CN103052400A - 自我复制rna分子的病毒样递送颗粒 - Google Patents

Abstract

通过用包裹在小颗粒中的自我复制型RNA进行给药达到核酸免疫目标。所述RNA编码感兴趣的免疫原，而颗粒可以通过模拟天然RNA病毒的递送功能来递送该RNA。因此本发明提供了在体内向脊椎动物细胞递送RNA的非病毒颗粒，其中所述颗粒由递送材料包裹着编码免疫原的自我复制RNA分子构成。这些颗粒是药物组合物的有用成分，用于针对各种疾病免疫对象。

Description

自我复制RNA分子的病毒样递送颗粒

本申请请求受益于美国专利临时申请61/361,828(2010年7月6日提交)，其完整内容通过引用纳入本文用作所有目的。

技术领域

本发明所属领域是用于免疫目的的自我复制RNA的非病毒递送。

背景技术

通过递送核酸对动物实现免疫是多年来的目标。曾经试验了各种途径，包括应用DNA或RNA、病毒或非病毒递送载体（或者甚至不用递送载体的“裸”疫苗）、复制型或非复制型载体，或者是病毒或非病毒载体。

现对于进一步且改进的核酸疫苗仍存在需求，特别是核酸疫苗的改良递送方式。

发明详述

根据本发明，核酸免疫是通过将自我复制型RNA包封于和/或吸附于一种小颗粒进行传输来实现的。所述RNA编码感兴趣的免疫原，所述颗粒则模拟天然病毒的传输功能来递送该RNA。

因而本发明提供了在体内向脊椎动物细胞递送RNA的非病毒颗粒，其中的颗粒由递送材料包裹着编码免疫原的自我复制RNA分子构成。本发明还提供在体内向脊椎动物细胞递送RNA的非病毒颗粒，其中的颗粒由递送材料上吸附有编码免疫原的自我复制RNA分子组成。这些颗粒在针对各种疾病对动物个体实施免疫的药物组合物中是有用的组成部分。结合运用一种非病毒颗粒来递送自我复制型RNA，提供了在仅递送少量RNA的情况下就能诱导出针对免疫原的强效和特异性的免疫应答的一种方法。此外，这些颗粒容易实现商业规模的制造。

颗粒

本发明中的颗粒是非病毒颗粒，即它们不是病毒。因而颗粒不含有衣壳蛋白。因规避了制备衣壳颗粒的需要，本发明无需细胞包装流程，故使得商业化生产放大变得容易，且最大程度减少了不经意间产生危险的感染性病毒的风险。

本发明的颗粒由递送材料构成，而不是将RNA包裹在病毒粒子中。多种材料适合于生产可在体内向脊椎动物细胞递送RNA的颗粒。特别令人感兴趣的两种递送材料是：(i)可形成脂质体的两亲性脂肪，以及(ii)可形成微粒的无毒且可生物降解的高分子聚合物。通过脂质体传输时，必须将RNA包裹于其中；如通过多聚物微粒传输，RNA可以是包封或吸附的形式。第三种感兴趣的递送材料是多聚物、交联剂、RNA以及带电荷的单体的微粒反应产物。

本发明一个实施方式中的颗粒包含了包封编码免疫原的自我复制RNA分子的脂质体，另一个实施方式中包含了包封编码免疫原的自我复制RNA分子的多聚物微粒，还有一个实施方式中包含了吸附编码免疫原的自我复制RNA分子的多聚物微粒。在所有三种情况下颗粒都基本上以球形为宜。第四个实施方式中本发明的颗粒包含了多聚物、交联剂、编码免疫原的自我复制RNA分子以及带电荷的单体的微粒反应产物。这些颗粒在模具中成型因而可制作成任何形状，其中包括但不仅限于球形。

RNA可以被包封在颗粒中（尤其是当颗粒是脂质体时）。这意味着颗粒内的RNA（如同在天然病毒内的那样）被递送材料隔离于外界基质，发现包封体可以保护RNA免于RNA酶降解。可以采取各种形式进行包封。例如在某些实施方式中（如像在单层脂质体中）递送材料围绕含有RNA的水性内核外形成外层，在另一些实施方式中（如模具成型颗粒）递送材料形成内含RNA的基质。所述颗粒可包括一些外在的RNA（例如，在颗粒外表面），但至少一半的RNA（最理想是全部）被包封在内部。包封于脂质体内部明显区别于参考资料1中披露的脂质/RNA复合物。

RNA可以吸附于颗粒上（尤其是当颗粒是一种多聚物微粒时）。这意味着递送材料未将RNA与外界基质相隔离，不像病毒中的RNA基因组那样。颗粒可以包括一些被包封的RNA（如，包封在颗粒核心内），但至少一半的RNA（最理想是全部）被吸附。

脂质体

各种两亲性脂肪可在水性环境内形成双层以包裹含有RNA的水性内核，成为脂质体。这些脂肪可具有阴性的、阳性的或两性离子的疏水性末端基团。由阴性磷脂生成脂质体可追朔到十九世纪六十年代，生成阳性脂质体的脂类则自从十九世纪九十年代一直在研究。一些磷脂是阴离子的，其他有两性的，还有阳离子的。适合的磷脂类型包括，但不仅限于：磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸和磷脂酰甘油，一些有用的磷脂类列于表1。有用的阳性脂类包括，但不仅限于：二油酰氧基三甲胺丙烷(DOTAP)、1,2-二硬脂酰氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DSDMA)、1,2-二油氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DODMA)、1,2-二亚油酰氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DLinDMA)、1,2-二亚油酰氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DLenDMA)。两性离子脂质类包括，但不仅限于：两性脂肪酰和两性脂肪醚。有用的两性脂类的例子有DPPC、DOPC和十二基磷基胆碱。脂质类可以是饱和的或不饱和的。以运用至少一种不饱和脂制备脂质体为宜。如果一种不饱和脂有两个尾部，可以是两端均为不饱和，或是一个饱和另一个不饱和。

本发明的脂质体颗粒可由单个的脂或混合的脂生成。混合脂可含有(i)阴离子脂质的混合物，(ii)阳离子脂质混合物，(iii)两性离子脂质混合物，(iv)阴离子脂质与阳离子脂质的混合物，(v)阴离子脂质与两性离子脂质的混合物，(vi)两性离子脂质与阳离子脂质的混合物，或(vii)阴离子脂质、阳离子脂质、两性离子脂质的混合物。类似地，一种混合物可同时含有饱和与非饱和脂。例如，混合物含有DSPC(两性离子，饱和)、DlinDMA(阳离子,不饱和)、和/或DMG(阴离子，饱和)。当采用混合脂时，并非所有脂质成分都需要是两亲性的，如：一种或多种两亲性脂可与胆固醇混合。

脂质的疏水部分可PEG化（即：通过与聚乙二醇共价结合进行修饰）。这种修饰可增加稳定性并防止脂质体的非特异性吸附。例如，可运用参考文献2和3中所披露的技术将脂质与PEG结合。可用各种长度的PEG，如0.5-8kDa。

DSPC、DlinDMA、PEG-DMG和胆固醇的混合物用于实施例。

脂质体颗粒通常被分为三组：多层脂质体(MLV)、小单层脂质体(SUV)，以及大单层脂质体(LUV)。MLV的每个囊泡中有多个双层，形成多个独立的水性腔体。SUV和LUV具有包封水性内核的单个双层；SUV的典型直径是<50nm，LUV直径>50nm。本发明脂质体颗粒的LUV理想直径在50-220nm范围。含有许多不同直径的LUV的组合物是：(i)至少80%数量的直径在20-220nm，(ii)群体的理想平均直径(Zav，按强度计)在40-200nm，和/或(iii)直径的多分散指数<0.2。参考资料1的脂质体/RNA复合体的直径可望在600-800nm，呈高分散性。

制备合适的脂质体的技术为本领域所共知，如参见参考资料4-6。资料7描述了一种有用的方法，涉及到将以下要素混合：(i)脂质的乙醇溶液(ii)核酸的水溶液(iii)缓冲液，然后混匀、平衡、稀释和纯化。本发明中偏好的脂质体是通过此混合过程得到的。

多聚微粒

根据本发明各种高分子聚合物可形成微粒来包裹或吸附RNA。运用基本无毒的多聚物意味着受体可安全地接受其颗粒；运用可生物降解的多聚物意味着颗粒在完成递送后可以被代谢，避免长期滞留。有用的多聚物还要是可灭菌的，以便制成药用级配方。

合适的无毒和可生物降解多聚物包括，但不仅限于：聚(α-羟基酸)、聚羟基丁酸、聚内酯（包括聚己内酯）、聚二氧环己酮、聚戊内酯、聚原酸酯、聚酸酐、聚氰基丙烯酸酯、酪氨酸衍生的聚碳酸酯，或聚酯酰胺，以及它们的组合。

在一些实施方式中，微粒由以下形成：聚(α-羟基酸)如聚乳酸(“PLA”)、乳酸与羟基乙酸共聚物如聚（D,L-乳酸-共-羟基乙酸）共聚物(“PLG”)、以及D,L-乳酸与聚己内酯的共聚物。有用的PLG多聚物包括那些乳酸/羟基乙酸摩尔比在以下范围的，如从20:80到80:20，如25:75、40:60、45:55、50:50、55:45、60:40、75:25。有用的PLG多聚物包括那些分子量在以下范围的，如5,000-200,000Da，如10,000-100,000、20,000-70,000、30,000-40,000、40,000-50,000Da。

微粒的理想直径在0.02μm到8μm范围。含有许多不同直径的微粒的组合中，至少80%数量的直径在0.03-7μm范围。

制备合适的微粒的技术为本领域所共知，如参见参考资料6、8（特别是第7章）和9。为便于RNA吸附，微粒可含有一种阳离子的表面活性剂和/或脂，如参考资料10和11中所披露。

本发明微粒的ζ电位可在40-100mV。

微粒优于脂质体的一个方面是它们很容易进行冻干以稳定保存。

模制颗粒

第三种感兴趣的递送材料是多聚物、交联剂、编码免疫原的自我复制型RNA以及带电荷的单体的微粒反应产物。这四种成分可混合成液体，置于模具中（如含有全氟聚醚），然后固化，根据模具形状和尺寸形成颗粒。合适的生产方法在参考资料12中有详述。这些方法提供可生物降解的交联寡聚高聚合纳米粒子。

颗粒理想的最大直径跨度是<5μm。它们可能总体带正电荷。

合适的多聚物包括，但不仅限于：聚(丙烯酸)、聚(磺化苯乙烯)、羧甲基纤维素(CMC)、聚(乙烯醇)、聚(环氧乙烷)、聚(乙烯吡咯烷酮)、葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮/乙酸乙烯酯/乙烯醇共聚物。偏好的多聚物是聚(乙烯吡咯烷酮)。生成颗粒的多聚物量可以是2-75wt%，例如10-60wt%、20-60wt%。

适合的交联剂可包括二硫化物和/或缩酮。例如，交联剂可包括：聚(ε-己内酯)-b-四甘醇-b-聚(ε-己内酯)二甲基丙烯酸酯、聚(ε-己内酯)-b-聚(乙二醇)-b-聚(ε-己内酯)二甲基丙烯酸酯、聚(乳酸)-b-四甘醇-b-聚(乳酸)二甲基丙烯酸酯、聚(乳酸)-b-聚(乙二醇)-b-聚(乳酸)二甲基丙烯酸酯、聚(乙醇酸)-b-四甘醇-b-聚(乙醇酸)二甲基丙烯酸酯、聚(乙醇酸)-b-聚(乙二醇)-b-聚(乙醇酸)二甲基丙烯酸酯、聚(ε-己内酯)-b-四甘醇-b-聚(ε-己内酯)二丙烯酸酯、聚(ε-己内酯)-b-聚(乙二醇)-b-聚(ε-己内酯)二丙烯酸酯、聚(乳酸)-b-四甘醇-b-聚(乳酸)二丙烯酸酯、聚(乳酸)-b-聚(乙二醇)-b-聚(乳酸)二丙烯酸酯、聚(乙醇酸)-b-聚(乙二醇)-b-聚(乙醇酸)二丙烯酸酯、硅烷、含硅的甲基丙烯酸酯，或二甲基二(甲基丙烯酰氧基-l-乙氧基)硅烷。生成颗粒的交联剂量可以是10-25wt%，例如10-60wt%、20-60wt%。

带电荷的单体可以是阳离子型的或阴离子型的。这些包括，但不仅限于：[2-(丙烯酰氧)乙基]三甲基氯化铵(AETMAC)和2-氨基乙基甲基丙烯酸酯盐酸盐(AEM-HCl)。生成颗粒的带电荷单体量可以是2-75wt%。

生成颗粒的RNA量可以是0.25-20wt%。

在模具内预固化混合物可含有引发剂。例如，模具内可含有<1wt%的引发剂、<0.5wt%的引发剂、或者<0.1wt%的引发剂。有用的引发剂范围是0.1-0.5%。诸如DEAP和DPT之类的光引发剂运用于紫外固化中是有用的。

本发明可使用表1中或参考资料12中实施例1-15中所列的任何材料，除了其中的siRNA成分被本文的自我复制型RNA取代。

RNA

本发明的颗粒包括编码免疫原的（不像siRNA的）自我复制型RNA分子。该颗粒在体内给药后，RNA被从颗粒中释放出来并在细胞内翻译，从而在原位提供免疫原。

和参考资料13不同，本发明颗粒里的RNA是自我复制型的。自我复制型的RNA分子（复制子）在被递送到脊椎动物细胞时即使没有任何蛋白存在，也可以通过自身转录来生成多重的后代RNA（通过其自身产生的反义拷贝）。自身复制型RNA分子是典型的正链分子，它可以在被送达细胞后直接翻译，这种翻译提供了RNA-依赖型RNA聚合酶，继而生成该递送RNA的反义和正义转录产物。于是被递送的RNA引起多重后代RNA产生。这些后代RNA，还有共线亚基因组转录子，可将其自身进行翻译而提供所编码免疫原的原位表达，或者可被转录以提供所递送RNA同一链的其他转录转录本，其可被翻译以提供所述免疫原的原位表达。这种顺序的转录过程的最终结果是引入的RNA复制子数量的巨量增加，从而使编码的免疫原成为细胞中主要的多肽产物。

实现这种方式自我复制的合适系统是采用基于α病毒的复制子。这些复制子是正链RNA，可在送达细胞后导致复制酶（或复制酶－转录酶）的翻译。复制酶被翻译为多聚蛋白，继而自身裂解产生复制复合体，生成被递送RNA正链的基因组负链拷贝。这些负链转录子可进行自身转录来提供母本正链RNA的更多拷贝，也可以提供编码免疫原的亚基因组转录子。亚基因组转录子的翻译带来了感染细胞中免疫原的原位表达。合适的α病毒属复制子可采用来自辛德毕斯病毒、塞姆利基森林病毒、东方马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒（VEEV）等的复制酶。可用突变型或野生型病毒株，如，复制子使用了VEEV的减毒突变株TC83[14]。

偏好的自我复制型RNA分子可以编码(i)RNA-依赖型RNA聚合酶，它可以从自身复制型RNA分子转录RNA，以及(ii)免疫原。聚合酶可以是α病毒复制酶，如含有或多种α病毒蛋白nsP1、nsP2、nsP3和nsP4。

然而天然α病毒基因组在编码非结构复制酶多聚蛋白以外，还编码病毒结构蛋白，希望本发明的自我复制型RNA分子最好不编码α病毒结构蛋白。这样较好的自我复制型RNA可在细胞里生成其自身的基因组RNA拷贝，但不会生成含有RNA的病毒体。没有生成这些病毒体的能力意味着，不像野生型α病毒那样，自我复制型RNA分子不能使自己传承感染性。本发明的自我复制型RNA中，不存在野生型病毒传承所必须的α病毒结构蛋白，它们被编码感兴趣的免疫原的基因所取代，如此，亚基因组转录子就编码了免疫原，而不是α病毒结构蛋白。

因此对本发明有用的自我复制型RNA分子可具有两个开放阅读框。第一个(5')开放阅读框编码复制酶；第二个(3')开放阅读框编码免疫原。在一些实施方式中RNA可具有额外的（如下游）开放阅读框，如用以编码其他免疫原（见下面），或编码辅助多肽。

较好的自我复制型RNA分子具有5'端帽子（如，7-甲基鸟苷）。这个帽子可加强体内的RNA翻译。在一些实施方式中，自我复制型RNA分子的5'端序列必须经过选择以保证与所编码的复制酶相容。

自我复制型RNA分子可具有3'poly-A尾端。它也可以在其3'末端附近包含poly-A聚合酶识别序列（如AAUAAA）。

自我复制型RNA分子可具有各种长度，但它们典型的长度是5000-25000个核苷酸，如8000-15000个核苷酸，或9000-12000个核苷酸。因而RNA比siRNA递送中所见的要长。

自我复制型RNA分子通常为单链。单链RNA通常可通过与TLR7、TLR8、RNA解旋酶和/或PKR结合而发生佐剂效应。以双链形式(dsRNA)递送的RNA能结合TLR3，这个受体也可被在单链RNA复制过程中形成的、或在单链RNA二级结构内形成的dsRNA所触发。

自我复制型RNA可以很方便地通过体外转录(IVT)来制备。IVT可运用(cDNA)模板，它是以细菌内质粒的形式构建和扩增的，或者是用合成方法创建的（如通过基因合成和/或聚合酶链反应(PCR)工程的手段）。例如，DNA-依赖型RNA聚合酶（如噬菌体T7、T3或SP6RNA聚合酶）可以用来从DNA模板转录自我复制型RNA。可以按需采用适当的加帽和加poly-A反应（尽管复制子的poly-A通常在DNA模板内编码）。这些RNA聚合酶对转录的5'端核苷酸有着严格的要求，在一些实施方式中这些要求必须与所编码的复制酶的要求相匹配，以保证IVT转录的RNA可作为其自身编码的复制酶的底物有效发挥作用。

如同参考资料15中所讨论，自我复制型RNA可包括（除5'端帽子结构以外）带有修饰的核酸碱基的一个或多个核苷酸。因而RNA可含有m5C(5-甲基胞苷)、m5U(5-甲基尿苷)、m6A(N6-甲基腺苷)、s2U(2-硫尿核苷)、Um(2'-O-甲基尿苷)、m1A(l-甲基腺苷)、m2A(2-甲基腺苷)；Am(2'-O-甲基腺苷)、ms2m6A(2-甲硫基-N6-甲基腺苷)、i6A(N6-异戊烯基腺苷)、ms2i6A(2-甲硫基-N6-异戊烯基腺苷)、io6A(N6-(顺式-羟基异戊烯基)腺苷)、ms2io6A(2-甲硫基-N6-(顺式-羟基异戊烯基)腺苷)、g6A(N6-苷氨酰氨甲酰腺苷)、t6A(N6-苏氨酰氨甲酰腺苷)、ms2t6A(2-甲硫基-N6-苏氨酰氨甲酰腺苷)、m6t6A(N6-甲基-N6-苏氨酰氨甲酰腺苷)、hn6A(N6-羟基缬氨酰氨甲酰腺苷)、ms2hn6A(2-甲硫基-N6-羟基缬氨酰氨甲酰腺苷)、Ar(p)(2'-O-核糖腺苷(磷酸酯))、I(肌苷)、m11(1-甲基肌苷)、m'Im(1,2'-O-二甲基肌苷)、m3C(3-甲基胞苷)、Cm(2T-O-甲基胞苷)、s2C(2-硫代胞苷)、ac4C(N4-乙酰胞苷)、f5C(5-甲酰基胞苷)、m5Cm(5,2-O-二甲基胞苷)、ac4Cm(N4乙酰2TO甲基胞苷)、k2C(赖西丁)、m1G(1-甲基鸟苷)、m2G(N2-甲基鸟苷)、m7G(7-甲基鸟苷)、Gm(2'-O-甲基鸟苷)、m22G(N2,N2-二甲基鸟苷)、m2Gm(N2,2'-O-二甲基鸟苷)、m22Gm(N2,N2,2'-O-三甲基鸟苷)、Gr(p)(2'-O-核糖鸟苷(磷酸酯))、yW(怀丁苷)、o2yW(过氧怀丁苷)、OHyW(羟基怀丁苷)、OHyW*(未修饰的羟基怀丁苷)、imG(丫苷)、mimG(甲基鸟苷)、Q(q核苷)、oQ(环氧q核苷)、galQ(半乳糖基q核苷)、manQ(甘露糖基q核苷)、preQo(7-氰基-7-去氮鸟苷)、preQi(7-氨基甲基-7-去氮鸟苷)、G(古嘌苷)、D(二氢尿苷)、m5Um(5,2'-O-二甲基尿苷)、s4U(4-硫代尿苷)、m5s2U(5-甲基-2-硫代尿苷)、s2Um(2-硫-2'-O-甲基尿苷)、acp3U(3-(3-氨基-3-羧丙基)尿苷)、ho5U(5-羟基尿苷)、mo5U(5-甲基尿苷)、cmo5U(尿苷5-氧乙酸)、mcmo5U(尿苷5-氧乙酸甲酯)、chm5U(5-(羧羟甲基)尿苷))、mchm5U(5-羧羟甲基)尿苷甲酯)、mcm5U(5-甲氧羰基甲基尿苷)、mcm5Um(S-甲氧羰基甲基-2-O-甲基尿苷)、mcm5s2U(5-甲氧羰基甲基-2-硫代尿苷)、nm5s2U(5-氨基甲基-2-硫代尿苷)、mnm5U(5-甲基氨基甲基尿苷)、mnm5s2U(5-甲基氨基甲基-2-硫代尿苷)、mnm5se2U(5-甲基氨基甲基-2-硒尿苷)、ncm5U(5-氨甲酰甲基尿苷)、ncm5Um(5-氨甲酰甲基-2'-O-甲基尿苷);cmnm5U(5-羧甲基氨基甲基尿苷)、cnmm5Um(5-羧甲基氨基甲基-2-L-O甲基尿苷)、cmnm5s2U(5-羧甲基氨基甲基-2-硫代尿苷)、m62A(N6,N6-二甲基腺苷)、Tm(2'-O-甲基肌苷)、m4C(N4-甲基胞苷)、m4Cm(N4,2-O-二甲基胞苷)、hm5C(5-羟甲基胞苷)、m3U(3-甲基尿苷)、cm5U(5-羧甲基尿苷)、m6Am(N6,T-O-二甲基腺苷)、rn62Am(N6,N6,O-2-三甲基腺苷)、m2'7G(N2,7-二甲基鸟苷)、m2'2'7G(N2,N2,7-三甲基鸟苷)、m3Um(3,2T-O-二甲基尿苷)、m5D(5-甲基二氢尿苷)、f5Cm(5-甲酰-2'-O-甲基胞苷)、m1Gm(1,2'-O-二甲基鸟苷)、m'Am(1,2-O-二甲基腺苷)丙因甲基尿苷（irinomethyluridine）)、tm5s2U(S-氨基乙磺酸甲基（taurinomethyl）-2-硫代尿苷))、imG-14(4-去甲鸟苷)、imG2(异鸟苷)、或ac6A(N6-乙酰腺苷)、次黄嘌呤、肌苷、8-氧-腺嘌呤,其7位取代衍生物、二氢尿嘧啶、假尿嘧啶、2-硫代尿嘧啶、4-硫代尿嘧啶、5-氨基尿嘧啶、5-(C1-C6)-烷基尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、5-(C2-C6)-烯基尿嘧啶、5-(C2-C6)-炔基尿嘧啶、5-(羟甲基)尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羟胞嘧啶、5-(C1-C6)-烷基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-(C2-C6)-烯基胞嘧啶、5-(C2-C6)-炔基胞嘧啶、5-氯胞嘧啶、5-氟胞嘧啶、5-溴胞嘧啶、N2-二甲基鸟嘌呤、7-去氮鸟嘌呤、8-氮鸟嘌呤、7-去氮-7-取代鸟嘌呤、7-去氮-7-(C2-C6)炔基鸟嘌呤、7-去氮-8-取代鸟嘌呤、8-羟基鸟嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、8-氧鸟嘌呤、2-氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、2,4-二氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、8-氮嘌呤、取代的7-去氮嘌呤、7-去氮-7-取代嘌呤、7-去氮-8-取代嘌呤、或者脱碱基核苷酸。例如，自我复制型RNA可包括一个或多个修饰的嘧啶核酸碱基，如假尿嘧啶和/或5-甲基胞嘧啶残基。但在一些实施方式中，RNA包括了未修饰的核酸碱基，以及可能包括未修饰的核苷酸，即，所有RNA中的核苷酸是标准的A、C、G和U核苷酸（除了任何5'端帽子结构中可能含有7'-甲基鸟苷）。另一些实施方式中，RNA可包括由7'-甲基鸟苷组成的5'端帽子，而且第1、第2或第3个5'端核苷酸可能在核糖2'位被甲基化。

本发明所用的理想的RNA在核苷酸直接只含有磷酸二酯键连接，但在一些实施方式中它可包含氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、和/或甲基磷酸酯的连接。

每个颗粒的RNA量是可变的，每个颗粒中单个自我复制型RNA分子的数量可取决于所用颗粒的性质。通常，颗粒可包含1-500个RNA分子。对于脂质体而言，典型的RNA分子数量是每个脂质体<50个，如<20、<10、<5、或1-4个。对于多聚微粒，RNA分子的数量取决于颗粒直径，但一般是<50个（如<20、<10、<5、或1-4个），或者每颗粒50-200个。理想状态是，颗粒包含少于10种不同RNA，如5、4、3、或2种不同RNA；最佳的是颗粒包含单个种类的RNA，即：颗粒中所有RNA分子具有相同序列和相同长度。

免疫原

本发明所采用的自我复制型RNA分子编码多肽免疫原。在颗粒给药后免疫原在受体体内被翻译并诱导免疫应答。免疫原可诱导针对细菌、病毒、真菌或寄生虫（或者在一些实施方式中，针对过敏原，在另一些例子中针对肿瘤抗原）的免疫应答。免疫应答可包含抗体反应（通常包括IgG）和/或细胞介导的免疫应答。多肽免疫原诱导典型的免疫应答，后者识别相应的细菌、病毒、真菌或寄生虫（或过敏原或肿瘤）多肽，但在一些实施方式中多肽可能作为模拟表位诱导免疫应答，其识别的是细菌、病毒、真菌或寄生虫的糖。典型的免疫原是表面多肽，如：粘附素、血凝素、包膜糖蛋白、刺突糖蛋白，等等。

自我复制型RNA分子可编码单个种类的多肽免疫原或多个多肽。多重免疫原可以以单个多肽免疫原（融合多肽）的形式存在，或者是各自独立的多肽。如果免疫原被作为独立的多肽表达，它们当中的一个或多个可以由上游IRES或额外的病毒启动元素来提供。另外，多重免疫原可以来自多聚蛋白的表达，这种多聚蛋白编码与短的自裂解蛋白酶（如口蹄疫病毒2A蛋白）相融合的单个免疫原；或者作为内含肽表达。

与参考资料1和16中不同，RNA编码免疫原。为避免疑惑，本发明不涉及编码萤火虫荧光素酶、或编码大肠杆菌（E.coli）β-半乳糖苷酶融合蛋白、或编码绿色荧光蛋白(GFP)的RNA。RNA也不是指小鼠胸腺总RNA。

在一些实施方式中，免疫原诱导的免疫应答针对下列细菌之一：

脑膜炎奈瑟菌（Neisseria meningitides）：有用的免疫原包括，但不仅限于：膜蛋白如粘附素、自转运蛋白、毒素、获铁蛋白，以及H-因子结合蛋白。参考资料17中披露了三种有用多肽的组合。

肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）：有用的多肽免疫原在参考资料18中有描述。这些包括，但不仅限于：RrgB菌毛亚基、β-N-乙酰-氨基己糖苷酶前体(spr0057)、spr0096、普通胁迫蛋白GSP-781(spr2021、SP2216)、丝氨酸/苏氨酸激酶StkP(SP1732)，以及肺炎球菌表面粘附素PsaA。

化脓链球菌（Streptococcus pyogenes）：有用的免疫原包括，但不仅限于参考资料19和20中所描述的多肽。

卡他莫拉菌（Moraxella catarrhalis）。

百日咳杆菌（Bordetella pertussis）：有用的免疫原包括但不仅限于：百日咳毒素或类毒素(PT)、丝状血凝素(FHA)、百日咳杆菌粘附素、凝集原2和3。

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）：有用的免疫原包括但不仅限于：参考资料21中所披露的多肽，如溶血素、esxA、esxB、铁色素结合蛋白(sta006)，和/或sta011脂蛋白。

破伤风梭菌（Clostridium tetani）：典型的免疫原是破伤风类毒素。

白喉杆菌（Cornynebacterium diphtheriae）：典型的免疫原是白喉类毒素。

流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）：有用的免疫原包括但不仅限于参考资料22和23中所描述的多肽。

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）。

无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）：有用的免疫原包括但不仅限于参考资料19中所描述的多肽。

沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis）：有用的免疫原包括但不仅限于：PepA、LcrE、ArtJ、DnaK、CT398、OmpH样、L7/L12、OmcA、AtoS、CT547、Eno、HtrA和MurG（如参考资料24中描述。LcrE[25]和HtrA[26]是两个较为偏好的免疫原。

肺炎衣原体（Chlamydia pneumoniae）：有用的免疫原包括但不仅限于参考资料27中所描述的多肽。

幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）：有用的免疫原包括但不仅限于：CagA、VacA、NAP、和/或脲酶[28]。

大肠杆菌（Escherichia coli）：有用的免疫原包括但不仅限于：源自大肠杆菌肠毒素(ETEC)、肠凝集性大肠杆菌(EAggEC)、弥散粘附型大肠杆菌(DAEC)、肠致病性大肠杆菌(EPEC)、肠外致病性大肠杆菌(ExPEC)、和/或肠出血性大肠杆菌(EHEC)的免疫原。ExPEC株包括尿路致病性大肠杆菌(UPEC)和脑膜炎/败血症相关大肠杆菌(MNEC)。诱导UPEC多肽免疫原在参考资料29和30中有描述。有用的MNEC免疫原在参考资料31中有描述。有用的针对多种大肠杆菌类型的免疫原是AcfD[32]。

炭疽芽孢杆菌（Bacillus anthracis）

鼠疫杆菌（Yersinia pestis）：有用的免疫原包括但不仅限于参考资料33和34中所描述的多肽。

表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermis）

产气荚膜杆菌或肉毒梭菌（Clostridium perfringens or Clostridiumbotulinums）

嗜肺军团菌（Legionella pneumophila）

贝氏柯克斯体（Coxiella burnetii）

布鲁氏菌属（Brucella），如牛布鲁氏菌（B.abortus）、犬布鲁氏菌（B.canis）、羊布鲁氏菌（B.melitensis）、沙林鼠布鲁氏菌（B.neotomae）、绵羊布鲁氏菌（B.ovis）、猪布鲁氏菌（B.suis）、鳍种布鲁氏菌（B.pinnipediae）。

弗朗西斯菌属（Francisella），如新凶手弗氏菌（F.novicida）、蜃楼弗氏菌（F.philomiragia）、土拉弗氏菌（F.tularensis）。

淋病奈瑟氏菌（Neisseria gonorrhoeae）

梅毒螺旋体（Treponema pallidum）

杜克雷嗜血杆菌（Haemophilus ducreyi）

粪肠球菌（Enterococcus faecalis）或屎肠球菌（Enterococcus faecium）

腐生葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticus）

小肠结肠炎耶尔森菌（Yersinia enterocolitica）

结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）

立克次体（Rickettsia）

单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）

霍乱弧菌（Vibrio cholerae）

伤寒沙门氏菌（Salmonella typhi）

伯氏疏螺旋体（Borrelia burgdorferi）

牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis）

克雷伯菌属（Klebsiella）

一些实施方式中免疫原诱导针对以下这些病毒的免疫应答：

正粘病毒科（Orthomyxovirus）：有用的免疫原可来自A、B、C型流感病毒，如血凝素、神经氨酸苷酶、或M2基质蛋白。当免疫原是A型流感病毒血凝素是，它可以是来自任何亚型的，如H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15或H16。

副黏液病毒科（Paramyxoviridae）：病毒免疫原包括但不仅限于：源自肺病毒（如呼吸道合胞病毒，RSV）、腮腺炎病毒(如腮腺炎病毒)、副黏液病毒（如副流感病毒）、偏肺病毒和麻疹病毒（如麻疹）。

痘病毒科（Poxviridae）：病毒免疫原包括但不仅限于：源自正粘病毒（Orthopoxvirus）如天花病毒（Variola vera），其中包括但不仅限于大天花（Variola major）和小天花（Variola minor）。

细小核糖核酸病毒科（Picornavirus）：免疫原包括但不仅限于源自细小核糖核酸毒科的那些，如肠病毒属、鼻病毒属、肝病毒属、心病毒属和鹅口疮病毒属。在一个实施方式中，肠病毒是脊髓灰质炎病毒，如1型、2型和/或3型脊髓灰质炎病毒。另一实施方式中，肠病毒是EV71肠病毒。另一实施方式中，肠病毒是柯萨奇病毒A或B型。

布尼亚病毒科（Bunyavirus）：病毒免疫原包括但不仅限于：源自正布尼亚病毒属如加利福尼亚脑炎病毒、白蛉热病毒属如裂谷热病毒、或内罗病毒属如克里米亚-刚果出血热病毒。

嗜肝RNA病毒科（Heparnavirus）：病毒免疫原包括但不仅限于：源自嗜肝RNA病毒属如甲型肝炎病毒(HAV)。

丝状病毒科（Filovirus）：病毒免疫原包括但不仅限于：源自丝状病毒属如埃博拉病毒（包括扎伊尔、象牙海岸、雷斯顿埃博拉病毒）或者马尔堡病毒。

披膜病毒科（Togavirus）：病毒免疫原包括但不仅限于：源自披膜病毒如风疹病毒属、α病毒属或动脉炎病毒属。其中包括风疹病毒。

黄病毒（Flavivirus）：病毒免疫原包括但不仅限于：源自黄病毒属如蜱传脑炎(TBE)病毒、登革热（1、2、3、4型）病毒、黄热病病毒、日本脑炎病毒、科萨努尔森林病毒、西尼罗河脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒、俄罗斯春夏脑炎病毒、玻瓦桑脑炎病毒。

瘟病毒（Pestivirus）：病毒免疫原包括但不仅限于：源自瘟病毒如牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、猪瘟(CSFV)或边界病病毒(BDV)。

嗜肝DNA病毒（Hepadnavirus）：病毒免疫原包括但不仅限于：源自嗜肝DNA病毒如乙肝病毒。组合物可以包含乙肝表面抗原(HBsAg)。

其他肝病毒：组合物可包含来自丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒或庚型肝炎病毒的免疫原。

弹状病毒（Rhabdovirus）：病毒免疫原包括但不仅限于：源自弹状病毒如狂犬病毒属（如狂犬病病毒）和水泡病毒属。

杯状病毒科（Caliciviridae）：病毒免疫原包括但不仅限于：源自杯状病毒科如诺瓦克病毒（诺如病毒），以及诺瓦克样病毒如夏威夷病毒和雪山病毒。

冠状病毒（Coronavirus）：病毒免疫原包括但不仅限于：源自SARS冠状病毒、禽类传染性支气管炎(IBV)、小鼠肝炎病毒(MHV)，以及猪传染性肠胃炎病毒(TGEV)。冠状病毒免疫原可以是刺突多肽。

反转录病毒（Retrovirus）：病毒免疫原包括但不仅限于：源自肿瘤病毒、慢病毒（如HIV-1或HIV-2），或者泡沫病毒。

呼肠弧病毒（Reovirus）：病毒免疫原包括但不仅限于：源自正呼肠弧病毒、轮状病毒、环状病毒或Colti病毒。

细小病毒（Parvovirus）：病毒免疫原包括但不仅限于：源自细小病毒B19。

疱疹病毒（Herpesvirus）：病毒免疫原包括但不仅限于：源自人疱疹病毒，如，仅作举例，单纯疱疹病毒(HSV)（如1型和2型）、水痘带状疱疹病毒(VZV)、EB病毒(EBV)、巨细胞病毒(CMV)、人类疱疹病毒6(HHV6)、人类疱疹病毒7(HHV7)和人类疱疹病毒8(HHV8).

乳多泡病毒（Papovaviruses）：病毒免疫原包括但不仅限于：源自乳头瘤病毒和多瘤病毒。（人类）乳头瘤病毒的血清型可以是1、2、4、5、6、8、11、13、16、18、31、33、35、39、41、42、47、51、57、58、63或65型的，如6、11、16和/或18型其中的或多种。

腺病毒（Adenovirus）：病毒免疫原包括但不仅限于源自腺病毒血清型36型(Ad-36)。

在一些实施方式中，免疫原诱导针对感染鱼的病毒的免疫应答，如传染性鲑鱼贫血症病毒(ISAV)、鲑鱼胰腺病病毒(SPDV)、传染性胰脏坏死病病毒(IPNV)、斑点叉尾鮰病毒(CCV)、鱼淋巴囊肿病毒(FLDV)、传染性造血组织坏死病病毒(IHNV)、锦鲤疱疹病毒、鲑鱼小RNA病毒（也被称为大西洋鲑小RNA病毒）、淡水鲑病毒(LSV)、大西洋鲑轮状病毒(ASR)、鳟鱼草莓病病毒(TSD)、银鲑肿瘤病毒(CSTV)，或病毒性出血性败血症病毒(VHSV)。

真菌抗原可衍生自皮肤真菌，包括絮状表皮霉菌(Epidermophytonfloccusum)，奥杜安氏小孢子菌(Microsporum audouini)，犬小孢子菌(Microsporum canis)，扭曲小孢子菌(Microsporum distortum)，马小孢子菌(Microsporum equinum)，石膏样小孢子菌(Microsporum gypsum)，矮小小孢子菌(Microsporum nanum)，同心性毛癣菌(Trichophyton concentricum)，马毛癣菌(Trichophyton equinum)，鸡毛癣菌(Trichophyton gallinae)，石膏样毛癣菌(Trichophyton gypseum)，麦格毛癣菌(Trichophyton megnini)，须癣毛癣菌(Trichophyton mentagrophytes)，小鼠毛癣菌(Trichophyton quinckeanum)，红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)，许兰毛癣菌(Trichophyton schoenleini)，断发毛癣菌(Trichophyton tonsurans)，疣状毛癣菌(Trichophytonverrucosum)，疣状毛癣菌(T.verrucosum)白色（album）变种、盘形（discoides）变种、赭色（ochraceum）变种，紫色毛癣菌(Trichophyton violaceum)和/或蜜块状毛癣菌(Trichophyton faviforme)；衍生自烟曲霉(Aspergillusfumigatus)、黄曲霉(Aspergillus flavus)、黑曲霉(Aspergillus niger)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、土曲霉(Aspergillus terreus)、聚多曲霉(Aspergillussydowi)、黄曲菌(Aspergillus flavatus)、灰绿曲霉(Aspergillus glaucus)、头状芽裂殖菌(Blastoschizomyces capitatus)、白假丝酵母(Candida albicans)、烯醇酶假丝酵母(Candida enolase)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)、光滑假丝酵母(Candida glabrata)、克柔假丝酵母(Candida krusei)、近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)、类星形假丝酵母(Candida stellatoidea)、克鲁斯假丝酵母(Candida kusei)、帕拉克斯假丝酵母(Candida parakwsei)、葡萄牙假丝酵母(Candida lusitaniae)、伪热带假丝酵母(Candidapseudotropicalis)、季也蒙假丝酵母(Candida guilliermondi)、卡氏枝孢霉(Cladosporium carrionii)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatidis)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、棒地霉(Geotrichum clavatum)、荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、微孢子虫(Microsporidia)、脑炎微孢子虫属(Encephalitozoon spp)、表层角结膜炎微孢子虫(Septata intestinalis)和肠微孢子虫(Enterocytozoon bieneusi)；较不常见的短粒虫属(Brachiola spp.)、微胞子虫属(Microsporidium spp.)、微孢子虫属(Nosema spp.)、皮里虫属(Pleistophora spp)、气管普孢虫属(Trachipleistophora spp.)、条孢虫属(Vittaforma spp.)、巴西芽生菌(Paracoccidioides brasiliensis)、卡氏肺孢子虫(Pneumocystis carinii)、苜蓿腐酶(Pythiumn insidiosum)、皮屑芽胞菌(Pityrosporum ovale)、酿酒酵母(Sacharomyces cerevisae)、布拉酵母(Saccharomyces boulardii)、粟酒酵母(Saccharomyces pombe)、尖端赛多孢子菌(Scedosporium apiosperum)、申克孢子丝菌(Sporothrix schenckii)、白吉利丝孢酵母(Trichosporon beigelii)、弓形虫(Toxoplasma gondii)、马尔尼菲青霉菌(Penicillium marneffei)、马拉色菌属(Malassezia spp.)、着色真菌属(Fonsecaea spp.)、王氏霉菌属(Wangiella spp.)、孢子丝菌属(Sporothrixspp.)、蛙粪霉属(Basidiobolus spp.)、耳霉属(Conidiobolus spp.)、根霉属(Rhizopus spp.)、毛霉属(Mucor spp.)、犁头霉属(Absidia spp.)、被孢霉属(Mortierella spp.)、小克银汉霉属(Cunninghamella spp.)、瓶霉属(Saksenaeaspp.)、链格孢菌属(Alternaria spp.)、弯孢菌属(Curvularia spp.)、长蠕孢菌属(Helminthosporium spp.)、镰胞菌属(Fusarium spp.)、曲霉属(Aspergillusspp.)、青霉属(Penicillium spp.)、链核盘菌属(Monolinia spp.)、丝核菌属(Rhizoctonia spp.)、拟青霉属(Paecilomyces spp.)、皮司霉属(Pithomyces spp.)和枝孢霉属(Cladosporium spp.)。

在一些实施方式中，免疫原诱导的免疫应答是针对疟原虫（Plasmodium）属的寄生虫，如恶性疟原虫（P.falciparum）、间日疟原虫（P.vivax）、三日疟原虫（P.malariae）或蛋形疟原虫（P.ovale）。因而本发明可被应用于针对疟疾的免疫。在一些实施方式中，免疫原诱导的免疫应答是针对鱼虱（Caligidae）科的寄生虫，尤其是那些出自疮痂鱼虱属（Lepeophtheirus）和鱼虱属（Caligus）的，比如像鲑疮痂鱼虱（Lepeophtheirus salmonis）或智利鱼虱（Caligus rogercresseyi）鱼虱之类的海虱。

在一些实施方式中，免疫原诱导的免疫应答针对：花粉过敏原（树木、草本、杂草以及花粉过敏原）；昆虫或蜘蛛类过敏原（吸入、唾液和毒液过敏原，如螨虫过敏原、蟑螂和蠓过敏原、膜翅类毒液过敏原）；动物毛发和皮屑过敏原（如狗、猫、马、大鼠、小鼠，等等）；还有食物过敏原（如麦角蛋白）。来自树木、草坪和草本的重要的花粉过敏原是那些源自分类学上的壳斗目、木犀目、松杉目和悬铃木科，包括但不仅限于：桦树（桦木属）、桤木（桤木属）、榛木（榛属）、角树（鹅耳枥属）和橄榄树（木犀榄属），雪松（柳杉属和刺柏属）、法国梧桐树（悬铃木）；禾本目草类包括黑麦草属、梯牧草属、早熟禾属、狗牙根属、鸭茅属、绒毛草属、虉草属、黑麦属和高粱属；菊目和荨麻目草本包括豚草属、蒿属和墙草属。另一些重要的吸入性过敏原是来自尘螨属和嗜霉螨属的屋内尘螨；仓储螨如嗜鳞螨属、甜食螨属和食酪螨属；来自蟑螂、蠓和跳蚤，如小蠊属、大蠊属、摇蚊属和头梳蚤属，以及来自哺乳动物如猫、狗和马；毒液过敏原包括如源于昆虫叮咬的，如来自来分类学上膜翅目的包括蜜蜂（蜜蜂科(Apidae)）、胡蜂（胡蜂科(Vespidea)）和蚂蚁（蚁科(Formicoidae)）。

在一些实施方式中，免疫原是选自以下的肿瘤抗原：(a)肿瘤-睾丸抗原如NY-ESO-1、SSX2、SCP1，还有RAGE、BAGE、GAGE和MAGE家族多肽，例如，GAGE-1、GAGE-2、MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6和MAGE-12（与黑色素瘤、肺癌、头颈部肿瘤、非小细胞癌（NSCLC）、乳腺癌、胃肠道肿瘤和膀胱癌相关）；(b)突变的抗体，如p53（与各种实体瘤相关，如结肠直肠癌、肺癌和头颈部肿瘤）、p21/Ras（与黑色素瘤、胰腺癌和结肠直肠癌相关）、CDK4（与黑色素瘤相关）、MUM1（与黑色素瘤相关）、caspase-8（与头颈部肿瘤相关）、CIA0205（与膀胱癌相关）、HLA-A2-R1701、β-联蛋白(β-catenin)（与黑色素瘤相关）、TCR（与T-细胞非霍奇金淋巴瘤相关）、BCR-abl（与慢性粒细胞白血病相关）、磷酸甘油醛异构酶、KIA0205、CDC-27和LDLR-FUT；(c)过表达抗原，如Galectin4（与结肠直肠癌相关）、Galectin9（与霍奇金病相关）、蛋白酶3（与慢性粒细胞白血病相关）、WT1（与各种白血病相关）、碳酸酐酶（与肾癌相关）、醛缩酶A（与肺癌相关）、PRAME（与黑色素瘤相关）、HER-2/neu（与乳腺癌、结肠癌、肺癌和卵巢癌相关）、乳腺珠蛋白、甲胎蛋白（与肝癌相关）、KSA（与结肠直肠癌相关）、胃泌素（与胰腺癌和胃癌相关）、端粒酶催化蛋白、MUC-1（与乳腺癌和卵巢癌相关）、G-250（与肾细胞癌相关）、p53（与乳腺癌、结肠癌相关），以及癌胚抗原（与乳腺癌、肺癌和消化道癌如结肠直肠癌相关）；(d)共享抗原，例如：黑素瘤-黑素细胞分化抗原，如MART-1/Melan A、gp100、MC1R、促黑激素受体、酪氨酸酶、酪氨酸酶相关蛋白-1/TRP1以及酪氨酸酶相关蛋白-2/TRP2（与黑色素瘤相关）；(e)前列腺相关抗原，如PAP、PSA、PSMA、PSH-P1、PSM-P1、PSM-P2，与前列腺癌相关；(f)免疫球蛋白个体基因型（与黑色素瘤和B细胞淋巴瘤相关）。在某些实施方式中，肿瘤免疫原包括，但不仅限于：p15、Hom/Mel-40、H-Ras、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、EB病毒抗原、EBNA、人乳头瘤病毒(HPV)抗原包括E6和E7、乙型和丙型肝炎病毒抗原、人类嗜T淋巴细胞病毒抗原、TSP-180、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、mn-23H1、TAG-72-4、CA19-9、CA72-4、CAM17.1、NuMa、K-ras、p16、TAGE、PSCA、CT7、43-9F、5T4、791Tgp72、β-HCG、BCA225、BTAA、CA125、CA15-3(CA27.29\BCAA)、CA195、CA242、CA-50、CAM43、CD68\KP1、CO-029、FGF-5、Ga733(EpCAM)、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90(Mac-2结合蛋白/亲环蛋白（cyclophilin）C-相关蛋白)、TAAL6、TAG72、TLP、TPS，等等。

药物组合物

本发明的颗粒是作为药物组合物的组成部分，用来针对各种疾病对个体实施免疫。这些组合物在所指颗粒以外还包括典型的药学可接受的载体。参考资料35中对药学可接受载体作了充分讨论。

本发明药物组合物可包括一种或多种小分子免疫增强剂。例如，组合物可包括TLR2激动剂(如Pam3CSK4)、TLR4激动剂（如像E6020这样的氨基烷基氨基葡糖苷磷酸酯）、TLR7激动剂(如咪喹莫特)、TLR8激动剂(如雷西莫特)和/或TLR9激动剂(如IC31)。任何这类激动剂的理想分子量是<2000Da。当有RNA被包封时，在一些实施方式中这样的激动剂也与RNA同样被包封起来，但在另一些实施方式中它们未被包封起来。当RNA被吸附于颗粒时，在一些实施方式中这样的激动剂也与RNA同样被吸附，但在另一些实施方式中它们没有被吸附。

本发明的药物组合物可将颗粒置于普通水（如注射用水）当中，或者是缓冲液当中，如磷酸缓冲液、Tris缓冲液、硼酸缓冲液、琥珀酸缓冲液、组氨酸缓冲液或柠檬酸缓冲液。缓冲盐的典型浓度在5-20mM。

本发明的药物组合物的pH在5.0到9.5之间，在6.0到8.0之间。

本发明的药物组合物可包含钠盐（如氯化钠）来赋予渗透压。典型的NaCl浓度是10+2mg/ml，如约9mg/ml。

本发明的药物组合物可含有金属离子螯合剂。它可以通过去除可使磷酸二酯键水解的离子，来延长RNA的稳定性。因而组合物可含有以下的或多种：EDTA、EGTA、BAPTA、喷替酸，等等。这样的螯合剂的典型含量是10-500μM，如0.1mM。柠檬酸盐如柠檬酸钠也可以作为螯合剂，它具有同时还可提供缓冲能力的优势。

本发明的药物组合物的渗透压在200mOsm/kg到400mOsm/kg之间，如240-360mOsm/kg，或290-310mOsm/kg。

本发明的药物组合物可含有一种或多种防腐剂，如硫柳汞或2-苯氧乙醇。优选无汞的组合物，可以制备无防腐剂的疫苗。

本发明的药物组合物优选无菌。

本发明的药物组合物优选无热原，如每剂量含<1EU(标准的内毒素单位)，优选<0.1EU。

本发明的药物组合物优选不含谷蛋白。

本发明的药物组合物可制成单位剂量的形式。一些实施方式中，单位剂量的装量在0.1-1.0ml，如约0.5ml。

组合物可制成可注射的溶液或悬液。组合物可制成肺部给药形式的，如利用精细喷雾的吸入器。组合物可制成鼻腔、耳道或眼部给药形式，如喷剂或滴剂。典型的是肌内注射给药。

组合物含有免疫学有效量的颗粒，以及任何其他需要的成分。“免疫学有效量”是指，给予个体的给药量，不管是单次的还是作为系列中的一部分，对于治疗或预防是有效的。这个量的变化取决于治疗对象的健康和身体状况、年龄、被治疗个体的所属物种（如，非人灵长类、灵长类，等等）、个体免疫系统合成抗体的能力、所期望达到的保护程度、疫苗的配方、医师对医疗状况的评估，以及其他相关因素。希望这个量可以落在较宽的范围内，这个范围可以通过常规试验来确定。本发明组合物的颗粒和RNA含量笼统以每个剂量所含的RNA来表示。较佳剂量是<100μg RNA（如10-100μg，比方10μg、25μg、50μg、75μg或100μg），但所见标示值要低得多，如<1μg/剂、<100ng/剂、<10ng/剂、<1ng/剂，等等。

本发明还提供了装有本发明药物组合物的递送装置（如注射器、雾化器、喷雾器、吸入器、皮贴等）。这种装置可用来对脊椎动物个体进行组合物给药。

本发明的颗粒不包括核糖体。

治疗方法和医疗用途

相对于参考资料16中披露的颗粒，本发明的颗粒和药物组合物是用于在体内针对感兴趣的免疫原诱导免疫应答。

本发明提供在脊椎动物体内提升免疫应答的方法，包含用有效量的本发明颗粒或药物组合物进行给药的步骤。免疫应答优选保护性的，优选涉及抗体和/或细胞介导的免疫。该方法可促进加强应答。

本发明还提供了颗粒或药物组合物应用于引起脊椎动物免疫应答的方法。

本发明还提供本发明的颗粒在制造引起脊椎动物免疫应答的药物方面的应用。

通过这些应用和方法引起脊椎动物免疫应答，脊椎动物可以获得针对各种疾病和/或感染的保护，如像以上所讨论的针对细菌性和/或病毒性的疾病。颗粒和组合物是免疫原型的，更优选疫苗组合物。根据本发明，疫苗可以是预防性的（即预防感染）或者是治疗性的（即治疗感染），但主要是预防性的。

脊椎动物以哺乳动物为好，如人类或大型哺乳类脊椎动物（如马、牛、鹿、山羊、猪）。当疫苗用于预防目的时，人类主要指儿童（如，幼儿或婴儿）或青少年；当疫苗用于治疗目的时，人类主要是指青少年或成年人。供儿童使用的疫苗也可用于对成年人给药，如用来评价安全性、剂量、免疫原性等。

根据本发明制备的疫苗可同时用来治疗儿童和成年人。病人年龄可以是小于1岁，小于5岁，1-5岁，5-15岁，15-55岁，或55岁以上。接受疫苗病人的较适年龄段是年长者（如>50岁，>60岁，更好为>65岁）、年幼者（如<5岁）、住院病人、医护工作者、武装服务和军队人员、孕妇、慢性病患者，或免疫缺陷病人。但该疫苗并非只适用于这些群体，它可在更广泛的人群中应用。

本发明的组合物通常可直接对病人给药。直接给药可通过肠外注射（如皮下、腹腔、静脉肌肉、皮内，或是组织间隙；不同于参考资料1，本发明不采用舌内注射的方式）。其他可选的给药途径包括直肠给药、口服（如片剂、喷雾）给药、口腔黏膜给药、舌下给药、阴道给药、局部给药、经皮给药、鼻腔给药、眼部给药、耳道给药、肺部给药，或其他黏膜给药。皮内或肌肉给药是两个较好的途径。注射可通过针头（如皮下注射针头），但也可选择无针头注射方式。典型的肌肉注射量是0.5ml。

本发明可用于诱导系统免疫和/或黏膜免疫，优选用于诱导增强的系统免疫和/或黏膜免疫。

用药剂量可以是一次性给药方案或多次给药方案。多次给药可用于初级免疫方案和/或加强免疫方案。在多次给药方案中可用相同或不同给药途径进行各次给药，如初级接种用肠外给药、加强接种用黏膜给药，初级接种用黏膜给药、加强接种用肠外给药，等等。多次给药方案中各次给药一般隔开至少1周（如约2周，约3周，约4周，约6周，约8周，约10周，约12周，约16周，等等）。在一个实施方式中多次给药可在出生后大约6周、10周和14周进行，即在6周龄、10周龄和14周龄的时候，如世界卫生组织发布的“扩大免疫规划”（EPI）中所采用。在另一实施方式中，两个初级给药之间相隔大约2个月，如间隔7、8或9个星期，然后是在第二次初级给药后的6个月到1年之间进行一次或多次的加强接种，如在第二次初级给药后的6、8、10或12个月。在另一实施方式中，3次初级给药之间相隔大约2个月，如间隔7、8或9个星期，然后是在第三次初级给药后的6个月到1年之间进行一次或多次的加强接种，如在第三次初级给药后的6、8、10或12个月。

实施方式总则

本发明的一些实施方式中，RNA包括未修饰的核苷酸（见前面）。另一些实施方式中，如果还需要一种或多种以下特征（前面已描述），则RNA可任选包含至少一种修饰的核苷酸：

A.RNA通过脂质体递送，该脂质体含有DSDMA、DODMA、DLinDMA和/或DLenDMA。

B.RNA包封在脂质体中，脂质体疏水部分的脂经PEG化。

C.RNA包封在脂质体中，至少80%数量的脂质体直径在20-220nm范围。

D.RNA通过微粒递送，微粒是无毒且可生物降解的多聚微粒。

E.RNA通过微粒递送，微粒的直径在0.02μm-8μm范围。

F.RNA通过微粒递送，至少80%数量的微粒直径在0.03-7μm范围。

G.RNA通过微粒递送，组合物是冻干的。

H.RNA的3'端具有poly-A尾，免疫原可在体内诱导针对细菌、病毒、真菌或寄生虫的免疫应答。

I.RNA与金属离子螯合剂结合递送，使用选自以下的递送系统：(i)脂质体；(ii)无毒的可生物降解的多聚物颗粒。

通用

除非另有注明，本发明的颗粒采用采用的是本领域传统的化学、生物化学、分子生物学、免疫学和药理学技术。这些技术在文献中有全面解释，参见参考资料36-42等。

术语“含有”代表“包括”和“由…组成”，如“含有”X的组合物可只有X，或者可另有其他，如X+Y。

术语“大约”与数值x相关时，例如可表示x±10%。

术语“基本上”不排除“完全地”，如组合物“基本上不含”Y可以是完全不含Y的。必要时“基本上”这个词在本发明中可省略。

电荷、阳离子、阴离子、两性离子等对应于pH7的条件。

TLR3是指Toll样受体3。它是独立的跨膜受体，对天然免疫系统起着关键作用。已知的TLR3激动剂包括poly(I:C)。“TLR3”是编码这个受体的基因获批准的HGNC名称，其独有的HGNC代码是HGNC:11849。人类TLR3基因的RefSeq序列是GI:2459625。

TLR7是指Toll样受体7。它是独立的跨膜受体，对天然免疫系统起着关键作用。已知的TLR3激动剂包括咪喹莫特。“TLR7”是编码这个受体的基因获批准的HGNC名称，其独有的HGNC代码是HGNC:15631。人类TLR7基因的RefSeq序列是GI:67944638。

TLR8是指Toll样受体8。它是独立的跨膜受体，对天然免疫系统起着关键作用。已知的TLR8激动剂包括雷西莫特。“TLR8”是编码这个受体的基因获批准的HGNC名称，其独有的HGNC代码是HGNC:15632。人类TLR7基因的RefSeq序列是GI:20302165。

RIG-I-样受体（“RLR”）家族包括在天然免疫系统中有着关键作用的各种RNA解旋酶[43]。RLR-1（也被称作RIG-I或维甲酸诱导基因I）在其N末端附近有两个胱冬酶募集结构域。批准的编码RLR-1解旋酶基因的HGNC名称是“DDX58”（DEAD(Asp-Glu-Ala-Asp)盒多肽58），其独有的HGNC代码是HGNC:19102。人类RLR-1基因的RefSeq序列是GI:77732514。RLR-2（也被称作MDA5或黑素瘤分化相关基因5）在其N末端附近也有两个胱冬酶募集结构域。批准的编码RLR-2解旋酶基因的HGNC名称是“IFIH1”（解旋酶C结构域1诱导干扰素），其独有的HGNC代码是HGNC:18873。人类RLR-2基因的RefSeq序列是GI:27886567。RLR-3（也被称作LGP2或遗传学和生理学的实验室）没有胱冬酶募集结构域。批准的编码RLR-3解旋酶基因的HGNC名称是“DHX58”（意为DEXH(Asp-Glu-X-His)盒多肽58），其独有的HGNC代码是HGNC:29517。人类RLR-3基因的RefSeq序列是GI:149408121。

PKR是依赖于双链RNA的蛋白激酶。它在天然免疫系统中起关键作用。“EIF2AK2”（真核翻译起始因子2-α激酶2）是编码该蛋白基因的获批准的HGNC名称，其独有的HGNC代码是HGNC:9437。人类PKR基因的RefSeq序列是GI:208431825。

附图的说明

图1显示带有显色RNA的凝胶。泳道说明：(1)分子量标记(2)裸复制子(3)RNA酶处理后的复制子(4)包封在脂质体内的复制子(5)RNA酶处理后的脂质体(6)用RNA酶处理然后经过苯酚/氯仿提取的脂质体

图2是脂质体的电镜显微照片。

图3显示在RNA分别以病毒样包装复制子（正方形）、裸RNA（三角形）或微粒（圆圈）的形式递送后，于第1天、第3天、第6天时的蛋白表达（以相对光单位表示，RLU）。

图4显示带有显色RNA的凝胶。泳道说明：(1)分子量标记(2)裸复制子(3)包封在脂质体内的复制子(4)经RNA酶处理后再用酚/氯仿提取的脂质体。

图5显示RNA分别以病毒样包装复制子（方块）、裸RNA（钻石形）或脂质体(+=0.1μg,x=1μg)的形式递送后，于第1天、第3天、第6天时的蛋白表达。

图6显示用四种不同剂量的脂质体包封RNA递送后，于第1天、第3天、第6天时的蛋白表达。

图7显示动物在接受病毒样包装复制子(VRP或VSRP)、1μg裸RNA以及1μg脂质体包封RNA给药后，其体内抗-F IgG效价。

图8显示动物在接受VRP、1μg裸RNA以及0.1g或1μg脂质体包封RNA给药后，其体内抗-F IgG效价。

图9显示动物在接受VRP、或0.1g或1μg脂质体包封RNA给药后，其体内中和抗体效价。

图10显示复制子分别以裸RNA（圆圈）、脂质体包封RNA（三角形和正方形）或脂质复合体（倒三角形）形式给药后的表达水平。

图11显示复制子分别以裸RNA(0.01-1μg)、脂质体包封RNA(0.01-10μg)或病毒样包装(VRP,10⁶感染单位，IU)的形式给药后，其F-特异性IgG的效价（第二次给药2星期后）。

图12显示复制子分别以裸RNA(1μg)、脂质体包封RNA(0.1或1μg)或病毒样包装(VRP,10⁶IU)的形式给药后，其F-特异性IgG的效价（圆圈）和PRNT效价（正方形）。同时显示了未经免疫处理小鼠体内的效价。实线表示几何平均数。

图13显示在第2次给药4周后，用代表F蛋白主要表位的合成肽进行再刺激后细胞内细胞因子的产生。Y轴表示CD8+CD4-占细胞因子＋的百分数。

图14显示小牛在免疫接种后63天（图14A）、210天（图14B）的F-特异性IgG效价（log₁₀效价的平均值+标准差）。在63天时三条线很容易区分，从下至上：PBS阴性对照；脂质体递送RNA；“Triangle4”产物。

图15显示作为对裸RNA(“RNA”)或脂质体包封RNA(“LNP”)，或者通过电穿透肌肉递送DNA的应答的抗-HIV血清IgG效价。

图16显示13组小鼠中IgG效价。每个圆圈代表一只小鼠，实线表示几何平均数。水平的虚线是分析的检测限。13组中从左到右是A到M，如下面所述。

图17显示pDC释放的(A)IL-6(B)IFNα(pg/ml)。有4对柱状线，从左到右：对照、经RNA+DOTAP免疫、经RNA+脂质转染胺试剂（lipofectamine）免疫、经脂质体包封RNA免疫。每对柱状线中黑色是野生型小鼠，灰色是rsq1突变体。

具体实施方式

RNA复制子

以下采用多种复制子。总体上它们是基于α病毒属基因组与委内瑞拉马脑炎病毒（VEEV）非结构蛋白、与辛德毕斯病毒的包装信号、与辛德毕斯病毒或VEEV突变株的3'UTR之间的杂合体。复制子长度约10kb，有poly-A尾部。

编码α病毒属复制子的质粒DNA（称为pT7-mVEEV-FL.RSVF或A317；pT7-mVEEV-SEAP或A306；pSP6-VCR-GFP或A50）被用作体外复制RNA的模板。复制子含有RNA复制所要求的α病毒属的遗传元素，但没有那些负责编码颗粒组装产物的基因；结构蛋白被感兴趣的蛋白所取代（例如：报告基因产物，如SEAP或GFP，或者是免疫原，如全长度的RSV F蛋白），于是复制子就不能诱导产生感染性颗粒。α病毒属cDNA上游的噬菌体(T7或SP6)启动子促进了复制子RNA在体外的合成，紧靠着poly(A)尾部的下游位置丁型肝炎病毒(HDV)核酶通过自身裂解行为生成正确的3'末端。

在HDV核酶通过适当的限制性内切酶作用使下游位置质粒DNA线性化以后，用源自T7或SP6噬菌体的DNA依赖性RNA聚合酶进行体外合成失控转录子。转录反应每种核苷三磷酸酯(ATP、CTP、GTP和UTP)用量为7.5mM(T7RNA聚合酶)或5mM(SP6RNA聚合酶)，在37°C反应2小时，具体参照生产商(安碧公司(Ambion))的提供的说明。转录后模板DNA用TURBO DNA酶(安碧公司)消化。用LiCl沉淀复制子RNA并在无核酸酶水中重溶。无帽RNA在转录后以牛痘病毒加帽酶(VCE)采用ScriptCap m7G加帽系统(Epicentre Biotechnologies)进行加帽，按照使用手册进行操作；以这种方式加帽的复制子名称前加上前缀“v”，如vA317是指通过VCE加帽的A317复制子。后转录加帽的RNA用LiCl沉淀并在无核酸酶水中重溶。通过测定OD_260nm确定RNA样品的浓度。用变性琼脂糖凝胶电泳确认体外转录子的完整性。

PLG吸附

微粒用500mg PLG RG503(乳酸/羟基乙酸摩尔比50:50，MW约30kDa)和20mg DOTAP，通过Omni Macro均质仪来制作。颗粒悬液在150rpm转速振荡过夜，然后过40μm的无菌滤器，2-8°C保存。将自我复制型RNA吸附到颗粒上。制备1mL的PLG/RNA悬液，将所需体积的PLG颗粒悬液加到小瓶内，加入无核酸酶的水至总体积900μL。向PLG悬液中逐滴加入100μL RNA(10μg/mL)，同时不断振荡。PLG/RNA室温孵育30分钟。重配好的l mL悬液中，加入45mg甘露醇、15mg蔗糖和250-500μgPVA。瓶子在-80°C冷冻并进行冷冻干燥。

为评价RNA吸附情况，将100μL颗粒悬液在10,000rpm离心5分钟，收集上清液。用1mL无核酸酶的水重溶PLG/RNA。100μL颗粒悬液中(1μg RNA)加入1mg硫酸肝素。混合物旋涡振荡后在室温放置30分钟进行RNA解吸。离心颗粒悬液并收集上清液。

为确定RNA酶稳定性，将100μL颗粒悬液与6.4mAU的RNA酶A一同在室温下孵育30分钟。用0.126mAU的蛋白酶K，55°C处理10分钟以灭活RNA酶。加入1mg硫酸肝素解吸RNA，然后离心。含RNA的上清液样品与甲醛加样染料混合，65°C加热10分钟，用1%变性凝胶分析（每道加样460ngRNA）。

为评价表达，在0天时，用1μg RNA、总注射体积100μL(每条腿50μL)对Balb/c小鼠作肌肉注射免疫。分别于第1、3、6天取血清。用化学发光分析法确定蛋白的表达。如图3所示，与没有任何递送颗粒时（圆圈）相比，当RNA用PLG给药时（三角形）表达水平较高。

脂质体包封

用按照参考资料7和44的方法制备的脂质体进行RNA包封。脂质体由10%DSPC（两性离子型）、40%DlinDMA（阳离子型）、48%胆固醇以及2%PEG结合的DMG(2kDa PEG)制成。这些比例是指所占总脂质体的摩尔百分比。

DlinDMA（1,2-二亚油酰氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷）采用参考资料2的流程合成。DSPC（二硬脂酰基卵磷脂）购自基酶公司（Genzyme）。胆固醇购自西格玛-艾尔德里奇公司（Sigma-Aldrich）。PEG结合的DMG（1,2-十四酰基磷脂酰乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)]，铵盐）、DOTAP（二油酰氧基三甲胺丙烷，盐酸盐）以及DC-chol（3β-[N-(N',N'-二甲基氨基乙烷)-氨甲酰]胆固醇盐酸盐）来自阿凡提极性脂质公司（Avanti Polar Lipids）。

简言之，将脂质溶于乙醇(2ml)，RNA复制子溶于缓冲液(2ml，100mM柠檬酸钠，pH6)，将以上与2ml缓冲液混合，平衡1小时。用6ml缓冲液稀释混合物并过滤。所得的产物含有脂质体，包封率在～95%。

例如，在一个特定方法中，在乙醇中制备新鲜的脂质储液。称量37mg的DlinDMA、11.8mg的DSPC、27.8mg的胆固醇和8.07mg的PEG-DMG，溶于7.55mL乙醇。新制备的脂质储液在37°C轻摇15分钟，形成均匀的混合物。然后755μL的储液加到1.245mL乙醇中制成2mL的脂质工作储液。这个量的脂质用来与250μg RNA形成脂质体。同样从含约1μg/μLRNA的100mM柠檬酸缓冲液(pH6)储液，制备2mL的RNA工作溶液。取三只20mL的玻璃小瓶（带有搅拌子），为了在使用前去除瓶子的RNA酶污染，用RNase Away溶液(分子生物制品公司（Molecular BioProducts）)淋洗，再用足量的MilliQ水充分清洗。其中一只小瓶用于RNA工作溶液，其他用于收集脂质和RNA的混合物（如后面所描述）。脂质和RNA工作溶液在装入3cc的luer-lok注射器之前，于37°C加热10分钟。将2mL柠檬酸缓冲液(pH6)装入另一个3cc的鲁尔接口（luer-lok）注射器。装有RNA和脂质的注射器用FEP（氟化乙烯丙烯，所有使用的FEP管内外径分别是2mm和3mm，获自艺达思健康科学公司（IdexHealth Science））管子连接到一台T混合器上(PEEK^TM500μm ID结合（junction），艺达思健康科学公司)。T混合器的出料口也是FEP管。第三个含有柠檬酸缓冲液的注射器单接一根管子。用注射泵以7mL/min的流速推动所有注射器。定位出料口管子将混合物收集在20mL玻璃瓶里（同时搅拌）。取出搅拌子，让乙醇/水溶液在室温下平衡1小时。将4ml混合物装入连接着FEP管子的5cc注射器，在另一个连有同样长度FEP管的5cc的注射器中加入等量的100mM柠檬酸缓冲液(pH6)。用注射泵以7mL/min的流速推动两个注射器，将最终的混合物收集在20mL玻璃瓶里（同时搅拌）。接下来，从第二次混合收集来的混合物（脂质体）通过Mustang Q膜（阴离子交换载体，可结合并除去带阴离子的分子，来自波乐公司（Pall Corporation）)。在这个膜用于处理脂质体之前，依次用4mL的1M NaOH、4mL的1M NaCl和10mL的100mM柠檬酸缓冲液(pH6)通过膜。脂质体在通过膜之前先在37°C温热10分钟。然后，将脂质体浓缩至2mL，在10-15倍体积的1xPBS里以切向流过滤（TFF）透析，收集最终产物。TFF系统和中空纤维滤膜购自斯派实验室(Spectrum Labs)(多明格斯牧场（Rancho Dominguez）)，并按照制造商的指南使用。使用的聚砜中空纤维滤膜是100kD截留孔径和8cm²表面积。为进行体外体内试验，将RNA用1xPBS稀释至所需浓度。另外的脂质体制备方法将在下面描述。

图2显示了用这些方法制备的脂质体的电镜显微照片实例。这些脂质体内包裹着编码全长度的RSV F抗原。一批的动态光散射测试显示其平均直径为141nm（按强度计）或78nm（按数量计）。

被包封的RNA百分比及RNA浓度用Quant-iT RiboGreen RNA试剂盒(Invitrogen)来确定，按生产商的说明进行操作。用试剂盒中提供的核糖体RNA标准品制作标准曲线。脂质体在加入染料前先用1X TE缓冲液（试剂盒中提供）稀释10倍或100倍。加入染料前，另行将脂质体用含有0.5%Triton X的1X TE缓冲液稀释10倍或100倍（以破碎脂质体，分析总RNA量）。此后每份溶液中加入等量的染料，加好染料的溶液每份取约180μL上到一块96孔组织培养板中，每个样做两个平行孔。在微孔读板器上读取荧光(Ex485nm,Em528nm)。所有脂质体配方根据RNA的包封量进行体内给药。

脂质体包封显示能保护RNA免受RNA酶降解。实验采用每微克RNA对应3.8mAU的RNA酶，室温孵育30分钟。RNA酶用蛋白酶K55oC处理10分钟来灭活。将样品以1:1v/v的比例与25:24:1v/v/v的苯酚:氯仿:异戊醇相混合，以将RNA从脂质体中抽提到水相里。样品漩涡混合数秒后在12k RPM转速离心15分钟。取出水相（含有RNA）分析RNA。在加样之前(400ng RNA/孔)所有样品与甲醛上样染料一同孵育，65oC变性10分钟，冷却到室温。用安碧Millennium标记物来大致估算RNA分子量。凝胶电泳在90V进行。按照生产商提供的说明，凝胶用0.1%SYBR Gold水溶液染色，室温振荡1小时。图1显示在未被包封的情况下RNA被RNA酶完全降解（泳道3）。RNA被包封后检测不到（泳道4），如用RNA酶处理这些脂质体则看不出变化（泳道4）。RNA酶处理过的脂质体在用苯酚提取后，可看到未降解的RNA（泳道6）。即使在4°C放置1周后，仍能看到RNA未出现任何降解片段（图4，箭头）。4°C放置6周且经过一轮冻融后，体内蛋白表达未发生变化。因此脂质体包封的RNA是稳定的。

为评价RNA在体内的表达，在转录子内编码报告酶（SEAP；分泌性碱性磷酸酶），而不是编码免疫原。在用1X Phospha-Light稀释缓冲液稀释4倍的血清里用化学发光的碱性磷酸酶底物测定表达水平。8-10周龄的BALB/c小鼠（每组5只）在0天时肌肉注射0.1μg或1μg的RNA剂量，每条腿50μl。同样的受体还用没有脂质体的1μg RNA（溶在不含RNA酶的1X PBS里）给药。还测试了病毒样包装的复制子。此处所用的病毒样包装复制子（用“VRPs”表示）按参考资料45的方法获得，其中的α病毒属复制子源自VEEV突变株，或来自VEEV基因组的嵌合体，后者是经基因操作使其包含辛德毕斯病毒的3'UTR以及辛德毕斯病毒包装信号（PS），用共电转将它们与编码辛德毕斯病毒衣壳和糖蛋白基因的缺陷辅助RNA包装入BHK细胞里。

如图5所示，在1μg剂量下，包封将SEAP水平提高了1/2log值，在0.1μg包封剂量下6天的表达量与1μg的未包封剂量下的相当。到第3天表达量超过了VRPs（正方形）所达到的水平。因此，相比裸RNA对照，当RNA制成脂质体时其表达增加，即使其剂量小了10倍。表达也强于VRP对照，但表达的动力学过程很不一样（见图5）。相对于裸RNA对照，用电穿透方法递送RNA使表达增加，但其水平低于脂质体。

进一步的SEAP实验显示了体内明确的量效关系，给药少至1ng RNA的量也可见到表达（图6）。比较包封复制子和裸露复制子的进一步实验表明，0.01μg的包封RNA相当于1μg的裸RNA。在0.5μg的RNA剂量下，经包封的材料在第6天给出12倍的高表达；在0.1μg的剂量下，第6天达到24倍。

除了关注组内的平均水平，对动物个体也进行了研究。在好几只动物对裸复制子无应答的同时，包封组没有发生无应答的情况。

进一步的实验用DOTAP替代了DlinDMA。与裸复制子相比尽管DOTAP脂质体获得了较好的表达，它们要次于DlinDMA脂质体（第1天有2-3倍的差异）。

为评价体内免疫原性，构建了复制子来表达来自呼吸道合胞病毒(RSV)的全长度F蛋白。在0天和21天时，将其以裸露(1μg)、脂质体包封(0.1或1μg)、或病毒样包装(10⁶IU;“VRP”)的形式递送。图7显示了第二次给药后2周时的抗-F IgG效价，脂质体显著增强了免疫原性。图8显示两周后的效价，在此时间点上0.1μg剂量的包封RNA与1μg剂量的包封RNA或VRP组之间无显著差别。第二次给药2周后三组的中和效价（测定60%空斑减少，“PRNT60”）无显著差异（图9）。图12显示第二次给药4周后IgG和PRNT两者的效价。

图13确认了RNA诱导了强烈的CD8T细胞应答。

进一步的实验比较了小鼠接受VRP、0.1μg脂质体包封RNA或1μg脂质体包封RNA后的F-特异性IgG效价。第二次给药后不同时间点的效价之比（VRP:脂质体）如下：

	2周	4周	8周
				0.1μg	2.9	1.0	1.1
1μg	2.3	0.9	0.9

因此脂质体包封RNA基本上诱导了与病毒样递送系统相同水平的免疫应答。

进一步实验显示10μg剂量下F-特异性IgG的高度应答，1μg与0.1μg剂量的应答强度相当，以及0.01μg下的较低程度应答。图11显示小鼠接受三个不同剂量裸复制子、4个不同剂量脂质体包封物或者VRP(10⁶IU)时的IgG效价。与VRP组相比1μg脂质体包封RNA组的应答无统计学意义(ANOVA)，但与这两组相比10μg脂质体包封RNA组中所见的较强应答有统计学意义(p<0.05)。

进一步研究确认，0.1μg的脂质体包封RNA比0.1μgDNA给药给出的抗-FIgG应答强得多（第二次给药15天后），甚至比采用电穿透(Elgen^TMDNA递送系统，因诺公司(Inovio))给药的20μg编码F抗原的质粒DNA免疫原性更强。

小鼠接受脂质体包封RNA复制子后几乎未见衰退迹象（体重降低等），尽管在第二次10μg RNA给药后观察到暂时性的3-4%体重减轻。与之相对应，10μg的脂质体包封DNA导致8-10%的体重损失。

作用机制

骨髓源树突状细胞(pDC)来自野生型小鼠或“Resq”(rsq1)突变体。突变体在其TLR7受体的氨基末端带有点突变，它去除了TLR7信号功能，但同时不影响配体结合[46]。复制子RNA与DOTAP和脂质转染胺试剂2000制成配方或包封在脂质体内，用来刺激细胞。如图17所示，IL-6和INFα在WT细胞内被诱导，但该应答在突变小鼠中几乎完全丧失。这些结果显示TLR7对于免疫细胞内的RNA识别是必需的，脂质体包封复制子可引起免疫细胞分泌高水平的干扰素和促炎细胞因子。

总体上脂质体递送的RNA转录子显示在肌肉注射24小时内诱导多种血清细胞因子（IFN-α、IP-10(CXCL-10)、IL-6、KC、IL-5、IL-13、MCP-1和MIP-a），而裸RNA只诱导MIP-1，单独的脂质体仅诱导IL-6。

IFN-α显示其有利于对脂质体包封RSV-F-编码复制子的免疫应答，因为在两次疫苗接种后抗-IFNα受体(IFNAR1)抗体使F-特异性血清IgG降低10倍。

通常可见脂质体递送RNA复制子在小鼠体内诱导平衡的IgG1:IgG2a亚型比例，与电穿透DNA或蛋白/MF59免疫（即Th1-型免疫应答）相比，有时呈现较高的IgG2a/IgG1比例。

脂质体制备方法

根据本发明通常采用8种方法来制备脂质体。这些在文本中注明为方法(A)到(H)，它们之间主要区别在过滤和TFF步骤。详述如下：

(A)在乙醇中制备新鲜的脂质储液。称量37mg的DlinDMA、11.8mg的DSPC、27.8mg的胆固醇和8.07mg的PEG DMG2000，溶于7.55mL乙醇。新制备的脂质储液在37°C轻摇15分钟，形成均匀的混合物。然后755μL的储液加到1.245mL乙醇中制成2mL的脂质工作储液。这个量的脂质用来与250μg RNA形成脂质体。同样从含约1μg/μLRNA的100mM柠檬酸缓冲液(pH6)储液，制备2mL的RNA工作溶液。取三只20mL的玻璃小瓶（带有搅拌子），用RNase Away溶液(Molecular BioProducts,San Diego,CA)淋洗，再用足量的MilliQ水充分清洗，以去除瓶子的RNA酶污染。其中一只小瓶用于RNA工作溶液，其他用于收集脂质和RNA的混合物（如后面所描述）。脂质和RNA工作溶液在装入3cc的鲁尔接口注射器之前，于37°C加热10分钟。将2mL柠檬酸缓冲液(pH6)装入另一个3cc的luer-lok注射器。装有RNA和脂质的注射器用FEP（氟化乙烯丙烯，所有使用的FEP管内外径分别是2mm和3mm，艺达思健康科学公司公司提供）管子连接到一台T混合器上(PEEK^TM500μm ID结合（junction），艺达思健康科学公司，华盛顿州奥克港)。T混合器的出料口也是FEP管。第三个含有柠檬酸缓冲液的注射器单接一根管子。用注射泵以7mL/min的流速推动所有注射器。定位出料口管子将混合物收集在20mL玻璃瓶里（同时搅拌）。取出搅拌子，让乙醇/水溶液在室温下平衡1小时。将4ml混合物装入连接着FEP管子的5cc注射器，在另一个连有同样长度FEP管的5cc的注射器中加入等量的100mM柠檬酸缓冲液(pH6)。用注射泵以7mL/min的流速推动两个注射器，将最终的混合物收集在20mL玻璃瓶里（同时搅拌）。接下来，从第二次混合收集来的混合物（脂质体）通过Mustang Q膜（阴离子交换载体，可结合并除去带阴离子的分子，美国密歇根州安娜堡的波乐公司)。在这个膜用于处理脂质体之前，依次用4mL的1M NaOH、4mL的1M NaCl和10mL的100mM柠檬酸缓冲液(pH6)通过Mustang膜。脂质体在通过膜之前先在37°C温热10分钟。然后，将脂质体浓缩至2mL，在10-15倍体积的1xPBS里以切向流过滤（TFF）透析，收集最终产物。TFF系统和中空纤维滤膜购自斯派实验室（Spectrum Labs），并按照制造商的指南使用。使用的聚砜中空纤维滤膜(产品代码：X1AB-100-20P)是100kD截留孔径和8cm²表面积。为进行体外体内试验，将RNA用1xPBS稀释至所需浓度。

(B)同方法(A)，差别在于：震摇后将226.7μL储液加到1.773mL乙醇中，成为2mL脂质工作储液，以此调节脂质与RNA的比例。

(C)同方法(B)，差别在于：省略Mustang过滤，故脂质体直接从20mL玻璃瓶进入TFF透析步骤。

(D)同方法(C)，差别在于：TFF采用的是聚醚砜(PES)中空纤维膜(产品代码：P-C1-100E-100-01N)，截留孔径100kD、表面积20cm²。

(E)同方法(D)，差别在于：采用方法(A)中的Mustang膜。

(F)同方法(A)，差别在于：省略Mustang过滤，故脂质体直接从20mL玻璃瓶进入TFF透析步骤。

(G)同方法(D)，差别在于：4mL的RNA工作溶液是从含约1μg/μLRNA的100mM柠檬酸缓冲液(pH6)储液所制备。然后取四只20mL玻璃小瓶作相同处理。其中两只小瓶用于RNA工作溶液（每瓶装2mL），其他用于收集脂质和RNA的混合物，同方法(C)。含RNA和脂质的注射器不是接到T混合器上，而是用PTFE（内径0.03英寸，外径1/16英寸）通过四通道接口(Syrris公司产品)连到Mitos液滴结合片上（Mitos Droplet junction Chip）（来自Syrris公司的微流体玻璃装置，产品代码：3000158）。用注射泵驱动两条RNA通道和一条脂质通道，乙醇与水相的混合在装置的X界面(100μm x105μm)进行。三条通路的流速控制在1.5mL/min，总体上水相与乙醇的流速比是2:1。定位出料口管子将混合物收集在20mL玻璃瓶里（同时搅拌）。取出搅拌子，让乙醇/水溶液在室温下平衡1小时。将混合物装入连接着另PTFE管子的5cc注射器，在另一个连有同样长度PTFE管的5cc的注射器中加入等量的100mM柠檬酸缓冲液(pH6)。用注射泵以3mL/min的流速推动两个注射器，将最终的混合物收集在20mL玻璃瓶里（同时搅拌）。然后，将脂质体浓缩至2mL，在10-15倍体积的1xPBS里进行TFF透析，同方法(D)。

(H)同方法(A)，差别在于：2mL脂质工作储液通过将120.9μL脂质储液与1.879mL乙醇混合制成。在用T混合器混合后将20mL小瓶中的脂质体装到Pierce Slide-A-Lyzer透析组件(赛默飞世尔公司（Thermo Scientific），超强型，容量0.5–3mL)中，在一灭菌的塑料容器内用400-500mL体积的1X PBS4°C透析过夜，然后收集最终产物。

BHK表达

不同脂质制备的脂质体与BHK细胞一同孵育过夜，对蛋白表达强度作出评价。以RV05脂质作为基线，在脂质体中加入10%的二植烷酰基磷脂酰乙醇胺(DPyPE)可使表达增加18倍，加入10%18:2（顺式）磷脂酰胆碱可增加10倍，代之以RV01则增加900倍。

总之，体内研究显示，针对编码的抗原，不饱和脂质尾部倾向于增强IgG效价。

RSV免疫原性

在0天和21天时，用编码RSV F蛋白的vA317自我复制型复制子，分别以单纯复制子(1μg)、复制子与DlinDMA制成脂质体(“RV01”)、复制子与DOTAP制成脂质体(“RV13”)的形式，对BALB/c小鼠进行给药，每组4或8只动物，双侧肌肉接种疫苗（每条腿上50μL）。RV01脂质体含有40%DlinDMA、10%DSPC、48%胆固醇和2%PEG-DMG，但所含RNA量不同。RV13脂质体40%DOTAP、10%DPE、48%胆固醇和2%PEG-DMG。为进行比较，表达同一RSV-F抗原的裸露质粒DNA(20μg)也通过电穿透或作为RV01(10)脂质体(0.1μg DNA)形式进行给药。用四只小鼠作为未经免疫处理对照组。

脂质体用方法(D)或(B)制备。方法(D)制备的一些脂质体中采用了双倍或一半剂量的RNA。脂质体的颗粒平均直径Z值、多分散指数（pdI）和包封效率数据如下：

RV	Zav(nm)	pdI	包封率%	方法
					RV01(10)	158.6	0.088	90.7	(A)
RV01(08)	156.8	0.144	88.6	(A)
					RV01(05)	136.5	0.136	99	(B)
RV01(09)	153.2	0.067	76.7	(A)
					RV01(10)	134.7	0.147	87.8*	(A)
RV13(02)	128.3	0.179	97	(A)

*该RV01(10)配方中核酸是DNA，不是RNA。

在14天、36天和49天取血清检测抗体。49天取小鼠脾脏作T细胞分析。

F-特异性血清IgG效价(GMT)如下：

RV	第14天	第36天
			裸DNA质粒	439	6712
裸A317RNA	78	2291
			RV01(10)	3020	26170
RV01(08)	2326	9720
			RV01(05)	5352	54907
RV01(09)	4428	51316
			RV01(10)DNA	5	13
RV13(02)	644	3616

细胞因子阳性且对RSV F51-66肽特异性的T细胞份额如下，只显示了具统计学上显著大于0的数据：

根据F-特异性IgG效价和T细胞数据的升高，说明与裸RNA对照组相比，脂质体配置显著增强了免疫原性。用脂质体配置质粒DNA或以裸露形式电穿透递送，免疫原性明显弱于脂质体配置的自我复制型RNA。

RV01RNA疫苗比RV13疫苗免疫原性强。RV01在其头部有叔胺基团，pKa约为5.8，还包括不饱和烷基尾部。RV13有不饱和烷基尾部但其头部有季胺基团，呈很强的阳性电荷。

脂质体----包封的要求

为评估脂质体组中所见效应是否仅仅是由于脂质体成分本身所引起，或者是与包封本身相关，复制子以包封形式（采用两种不同的纯化方案，0.1μgRNA）、或在脂质体形成后与之相混合（未经包封的“脂质复合体”，0.1μg RNA）、或以裸RNA(1μg)的形式，进行给药。图10显示包封是效价表达之关键。

进一步实验采用了三种不同的RNA：(i)表达RSV-F的‘vA317’复制子，即RSV表面融合糖蛋白；(ii)表达GFP的‘vA17’；(iii)编码GFP的复制缺陷型‘vA336’。

RNA以裸露形式或按方法(D)制成的脂质体形式进行给药。用方法(D)制备不含RNA的空脂质体。四种脂质体配置的性质如下：

RNA	颗粒大小Zav(nm)	多分散度	RNA包封率
				vA317	155.7	0.113	86.6%
vA17	148.4	0.139	92%
				vA336	145.1	0.143	92.9%
空白	147.9	0.147	-

BALB/c小鼠，每组5只动物，在0天和21天时双侧肌肉注射以下疫苗（每条腿50μL）：

第1组：裸露的自我复制型RSV-F RNA(vA317,0.1μg)

第2组：脂质体包封的自我复制型RSV-F RNA(vA317,0.1μg)

第3组：与空脂质体相混合的自我复制型RSV-F RNA(vA317,0.1μg)

第4组：亚单位蛋白(5μg)

在14天、35天和51天取血清检测抗体。测定F-特异性的血清IgG效价(GMT)，如果有单个动物的效价<25（检测限），将其归为效价值5。另外在51天取小鼠脾脏作T细胞分析，以测定细胞因子阳性且对RSV F51-66肽特异(CD4+)或对RSV F F85-93肽和F249-258肽特异(CD8+)的细胞。

10个组以及未免疫对照组小鼠的IgG效价如下：

天数	1	2	3	4	-
						14	22	1819	5	5	5
35	290	32533	9	19877	5
						51	463	30511	18	20853	5

第51天时RSV血清中和效价如下：

天数	1	2	3	4
					51	35	50	24	38

在第51天呈现RSV F-特异性CD4+脾脏T细胞的动物如下，其中只给出统计学上显著大于0的刺激应答数据（阳性细胞%）：

细胞因子	1	2	3	4
					IFN-γ		0.04
IL2	0.02	0.06		0.02
					IL5
TNFα	0.03	0.05

在第51天呈现RSV F-特异性CD8+脾脏T细胞的动物如下，其中只给出统计上显著大于0的刺激应答数据：

细胞因子	1	2	3	4
					IFN-γ	0.37	0.87
IL2	0.11	0.40		0.04
					IL5
TNFα	0.29	0.79		0.06

因为简单地将RNA与脂质体混合（第3组）没有免疫原性（实际上比裸RNA更低），可见将RNA包封在脂质体内是获得高免疫原性所必需的。

另一项研究中小鼠接受各种组合给药：(i)编码全长RSV F蛋白的自我复制型RNA复制子(ii)编码GFP的自我复制型RNA复制子(iii)编码GFP的RNA复制子，其nsP4被敲除而失去自我复制能力(iv)全长RSV F蛋白。全部13组的接受如下：

A	-	-
			B	0.1μg of(i),裸露	-
C	0.1μg of(i),包封在脂质体内	-
			D	0.1μg of(i),和分离脂质体	-
E	0.1μg of(i),裸露	10μg of(ii),裸露
			F	0.1μg of(i),裸露	10μg of(iii),裸露
G	0.1μg of(i),包封在脂质体内	10μg of(ii),裸露
			H	0.1μg of(i),包封在脂质体内	10μg of(iii),裸露
I	0.1μg of(i),包封在脂质体内	1μg of(ii),包封在脂质体内
			J	0.1μg of(i),包封在脂质体内	1μg of(iii),包封在脂质体内
K	5μg F蛋白	-
			L	5μg F蛋白	1μg of(ii),包封在脂质体内
M	5μg F蛋白	1μg of(iii),包封在脂质体内

图16的结果显示F-特异性IgG应答需要脂质体包封，而不是简单的共同递送（比较C和D）。K、L、M之间的比较说明RNA为共同给药的蛋白提供了佐剂效应，这种效应在复制型和非复制型RNA中都可见到。

不同突变小鼠中的RSV免疫原性

复制子“vA142”编码全长度的野生型RSV表面融合(F)糖蛋白，但去除了融合肽，借助核酶介导的剪切作用形成了3'末端。在三种不同突变小鼠中进行试验。

BALB/c小鼠在0天和22天时双侧肌肉注射疫苗（每条腿50μL）。动物分为8个试验组（每组5只动物）和一个未免疫处理组（2只动物）：

第1组：给予裸复制子(1μg)。

第2组：给予脂质体“RV01(37)”递送的1μg复制子，脂质体含40%DlinDMA、10%DSPC、48%胆固醇、2%PEG结合DMG。

第3组：给予同第2组，但RNA量为0.1μg。

第4组：给予脂质体“RV17(10)”（40%RV17(上述)、10%DSPC、49.5%胆固醇、0.5%PEG-DMG）中的1μg复制子。

第5组：给予脂质体“RV05(11)”（40%RV07脂、30%18:2PE(DLoPE、28%胆固醇、2%PEG-DMG）中的1μg复制子。

第6组：给予脂质体“RV17(10)”中的0.1μg复制子。

第7组：给予5μg RSV-F亚单位蛋白，辅以氢氧化铝佐剂。

第8组：未经免疫处理对照（2只动物）。

在14天、35天和49天取血清检测抗体。F-特异性血清IgG GMT如下：

天数	1	2	3	4	5	6	7	8
									14	82	2463	789	2496	1171	1295	1293	5
35	1538	34181	25605	23579	13718	8887	73809	5

35天时F-特异性IgG1和IgG2a效价(GMT)如下：

IgG	1	2	3	4	5	6	7
								IgG1	94	6238	4836	7425	8288	1817	78604
IgG2a	5386	77064	59084	33749	14437	17624	24

35天和49天的RSV血清中和抗体效价如下（数据是2-5只小鼠的收集池所测得的60%空斑减少中和效价，每组1个收集池）：

天数	1	2	3	4	5	6	7	8
									35	<20	143	20	101	32	30	111	<20
49	<20	139	<20	83	41	32	1009	<20

49天时取小鼠脾脏作T细胞分析。F-特异性T细胞(CD4+或CD8+)平均数值如下，其中只显示统计学上显著大于0的数据（CD4+：对RSV F51-66肽、F164-178肽、F309-323肽特异，或CD8+：对F85-93肽和F249-258特异）：

C57BL/6以同样方式免疫接种，但设第9组接受表达全长度野生型RSV表面融合糖蛋白（去除融合肽）的VRP(1x10⁶IU)。

在14天、35天和49天取血清检测抗体。F-特异性IgG效价（GMT）如下：

天数	1	2	3	4	5	6	7	8	9
										14	1140	2133	1026	2792	3045	1330	2975	5	1101
35	1721	5532	3184	3882	9525	2409	39251	5	12139

35天时F-特异性IgG1和IgG2a效价(GMT)如下：

IgG	1	2	3	4	5	6	7	8
									IgG1	66	247	14	328	468	92	56258	79
IgG2a	2170	7685	5055	6161	1573	2944	35	14229

35天和49天的RSV血清中和抗体效价如下（数据是2-5只小鼠的收集池所测得的60%空斑减少中和效价，每组1个收集池）：

天数	1	2	3	4	5	6	7	8	9
										35	<20	27	29	22	36	<20	28	<20	<20
49	<20	44	30	23	36	<20	33	<20	37

49天时取脾脏作T细胞分析。F-特异性细胞因子阳性T细胞(CD8+)平均数值如下，其中只显示统计学上显著大于0的数据（对RSV F85-93肽和F249-258特异）：

9组C3H/HeN小鼠用相同方式免疫接种。F-特异性IgG效价(GMT)如下：

天数	1	2	3	4	5	6	7	8	9
										14	5	2049	1666	1102	298	984	3519	5	806
35	152	27754	19008	17693	3424	6100	62297	5	17249

35天时F-特异性IgG1和IgG2a效价(GMT)如下：

IgG	1	2	3	4	5	6	7	8
									IgG1	5	1323	170	211	136	34	83114	189
IgG2a	302	136941	78424	67385	15667	27085	3800	72727

35天和49天的RSV血清中和抗体效价如下：

天数	1	2	3	4	5	6	7	8	9
										35	<20	539	260	65	101	95	443	<20	595
49	<20	456	296	35	82	125	1148	<20	387

因此三种不同脂质(RV01、RV05、RV17；pKa5.8、5.85、6.1)在三种不同近交系小鼠株系中进行了测试。所有三种株系中RV01比RV17有效；RV05对于BALB/c和C3H株系的效果不如RV01或RV17，但它对B6株系更有效。在所有情况中脂质体比平行测试的两种阳离子型纳米乳液更有效。

CMV免疫原性

用作为阳离子型脂质的DLinDMA制成的RV01脂质体，被用来递送编码巨细胞病毒(CMV)糖蛋白的RNA复制子。“vA160”复制子编码全长度的糖蛋白H和L(gH/gL)，而“vA322”复制子则编码其可溶性的形式(gHsol/gL)。两种蛋白在一单个复制子内受控于独立的亚基因组启动子；两个独立的载体，其中一个编码gH另一个编码gL，用两者一同给药未能获得好的结果。

BALB/c小鼠，每组10只，在0天、21天和42天时分别用表达gH/gL(1x10⁶IU)的VRP、表达gHsol/gL(1x10⁶IU)的VRP以及作为对照的PBS，进行双侧肌肉注射（每条腿50μL）。两个试验组接受脂质体(40%DlinDMA、10%DSPC、48%胆固醇、2%PEG-DMG；用方法(D)制得，但一批的RNA量为150μg)包封配方的1μg的vA160或vA322复制子。

vA160脂质体的直径Zav为168nm，pdI为0.144，包封率为87.4%。vA322脂质体的直径Zav为162nm，pdI为0.131，包封率为90%。

复制子可通过同一载体表达两种蛋白。

在63天时取血清进行免疫学分析(3wp3)。CMV中和效价（相对于对照组，每孔中发生阳性病毒数50%降低的血清稀释度的倒数）如下：

gH/gL VRP	gHsol/gL VRP	gH/gL脂质体	gHsol/gL脂质体
				4576	2393	4240	10062

在上皮细胞分析中，表达全长度或可溶型的CMV gH/gL复合物可诱导高效价的中和抗体。脂质体包封RNA诱导的平均效价至少和相应的VRP一样高。

重复实验证实复制子能通过单一的载体表达两种蛋白。RNA复制子诱导的3wp3效价是11457，对应的VRP是5516。

在vA160以外还用不同复制子作了进一步实验。vA526复制子在三个亚基因组启动子控制下表达CMV五聚复合物(gH-gL-UL128-UL130-UL-131)的：第一个启动gH表达；第二个启动gL表达；第三个启动UL128-2A-UL130-2A-UL131聚合蛋白表达，其中含有在三个UL基因之间的两个2A剪切位点。vA527复制子通过三个亚基因组启动子和两个IRES表达CMV五聚复合物：第一个亚基因组启动子启动gH表达；第二个亚基因组启动子启动gL表达；第三个亚基因组启动子启动UL128聚合蛋白表达；UL130受控于EMCV IRES；UL131受控于EV71IRES。这三种复制子制成脂质体（方法(H)，批次大小是150μg）或VRP来给药。

BALB/c小鼠，每组10只，在0天、21天和42天时双侧肌肉注射以下疫苗（每条腿50μL）：

第1组：表达gH FL/gL(1x10⁶IU)的VRP

第2组：五聚物，2A VRP(1x10⁵IU)

第3组：五聚物，2A VRP(1x10⁶IU)

第4组：五聚物，IRES VRP(1x10⁵IU)

第5组：以脂质体包封的自我复制型RNA vA160(1μg)

第6组：以脂质体包封的自我复制型RNA vA vA526(1μg)

第7组：以脂质体包封的自我复制型RNA vA vA527(1μg)

第8组：配制成阳离子型纳米乳液的自我复制型RNA vA160(1μg)

第9组：配制成阳离子型纳米乳液的自我复制型RNA vA526(1μg)

第10组：配制成阳离子型纳米乳液的自我复制型RNA vA527(1μg)

在21天(3wp1)、42天(3wp2)和63天(3wp3)时取血清进行免疫学分析。

21天42天和63天时CMV血清中和效价如下：

疫苗组别	3wp1	3wp2	3wp3
				1	126	6296	26525
2	N/A	N/A	6769
				3	N/A	3442	7348
4	N/A	N/A	2265
				5	347	9848	42319
6	179	12210	80000
				7	1510	51200	130000
8	N/A	N/A	845
				9	N/A	N/A	228
10	N/A	N/A	413

自我复制型RNA可用来通过单一载体表达多重抗原，用来诱导强效和特异性的免疫应答。复制子能表达5种抗原(CMV五聚复合物(gH-gL-UL128-UL130-UL-131)并诱导强效的免疫应答。上皮细胞分析中在所有分析时间点上(3wp1、3wp2和3wp3)自我复制型RNA以脂质体形式递送给药能诱导较高效价的中和抗体。这些应答强于相对应的VRP和阳离子型纳米乳。

给药体积

液压递送利用了由大体积溶液快速注射产生的力来克服细胞膜的物理阻力，这种阻力可阻止大的不可透过膜的化合物进入细胞。曾显示这种现象对DNA疫苗在细胞内的递送有用。

用于小鼠的典型的肌肉注射给药体积是在后腿注射50μl，这对于小鼠腿部肌肉而言是相对较大的注射体积。相对来说，约0.5ml的人类肌肉注射量是较小的。如果小鼠体内的免疫原性为体积依赖性的，那么复制子疫苗在液压力作用下其效力或许会失去，至少是一部分，这样就不提倡将相同疫苗用于人类和大型动物。

BALB/c小鼠，每组10只，在0天和21天时用vA317复制子进行双侧肌肉注射（每条腿5或50μL）：

第1组：裸复制子，每条腿0.2μg50μL

第2组：裸复制子，每条腿0.2μg5μL

第3组：脂质体配方的复制子（每条腿0.2μg50μL）

第4组：脂质体配方的复制子（每条腿0.2μg5μL）

在14天和35天取血清进行抗体分析。F-特异性的血清IgG效价(GMT)如下：

天数	1	2	3	4
					14	42	21	2669	2610
35	241	154	17655	18516

可见脂质体配方的复制子，其免疫原性不因给药体积的不同而发生变化，说明这些RNA疫苗的效力与液压递送无关。

表达动力学

表达荧光素酶报告基因(luc)的自我复制型RNA复制子(“vA311”)被用来研究注射后的蛋白表达动力学。BALB/c小鼠，每组5只，在0天时双侧肌肉注射以下疫苗（每条腿50μL）：

第1组：表达荧光素酶的DNA，以电穿透方法递送(10μg)

第2组：配制成脂质体的自我复制型RNA(1μg)

第3组：配制成阳离子型纳米乳液的自我复制型RNA(1μg)

第4组：配制成阳离子型纳米乳液的自我复制型RNA(1μg)

第5组：表达荧光素酶的VRP(1x10⁶IU)

接种疫苗前先将小鼠去毛。麻醉小鼠(含有2%异氟烷的氧气)，先用电动剃刀刮毛，再用Nair进行化学脱毛。在第3、7、14、21、28、35、42、49、63和70天时用Xenogen IVIS200成像系统(卡钳生命科学公司（Caliper LifeSciences）)获取生物荧光数据。在成像前5分钟腹腔注射8mg/kg量的荧光素溶液。麻醉动物并转移到成像系统上。用制冷CCD照相机检测生物荧光信号时，图像采集时间保持恒定。

据目测观察，可见荧光素酶表达细胞处于RNA注射的原位，动物在去除四肢后无信号显示。

定量方面，荧光素酶表达测定以70天里的平均辐射强度(p/s/cm²/sr)来量化，5组的结果如下：

天数	1	2	3	4	5
						3	8.69E+07	3.33E+06	2.11E+06	9.71E+06	1.46E+07
7	1.04E+08	8.14E+06	1.83E+07	5.94E+07	1.64E+07
						14	8.16E+07	2.91E+06	9.22E+06	3.48E+07	8.49E+05
21	1.27E+07	3.13E+05	6.79E+04	5.07E+05	6.79E+05
						28	1.42E+07	6.37E+05	2.36E+04	4.06E+03	2.00E+03
35	1.21E+07	6.12E+05	2.08E+03
						42	1.49E+07	8.70E+05
49	1.17E+07	2.04E+05
						63	9.69E+06	1.72E+03
70	9.29E+06

配制成阳离子型纳米乳液的自我复制型RNA在第3天显示生物荧光，在第7天达到峰值，然后在28-35天间降至背景水平。当被制成脂质体时，RNA在第3天显示可检测到的生物荧光，在第7天达到峰值，到63天降至背景水平。用VRP递送的RNA在第21天显示比配方RNA增强的生物荧光，但在28天时表达降至背景水平。电穿孔DNA在所有检测时间点都显示最高强度的生物荧光，而且在实验的70天里生物荧光未降至背景水平。

给药途径

用编码HIV gp140的脂质体包封RNA对小鼠进行肌肉或皮内或皮下给药。所有三种给药途径都得到高水平的HIV-特异性IgG（图15），超过应答电穿透肌肉内DNA观察到的效价。

棉鼠

用棉鼠(Sigmodon hispidis)替代小鼠进行研究。与裸RNA相比，1μg剂量的脂质体包封物使F-特异性IgG效价提高了8.3倍，PRNT提高了9.5倍。抗体应答强度与5x10⁶IU的VRP相当。裸RNA和脂质体包封RNA两者都能对接受RSV刺激(1x10⁵空斑形成单位)的棉鼠形成保护，使肺内病毒负荷下降3.5个数量级。包封使降低程度增加约2倍。

进一步的棉鼠实验采用了四种不同复制子：表达全长RSV-F的vA317；表达截短RSV-F（去除跨膜和胞质尾区）的vA318；表达去除了融合肽的RSV-F的vA142；表达截短且去除融合肽的RSV-F的vA140。棉鼠，每组4-8只动物，在0天和21天时双侧肌肉注射上述四种复制子疫苗（每条腿100μL），共采用两种剂量(1.0和0.1μg)，复制子按照方法(D)进行脂质体包封，但批次大小为150μg RNA。对照组分别接受辅以明矾佐剂的RSV-F亚单位蛋白疫苗(5μg)（每组8只动物)、表达全长VRP的RSV-F(1x10⁶IU，每组8只动物)，或是未经免疫处理（每组4只动物）。在0天、21天和34天时取血清进行抗体分析。

21天和34天时的F-特异性血清IgG效价及RSV血清中和抗体效价如下：

本试验研究的所有四种复制子(vA317、vA318、vA142、vA140)以脂质体形式给药在棉鼠中都呈现免疫原性，尽管其血清中和效价比含佐剂的蛋白疫苗或VRP所诱导的至少低10倍。脂质体/RNA疫苗诱导在第一次疫苗接种后诱导了F-特异性IgG和RSV中和抗体，第二次接种有效加强了应答。第二次接种采用1μg复制子剂量比0.1μg剂量得到的F-特异性IgG效价高2-3倍。四种复制子诱导的抗体效价水平相当，说明无论有没有融合肽，全长和截短的RSV-F在棉鼠中免疫原性相似。

进一步的棉鼠试验采用了vA317、vA318和vA142复制子。棉鼠，每组2-8只动物，在0天和21天时双侧肌肉注射（每条腿100μL）RV01脂质体包封的复制子(0.1或1μg)，包封物根据方法(D)制得，但批次大小为150μg RNA量。对照组接受辅以明矾佐剂的RSV-F亚单位蛋白疫苗(5μg)，或表达全长RSV-F的VRP(1x10⁶IU，每组8只动物)。所有这些动物在第56天用辅以明矾佐剂的RSV-F亚单位蛋白疫苗(5μg)进行第三次疫苗接种。另设一组未经免疫处理的对照（每组4只动物）。此外另加一组在0天和56天时接受双侧肌肉注射（每条腿50μL）1μg vA317RNA脂质体，但不作第三次的亚单位蛋白疫苗接种。

在0天、21天、35天、56天、70天时取血清进行抗体分析，增加的一组另加14天、28天和42天的分析。F-特异性血清IgG效价(GMT)如下：

血清中和效价如下（每组内分两批各取3-4只小鼠所测得的60%RSV中和效价每组中两批的GMT值）：

增加组的血清效价和中和效价如下：

由此证实这些复制子在棉鼠中具有免疫原性，在第一次接种疫苗后可诱导F-特异性IgG和RSV中和抗体。第二次接种有效加强了应答。第二次接种采用1μg复制子剂量比0.1μg剂量得到的F-特异性IgG效价高1.5-4倍。

对作过F三聚体亚单位+明矾注射的棉鼠进行第三次接种疫苗（蛋白，56天时），效价未得到增强，但其确实可以大大增加先前注射过复制子疫苗的棉鼠的效价。多数情况下，经两次复制子疫苗注射再加上蛋白加强免疫，RSV血清中和效价等于或高于两次或三次蛋白疫苗注射所诱导的效价。

本研究还评价了1.0μg vA317诱导抗体应答的动力学。单次疫苗接种所诱导的F-特异性血清IgG效价和RSV中和效价在21天左右达到峰值，并至少保持到56天（F-特异性IgG效价降低50-70%，RSV中和效价几乎不变）。56天时对这些动物进行相同的第二次接种，抗体效价增加到至少与21天作第二次疫苗注射的水平相等。

进一步实验有关于病毒刺激。vA368复制子编码野生型RSV全长度表面融合糖蛋白，其融合肽被去除，表达由EV71IRES启动。棉鼠，每组7只，在0天和21天时双侧肌肉注射（每条腿100μL）脂质体包封的vA368或者带有同样复制子的VRP。包封物按方法(H)制得，但一批的RNA量是175μg。还设置了接受5μg含明矾佐剂蛋白和未经免疫处理的对照组。

所有组在最后一次免疫接种4周后接受1x10⁶PFU RSV鼻腔刺激(i.n.)。在0天、21天、35天时取血清进行抗体分析。在刺激后第5天测定肺部病毒效价。结果如下

可见RNA疫苗使肺部病毒负荷降低了三个数量级：从未接种对照棉鼠的约10⁶PFU/g到接种棉鼠的少于103PFU/g。

大型哺乳动物研究

大型动物研究用牛来进行。小牛（4-6周龄，约60-80kg,每组5只）在0天、21天、86天和146天时，以66μg编码全长度RSV F蛋白的vA317复制子注射免疫。复制子被包封在脂质体内。单独注射PBS作为阴性对照，获批准的商品疫苗作为阳性对照（来自富道公司（Fort Dodge）的“Triangle4”，含有灭活的病毒）。所有小牛在146天时接受含MF59佐剂的15μg F蛋白乳液注射。一只奶牛在86天时被误用了错的疫苗而非Triangle4，故其数据从100天起被排除在外。

RNA疫苗编码人类RSV F而“Triangle4”一名含牛RSV F，但RSV F在BRSV之间HRSV呈高度保守。

脂质体按方法(E)制备，但是使用1.5mg RNA的批次大小。

牛接受了2ml的各试验疫苗，在颈部两侧肌肉各注射1ml。作为对比，在颈部单次注射2ml的“Triangle4”疫苗。

在0、14、21、35、42、56、63、86、100、107、114、121、128、135、146、160、167、174、181、188、195和202天时取血清进行抗体分析。如果单个动物的效价低于检测限，则将其定为效价=5。

图14A显示在前63天里F-特异性IgG效价。RNA复制子脂质体的形式对奶牛有免疫原性，尽管其效价低于商品疫苗。所有接受疫苗的奶牛在第二次接种后出现F-特异性抗体，而且其效价在第二次接种后的2-6周之间很稳定（RNA疫苗特别稳定）。

图14B显示210天里F-特异性血清IgG效价(GMT)，测定到202天为止的数据如下：

RSVP血清中和抗体效价如下：

用于第二次脂质体给药的材料不是新鲜制作的，小鼠免疫原性研究显示同批次的RNA有效力降低的现象。因此有可能如果使用的所有疫苗材料都是新鲜的，疫苗免疫原性将会更强。

当进行补体测试时，在所有接种疫苗的奶牛中检测到中和抗体。该项测试中，所有接种疫苗的牛在第二次RNA接种后显示很好的中和抗体水平。此外，几只牛在第二次接种后、所有牛在第三次接种后，检测到RNA疫苗诱导的F-特异性血清IgG效价。

含MF59佐剂的RSV-F能加强所有先前经疫苗接种的牛的IgG应答，能加强先前经RNA疫苗接种的牛的补体非依赖中和抗体。

以往曾发现，基于DNA的疫苗当被从小型动物模型转移至大一些的动物或人类时有效力丧失的现象，因而对RNA疫苗在大型动物上进行概念验证显得特别重要。用于奶牛的典型的DNA疫苗剂量是0.5-1mg[47,48]，所以仅仅66μg的RNA就能诱导出免疫应答的结果很令人鼓舞。

应该理解本发明只是以实例的方式加以描述，可在本发明范围和精神内进行修改。

表1：有用的磷脂

DDPC1,2-二癸酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱

DEPA1,2-二芥酰-sn-甘油-3-磷酸盐

DEPC1,2-芥酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱

DEPE1,2-二芥酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺

DEPG1,2-二芥酰-sn-甘油-3-[磷脂酰-外消旋-(1-甘油...)

DLOPC1,2-亚麻酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱

DLPA1,2-二月桂酰-sn-甘油-3-磷酸盐

DLPC1,2-二月桂酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱

DLPE1,2-二月桂酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺

DLPG1,2-二月桂酰-sn-甘油-3-[磷脂酰-外消旋-(1-甘油...)

DLPS1,2-二月桂酰-sn-甘油-3-磷脂酰丝氨酸

DMG1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺

DMPA1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸盐

DMPC1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱

DMPE1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺

DMPG1,2-肉豆蔻酰-sn-甘油-3-[磷脂酰-外消旋-(1-甘油...)

DMPS1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷脂酰丝氨酸

DOPA1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸盐

DOPC1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱

DOPE1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺

DOPG1,2-二油酰-sn-甘油-3-[磷脂酰-外消旋-(1-甘油...)

DOPS1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷脂酰丝氨酸

DPPA1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸盐

DPPC1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱

DPPE1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺

DPPG1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-[磷脂酰-外消旋-(1-甘油...)

DPPS1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷脂酰丝氨酸

DPyPE1,2-二植烷酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺

DSPA1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸盐

DSPC1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱

DSPE1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺

DSPG1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-[磷脂酰-外消旋-(1-甘油...)

DSPS1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷脂酰丝氨酸

EPC蛋-PC

HEPC氢化蛋PC

HSPC高纯度氢化大豆PC

HSPC氢化大豆PC

LYSOPC MYRISTIC1-肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱

LYSOPC PALMITIC1-棕榈酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱

LYSOPC STEARIC1-硬脂酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱

乳鞘磷脂MPPC1-肉豆蔻酰,2-棕榈酰-sn-甘油3-磷脂酰胆碱

MSPC1-肉豆蔻酰,2-硬酯酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱

PMPC1-棕榈酰,2-肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱

POPC1-棕榈酰,2-油酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱

POPE1-棕榈酰,2-油酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺

POPG1,2-二油酰-sn-甘油-3-[磷脂酰-外消旋-(1-甘油)...]

PSPC1-棕榈酰,2-硬酯酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱

SMPC1-硬脂酰,2-肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱

SOPC1-硬脂酰,2-油酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱

SPPC1-硬脂酰,2-棕榈酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱

参考文献：

[1].Johanning等(1995)Nucleic Acids Res23:1495-1501.

[2].Heyes等(2005)J Controlled Release107:276-87.

[3].WO2005/121348.

[4].Liposomes:Methods and Protocols,（《脂质体：方法和方案》）第1卷:Pharmaceutical Nanocarriers:Methods and Protocols.（药物纳米载体：放马和方案）(Weissig编).休曼出版社(Humana Press),2009.ISBN160327359X.

[5].Liposome Technology,（《脂质体技术》）第I、II和III卷.(Gregoriadis编辑).印富玛健康护理公司（Informa Healthcare）,2006.

[6].Functional Polymer Colloids and Microparticles volume4(Microspheres,microcapsules&liposomes)（《功能聚合物胶体和微颗粒》）第4卷（微团、微胶囊和脂质体）.(Arshady和Guyot编辑).辞塔斯图书公司（CitusBooks）,2002.

[7].Jeffs等(2005)Pharmaceutical Research22(3):362-372.

[8].Polymers in Drug Delivery.（《药物递送中的聚合物》）(Uchegbu和Schatzlein编).CRC出版社,2006.

[9].Microparticulate Systems for the Delivery of Proteins and Vaccines.（《用于蛋白和疫苗递送的微粒系统》）(Cohen和Bernstein编).CRC出版社,1996.

[10].O’Hagan等(2001)J Virology75:9037-9043.

[11].Singh等(2003)Pharmaceutical Research20:247-251.

[12].WO2009/132206.

[13].Martinon等(1993)Eur J Immunol23:1719-22.

[14].WO2005/113782.

[15].WO2011/005799.

[16].El Ouahabi等(1996)FEBS Letts380:108-12.

[17].Giuliani等(2006)Proc Natl Acad Sci U S A103(29):10834-9.

[18].WO2009/016515.

[19].WO02/34771.

[20].WO2005/032582.

[21].WO2010/119343.

[22].WO2006/110413.

[23].WO2005/111066.

[24].WO2005/002619.

[25].WO2006/138004.

[26].WO2009/109860.

[27].WO02/02606.

[28].WO03/018054.

[29].WO2006/091517.

[30].WO2008/020330.

[31].WO2006/089264.

[32].WO2009/104092.

[33].WO2009/031043.

[34].WO2007/049155.

[35].Gennaro(2000)Remington:The Science and Practice of Pharmacy.(《雷明顿：药物科学和实践》)第20版,ISBN:0683306472.

[36].Methods In Enzymology（《酶学方法》）(S.Colowick和N.Kaplan,编，学院出版社公司（Academic Press,Inc.）)

[37].Handbook of Experimental Immunology,（实验免疫学手册）I-IV卷(D.M.Weir和C.C.Blackwell,编,1986,布莱克威尔科学出版公司（BlackwellScientific Publications）)

[38].Sambrook等(2001)Molecular Cloning:A Laboratory Manual(《分子克隆：实验室手册》），第三版(冷泉港实验室出版社(Cold Spring HarborLaboratory Press)).

[39].Handbook of Surface and Colloidal Chemistry(《表面和胶体化学手册》）(Birdi,K.S.编,CRC出版社,1997)

[40].Ausubel等(eds)(2002)Short protocols in molecular biology,(《精编分子生物学实验指南》），第5版(新编).

[41].Molecular Biology Techniques:An Intensive Laboratory Course,（《分子生物学技术：详细实验室课程》）(Ream等编1998,学院出版社)

[42].PCR(Introduction to Biotechniques Series(PCR(生物技术系列介绍)，第2版(Newton和Graham编,1997,施普林格出版社（Springer Verlag）)

[43].Yoneyama和Fujita(2007)Cytokine&Growth Factor Reviews18:545-51.

[44].Maurer等(2001)Biophysical Journal,80:2310-2326.

[45].Perri等(2003)J Virol77:10394-10403.

[46].Iavarone等(2011)J Immunol186;4213-22.

[47].Boxus等(2007)J Virol81:6879-89.

[48].Taylor等(2005)Vaccine23:1242-50.

Claims (16)

1.一种用于向脊椎动物细胞体内递送RNA的非病毒颗粒，其中(a)所述颗粒含有一种递送材料，所述材料（i）包裹编码免疫原的自我复制型RNA分子或（ii）吸附编码免疫原的自我复制型RNA分子，(b)所述RNA不含修饰的核苷酸。

2.如权利要求1所述的颗粒，其特征在于，所述颗粒是脂质体且其内包封所述RNA。

3.如权利要求1所述的颗粒，其特征在于，所述颗粒是无毒的、可生物降解的多聚微粒，其上吸附所述RNA。

4.如权利要求1所述的颗粒，其特征在于，所述颗粒是可生物降解的交联寡聚纳米颗粒，它通过多聚物、交联剂、带电荷的单体和所述RNA的反应形成。

5.如权利要求2所述的颗粒，其特征在于，所述脂质体含带有阳离子型头部的脂质。

6.如权利要求2或5所述的颗粒，其特征在于，所述脂质体含带有两性离子型头部基团的脂质。

7.如权利要求2、5或6所述的颗粒，其特征在于，所述脂质体直径在50-220nm范围。

8.如根据权利要求3所述的颗粒，其特征在于，所述颗粒含有聚（D,L-乳酸-共-羟基乙酸）共聚物。

9.如权利要求3或8所述的颗粒，其特征在于，所述颗粒的直径在30nm-7μm范围。

10.如前述权利要求中任一项所述的颗粒，其特征在于，所述自我复制型RNA分子编码(i)能从自身复制型RNA分子转录RNA的RNA依赖性RNA聚合酶和(ii)免疫原。

11.如权利要求10所述的颗粒，其特征在于，所述RNA分子有两个开放阅读框，其中第一个编码α病毒复制酶，第二个编码免疫原。

12.如前述权利要求中任一项所述的颗粒，其特征在于，所述RNA分子为9000-12000核苷酸长度。

13.如前述权利要求中任一项所述的颗粒，其特征在于，所述免疫原能在体内诱导针对细菌、病毒、真菌或寄生虫的免疫应答。

14.如权利要求13所述的颗粒，其特征在于，所述免疫原能在体内诱导针对呼吸道合胞病毒糖蛋白F的免疫应答。

15.一种含有前述权利要求中任一项所述的颗粒的药物组合物。

16.一种在脊椎动物体内引起保护性免疫应答的方法，所述方法包括给予脊椎动物有效量的权利要求1-14中所述的颗粒或权利要求15中所述的药物组合物的步骤。

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