JP2015517504A - オリゴヌクレオチドキレート錯体−ポリペプチド組成物および方法 - Google Patents

Abstract

オリゴヌクレオチドキレート錯体と、少なくとも１つのポリペプチドまたはペグ化ポリペプチドとを含む医薬組成物を開示する。本開示は、さらに、ウイルス感染を含む疾患を治療するためのさらなる医薬組成物および方法も記載する。【選択図】図８８

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１２年８月３０日に出願された米国仮出願番号第６１／６９５，０３５号および２０１２年５月１８日に出願された米国仮出願番号第６１／６４８，７１１号からの優先権を主張し、その内容全体が、本明細書に参照により組み込まれる。

（技術分野）
本記載は、オリゴヌクレオチド（ＯＮ）キレート錯体と、１つ以上の異なるポリペプチドまたはペグ化ポリペプチドとを含む組成物、ＯＮキレート錯体と、１つ以上の異なるポリペプチドまたはペグ化ポリペプチドとを含む組成物を調製する方法、および前記組成物を用いて異なる疾患を治療する方法に関する。

オリゴヌクレオチド（ＯＮ）キレート錯体は、二価または他の多価の金属カチオンによって分子間で接続した２つ以上のＯＮである。ＯＮキレート錯体は、これらの化合物の投与に関連する副作用の原因となり得るＯＮ固有のキレート化特性を無効化する。ＯＮキレート錯体の投与は、キレート化されていないＯＮの投与に関連する副作用を軽減する、ＯＮを被検体に投与する新しい方法である。これらの副作用としては、静脈点滴に伴う振戦、発熱および悪寒、または皮下投与の注射部位での硬結、炎症および疼痛が挙げられるだろう。さらに、ＯＮをキレート化した錯体として調製することによって、その薬物動態挙動が向上することがあり、キレート化されていないＯＮと比較して、同様の投薬量で向上した治療性能を与える。ＯＮキレート錯体の特徴および特性は、その全体が本明細書に本明細書に参照により組み込まれる国際出願公開第ＷＯ ２０１２／０２１９８５号および米国特許出願公開第２０１２／００４６３４８号に既に記載されている。

ＯＮキレート錯体は、単純なナトリウム塩として投与するとき、ＯＮの生化学的活性に影響を与えることなく副作用が低下したＯＮを投与する改良された方法を提供する。

配列依存性の機構または配列非依存性機構によって作用するＯＮを含むＯＮキレート錯体は、ある疾患状態に治療効果を有し得るが、ＯＮキレート錯体での治療を受けている罹患した被検体に最適な治療結果を与えない場合がある。

従って、当該技術分野において、ＯＮキレート錯体を、例えば、組み合わせた製剤に含む改良された新規組成物を提供することが必要とされている。

配列依存性の機構または配列非依存性機構によって作用する抗ウイルスＯＮを含む抗ウイルスＯＮキレート錯体は、異なるウイルス感染に対して抗ウイルス効果を有し得る。これらの抗ウイルスの効果は、ＯＮキレートを用いた治療を受け、既にウイルスに感染している被検体において、最適な治療結果を与えない場合がある。さらに改善された治療結果は、抗ウイルスＯＮキレート錯体と、既知の抗ウイルス活性を有するポリペプチド系免疫療法の同時使用によって達成されるだろう。

従って、当該技術分野において、抗ウイルスＯＮキレート錯体と、抗ウイルスポリペプチドまたはペグ化ポリペプチドとを組み合わせて含む新規組成物を提供する必要がある。理想的には、抗ウイルスポリペプチドは、問題としている抗ウイルスＯＮキレートと同じ標的／生化学的経路に影響を与えることによって、または抗ウイルスＯＮキレート錯体によって影響を受けるものとは別個の標的／生化学的経路に影響を与えることによって、問題としているウイルス感染に対する活性も有しているであろう。

本記載によれば、ＯＮキレート錯体と、１つ以上の異なるポリペプチドとを含む医薬組成物を提供する。

本記載によれば、抗ウイルスＯＮキレート錯体と、１つ以上の抗ウイルスポリペプチドまたはペグ化ポリペプチドとを含む抗ウイルス医薬組成物を提供する。

ＯＮキレート錯体と、ポリペプチドとを含む医薬組成物を、治療を必要とする被検体に投与する工程を含む、ある疾患状態を治療する方法を開示する。

第１の組成物がＯＮキレート錯体を含み、第２の組成物がポリペプチドを含む別個の医薬組成物を、同じ投与経路または異なる投与経路によって、治療が必要な被検体に投与する工程を含む、ある疾患状態を治療する方法を開示する。

抗ウイルスＯＮキレートと、抗ウイルスポリペプチドとを含む医薬組成物を、治療が必要な被検体に投与する工程を含む、ウイルス感染を治療する方法を開示する。

片方の組成物が抗ウイルスＯＮキレート錯体を含み、他方の組成物が抗ウイルスポリペプチドを含む別個の医薬組成物を、同じ投与経路または異なる投与経路によって、治療が必要な被検体に投与する工程を含む、ある疾患状態を治療する方法を開示する。

同じ投与経路または異なる投与経路を用い、同じ医薬組成物または異なる医薬組成物で抗ウイルスＯＮキレート錯体および抗ウイルスポリペプチドを投与する工程を含む、ウイルス感染を治療する方法を開示する。

ある疾患を治療するためのＯＮキレート錯体とポリペプチドとを含む医薬組成物の使用を開示する。

ある疾患を治療するための医薬の製造におけるＯＮキレート錯体とポリペプチドとを含む医薬組成物の使用を開示する。

同じまたは異なる投与経路のために製剤化された、ＯＮキレート錯体を含む第１の医薬組成物と、ある疾患状態を治療するためのポリペプチドを含む第２の医薬組成物の使用を開示する。

ウイルス感染を治療するための抗ウイルスＯＮキレートと抗ウイルスポリペプチドとを含む医薬組成物の使用を開示する。

ウイルス感染を治療するための医薬の製造における抗ウイルスＯＮキレートと抗ウイルスポリペプチドとを含む医薬組成物の使用を開示する。

ウイルス感染を治療するために、同じまたは異なる経路による別個の投与のために製剤化された、片方が抗ウイルスＯＮキレートを含み、他方が抗ウイルスポリペプチドを含む医薬組成物（ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ）の使用を開示する。

ウイルス感染を治療するために、同じまたは異なる投与経路のために同じ医薬組成物または異なる医薬組成物に製剤化された、抗ウイルスＯＮキレート錯体および抗ウイルスポリペプチドの使用を開示する。

二価カチオンによって分子間で接続した２つ以上のＯＮからなるオリゴヌクレオチド（ＯＮ）キレート錯体と、少なくとも１つのポリペプチドとを含む、医薬組成物を提供する。

二価カチオンによって分子間で接続した２つ以上の抗ウイルスＯＮからなる抗ウイルスＯＮキレート錯体と、少なくとも１つの抗ウイルスポリペプチドとを含む、医薬組成物を提供する。

一実施形態では、抗ウイルスポリペプチドは、さらにペグ化されている。

別の実施形態では、二価カチオンは、２＋の電荷状態を有するアルカリ土類金属である。

別の実施形態では、二価金属カチオンは、２＋の電荷状態を有する遷移金属である。

別の実施形態では、二価金属カチオンは、２＋の電荷状態を有するランタニド金属である。

別の実施形態では、二価金属カチオンは、２＋の電荷状態を有する後遷移金属である。

別の実施形態では、二価金属カチオンはカルシウムである。

別の実施形態では、二価金属カチオンはマグネシウムである。

別の実施形態では、二価金属カチオンは、鉄（２＋）、マンガン、銅または亜鉛である。

別の実施形態では、二価カチオンは、２種類以上の異なる二価金属カチオンで構成される。

別の実施形態では、二価カチオンは、カルシウムおよびマグネシウムで構成される。

別の実施形態では、ＯＮキレート錯体は、少なくとも１つの二本鎖ＯＮを含む。

別の実施形態では、ＯＮキレート錯体は、少なくとも１つのホスホロチオエート結合を有する少なくとも１つのＯＮを含む。

別の実施形態では、ＯＮキレート錯体は、少なくとも１つの完全にホスホロチオエート化されたＯＮを含む。

別の実施形態では、ＯＮキレート錯体は、１つの２’位が修飾されたリボースを有する少なくとも１つのＯＮを含む。

別の実施形態では、ＯＮキレート錯体は、それぞれのリボースの２’位がＯ−メチル化されている少なくとも１つのＯＮを含む。

別の実施形態では、ＯＮキレート錯体は、少なくとも１つの５’メチルシトシンを含む少なくとも１つのＯＮを含む。

別の実施形態では、ＯＮキレート錯体は、各シトシンがさらに５’メチルシトシンである少なくとも１つのＯＮを含む。

別の実施形態では、ＯＮキレート錯体は、配列番号１〜６および１０〜１８から選択されるオリゴヌクレオチドを含む。

別の実施形態では、ＯＮキレート錯体は、配列番号７〜９から選択されるオリゴヌクレオチドを含む。

別の実施形態では、ポリペプチドは、以下
チモシンα１；
任意のα−インターフェロンまたはそのペグ化誘導体；
任意のβ−インターフェロンまたはそのペグ化誘導体；
任意のγ−インターフェロンまたはそのペグ化誘導体；
任意のλ−インターフェロンまたはそのペグ化誘導体；
インターフェロンα−２ａ、α−２ｂまたはα−Ｎ３；
インターフェロンβ−１ａまたはβ−１ｂ；
インターフェロンγ−１ｂ；
インターフェロンλ１、λ２またはλ３；
ペグ化インターフェロンα−２ａ、α−２ｂ、λ１、λ２またはλ３；
Ｍｙｒｃｌｕｄｅｘ Ｂ；
任意の抗ウイルスサイトカインまたはそのペグ化誘導体；
胸腺タンパク質Ａ；および
抗ウイルス活性または免疫刺激活性を有することが示されている任意のポリペプチド
の少なくとも１つである。

別の実施形態では、医薬組成物は、皮下投与のために製剤化される。

別の実施形態では、医薬組成物は、静脈点滴のために製剤化される。

別の実施形態では、医薬組成物は、エアロゾル吸入、眼内、経口摂取、腸内、筋肉注射、腹腔内注射、髄腔内注射、髄腔内注入、気管内、静脈注射および局所投与のような投与経路のうち、少なくとも１つの投与のために製剤化される。

別の実施形態では、ＯＮキレート錯体は、配列番号２からなる少なくとも１つのＯＮを含む。

別の実施形態では、ＯＮキレート錯体は、配列番号１１からなる少なくとも１つのＯＮを含む。

別の実施形態では、ＯＮキレート錯体は、配列番号１８からなる少なくとも１つのＯＮを含む。

別の実施形態では、医薬組成物は、エンテカビル、フマル酸テノホビルジソプロキシル、テルビブジン、アデホビルジピボキシル、ラミブジン、リバビリン、テラプレビル、ボセプレビル、ＧＳ−７９７７、テゴブビル、ザナミビル、オセルタミビル、ガンシクロビル、ホスカルネット、アシクロビル、ジドブジン、アバカビル、ロピナビル、リトナビルまたはエファビレンツのうち１つ以上をさらに含む。

別の実施形態では、医薬組成物は、担体をさらに含む。

配列番号３からなるオリゴヌクレオチドを含むＯＮキレート錯体と、ペグ化インターフェロンα−２ａとを含む、医薬組成物を提供する。

配列番号１８からなるオリゴヌクレオチドを含むＯＮキレート錯体と、ペグ化インターフェロンα−２ａとを含む、医薬組成物を提供する。

配列番号１１からなるオリゴヌクレオチドを含むＯＮキレート錯体と、ペグ化インターフェロンα−２ａとを含む、医薬組成物を提供する。

配列番号３からなるオリゴヌクレオチドを含むＯＮキレート錯体と、チモシンα１とを含む、医薬組成物を提供する。

配列番号１８からなるオリゴヌクレオチドを含むＯＮキレート錯体と、チモシンα１とを含む、医薬組成物を提供する。

配列番号１１からなるオリゴヌクレオチドを含むＯＮキレート錯体と、チモシンα１とを含む、医薬組成物を提供する。

配列番号３からなるオリゴヌクレオチドを含むＯＮキレート錯体と、インターフェロンα−２ｂとを含む、医薬組成物を提供する。

配列番号１８からなるオリゴヌクレオチドを含むＯＮキレート錯体と、インターフェロンα−２ｂとを含む、医薬組成物を提供する。

配列番号１１からなるオリゴヌクレオチドを含むＯＮキレート錯体と、インターフェロンα−２ｂとを含む、医薬組成物を提供する。

配列番号３からなるオリゴヌクレオチドを含むＯＮキレート錯体と、ペグ化チモシンα１とを含む、医薬組成物を提供する。

配列番号１８からなるオリゴヌクレオチドを含むＯＮキレート錯体と、ペグ化チモシンα１とを含む、医薬組成物を提供する。

配列番号１１からなるオリゴヌクレオチドを含むＯＮキレート錯体と、ペグ化チモシンα１とを含む、医薬組成物を提供する。

配列番号３からなるオリゴヌクレオチドを含むＯＮキレート錯体と、ペグ化インターフェロンα−２ｂとを含む、医薬組成物を提供する。

配列番号１８からなるオリゴヌクレオチドを含むＯＮキレート錯体と、ペグ化インターフェロンα−２ｂとを含む、医薬組成物を提供する。

配列番号１１からなるオリゴヌクレオチドを含むＯＮキレート錯体と、ペグ化インターフェロンα−２ｂとを含む、医薬組成物が存在する。

配列番号３からなるオリゴヌクレオチドを含むＯＮキレート錯体と、インターフェロンλ１とを含む、医薬組成物を提供する。

配列番号１８からなるオリゴヌクレオチドを含むＯＮキレート錯体と、インターフェロンλ１とを含む、医薬組成物が存在する。

配列番号１１からなるオリゴヌクレオチドを含むＯＮキレート錯体と、インターフェロンλ１とを含む、医薬組成物を提供する。

配列番号３からなるオリゴヌクレオチドを含むＯＮキレート錯体と、ペグ化インターフェロンλ１とを含む、医薬組成物が存在する。

配列番号１８からなるオリゴヌクレオチドを含むＯＮキレート錯体と、ペグ化インターフェロンλ１とを含む、医薬組成物を提供する。

配列番号１１からなるオリゴヌクレオチドを含むＯＮキレート錯体と、ペグ化インターフェロンλ１とを含む、医薬組成物を提供する。

本明細書に記載の医薬組成物を調製するための方法であって、この方法は、
ａ．医薬的に許容され得る水性賦形剤に少なくとも１つのオリゴヌクレオチド（ＯＮ）ナトリウム塩を溶解することと；
ｂ．ＯＮキレート錯体が可溶性のままであるように、溶解したＯＮに、医薬的に許容され得る二価の金属塩溶液を徐々に加えることと；
ｃ．相溶性の医薬的に許容され得る水性賦形剤に１つ以上の抗ウイルスポリペプチドを溶解することと；
ｄ．前記ＯＮキレート錯体および抗ウイルスポリペプチドの溶解性が保持されるように、抗ウイルスポリペプチド溶液とＯＮキレート錯体溶液とを徐々に混合することとを含む、方法を提供する。

さらに、本明細書に記載の医薬組成物を調製するための方法であって、この方法は、
ａ．医薬的に許容され得る水性賦形剤に少なくとも１つのオリゴヌクレオチド（ＯＮ）ナトリウム塩を溶解することと；
ｂ．ＯＮキレート錯体が可溶性のままであるように、溶解したＯＮに、医薬的に許容され得るカルシウムおよび／またはマグネシウム塩溶液のうち少なくとも１つを徐々に加えることと；
ｃ．相溶性の医薬的に許容され得る水性賦形剤に１つ以上の抗ウイルスポリペプチドを溶解することと；
ｄ．前記ＯＮキレート錯体および抗ウイルスポリペプチドの溶解性が保持されるように、抗ウイルスポリペプチド溶液とＯＮキレート錯体溶液とを徐々に混合することとを含む、方法も提供する。

一実施形態では、医薬組成物を投与する直前に、ＯＮキレート錯体溶液とポリペプチド溶液とを混ぜ合わせる。

別の実施形態では、溶解したＯＮに加えられる二価金属塩の比率は、オリゴヌクレオチド１００ｍｇあたり、０．１〜５０ｍｇである。

別の実施形態では、最終的なＯＮ濃度が０．１〜２００ｍｇ／ｍｌである。

別の実施形態では、二価金属塩は、塩化物塩、グルコン酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、リンゴ酸塩、アスパラギン酸塩、フマル酸塩、アスコルビン酸塩、安息香酸塩、エリソルビン酸塩、プロピオン酸塩、硫酸塩または炭酸水素酸塩のうち、少なくとも１つである。

別の実施形態では、二価金属塩溶液は、カルシウム、マグネシウム、鉄（２＋）、マンガン、銅または亜鉛のうち少なくとも１つを含む。

本明細書に記載するような医薬組成物を含むキットを提供する。

一実施形態では、ＯＮキレート錯体と、少なくとも１つのポリペプチドとが別個に製剤化される。

別の実施形態では、ＯＮキレート錯体と、少なくとも１つのポリペプチドとが、同じまたは異なる投与経路によって同時投与するために製剤化される。

ここで、添付の図面を参照する。

図１は、ＯＮの一般的な物理化学的特徴を示す。（Ａ）高速液体クロマトグラフィーによる、ＲＥＰ ２００６および確定した配列を有する２１マーのホスホロチオエートＯＮの同時分離。（Ｂ）質量分析計による２１マーＯＮ中の種類の特定。（Ｃ）質量分析計によるＲＥＰ ２００６のＯＮ中の種類の特定。 図２Ａは、ＯＮ配列に依存しないＯＮの一般的な化学的特徴を示す。その配列にかかわらず、任意のＯＮは、疎水性および親水性の活性を両方とも有するポリマーとして存在する。ホスホロチオエート化（この図の化学構造で示される）は、ＯＮポリマーの疎水性を高めるのに役立つが親水性には影響を与えない。 図２Ｂは、二価金属カチオンおよび三価金属カチオンのＯＮキレート化の性質を概念化したものである。金属カチオン（灰色の丸であらわされる）は、ホスホジエステル結合中の２個または３個の架橋していない酸素原子または硫黄原子の間の金属イオン架橋（楕円であらわされる）を介し、ＯＮポリマーの親水性表面を接続する。 図３は、さまざまなＯＮ濃度および二価金属カチオン濃度で、二価金属カチオンまたは多価金属カチオンが存在する状態でＯＮの溶液挙動のモデルを示す。（Ａ）低濃度の二価／三価の金属カチオン、低濃度のＯＮでは、ダイマーが得られるか、または結合部位が少ないＯＮキレート錯体が得られる。（Ｂ）二価／三価の金属カチオン濃度を高めると、溶液中にもっと多くの完全なＯＮキレート錯体が生成する。（Ｃ）二価または三価の金属が存在する状態で、ＯＮ濃度をさらに上げると、金属濃度を上げていくにつれて、もっと結合部位が多いＯＮキレート錯体を得ることができる。（Ａ）〜（Ｃ）のすべてのキレート錯体は、親水性表面が水性環境に露出していることによって、水溶液に可溶性であり、そのため、溶解度が維持される。（Ｄ）十分なＯＮ濃度および金属濃度では、すべての親水性表面がＯＮキレート錯体内に封じ込められ、水性環境に疎水性表面のみが露出している。これにより、ＯＮキレート錯体が沈殿する。 図４は、蛍光性ＯＮキレート錯体の溶液挙動が蛍光偏光に及ぼす影響を示す。金属濃度を上げていくと、ＯＮキレート錯体作成の大きさ（および質量）も大きくなり（図３を参照）、従って、溶液中でさらにゆっくりと回転する。溶液中で錯体がこのようにゆっくりと回転すると、蛍光偏光が大きくなり、ｍＰ値が大きくなる。 図５は、実施例ＩＶに示すようなオリゴ方法を用いたＲＥＰ ２０５５カルシウムキレート／インターフェロンα−２ｂ組成物のＨＰＬＣ分離を示す。全長ＯＮピーク（大きな矢印）は、不完全な合成の少量生成物（小さな矢印）がクロマトグラムの前側に存在し、典型的には、全長ＯＮ配列と比較して、１つ以上のヌクレオチドが失われた配列を有するＯＮである。このＨＰＬＣプロフィールは、使用したすべての精製していないＯＮ（ＲＥＰ ２０５５、ＲＥＰ ２０５７およびＲＥＰ ２１４８）に典型的である。 図６は、図５の１６．７０分のＨＰＬＣピークからのＲＥＰ ２０５５カルシウムキレート／インターフェロンα−２ｂ組成物中のオリゴヌクレオチド含有量のＥＳＩ−ＭＳ分析を示す。主な種について観察された質量は１２６１２．２Ｄａであり、ＲＥＰ ２０５５であると特定されている（予想される分子量＝１２６１２．５）。 図７は、タンパク質方法１を用いたＲＥＰ ２０５５カルシウムキレート／インターフェロンα−２ｂ組成物のＨＰＬＣ分離を示す（実施例ＩＶを参照）。 図８は、図７の１１．０３分のＨＰＬＣピークからのＲＥＰ ２０５５カルシウムキレート／インターフェロンα−２ｂ組成物中のペプチド含有量のＥＳＩ−ＭＳ分析を示す。１９２６３Ｄａに観察された質量ピークはインターフェロンα−２ｂに対応し（予想される分子量＝１９２７１Ｄａ）、６６５６０Ｄａでのピークは、ヒトアルブミンに対応する。 図９は、本明細書に記載するオリゴ方法を用いたＲＥＰ ２０５７カルシウムキレート／インターフェロンα−２ｂ組成物のＨＰＬＣ分離を示す（実施例ＩＶを参照）。図５と同様に、不完全な合成の少量生成物が全長ＲＥＰ ２０５７配列の主要なピークより前側に存在する。 図１０は、図９の１５．４６分のＨＰＬＣピークからのＲＥＰ ２０５７カルシウムキレート／インターフェロンα−２ｂ組成物中のオリゴヌクレオチド含有量のＥＳＩ−ＭＳ分析を示す。主な種について観察された質量は１３４１３．５Ｄａであり、ＲＥＰ ２０５７であると特定されている（予想される分子量＝１３４１３．３）。 図１１は、本明細書に記載するタンパク質方法１を用いたＲＥＰ ２０５７カルシウムキレート／インターフェロンα−２ｂ組成物のＨＰＬＣ分離を示す（実施例ＩＶを参照）。 図１２は、図１１の１１．４３分のＨＰＬＣピークからのＲＥＰ ２０５７カルシウムキレート／インターフェロンα−２ｂ組成物中のペプチド含有量のＥＳＩ−ＭＳ分析を示す。１９２６４Ｄａで観察される質量ピークは、インターフェロンα−２ｂに対応し（予想される分子量＝１９２７１Ｄａ）、６６６１８Ｄａでのピークは、ヒトアルブミンに対応する。 図１３は、本明細書に記載するオリゴ方法を用いたＲＥＰ ２１３９カルシウムキレート／インターフェロンα−２ｂ組成物のＨＰＬＣ分離を示す（実施例ＩＶを参照）。不完全な合成生成物はみられない。 図１４は、図１３の１９．１１のＨＰＬＣピークからのＲＥＰ ２１３９カルシウムキレート／インターフェロンα−２ｂ組成物中のオリゴヌクレオチド含有量のＥＳＩ−ＭＳ分析を示す。主な種について観察された質量は１４０９５．３Ｄａであり、ＲＥＰ ２１３９であると特定されている（予想される分子量＝１４０９４．６）。 図１５は、本明細書に記載するタンパク質方法１を用いたＲＥＰ ２１３９カルシウムキレート／インターフェロンα−２ｂ組成物のＨＰＬＣ分離を示す（実施例ＩＶを参照）。 図１６は、図１５の１１．１２分のＨＰＬＣピークからのＲＥＰ ２１３９カルシウムキレート／インターフェロンα−２ｂ組成物中のペプチド含有量のＥＳＩ−ＭＳ分析を示す。１９２６４Ｄａに観察される質量ピークは、インターフェロンα−２ｂに対応し（予測される質量＝１９２７１Ｄａ）、６６６７４Ｄａでのピークは、ヒトアルブミンに対応する。 図１７は、本明細書に記載するオリゴ方法を用いたＲＥＰ ２１４８カルシウムキレート／インターフェロンα−２ｂ組成物のＨＰＬＣ分離を示す（実施例ＩＶを参照）。不完全な合成の少量生成物が全長ＲＥＰ ２１４８配列の主要なピークより前側に存在する。 図１８は、図１７の１５．３４分のＨＰＬＣピークからのＲＥＰ ２１４８カルシウムキレート／インターフェロンα−２ｂ組成物中のオリゴヌクレオチド含有量のＥＳＩ−ＭＳ分析を示す。主な種について観察された質量は１２８９１．６Ｄａであり、ＲＥＰ ２１４８であると特定されている（予想される分子量＝１２８９３．６）。 図１９は、本明細書に記載するタンパク質方法１を用いたＲＥＰ ２１４８カルシウムキレート／インターフェロンα−２ｂ組成物のＨＰＬＣ分離を示す（実施例ＩＶを参照）。 図２０は、図１９の８．４４分のＨＰＬＣピークからのＲＥＰ ２１４８カルシウムキレート／インターフェロンα−２ｂ組成物中のペプチド含有量のＥＳＩ−ＭＳ分析を示す。１９２６５Ｄａで観察された質量ピークは、インターフェロンα−２ｂに対応する。 図２１は、本明細書に記載するオリゴ方法を用いたＲＥＰ ２００６カルシウムキレート／チモシンα１組成物のＨＰＬＣ分離を示す（実施例ＩＶを参照）。６．３１分に溶出するピークは、チモシンα１（白色の矢印）に対応し、１５．１５分に溶出するピークは、全長ＲＥＰ ２００６（黒色の矢印）に対応する。 図２２は、図２１の１５．１５分のＨＰＬＣピークからのＲＥＰ ２００６カルシウムキレート／チモシンα１組成物中のオリゴヌクレオチド含有量のＥＳＩ−ＭＳ分析を示す。観察された質量は約１２６５０〜１３１５０Ｄａであり、これがＲＥＰ ２００６であると特定されている（予想される分子量＝１２６１２〜１３０９２Ｄａ）。 図２３は、図２１の６．３１分のＨＰＬＣピークからのＲＥＰ ２００６カルシウムキレート／チモシンα１組成物中のペプチド含有量のＥＳＩ−ＭＳ分析を示す。主な種について観察された質量は３１０８Ｄａであり、チモシンα１であると特定されている（予想される分子量＝３１０８Ｄａ）。 図２４は、本明細書に記載するオリゴ方法を用いたＲＥＰ ２０５５カルシウムキレート／チモシンα１組成物のＨＰＬＣ分離を示す（実施例ＩＶを参照）。６．１２分に溶出するピークは、チモシンα１（白色の矢印）に対応し、１６．７０分に溶出するピークは、全長ＲＥＰ ２０５５（黒色の矢印）に対応する。 図２５は、図２４の１６．７０分のＨＰＬＣピークからのＲＥＰ ２０５５カルシウムキレート／チモシンα１組成物中のオリゴヌクレオチド含有量のＥＳＩ−ＭＳ分析を示す。主な種について観察された質量は１２６１２．１Ｄａであり、ＲＥＰ ２０５５であると特定されている（予想される分子量＝１２６１２．５）。 図２６は、図２４の６．１２分のＨＰＬＣピークからのＲＥＰ ２０５５カルシウムキレート／チモシンα１組成物中のペプチド含有量のＥＳＩ−ＭＳ分析を示す。主な種について観察された質量は３１０７．６Ｄａであり、チモシンα１であると特定されている（予想される分子量＝３１０８Ｄａ）。 図２７は、本明細書に記載するオリゴ方法を用いたＲＥＰ ２０５７カルシウムキレート／チモシンα１組成物のＨＰＬＣ分離を示す（実施例ＩＶを参照）。６．１８分に溶出するピークは、チモシンα１（白色の矢印）に対応し、１５．４７分に溶出するピークは、全長ＲＥＰ ２０５７（黒色の矢印）に対応する。 図２８は、図２７の１５．４７分のＨＰＬＣピークからのＲＥＰ ２０５７カルシウムキレート／チモシンα１組成物中のオリゴヌクレオチド含有量のＥＳＩ−ＭＳ分析を示す。主な種について観察された質量は１３４１３．５Ｄａであり、ＲＥＰ ２０５７であると特定されている（予想される分子量＝１３４１３．３Ｄａ）。 図２９は、図２７の６．１８分のＨＰＬＣピークからのＲＥＰ ２０５７カルシウムキレート／チモシンα１組成物中のペプチド含有量のＥＳＩ−ＭＳ分析を示す。主な種について観察された質量は３１０７．６Ｄａであり、チモシンα１であると特定されている（予想される分子量＝３１０８Ｄａ）。 図３０は、本明細書に記載するオリゴ方法を用いたＲＥＰ ２１３９カルシウムキレート／チモシンα１組成物のＨＰＬＣ分離を示す（実施例ＩＶを参照）。６．１３分に溶出するピークは、チモシンα１（白色の矢印）に対応し、１９．０１分に溶出するピークは、全長ＲＥＰ ２１３９（黒色の矢印）に対応する。 図３１は、図３０の１９．０１分のＨＰＬＣピークからのＲＥＰ ２１３９カルシウムキレート／チモシンα１組成物中のオリゴヌクレオチド含有量のＥＳＩ−ＭＳ分析を示す。主な種について観察された質量は１４０９４．５Ｄａであり、ＲＥＰ ２１３９であると特定されている（予想される分子量＝１４０９４．６）。 図３２は、図３０の６．１３分のＨＰＬＣピークからのＲＥＰ ２１３９カルシウムキレート／チモシンα１組成物中のペプチド含有量のＥＳＩ−ＭＳ分析を示す。主な種について観察された質量は３１０７．６Ｄａであり、チモシンα１であると特定されている（予想される分子量＝３１０８Ｄａ）。 図３３は、本明細書に記載するオリゴ方法を用いたＲＥＰ ２１４８カルシウムキレート／チモシンα１組成物のＨＰＬＣ分離を示す（実施例ＩＶを参照）。６．２８分に溶出するピークは、チモシンα１（白色の矢印）に対応し、１５．１９分に溶出するピークは、全長ＲＥＰ ２１４８（黒色の矢印）に対応する。 図３４は、図３３の１５．１９分のＨＰＬＣピークからのＲＥＰ ２１４８カルシウムキレート／チモシンα１組成物中のオリゴヌクレオチド含有量のＥＳＩ−ＭＳ分析を示す。主な種について観察された質量は１２８９２Ｄａであり、ＲＥＰ ２１４８であると特定されている（予想される分子量＝１２８９３Ｄａ）。 図３５は、図３３の６．２８分のＨＰＬＣピークからのＲＥＰ ２１４８カルシウムキレート／チモシンα１組成物中のペプチド含有量のＥＳＩ−ＭＳ分析を示す。主な種について観察された質量は３１０７．３Ｄａであり、チモシンα１であると特定されている（予想される分子量＝３１０８Ｄａ）。 図３６は、本明細書に記載するオリゴ方法を用いたＲＥＰ ２００６カルシウムキレート／ペグ化インターフェロンα−２ａ組成物のＨＰＬＣ分離を示す（実施例ＩＶを参照）。 図３７は、図３６の１４．５９分のＨＰＬＣピークからのＲＥＰ ２００６カルシウムキレート／ペグ化インターフェロンα−２ａ組成物中のオリゴヌクレオチド含有量のＥＳＩ−ＭＳ分析を示す。主な種について観察された質量は約１２６００〜１３２００Ｄａであり、ＲＥＰ ２００６であると特定されている（予想される分子量＝１２６１２〜１３０９２Ｄａ）。 図３８は、本明細書に記載するタンパク質方法２を用いたＲＥＰ ２００６カルシウムキレート／ペグ化インターフェロンα−２ａ組成物のＨＰＬＣ分離を示す（実施例ＩＶを参照）。 図３９は、図３８の１３．２１分のＨＰＬＣピークからのＲＥＰ ２００６カルシウムキレート／ペグ化インターフェロンα−２ａ組成物中のペプチド含有量のＥＳＩ−ＭＳ分析を示す。 図４０は、本明細書に記載するオリゴ方法を用いたＲＥＰ ２０５５カルシウムキレート／ペグ化インターフェロンα−２ａ組成物のＨＰＬＣ分離を示す（実施例ＩＶを参照）。 図４１は、図４０の１６．７１分のＨＰＬＣピークからのＲＥＰ ２０５５カルシウムキレート／ペグ化インターフェロンα−２ａ組成物中のオリゴヌクレオチド含有量のＥＳＩ−ＭＳ分析を示す。主な種について観察された質量は１２６１２．４Ｄａであり、ＲＥＰ ２０５５であると特定されている（予想される分子量＝１２６１２．５Ｄａ）。 図４２は、本明細書に記載するタンパク質方法２を用いたＲＥＰ ２０５５カルシウムキレート／ペグ化インターフェロンα−２ａ組成物のＨＰＬＣ分離を示す（実施例ＩＶを参照）。 図４３は、図４２の８．０３分のＨＰＬＣピークからのＲＥＰ ２０５５カルシウムキレート／ペグ化インターフェロンα−２ａ組成物中のペプチド含有量のＥＳＩ−ＭＳ分析を示す。 図４４は、本明細書に記載するオリゴ方法を用いたＲＥＰ ２０５７カルシウムキレート／ペグ化インターフェロンα−２ａ組成物のＨＰＬＣ分離を示す（実施例ＩＶを参照）。 図４５は、図４４の１５．４５分のＨＰＬＣピークからのＲＥＰ ２０５７カルシウムキレート／ペグ化インターフェロンα−２ａ組成物中のオリゴヌクレオチド含有量のＥＳＩ−ＭＳ分析を示す。主な種について観察された質量は１３４１３．５Ｄａであり、ＲＥＰ ２０５７であると特定されている（予想される分子量＝１３４１３．３Ｄａ）。 図４６は、本明細書に記載するタンパク質方法２を用いたＲＥＰ ２０５７カルシウムキレート／ペグ化インターフェロンα−２ａ組成物のＨＰＬＣ分離を示す（実施例ＩＶを参照）。 図４７は、図４６の８．０４分のＨＰＬＣピークからのＲＥＰ ２０５７カルシウムキレート／ペグ化インターフェロンα−２ａ組成物中のペプチド含有量のＥＳＩ−ＭＳ分析を示す。 図４８は、本明細書に記載するオリゴ方法を用いたＲＥＰ ２１３９カルシウムキレート／ペグ化インターフェロンα−２ａ組成物のＨＰＬＣ分離を示す（実施例ＩＶを参照）。 図４９は、図４８の１９．０８分のＨＰＬＣピークからのＲＥＰ ２１３９カルシウムキレート／ペグ化インターフェロンα−２ａ組成物中のオリゴヌクレオチド含有量のＥＳＩ−ＭＳ分析を示す。主な種について観察された質量は１４０９５．３Ｄａであり、ＲＥＰ ２１３９であると特定されている（予想される分子量＝１４０９４．６Ｄａ）。 図５０は、本明細書に記載するタンパク質方法２を用いたＲＥＰ ２１３９カルシウムキレート／ペグ化インターフェロンα−２ａ組成物のＨＰＬＣ分離を示す（実施例ＩＶを参照）。 図５１は、図５０の８．０２分のＨＰＬＣピークからのＲＥＰ ２１３９カルシウムキレート／ペグ化インターフェロンα−２ａ組成物中のペプチド含有量のＥＳＩ−ＭＳ分析を示す。 図５２は、本明細書に記載するオリゴ方法を用いたＲＥＰ ２１４８カルシウムキレート／ペグ化インターフェロンα−２ａ組成物のＨＰＬＣ分離を示す（実施例ＩＶを参照）。 図５３は、図５２の１５．４２分のＨＰＬＣピークからのＲＥＰ ２１４８カルシウムキレート／ペグ化インターフェロンα−２ａ組成物中のオリゴヌクレオチド含有量のＥＳＩ−ＭＳ分析を示す。主な種について観察された質量は１２８９１．５Ｄａであり、ＲＥＰ ２１４８であると特定されている（予想される分子量＝１２８９３Ｄａ）。 図５４は、本明細書に記載するタンパク質方法２を用いたＲＥＰ ２１４８カルシウムキレート／ペグ化インターフェロンα−２ａ組成物のＨＰＬＣ分離を示す（実施例ＩＶを参照）。 図５５は、図５４の１３．１７分のＨＰＬＣピークからのＲＥＰ ２１４８カルシウムキレート／ペグ化インターフェロンα−２ａ組成物中のペプチド含有量のＥＳＩ−ＭＳ分析を示す。 図５６は、本明細書に記載するオリゴ方法を用いたＲＥＰ ２０５５カルシウムキレート／ペグ化インターフェロンλ１組成物のＨＰＬＣ分離を示す（実施例ＩＶを参照）。 図５７は、図５６の１４．８４分のＨＰＬＣピークからのＲＥＰ ２０５５カルシウムキレート／ペグ化インターフェロンλ１組成物中のオリゴヌクレオチド含有量のＥＳＩ−ＭＳ分析を示す。主な種について観察された質量は１２６１０．６Ｄａであり、ＲＥＰ ２０５５であると特定されている（予想される分子量＝１２６１２．５Ｄａ）。 図５８は、本明細書に記載するタンパク質方法２を用いたＲＥＰ ２０５５カルシウムキレート／ペグ化インターフェロンλ１組成物のＨＰＬＣ分離を示す（実施例ＩＶを参照）。 図５９は、図５８の１０．６８分のＨＰＬＣピークからのＲＥＰ ２０５５カルシウムキレート／ペグ化インターフェロンλ１組成物中のペプチド含有量のＥＳＩ−ＭＳ分析を示す。主要なピークは２０１３９Ｄａに観察され、これは、インターフェロンλ１のおおよその分子量と一致する。 図６０は、本明細書に記載するオリゴ方法を用いたＲＥＰ ２１３９カルシウムキレート／ペグ化インターフェロンλ１組成物のＨＰＬＣ分離を示す（実施例ＩＶを参照）。 図６１は、図６０の１７．３１分のＨＰＬＣピークからのＲＥＰ ２１３９カルシウムキレート／ペグ化インターフェロンλ１組成物中のオリゴヌクレオチド含有量のＥＳＩ−ＭＳ分析を示す。主な種について観察された質量は１４０９５．３Ｄａであり、ＲＥＰ ２１３９であると特定されている（予想される分子量＝１４０９４．６Ｄａ）。 図６２は、本明細書に記載するタンパク質方法２を用いたＲＥＰ ２１３９カルシウムキレート／ペグ化インターフェロンλ１組成物のＨＰＬＣ分離を示す（実施例ＩＶを参照）。 図６３は、図６２の１０．５３分のＨＰＬＣピークからのＲＥＰ ２１３９カルシウムキレート／ペグ化インターフェロンλ１組成物中のタンパク質含有量のＥＳＩ−ＭＳ分析を示す。主要なピークは２０１３９Ｄａに観察され、これは、インターフェロンλ１のおおよその分子量と一致していた。 図６４は、本明細書に記載するオリゴ方法を用いたＲＥＰ ２１４８カルシウムキレート／ペグ化インターフェロンλ１組成物のＨＰＬＣ分離を示す（実施例ＩＶを参照）。 図６５は、図６４の１５．４７分のＨＰＬＣピークからのＲＥＰ ２１４８カルシウムキレート／ペグ化インターフェロンλ１組成物中のオリゴヌクレオチド含有量のＥＳＩ−ＭＳ分析を示す。主な種について観察された質量は１２８９１．８Ｄａであり、ＲＥＰ ２１４８であると特定されている（予想される分子量＝１２８９３Ｄａ）。 図６６は、本明細書に記載するタンパク質方法２を用いたＲＥＰ ２１４８カルシウムキレート／ペグ化インターフェロンλ１組成物のＨＰＬＣ分離を示す（実施例ＩＶを参照）。 図６７は、図６６の１０．５１分のＨＰＬＣピークからのＲＥＰ ２１４８カルシウムキレート／ペグ化インターフェロンλ１組成物中のタンパク質含有量のＥＳＩ−ＭＳ分析を示す。主要なピークは２０１３９Ｄａに観察され、これは、インターフェロンλ１のおおよその分子量と一致していた。 図６８は、本明細書に記載するオリゴ方法を用いたＲＥＰ ２０５５マグネシウムキレート／チモシンα１組成物のＨＰＬＣ分離を示す（実施例ＩＶを参照）。５．８６分に溶出するピークは、チモシンα１（白色の矢印）に対応し、１４．６２分に溶出するピークは、全長ＲＥＰ ２０５５（黒色の矢印）に対応する。 図６９は、図６８の１４．６２分のＨＰＬＣピークからのＲＥＰ ２０５５マグネシウムキレート／チモシンα１組成物中のオリゴヌクレオチド含有量のＥＳＩ−ＭＳ分析を示す。主な種について観察された質量は１２６１０．１Ｄａであり、ＲＥＰ ２０５５であると特定されている（予想される分子量＝１２６１２．５）。 図７０は、図６８の５．８２分のＨＰＬＣピークからのＲＥＰ ２０５５マグネシウムキレート／チモシンα１組成物中のペプチド含有量のＥＳＩ−ＭＳ分析を示す。主な種について観察された質量は３１０７．１Ｄａであり、チモシンα１であると特定されている（予想される分子量＝３１０８Ｄａ）。 図７１は、本明細書に記載するオリゴ方法を用いたＲＥＰ ２０５５マグネシウムキレート／チモシンα１組成物のＨＰＬＣ分離を示す（実施例ＩＶを参照）。６．０２分に溶出するピークは、チモシンα１（白色の矢印）に対応し、１４．８５分に溶出するピークは、全長ＲＥＰ ２０５５（黒色の矢印）に対応する。 図７２は、図７１の１４．８５分のＨＰＬＣピークからのＲＥＰ ２０５５混合カルシウム−マグネシウムキレート／チモシンα１組成物中のオリゴヌクレオチド含有量のＥＳＩ−ＭＳ分析を示す。主な種について観察された質量は１２６０９．７Ｄａであり、ＲＥＰ ２０５５であると特定されている（予想される分子量＝１２６１２．５）。 図７３は、図７１の６．０２分のＨＰＬＣピークからのＲＥＰ ２０５５混合カルシウム−マグネシウムキレート／チモシンα１組成物中のペプチド含有量のＥＳＩ−ＭＳ分析を示す。主な種について観察された質量は３１０７．１Ｄａであり、チモシンα１であると特定されている（予想される分子量＝３１０８Ｄａ）。 図７４は、本明細書に記載するオリゴ方法を用いたＲＥＰ ２０５５マグネシウムキレート／ペグ化インターフェロンα−２ａ組成物のＨＰＬＣ分離を示す（実施例ＩＶを参照）。 図７５は、図７４の１４．８３分のＨＰＬＣピークからのＲＥＰ ２０５５マグネシウムキレート／ペグ化インターフェロンα−２ａ組成物中のオリゴヌクレオチド含有量のＥＳＩ−ＭＳ分析を示す。主な種について観察された質量は１２６１０．２Ｄａであり、ＲＥＰ ２０５５であると特定されている（予想される分子量＝１２６１２．５Ｄａ）。 図７６は、本明細書に記載するタンパク質方法２を用いたＲＥＰ ２０５５マグネシウムキレート／ペグ化インターフェロンα−２ａ組成物のＨＰＬＣ分離を示す（実施例ＩＶを参照）。 図７７は、図７６の１３．４４分のＨＰＬＣピークからのＲＥＰ ２０５５マグネシウムキレート／ペグ化インターフェロンα−２ａ組成物中のぺプチド含有量のＥＳＩ−ＭＳ分析を示す。 図７８は、本明細書に記載するオリゴ方法を用いたＲＥＰ ２０５５混合カルシウム−マグネシウム／ペグ化インターフェロンα−２ａ組成物のＨＰＬＣ分離を示す（実施例ＩＶを参照）。 図７９は、図７８の１４．８３分のＨＰＬＣピークからのＲＥＰ ２０５５混合カルシウム−マグネシウム／ペグ化インターフェロンα−２ａ組成物中のオリゴヌクレオチド含有量のＥＳＩ−ＭＳ分析を示す。主な種について観察された質量は１２６０９．８Ｄａであり、ＲＥＰ ２０５５であると特定されている（予想される分子量＝１２６１２．５Ｄａ）。 図８０は、本明細書に記載するタンパク質方法２を用いたＲＥＰ ２０５５混合カルシウム−マグネシウム／ペグ化インターフェロンα−２ａ組成物のＨＰＬＣ分離を示す（実施例ＩＶを参照）。 図８１は、図８０の１３．４４分のＨＰＬＣピークからのＲＥＰ ２０５５混合カルシウム−マグネシウム／ペグ化インターフェロンα−２ａ組成物中のペプチド含有量のＥＳＩ−ＭＳ分析を示す。 図８２は、本明細書に記載するオリゴ方法を用いたＲＥＰ ２１３９マグネシウムキレート／チモシンα１組成物のＨＰＬＣ分離を示す（実施例ＩＶを参照）。５．８４分に溶出するピークは、チモシンα１（白色の矢印）に対応し、１６．８６分に溶出するピークは、全長ＲＥＰ ２１３９（黒色の矢印）に対応する。 図８３は、図８２の１６．８６分のＨＰＬＣピークからのＲＥＰ ２１３９マグネシウムキレート／チモシンα１組成物中のオリゴヌクレオチド含有量のＥＳＩ−ＭＳ分析を示す。主な種について観察された質量は１４０９１．３Ｄａであり、ＲＥＰ ２１３９であると特定されている（予想される分子量＝１４０９４．６Ｄａ）。 図８４は、図８２の５．８４分のＨＰＬＣピークからのＲＥＰ ２１３９マグネシウムキレート／チモシンα１組成物中のペプチド含有量のＥＳＩ−ＭＳ分析を示す。主な種について観察された質量は３１０７．１Ｄａであり、チモシンα１であると特定されている（予想される分子量＝３１０８Ｄａ）。 図８５は、本明細書に記載するオリゴ方法を用いたＲＥＰ ２１３９混合カルシウム−マグネシウムキレート／チモシンα１組成物のＨＰＬＣ分離を示す（実施例ＩＶを参照）。５．８４分に溶出するピークは、チモシンα１（白色の矢印）に対応し、１６．６１分に溶出するピークは、全長ＲＥＰ ２１３９（黒色の矢印）に対応する。 図８６は、図８５の１６．６１分のＨＰＬＣピークからのＲＥＰ ２１３９混合カルシウム−マグネシウムキレート／チモシンα１組成物中のオリゴヌクレオチド含有量のＥＳＩ−ＭＳ分析を示す。主な種について観察された質量は１４０９１．１Ｄａであり、ＲＥＰ ２１３９であると特定されている（予想される分子量＝１４０９４．６Ｄａ）。 図８７は、図８５の５．８４分のＨＰＬＣピークからのＲＥＰ ２１３９混合カルシウム−マグネシウムキレート／チモシンα１組成物中のペプチド含有量のＥＳＩ−ＭＳ分析を示す。主な種について観察された質量は３１０７．１Ｄａであり、チモシンα１であると特定されている（予想される分子量＝３１０８Ｄａ）。 図８８は、本明細書に記載するオリゴ方法を用いたＲＥＰ ２１３９マグネシウムキレート／ペグ化インターフェロンα−２ａ組成物のＨＰＬＣ分離を示す（実施例ＩＶを参照）。 図８９は、図８８の１７．１９分のＨＰＬＣピークからのＲＥＰ ２１３９マグネシウムキレート／ペグ化インターフェロンα−２ａ組成物中のオリゴヌクレオチド含有量のＥＳＩ−ＭＳ分析を示す。主な種について観察された質量は１４０９１．５Ｄａであり、ＲＥＰ ２１３９であると特定されている（予想される分子量＝１４０９４．６Ｄａ）。 図９０は、本明細書に記載するタンパク質方法２を用いたＲＥＰ ２１３９マグネシウムキレート／ペグ化インターフェロンα−２ａ組成物のＨＰＬＣ分離を示す（実施例ＩＶを参照）。 図９１は、図９０の１３．３８分のＨＰＬＣピークからのＲＥＰ ２１３９マグネシウムキレート／ペグ化インターフェロンα−２ａ組成物中のペプチド含有量のＥＳＩ−ＭＳ分析を示す。 図９２は、本明細書に記載するオリゴ方法を用いたＲＥＰ ２１３９混合カルシウム−マグネシウムキレート／ペグ化インターフェロンα−２ａ組成物のＨＰＬＣ分離を示す（実施例ＩＶを参照）。 図９３は、図９２の１６．９５分のＨＰＬＣピークからのＲＥＰ ２１３９混合カルシウム−マグネシウムキレート／ペグ化インターフェロンα−２ａ組成物中のオリゴヌクレオチド含有量のＥＳＩ−ＭＳ分析を示す。主な種について観察された質量は１４０９１．４Ｄａであり、ＲＥＰ ２１３９であると特定されている（予想される分子量＝１４０９４．６Ｄａ）。 図９４は、本明細書に記載するタンパク質方法２を用いたＲＥＰ ２１３９混合カルシウム−マグネシウムキレート／ペグ化インターフェロンα−２ａ組成物のＨＰＬＣ分離を示す（実施例ＩＶを参照）。 図９５は、図９４の１３．４６分のＨＰＬＣピークからのＲＥＰ ２１３９混合カルシウム−マグネシウムキレート／ペグ化インターフェロンα−２ａ組成物中のペプチド含有量のＥＳＩ−ＭＳ分析を示す。

その内容が全体的に本明細書に参照により組み込まれる国際出願公開第ＷＯ ２０１２／０２１９９５号および米国特許出願公開第２０１２／００４６３４８号に記載されるように、二価の任意の単純な金属カチオン（例えば、限定されないが、Ｃａ²⁺、Ｍｇ²⁺およびＦｅ²⁺）を含む水溶液中のＯＮは、塩として存在せず、ＯＮのキレート化した錯体として存在する。これらの錯体は、ＯＮダイマー、またはＯＮが二価金属イオン架橋を介し、そのホスホジエステル骨格またはホスホロチオエート結合によって分子間で結合したもっと結合部位が多い分子組織で構成される（図２Ｂを参照）。特定のＯＮ濃度および金属カチオン濃度では、これらのキレート化された錯体は、水溶液中で安定であり、可溶性であり、ＯＮキレート錯体中の二価カチオンが溶液と相互作用するのを効果的に抑える。このキレート錯体の作成は、３＋以上の電荷を有する単純な金属カチオンとの間でも起こりそうである（図２Ｂに示されるように）。従って、ＯＮは、多価金属カチオンキレート化剤として機能し、多価金属カチオンと塩を形成しない。

ＯＮキレート錯体は、カルシウム、マグネシウム、コバルト、鉄、マンガン、バリウム、ニッケル、銅、亜鉛、カドミウム、水銀および鉛を含む多様な多価金属カチオンを含んでいてもよい。さらに、これらの多価金属カチオンのキレート化によって、金属カチオンを介して接続する２つ以上のＯＮで構成されるＯＮキレート錯体が生成し、ホスホジエステル結合またはホスホロチオエート結合のいずれかを有するＯＮ存在下、６ヌクレオチド長より長いヌクレオチドのＯＮが生じることが示される。ＯＮは、場合により、それぞれホスホロチオエート酸による結合を有していてもよい。キレート化によって、リボースの２’位に修飾（例えば、２’位のＯメチル）を含み、修飾された塩基（例えば、５’メチルシトシンまたは４−チオウラシル）を含むＯＮも生じる。これらの２’位での修飾は、１つ以上またはすべてのリボースに存在していてもよく、修飾された塩基は、１つ以上の塩基に存在していてもよく、またはそれぞれの塩基に広く存在していてもよい（すなわち、すべてのシトシンが５’メチルシトシンとして存在する）。さらに、ＯＮキレート錯体は、複数の修飾を含むＯＮを含んでいてもよく、例えば、それぞれの結合がホスホロチオエート化されており、それぞれのリボースが２’位で修飾されており、それぞれの塩基が修飾されている。ＯＮキレート錯体の作成と適合するＯＮの修飾を、以下にさらに定義する。さらに、金属カチオンのキレート化は、存在するヌクレオチドの配列に依存しないが、その代わりに、すべてのＯＮに共通する物理化学的特徴に依存する（図２Ａを参照）。

ＯＮキレート錯体の作成は、任意の二価の金属カチオンを用いて達成することができるが、医薬として使用することを意図したＯＮキレート錯体は、好ましくは、カルシウムおよび／またはマグネシウムのみを含むべきであり、鉄、マンガン、銅または亜鉛も痕跡量含んでいてもよいが、コバルト、バリウム、ニッケル、カドミウム、水銀、鉛またはここに列挙しない任意の他の二価の金属は含むべきではない。

重要なことに、ＯＮキレート錯体の作成は、一価カチオン、例えば、Ｎａ⁺、Ｋ⁺またはＮＨ₄ ⁺を用いて行われず、従って、任意の一価カチオンを用いては行われないであろう。従って、「ＯＮ塩」という用語は、もっと正確には、一価カチオンとのＯＮ塩、またはＯＮとキレート錯体を形成しないカチオンとのＯＮ塩にのみ限定される。

血液中のタンパク質成分とＯＮの既知の一時的な相互作用の少なくとも一部は、ＯＮと、カルシウムに結合するタンパク質、例えば、アルブミンおよびカルシウム依存性凝固カスケードのタンパク質との相互作用によって媒介されるであろう。従って、キレート化された錯体としてのＯＮの投与（カルシウムの金属に結合したタンパク質と相互作用する傾向を顕著に減らすか、またはなくす）は、血液中のこれらのタンパク質の相互作用を軽減し、ＯＮ投与の副作用を少なくすることができ（例えば、一時的な抗凝固）、キレート化されていないＯＮと比較して、ＯＮ投薬量のうち、標的臓器（例えば、肝臓、肺または膵臓）に到達する部分を増やすこともできる。

蛍光偏光は、分子間相互作用を調べるために一般的に用いられる方法である。この技術では、ベイト（すなわち、任意のＯＮ）を蛍光タグ（例えば、ＦＩＴＣ）で標識する。溶液中、ベイト分子は、ブラウン運動に起因して溶液中で自由に回転し、ベイトを正しい波長の光で励起させたとき、不十分な偏光した蛍光発光が生じる。十分な分子量（少なくともベイトと同じ大きさ）のリガンドを用いると、ベイトとリガンドとの相互作用によって、溶液中でのこの錯体の回転が実質的に阻害される。このように溶液中で回転が阻害された結果、励起したときの蛍光発光は顕著に偏光するようになる。従って、この技術を用い、結合相手に対する物理的な制約条件なく、溶液中の相互作用を測定することができる。蛍光偏光は、無次元のｍＰとして報告され、反応中で結合したベイト分子の割合に正比例する。例えば、非常に少量のベイト分子が特定のリガンドに結合している場合、蛍光偏光は非常にわずかであると思われ、その結果、ｍＰ値が小さい。そのスペクトルの他端で、多くの割合のベイト分子が特定のリガンドに結合している（または高濃度のリガンドを用いる）場合、かなりの蛍光偏光が存在すると思われ、その結果、ｍＰ値が大きい。この様式で、固定した量の蛍光タグ化ベイト存在下、リガンドの濃度を変えることによって、特定のベイト−リガンド相互作用の結合等温線を作成することができる。

ここで、多様な蛍光標識したＯＮを使用し、多価金属カチオン存在下、これらの錯体生成を調べる。蛍光偏光による錯体生成の監視は、これらのＯＮを蛍光標識する必要があるが、この標識は、当該ＯＮの窒素系塩基またはホスホジエステル骨格のいずれかと干渉しないように、３’末端でＯＮに接続する。さらに、蛍光タグは、硬い３炭素リンカーによってＯＮから離れた状態で保持され、さらに、溶液中の通常のＯＮの挙動の撹乱を排除する。従って、蛍光標識されたＯＮを用いた蛍光偏光を用いる本明細書で観察される任意のＯＮ錯体生成は、標識されていないＯＮ（錯体化しているか、していないかによらない）の溶液挙動の正確な代表例である。

当該技術分野の技術水準は、ＯＮナトリウム塩を用いた治療が必要な被検体にＯＮを投与する実務を明確に教示する。この教示は、ホミビルセン（ＩＳＩＳ ２９２２）、ミポメルセン（ＩＳＩＳ ３０１０１２）、トレコビルセン（Ｔｒｅｃｏｖｉｒｓｅｎ）（ＧＥＭ ９１）、クスチルセン（ＯＧＸ−０１１／ＩＳＩＳ １１２９８９）、ゲナセンス（Ｇ３１３９）、アプリノカルセン（Ａｐｒｉｎｏｃａｒｓｅｎ）（ＩＳＩＳ ３５３１／ＬＹ ９００００３）、ＰＲＯ−５１（ＧＳＫ ２４０２９６８）およびＡＬＮ−ＲＳＶ０１を含むナトリウム塩として臨床試験で多くのＯＮを投与することによって例示される（Ｇｅａｒｙ ｅｔ ａｌ．、２００２、Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ、４１：２５５−２６０；Ｙｕ ｅｔ ａｌ．２００９、Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ、４８：３９−５０；Ｓｅｒｅｎｉ ｅｔ ａｌ．１９９９、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、３９：４７−５４；Ｃｈｉ ｅｔ ａｌ．２００５、Ｊ．Ｎａｔ．Ｃａｎｃ．Ｉｎｓｔ．、９７：１２８７−１２９６；Ｍａｒｓｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．２００４、Ａｎｎ．Ｏｎｃｏｌ．、１５：１２７４−１２８３；Ｇｒｏｓｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．２００４、Ｎｅｕｒｏ−Ｏｎｃｏｌ、６：３２−４０；Ｇｏｅｍａｎｓ ｅｔ ａｌ．２０１１ ＮＥＪＭ ３６４：１５１３−１５２２）。カルシウムまたはマグネシウムまたは任意の他の二価の金属の使用を伴う親化合物の投与についてのオリゴヌクレオチド製剤を教示する現時点で公開されたデータは存在しない。

ＯＮナトリウム塩の投与に関連する副作用の多くは、そのキレート化効果に起因するものであろう。ＯＮによる血液の抗凝固性は、少なくとも部分的には、ＯＮによる血清カルシウムのキレート化によって生じ、これにより、カルシウム依存性の凝固カスケードが損なわれる。血清カルシウムのキレート化およびこのキレート化が起こり得る背後にある血清低カルシウム血症は、ＩＶ投与によるＯＮ投与で観察される副作用とも一致しており、発熱、振戦、衰弱および動脈血圧の低下（後者は、迅速なＩＶ点滴または注射に伴う）が挙げられる。ＯＮの皮下注射で観察される注射部位での反応（硬結、炎症、圧痛および疼痛）は、少なくとも一部には、注射部位でのカルシウムおよび可能な他の二価のカチオンまたは多価カチオン、例えば、マグネシウムのＯＮによる局所的なキレート化に起因する。キレート化した錯体としてのＯＮの投与は、これらの副作用の多くを軽減することが示されている。

さらに、ＯＮキレート錯体は、任意のＯＮを含む溶液中で二価の金属を用いて生成し、この生成、および溶液中の種々のポリペプチドおよびペグ化ポリペプチドと、任意のＯＮキレート錯体との相溶性についての教示は、多様なＯＮ修飾を有する縮重ＯＮ ＲＥＰ ２００６および例示的なオリゴヌクレオチド配列［以下の例では、（ＡＧ）₂₀および（ＡＣ）₂₀］の使用によって当業者に十分に示されている。多様なポリペプチドまたはペグ化ポリペプチドと、上のＯＮ種をキレートとして含む組成物の安定な生成は、任意のＯＮキレート錯体（その特定の官能基にかかわらず）が、特定の疾患の徴候を治療するために当該技術分野で望ましいとされている種々のポリペプチドまたはペグ化ポリペプチドを含む安定な溶液（例えば、Ｂ型肝炎またはＣ型肝炎を治療するためのペグ化インターフェロンまたはＢ型肝炎を治療するためのｍｙｒｃｌｕｄｅｘ Ｂ）を生成することを示すであろう。

オリゴヌクレオチド（ＯＮ）という用語は、リボ核酸（ＲＮＡ）および／またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）のオリゴマーまたはポリマーを指す。この用語は、修飾されたヌクレオ塩基（５’メチルシトシンおよび４’チオウラシルを含む）、糖類およびヌクレオチド間の共有（骨格）結合で構成されるＯＮ、および同様の機能を有する天然には存在しない部分を含むＯＮを含む。このような修飾または置換されたＯＮは、例えば、免疫反応性の低下、細胞取り込みの向上、核酸標的に対する親和性の向上、ヌクレアーゼ存在下での安定性の上昇といった望ましい特性のため、天然形態よりも好ましい場合がある。ＯＮは、二本鎖であってもよい。

本開示では、ＯＮは、種々の修飾、例えば、安定化する修飾を含んでいてもよく、従って、ホスホジエステル結合および／または糖および／または塩基に少なくとも１つの修飾を含んでいてもよい。例えば、ＯＮは、限定されないが、１つ以上の修飾を含んでいてもよく、または示した修飾を有するすべての結合または糖類または塩基を含むように完全に修飾されていてもよい。修飾された結合としては、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、および／またはメチルホスホネート結合を挙げることができる。修飾された結合は有用であるが、ＯＮは、ホスホジエステル結合を含んでいてもよい。さらなる有用な修飾としては、限定されないが、２’−Ｏ−アルキル修飾を含め、糖の２’位での修飾、例えば、２’−Ｏ−メチル修飾、２’Ｏ−メトキシエチル（２’ＭＯＥ）、２’−アミノ修飾、２’−ハロ修飾、例えば、２’−フルオロ；非環状ヌクレオチド類似体が挙げられる。他の２’位での修飾も当該技術分野で知られており、例えば、ロックド核酸を使用することができる。特に、ＯＮは、全体的に修飾された結合を有するか、またはそれぞれの結合が修飾されており、例えば、ホスホロチオエートを含み；３’−および／または５’−ｃａｐを含み；末端３’−５’結合を含み；ＯＮは、リンカーによって接続した２つ以上のＯＮ配列からなるコンカテマーであるか、またはこれを含む。塩基修飾は、シトシン塩基の５’メチル化（５’メチルシトシンまたはヌクレオチドの観点で、５’メチルシチジン）および／またはウラシル塩基の４’チオ化（４’チオウラシルまたはヌクレオチドの観点で、４’チオウリジン）を含んでいてもよい。ホスホロチオエート結合、２’リボース修飾（例えば、２’Ｏ−メチル化）および修飾された塩基（例えば、５’メチルシトシン）を含むオリゴヌクレオチドのように、合成条件が化学的に適合性であるような異なる化学的に適合性の修飾された結合を組み合わせてもよい。ＯＮは、さらに、これらの異なるすべての修飾で完全に修飾されていてもよい（例えば、それぞれの結合がホスホロチオエート化され、それぞれのリボースが２’Ｏでメチル修飾されており、それぞれのシトシン塩基が、さらなる５’メチル修飾を有する（５’メチルシトシン））。

本記載では、「抗ウイルスＯＮ」という用語は、その特定の生化学的活性（配列依存性または配列非依存性）によって、任意のＯＮが、ある態様のウイルス複製を直接的または間接的に阻害する能力、または免疫学的機構または他の機構による感染を排除する宿主の能力を直接的または間接的に高める能力を有することを指す。

本開示では、「ＯＮキレート錯体」という用語は多価金属カチオンによって分子間で接続した、溶液中の２つ以上のＯＮの錯体を指す。

本開示では、「抗ウイルスＯＮキレート錯体」という用語は、多価金属カチオンによって分子間で接続した、溶液中の２つ以上の抗ウイルスＯＮの錯体を指す。抗ウイルスＯＮキレート錯体は、１種類の抗ウイルスＯＮで構成されていてもよく、または同じ作用機序または異なる作用機序を有し得る抗ウイルスＯＮの２種類以上の異なる種（例えば、２種類以上のアンチセンスＯＮ、少なくとも１つのアンチセンスＯＮと少なくとも１つのアプタマー、少なくとも１つのアンチセンスＯＮと少なくとも１つのｓｉＲＮＡ）で構成されていてもよい。

本開示では、「抗ウイルスポリペプチド」という用語は、その特定の生化学的活性（配列依存性または配列非依存性）によって、あるポリペプチドが、ある態様のウイルス複製を直接的または間接的に阻害する能力、または免疫学的機構または他の機構による感染を排除する宿主の能力を直接的または間接的に高める能力を有することを指す。ポリペプチドは、天然由来であってもよく、または組み換えであってもよい。ポリペプチドは、天然に存在するポリペプチドの一部から組み換えによって誘導されてもよい。ポリペプチドは、ペグ化されていてもよく、またはペグ化されていなくてもよい。

本開示では、「縮重ＯＮ」という用語は、すべての位置にゆらぎ（Ｎ）を有する一本鎖ＯＮ、例えば、ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮを意味することを意図している。それぞれの塩基は、このＯＮが、実際に、同じ長さおよび物理化学的特性を有する異なるランダムに生成した配列の集合として存在するとき、ゆらぎとして合成される。例えば、４０塩基長の縮重ＯＮについて、この集合の任意の特定の配列は、理論的には、フラクション全体の１／４⁴⁰または８．３×１０^-25のみにあらわれるだろう。１モル＝６．０２２×１０²³分子であり、１モルの４０マーＯＮは、質量が約１２〜１４ｋｇ（存在する配列および修飾に依存する）であるという事実から、特定の配列が効果的に存在する任意のＯＮは、任意の調製において、１個より多く存在しない。従って、このような調製で観察される任意のキレート生成または生物学的活性は、その調製に固有である確定した配列を有する任意の特定のＯＮが、特定のヌクレオチド配列から誘導される任意の意味ある活性の原因となるとは予測することができないため、配列に依存しない（または配列とは独立した）ＯＮの物理化学特性に起因しなければならない。

この概念をさらに説明すると、実施例Ｉは、高速液体クロマトグラフィーおよび質量分析計によって、ＲＥＰ ２００６（縮重し、完全にホスホロチオエート化された配列を有する４０マーＯＮ）の特徴を、確定した配列を有する２１マーＯＮ（これも完全にホスホロチオエート化されている）と比較し、同様の大きさおよび化学修飾（すなわち、ホスホロチオエート化）を有する任意のＯＮは、存在するヌクレオチド配列によって影響を受けない非常によく似た（同一ではないにしても）物理化学特徴を有することを明確に示す（図１Ａ〜Ｃを参照）。

本出願では、「核酸ポリマー」またはＮＡＰという用語は、配列特異的な機能を含まない任意の一本鎖ＯＮを特定することを意図している。ＮＡＰの生化学的活性は、ＯＮのＴｏｌｌ様受容体認識、標的核酸のハイブリダイゼーション、または存在する特定の順序のヌクレオチドから誘導される特定の二次元／三次元ＯＮ構造を必要とするアプタマー相互作用に依存しない。ＮＡＰは、上述のような塩基および／または結合および／または糖修飾を含んでいてもよい。

ＯＮは、配列依存性または配列に依存しない多くの機構によって、その効果を発揮することができる。配列依存性の機構は、その活性に特定の核酸配列を必要とし、その活性が、存在するヌクレオチド配列の１つ以上の改変によって低下する機構である。この特定の配列は、ＯＮの全長またはその一部分（配列モチーフ）のみを包含していてもよい。配列依存性のＯＮの例としては、以下のものが挙げられる。
１．アンチセンスＯＮ（一本鎖または二本鎖（例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）または小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ））が、目的のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の特定の部分と相補性であり、細胞に導入されたとき、ＲＮＡｓｅ ＨまたはＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）によって、これらの標的ｍＲＮＡの分解を行わせる。
２．立体障壁のあるＯＮは、ｍＲＮＡの特定の部分に相補性であるが、ＲＮＡｓｅ Ｈを活性化しないように設計された一本鎖アンチセンスＯＮである。標的ｍＲＮＡに対するこれらのＯＮのハイブリダイゼーションによって、ｍＲＮＡに対して通常は作用するタンパク質に対し立体的な障壁を与える二本鎖構造が得られる。このようなＯＮを使用し、特定のｍＲＮＡの翻訳をブロックするか、または特定のｍＲＮＡの後翻訳スプライシングおよび成熟を妨害することができる。このようなＯＮを、全体での２’位でのリボース修飾（例えば、２’位でのＯメチル化）によって（これらのＯＮの作用機序に不可欠ではないため）、ＲＮＡｓｅ Ｈの活性化をブロックするように操作してもよい。
３．アプタマーは、特定のタンパク質との相互作用を可能にする特定の三次元構造に合うように変えられ、ホストＤＮＡまたはＲＮＡと簡単には相互作用しないＯＮである。アプタマーは、さらに、シュピーゲルマー（Ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒ）を含んでいてもよく、ＯＮに高い酵素安定性を与えるために、Ｄ−ヌクレオチドの代わりにＬ−ヌクレオチドを使用する。
４．免疫刺激性ＯＮは、哺乳動物における免疫応答を刺激するために特定の６マー核酸モチーフ（ＸＸＣＧＸＸ）を利用する。最適モチーフは、種ごとにさまざまであるが、ＸＸＣＧＸＸモチーフに一致する特定の配列に厳格に依存する。
５．マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、種々の生化学的経路の制御に関与する天然に存在するマイクロＲＮＡ分子に結合し、その機能をブロックする。

配列非依存性ＯＮについて、唯一報告されている例はホスホロチオエート化ＮＡＰであり、両親媒性ポリマーとしての物理化学特性によって、大きさ（長さ）に依存する様式で両親媒性タンパク質構造と選択的に相互作用する。

いくつかの抗ウイルスポリペプチド系薬物は、現時点では、ウイルス感染の治療のために承認されており、ペグ化インターフェロンα−２ａ（Ｂ型肝炎（ＨＢＶ）およびＣ型肝炎（ＨＣＶ）の治療の場合）、インターフェロンα−２ｂ（ＨＢＶの治療の場合）、チモシンα１（ＨＢＶの治療の場合）およびエンフビルチド（ＨＩＶ−１の治療の場合）が挙げられる。ＨＢＶの治療のためのミリスチル化ｐｒｅ−ｓ１ ＨＢＶ表面抗原タンパク質フラグメント（ｍｙｒｃｌｕｄｅｘ Ｂ、Ｐｅｔｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ、２００８、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２６：３３５−３４１）、ペグ化インターフェロンλ１（Ｍｕｉｒ ｅｔ ａｌ、２０１０ Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ５２：８２２−８３２）を含む、開発中の他のポリペプチド系薬物も存在する。さらに、インターフェロンλ１、λ２およびλ３は、抗ウイルス活性を有することも知られている（Ｆｒｉｂｏｒｇ ｅｔ ａｌ、２０１３、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ ＣＨｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ５７：１３１２−１３２２）。ペグ化されているか、またはペグ化されていないインターフェロンおよび他の既知の免疫調整剤（例えば、チモシンα１）の場合、これらのポリペプチドは、被検体のウイルス感染に対する免疫応答の刺激を引き起こすそれぞれの生化学的経路の刺激に活性がある。これらのポリペプチドは、免疫応答を首尾よく刺激し得るが、ＨＢＶ感染患者またはＨＣＶ感染患者のほんの一部のみが、これらのポリペプチド系薬物を用い、感染の完全な制御を達成する。Ｍｙｒｃｌｕｄｅｘ Ｂは、肝細胞に入ったＨＢＶをブロックするように機能するが、その治療効果は、ヒト患者ではまだ示されていない。

これらのポリペプチドに加え、ＯＮキレート錯体と合わせたとき、ウイルス感染の治療に有用であり得る既知の抗ウイルス活性を有する他の種類のポリペプチドが存在する。このようなポリペプチドとしては、サイトカイン、例えば、限定されないが、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６およびインターフェロンγが挙げられる。

治療に活性なポリペプチドをペグ化する方法、およびポリペプチドの生化学的活性とのペグ化の適合性は、当該技術分野でよく知られており、特定のアミノ酸残基で、問題となるポリペプチドに対するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖の結合からなる。ペグ化の主な機能は、ポリペプチドの血中寿命を長くし、さらに、その免疫原性を低下させることである。これらの特徴は、問題としているポリペプチドの忍容性を高め、最適な治療効果に必要な投薬頻度を下げる。ポリペプチドに対するＰＥＧ残基の接続は、問題としているポリペプチドの特定の生化学的活性に影響を与えることなく達成可能であることが当該技術分野でさらに知られている。ペグ化は、問題としているポリペプチドの水溶解度を高め、その製剤化の容易性を高めることも知られている。ペグ化ポリペプチドの多くの例は、当該技術分野で知られており、エリスロポエチンのペグ化形態Ｍｉｒｃｅｒａ（商標）；ヒト顆粒球コロニー刺激因子のペグ化形態Ｎｅｕｌａｓｔａ（商標）；ヒトインターフェロンα−２ａのペグ化形態Ｐｅｇａｓｙｓ（商標）；ヒトインターフェロンα−２ｂのペグ化形態Ｐｅｇ−ｉｎｔｒｏｎ（商標）；およびペグ化インターフェロンλ１（現時点で臨床開発中である）が挙げられる。従って、ＯＮキレート錯体を含む組成物へのペグ化ポリペプチド（すなわち、ペグ化インターフェロンα−２ａ）の適合性に関する開示は、一般的に任意のペグ化ポリペプチドとＯＮキレート錯体との適合性について、特に、ＯＮキレート錯体と適合性である本開示に存在する特定のペグ化されていないポリペプチドのペグ化態様（すなわち、チモシンα１、インターフェロンα−２ｂおよびインターフェロンλ１）について、一般的な実施可能性を与える。

いくつかの抗ウイルスＯＮ系薬物は、ウイルス感染の治療について、現時点で開発中であり、ＨＢＶの治療の場合、ホスホロチオエート化ＮＡＰであるＲＥＰ ９ＡＣ（ＲＥＰ ２０５５）、ＲＥＰ ９ＡＣ’（ＲＥＰ ２１３９）およびＲＥＰ ９ＡＣ^m（ＲＥＰ ２１４８）；ＨＣＶの治療の場合、ミラビルセン（Ｊａｎｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ、２０１３、ＮＥＪＭ、Ｍａｒｃｈ ２７）；および呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）の治療の場合、ＡＬＮ−ＲＳＶ０１（Ｚａｍｏｒａ ｅｔ ａｌ、２０１１、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．、１８３：５３１−５３８）が挙げられる。これらはそれぞれ、作用機序が異なり、ＮＡＰは、実施例Ｖに記載されるようにＨＢＶ表面抗原タンパク質（免疫機能を阻害するタンパク質）の血中への放出を防ぎ、ミラビルセン（ｍｉＲＮＡ）は、ＨＣＶ複製に対し役割を果たすことが知られているミクロＲＮＡ ｍｉｒ−１２２の作用をブロックし、ＡＬＮ−ＲＳＶ０１（ｓｉＲＮＡ）は、ＲＳＶ Ｎヌクレオカプシドタンパク質の合成をブロックし、ＲＳＶビリオンの産生を防ぐ。これらすべてのＯＮ薬物は、被検体において意図した効果を励起させるのに非常に有効であり、ＲＥＰ ９ＡＣ／ＲＥＰ ９ＡＣ’／ＲＥＰ ９ＡＣｍは、血中でのＨＢＶ表面抗原のクリアランスを引き起こし、ひいては血中のＨＢＶウイルスの低下を励起するＨＢＶサブウイルス粒子（ＳＶＰ）の細胞内での移動および分泌をブロックし、ミラビルセンは、ＨＣＶ複製に関与するｍｉｒ−１２２機能を阻害するように十分に働き、ＡＬＮ−ＲＳＶ−０１は、ＲＳＶカプシドタンパク質の産生をブロックするように十分に働く。しかし、これらのＯＮ系化合物を非経口で投与するすべての場合に、投与に関連する副作用、例えば、静脈内に投与したときの発熱、悪寒、振戦、または皮下投与によって投与したときに、注射部位での疼痛、炎症または硬結を伴う。さらに重要なことに、これらすべてのＯＮ系薬物が、被検体において意図した効果を有するが、全体的な治療転帰は、望ましいものとはほど遠く、これらの薬物を用いた治療を受けた患者の一部のみが、実質的な抗ウイルス応答を達成するか、または治療中または治療を止めた後に感染の完全な制御を達成する。

従って、（投与に関連する副作用を最低限にし、薬物動態特性を潜在的に高めるために）これらのＯＮ系抗ウイルス薬物のいずれかをＯＮキレートとして調製することが望ましく、これを、同じ製剤で１つ以上の抗ウイルスポリペプチド（例えば、ペグ化インターフェロンα−２ａ、インターフェロンα−２ｂまたはチモシンα１またはペグ化インターフェロンλ１）と合わせることが望ましい。ポリペプチドの免疫刺激性抗ウイルス効果と組み合わせたＯＮ系化合物（キレートとして）の特定の抗ウイルス効果は、被検体におけるもっと完全に高められた抗ウイルス応答の誘発において改善された有益な効果を有し、別個にいずれかの薬物を使用する場合と比較すると、被検体の大部分が感染の完全な制御を達成することができた。

被検体において改善された抗ウイルス応答を達成するために、少なくとも１つの抗ウイルスＯＮキレート錯体と、少なくとも１つの抗ウイルスポリペプチドまたはペグ化ポリペプチドとを含む医薬組成物を用い、特定のウイルス感染を治療することが有用であろう。

少なくとも１つの抗ウイルスＯＮキレート錯体および抗ウイルスポリペプチドを用いて、同じ投与経路または同じではない投与経路によってこれらの化合物をそれぞれ異なる医薬組成物で別個に投与し、特定のウイルス感染を治療することが有用であろう。

被検体において最も良好な考えられる抗ウイルス応答を与えるために、同じ医薬組成物または別個の医薬組成物で投与される、抗ウイルスＯＮキレートおよび抗ウイルスポリペプチドの併用療法に第３の非ＯＮ非ポリペプチド薬物を加えることが必要であろう。このような薬物は、（これらに限定されないが）エンテカビル、フマル酸テノホビルジソプロキシル、テルビブジン、アデホビルジピボキシル、ラミブジン、リバビリン、テラプレビル、ボセプレビル、ＧＳ−７９７７、テゴブビル、ザナミビル、オセルタミビル、ガンシクロビル、ホスカルネット、アシクロビル、ジドブジン、アバカビル、ロピナビル、リトナビルおよび／またはエファビレンツであってもよい。このような抗ウイルス薬物は、多くのウイルス、例えば、ＨＣＶ、ＨＢＶ、ＨＩＶ、インフルエンザ、ＲＳＶおよびサイトメガロウイルスにおいて、ウイルスゲノムおよび／またはウイルスｍＲＮＡの複製を防ぐことができる。

抗ウイルスポリペプチドまたはペグ化ポリペプチドの免疫刺激効果と組み合わせた抗ウイルスＯＮキレート錯体の特定の抗ウイルス効果と、上に列挙した非ＯＮ非ポリペプチド薬物によるウイルスＤＮＡ／ＲＮＡ複製の遮断との組み合わせによって、ウイルスに感染した被検体に最良で最も強力な治療応答を与えることができ、問題としている被検体が、治療を止めた後にも持続可能なウイルスの持続性制御を達成するという機会をさらに増やすことが可能である。

製剤中のＯＮキレート錯体は、抗ウイルス活性を有する任意のＯＮから誘導されてもよく、その例を表１に与える。

LNA＝ロックド核酸、PS＝ホスホロチオエート、2’OMe＝2’Oメチル、5’MeC＝5’メチルシトシン

製剤中のポリペプチドは、直接的な抗ウイルス活性を有することができるか、または宿主から誘導される抗ウイルス活性を刺激することができ、以下のものであってもよい。
チモシンα１；
任意のα−インターフェロンまたはそのペグ化誘導体；
任意のβ−インターフェロンまたはそのペグ化誘導体；
任意のγ−インターフェロンまたはそのペグ化誘導体；
任意のλ−インターフェロンまたはそのペグ化誘導体；
インターフェロンα−２ａ、α−２ｂまたはα−Ｎ３；
インターフェロンβ−１ａまたはβ−１ｂ；
インターフェロンγ−１ｂ；
インターフェロンλ１、λ２またはλ３；
ペグ化インターフェロンα−２ａ、α−２ｂ、λ１、λ２またはλ３；
Ｍｙｒｃｌｕｄｅｘ Ｂ；
任意の抗ウイルスサイトカインまたはそのペグ化誘導体；
胸腺タンパク質Ａ；および／または
抗ウイルス活性または免疫刺激活性を有することが示されている任意のポリペプチド。

多くの異なるＯＮキレート錯体を、ＯＮまたはポリペプチドの構造に影響を与えない単一の医薬組成物中で、異なるポリペプチドまたはペグ化ポリペプチド薬物と組み合わせることができるという実証が本明細書に与えられる。

これらの組成物を使用し、ＯＮキレート錯体およびポリペプチド薬物の両方を、このような治療が必要な被検体に同時に、（以下の実施例ＶＩに示されるような）単一の投与態様を用いて投与することができる。

さらに、上の組成物は、生理学的および／または医薬的に許容され得る担体、アジュバント、ビヒクルおよび／または賦形剤を含んでいてもよい。担体の特徴は、投与経路によって変わってもよい。「医薬的に許容され得る担体、アジュバント、ビヒクルおよび／または賦形剤」という用語は、被検体に投与してもよく、本明細書に記載する組成物に組み込まれてもよく、その薬理活性を破壊しない担体、アジュバント、ビヒクルまたは賦形剤を指す。本明細書に記載する医薬組成物で使用してもよい医薬的に許容され得る担体、アジュバント、ビヒクルおよび賦形剤としては、限定されないが、イオン交換剤、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、自己乳化性薬物送達システム（「ＳＥＤＤＳ」）、医薬投薬形態に使用される界面活性剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ類または他の同様のポリマー系送達マトリックス、血清タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン、バッファー基剤、例えば、ホスフェート、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩または電解質、例えば、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系基剤、ポリエチレングリコール、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー、ポリエチレングリコール、羊毛脂、カプリン酸ナトリウムまたはテトラデシルマルトシド（ＴＤＭ）、または他のアルキル化糖類のＴＤＭ誘導体が挙げられる。シクロデキストリン、例えば、α−、β−およびγ−シクロデキストリン、または化学修飾された誘導体、例えば、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンおよび３−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンを含め、ヒドロキシアルキルシクロデキストリン、または他の可溶化された誘導体を使用し、本明細書に記載する組成物の送達性を高めてもよい。

本明細書で記載する組成物は、以下に記載するような他の治療薬剤を含んでいてもよく、例えば、従来の固体または液体のビヒクルまたは希釈剤や、例えば、医薬製剤の分野でよく知られた技術に従って、望ましい投与態様に適した種類の医薬添加剤（例えば、賦形剤、バインダー、防腐剤、安定化剤、香味剤など）を使用することによって製剤化されてもよい。

本明細書に記載する組成物を、任意の適切な手段によって、例えば、経口で、例えば、錠剤、カプセル、顆粒または粉末の形態で；舌下；口腔；非経口で、例えば、皮下、静脈内、筋肉内、髄腔内または注射または点滴技術によって（例えば、滅菌の注射可能な水溶液または非水溶液または懸濁物として）；吸入によって；局所的に、例えば、クリームまたは軟膏の形態で；または直腸から、例えば、坐剤または浣腸の形態で；非毒性の医薬的に許容され得るビヒクルまたは希釈剤を含む投薬単位の製剤で投与してもよい。本組成物を、例えば、即時放出または持続性放出に適切な形態で投与してもよい。即時放出または持続性放出を、適切な医薬組成物を用いることによって、特に、持続性放出の場合には、デバイス、例えば、皮下インプラントまたは等張性ポンプを用いることによって達成してもよい。従って、上の組成物を、眼内、経口摂取、舌下、腸内、吸入、皮下注射、筋肉注射、腹腔内注射、髄腔内注射または髄腔内注入、気管内、静脈注射または静脈点滴、または局所的のいずれか１つによって投与するのに合わせて変えてもよい。

経口投与のための例示的な組成物としては、例えば、かさを付与するための微結晶性セルロース、懸濁剤としてのアルギン酸またはアルギン酸ナトリウム、粘度向上剤としてのメチルセルロース、および甘味剤または香味剤、例えば、当該技術分野で知られているものを含んでいてもよい懸濁物；および例えば、微結晶性セルロース、デンプン、ステアリン酸マグネシウムおよび／またはラクトースおよび／または他の賦形剤、バインダー、増量剤、崩壊剤、希釈剤および滑沢剤、例えば、オリゴヌクレオチドキレート安定性を妨害しない当該技術分野で知られているものを含んでいてもよい即時放出錠剤が挙げられる。また、本組成物を、舌下投与および／または口腔投与によって口腔を介して送達してもよい。成型した錠剤、圧縮した錠剤または凍結乾燥した錠剤は、使用可能な例示形態である。例示的な組成物としては、迅速に溶解する希釈剤、例えば、マンニトール、ラクトース、スクロースおよび／またはシクロデキストリンを用いて本組成物を製剤化するものが挙げられる。さらに、このような製剤に含まれるのは、高分子量賦形剤、例えば、セルロース（ａｖｉｃｅｌ）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であってもよい。このような製剤は、粘膜付着を補助する賦形剤、例えば、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ナトリウムカルボキシメチルセルロース（ＳＣＭＣ）、無水マレイン酸コポリマー（例えば、Ｇａｎｔｒｅｚ）および放出を制御する薬剤、例えば、ポリアクリルコポリマー（例えば、カルボポール９３４）を含んでいてもよい。また、製造および使用を容易にするために、滑沢剤、滑剤、香味剤、着色剤および安定化剤を加えてもよい。

本明細書に記載する化合物の有効量は、当該技術分野の一般的な技術によって決定されてもよく、成人について、１日あたり、体重１ｋｇあたり約０．１〜５０ｍｇ／ｋｇの活性化合物といった例示的な投薬量を含み、これを１回の投薬で投与してもよく、例えば、（限定されないが）１日に１〜５回または週に１〜７回の個々に分けた投薬量の形態で投与してもよい。任意の特定の被検体のための特定の投薬レベルおよび投薬頻度は、変わってもよく、使用する特定の化合物の活性、この化合物の代謝安定性および活性の長さ、被検体の種類、年齢、体重、全身の健康状態、性別、食事、投与態様および投与時間、排泄速度およびクリアランス、薬物の組み合わせおよび特定の状態の重篤度といった種々の因子に依存して変わることが理解されるだろう。治療に好ましい被検体としては、動物、最も好ましくは、哺乳動物種、例えば、ヒトおよび家畜、例えば、イヌ、ネコなどが挙げられる。

ウイルスに感染したヒト患者を治療するために、組み合わせで使用する場合、抗ウイルスオリゴヌクレオチドキレート錯体および抗ウイルスポリペプチドの有益な抗ウイルス活性の例も本明細書に提供する。

以下の実施例を参照することによって、本開示はさらに簡単に理解されるだろう。

（実施例Ｉ）
（ＯＮキレート錯体の形成）
図１Ａは、同時にカラムに一緒に注入された２種類のＯＮ調製物のＨＰＬＣ（疎水性カラムを用いる）による分離の詳細である。これらの１つ目は、内部標準と呼ばれ、特定の確定した配列を有する２１マーのホスホロチオエートＯＮであり、２つ目はＲＥＰ ２００６（４０マーの縮重ホスホロチオエートＯＮ）である。これら両方の種は、その物理化学特性（すなわち、大きさおよび疎水性）にのみ由来して別個の確定したピークに分離され、これらそれぞれのＯＮに存在するヌクレオチド配列は、その物理化学特性に意義のある影響はなく、従って、その分離に影響がない。そのように、内部標準は、ＲＥＰ ２００６と比較して、これら２種類のＯＮポリマーの大きさの違いのみに起因して、もっと短い保持時間で厳密に確定したピークとしてカラムから溶出する。ＲＥＰ ２００６のピークの片方の端にある肩部は、比較的長いＯＮの産生に典型的な配列の失敗に起因することを注記しておく。非常に多くの異なる配列が存在するが、ＲＥＰ ２００６の不均一な配列の性質にかかわらず、ＲＥＰ ２００６調製物中のすべての種類に共通の物理化学的特性を示す２１マーの特定の配列としてＨＰＬＣによって同様に十分に確定されたピークとして分離される。ＲＥＰ ２００６および２１マーピークのＨＰＬＣ分離の後、これらに対し、質量分析法（ＭＳ）を行い、これらの確定したピークの中に存在する種類を特定することができる（図１Ｂおよび１Ｃ）。

図１Ｂでは、この２１マーは、ＭＷが７４０２．６Ｄａの単一の種類に分離され、確定した配列を有するＰＳ−ＯＮと一致する。しかし、ＲＥＰ ２００６のＭＳ分析（図１Ｃ）から、質量範囲がほとんど完全な正規分布を有し、完全な縮重の性質と一致する非常に多量の種類が存在することがわかる。この質量範囲は、Ｃ４０（最小の種類）からＡ４０（最大の種類）にわたり、これらの種の出現率は非常に小さく、その質量が質量範囲の中心に近づくにつれて種類の数（ピーク強度）が増加する。これは、ますます多くの異なる配列から同様の質量が生じるためである。ＲＥＰ ２００６に存在する異なるＯＮ種類のすべてが、ＨＰＬＣ分離中に疎水性カラムで同じ保持時間を有するという事実は、同じ大きさの同じ化学修飾（すなわち、ホスホロチオエート化）を有するすべてのＯＮは、非常によく似た（同じではない場合）物理化学的特性を有し、それ自体が、特定のＯＮ分子に存在するヌクレオチドの配列に依存しない任意の用途または特性において機能的によく似ていると考え得ることを明確に示す。従って、任意の特定の縮重ＯＮで観察された任意のＯＮキレート錯体（例えば、ＲＥＰ ２００６）は、存在するＯＮの配列に依存するはずはなく、任意のＯＮの保存された物理化学的特性に依存しなければならない。

（実施例ＩＩ）
（抗ウイルスＯＮを用いたキレート錯体の形成）
ＲＥＰ ２０３１、ＲＥＰ ２０５５、ＲＥＰ ２０５７およびＲＥＰ ２１３９は、ＨＩＶ、ＨＳＶ、サイトメガロウイルス、ＬＣＭＶ、ＨＣＶおよび他のエンベロープウイルスに対して広いスペクトルの抗ウイルス活性を有する核酸ポリマー（ＮＡＰ）である（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ、２００８、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．５２：２７２７−２７３３；Ｃａｒｄｉｎ ｅｔ ａｌ、２００９、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ Ｊ．６：２１４；Ｖａｉｌｌａｎｔ ｅｔ ａｌ、２００６、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、５０：１３９３−１４０１；Ｇｕｚｍａｎ ｅｔ ａｌ、２００７、Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｔｈｅｒａｐｙ、１２：１１４７−１１５６；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、３７２：１０７−１１７；Ｍａｔｓｕｍｕｒａ ｅｔ ａｌ、２００９、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １３７：６７３−６８１）。これらの化合物は、すべて、４０マーの完全にホスホロチオエート化したＯＮであり、５’−３’配列が、ＲＥＰ ２０３１（配列番号１）の場合にはＣ₄₀、ＲＥＰ ２０５５（配列番号２）の場合には（ＡＣ）₂₀、ＲＥＰ ２０５７（配列番号３）の場合には（ＡＧ）₂₀、ＲＥＰ ２１３９（配列番号１８）の場合には（２’ＯＭｅＡ−２’ＯＭｅ、５’ＭｅＣ）₂₀である。一方、ＲＥＰ ２０３１、ＲＥＰ ２０５５およびＲＥＰ ２０５７は、ＤＮＡ ＯＮであり、ＲＥＰ ２１３９は、ＲＮＡ ＯＮであり、すべてのリボースが２’位でＯメチル修飾されており、すべてのシトシンが５’メチル化されている。

これらの化合物の３’ＦＩＴＣ標識された誘導体を用いた蛍光偏光によって、これらの抗ウイルスＯＮを用いたキレート錯体の生成を試験した。ＯＮの合成中、各ＯＮを、十分に確立された試薬および合成プロトコルを用い、硬い３炭素リンカーによって３’末端でフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）にコンジュゲート化した。この合成によってこれらのＯＮを切断し、アンモニウム塩として残した。これらのＯＮを、それぞれ１ｍＭトリス（ｐＨ７．２）中の０．５ｍＭストックとして調製した。これらのストックを使用し、ＦＰバッファー（１０ｍＭトリス、８０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ β−メルカプトエタノールおよび０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０）中の３ｎＭ蛍光ＯＮ溶液を調製した。ＦＰ測定の前に、溶液中に存在する二価の金属を除去するために、ＥＤＴＡが存在した。これらのバッファー溶液は、それぞれ、モル過剰の一価カチオン存在下、ＯＮ錯体形成を評価するために、８０ｍＭ ＮａＣｌも含んでいた。溶液中のそれぞれの蛍光ＯＮに、ＡＣＳグレードの二価の（２＋）金属の塩化物塩を加えた（表２に記載されるように）。ＯＮキレート錯体の形成の増加により質量のより大きな変化が生じるように、蛍光偏光の増加によって、ダイマーまたはより高次のＯＮキレート錯体の形成を監視した（無次元の単位「ｍＰ」によって定量）（図３を参照）。溶液中のこれらのＯＮキレート錯体の回転がゆっくりになると、発光する蛍光の偏光が増加した（図４を参照）。これらの実験結果を表２に表す。
平均および標準偏差は、2回の測定に基づいたものであった。

それぞれの場合に、マグネシウムカチオンおよびカルシウムカチオンの存在下、すべての蛍光標識したＯＮについて蛍光偏光の顕著な増加がみられ、これは、これらの二価の金属カチオンとのＯＮキレート錯体形成を示す。これらの結果は、以下のことを示す。
・カルシウムおよびマグネシウム存在下、ＲＥＰ ２００６、ＲＥＰ ２０３１、ＲＥＰ ２０５５、ＲＥＰ ２０５７およびＲＥＰ ２１３９は、ダイマーまたはより高次の錯体を形成する。これらの錯体は、すべての他の二価の金属カチオンおよび任意のＯＮを用いても形成されると予想される（縮重ＮＡＰ ＲＥＰ ２００６を用いて示されるように）。これらのＯＮ錯体の形成は、これらのＯＮと、これらの二価の金属カチオンとの相互作用を含む。
・ＲＥＰ ２０３１、ＲＥＰ ２０５５、ＲＥＰ ２０５７またはＲＥＰ ２１３９は、使用した実験条件では自己ハイブリダイズすることができないため、ＯＮ錯体の生成は、従来のＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ相互作用を介する窒素系塩基の間のハイブリダイゼーションに起因するものとは考えられない。
・これらのＯＮ錯体の形成は、水溶液中で安定であり、可溶性であり、かつ、これらの錯体が、生成する錯体の一部として、問題にしている二価の金属を組み込むと思われるため、これらのＯＮ錯体は、問題となる二価金属を、ＯＮ錯体が形成される溶液からキレート化する作用を有する。

（実施例ＩＩＩ）
（ＯＮキレート錯体およびポリペプチドを含有する組成物の調製）
ＯＮキレート錯体およびポリペプチドを含有する組成物の調製を、５種類の異なる抗ウイルスＯＮと４種類の抗ウイルスポリペプチドを用いて行った。使用したＯＮは、ＨＢＶ、ＨＣＶ、インフルエンザ、ＲＳＶ、エボラ、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２を含むエンベロープウイルスで広いスペクトルの抗ウイルス活性を有することが既に示されているＮＡＰＳであった。これらのＯＮは、ＲＥＰ ２００６（４０マーの縮重ホスホロチオエートＮＡＰ）、ＲＥＰ ２０５５（配列番号２）、ＲＥＰ ２０５７（配列番号３）、ＲＥＰ ２１３９（配列番号１８）およびＲＥＰ ２１４８（配列番号１１）である。これらのＮＡＰは、フロー反応器中、標準的な固相合成条件で調製され、さらに、塩交換し、精製中にアンモニウム対イオンをナトリウム対イオンと交換した。これらのＯＮの理論的な遊離酸の分子量は、それぞれ（１２６１２〜１３０９２）、１２６１２、１３４１３および１４０９４および１２８９３Ｄａである。使用した抗ウイルスポリペプチドは、インターフェロンα−２ｂ、チモシンα１、ペグ化インターフェロンα−２ａおよびインターフェロンλ１（ＩＬ−２９）であり、すべて抗ウイルス活性を有することが示されている（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ、２００８、Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ．、７７：１３６−１４１；Ｆｒｉｅｄ ｅｔ ａｌ、２００２、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３４７：９７５−９８２；Ｆｒｉｂｏｒｇ ｅｔ ａｌ、２０１３、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．５７：１３１２−１３２２）。すべてのＯＮを、固相オリゴヌクレオチド合成について当該技術分野での現行の標準に従って合成し、許容された方法を用い、ｉｎ ｖｉｖｏ投与に適したナトリウム塩として調製し、保存前に含水量が１０％未満になるまで凍結乾燥させた。ＲＥＰ ２００６、ＲＥＰ ２０５５、ＲＥＰ ２０５７およびＲＥＰ ２１４８は、固相合成中に通常発生する少量の不完全な合成生成物を含有する未精製調製物であった。ＲＥＰ ２１３９を、不完全な合成生成物がほとんど存在しないもっと純度の高い調製物として調製した。ＲＥＰ ２００６、ＲＥＰ ２０５７およびＲＥＰ ２１３９を、通常の生理食塩水溶液としてあらかじめ調製しておき、キレート生成中に２５ｍｇ／ｍｌに調整した。ＲＥＰ ２０５５も、通常の生理食塩水溶液としてあらかじめ調製しておくが、キレート調製中に１２．５ｍｇ／ｍｌに調整した。チモシンα１は、分子量が３１０８Ｄａであり、２８アミノ酸の合成アミノ末端アシル化ペプチドを市販製剤（Ｚａｄａｘｉｎ（商標））として得て、注射のために１．６ｍｇ／ｍｌ水溶液として調製した。組み換えＤＮＡ技術を用いてインターフェロンα−２ｂをＥ．ｃｏｌｉ中で産生させ、インターフェロンα−２ｂは、分子量が１９２７１Ｄａである。インターフェロンα−２ｂを市販製剤（Ｉｎｔｒｏｎ Ａ（商標））で得て、注射のために、１ｍｇ／ｍｌのヒト血清アルブミン（分子量が約６６５００Ｄａ）も含有する１×１０⁷ＩＵ／ｍｌ水溶液として調製した。ペグ化インターフェロンα−２ａは、分子量合計が約６００００Ｄａのインターフェロンα−２ａおよび単一の分枝鎖ビス−モノメトキシポリエチレングリコール鎖の共有結合コンジュゲートである。ペグ化インターフェロンα−２ａを市販製剤（Ｐｅｇａｓｙｓ（商標））として得て、３６０ｕｇ／ｍｌの濃度で痕跡量のベンジルアルコールを含有する水で注射のためにあらかじめ希釈しておいた。精製した組み換えインターフェロンλ１（ＩＬ−２９）を、Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＳａｎＤｉｅｇｏ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）製のリン酸緩衝化生理食塩水の０．５ｍｇ／ｍｌ担体不含溶液として得て、ゲル電気泳動で決定する場合、分子量が約２０ｋＤａである。

塩化カルシウムを、注射のためのＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏの１００ｍｇ／ｍｌ ＵＳＰ水調製物として得た（ＨｏｓｐｉｒａによるＬｉｆｅｓｈｉｅｌｄ（商標））。硫酸マグネシウムを、注射のためのＭｇＳＯ₂・７Ｈ₂Ｏの５００ｍｇ／ｍｌ ＵＳＰ水調製物（Ｂａｘｔｅｒ）として得て、これを通常の生理食塩水で１００ｍｇ／ｍｌに希釈した。カルシウム、マグネシウムまたはカルシウムとマグネシウムを含有するＯＮキレート錯体を調製するために、一定速度で混合しつつ、ＯＮに対する金属塩の望ましい比率が達成されるまで、これらの金属塩溶液をＯＮ溶液に徐々に滴下した。カルシウムキレート錯体の場合、ＯＮ １００ｍｇあたり、塩化カルシウム３０ｍｇという比率が溶液中で得られたが、但し、ＲＥＰ ２１４８カルシウムキレート錯体の場合には、１００ｍｇのＯＮあたり、２０ｍｇの塩化カルシウムを含んでいた。マグネシウムキレート錯体の場合、ＯＮ １００ｍｇあたり、マグネシウムサルフェート３０ｍｇの比率を溶液中で得た。混合カルシウム／マグネシウムキレート錯体の場合、ＯＮ １００ｍｇあたり、塩化カルシウム１５ｍｇおよび硫酸マグネシウム１５ｍｇの比率を溶液中で得た。この方法論によって、ＯＮキレート錯体が生成することが示されている（米国出願公開第２０１２／００４６３４８号に記載されるように）。この手順終了時に、ＯＮキレート錯体は、非常に淡い黄色がかった色を有する透明で均一な溶液であった。

ＯＮキレート錯体溶液をポリペプチドまたはペグ化ポリペプチド溶液と１：１の比率で最終体積が１ｍｌになるように穏やかに混合することによって、ＯＮキレート錯体／ポリペプチドまたはペグ化ポリペプチド組成物を調製した。

（実施例ＩＶ）
（ＯＮキレート錯体とポリペプチドとを含有する組成物の特性決定）
実施例ＩＩＩで調製した組成物に含まれるＯＮおよびポリペプチドまたはペグ化ポリペプチドの属性を確認するために、これらを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって分析した後、エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）によって分析した。これらの組成物中に存在するＯＮおよびポリペプチドまたはペグ化ポリペプチド種の質量および化学が広範囲に変化するため、３種類の異なるＨＰＬＣ方法論を分析のために使用した。
オリゴ方法：固相：2×50mm ACE (商標) C18 (3um)
移動相：A = 1/0.1% HFIPA/DIEA
B = 65/0.075/0.0375% ACN/HFIPA/DIEA
勾配：20分の間5-25% B
60℃で2分の間70% B
流速：0.4 ml/min
タンパク質方法１：固相：2×50mm PLRP-s (Agilent(商標)) 4000A (8um)
移動相：A = ACN中0.05% TFA
B = ACN中0.05% TFA
C = H₂O中0.1% NH₄OH
D = 40/40/20 ACN/MeOH/H₂O中、0.1% NH₄OH
勾配：80/20% C/Dで1分間洗浄して廃棄
(場合により、20% Dで1分間洗浄して廃棄)
15分の間20%-100% D、2分の間100% B
(場合により、16分の間20-70% B)
流速：洗浄のために0.5 ml/min
勾配のために0.3 ml/min
タンパク質方法２：固相：2×50mm PLRP-s (Agilent(商標)) 4000A (8um)
移動相：A = ACN中0.05% TFA
B = ACN中0.05% TFA
C = H₂O中0.1% NH₄OH
D = 40/40/20 ACN/MeOH/H₂O中、0.1% NH₄OH
勾配：80/20% C/Dで1分間洗浄して廃棄
15分の間80/20% A/B-100% B
2分の間100% B
流速：洗浄のために0.5 ml/min
勾配のために0.3 ml/min

使用した装置は、オリゴ方法の場合には、負イオンを用いたＬＴＱスキャンモードで、両方のタンパク質方法の場合には、正イオンを用いた解像度７５００でのＯｒｂｉｔｒａｐ高質量スキャンモードで操作したＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙであった。省略語：ＡＣＮ＝アセトニトリル、ＴＦＡ＝トリフルオロ酢酸、ＨＦＩＰＡ＝ヘキサフルオロイソプロパノール、ＤＩＥＡ＝Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン。

これらの分析から得た結果は、図５〜９５に見出すことができる。すべてのＨＰＬＣクロマトグラムは、全イオン流（ＴＩＣ）のデータからプロットし、ピークの保持時間は、その後のＥＳＩ−ＭＳによって質量属性を伴う（ペグ化インターフェロンα−２ａ中のポリエチレングリコールコンジュゲートの存在によって妨害された図３９、４３、４７、５１、５５、７７、８１、９１および９５を除く）。ＯＮキレート錯体とチモシンα１とを含む組成物の場合には、オリゴ方法は、両方の種を同時に分析するのに十分であった。大きな分子量のタンパク質を含有する他の組成物の場合、ＯＮの分析およびポリペプチドの分析を同じサンプルで行ったが、異なるＨＰＬＣ方法を用いて行った（図５〜９５に示すように）。

すべての組成物のＯＮ含有量のＬＣ−ＭＳ分析は、これらの組成物中に存在するＯＮが、その予想される純度に対応していることを示しており、ＲＥＰ ２０５５（図５、２４、４０、５６、６８、７１、７４および７８）、ＲＥＰ ２０５７（図９、２７および４４）およびＲＥＰ ２１４８（図１７、３３、５２および６４）の場合には、オリゴ方法を用い、少量の不完全なＯＮ合成生成物がＨＰＬＣ分析で観察されたが、ＲＥＰ ２１３９の場合には存在しなかった（図１３、３０、４８、６０、８２、８５、８８および９２）。すべての場合に、リード（主要）ＯＮピークのＥＳＩ−ＭＳは、ＲＥＰ ２０５５、ＲＥＰ ２０５７、ＲＥＰ ２１３９およびＲＥＰ ２１４８の予想される分子量とほぼ完全に相関関係にあった。ＲＥＰ ２００６の場合、リードピークのＥＳＩ−ＭＳは、１２６１２〜１３０９２Ｄａ範囲に広く分布したピークを生成し、その縮重性と一致していた（図２２および３７）。

インターフェロンα−２ｂを含有する組成物を分析するために、タンパク質方法１を用いて行ったＨＰＬＣクロマトグラムは、これらの組成物中に１個より多いポリペプチドが存在することと一致して、大きな解像度の悪いピークを示した（図７、１１、１５および１９）が、リードピークは、インターフェロンα−２ｂおよびヒトアルブミンの予想される分子量にほぼ実際に相関関係にある２個の別個の質量種に分離した（図８、１２、１６および２０）。

チモシンα１を含有する組成物の場合、オリゴ方法１から得られたＨＰＬＣクロマトグラムは、同じ分離状態で、ポリペプチドの相対的に低い分子量に起因して、（主要）ＯＮピークよりも保持時間がかなり短い第２の目立ったピークを捕捉することができた（図２１、２４、２７、３０、３３、６８、７１、８２および８５）。すべての場合に、この第２のピークのＥＳＩ−ＭＳは、チモシンα１の予想される分子量とほぼ実際に相関関係にあった（図２３、２６、２９、３２、３５、７０、７３、８４および８７）。

ペグ化インターフェロンα−２ａを含有する組成物の場合、ＬＣ−ＭＳ分析は、ペグ化コンジュゲートの存在によってきわめて複雑であり、多くのイオン種を生成し、任意のペグ化ポリペプチドの質量スペクトルを正しくデコンボリューションすることは非常に困難である。しかし、タンパク質方法２を用い、ペグ化インターフェロンα−２ａを含有する組成物から得たＨＰＬＣデータは、すべて、ペグ化ポリペプチドの予想された保持時間と一致した同様の目立ったピークを示した（図３８、４２、４６、５０、５４、７６、８０、９０および９４）。すべての場合でこれらのピークのＥＳＩ−ＭＳ分析は、ペグ化タンパク質の存在に一致するｍ／ｚ ６００〜１００から１５００〜３６００までのペグ化に関連するシグナルの同様の群を示した（図３９、４３、４７、５１、５５、７７、８１、９１および９５）。

実施例ＩＩＩで調製したすべてのオリゴヌクレオチドキレート−ポリペプチド組成物の一部は、誘導結合プラズマ光学発光スペクトル（ＩＣＰ−ＯＥＳ）によるカルシウムまたはマグネシウム測定にも供した。分析したそれぞれの組成物について、カルシウムおよびマグネシウムの測定値を表３に示す。

実施例ＩＩＩおよびＩＶから得た結果は、以下のことを示す。
１．カルシウム、マグネシウムまたは混合カルシウム／マグネシウムを含むＯＮキレート錯体と、ポリペプチドまたはペグ化ポリペプチドとを含有する組成物は、非経口投与に適するように調製することができる。
２．ＲＥＰ ２０５５、ＲＥＰ ２０５７、ＲＥＰ ２１３９、ＲＥＰ ２１４８、インターフェロンα−２ｂ、チモシンα１およびインターフェロンλ１について、観察された分子量と理論分子量とにほぼ完全な相関関係があることによって実証されるように、問題としているこれらの組成物中のＯＮも、ポリペプチドまたはペグ化ポリペプチドも、なんら検出可能な化学変化を受けない。
３．ペグ化インターフェロンα−２ａを含有する組成物の場合には、ＯＮは改変されず、ポリペプチドの改変（存在する場合）は、検出することができなかった。

これらの結果から、以下も推論することができる。
１．ＲＥＰ ２００６は、完全な縮重ＯＮであり、それ自体が、すべてのＯＮに共通の物理化学的特性のプロトタイプモデルである。そのように、キレート錯体として製剤化可能な任意のＯＮは、溶液中でこれらのポリペプチドまたはペグ化ポリペプチドと適合性であろう。
２．ＲＥＰ ２００６、ＲＥＰ ２０５５、ＲＥＰ ２０５７およびＲＥＰ ２１４８は、ＤＮＡであり、一方、ＲＥＰ ２１３９はＲＮＡである。従って、任意のＲＮＡまたはＤＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドＯＮを、ＯＮキレート錯体およびポリペプチドを含有する組成物の調製に使用することができる。
３．ＲＥＰ ２００６、ＲＥＰ ２０５５およびＲＥＰ ２０５７は、修飾されていないリボースを有し、一方、ＲＥＰ ２１３９は、それぞれ、リボースが２’位でＯメチル化されている。従って、任意の２’位でのリボース修飾は、ＯＮキレート錯体およびポリペプチドを含有する組成物の調製に適合性であろう。
４．ＲＥＰ ２１３９およびＲＥＰ ２１４８は、それぞれ、５’メチルシトシンとしてさらに修飾されたシトシンを含む。そのように、修飾された塩基を含むＯＮを、ＯＮキレート錯体およびポリペプチドまたはペグ化ポリペプチドを含有する組成物の調製に使用することができる。
５．ＯＮキレート錯体と、ポリペプチドまたはペグ化ポリペプチドとを含む組成物は、任意の医薬的に許容され得る二価金属カチオン、例えば、カルシウムおよび／またはマグネシウムと適合性であろう。
６．組成物の調製に使用する４種類のポリペプチドは、広く多様な構造に広がっており、チモシンα１は、小さな合成ポリペプチドであり、インターフェロンα−２ｂおよびインターフェロンλ１は、大きな組み換えポリペプチドであり、ペグ化インターフェロンα−２ａは、大きく複雑なペグ化コンジュゲートである大きな組み換えペプチドである。従って、ＯＮキレート錯体とポリペプチドとを含む組成物を、ポリエチレングリコールのような複雑なコンジュゲートを用い、小さな合成ペプチドから大きな組み換えポリペプチドまでの広範囲のポリペプチドを用いて首尾よく調製することができる。おそらく、唯一の限定は、問題としているポリペプチドが、水溶液に可溶性であるべきであるということである。さらに、Ｉｎｔｒｏｎ Ａ（インターフェロンα−２ｂの供給源として使用）の中の担体タンパク質としてのＢＳＡの使用は、このポリペプチド製剤を用いて調製した組成物の安定性を妨害しなかった。
７．上述のように、ペグ化は、当該技術分野で、ポリペプチドの忍容性および薬物動態挙動を高めることが知られており、多くのペグ化ポリペプチドは、現時点で、承認されている医薬として使用中である（上を参照）。従って、本明細書に記載する組成物を、ペグ化ペプチド存在下で十分に忍容性にすることができるという証明、および改善された抗ウイルス応答のためのヒト患者でのＯＮキレート錯体とペグ化ペプチドとを合わせる有用性（以下の実施例ＶＩを参照）は、当業者に対し、記載される組成物の一部であると本明細書で把握される任意のポリペプチドが、ペグ化ポリペプチドとして存在してもよいという明確な教示を与える。例えば、チモシンα１は、ペグ化されていてもよく、インターフェロンα−２ｂは、ペグ化されていてもよく（インターフェロンα−２ｂのペグ化態様Ｐｅｇ−ｉｎｔｒｏｎ（商標）は、現時点で承認されている医薬である）、インターフェロンλ１は、ペグ化されていてもよい（インターフェロンλ１のペグ化態様が、現時点で抗ウイルス剤として臨床開発中である）。

（実施例Ｖ）
（ＮＡＰは、細胞を出て行くＨＢｓＡｇの通過を阻害する）
Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）は、ＨＢＶ感染に対する免疫応答の多くの側面をブロックすることが示されている（Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ、Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ４３：４６５−４７１；Ｍｏｕｃａｒｉ ｅｔ ａｌ、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ４９：１１５１−１１５７；Ｖａｎｌａｎｄｓｃｈｏｏｔ ｅｔ ａｌ、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８３：１２８１−１２８９；Ｗｏｌｔｍａｎ ｅｔ ａｌ、ＰｌｏＳ Ｏｎｅ ６：ｅ１５３２４；Ｗｕ ｅｔ ａｌ、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ４９：１１３２−１１４０およびＸｕ ｅｔ ａｌ、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ４６：２６４０−２６４６）。従って、循環するＨＢｓＡｇの除外は、慢性Ｂ型肝炎に感染した患者において、免疫能力を修復することができる重要な因子であろう。循環中のＨＢｓＡｇを除外するための有効な方法は、感染した細胞からＳＶＰの生成および／または放出を防ぐことである（ＳＶＰは、血液中のＨＢｓＡｇの主要な担体である）。ＳＶＰの形態発生および細胞内の通過は、ＳＶＰを特異的に豊富に含む形態であるＨＢｓＡｇタンパク質の小さな形態（ｓＨＢｓＡｇ）を発現させることによって、ＢＨＫ−２１細胞中、ｉｎ ｖｉｔｒｏでモデルにすることができる。このモデル系は、ヒト患者におけるＨＢＶ ＳＶＰの形態発生および通過の代理モデルであると考えられる（Ｐａｔｉｅｎｔ ｅｔ ａｌ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８１：３８４２−３８５１）。ＨＢＶ感染を慢性化する血清ＨＢｓＡｇの重要な役割のために、このモデルにおいて、化合物がＳＶＰの生成またはその細胞内の通過をブロックする能力は、ＨＢＶに対する抗ウイルス活性を示す。

完全に縮重ホスホロチオエート化ＮＡＰであるＲＥＰ ２００６およびＲＥＰ ２１０７（２１０７も、すべてのリボースが２’Ｏメチル修飾を有する）、非ホスホロチオエート化した完全に２’Ｏメチル化した縮重ＮＡＰ（ＲＥＰ ２０８６）およびポリＡＣ配列からなるＮＡＰ：ＲＥＰ ２０５５（配列番号２）およびＲＥＰ ２１４８（配列番号１１）を含む種々のＮＡＰ化合物を、ｓＨＢｓＡｇを発現するＢＨＫ−２１細胞において試験した。これらのＮＡＰを、エレクトロポレーションを用いたｓＨＢｓＡｇ発現のためのテンプレートＲＮＡと同時に、エレクトロポレーションによってＢＨＫ−２１細胞に導入した。免疫蛍光顕微鏡検査法によってＢＨＫ−２１細胞の内側のＨＢｓＡｇタンパク質の位置を視覚化することによって、ＢＨＫモデル系における活性を評価した。ＨＢｓＡｇが核の周囲の空間に制限され、細胞の周囲へと通過する（分泌）のが抑えられる場合、化合物が活性であると判断した。種々のＮＡＰ化合物の活性を以下の表４にまとめる。
− ＝ 影響は観察されない
＋から＋＋＋＋ ＝ わずかな効果から完全な効果までが観察される

ｓＨＢｓＡｇを発現するＢＨＫ−２１細胞をＲＥＰ ２００６およびＲＥＰ ２１０７で治療した結果は、ＮＡＰが、配列に依存しない様式でｓＨＢｓＡｇの通過をブロックする能力を示す。ＲＥＰ ２０８６はこの活性をもたず、この活性は、厳格にホスホロチオエート化の存在に依存することを示す。さらに、この能力は、２’リボース修飾の存在下で保持され（ＲＥＰ ２１０７において）、塩基修飾の存在下で保持される（ＲＥＰ ２１４８の場合には、５’メチルシトシン）。さらに、ＲＥＰ ２１０７、ＲＥＰ ２０５５およびＲＥＰ ２１３９は、免疫刺激活性を完全にもたないことが知られており、ＲＥＰ ２００６に匹敵する活性であった。さらに、ポリＡＣの確定した配列（ＲＥＰ ２０５５およびＲＥＰ ２１４８）は、縮重配列（ＲＥＰ ２００６およびＲＥＰ ２１０７）に対し、匹敵するレベルで活性であった。

これらの結果は、縮重配列およびＡＣという繰り返し（従って、ＣＡでもある）を含む配列、および交互のプリン／ピリミジンヌクレオチド（例えば、ＴＧおよびＧＴまたはＵＧおよびＧＵ）という繰り返しも含み、２’リボース修飾または塩基修飾も含み、または２’リボース修飾と塩基修飾を含む他の配列という観点で（実施例ＶＩのＲＥＰ ２１３９を参照）、ホスホロチオエート化ＮＡＰは、米国特許第８，００８，２６９号、同第８，００８，２７０号および同第８，０６７，３８５号に記載されるように、２０〜１２０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド長で、感染した細胞からのＳＶＰの生成および細胞内での通過および分泌をブロックすることが可能であると予想されることを示す。

（実施例ＶＩ）
（ヒト患者における慢性Ｂ型肝炎を治療するための併用療法）
ＲＥＰ ２０５５は、ホスホロチオエート化ＯＮの単純なナトリウム塩である（配列番号２）。ＲＥＰ ２１３９−Ｃａは、存在するオリゴヌクレオチド１００ｍｇあたり、３０ｍｇのＣａＣｌ₂の比率を用い、通常の生理食塩水で調製したホスホロチオエートオリゴヌクレオチドＲＥＰ ２１３９のカルシウムキレート錯体である（配列番号１８）。ＲＥＰ ２０５５およびＲＥＰ ２１３９は、ＮＡＰであり、この化合物群は、エンベロープウイルスに対して有効な広いスペクトルの抗ウイルス化合物である（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ、２００８、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ、５２：２７２７−２７３３；Ｃａｒｄｉｎ ｅｔ ａｌ、２００９、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ Ｊｏｕｒｎａｌ、６：２１４；Ｇｕｚｍａｎ ｅｔ ａｌ、２００７、Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｔｈｅｒａｐｙ、１２：１１４７−１１５６；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ、２００８、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、３７２：１０７−１１７；Ｍａｔｓｕｍｕｒａ ｅｔ ａｌ、２００９、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、１３７：６７３−６８１；Ｖａｉｌｌａｎｔ ｅｔ ａｌ、２００６、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ、５０：１３９３−１４０１および米国特許第８，００８，２６９Ｂ号、同第８，００８，２７０号および同第８，０６７，３８５号）。キレート錯体は、ＮＡＰまたは他のＯＮ種の生体活性に影響を与えないため、カルシウムキレート錯体としてのＲＥＰ ２１３９の製剤は、抗ウイルス活性になんら影響を与えない。抗ウイルス活性のために必要な唯一のＮＡＰ修飾は、ＯＮ中の各結合のホスホロチオエート化である。２’位でのリボース修飾（例えば、２’Ｏメチル化）および塩基修飾（例えば、５’メチルシトシンおよび４’チオウラシル）を含むさらなる修飾は、ＮＡＰの抗ウイルス活性への影響は無視できるが、これを使用し、ヒト患者での忍容性を最適化することができる。

ペグ化インターフェロンα−２ａは、Ｒｏｃｈｅ Ｉｎｃ．（バーゼル、スイス）によってＰｅｇａｓｙｓ（商標）という商標で販売され、慢性ＨＢＶ感染の治療について承認されている。チモシンα１は、ＳｃｉＣｌｏｎｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（フォスターシティ、カリフォルニア、Ｕ．Ｓ．Ａ．）によってＺａｄａｘｉｎ（商標）という商標で販売され、多くのアジア国において、これも慢性ＨＢＶ感染の治療について承認されている。

免疫療法（獲得免疫応答および先天性免疫応答の刺激）と組み合わせたＮＡＰ治療の抗ウイルス効果が、慢性ＨＢＶに感染した患者において抗ウイルス応答を高めることができるかどうかを調べるために、患者は、進行中のＮＡＰ計画に従って、ＲＥＰ ２０５５を単剤療法で受けるか、ＲＥＰ ２１３９−Ｃａおよびチモシンα１（Ｚａｄａｘｉｎ（商標）−週に２回、１．６ｍｇ 皮下注射として与えられる）またはペグ化インターフェロンα−２ａ（Ｐｅｇａｓｙｓ（商標）−週に１回、１８０μｇ 皮下注射として与えられる）との併用療法で受けた。

ＲＥＰ ２０５５およびＲＥＰ ２１３９−Ｃａは、単剤療法で使用する場合、一般的にＨＢＶ感染に対してすべてのＮＡＰの作用の治療機序であるＨＢｓＡｇの放出のブロックについて同等に活性がある。ＲＥＰ ２０５５およびＲＥＰ ２１３９−Ｃａは、匹敵する単剤計画で与えられる場合、それぞれ、７／８人、９／１２人の患者において、ＨＢＶ感染した患者の血清のＨＢｓＡｇクリアランスを達成し、血清ＨＢｓＡｇのクリアランスは、両方の薬物と適合性であり（表５を参照）、ナトリウム塩またはキレート錯体として与えられる場合、これらのＮＡＰの匹敵する抗ウイルス活性を示す。
*HBsAgのためのAbbott Architect（商標）定量試験によって決定した場合

インターフェロンに基づく治療は、典型的には、患者の２５％で、治療を止めた後に、ＨＢＶ感染の制御を達成し（血清ＨＢＶ ＤＮＡ＜５００コピー／ｍｌ；Ｍｏｕｒｃａｒｉ ｅｔ ａｌ、２００９、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ４９：１１５１−１１５７）、チモシンα１治療は、一般的に、匹敵する効果を有すると考えられる（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ、２００８ Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ７７：１３６−１４１）。

ＲＥＰ ２０５５単剤療法によって、治療を止めた後に、３／７人の患者（４３％）において、ＨＢＶ感染の制御を達成する（血清ＨＢＶ ＤＮＡ＜５００コピー／ｍｌ）。ＲＥＰ ２１３９−Ｃａ治療は、単剤療法で与えられる場合、血清ＨＢｓＡｇのクリアランスにおいてＲＥＰ ２０５５と同一の効果を有するが、チモシンα１またはペグ化インターフェロンα−２ａと組み合わせ、ＨＢＶに感染した８／９人の患者（８９％）において、ウイルスの制御を達成した（表６を参照）。
＊血清HBV DNA＜500コピー／ml

これらの結果は、抗ウイルスＯＮキレート錯体（この実施例では、ＲＥＰ ２１３９−Ｃａ）および抗ウイルスポリペプチド（この実施例では、ペグ化インターフェロンα−２ａまたはチモシンα１）を組み合わせた効果によって、ヒト患者においてＨＢＶ感染の治療後の制御において向上が導かれ得ることを示し、さらに、ウイルス感染した患者におけるＯＮキレート錯体およびポリペプチドまたはペグ化ポリペプチドとの併用療法の有用性を示す。

抗ウイルスＯＮキレート錯体および抗ウイルスポリペプチドで構成される組成物は、両方の薬剤を同時に与えることによってウイルス感染（ＨＢＶ感染を含む）した患者において全体的な抗ウイルス応答を高めるため、望ましいであろう（その有用性は、本実施例に開示する）。

上述の組成物中の抗ウイルスＯＮキレートは、上述の任意の抗ウイルスＯＮを含んでいてもよく、ＨＢＶの場合には、具体的には、ＲＥＰ ２０５５（配列番号３）、ＲＥＰ ２１３９（配列番号１８）、ＲＥＰ ２１４８（配列番号１１）、または上述のようなＨＢｓＡｇの通過をブロックする他のＮＡＰ化合物を含んでいてもよい。

上述の組成物中のポリペプチドは、任意の抗ウイルスポリペプチドまたはペグ化抗ウイルスポリペプチドを含んでいてもよく、ＨＢＶの場合には、具体的には、インターフェロンα−２ｂ、ペグ化インターフェロンα−２ｂ、ペグ化インターフェロンα−２ａ、チモシンα１、インターフェロンλ１またはペグ化インターフェロンλ１を含んでいてもよい。

上述の併用治療を用いたときの同様の有利な効果は、ＨＢＶ感染だけではなく、他のウイルス感染、例えば、Ｃ型肝炎、インフルエンザ、ＲＳＶ、および抗ウイルスＯＮまたは抗ウイルスポリペプチドまたはペグ化ポリペプチドの効果に対して応答し得る他のウイルスで実現することができる。ＮＡＰを本実施例で使用するが、このようなヒト患者での抗ウイルス転帰の向上は、抗ウイルスポリペプチドまたはペグ化ポリペプチドと組み合わせたとき、キレート錯体として製剤化された配列依存性機構によって作用する他の抗ウイルスＯＮを用いて達成することができる。これらの効果は、抗ウイルスオリゴヌクレオチドキレート錯体および抗ウイルスポリペプチドの正しい組み合わせを用い、他のウイルス感染にも、もっと幅広く有効であろう。例えば、ＮＡＰは、多くのエンベロープウイルス、例えば、Ｃ型肝炎、インフルエンザ、呼吸器合胞体ウイルスおよびサイトメガロウイルスに対して広く活性であり、従って、ＮＡＰキレート錯体は、適切な抗ウイルスポリペプチド（チモシンα１またはペグ化インターフェロンα−２ａであってもよいが、特定のウイルス感染にもっと適している別の抗ウイルスポリペプチドであってもよい）と組み合わせて、単剤療法でいずれかの化合物を用いるよりも、感染した被検体でかなり良好な抗ウイルス応答を発生させると予想されるだろう。別の場合に、ミラビルセンのキレート錯体（配列番号７）をインターフェロン（ペグ化されているか、またはペグ化されていない）と組み合わせ、Ｃ型肝炎に感染した患者において、抗ウイルス応答を向上させることができた。

この有利な効果は、ＮＡＰキレート錯体およびチモシンα１またはペグ化インターフェロンα−２ａも、特定のウイルス感染または免疫刺激オリゴヌクレオチドに対して開発された他の種類のオリゴヌクレオチド、例えば、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはアプタマーＯＮのＯＮキレート錯体を用いて起こると予想されることを示した。従って、これらの任意のＯＮ群から誘導されるＯＮキレート錯体と、適切な抗ウイルスポリペプチドとを組み合わせる方法は、単剤療法の抗ウイルスオリゴヌクレオチド（ナトリウム塩またはキレート錯体のいずれか）または抗ウイルスポリペプチドまたはペグ化ポリペプチドに対する応答を示した多種多様なウイルス感染に治療的な用途を有すると予想されるだろう。

上の実施例という観点で、２種類以上の抗ウイルスＯＮキレート錯体（例えば、ＮＡＰおよびアンチセンスＯＮを含むか、またはＮＡＰおよび抗ウイルスｓｉＲＮＡを含む）を、同じ経路または異なる経路によって投与される同じ製剤または複数の製剤で、１つ以上の抗ウイルスポリペプチドまたはペグ化ポリペプチド（例えば、ペグ化インターフェロンα−２ａおよびチモシンα１またはチモシンα１およびペグ化インターフェロンλ１）と組み合わせることを想定することができた。

上の実施例では、ＲＥＰ ２１３９−Ｃａを静脈内点滴によって投与し、ペグ化インターフェロンα−２ａまたはチモシンα１を皮下投与によって投与した。上の実施例の教示に基づき、当業者は、皮下注射または静脈点滴によって、ＯＮキレート錯体およびポリペプチドを同じ製剤で同時に与えることができる（例えば、上の実施例３および４に開示されたもの）ことを簡単に予想することができ、いずれかの薬剤を別個に投与する場合（同じ投与経路または異なる投与経路によって）と同じ有利な効果を有すると予想されるだろう。

本明細書に記載する抗ウイルスの設定において、ＯＮキレート錯体および抗ウイルスポリペプチドまたはペグ化ポリペプチドを用いた本明細書に記載したような併用治療の有利な効果は、これら両方の薬剤が単剤療法である程度の活性の測定値を有する治療設定においてＯＮキレートおよびポリペプチドまたはペグ化ポリペプチドを用いた併用治療の同様な有利な効果を明確に予想する。例えば、癌に関与する遺伝子を標的とする（従って、抗癌活性を有する）アンチセンスＯＮを本明細書に記載したようにＯＮキレート錯体として製剤化し、さらに、通常は単剤療法で用いられる場合に、ある程度の抗癌活性の測定値を有することが知られている免疫療法剤と組み合わせることができる。このような治療設定としては、癌、多発性硬化症およびアルツハイマー病を挙げることができる。

Claims (64)

1. 二価カチオンによって分子間で接続した２つ以上のＯＮからなるオリゴヌクレオチド（ＯＮ）キレート錯体と、少なくとも１つのポリペプチドとを含む、医薬組成物。
2. 二価カチオンによって分子間で接続した２つ以上の抗ウイルスＯＮからなる抗ウイルスＯＮキレート錯体と、少なくとも１つの抗ウイルスポリペプチドとを含む、医薬組成物。
3. ポリペプチドが、さらにペグ化されている、請求項１または２に記載の医薬組成物。
4. 前記多価カチオンが、２＋の電荷状態を有するアルカリ土類金属である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
5. 前記二価金属カチオンが、２＋の電荷状態を有する遷移金属である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
6. 前記二価金属カチオンが、２＋の電荷状態を有するランタニド金属である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
7. 前記二価金属カチオンが、２＋の電荷状態を有する後遷移金属である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
8. 前記二価金属カチオンが、カルシウムである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
9. 前記二価金属カチオンが、マグネシウムである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
10. 前記二価金属カチオンが、鉄（２＋）、マンガン、銅または亜鉛である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
11. 前記二価カチオンが、２種類以上の異なる二価金属カチオンで構成される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
12. 前記二価カチオンが、カルシウムおよびマグネシウムで構成される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
13. 前記ＯＮキレート錯体が、少なくとも１つの二本鎖ＯＮを含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
14. 前記ＯＮキレート錯体が、少なくとも１つのホスホロチオエート結合を有する少なくとも１つのＯＮを含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
15. 前記ＯＮキレート錯体が、少なくとも１つの完全にホスホロチオエート化されたＯＮを含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
16. 前記ＯＮキレート錯体が、１つの２’位が修飾されたリボースを有する少なくとも１つのＯＮを含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
17. 前記ＯＮキレート錯体が、それぞれのリボースの２’位がＯ−メチル化されている少なくとも１つのＯＮを含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
18. 前記ＯＮキレート錯体が、少なくとも１つの５’メチルシトシンを含む少なくとも１つのＯＮを含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
19. 前記ＯＮキレート錯体が、各シトシンがさらに５’メチルシトシンである少なくとも１つのＯＮを含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
20. 前記ＯＮキレート錯体が、すべてのリボースが２’位でＯメチル化され、かつ各シトシンがさらに５’メチルシトシンである少なくとも１つのＯＮを含む、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
21. 前記ＯＮキレート錯体が、配列番号１〜６および１０〜１８から選択されるオリゴヌクレオチドを含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
22. 前記ＯＮキレート錯体が、配列番号７〜９から選択されるオリゴヌクレオチドを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
23. 前記ポリペプチドが、以下
    チモシンα１；
    α−インターフェロンまたはそのペグ化誘導体；
    β−インターフェロンまたはそのペグ化誘導体；
    γ−インターフェロンまたはそのペグ化誘導体；
    λ−インターフェロンまたはそのペグ化誘導体；
    インターフェロンα−２ａ、α−２ｂまたはα−Ｎ３；
    インターフェロンβ−１ａまたはβ−１ｂ；
    インターフェロンγ−１ｂ；
    インターフェロンλ１、λ２またはλ３；
    ペグ化インターフェロンα−２ａ、α−２ｂ、λ１、λ２またはλ３；
    Ｍｙｒｃｌｕｄｅｘ Ｂ；
    抗ウイルスサイトカインまたはそのペグ化誘導体；
    胸腺タンパク質Ａ；および
    抗ウイルス活性または免疫刺激活性を有することが示されているポリペプチド
    の少なくとも１つである、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
24. 皮下投与のために製剤化された、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
25. 静脈点滴のために製剤化された、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
26. 以下の投与経路、エアロゾル吸入、眼内、経口摂取、腸内、筋肉注射、腹腔内注射、髄腔内注射、髄腔内注入、気管内、静脈注射および局所投与の少なくとも１つの投与のために製剤化された、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
27. 前記ＯＮキレート錯体が、配列番号２からなる少なくとも１つのＯＮを含む、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
28. 前記ＯＮキレート錯体が、配列番号１１からなる少なくとも１つのＯＮを含む、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
29. 前記ＯＮキレート錯体が、配列番号１８からなる少なくとも１つのＯＮを含む、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
30. エンテカビル、フマル酸テノホビルジソプロキシル、テルビブジン、アデホビルジピボキシル、ラミブジン、リバビリン、テラプレビル、ボセプレビル、ＧＳ−７９７７、テゴブビル、ザナミビル、オセルタミビル、ガンシクロビル、ホスカルネット、アシクロビル、ジドブジン、アバカビル、ロピナビル、リトナビルまたはエファビレンツのうち１つ以上をさらに含む、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
31. 担体をさらに含む、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
32. 配列番号３からなるオリゴヌクレオチドを含むＯＮキレート錯体と、ペグ化インターフェロンα−２ａとを含む、医薬組成物。
33. 配列番号１８からなるオリゴヌクレオチドを含むＯＮキレート錯体と、ペグ化インターフェロンα−２ａとを含む、医薬組成物。
34. 配列番号１１からなるオリゴヌクレオチドを含むＯＮキレート錯体と、ペグ化インターフェロンα−２ａとを含む、医薬組成物。
35. 配列番号３からなるオリゴヌクレオチドを含むＯＮキレート錯体と、チモシンα１とを含む、医薬組成物。
36. 配列番号１８からなるオリゴヌクレオチドを含むＯＮキレート錯体と、チモシンα１とを含む、医薬組成物。
37. 配列番号１１からなるオリゴヌクレオチドを含むＯＮキレート錯体と、チモシンα１とを含む、医薬組成物。
38. 配列番号３からなるオリゴヌクレオチドを含むＯＮキレート錯体と、インターフェロンα−２ｂとを含む、医薬組成物。
39. 配列番号１８からなるオリゴヌクレオチドを含むＯＮキレート錯体と、インターフェロンα−２ｂとを含む、医薬組成物。
40. 配列番号１１からなるオリゴヌクレオチドを含むＯＮキレート錯体と、インターフェロンα−２ｂとを含む、医薬組成物。
41. 配列番号３からなるオリゴヌクレオチドを含むＯＮキレート錯体と、ペグ化チモシンα１とを含む、医薬組成物。
42. 配列番号１８からなるオリゴヌクレオチドを含むＯＮキレート錯体と、ペグ化チモシンα１とを含む、医薬組成物。
43. 配列番号１１からなるオリゴヌクレオチドを含むＯＮキレート錯体と、ペグ化チモシンα１とを含む、医薬組成物。
44. 配列番号３からなるオリゴヌクレオチドを含むＯＮキレート錯体と、ペグ化インターフェロンα−２ｂとを含む、医薬組成物。
45. 配列番号１８からなるオリゴヌクレオチドを含むＯＮキレート錯体と、ペグ化インターフェロンα−２ｂとを含む、医薬組成物。
46. 配列番号１１からなるオリゴヌクレオチドを含むＯＮキレート錯体と、ペグ化インターフェロンα−２ｂとを含む、医薬組成物。
47. 配列番号３からなるオリゴヌクレオチドを含むＯＮキレート錯体と、インターフェロンλ１とを含む、医薬組成物。
48. 配列番号１８からなるオリゴヌクレオチドを含むＯＮキレート錯体と、インターフェロンλ１とを含む、医薬組成物。
49. 配列番号１１からなるオリゴヌクレオチドを含むＯＮキレート錯体と、インターフェロンλ１とを含む、医薬組成物。
50. 配列番号３からなるオリゴヌクレオチドを含むＯＮキレート錯体と、ペグ化インターフェロンλ１とを含む、医薬組成物。
51. 配列番号１８からなるオリゴヌクレオチドを含むＯＮキレート錯体と、ペグ化インターフェロンλ１とを含む、医薬組成物。
52. 配列番号１１からなるオリゴヌクレオチドを含むＯＮキレート錯体と、ペグ化インターフェロンλ１とを含む、医薬組成物。
53. 請求項１〜５２のいずれか１項に記載の医薬組成物を調製するための方法であって、この方法は、
    ａ．医薬的に許容され得る水性賦形剤に少なくとも１つのオリゴヌクレオチド（ＯＮ）ナトリウム塩を溶解する工程と；
    ｂ．ＯＮキレート錯体が可溶性のままであるように、溶解したＯＮに、医薬的に許容され得る二価の金属塩溶液を徐々に加える工程と；
    ｃ．相溶性の医薬的に許容され得る水性賦形剤に１つ以上の抗ウイルスポリペプチドを溶解する工程と；
    ｄ．前記ＯＮキレート錯体および抗ウイルスポリペプチドの溶解性が保持されるように、抗ウイルスポリペプチド溶液とＯＮキレート錯体溶液とを徐々に混合する工程と
    を含むことを特徴とする、方法。
54. 請求項１〜５２のいずれか１項に記載の医薬組成物を調製するための方法であって、この方法は、
    ａ．医薬的に許容され得る水性賦形剤に少なくとも１つのオリゴヌクレオチド（ＯＮ）ナトリウム塩を溶解する工程と；
    ｂ．ＯＮキレート錯体が可溶性のままであるように、溶解したＯＮに、医薬的に許容され得るカルシウムおよび／またはマグネシウム塩溶液のうち少なくとも１つを徐々に加える工程と；
    ｃ．相溶性の医薬的に許容され得る水性賦形剤に１つ以上の抗ウイルスポリペプチドを溶解する工程と；
    ｄ．前記ＯＮキレート錯体および抗ウイルスポリペプチドの溶解性が保持されるように、抗ウイルスポリペプチド溶液とＯＮキレート錯体溶液とを徐々に混合する工程と
    を含むことを特徴とする、方法。
55. 医薬組成物を投与する直前に、ＯＮキレート錯体溶液とポリペプチド溶液とを混ぜ合わせる、請求項５３または５４に記載の方法。
56. 溶解したＯＮに加えられる二価金属塩の比率は、オリゴヌクレオチド１００ｍｇあたり０．１〜５０ｍｇである、請求項５３または５４に記載の方法。
57. 最終的なＯＮ濃度が、０．１〜２００ｍｇ／ｍｌである、請求項５３または５４に記載の方法。
58. 二価金属塩が、塩化物塩、グルコン酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、リンゴ酸塩、アスパラギン酸塩、フマル酸塩、アスコルビン酸塩、安息香酸塩、エリソルビン酸塩、プロピオン酸塩、硫酸塩または炭酸水素酸塩のうち少なくとも１つである、請求項５３〜５７のいずれか１項に記載の方法。
59. 二価金属塩溶液が、カルシウム、マグネシウム、鉄（２＋）、マンガン、銅または亜鉛のうち少なくとも１つを含む、請求項５３〜５７のいずれか１項に記載の方法。
60. 使用するＯＮが、配列番号１〜１８から選択される、請求項５３〜５９のいずれか１項に記載の方法。
61. １つ以上のポリペプチドが、以下
    チモシンα１；
    α−インターフェロンまたはそのペグ化誘導体；
    β−インターフェロンまたはそのペグ化誘導体；
    γ−インターフェロンまたはそのペグ化誘導体；
    λ−インターフェロンまたはそのペグ化誘導体；
    インターフェロンα−２ａ、α−２ｂまたはα−Ｎ３；
    インターフェロンβ−１ａまたはβ−１ｂ；
    インターフェロンγ−１ｂ；
    インターフェロンλ１、λ２またはλ３；
    ペグ化インターフェロンα−２ａ、α−２ｂ、λ１、λ２またはλ３；
    Ｍｙｒｃｌｕｄｅｘ Ｂ；
    抗ウイルスサイトカインまたはそのペグ化誘導体；
    胸腺タンパク質Ａ；および
    抗ウイルス活性または免疫刺激活性を有することが示されているポリペプチド
    からなる群から選択される、請求項５３〜６０のいずれか１項に記載の方法。
62. 請求項１〜５２のいずれか１項に記載の医薬組成物を含むキット。
63. ＯＮキレート錯体と、少なくとも１つのポリペプチドとが別個に製剤化される、請求項６２に記載のキット。
64. ＯＮキレート錯体と、少なくとも１つのポリペプチドとが、同じまたは異なる投与経路によって同時投与するために製剤化される、請求項６３に記載のキット。