MX2013000089A - Particulas de suministro similares a viriones para moleculas de arn de autorreplicacion. - Google Patents

Particulas de suministro similares a viriones para moleculas de arn de autorreplicacion.

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Abstract

Se logra la inmunización por ácido nucleico por suministrar un ARN de autorreplicación encapsulado dentro de una partícula pequeña. El ARN codifica un inmunogen de interés, y la partícula puede suministrar este ARN por imitar la función de suministro de un virus de ARN natural. De esta forma la invención proporciona una partícula no virión para suministro in vivo de ARN a una célula vertebrada, en donde la partícula comprende un material de suministro que encapsula una molécula de ARN de autorreplicación la cual codifica un inmunogen. Estas partículas son útiles como componentes en composiciones farmacéuticas para inmunizar sujetos contra varias enfermedades.

Description

PARTICULAS DE SUMINISTRO SIMILARES A VIRIONES PARA MOLECULAS DE ARN DE AUTORREPLICACION Campo de la Invención Esta invención está en el campo de un suministro no viral de ARN de autorreplicación para inmunización.
Antecedentes de la Invención Ha sido una meta por varios años El suministro de ácidos nucleicos para inmunizar animales . Se han probado varios procedimientos, incluyendo el uso de ADN o ARN, de vehículos de suministro virales o no virales (o incluso vehículo no de suministro, en una vacuna "desnuda") , de vectores de replicación o de no replicación, o de vectores virales o no virales.
Permanece una necesidad para vacunas de ácido nucleico adicionales y mejoradas y, en particular, para formas mejoradas de suministro de vacunas de ácido nucleicos.
Breve Descripción de la Invención De acuerdo a la invención, se logra la inmunización por ácidos nucleicos por suministrar un ARN de autorreplicación encapsulado dentro y/o adsorbido a una partícula pequeña. El ARN codifica un inmunogen de interés, y la partícula puede suministrar este ARN por imitar la función de suministro de un virus natural.
De esta forma la invención proporciona una Ref. 238220 partícula no virión para suministro in vivo de ARN a una célula vertebrada, en donde la partícula comprende un material de suministro que encapsula una molécula de ARN de autorreplicación la cual codifica un inmunogen. La invención también proporciona una partícula no virión para suministro in vivo de ARN a una célula vertebrada, en donde la partícula comprende un material de suministro en el cual se adsorbe una molécula de ARN de autorreplicación la cual codifica un inmunogen. Estas partículas son útiles como componentes en composiciones farmacéuticas para inmunizar sujetos contra varias enfermedades. La combinación para utilizar una partícula no virión para suministrar un ARN de autorreplicación proporciona una forma para producir una respuesta inmunológica fuerte y específica contra el inmunogen mientras que suministra solamente una dosis baja de ARN. Por otra parte, estas partículas pueden ser fabricadas fácilmente en una escala comercial.
La Partícula Partículas de la invención son partículas no viriones es decir no son un virión. De esta forma la partícula no comprende una cápside de proteína. Por evitar la necesidad de crear una partícula de cápside, la invención no requiere una línea celular de empaque, de esta forma permitiendo escalación más fácil para producción comercial y minimizar el riesgo que sean inadvertidamente producidos virus infecciosos peligrosos.
En lugar de encapsular ARN en un virión, se forman partículas de la invención a partir de un material de suministro. Son adecuados varios materiales para formar partículas las cuales pueden suministrar ARN a una célula vertebrada ín vivo. Dos materiales de suministro de interés particular son (i) lípidos anfifílieos los cuales pueden formar liposomas y (ii) polímeros no tóxicos y biodegradables los cuales pueden formar micropartículas . Donde el suministro es por liposoma, el ARN debe ser encapsulado; donde el suministro es por micropartículas poliméricas, el ARN puede ser encapsulado o adsorbido. Un tercer material de suministro de interés es el producto de reacción particulada de un polímero, un reticulador, un ARN, y un monómero cargado.
De esta forma una modalidad de una partícula de la invención comprende un liposoma que encapsula una molécula de ARN de autorreplicación la cual codifica un inmunogen, mientras que otra modalidad comprende una micropartícula polimérica que encapsula una molécula de ARN de autorreplicación la cual codifica un inmunogen, y otra modalidad comprende una micropartícula polimérica en la cual se adsorbe una molécula de ARN de autorreplicación la cual codifica un inmunogen. En todos los tres casos las partículas son preferentemente substancialmente esféricas . En una cuarta modalidad una partícula de la invención comprende el producto de reacción particulado de un polímero, un reticulador, una molécula de ARN de autorreplicación la cual codifica un inmunogen, y un monómero cargado. Estas partículas son formadas dentro de moldes y así pueden ser creadas con cualquier forma que incluye, pero no se limita a, esferas.
El ARN puede ser encapsulado dentro de las partículas (particularmente si la partícula es un liposoma) . Esto significa que se separa ARN dentro de las partículas (como en un virus natural) a partir de cualquier medio externo por el material de suministro, y la encapsulación ha sido encontrada para proteger al ARN de digestión de ARNasa. La encapsulación puede tomar varias formas. Por ejemplo, en algunas modalidades (como en un liposoma unilaminar) el material de suministro forma una capa externa alrededor del núcleo que contiene ARN acuoso, mientras que en otras modalidades (por ejemplo en partículas moldeadas) el material de suministro forma una matriz dentro de la cual se embebe el ARN. Las partículas pueden incluir algún ARN externo (por ejemplo en la superficie de las partículas) , pero por lo menos la mitad del ARN es encapsulado (e idealmente todo el) . La encapsulación dentro de los liposomas es distinta de, por ejemplo, los complejos de lípidos/ARN descritos en la referencia 1.
El ARN puede ser adsorbido · a las partículas (particularmente si la partícula es una micropartícula polimérica) . Esto significa que no se separa ARN de cualquier medio externo por el material de suministro, a diferencia del genoma de ARN de un virus natural . Las partículas pueden incluir algún ARN encapsulado (por ejemplo en el núcleo de una partícula) , pero por lo menos la mitad del ARN es adsorbido (e idealmente todo) .
Liposomas Varios lipidos anfifílicos pueden formar bicapas en un ambiente acuoso para encapsular un núcleo acuoso que contiene ARN como un liposoma. Estos lipidos pueden tener un grupo de cabeza aniónico, catiónico o zwiteriónico hidrofílico. La formación de liposomas a partir de fosfolípidos aniónicos se remonta a los años sesenta, y se han estudiado desde los noventas los lipidos que forman liposomas catiónicos. Algunos fosfolípidos son aniónicos mientras que otros son zwiteriónicos y otros son catiónicos . Las clases adecuadas de fosfolípidos incluyen, pero no se limitan a, fosfatidiletanolaminas , fosfatidilcolinas , fosfatidilserinas y fosfatidilgliceroles y algunos fosfolípidos útiles son enlistados en la Tabla 1. Los lipidos catiónicos útiles incluyen, pero no se limitan a, propano de dioleoiltrimetilamonio (DOTAP) , 1 , 2-diesteariloxi-N, N-dimetil-3-aminopropano (DSDMA) , 1 , 2 -dioleiloxi-N, -dimetil-3 -aminopropano (DODMA) , 1 , 2-dilinoleiloxi-N, N-dimetil- 3 -aminopropano (DLinDMA) , 1, 2-dilinoleniloxi-N, N-dimetil-3-aminopropano (DLenDMA) . Los lípidos zwiteriónicos incluyen, pero no se limitan a, lípidos zwiteriónicos de acilo y lípidos zwiteriónicos de éter. Ejemplos de lípidos zwiteriónicos útiles son DPPC, DOPC y dodecilfosfocolina. Los lípidos pueden ser saturados o insaturados . Se prefiere el uso de por lo menos un lípido insaturado para preparar liposomas . Si un lípido insaturado tiene dos colas, ambas colas pueden ser insaturadas, o pueden tener una cola saturada y una cola insaturada .
Las partículas liposomales de la invención pueden ser formadas a partir de un solo lípido o de una mezcla de lípidos. Una mezcla puede comprender (i) una mezcla de lípidos aniónicos (ii) una mezcla de lípidos catiónicos (iii) una mezcla de lípidos zwiteriónicos (iv) una mezcla de lípidos aniónicos y lípidos catiónicos (v) una mezcla de lípidos aniónicos y lípidos zwiteriónicos (vi) una mezcla de lípidos zwiteriónicos y lípidos catiónicos o (vii) una mezcla de lípidos aniónicos, lípidos catiónicos y lípidos zwiteriónicos. Similarmente , una mezcla puede comprender tanto lípidos saturados o insaturados. Por ejemplo, una mezcla puede comprender DSPC ( zwiteriónico , saturado) , DlinDMA (catiónico, insaturado) , y/o DMG (aniónico, saturado) . Donde se usa una mezcla de lípidos, no todos los lípidos componentes en la mezcla necesitan ser anfifílieos, por ejemplo uno o más lípidos anfifílieos pueden ser mezclados con colesterol.
La porción hidrofílica de un lípido puede ser PEGilado (es decir modificado por unión covalente de un polietilenglicol) . Esta modificación puede incrementar la estabilidad y evitar la adsorción no específica de los liposomas. Por ejemplo, los lípidos pueden ser conjugados a PEG usando técnicas como aquellas descritas en la referencia 2 y 3. Pueden ser usadas varias longitudes de PEG por ejemplo entre 0.5-8 kDa.
Se usa una mezcla de DSPC, DlinDMA, PEG-DMG y colesterol en los ejemplos.
Las partículas liposomales son usualmente divididas en tres grupos: vesículas muítilaminares (MLV, por sus siglas en inglés) ; vesículas unilaminares pequeñas (SUV, por sus siglas en inglés) ; y vesículas unilaminares grandes (LUV, por sus siglas en inglés) . MLV tienen múltiples bicapas en cada vesícula formando varios compartimientos acuosos separados . SUV y LUV tienen una bicapa simple que encapsula un núcleo acuoso,- SUV tienen típicamente un diámetro < 50 nm, y LUV tienen un diámetro > 50 nm. Las partículas liposomales de la invención son idealmente LUV con un diámetro en el intervalo de 50-220 nm. Para una composición que comprende una población de LUV con diferentes diámetros: (i) por lo menos 80% por número deben tener diámetros en el intervalo de 20-220 nm, (ii) el diámetro promedio (Zav, por intensidad) de la población está idealmente en el intervalo de 40-200 nm, y/o (iii) los diámetros deben tener un índice de polidispersidad < 0.2. Los complejos de liposoma/ARN de referencia 1 son esperados para tener un diámetro en el intervalo de 600-800 nm y tener una alta polidispersidad.
Las técnicas para preparar liposomas adecuadas son bien conocidas en la técnica por ejemplo ver las referencias 4 a 6. Se describe un método útil en la referencia 7 e implica mezclar (i) una solución etanólica de los lípidos (ii) una solución acuosa del ácido nucleico y (iii) amortiguador, seguido por mezclado, equilibrio, dilución y purificación. Los liposomas preferidos de la invención son obtenibles por este proceso de mezclado.
Micropartículas Poliméricas Varios polímeros pueden formar micropartículas para encapsular o adsorber ARN de acuerdo a la invención. El uso de polímero substancialmente no tóxico significa que un receptor puede recibir seguramente las partículas, y el uso de un polímero biodegradable significa que las partículas pueden ser metabolizados después de suministrar para evitar persistencia a largo plazo. Los polímeros útiles son también esterilizables, para ayudar a preparar formulaciones de grado farmacéutico.
Los polímeros no tóxicos y biodegradables adecuados incluyen, pero no se limitan a, poli (a-hidroxiácidos) , ácidos polihidroxibutíricos, polilactonas (incluyendo policaprolactonas) , polidioxanos , polivalerolactona, poliortoésteres , polianhídridos , policianoacrilatos , policarbonatos derivados de tirosina, o poliéster amidas, y combinaciones de los mismos.
En algunas modalidades, se forman las micropartículas de poli (oc-hidroxiácidos) , como poli (lacturos) (PLA por sus siglas en inglés) , copolímeros de lacturo y glicoluro como poli (D, L-lacturo-co-glicoluro) (PLG, por sus siglas en inglés) y copolímeros de D,L-lacturo y caprolactona. Los polímeros PLG útiles incluyen aquellos que tienen una proporción molar de lacturo/glicoluro en el intervalo, por ejemplo, de 20:80 a 80:20 por ejemplo 25:75, 40:60, 45:55, 50:50, 55:45, 60:-40, 75:25. Los polímeros PLG útiles incluyen aquellos que tienen un peso molecular entre, por ejemplo, 5,000-200,000 Da por ejemplo entre 10,000-100,000, 20,000-70,000, 30,000-40,000, 40 , 000-50 , 000 Da.
Las micropartículas tienen idealmente un diámetro en el intervalo de 0.02 µp? a 8 µp?. Para una composición la cual comprende una población de micropartículas con diferentes diámetros por lo menos 80% por número deben tener diámetros en el intervalo de 0.03-7 µt?.
Técnicas para preparar micropartículas adecuadas son bien conocidas en la técnica por ejemplo ver las referencias 6, 8 (en particular el capítulo 7) y 9. Para facilitar la adsorción de ARN, una micropartícula puede incluir un tensioactivo catiónico y/o lípido por ejemplo como se describe en las referencias 10 y 11.
Las micropartículas de la invención pueden tener un potencial zeta de entre 40-100 mV.
Una ventaja de micropartículas sobre liposomas es que son fácilmente liofilizadas para almacenamiento estable.
Partículas Moldeadas Un tercer material de suministro de interés es el producto de reacción particulado de un polímero, un reticulador, un ARN de autorreplicación el cual codifica un inmunogen, y un monómero cargado. Estos cuatro componentes pueden ser mezclados como un líquido, colocado en un molde (por ejemplo que comprende un perfluoropoliéter) , y entonces curado para formar las partículas de acuerdo a la forma y dimensiones del molde. Detalles de un método de producción adecuado son descritos en la referencia 12. Estos métodos proporcionan una nanopartícula de polímero oligomérico reticulado biodegradable .
Idealmente las partículas tienen una dimensión de sección transversal más grande de < 5µp?. Pueden tener una carga positiva total .
Los polímeros adecuados incluyen, pero no se limitan a: un poli (ácido acrílico) , un poli (sulfonato de estireno) ; una carboximetilcelulosa (CMC); un poli (alcohol vinílico) ; un poli (óxido de etileno) ; un poli (vinilpirrolidona) ; un dextrano; un poli (alcohol vinilpirolidona-covinil acetato-covinílico) . Un polímero preferido es una poli (vinilpirrolidinona) . La cantidad de polímero para formar las partículas puede ser entre 2-75% en peso por ejemplo 10-60 % en peso de 20-60% en peso.
Los reticuladores adecuados pueden incluir un disulfuro y/o cetal. Por ejemplo, el reticulador puede comprender poli (epsilon-caprolactona) -b-tetraetileno glicol-b-poli (epsilon-capro-lactona) dimetacrilato, poli (epsilon-caprolactona) -b-poli (etilenglicol) -b-poli (epsilon-caprolactona) dimetilacrilato, poli (ácido láctico) -b-tetraetilenglico-b-poli (ácido láctico) dimetacrilato, poli (ácido láctico) -b-poli (etilenglicol) -b-poli (ácido láctico) dimetacrilato, poli (ácido glicólico) , b-tetraetilenglicol-b-poli (ácido glicólico) dimetacrilato, poli (ácido glicólico) -b-poli (etilenglicol) -b-poli (ácido glicólico) dimetacrilato, poli (epsilon-caprolactona) -b-tetraetilenglicol-b-poli (epsilon-caprolactona) diacrilato, poli (epsilon-caprolactona) -b-poli (etilenglicol) -b-poli (epsilon-caprolactona) diacrilato, poli (ácido láctico) -b-tetraetilenglicol-b-poli (ácido láctico) diacrilato, poli (ácido láctico) -b-poli (etilenglicol) -b-poli (ácido láctico) diacrilato, poli (ácido glicólico) -b-tetraetilenglicol-b-poli (ácido glicólico) diacrilato, poli (ácido glicólico) -b-poli (etilenglicol) -b-poli (ácido glicólico) diacrilato, silano, metacrilatos que contienen silicio, o dimetildi (metacriloiloxi-l-etoxi) silano. La cantidad de reticulador para formar las partículas puede ser entre 10-25% en peso por ejemplo 10-60% en peso, 20-60% en peso .
Los monómeros cargados pueden ser catiónicos o aniónicos. Estos incluyen, pero no se limitan a: cloruro de [2- (acriloiloxi) etil]trimetilamonio (AETMAC) y clorhidrato de 2-aminoetilmetacrilato (AEM-HCl) . La cantidad de monómero cargado para formar las partículas puede ser entre 2-75% en peso .
La cantidad de ARN para formar las partículas puede ser entre 0.25-20% en peso.
Una mezcla precuración dentro de un molde puede incluir un iniciador. Por ejemplo, el molde puede incluir < 1% en peso de iniciador, < 0.5% en peso de iniciador, ó _< 0.1% en peso de iniciador. Entre 0.1-0.5% de iniciador es útil. Los fotoiniciadores como DEAP y DPT son útiles por ejemplo para uso con curación ultravioleta.
La invención puede usar cualquiera de los materiales descritos en la Tabla 1 ó Ejemplos 1-15 de referencia 12, excepto que los componentes ARNSi en los mismos serán reemplazados por ARN de autorreplicacion como en la presente.
El ARN Partículas de la invención incluyen una molécula de ARN de autorreplicación la cual (a diferencia de siARN) codifica un inmunogen. Después de la administración in vivo de las partículas, se libera ARN a partir de las partículas y es traducida dentro de una célula para proporcionar el inmunogen in situ.
A diferencia de la referencia 13, el ARN en partículas de la invención es de autorreplicación. Una molécula de ARN de autorreplicación (replicón) puede, cuando se suministra a una célula vertebrada incluso sin ninguna proteína, llevar a la producción de ARN hijas múltiples por transcripción de si mismas (por medio de una copia antisentido la cual se genera de si misma) . Una molécula de ARN de autorreplicación es de esta forma típicamente una molécula de una cadena la cual puede ser traducida directamente después de suministro a una célula, y esta traducción proporciona una ARN polimerasa dependiente a ARN la cual entonces produce tanto transcripciones antisentido y sentido a partir de ARN suministrado. De esta forma el ARN suministrado lleva a la producción de ARN hijas múltiples. Estas ARN hijas, así como también transcripciones subgenómicas colineares, pueden ser traducidas por si mismas para proporcionar expresión in situ de un inmunogen codificado, o pueden ser transcritas para proporcionar transcripciones adicionales con el mismo sentido como el ARN suministrado las cuales son traducidas para proporcionar expresión in situ del inmunogen. Los resultados totales de esta secuencia de transcripciones es una amplificación muy grande en el número de los ARN de replicón introducidos y así el inmunogen codificado llega a ser un producto de polipéptido principal de las células .
Un sistema adecuado para lograr autorreplicación en esta forma es usar un replicón a base de alfavirus. Estos replicones son ARN de cadena + los cuales llevan a la traducción de una replicasa (o replicasa-transcriptasa) después de suministro a una célula. La replicasa es traducida como una poliproteína la cual se autoescinde para proporcionar un complejo de replicación el cual crea copias de cadenas - genómicas del ARN suministrado por cadena +. Estas transcripciones de cadena - pueden por sí mismas ser transcritas para dar copias adicionales del ARN progenitor de cadena + y también para dar una transcripción subgenómica la cual codifica el inmunogen. La traducción de la transcripción subgenómica de esta forma lleva a expresión in situ del inmunogen por la célula infectada. Los replicones alfavirus adecuados pueden usar una replicasa de un virus Sindbis, un virus forest Semliki, un virus de encefalitis equino del este, un virus de encefalitis equino de Venezuela, etc. Secuencias de virus del tipo mutante o silvestre pueden ser usadas, por ejemplo el mutante TC83 atenuado de VEEV ha sido usado en replicones (14) .
Una molécula de ARN de autorreplicación preferida de esta forma codifica (i) una ARN polimerasa dependiente a ARN la cual puede transcribir ARN a partir de la molécula de ARN de autorreplicación y (ii) un inmunogen. La polimerasa puede ser una alfavirus replicasa por ejemplo que comprende una o más de las proteínas de alfavirus nsPl, nsP2, nsP3 y nsP4.
Mientras que los genomas de alfavirus naturales codifican proteínas de viriones estructurales además de la poliproteína replicasa no estructural, se prefiere que las moléculas de ARN de autorreplicación de la invención no codifiquen proteínas estructurales de alfavirus. De esta forma un ARN de autorreplicación preferido puede llevar a la producción de copias de ARN genómicas de si mismas en una célula, pero no a la producción de viriones que contienen ARN. La molécula de ARN no puede perpetuarse por si misma en forma infecciosa. Las proteínas estructurales de alfa virus las cuales son necesarias para perpetuación en virus del tipo silvestre están ausentes de ARN de autorreplicación de la invención y su lugar es tomada por gen que codifica el inmunogen de interés, de tal forma que la transcripción subgenómica codifica el inmunogen más que las proteínas de virión alfa virus estructural.
De esta forma una molécula de ARN de autorreplicacion útil con la invención puede tener dos cuadros de lectura abierta. El primer cuadro de lectura abierta (5') codifica una replicasa; el segundo cuadro de lectura abierta ( 3 ' ) codifica un inmunogen. En algunas modalidades el ARN puede tener cuadros de lectura abierta adicionales (por ejemplo cadena abajo) por ejemplo para codificar además inmunogenes (ver posteriormente) o para codificar polipéptidos accesorios.
Una molécula de ARN de autorreplicacion preferida tiene una corona en el extremo 5" (por ejemplo una 7-metilguanosina) . Esta corona en el extremo puede incrementar la traducción in vivo del ARN. En algunas modalidades la secuencia 5' de la molécula de ARN de autorreplicacion debe ser seleccionada para asegurar la compatibilidad con la replicasa codificada.
Una molécula de ARN de autorreplicacion puede tener una cola 3 ' poli-A. Puede también incluir una secuencia de reconocimiento de polimerasa poli-A (por ejemplo AAUAAA) cerca de su extremo 3 ' .
Las moléculas de ARN de autorreplicacion pueden tener varias longitudes pero tienen típicamente 5000-25000 nucleótidos de largo por ejemplo 8000-15000 nucleótidos, ó 9000-12000 nucleótidos. De esta forma el ARN es más largo que el observado en suministro de ARNSi.
Las moléculas de ARN de autorreplicación típicamente serán de cadena sencilla. Los ARN de cadena sencilla pueden generalmente iniciar un efecto adyuvante por enlazar a TLR7 , TLR8 , ARN helicasas y/o PKR . El ARN suministrado en forma de doble cadena (ARNdc) puede enlazar a TLR3, y este receptor puede también ser accionado por ARNdc el cual es formado ya sea durante la replicación de un ARN de cadena sencilla o dentro de una estructura secundaria de un ARN de cadena sencilla.
El ARN de autorreplicación puede ser preparado convenientemente por transcripción in vi tro (IVT, por sus siglas en inglés) . IVT puede usar un templado (ADNc) y propagado en forma de plásmido en bacterias, o creado sintéticamente (por ejemplo por métodos de modificación de reacción de cadena polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) y síntesis de genes) . Por ejemplo, una ARN polimerasa dependiente a ADN (como el bacteriófago T7, T3 ó SP6 ARN polimerasas) puede ser usado para transcribir el ARN de autorreplicación a partir del templado de ADN. Un coronado en el extremo apropiado y reacciones de adición de poli A pueden ser usados como se requiere (aunque el poli A de replicón es codificado usualmente dentro del templado de ADN) . Estas ARN polimerasas pueden tener requerimientos astringentes para el nucleótido 5 " transcrito y en algunas modalidades estos requerimientos deben ser acoplados con los requerimientos de la replicasa codificada, para asegurar que el ARN transcrito por IVT puede funcionar eficientemente como un substrato para su replicasa autocodificada.
Como se discute en la referencia 15, el ARN de autorreplicación puede incluir (además de cualquier estructura de corona en el extremo 5') uno o más nucleótidos que tienen una nucleobase modificada. De esta forma el ARN puede comprender m5C (5-metilcitidina) , m5U (5-metiluridina) , m6A (N6-metiladenosina) , s2U (2-tiouridina) , Um (2'-0-metiluridina) , mlA (1-metiladenosina) ; m2A (2-metiladenosina) ; Am (2'-0-metiladenosina) ; ms2m6A (2-metiltio-N6 -metiladenosina) ; i6A (N- isopenteniladenosina) ; ms2i6A (2-metiltio-N6isopenteniladenosina) ; io6A (N6- (cis-hidroxiisopentenil) adenosina) ; ms2io6A (2 -metiltio-N6 - (cis-hidroxiisopentenil) denosina) ; g6A (N6-glicinilcarbamoiladenosina) ; t6A (N6-treonilcarbamoiladenosina) ; ms2t6A (2-metiltio-N6-treonilcarbamoiladenosina) ; m6t6A (N6 -metil-N6 -treonilcarbamoiladenosina) ; hn6A (N6-hidroxinorvalilcarbamoiladenosina) ; ms2hn6A (2-metiltio-N6-hidroxinorvalilcarbamoiladenosina) ; Ar(p) (2'-0-ribosiladenosina (fosfato)); I (inosina) ; mil (l-metilinosina) ; m'Im (1, 2 '-O-dimetilinosina) ; m3C (3-metilcitidina) ,· Cm (2T-0-metilcitidina) ; s2C (2-tiocitidina) ,-ac4C (N4-acetilcitidina) ; f5C (5-fonilcitidina) ; m5Cm (5,2-0-dimetilcitidina) ; ac4Cra (N4acetil2T0metilcitidina) ; k2C (lisidina) ; mlG ( 1-metilguanosina) ; m2G (N2 -metilguanosina) ; m7G (7-raetilguanosina) ; Gm (2' -O-metilguanosina) ; m22G (N2,N2-dimetilguanosina) ; m2Gm (N2 , 2 ' -O-dimetilguanosina) ; ra22Gm (N2 , N2 , 2 ' -O- trimetilguanosina) ; Gr(p) (2'-0-ribosilguanosina (fosfato) ) ; y (wibutosina) ; o2yW (peroxiwibutosina) ; OHyW (hidroxiwibutosina) ; OHyW* (hidroxiwibutosina bajomodificada) , iraG (wiosina) ; raimG (metilguanosina) , Q (queuosina) ; oQ (epoxiqueuosina) ; galQ (galtactosil-queuosina) ; manQ (manosil -queuosina) ; preQo (7-ciano-7-deazaguanosina) preQi (7-aminometil-7-deazaguanosina) ; G (arcaeosina) , D (dihidrouridina) m5Um (5, 2 ' -O-dimetiluridina) ; s4U (4 -tiouridina) ; m5s2U (5-metil- 2 -tiouridina) ; s2Um (2-tio-2 ' -O-metiluridina) ; acp3U (3- (3-amino-3-carboxipropil) uridina) ; ho5U (5-hidroxiuridina) mo5U (5-metoxiuridina) ; cmo5U (ácido uridin 5-oxiacético) ; mcmo5U (éster metilo del ácido uridin 5 -oxiacético) ; chm5U (5-(carboxihidroximetil) uridina) ) ; mchm5U (éster metilo de 5-(carboxihidroximetil) uridina) mcm5U ( 5-metoxicarbonil metiluridina) ; mcm5Um (S-metoxicarbonilmetil-2-?-metiluridina) ; mcm5s2U ( 5 -metoxicarbonilmetil-2 -tiouridina) ; nm5s2U (5-aminometil-2-tiouridina) ; mnm5U (5-metilaminometiluridina) ; mnm5s2U (5-metilaminometil-2-tiouridina) ; mnm5se2U (5-metilaminometil-2-selenouridina) ; ncm5U (5 -carbamoilmetiluridina) ; ncm5Um (5-carbamoilmetil-2 '- O-metiluridina) ; cmnm5U (5-carboximetilarainometiluridina) ; cnmm5Um (5-carboximetilaminometil-2-L-0-raetiluridina) ; cmnm5s2U (5-carboximetilaminometil-2- tiouridina) ; m62A (N6,N6-dimetiladenosina) ; Tm (2 ' -O-metilinosina) ; m4C (N4-metilcitidina) ; m4Cm (N4 , 2-O-dimetilcitidina) ; hm5C (5-hidroximetilcitidina) ; m3U (3-metiluridina) ; cm5U (5-carboximetiluridina) ; m6Am (N6 , T-O-dimetiladenosina) ; rn62Am (N6,N6,0-2-trimetiladenosina) ; m2'TG (N2 , 7-diraetilguanosina) ; m2'2'7G (N2,N2, 7-trimetilguanosina) ; m3Um (3,2T-0-dimetiluridina) ; m5D (5-metildihidrouridina) f5Cm (5-formil-2'-0-metilicitidina) ; mlGm ( 1 , 2 ' -O-dimetilguanosina) ; m'Am (1, 2-O-dimetiladenosina) irinometiluridina) ; tm5s2U (S-taurinometil-2-tiouridina) ) ; imG-14 (4-demetilguanosina) ; imG2 (isoguanosina) ; ó ac6A (N6-acetiladenosina) ; hipoxantina, inosina, 8-oxo-adenina, derivados 7 -substituidos de los mismos, dihidrouracilo, pseudouracilo, 2 - tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-aminouracilo, 5- (C1-C6) -alquiluracilo, 5-metiluracilo, 5- (C2-C6) -alqueniluracilo, 5-(C2-C6)-alquiniluracilo, 5- (hidroximetil) uracilo, 5 -clorouracilo, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-hidroxicitocina, 5- (C1-C6) -alquilcitocina, 5 -metilcitocina, 5- (C2-C6) -alquenilcitocina, 5- (C2-C6) -alquinilcitocina, 5-clorocitocina, 5-fluorocitocina, 5-bromocitocina, N2 -dimetilguanina, 7-deazaguanina, 8-azaguanina, 7-deaza-7-substituido guanina, 7-deaza-7- (C2-C6) alquinilguanina, 7 -deaza- 8 -substituido guanina, 8-hidroxiguanina, 6-tioguanina, 8-oxoguanina, 2-arainopurina, 2-amino-6-cloropurina, 2 , 4 -diaminopurina, 2,6-diaminopurina, 8-azapurina, 7-deazapurina substituida, purina 7-deaza-7-substituida, purina 7-deaza-8-substituida, o un nucleótido abásico. Por ejemplo, un ARN de autorreplicación puede incluir una o más nucleobases de pirimidina modificada, como residuos de pseudouridina y/o 5 -metilcitocina . En algunas modalidades, sin embargo, el ARN incluye nucleobases no modificadas, y puede incluir nucleótidos no modificados es decir todos los nucleótidos en el ARN son ribonucleótidos estándar A, C, G y U (excepto para cualquier estructura de corona en el extremo 5", el cual puede incluir una 7'-metilguanosina) . En otras modalidades, el ARN puede incluir una corona en el extremo 5' que comprende una 7'-metilguanosina, y el primer 1, 2 ó 3 5 'ribonucleótidos pueden ser metilados en la posición 2' de la ribosa.
Un ARN usado con la invención idealmente incluye solamente enlaces de fosfodiéster entre nucleósidos, pero en algunas modalidades puede contener enlaces de fosforamidato, fosforotioato, y/o metilfosfonato .
La cantidad de ARN por partícula puede variar, y el número de moléculas de ARN de autorreplicación individuales por partícula puede depender de las características de la partícula que es usada. En general, una partícula puede incluir de 1-500 moléculas de ARN. Para un liposoma el número de moléculas de ARN es típicamente < 50 por liposoma por ejemplo <20, <10, <5 ó 1-4. Para una micropartícula polimérica el número de moléculas de ARN dependerá del diámetro de partícula pero puede ser < 50 por partícula (por ej . <20, <10, <5, ó 1-4) o de 50-200 por partícula. Idealmente, una partícula incluye menos de 10 diferentes especias de ARN por ejemplo 5, 4, 3, ó 2 diferentes especias; más preferentemente, una partícula incluye una especie de ARN sencilla es decir todas las moléculas de ARN en la partícula tienen la misma secuencia y misma longitud.
El inmunogen Las moléculas de ARN de autorreplicación usadas con la invención codifican un inmunogen de polipéptido. Después de la administración de las partículas el inmunogen es traducido in vivo y puede producir una respuesta inmunológica en el receptor. El inmunogen puede producir una respuesta inmunológica contra una bacteria, un virus, un hongo o un parásito (o, en algunas modalidades, contra un alérgeno; y en otras modalidades, contra un antígeno de tumor) . La respuesta inmunológica puede comprender una respuesta anticuerpo (usualmente que incluye IgG) y/o una respuesta inmunológica mediada por células. El inmunogen de polipéptido producirá típicamente una respuesta inmunológica la cual reconoce el polipéptido bacteriano, viral, fúngico o parásito correspondiente (o alérgeno o tumor) , pero en algunas modalidades el polipéptido puede actuar como un mimotopo para producir una respuesta inmunológica la cual reconoce un sacárido bacteriano, viral, fúngico o parásito. El inmunogen será típicamente un polipéptido superficial por ejemplo una adhesina, una hemaglutinina, una glicoproteína de cubierta, una glicoproteína de pitón, etc.
Las moléculas de AR de autorreplicación pueden codificar un inmunogen de polipéptido simple o polipéptidos múltiples . Los inmunogenes múltiples pueden ser presentados como un inmunogen de polipéptido sencillo (polipéptido de fusión) o como polipéptidos separados. Si los inmunogenes son expresados como polipéptidos separados entonces uno o más de estos pueden ser proporcionados con un IRES cadena arriba o un elemento de promotor viral adicional. Alternativamente, pueden ser expresados inmunogenes múltiples a partir de una poliproteína que codifica inmunogenes individuales fusionados a una proteasa autocatalítica corta (por ejemplo proteína 2A de virus de enfermedad de pie a boca), o como inteinas.
A diferencia de las referencias 1 y 16, el ARN codifica un inmunogen. Para evitar la duda, la invención no comprende ARN el cual codifica una luciferasa de luciérnaga o la cual codifica una proteína de fusión de ß-galactosidasa de E. coli o la cual codifica una proteína fluorescente verde (GFP, por sus siglas en inglés) . También, el ARN no es ARN de timo de ratón total .
En algunas modalidades el inmunogen produce una respuesta inmunológica contra una de estas bacterias.
Neisseria meningitidis: los inmunogenes útiles incluyen, pero no se limitan a, proteínas de membrana como adhesinas, autotransportadores, toxinas, proteínas de adquisición de hierro, y proteína de enlace del factor H. Una combinación de tres polipéptidos útiles es descrita en la referencia 17.
Streptococcus pneumoniae : los inmunogenes de polipéptido útiles son descritos en la referencia 18. Estos incluyen, pero no se limitan a, la subunidad de RrgB pilus, el precursor de beta-n-acetil-hexosaminidasa (spr0057) , spr0096, proteína de estrés general GSP-781 (spr2021, SP2216), serina/treonina cinasa StkP (SP1732), y adhesina superficial de neumococo PsaA.
Streptococcus pyogenes: inmunogenes útiles incluyen, pero no se limitan a, los polipéptidos descritos en las referencias 19 y 20.
Moraxella catarrhalis Bordetella pertussis: los inmunogenes de pertussis útiles incluyen, pero no se limitan a, toxina de pertussis o toxoide (PT, por sus siglas en inglés) , hemaglutinina filamentosa (FHA, por sus siglas en inglés) , pertactina, y aglutinogenos 2 y 3.
Staphylococcus aureus: los inmunogenes útiles incluyen, pero no se limitan a, los polipéptidos descritos en la referencia 21, como una hemolisina, esxA, esxB, proteína de enlace de ferricromo (sta006) y/o la lipoproteína staOll.
Clostridium tetani: el inmunogen típico es toxoide tetánico.
Cornynebacterium diphtheriae: el inmunogen típico es toxoide de difteria.
Haemophilus influenzae: los inmunogenes útiles incluyen, pero no se limitan a, los polipéptidos descritos en las referencias 22 y 23.
Pseudomonas aeruginosa Streptococcus agalactiae .- los inmunogenes útiles incluyen, pero no se limitan a, los polipéptidos descritos en la referencia 19.
Chlamydia trachomatis : los inmunogenes útiles incluyen, pero no se limitan a, PepA, LcrE, ArtJ, DnaK, CT398, similar a OmpH, L7/L12, OmcA, AtoS , CT547, Eno, HtrA, y MurG (por ejemplo como se describe en la referencia 24. LcrE [25] y HtrA [26] son dos inmunogenes preferidos.
Chlamydia pneumoniae: los inmunogenes útiles incluyen, pero no se limitan a, los polipéptidos descritos en la referencia 27.
Helicobacter pylori: inmunogenes útiles incluyen, pero no se limitan a, CagA, VacA, NAP, y/o ureasa [28].
Escherichia coli: inmunogenes útiles incluyen, pero no se limitan a, inmunogenes derivados de E. coli enterotoxigénico (ETEC, por sus siglas en inglés) , E. coli enteroagregativo (EaggEC) , E. coli de adhesión difusa (DAEC, por sus siglas en inglés) , E. coli enteropatogénico (EPEC, por sus siglas en inglés) , E. coli patogénico extraintestinal (ExPEC) y/o E. coli enterohemorrágico (EHEC, por sus siglas en inglés) . Cepas de ExPEC incluyen E. coli uropatogénica (UPEC, por sus siglas en inglés) y E. coli asociado a meningitis/sepsis (MNEC, por sus siglas en inglés). Los inmunogenes de polipéptido de UPEC útiles son descritos en las referencias 29 y 30. Los inmunogenes de MNEC útiles son descritos en la referencia 31. Un inmunogen útil para varios tipos de E. coli es AcfD [32].
Bacillus anthracis Yersinia pestis: los inmunogenes útiles incluyen, pero no se limitan a, aquellos descritos en las referencias 33 y 34.
Staphylococcus epidermis Clostridium perfringens o Clostridium botulinums Legionella pneumophila Coxiella burnetii Brúcela, tal como B. abortus, B. canis, B. melitensis, B. neotomae, B. ovis, B.suis, B. pinnipediae.
Francisella, como F. novicida, F. philomiragia, F. tularensis .
Neisseria gonorrhoeae Treponema pallidum Haemophilus ducreyi Enterococcus faecalis o Enterococcus faecium Staphylococcus saprophyticus Yersinia enterocolitica Mycobacterium tuberculosis Rickettsia ? Listeria onocytogenes \ Vibrio cholerae \ Salmonella typhi ? Borrelia burgdorferi j i Porpüyronjonas gingivalis j Klebsiella \ i En algunas modalidades el inmunogen produce una i i I respuesta mmunologica contra uno de estos virus: i Orthomyxovirus : los inmunogenes útiles pueden ser de un virus de influenza A, B ó C, como la hemaglutinina, neuraminidasa, o proteínas M2 de matriz. Donde el inmunogen es de un virus de influenza A puede ser de cualquier subtipo por ejemplo Hl, H2 , H3 , H4 , H5, H6, H7 , H8 , H9, H10, Hll, H12, H13, H14, H15 ó H16.
Virus de Paramyxoviridae : los inmunogenes virales incluyen, pero no se limitan a, aquellos derivados de pneumovirus (por ejemplo virus sincicial respiratorio, RSV) , rubulavirus (por ejemplo, virus de paperas) , paramixovirus (por ejemplo virus de parainfluenza) , Metapneumovirus y Morbilivirus (por ejemplo sarampión) .
Poxviridae: inmunogenes virales incluyen, pero no se limitan a, aquellos derivados de Orthopoxvirus como Varióla vera, incluyendo pero no limitado a, Varióla major y Varióla miñor.
Picornavirus: los inmunogenes virales incluyen, pero no se limitan a, aquellos derivados de Picornavirus, como enterovirus, Rinovirus, Heparnavirus, Cardiovirus y Aftovirus . En una modalidad, el enterovirus es un poliovirus por ejemplo poliovirus del tipo 1, tipo 2 y/o tipo 3. En otra modalidad, el enterovirus es un enterovirus EV71. En otra modalidad, el enterovirus es un virus coxsackie A o B.
Bunyavirus: Los inmunogenes virales incluyen, pero no se limitan a: aquellos derivados de un Orthobunyavirus, como el virus de encefalitis de California, un Phlebovirus, como virus de fiebre del valle de Rift o un Nairovirus, como virus de fiebre hemorrágica Crimean-Congo.
Heparnavirus: los inmunogenes virales incluyen, pero no se limitan a, aquellos derivados de un Heparnavirus, como virus de hepatitis A (HAV, por sus siglas en inglés) .
Filovirus : los inmunogenes virales incluyen, pero no se limitan a, aquellos derivados de un filovirus, como el virus del Ebola (que incluye virus de Zaire, de la costa Ivory, Reston o Sudan) , o un virus Marburg.
Togavirus: los inmunogenes virales incluyen, pero no se limitan a, aquellos derivados de un Togavirus, como un Rubivirus, un Alfavirus, o un Arterivirus. Esto incluye virus de rubéola.
Flavivirus: los inmunogenes virales incluyen, pero no se limitan a, aquellos derivados de un Flavivirus, como virus de encefalitis transportada en garrapata ( BE, por sus siglas en inglés) , virus del dengue (tipos 1, 2, 3 ó 4) , virus de fiebre amarilla, virus de encefalitis Japonesa, virus del bosque de Kyasanur, virus de encefalitis del Nilo Occidental, virus de encefalitis de St. Louis, virus de encefalitis de primavera verano de rusia, virus de encefalitis de Powassan.
Pestivirus : Inmunogenes virales incluyen, pero no se limitan a, aquellos derivados de un Pestivirus, como diarrea viral bovina (BVDV, por sus siglas en inglés) , fiebre de cerdo clásica (CSFV, por sus siglas en inglés) o enfermedad de la frontera (BDV, por sus siglas en inglés) .
Hepadnavirus: Inmunogenes virales incluyen, pero no se limitan a, aquellos derivados de un Hepadnavirus, como virus de Hepatitis B. Una composición puede incluir antigeno superficial de virus de hepatitis B (HbsAg, por sus siglas en inglés) .
Otros virus de hepatitis: Una composición puede incluir un inmunogen de virus de hepatitis C, virus de hepatitis delta, virus de hepatitis E, o virus de hepatitis G.
Rhabdovirus: Los inmunogenes virales incluyen, pero no se limitan a: aquellos derivados de un Rhabdovirus, como Lyssavirus (por ejemplo virus de rabia) y vesiculovirus (VSV, por sus siglas en inglés) .
Caliciviridae : Los inmunogenes virales incluyen, pero no se limitan a, aquellos derivados de Calciviridae , como virus de Norwalk (Norovirus) , y virus similares a Norwalk, como virus de Hawaii y virus de nieve de montaña.
Coronavirus: los inmunogenes virales incluyen, pero no se limitan a, aquellos derivados de un coronavirus SARS, bronquitis infecciosa aviaria (IBV, por sus siglas en inglés) , virus de hepatitis de ratón (MHV, por sus siglas en inglés) , y virus de gastroenteritis transmisible porcina (TGEV, por sus siglas en inglés) . El inmunogen de coronavirus puede ser un polipéptido de pitón.
Retrovirus.- Inmunogenes virales incluyen, pero no se limitan a, aquellos derivados de un Oncovirus, un Lentivirus (por ejemplo HIV-1 ó HIV-2) o un Spumavirus .
Reovirus : inmunogenes virales incluyen, pero no se limitan a, aquellos derivados de un Ortoreovirus , un rotavirus , un Orbivirus o un Coltivirus.
Parvovirus: Inmunogenes virales incluyen, pero no se limitan a, aquellos derivados de Parvovirus B19.
Virus Herpes: Inmunogenes virales incluyen, pero no se limitan a, aquellos derivados de un virus de herpes humano, como, por la forma de ejemplo solamente, virus de herpes simple (HSV, por sus siglas en inglés) (por ejemplo HSV del tipo 1 y 2) , virus de Varicela zoster (VZV, por sus siglas en inglés) , virus de Epstein-Barr (EBV, por sus siglas en inglés) , citomegalovirus (CMV, por sus siglas en inglés) , virus de herpes humano 6 (HHV6, por sus siglas en inglés), virus del herpes humano 7 (HHV7, por sus siglas en inglés), y virus del herpes humano 8 (HHV8, por sus siglas en inglés) .
Papovavirus: los inmunogenes virales incluyen, pero no se limitan a, aquellos derivados de papilomavirus y poliomavirus . Los papilomavirus (humanos) pueden ser del serotipo 1, 2, 4, 5, 6, 8, 11, 13, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 41, 42, 47, 51, 57, 58, 63 ó 65 por ejemplo de uno o más serotipos 6, 11, 16 y/o 18.
Adenovirus: los inmunogenes virales incluyen aquellos derivados de adenovirus serotipo 36 (Ad-36) .
¦En algunas modalidades, el inmunogen produce una respuesta inmunológica contra un virus el cual infecta pescado, como: virus de anemia de salmón infeccioso (ISAV, por sus siglas en inglés) , virus de enfermedad pancreática de salmón (SPDV, por sus siglas en inglés) , virus de necrosis pancreática infecciosa (IPNV, por sus siglas en inglés) , virus de pescado gato de canal (CCV, por sus siglas en inglés) , virus de enfermedad de linfocistis de pescado (FLDV, por sus siglas en inglés) , virus de necrosis hematopoyética infecciosa (IHNV, por sus siglas en inglés) , virus de herpes koi, virus similar a salmón picorna (también conocido como virus similar a picorna de salmón atlántico) , virus de salmón encerrado (LSV, por sus siglas en inglés) , rotavirus de salmón del atlántico (ASR, por sus siglas en inglés) , virus de enfermedad de trucha fresa (TSD, por sus siglas en inglés) , virus de tumor de salmón coho (CSTV, por sus siglas en inglés) , o virus de septicemia hemorrágica viral (VHSV, por sus siglas en inglés) .
Los inmunogenes fúngicos pueden ser derivados de Dermatophytres , incluyendo: Epidermop y on floccusum, Microsporum audouini, Microsporum canis, Microsporum distortum, Microsporum equinum, Microsporum gypsum, Microsporum nanum, Trichophyton concentricum, Trichophyton equinum, Trichophyton gallinae, Trichophyton gypseum, Trichophyton megnini, Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton quinckeanum, Trichophyton rubrum, Trichophyton schoenleini , Trichophyton tonsurans, Trichophyton verrucosu , T. verrucosum var. álbum, var. discoides, var . ochraceum, Trichophyton violaceum, y/o Trichophyton faviforme; o de Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus, Aspergillus níger, Aspergillus nidulans, Aspergillus terreus, Aspergillus sydowi, Aspergillus flavatus, Aspergillus glaucus, Blastoschizomyces capitatus, Candida albicans, Candida enolase, Candida tropicalis, Candida glabrata, Candida krusei, Candida parapsilosis, Candida stellatoidea, Candida kusei, Candida parakwsei, Candida lusitaniae, Candida pseudotropicalis, Candida guilliermondi , Cladosporium carrionii, Coccidioides immitis, Blastomyces dermatidis, Cryptococcus neoformans, Geotrichum clavatum, Histoplasma capsulatum, Klebsiella pneumoniae, Microsporidia, Encephalitozoon spp. , Septata intestinalis y Enterocytozoon bieneusit ; los menos comunes son Brachiola spp, Microsporidium spp., Nosema spp., Pleistophora spp., Trachipleistophora spp. , Vittaforma spp Paracoccidioides brasiliensis, Pneumocystis carinii, Pytriumn insidiosum, Pityrosporu ovale, Sacharomyces cerevisae, Saccharomyces boulardii , Saccharomyces pombe, Scedosporium apiosperum, Sporothrix schenckii, Trichosporon beigelii, Toxoplasma gondii, Penicilliu marneffei, Malassezia spp. , Fonsecaea spp., Wangiella spp., Sporothrix spp., Basidiobolus spp., Conidiobolus spp. , Rhizopus spp, Mucor spp. , Absidia spp, Mortierella spp, Cunninghamella spp, Saksenaea spp, Alternaría spp, Curvularia spp, Helminthosporium spp, Fusarium spp, Aspergillus spp, Penicillium spp, Monolinia spp, Rhizoctonia spp, Paecilomhyces spp, Pithomyces spp, y Cladosporium spp.
En algunas modalidades el inmunogen produce una respuesta inmunológica contra un parásito a partir del género Plasmodiu , como P. falciparum, P. vivax, P. malariae o P. ovale. De esta forma la invención puede ser usada para inmunizar contra malaria. En algunas modalidades el inmunogen produce una respuesta inmunológica contra un parásito de la familia Caligidae, particularmente aquellas de los géneros Lepeophtheirus y Caligus, por ejemplo piojos marinos como Lepeophtheirus salmonis o Caligus rogercresseyi .
En algunas modalidades el inmunogen produce una respuesta inmunológica contra: alérgenos de polen (alérgenos de polen de árboles, hierba, mala hierba y pasto) ; alérgenos de insectos o arácnidos (alérgenos de inhalante, saliva y veneno por ejemplo alérgenos de termitas, cucarachas y alérgenos de mosquitos, alérgenos de veneneo de himenoptera) ; alérgenos de cabello animal y caspa (a partir de perro, gato, caballo, rata, ratón, etc) , y alérgenos de alimentos (por ejemplo una gliadina) . Alérgenos de polen importantes de árboles, pastos y hierbas son de origen de órdenes taxonómicos de Fágales, Oléales, Piñales y platanaceae que incluyen, pero no se limitan a, abedul (Betula) , aliso (Alnus) , avellano (Corylus) , carpe (Carpinus) y oliva (Olea) , cedro (Cryptomeria y Juniperus) , platanar (Platanus) , el orden de Poales que incluyen pastos del género Lolium, Phleum, Poa, Cynodon, Dactylis, Holcus, Phalaris, Sécale y Sorghum, los órdenes de Asterales y Urticales que incluyen hierbas del género Ambrosia, Artemisia y Parietaria. Otro alérgenos de inhalación importantes son aquellos de termitas de polvo de casa del género Dermatophagoides y Euroglyphus, termitas de almacenamiento por ej . Lepidoglyphis , Glycyphafus y Tyrophagus, aquellos de cucarachas, mosquitos y moscas, por ejemplo Blatella, Periplaneta, Chironomus y Ctenocepphalides, y aquellos de mamíferos como gato, perro y caballo, alérgenos de veneno que incluyen los que se originan de insectos que pican o penetrantes como aquellos del orden taxonómico de hymenoptera que incluye abejas (Apidae) , avispas (Vespidea y hormigas ( Formicoidae) .
En algunas modalidades el inmunogen es un antígeno de tumor seleccionado de: (a) antígenos de cáncer de testículos como NY-ESO-1, SSX2 , SCP1 así como también polipéptidos de la familia RAGE, BAGE, GAGE y MAGE, por ejemplo, GAGE- 1 , GAGE-2 , MAGE- 1 , MAGE-2 , MAGE-3 , MAGE- , MAGE- 5, MAGE- 6 y MAGE- 12 (los cuales pueden ser usados, por ejemplo, para manejar el melanoma, pulmón, cabeza y cuello. Tumores de NSCLC, mama, gastrointestinal y vejiga; (b) antígenos mutados, por ejemplo, p53 (asociado con varios tumores sólidos, por ejemplo, cáncer colorrectal, pulmón, cabeza y cuello) , p21/Ras (asociado con, por ejemplo, melanoma, cáncer pancreático y cáncer colorrectal) , CDK4 (asociado con, por ejemplo melanoma) , MUM1 (asociado con, por ejemplo melanoma) , caspasa-8 (asociado con, cáncer de cabeza y cuello) , CIA 0205 (asociado con, por ejemplo, cáncer de vejiga), HLA-A2-R1701, beta catenina (asociado con, por ejemplo, melanoma) , TCR (asociado con, por ejemplo, linfoma no de Hodgkins de células T) , BCR-abl (asociado con, por ejemplo leucemia mielogenosa crónica) , triosefosfato isomerasa, KIA 0205, CDC-27, y LDLR-FUT; (c) antígenos sobre expresados, por ejemplo, Galectina 4 (asociado con, por ejemplo, cáncer colorrectal) , Galectina 9 (asociado con, por ejemplo, enfermedad de Hodgkin) , proteinasa 3 (asociado con, por ejemplo, leucemia mielogenosa crónica) , WT 1 (asociado con, por ejemplo varias leucemias) , anhidrasa carbónica (asociada con, por ejemplo cáncer renal) , aldolasa A (asociado con, por ejemplo cáncer de pulmón) , PRAME (asociado con por ejemplo melanoma) , HER-2/neu (asociado con, por ej . cáncer de mama, colon, pulmón u ovárico) , mamaglobina, alfa-fetoproteina (asociada con, por ejemplo, hepatoma) , SA (asociado con, por ejemplo cáncer colorrectal) , gastrina (asociado con, por ejemplo cáncer pancreático y gástrico) , proteína catalítica de telomerasa, MUC-1 (asociado con, por ejemplo, cáncer de mama y ovárico) , G-250 (asociado con, por ej . carcinoma celular renal) , p53 (asociado con, por ejemplo, cáncer de mama, colon) y antígeno carcinoembriónico (asociado con, por ejemplo cáncer de mama, cáncer de pulmón y cánceres del tracto gastrointestinal como cáncer colorrectal) ; (d) antígenos compartidos, por ejemplo, antígenos de diferenciación de melanoma-melanocito como MART-1/Melan a, gplOO, MC1R, receptor de hormona estimulante de melanocitos, tirosinasa, proteína-1/TRPl relacionada a tirosinasa y proteína-2/TRP2 relacionada a tirosinasa (asociada con, por ejemplo, melanoma) , (e) antígenos asociados a próstata como PAP, PSA, PSMA, PSH-P1, PSM-P1, PSM-P2, asociados con por ejemplo cáncer de próstata; (f) idiotipos de inmunoglobulina (asociados con mieloma y linfornas de células B, por ejemplo) . En ciertas modalidades, los inmunogenes tumorales incluyen, pero no se limitan a, pl5, Hom/Mel-40, H-Ras, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IG , MYL-RAR, antígenos de virus Epstein Barr, EBNA, antígenos de papilomavirus humano (HPV, por sus siglas en inglés) , que incluyen E6 y E7, antígenos de virus de hepatitis B y C, antígenos de virus linfotrópico de células T humanas, TSP-180, pl85erbB2, pl80erbB-3, c-met, mn-23Hl, TAG-72-4, CA 19-9, CA 72-4, CAM 17.1, NuMa, -ras, pl6, TAGE, PSCA, CT7 , 43-9F, 5T4, 791 Tgp72, beta-HCG, BCA225, BTAA, Cal25, CA15-3 (CA 27.29\BCAA), CA 195, CA 242, CA-50, CAM43 , CD68\KP1, CO-029, FGF-5, Ga733 (EpCAM) , HTgp-175, M344, MA-50, MG7 -Ag, MOV18, NB/70K, NY-CO-1, RCAS1, SDCCAG16, TA-90 (proteína de enlace a Mac-2/proteina asociada a ciclofilinaC) , TAAL6 , TAG72, TLP, TPS y similares.
Composiciones Farmacéuticas Las partículas de la invención son útiles como componentes en composiciones farmacéuticas para inmunizar sujetos contra varias enfermedades. Estas composiciones incluirán típicamente un portador aceptable farmacéuticamente además de las partículas. Está disponible una discusión completa de portadores aceptables farmacéuticamente en la referencia 35.
Una composición farmacéutica de la invención puede incluir uno o más inmunopotenciadores de molécula pequeña. Por ejemplo, la composición puede incluir un agonista de TLR2 (por ejemplo Pam3CSK4) , un agonista de TLR4 (por ejemplo un fosfato de aminoalquilglucosaminida, como E6020) , un agonista de TLR7 (por ejemplo imiquimod) , un agonista de TLR8 (por ejemplo resiquimod) y/o un agonista de TLR9 (por ejemplo IC31) . Cualquier agonista tiene idealmente un peso molecular de <2000 Da. Donde se encapsula un ARN, en algunas modalidades los agonistas son también encapsulados con el ARN, pero en otras modalidades son no encapsulados. Donde se adsorbe un ARN a una partícula, en algunas modalidades los agonistas son también adsorbidos con el ARN, pero en otras modalidades no son adsorbidos.
Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden incluir las partículas en agua simple (por ejemplo w.f.i.) o en un amortiguador por ejemplo un amortiguador de fosfato, un amortiguador Tris, un amortiguador borato, un amortiguador succinato, un amortiguador de histidina, o un amortiguador de citrato. Las sales de amortiguador serán típicamente incluidas en el intervalo de 5-20 mM.
Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden tener un pH entre 5.0 y 9.5 por ej emplo entre 6.0 y 8.0.
Las composiciones de la invención pueden incluir sales de sodio (por ej . Cloruro de sodio) para dar tonicidad. Una concentración de 10 + 2 mg/ml de NaCl es típica por ejemplo aproximadamente 9 mg/ml.
Las composiciones de la invención pueden incluir quelantes de ion metálico. Estos pueden prolongar la estabilidad de ARN por remover iones los cuales pueden acelerar hidrólisis de fosfodiéster . De esta forma una composición puede incluir uno o más de EDTA, EGTA, BAPTA, ácido pentético, etc., Los quelantes están presentes típicamente entre 10-500 µ , por ejemplo 0.1 mm. Una sal de citrato, como citrato de sodio, puede también actuar como un quelante, mientras que también proporciona ventajosamente actividad de amortiguamiento.
Composiciones farmacéuticas de la invención pueden tener una osomolaridad de entre 200 mOsm/kg y 400 mOsm/kg, por ejemplo entre 240-360 mOsm/kg, o entre 290-310 mOsm/kg.
Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden incluir uno o más conservadores, como tiomersal o 2-fenoxietanol . Se prefieren composiciones libres de mercurio, y pueden ser preparadas vacunas libres de conservadores.
Las composiciones farmacéuticas de la invención son preferentemente estériles.
Las composiciones farmacéuticas de la invención son preferentemente no pirogénicas por ejemplo que contienen <1 EU (unidad de endotoxina, una medición estándar) por dosis, y preferentemente < 0.1 EU por dosis.
Composiciones farmacéuticas de la invención son preferentemente libres de gluten.
Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden ser preparadas en una forma de dosis de unidad. En algunas modalidades una dosis de unidad puede tener un volumen de entre 0.1-1.0 mi por ejemplo aproximadamente 0.5 mi.
Las composiciones pueden ser preparadas como inyectables, ya sea como soluciones o suspensiones. La composición puede ser preparada para administración pulmonar por ejemplo por un inhalador, usando una aspersión fina. La composición puede ser preparada para administración nasal, aural u ocular por ejemplo como aspersiones o gotas. Los inyectables para administración intramuscular son típicas.
Las composiciones comprenden una cantidad efectiva inmunológicamente de partículas, así como también cualesquiera otros componentes, como se necesite. Por "cantidad efectiva inmunológicamente", se entiende que la administración de esa cantidad a un individuo, ya sea en una dosis sencilla o como parte de una serie, es efectiva para tratamiento o prevención. Esta cantidad varía dependiendo de la condición de salud y física del individuo a ser tratado, edad, el grupo taxonómico del individuo a ser tratado (por ejemplo, primate no humano, primate, etc.), la capacidad del sistema inmunológico del individuo para sintetizar anticuerpos, el grado de protección deseada, la formulación de la vacuna, la evaluación del doctor que trata la situación médica y de otros factores relevantes. Se espera que la cantidad caerá en un intervalo relativamente amplio que puede ser determinado a través de pruebas de rutina. La partícula y contenido de ARN de composiciones de la invención serán generalmente expresadas en términos de la cantidad de ARN por dosis. Una dosis preferida tiene < 100 µg de ARN (por ejemplo de 10-100 µg, como aproximadamente 10 µg, 25 µg, 50 µg, 75 µg ó 100 µg) , pero la expresión puede ser vista en niveles mucho menores por ejemplo 1 µg/dosis, < 100 ng/dosis, < 10 ng/dosis, < 1 ng/dosis, etc.
La invención también proporciona un dispositivo de suministro (por ejemplo jeringa, nebulizador, aspersor, inhalador, parche dérmico, etc.) que contiene una composición farmacéutica de la invención. Este dispositivo puede ser usado para administrar la composición a un sujeto vertebrado.
Las partículas de la invención no incluyen ribosomas .
Métodos de Tratamiento y Usos Médicos En contraste a las partículas descritas en la referencia 16, las partículas y composiciones farmacéuticas de la invención son para uso in vivo para producir una respuesta inmunologica contra un inmunogen de interés .
La invención proporciona un método para incrementar una respuesta inmunologica en un vertebrado que comprende la etapa de administrar una cantidad efectiva de una partícula o composición farmacéutica de la invención. La respuesta inmunologica es preferentemente protectora y preferentemente implica anticuerpos y/o inmunidad mediada por células . El método puede originar una respuesta de refuerzo.
La invención también proporciona una partícula o composición farmacéutica de la invención para uso en un método para incrementar una respuesta inmunologica en un vertebrado .
La invención también proporciona el uso de una partícula de la invención en la fabricación de un medicamento para originar una respuesta inmunologica en un vertebrado.
Por originar una respuesta inmunologica en el vertebrado por estos usos y métodos, el vertebrado puede ser protegido contra varias enfermedades y/o infecciones por ejemplo contra enfermedades bacteriales y/o virales como se discute anteriormente. Las partículas y composiciones son inmunogénicas, y son más preferentemente composiciones de vacuna. Las vacunas de acuerdo a la invención pueden ser ya sea profilácticas (es decir evitar infección) o terapéuticas (es decir tratar infección) , pero típicamente serán profilácticas.
El vertebrado es preferentemente un mamífero, como un mamífero humano o veterinario grande (por ejemplo caballos, ganado, venados, cabras, cerdos) . Donde la vacuna es para uso profiláctico, el humano es preferentemente un niño (por ejemplo bebé o un infante) o un adolescente, donde la vacuna es para uso terapéutico, el humano es preferentemente un adolescente o un adulto. Una vacuna propuesta para niños puede también ser administrada a adultos por ejemplo para evaluar la seguridad, dosis, inmunogenicidad, etc.
Las vacunas preparadas de acuerdo a la invención pueden ser usadas para tratar tanto niños y adultos. De esta forma un paciente humano puede ser menor a 1 año de edad, menor a 5 años de edad, 1-5 años de edad, 5-15 años de edad, 15-55 años de edad, ó por lo menos 55 años de edad. Pacientes preferidos para recibir las vacunas son los más viejos (por ejemplo > 50 años de edad, > 60 años de edad, y preferentemente _> 65 años) , los jóvenes (por ejemplo < 5 años de edad) , pacientes hospitalizados, trabajadores de la salud, servicio armado y personal militar, mujeres preñadas, la enfermedad crónica, o pacientes inmunodeficientes . Las vacunas no son adecuadas únicamente para estos grupos, sin embargo, y pueden ser usados más generalmente en una población.
Composiciones de la invención generalmente serán administradas directamente a un paciente. El suministro directo puede ser realizado por inyección parental (por ejemplo subcutánea, intraperitoneal , intravenosa, intramuscular, intradérmicamente o al espacio intersticial de un tejido; a diferencia de la referencia 1, inyección intraglosal no es usada típicamente con la presente invención) . Las rutas de suministro alternativas incluyen administración rectal, oral (por ejemplo tableta, aspersión) , bucal, sublingual, vaginal, tópica, transdérmica o transcutánea, intranasal, ocular, aural, pulmonar u otra administración mucosal. La administración intradérmica e intramuscular son dos rutas preferidas. La inyección puede ser por medio de una aguja (por ejemplo una aguja hipodérmica) , pero puede ser usada alternativamente inyección libre de aguja. Una dosis intramuscular típica es 0.5 mi.
La invención puede ser usada para producir inmunidad sistémica y/o mucosal, preferentemente para producir una inmunidad sistémica y/o mucosal mejorada.
La dosis puede ser por un programa de dosis sencilla o un programa de dosis múltiple. Las dosis múltiples pueden ser usadas en un programa de inmunización primaria y/o en un programa de inmunización de refuerzo. En un programa de dosis múltiple las varias dosis pueden ser dadas por las mismas o diferentes rutas por ejemplo un cebo parental y refuerzo mucosal, un cebo mucosal y reforzador parental, etc. Las dosis múltiples serán típicamente administradas por lo menos con 1 semana de separación (por ejemplo aproximadamente 2 semanas, aproximadamente 3 semanas, aproximadamente 4 semanas, aproximadamente 6 semanas, aproximadamente 8 semanas, aproximadamente 10 semanas, aproximadamente 12 semanas, aproximadamente 16 semanas, etc.). En una modalidad, las dosis múltiples pueden ser administradas aproximadamente 6 semanas, 10 semanas y 14 semanas después del nacimiento, por ejemplo en una edad de 6 semanas, 10 semanas y 14 semanas, como se usa con frecuencia en programa expandido en inmunización ("EPI", por sus siglas en inglés) de la Organización Mundial de la Salud. En una modalidad alternativa, dos dosis primarias son administradas aproximadamente cada dos meses, por ejemplo aproximadamente 7, 8 ó 9 semanas aparte, seguido por una o más dosis de refuerzo aproximadamente 6 meses a 1 año después de la segunda dosis primaria, por ejemplo aproximadamente 6, 8, 10 ó 12 meses después de la segunda dosis primaria. En una modalidad adicional, se administran tres dosis primarias aproximadamente con dos meses de separación, por ejemplo aproximadamente 7, 8 ó 9 meses de separación, seguido por una o más dosis de refuerzo aproximadamente 6 meses a 1 año después de la tercera dosis primaria, por ejemplo, aproximadamente 6, 8, ó 12 meses después de la tercera dosis 5 primaria.
Modalidades Generales En algunas modalidades de la invención, el ARN incluye nucleótidos no modificados (ver anteriormente) . En otras modalidades el ARN puede incluir opcionalmente por lo 0 menos un nucleótido modificado, con la condición de que se requiera también una o más de las siguientes características (ya descritas anteriormente) .
A. Donde se suministra el ARN con un liposoma, el liposoma comprende DSDMA, DODMA, DLinDMA y/o DLenDMA.
S. Donde se encapsula el ARN en un liposoma, la porción hidrofílica de un lípido en el liposoma es PEGilado.
C. Donde se encapsula el ARN en un liposoma, por ló menos 80% por número de los liposomas tienen diámetros en el intervalo de 20-220 nm.
D. Donde se suministra el ARN con una micropartícula, la micropartícula es una micropartícula de polímero no tóxica y biodegradable .
E. Donde se suministra el ARN con una micropartícula, las micropartículas tienen un diámetro en el intervalo de 0.02 µp? 5 a 8 µp?.
F. Donde el ARN es suministrado con una micropartícula, por lo menos 80% en número de las micropartículas tienen un diámetro en el intervalo de 0.03-7 µp?.
G. Donde el ARN es suministrado con una micropartícula, la composición es liofilizada.
H. El ARN tiene una cola poli-A de 3', y el inmunogen puede producir una respuesta inmunológica in vivo contra una bacteria, un virus, un hongo o un parásito.
I. Se suministra el ARN en combinación con un quelante de ión metálico con un sistema de suministro seleccionado de (i) liposomas (ii) micropartículas de polímero no tóxico y biodegradable .
General La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique de otra forma, métodos convencionales de química, bioquímica, biología molecular, inmunología y farmacología, dentro de la experiencia de la técnica. Las técnicas son explicadas totalmente en la literatura. Ver, por ejemplo, referencias 36-42, etc.
El término "que comprende" comprende "que incluye" así como también "que consiste" por ejemplo una composición "que comprende" X puede consistir exclusivamente de X o puede incluir algo adicional por ejemplo X + Y.
El término "aproximadamente" en relación a un valor numérico x es opcional y significa, por ejemplo, x + 10%.
La palabra "substancialmente" no excluye "completamente" por ejemplo una composición la cual es "substancialmente libre" de Y puede ser completamente libre de Y. Donde sea necesario, la palabra "substancialmente" puede ser omitida de la definición de la invención.
Referencias a carga, a cationes, a aniones, a zwiteriones, etc, se toman en pH 7.
TLR3 es el receptor 3 tipo peaje. Es un receptor de extensión de membrana sencillo el cual juega un papel clave en el sistema inmunológico innato. Los agonistas TLR3 conocidos incluyen poli(I:C). "TLR3" es el nombre HGNC aprobado para el gen que codifica este receptor, y su único HGNC ID es HGNC : 11849. La secuencia RefSeq para el gen TLR3 humano es GI: 2459625.
TLR7 es el receptor 7 similar a peaje. Es un receptor de extensión de membrana simple el cual juega un papel clave en el sistema inmunológico innato. Los agonistas TLR7 conocidos incluyen por ejemplo imiquimod. "TLR7" es el nombre HGNC aprobado para el gen que codifica este receptor, y su único HGNC ID es HGNC: 15631. La secuencia RefSeq para el gen TLR7 humano es GI : 67944638.
TLR8 es el receptor 8 similar a peaje. Es un receptor de extensión de membrana simple el cual juega un papel clave en el sistema inmunológico innato. Los agonistas de TLR8 conocidos incluyen, por ejemplo resiquimod. "TLR8" es el nombre HGNC aprobado para el gen que codifica este receptor, y su HGNC ID es HGNC: 15632. La secuencia RefSeq para el gen TLR8 humano es GI: 20302165.
La familia del receptor como RIG-I ("RLR") incluye varias ARN helicasas las cuales juegan papeles clave en el sistema inmunológico innato [43]. RLR-1 (también conocido como RIG-I o gen inducible I por ácido retinoico) tiene dos dominios de recrutación innnata de caspasa cerca de su N-terminación. El nombre HGNC aprobado para el gen que codifica la RLR-1 helicasa es "DDX58" (para DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) polipéptido 58 de cuadro) y el único HGNC ID es HGNC: 19102. La secuencia RefSeq para el gen RLR-1 humano es GI: 77732514. RLR-2 (también conocido como MDA5 o gen 5 asociado a diferenciación de melanoma) tiene también dos dominios de recrutación de caspasa cerca de su N-terminación. El nombre HGNC aprobado para el gen que codifica la RLR- 2 helicasa es "IFIH1" (para interferon inducido con helicasa C dominio 1) y la HGNC ID única es HGNC: 18873. La secuencia RefSEq para el gen RLR-2 humano es GI: 27886567. RLR-3 (también conocido como LGP2 o laboratorio de genética y fisiología 2) no tiene dominios de recrutación de caspasa. El nombre HGNC aprobado para el gen que codifica la RLR- 3 helicasa es "DHX58" (para DEXH (Asp-Glu-X-His) polipéptido 58 de cuadro) y el único HGNC ID es HGNC: 29517. La secuencia RefSEq para el gen RLR-3 humano es GI : 149408121.
PKR es una proteína cinasa dependiente a ARN de doble cadena. Juega un papel principal en el sistema inmunológico. "EIF2AK2" (para factor 2 -alfa cinasa 2 de inicio de traducción eucariótico) es el nombre HGNC aprobado para el gen que codifica esta enzima, y su único HGNC ID es HGNC: 9437. La secuencia RefSEq para el gen PKR humano es GI:208431825.
Breve Descripción de las Figuras La Figura 1 muestra un gel con ARN teñido. Las bandas muestran (1) marcadores (2) replicón desnudo (3) replicón después del tratamiento con ARNasa (4) replicón encapsulado en liposoma (5) liposoma después del tratamiento con ARNasa (5) liposoma tratado con ARNasa entonces sometido a extracción con fenol/cloroformo.
La Figura 2 es una micrografía de electrones de l posomas .
La Figura 3 muestra expresión de proteínas (como unidades ligeras relativas, RLU) en los días 1, 3 y 6 después del suministro de ARN como un replicón empacado en virion (cuadrados) , ARN desnudo (triángulos) , o como micropartículas (circuios) .
La Figura 4 muestra un gel con ARN teñido. Las bandas muestran (1) marcadores (2) replicón desnudo (3) replicón encapsulado en liposoma (4) liposoma tratado con ARNasa entonces sometido a extracción con fenol/cloroformo.
La Figura 5 muestra expresión de proteína en los días 1, 3 y 6 después del suministro de ARN como replicón empacado en virión (cuadros) , como ARN desnudo (diamantes) o en liposomas (+=0.1 µg, x=l g) .
La Figura 6 muestra expresión de proteína en los días 1, 3 y 6 después del suministro de cuatro dosis diferentes de ARN encapsulado en liposoma.
La Figura 7 muestra títulos de IgG anti-F en animales que reciben replicón empacado en virión (VRP o VSRP) , 1 µg de ARN desnudo, y 1 µg de ARN encapsulado en liposoma .
La Figura 8 muestra títulos IgG anti-F en animales que reciben VRP, 1 µg de ARN desnudo, y 0.1 g g ó l µg de ARN encapsulado en liposoma.
La Figura 9 muestra títulos anticuerpo neutralizantes en animales que reciben VRP o ya sea 0.1 g ó 1 µg de ARN encapsulado en liposoma.
La Figura 10 muestra niveles de expresión después del suministro de un replicón como ARN desnudo (círculos) , ARN encapsulado en liposoma (triángulo y cuadro) , o como un lipoplex (triángulo invertido) .
La Figura 11 muestra títulos de IgG específicos a F (2 semanas después de una segunda dosis) después del suministro de un replicón como ARN desnudo (0.01-1 g) , ARN encapsulado en liposoma (0.01-10 g) , o empacado como un virión (VRP, 106 unidades infecciosas o IU) .
La Figura 12 muestra títulos de IgG específicos a F (círculos) y títulos PRNT (cuadros) después del suministro de un replicón como ARN desnudo (1 µg) , ARN encapsulado en liposoma (0.1 ó 1 µg) , o empacado como un virión (VRP, 106 ITU) . Títulos en ratones ingenuos son también mostrados. Las líneas sólidas muestran media geométrica.
La Figura 13 muestra producción de citocina intracelular después de la restimulación con péptidos sintéticos que representan los epitopos principales en la proteína F, 4 semanas después de una segunda dosis. El eje y muestra el % de citocina + de CD8+CD4-.
Las Figuras 14A-14B muestran títulos IgG específicos a F (títulos logi0 medios + desviación estándar) sobre 63 días (Figura 14A) y 210 días (Figura 14B) después de la inmunización de terneras. Las tres líneas son fácilmente distinguidas en el día 63 y son, de la parte inferior a la superior: control negativo PBS; ARN suministrado por liposoma; y el producto "triángulo 4".
La Figura 15 muestra títulos IgG de suero anti-VIH en respuesta a ARN desnudo ("ARN") o encapsulado en liposoma ("LNP"), o a ADN suministrado por electroporación en músculo.
La Figura 16 muestra títulos de IgG en 13 grupos de ratones. Cada círculo es un ratón individual, y líneas sólidas muestran medias geométricas. La línea horizontal punteada es el límite de detección del ensayo. Los grupos 13 son, a partir de izquierda a derecha, A a M como se describe posteriormente .
Las Figuras 17A-17B muestran (A) IL-6 y (B) IFNa (pg/ml) liberado por pDC. Hay cuatro pares de barras, a partir de izquierda a derecha; control: inmunizado con ARN+DOTAP; inmunizado con AR +lipofectamina; e inmunizado con ARN en liposomas. En cada par la barra negra es ratones del tipo silvestre, gris es mutante rsql .
Descripción Detallada de la Invención Replicones de ADN Varios replicones son usados posteriormente. En general estos se basan en un genoma alfavirus híbrido con proteínas no estructurales a partir de virus de encefalitis de equino de Venezuela (VEEV, por sus siglas en inglés) , una señal de empaque a partir del virus sindbis, y 3' UTR de virus sindbis o un mutante VEEV. El replicón tiene aproximadamente 10 kb de largo y tiene una cola poli-A.
El ADN de plásmido que codifica replicones de alfavirus (nombrado: pT7-mVEEV-FL-RSVF ó A317; pT7-mVEEV-SEAP ó A306; pSP6-VCR-GFP ó A50) sirve como un templado para síntesis de ARN in vitro. Los replicones contienen los elementos genéticos de alfa virus requeridos para replicación de ARN pero carecen de aquellos que codifican productos de genes necesarios para ensamble de partículas; las proteínas estructurales son en su lugar reemplazadas por una proteína de interés (ya sea un reportador como SEAP o GEP o un inmunogen como proteína RSV F de longitud completa) y por lo tanto los replicones son incapaces de inducir la generación de partículas infecciosas. Un promotor bacteriófago (T7 ó SP6) cadena arriba del ADNc de alfavirus facilita la síntesis del ARN de replicón in vitro y una ribozima de virus delta de hepatitis (HDV, por sus siglas en inglés) inmediatamente cadena abajo de la cola poli (A) genera el extremo 3' correcto a través de su actividad de autoescisión.
Después de la linearización del ADN de plásmido cadena abajo de la ribozima HDV con una endonucleasa de restricción adecuada, las transcripciones de corrida son sintetizadas in vitro usando ARN polimerasa dependiente a ADN derivado de bacteriófago T7 ó SP6. Las transcripciones son realizadas por 2 horas en 37°C en la presencia de 7.5 mM (ARN polimerasa de T7) ó 5 m m (ARN polimerasa de SP6) de cada uno de los trifosfatos de nucleósido (ATP, CTP, GTP y UTP) después de las instrucciones proporcionadas por el fabricante (Ambion) . Después de la transcripción el ADN templado es digerido con ADNasa TURBO (Ambion) . El ARN de replicón es precipitado con LiCl y reconstituido en agua libre de nucleasa. El ARN no coronado en el extremo es coronado en el extremo post- transcripcionalmente con Enzima de coronación en el extremo de Vaccinia (VCE por sus siglas en inglés) usando el sistema de coronación en el extremo m7G ScriptCap (Epicentre Biotechnologies) como se subraya en el manual del usuario; replicones coronados en el extremo en esta forma son dados con el prefijo "v" por ejemplo vA317 es el replicón A317 coronado en el extremo por VCE. El ARN coronado en el extremo post-transcripcionalmente es precipitado con LiCl y reconstituido en agua libre de nucleasa. La concentración de las muestras de ARN es determinada por medir OD260nm- La integridad de las transcripciones in vitro es confirmada por desnaturalizar la electroforesis de gel de agarosa.
Adsorción de PLG.
Se hacen las micropartículas usando 500 mg de PLG RG503 (proporción molar 50:50 de lacturo/glicoluro, V ~30kDa) y 20 mg de DOTAP usando un macrohomogenizador Omni. La suspensión de partículas es agitada en 150 rpm durante la noche y entonces filtrada a través de un filtro estéril de 40 µp\ para almacenamiento en 2-8°C. El ARN de autorreplicación es adsorbido a las partículas . Para preparar 1 mi de suspensión de PLG/ARN se agrega el volumen requerido de suspensión de partículas de PLG a un vial y agua libre de nucleasa es agregada para llevar el volumen a 900 µ? . Se agrega 100 µ? de ARN (10 µg/ml) en gotas a la suspensión PLG, con agitación constante. Se incuba PLG/ARN en temperatura ambiente por 30 minutos. Para 1 mi de suspensión reconstituida, se agregan 45 mg de manitol, 15 mg de sacarosa y 250-500 µg de PVA. Los viales son congelados en -80°C y liofilizados .
Para evaluar la adsorción de ARN, . se centrifuga la suspensión de partículas de 100 µ en 10,000 rpm por 5 minutos y se recolecta el sobrenadante. Se reconstituye el PLG/ARN usando 1 mi de agua libre de nucleasa. Se agrega a 100 µ?? de suspensión de partículas (1 µg de ARN) . Se agrega sulfato de heparina 1 mg. Se lleva a vortex la mezcla y se permite sedimentar en temperatura ambiente por 30 minutos para deabsorción de ARN. Se centrífuga la suspensión de partículas y se recolecta el sobrenadante.
Para estabilidad de ARNasa, se incuban 100 µ??. de suspensión de partículas con 6.4 mAU de ARNasa A en temperatura ambiente por 30 minutos. Se inactiva la ARNasa con 0.126 mAU de proteinasa K en 55 °C por 10 minutos. 1 mg de sulfato de heparina se agrega para deabsorber el ARN seguido por centrifugación. Las muestras de sobrenadante que contienen ARN son mezcladas con tinte de carga de formaldehído, se calienta en 65 °C por 10 minutos y se analiza usando 1% de gel desnaturalizante (460 ng de ARN cargado por banda) .
Para evaluar la expresión, se inmunizan los ratones Balb/c con 1 µg de ARN en 100 µ?, de volumen de inyección intramuscular (50 µL/leg) en el día 0. Se recolectan los sueros en los días 1, 3 y 6. Se determina la expresión de proteína usando un ensayo de quimioluminiscencia. Como se muestra en la Figura 3, la expresión es superior cuando se suministra el ARN por PLG (triángulos) que sin ninguna partícula de suministro (círculos) .
Encapsulación Liposomal Se encapsula el ARN en liposomas hechos por el método las referencias 7 y 44. Los liposomas son hechos de 10% de DSPC (zwiteriónico) , 40% de DlinDMA (catiónico) , 48% de colesterol y 2% de DMG conjugado a PEG (2kDa de PEG) . Estas proporciones se refieren a % de moles en el liposoma total.
Se sintetiza DlinDMA (1, 2-dilinoleiloxi-N, N-dimetil-3 -aminopropano) usando el procedimiento de referencia 2. DSPC (1 , 2-diasteroil-sn-glicero-3 -fosfocolina) es comprado de Genzyme . Se obtiene el colesterol de Sigma-Aldrich. DMG conjugado a PEG (1, 2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi (polietilenglicol) , sal de amonio, DOTAP (1, 2-dioleoil-3-trimetilamonio-propano, sal de cloruro) y DC-chol (clorhidrato de 3ß-[?- (?' , ' -dimetilaminoetano) -carbamoil]colesterol) son de Avanti Polar Lipids .
Brevemente, se disuelven los lípidos en etanol (2 mi) , se disuelve el replicón de ARN en amortiguador (2 mi, 100 mM de citrato de sodio, pH 6) y estos son mezclados con 2 mi de amortiguador seguido por 1 hora de equilibrio. Se diluye la mezcla con 6 mi de amortiguador después se filtra.
El producto resultante contiene liposomas, con ~95% de eficiencia de encapsulación.
Por ejemplo, en un método particular, se preparan las soluciones de provisión de lípido fresco en etanol. 37 mg de DlinDMA, 11.8 mg de DSPC, 27.8 mg de colesterol y 8.07 mg de PEG-DMG son pesados y disueltos en 7.55 mi de etanol. La solución de lípidos preparada recientemente es agitada suavemente en 37°C por aproximadamente 15 minutos para formar una mezcla homogénea. Entonces, 755 µ?. de la provisión es agregada a 1.245 mi de etanol para hacer una solución de provisión de lípidos de desarrollo de 2 mi. Esta cantidad de lípidos es usada para formar liposomas con 250 µg de ARN. Se prepara también 2 mi de solución de desarrollo de ARN a partir de una solución de provisión de ~ 1 µg/µL en 100 mM de amortiguador de citrato (pH 6) . Tres viales de vidrio de 20 mi (con barras de agitación) son enjuagadas con solución de RNase Hawai (Molecular BioProducts) y se lava con abundante agua MilliQ antes de usar para descontaminar los viales de ARNasas . Uno de los viales es usado para la solución de desarrollo de ARN y los otros para recolectar las mezclas de lípidos y ARN (como se describe posteriormente) . Se calientan las soluciones de lípidos y ARN de desarrollo en 37°C por 10 minutos antes de ser cargado en jeringas de luer-lok de 3 mi. Se carga 2 mi de amortiguador de citrato (pH 6) en otra jeringa de 3 mi. Las jeringas que contienen ARN y los lípidos se conectan a un mezclador T (unión ID de 500 µp? PEEK , Idex Health Science) usando tubería FEP (etilen-propilen fluorinado; toda la tubería FEP usada tiene un diámetro interno de 2 mm y un diámetro externo de 3 mm; obtenido de Idex Health Science) . La salida del mezclador T es también tubería FEP. La tercera jeringa que contiene el amortiguador de citrato es conectada a una pieza separada de tubería. Todas las jeringas son entonces accionadas en una velocidad de flujo de 7 ml/min usando una bomba de jeringa. Las salidas de tubo son colocadas para recolectar las mezclas en un vial de vidrio de 20 mi (mientras se agita) . Se toma la barra de agitación y se permite equilibrar el etanol/solución acuosa a temperatura ambiente por 1 hora. 4 mi de la mezcla se carga en una jeringa de 5 mi, la cual se conecta a una pieza de tubería FEP y en otra jeringa de 5 mi conectada a una longitud igual de tubería FEP, se carga una cantidad igual de 100 mM de amortiguador de citrato (pH 6) . Se accionan dos jeringas en una velocidad de flujo de 7 ml/min usando la bomba de jeringa y la mezcla final se recolecta en un vial de vidrio de 20 mi (mientras se agita) . Después, la mezcla recolectada a partir de la segunda etapa de mezclado (liposomas) son pasados a través de una membrana Mustang Q (un soporte de intercambio de aniones que enlaza y remueve las moléculas aniónicas, obtenidas de Pall Corporation) . Antes de usar esta membrana para los liposomas, 4 mi de 1M NaOH, 4 mi de 1 M NaCl y 10 mi de 100 mM de amortiguador citrato (pH 6) son pasados exitosamente. Se calientan los liposomas por 10 minutos en 37°C antes de pasar a través de la membrana. Después, los liposomas son concentrados a 2 mi y se dializan contra 10-15 volúmenes de IX PBS usando por filtración de flujo tangencial antes de recuperar el producto final. El sistema TFF y membranas de filtración de fibra hueca son compradas de Spectrum Labs (Rancho Domínguez) y se usan de acuerdo a las pautas del fabricante. Se usan las membranas de filtración de fibra hueca de polisulfona con un corte de tamaño de poro de 100 kD y área superficial de 8 cm2. Para los experimentos in vitro e in vivo se diluyen las formulaciones a la concentración requerida de ARN con IX PBS. Se describen posteriormente los métodos de fabricación de liposoma adicionales.
La Figura 2 muestra una micrografía de electrones de ejemplo de liposomas preparados por estos métodos. Estos liposomas contienen ARN encapsulado que codifican el antígeno RSV F de longitud completa. La difusión de luz dinámica de un lote muestra un diámetro promedio de 141 nm (por intensidad) ó 78 nm (por número) .
Se determina el porcentaje de concentración de ARN y ARN encapsulado por el kit de reactivo Quant-iT RiboGreen RNA (Invitrogen) , siguiendo las instrucciones del fabricante. El estándar de ARN ribosomal proporcionado en el kit es usado para generar una curva estándar. Se diluyen los liposomas lOx ó lOOx en amortiguador IX TE (del kit) antes a la adición del tinte. Separadamente, se diluyen los liposomas 10 veces ó 100 veces en amortiguador de IX TE que contiene 0.5% de Tritón X antes a la adición del tinte (para alterar los liposomas y de esta forma ensayar el ARN total) . Después de esto se agrega una cantidad igual de tinte a cada solución y entonces se carga ~180 µ? de cada solución después de la adición del tinte por duplicado en una placa de cultivo de tejido de 96 pozos. Se lee la fluorescencia (Ex 485 nm, Em 528 nm) en un lector de microplaca. Todas las formulaciones de liposoma son dosificadas in vivo en base a la cantidad encapsulada de ARN.
Se muestra la encapsulación en liposomas para proteger ARN de digestión con ARNasa. Los experimentos usan 3.8 mAU de ARNasa por microgramo de ARN, incubado por 30 minutos en temperatura ambiente. Se inactiva la ARNasa con Proteinasa K en 55°C por 10 minutos. Se agrega entonces una mezcla 1:1 v/v de muestra a 25:24:1 v/v/v, fenol : cloroformo : alcohol isoamílico para extraer el ARN de los lípidos en la fase acuosa. Se mezclan las muestras por vórtex por unos cuantos segundos y entonces se coloca en una centrífuga por 15 minutos en 12 k RPM. Se remueve la fase acuosa (que contiene el ARN) y se usa para analizar el ARN. Antes a la carga (400 ng de ARN por pozo) se incuban todas las muestras con tinte de carga de formaldehído, se desnaturaliza por 10 minutos en 65°C y se enfría a temperatura ambiente . Se usan los marcadores Ambion Millennium para aproximar el peso molecular de la construcción de ARN. Se corre el gel en 90 V. Se tiñe el gel usando 0.1% de oro SYBR de acuerdo a las pautas del fabricante en agua por mecer en temperatura ambiente por 1 hora. La Figura 1 muestra que la ARNasa digiere completamente el ARN en la ausencia de encapsulacion (banda 3) . El ARN es no detectable después de la encapsulacion (banda 4), y no se observa cambio si estos liposomas son tratados con ARNasa (banda 4) . Después de que los liposomas tratados con ARNasa son sometidos a extracción con fenol, se observa ARN no digerido (banda 6) .
Incluso después de 1 semana en 4°C el ARN puede ser visto sin ninguna fragmentación (Figura 4, flecha). La expresión de proteínas in vivo no es cambiada después de 6 semanas en 4°C y un ciclo de congelación-descongelación. De esta forma es estable el ARN encapsulado en liposoma.
Para evaluar la expresión in vivo del ARN se codifica una enzima reportadora (SEAP; fosfatasa alcalina secretada) en el replicón, más que un inmunogen. Se miden los niveles de expresión en suero diluido 1:4 en amortiguador de IX Phospha-Light usando un substrato de fosfato alcalino quimioluminiscente . Se inyectan ratones BALB/c de 8-10 semanas de edad (5/grupo) intramuscularmente en el día 0, 50 µ? por pierna con 0.1 µg ó 1 µg de dosis de ARN. El mismo vector es también administrado sin los liposomas (en IX PBS libre de ARNasa) en 1 g. Los replicones empacados en viriones son también probados. Los replicones empacados en viriones usados en la presente (referidos como "VRP") son obtenidos por los métodos de referencia 45, donde el replicón de alfavirus es derivado de VEEV mutante o una quimera derivada del genoma de VEEV modificado para contener el 3' UTR de virus Sindbis y una señal de empaque de virus Sindbis (PS) , empacado por coelectroporarlos en células BHK con ARN auxiliadoros defectuosos que codifican la capside de virus Sindbis y genes de glicoproteína .
Como se muestra en la Figura 5, la encapsulación incrementa los niveles de SEAP por aproximadamente ¾ log en una dosis de 1 µg, y en el día 6 la expresión de niveles acoplados de dosis encapsulada de 0.1 µg observados con 1 µg de dosis no encapsulada. Por el día 3 los niveles de expresión exceden aquellos logrados con VRP (cuadros) . De esta forma expresa incremento cuando el ARN es formulado en los liposomas con relación al control de ARN desnudo, incluso en una dosis 10 veces menor. La expresión es también superior con relación al control VRP, pero las cinéticas de expresión son muy diferentes (ver la Figura 5) . El suministro del ARN con electroporación resulta en expresión incrementada con relación al control de ARN desnudo, pero estos niveles son menores que con los liposomas .
Además los experimentos SEAP muestran una respuesta de dosis clara in vivo, con expresión vista después del suministro de tan poco como 1 ng de AR (Figura 6) . Experimentos adicionales que comparan expresión de replicones encapsulados y desnudos indican que 0.01 µg de ARN encapsulado es equivalente a 1 µg de ARN desnudo. En una dosis de 0.5 µg de ARN el material encapsulado da una expresión superior 12 veces en el día 6; en niveles de dosis de 0.1 9 son 24 veces superior en el día 6.
Más que observar en niveles promedio en el grupo, se estudian también los animales individuales . Mientras que varios animales no responden a replicones desnudos, la encapsulación elimina la no respuesta.
Experimentos adicionales reemplazan DlinDMA con DOTAP . Aunque los liposomas DOTAP dan mejor expresión que el replicón desnudo, son inferiores a los liposomas DlinDMA (2 a 3 veces de diferencia en el día 1) .
Para evaluar la inmunogenicidad in vivo se construye un replicón para expresar la proteína F de longitud completa a partir del virus sincicial respiratorio (RSV, por sus siglas en inglés) . Este es suministrado desnudo (1 µg) , encapsulado en liposomas (0.1 ó 1 g) , o empacado en viriones (106 IU; "VRP") en días 0 y 21. La Figura 7 muestra títulos IgG anti-F 2 semanas después de la segunda dosis, y los liposomas incrementan claramente la inmunogenicidad. La Figura 8 muestra títulos 2 semanas más tarde, punto en el cual no hay diferencia estadíastica entre el ARN encapsulado en 0.1 g, el ARN encapsulado en 1 µg, o el grupo VRP . Los títulos de neutralización (medidos como 60% de reducción de placa, "PRNT60") no son diferentes significativamente en estos tres grupos 2 semanas después de la segunda dosis (Figura 9) . La Figura 12 muestra tanto títulos IgG y PRNT 4 semanas después de la segunda dosis.
La Figura 13 confirma que el ARN produce una respuesta celular de CD8 T robusta.
Experimentos adicionales comparan títulos IgG específicos a F en ratones que reciben VRP, 0.1 g de ARN encapsulado en liposoma, ó ARN encapsulado con liposoma 1 µ . Las proporciones título (VRP : liposoma) en varios tiempos después de la segunda dosis son como a continuación: De esta forma el ARN encapsulado en liposoma induce esencialmente la misma magnitud de respuesta inmunológica como se observa con el suministro de viriones.
Experimentos adicionales muestran respuestas de IgG específicas a F superiores con una dosis de 10 µg, respuestas equivalentes para dosis de 1 µg y 0.1 g, y una respuesta · inferior con una dosis de 0.01 µg. La Figura 11 muestra ¡ títulos de IgG en ratones que reciben el replicón en forma ¡ desnuda en 3 diferentes dosis, en liposomas en 4 diferentes dosis, o como VRP (106 IU) . La respuesta observada con 1 µg ¡ de ARN encapsulado en liposoma es insignificante ! estadíasticamente (ANOVA) cuando se compara con VRP, pero la ; respuesta superior observada con 10 µg de ARN encapsulado en liposoma es estadíasticamente significativo (p< 0.05), cuando ' se compara con ambos de estos grupos. ¡ Un estudio adicional confirma que 0.1 µg de ARN i encapsulado en liposoma da respuestas de IgG anti-F muy ¡ superiores (15 días post segunda dosis) que 0.1 µg de ADN j suministrado, e incluso es más inmunogénico que 20 µg de ADN de plásmido que codifica el antígeno F, suministrado por electroporación (Elgen™ DNA Delivery System, Inovio) .
Los ratones muestran pocos signos visuales de tensión (pérdida de peso, etc.) después de recibir replicón de ARN encapsulado en liposoma, aunque una pérdida de peso temporal de 3-4% es observada después de una segunda dosis de 10 µg de ARN. En contraste, el suministro de 10 µg de ADN encapsulado en liposoma lleva a 8-10% de pérdida de peso.
Mecanismo de Acción Se obtienen células dendríticas derivadas de médula ósea (pDC) de ratones del tipo silvestre o la cepa mutante "Resq" (rsql) . La cepa mutante tiene una mutación de punto en la terminación amino de su receptor TLR7 el cual abóle señalización de TLR7 sin afectar el enlace de ligando (46) . Las células son estimuladas con ARN de replicón formulado con DOTAP, lipofectamina 2000 ó dentro de un liposoma. Como se muestra en la Figura 17, se inducen 11-6 y INFa en células WT pero esta respuesta es casi completamente anulada en ratones mutantes . Estos resultados muestras que TLR7 es requerida para reconocimiento de ARN en células inmunológicas , y que los replicones encapsulados en liposomas pueden provocar que las células inmunológicas secreten altos niveles de ambos interferones y citocinas pro-inflamatorias .
En general, los replicones de ARN suministrados por liposoma son mostrados para inducir varias citocinas séricas dentro de 24 horas de inyección intramuscular (IFN-a, IP-10 (CXCL-10), IL-6, KC, IL-5, IL-13, MCP-1, y MIP-a) mientras que solamente MIP-1 es inducida por ARN desnudo y liposoma solo induce solamente IL-6.
IFN-a es mostrada para contribuir a la respuesta inmunológica para replicón que codifica RSV-F encapsulado en liposoma ya que un anticuerpo de receptor anti-IFNa (IFNAR1) reduce el IgG sérico específico a F una reducción de 10 veces después de 2 vacunaciones .
Los replicones de ARN suministrados en liposoma han sido generalmente observados para producir un perfil de subtipo IgGl-IgG2a equilibrado en ratones, algunas veces con una proporción de IgG2a/IgGl superior que la observada con ADN electroporado o con inmunizaciones de proteína/MF50 (es decir una respuesta inmunológica del tipo Thl) .
Métodos de Fabricación de Liposoma En general, han sido usados ocho diferentes métodos para preparar liposomas de acuerdo a la invención. Estos son referidos en el texto como métodos (A) a (H) y difieren principalmente en relación a la filtración y etapas TFF. Los detalles son como a continuación: (A) se preparan soluciones de provisión de lípido fresco. 37 mg de DlinDMA, 11.8 mg de DSPC, 27.8 mg de colesterol y 8.07 mg de PEG DMG 2000 son pesados y disueltos en 7.55 mi de etanol. La solución de provisión de lípidos preparada recientemente es agitada recientemente en 37°C pero aproximadamente 15 minutos para formar una mezcla homogénea. Entonces, se agregan 755 µ? de provisión a 1.245 mi de etanol para hacer una solución de provisión de lípidos de desarrollo de 2 mi. Esta cantidad de lípidos es usada para formar liposomas con 250 µg de ARN. Se prepara también 2 mi de solución de desarrollo de ARN a partir de una solución de provisión de ~1 µg/µl en 100 mi de amortiguador de citrato (pH 6) . Se enjuagan tres viales de vidrio de 20 mi (con barras de agitación) con solución Rnase Hawai (Molecular BioProducts, San diego, CA) y se lavan con bastante agua MilliQ antes de uso para decontaminar los viales de Rnases, Uno de los viales es usado para la solución de desarrollo de ARN y los otros para recolectar las mezclas de lípidos y ARN (como se describe posteriormente) . Las soluciones de lípidos de desarrollo y ARN son calentadas en 37°C por 10 minutos antes de ser cargados en jeringas luer-lok de 3 mi. Se cargan 2 mi de amortiguador de citrato (pH 6) en otra jeringa de 3 mi. Las jeringas que contienen ARN y los lípidos son conectados a un mezclador T (PEEK™ 500 µ?a de junción ID, Idex Health Science, Oak Harbor, WA) usando tubería FEP (etilenpropileno fluorinado; tubería FEP tiene un diámetro interno de 2 mm x 3 mm de diámetro externo, suministrado por Idex Health Science) . La salida del mezclador T es también tubería FEP. La tercera jeringa que contiene el amortiguador de citrato es conectada a una pieza separada de tubería FEP. Todas las jeringas son accionadas en una velocidad de flujo de 7 ml/minuto usando una bomba de jeringa. Las salidas del tubo son colocadas para recolectar las mezclas en un vial de 20 mi de vidrio (mientras se agita) . La barra de agitación es tomada y se permite equilibrar al etanol/solución acuosa en temperatura ambiente por 1 hora. 4 mi de la mezcla se carga en una jeringa de 5 mi, la cual se conecta a una pieza de tubería de FEP y en otra jeringa de 5 mi conectada a una longitud igual de tubería de FEP, se carga una cantidad igual de 100 m de amortiguador de citrato (pH 6) . Las dos jeringas son accionadas en 7 ral/rain de velocidad de flujo usando la bomba de jeringa y la- mezcla final se recolecta en un vial de vidrio de 20 mi (mientras se agita) . Después, la mezcla recolectada a partir de la segunda etapa de mezclado (liposomas) se pasa a través de una membrana Mustang Q (un soporte de intercambio de aniones que enlaza y remueve moléculas aniónicas, obtenidas de Pall Corporation, AnnARbor, MI, USA) . Antes de pasar los liposomas, 4 mi de 1 M de NaOH, 4 mi de 1 M de NaCl, y 10 mi de 100 mM de amortiguador de citrato (pH 6) son pasados exitosamente a través de la membrana Mustang. Se calientan los liposomas por 10 minutos en 37°C antes de pasar a través de la membrana. Después, los liposomas son concentrados a 2 mi y se dializan contra 10-15 volúmenes de IX PBS usando TFF antes de recuperar el producto final. El sistema TFF y las membranas de filtración de fibra hueca son comprados de Spectrum Labs y se usan de acuerdo a las pautas del fabricante. Se usan membranas de filtración de fibra hueca de polisulfona (número de parte P/N: X1AB-100-20P) con un corte de tamaño de poro de 100 kD y área superficial de 8 cm2. Para experimentos in vitro e in vivo, se diluyen las formulaciones a la concentración de ARN requerida con IX PBS .
(B) Como el método (A) excepto que, después de agitar, 226.7 µ? de la provisión es agregada a 1.773 mi de etanol para hacer una solución de provisión de lípidos de desarrollo de 2 mi, de esta forma modificando la proporción de lípidos :ARN.
(C) Como el método (B) excepto que se omite la filtración Mustang, por lo tanto los liposomas vienen de viales de vidrio de 20 mi en la diálisis TFF.
(D) Como el método (C) excepto que TFF usa membranas de fibra hueca de polietersulfona (PES, por sus siglas en inglés) (número de parte P-C1-100E-100-01N) con un corte de tamaño de poro de 100 kD y área superficial de 20 era .
(E) Como el método (D) excepto que se usa una membrana Mustang, como en el método (A) .
(F) Como en el método (A) excepto que se omite la filtración Mustang, por lo tanto los liposomas vienen del vial de vidrio de 20 mi en la diálisis de TFF.
(G) Como en el método (D) excepto que se prepara 4 mi de una solución de desarrollo de ARN a partir de una solución de provisión de ~ 1 µg/µl en 100 m M de amortiguador de citrato (pH 6) . Después se preparan cuatro viales de vidrio de 20 mi en la misma forma. Dos de ellos son usados para la solución de desarrollo de ARN (2 mi en cada vial) y los otros para recolectar las mezclas de lípidos y ARN, como en (c) . Más que usar el mezclador T, se conectan las jeringas que contienen ARN y los lípidos a un chip de unión Mitos Droplet (un dispositivo microfluido de vidrio obtenido de Syrris, No. de parte 3000158) usando tubería de PTFE (0.03 pulgadas (0.076 cm) de diámetro interno x 1/16 pulgadas (0.16 cm) de diámetro externo) usando un conector de borde de 4 formas (Syrris) . Dos corrientes de ARN y una corriente de lípidos se accionan por bombas de jeringa y se hace el mezclado del etanol y fase acuosa en la unión X (100 µ?t\ x 105 µ??) del chip. La velocidad de flujo de todas las tres corrientes se mantiene en 1.5 ml/min, aquí la proporción de velocidad de flujo acuoso a etanólico es 2:1. La salida del tubo es colocada para recolectar las mezclas en un vial de vidrio de 20 mi (mientras se agita) . Se toma la barra de agitación y se permite equilibrar el etanol/solución acuosa a temperatura ambiente por 1 hora. Entonces se carga la mezcla en una jeringa de 5 mi, la cual se fija a otra pieza de la tubería de PTFE: en otra jeringa de 5 mi con igual longitud de tubería PTFE, se carga un volumen igual de 100 mM de amortiguador de citrato (pH 6) . Las dos jeringas son accionadas en velocidad de flujo de 3 ml/min usando una bomba de jeringa y la mezcla final recolectada en un vial de 20 mi de vidrio (mientras se agita) . Después, se concentran los liposomas a 2 mi y se dializa contra 10-15 volúmenes de IX PBS usando TFF como en (D) .
(H) Como el método (A) excepto que se hace la solución de provisión de lípidos de desarrollo 2 mi por mezclar 120.9 µ? de la provisión de lípidos con 1.870 mi de etanol. También, después de mezclar en el mezclador T se cargan los liposomas del vial de 20 mi en cásete de diálisis Pierce Slide-A-Lyzer (Termo Scientific, extra resistencia, 0.5-3 mi de capacidad) y se dializa contra 400-500 mi de IX PBS durante la noche en 4°C n un contenedor de plástico en autoclave antes de recuperar el producto final.
Expresión de BHK Los liposomas con diferentes lípidos son incubados con células BHK durante la noche y se evalúan para potencia de expresión de proteína. A partir de una línea base con lípidos RV05 la expresión puede ser incrementada 18 veces por agregar 10% de 1, 2-difitanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DpyPE) al liposoma, 10 veces por agregar 10% de 18:2 (cis) fosfatidilcolina, y 900 veces en lugar de usar RV01.
En general, estudios in vivo muestran que las colas de lípidos insaturados tienden a incrementar los títulos de IgG incrementados contra antígenos codificados.
Inmunogenicidad de RSV El replicón de autorreplicación VA317 que codifica la proteína RSV F es administrada a ratones BALB/c, 4 u 8 animales por grupo, por vacunaciones intramusculares bilaterales (50 µ? por pierna) en los días 0 y 21 con el replicón (1 µg) solo o formulado como liposomas con DlinDMA ("RV01") ó DOTAP ("RV13") . Los liposomas RV01 tienen 40% de DlinDMA, 10% de DSPOC, 48% de colesterol y 2% de PEG-DMG, pero con diferentes cantidades de ARN. Los liposomas RV13 tienen 40% de DOTAP, 10% de DPE, 48% de colesterol y 2% de PEG-DMG. Para comparación, ADN de plásmido desnudo (20 µg) que expresa el mismo antígeno RSV-F es suministrado ya sea usando electroporacion o con liposomas RVOl (10) (0.1 de ADN) . Se usan cuatro ratones como un grupo de control ingenuo .
Se preparan los liposomas por el método (D) ó método (B) . Para algunos liposomas hechos por el método (D) se usa una cantidad doble o la mitad de ARN. El diámetro de partícula promedio Z, índice de polidispersidad y eficiencia de encapsulacion de los liposomas son como a continuación.
* Para esta formulación RVOl (10) el ácido nucleico es ADN no ARN.
Se recolecta el suero para análisis de anticuerpo en los días 14, 36 y 40. Los vasos se cosechan a partir de ratones en el día 49 para análisis de células T.
Los títulos de IgG de suero específicos a F (GMT) son como a continuación: La proporción de células T las cuales son positivas a citocina y específicas para péptido RSV F51-66 son como a continuación, mostrando solamente figuras las cuales son significativas estadíasticamente arriba del cero: De esta forma las formulaciones de liposoma incrementan significativamente la inmunogenicidad con relación a los controles de ARN desnudos, como se determina por títulos de IgG específicos a F incrementados y frecuencias de células T. El ADN de plásmido formulado con liposomas, o suministrados desnudos usando electroporación, es significativamente menos inmunogénico que el ARN de autorreplicación formulado por liposoma.
Las vacunas de ARN RV01 son más inmunogénicas que la vacuna RV13. RV01 tiene una amina terciaria en el grupo de cabeza con un pKa de aproximadamente 5.8 y también incluyen colas de alquilo insaturados. RV13 tiene colas de alquilo insaturadas pero su grupo cabeza tiene una amina cuatenaria y es muy altamente catiónica.
Liposomas- requerimiento para encapsulacion Para evaluar si el efecto observado en los grupos de liposoma es debido simplemente a los componentes de lipsoma, o es enlazado a la encapsulacion, se administra el replicón en forma encapsulada (con dos protocolos de purificación diferentes, 0.1 µg de ARN), o se mezcla con los liposomas después de su formación (un "lipoplex" no encapsulado, 0.1 µg de ARN), o se mezcla con los liposomas después de su formación (un "lipoplex" no encapsulado, 0.1 µg de ARN) , o como ARN desnudo (1 µg) . La Figura 10 muestra que el lipoplex da los niveles más bajos de expresión, mostrando que la encapsulación es esencial para expresión potente.
Experimentos adicionales usan tres diferentes ARN: (i) replicón "VA317" que expresa RSV-F es decir la glicoproteína de fusión superficial de RSV; (ii) "vA17" replicón que expresa GFP; y (iii) "vA336" que es defectivo en replicación y codifica GFP.
Se suministran los ARN ya sea desnudos o con liposomas hechos por el método (D) . Los liposomas vacíos son hechos por el método (D) pero sin ARN. Las cuatro formulaciones de liposoma tienen estas características: Ratones BALB/c, 5 animales por grupo, son dados con vacunaciones intramusculares bilaterales (50 µ? por pierna) en los días 0 y 21 con: Grupo 1 ARN RSV-F de autorreplicación desnudo Grupo 2 ARN de RSV-F de autorreplicación (vA317, 0.1 g) encapsulado en liposomas Grupo 3 ARN de RSV-F de autorreplicación (vA317, 0.1 µg) agregado a liposomas vacíos Grupo 4 proteína de subunidad F (5 µg) Se recolecta el suero para análisis de anticuerpo en los días 14, 35 y 51. Se miden los títulos de IgG séricos específicos a F (GMT) ; si un animal individual tiene un título de <25 (límite de detección) , es asignado con un título de 5. Además, los vasos son cosechados a partir de ratones en el día 51 para el análisis de células T, para determinar las células las cuales son positivas a citocina y específicas para péptido de F51-66 RSV (CD4+) ó para péptidos F85-93 RSV F y F249-258 (CD8+) .
Los títulos IgG son como a continuación en los grupos 10 y en los ratones de control no inmunizados: Los títulos de neutralización de suero RSV en el día 51 son como a continuación; : Los animales que muestran células T CD4+ específicas a RSV F en el día 51 son como a continuación, donde se da un número (% de células positivas) solamente si la respuesta estimulada es estadíastica y significativamente arriba de cero : Los animales que muestran células T CD8+ especificas a RSV F en el día 51 son como a continuación, donde un número es dado solamente si la respuesta estimulada es estadíastica y significativamente arriba de cero: De esta forma la encapsulación de ARN con los liposomas es necesaria para alta inmunogenicidad, como una simple mezcla de ARN y los liposomas (grupo 3) no son inmunogénicos (de hecho, menos inmunogénico que el ARN desnudo) .
En otros estudios los ratones reciben varias combinaciones de (i) replicón de ADN de autorreplicación que codifica proteína RSV F de longitud completa (ii) replicón de ADN que codifica GFP de autorreplicación (iii) replicón de ARN que codifica GFP con una desactivación en nsP4 el cual elimina autorreplicación (iv) proteína F RSV de longitud completa. 13 grupos en total reciben: Resultados en la Figura 16 muestran que las respuestas IgG específicas a F requieren encapsulación en el liposoma más qué cosuministro simple (comparar grupos C y D) . Una comparación de grupos K, L y M muestra que el AR proporciona un efecto adyuvante contra la proteína coadministrada, y este efecto es observado con tanto ARN de replicación y no replicación.
Inmunogenicidad de RSV en diferentes cepas de ratón El replicón "vA142" codifica la glicoproteína de fusión superficial del tipo silvestre de longitud completa (F) de RSV pero con el péptido de fusión eliminado, y el extremo 3" es formado por escisión mediada por ribozima. Se prueba en tres diferentes cepas de ratón.
Se da a los ratones BALB/c vacunaciones intramusculares bilaterales (50 µ? por pierna) en los días 0 y 22. Los animales son divididos en 8 grupos de prueba (5 animales por grupo) y un control ingenuo (2 animales) : Al Grupo 1 se le da replicón desnudo (1 µg) .
Al Grupo 2 se les da 1 µg de replicón suministrado en liposomas "RV01(37)" con 40% de DlinDMA, 10% de DSPC, 48% de Chol, 2% de DMG conjugado por PEG.
Al grupo 3 se les da el mismo grupo 2, pero en 0.1 µg de ARN.
Al grupo 4 se les da 1 µg de replicón en "RV17(10)" de liposomas (40% de RV17 (ver posteriormente) , 10% de DSPC, 49.5% de colesterol, 0.5% de PEG-DMG) .
Grupo 5 son 1 µg de replicón en liposomas de "RV05(1D" (40% de lípido RV07, 30% de 18.2 PE (DloPE, 28% de colesterol, 2% de PEG-DMG) .
Al grupo 6 se les da 0.1 µg de replicón en liposomas de "RV17(10)".
Al grupo 7 se les da, 5 µg de proteína de subunidad RSV-F con adyuvante de hidroxido de aluminio.
Al grupo 8 se les da control ingenuo (2 animales) Se recolectan los sueros para análisis de anticuerpo en los días 14, 35 y 49. Los GMT de IgG de suero específicos a F son: En el día 35 se dan títulos IgGl y IgG2a específicos a F (GMT) como a continuación: Títulos de anticuerpo de neutralización de suero RSV en los días 35 y 49 son como a continuación (los datos son 60% de títulos de neutralización de reducción de placa de agrupaciones de 2-5 ratones, 1 agrupación por grupo) : Se cosechan los vasos en el día 49 para análisis de células T. Las frecuencias de células T positivas a citocina específicas a F netas promedio (CD4+ ó CD8+) son como a continuación, mostrando solamente figuras las cuales son estadíastica y significativamente arriba de cero (específicas para péptidos de RSV F51-66, F164-178, F309-323 para CD4+, o para péptidos F85-93 y F249-258 para CD8+) .
Los ratones C57B/6 son inmunizados en la misma forma, pero el grupo noveno recibe VRP (lxlO6 IU) expresando la glicoproteína de fusión de superficie del tipo silvestre de longitud completa de RSV (eliminación de péptido de fusión) .
Se recolectan los sueros para análisis de anticuerpo en los días 14, 35 y 49. Los títulos IgG específicos a F (GMT) son: En el día 35 los títulos IgGl y IgG2a específicos a (GMT) son como a continuación Los títulos de anticuerpo de neutralización de suero RSV en los días 35 y 40 son como a continuación (datos son 60% de títulos de neutralización de reducción de placa de agrupaciones de 2-5 ratones, 1 agrupación por grupo) : Se cosechan los vasos en el día 49 para análisis de células T. Las frecuencias de células T positivas citocina específicas a F netas promedio (CD8+) son como a continuación, mostrando solamente las figuras las cuales son estadíastica y significativamente arriba de cero (específicas para péptidos RSV F85-93 y F249-258) : Se inmunizan nueve grupos de ratones C3H/HeN en la misma forma. Los títulos de IgG específicos a F (GMT) son: En el día 35 los títulos IgGl y IgG2a específicos a F (GMT por sus siglas en inglés) son como a continuación: Los títulos de anticuerpo de neutralización suero RSV en los días 35 y 40 son como a continuación.
De esta forma tres diferentes lípidos (RV01, RV05, RV17, pKa 5.8, 5.85, 6.1) son probados en tres diferentes cepas de ratón reproducidos diferentes. Para todas las tres cepas RV01 es más efectivo que RV17; para cepas de BALB/c y C3H RV05 es menos efectiva que ya sea RV01 ó RV17, pero es más efectiva en la cepa B6. En todos los casos, sin embargo, los liposomas son más efectivos que dos nanoemulsiones catiónicas las cuales son probadas en paralelo.
Inmunogenicidad de CMV Los liposomas RV01 con DLinDMA como el lípido catiónico son usados para suministrar replicones de ARN que codifican glicoproteínas de citomegalovirus (CMV por sus siglas en inglés) . El replicón "vA160" codifica glicoproteínas de longitud completa H y L (gH/gL) , mientras que el replicón "vA322" codifica una forma soluble (gHsol/gL) . Las dos proteínas están bajo el control de promotores subgenómicos separados en un solo replicón; la coadministración de dos vectores separados, uno que codifica gH y uno que codifica gL, no da buenos resultados.
Se les da a los ratones BALB/c, 10 por grupo, vacunaciones intramusculares bilaterales (50 µ? por pierna) en los días 0, 21 y 42 con VRP que expresan gH/gL (lxlO6 IU) , VRP que expresan gHsol/gL (1X106 IU) y PBS como los controles. Dos grupos de prueba reciben 1 µg del replicón vA160 ó vA322 formulado en liposomas (40% DlinDMA, 10% de DSPC, 48% Chol, 2% de PEG-DMG; hecho usando método (D) pero con 150 µg de tamaño de lote de ARN) .
Los liposomas vA160 tienen un diámetro Zav de 168 nm, un pdl de 0.144 y 87.4% de encapsulación. Los liposomas vA322 tienen un diámetro Zav de 162 nm, un pdl de 0.131 y 90% de encapsulación.
Los replicones son capaces de expresar dos proteínas de un solo vector.
Los sueros son recolectados para análisis inmunológico en el día 63 (3wp3) . Los títulos de neutralización CMV (el reciproco de la dilución sérica que produce una reducción de 50% en número de focos de virus positivos por pozo, con relación a los controles) son como a continuación: ARN que expresa ya sea una longitud completa o una forma soluble del complejo de gH/gL de CMV de esta forma produce altos títulos de anticuerpos de neutralización, como se ensaya en células epiteliales. Los títulos promedio producidos por los ARN encapsulados en liposoma son por lo menos tan altos como para los VRP correspondientes.
Experimentos repetidos confirman que el replicón es capaz de expresar dos proteínas a partir de un solo vector. El replicón de ARN da un título de 3wp3 de 11457, comparado con 5516 con VRP.
Experimentos adicionales usan replicones diferentes además de vA160. El replicón vA526 expresa el complejo pentamérico CMV (gH-gL-UL128-UL130-UL-131) bajo el control de tres promotores subgenómicos : el primero acciona la expresión de gHM; el segundo acciona la expresión de gL; el tercero acciona la expresión de la poliproteína UL128-2A-UL130-2A- UL131, la cual contiene dos sitios de escisión 2A entre los genes UL. El replicón vA527 expresa el complejo pentamérico CMV por medio de tres promotores subgenómicos y dos IRESs,· el primer promotor subgenómico acciona la expresión de gH; el segundo promotor subgenómico acciona la expresión de gL; el tercer promotor subgenómico acciona la expresión de UL128; UL130 está bajo el control de EMCV IRES; UL131 está bajo el control de EV71 IRES. Estos tres replicones son suministrados por liposoma (método (H) , con 150 µg de tamaño de lote) o por VRP.
Los ratones BALB/c, 10 grupos de 10 animales, son dados con vacunaciones intramusculares bilaterales (50 µg por pierna) en días 0, 21 y 42 con: Grupo 1 VRP que expresan gH FL/gL (lxlO6 IU) Grupo 2 2A VRP, pentamérico (lxlO5 IU) Grupo 3 2A VRP, pentamérico (lxlO6 IU) Grupo 4 IRES VRP, pentamérico (1x10s IU) Grupo 5 vA160 de AR de autorreplicación (1 µg) formulado en liposomas Grupo 6 vA526 de ARN de autorreplicación (1 µg) formulado en liposomas Grupo 7 VA527 de ARN de autorreplicación (1 g) formulado en liposomas Grupo 8 vA160 de ARN de autorreplicación (1 µg) formulado en una nanoemulsión catiónica.
Grupo 9 vA526 de ARN de autorreplicación (1 µg) formulado en una nanoemulsión catiónica.
Grupo 10 VA527 de ARN de autorreplicación (1 µg) formulado en una nanoemulsion catiónica.
Se recolectan los sueros para análisis inmunológico en los días 21 (3wpl) , 42 (3wp2) , y 63 (3wp3) .
Los títulos de neutralización séricos de C V en los días 21, 42 y 63 son: De esta forma el ARN de autorreplicación puede ser usado para expresar múltiples antígenos de un solo vector y para incrementar una respuesta inmunológica potente y específica. El replicón puede expresar cinco antígenos (complejo pentamérico de CMV (gH-gL-UL128-UL130-UL-131) e incrementar una potente respuesta inmunológica. El ARN de autorreplicación suministrado en liposomas es capaz de producir altos títulos de anticuerpo neutralizante, como se ensaya en células epiteliales, en todos los puntos de tiempo ensayados (3wpl, 3wp2 y 3wp3) . Estas respuestas son superiores a los V P correspondientes y a nanoemulsiones catiónicas .
Volumen de Suministro El suministro hidrodinámico emplea la fuerza generada por la inyección rápida de un gran volumen de solución para solucionar las barreras físicas de membranas celulares las cuales evitan compuestos impermeables a membrana y grandes a partir células entrantes. Este fenómeno ha sido previamente mostrado para ser útil para el suministro intracelular de vacunas de ADN.
Un volumen de suministro de ratón típico para inyección intramuscular es 50 µ? en la pierna trasera, la cual es un volumen relativamente alto para un músculo de pierna de ratón. En contraste, una dosis intramuscular humana de ~0.5 mi es relativamente pequeña. Si la inmunogenicidad en ratones puede ser dependiente a volumen entonces la eficacia de las vacunas de replicón pueden ser debido, por lo menos en parte, a fuerzas hidrodinámicas, lo cual no puede ser fomentado para uso de las mismas vacunas en humanos y animales más grandes .
Se suministra el replicón vA317 a ratones BALB/c, 10 por grupo, por vacunaciones intramusculares bilaterales (5 ó 50 por pierna) en el día 0 y 21: Grupo 1 reciben replicón desnudo, 0.2 µg en 50 µ? por pierna Grupo 2 reciben replicón desnudo, 0.2 µ9 en 5 µ? por pierna Grupo 3 reciben replicón formulado por liposoma (0.2 g, 50 µ? por pierna) Grupo 4 reciben replicón formulado por liposoma (0.2 µg/ 5 µg por pierna) Se recolecta el suero para análisis de anticuerpo en los días 14 y 35. Los GMT de suero específicos a F son: De esta forma la inmunogenicidad del replicón formulado no varía de acuerdo al volumen suministrado, de esta forma indicando que estas vacunas de ARN no dependen del suministro hidrodinámico para su eficacia.
Cinéticas de Expresión Un replicón de ARN de autorreplicación ("vA311") que expresa un gen reportador de luciferasa (luc) es usado para estudiar las cinéticas de expresión de proteína después de la inyección. Ratones BABL/c, 5 animales por grupo, reciben vacunaciones intramusculares bilaterales (50 µ? por pierna) en el día 0 con: Grupo 1 ADN que expresa luciferasa, suministrado usando electroporacion (10 µg) Grupo 2 ARN de autorreplicación (1 µg) formulado en liposomas Grupo 3 ARN de autorreplicación (1 µg) formulado con una nanoemulsión catiónica Grupo 4 ARN de autorreplicación (1 µg) formulado con una nanoemulsión catiónica Grupo 5 VRP (1x10s) que expresa luciferasa Antes a la vacunación se depilan los ratones. Se anestesian los ratones (2% de isoflurano en oxígeno) , se remueve primero el cabello con una navaja eléctrica y entonces Nair químico. Los datos de bioluminiscencia son entonces adquiridos usando un sistema de imagen Xenogen IVIS 200 (Caliper Life Sciences) en los días 3, 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 63 y 70. Cinco minutos antes a que se fotografíen los ratones se les inyecta peritonealmente con 8 mg/kg de solución de luciferina. Los animales son entonces anestesiados y transferidos al sistema de imagen.
Se mantienen constantes los tiempos de adquisición de imagen como se mide la señal de bioluminiscencia con una cámara CCD fría.
En términos visuales, las células de expresión de luciferasa son vistas para permanecer principalmente en el sitio de inyección de ARN y fotografía de los animales después de la remoción de quas no muestra señal.
En términos cuantitativos, se mide la expresión de luclferasa como radiación promedio sobre un periodo de 70 días (p/s/cm2/sr) y los resultados son como a continuación para los 5 grupos.
El ARN de autorreplicación formulado con nanoemulsiones catiónicas muestra bioluminiscencia medible en el día 3, lo cual origina un pico en el día 7 y entonces se reduce a niveles base por los días 28 a 35. Cuando se formula en liposomas el ARN muestra bioluminiscencia medible en el día 3 , el cual origina un pico en el día 7 y reduce a niveles base por el día 63. El ARN suministrado usando VRP muestra bioluminiscencia mejorada en el día 21 cuando se compara con el ARN formulado, pero la expresión se ha reducido a niveles base por el día 28. El ADN electroporado muestra el nivel más alto de bioluminiscencia en todos los puntos medidos y niveles de bioluminiscencia no reducen a niveles base dentro de 70 días del experimento.
Ruta de Suministro El ARN encapsulado en liposoma que codifica HIV gpl40 es suministrado a ratones intramuscular, intradérmica, o subcutáneamente. Todas las tres rutas llevan a niveles de IgG altas séricas de anticuerpos específicos a VIH (Figura 15) , que exceden títulos en respuesta a ADN intramuscular electroporado.
Ratas de Algodón Se realiza un estudio en ratas de algodón (Sigmodon hispidis) en lugar de ratones. En una dosis de 1 µg de encapsulación de liposoma se incrementan los títulos IgG específicos a F por 8.3 veces comparado con ARN desnudo y se incrementan los títulos PRNT por 9.5 veces. La magnitud de la respuesta de anticuerpo es equivalente a aquella inducida por 5xl06 IU VRP. Tanto el ARN encapsulado en liposoma y desnudo son capaces de proteger las ratas de algodón a partir del reto con RSV (lxlO5 unidades formadoras de placa) , reduciendo la carga viral de pulmón por al menos 3.5 logs . La encapsulación incrementa la reducción por aproximadamente 2 veces .
Además de trabajo en ratas de algodón se usan cuatro diferentes replicones: vA317 expresa RSV-F de longitud completa; vA318 expresa RSV-F truncada (cola transmembranal y citoplásmica removida) RSV-F; vA142 expresa RSV-F con su péptido de fusión eliminado; vA140 expresa el RSV-F truncado también sin su péptido. Las ratas de algodón, 4 a 8 animales por grupo, son dadas con vacunaciones intramusculares (100 µg en una pierna) en los días 0 y 21 con los cuatro diferentes replicones en dos dosis (1.0 y 0.1 µg) formulados en liposomas hechos por el método (D) , pero con un tamaño de lote de AR de 150 g. Los grupos de control reciben una vacuna de proteína de subunidad RSV-F (5 µg) con adyuvante con alum (8 animales/grupo) , VRP que expresan RSV-F de longitud completa (lxlO6, 8 animales/grupo) , o control ingenuo (4 animales/grupo) . Se recolecta el suero para análisis de anticuerpo en los días 0, 21 y 34.
Los títulos de IgG séricos específicos a F y títulos de anticuerpo neutralizante sérico RSV en el día 21 y 34 son: estudio (vA317, vA318, vA142, vA140) son inmunogénicos en ratas de algodón cuando se suministran por liposoma, aunque los títulos de neutralización sérica son por lo menos diez veces menores que aquellos inducidos por vacunas de proteína con adyuvante o por VRP. Las vacunas de liposoma/ARN producen IgG específicos a F séricos y anticuerpos neutralizantes de RSV después de la primera vacunación, y una segunda vacunación refuerza la respuesta efectivamente. Los títulos IgG específicos a F después de la segunda vacunación con 1 µg de replicón son 2 a 3 veces superiores a aquella después de la segunda vacunación con 0.1 µg de replicón. Los cuatro replicones producen títulos de anticuerpo comparables, sugiriendo que la longitud completa y RSV-F truncada, cada una con o sin el péptido de fusión, son similarmente inmunogénicos en ratas de algodón.
Además trabajo en ratas de algodón otra vez usan los replicones de vA317, vA318 y vA142. Las ratas de algodón, 2-8 animales por grupo, son dadas con vacunaciones intramusculares (100 µ? en una pierna) en los días 0 y 21 con los replicones (0.1 ó 1 µg) encapsulados en liposomas RV01 hechos por el método (D) pero con un tamaño de lote de ARN de 150 µg. Los grupos de control reciben la vacuna de proteína de subunidad RSV-F (5 µg) en adyuvante con alum o RSV-F de longitud completa que expresa VRP (lxlO6 IU, animales/grupo) . Todos estos animales reciben una tercera vacunación (día 56) con vacuna de proteína de subunidad RSV-F (5 µg) con adyuvante con alum. Además hay un control ingenuo (4 animales/grupo) . Además, se da un grupo extra con vacunaciones intramusculares bilaterales (50 µg por pierna) en los días 0 y 56 con 1 µg de ARN de vA317 en liposomas pero no reciben una tercera vacunación con la vacuna de proteína de subunidad .
Se recolecta el suero para análisis de anticuerpo en los días 0, 21, 35, 56, 70, más los días 14, 28 y 42 para el grupo extra. Los títulos de IgG séricos específicos a F (GMT por sus siglas en inglés) son como a continuación.
Los títulos de neutralización sérica son como a continuación (60% de títulos de neutralización de RSV para 2 agrupaciones de 3-4 animales por grupo, GMT de estos dos agrupaciones por grupo) : Los títulos séricos y títulos de neutralización para el grupo extra son como a continuación: De esta forma los replicones son confirmados como inmunogénicos en ratas de algodón, produciendo IgG específico a F sérico y anticuerpos neutralizantes de RSV después de la primera vacunación. Una segunda vacunación refuerza las respuestas efectivamente. Los títulos de IgG específicos a F después de la' segunda vacunación con 1.0 µg de replicón son 1.5 a 4 veces superiores a aquella después de la segunda vacunación con 0.1 µg de replicón.
La tercera vacunación (proteína en el día 56) no refuerza títulos en ratas de algodón previamente vacunadas con la subunidad de trímero F + alum, pero proporciona un gran refuerzo a títulos en ratas de algodón previamente vacunadas con replicón. En la mayoría de los casos los títulos de neutralización séricos de RSV después de dos vacunaciones de replicón seguido por el refuerzo de proteína es igual a o mayor a los títulos inducidos por dos o tres vacunaciones de proteína secuenciales .
Este estudio evalúa también las cinéticas de la respuesta de anticuerpo a 1.0 µg vA317. Los títulos de neutralización de IgG y RSV séricos específicos a F inducidos por una sola vacunación alcanzan su pico alrededor del día 21 y son mantenidos a través de por lo menos el día 56 (50-70% de caída en título de IgG específico a F, cambia poco en titulo de neutralización de RSV) . Se da una segunda vacunación homologa a estos animales en el día 56, y los títulos de anticuerpo reforzado a un nivel por lo menos igual a aquel logrado cuando se administra la segunda vacunación en el día 21.
Experimentos adicionales implican un reto viral. El replicón vA368 codifica la glicoproteína de fusión superficial del tipo silvestre de longitud completa de RSV con el péptido de fusión eliminado, con expresión accionada por el EV71 IRES. Las ratas de algodón, 7 por grupo, son dadas con vacunación intramuscular (100 µ? por pierna) en los días 0 y 21 con vA368 en liposomas preparados por el método (H) , 175 µg de tamaño de lote de ARN, o con VRP que tiene el mismo replicón. Un grupo de control recibe 5 µg de proteina con adyuvante de alum, y un grupo de control ingenuo es también incluido.
Todos los grupos reciben un reto intranasal (i.n.) con lxlO6 PFU RSV cuatro semanas después de la inmunización final. Se recolecta el suero para análisis anticuerpo en los días 0, 21, 35. Los títulos de pulmón viral son medidos 5 días post reto. Los resultados son como a continuación: De esta forma la vacuna de ARN reduce la carga viral de pulmón por sobre tres logs, de aproximadamente 106 PFU/g en ratas de algodón de control no vacunado a menos de 103 PFU/g en ratas de algodón vacunadas.
Estudio en mamífero grande Se realiza un estudio animal grande en ganado. Las terneras son inmunizadas (4-6 semanas de edad, -60-80 kg, 5 por grupo) con 66 g de replicón vA317 que codifica proteína RSV F de longitud completa en los días 0, 21, 86 y 146. Los replicones son formulados dentro de liposomas . Se usa PBS solo como un control negativo, y se usa una vacuna autorizada como un control positivo ("Triángulo 4" a partir de Fort Dodge, que contiene virus muerto) . Todas las terneras reciben 15 µg de proteína F con adyuvante con emulsión MF59 en el día 146. Una vaca es vacunada erróneamente con la vacuna mala en el día 85 en lugar del triángulo 4 y por lo tanto sus datos son excluidos del día 100 hacia delante.
Las vacunas de ARN codifican RSV F humano mientras que la vacuna "triángulo 4" contiene RSV F bovino, pero la proteína RSV F es altamente conservada entre BRSV y HRSV.
Los liposomas son hechos por el método (E) , excepto que se usa un tamaño de lote de ARN de 1.5 mg.
Las terneras reciben 2 mi de cada vacuna experimental, se administran intramuscularmente como 2x1 mi en cada lado del cuello. En contraste, la vacuna del "triángulo 4" es dada como una sola dosis de 2 mi en el cuello.
Se recolecta el suero para análisis de anticuerpo en los días 0, 14, 21, 35, 42, 56, 63, 86, 100, 107, 114, 121, 128, 135, 146, 160, 167, 174, 181, 188, 195 y 202. Si un animal individual tiene un título abajo del límite de detección es asignado con el título de 5.
La Figura 14A muestra títulos de IgG específicos a F sobre los primeros 63 días. El replicón de ADN es inmunogénico en las vacas por medio de liposomas, aunque da menores títulos que la vacuna permitida. Todas las vacas vacunadas muestran anticuerpos específicos a F después de la segunda dosis, y los títulos son muy estables del periodo de 2 a 6 semanas después de la segunda dosis (y son particularmente estables para las vacunas de ARN) .
La Figura 14B muestra títulos de IgG séricos específicos a F (GMT) sobre 210 días, y mide valores hasta el día 202 como a continuación Los títulos de anticuerpo de neutralización de suero SRV son como a continuación: El material usado para la segunda dosis de liposoma no es preparado recientemente, y el mismo lote de AR muestra una disminución en potencia en un estudio de inmunogenicidad de ratón. Por lo tanto es posible que la vacuna pueda haber sido más inmunogénica si se ha usado material fresco para todas las vacunas .
Cuando se ensaya con complemento, se detectan anticuerpos neutralizantes en todas las vacas vacunadas. En este ensayo, todas las terneras vacunadas tienen buenos títulos de anticuerpo neutralizante después de la segunda vacunación de ARN. Adicionalmente, la vacuna ARN produce títulos de IgG de suero específicos a F que son detectados en unas cuantas terneras después de la segunda vacunación y en todas las terneras después de la tercera.
El RSV-F con adyuvante de MF 59 es capaz de reforzar la respuesta IgG en todas las terneras vacunadas previamente, y refuerzan títulos de neutralización independientes a complemento de terneras previamente vacunadas con ARN.
La prueba de concepto para vacunas de ARN en animales grandes es particularmente importante a la luz de la pérdida en potencia observada previamente con vacunas a base de ADN cuando se mueven de modelos de animales pequeños a animales más grandes y humanos. Una dosis típica para vacuna de ADN de vaca puede ser 0.5-1 mg (47, 48) y también está fomentando que respuestas inmunológicas sean inducidas con solamente 66 µg de AR .
Será entendido que la invención ha sido descrita por la forma de ejemplo solamente y se pueden hacer modificaciones mientras que permanecen dentro del alcance y espíritu de la invención.
Tabla 1: fosfolípidos útiles DIC 1, 2-didecanoil-sn-Glicero-3-fosfatidilcolina DEPA 1, 2-dierucoil-sn-glicero-3-fosfato DEPC 1, 2-erucoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina DEPE 1, 2-dierucoil-sn-glicero-3-fosfatidiletanolamina DEPG 1, 2-dierucoil-sn-glicero-3 (fosfatidi-rac- (1-glicerol) DLOPC 1, 2-linoleoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina DLPA 1, 2-dilauroil-sn-glicero-3-fosfato DLPC 1, 2-dialauroil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina DLPE 1, 2-dialuroil-sn-glicero-3-fosfatidiletanolamina DLPG 1, 2-dilauroil-sn-glicero-3[fosfatidil-rac- (1-glicerol) DLPS 1, 2-dialuroil-sn-glicero-3-fosfatidilserina DMG 1, 2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina DMPA 1, 2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfato DMPC 1, 2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina D PE 1, 2-dimiristoil-sn-glicero-3 fosfatidiletanolamina DMPG 1, 2-miristoil-sn-glicero-3[fosfatidil-rac- (1 glicerol) DMPS 1, 2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfatidilserina DOPA 1, 2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfato DOPC 1, 2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina DOPE 1, 2-dioleoil-sn-glicero-3 fosfatidiletanolamina DOPG 1, 2-dioleoil-sn-glicero-3-[fosfatidil-rac- (1 glicerol) DOPS 1, 2-dioleoil-sn-Glicero-3-fosfatidilserina DPPA 1, 2-dipalmitoil-sn-Glicero-3-fosfato DPPC 1 , 2 -dipalmitoil-sn-Glicero-3 -fosfatidilcolina DPPE 1, 2-dipalmitoil-sn-Glicero-3 fosfatidiletanolamina DPPG 1, 2-dipalmitoil-sn-Glicero-3[fosfatidil-rac (1-glicerol .. ) DPPS 1, 2 -dipalmitoil-sn-Glicero-3 -fosfatidilserina DPyPE 1, 2-difitanoil-sn-glicero-3 -fosfoetanolamina DSPA 1, 2-distearoil-sn-Glicero-3-fosfato DSPC 1 , 2-distearoil-sn-Glicero-3-fosfatidilcolina DSPE 1, 2-diostearpil-sn-Glicero-3 fosfatidiletanolamina DSPG 1, 2-distearoil-sn-Glicero-3-[fosfatidil-rac (l-glicerol .. ) DSPS 1 , 2-distearoil-sn-Glicero-3-fosfatidilserina EPC PC de huevo HEPC PC de huevo hidrogenado HSPC PC de soya hidrogenada de alta pureza PSC PC de soya hidrogenada LYSOP MYRISTIC l-miristoil-sn-Glicero-3 fosfatidiIcolina LYSOPC PALMITIC l-palmitoil-sn-Glicero-3 fosfatidilcolina LYSOPC STEARIC l-estearoil-sn-Glicero-3 fosfatidilcolina MPPC de esfingomielina de leche 1-miristoil , 2 palraitoil-sn-Glicero 3 -fosfatidilcolina MSPC 1-miristoil, 2-estearoil-sn-Glicero-3 fosfatidilcolina PMPC l-palmitoil-2-miristoil-sn-Glicero-3 fosfatidilcolina POPC 1-palmitoil , 2-oleoil-sn-Glicero-3 fosfatidilcolina POPE 1-palmitoil-2-oleoil-sn-Glicero-3 fosf tidiletanolamina POPG 1, 2-dioleoil-sn-Glicero-3[fosfatidil-rac- (1 glicerol) ... ] PSPC 1-palmitoil, 2-estearoil-sn-Glicero-3 fosfatidilcolina SMPC 1-estearoil, 2-rairistoil-sn-Glicero-3-fosfatidilcolina SOPC 1-estearoil, 2-oleoil-sn-Glicero-3-fosfatidilcolina SPPC 1-estearoil, 2-palmitoil-sn-Glicero-3 -fosfatidilcolina REFERENCIAS [1] Johanning et al . 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Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (16)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:
1. Una partícula de no viriones para suministro in vivo de ARN a una célula vertebrada, caracterizada porque (a) la partícula comprende un material de suministro ya sea (i) que encapsula una molécula de ARN de autorreplicación la cual codifica un inmunogen ó (ii) en la cual una molécula de ARN de autorreplicación la cual codifica un inmunogen ó (ii) en la cual una molécula de ARN de autorreplicación la cual codifica un inmunogen es adsorbida, y (b) el ARN incluye nucleótidos no modificados.
2. La partícula de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la partícula es un liposoma y el ARN es encapsulado en la misma.
3. La partícula de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la partícula es una micropartícula polimérica no tóxica y biodegradable y el ARN es adsorbido en la misma.
4. La partícula de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la partícula es una nanopartícula de polímero oligomérico reticulado biodegradable formada por hacer reaccionar un polímero, un reticulador, un monómero cargado y el ARN.
5. La partícula de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque el liposoma comprende un lípido con un grupo de cabeza catiónico.
6. La partícula de conformidad con la reivindicación 2 ó 5, caracterizada porque el liposoma comprende un lípido con un grupo de cabeza zwiteriónico .
7. La partícula de conformidad con la reivindicación 2, 5 ó 6, caracterizada porque el liposoma tiene un diámetro en el intervalo de 50-220 nm.
8. La partícula de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque la partícula comprende un poli (D( L-lacturo-co-glicoluro) .
9. La partícula de conformidad con la reivindicación 3 u 8, caracterizada porque la partícula tiene un diámetro de 30 nm a 7 µp?.
10. La partícula de conformidad con la reivindicación precedente, caracterizada porque la molécula de ARN de autorreplicación codifica (i) una ARN polimerasa dependiente a ARN la cual puede transcribir ARN a partir de la molécula de ARN de autorreplicación y (ii) un inmunogen.
11. La partícula de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque la molécula de ARN tiene dos cuadros de lectura abierta, el primero de los cuales codifica una replicasa de alfavirus y la segunda la cual codifica el inmunogen.
12. La partícula de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizada porque la molécula de ARN tiene 9000-12000 nucleótidos de largo.
13. La partícula de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizada porque el inmunogen puede producir una respuesta inmunológica in vivo contra una bacteria, un virus un hongo o un parásito. '
14. La partícula de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque el inmunogen puede producir una respuesta inmunológica in vivo contra la glicoproteína F del virus sincicial respiratorio.
15. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende una partícula de conformidad con cualquier reivindicación precedente.
16. Un método para incrementar una respuesta inmunológica protectora en un vertebrado, caracterizado porque comprende la etapa de administrar al vertebrado una cantidad efectiva de la partícula de conformidad con las reivindicaciones 1-14, ó la composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 15.
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