ON que comprende un oligonucleótido que consiste en la SEQ ID n.° 3, y el interferón A1.

Hay una composición farmacéutica que comprende un complejo de quelato de ON que comprende un oligonucleótido que consiste en la SEQ ID n.° 18, y el interferón A1.

Se da a conocer una composición farmacéutica que comprende un complejo de quelato de ON que comprende un oligonucleótido que consiste en la SEQ ID n.° 11, y el interferón A1.

Hay una composición farmacéutica que comprende un complejo de quelato de ON que comprende un oligonucleótido que consiste en la SEQ ID n.° 3 y el interferón A1 PEGilado.

Se da a conocer una composición farmacéutica que comprende un complejo de quelato de ON que comprende un oligonucleótido que consiste en la SEQ ID n.° 18, y el interferón A1 PEGilado.

Se da a conocer una composición farmacéutica que comprende un complejo de quelato de ON que comprende un oligonucleótido que consiste en la SEQ ID n.° 11 y el interferón A1 PEGilado.

Se da a conocer un método para preparar la composición farmacéutica tal y como se describe en la presente memoria, en donde el método comprende:

a. disolver al menos una sal de sodio de un oligonucleótido (ON) en un excipiente acuoso farmacéuticamente aceptable;

b. añadir poco a poco una solución de sal de metal divalente farmacéuticamente aceptable al ON disuelto de tal forma que el complejo de quelato de ON permanezca soluble;

c. disolver uno o más polipéptidos antivíricos en un excipiente acuoso farmacéuticamente aceptable y compatible; y

d. mezclar poco a poco la solución de polipéptidos antivíricos con la solución del complejo de quelato de ON de tal forma que se conserve la solubilidad de tal complejo de quelato de ON y el polipéptido antivírico.

También se da a conocer un método para preparar la composición farmacéutica tal y como se describe en la presente memoria, en donde el método comprende:

a. disolver al menos una sal de sodio de oligonucleótidos (ON) en un excipiente acuoso farmacéuticamente aceptable;

b. añadir poco a poco al menos una de una solución de sal de calcio y/o magnesio farmacéuticamente aceptable al ON disuelto de tal forma que el complejo de quelato de ON permanezca soluble;

c. disolver uno o más polipéptidos antivíricos en un excipiente acuoso farmacéuticamente aceptable; y d. mezclar poco a poco la solución del polipéptido antivírico con la solución del complejo de quelato de ON de tal forma que se conserva la solubilidad de dicho complejo de quelato de ON y el polipéptido antivírico.

En una realización, la solución del complejo de quelato de ON y la solución del polipéptido se combinan justo antes de administrar la composición farmacéutica.

En otra realización, la relación de la sal de metal divalente añadida por el ON disuelto es de 0.1 a 50 mg por 100 mg de oligonucleótido.

En otra realización, la concentración final de ON es de 0.1 a 200 mg/ml.

En otra realización, la sal de metal divalente es al menos una de una sal de cloruro, una sal de gluconato, una sal de citrato, una sal de lactato, una sal de malato, una sal de aspartato, una sal de fumarato, una sal de ascorbato, una sal de benzoato, una sal de eritorbato, una sal de propionato, una sal de sulfato o una sal de bicarbonato.

En otra realización, la solución de la sal de metal divalente contiene al menos uno de calcio, magnesio, hierro (2+), manganeso, cobre o zinc.

Se da a conocer un kit que comprende la composición farmacéutica tal y como se describe en la presente memoria. En una realización, el complejo de quelato de ON y el al menos un polipéptido se formulan por separado.

En otra realización, el complejo de quelato de ON y el al menos un polipéptido se formulan para una coadministración por la misma vía o por diferentes vías de administración.

Breve descripción de las figuras

Ahora se hará referencia a los dibujos acompañantes:

En la figura 1 se ilustran las características fisicoquímicas comunes de los ON. A) Coseparación de REP 2006 y un ON con fosforotioato 21-mero con una secuencia definida mediante cromatografía líquida de alta resolución. B) identificación de las especies en el ON 21-mero mediante espectroscopia de masas. C) Identificación de las especies

en el ON de REP 2006 mediante espectroscopia de masas.

En la figura 2A se ilustran las características químicas generales de los ON que no dependen de la secuencia del ON.

Independientemente de la secuencia, cualquier ON existe como un polímero que tiene actividades hidrófobas e

hidrófilas. La adición de fosforotioato (representada en la estructura química de esta figura) sirve para incrementar la

hidrofobia del polímero de tipo ON, pero no afecta la hidrofilia. En la figura 2B se conceptualiza la naturaleza de la

quelación de ON con cationes de metales divalentes y trivalentes. Los cationes metálicos (representados mediante

círculos rellenos de gris) conectan las superficies hidrófilas de los polímeros de tipo ON mediante puentes de iones

metálicos (representados por elipses) entre dos o tres átomos de oxígeno o azufre sin puente en los enlaces de tipo

fosfodiéster.

En la figura 3 se ilustra el modelo para el comportamiento en solución de los ON en presencia de cationes metálicos

divalentes o multivalentes al variar la concentración de los ON y de los cationes metálicos divalentes. A) Las

concentraciones bajas de cationes metálicos divalentes/trivalentes y de ON producen dímeros o complejos de quelato

de ON de orden inferior. B) El incremento de la concentración de cationes metálicos divalentes/trivalentes produce la

formación de complejos de quelato de ON más completos en la solución. C) Al incrementar aún más la concentración

de los ON en presencia de metales divalentes o trivalentes se consigue producir complejos de quelato de ON de mayor

orden cuando se incrementa la concentración de los metales. Todos los complejos de quelato de (A) a (C) son solubles

en solución acuosa gracias a que todavía tienen superficies hidrófilas expuestas al medio acuoso, lo que mantiene así

la solubilidad. D) A una concentración de metal y de ON suficiente, todas las superficies hidrófilas se ver ahora

constreñidas dentro de los complejos de quelato de ON, lo que deja solo las superficies hidrófobas expuestas al medio

acuoso. Esto da lugar a la precipitación del complejo de quelato de ON.

En la figura 4 se ilustra el efecto del comportamiento en solución de los complejos de quelato de ON fluorescentes

sobre la polarización de la fluorescencia. Con concentraciones crecientes de los metales, también se incrementa el

tamaño (y la masa) de los complejos de quelato de ON así formados (véase la figura 3) y, por lo tanto, se mueve más

lentamente en la solución. Este movimiento más lento que presenta el complejo en la solución conduce a un

incremento de la polarización de la fluorescencia y a un incremento del valor de mP.

En la figura 5 se ilustra una separación por HPLC de la composición de quelatos de calcio de REP 2055 / interferón

a-2b con el uso del método para oligonucleótidos tal y como se describe en el ejemplo IV. El pico de ON de longitud

completa (flecha grande) está precedido en el cromatograma por los productos menores de la síntesis incompleta

(flechas pequeñas) y son típicamente ON con secuencias que carecen de uno o más nucleótidos en comparación con

la secuencia completa del ON. Este perfil de HPLC es típico de todos los ON sin purificar utilizados (REP 2055, REP

2057 y REP 2148).

En la figura 6 se ilustra un análisis por ESI-MS del contenido de oligonucleótidos en la composición de quelato de

calcio de REP 2055 / interferón a-2b a partir del pico de HPLC a 16.70 min en la figura 5. La masa observada de la

especie principal es 12612.2 Da, lo que la identifica como el REP 2055 (m. molec. esperada = 12612.5 Da).

En la figura 7 se ilustra una separación por HPLC de la composición de quelato de calcio de REP 2055 / interferón a-2b utilizando el método 1 para proteínas (véase el ejemplo IV).

En la figura 8 se ilustra un análisis por ESI-MS del contenido de péptidos en la composición de quelato de calcio de

REP 2055 / interferón a-2b a partir del pico de HPLC a 11.03 min en la figura 7. El pico de la masa observada a

19 263 Da corresponde al interferón a-2b (m. molec. esperada = 19271 Da) y el pico a 66560 Da corresponde a la albúmina humana.

En la figura 9 se ilustra una separación por HPLC de la composición de quelato de calcio de REP 2057 / interferón a-2b utilizando el método para oligonucleótidos descrito en la presente memoria (véase el ejemplo IV). Como en la figura

5, los productos menores de la síntesis incompleta preceden al pico principal de la secuencia completa de REP 2057.

En la figura 10 se ilustra un análisis por ESI-MS del contenido de oligonucleótidos en la composición de quelato de

calcio de REP 2057 / interferón a-2b a partir del pico de HPLC a 15.46 min en la figura 9. La masa observada de la

especie principal es 13413.5 Da, lo que la identifica como el REP 2057 (m. molec. esperada = 13413.3 Da).

En la figura 11 se ilustra una separación por HPLC de la composición de quelato de calcio de REP 2057 / interferón

a-2b utilizando el método 1 para proteínas descrito en la presente memoria (véase el ejemplo IV).

En la figura 12 se ilustra un análisis por ESI-MS del contenido de péptidos en la composición de quelato de calcio de

REP 2057 / interferón a-2b a partir del pico de HPLC a 11.43 min en la figura 11. El pico de masa observado a 19 264 Da corresponde al interferón a-2b (m. molec. esperada = 19271 Da) y el pico a 66618 Da corresponde a la albúmina humana.

En la figura 13 se ilustra una separación por HPLC de la composición de quelato de calcio de REP 2139 / interferón

a-2b utilizando el método para oligonucleótidos descrito en la presente memoria (véase el ejemplo IV). No se observan productos de la síntesis incompleta.

En la figura 14 se ilustra un análisis por ESI-MS del contenido de oligonucleótidos en la composición de quelato de calcio de REP 2139 / interferón a-2b a partir del pico de HPLC a 19.11 min en la figura 13. La masa observada de la especie principal es 14095.3 Da, lo que la identifica como el REP 2139 (m. molec. esperada = 14094.6 Da).

En la figura 15 se ilustra una separación por HPLC de la composición de quelato de calcio de REP 2139 / interferón a-2b utilizando el método 1 para proteínas descrito en la presente memoria (véase el ejemplo IV).

En la figura 16 se ilustra un análisis por ESI-MS del contenido de péptidos en la composición de quelato de calcio de REP 2139 / interferón a-2b a partir del pico de la HPLC a 11.12 min en la figura 15. El pico de masa observado a 19 264 Da corresponde al interferón a-2b (m. molec. esperada = 19271 Da) y el pico a 66674 Da corresponde a la albúmina humana.

En la figura 17 se ilustra una separación por HPLC de la composición de quelato de calcio de REP 2148 / interferón a-2b utilizando el método para oligonucleótidos descrito en la presente memoria (véase el ejemplo IV). Los productos menores de la síntesis incompleta preceden al pico principal de la secuencia completa del REP 2148.

En la figura 18 se ilustra un análisis por ESI-MS del contenido de oligonucleótidos en la composición de quelato de calcio de REP 2148 / interferón a-2b a partir del pico de HPLC a 15.34 min en la figura 17. La masa observada de la especie principal es 12891.6 Da, lo que la identifica como el REP 2148 (m. molec. esperada = 12893.6 Da).

En la figura 19 se ilustra una separación por HPLC de la composición de quelato de calcio de REP 2148 / interferón a-2b utilizando el método 1 para proteínas descrito en la presente memoria (véase el ejemplo IV).

En la figura 20 se ilustra un análisis por ESI-MS del contenido de péptidos en la composición de quelato de calcio de REP 2148 / interferón a-2b a partir del pico de HPLC a 8.44 min en la figura 19. El pico de masa observado a 19265 Da corresponde al interferón a-2b.

En la figura 21 se ilustra una separación por HPLC de la composición de quelato de calcio de REP 2006 / timosina a1 utilizando el método para oligonucleótidos descrito en la presente memoria (véase el ejemplo IV). El pico que se eluye a 6.31 min corresponde a la timosina a1 (flecha blanca) y el pico que se eluye a 15.15 min corresponde al REP 2006 completo (flecha negra).

En la figura 22 se ilustra un análisis por ESI-MS del contenido de oligonucleótidos en la composición de quelato de calcio de REP 2006 / timosina a1 a partir del pico de HPLC a 15.15 min en la figura 21. La masa observada es de ~12650-13 150 Da, lo que la identifica como el REP 2006 (m. molec. esperada = de 12612 a 13092 Da).

En la figura 23 se ilustra un análisis por ESI-MS del contenido de péptidos en la composición de quelato de calcio de REP 2006 / timosina a1 a partir del pico de HPLC a 6.31 min en la figura 21. La masa observada de la especie principal es 3108 Da, lo que la identifica como la timosina a1 (m. molec. esperada = 3108 Da).

En la figura 24 se ilustra una separación por HPLC de la composición de quelato de calcio de REP 2055 / timosina a1 utilizando el método para oligonucleótidos descrito en la presente memoria (véase el ejemplo IV). El pico que se eluye a 6.12 min corresponde a la timosina a1 (flecha blanca) y el pico que se eluye a 16.70 min corresponde al REP 2055 completo (flecha negra).

En la figura 25 se ilustra un análisis por ESI-MS del contenido de oligonucleótidos en la composición de quelato de calcio de REP 2055 / timosina a1 a partir del pico de HPLC a 16.70 min en la figura 24. La masa observada de la especie principal es 12612.1 Da, lo que la identifica como el REP 2055 (m. molec. esperada = 12612.5 Da).

En la figura 26 se ilustra un análisis por ESI-MS del contenido de péptidos en la composición de quelato de calcio de REP 2055 / timosina a1 a partir del pico de HPLC a 6.12 min en la figura 24. La masa observada de la especie principal es 3107.6 Da, lo que la identifica como la timosina a1 (m. molec. esperada = 3108 Da).

En la figura 27 se ilustra una separación por HPLC de la composición de quelato de calcio de REP 2057 / timosina a1 utilizando el método para oligonucleótidos descrito en la presente memoria (véase el ejemplo IV). El pico que se eluye a 6.18 min corresponde a la timosina a1 (flecha blanca) y el pico que se eluye a 15.47 min corresponde al REP 2057 completo (flecha negra).

En la figura 28 se ilustra un análisis por ESI-MS del contenido de oligonucleótidos en la composición de quelato de calcio de REP 2057 / timosina a1 a partir del pico de HPLC a 15.47 min en la figura 27. La masa observada de la especie principal es 13413.5 Da, lo que la identifica como el REP 2057 (m. molec. esperada = 13413.3 Da).

En la figura 29 se ilustra un análisis por ESI-MS del contenido de péptidos en la composición de quelato de calcio de REP 2057 / timosina a1 a partir del pico de HPLC a 6.18 min en la figura 27. La masa observada de la especie principal es 3107.6 Da, lo que la identifica como la timosina a1 (m. molec. esperada = 3108 Da).

En la figura 30 se ilustra una separación por HPLC de la composición de quelato de calcio de REP 2139 / timosina a l utilizando el método para oligonucleótidos descrito en la presente memoria (véase el ejemplo IV). El pico que se eluye a 6.13 min corresponde a la timosina a1 (flecha blanca) y el pico que se eluye a 19.01 min corresponde al REP 2139 competo (flecha negra).

En la figura 31 se ilustra un análisis por ESI-MS del contenido de oligonucleótidos en la composición de quelato de calcio de REP 2139 / timosina a1 a partir del pico de HPLC a 19.01 min en la figura 30. La masa observada de la especie principal es 14094.5 Da, lo que la identifica como el REP 2139 (m. molec. esperada = 14094.6 Da).

En la figura 32 se ilustra un análisis por ESI-MS del contenido de péptidos en la composición de quelato de calcio de REP 2139 / timosina a1 a partir del pico de HPLC a 6.13 min en la figura 30. La masa observada de la especie principal es 3107.6 Da, lo que la identifica como la timosina a1 (m. molec. esperada = 3108 Da).

En la figura 33 se ilustra una separación por HPLC de la composición de quelato de calcio de REP 2148 / timosina a1 utilizando el método para oligonucleótidos descrito en la presente memoria (véase el ejemplo IV). El pico que se eluye a 6.28 min corresponde a la timosina a1 (flecha blanca) y el pico que se eluye a 15.19 min corresponde al REP 2148 competo (flecha negra).

En la figura 34 se ilustra un análisis por ESI-MS del contenido de oligonucleótidos en la composición de quelato de calcio de REP 2148 / timosina a1 a partir del pico de HPLC a 15.19 min en la figura 33. La masa observada de la especie principal es 12892 Da, lo que la identifica como el REP 2148 (m. molec. esperada = 12893 Da).

En la figura 35 se ilustra un análisis por ESI-MS del contenido de péptidos en la composición de quelato de calcio de REP 2148 / timosina a1 a partir del pico de HPLC a 6.28 min en la figura 33. La masa observada de la especie principal es 3107.3 Da, lo que la identifica como la timosina a1 (m. molec. esperada = 3108 Da).

En la figura 36 se ilustra una separación por HPLC de la composición de quelato de calcio de REP 2006 / interferón a-2a PEGilado utilizando el método para oligonucleótidos descrito en la presente memoria (véase el ejemplo IV).

En la figura 37 se ilustra un análisis por ESI-MS del contenido de oligonucleótidos en la composición de quelato de calcio de REP 2006 / interferón a-2a PEGilado a partir del pico de HPLC a 14.59 min en la figura 36. La masa observada de la especie principal es ~12600-13200 Da, lo que la identifica como el REP 2006 (m. molec. esperada = de 12612 a 13092 Da).

En la figura 38 se ilustra una separación por HPLC de la composición de quelato de calcio de REP 2006 / interferón a-2a PEGilado utilizando el método 2 para proteínas descrito en la presente memoria (véase el ejemplo IV).

En la figura 39 se ilustra un análisis por ESI-MS del contenido de péptidos en la composición de quelato de calcio de REP 2006 / interferón a-2a PEGilado a partir del pico de HPLC a 13.21 min en la figura 38.

En la figura 40 se ilustra una separación por HPLC de la composición de quelato de calcio de REP 2055 / interferón a-2a PEGilado utilizando el método para oligonucleótidos descrito en la presente memoria (véase el ejemplo IV).

En la figura 41 se ilustra un análisis por ESI-MS del contenido de oligonucleótidos en la composición de quelato de calcio de REP 2055 / interferón a-2a PEGilado a partir del pico de HPLC a 16.71 min en la figura 40. La masa observada de la especie principal es 12612.4 Da, lo que la identifica como el REP 2055 (m. molec. esperada = 12 612.5 Da).

En la figura 42 se ilustra una separación por HPLC de la composición de quelato de calcio de REP 2055 / interferón a-2a PEGilado utilizando el método 2 para proteínas descrito en la presente memoria (véase el ejemplo IV).

En la figura 43 se ilustra un análisis por ESI-MS del contenido de péptidos en la composición de quelato de calcio de REP 2055 / interferón a-2a PEGilado a partir del pico de HPLC a 8.03 min en la figura 42.

En la figura 44 se ilustra una separación por HPLC de la composición de quelato de calcio de REP 2057 / interferón a-2a PEGilado utilizando el método para oligonucleótidos descrito en la presente memoria (véase el ejemplo IV).

En la figura 45 se ilustra un análisis por ESI-MS del contenido de oligonucleótidos en la composición de quelato de calcio de REP 2057 / interferón a-2a PEGilado a partir del pico de HPLC a 15.45 min en la figura 44. La masa observada de la especie principal es 13413.5 Da, lo que la identifica como el REP 2057 (m. molec. esperada = 13 413.3 Da).

En la figura 46 se ilustra una separación por HPLC de la composición de quelato de calcio de REP 2057 / interferón a-2a PEGilado utilizando el método 2 para proteínas descrito en la presente memoria (véase el ejemplo IV).

En la figura 47 se ilustra un análisis por ESI-MS del contenido de péptidos en la composición de quelato de calcio de REP 2057 / interferón a-2a PEGilado a partir del pico de HPLC a 8.04 min en la figura 46.

En la figura 48 se ilustra una separación por HPLC de la composición de quelato de calcio de REP 2139 / interferón a-2a PEGilado utilizando el método para oligonucleótidos descrito en la presente memoria (véase el ejemplo IV).

En la figura 49 se ilustra un análisis por ESI-MS del contenido de oligonucleótidos en la composición de quelato de calcio de REP 2139 / interferón a-2a PEGilado a partir del pico de HPLC a 19.08 min en la figura 48. La masa observada de la especie principal es 14095.3 Da, lo que la identifica como el REP 2139 (m. molec. esperada = 14 094.6 Da).

En la figura 50 se ilustra una separación por HPLC de la composición de quelato de calcio de REP 2139 / interferón a-2a PEGilado utilizando el método 2 para proteínas descrito en la presente memoria (véase el ejemplo IV).

En la figura 51 se ilustra un análisis por ESI-MS del contenido de péptidos en la composición de quelato de calcio de REP 2139 / interferón a-2a PEGilado a partir del pico de HPLC a 8.02 min en la figura 50.

En la figura 52 se ilustra una separación por HPLC de la composición de quelatos de calcio de REP 2148 / interferón a-2a PEGilado utilizando el método para oligonucleótidos descrito en la presente memoria (véase el ejemplo IV).

En la figura 53 se ilustra un análisis por ESI-MS del contenido de oligonucleótidos en la composición de quelato de calcio de REP 2148 / interferón a-2a PEGilado a partir del pico de HPLC a 15.42 min en la figura 52. La masa observada de la especie principal es 12891.5 Da, lo que la identifica como el REP 2148 (m. molec. esperada = 12 893 Da).

En la figura 54 se ilustra una separación por HPLC de la composición de quelato de calcio de REP 2148 / interferón a-2a PEGilado utilizando el método 2 para proteínas descrito en la presente memoria (véase el ejemplo IV).

En la figura 55 se ilustra un análisis por ESI-MS del contenido de péptidos en la composición de quelato de calcio de REP 2148 / interferón a-2a PEGilado a partir del pico de HPLC a 13.17 min en la figura 54.

En la figura 56 se ilustra una separación por HPLC de la composición de quelato de calcio de REP 2055 / interferón A1 utilizando el método para oligonucleótidos descrito en la presente memoria (véase el ejemplo IV).

En la figura 57 se ilustra un análisis por ESI-MS del contenido de oligonucleótidos en la composición de quelato de calcio de REP 2055 / interferón A1 a partir del pico de HPLC a 14.84 min en la figura 56. La masa observada de la especie principal es 12610.6 Da, lo que la identifica como el REP 2055 (m. molec. esperada = 12612.5 Da).

En la figura 58 se ilustra una separación por HPLC de la composición de quelato de calcio de REP 2055 / interferón A1 utilizando el método 2 para proteínas descrito en la presente memoria (véase el ejemplo IV).

En la figura 59 se ilustra un análisis por ESI-MS del contenido de péptidos en la composición de quelato de calcio de REP 2055 / interferón A1 a partir del pico de HPLC a 10.68 min en la figura 58. Se observa un pico principal a 20 139 Da, coherente con la masa molecular aproximada del interferón A1.

En la figura 60 se ilustra una separación por HPLC de la composición de quelato de calcio de REP 2139 / interferón A1 utilizando el método para oligonucleótidos descrito en la presente memoria (véase el ejemplo IV).

En la figura 61 se ilustra un análisis por ESI-MS del contenido de oligonucleótidos en la composición de quelato de calcio de REP 2139 / interferón A1 a partir del pico de HPLC a 17.31 min en la figura 60. La masa observada de la especie principal es 14095.3 Da, lo que la identifica como el REP 2139 (m. molec. esperada = 14094.6 Da).

En la figura 62 se ilustra una separación por HPLC de la composición de quelato de calcio de REP 2139 / interferón A1 utilizando el método 2 para proteínas descrito en la presente memoria (véase el ejemplo IV).

En la figura 63 se ilustra un análisis por ESI-MS del contenido de proteínas en la composición de quelato de calcio de REP 2139 / interferón A1 a partir del pico de HPLC a 10.53 min en la figura 62. Se observa un pico principal a 20 139 Da, coherente con la masa molecular aproximada del interferón A1.

En la figura 64 se ilustra una separación por HPLC de la composición de quelato de calcio de REP 2148 / interferón A1 utilizando el método para oligonucleótidos descrito en la presente memoria (véase el ejemplo IV).

En la figura 65 se ilustra un análisis por ESI-MS del contenido de oligonucleótidos en la composición de quelato de calcio de REP 2148 / interferón A1 a partir del pico de HPLC a 15.47 min en la figura 64. La masa observada de la especie principal es 12891.8 Da, lo que la identifica como el REP 2148 (masa molecular esperada = 12893 Da).

En la figura 66 se ilustra una separación por HPLC de la composición de quelato de calcio de REP 2148 / interferón A1 utilizando el método 2 para proteínas descrito en la presente memoria (véase el ejemplo IV).

En la figura 67 se ilustra un análisis por ESI-MS del contenido de proteínas en la composición de quelato de calcio de REP 2148 / interferón A1 a partir del pico de HPLC a 10.51 min en la figura 66. Se observa un pico principal a 20 139 Da, coherente con la masa molecular aproximada del interferón A1.

En la figura 68 se ilustra una separación por HPLC de la composición de quelato de magnesio de REP 2055 / timosina a1 utilizando el método para oligonucleótidos descrito en la presente memoria (véase el ejemplo IV). El pico que se eluye a 5.86 min corresponde a la timosina a1 (flecha blanca) y el pico que se eluye a 14.62 min corresponde al REP 2055 competo (flecha negra).

En la figura 69 se ilustra un análisis por ESI-MS del contenido de oligonucleótidos en la composición de quelato de magnesio de REP 2055 / timosina a1 a partir del pico de HPLC a 14.62 min en la figura 68. La masa observada de la especie principal es 12610.1 Da, lo que la identifica como el REP 2055 (masa molecular esperada = 12612.5 Da).

En la figura 70 se ilustra un análisis por ESI-MS del contenido de péptidos en la composición de quelato de magnesio de REP 2055 / timosina a1 a partir del pico de HPLC a 5.82 min en la figura 68. La masa observada de la especie principal es 3107.1 Da, lo que la identifica como la timosina a1 (masa molecular esperada = 3108 Da).

En la figura 71 se ilustra una separación por HPLC de la composición de quelato de calcio y magnesio mezclados de REP 2055 / timosina a1 utilizando el método para oligonucleótidos descrito en la presente memoria (véase el ejemplo IV). El pico que se eluye a 6.02 min corresponde a la timosina a1 (flecha blanca) y el pico que se eluye a 14.85 min corresponde al REP 2055 competo (flecha negra).

En la figura 72 se ilustra un análisis por ESI-MS del contenido de oligonucleótidos en la composición de quelato de calcio y magnesio mezclados de REP 2055 / timosina a1 a partir del pico de HPLC a 14.85 min en la figura 71. La masa observada de la especie principal es 12609.7 Da, lo que la identifica como el REP 2055 (masa molecular esperada = 12612.5 Da).

En la figura 73 se ilustra un análisis por ESI-MS del contenido de péptidos en la composición de quelato de calcio y magnesio mezclados de REP 2055 / timosina a1 a partir del pico de HPLC a 6.02 min en la figura 71. La masa observada de la especie principal es 3107.1 Da, lo que la identifica como la timosina a1 (masa molecular esperada = 3 108 Da).

En la figura 74 se ilustra una separación por HPLC de la composición de quelato de magnesio de REP 2055 / interferón a-2a PEGilado utilizando el método para oligonucleótidos descrito en la presente memoria (véase el ejemplo IV).

En la figura 75 se ilustra un análisis por ESI-MS del contenido de oligonucleótidos en la composición de quelato de magnesio de REP 2055 / interferón a-2a PEGilado a partir del pico de HPLC a 14.83 min en la figura 74. La masa observada de la especie principal es 12610.2 Da, lo que la identifica como el REP 2055 (masa molecular esperada = 12 612.5 Da).

En la figura 76 se ilustra una separación por HPLC de la composición de quelato de magnesio de REP 2055 / interferón a-2a PEGilado utilizando el método 2 para proteínas descrito en la presente memoria (véase el ejemplo IV).

En la figura 77 se ilustra un análisis por ESI-MS del contenido de péptidos en la composición de quelato de magnesio de REP 2055 / interferón a-2a PEGilado a partir del pico de HPLC a 13.44 min en la figura 76.

En la figura 78 se ilustra una separación por HPLC de la composición de quelato de calcio y magnesio mezclados de REP 2055 / interferón a-2a PEGilado utilizando el método para oligonucleótidos descrito en la presente memoria (véase el ejemplo IV).

En la figura 79 se ilustra un análisis por ESI-MS del contenido de oligonucleótidos en la composición de quelato de calcio y magnesio mezclados de REP 2055 / interferón a-2a PEGilado a partir del pico de HPLC a 14.83 min en la figura 78. La masa observada de la especie principal es 12609.8 Da, lo que la identifica como el REP 2005 (m. molec. esperada = 12612.5 Da).

En la figura 80 se ilustra una separación por HPLC de la composición de quelato de calcio y magnesio mezclados de REP 2055 / interferón a-2a PEGilado utilizando el método 2 para proteínas descrito en la presente memoria (véase el ejemplo IV).

En la figura 81 se ilustra un análisis por ESI-MS del contenido de péptidos en la composición de quelato de calcio y magnesio mezclados de REP 2055 / interferón a-2a PEGilado a partir del pico de HPLC a 13.44 min en la figura 80.

En la figura 82 se ilustra una separación por HPLC de la composición de quelato de magnesio de REP 2139 / timosina a1 utilizando el método para oligonucleótidos descrito en la presente memoria (véase el ejemplo IV). El pico que se eluye a 5.84 min corresponde a la timosina a1 (flecha blanca) y el pico que se eluye a 16.86 min corresponde al REP 2139 competo (flecha negra).

En la figura 83 se ilustra un análisis por ESI-MS del contenido de oligonucleótidos en la composición de quelato de magnesio de REP 2139 / timosina a1 a partir del pico de HPLC a 16.86 min en la figura 82. La masa observada de la especie principal es 14091.3 Da, lo que la identifica como el REP 2139 (m. molec. esperada = 14094.6 Da).

En la figura 84 se ilustra un análisis por ESI-MS del contenido de péptidos en la composición de quelato de magnesio de REP 2139 / timosina a1 a partir del pico de HPLC a 5.84 min en la figura 82. La masa observada de la especie principal es 3107.1 Da, lo que la identifica como la timosina a1 (m. molec. esperada = 3108 Da).

En la figura 85 se ilustra una separación por HPLC de la composición de quelato de calcio y magnesio mezclados de REP 2139 / timosina a1 utilizando el método para oligonucleótidos descrito en la presente memoria (véase el ejemplo IV). El pico que se eluye a 5.84 min corresponde a la timosina a1 (flecha blanca) y el pico que se eluye a 16.61 min corresponde al REP 2139 competo (flecha negra).

En la figura 86 se ilustra un análisis por ESI-MS del contenido de oligonucleótidos en la composición de quelato de calcio y magnesio mezclados de REP 2139 / timosina a1 a partir del pico de HPLC a 16.61 min en la figura 85. La masa observada de la especie principal es 14091.1 Da, lo que la identifica como el REP 2139 (m. molec. esperada = 14 094.6 Da).

En la figura 87 se ilustra un análisis por ESI-MS del contenido de péptidos en la composición de quelato de calcio y magnesio mezclados de REP 2139 / timosina a1 a partir del pico de HPLC a 5.84 min en la figura 85. La masa observada de la especie principal es 3107.1 Da, lo que la identifica como la timosina a1 (m. molec. esperada = 3 108 Da).

En la figura 88 se ilustra una separación por HPLC de la composición de quelato de magnesio de REP 2139 / interferón a-2a PEGilado utilizando el método para oligonucleótidos descrito en la presente memoria (véase el ejemplo IV).

En la figura 89 se ilustra un análisis por ESI-MS del contenido de oligonucleótidos en la composición de quelato de magnesio de REP 2139 / interferón a-2a PEGilado a partir del pico de HPLC a 17.19 min en la figura 88. La masa observada de la especie principal es 14091.5 Da, lo que la identifica como el REP 2139 (m. molec. esperada = 14 094.6 Da).

En la figura 90 se ilustra una separación por HPLC de la composición de quelatos de magnesio de REP 2139 / interferón a-2a PEGilado utilizando el método 2 para proteínas descrito en la presente memoria (véase el ejemplo IV).

En la figura 91 se ilustra un análisis por ESI-MS del contenido de péptidos en la composición de quelato de magnesio de REP 2139 / interferón a-2a PEGilado a partir del pico de HPLC a 13.38 min en la figura 90.

En la figura 92 se ilustra una separación por HPLC de la composición de quelato de calcio y magnesio mezclados de REP 2139 / interferón a-2a PEGilado utilizando el método para oligonucleótidos descrito en la presente memoria (véase el ejemplo IV).

En la figura 93 se ilustra un análisis por ESI-MS del contenido de oligonucleótidos en la composición de quelato de calcio y magnesio mezclados de REP 2139 / interferón a-2a PEGilado a partir del pico de HPLC a 16.95 min en la figura 92. La masa observada de la especie principal es 14091.4 Da, lo que la identifica como el REP 2139 (m. molec. esperada = 14094.6 Da).

En la figura 94 se ilustra una separación por HPLC de la composición de quelato de calcio y magnesio mezclados de REP 2139 / interferón a-2a PEGilado utilizando el método 2 para proteínas descrito en la presente memoria (véase el ejemplo IV).

En la figura 95 se ilustra un análisis por ESI-MS del contenido de péptidos en la composición de quelato de calcio y magnesio mezclados de REP 2139 / interferón a-2a PEGilado a partir del pico de HPLC a 13.46 min en la figura 94.

Descripción detallada

Tal y como se describe en la publicación de solicitud de patente internacional n.° WO 2012/021995 y en la publicación de solicitud de patente de los EE. UU. n.° 2012/0046348, los ON en soluciones acuosas que contienen algún catión metálico simple que es divalente (tal como, por ejemplo, Ca2+, Mg2+ y Fe2+) no existen como sales, sino más bien como complejos quelados de los ON. Estos complejos comprenden dímeros de ON u organizaciones moleculares de orden superior en las cuales los ON están conectados intermolecularmente por sus esqueletos de fosfodiéster o fosforotioato a través de puentes iónicos de metales divalentes (véase la figura 2B). A determinadas concentraciones de ON y cationes metálicos, estos complejos quelados son estables y solubles en la solución acuosa y secuestran de manera eficaz los cationes divalentes en los complejos de quelato de ON a partir de la interacción en la solución. Esta formación de complejos de quelatos también es probable que se produzca con cationes metálicos simples con una carga de 3+ o superior (como se describe en la figura 2B). Así pues, los ON funcionan como quelantes de cationes metálicos multivalentes y no forman sales con los cationes metálicos multivalentes.

Los complejos de quelato de ON pueden contener distintos cationes metálicos multivalentes que incluyen calcio, magnesio, cobalto, hierro, manganeso, bario, níquel, cobre, zinc, cadmio, mercurio y plomo. Ya se había demostrado que la quelación de estos cationes metálicos multivalentes da lugar a la formación de complejos de quelato de ON que comprenden dos o más ON conectados a través de cationes metálicos, y que se produce con los ON de más de 6 nucleótidos de longitud y en presencia de ON con enlaces de fosfodiéster o fosforotioato. Los ON pueden, de manera optativa, llevar un fosforotioato en cada enlace. La quelación también se produce con los ON que contienen modificaciones en el 2' (tales como O-metilo en 2') de las ribosas o que contienen bases modificadas, tales como la 5'-metilcitosina o el 4-tiouracilo. Estas modificaciones en 2' puede estar presentes en una, en varias o en todas las ribosas, y la modificación de las bases puede darse en una o más bases, o estar universalmente presentes en cada base (a saber, todas las citosinas están presentes como 5'-metilcitosina). Además, los complejos de quelato de ON pueden comprender ON que contienen numerosas modificaciones, tales como cada enlace con fosforotioato, cada 2’ de ribosa con modificación y cada base modificada. Las modificaciones de los ON compatibles con la formación de complejos de quelato de ON se definen con más detalle a continuación. Además, la quelación de los cationes metálicos no depende de la secuencia de nucleótidos presente, sino que en su lugar se basa en las características fisicoquímicas comunes a todos los ON (véase la figura 2A).

Aunque la formación de complejos de quelato de ON se puede conseguir con cualquier catión de metal divalente, los complejos de quelato de ON que se pretenden utilizar como fármacos deben contener preferiblemente solo calcio y/o magnesio, pero podrían contener también hierro, manganeso, cobre o zinc en cantidades insignificantes y no deben incluir cobalto, bario, níquel, cadmio, mercurio, plomo ni cualquier otro metal divalente que no esté recogido aquí.

Es importante saber que la formación de complejos de quelato de ON no se produce con cationes monovalentes, tales como Na+, K+ o NH4+, y, por lo tanto, es poco probable que se produzca con algún catión monovalente. Así pues, el término «sal de ON» se limita más correctamente solo a sales de ON con cationes monovalentes o con cationes que no forman complejos de quelatos con los ON.

Al menos una porción de la interacción transitoria conocida de los ON con componentes proteicos en la sangre está probablemente mediada por la interacción de los ON con proteínas fijadoras de calcio, tales como la albúmina y las proteínas de la cascada de coagulación dependientes de calcio. Así pues, la administración de los ON como complejos quelados (que reducen o eliminan significativamente su propensión a interaccionar con las proteínas que se fijan al calcio) mitigará estas interacciones con las proteínas en la sangre y dará lugar a menos efectos secundarios con la administración de los ON (tal como la anticoagulación transitoria) y podría también incrementar la fracción de la dosis de los ON que alcanza los órganos deseados (p. ej., el hígado, los pulmones o el bazo) en comparación con los ON sin quelar.

La polarización de la fluorescencia es una metodología habitual utilizada para estudiar las interacciones intermoleculares. En esta técnica, el cebo (esto es, cualquier ON) se marca con una etiqueta fluorescente (por ejemplo, ITCF: isotiocianato de fluoresceína). En la solución, la molécula de cebo se desplaza con total libertad debido al movimiento browniano, lo que da lugar a la emisión de fluorescencia poco polarizada cuando el cebo se somete a la excitación con la longitud de onda luminosa correcta. Con un ligando de suficiente masa molecular (al menos el mismo tamaño que el cebo), la interacción entre el cebo y el ligando introduce una inhibición sustancial de los movimientos del complejo en la solución. Como resultado de esta inhibición de los movimientos en la solución, la emisión de la fluorescencia se polariza significativamente tras la excitación. Así pues, con esta técnica se pueden medir las interacciones en la solución sin ninguna limitación física sobre ninguno de los compañeros de fijación. La polarización de la fluorescencia se describe como la mP adimensional, que es directamente proporcional a la fracción de las moléculas de cebo fijadas en la reacción. Por ejemplo, si una fracción muy pequeña de moléculas de cebo estuvieran fijadas a un ligando en concreto, habría muy poca polarización de la fluorescencia y, por lo tanto, los valores de mP serían pequeños. En el otro extremo del espectro, si una gran proporción de moléculas de cebo estuvieran fijadas a un ligando en concreto (o con una concentración mayor del ligando), habría una polarización sustancial de la fluorescencia y, por lo tanto, los valores de mP serían grandes. De esta forma, se pueden generar las isotermas de fijación para determinadas interacciones entre cebo y ligando al variar la concentración del ligando en presencia de una cantidad fija del cebo etiquetado con fluorescencia.

En la presente memoria se emplean diferentes ON marcados con fluorescencia para estudiar cómo entran a formar complejos en presencia de cationes metálicos multivalentes. Aunque la monitorización de la formación de los complejos mediante la polarización de la fluorescencia requiere que estos ON estén marcados con fluorescencia, esta etiqueta se sujeta al ON en el extremo 3' de modo que no interfiera ni con la base nitrogenada ni con el esqueleto de fosfodiéster del ON en cuestión. Además, la etiqueta fluorescente se mantiene alejada del ON mediante un conector rígido de 3 carbonos para descartar además cualquier alteración del comportamiento normal de los ON en la solución. Así pues, cualquier formación de complejos de ON observada en la presente memoria con el uso de la polarización de la fluorescencia con un ON marcado con fluorescencia es una representación exacta del comportamiento de la solución de los ON sin marcar (tanto formando complejos como sin formarlos).

Lo normal en la técnica da a conocer claramente la práctica de la administración de los ON a los sujetos que necesitan un tratamiento con sales de sodio de ON. Esto se ejemplifica mediante la administración de numerosos ON en los ensayos clínicos como sales de sodio que incluyen Fomivirisen (ISIS 2922), Mipomersen (ISIS 301012), Trecovirsen (GEM 91), Custirsen (OGX-011 / ISIS 112989), Genasense (G3139), Aprinocarsen (ISIS 3531 / LY 900003), PRO-51 (GSK 2402968) y ALN-RSV01 (Geary et al., 2002, Clin. Pharmacokinetics, 41: 255-260; Yu et al., 2009, Clin. Pharmacokinetics, 48: 39-50; Sereni et al, 1999, J. Clin. Pharmacol., 39: 47-54; Chi et al., 2005, J. Nat. Canc. Inst., 97: 1287-1296; Marshall et al., 2004, Ann. Oncol., 15: 1274-1283; Grossman et al., 2004, Neuro-Oncol, 6: 32-40; Goemans et al, 2011 NEJM 364: 1513-1522). No hay en la actualidad datos publicados que den a conocer la formulación de oligonucleótidos para la administración parenteral con el uso de calcio, magnesio u otros metales divalentes.

Muchos de los efectos secundarios asociados a la administración de las sales sódicas de los ON pueden atribuirse a sus efectos de quelación. La anticoagulación de la sangre por los ON está causada al menos en parte por la quelación del calcio en el suero debida a los ON, lo que perturba así la cascada de coagulación dependiente del calcio. Esta quelación del calcio en el suero y la subyacente hipocalciemia en el suero que puede ocasionar es también coherente con los efectos secundarios observados con la administración de los ON mediante administración i.v., que incluyen fiebre, escalofríos, debilidad e hipotensión arterial (esto último con una infusión o inyección i.v. rápida). Las reacciones en el sitio de la inyección que se observan con las inyecciones subcutáneas de los ON (endurecimiento, inflamación, hipersensibilidad y dolor) se debe al menos en parte a la quelación local del calcio y posiblemente de otros cationes divalentes o multivalentes, tales como el magnesio, debida a los ON en el sitio de la inyección. La administración de los ON como complejos quelados se ha demostrado que mitiga muchos de estos efectos secundarios.

Además, ya que los complejos de quelato de ON se formarán con metales divalentes en la solución con cualquier ON, la enseñanza de la formación y la compatibilidad de diferentes polipéptidos y polipéptidos PEGilados en la solución con cualquier complejo de quelato de ON se demostrará adecuadamente a cualquier experto en la técnica mediante el uso del ON REP 2006 degenerado y una secuencia de oligonucleótidos ejemplar [en los ejemplos de más adelante, (AG)20 y (AC)20] con diferentes modificaciones de los ON. La formación estable de las composiciones que contienen las especies de ON de más arriba como quelatos con diferentes polipéptidos o polipéptidos PEGilados demostrará que cualquier complejo de quelato de ON (independientemente de su funcionalidad específica) formará una solución estable con diferentes polipéptidos o polipéptidos PEGilados que serían deseables en la técnica para el tratamiento de una indicación de enfermedad específica (p. ej., interferones PEGilados para el tratamiento de la hepatitis B o de la hepatitis C, o bulevirtida para el tratamiento de la hepatitis B).

El término oligonucleótido (ON) se refiere a un oligómero o polímero de ácido ribonucleico (ARN) y/o ácido desoxirribonucleico (ADN). Este término incluye los ON compuestos de nucleobases modificadas (entre ellas 5'-metilcitosina y 4'-tiouracilo), azúcares y enlaces covalentes internucleosídicos (del esqueleto), así como los ON que tienen porciones que no se producen en la naturaleza que funcionan de manera parecida. Tales ON modificados o sustituidos pueden ser preferibles frente a las formas nativas debido a sus propiedades deseables, tales como, por ejemplo, menos inmunorreactividad, mayor captación por la célula, mayor afinidad por la diana de ácido nucleico, y mayor estabilidad en presencia de nucleasas. Los ON también pueden ser bicatenarios.

Los ON de esta descripción pueden incluir diferentes modificaciones, p. ej., modificaciones estabilizantes, y así pues pueden incluir al menos una modificación en el enlace de fosfodiéster y/o sobre el azúcar y/o sobre la base. Por ejemplo, el ON puede incluir, sin restricción, una o más modificaciones, o puede estar totalmente modificado de modo que contenga todos los enlaces o azúcares o bases con las modificaciones citadas. Los enlaces modificados pueden incluir enlaces de tipo fosforotioato, enlaces de tipo fosforoditioato y/o enlaces de tipo metilfosfonato. Aunque los enlaces modificados son útiles, los ON pueden incluir enlaces fosfodiéster. Otras modificaciones útiles incluyen, sin restricción, modificaciones en la posición 2' del azúcar, que incluyen las modificaciones de 2'-0-alquilación, tales como modificaciones de tipo 2'-0-metilo, 2'-0-metoxietilo (2'-MOE), modificaciones de tipo 2'-amino, modificaciones de tipo 2'-halo tales como 2'-fluoro; análogos de nucleótidos acíclicos. También se conocen en la técnica, y se pueden utilizar, otras modificaciones del 2', tales como los ácidos nucleicos bloqueados. En concreto, el ON tiene enlaces modificados a lo largo de él o tiene cada enlace modificado, p. ej., fosforotioato; tiene una caperuza en el 3' y/o en el 5'; incluye un enlace 3'-5' terminal; el ON es o incluye un concatémero que consiste en dos o más secuencias de ON unidas mediante uno o varios conectores. Las modificaciones de las bases pueden incluir la metilación en 5' de la base citosina (5’-metilcitosina o, en el contexto de un nucleótido, 5’-metilcitidina) y/o tioación en el 4' de la base uracilo (4’-tiouracilo o, en el contexto de un nucleótido, 4’-tiouridina). Se pueden combinar diferentes enlaces modificados compatibles químicamente cuando las condiciones de la síntesis son químicamente compatibles, tal como tener un oligonucleótido con enlaces de tipo fosforotioato, una modificación en el 2' de la ribosa (tal como 2'-0-metilación) y una base modificada (tal como 5'-metilcitosina). El ON puede estar además completamente modificado con todas estas modificaciones diferentes (p. ej., cada enlace de tipo fosforotioato, cada ribosa modificada con 2'-0-metilo y la adición a cada base de citosina de la modificación 5'-metílica (5'-metilcitosina)).

En la presente descripción, el término «ON antivírico» se refiere a cualquier ON que en virtud de su actividad bioquímica específica (tanto si es una dependiente como si es independiente de la secuencia) tiene la capacidad de inhibir directa o indirectamente algún aspecto de la replicación vírica, o mejorar directa o indirectamente la capacidad del hospedador para eliminar las infecciones mediante mecanismos inmunológicos u otros mecanismos.

En la presente descripción, el término «complejo de quelato de ON» se refiere a un complejo de dos o más ON en una solución unidos intermolecularmente por un catión metálico multivalente.

En la presente descripción, el término «complejo de quelato de ON antivírico» se refiere a un complejo de dos o más ON antivíricos en solución unidos intermolecularmente por un catión metálico multivalente. El complejo de quelato de ON antivírico puede comprender una sola especie de ON antivírico o dos o más especies diferentes de ON antivíricos que pueden tener el mismo o diferentes mecanismos de acción (p. ej., dos o más ON antisentido, al menos un ON antisentido y al menos un aptámero, al menos un ON antisentido y al menos un siRNA).

En la presente descripción, el término «polipéptido antivírico» se refiere a un polipéptido que en virtud de su actividad bioquímica específica (tanto si es dependiente como si es independiente de la secuencia) tiene la capacidad de inhibir directa o indirectamente algún aspecto de la replicación del virus, o de mejorar directa o indirectamente la capacidad del hospedador para eliminar las infecciones mediante mecanismos inmunológicos u otros mecanismos. El polipéptido puede proceder de la naturaleza o ser recombinante. El polipéptido puede derivarse por técnicas recombinantes a partir de una porción del polipéptido que se produce en la naturaleza. El polipéptido puede estar PEGilado o sin PEGilar.

En la presente descripción, el término «ON degenerado» pretende significar un ON monocatenario que tiene una indeterminación (N) en cada posición, tal como NNNNNNNNNN. Cada base se sintetiza como una indeterminación de tal forma que este ON existe realmente como una población de diferentes secuencias generadas al azar con la misma longitud y las mismas propiedades fisicoquímicas. Por ejemplo, para un ON degenerado de 40 bases de longitud, cualquier secuencia en concreto en la población representaría teóricamente solo 1/440 o 8.3 x 10-25 de la fracción total. Dado que 1 mol = 6.022 x 1023 moléculas, y que 1 mol de un ON 40-mero tendría una masa de aproximadamente 12 a 14 kg (según la secuencia y las modificaciones presentes), cualquier ON con una secuencia específica no existe efectivamente más de una vez en cualquier preparación. Por lo tanto, cualquier formación de quelatos o actividad biológica observada en tal preparación debe ser el resultado de las propiedades fisicoquímicas que no dependen de la secuencia (o son independientes de la secuencia) de los ON, ya que cualquier ON concreto con una secuencia definida, que es única en la preparación, no se puede esperar que contribuya a ninguna actividad significativa derivada de su secuencia nucleotídica específica.

Para ilustrar más este concepto, en el ejemplo I se compara la caracterización de REP 2006 (un ON 40-mero con una secuencia degenerada que conecta todos los nucleótidos con fosforotioatos) con un ON 21-mero de una secuencia definida (también completamente modificada con fosforotioatos) por cromatografía líquida de alta resolución y espectrometría de masas, y demuestra claramente que cualquier ON con un tamaño y modificación química similares (a saber, adición de fosforotioatos) tendrá unas características fisicoquímicas muy parecidas (cuando no idénticas) que no se ven afectadas por la secuencia de nucleótidos presente (véanse las figuras 1A-C).

En la presente solicitud, el término «polímero de ácido nucleico» o PAN pretende identificar cualquier ON monocatenario que no contiene ninguna funcionalidad específica de la secuencia. La actividad bioquímica de los PAN no es dependiente de que los ON reconozcan el receptor de tipo Toll, de la hibridación con un ácido nucleico diana o interacción aptamérica que requiere una estructura de ON secundaria/terciaria específica debida a un orden específico de los nucleótidos presentes. Los PAN pueden incluir una base o un enlace y/o modificaciones de azúcares, tal y como se describe más arriba.

Los ON pueden ejercer sus efectos terapéuticos mediante numerosos mecanismos que son dependientes de la secuencia o bien independientes de la secuencia. Los mecanismos dependientes de la secuencia son los que necesitan una secuencia de ácido nucleico específica para su actividad y donde la actividad se reduce mediante una o más alteraciones en la secuencia de nucleótidos presente. Esta secuencia específica puede abarcar toda la longitud del ON o solo una porción de él (un motivo de la secuencia). Los ejemplos de ON dependientes de la secuencia incluyen:

1. Los ON antisentido (monocatenario o bien bicatenario (p. ej., ARN pequeño interferente (siRNA) o ARN pequeño ahorquillado (shRNA)) son complementarios a una porción específica de un ARN mensajero (ARNm) de interés, y cuando se introducen en una célula, provocan la degradación de determinados ARNm mediante la RNAsa H o el complejo de silenciación inducido por ARN (RISC).

2. Los ON de bloqueo estérico son ON antisentido monocatenarios que son complementarios a una porción específica de un ARNm, pero que están construidos para que no activen la RNAsa H. La hibridación de estos ON a su ARNm diana da lugar a una porción bicatenaria que proporciona un impedimento estérico a las proteínas que normalmente actúan en el ARNm. Tales ON se pueden emplear para bloquear la traducción de un ARNm en concreto o para interferir con el ayuste postranscripcional y la maduración de un ARNm en concreto. Tales ON se pueden fabricar para que bloqueen la activación de la RNAsa H (ya que no es integral al mecanismo de acción de estos ON) mediante modificaciones de todas las posiciones 2' de las ribosas (tal como la 2’-0-metilación).

3. Los aptámeros son ON que adoptan una conformación tridimensional específica capaz de interaccionar específicamente con las proteínas y que no interaccionan fácilmente con el ADN o el ARN del hospedador. Los aptámeros también pueden incluir espigeliómeros, que utilizan nucleótidos L en vez de nucleótidos D para conferir una mayor estabilidad enzimática al ON.

4. Los ON inmunoestimulantes utilizan un motivo de ácido nucleico 6-mero específico (XXCGXX) para estimular la respuesta inmunitaria en los mamíferos. El motivo óptimo varía de especie a especie, pero es estrictamente dependiente de una secuencia específica que conforma el motivo XXCGXX.

5. Los micro-ARN (miRNA) se fijan y bloquean la función de moléculas de micro-ARN que se producen en la naturaleza que están implicadas en la regulación de diferentes rutas bioquímicas.

El único ejemplo descrito de ON independientes de la secuencia son los PAN con fosforotioatos, que interaccionan selectivamente con las estructuras proteicas antipáticas de una forma dependiente del tamaño (longitud) en virtud de sus propiedades fisicoquímicas como polímeros antipáticos.

En la actualidad se han autorizado varios fármacos basados en polipéptidos antivíricos para el tratamiento de las infecciones víricas que incluyen el interferón a-2a PEGilado (para el tratamiento de la hepatitis B (VHB) y la hepatitis C (VHC)), el interferón a-2b (para el tratamiento del VHB), la timosina a l (para el tratamiento del VHB) y la enfurtida (para el tratamiento del VIH-1). También hay otros fármacos basados en polipéptidos en desarrollo, entre ellos un fragmento de la proteína del antígeno de la superficie del VHB pre-s1 miristilada (bulevirtida, Petersen et al., 2008, Nature Biotech. 26: 335-341) para el tratamiento del VHB, y el interferón A1 PEGilado (Muir et al., 2010, Hepatology 52: 822-832). Además, también se sabe que los interferones A1, A2 y A3 tienen actividad antivírica (Friborg et al., 2013, Antimicrobial Agents and Chemotherapy 57: 1312-1322). En el caso de los interferones PEGilados o sin PEGilar y otros inmunomoduladores conocidos (p. ej., timosina a1), estos polipéptidos son activos a la hora de estimular sus respectivas rutas bioquímicas que conducen a la estimulación de una respuesta inmunitaria a la infección vírica en los sujetos. Aunque estos polipéptidos pueden estimular con éxito la respuesta inmunitaria, solo una pequeña fracción de pacientes con infecciones del VHB o del VHC consiguen controlar completamente la infección con el uso de estos fármacos basados en polipéptidos. La bulevirtida funciona bloqueando la entrada del VHB en los hepatocitos, pero todavía no se ha demostrado su beneficio terapéutico en los pacientes humanos.

Además de estos polipéptidos, hay otras clases de polipéptidos con actividad antivírica conocida que pueden ser útiles para el tratamiento de una infección vírica cuando se combinan con un complejo de quelato de ON. Tales polipéptidos incluyen citocinas, tales como TNF-a, IL-1 p, IL-2, IL-4, IL-6, y el interferón y.

Se conocen bien en la técnica los métodos para la PEGilación de los polipéptidos terapéuticamente activos y la compatibilidad de la PEGilación con la actividad bioquímica de los polipéptidos, y consisten en la conexión de las cadenas de polietilenglicol (PEG) al polipéptido en cuestión en determinados restos aminoacídicos. La función principal de la PEGilación es incrementar la vida útil de un polipéptido en circulación y también reducir su inmunogenia. Estas características mejoran la tolerancia del polipéptido en cuestión y reducen la frecuencia de la dosificación necesaria para el efecto terapéutico óptimo. Además, se sabe en la técnica que la adhesión de los restos de PEG a un polipéptido se puede conseguir sin afectar a la actividad bioquímica específica del polipéptido en cuestión. También se sabe que la PEGilación incrementa la hidrosolubilidad del polipéptido en cuestión, lo que mejora y facilita su formulación. Se conocen en la técnica numerosos ejemplos de polipéptidos PEGilados, e incluyen: Mircera™, una forma PEGilada de la eritropoyetina; Neulasta™, una forma PEGilada del factor estimulante de las colonias de granulocitos humanos; Pegasys™, una forma PEGilada del interferón a-2a humano; Peg-intron™, una forma PEGilada del interferón a-2b humano; y el interferón A1 PEGilado (que actualmente está en desarrollo clínico). Por lo tanto, la descripción de la compatibilidad de un polipéptido PEGilado (a saber, el interferón a-2a PEGilado) en una composición con un complejo de quelato de ON proporciona una habilitación general de la compatibilidad de cualquier polipéptido PEGilado con un complejo de quelato de ON en general y, sobre todo, para las versiones PEGiladas de determinados polipéptidos sin PEGilar que se presentan en la actual descripción por ser compatibles con un complejo de quelato de ON (a saber, la timosina a1, el interferón a-2b y el interferón A1).

En la actualidad están en desarrollo varios fármacos basados en ON antivíricos para el tratamiento de las infecciones víricas que incluyen los PAN con fosforotioatos REP 9AC (REP 2055), REP 9AC' (REP 2139) y REP 9ACm (REP 2148) para el tratamiento del VHB; miravirsén para el tratamiento del VHC (Janssen et al., 2013, NEJM, 27 de marzo); y ALN-RSV01 para el tratamiento del virus respiratorio sincitial (VRS) (Zamora et al, 2011, Am. J. Resp. Crit. Care Med.

183: 531 -538). Cada uno de ellos tiene un mecanismo de acción diferente: los PAN impiden que se libere a la sangre la proteína del antígeno de la superficie del VHB (una proteína que impide la función inmunitaria) como se describe en el ejemplo V, el miravirsén (un miRNA) bloquea la acción del micro-ARN mir-122 que se sabe que interviene en la replicación del VHC, y el ALN-RSV01 (un siRNA) bloquea la síntesis de la proteína N de la nucleocápsida del VRS, lo que impide la producción de viriones del VRS. Todos estos fármacos basados en ON son muy eficaces a la hora de desencadenar sus efectos pretendidos en los sujetos: REP 9AC / REP 9AC' / REP 9ACm bloquean el tránsito intracelular y la secreción de partículas subvíricas (PSV) del VHB que dan lugar a la eliminación del antígeno de la superficie del VHB en la sangre, lo que a su vez desencadena una reducción del VHB en la sangre; el miravirsén funciona bien para inhibir la función del mir-122 que está implicado en la replicación del VHC; y el ALN-RSV-01 funciona bien para bloquear la producción de la proteína de la cápsida del VRS. Sin embargo, en todos los casos en los que estos compuestos basados en ON se administran por vía parenteral, están asociados a efectos secundarios relacionados con la administración, tales como fiebre, escalofríos, estremecimientos, cuando se administran mediante infusión intravenosa, o dolor, inflamación o endurecimiento del sitio de la inyección cuando se administran por vía subcutánea. Más importante si cabe, mientras que todos estos fármacos basados en ON proporcionan el efecto deseado en los sujetos, el resultado terapéutico global está lejos de ser lo deseable: solo una fracción de pacientes que se someten al tratamiento con estos fármacos logran responder contra el virus de manera significativa, o logran controlar por completo la infección durante el tratamiento o después de retirar el tratamiento.

Por lo tanto, es deseable preparar cualquiera de estos fármacos antivíricos basados en ON como quelatos de ON (para disminuir al mínimo los efectos secundarios relacionados con la administración y mejorar potencialmente sus propiedades farmacocinéticas) y combinarlos con uno o más polipéptidos antivíricos (tales como el interferón a-2a PEGilado, el interferón a-2b o la timosina a1 o el interferón A1 PEGilado) en la misma formulación. Los efectos antivíricos específicos de los compuestos basados en ON (como quelatos), junto a los efectos antivíricos inmunoestimulantes de los polipéptidos, podrían tener un efecto aún más beneficioso a la hora de que los sujetos desencadenen una respuesta antivírica completa más potente y podrían conducir a que una mayor fracción de sujetos consigan controlar por completo la infección cuando se compara con cualquiera de los fármacos utilizado por separado.

Puede ser útil tratar una infección vírica concreta con una composición farmacéutica que comprende al menos un complejo de quelato de ON antivírico y al menos un polipéptido o polipéptido PEGilado antivírico para conseguir una mejoría de la respuesta antivírica en un sujeto.

Puede ser útil tratar una infección vírica concreta con al menos un complejo de quelato de ON antivírico y un polipéptido antivírico, en donde cada uno de estos compuestos se administra por separado en diferentes composiciones farmacéuticas, ya sea por la misma vía de administración o no.

Para proporcionar la mejor respuesta antivírica posible en un sujeto, podría ser necesario añadir a la politerapia de un quelato de ON antivírico y un polipéptido antivírico, tanto si se administra en la misma composición farmacéutica o en composiciones distintas, un tercer fármaco no polipeptídico y que no sea un ON. Tales fármacos pueden ser (pero sin limitarse a ellos): entecavir, tenofovir, telbuvidina, adefovir, lamivudina, ribavirina, telaprevir, boceprevir, GS-7977, tegobuvir, zanamivir, oseltamivir, ganciclovir, foscarnet, aciclovir, zidovudina, abacavir, lopinavir, ritonavir y/o efavirenz. Tales fármacos antivíricos pueden impedir la replicación del genoma vírico y/o del ARNm vírico en muchos virus, tales como VHC, VHB, VIH, gripe, VRS y citomegalovirus.

Es posible que la combinación de los efectos antivíricos específicos del complejo de quelato de ON antivírico, combinados con los efectos inmunoestimulantes de los polipéptidos o polipéptidos PEGilados antivíricos y el bloqueo de la replicación del ADN/ARN vírico por los fármacos no polipeptídicos y que no son ON recogidos más arriba puedan proporcionar la respuesta terapéutica mejor y más potente en un sujeto con la infección vírica y además incrementar la posibilidad de que el sujeto en cuestión consiga un control duradero del virus que se puede prolongar después de detener el tratamiento.

El complejo de quelato de ON en la formulación pueden proceder de cualquier ON con actividad antivírica, ejemplos de los cuales se dan a conocer en la tabla 1.

Tabla 1

El polipéptido en la formulación puede tener actividad antivírica directa o ser capaz de estimular la actividad antivírica derivada del hospedador y puede ser lo siguiente:

Timosina a1;

Cualquier interferón a o derivados PEGilados del mismo;

Cualquier interferón p o derivados PEGilados del mismo;

Cualquier interferón y o derivados PEGilados del mismo;

Cualquier interferón A o derivados PEGilados del mismo;

interferón a-2a o a-2b o a-N3;

interferón p-1a o p-1 b;

interferón Y-1b;

interferón A1 o A2 o A3;

interferón a-2a o a-2b o A1 o A2 o A3 PEGilado;

bulevirtida;

cualquier citocina antivírica o derivados PEGilados de la misma;

proteína A tímica; y/o

cualquier polipéptido o polipéptido PEGilado que se ha demostrado que tiene actividad antivírica o una actividad inmunoestimulante.

Se da a conocer en la presente memoria una demostración de que numerosos complejos de quelato de ON diferentes se pueden combinar con fármacos con diferentes polipéptidos o polipéptidos PEGilados en una única composición farmacéutica que no afecta a la estructura del ON ni del polipéptido.

Estas composiciones se pueden utilizar para administrar tanto el complejo de quelato de ON como el fármaco o fármacos de polipéptidos a un sujeto que necesita tal tratamiento al mismo tiempo y con un solo modo de administración, tal y como se demuestra en el ejemplo VI de más adelante.

Además, las composiciones de más arriba pueden incluir sustancias de arrastre, adyuvantes, vehículos y/o excipientes fisiológicamente y/o farmacéuticamente aceptables. Las características de la sustancia de arrastre pueden depender de la vía de administración. El término «sustancia de arrastre, adyuvante, vehículo y/o excipiente farmacéuticamente aceptable» se refiere a una sustancia de arrastre, un adyuvante, un vehículo o un excipiente que se puede administrar a un sujeto, que está incorporado en una composición de la presente invención y que no destruye la actividad farmacológica del mismo. Las sustancias de arrastre, adyuvantes, vehículos y excipientes farmacéuticamente aceptables que se pueden utilizar en las composiciones farmacéuticas descritas en la presente memoria incluyen, pero sin limitarse a ellos, los siguientes: intercambiadores iónicos, alúmina, estearato de aluminio, lecitina, sistemas de administración de fármacos autoemulsionantes (SEDDS), tensioactivos utilizados en formas de dosificación farmacéutica tales como Tweens u otras matrices de administración poliméricas similares, proteínas séricas tales como seroalbúmina humana, sustancias tamponantes tales como fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato de potasio, mezclas parciales de glicéridos de ácidos grasos vegetales saturados, agua, sales o electrolitos, tales como sulfato de protamina, hidrogenofosfato de disodio, hidrogenofosfato de potasio, cloruro de sodio, sales de zinc, sílice coloidal, trisilicato de magnesio, polivinilpirrolidona, sustancias derivadas de la celulosa, polietilenglicol, carboximetilcelulosa de sodio, poliacrilatos, ceras, polímeros de bloque de polietileno-polioxipropileno, polietilenglicol, grasa de lana, caprato de sodio o tetradecilmaltósido (TDM) u otros derivados del TDM de sacáridos alquilados. Las ciclodextrinas tales como a-, p- y Y-ciclodextrina, o derivados por modificación química tales como hidroxialquilciclodextrinas, entre ellas las 2-y 3-hidroxipropil-p-ciclodextrinas, u otros derivados solubilizados, también se pueden utilizar para mejorar la administración de las composiciones de la presente invención.

Las composiciones descritas en la presente memoria pueden contener otros agentes terapéuticos como se describe más adelante y se pueden formular, por ejemplo, empleando vehículos o diluyentes sólidos o líquidos convencionales, así como aditivos farmacéuticos de un tipo adecuado al modo de administración deseado (por ejemplo, excipientes, aglutinantes, conservantes, estabilizantes, saborizantes, etc.) de acuerdo con técnicas tales como las que se conocen bien en la técnica de la formulación farmacéutica.

Las composiciones descritas en la presente memoria se pueden administrar mediante cualquier medio idóneo, por ejemplo, por vía oral, tal como en forma de comprimidos, cápsulas, gránulos o polvos; por vía sublingual; por vía yugal; por vía parenteral, tal como técnicas de inyección o infusión subcutánea, intravenosa, intramuscular, intratecal (p. ej., como soluciones o suspensiones acuosas o no acuosas inyectables estériles); mediante inhalación; por vía tópica, tal como en forma de una crema o ungüento; o por vía rectal, tal como en forma de supositorios o enema; en formulaciones de dosis unitarias que contienen vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables que no son tóxicos. Las presentes composiciones pueden administrarse, por ejemplo, en una forma idónea para la liberación inmediata o la liberación prolongada. La liberación inmediata o la liberación prolongada se puede conseguir mediante el uso de composiciones farmacéuticas idóneas o, en concreto en el caso de la liberación prolongada, mediante el uso de dispositivos tales como implantes subcutáneos o bombas osmóticas. Así pues, las composiciones de más arriba se pueden adaptar para la administración por cualquiera de las vías siguientes: intraocular, ingestión oral, sublingual, entérica, inhalación, inyección subcutánea, inyección intramuscular, inyección intraperitoneal, inyección o infusión intratecal, intratraqueal, inyección o infusión intravenosa o por vía tópica.

Las composiciones ejemplares para la administración oral incluyen suspensiones que pueden contener, por ejemplo, celulosa microcristalina para dar volumen, ácido algínico o alginato de sodio como un agente de suspensión, metilcelulosa como potenciador de la viscosidad, y edulcorantes o saborizantes, tales como los conocidos en la técnica; y comprimidos de liberación inmediata que pueden contener, por ejemplo, celulosa microcristalina, almidón, estearato de magnesio y/o lactosa y/o otros excipientes, aglutinantes, aditivos, disgregantes, diluyentes y lubricantes, tales como los conocidos en la técnica, que no interfieren con la estabilidad de los quelatos de oligonucleótidos. Las presentes composiciones también se pueden administrar a través de la cavidad oral mediante la administración sublingual y/o yugal. Los comprimidos moldeados, los comprimidos por compresión o los comprimidos liofilizados son formas ejemplares que se pueden utilizar. Las composiciones ejemplares incluyen las que formulan las presentes composiciones con diluyentes que se disuelven rápido, tales como manitol, lactosa, sacarosa y/o ciclodextrinas. También pueden estar incluidos en tales formulaciones los excipientes de masa molecular alta, tales como celulosa (avicel) o polietilenglicoles (PEG). Tales formulaciones también pueden incluir un excipiente para ayudar a la adherencia a la mucosa, tal como hidroxipropilcelulosa (HPC), hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC), carboximetilcelulosa de sodio (SCMC), copolímero de anhídrido maleico (p. ej., Gantrez) y agentes para controlar la liberación, tal como copolímero poliacrílico (p. ej., Carbopol 934). Para facilitar la fabricación y el uso también se pueden añadir lubricantes, deslizantes, saborizantes, colorantes y estabilizantes.

La cantidad eficaz de un compuesto descrito en la presente memoria puede ser determinada por el experto en la técnica e incluye cantidades de dosificación ejemplares para un humano adulto de aproximadamente 0.1 a 50 mg/kg de masa corporal del compuesto activo al día, que se puede administrar en una única dosis o en forma de distintas dosis independientes, tal como de 1 a 5 veces al día o de 1 a 7 dosis a la semana. Se ha de saber que el nivel de dosis específica y la frecuencia de dosificación para cualquier sujeto en particular puede variar y dependerá de una serie de factores que incluyen la actividad del compuesto específico empleado, la estabilidad metabólica y la duración de la acción de ese compuesto, la especie, edad, masa corporal, salud general, sexo y dieta del sujeto, el modo y el momento de la administración, la velocidad de excreción y eliminación, la combinación de fármacos y la gravedad de la afección concreta. Los sujetos preferidos para el tratamiento incluyen animales, lo más preferiblemente especies de mamíferos tales como los humanos, y animales domésticos tales como perros y gatos.

También se da a conocer en la presente memoria un ejemplo de la actividad antivírica beneficiosa de un complejo de quelato de oligonucleótido antivírico y un polipéptido antivírico cuando se utilizan en combinación (politerapia) para tratar pacientes humanos con una infección vírica.

La presente descripción se entenderá con más facilidad al hacer referencia a los ejemplos que vienen a continuación.

Ejemplos

Ejemplo 1: Caracterización de los ON degenerados

En la figura 1A se detalla la separación por HPLC (mediante el uso de una columna hidrófoba) de dos preparaciones de ON que se coinyectan en la columna al mismo tiempo. La primera de ellas se denomina patrón interno y es un ON 21-mero con fosforotioatos con una secuencia definida específica, la segunda es el REP 2006 (un ON degenerado 40-mero con fosforotioato). Las dos especies se separan en picos definidos diferentes basándose solo en sus propiedades fisicoquímicas (a saber, tamaño e hidrofobia); la secuencia de nucleótidos presente en cada uno de estos ON no tiene un impacto significativo sobre sus propiedades fisicoquímicas y, por lo tanto, no tiene ningún impacto sobre su separación. Como tal, el patrón interno se eluye de la columna como un pico muy bien definido con un tiempo de retención más pequeño que el de REP 2006, solo debido a la diferencia de tamaño de estos dos polímeros de tipo ON. Obsérvese que un hombro a cualquiera de los lados del pico de REP 2006 se debe a secuencias malas típicas en la producción de ON más largos. A pesar de la naturaleza heterogénea de la secuencia de REP 2006, se resuelve como un pico igualmente bien definido por HPLC como la secuencia específica 21-mero que ilustra las propiedades fisicoquímicas comunes de todas las especies en la preparación de REP 2006, incluso aunque se encuentre presente un número muy grande de secuencias diferentes. Después de la separación por HPLC de y los picos del REP 2006 y de los 21-meros, estos se pueden someter a la espectroscopia de masas (MS) para identificar la especie presente dentro de estos picos definidos (figuras 1B y 1C).

En la figura 1B, el 21 -mero se resuelve en una única especie cuya masa molecular es de 7402.6 Da, coherente con este ON-PS que tiene una secuencia definida. Sin embargo, el análisis por MS de REP 2006 (figura 1C) revela la presencia de un número muy grande de especies cuyo margen de masas tiene una distribución normal casi perfecta, coherente con su naturaleza completamente degenerada. Este margen de masas va de C40 (la especie más pequeña) a A40 (la especie más grande) y la prevalencia de estas especies es extremadamente pequeña, en donde el número de especies crece (intensidad del pico) a medida que su masa se acerca al centro del margen de masas. Esto es porque un número cada vez más grande de secuencias diferentes dará lugar a una masa similar. El hecho de que todas las especies de ON diferentes presentes en el REP 2006 tengan el mismo tiempo de retención en una columna hidrófoba durante la separación por HPLC demuestra con claridad que los ON del mismo tamaño y con las mismas modificaciones químicas (a saber, fosforotioatación) probablemente tendrán propiedades fisicoquímicas muy similares (cuando no idénticas) y, como tales, se pueden considerar funcionalmente similares en cualquier aplicación o propiedad que no sea dependiente de la secuencia de los nucleótidos presente en una molécula de ON en concreto. Así pues, cualquier formación de complejos de quelato de ON observada con cualquier ON degenerado en concreto (p. ej., REP 2006) no puede ser dependiente de la secuencia de los ON presentes y debe depender de las propiedades fisicoquímicas conservadas de cualquier ON.

Ejemplo II: Formación de complejos de quelatos con los ON antivíricos

REP 2031, REP 2055, REP 2057 y REP 2139 son polímeros de ácido nucleico (PAN) con actividad antivírica de amplio espectro contra el VIH, VHS, citomegalovirus, VCML, VHC y otros virus con envoltura (Bernstein et al., 2008, Antimicrobial Agents Chemother. 52: 2727-2733; Cardin et al., 2009, Virology J. 6: 214; Vaillant et al., 2006, Antimicrobial Agents Chemother., 50: 1393-1401; Guzman et al, 2007, Antiviral Therapy, 12: 1147-1156; Lee et al., Virology, 372: 107-117; Matsumura et al., 2009, Gatroenterology 137: 673-681) Todos estos compuestos son ON 40-meros totalmente fosforotioatados con secuencias C40 de 5' ^ 3' en el caso de REP 2031 (SEQ iD n.° 1), (AC)20 en el caso de REP 2055 (SEQ ID n.° 2), (AG)20 en el caso de REP 2057 (SEQ ID n.° 3) y (2'OMeA-2'OMe, 5'MeC)20 en el caso de REP 2139 (SEQ ID n.218). Mientras que REP 2031, REP 2055 y REP 2057 son ON del ADN, REP 2139 es un ON de ARN en donde todas las ribosas tienen 2'-0-metilaciones y todas las citosinas están metiladas en 5’.

La formación de complejos de quelatos con estos ON antivíricos se estudió con la polarización de fluorescencia y el uso de derivados de estos compuestos marcados con ITCF en 3'. Durante la síntesis de los ON, cada ON se conjuga con el isotiocianato de fluoresceína (ITCF) en el extremo 3' mediante un conector rígido de 3 carbonos con el uso de reactivos y protocolos de síntesis bien consolidados. Estos ON se escinden de la síntesis y se dejan como sales de amonio. Cada uno de estos ON se preparó como una solución concentrada a 0.5 mM en TRIS a 1 mM (pH 7.2). Estas soluciones concentradas se utilizaron para preparar soluciones de ON fluorescentes a 3 nM en el tampón FP (TRIS a 10 mM, NaCl a 80 mM, EDTA a 1 mM, p-mercaptoetanol a 10 mM y Tween®-20 al 0.1 %). El EDTA estaba presente para retirar cualquier metal divalente presente en la solución antes de las mediciones de FP. Cada una de estas soluciones tamponantes también contenían NaCl a 80 mM para valorar la formación de complejos de ON en presencia de un exceso molar de los cationes monovalentes. A cada ON fluorescente en solución se le añadieron sales de grado ACS de cloruros de metales divalentes (2+) (tal y como se describe en la tabla 2). La formación de dímeros o de complejos de quelato de ON de orden superior se monitorizó mediante un incremento en la polarización de la fluorescencia (cuantificada mediante la unidad adimensional «mP») de tal modo que el incremento de la formación de complejos de quelato de ON dio lugar a cambios más grandes de la masa (véase la figura 3). El movimiento aleatorio más lento resultante de estos complejos de quelato de ON en la solución conduce a un incremento de la polarización de la fluorescencia emitida (véase la figura 4). Los resultados de estos experimentos se presentan en la tabla 2.

Tabla 2

En cada caso, se observaron incrementos significativos de la polarización de la fluorescencia con todos los ON marcados con fluorescencia en presencia de calcio y magnesio, lo que indica que se formaron complejos de quelato de ON con estos cationes metálicos divalentes. Estos resultados demuestran lo siguiente:

• REP 2006, REP 2031, REP 2055, REP 2057 y REP 2139 forman dímeros y complejos de orden mayor en presencia de los cationes de magnesio y de calcio. Estos complejos se espera que se formen con todos los demás cationes metálicos multivalentes y con cualquier ON (tal y como se muestra con el REP 2006 de tipo PAN degenerado). La formación de estos complejos de ON implica la interacción de estos ON con estos cationes metálicos divalentes.

• La formación de los complejos de ON no se puede deber a la hibridación entre las bases nitrogenadas a través de las interacciones tradicionales de Watson y Crick porque REP 2031, REP 2055, REP 2057 y REP 2139 no se pueden hibridar consigo mismos en las condiciones experimentales empleadas.

• La formación de estos complejos de ON es estable y soluble en una solución acuosa, y ya que estos complejos parecen incorporar el metal divalente en cuestión como parte del complejo formado, estos complejos de ON tienen el efecto de quelar el metal divalente en cuestión a partir de la solución en la que se formó el complejo de ON.

Ejemplo III: Preparación de composiciones que contienen complejos de quelato de ON y polipéptidos

La preparación de las composiciones que contienen los complejos de quelato de ON y un polipéptido se llevó a cabo con el uso de cinco ON antivíricos diferentes y cuatro polipéptidos antivíricos. Los ON utilizados eran PAN que se ha demostrado anteriormente que tienen actividad antivírica de amplio espectro sobre los virus con envoltura, entre ellos VHB, VHC, gripe, VRS, ébola, VHS-1 y VHS-2. Estos ON son REP 2006 (un PAN degenerado 40-mero con fosforotioatos), REP 2055 (SEQ ID n.22), REP 2057 (SEQ ID n.23), REP 2139 (SEQ ID n.218) y REP 2148 (SE ID n.° 11). Estos PAN se prepararon en las condiciones estándares de síntesis en fase sólida en un reactor de flujo y adicionalmente se les intercambió la sal para reemplazar los contraiones de amonio con contraiones de sodio durante la purificación. La masa molecular teórica de los ácidos libres de estos ON es (12612-13092), 12612, 13413 y 14094 y 12893 Da, respectivamente. Los polipéptidos antivíricos utilizados eran el interferón a-2b, la timosina a1, el interferón a-2a PEGilado y el interferón A1 (IL-29) que se ha demostrado que tienen actividad antivírica (Yang et al, 2008, Antiviral Res., 77: 136-141; Fried et al., 2002, N. Engl. J. Med., 347: 975-982; Friborg et al, 2013, Antimicrob. Agents Chemother. 57: 1312-1322). Todos los ON se sintetizaron de acuerdo con los estándares actuales en la técnica para la síntesis de oligonucleótidos en fase sólida y se prepararon como sales de sodio idóneas para la administración in vivo con el uso de métodos aceptados y se liofilizaron hasta un contenido de agua <10 % de antes de su almacenamiento. REP 2006, REP 2055, REP 2057 y REP 2148 eran preparaciones sin purificar que contenían cantidades menores de productos de la síntesis incompleta que normalmente se producen durante la síntesis en fase sólida. El REP 2139 se preparó como una preparación de pureza más alta en donde la mayoría de los productos de la síntesis incompleta estaban ausentes. REP 2006, REP 2057 y REP 2139 se prepararon previamente como soluciones en una solución salina normal y se ajustaron a 25 mg/ml durante la formación de quelatos. El REP 2055 también se preparó previamente como una solución en una solución salina normal, pero se ajustó a 12.5 mg/ml durante la preparación de los quelatos. La timosina a1 es un péptido sintético acilado en el extremo amino de 28 aminoácidos con una masa molecular de 3108 Da y se obtuvo en una preparación comercial (Zadaxin™) y se preparó como una solución a 1.6 mg/ml en agua para la inyección. El interferón a-2b se produjo en E. coli mediante técnicas de ADN recombinante y tiene una masa molecular de 19271 Da. El interferón a-2b se obtuvo en una preparación comercial (Intron A™) y se preparó como una solución de 1 x 107 Ul/ml en agua para la inyección que también contenía 1 mg/ml de seroalbúmina humana (que tiene una masa molecular de aproximadamente 66500 Da). El interferón a-2a PEGilado es un conjugado covalente del interferón a-2a y una cadena de bis-monometoxipolietilenglicol con una única ramificación con una masa molecular aproximada total de 60000 Da. El interferón a-2a PEGilado se obtuvo en una preparación comercial (Pegasys™) diluido previamente en agua para la inyección que contiene cantidades insignificantes de alcohol bencílico a una concentración de 360 pg/ml. El interferón A1 (IL-29) recombinante purificado se obtuvo como una solución libre de sustancias de arrastre a 0.5 mg/ml en solución salina tamponada con fosfato de Ebiosciences (San Diego, EE. UU.) y que tiene una masa molecular de aproximadamente 20 kDa según se determinó mediante electroforesis en gel.

Se obtuvo el cloruro de calcio como una preparación de la USP a 100 mg/ml de CaCl2-2H2Ü en agua para la inyección (Lifeshield™ por Hospira). El sulfato de magnesio se obtuvo como una preparación de la USP a 500 mg/ml de MgSO2-7H2O en agua para la inyección (Baxter) y se diluyó a 100 mg/ml en solución salina normal. Para preparar los complejos de quelato de ON que contienen calcio, magnesio, o calcio y magnesio, estas soluciones de sales metálicas se añadieron gota a gota poco a poco a la solución de ON en mezcla constante hasta que se consiguió la relación deseada de sal metálica por ON. Para los complejos de quelato de calcio, se obtuvo la relación de 30 mg de cloruro de calcio por 100 mg de ON en la solución, excepto para el complejo de quelato de calcio de REP 2148, que contenía 20 mg de cloruro de calcio por 100 mg de ON. Para los complejos de quelato de magnesio, se obtuvo la relación de 30 mg de sulfato de magnesio por 100 mg de ON en la solución. Para los complejos de quelato de calcio y magnesio mezclados, se obtuvo la relación de 15 mg de cloruro de calcio y 15 mg de sulfato de magnesio por 100 mg de ON en la solución. Esta metodología se ha demostrado que da lugar a la formación de complejos de quelato de ON (tal y como se describe en la publicación de la solicitud en los EE. UU. n.° 2012/0046348). Al final de este procedimiento, el complejo de quelato de ON era una solución homogénea transparente con un color amarillento muy pálido.

Las composiciones de complejos de quelato de ON / polipéptido o polipéptido PEGilado se prepararon mezclando con cuidado la solución de complejo de quelato de ON con la solución de polipéptido o de polipéptido PEGilado en una relación de 1:1 para un volumen final de 1 ml.

Ejemplo IV: Caracterización de las composiciones que contienen complejos de quelato de ON y polipéptidos

Para confirmar la identidad de los ON y de los polipéptidos o de los polipéptidos PEGilados contenidos en las composiciones preparadas en el ejemplo III, estas se sometieron al análisis por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) seguida de la espectrometría de masa de ionización por electropulverización (ESI-MS). Debido a la amplia variación de la masa y de la química de los ON y de la especie del polipéptido o del polipéptido PEGilado presentes en estas composiciones, se utilizaron para el análisis tres metodologías de HPLC diferentes:

Método para oligonucleótidos: Fase sólida: 2 x 50 mm de ACE™ C18 (3 pm)

Fase móvil: A = HFIPA/DIEA al 1/0.1 %

B = ACN/HFIPA/DIEA al 65/0.075/0.0375 %

Gradiente: B al 5-25 % durante 20 min

B al 70 % durante 2 min a 60 °C

Flujo: 0.4 ml/min

Método 1 para proteínas: Fase sólida: 2 x 50 mm de PLRP-s (Agilent™) 4000A (8 pm)

Fase móvil: A = TFA al 0.05 % en ACN

B = TFA al 0.05 % en ACN

C = NH4OH al 0.1 % en H2O

D = NH4OH al 0.1 % en ACN/MeOH/H2O a 40/40/20

Gradiente: Lavado con C/D al 80/20 % durante 1 min y se tira

(de manera optativa, lavado con D al 20 % durante 1 min y se tira)

D al 20 %-100 % durante 15 min, B al 100 % durante 2 min (de manera optativa, B al 20-70 % durante 16 min)

Flujo: 0.5 ml/min para lavado

0.3 ml/min para gradiente

Método 2 para proteínas: Fase sólida: 2 x 50 mm de PLRP-s (Agilent™) 4000A (8 gm)

Fase móvil: A = TFA al 0.05 % en ACN

B = TFA al 0.05 % en ACN

C = NH4OH al 0.1 % en H2O

D = NH4OH al 0.1 % en ACN/MeOH/H2O a 40/40/20

Gradiente: Lavado con C/D al 80/20 % durante 1 min y se tira

A/B al 80/20 % a B al 100 % durante 15 min

B al 100 % durante 2 min

Flujo: 0.5 ml/min para lavado

0.3 ml/min para gradiente

La instrumentación utilizada fue un LTQ-Orbitrap Discovery que funciona en un modo de barrido LTQ con iones negativos para el método para oligonucleótidos y un modo de barrido de masas altas Orbitrap a una resolución de 7500 con iones positivos para ambos métodos para proteínas. Acrónimos: ACN = acetonitrilo, TFA = ácido trifluoroacético, HFIPA = hexafluoroisopropanol, DIEA = N,N-diisopropiletilamina.

Los resultados de estos análisis se pueden encontrar en las figuras 5 a 95. Todos los cromatogramas por HPLC se representan en un gráfico a partir de los datos de corriente iónica total (TIC) donde el tiempo de retención de los picos está acompañado por la identificación de la masa a partir de la ESI-MS posterior (excepto para las figuras 39, 43, 47, 51,55, 77, 81,91 y 95, en donde no fue posible por la presencia del conjugado de polietilenglicol en el interferón a-2a PEGilado). Para los casos de las composiciones que contienen complejos de quelato de ON y la timosina a1, el método para oligonucleótidos fue suficiente para analizar ambas especies simultáneamente. Para las otras composiciones que contienen las proteínas de mayor masa molecular, el análisis del ON y el análisis del polipéptido se llevó a cabo en la misma muestra, pero con diferentes metodologías de HPLC (tal y como se indica en las figuras 5 a 95).

El análisis por LC-MS del contenido de los ON de todas las composiciones demostró que los ON presentes en estas composiciones correspondían con su pureza esperada: se observó poca cantidad de productos de la síntesis incompleta de los ON en los análisis por HPLC con el método para oligonucleótidos con REP 2055 (figuras 5, 24, 40, 56, 68, 71,74 y 78), REP 2057 (figuras 9, 27 y 44) y REP 2148 (figuras 17, 33, 52 y 64), pero no aparecían en el caso del REP 2139 (figuras 13, 30, 48, 60, 82, 85, 88 y 92). En todos los casos, la eS i-MS de los picos de los ON en cabeza (principales) se correlacionaban casi a la perfección con la masa molecular esperada de REP 2055, REP 2057, REP 2139 y REP 2148. Para el REP 2006, la ESI-MS del pico en cabeza produjo un pico de distribución ancha en el margen de 12612 a 13092 Da, coherente con su naturaleza degenerada (figuras 22 y 37).

Para el análisis de las composiciones que contienen el interferón a-2b, los cromatogramas de HPLC ejecutados con el método 1 para proteínas mostraron un número de picos grande y poco resueltos, coherente con la presencia de más de un polipéptido en estas composiciones (figuras 7, 11, 15 y 19), pero el pico en cabeza se resolvió en dos especies de masa diferente que se correlacionaba casi con exactitud con la masa molecular esperada para el interferón a-2b y la albúmina humana (figuras 8, 12, 16 y 20).

Para las composiciones que contienen la timosina a1, los cromatogramas de HPLC obtenidos con el método 1 para oligonucleótidos eran capaces de capturar un segundo pico prominente en la misma separación con un tiempo de retención mucho más pequeño que el pico de ON (principal) (figuras 21,24, 27, 30, 33, 68, 71,82 y 85) debido a que la masa molecular de este polipéptido es relativamente baja. En todos los casos, la ESI-MS de este pico secundario se correlacionaba casi con exactitud con la masa molecular esperada de la timosina a1 (figuras 23, 26, 29, 32, 35, 70, 73, 84 y 87).

Para las composiciones que contienen el interferón a-2a PEGilado, el análisis por LC-MS se complica enormemente por la presencia del conjugado PEGilado, que genera numerosas especies iónicas que dificultan muchísimo la desconvolución correcta del espectro de masas para cualquier polipéptido PEGilado. Sin embargo, con el método 2 para proteínas, los datos de la HPLC de todas las composiciones que contienen el interferón a-2a PEGilado mostraban unos picos prominentes similares que eran coherentes con el tiempo de retención esperado para un polipéptido PEGilado (figuras 38, 42, 46, 50, 54, 76, 80, 90 y 94). Los análisis por ESI-MS de estos picos en todos los casos mostró un grupo similar de señales relacionadas de PEGilación desde m/z 600-100 y 1500-3600 coherente con la presencia de una proteína PEGilada (figuras 39, 43, 47, 51,55, 77, 81, 91 y 95).

Una porción de todas las composiciones de quelato de oligonucleótido y polipéptido preparadas en el ejemplo III también se sometieron a la determinación del calcio y/o magnesio por espectroscopia de emisión óptica de plasma acoplado inductivamente (ICP-OES). Las determinaciones del calcio y del magnesio para cada composición analizada se presentan en la tabla 3.

Tabla 3

Los resultados de los ejemplos III y IV demuestran lo siguiente:

1. Se pueden preparar composiciones que contienen complejos de quelato de ON que comprenden calcio, magnesio, o calcio y magnesio mezclados y polipéptidos o polipéptidos PEGilados que son idóneas para la administración parenteral.

2. Ni el ON ni el polipéptido ni el polipéptido PEGilado en estas composiciones en cuestión sufre ningún cambio químico detectable, como se comprueba por la correlación casi perfecta entre la masa molecular observada y la teórica para r Ep 2055, REP 2057, REP 2139, REP 2148, interferón a-2b, timosina a1 e interferón A1.

3. En el caso de las composiciones que contienen el interferón a-2a PEGilado, los ON no están alterados y las alteraciones de los polipéptidos (en caso de existir) no se pudieron detectar.

A partir de estos resultados, se puede deducir lo siguiente:

1. El REP 2006 es un ON totalmente degenerado y, como tal, es un modelo prototípico para las propiedades fisicoquímicas comunes a todos los ON. Como tal, cualquier ON que se pueda formular como un complejo de quelato sería compatible con estos polipéptidos o polipéptidos PEGilados en solución.

2. REP 2006, REP 2055, REP 2057 y REP 2148 son de ADN mientras que REP 2139 es de ARN. Por lo tanto, cualquier ON de ARN o ADN o del híbrido ARN/ADN se puede utilizar para preparar composiciones que contienen complejos de quelato de ON y polipéptidos.

3. REP 2006, REP 2055 y REP 2057 tienen las ribosas sin modificar, mientras que REP 2139 tiene cada ribosa 2'-0-metilada. Por lo tanto, cualquier modificación en el 2’ de la ribosa será compatible con la preparación de composiciones que contienen complejos de quelato de ON y polipéptidos.

4. REP 2139 y REP 2148 comprenden cada uno citosina modificada adicionalmente como 5'-metilcitosina.

Como tales, los ON que contienen bases modificadas se pueden usar en la preparación de composiciones que contienen complejos de quelato de ON y polipéptidos o polipéptidos PEGilados.

5. Las composiciones que comprenden un complejo de quelato de ON y un polipéptido o un polipéptido PEGilado serán compatibles con cualquier catión metálico divalente farmacéuticamente aceptable, tal como calcio y/o magnesio.

6. Los 4 polipéptidos utilizados en la preparación de las composiciones abarcan estructuras ampliamente divergentes: la timosina a1 es un polipéptido sintético pequeño, el interferón a-2b y el interferón A1 son polipéptidos recombinantes grandes, y el interferón a-2a PEGilado es un péptido recombinante grande con un enorme y complejo conjugado PEGilado. Por lo tanto, las composiciones que comprenden complejos de quelato de ON y polipéptidos se pueden preparar satisfactoriamente con un amplio margen de polipéptidos, desde polipéptidos sintéticos pequeños hasta grandes polipéptidos recombinantes con conjugados complejos como el polietilenglicol. Probablemente la única limitación es que el polipéptido en cuestión debe ser soluble en las soluciones acuosas. Adicionalmente, el uso de la SAB como proteína de arrastre en el Intron A™ (utilizado como fuente de interferón a-2b) no interfirió con la estabilidad de las composiciones preparadas con esta formulación de polipéptido.

7. Tal y como se describe más arriba, la PEGilación se conoce bien en la técnica para mejorar la tolerancia y el comportamiento farmacocinético de los polipéptidos y en la actualidad están en uso numerosos polipéptidos PEGilados como fármacos autorizados (véase más arriba). Por lo tanto, la demostración de que las composiciones descritas en la presente memoria pueden tolerar bien la presencia de un péptido PEGilado y la utilidad de combinar un complejo de quelato de ON y un péptido PEGilado para mejorar la respuesta antivírica y en los pacientes humanos (véase el ejemplo VI más adelante) da a conocer una enseñanza clara a cualquier experto en la técnica de que cualquier polipéptido contemplado en la presente memoria como parte de las composiciones descritas pueden también estar presentes como un polipéptido PEGilado. Por ejemplo, la timosina a1 puede estar PEGilada, el interferón a-2b puede estar PEGilado (una versión PEGilada del interferón a-2b, Peg-intron™, es actualmente un fármaco autorizado) y el interferón A1 puede estar PEGilado (una versión PEGilada del interferón A1 está actualmente en desarrollo clínico como un agente antivírico).

Ejemplo V: Los PAN inhiben el transporte del HBsAg al exterior de las células

Se ha demostrado que el antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg) bloquea muchos aspectos de la respuesta inmunitaria contra la infección del VHB (Cheng et al., J. Hepatology 43: 465-471; Moucari et al, Hepatology 49: 1151­ 1157; Vanlandschoot et al., J. Gen. Virol. 83: 1281-1289; Woltman et al., PloS One 6: e15324; Wu et al., Hepatology 49: 1132-1140, y Xu et al., Mol. Immunology 46: 2640-2646). Por lo tanto, la eliminación de1HBsAg en circulación puede ser un factor decisivo para permitir la restauración de la inmunocompetencia en los pacientes con una infección crónica de hepatitis B. Un método eficaz para eliminar el HBsAg en la circulación es impedir la formación y/o liberación de PSV desde las células infectadas (las PSV son el principal portador de HBsAg en la sangre). La morfogenia y el transporte intracelular de las PSV se puede modelizar in vitro en las células BHK-21 mediante la expresión de la forma pequeña de la proteína del HBsAg (sHBsAg) que es la forma específicamente enriquecida en las PSV. Este sistema de modelo se considera que es un modelo sustituto para la morfogenia y el transporte de las PSV del VHB en los pacientes humanos (Patient et al., J. Virology 81: 3842-3851). Debido la importancia crítica de1HBsAg en el suero a la hora de permitir la cronicidad de la infección del VHB, la capacidad que tienen los compuestos para bloquear en este modelo la formación de las PSV o su tránsito intracelular demuestra su actividad antivírica contra el VHB.

Se analizaron diferentes compuestos de tipo PAN en las células BHK-21 que expresan el sHBsAg que incluyen los PAN con fosforotioato completamente degenerados REP 2006 y REP 2107 (el 2107 también tiene todas las ribosas con la modificación de tipo 2'-0-metilación), un PAN sin fosforotioatos degenerado y completamente 2'-0-metilado (REP 2086), así como los PAN que consisten en una secuencia de poli-AC: REP 2055 (SEQ ID n.° 2) y REP 2148 (SEQ ID n.° 11). Estos PAN se introdujeron en las células BHK-21 por electroporación al mismo tiempo que el ARN de plantilla para la expresión del sHBsAg por electroporación. La actividad en el sistema modelo de BHK se valoró con la visualización de la ubicación de la proteína HBsAg dentro de las células BHK-21 por microscopia de inmunofluorescencia. Se consideró que los compuestos eran activos si el HBsAg se limitaba al espacio perinuclear y se impedía que se transportara a la periferia de la célula (secreción). La actividad de diferentes compuestos de tipo PAN se resume en la tabla 4 que viene a continuación.

Tabla 4

Los resultados de las células BHK-21 que expresan el sHBsAg tras el tratamiento con REP 2006 y REP 2107 demuestran la capacidad que tienen los PAN para bloquear el transporte del sHBsAg de una forma independiente de la secuencia. La falta de actividad con el REP 2086 demuestra que esta actividad es estrictamente dependiente de la presencia los fosforotioatos. Además, esta capacidad se conservaba en presencia de una modificación del 2' de la ribosa (en el REP 2107) y la modificación de las bases (5'-metilcitosina en el caso de REP 2148). Adicionalmente, se sabe que REP 2107, REP 2055 y REP 2139 están totalmente desprovistos de cualquier actividad inmunoestimulante y su actividad era comparable a la del REP 2006. De igual forma, la secuencia definida de poli-AC (REP 2055 y REP 2148) tenía una actividad comparable a la de la secuencia degenerada (REP 2006 y REP 2107).

Estos resultados demuestran que dentro del contexto de una secuencia degenerada y de secuencias que contienen repeticiones de AC (y por lo tanto también de CA) y otras secuencias que también comprenden repeticiones de nucleótidos de purina y pirimidina alternados (tales como TG y GT o UG y GU) y que comprenden modificaciones en la posición 2' de las ribosas o modificaciones de las bases, o que comprenden tanto la modificación de los 2' de las ribosas y modificaciones de las bases (véase REP 2139 en el ejemplo VI), se esperará que los PAN con fosforotioato sean capaces de bloquear la formación y el transporte intracelular y la secreción de las PSV desde las células infectadas cuando la longitud de los oligonucleótidos esté entre 20 y 120 nucleótidos, tal y como se describe en las patentes de los EE. UU. n.os 8008269, 8008270 y 8067385.

Ejemplo VI: Politerapia para el tratamiento de la hepatitis B crónica en los pacientes humanos

El REP 2055 es una sal de sodio simple de un ON con fosforotioatos (SEQ ID n.° 2). El REP 2139-Ca es el complejo de quelato con calcio del oligonucleótido con fosforotioatos REP 2139 (SEQ ID n.° 18) preparado en solución salina normal con el uso de una relación de 30 mg de CaCl2 por cada 100 mg de oligonucleótido presente. REP 2055 y REP 2139 son PAN y esta familia de compuestos son compuestos antivíricos de amplio espectro eficaces contra los virus con envoltura (Bernstein et al., 2008, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 52: 2727-2733; Cardin et al., 2009, Virology Journal, 6: 214; Guzman et al, 2007, Antiviral Therapy, 12: 1147-1156; Lee et al., 2008, Virology, 372: 107­ 117; Matsumura et al., 2009, Gastroenterology, 137: 673-681; Vaillant et al, 2006, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 50: 1393-1401 y las patentes de los EE. UU. n.os 8008269B, 8008270 y 8067385). Los complejos de quelatos no afectan a la bioactividad de los PAN ni a otras especies de ON y, así pues, la formulación de REP 2139 como complejo de quelato con calcio no tiene ningún efecto sobre su actividad antivírica. La única modificación de PAN requerida para la actividad antivírica es la presencia de fosforotioatos en cada enlace del ON. Otras modificaciones que incluyen modificaciones del 2' de las ribosas (tal como la 2'-O-metilación) y las modificaciones de las bases (tales como 5'-metilcitosina y 4'-tiouracilo) tienen un efecto insignificante sobre la actividad antivírica de los PAN, pero se pueden utilizar para optimizar la tolerancia en los pacientes humanos.

El interferón a-2a PEGilado lo vende Roche Inc. (Basilea, Suiza) con la marca Pegasys™ y está autorizado para tratar la infección crónica del VHB. SciClone Pharmaceuticals (Foster City, California, EE. UU.) vende la timosina a1 con la marca Zadaxin™ y también está autorizada para tratar la infección crónica del VHB en muchos países asiáticos.

Para estudiar si el efecto antivírico del tratamiento con los PAN combinado con inmunoterapia (estimulación de la respuesta inmunitaria adaptativa y la innata) podía mejorar la respuesta antivírica en los pacientes con infección crónica del VHB, los pacientes se sometieron a una monoterapia con REP 2055 y a una politerapia con REP 2139-Ca y timosina a1 (Zadaxin™, administrado como una inyección subcutánea de 1.6 mg dos veces a la semana) o bien el interferón a-2a PEGilado (Pegasys™, administrado como una inyección subcutánea de 180 pg una vez a la semana) en su pauta de PAN en curso.

Tanto REP 2055 como REP 2139-Ca, cuando se utilizaban en monoterapia, eran igualmente activos a la hora de bloquear la liberación del HBsAg, que es el mecanismo de acción terapéutica de todos los PAN contra la infección del VHB en general. REP 2055 y r Ep 2139-Ca, cuando se administraban en pautas de monoterapia comparables, consiguieron la eliminación del HBsAg en el suero de los pacientes infectados con el VHB en 7 de 8 y en 9 de 12 pacientes, respectivamente, y la eliminación del HBsAg en el suero era comparable con ambos fármacos (véase la tabla 5), lo que demuestra que la actividad antivírica de estos PAN es comparable cuando se administran como sales de sodio o como complejos de quelatos.

Tabla 5

El tratamiento basado en interferones conduce típicamente a que el 25 % de los pacientes lleguen a controlar su infección por VHB después de parar el tratamiento (el ADN del VHB en el suero está por debajo de 500 copias/ml; Mourcari et al., 2009, Hepatology 49: 1151-1157) y el tratamiento con timosina a1 se suele considerar que tiene un efecto comparable (Yang et al., 2008, Antiviral Research 77: 136-141).

La monoterapia con REP 2055 hace que se controle la infección del VHB (el ADN del VHB en el suero está por debajo de 500 copias/ml) después de parar el tratamiento en 3 de los 7 pacientes (43 %). El tratamiento con REP 2139-Ca, que tiene el mismo efecto que REP 2055 a la hora de eliminar el HBsAg del suero, cuando se administra en monoterapia) combinado con la timosina a1 o bien con el interferón a-2a PEGilado conduce a la consolidación del control del virus en 8 de los 9 pacientes (89 %) con infección del VHB (véase la tabla 6).

Tabla 6

Logro de la respuesta virológica sostenida (RVS) con monoterapia de PAN o politerapia de PAN e inmunoterapia

Estos resultados demuestran que el efecto combinado de un complejo de quelato de ON antivírico (en este ejemplo, el REP 2139-Ca) y un polipéptido antivírico (en este ejemplo, el interferón a-2a PEGilado o la timosina a1) puede conducir a una mejora del control de la infección del VHB en los pacientes humanos una vez acabado el tratamiento, y además demuestra la utilidad del tratamiento combinado con un complejo de quelato de ON y polipéptido o polipéptido PEGilado en un paciente con una infección vírica.

Serían deseables las composiciones que comprenden un complejo de quelato de ON antivírico y un polipéptido antivírico, ya que mejorarían la respuesta antivírica global de los pacientes con una infección vírica (que incluye la infección del VHB) al aportar ambos agentes a la vez (cuya utilidad se describe en el ejemplo actual).

El quelato de ON antivírico en la composición descrita más arriba puede incluir cualquier ON antivírico que se describa más arriba y, en el caso del VHB, podrá incluir específicamente REP 2055 (SEQ ID n.° 2), REP 2139 (SeQ ID n.° 18), REP 2148 (SEQ ID n.° 11) o cualquier otro compuesto de tipo PAN que bloquee el tránsito de1HBsAg, tal y como se describe más arriba.

El polipéptido de la composición descrita más arriba puede incluir cualquier polipéptido antivírico o polipéptido antivírico PEGilado, y, en el caso del VHB, podía específicamente incluir el interferón a-2b, el interferón a-2b PEGilado, el interferón a-2a PEGilado, la timosina a1, el interferón A1 o el interferón A1 PEGilado.

Se podría notar un efecto beneficioso similar con las politerapias descritas más arriba no solo en la infección del VHB sino también en otras infecciones víricas, tales como la hepatitis C, la gripe, el VRS y otros virus que podrían responder al efecto de un ON antivírico o un polipéptido o polipéptido PEGilado antivírico. Aunque los PAN se utilizan en el presente ejemplo, tales mejoras de los resultados antivíricos en los pacientes humanos se podían conseguir con otros ON antivíricos que actúan mediante mecanismos dependientes de la secuencia formulados como complejos de quelatos cuando se combinan con los polipéptidos o polipéptidos PEGilados antivíricos. Estos efectos serían también eficaces de manera más amplia en otras infecciones víricas con la combinación correcta de complejo de quelato de oligonucleótido antivírico y polipéptido antivírico. Por ejemplo, los PAN son ampliamente activos contra muchos otros virus con envoltura, tales como los de la hepatitis C, la gripe, el virus respiratorio sincitial y el citomegalovirus, y, por lo tanto, los complejos de quelato de PAN, en combinación con el polipéptido antivírico idóneo (que podría ser la timosina a1 o el interferón a-2a PEGilado, pero que podría ser también otro polipéptido antivírico mejor adaptado a una infección vírica en concreto) se esperaría que produjese una respuesta antivírica mucho mejor en el sujeto infectado que con cada compuesto en monoterapia. En otro ejemplo, el complejo de quelato de miravirsén (SEQ ID n.° 7) se podría combinar con un interferón (PEGilado o no) para mejorar la respuesta antivírica en los pacientes con infección de hepatitis C.

Los efectos beneficiosos demostrados con los complejos de quelato de PAN y la timosina a1 o el interferón a-2a PEGilado también se esperaría que se produjesen con complejos de quelato de ON de otras clases de oligonucleótidos, tales como antisentido o siRNA o miRNA u ON aptaméricos desarrollados contra una infección vírica en concreto u oligonucleótidos inmunoestimulantes. Por lo tanto, el método donde se combina un complejo de quelato de ON derivado de cualquiera de estas clases de ON con un polipéptido antivírico adecuado se esperaría que tuviera uso terapéutico en una amplia variedad de infecciones víricas que se sabe que responden al oligonucleótido antivírico (como una sal de sodio o bien como un complejo de quelato) o al polipéptido o polipéptido PEGilado antivírico en monoterapia.

En vista de los ejemplos de más arriba, ahora se podría contemplar que dos o más complejos de quelato de ON antivírico (p. ej., que contienen un PAN y un ON antisentido o que contienen un NAP y un siRNA antivírico) se podían combinar con uno o más polipéptidos o polipéptidos PEGilados antivíricos (p. ej., el interferón a-2a PEGilado y la timosina a1 o la timosina a1 y el interferón A1 PEGilado), bien en la misma formulación o en varias formulaciones para administrar a través de la misma vía u otras vías diferentes.

En el ejemplo de más arriba, el REP 2139-Ca se administró por infusión intravenosa y el interferón a-2a PEGilado o la timosina a1 se administraron por vía subcutánea. Basándose en las enseñanzas del ejemplo de más arriba, el experto en la técnica sería capaz ahora de predecir con facilidad que el complejo de quelato de ON y el polipéptido se podía dar simultáneamente en la misma formulación (tal como las que se han descrito en los ejemplos 3 y 4 de más arriba) mediante la inyección subcutánea o bien la infusión intravenosa, y se podría predecir que tienen el mismo efecto beneficioso que cuando se administra cualquiera de los agentes por separado (bien por la misma vía o por diferentes vías de administración).

Los efectos beneficiosos de la politerapia tal y como se describe en la presente memoria con un complejo de quelato de ON y un polipéptido o polipéptido PEGilado antivírico en el contexto antivírico tal y como se describe en la presente memoria predice de manera clara que serán similares los efectos beneficiosos de la politerapia con quelatos de ON y polipéptidos o polipéptidos PEGilados en el contexto terapéutico donde ambos agentes tienen algo de actividad en monoterapia. Por ejemplo, un ON antisentido que actúa selectivamente sobre un gen implicado en un cáncer (que, por lo tanto, tiene actividad antineoplásica) se podía formular como un complejo de quelato de ON tal y como se describe en la presente memoria y se podía combinar además con un agente inmunoterápico que se sabe que tiene algo de actividad antineoplásica cuando se utiliza normalmente en monoterapia. Tales contextos terapéuticos podían incluir el cáncer, la esclerosis múltiple y la enfermedad de Alzheimer.

Claims (9)

REIVINDICACIONES

1. Una composición farmacéutica que comprende un complejo de quelato de oligonucleótido (ON) antivírico, que consiste en dos o más ON antivíricos conectados intermolecularmente por un catión divalente, en donde los dos o más ON antivíricos son polímeros de ácido nucleico (PAN) monocatenarios con fosforotioatos seleccionados de SEQ ID n.° 18 o SEQ ID n.° 11 y al menos un polipéptido antivírico seleccionado del grupo que consiste en el interferón a-2a PEGilado y la timosina a1 sintética,

y en donde la composición farmacéutica está formulada para la administración subcutánea o para la infusión intravenosa.

2. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho catión metálico divalente es un metal alcalinotérreo, un metal de transición, un metal lantánido o un metal de postransición con un estado de carga de 2+.

3. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde dicho catión metálico divalente es calcio, magnesio, hierro (2+), manganeso, cobre o zinc.

4. La composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que además comprende uno o más de los siguientes: entecavir, tenofovir, telbuvidina, adefovir, lamivudina, ribavirina, telaprevir, boceprevir, GS-7977, tegobuvir, zanamivir, oseltamivir, ganciclovir, foscarnet, aciclovir, zidovudina, abacavir, lopinavir, ritonavir o efavirenz.

5. La composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que además comprende una sustancia de arrastre.

6. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende

a) un complejo de quelato de ON que comprende un oligonucleótido que consiste en la SEQ ID n.° 18, y el interferón a-2a PEGilado,

b) un complejo de quelato de ON que comprende un oligonucleótido que consiste en la SEQ ID n.° 11, y el interferón a-2a PEGilado,

c) un complejo de quelato de ON que comprende un oligonucleótido que consiste en la SEQ ID n.° 18, y la timosina a1 sintética, o

d) un complejo de quelato de ON que comprende un oligonucleótido que consiste en la SEQ ID n.° 11, y la timosina a1 sintética.

7. Una composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para ser utilizada en tratamientos.

8. Una composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para ser utilizada en un método para tratar una infección vírica.

9. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dos o más ON antivíricos son polímeros de ácido nucleico (PAN) monocatenarios con fosforotioatos de SEQ ID n.° 18, y al menos un polipéptido antivírico seleccionado del grupo que consiste en el interferón a-2a PEGilado y la timosina a1 sintética, para ser usada en un método para tratar la hepatitis B.