CN104349793A - 寡核苷酸螯合物-多肽组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种包含寡核苷酸螯合物和至少一种多肽或聚乙二醇化多肽的药物组合物。本公开还描述了用于治疗包括病毒感染在内的疾病的其它药物组合物和方法。

Description

寡核苷酸螯合物-多肽组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2012年8月30日提交的美国临时申请号61/695,035和2012年5月18日提交的美国临时申请号61/648,711的优先权，它们的全部内容以引用方式并入本文。
技术领域
本说明书涉及包含寡核苷酸(ON)螯合物和一种或多种不同多肽或聚乙二醇化多肽的组合物，用于制备包含ON螯合物和一种或多种不同多肽或聚乙二醇化多肽的组合物的方法以及用所述组合物治疗不同疾病的方法。
背景技术
寡核苷酸(ON)螯合物是分子间通过二价或其它多价金属阳离子连接的两个或两个以上ON。ON螯合物中和ON的可能造成这些化合物的施用相关副作用的固有螯合性质。施用ON螯合物是对受试者施用ON的新方法，其中减轻了与非螯合ON相关的施用相关副作用。这些副作用可能包括伴随静脉内输注的发抖、发热和寒战或伴随皮下施用的注射部位硬化、炎症和疼痛。此外，通过将ON制备成螯合络合物，可能改善其药动学特性，与非螯合ON相比用相似的剂量可提供更好的治疗性能。ON螯合物的特征和性质先前在国际申请公布号WO 2012/021985和美国申请公布号2012/0046348中有描述，所述公布以全文引用方式并入本文。
ON螯合物提供一种改进的施用ON的方法，这种方法使副作用减少而不影响作为简单的钠盐施用时ON的生化活性。
包含通过序列相关或序列无关的机制起作用的ON的ON螯合物可以在疾病病况中具有治疗效果，它可能在用所述ON螯合物进行治疗的患病受试者中不提供最佳的治疗结果。
因此，在本领域中需要提供一种改进的新组合物，它包含ON螯合物，如在组合制剂中。
包含通过序列相关或序列无关的机制起作用的抗病毒ON的抗病毒ON螯合物能够对不同病毒感染具有抗病毒作用。这些抗病毒作用可能在用所述ON螯合物进行治疗的存在病毒感染的受试者中不提供最佳治疗效果。进一步改善的治疗效果可以通过同时使用抗病毒ON螯合物和具有已知抗病毒活性的基于多肽的免疫治疗来实现。
因此，本领域中需要提供包含抗病毒ON螯合物和抗病毒多肽或聚乙二醇化多肽的组合的新组合物。理想地，所述抗病毒多肽还对所讨论的病毒感染有活性，通过影响与所讨论的抗病毒ON螯合物相同的靶标/生化途径或通过影响与所述抗病毒ON螯合物所影响的不同的靶标/生化途径。
概述
根据本说明书，现在提供包含ON螯合物和一种或多种不同多肽的药物组合物。
根据本说明书，现在提供包含抗病毒ON螯合物和一种或多种抗病毒多肽或聚乙二醇化多肽的抗病毒药物组合物。
公开一种治疗疾病病况的方法，所述方法包括对需要治疗的受试者施用包含ON螯合物和多肽的药物组合物的步骤。
公开一种治疗疾病病况的方法，所述方法包括通过相同或不同施用途径对需要治疗的受试者施用单独的药物组合物的步骤，其中第一组合物包含ON螯合物并且第二组合物包含多肽。
公开一种治疗病毒感染的方法，所述方法包括对需要治疗的受试者施用包含抗病毒ON螯合物和抗病毒多肽的药物组合物的步骤。
公开一种治疗病毒感染的方法，所述方法包括通过相同或不同途径对需要治疗的受试者施用单独的药物组合物的步骤，其中一种包含抗病毒ON螯合物并且另一种包含抗病毒多肽。
公开一种治疗病毒感染的方法，所述方法包括使用相同或不同施用途径在相同药物组合物或在不同药物组合物中施用抗病毒ON螯合物和抗病毒多肽的步骤。
公开包含ON螯合物和多肽的药物组合物用于治疗疾病的用途。
公开包含ON螯合物和多肽的药物组合物在制造用于治疗疾病的药剂中的用途。
公开包含ON螯合物的第一药物组合物和包含多肽的第二药物组合物用于治疗疾病病况的用途，所述组合物被配制用于相同或不同施用途径。
公开包含抗病毒ON螯合物和抗病毒多肽的药物组合物用于治疗病毒感染的用途。
公开包含抗病毒ON螯合物和抗病毒多肽在制造用于治疗病毒感染的药剂中的用途。
公开药物组合物用于治疗病毒感染的用途，一种包含抗病毒ON螯合物并且另一种包含抗病毒多肽，所述药物组合物被配制用于通过相同或不同途径分别施用。
公开抗病毒ON螯合物和抗病毒多肽用于治疗病毒感染的用途，所述抗病毒ON螯合物和抗病毒多肽被配制在相同药物组合物或不同药物组合物中用于相同或不同施用途径。
提供包含由两个或两个以上分子间通过二价阳离子连接的寡核苷酸(ON)组成的ON螯合物和至少一种多肽的药物组合物。
提供一种包含由两个或两个以上分子间通过二价阳离子连接的抗病毒ON组成的抗病毒ON螯合物和至少一种抗病毒多肽的药物组合物。
在一个实施方案中，所述抗病毒多肽被进一步聚乙二醇化。
在另一个实施方案中，所述二价阳离子是具有2+电荷状态的碱土金属。
在另一个实施方案中，所述二价金属阳离子是具有2+电荷状态的过渡金属。
在另一个实施方案中，所述二价金属阳离子是具有2+电荷状态的镧系金属。
在另一个实施方案中，所述二价金属阳离子是具有2+电荷状态的后过渡金属。
在另一个实施方案中，所述二价金属阳离子是钙。
在另一个实施方案中，所述二价金属阳离子是镁。
在另一个实施方案中，所述二价金属阳离子是铁(2+)、锰、铜或锌。
在另一个实施方案中，所述二价阳离子由两种或两种以上不同二价金属阳离子构成。
在另一个实施方案中，所述二价阳离子由钙和镁构成。
在另一个实施方案中，所述ON螯合物包含至少一个双链ON。
在另一个实施方案中，所述ON螯合物包含至少一个具有至少一个硫代磷酸酯键的ON。
在另一个实施方案中，所述ON螯合物包含至少一个完全硫代磷酸酯化的ON。
在另一个实施方案中，所述ON螯合物包含至少一个具有一个2’修饰的核糖的ON。
在另一个实施方案中，所述ON螯合物包含至少一个每个核糖都被2’O-甲基化的ON。
在另一个实施方案中，所述ON螯合物包含至少一个含有至少一个5’甲基胞嘧啶的ON。
在另一个实施方案中，所述ON螯合物包含至少一个其中每个胞嘧啶都进一步是5’甲基胞嘧啶的ON。
在另一个实施方案中，所述ON螯合物包含选自SEQ ID NO：1-6和10-18的寡核苷酸。
在另一个实施方案中，所述ON螯合物包含选自SEQ ID NO：7-9的寡核苷酸。
在另一个实施方案中，所述多肽是以下至少一种：
胸腺素α1；
任何α-干扰素或其聚乙二醇化衍生物；
任何β-干扰素或其聚乙二醇化衍生物；
任何γ-干扰素或其聚乙二醇化衍生物；
任何λ-干扰素或其聚乙二醇化衍生物；
干扰素α-2a或α-2b或α-N3；
干扰素β-1a或β-1b；
干扰素γ-1b；
干扰素λ1或λ2或λ3；
聚乙二醇化干扰素α-2a或α-2b或λ1或λ2或λ3；
Myrcludex B；
任何抗病毒细胞因子或其聚乙二醇化衍生物；
胸腺蛋白A；和
任何显示具有抗病毒活性或免疫刺激活性的多肽。
在另一个实施方案中，所述药物组合物配制用于皮下施用。
在另一个实施方案中，所述药物组合物配制用于静脉内输注。
在另一个实施方案中，所述药物组合物配制用于至少一种以下施用途径：气雾剂吸入、眼内、口服、肠道、肌内注射、腹膜内注射、鞘内注射、鞘内输注、气管内、静脉内注射和局部。
在另一个实施方案中，所述ON螯合物包含至少一个由SEQ IDNO：2组成的ON。
在另一个实施方案中，所述ON螯合物包含至少一个由SEQ IDNO：11组成的ON。
在另一个实施方案中，所述ON螯合物包含至少一个由SEQ IDNO：18组成的ON。
在另一个实施方案中，所述药物组合物进一步包含一种或多种以下药物：恩替卡韦(entecavir)、替诺福韦酯富马酸盐(tenofovir disoproxilfumarate)、telbuvidine、阿德福韦酯(adefovir dipivoxil)、拉米夫定(lamivudine)、利巴韦林(ribavirin)、特拉匹韦(telaprevir)、波塞普韦(boceprevir)、GS-7977、tegobuvir、扎那米韦(zanamivir)、奥司他韦(oseltamivir)、更昔洛韦(ganciclovir)、膦甲酸(foscarnet)、阿昔洛韦(acyclovir)、叠氮胸苷(zidovudine)、阿巴卡韦(abacavir)、洛匹那韦(lopinavir)、利托那韦(ritonavir)或依法韦仑(efavirenz)。
在另一个实施方案中，所述药物组合物进一步包含药学上可接受的载剂。
提供一种药物组合物，它包含含有由SEQ ID NO：3组成的寡核苷酸的ON螯合物和聚乙二醇化干扰素α-2a。
提供一种药物组合物，它包含含有由SEQ ID NO：18组成的寡核苷酸的ON螯合物和聚乙二醇化干扰素α-2a。
提供一种药物组合物，它包含含有由SEQ ID NO：11组成的寡核苷酸的ON螯合物和聚乙二醇化干扰素α-2a。
提供一种药物组合物，它包含含有由SEQ ID NO：3组成的寡核苷酸的ON螯合物和胸腺素α1。
提供一种药物组合物，它包含含有由SEQ ID NO：18组成的寡核苷酸的ON螯合物和胸腺素α1。
提供一种药物组合物，它包含含有由SEQ ID NO：11组成的寡核苷酸的ON螯合物和胸腺素α1。
提供一种药物组合物，它包含含有由SEQ ID NO：3组成的寡核苷酸的ON螯合物和干扰素α-2b.
提供一种药物组合物，它包含含有由SEQ ID NO：18组成的寡核苷酸的ON螯合物和干扰素α-2b。
提供一种药物组合物，它包含含有由SEQ ID NO：11组成的寡核苷酸的ON螯合物和干扰素α-2b。
提供一种药物组合物，它包含含有由SEQ ID NO：3组成的寡核苷酸的ON螯合物和聚乙二醇化胸腺素α1。
提供一种药物组合物，它包含含有由SEQ ID NO：18组成的寡核苷酸的ON螯合物和聚乙二醇化胸腺素α1.
提供一种药物组合物，它包含含有由SEQ ID NO：11组成的寡核苷酸的ON螯合物和聚乙二醇化胸腺素α1。
提供一种药物组合物，它包含含有由SEQ ID NO：3组成的寡核苷酸的ON螯合物和聚乙二醇化干扰素α-2b.
提供一种药物组合物，它包含含有由SEQ ID NO：18组成的寡核苷酸的ON螯合物和聚乙二醇化干扰素α-2b。
提供一种药物组合物，它包含含有由SEQ ID NO：11组成的寡核苷酸的ON螯合物和聚乙二醇化干扰素α-2b。
提供一种药物组合物，它包含含有由SEQ ID NO：3组成的寡核苷酸的ON螯合物和干扰素λ1。
提供一种药物组合物，它包含含有由SEQ ID NO：18组成的寡核苷酸的ON螯合物和干扰素λ1。
提供一种药物组合物，它包含含有由SEQ ID NO：11组成的寡核苷酸的ON螯合物和干扰素λ1。
提供一种药物组合物，它包含含有由SEQ ID NO：3组成的寡核苷酸的ON螯合物和聚乙二醇化干扰素λ1。
提供一种药物组合物，它包含含有由SEQ ID NO：18组成的寡核苷酸的ON螯合物和聚乙二醇化干扰素λ1。
提供一种药物组合物，它包含含有由SEQ ID NO：11组成的寡核苷酸的ON螯合物和聚乙二醇化干扰素λ1。
提供一种用于制备本文中描述的药物组合物的方法，所述方法包括：
a.在药学上可接受的含水赋形剂中溶解至少一种寡核苷酸(ON)钠盐；
b.向所述溶解的ON中逐渐添加药学上可接受的二价金属盐溶液以使所述ON螯合物保持可溶；
c.在药学上可接受的相容含水赋形剂中溶解一种或多种抗病毒多肽；以及
d.使所述抗病毒多肽溶液与所述ON螯合物溶液逐渐混合以使所述ON螯合物和抗病毒多肽保持溶解。
提供一种用于制备本文中描述的药物组合物的方法，所述方法包括：
a.在药学上可接受的含水赋形剂中溶解至少一种寡核苷酸(ON)钠盐；
b.向所述溶解的ON中逐渐添加至少一种药学上可接受的钙和/或镁盐溶液以使所述ON螯合物保持可溶；
c.在药学上可接受的相容含水赋形剂中溶解一种或多种抗病毒多肽；以及
d.使所述抗病毒多肽溶液与所述ON螯合物溶液逐渐混合以使所述ON螯合物和抗病毒多肽保持溶解。
在一个实施方案中，所述ON螯合物溶液和所述多肽溶液是在临施用所述药物组合物之前混合的。
在另一个实施方案中，向所述溶解的ON中添加的二价金属盐的比率是每100mg寡核苷酸0.1-50mg。
在另一个实施方案中，最终ON浓度是0.1-200mg/ml。
在另一个实施方案中，所述二价金属盐是氯化物盐、葡萄糖酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、苹果酸盐、天冬氨酸盐、富马酸盐、抗坏血酸盐、苯甲酸盐、异抗坏血酸盐、丙酸盐、硫酸盐或碳酸氢盐中的至少一种。
在另一个实施方案中，所述二价金属盐溶液包含钙、镁、铁(2+)、锰、铜或锌中的至少一种。
提供一种包含本文中描述的药物组合物的试剂盒。
在一个实施方案中，所述ON螯合物和所述至少一种多肽是分别配制的。
在另一个实施方案中，所述ON螯合物和所述至少一种多肽是配制用于通过相同或不同施用途径共同施用的。
附图简述
现在参考附图：
图1说明ON的共同理化特征。A)通过高效液相色谱法共同分离REP 2006和具有定义序列的21聚体硫代磷酸酯化ON。B)通过质谱法鉴别所述21聚体ON中的物质。C)通过质谱法鉴别所述REP2006ON中的物质。
图2A说明ON的不依赖于ON序列的一般化学特征。与序列无关，任何ON都作为同时具有疏水和亲水活性的聚合物存在。硫代磷酸酯化(在这个图中的化学结构中描绘)用来提高ON聚合物的疏水性但是不影响亲水性。图2B示意性表示二价和三价金属阳离子的ON螯合性质。金属阳离子(由灰色实心图表示)通过磷酸二酯键中的两个或三个非桥接氧或硫原子之间的金属离子桥(由省略号表示)连接ON聚合物的亲水性表面。
图3说明在不同ON和二价金属阳离子浓度下存在二价或多价金属阳离子时的ON的溶液特性模型。A)低二价/三价金属阳离子，低ON浓度产生二聚体或低阶ON螯合物。B)提高二价/三价金属阳离子浓度在溶液中形成更完全的ON螯合物。C)在二价或三价金属存在下进一步提高ON浓度能够随着金属浓度提高产生较高阶ON螯合物。由于亲水性表面仍然暴露于含水环境而维持溶解度，因此(A)至(C)中的所有螯合物均可溶于水溶液。D)在足够的ON和金属浓度下，所有亲水性表面现将限制在ON螯合物内，仅使疏水表面暴露于含水环境。这导致ON螯合物的沉淀。
图4说明荧光-ON螯合物的溶液特性对荧光偏振的影响。随着金属浓度提高，ON螯合物形成的大小(和质量)也增加(参见图3)并且因此在溶液中翻滚更缓慢。络合物在溶液中的这种较慢的翻滚导致荧光偏振升高和mP值升高。
图5说明使用实施例IV中描绘的寡聚物方法(oligo method)对REP 2055钙螯合物/干扰素α-2b组合物进行的HPLC分离。少量不完全合成产物(小箭头)在色谱图中先于全长ON峰(大箭头)并且通常是具有与全长ON序列相比缺失一个或多个核苷酸的序列的ON。这种HPLC曲线对于使用的全部未纯化ON(REP 2055、REP 2057和REP2148)来说是典型的。
图6说明来自图5中16.70min的HPLC峰的REP 2055钙螯合物/干扰素α-2b组合物中的寡核苷酸含量的ESI-MS分析。观察到的主要物质的质量是12612.2Da，确定它是REP 2055(预期m.wt.＝12612.5)。
图7说明使用蛋白质方法1对REP 2055钙螯合物/干扰素α-2b组合物进行的HPLC分离(参见实施例IV)。
图8说明来自图7中11.03min的HPLC峰的REP 2055钙螯合物/干扰素α-2b组合物中的肽含量的ESI-MS分析。在19263Da观察到的质量峰对应于干扰素α-2b(预期m.wt.＝19271Da)，并且在66560Da的峰对应于人白蛋白。
图9说明使用本文中描述的寡聚物方法对REP 2057钙螯合物/干扰素α-2b组合物进行的HPLC分离(参见实施例IV)。如图5中所示，少量不完全合成的产物先于全长REP 2057序列的主峰。
图10说明来自图9中15.46min的HPLC峰的REP 2057钙螯合物/干扰素α-2b组合物中的寡核苷酸含量的ESI-MS分析。观察到的主要物质的质量是13413.5Da，确定它是REP 2057(预期m.wt.＝13413.3)。
图11说明使用本文中描述的蛋白质方法1对REP 2057钙螯合物/干扰素α-2b组合物进行的HPLC分离(参见实施例IV)。
图12说明来自图11中11.43min的HPLC峰的REP 2057钙螯合物/干扰素α-2b组合物中的肽含量的ESI-MS分析。在19264Da观察到的质量峰对应于干扰素α-2b(预期m.wt.＝19271Da)，并且在66618Da的峰对应于人白蛋白。
图13说明使用本文中描述的寡聚物方法对REP 2139钙螯合物/干扰素α-2b组合物进行的HPLC分离(参见实施例IV)。没有发现不完全合成产物。
图14说明来自图13中19.11的REP 2139钙螯合物/干扰素α-2b组合物中的寡核苷酸含量的ESI-MS分析。观察到的主要物质的质量是14095.3Da，确定它是REP 2139(预期m.wt.＝14094.6)。
图15说明使用本文中描述的蛋白质方法1对REP 2139钙螯合物/干扰素α-2b组合物进行的HPLC分离(参见实施例IV)。
图16说明来自图15中11.12min的HPLC峰的REP 2139钙螯合物/干扰素α-2b组合物中的肽含量的ESI-MS分析。在19264Da观察到的质量峰对应于干扰素α-2b(预期m.wt.＝19271Da)，并且在66674Da的峰对应于人白蛋白。
图17说明使用本文中描述的寡聚物方法对REP 2148钙螯合物/干扰素α-2b组合物进行的HPLC分离(参见实施例IV)。少量不完全合成产物先于全长REP 2148序列的主峰。
图18说明来自图17中15.34min的HPLC峰的REP 2148钙螯合物/干扰素α-2b组合物中的寡核苷酸含量的ESI-MS分析。观察到的主要物质的质量是12891.6Da，确定它是REP 2148(预期m.wt.＝12893.6)。
图19说明使用本文中描述的蛋白质方法1对REP 2148钙螯合物/干扰素α-2b组合物进行的HPLC分离(参见实施例IV)。
图20说明来自图19中8.44min的HPLC峰的REP 2148钙螯合物/干扰素α-2b组合物中的肽含量的ESI-MS分析。在19265Da观察到的质量峰对应于干扰素α-2b。
图21说明使用本文中描述的寡聚物方法对REP 2006钙螯合物/胸腺素α1组合物进行的HPLC分离(参见实施例IV)。在6.31min洗脱的峰对应于胸腺素α1(白色箭头)，并且在15.15min洗脱的峰对应于全长REP 2006(黑色箭头)。
图22说明来自图21中15.15min的HPLC峰的REP 2006钙螯合物/胸腺素α1组合物中的寡核苷酸含量的ESI-MS分析。观察到的质量是约12650-13150Da，确定它是REP 2006(预期m.wt.＝12612-13092Da)。
图23说明来自图21中6.31min的HPLC峰的REP 2006钙螯合物/胸腺素α1组合物中的肽含量的ESI-MS分析。观察到的主要物质的质量是3108Da，确定它是胸腺素α1(预期m.wt.＝3108Da)。
图24说明使用本文中描述的寡聚物方法对REP 2055钙螯合物/胸腺素α1组合物进行的HPLC分离(参见实施例IV)。在6.12min洗脱的峰对应于胸腺素α1(白色)，并且在16.70min洗脱的峰对应于全长REP 2055(黑色箭头)。
图25说明来自图24中16.70min HPLC峰的REP 2055钙螯合物/胸腺素α1组合物中的寡核苷酸含量的ESI-MS分析。观察到的主要物质的质量是12612.1Da，确定它是REP 2055(预期m.wt.＝12612.5)。
图26说明来自图24中6.12min的HPLC峰的REP 2055钙螯合物/胸腺素α1组合物中的肽含量的ESI-MS分析。观察到主要物质的质量是3107.6Da，确定它是胸腺素α1(m.wt.＝3108Da)。
图27说明使用本文中描述的寡聚物方法对REP 2057钙螯合物/胸腺素α1组合物进行的HPLC分离(参见实施例IV)。在6.18min洗脱的峰对应于胸腺素α1(白色箭头)，并且在15.47min洗脱的峰对应于全长REP 2057(黑色箭头)。
图28说明来自图27中15.47min的HPLC峰的REP 2057钙螯合物/胸腺素α1组合物中的寡核苷酸含量的ESI-MS分析。观察到的主要物质的质量是13413.5Da，确定它是REP 2057(预期m.wt.＝13413.3Da)。
图29说明来自图27中6.18min的HPLC峰的REP 2057钙螯合物/胸腺素α1组合物中的肽含量的ESI-MS分析。观察到的主要物质的质量是3107.6Da，确定它是胸腺素α1(预期m.wt.＝3108Da)。
图30说明使用本文中描述的寡聚物方法对REP 2139钙螯合物/胸腺素α1组合物进行的HPLC分离(参见实施例IV)。在6.13min洗脱的峰对应于胸腺素α1(白色箭头)，并且在19.01min洗脱的峰对应于全长REP 2139(黑色箭头)。
图31说明来自图30中19.01min的HPLC峰的REP 2139钙螯合物/胸腺素α1组合物中的寡核苷酸含量的-ESIMS分析。观察到的主要物质的质量是14094.5Da，确定它是REP 2139(预期m.wt.＝14094.6)。
图32说明来自图30中6.13min的HPLC峰的REP 2139钙螯合物/胸腺素α1组合物中的肽含量的ESI-MS分析。观察到的主要物质的质量是3107.6Da，确定它是胸腺素α1(预期m.wt.＝3108Da)。
图33说明使用本文中描述的寡聚物方法对REP 2148钙螯合物/胸腺素α1组合物进行的HPLC分离(参见实施例IV)。在6.28min洗脱的峰对应于胸腺素α1(白色箭头)，在15.19min洗脱的峰对应于全长REP 2148(黑色箭头)。
图34说明来自图33中15.19min的HPLC峰的REP 2148钙螯合物/胸腺素α1组合物中的寡核苷酸含量的ESI-MS分析。观察到的主要物质的质量是12892Da，确定它是REP 2148(预期m.wt.＝12893Da)。
图35说明来自图33中6.28min的HPLC峰的REP 2148钙螯合物/胸腺素α1组合物中的肽含量的ESI-MS分析。观察到的主要物质的质量是3107.3Da，确定它是胸腺素α1(预期m.wt.＝3108Da)。
图36说明使用本文中描述的寡聚物方法对REP 2006钙螯合物/聚乙二醇化干扰素α-2a组合物进行的HPLC分离(参见实施例IV)。
图37说明来自图36中14.59min的HPLC峰的REP 2006钙螯合物/聚乙二醇化干扰素α-2a组合物中的寡核苷酸含量的ESI-MS分析。观察到的主要物质的质量是约12600-13200Da，确定它是REP 2006(预期m.wt.＝12612-13092Da)。
图38说明使用本文中描述的蛋白质方法2对REP 2006钙螯合物/聚乙二醇化干扰素α-2a组合物进行的HPLC分离(参见实施例IV)。
图39说明来自图38中13.21min的HPLC峰的REP 2006钙螯合物/聚乙二醇化干扰素α-2a组合物中的肽含量的ESI-MS分析。
图40说明使用本文中描述的寡聚物方法对REP 2055钙螯合物/聚乙二醇化干扰素α-2a组合物进行的HPLC分离(参见实施例IV)。
图41说明来自图40中16.71min的HPLC峰的REP 2055钙螯合物/聚乙二醇化干扰素α-2a组合物中的寡核苷酸含量的ESI-MS分析。观察到的主要物质的质量是12612.4Da，确定它是REP 2055(预期m.wt.＝12612.5Da)。
图42说明使用本文中描述的蛋白质方法2对REP 2055钙螯合物/聚乙二醇化干扰素α-2a组合物进行的HPLC分离(参见实施例IV)。
图43说明来自42图中8.03min的HPLC峰的REP 2055钙螯合物/聚乙二醇化干扰素α-2a组合物中的肽含量的ESI-MS分析。
图44说明使用本文中描述的寡聚物方法对REP 2057钙螯合物/聚乙二醇化干扰素α-2a组合物进行的HPLC分离(参见实施例IV)。
图45说明来自图44中15.45min的HPLC峰的REP 2057钙螯合物/聚乙二醇化干扰素α-2a组合物中的寡核苷酸含量的ESI-MS分析。观察到的主要物质的质量是13413.5Da，确定它是REP 2057(预期m.wt.＝13413.3Da)。
图46说明使用本文中描述的蛋白质方法2对REP 2057钙螯合物/聚乙二醇化干扰素α-2a组合物进行的HPLC分离(参见实施例IV)。
图47说明来自图46中8.04min的HPLC峰的REP 2057钙螯合物/聚乙二醇化干扰素α-2a组合物中的肽含量的ESI-MS分析。
图48说明使用本文中描述的寡聚物方法对REP 2139钙螯合物/聚乙二醇化干扰素α-2a组合物进行的HPLC分离(参见实施例IV)。
图49说明来自图48中19.08min的HPLC峰的REP 2139钙螯合物/聚乙二醇化干扰素α-2a组合物中的寡核苷酸含量的ESI-MS分析。观察到的主要物质的质量是14095.3Da，确定它是REP 2139(预期m.wt.＝14094.6Da)。
图50说明使用本文中描述的蛋白质方法2对REP 2139钙螯合物/聚乙二醇化干扰素α-2a组合物进行的HPLC分离(参见实施例IV)。
图51说明来自图50中8.02min的HPLC峰的REP 2139钙螯合物/聚乙二醇化干扰素α-2a组合物中的肽含量的ESI-MS分析。
图52说明使用本文中描述的寡聚物方法对REP 2148钙螯合物/聚乙二醇化干扰素α-2a组合物进行的HPLC分离(参见实施例IV)。
图53说明来自图52中15.42min的HPLC峰的REP 2148钙螯合物/聚乙二醇化干扰素α-2a组合物中的寡核苷酸含量的ESI-MS分析。观察到的主要物质的质量是12891.5Da，确定它是REP 2148(预期m.wt.＝12893Da)。
图54说明使用本文中描述的蛋白质方法2对REP 2148钙螯合物/聚乙二醇化干扰素α-2a组合物进行的HPLC分离(参见实施例IV)。
图55说明来自图54中13.17min的HPLC峰的REP 2148钙螯合物/聚乙二醇化干扰素α-2a组合物中的肽含量的ESI-MS分析。
图56说明使用本文中描述的寡聚物方法对REP 2055钙螯合物/干扰素λ1组合物进行的HPLC分离(参见实施例IV)。
图57说明来自图56中14.84min的HPLC峰的REP 2055钙螯合物/干扰素λ1组合物中的寡核苷酸含量的ESI-MS分析。观察到的主要物质的质量是12610.6Da，确定它是REP 2055(预期m.wt.＝12612.5Da)。
图58说明使用本文中描述的蛋白质方法2对REP 2055钙螯合物/干扰素λ1组合物进行的HPLC分离(参见实施例IV)。
图59说明来自图58中10.68min的HPLC峰的REP 2055钙螯合物/干扰素λ1组合物中的肽含量的ESI-MS分析。观察到的主锋在20139Da，与干扰素λ1的大概分子量一致。
图60说明使用本文中描述的寡聚物方法对REP 2139钙螯合物/干扰素λ1组合物进行的HPLC分离(参见实施例IV)。
图61说明来自图60中17.31min的HPLC峰的REP 2139钙螯合物/干扰素λ1组合物中的寡核苷酸含量的ESI-MS分析。观察到的主要物质的质量是14095.3Da，确定它是REP 2139(预期m.wt.＝14094.6Da)。
图62说明使用本文中描述的蛋白质方法2对REP 2139钙螯合物/干扰素λ1组合物进行的HPLC分离(参见实施例IV)。
图63说明来自图62中10.53min的HPLC峰的REP 2139钙螯合物/干扰素λ1组合物中的蛋白质含量的ESI-MS分析。观察到的主锋在20139Da，与干扰素λ1的大概分子量一致
图64说明使用本文中描述的寡聚物方法对REP 2148钙螯合物/干扰素λ1组合物进行的HPLC分离(参见实施例IV)。
图65说明来自图64中15.47min的HPLC峰的REP 2148钙螯合物/干扰素λ1组合物中的寡核苷酸含量的ESI-MS分析。观察到的主要物质的质量是12891.8Da，确定它是REP 2148(预期m.wt.＝12893Da)。
图66说明使用本文中描述的蛋白质方法2对REP 2148钙螯合物/干扰素λ1组合物进行的HPLC分离(参见实施例IV)。
图67说明来自图66中10.51min的HPLC峰的REP 2148钙螯合物/干扰素λ1组合物中的蛋白质含量的ESI-MS分析。观察到的主锋在20139Da，与干扰素λ1的大概分子量一致
图68说明使用本文中描述的寡聚物方法对REP 2055镁螯合物/胸腺素α1组合物进行的HPLC分离(参见实施例IV)。在5.86min洗脱的峰对应于胸腺素α1(白色箭头)，并且在14.62min洗脱的峰对应于全长REP 2055(黑色箭头)。
图69说明来自图68中14.62min的HPLC峰的REP 2055镁螯合物/胸腺素α1组合物中的寡核苷酸含量的ESI-MS分析。观察到的主要物质的质量是12610.1Da，确定它是REP 2055(预期m.wt.＝12612.5Da)。
图70说明来自图68中5.82min的HPLC峰的REP 2055镁螯合物/胸腺素α1组合物中的肽含量的ESI-MS分析。观察到的主要物质的质量是3107.1Da，确定它是胸腺素α1(预期m.wt.＝3108Da)。
图71说明使用本文中描述的寡聚物方法对REP 2055混合钙-镁螯合物/胸腺素α1组合物进行的HPLC分离(参见实施例IV)。在6.02min洗脱的峰对应于胸腺素α1(白色箭头)，并且在14.85min洗脱的峰对应于全长REP 2055(黑色箭头)。
图72说明来自图71中14.85min的HPLC峰的REP 2055混合钙-镁螯合物/胸腺素α1组合物中的寡核苷酸含量的ESI-MS分析。观察到的主要物质的质量是12609.7Da，确定它是REP 2055(预期m.wt.＝12612.5Da)。
图73说明来自图71中6.02min的HPLC峰的REP 2055混合钙镁螯合物/胸腺素α1组合物中的肽含量的ESI-MS分析。观察到的主要物质的质量是3107.1Da，确定它是胸腺素α1(预期m.wt.＝3108Da)。
图74说明使用本文中描述的寡聚物方法对REP 2055镁螯合物/聚乙二醇化干扰素α-2a组合物进行的HPLC分离(参见实施例IV)。
图75说明来自图74中14.83min的HPLC峰的REP 2055镁螯合物/聚乙二醇化干扰素α-2a组合物中的寡核苷酸含量的ESI-MS分析。观察到的主要物质的质量是12610.2Da，确定它是REP 2055(预期m.wt.＝12612.5Da)。
图76说明使用本文中描述的蛋白质方法2对REP 2055镁螯合物/聚乙二醇化干扰素α-2a组合物进行的HPLC分离(参见实施例IV)。
图77说明来自图76中13.44min的HPLC峰的REP 2055镁螯合物/聚乙二醇化干扰素α-2a组合物中的肽含量的ESI-MS分析。
图78说明使用本文中描述的寡聚物方法对REP 2055混合钙-镁螯合物/聚乙二醇化干扰素α-2a组合物进行的HPLC分离(参见实施例IV)。
图79说明来自图78中14.83min的HPLC峰的REP 2055混合钙-镁螯合物/聚乙二醇化干扰素α-2a组合物中的寡核苷酸含量的ESI-MS分析。观察到的主要物质的质量是12609.8Da，确定它是REP2055(预期m.wt.＝12612.5Da)。
图80说明使用本文中描述的蛋白质方法2对REP 2055混合钙-镁螯合物/聚乙二醇化干扰素α-2a组合物进行的HPLC分离(参见实施例IV)。
图81说明来自图80中13.44min的HPLC峰的REP 2055混合钙-镁螯合物/聚乙二醇化干扰素α-2a组合物中的肽含量的ESI-MS分析。
图82说明使用本文中描述的寡聚物方法对REP 2139镁螯合物/胸腺素α1组合物进行的HPLC分离(参见实施例IV)。在5.84min洗脱的峰对应于胸腺素α1(白色箭头)，并且在16.86min洗脱的峰对应于全长REP 2139(黑色箭头)。
图83说明来自图82中16.86min的HPLC峰的REP 2139镁螯合物/胸腺素α1组合物中的寡核苷酸含量的ESI-MS分析。观察到的主要物质的质量是14091.3Da，确定它是REP 2139(预期m.wt.＝14094.6Da)。
图84说明来自图82中5.84min的HPLC峰的REP 2139镁螯合物/胸腺素α1组合物中的肽含量的ESI-MS分析。观察到的主要物质的质量是3107.1Da，确定它是胸腺素α1(预期m.wt.＝3108Da)。
图85说明使用本文中描述的寡聚物方法对REP 2139混合钙-镁螯合物/胸腺素α1组合物进行的HPLC分离(参见实施例IV)。在5.84min洗脱的峰对应于胸腺素α1(白色箭头)，并且在16.61min洗脱的峰对应于全长REP 2139(黑色箭头)。
图86说明来自图85中16.61min的HPLC峰的REP 2139混合钙-镁螯合物/胸腺素α1组合物中的寡核苷酸含量的ESI-MS分析。观察到的主要物质的质量是14091.1Da，确定它是REP 2139(预期m.wt.＝14094.6Da)。
图87说明来自图85中5.84min的HPLC峰的REP 2139混合钙镁螯合物/胸腺素α1组合物中的肽含量的ESI-MS分析。观察到的主要物质的质量是3107.1Da，确定它是胸腺素α1(预期m.wt.＝3108Da)。
图88说明使用本文中描述的寡聚物方法对REP 2139镁螯合物/聚乙二醇化干扰素α-2a组合物进行的HPLC分离(参见实施例IV)。
图89说明来自图88中17.19min的HPLC峰的REP 2139镁螯合物/聚乙二醇化干扰素α-2a组合物中的寡核苷酸含量的ESI-MS分析。观察到的主要物质的质量是14091.5Da，确定它是REP 2139(预期m.wt.＝14094.6Da)。
图90说明使用本文中描述的蛋白质方法2对REP 2139镁螯合物/聚乙二醇化干扰素α-2a组合物进行的HPLC分离(参见实施例IV)。
图91说明来自图90中13.38min的HPLC峰的REP 2139镁螯合物/聚乙二醇化干扰素α-2a组合物中的肽含量的ESI-MS分析。
图92说明使用本文中描述的寡聚物方法对REP 2139混合钙-镁螯合物/聚乙二醇化干扰素α-2a组合物进行的HPLC分离(参见实施例IV)。
图93说明来自图92中16.95min的HPLC峰的REP 2139混合钙-镁螯合物/聚乙二醇化干扰素α-2a组合物中的寡核苷酸含量的ESI-MS分析。观察到的主要物质的质量是14091.4Da，确定它是REP2139(预期m.wt.＝14094.6Da)。
图94说明使用本文中描述的蛋白质方法2对REP 2139混合钙-镁螯合物/聚乙二醇化干扰素α-2a组合物进行的HPLC分离(参见实施例IV)。
图95说明来自图94中13.46min的HPLC峰的REP 2139混合钙-镁螯合物/聚乙二醇化干扰素α-2a组合物中的肽含量的ESI-MS分析。
发明详述
如国际申请公布号WO 2012/021995和美国申请公布号2012/0046348所述(所述公布的内容以全文引用方式并入本文)，ON在含有任何二价简单金属阳离子(例如但不限于，Ca2+、Mg2+和Fe2+)的水溶液中都不以盐的形式存在，而是以ON的螯合的络合物形式存在。这些络合物由ON二聚体或高阶分子组织构成，其中ON是通过二价金属离子桥在它们的磷酸二酯或硫代磷酸酯骨架分子间连接的(参见图2B)。在特定的ON和金属阳离子浓度下，这些螯合的络合物在水溶液中是稳定并且可溶的，并且有效地隔离ON螯合物中的任何二价阳离子与溶液相互作用。这种螯合物形成也可能在带有3+电荷或更高电荷的简单金属阳离子情况下发生(如图2B中描绘的)。因此ON起多价金属阳离子螯合剂(chelater)的作用并且不与多价金属阳离子形成盐。
ON螯合物可以含有各种多价金属阳离子，包括钙、镁、钴、铁、锰、钡、镍、铜、锌、镉、汞和铅。进一步显示这些多价金属阳离子的螯合导致形成由两个或两个以上通过金属阳离子连接的ON构成的ON螯合物并且在长度大于6个核苷酸的ON的情况下和在具有磷酸二酯或硫代磷酸酯键的ON的存在下发生。ON可以任选每个键都被硫代磷酸酯化。螯合也在于核糖上含有2’修饰(如2’O甲基)或含有诸如5’甲基胞嘧啶或4-硫代尿嘧啶等修饰碱基的ON的情况下发生。这些2’修饰可以存在于一个或多个或所有核糖上并且修饰的碱基可以存在于一个或多个碱基上或普遍存在于每个碱基上(即所有胞嘧啶都以5’甲基胞嘧啶的形式存在)。此外，ON螯合物可以包含含有多个修饰如每个键都被硫代磷酸酯化、每个核糖都被2’修饰和每个碱基都被修饰的ON。下文进一步定义与ON螯合物形成相容的ON修饰。此外，金属阳离子的螯合与存在的核苷酸序列无关，而是依赖于所有ON共同的理化特征(参见图2A)。
虽然ON螯合物的形成可以用任何二价金属阳离子实现，但是意图用作药物的ON螯合物应该优选仅含有钙和或镁，但是也可以含有痕量的铁、锰、铜或锌，并且不应该包括钴、钡、镍、镉、汞、铅或任何这里未列出的其他二价金属。
重要的是，ON螯合物的形成不发生在诸如Na+、K+或NH4 +等单价阳离子上并且因此不可能发生在任何单价阳离子上。因此，术语“ON盐”更准确地仅限于ON与单价阳离子或与不与ON形成螯合物的阳离子的盐。
至少一部分已知的ON与血液中蛋白质组分的瞬时相互作用可能是由ON与诸如白蛋白和钙依赖性凝血级联蛋白等钙结合蛋白的相互作用介导的。因此以螯合的络合物形式施用ON(这显著降低或消除它们与钙结合蛋白相互作用的倾向)将减少这些蛋白质在血液中的相互作用并且使伴随ON施用的副作用(如瞬时抗凝血)较少并且与非螯合ON相比还可以提高到达靶器官(例如肝脏、肺或脾脏)的ON剂量分数。
荧光偏振是用于研究分子间相互作用的常见方法。在这种技术中，用荧光标记物(例如FITC)标记待测物(即任何ON)。在溶液中，待测物分子由于布朗运动而在溶液中自由翻滚，这使得用恰当波长的光激发待测物时偏振荧光发射很弱。使用足够分子量的配体(至少和待测物一样大小)，待测物和配体之间的相互作用带来对所述络合物在溶液中翻滚的实质性抑制。由于抑制了溶液中的这种翻滚，因此在激发时荧光发射被显著偏振。因此使用这种技术，可以在溶液中测量相互作用而对任何一个结合配偶体都没有物理限制。荧光偏振报告为无量纲的mP，它与反应中的结合型待测物分子的分数成正比。例如，如果非常小的比例的待测物分子被特定配体结合，那么荧光偏振将会极少并且因此mP值也小。另一个极端，如果大部分待测物分子被特定配体结合(或用较高浓度的配体)，将有相当大的荧光偏振并且因此mP值也大。用这种方式，可以通过在固定量的荧光标记待测物的存在下改变配体浓度来产生特定待测物-配体相互作用的结合等势线。
本文中使用不同的荧光标记ON来研究它们在多价金属阳离子存在下的络合物形成。虽然通过荧光偏振监测络合物形成需要这些ON被荧光标记，但是这种标记固定在ON的3’端上，以便不干扰所讨论的ON的含氮碱基或磷酸二酯骨架。此外，为了进一步排除溶液中的正常ON行为的任何扰动，荧光标记物通过刚性的3碳接头与ON保持远离。因此本文中使用荧光偏振用荧光标记ON观察到的任何ON络合物形成都是未标记ON(无论是否形成络合物)溶液行为的准确表现。
本领域中的标准清楚地用ON钠盐教导了对需要治疗的受试者施用ON的做法。这通过在临床试验中施用众多钠盐形式的ON示范过，它们包括Fomivirisen(ISIS 2922)、Mipomersen(ISiS 301012)、Trecovirsen(GEM 91)、Custirsen(OGX-011/ISIS 112989)、Genasense(G3139)、Aprinocarsen(ISIS 3531/LY 900003)、PRO-51(GSK 2402968)和ALN-RSV01(Geary等，2002，Clin.Pharmacokinetics，41：255-260；Yu等，2009，Clin.Pharmacokinetics，48：39-50；Sereni等，1999，J.Clin.Pharmacol.，39：47-54；Chi等，2005，J.Nat.Canc.Inst.，97：1287-1296；Marshall等，2004，Ann.Oncol.，15：1274-1283；Grossman等，2004，Neuro-Oncol，6：32-40；Goemans等，2011NEJM 364：1513-1522)。目前没有公布教导使用钙、镁或其它二价金属配制用于肠胃外施用的寡核苷酸的资料。
与钠盐ON的施用有关的许多副作用都可以归因于它们的螯合效应。ON的抗凝血至少部分是由血清钙被ON螯合从而削弱钙依赖性凝血级联引起的。血清钙的这种螯合以及它能够导致的潜在血清低血钙还与通过IV施用来施用ON观察到的副作用一致，这些副作用包括发热、发抖、虚弱和动脉血压下降(后者伴随快速IV输注或注射)。伴随皮下注射ON观察到的注射部位反应(硬化、炎症、脆弱和疼痛)至少部分是由于在注射部位的钙和可能的其它二价或多价阳离子(如镁)被ON局部螯合。以螯合的络合物形式施用ON已经证明可减轻许多这些副作用。
此外，因为在溶液中用二价金属与任何ON都会形成ON螯合物，所以通过使用简并ON REP 2006和带有不同ON修饰的示例性寡核苷酸序列[在以下实施例中(AG)20和(AC)20]将会向本领域技术人员充分地证明溶液中的多种多肽和聚乙二醇化多肽与任何ON螯合物的形成和相容性的教导。含有与不同的多肽或聚乙二醇化多肽的螯合物形式的以上ON物质的组合物的稳定形成将证明任何ON螯合物(与其特定的功能无关)者会与多种多肽或聚乙二醇化多肽形成稳定溶液，这在本领域中对于特定的疾病适应症(例如聚乙二醇化干扰素用于治疗乙型肝炎或丙型肝炎，或myrcludex B用于治疗乙型肝炎)的治疗将是合乎需要的。
术语寡核苷酸(ON)是指核糖核酸(RNA)和/或脱氧核糖核酸(DNA)的寡聚物或聚合物。这个术语包括由修饰的核碱基(包括5’甲基胞嘧啶和4’硫代尿嘧啶)、糖和共价核苷间(骨架)键联构成的ON以及具有功能类似的非天然存在的部分的ON。由于所希望的特性，例如降低的免疫反应性、增强的细胞摄取、增强的对核酸靶标的亲和力以及增加的在核酸酶的存在下的稳定性，这类修饰或取代的ON可能比天然形式优选。ON也可以是双链的。
本公开中的ON可以包括各种修饰，例如稳定化修饰，并且因此可以在磷酸二酯键和/或在糖上和/或在碱基上包括至少一个修饰。例如，ON可以包括(但不限于)一个或多个修饰，或者被完全修饰以便含有具有所述修饰的所有键或糖或碱基，修饰的键可以包括硫代磷酸酯键、二硫代磷酸酯键和/或甲基膦酸酯键。虽然修饰的键是有用的，但是ON可以包括磷酸二酯键。其它有用的修饰包括(但不限于)在糖的2’位的修饰，包括2’-O-烷基修饰，如2’-O-甲基修饰、2’O-甲氧基乙基(2'MOE)、2’-氨基修饰、2’-卤代修饰，如2’-氟；非环核苷酸类似物。其他2’修饰也是本领域已知的并且可以使用，如锁核酸。具体来讲，ON到处都具有修饰的键或者每个键都被修饰，例如，硫代磷酸酯化；具有3’-和/或5’-帽子；包括末端3’-5’键；所述ON是或者包括由通过接头连接的两个或两个以上ON组成的多联体。碱基修饰可以包括胞嘧啶碱基的5’甲基化(5’甲基胞嘧啶或在核苷酸的环境中，5’甲基胞苷)和/或尿嘧啶碱基的4’硫化(4’硫脲嘧啶或在核苷酸的环境中，4’硫代尿苷)。当合成条件在化学上相容时，如具有带有硫代磷酸酯键、2’核糖修饰(如2’O-甲基化)和修饰碱基(如5’甲基胞嘧啶)，可以合并不同化学相容的修饰的键。可以用所有这些不同修饰进一步完全修饰ON(例如，每个键都硫代磷酸酯化，每个核糖都被2’O甲基修饰以及每个胞嘧啶碱基此外都具有5’甲基修饰(5’甲基胞嘧啶))。
在本说明书中，术语“抗病毒ON”是指借助于其特定的生化活性(无论是序列相关或序列无关的)能够直接或间接抑制病毒复制的一些方面或直接或间接增强宿主通过免疫或其它机制清除感染的能力的任何ON。
在本公开中，术语“ON螯合物”是指在溶液中分子间通过多价金属阳离子连接的两个或两个以上ON的络合物。
在本公开中，术语“抗病毒ON螯合物”是指在溶液中分子间通过多价金属阳离子连接的两个或两个以上抗病毒ON的络合物。所述抗病毒ON螯合物可以由单一种类的抗病毒ON或两种或两种以上不同种类的抗病毒ON构成，它们可能具有相同或不同的作用机制(例如，两种或两种以上反义ON、至少一种反义ON和至少一种适体、至少一种反义ON和至少一种siRNA)。
在本公开中，术语“抗病毒多肽”是指借助于其特定的生化活性(无论是序列相关或序列无关的)能够直接或间接抑制病毒复制的一些方面或直接或间接增强宿主通过免疫或其它机制清除感染的能力的多肽。所述多肽可以是天然获得或重组的。所述多肽可以是从一部分天然存在多肽重组获得的。所述多肽可以是聚乙二醇化或非聚乙二醇化的。
在本公开中，术语“简并ON”意指在每个位置都具有摆动(N)的单链ON，如NNNNNNNNNN。每个碱基都合成为摆动碱基，以使这个ON实际上作为一群具有相同长度和理化性质的不同随机生成的序列存在。例如，对于长度为40个碱基的简并ON，在群中的任何特定序列理论上仅表示总分数的1/440或8.3X 10-25。假定1摩尔＝6.022X1023个分子，并且1摩尔40聚体ON的质量实际上大约为12-14kg(取决于存在的序列和修饰)，任何具有有效特定序列的ON实际上在任何制剂中出现不超过一次。因此在这种制剂中观察到的任何螯合物形成或生物活性必定是由于ON的非序列相关(或与所述序列无关)的理化性质，因为不能期望具有定义序列的任何特定ON(在所述制剂中是独特的)贡献来源于其特定核苷酸序列的任何活性。
作为这个概念的再一个示例，实施例I通过高压液相色谱法和质谱法比较REP 2006(具有简并的完全硫代磷酸酯化的序列的40聚体ON)与具有定义序列(也完全被硫代磷酸酯化)的21聚体ON的表征，并明确显示具有相似大小和化学修饰(即硫代磷酸酯化)的任何ON将具有不受存在的核苷酸序列影响的高度相似的(如果不相同)理化特征(参见图1A-C)。
在本申请中，术语“核酸聚合物”或NAP意图用来鉴别不包含序列特异性功能的任何单链ON。NAP的生化活性不依赖于ON的Toll样受体识别、与靶核酸的杂交或需要来源于存在的核苷酸的特定顺序的特定二级/三级ON结构的适体相互作用。NAP可以包括如上所述的碱基和或键和或糖修饰。
ON可以通过序列相关或序列无关的众多机制来发挥它们的治疗作用。序列相关的机制是其活性需要特定的核酸序列并且其中所述活性因存在的核苷酸序列中的一个或多个改变而降低的那些机制。这个特定的序列可能涵盖ON的整个长度或只有它的一部分(序列基序)。序列相关的ON的实例包括：
1.反义ON(单链或双链的(例如，小干扰RNA(siRNA)或小发夹RNA(shRNA))是与所研究的信使RNA(mRNA)的特定部分互补的并且当引入细胞中时，它们引导特定的mRNA被RNA酶H或RNA诱导的沉默络合物(RISC)降解。
2.空间阻断(Stearic blocking)ON是与mRNA的特定部分互补但被工程改造成不活化RNA酶H的单链反义ON。这些ON与它们的靶标mRNA杂交产生对通常作用于所述mRNA的蛋白质提供位阻(stearic hindrance)的双链部分。这些ON可以用于阻断特定mRNA的翻译或者用于干扰特定mRNA的转录后剪接和成熟。这些ON可被工程改造成通过完全2’核糖修饰(如2’O甲基化)来阻断RNA酶H活化(因为RNA酶H的活化与这些ON的作用机制不是一个整体)。
3.适体是采取能够进行特异性蛋白质相互作用的特定的三维构象并且不易与宿主DNA或RNA相互作用的ON。适体还可以包括镜像异构体，它们使用L-核苷酸替代D-核苷酸以对所述ON赋予高度酶稳定性。
4.免疫刺激性ON使用特定的6聚体核酸基序(XXCGXX)来刺激哺乳动物中的免疫应答。最佳的基序随物种的改变而改变，但是严格依赖于与XXCGXX基序一致的特定序列。
5.微型RNA(miRNA)结合并阻断各种生化途径调节中所涉及的天然存在微型RNA分子的功能。
唯一报告的序列无关的ON的实例是硫代磷酸酯化NAP，它借助于其作为两亲聚合物的理化性质以大小(长度)相关的方式选择性地与两亲蛋白质结构相互作用。
若干基于多肽的抗病毒药物目前已批准用于治疗病毒感染，它们包括聚乙二醇化干扰素α-2a(用于治疗乙型肝炎(HBV)和丙型肝炎(HCV))、干扰素α-2b(用于治疗HBV)、胸腺素α1(用于治疗HBV)和enfurtide(用于治疗HIV-1)。还有其它基于多肽的药物正在开发，包括用于治疗HBV的肉豆蔻基化pre-s1HBV表面抗原蛋白片段(myrcludex B，Petersen等，2008，Nature Biotech.26：335-341)和聚乙二醇化干扰素λ1(Muir等，2010Hepatology 52：822-832)。此外，干扰素λ1、λ2和λ3也已知具有抗病毒活性(Friborg等，2013，AntimicrobialAgents and Chemotherapy 57：1312-1322)。在聚乙二醇化或非聚乙二醇化干扰素和其它已知免疫调节剂(例如胸腺素α1)的情况下，这些多肽具有刺激其相应的生化途径的活性，这种刺激导致对受试者病毒感染的免疫应答的刺激。虽然这些多肽可以成功地刺激免疫应答，但是使用这些基于多肽的药物只有小部分患有HBV或HCV感染的患者实现其感染的完全控制。Myrcludex B用于阻断HBV进入肝细胞，但是其治疗效益还有待于在人患者中证明。
除了这些多肽之外，还有其它种类的具有已知抗病毒活性的多肽，它们在与ON螯合物组合时可用于治疗病毒感染。这些多肽包括细胞因子，诸如但不限于TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6和干扰素γ。
用于对治疗活性多肽进行聚乙二醇化的方法以及聚乙二醇化与多肽生化活性的相容性在本领域是熟知的并且包括将聚乙二醇(PEG)链连接到所讨论的多肽的特定氨基酸残基上。聚乙二醇化的主要功能是增加多肽的循环寿命并且也使其免疫原性降低。这些特征改善所讨论的多肽的耐受性并且降低最佳治疗效果所需要的给药频率。本领域进一步已知可以实现PEG残基与多肽的连接而不影响所讨论的多肽的特定生化活性。还已知聚乙二醇化可增加所讨论的多肽的水溶性，从而提高其配制简易性。众多聚乙二醇化多肽的实例在本领域是已知的并且包括：MirceraTM，促红细胞生成素的聚乙二醇化形式；NeulastaTM，人粒细胞群落刺激因子的聚乙二醇化形式；PegasysTM人干扰素α-2a的聚乙二醇化形式；Peg-intronTM，人干扰素α-2b的聚乙二醇化形式；和聚乙二醇化干扰素λ1(目前正在临床开发中)。因此，组合物中的一种聚乙二醇化多肽(即聚乙二醇化干扰素α-2a)与ON螯合物的相容性的公开提供任何聚乙二醇化多肽与ON螯合物的一般相容性的普遍可实施性，并且特别是对于在本公开中呈示的与ON螯合物相容的特定的非聚乙二醇化多肽的聚乙二醇化形式(即胸腺素α1、干扰素α-2b和干扰素λ1)。
若干基于ON的抗病毒药物目前正在开发用于治疗病毒感染，它们包括用于治疗HBV的硫代磷酸酯化NAP REP 9AC(REP 2055)、REP 9AC’(REP 2139)和REP 9ACm(REP 2148)；用于治疗HCV的miravirsen(Janssen等，2013，NEJM，March 27)；和用于治疗呼吸道合胞病毒(RSV)的ALN-RSV01(Zamora等，2011，Am.J.Resp.Crit.CareMed.，183：531-538)。它们各有不同的作用机制：如实施例V所述，NAP阻止HBV表面抗原蛋白释放进入血液(一种抑制免疫功能的蛋白质)；miravirsen(一种miRNA)阻断微型RNA mir-122的作用，已知RNA mir-122在HCV复制中发挥作用；和ALN-RSV01(一种siRNA)阻断RSVN核衣壳蛋白的合成，从而阻止RSV病毒粒子产生。所有这些ON药物对于在受试者中引发其预期效果是非常有效的：REP9AC/REP 9AC'/REP 9ACm阻断HBV亚病毒颗粒(SVP)的细胞内转运和分泌，这导致血液中HBV表面抗原的清除，进而引起血液中HBV病毒的减少；miravirsen对抑制HCV复制中所涉及的mir-122功能非常有效；并且ALN-RSV-01对阻断RSV衣壳蛋白产生非常有效。然而，在肠胃外施用这些基于ON的化合物的任何情况下，当通过静脉内输注时，它们与诸如发热、寒战、发抖等施用相关副作用有关，或者当通过皮下施用进行施用时与注射部位的疼痛、炎症或硬化有关。更重要的是，虽然所有这些基于ON的药物在受试者中具有其预期效果，但是总体的治疗结果离希望的结果还远：只有一小部分用这些药物进行治疗的患者实现实质性抗病毒应答或在治疗期间或停止治疗之后完全控制其感染。
因此希望将任何这些基于ON的抗病毒药物制备为ON螯合物(以便使其施用相关副作用减至最少并且潜在地改善其药动学性质)并且将它们与一种或多种抗病毒多肽(如聚乙二醇化干扰素α-2a、干扰素α-2b或胸腺素α1或聚乙二醇化干扰素λ1)组合于同一制剂中。基于ON的化合物(呈螯合物形式)的特定抗病毒作用与多肽的免疫刺激抗病毒作用联合起来能够在于受试者中引发更加全面增强的抗病毒应答方面具有提高的有益效果，并且在与任何一种药物单独使用相比，使大部分受试者实现其感染的完全控制。
用包含至少一种抗病毒ON螯合物和至少一种抗病毒多肽或聚乙二醇化多肽的药物组合物治疗特定病毒感染以在受试者中实现提高的抗病毒应答可能是有用的。
用至少一种抗病毒ON螯合物和抗病毒多肽治疗特定病毒感染可能是有用的，其中每种这些化合物是在不同药物组合物中单独施用的，无论施用途径是否相同。
为了在受试者中提供尽可能好的抗病毒应答，有必要向抗病毒ON螯合物和抗病毒多肽(无论是否以相同或单独的药物组合物施用)的组合治疗中添加第三种非ON、非多肽药物。这些药物可以是(但不限于)：恩替卡韦、替诺福韦酯富马酸盐、telbuvidine、阿德福韦酯、拉米夫定、利巴韦林、特拉匹韦、波塞普韦、GS-7977、tegobuvir、扎那米韦、奥司他韦、更昔洛韦、膦甲酸、阿昔洛韦、叠氮胸苷、阿巴卡韦、洛匹那韦、利托那韦和/或依法韦仑。这些抗病毒药物能够阻止许多病毒的病毒基因组和或病毒mRNA的复制，如HCV、HBV、HIV、流感病毒、RSV和巨细胞病毒。
有可能抗病毒ON螯合物的特定的抗病毒作用与抗病毒多肽或聚乙二醇化多肽的免疫刺激作用联合以及通过上面列出的非ON、非多肽药物阻断病毒DNA/RNA复制的组合能够在患有病毒感染的受试者中提供最好和最有效的治疗响应并且进一步增加所讨论的受试者获得病毒持久的控制的机会，这种控制能够在治疗中断之后持续。
制剂中的ON螯合物可以来源于具有抗病毒活性的任何ON，其实例在表1中提供。
表1
可以制备成螯合物的ON的实例。
LNA＝锁核酸，PS＝硫代磷酸酯，2'OMe＝2’O甲基，5'MeC＝5’甲基胞嘧啶
制剂中的多肽可以具有直接抗病毒活性或能够刺激宿主来源的抗病毒活性并且可以是以下：
胸腺素α1；
任何α-干扰素或其聚乙二醇化衍生物；
任何β-干扰素或其聚乙二醇化衍生物；
任何γ-干扰素或其聚乙二醇化衍生物；
任何λ-干扰素或其聚乙二醇化衍生物；
干扰素α-2a或α-2b或α-N3；
干扰素β-1a或β-1b；
干扰素γ-1b；
干扰素λ1或λ2或λ3；
聚乙二醇化干扰素α-2a或α-2b或λ1或λ2或λ3；
Myrcludex B；
任何抗病毒细胞因子或其聚乙二醇化衍生物；
胸腺蛋白A；和/或
任何显示具有抗病毒活性或免疫刺激活性的多肽或聚乙二醇化多肽。
本文中提供一种示范，即众多不同ON螯合物能够与不同多肽或聚乙二醇化多肽药物组合于单一药物组合物，这不影响ON或多肽的结构。
这些组合物可以用于对需要这种治疗的受试者同时并且采用单一施用方式施用ON螯合物和多肽药物，如以下实施例VI中所证明)。
此外，以上组合物可以包含生理学和/或药学上可接受的载剂、佐剂、媒介物和/或赋形剂。载剂的特征可能取决于施用途径。术语“药学上可接受的载剂、佐剂、媒介物和/或赋形剂”是指可以对受试者施用，并入本发明组合物中并且不破坏其药理学活性的载剂、佐剂、媒介物或赋形剂。可用于本文中描述的药物组合物的药学上可接受的载剂、佐剂、媒介物和赋形剂包括但不限于以下：离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、自乳化药物递送系统(“SEDDS”)、在药物剂型中使用的表面活性剂如Tweens或其它类似聚合递送基质、血清蛋白质如人血清白蛋白、缓冲物质如磷酸盐、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、盐或电解质如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶体二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、基于纤维素的物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物、聚乙二醇、羊毛脂、癸酸钠或十四烷基麦芽糖苷(TDM)、或烷基化糖的其它TDM衍生物。环糊精如α-、β-和γ-环糊精，或化学修饰的衍生物如羟烷基环糊精，包括2-和3-羟丙基-β-环糊精，或其它溶解的衍生物也可以用于增强本发明组合物的递送。
本文中描述的组合物可以包含如下所述的其他治疗剂，并且可以例如根据如药物制剂领域中熟知的那些技术通过使用传统的固体或液体媒介物或稀释剂以及适合于所要施用方式的类型的药物添加剂来(例如，赋形剂、粘合剂、防腐剂、稳定剂、调味剂等)来配制。
本文中描述的组合物可以通过任何合适的方法施用，例如，口服施用，诸如以片剂、胶囊、颗粒或散剂形式；舌下；口腔；肠胃外，诸如通过皮下、静脉内、肌内、鞘内或注射或输注技术(例如，作为无菌可注射水性或非水性溶液或混悬液)；吸入；局部，如以乳膏或软膏形式；或直肠，如以栓剂或灌肠剂形式；以包含药学上可接受的无毒媒介物或稀释剂的剂量单位制剂。本组合物可以例如以适于即时释放或延缓释放的形式施用。即时释放或延缓释放可以通过使用合适的药物组合物来实现，或者，特别是在延缓释放的情况下，通过使用诸如皮下植入物或渗透泵等装置来实现。因此，以上组合物可能适合通过以下途径中的任一种来施用：眼内、口服、舌下、肠道、吸入、皮下注射、肌内注射、腹膜内注射、鞘内注射或输注、气管内、静脉内注射或者输注，或局部。
用于口服施用的示例性组合物包括混悬液和即时释放片剂，所述混悬液可能包含例如用于赋予整体性的微晶纤维素，作为助悬剂的海藻酸或海藻酸钠，作为粘度增强剂的甲基纤维素，和甜味剂或调味剂，诸如本领域已知者；并且所述即时释放片剂可包含例如微晶纤维素、淀粉、硬脂酸镁和/或乳糖和/或其它赋形剂、粘合剂、增积剂、崩解剂、稀释剂和润滑剂，诸如本领域已知者，它们不干扰寡核苷酸螯合稳定性。本组合物也可以通过舌下和/或口腔施用来经由口腔递送。模制片剂、压制片剂或冻干片剂是可以使用的示例性形式。示例性的组合物包括用诸如甘露醇、乳糖、蔗糖和/或环糊精等速溶稀释剂配制本组合物的那些。这些制剂中还可以包含诸如纤维素(avicel)或聚乙二醇(PEG)等高分子量赋形剂。这些制剂还可以包含赋形剂以帮助粘膜粘附，如羟丙基纤维素(HPC)、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羧甲基纤维素钠(SCMC)、马来酸酐共聚物(例如，Gantrez)和诸如聚丙烯酸共聚物等控制释放的药剂(例如，Carbopol 934)。为便于制造和使用，还可以添加润滑剂、助流剂、调味剂、着色剂和稳定剂。
本文中描述的化合物的有效量可以由一般技术人员确定，并且包括示例性的剂量，对于成年人是每天每公斤体重约0.1至50mg活性化合物，这可以以单次剂量或以独立分开的剂量的形式施用，如(但不限于)每天1至5次，或者每周1至7次剂量。应理解的是，对于任何特定的受试者来说，特定的剂量水平和给药频率可能相异，并且将取决于多种因素，包括所用的特定化合物的活性、那种化合物的代谢稳定性和作用时长、受试者的物种、年龄、体重、总体健康状况、性别和饮食、施用方式和时间、排泄率和清除率、药物组合和特定病状的严重程度。治疗的优选受试者包括动物，最优选地是哺乳动物物种如人，和家畜如犬、猫等。
本文中还提供当组合使用以便治疗患有病毒感染的人患者时抗病毒寡核苷酸螯合物和抗病毒多肽的有益抗病毒活性的实例。
通过参考以下实施例将更容易地理解本公开。
实施例I
简并ON的表征
图1A详细说明通过HPLC(使用疏水柱)分离同时共同注射到柱子中的两种ON制剂。其中的第一个称为内标物并且是具有特定的定义序列的21聚体硫代磷酸酯化ON，第二个是REP 2006(40聚体简并硫代磷酸酯化ON)。这两种物质仅根据其理化性质(即大小和疏水性)分离成不同的定义峰；每个这些ON中存在的核苷酸序列对其理化性质没有重要影响并且因此对其分离没有影响。因此，内标物与REP 2006相比作为具有较小保持时间的严格定义的峰流出柱子，只是由于这两种ON聚合物的大小不同。注意到在REP 2006峰任何一侧的肩峰是由于在较长ON的制备中通常存在的失败序列。虽然REP2006的序列性质不均一，但是它像21聚体特定序列那样通过HPLC解析为相似地定义明确的峰，这说明REP 2006制剂中的所有物质的共同理化性质，即使存在极大数目的不同序列。在通过HPLC分离REP 2006和21聚体峰之后，它们可以进行质谱(MS)分析以鉴定在这些定义峰内存在的物质(图1B和1C)。
在图1B中，21聚体被解析成具有7402.6Da的MW的单一物质，与具有定义的序列的这种PS-ON一致。然而，REP 2006的MS分析(图1C)显示存在极大数目的物质，它们的质量范围具有几乎完美的正态分布，与其完全简并的性质一致。这个质量范围从C40(最小的物质)到A40(最大的物质)并且这些物质的出现率(prevalence)极小，随着这些物质质量接近质量范围的中心，物质的数目升高(峰强度)。这是因为越来越大的数目的不同序列将导致相似的质量。REP 2006中存在的所有不同ON物质在HPLC分离期间在疏水柱上具有相同保留时间这一事实明确地证明具有相同大小并且带有相同化学修饰(即硫代磷酸酯化)的所有ON可能会具有高度相似(如果不相同)的理化性质，并且因此，可以认为在不依赖于存在于特定ON分子中的核苷酸序列的任何应用或性质中功能相似。因此，用任何特定简并ON(例如REP2006)观察到的任何ON螯合物形成不可能依赖于存在的ON序列，并且必定依赖于任何ON的保守理化性质。
实施例II
与抗病毒ON形成螯合物
REP 2031、REP 2055、REP 2057和REP 2139是具有针对HIV、HSV、巨细胞病毒、LCMV、HCV和其他包膜病毒的广谱抗病毒活性的核酸聚合物(NAP)(Bernstein等，2008，Antimicrobial AgentsChemother.52：2727-2733；Cardin等，2009，Virology J.6：214；Vaillant等，2006，Antimicrobial Agents Chemother.，50：1393-1401；Guzman等，2007，Antiviral Therapy，12：1147-1156；Lee等，Virology，372：107-117；Matsumura等，2009，Gastroenterology 137：673-681)。所有这些化合物都是40聚体完全硫代磷酸酯化的ON，在REP 2031(SEQ ID NO：1)的情况下带有5’-3’序列C40，在REP 2055(SEQ ID NO：2)的情况下带有(AC)20，在REP 2057(SEQ ID NO：3)的情况下带有(AG)20以及在REP 2139(SEQ ID NO：18)的情况下带有(2'OMeA-2'OMe，5'MeC)20。虽然REP 2031、REP 2055和REP 2057是DNA ON，但是REP 2139是RNA ON，其中全部核糖都经过2’O甲基修饰并且全部胞嘧啶都经过5’甲基化。
与这些抗病毒ON形成螯合物是使用这些化合物的3'FITC标记衍生物用荧光偏振研究的。在ON合成期间，使用良好建立的试剂和合成方案在3’端通过刚性的3碳接头将每个ON缀合到异硫氰酸荧光素(FITC)上。这些ON从合成中裂解并且作为铵盐留下。这些ON各自被制备成在1mM TRIS中的0.5mM储备液(pH 7.2)。这些储备液用于在FP缓冲液(10mM TRIS，80mM NaCl，1mM EDTA，10mMβ-巯基乙醇和0.1％-20)中制备3nM荧光ON溶液。存在的EDTA用于除去FP测定之前溶液中存在的任何二价金属。每种这些缓冲溶液还包含80mM NaCl以评价在摩尔过量的单价阳离子存在下的ON络合物形成。向溶液中的每种荧光ON添加ACS级二价(2+)金属氯化物盐(如表2中所述)。二聚体或高阶ON螯合物的形成是通过荧光偏振的升高(通过无量纲单位“mP”定量)监测的，因此ON螯合物形成增加导致质量有较大改变(参见图3)。引起的这些ON螯合物在溶液中的翻滚减慢导致发射荧光的偏振增加(参见图4)。这些实验的结果在表2中提供。
表2
用不同二价金属与NAP形成ON螯合物
平均值和标准偏差是基于两次重复测量。
在各种况下，所有荧光标记的ON在钙和镁存在下都观察到荧光偏振的显著增加，表明与这些二价金属阳离子形成ON螯合物。这些结果证明以下结论：
·REP 2006、REP 2031、REP 2055、REP 2057和REP 2139在镁和钙阳离子存在下形成二聚体和高阶络合物。预计与所有其他多价金属阳离子以及与任何ON都形成这些络合物(如简并NAP REP 2006所示)。这些ON络合物的形成涉及这些ON与这些二价金属阳离子的相互作用。
·ON络合物的形成不可能是由于含氮碱基之间通过传统的沃森-克里克相互作用的杂交，因为REP 2031、REP 2055、REP 2057和REP2139不能在使用的实验条件下自身杂交。
·这些ON络合物的形成是稳定的并且可溶于水溶液，并且因为这些络合物似乎并入了所讨论的二价金属作为形成的络合物的一部分，所以这些ON络合物具有从形成所述ON络合物的溶液中螯合所讨论的二价金属的作用。
实施例III
包含ON螯合物和多肽的组合物的制备。
包含ON螯合物和多肽的组合物的制备是使用五种不同抗病毒ON和四种抗病毒多肽进行的。使用的ON是先前已经显示在包膜病毒中具有广谱抗病毒活性的NAPS，这些包膜病毒包括HBV、HCV、流感病毒、RSV、埃博拉(Ebola)病毒、HSV-1和HSV-2。这些ON是REP 2006(40聚体简并硫代磷酸酯化NAP)、REP 2055(SEQ IDNO：2)、REP 2057(SEQ ID NO：3)、REP 2139(SEQ ID NO：18)和REP2148(SEQ ID NO：11)。这些NAP是在流动式反应器中通过标准的固相合成条件制备的并且另外在纯化期间进行盐交换以将铵相对离子置换成钠相对离子。这些ON的理论游离酸分子量分别是(12612-13092)、12612、13413以及14094和12893Da。使用的抗病毒多肽是干扰素α-2b、胸腺素α1、聚乙二醇化干扰素α-2a和干扰素λ1(IL-29)，它们全部显示具有抗病毒活性(Yang等，2008，Antiviral Res.，77：136-141；Fried等，2002，N.Engl.J.Med.，347：975-982；Friborg等，2013，Antimicrob.Agents Chemother.57：1312-1322)。所有ON都是按照本领域对于固相寡核苷酸合成的现行标准合成的，并且使用公认的方法制备成适于体内施用的钠盐，并且在储存之前冻干至含水量＜10％。REP 2006、REP 2055、REP 2057和REP 2148是含有通常在固相合成期间出现的少量不完全合成产物的未纯化制剂。REP 2139被制备成不存在大部分不完全合成产物的较高纯度的制剂。REP2006、REP 2057和REP 2139预先在生理盐水中制备成溶液并且在螯合物形成期间调节至25mg/ml。REP 2055也预先在生理盐水中制备成溶液，但是在螯合物制备期间调节至12.5mg/ml。胸腺素α1是具有28个氨基酸且分子量为3108Da的氨基末端酰化的合成肽，并且可以商业制剂(ZadaxinTM)获得，并且在注射用水中制备成1.6mg/ml溶液。干扰素α-2b是在大肠杆菌(E.coli)中通过重组DNA技术制备的，并且具有19271Da的分子量。干扰素α-2b是以商业制剂(IntronATM)获得的，并且在含有1mg/ml人血清白蛋白(具有约66500Da的分子量)的注射用水中制备成1X107IU/ml的溶液。聚乙二醇化干扰素α-2a是干扰素α-2a和单分支双聚乙二醇单甲醚链的共价缀合物，它的总的大概分子量是60000Da。聚乙二醇化干扰素α-2a是以商业制剂(PegasysTM)获得的，它在含有痕量苄醇的注射用水中预稀释成360ug/ml的浓度。纯化的重组干扰素λ1(IL-29)是从Ebiosciences(SanDiego，U.S.A.)作为在磷酸盐缓冲盐水中的0.5mg/ml无载剂溶液获得的，并且如凝胶电泳所测定，它具有约20kDa的分子量。
氯化钙是作为CaCl2·2H2O在注射用水中的100mg/ml USP制剂(LifeshieldTM，Hospira)获得的。硫酸镁是作为MgSO2·7H2O在注射用水中的500mg/ml USP制剂(Baxter)获得的并且在生理盐水中稀释至100mg/ml。为了制备含有钙、镁或钙和镁的ON螯合物，在不断混合下将这些金属盐溶液逐渐逐滴添加至ON溶液中，直到达到希望的金属盐与ON的比率。对于钙螯合物，在溶液中获得每100mg ON 30mg氯化钙的比率，REP 2148钙螯合物除外，它每100mg ON含有20mg氯化钙。对于镁螯合物，在溶液中获得每100mg ON 30mg硫酸镁的比率。对于混合钙/镁螯合物，在溶液中获得每100mg ON 15mg氯化钙和15mg硫酸镁的比率。已经证明这种方法导致ON螯合物的形成(如美国申请公布号2012/0046348所述)。在这个程序结束时，ON螯合物是具有非常淡的浅黄色的澄清均质溶液。
ON螯合物/多肽或聚乙二醇化多肽组合物是通过轻缓混合1∶1比率的ON螯合物溶液与多肽或聚乙二醇化多肽溶液至1ml最终体积来制备的。
实施例IV
包含ON螯合物和多肽的组合物的表征。
为了确认实施例III中制备的组合物中包含的ON和多肽或聚乙二醇化多肽的一致性，对它们进行高压液相色谱法(HPLC)分析，随后进行电喷雾电离质谱(ESI-MS)分析。因为这些组合物中存在的ON和多肽或聚乙二醇化多肽物质的质量和化学性质有较大偏差，所以使用三种不同HPLC方法进行分析：
寡聚物方法：固相：2x 50mmACETM C18(3um)
移动相：A＝1/0.1％HFIPA/DIEA
B＝65/0.075/0.0375％ACN/HFIPA/DIEA
梯度：20min内5-25％B
70％B维持2min，60℃
流速：0.4ml/min
蛋白质方法1：固相：2x 50mm PLRP-s(Agilent TM)4000A(8um)
移动相：A＝含0.05％TFA的ACN
B＝含0.05％TFA的ACN
C＝含0.1％NH4OH的H2O
D＝含0.1％NH4OH的40/40/20ACN/MeOH/H2O
梯度：80/20％C/D洗涤1min至废液
(任选20％D洗涤1min至废液)
15min内20％-100％D，100％B维持2min
(任选16min内20-70％B)
流速：洗涤为0.5ml/min
梯度为0.3ml/min
蛋白质方法2：固相：2x 50mm PLRP-s(Agilent TM)4000A(8um)
移动相：A＝含0.05％TFA的ACN
B＝含0.05％TFA的ACN
C＝含0.1％NH4OH的H2O
D＝含0.1％NH4OH的40/40/20ACN/MeOH/H2O
梯度：80/20％C/D洗涤1min至废液
15min内80/20％A/B-100％B
100％B维持2min
流速：洗涤为0.5ml/nin
梯度为0.3ml/min
使用的仪器是LTQ-Orbitrap Discovery，对于寡聚物方法，是用负离子以LTQ扫描模式运行，而对于两种蛋白质方法，是用正离子以Orbitrap高质量扫描模式在7500分辨率下运行。同义词：ACN＝乙腈，TFA＝三氟乙酸，HFIPA＝六氟异丙醇，DIEA＝N，N-二异丙基乙胺。
来自这些分析的结果可见于图5-95中。所有HPLC色谱图是根据总离子流(TIC)数据作图的，其中峰保留时间附有来自随后的ESI-MS的质量标识(图39、43、47、51、55、77、81、91和95除外，其中这是因聚乙二醇化干扰素α-2a中存在的聚乙二醇缀合物而被阻止)。对于含有ON螯合物和胸腺素α1的组合物的案例，所述寡聚物方法足以同时分析两种物质。对于含有大分子量蛋白质的其他组合物，对同一样品进行ON分析和多肽分析，但是使用不同HPLC方法(如图5-95中所示)。
所有组合物的ON含量的LC-MS分析证明存在于这些组合物中的ON符合其预期纯度：对于REP 2055(图5、24、40、56、68、71、74和78)、REP 2057(图9、27和44)和REP 2148(图17、33、52和64)，在使用寡聚物方法的HPLC分析中观察到少量不完全ON合成产物，但是在REP 2139(图13、30、48、60、82、85、88和92)的情况下不存在。在任何情况下，主(初级)ON峰的ESI-MS几乎与REP2055、REP 2057、REP 2139和REP 2148的预期分子量完全相关。对于REP 2006，主峰的ESI-MS产生在12612-13092Da范围中分布较宽的峰，与其简并性质一致(图22和37)。
对于含有干扰素α-2b的组合物的分析，使用蛋白质方法1获得的HPLC色谱图显示与这些组合物中存在一种以上多肽一致的大的低分辨峰(图7、11、15和19)，但是主峰解析成几乎与干扰素α-2b和人白蛋白的预期分子量几乎完全相关的两种不同质量的物质(图8、12、16和20)。
对于含有胸腺素α1的组合物，从寡聚物方法1获得的HPLC色谱图能够在同一次分离中获得第二个主峰，但是由于这种多肽的分子量相对低，其保留时间比(初级)ON峰小许多(图21、24、27、30、33、68、71、82和85)。在所有情况下，这个二级峰的ESI-MS与胸腺素α1的预期分子量几乎完全相关(图23、26、29、32、35、70、73、84和87)。
对于含有聚乙二醇化干扰素α-2a的组合物，聚乙二醇化缀合物的存在使LC-MS分析大大复杂化，聚乙二醇化缀合物产生众多离子物质，这使任何聚乙二醇化多肽质谱的正确反演很难。然而，使用蛋白质方法2，来自含有聚乙二醇化干扰素α-2a的组合物的HPLC数据全部显示与对于聚乙二醇化多肽预期的保留时间一致的相似主峰(图38、42、46、50、54、76、80、90和94)。在所有情况下这些峰的ESI-MS分析都显示来自与聚乙二醇化蛋白质的存在一致的m/z600-100-和1500-3600的聚乙二醇化相关信号的相似群组(图39、43、47、51、55、77、81、91和95)。
实施例III中制备的全部寡核苷酸螯合物-多肽组合物中的一部分还通过感应耦合等离子体发射光谱学(ICP-OES)进行了钙和或镁测定。所分析的每种组合物的钙和镁测定数据在表3中提供。
表3
ON螯合物-多肽组合物的金属测定。
实施例III和IV的结果证明以下：
1.包含含有钙、镁或混合的钙/镁和多肽或聚乙二醇化多肽的ON螯合物的组合物可以制备成适合于肠胃外施用。
2.如通过REP 2055、REP 2057、REP 2139、REP 2148、干扰素α-2b、胸腺素α1和干扰素λ1的实测和理论分子量之间几乎完全的相关性所证明，所讨论的这些组合物中的ON和多肽或聚乙二醇化多肽都没有经历任何可检测到的化学变化。
3.在包含聚乙二醇化干扰素α-2a的组合物的情况下，ON没有改变，而多肽改变(如果有)不能检测到。
根据这些效果，还可以有以下推断：
1.REP 2006是完全简并的ON并且因此是所有ON所共有的理化性质的原型模型。因此，可以配制为螯合物的任何ON在溶液中将与这些多肽或聚乙二醇化多肽相容。
2.REP 2006、REP 2055、REP 2057和REP 2148是DNA，而REP2139是RNA。因此，可以在包含ON螯合物和多肽的组合物的制备中使用任何RNA或DNA或RNA/DNA杂交ON。
3.REP 2006、REP 2055和REP 2057具有未修饰的核糖，而REP2139的每个核糖都被2’O甲基化。因此，任何2’核糖修饰都将与包含ON螯合物和多肽的组合物的制备相容。
4.REP 2139和REP 2148所包含的每个胞嘧啶都被进一步修饰为5′甲基胞嘧啶。因此，包含修饰碱基的ON可以用于制备包含ON螯合物和多肽或聚乙二醇化多肽的组合物。
5.含有ON螯合物和多肽或聚乙二醇化多肽的组合物将与诸如钙和/或镁等任何药学上可接受的二价金属阳离子相容。
6.组合物制备中使用的四种多肽涵盖相差很大的结构：胸腺素α1是一种小的合成多肽，干扰素α-2b和干扰素λ1是大的重组多肽而聚乙二醇化干扰素α-2a是带有大的复杂聚乙二醇化缀合物的大的重组肽。因此，可以使用从小的合成多肽到带有复杂缀合物如聚乙二醇的大的重组多肽这些广泛的多肽成功地制备含有ON螯合物和多肽的组合物。有可能唯一的限制就是所讨论的多肽应该可溶于水溶液。此外，在内含子A(用作干扰素α-2b的来源)中使用BSA作为载体蛋白不影响用这种多肽制剂制备的组合物的稳定性。
7.如上所述，在本领域中熟知聚乙二醇化可用于改进多肽的耐受性和药动学忒性并且众多聚乙二醇化多肽目前作为批准药物正在使用(参见上文)。因此，证实本文中描述的组合物可以良好地耐受聚乙二醇化肽的存在以及组合ON螯合物和聚乙二醇化肽对于改善抗病毒应答和在人患者中的实用性(参见以下实施例VI)为本领域任何技术人员提供了明确的教导，即本文中设想作为组合物的一部分的任何多肽还可以作为聚乙二醇化多肽存在。例如，胸腺素α1可以被聚乙二醇化，干扰素α-2b可以被聚乙二醇化(干扰素α-2b的聚乙二醇化形式Peg-intronTM是目前批准的药物)，并且干扰素λ1可以被聚乙二醇化(干扰素λ1的聚乙二醇化形式目前在临床中作为抗病毒剂开发)。
实施例V
NAP抑制HBsAg转运出细胞。
已经证明乙型肝炎表面抗原(HBsAg)阻断对HBV感染的免疫应答的许多方面(cheng等，J.Hepatology 43：465-471；Moucari等，Hepatology 49：1151-1157；Vanlandschoot等，J.Gen.Virol.83：1281-1289；Woltman等，PloS One 6：e15324；Wu等，Hepatology 49：1132-1140和Xu等，Mol.Immunology 46：2640-2646)。因此，消除循环HBsAg可能是使患有慢性乙型肝炎感染患者免疫活性恢复的关键因素。消除循环中的HBsAg的一种有效方法是防止SVP形成和或从感染细胞释放(SVP是血液中HBsAg的主要载体)。SVP的形态发生和细胞内转运可以在BHK-21细胞中通过表达HBsAg蛋白的小形式(sHBsAg)进行体外模拟，sHBsAg是在SVP中特别富集的形式。这种模型系统被认为是人患者中的HBV SVP的形态发生和转运的替代模型(Patient等，J.Virology 81：3842-3851)。由于血清HBsAg在允许HBV感染的长期性中有关键作用，因此化合物阻断这种模型中的SVP形成或其细胞内转运的能力显示其对HBV的抗病毒活性。
在表达sHBsAg的BHK-21细胞中测试多种NAP化合物，包括完全简并的硫代磷酸酯化NAP REP 2006和REP 2107(2107的所有核糖还带有2’O甲基修饰)，非硫代磷酸酯化、完全2’O甲基化的简并NAP(REP 2086)以及由聚AC序列组成的NAP：REP 2055(SEQ IDNO：2)和REP 2148(SEQ ID NO：11)。这些NAP与使用电穿孔用于sHBsAg表达的模板RNA同时通过电穿孔引入BHK-21细胞。通过用免疫荧光显微术对BHK-21细胞内HBsAg蛋白的位置进行观测来评价BHK模型系统中的活性。如果HBsAg局限于核周间隙并且阻止转运到细胞外周(分泌)就判断化合物是具有活性的。各种NAP化合物的活性总结在下表4中。
表4
多种NAP对BHK-21细胞中的HBsAg转运的影响
NAP 保留在核周间隙中的HBsAg 转运到细胞外周的HBsAg
对照(不存在NAP) - ++++
REP2006 ++++ -
REP2107 +++ +
REP 2086 - ++++
REP 2055(SEQ ID NO：2) ++++ -
REP 2148(SEQ ID NO：11) ++++ -
-＝未观察到效果
+到++++＝观察到临界到完全的效果
用REP 2006和REP 2107处理表达sHBsAg的BHK-21细胞的结果说明NAP能够以序列无关的方式阻断sHBsAg转运。REP 2086缺乏活性说明这种活性严格依赖于硫代磷酸酯化的存在。此外，在2’核糖修饰(在REP 2107中)和碱基修饰(在REP 2148的情况下是5′甲基胞嘧啶)存在下这种能力得到保留。此外，已知REP 2107、REP 2055和REP 2139完全没有任何免疫刺激活性并且与REP 2006活性相当。同样，聚AC的定义序列(REP 2055和REP 2148)与简并序列(REP 2006和REP 2107)的活性相当。
这些结果显示，在简并序列和包含AC重复(并且因此也是CA重复)的序列和也含有交替嘌呤/嘧啶核苷酸重复(如TG和GT或UG和GU)并且含有2’核糖修饰或碱基修饰或同时含有2’核糖修饰和碱基修饰(参见实施例VI中的REP 2139)的其他序列的情形中，在20-120个核苷酸的寡核苷酸长度下，预期硫代磷酸酯化的NAP将能够阻断SVP的形成以及从感染细胞的细胞内转运和分泌，如美国专利8,008,269、8,008,270和8,067,385中所述。
实施例VI
用于治疗人患者的慢性乙型肝炎的组合治疗
REP 2055是硫代磷酸酯化ON(SED ID NO：2)的简单钠盐。REP2139-Ca是在生理盐水中使用每存在100mg寡核苷酸就有30mg CaCl2的比率制备的硫代磷酸酯化寡核苷酸REP 2139(SEQ ID NO：18)的钙螯合物。REP 2055和REP 2139是NAP并且这类化合物是对包膜病毒有效的广谱抗病毒化合物(Bernstein等，2008，Antimicrobial Agentsand Chemotherapy，52：2727-2733；Cardin等，2009，Virology Journal，6：214；Guzman等，2007，Antiviral Therapy，12：1147-1156；Lee等，2008，Virology，372：107-117；Matsumura等，2009，Gastroenterology，137：673-681；Vaillant等，2006，Antimicrobial Agents and Chemotherapy，50：1393-1401和美国专利8,008,269B、8,008,270和8,067,385)。螯合物不影响NAP或其他ON物质的生物活性并且因此将REP 2139配制为钙螯合物对其抗病毒活性没有影响。抗病毒活性唯一需要的NAP修饰是ON中的每个键的硫代磷酸酯化。包括2’核糖修饰(如2’O甲基化)和碱基修饰(如5’甲基胞嘧啶和/或4’硫代尿嘧啶)在内的其它修饰对NAP的抗病毒活性的影响可以忽略，但是可以用于优化人患者的耐受性。
聚乙二醇化干扰素α-2a由Roche Inc.(Basel，Switzerland)以商标PegasysTM销售并且批准用于治疗慢性HBV感染。胸腺素α1由SciClone Pharmaceuticals(Foster City，California，U.S.A.)以商标ZadaxinTM销售并且也在许多亚洲国家批准用于治疗慢性HBV感染。
为了研究NAP治疗与免疫治疗(刺激适应性和天生的免疫应答)的组合的抗病毒效果是否能够改善患有慢性HBV感染的患者的抗病毒应答，患者用REP 2055进行单药治疗以及用REP 2139-Ca和胸腺素α1(ZadaxinTM-1.6mg皮下注射，每周两次给予)或聚乙二醇化干扰素α-2a(PegasysTM-180μg皮下注射，每周一次给予)进行组合治疗，达到其正在进行的NAP方案。
REP 2055和REP 2139-Ca两者当在单药治疗中使用时在阻断HBsAg的释放方面具有同等活性，阻断HBsAg的释放是一般情况下所有NAP对HBV感染的治疗作用机制。REP 2055和REP 2139-Ca当在相当的单药治疗方案中给予时，分别在8名患者中的7名中和12名患者中的9名中实现HBV感染患者血清中的HBsAg清除，并且这两种药物的血清HBsAg清除相当(参见表5)，这显示当作为钠盐或作为螯合物给予时这些NAP的抗病毒活性相当。
表5
REP 2055和REP 2139-Ca有效地并且同等地清除患有慢性HBV感染的患者的血清HBsAg。
*通过Abbott ArchitectTM HBsAg定量检测进行测定
基于干扰素的治疗通常在治疗停止之后使25％的患者实现其HBV感染的控制(血清HBV DNA＜500个拷贝/ml；Mourcari等，2009，Hepatology 49：1151-1157)，并且一般认为胸腺素α1治疗具有相当的效果(Yang等，2008Antiviral Research 77：136-141)。
REP 2055单药治疗在治疗停止之后在7名患者中的3名(43％)中实现HBV感染的控制(血清HBV DNA＜500个拷贝/ml)。REP 2139-Ca治疗(在以单药治疗给予时在清除血清HBsAg方面与REP 2055有相同的效果)与胸腺素α1或聚乙二醇化干扰素α-2a的组合在患有HBV感染的9名患者中的8名(89％)中实现病毒控制(参见表6)。
表6
用NAP单药治疗或组合的NAP/免疫治疗实现持续的病毒学应答(SVR)。
*血清HBV DNA＜500个拷贝/ml
这些结果证明抗病毒ON螯合物(在这个实施例中是REP 2139-Ca)和抗病毒多肽(在这个实施例中是聚乙二醇化干扰素α-2a或胸腺素α1)的组合作用能够使得人患者HBV感染的治疗后控制得到改善并且进一步证明在患有病毒感染的患者中用ON螯合物和多肽或聚乙二醇化多肽组合治疗的实用性。
由抗病毒ON螯合物和抗病毒多肽构成的组合物将是合乎需要的，因为它们会通过同时提供两种药剂来改善患有病毒感染(包括HBV感染)的患者的总体抗病毒应答(它的实用性在本实施例中公开)。
上述组合物中的抗病毒ON螯合物可以包括如上所述的任何抗病毒ON并且在HBV的情况下可以特别包括REP 2055(SEQ IDNO：3、REP 2139(SEQ ID NO：18)、REP 2148(SEQ ID NO：11)或如上所述阻断HBsAg转运的任何其他NAP化合物。
上述组合物中的多肽可以包括任何抗病毒多肽或聚乙二醇化抗病毒多肽并且在HBV的情况下可以特别包括干扰素α-2b、聚乙二醇化干扰素α-2b、聚乙二醇化干扰素α-2a、胸腺素α1、干扰素λ1或聚乙二醇化干扰素λ1。
可以认识到，上述组合疗法不仅在HBV感染中，而且在其他病毒感染如丙型肝炎病毒、流感病毒、RSV和能够对抗病毒ON或抗病毒多肽或聚乙二醇化多肽的作用有响应的其他病毒等中也有类似的有益效果。虽然在本实施例中使用NAP，但是在人患者抗病毒结果的这些改善可以使用与抗病毒多肽或聚乙二醇化多肽组合时配制成螯合物的通过序列相关机制起作用的其他抗病毒ON实现。在使用抗病毒寡核苷酸螯合物和抗病毒多肽的正确组合的情况下，这些作用也会在其他病毒感染中更加广泛地有效。例如，NAP对诸如丙型肝炎、流感、呼吸道合胞病毒和巨细胞病毒等许多其他包膜病毒有广泛活性，并且因此预计NAP螯合物与适当的抗病毒多肽(可以是胸腺素α1或聚乙二醇化干扰素α-2a，但是也可以是更适合于特定病毒感染的另一种抗病毒多肽)的组合在感染受试者中将产生比单药治疗中的任何一种化合物好得多的抗病毒应答。在另一种情况下，为了改善患有丙型肝炎感染患者的抗病毒应答，可以将miravirsen(SEQ ID NO：7)的螯合物与干扰素(聚乙二醇化或非聚乙二醇化)组合。
用NAP螯合物和胸腺素α1或聚乙二醇化干扰素α-2a证明的有益效果预计也会发生在诸如反义或siRNA或miRNA或针对特定病毒感染开发的适体ON或免疫刺激寡核苷酸等其他种类寡核苷酸的ON螯合物上。因此，预计将来源于任何这些ON种类的ON螯合物与适当的抗病毒多肽组合的方法将会在显示对单药治疗中的抗病毒寡核苷酸(作为钠盐或螯合物)或抗病毒多肽或聚乙二醇化多肽有响应的各种各样的病毒感染中有治疗用途。
鉴于以上实施例，现在可以设想两种或两种以上抗病毒ON螯合物(例如包含NAP和反义ON或包含NAP和抗病毒siRNA)能够与一种或多种抗病毒多肽或聚乙二醇化多肽(例如聚乙二醇化干扰素α-2a和胸腺素α1或胸腺素α1和聚乙二醇化干扰素λ1)组合，在同一制剂中或在多个制剂中，以通过相同或不同途径施用。
在以上实施例中，REP 2139-Ca是通过静脉内输注施用的，而聚乙二醇化干扰素α-2a或胸腺素α1是通过皮下施用来施用的。基于以上实施例的教导，本领域技术人员现在将能够容易地预测ON螯合物和多肽能够通过皮下注射或静脉内输注在同一制剂(如已经在以上实施例3和4中公开的那些制剂)中给予并且会预测到与分别施用(通过相同或不同施用途径)任何一种药剂时具有相同的有益效果。
本文中描述的ON螯合物和抗病毒多肽或聚乙二醇化多肽的组合疗法在本文中描述的抗病毒环境中的有益效果明确地预测使用ON螯合物和多肽或聚乙二醇化多肽在这两种药剂在单药治疗中具有一定程度活性的治疗环境中进行组合治疗具有类似的有益效果。例如，靶向癌症中所涉及的基因的反义ON(因此其具有抗癌活性)可以被配制成本文中描述的ON螯合物并且进一步与已知在单药治疗中正常使用时具有一定程度抗癌活性的免疫治疗剂组合。这些治疗环境可以包括癌症、多发性硬化和阿尔茨海默病。

Claims (64)

1.一种药物组合物，其包含由两个或两个以上分子间通过二价阳离子连接的寡核苷酸(ON)组成的ON螯合物和至少一种多肽。
2.一种药物组合物，其包含由两个或两个以上分子间通过二价阳离子连接的抗病毒ON组成的抗病毒ON螯合物和至少一种抗病毒多肽。
3.如权利要求1或2所述的药物组合物，其中所述多肽被进一步聚乙二醇化。
4.如权利要求1至3中任一项所述的药物组合物，其中所述多价阳离子是具有2+电荷状态的碱土金属。
5.如权利要求1至4中任一项所述的药物组合物，其中所述二价金属阳离子是具有2+电荷状态的过渡金属。
6.如权利要求1至5中任一项所述的药物组合物，其中所述二价金属阳离子是具有2+电荷状态的镧系金属。
7.如权利要求1至6中任一项所述的药物组合物，其中所述二价金属阳离子是具有2+电荷状态的后过渡金属。
8.如权利要求1至7中任一项所述的药物组合物，其中所述二价金属阳离子是钙。
9.如权利要求1至7中任一项所述的药物组合物，其中所述二价金属阳离子是镁。
10.如权利要求1至7中任一项所述的药物组合物，其中所述二价金属阳离子是铁(2+)、锰、铜或锌。
11.如权利要求1至7中任一项所述的药物组合物，其中所述二价阳离子由两种或两种以上不同二价金属阳离子构成。
12.如权利要求1至7中任一项所述的药物组合物，其中所述二价阳离子由钙和镁构成。
13.如权利要求1至12中任一项所述的药物组合物，其中所述ON螯合物包含至少一个双链ON。
14.如权利要求1至13中任一项所述的药物组合物，其中所述ON螯合物包含至少一个具有至少一个硫代磷酸酯键的ON。
15.如权利要求1至14中任一项所述的药物组合物，其中所述ON螯合物包含至少一个完全硫代磷酸酯化的ON。
16.如权利要求1至15中任一项所述的药物组合物，其中所述ON螯合物包含至少一个具有一个2’修饰的核糖的ON。
17.如权利要求1至16中任一项所述的药物组合物，其中所述ON螯合物包含至少一个每个核糖都被2’O-甲基化的ON。
18.如权利要求1至17中任一项所述的药物组合物，其中所述ON螯合物包含至少一个包含至少一个5′甲基胞嘧啶的ON。
19.如权利要求1至18中任一项所述的药物组合物，其中所述ON螯合物包含至少一个其中每个胞嘧啶都进一步是5′甲基胞嘧啶的ON。
20.如权利要求1至19中任一项所述的药物组合物，其中所述ON螯合物包含至少一个其中每个核糖都被2’O-甲基化并且其中每个胞嘧啶都进一步是5′甲基胞嘧啶的ON。
21.如权利要求1至12中任一项所述的药物组合物，其中所述ON螯合物包含选自SEQ ID NO：1-6和10-18的寡核苷酸。
22.如权利要求1至3中任一项所述的药物组合物，其中所述ON螯合物包含选自SEQ ID NO：7-9的寡核苷酸。
23.如权利要求1至22中任一项所述的药物组合物，其中所述多肽是以下中的至少一种：
胸腺素α1；
任何α-干扰素或其聚乙二醇化衍生物；
任何β-干扰素或其聚乙二醇化衍生物；
任何γ-干扰素或其聚乙二醇化衍生物；
任何λ-干扰素或其聚乙二醇化衍生物；
干扰素α-2a或α-2b或α-N3；
干扰素β-1a或β-1b；
干扰素γ-1b；
干扰素λ1或λ2或λ3；
聚乙二醇化干扰素α-2a或α-2b或λ1或λ2或λ3；
Myrcludex B；
任何抗病毒细胞因子或其聚乙二醇化衍生物；
胸腺蛋白A；和
任何显示具有抗病毒活性或免疫刺激活性的多肽。
24.如权利要求1至23中任一项所述的药物组合物，其是配制用于皮下施用。
25.如权利要求1至23中任一项所述的药物组合物，其是配制用于静脉内输注。
26.如权利要求1至23中任一项所述的药物组合物，其是配制用于至少一种以下施用途径：气雾剂吸入、眼内、口服、肠道、肌内注射、腹膜内注射、鞘内注射、鞘内输注、气管内、静脉内注射和局部。
27.如权利要求1至26中任一项所述的药物组合物，其中所述ON螯合物包含至少一个由SEQ ID NO：2组成的ON。
28.如权利要求1至26中任一项所述的药物组合物，其中所述ON螯合物包含至少一个由SEQ ID NO：11组成的ON。
29.如权利要求1至26中任一项所述的药物组合物，其中所述ON螯合物包含至少一个由SEQ ID NO：18组成的ON。
30.如权利要求1至29中任一项所述的药物组合物，其进一步包含一种或多种以下药物：恩替卡韦、替诺福韦酯富马酸盐、telbuvidine、阿德福韦酯、拉米夫定、利巴韦林、特拉匹韦、波塞普韦、GS-7977、tegobuvir、扎那米韦、奥司他韦、更昔洛韦、膦甲酸、阿昔洛韦、叠氮胸苷、阿巴卡韦、洛匹那韦、利托那韦或依法韦仑。
31.如权利要求1至30中任一项所述的药物组合物，其进一步包含载剂。
32.一种药物组合物，其包含含有由SEQ ID NO：3组成的寡核苷酸的ON螯合物和聚乙二醇化干扰素α-2a。
33.一种药物组合物，其包含含有由SEQ ID NO：18组成的寡核苷酸的ON螯合物和聚乙二醇化干扰素α-2a。
34.一种药物组合物，其包含含有由SEQ ID NO：11组成的寡核苷酸的ON螯合物和聚乙二醇化干扰素α-2a。
35.一种药物组合物，其包含含有由SEQ ID NO：3组成的寡核苷酸的ON螯合物和胸腺素α1。
36.一种药物组合物，其包含含有由SEQ ID NO：18组成的寡核苷酸的ON螯合物和胸腺素α1。
37.一种药物组合物，其包含含有由SEQ ID NO：11组成的寡核苷酸的ON螯合物和胸腺素α1。
38.一种药物组合物，其包含含有由SEQ ID NO：3组成的寡核苷酸的ON螯合物和干扰素α-2b。
39.一种药物组合物，其包含含有由SEQ ID NO：18组成的寡核苷酸的ON螯合物和干扰素α-2b。
40.一种药物组合物，其包含含有由SEQ ID NO：11组成的寡核苷酸的ON螯合物和干扰素α-2b。
41.一种药物组合物，其包含含有由SEQ ID NO：3组成的寡核苷酸的ON螯合物和聚乙二醇化胸腺素α1。
42.一种药物组合物，其包含含有由SEQ ID NO：18组成的寡核苷酸的ON螯合物和聚乙二醇化胸腺素α1。
43.一种药物组合物，其包含含有由SEQ ID NO：11组成的寡核苷酸的ON螯合物和聚乙二醇化胸腺素α1。
44.一种药物组合物，其包含含有由SEQ ID NO：3组成的寡核苷酸的ON螯合物和聚乙二醇化干扰素α-2b。
45.一种药物组合物，其包含含有由SEQ ID NO：18组成的寡核苷酸的ON螯合物和聚乙二醇化干扰素α-2b。
46.一种药物组合物，其包含含有由SEQ ID NO：11组成的寡核苷酸的ON螯合物和聚乙二醇化干扰素α-2b。
47.一种药物组合物，其包含含有由SEQ ID NO：3组成的寡核苷酸的ON螯合物和干扰素λ1。
48.一种药物组合物，其包含含有由SEQ ID NO：18组成的寡核苷酸的ON螯合物和干扰素λ1。
49.一种药物组合物，其包含含有由SEQ ID NO：11组成的寡核苷酸的ON螯合物和干扰素λ1。
50.一种药物组合物，其包含含有由SEQ ID NO：3组成的寡核苷酸的ON螯合物和聚乙二醇化干扰素λ1。
51.一种药物组合物，其包含含有由SEQ ID NO：18组成的寡核苷酸的ON螯合物和聚乙二醇化干扰素λ1。
52.一种药物组合物，其包含含有由SEQ ID NO：11组成的寡核苷酸的ON螯合物和聚乙二醇化干扰素λ1。
53.一种用于制备如权利要求1至52中任一项所述的药物组合物的方法，所述方法包括：
a.在药学上可接受的含水赋形剂中溶解至少一种寡核苷酸(ON)钠盐；
b.向所述溶解的ON中逐渐添加药学上可接受的二价金属盐溶液以使所述ON螯合物保持可溶；
c.在药学上可接受的相容含水赋形剂中溶解一种或多种抗病毒多肽；以及
d.使所述抗病毒多肽溶液与所述ON螯合物溶液逐渐混合以使所述ON螯合物和抗病毒多肽保持溶解。
54.一种用于制备如权利要求1至52中任一项所述的药物组合物的方法，所述方法包括：
a.在药学上可接受的含水赋形剂中溶解至少一种寡核苷酸(ON)钠盐；
b.向所述溶解的ON中逐渐添加药学上可接受的钙和/或镁盐溶液中的至少一种以使所述ON螯合物保持可溶；
c.在药学上可接受的相容含水赋形剂中溶解一种或多种抗病毒多肽；以及
d.使所述抗病毒多肽溶液与所述ON螯合物溶液逐渐混合以使所述ON螯合物和抗病毒多肽保持溶解。
55.如权利要求53或54所述的方法，其中所述ON螯合物溶液和所述多肽溶液是在临施用所述药物组合物之前混合的。
56.如权利要求53或54所述的方法，其中向所述溶解的ON中添加的二价金属盐的比率是每100mg寡核苷酸0.1-50mg。
57.如权利要求53或54所述的方法，其中所述最终ON浓度是0.1-200mg/ml。
58.如权利要求53至57中任一项所述的方法，其中所述二价金属盐是氯化物盐、葡萄糖酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、苹果酸盐、天冬氨酸盐、富马酸盐、抗坏血酸盐、苯甲酸盐、异抗坏血酸盐、丙酸盐、硫酸盐或碳酸氢盐中的至少一种。
59.如权利要求53至57中任一项所述的方法，其中所述二价金属盐溶液包含钙、镁、铁(2+)、锰、铜或锌中的至少一种。
60.如权利要求53至59中任一项所述的方法，其中使用的所述ON选自SEQ ID NO：1-18。
61.如权利要求53至60中任一项所述的方法，其中所述一种或多种多肽选自由以下组成的组：
胸腺素α1；
任何α-干扰素或其聚乙二醇化衍生物；
任何β-干扰素或其聚乙二醇化衍生物；
任何γ-干扰素或其聚乙二醇化衍生物；
任何λ-干扰素或其聚乙二醇化衍生物；
干扰素α-2a或α-2b或α-N3；
干扰素β-1a或β-1b；
干扰素γ-1b；
干扰素λ1或λ2或λ3；
聚乙二醇化干扰素α-2a或α-2b或λ1或λ2或λ3；
Myrcludex B；
任何抗病毒细胞因子或其聚乙二醇化衍生物；
胸腺蛋白A；和
任何显示具有抗病毒活性或免疫刺激活性的多肽。
62.一种试剂盒，其包含如权利要求1至52中任一项所述的药物组合物。
63.如权利要求62所述的试剂盒，其中所述ON螯合物和所述至少一种多肽是分别配制的。
64.如权利要求63所述的试剂盒，其中所述ON螯合物和所述至少一种多肽是配制用于通过相同或不同施用途径共同施用的。
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