TW201729836A - 呼吸道融合病毒疫苗 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於呼吸道融合病毒(RSV)核糖核酸(RNA)疫苗，以及使用該等疫苗之方法及包含該等疫苗之組合物。

Description

呼吸道融合病毒疫苗 相關申請案
本申請案根據35 U.S.C.§ 119(e)主張2015年10月22日申請之美國臨時申請案第62/245,208號、2015年10月28日申請之美國臨時申請案第62/247,563號及2015年10月29日申請之美國臨時申請案第62/248,250號之權益，其各自以全文引用的方式併入本文中。本申請案亦根據35 U.S.C.§ 119(e)主張2015年10月22日申請之美國臨時申請案第62/245,031號之權益，其以全文引用的方式併入本文中。
人類呼吸道融合病毒(respiratory syncytial virus，RSV)係肺炎病毒亞科(Pneumovirinae)及副黏液病毒科(Paramyxoviridae)之一種反義、單股RNA病毒。在成年人中之症狀通常類似鼻竇感染或普通感冒，但該感染亦可能無症狀。在老年成年人(例如，>60歲)中，RSV感染可能會進展成毛細枝氣管炎或肺炎。在兒童中之症狀往往更嚴重，包括毛細枝氣管炎及肺炎。據估計在美國，大多數兒童在三歲時感染RSV。RSV病毒體由包含與核蛋白(N)、磷蛋白(P)及大聚合酶蛋白(L)結合之病毒RNA之內部核衣殼組成。該核衣殼由基質蛋白(M)包圍且經合併有病毒融合(F)及附著(G)蛋白以及小疏水性蛋白(SH)之脂質雙層囊封。病毒基因組亦編碼抑制I型干擾素活性之兩種非結構蛋白(NS1及NS2)以及M-2蛋白。
去氧核糖核酸(DNA)疫苗接種係一種用於刺激對於外來抗原(諸 如RSV抗原)之體液及細胞免疫反應之技術。向活宿主直接注入基因工程DNA(例如，裸質體DNA)導致少量宿主細胞直接產生抗原，從而產生保護性免疫反應。然而，利用此技術產生潛在問題，包括可能發生插入誘變，此可導致致癌基因活化或對腫瘤抑制基因之抑制作用。
本發明之RNA疫苗可用於誘發針對RSV之平衡免疫反應，該平衡免疫反應包含細胞與體液免疫性，而無例如插入誘變可能性之風險。
RNA(例如，mRNA)疫苗視感染之盛行率或未滿足醫療需求之程度或水準而可用於不同情境中。RNA疫苗可用於治療及/或預防RSV之各種基因型、菌株及分離株之感染。如本文所提供之RNA疫苗之優越特性在於其與市售抗病毒治療處理相比產生大得多之抗體效價且更早地產生反應。儘管不希望受理論束縛，但咸信本發明之RNA疫苗經更好地設計以在RNA疫苗指派天然細胞機制時經轉譯而產生適當之蛋白構型。與離體製造且可觸發不利細胞反應之傳統疫苗不同，如本文所提供之RNA疫苗以更自然之方式提供給細胞系統。
本發明之一些實施例提供呼吸道融合病毒(RSV)疫苗，其包括(i)至少一種核糖核酸(RNA)聚核苷酸，其具有編碼至少一種RSV抗原性多肽或其免疫原性片段(例如，能夠引起針對RSV之免疫反應之免疫原性片段)之開放閱讀框架，及(ii)醫藥學上可接受之載劑。
在一些實施例中，該至少一種RNA聚核苷酸具有至少一個化學修飾。
在一些實施例中，該抗原性多肽為醣蛋白G或其免疫原性片段。
在一些實施例中，抗原性多肽為醣蛋白F或其免疫原性片段。
在一些實施例中，至少一種抗原性多肽為醣蛋白F且至少一種抗 原性多肽係選自G、M、N、P、L、SH、M2、NS1及NS2。
在一些實施例中，至少一種抗原性多肽為醣蛋白F且至少兩種抗原性多肽係選自G、M、N、P、L、SH、M2、NS1及NS2。
在一些實施例中，RNA疫苗進一步包含佐劑。
在一些實施例中，至少一種RNA聚核苷酸由至少一種如SEQ ID NO：1、2、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、242、246、257、258或259所述之核酸序列，或與如SEQ ID NO：1、2、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、242、246、257、258或259所述之核酸序列具有至少80%一致性之同源物編碼。在一些實施例中，至少一種RNA聚核苷酸由至少一種如SEQ ID NO：1、2、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、242、246、257、258或259所述之核酸序列，或與如SEQ ID NO：1、2、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、242、246、257、258或259所述之核酸序列具有至少90%(例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.8%或99.9%)一致性之同源物編碼。在一些實施例中，至少一種RNA聚核苷酸由如SEQ ID NO：1、2、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、242、246、257、258或259所述之核酸序列之至少一個片段(例如，具有至少一種抗原性序列或至少一個抗原決定基之片段)編碼。
在一些實施例中，至少一種RNA聚核苷酸包含至少一種如SEQ ID NO：260至280中任一者所述之核酸序列，或與如SEQ ID NO：260至280中任一者所述之核酸序列具有至少80%一致性之同源物。在一些實施例中，至少一種RNA聚核苷酸包含至少一種如SEQ ID NO：260至280中任一者所述之核酸序列，或與如SEQ ID NO：260至280中任一者所述之核酸序列具有至少90%(例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.8%或99.9%)一致性之同源 物。在一些實施例中，至少一種RNA聚核苷酸包含如SEQ ID NO：260至280中任一者所述之核酸序列之至少一個片段(例如，具有至少一種抗原性序列或至少一個抗原決定基之片段)。
在一些實施例中，RSV抗原性多肽之胺基酸序列為如SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所述之胺基酸序列，或為該胺基酸序列之片段，或為與該胺基酸序列具有至少80%(例如，85%、90%、95%、98%、99%)一致性之同源物。
在一些實施例中，RSV抗原性多肽之胺基酸序列為如SEQ ID NO：3、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、243或245所述之胺基酸序列，或為該胺基酸序列之片段，或為與該胺基酸序列具有至少80%(例如，85%、90%、95%、98%、99%)一致性之同源物。
在一些實施例中，至少一種RNA(例如，mRNA)聚核苷酸編碼與本發明之胺基酸序列具有至少90%一致性且具有膜融合活性之抗原性多肽。在一些實施例中，至少一種RNA聚核苷酸編碼與本發明之胺基酸序列具有至少95%一致性且具有膜融合活性之抗原性多肽。在一些實施例中，至少一種RNA聚核苷酸編碼與本發明之胺基酸序列具有至少96%一致性且具有膜融合活性之抗原性多肽。在一些實施例中，至少一種RNA聚核苷酸編碼與本發明之胺基酸序列具有至少97%一致性且具有膜融合活性之抗原性多肽。在一些實施例中，至少一種RNA聚核苷酸編碼與本發明之胺基酸序列具有至少98%一致性且具有膜融合活性之抗原性多肽。在一些實施例中，至少一種RNA聚核苷酸編碼與本發明之胺基酸序列具有至少99%一致性且具有膜融合活性之抗原性多肽。在一些實施例中，至少一種RNA聚核苷酸編碼與本發明之胺基酸序列具有95至99%一致性且具有膜融合活性之抗原性多肽。
在一些實施例中，至少一種RNA(例如，mRNA)聚核苷酸編碼具 有本發明之胺基酸序列之抗原性多肽且為密碼子最佳化之mRNA。
在一些實施例中，至少一種RNA(例如，mRNA)聚核苷酸編碼具有本發明之胺基酸序列之抗原性多肽且與(相應)野生型mRNA序列具有小於80%一致性。在一些實施例中，至少一種RNA聚核苷酸編碼具有本發明之胺基酸序列之抗原性多肽且與野生型mRNA序列具有小於75%、85%或95%一致性。在一些實施例中，至少一種RNA聚核苷酸編碼具有本發明之胺基酸序列之抗原性多肽且與野生型mRNA序列具有30至80%、40至80%、50至80%、60至80%、70至80%、75至80%或78至80%一致性。在一些實施例中，至少一種RNA聚核苷酸編碼具有本發明之胺基酸序列之抗原性多肽且與野生型mRNA序列具有30至85%、40至85%、50至85%、60至85%、70至85%、75至85%或80至85%一致性。在一些實施例中，至少一種RNA聚核苷酸編碼具有本發明之胺基酸序列之抗原性多肽且與野生型mRNA序列具有30至90%、40至90%、50至90%、60至90%、70至90%、75至90%、80至90%或85至90%一致性。
在一些實施例中，至少一種RNA(例如，mRNA)聚核苷酸由與本發明之核酸序列具有至少90%一致性之核酸(例如，DNA)編碼。在一些實施例中，至少一種RNA聚核苷酸由與本發明之核酸序列具有至少95%一致性之核酸編碼。在一些實施例中，至少一種RNA聚核苷酸由與本發明之核酸序列具有至少96%一致性之核酸編碼。在一些實施例中，至少一種RNA聚核苷酸由與本發明之核酸序列具有至少97%一致性之核酸編碼。在一些實施例中，至少一種RNA聚核苷酸由與本發明之核酸序列具有至少98%一致性之核酸編碼。在一些實施例中，至少一種RNA聚核苷酸由與本發明之核酸序列具有至少99%一致性之核酸編碼。在一些實施例中，至少一種RNA聚核苷酸由與本發明之核酸序列具有95至99%一致性之核酸編碼。
在一些實施例中，至少一種mRNA聚核苷酸由具有本發明之序列之核酸編碼且與野生型mRNA序列具有小於80%一致性。在一些實施例中，至少一種mRNA聚核苷酸由具有本發明之序列之核酸編碼且與野生型mRNA序列具有小於75%、85%或95%一致性。在一些實施例中，至少一種mRNA聚核苷酸由具有本發明之序列之核酸編碼且與野生型mRNA序列具有小於30至80%、40至80%、50至80%、60至80%、70至80%、75至80%或78至80%一致性。在一些實施例中，至少一種mRNA聚核苷酸由具有本發明之序列之核酸編碼且與野生型mRNA序列具有小於30至85%、40至85%、50至85%、60至85%、70至85%、75至85%或80至85%一致性。在一些實施例中，至少一種mRNA聚核苷酸由具有本發明之序列之核酸編碼且與野生型mRNA序列具有小於30至90%、40至90%、50至90%、60至90%、70至90%、75至90%、80至90%或85至90%一致性。
在一些實施例中，至少一種RNA(例如，mRNA)聚核苷酸編碼具有本發明之胺基酸序列且與野生型mRNA序列具有至少80%一致性之抗原性多肽，但不包括野生型mRNA序列。
在一些實施例中，RSV疫苗包括至少一種具有編碼至少一種RSV抗原性多肽之開放閱讀框架之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸，該RNA聚核苷酸具有至少一個化學修飾。
在一些實施例中，RSV疫苗包括至少一種具有編碼至少一種RSV抗原性多肽之開放閱讀框架之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸，該RNA聚核苷酸具有至少一個化學修飾及至少一個5'端帽，其中RSV疫苗係在脂質奈米粒子中調配。
在一些實施例中，5'端帽為7mG(5')ppp(5')NlmpNp。
在一些實施例中，至少一個化學修飾係選自由以下組成之群：假尿苷、N1-甲基假尿苷、2-硫尿苷、4'-硫尿苷、5-甲基胞嘧啶、2- 硫基-1-甲基-1-去氮雜-假尿苷、2-硫基-1-甲基-假尿苷、2-硫基-5-氮雜-尿苷、2-硫基-二氫假尿苷、2-硫基-二氫尿苷、2-硫基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫基-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫基-1-甲基-假尿苷、4-硫基-假尿苷、5-氮雜-尿苷、二氫假尿苷、5-甲氧基尿苷及2'-O-甲基尿苷。
在一些實施例中，脂質奈米粒子包含陽離子型脂質、經PEG改質之脂質、固醇及非陽離子型脂質。在一些實施例中，陽離子型脂質為可電離之陽離子型脂質且非陽離子型脂質為中性脂質，且固醇為膽固醇。在一些實施例中，陽離子型脂質係選自由以下組成之群：2,2-二亞油基-4-二甲胺基乙基-[1,3]-二氧戊環(DLin-KC2-DMA)、二亞油基-甲基-4-二甲胺基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)、9-((4-(二甲胺基)丁醯基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L319)、(12Z,15Z)-N,N-二甲基-2-壬基二十一烷-12,15-二烯-1-胺(L608)及N,N-二甲基-1-[(1S,2R)-2-辛基環丙基]十七烷-8-胺(L530)。
在一些實施例中，脂質為
在一些實施例中，脂質為
本發明之一些實施例提供一種呼吸道融合病毒(RSV)疫苗，其包括至少一種具有編碼至少一種RSV抗原性多肽之開放閱讀框架之核糖核酸(RNA)聚核苷酸，其中該開放閱讀框架中至少80%之尿嘧啶具有化學修飾，視情況其中該RSV疫苗係在脂質奈米粒子中調配。
在一些實施例中，開放閱讀框架中100%之尿嘧啶具有化學修飾。在一些實施例中，化學修飾位於尿嘧啶之5位。在一些實施例中，化學修飾為N1-甲基假尿苷。在一些實施例中，化學修飾為位於尿嘧啶之5位之N1-甲基假尿苷。在一些實施例中，開放閱讀框架中100%之尿嘧啶經修飾以包括N1-甲基假尿苷。
本發明之一些實施例提供在個體中誘發抗原特異性免疫反應之方法，其包括向該個體投與有效產生抗原特異性免疫反應之量之RSVRNA(例如，mRNA)疫苗。
在一些實施例中，抗原特異性免疫反應包含T細胞反應或B細胞反應或兩者。
在一些實施例中，一種產生抗原特異性免疫反應之方法涉及單次投與RSV RNA(例如，mRNA)疫苗。在一些實施例中，方法進一步包括向個體投與補強劑量之RSV RNA(例如，mRNA)疫苗。根據本發明之補強疫苗可包含本文所揭示之任何RSV RNA(例如，mRNA)疫苗且可與初始投與之RSV RNA疫苗相同。在一些實施例中，每年在每個RSV季節投與相同之RSV RNA疫苗。
在一些實施例中，藉由皮內、鼻內或肌肉內注射向個體投與RSV RNA(例如，mRNA)疫苗。在一些實施例中，藉由肌肉內注射向個體投與RSV RNA疫苗。
本文亦提供用於在個體中誘發抗原特異性免疫反應之方法中之RSV RNA(例如，mRNA)疫苗，該方法包括向個體投與有效產生抗原特異性免疫反應之量之該RSV疫苗。
本文進一步提供RSV RNA(例如，mRNA)疫苗在製造用於在個體中誘發抗原特異性免疫反應之方法中之藥物中的用途，該方法包括向該個體投與有效產生抗原特異性免疫反應之量之該RSV疫苗。
本發明之一些態樣提供以在個體中產生抗原特異性免疫反應之 有效量來調配之RSV RNA(例如，mRNA)疫苗。
本發明之其他態樣提供在個體中誘發抗原特異性免疫反應之方法，該方法包括向個體投與在個體中產生抗原特異性免疫反應之有效量之本文所述之RSV RNA(例如，mRNA)疫苗。
在一些實施例中，抗-RSV抗原性多肽在個體中產生之抗體效價相對於對照物(例如，對照疫苗)而言增加至少1 log。在一些實施例中，抗-RSV抗原性多肽在個體中產生之抗體效價相對於對照物(例如，對照疫苗)而言增加1至3 log。
在一些實施例中，抗-RSV抗原性多肽在個體中產生之抗體效價相對於對照物(例如，對照疫苗)而言增加至少2倍。在一些實施例中，抗-RSV抗原性多肽在個體中產生之抗體效價相對於對照物(例如，對照疫苗)而言增加至少5倍。在一些實施例中，抗-RSV抗原性多肽在個體中產生之抗體效價相對於對照物(例如，對照疫苗)而言增加至少10倍。在一些實施例中，抗-RSV抗原性多肽在個體中產生之抗體效價相對於對照物(例如，對照疫苗)而言增加2至10倍。
在一些實施例中，對照物為抗-RSV抗原性多肽在未經投與RSV疫苗之個體中產生之抗體效價。在一些實施例中，對照物為抗-RSV抗原性多肽在經投與活的減毒或滅活RSV疫苗之個體中產生之抗體效價。在一些實施例中，對照物為抗-RSV抗原性多肽在經投與重組或經純化之RSV蛋白疫苗之個體中產生之抗體效價。在一些實施例中，對照物為抗-RSV抗原性多肽在經投與RSV類病毒粒子(VLP)疫苗之個體中產生之抗體效價。
在一些實施例中，有效量為等於比重組RSV蛋白疫苗之護理標準劑量減少至少2倍之劑量，其中抗-RSV抗原性多肽在個體中產生之抗體效價等於抗-RSV抗原性多肽在經投與護理標準劑量之重組或經純化之RSV蛋白疫苗、活的減毒或滅活RSV疫苗或RSV VLP疫苗之對照 個體中產生之抗體效價。
在一些實施例中，有效量為等於比重組RSV蛋白疫苗之護理標準劑量減少至少4倍之劑量，其中抗-RSV抗原性多肽在個體中產生之抗體效價等於抗-RSV抗原性多肽在經投與護理標準劑量之重組或經純化之RSV蛋白疫苗、活的減毒或滅活RSV疫苗或RSV VLP疫苗之對照個體中產生之抗體效價。
在一些實施例中，有效量為等於比重組RSV蛋白疫苗之護理標準劑量減少至少10倍之劑量，其中抗-RSV抗原性多肽在個體中產生之抗體效價等於抗-RSV抗原性多肽在經投與護理標準劑量之重組或經純化之RSV蛋白疫苗、活的減毒或滅活RSV疫苗或RSV VLP疫苗之對照個體中產生之抗體效價。
在一些實施例中，有效量為等於比重組RSV蛋白疫苗之護理標準劑量減少至少100倍之劑量，其中抗-RSV抗原性多肽在個體中產生之抗體效價等於抗-RSV抗原性多肽在經投與護理標準劑量之重組或經純化之RSV蛋白疫苗、活的減毒或滅活RSV疫苗或RSV VLP疫苗之對照個體中產生之抗體效價。
在一些實施例中，有效量為等於比重組RSV蛋白疫苗之護理標準劑量減少至少1000倍之劑量，其中抗-RSV抗原性多肽在個體中產生之抗體效價等於抗-RSV抗原性多肽在經投與護理標準劑量之重組或經純化之RSV蛋白疫苗、活的減毒或滅活RSV疫苗或RSV VLP疫苗之對照個體中產生之抗體效價。
在一些實施例中，有效量為等於比重組RSV蛋白疫苗之護理標準劑量減少2倍至1000倍之劑量，其中抗-RSV抗原性多肽在個體中產生之抗體效價等於抗-RSV抗原性多肽在經投與護理標準劑量之重組或經純化之RSV蛋白疫苗、活的減毒或滅活RSV疫苗或RSV VLP疫苗之對照個體中產生之抗體效價。
在一些實施例中，有效量為25μg至1000μg或50μg至1000μg或25至200μg之總劑量。在一些實施例中，有效量為50μg、100μg、200μg、400μg、800μg或1000μg之總劑量。在一些實施例中，有效量為總計兩次向個體投與之25μg之劑量。在一些實施例中，有效量為總計兩次向個體投與之50μg之劑量。在一些實施例中，有效量為總計兩次向個體投與之100μg之劑量。在一些實施例中，有效量為總計兩次向個體投與之200μg之劑量。在一些實施例中，有效量為總計兩次向個體投與之400μg之劑量。在一些實施例中，有效量為總計兩次向個體投與之500μg之劑量。
在一些實施例中，向個體投與之有效量為50μg至1000μg之總劑量(RSV RNA(例如，mRNA)疫苗之總劑量)。
在一些實施例中，RSV RNA(例如，mRNA)疫苗針對RSV之功效(或有效性)大於60%。
疫苗功效可使用標準分析來評估(參見例如，Weinberg等人，J Infect Dis.2010年6月1日；201(11)：1607-10)。舉例而言，疫苗功效可藉由雙盲、隨機化、臨床對照試驗來量測。疫苗功效可表示為在未接種疫苗(ARU)與接種疫苗(ARV)研究小組之間疾病發作率(AR)之按比例降低且可使用以下公式由來自接種疫苗組之疾病相對風險(RR)計算：功效=(ARU-ARV)/ARU×100；及功效=(1-RR)×100。
同樣，疫苗有效性可使用標準分析來評估(參見例如，Weinberg等人，J Infect Dis.2010年6月1日；201(11)：1607-10)。疫苗有效性為對在群體中疫苗(其可能已經證明具有高疫苗功效)如何減少疾病之評估。此量測可評估在自然野外條件下而非在對照臨床試驗中疫苗接種計劃而不僅僅疫苗本身之益處與不利影響之平衡。疫苗有效性與疫苗 功效(效力)成正比，但亦受群體中之目標組經免疫接種之程度如何，以及受影響住院治療、門診或成本之‘現實世界’結果之其他非疫苗相關因素影響。舉例而言，可使用回顧性病例對照分析，其中在一組感染病例及適當對照物中比較疫苗接種比率。疫苗有效性可使用用於儘管進行疫苗接種仍發展感染之比值比(OR)表示為比率差：有效性=(1-OR)×100。
在一些實施例中，RSV RNA(例如，mRNA)疫苗針對RSV之功效(或有效性)大於65%。在一些實施例中，疫苗針對RSV之功效(或有效性)大於70%。在一些實施例中，疫苗針對RSV之功效(或有效性)大於75%。在一些實施例中，疫苗針對RSV之功效(或有效性)大於80%。在一些實施例中，疫苗針對RSV之功效(或有效性)大於85%。在一些實施例中，疫苗針對RSV之功效(或有效性)大於90%。
在一些實施例中，疫苗使個體對RSV免疫長達1年(例如用於單個RSV季節)。在一些實施例中，疫苗使個體對RSV免疫長達2年。在一些實施例中，疫苗使個體對RSV免疫2年以上。在一些實施例中，疫苗使個體對RSV免疫3年以上。在一些實施例中，疫苗使個體對RSV免疫4年以上。在一些實施例中，疫苗使個體對RSV免疫5至10年。
在一些實施例中，經投與RSV RNA(例如，mRNA)疫苗之個體為約5歲或5歲以下，介於約1歲與約5歲之間(例如，約1、2、3、4、5或6歲)，介於約6個月與約1歲之間(例如，約6、7、8、9、10、11或12個月)，為約6個月或6個月以下，或為約12個月或12個月以下(例如，12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2個月或1個月)。在一些實施例中，個體為足月出生(例如，約37至42週)。在一些實施例中，個體在妊娠約36週或更早時(例如，約36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26或25週)早產，個體在妊娠約32週或更早時早產，或個體在妊娠約32週與約36週之間早產。
在一些實施例中，當投與RSV RNA(例如，mRNA)疫苗時，個體為孕婦(例如，在前期、中期或後期)。RSV引起下呼吸道感染，主要在嬰兒及幼兒中。三分之一的RSV相關死亡發生在生命之第一年中，其中此等死亡中之99%發生在資源匱乏之國家中。幾乎所有兒童在其第二個生日之前感染病毒在美國很普遍。因此，本發明提供用於產婦免疫以改善針對RSV之保護作用之母嬰傳播的RSV疫苗。
在一些實施例中，個體具有慢性肺病(例如，慢性阻塞性肺病(COPD)或氣喘)。COPD之兩種形式包括慢性枝氣管炎，其涉及長期咳嗽並伴有黏液，以及肺氣腫，其涉及隨時間對肺部之損傷。因此，經投與RSV RNA(例如，mRNA)疫苗之個體可能患有慢性枝氣管炎或肺氣腫。
在一些實施例中，個體已暴露於RSV，感染(具有)RSV，或存在感染RSV之風險。
在一些實施例中，個體免疫受損(具有受損之免疫系統，例如具有免疫病症或自體免疫病症)。
在一些實施例中、個體為約60歲、約70歲或70歲以上(例如，約60、65、70、75、80、85或90歲)之老年個體。
在一些實施例中，個體為介於約20歲與約50歲之間(例如，約20、25、30、35、40、45或50歲)的年輕成年人。
本發明之一些態樣提供呼吸道融合病毒(RSV)RNA(例如，mRNA)疫苗，其含有連接至RSV抗原性多肽之信號肽。因此，在一些實施例中，RSV RNA(例如，mRNA)疫苗含有至少一種核糖核酸(RNA)聚核苷酸，其具有編碼連接至RSV抗原性肽之信號肽之開放閱讀框架。本文亦提供編碼本文所揭示之RSV RNA(例如，mRNA)疫苗之核酸。
在一些實施例中，RSV抗原性肽為RSV附著蛋白(G)或其免疫原 性片段。在一些實施例中，RSV抗原性肽為RSV融合(F)醣蛋白或其免疫原性片段。在一些實施例中，RSV抗原性肽為核蛋白(N)或其免疫原性片段。在一些實施例中，RSV抗原性肽為磷蛋白(P)或其免疫原性片段。在一些實施例中，RSV抗原性肽為大聚合酶蛋白(L)或其免疫原性片段。在一些實施例中，RSV抗原性肽為基質蛋白(M)或其免疫原性片段。在一些實施例中，RSV抗原性肽為小疏水性蛋白(SH)或其免疫原性片段。在一些實施例中，RSV抗原性肽為非結構蛋白1(NS1)或其免疫原性片段。在一些實施例中，RSV抗原性肽為非結構蛋白2(NS2)或其免疫原性片段。
在一些實施例中，信號肽為IgE信號肽。在一些實施例中，信號肽為IgE HC(Ig重鏈ε-1)信號肽。在一些實施例中，信號肽具有序列MDWTWILFLVAAATRVHS(SEQ ID NO：281)。在一些實施例中，信號肽為IgGκ信號肽。在一些實施例中，信號肽具有序列METPAQLLFLLLLWLPDTTG(SEQ ID NO：282)。在一些實施例中，信號肽由序列TGGAGACTCCCGCTCAGCTGCTGTTTTTGCTCCTCCTATGGCTGCCGGATACCACCGGC(SEQ ID NO：287)或AUGGAGACUCCCGCUCAGCUGCUGUUUUUGCUCCUCCUAUGGCUGCCGGAUACCACCGGC(SEQ ID NO：288)編碼。在一些實施例中，信號肽係選自：日本腦炎PRM信號序列(MLGSNSGQRVVFTILLLLVAPAYS；SEQ ID NO：283)、VSVg蛋白信號序列(MKCLLYLAFLFIGVNCA；SEQ ID NO：284)及日本腦炎JEV信號序列(MWLVSLAIVTACAGA；SEQ ID NO：285)。在一些實施例中，信號肽為MELLILKANAITTILTAVTFC(SEQ ID NO：289)。
本文亦提供呼吸道融合病毒(RSV)疫苗，該等疫苗包含至少一種核糖核酸(RNA)聚核苷酸，其具有編碼膜結合RSV F蛋白、膜結合DS-Cav1(穩定化之融合前RSV F蛋白)或膜結合RSV F蛋白及膜結合DS- Cav1之組合之開放閱讀框架，及醫藥學上可接受之載劑。
在一些實施例中，RNA聚核苷酸包含SEQ ID NO：5之序列及/或SEQ ID NO：7之序列。
在一些實施例中，有效量之RSV RNA(例如，mRNA)疫苗(例如，單一劑量之RSV疫苗)導致針對RSV之血清中和抗體相對於對照物(例如，對照疫苗)而言增加2倍至200倍(例如，約2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200倍)。在一些實施例中，單一劑量之RSV RNA(例如，mRNA)疫苗導致針對RSV之血清中和抗體相對於對照物(例如，對照疫苗)而言增加約5倍、50倍或150倍。在一些實施例中，單一劑量之RSV RNA(例如，mRNA)疫苗導致針對RSV之血清中和抗體相對於對照物(例如，對照疫苗)而言增加約2倍至10倍或約40至60倍。
在一些實施例中，血清中和抗體為針對RSV A及/或RSV B。
在一些實施例中，RSV疫苗係在MC3脂質奈米粒子中調配(參見例如，美國公開案第2013/0245107 A1號及國際公開案第WO 2010/054401號)。
本文亦提供在個體中誘發抗原特異性免疫反應之方法，該方法包括向個體投與在個體中產生抗原特異性免疫反應之有效量之RSV RNA(例如，mRNA)疫苗，該疫苗包含至少一種核糖核酸(RNA)聚核苷酸，其具有編碼膜結合RSV F蛋白、膜結合DS-Cav1(穩定化之融合前RSV F蛋白)或膜結合RSV F蛋白與膜結合DS-Cav1之組合之開放閱讀框架，及醫藥學上可接受之載劑。
在一些實施例中，方法進一步包括投與補強劑量之RSV RNA(例如，mRNA)疫苗。在一些實施例中，方法進一步包括投與第二補強劑量之RSV疫苗。
在一些實施例中，當與鞭毛蛋白佐劑組合時，尤其一或多種編碼抗原之mRNA與編碼鞭毛蛋白之mRNA組合時，RNA疫苗RNA(例如，mRNA)之功效可顯著增強。
與鞭毛蛋白佐劑(例如，mRNA編碼之鞭毛蛋白佐劑)組合之RNA(例如，mRNA)疫苗之優越特性在於其與市售疫苗調配物相比可產生更大之抗體效價且更早地產生反應。儘管不希望受理論束縛，但咸信RNA疫苗(例如，mRNA聚核苷酸)經更好地設計以在RNA(例如，mRNA)疫苗指派天然細胞機制時對於抗原與佐劑兩者而言經轉譯而產生適當之蛋白構型。與離體製造且可觸發不利細胞反應之傳統疫苗不同，RNA(例如，mRNA)疫苗以更自然之方式提供給細胞系統。
本發明之一些實施例提供RNA(例如，mRNA)疫苗，其包括至少一種具有編碼至少一種抗原性多肽或其免疫原性片段(例如，能夠誘發針對原性多肽之免疫反應之免疫原性片段)之開放閱讀框架之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸及至少一種具有編碼鞭毛蛋白佐劑之開放閱讀框架之RNA(例如，mRNA聚核苷酸)。
在一些實施例中，至少一種鞭毛蛋白多肽(例如，經編碼之鞭毛蛋白多肽)為鞭毛蛋白。在一些實施例中，至少一種鞭毛蛋白多肽(例如，經編碼之鞭毛蛋白多肽)為免疫原性鞭毛蛋白片段。在一些實施例中，至少一種鞭毛蛋白多肽及至少一種抗原性多肽由單一RNA(例如，mRNA)聚核苷酸編碼。在其他實施例中，至少一種鞭毛蛋白多肽及至少一種抗原性多肽由不同RNA聚核苷酸編碼。
在一些實施例中，至少一種鞭毛蛋白多肽與具有SEQ ID NO：173至175之序列之鞭毛蛋白多肽具有至少80%、至少85%、至少90%或至少95%一致性。
在一些實施例中，本文所述之核酸疫苗經化學修飾。在其他實施例中，核酸疫苗未經修飾。
其他態樣提供用於對個體進行疫苗接種的組合物及方法，其包含向個體投與核酸疫苗，該核酸疫苗包含一或多個具有編碼第一呼吸道病毒抗原性多肽之開放閱讀框架的RNA聚核苷酸，其中RNA聚核苷酸不包括穩定元件，且其中佐劑不與疫苗共同調配或共同投藥。
在其他態樣中，本發明為一種用於對個體進行疫苗接種的組合物或方法，其包含向個體投與核酸疫苗，該核酸疫苗包含一或多個具有編碼第一抗原性呼吸道病毒多肽之開放閱讀框架的RNA聚核苷酸，其中向個體投與劑量介於10μg/kg與400μg/kg之間的核酸疫苗。在一些實施例中，藉由皮內或肌肉內注射向個體投與核酸疫苗。在一些實施例中，核酸疫苗在第零天向個體投與。在一些實施例中，在第二十一天向個體投與第二劑量的核酸疫苗。
在一些實施例中，在投與給個體之核酸疫苗中包括劑量為25微克的RNA聚核苷酸。在一些實施例中，在投與給個體之核酸疫苗中包括劑量為100微克的RNA聚核苷酸。在一些實施例中，在投與給個體之核酸疫苗中包括劑量為50微克的RNA聚核苷酸。在一些實施例中，在投與給個體之核酸疫苗中包括劑量為75微克的RNA聚核苷酸。在一些實施例中，在投與給個體之核酸疫苗中包括劑量為150微克的RNA聚核苷酸。在一些實施例中，在投與給個體之核酸疫苗中包括劑量為400微克的RNA聚核苷酸。在一些實施例中，在投與給個體之核酸疫苗中包括劑量為200微克的RNA聚核苷酸。在一些實施例中，RNA聚核苷酸在局部淋巴結中之累積量比在遠端淋巴結中高100倍。在其他實施例中，核酸疫苗經化學修飾；且在其他實施例中，核酸疫苗不經化學修飾。
本發明之態樣提供一種核酸疫苗，其包含一或多個具有編碼第一抗原性多肽之開放閱讀框架的RNA聚核苷酸以及醫藥學上可接受之載劑或賦形劑，其中RNA聚核苷酸不包括穩定元件，其中疫苗中不包 括佐劑。在一些實施例中，穩定元件為組蛋白莖-環。在一些實施例中，穩定元件為GC含量相對於野生型序列增加的核酸序列。
本發明之態樣提供核酸疫苗，其包含一或多個具有編碼第一抗原性多肽之開放閱讀框架的RNA聚核苷酸，其中RNA聚核苷酸以用於向宿主活體內投藥之調配物形式存在，對於可接受之百分比的人類個體而言，其賦予第一抗原優於血清保護準則的抗體效價。在一些實施例中，抗體效價為中和抗體效價。
亦提供核酸疫苗，其包含一或多個具有編碼第一抗原性多肽之開放閱讀框架的RNA聚核苷酸，其中RNA聚核苷酸以用於向宿主活體內投藥的調配物形式存在，其所引起的高抗體效價持續時間比由具有穩定化元件或用佐劑調配且編碼第一抗原性多肽的mRNA疫苗所引起的抗體效價長。在一些實施例中，RNA聚核苷酸經調配以在單次投藥一週之內產生中和抗體。在一些實施例中，佐劑係選自陽離子肽及免疫刺激性核酸。在一些實施例中，陽離子肽為魚精蛋白。
態樣提供核酸疫苗，其包含一或多個具有開放閱讀框架、包含至少一個化學修飾或視情況不含化學修飾之RNA聚核苷酸，該開放閱讀框架編碼第一抗原性多肽，其中RNA聚核苷酸以用於向宿主活體內投藥的調配物形式存在，使得宿主體內的抗原表現水準顯著超過藉由具有穩定化元件或用佐劑調配且編碼第一抗原性多肽的mRNA疫苗產生的抗原表現水準。
其他態樣提供核酸疫苗，其包含一或多個具有開放閱讀框架、包含至少一個化學修飾或視情況不含化學修飾之RNA聚核苷酸，開放閱讀框架編碼第一抗原性多肽，其中該疫苗所具有的RNA聚核苷酸比未經修飾之mRNA疫苗產生等效抗體效價所需的RNA聚核苷酸少至少10倍。在一些實施例中，RNA聚核苷酸以25-100微克的劑量存在。
本發明之態樣亦提供一個單位的使用疫苗，其包含10μg與400 μg之間的一或多個RNA聚核苷酸以及醫藥學上可接受之載劑或賦形劑，該一或多個RNA聚核苷酸具有開放閱讀框架、包含至少一個化學修飾或視情況不含化學修飾，開放閱讀框架編碼第一抗原性多肽，該疫苗經調配用於傳遞至人類個體中。在一些實施例中，疫苗進一步包含陽離子脂質奈米粒子。
本發明之態樣提供在一名個體或一群個體中創建、維持或恢復對呼吸道病毒株之抗原記憶的方法，其包含向該個體或群體投與增強抗原記憶之核酸疫苗，該核酸疫苗包含(a)至少一個RNA聚核苷酸，該聚核苷酸包含至少一個化學修飾或視情況不含化學修飾及兩個或更多個經密碼子最佳化之開放閱讀框架，該等開放閱讀框架編碼一組參考抗原性多肽，及(b)視情況選用之醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。在一些實施例中，經由選自由肌肉內投與、皮內投與及皮下投與組成之群的途徑向個體投與疫苗。在一些實施例中，投藥步驟包含用適合於注射組合物之裝置接觸個體之肌肉組織。在一些實施例中，投藥步驟包含與電穿孔組合用適合於注射組合物之裝置接觸個體之肌肉組織。
本發明之態樣提供對個體進行疫苗接種之方法，其包含向個體投與介於25μg/kg與400μg/kg之間的單一劑量的核酸疫苗，該核酸疫苗包含可有效對個體進行疫苗接種的量的一或多個具有編碼第一抗原性多肽之開放閱讀框架的RNA聚核苷酸。
其他態樣提供核酸疫苗，其包含一或多個具有開放閱讀框架、包含至少一個化學修飾之RNA聚核苷酸，開放閱讀框架編碼第一抗原性多肽，其中該疫苗所具有的RNA聚核苷酸比未經修飾之mRNA疫苗產生等效抗體效價所需的RNA聚核苷酸少至少10倍。在一些實施例中，RNA聚核苷酸以25-100微克的劑量存在。
其他態樣提供核酸疫苗，其包含經LNP調配之具有開放閱讀框架 且不含化學修飾(未經修飾)的RNA聚核苷酸，開放閱讀框架編碼第一抗原性多肽，其中該疫苗所具有的RNA聚核苷酸比不在LNP中調配的未經修飾之mRNA疫苗產生等效抗體效價所需的RNA聚核苷酸少至少10倍。在一些實施例中，RNA聚核苷酸以25-100微克的劑量存在。
實例中所呈現之資料證明，使用本發明調配物顯著增強了免疫反應。經化學修飾及未經修飾之RNA疫苗均適用於本發明。出人意料地，與先前技術報導(較佳使用在載劑中調配的未經化學修飾之mRNA來製造疫苗)相反，本文描述了，經化學修飾之mRNA-LNP疫苗所需的有效mRNA劑量遠低於未經修飾之mRNA，亦即，當在除LNP以外之載劑中調配時，比未經修飾之mRNA低十倍。本發明之經化學修飾及未經修飾之RNA疫苗所產生的免疫反應均優於在不同的脂質載劑中調配的mRNA疫苗。
在其他態樣中，本發明涵蓋一種治療年齡為60歲或更大的老年個體的方法，其包含向個體投與核酸疫苗，該核酸疫苗包含可有效對個體進行疫苗接種的量的一或多個具有編碼呼吸道病毒抗原性多肽之開放閱讀框架的RNA聚核苷酸。
在其他態樣中，本發明涵蓋一種治療年齡為17歲或更小的幼齡個體的方法，其包含向個體投與核酸疫苗，該核酸疫苗包含可有效對個體進行疫苗接種的量的一或多個具有編碼呼吸道病毒抗原性多肽之開放閱讀框架的RNA聚核苷酸。
在其他態樣中，本發明涵蓋一種治療成年個體之方法，其包含向個體投與核酸疫苗，該核酸疫苗包含可有效對個體進行疫苗接種的量的一或多個具有編碼呼吸道病毒抗原性多肽之開放閱讀框架的RNA聚核苷酸。
在一些態樣中，本發明為一種用包括至少兩個編碼呼吸道抗原之核酸序列的組合疫苗對個體進行疫苗接種的方法，其中疫苗之劑量 為組合治療劑量，其中各編碼抗原之個別核酸之劑量為子治療劑量。在一些實施例中，在投與給個體之核酸疫苗中，組合劑量為25微克RNA聚核苷酸。在一些實施例中，在投與給個體之核酸疫苗中，組合劑量為100微克RNA聚核苷酸。在一些實施例中，在投與給個體之核酸疫苗中，組合劑量為50微克RNA聚核苷酸。在一些實施例中，在投與給個體之核酸疫苗中，組合劑量為75微克RNA聚核苷酸。在一些實施例中，在投與給個體之核酸疫苗中，組合劑量為150微克RNA聚核苷酸。在一些實施例中，在投與給個體之核酸疫苗中，組合劑量為400微克RNA聚核苷酸。在一些實施例中，各編碼抗原之個別核酸之子治療劑量為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20微克。在其他實施例中，核酸疫苗經化學修飾；且在其他實施例中，核酸疫苗不經化學修飾。
RNA聚核苷酸為SEQ ID NO：1、2、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、242、246、257、258或259中之一者且包括至少一個化學修飾。在其他實施例中，RNA聚核苷酸為SEQ ID NO：1、2、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、242、246、257、258或259中之一者且不包括任何化學修飾，或未經修飾。在其他實施例中，至少一個RNA聚核苷酸編碼SEQ ID NO：3、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、243或245中之任一者之抗原性蛋白且包括至少一個化學修飾。在其他實施例中，RNA聚核苷酸編碼SEQ ID NO：3、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、243或245中之任一者之抗原性蛋白且不包括任何化學修飾，或未經修飾。
本發明之各實施例之詳情係在以下描述中陳述。本發明之其他特點、目標及優勢將自描述及圖式以及申請專利範圍而明瞭。
如在不同視圖中類似參考字符係指相同部分之附圖中所說明，前述及其他目標、特點及優勢將自以下本發明之特定實施例之描述而明瞭。圖式不一定按照比例，反而著重於說明本發明之各實施例之原理。
圖1展示來自對小鼠之免疫原性研究之資料，該研究經設計以評估與蛋白抗原相比對使用與MC3 LNP一起調配之各種mRNA疫苗傳遞之RSV疫苗抗原的免疫反應。該資料顯示強的中和抗體效價。
圖2展示RNA/LNP疫苗產生與蛋白抗原相比高得多之細胞免疫反應。
圖3A至3C展示來自測試小鼠中之免疫原性之細胞內細胞介素染色檢定的資料，其顯示RSV-F mRNA/NLP疫苗及RSV-G mRNA/LNP疫苗，而非DS-CAV1蛋白抗原，在小鼠中引發穩健之Th1偏向性CD4+免疫反應。
圖4A至4C展示來自測試小鼠中之免疫原性之細胞內細胞介素染色檢定的資料，其顯示RSV-F mRNA/NLP疫苗及RSV-G mRNA/LNP疫苗，而非DS-CAV1蛋白抗原，在小鼠中引發穩健之Th1偏向性CD8+免疫反應。
圖5展示來自對小鼠之免疫原性研究之資料，其顯示強的中和抗體效價，等於使用以ADJU-PHOS®作為佐劑之蛋白抗原達成之彼等效價。
圖6A至6C展示來自測試小鼠中之免疫原性之細胞內細胞介素染色檢定的資料，其顯示RSV-F mRNA/LNP疫苗及RSV-G mRNA/LNP疫苗，而非DS-CAV1蛋白抗原，在小鼠中引發穩健之Th1偏向性CD4+免疫反應。
圖7A至7C展示來自測試小鼠中之免疫原性之細胞內細胞介素染色檢定的資料，其證實RSV-F mRNA/LNP疫苗，而非RSV-G mRNA/LNP疫苗或DS-CAV1蛋白抗原，在小鼠中引發穩健之TH1偏向性CD8+免疫反應。
圖8展示來自檢定之資料，其顯示自經與MC3 LNP一起調配之RSV mRNA疫苗免疫接種之任何小鼠的肺部未發現病毒，且在較低劑量之DS-CAV1蛋白/ADJU-PHOS®疫苗下僅一隻動物在鼻部具有可偵測到之任何病毒。
圖9展示來自對棉鼠之免疫原性研究之資料，其顯示在經與MC3 LNP一起調配之各種RSV mRNA疫苗免疫接種之動物中強的中和抗體效價。
圖10展示來自棉鼠競爭ELISA之資料，其表徵對各種RSV mRNA疫苗之抗原性Ø及抗原性位點II反應。
圖11展示來自棉鼠攻毒檢定之資料，其顯示與MC3 LNP一起調配之RSV mRNA疫苗之保護性作用。
圖12展示代表在非洲綠猴中由RSV mRNA疫苗及對照調配物誘發之針對RSV A之血清中和抗體效價(NT50個別及GMT，95%信賴區間)的圖表。
圖13A至13B展示代表在第10週所量測(PD3 2週)之針對帕利珠單抗(palivizumab)(位點II)(圖13A)及D25(位點Ø)(圖13B)之血清抗體競爭ELISA效價(IT50個別及GMT，95%信賴區間)的圖表。
圖14A至14B展示代表在95%信賴區間下在非洲綠猴中攻毒後所偵測到之平均肺部病毒血症(圖13A)及攻毒後所偵測到之平均鼻部病毒血症(圖13B)的圖表。
圖15展示代表在疫苗接種後2週經歷RSV之非洲綠猴中由各種RSV mRNA疫苗及對照調配物誘發之針對RSV A之血清中和抗體效價(NT50個別及GMT，95%信賴區間)的圖表。
圖16展示代表在經歷RSV之非洲綠猴中由各種RSV mRNA疫苗及 對照調配物誘發之針對RSV A之血清中和抗體效價(GMT，95%信賴區間)的圖表。
圖17A至17B展示代表在基線及免疫接種後4週所量測之針對帕利珠單抗(位點II)(圖17A)及D25(位點Ø)(圖17B)之血清抗體競爭ELISA效價(IT50個別及GMT，95%信賴區間)的圖表。
圖18A至18B展示代表在經歷RSV之非洲綠猴中由各種疫苗及對照調配物誘發之RSV F特異性CD4+(圖18A)及CD8+(圖18B)T細胞反應的圖表。
圖19展示代表在第4週(針對RSV A(圓形)及RSV B(方形)之劑量1後4週)及第8週(針對RSV A(向上指之三角形)及RSV B(向下指之三角形)之劑量2後4週)棉鼠中由各種疫苗及對照調配物誘發之針對RSV A及RSV B之血清中和抗體效價(NT50個別及GMT，95%信賴區間)的圖表。
圖20展示代表在95%信賴區間下以RSV B 18357攻毒後所量測之棉鼠中平均肺部(圓形)及鼻部(方形)病毒複本數的圖表。
本發明之實施例提供RNA(例如，mRNA)疫苗，其包括(至少一種)編碼呼吸道融合病毒(RSV)抗原之聚核苷酸。RSV係肺炎病毒亞科之反義、單股RNA病毒。該病毒存在至少兩種抗原性亞組，稱為A組及B組，主要因為表面G醣蛋白之差異。兩種RSV表面醣蛋白G及F介導與呼吸道上皮細胞附著及附著至呼吸道上皮細胞。F表面醣蛋白介導相鄰細胞之接合。此導致形成合胞細胞。RSV係毛細枝氣管炎之最常見原因。大多數受感染之成年人發展成類似輕微感冒之症狀，諸如充血、低熱及喘息。嬰兒及幼兒可能會罹患更嚴重之症狀，諸如毛細枝氣管炎及肺炎。該疾病可經由與呼吸道分泌物接觸而在人中間傳播。
RSV之基因組編碼至少三種表面醣蛋白，包括F、G及SH，四種核衣殼蛋白，包括L、P、N及M2，及一種基質蛋白，M。醣蛋白F藉由病毒體與宿主膜之間的融合引導病毒穿透。醣蛋白G為II型跨膜醣蛋白且為主要附著蛋白。SH為短的整合膜蛋白。基質蛋白M存在於脂質雙層之內層中且輔助病毒體形成。核衣殼蛋白L、P、N及M2調節RSV基因組之複製及轉錄。人們認為醣蛋白G在枝氣管上皮細胞之表面上繫栓及穩定化病毒粒子，而醣蛋白F與細胞糖胺聚糖相互作用以介導RSV病毒體內含物融合及傳遞至宿主細胞中(Krzyzaniak MA等人PLoS Pathog 2013；9(4))。
如本文所提供之RSV RNA(例如，mRNA)疫苗可用於誘發平衡免疫反應，包含細胞及體液免疫性，而無許多與DNA疫苗接種相關之風險。
國際申請案第PCT/US2015/02740號之整個內容以引用的方式併入本文中。
已發現，本文所述之mRNA疫苗在若干方面優於當前疫苗。首先，脂質奈米粒子(LNP)傳遞優於文獻中所述的包括魚精蛋白基礎方法的其他調配物，且不需要額外佐劑。LNP之使用實現了經化學修飾或未經修飾之mRNA疫苗的有效傳遞。另外，本文已證明，經修飾及未經修飾之經LNP調配的mRNA疫苗均在顯著程度上優於習知疫苗。在一些實施例中，本發明之mRNA疫苗比習知疫苗好至少10倍、20倍、40倍、50倍、100倍、500倍或1,000倍。
雖然嘗試過製造功能性RNA疫苗，包括mRNA疫苗及自我複製RNA疫苗，但此等RNA疫苗之治療功效尚未完全確立。非常出人意料地，根據本發明之態樣，本發明人發現了一類用於活體內傳遞mRNA疫苗之調配物，其產生顯著增強的且在很多方面協同的免疫反應，包括增強的抗原產生及具有中和能力之功能性抗體產生。即使在投與劑 量顯著低於在其他各類基於脂質之調配物中所用的mRNA劑量的mRNA時，仍可以達成此等結果。本發明之調配物已展現出足以建立功能性mRNA疫苗作為預防及治療劑之功效的顯著出人意料的活體內免疫反應。另外，自我複製RNA疫苗依靠病毒複製路徑向細胞傳遞足夠RNA以產生免疫原性反應。本發明之調配物不需要病毒複製來產生足以產生強免疫反應的蛋白質。因此，本發明之mRNA並非自我複製RNA且不包括病毒複製所需之組分。
在一些態樣中，本發明涉及以下出人意料的發現：脂質奈米粒子(LNP)調配物顯著增強mRNA疫苗、包括經化學修飾及未經修飾之mRNA疫苗的有效性。使用若干不同抗原檢查在LNP中調配之mRNA疫苗的活體內功效。本文中呈現之結果證明在LNP中調配之mRNA疫苗的功效意外地優於其他市售疫苗。
相比於所測試的其他疫苗，本發明之調配物除了提供增強的免疫反應之外，亦更快速地產生免疫反應且抗原劑量更小。本發明之mRNA-LNP調配物亦定量地且定性地產生優於在不同載劑中調配的疫苗的免疫反應。
本文所述之資料證明，本發明之調配物產生出乎意料地優於現有抗原疫苗之顯著改良。另外，本發明之mRNA-LNP調配物優於其他疫苗，即使在mRNA之劑量低於其他疫苗時仍然如此。比較小鼠中用MC3 LNP調配的各種mRNA疫苗的蛋白質抗原疫苗接種。資料證明，相比於現有疫苗，mRNA疫苗產生更強的中和抗體效價，細胞免疫反應比蛋白質抗原高得多，在小鼠中引起穩定的偏向Th1的CD4+及CD8+免疫反應且肺中的病毒減少。與在較低劑量之蛋白質/佐劑疫苗調配物情況下的僅一隻動物相反，自經用MC3 LNP調配之RSV mRNA疫苗免疫的小鼠中之任一者之肺中未回收到病毒。亦在大鼠及猴中達成顯著中和抗體效價。
本文所述之研究中所用的LNP先前用於在各種動物模型中以及在人類中傳遞siRNA。鑒於聯合LNP調配物之siRNA傳遞所得的觀察結果，LNP適用於疫苗這一事實非常出人意料。已觀察到，在LNP中調配之siRNA的治療性傳遞引起了與短暫性IgM反應有關的不當發炎反應，通常導致抗原產量降低且免疫反應減弱。與siRNA所觀察到之結果相反，本文證明本發明之LNP-mRNA調配物可產生增強的IgG水準，對於預防及治療方法而言為足夠的，並非短暫性IgM反應。
核酸/聚核苷酸
如本文所提供之RSV疫苗包含至少一種(一或多種)核糖核酸(RNA)聚核苷酸，其具有編碼至少一種RSV抗原性多肽之開放閱讀框架。術語「核酸」以其最廣泛之含義包括包含核苷酸聚合物之任何化合物及/或物質。此等聚合物稱為聚核苷酸。
在一些實施例中、至少一種RNA聚核苷酸由至少一種如SEQ ID NO：1、2、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、242、246、257、258或259所述之核酸序列，或與如SEQ ID NO：1、2、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、242、246、257、258或259所述之核酸序列具有至少80%一致性之同源物編碼。在一些實施例中、至少一種RNA聚核苷酸由至少一種如SEQ ID NO：1、2、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、242、246、257、258或259所述之核酸序列，或與如SEQ ID NO：1、2、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、242、246、257、258或259所述之核酸序列具有至少90%(例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.8%或99.9%)一致性之同源物編碼。在一些實施例中，至少一種RNA聚核苷酸由如SEQ ID NO：1、2、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、242、246、257、258或259所述之核酸序列之至少一個片段(例如，具有至少一種 抗原性序列或至少一個抗原決定基之片段)編碼。在一些實施例中，至少一種RNA聚核苷酸具有至少一個化學修飾。在一些實施例中，至少一種RNA聚核苷酸為mRNA聚核苷酸，其中mRNA聚核苷酸之每一尿嘧啶(100%之尿嘧啶)經化學修飾。在一些實施例中，至少一種RNA聚核苷酸為mRNA聚核苷酸，其中mRNA聚核苷酸之每一尿嘧啶(100%之尿嘧啶)經化學修飾以包括N1-甲基假尿苷。
在一些實施例中，RSV抗原性多肽之胺基酸序列為如SEQ ID NO：3、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、243或245所述之胺基酸序列，或為如SEQ ID NO：3、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、243或245所述之胺基酸序列之(抗原性)片段，或為與如SEQ ID NO：3、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、243或245所述之胺基酸序列具有至少80%(例如，85%、90%、95%、98%、99%)一致性之同源物。
核酸(亦稱為聚核苷酸)可為或可包括例如核糖核酸(RNA)、去氧核糖核酸(DNA)、蘇糖核酸(TNA)、二醇核酸(GNA)、肽核酸(PNA)、鎖核酸(LNA)，包括具有β-D-核糖組態之LNA、具有α-L-核糖組態之α-LNA(LNA之非對映異構體)、具有2'-胺基官能基之2'-胺基-LNA及具有2'-胺基官能基之2'-胺基-α-LNA)、乙烯核酸(ENA)、環己烯基核酸(CeNA)或其嵌合體或組合。
在一些實施例中，本發明之聚核苷酸充當信使RNA(mRNA)。「信使RNA」(mRNA)係指編碼(至少一種)多肽(天然存在、非天然存在或經修飾之胺基酸聚合物)且可經轉譯以活體外、活體內、原位或離體產生經編碼之多肽的任何聚核苷酸。熟習技工將瞭解，除了另外規定，本申請案中所陳述之聚核苷酸序列將在代表性DNA序列中列舉「T」，但當序列表示RNA(例如，mRNA)時，「T」將被取代為「U」。因此，由以特定序列識別號識別之DNA編碼之任何RNA聚核 苷酸亦可包含由DNA編碼之對應RNA(例如，mRNA)序列，其中DNA序列之每一「T」經「U」取代。
mRNA分子之基本組分通常包括至少一個編碼區、5'未轉譯區(UTR)、3'UTR、5'端帽及poly-A尾。本發明之聚核苷酸可充當mRNA，但在其功能性及/或結構設計特徵方面可區別於野生型mRNA，該等特徵用以使用基於核酸之治療來克服有效多肽表現之現有問題。
在一些實施例中，RSV疫苗之RNA聚核苷酸(例如，mRNA)編碼2至10種、2至9種、2至8種、2至7種、2至6種、2至5種、2至4種、2至3種、3至10種、3至9種、3至8種、3至7種、3至6種、3至5種、3至4種、4至10種、4至9種、4至8種、4至7種、4至6種、4至5種、5至10種、5至9種、5至8種、5至7種、5至6種、6至10種、6至9種、6至8種、6至7種、7至10種、7至9種、7至8種、8至10種、8至9種或9至10種抗原性多肽。在一些實施例中，RSV RNA(例如，mRNA)疫苗之RNA聚核苷酸(例如，mRNA)編碼至少10種、20種、30種、40種、50種、60種、70種、80種、90種或100種抗原性多肽。在一些實施例中，RSV疫苗之RNA聚核苷酸(例如，mRNA)編碼至少100種抗原性多肽，或至少200抗原性多肽。在一些實施例中，RSV疫苗之RNA聚核苷酸(例如，mRNA)編碼1至10種、5至15種、10至20種、15至25種、20至30種、25至35種、30至40種、35至45種、40至50種、1至50種、1至100種、2至50種或2至100種抗原性多肽。
在一些實施例中，本發明之聚核苷酸(例如，mRNA)經密碼子最佳化。密碼子最佳化方法在此項技術中已知且可如本文所提供來使用。在一些實施例中，密碼子最佳化可用於匹配標靶及宿主有機體之密碼子頻率以確保適當摺疊；偏向GC含量以增加mRNA穩定性或減少二級結構；使可損害基因構造或表現之串聯重複密碼子或鹼基運作最 小化；定製轉錄及轉譯控制區；插入或移除蛋白運輸序列；在所編碼蛋白(例如，醣苷化位點)中移除/添加轉譯後修飾位點；添加、移除或改組蛋白結構域；插入或刪除限制位點；修飾核糖體結合位點及mRNA降解位點；調節轉譯速率以使得蛋白之各種結構域可適當摺疊；或減少或消除聚核苷酸內有問題之二級結構。密碼子最佳化工具、演算法及服務在此項技術中已知，非限制性實例包括來自GeneArt(Life Technologies)、DNA2.0(Menlo Park CA)及/或專利方法之服務。在一些實施例中，使用最佳化演算法最佳化開放閱讀框架(ORF)序列。
在一些實施例中，密碼子最佳化之序列與天然存在或野生型序列(例如，編碼所關注多肽或蛋白(例如，抗原性蛋白或多肽)之天然存在或野生型mRNA序列)共有小於95%序列一致性。在一些實施例中，密碼子最佳化之序列與天然存在或野生型序列(例如，編碼所關注多肽或蛋白(例如，抗原性蛋白或多肽)之天然存在或野生型mRNA序列)共有小於90%序列一致性。在一些實施例中，密碼子最佳化之序列與天然存在或野生型序列(例如，編碼所關注多肽或蛋白(例如，抗原性蛋白或多肽)之天然存在或野生型mRNA序列)共有小於85%序列一致性。在一些實施例中，密碼子最佳化之序列與天然存在或野生型序列(例如，編碼所關注多肽或蛋白(例如，抗原性蛋白或多肽)之天然存在或野生型mRNA序列)共有小於80%序列一致性。在一些實施例中，密碼子最佳化之序列與天然存在或野生型序列(例如，編碼所關注多肽或蛋白(例如，抗原性蛋白或多肽)之天然存在或野生型mRNA序列)共有小於75%序列一致性。
在一些實施例中，密碼子最佳化序列與天然存在或野生型序列(例如，編碼所關注多肽或蛋白(例如，抗原性蛋白或多肽)之天然存在或野生型mRNA序列)共有介於65%與85%之間(例如，介於約67%與約 85%之間或介於約67%與約80%之間)的序列一致性。在一些實施例中，密碼子最佳化序列與天然存在或野生型序列(例如，編碼所關注多肽或蛋白(例如，抗原性蛋白或多肽)之天然存在或野生型mRNA序列)共有介於65%與75%或約80%之間的序列一致性。
在一些實施例中，RSV疫苗包括至少一種RNA聚核苷酸，其具有編碼至少一種RSV抗原性多肽之開放閱讀框架，具有至少一個修飾、至少一個5'端帽，且在脂質奈米粒子中調配。根據製造商之方案，聚核苷酸之5'封端可在活體外轉錄反應期間使用以下化學RNA帽類似物來同時完成以產生5'-鳥苷帽結構：3'-O-Me-m7G(5')ppp(5')G[ARCA帽]；G(5')ppp(5')A；G(5')ppp(5')G；m7G(5')ppp(5')A；m7G(5')ppp(5')G(New England BioLabs,Ipswich,MA)。經修飾之RNA之5'封端可在轉錄後使用牛痘病毒封端酶完成以產生「帽0」結構：m7G(5')ppp(5')G(New England BioLabs,Ipswich,MA)。帽1結構可使用牛痘病毒封端酶與2'-O甲基-轉移酶來產生以產生：m7G(5')ppp(5')G-2'-O-甲基。帽2結構可由帽1結構產生，隨後使用2'-O甲基-轉移酶對5'倒數第三個核苷酸進行2'-O-甲基化。帽3結構可由帽2結構產生，隨後使用2'-O甲基-轉移酶對5'倒數第三個核苷酸進行2'-O-甲基化。酶可自重組來源衍生。
當轉染至哺乳動物細胞中時，經修飾之mRNA具有介於12至18小時之間，或大於18小時，例如24、36、48、60、72小時或大於72小時之穩定性。
在一些實施例中，密碼子最佳化之RNA可為其中G/C含量增強之RNA。核酸分子(例如，mRNA)之G/C含量可影響RNA之穩定性。鳥瞟呤(G)及/或胞嘧啶(C)殘基之量增加之RNA在功能方面可比含有大量腺嘌呤(A)及胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)核苷酸之RNA更穩定。舉例而言，WO02/098443揭示一種醫藥組合物，其含有在轉譯區藉由序列修 飾穩定化之mRNA。由於遺傳密碼之退化，修飾藉由以促進更大RNA穩定性而不改變所得胺基酸之彼等密碼子取代現有密碼子來起作用。該方法侷限於RNA之編碼區。
抗原/抗原性多肽
已知存在RSV之至少兩種抗原性亞組(A及B)。此抗原性二態性係主要歸因於表面G醣蛋白之差異。兩種表面醣蛋白G及F存在於包膜中且介導與呼吸道上皮細胞之附著及融合。F蛋白亦介導相鄰細胞接合形成特徵性合胞細胞，病毒由此而得名。RSV之兩種抗原性變異體之流行病學及生物學意義尚不確定。儘管如此，有一些證據表明A組感染傾向於更嚴重。
RSV基因組之長度為~15,000個核苷酸且由具有負極性之單股RNA構成。其具有編碼11種蛋白之10個基因，存在M2之2個開放閱讀框架。該基因組自NS1至L依序轉錄，而表現水準沿其長度降低。
NS1及NS2抑制I型干擾素活性。在一些實施例中，RSV疫苗包含至少一種RNA(例如，mRNA)聚核苷酸，其具有編碼NS1、NS2或其免疫原性片段之產物之開放閱讀框架。
N編碼形成核衣殼之與基因組RNA相關之核衣殼蛋白。在一些實施例中，RSV疫苗包含至少一種RNA(例如，mRNA)聚核苷酸，其具有編碼核衣殼蛋白或其免疫原性片段之開放閱讀框架。
M編碼病毒組裝所需之基質蛋白。在一些實施例中，RSV疫苗包含至少一種RNA(例如，mRNA)聚核苷酸，其中具有編碼基質蛋白或其免疫原性片段之開放閱讀框架。
SH、G及F形成病毒外殼。G蛋白為高度醣基化之表面蛋白且充當附著蛋白。F蛋白為介導融合之另一種重要表面蛋白，從而允許病毒進入細胞質且亦允許形成合胞體。F蛋白在RSV之兩種亞型中為同源的；針對F蛋白之抗體為中和抗體。相比之下，G蛋白在兩種亞型 之間顯著不同。在一些實施例中，RSV疫苗包含至少一種RNA(例如，mRNA)聚核苷酸，其具有編碼SH、G或F蛋白或其組合或其免疫原性片段之開放閱讀框架。
細胞表面處之核仁素為RSV融合蛋白之受體。已顯示核仁素-RSV融合蛋白相互作用之干擾在細胞培養物及動物模型中針對RSV感染具有治療性。在一些實施例中，RSV疫苗包含至少一種RNA(例如，mRNA)聚核苷酸，其具有編碼核仁素或其免疫原性片段之開放閱讀框架。
M2為轉錄亦所需之第二基質蛋白且編碼M2-1(伸長因子)及M2-2(轉錄調控)。M2含有CD8抗原決定基。在一些實施例中，RSV疫苗包含至少一種RNA(例如，mRNA)聚核苷酸，其具有編碼第二基質蛋白或其免疫原性片段之開放閱讀框架。
L編碼RNA聚合酶。在一些實施例中，RSV疫苗包含至少一種RNA(例如，mRNA)聚核苷酸，其具有編碼RNA聚合酶(L)或其免疫原性片段之開放閱讀框架。
磷蛋白P為L蛋白之輔因子。在一些實施例中，RSV疫苗包含至少一種RNA(例如，mRNA)聚核苷酸，其具有編碼磷蛋白P或其免疫原性片段之開放閱讀框架。
本發明之一些實施例提供RSV疫苗，該等疫苗包括至少一種RNA(例如，mRNA)聚核苷酸，其具有編碼醣蛋白G或其免疫原性片段(例如，能夠對RSV引起免疫反應之免疫原性片段)之開放閱讀框架。
本發明之一些實施例提供RSV疫苗，該等疫苗包括至少一種RNA(例如，mRNA)聚核苷酸，其具有編碼醣蛋白F或其免疫原性片段(例如，能夠對RSV引起免疫反應之免疫原性片段)之開放閱讀框架。
本發明之一些實施例揭示RSV疫苗，該等疫苗包括至少一種RNA(例如mRNA)聚核苷酸，其具有編碼呈融合後形式之多肽或其免疫原 性片段之開放閱讀框架。本發明之其他實施例揭示RSV疫苗，該等疫苗包括至少一種RNA(例如mRNA)聚核苷酸，其具有編碼呈融合前形式之多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架。在一些實施例中，多肽或其抗原性片段包含呈融合前構型之醣蛋白，例如但不限於融合前醣蛋白F或DS-CAV1。儘管不希望受理論束縛，但特定多肽或其抗原性片段在呈融合前構型時可含有更多抗原決定基以用於中和與相同蛋白或其免疫原性片段之融合後構型有關之抗體。舉例而言，融合前醣蛋白F或其免疫原性片段在其膜遠端頂點處具有獨特抗原位點(「抗原性位點0」)。抗原性位點0可(但不一定)包含RSV F蛋白序列之殘基62至69及196至209。在諸如(但不限於)融合前醣蛋白F或其免疫原性片段之一些情況下，融合前多肽或其免疫原性片段可展現比以融合後多肽或其免疫原性片段所達成之彼等免疫反應大許多倍之免疫反應。融合前RSV醣蛋白及其使用方法係在WO/2014/160463中描述，該案以引用的方式併入本文中。
在一些實施例中，RSV疫苗包括至少一種RNA(例如，mRNA)聚核苷酸，其具有編碼自RSV菌株A2(RSV A2)獲得之醣蛋白F或醣蛋白G或其免疫原性片段之開放閱讀框架。本發明涵蓋其他RSV菌株，包括亞型A菌株及亞型B菌株。
在一些實施例中，RSV疫苗具有至少一種RNA(例如，mRNA)，其具有至少一個修飾，包括(但不限於)至少一個化學修飾。
在一些實施例中，RSV抗原性多肽長於25個胺基酸且短於50個胺基酸。因此，多肽包括基因產物、天然存在之多肽、合成多肽、同源物、異種同源物、同種同源物、片段及前述各物之其他等效物、變異體及類似物。多肽可為單分子或可為多分子複合物，諸如二聚體、三聚體或四聚體。多肽亦可包含單鏈或多鏈多肽，諸如抗體或胰島素，且可締合或連接。最常見地，在多鏈多肽中可見二硫鍵聯。術語多肽 亦可適用於胺基酸聚合物，其中至少一個胺基酸殘基為相應天然存在之胺基酸之人工化學類似物。
術語「多肽變異體」係指其胺基酸序列不同於天然或參考序列之分子。胺基酸序列變異體與天然或參考序列相比可在胺基酸序列內之特定位置具備取代、刪除及/或插入。通常，變異體與天然或參考序列具備至少50%一致性。在一些實施例中，變異體與天然或參考序列共有至少80%或至少90%一致性。
在一些實施例中，提供「變異體模擬物」。如本文所用，「變異體模擬物」含有至少一個將模擬活化序列之胺基酸。舉例而言，麩胺酸可充當磷基-蘇胺酸及/或磷基-絲胺酸之模擬物。或者，變異體模擬物可導致去活化或導致含有模擬物之失活產物。舉例而言，苯丙胺酸可充當酪胺酸之失活取代，或丙胺酸可充當絲胺酸之失活取代。
「異種同源物」係指不同物種中藉由物種形成由共同祖先基因進化而來之基因。通常，異種同源物在進化過程中保留相同功能。異種同源物之識別對於最新測序之基因組中基因功能之可靠性預測至關重要。
「類似物」意欲包括因一或多種胺基酸改變而不同之多肽變異體，例如仍保留母體或起始多肽之一或多種特性的對胺基酸殘基之取代、添加或刪除。
「同種同源物」為基因組中藉由複製而有關聯之基因(或蛋白)。異種同源物在進化過程中保留相同功能，而同種同源物進化出新功能，即使此等功能與原始功能有關。
本發明提供若干類型之基於聚核苷酸或多肽之組合物，包括變異體及衍生物。此等變異體及衍生物包括例如取代、插入、刪除及共價變異體及衍生物。術語「衍生物」與術語「變異體」同義使用，但通常係指相對於參考分子或起始分子而言以任何反式修飾及/或改變 之分子。
因此，本發明之範疇內包括編碼相對於參考序列而言含有取代、插入及/或添加、刪除及共價修飾之肽或多肽(特定言之為本文所揭示之多肽序列)之聚核苷酸。舉例而言，序列標籤或胺基酸(諸如一或多種離胺酸)可添加至肽序列中(例如，在N末端或C末端)。序列標籤可用於肽偵測、純化或定位。離胺酸可用於增加肽溶解性或允許生物素化。或者，位於肽或蛋白之胺基酸序列之羧基及胺基末端區域的胺基酸殘基可視情況刪除，提供截短序列。特定胺基酸(例如，C末端或N末端殘基)可或者視序列之用途而刪除，例如將序列表現為可溶性或連接至固體支撐物之較大序列之一部分。在替代性實施例中，(或編碼)信號序列、終止序列、跨膜結構域、連接子、多聚化結構域(例如，摺疊子區域)及其類似物之序列可經達成相同或類似功能之替代序列取代。該等序列對於熟習此項技術者易於識別。亦應瞭解，本文所提供之一些序列含有例如在用於製備RNA(例如，mRNA)疫苗之前可刪除之序列標籤或末端肽序列(例如，在N末端或C末端)。
當提及多肽時，「取代變異體」為在天然或起始序列中移除至少一個胺基酸殘基且在其相同位置之處插入不同胺基酸之彼等取代變異體。取代可為單次的，其中分子中僅一個胺基酸經取代，或取代可為多次的，其中同一分子中兩個或兩個以上胺基酸經取代。
如本文所用，術語「保守性胺基酸取代」係指以具有類似大小、電荷或極性之不同胺基酸取代序列中通常存在之胺基酸。保守性取代之實例包括以一種非極性(疏水性)殘基(諸如異白胺酸、纈胺酸及白胺酸)取代另一種非極性殘基。同樣，保守性取代之實例包括以一種極性(親水性)殘基取代另一種殘基，諸如精胺酸與離胺酸之間、麩醯胺酸與天冬醯胺酸之間及甘胺酸與絲胺酸之間。另外，以諸如離胺酸、精胺酸或組胺酸之鹼性殘基取代另一者，或以諸如天冬胺酸或麩 胺酸之一種酸性殘基取代另一種酸性殘基為保守性取代之其他實例。非保守性取代之實例包括以諸如異白胺酸、纈胺酸、白胺酸、丙胺酸、甲硫胺酸之非極性(疏水性)胺基酸殘基取代諸如半胱胺酸、麩醯胺酸、麩胺酸或離胺酸之極性(親水性)殘基及/或以極性殘基取代非極性殘基。
當提及多肽或聚核苷酸時，「特徵」分別定義為分子之基於不同胺基酸序列或基於核苷酸之組分。由聚核苷酸編碼之多肽之特徵包括表面表現、局部構型形狀、摺疊、環、半環、結構域、半結構域、位點、末端或其任何組合。
如本文所用，當提及多肽時，術語「結構域」係指具有一或多種可識別之結構或功能性特徵或特性(例如，結合能力，充當蛋白與蛋白相互作用之位點)之多肽的基元。
如本文所用，當提及多肽時，術語「位點」在其係關於基於胺基酸之實施例時與「胺基酸殘基」及「胺基酸側鏈」同義使用。如本文所用，當提及聚核苷酸時，術語「位點」在其係關於基於核苷酸之實施例時與「核苷酸」同義使用。位點表示基於多肽或聚核苷酸之分子中可經修飾、操作、變更、衍生或改變之肽或多肽或聚核苷酸中之位置。
如本文所用，當提及多肽或聚核苷酸時，術語「末端(termini或terminus)」分別係指多肽或聚核苷酸之端點。該等端點不僅侷限於多肽或聚核苷酸之第一或最終位點，而且可包括末端區域中之其他胺基酸或核苷酸。基於多肽之分子可表徵為具有N末端(由具有游離胺基(NH2)之胺基酸封端)及C末端(由具有游離羧基(COOH)之胺基酸封端)。蛋白在一些情況下由藉由二硫鍵或藉由非共價力(多聚物、寡聚物)結合在一起之多個多肽鏈組成。此等蛋白具有多個N末端及C末端。或者，視情況而定，多肽之末端可經修飾以便其可由基於非多肽 之部分開始或結束，諸如有機結合物。
如熟習此項技術者所公認，蛋白片段、功能性蛋白結構域及同源蛋白亦視為在所關注多肽之範疇內。舉例而言，本文提供長度為10、20、30、40、50、60、70、80、90、100個或大於100個胺基酸之參考蛋白的任何蛋白片段(意謂比參考多肽序列短但其他方面均一致之具有至少一個胺基酸殘基之多肽序列)。在另一實例中，根據本發明可使用與本文所述之任何序列40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或100%一致的包括具有20、30、40、50或100個胺基酸之延伸段之任何蛋白。在一些實施例中，多肽包括如本文所提供或提及之任何序列中所示之2、3、4、5、6、7、8、9、10種或10種以上突變。在一些實施例中，蛋白片段長於25個胺基酸且短於50個胺基酸。
本發明之多肽或聚核苷酸分子可與參考分子(例如，參考多肽或參考聚核苷酸)，例如與此項技術所述之分子(例如，經工程化或設計之分子或野生型分子)共有一定程度之序列類似性或一致性。如此項技術中已知，術語「一致性」係指如藉由對比序列所測定之兩種或兩種以上多肽或聚核苷酸之序列之間的關係。在此項技術中，一致性亦意謂如由兩個或兩個以上胺基酸殘基或核酸殘基串之間的匹配數所測定之其間之序列相關程度。一致性量測兩種或兩種以上序列中具有由特定數學模型或電腦程式(例如，「演算法」)提出之間隙對準(若存在)之較小者之間的一致匹配百分比。「一致性%」在適用於多肽或聚核苷酸序列時定義為在對準序列及必要時引入間隙以達成最大一致性百分比後，候選胺基酸或核酸序列中與第二序列之胺基酸序列或核酸序列中之殘基一致的殘基(胺基酸殘基或核酸殘基)百分比。用於對準之方法及電腦程式在此項技術中熟知。應瞭解，一致性取決於一致性百分比之計算，但由於計算中引入之間隙及罰分而其值可不同。通常，如藉由本文所述且熟習此項技術者已知之序列對準程式及參數所測 定，特定聚核苷酸或多肽之變異體與彼特定參考聚核苷酸或多肽具有至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、但小於100%之序列一致性。用於對準之該等工具包括BLAST套組之彼等工具(Stephen F.Altschul，等人(1997),「Gapped BLAST and PSI-BLAST：a new generation of protein database search programs」,Nucleic Acids Res.25：3389-3402)。另一種受歡迎之局部對準技術係基於Smith-Waterman演算法(Smith,T.F.及Waterman,M.S.(1981)「Identification of common molecular subsequences.」J.Mol.Biol.147：195-197)。基於動態程式設計之通用全局對準技術為Needleman-Wunsch演算法(Needleman,S.B.及Wunsch,C.D.(1970)「A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequences of two proteins.」J.Mol.Biol.48：443-453)。最近已研發出一種快速最佳化全局序列對準演算法(Fast Optimal Global Sequence Alignment Algorithm，FOGSAA)，據稱其比其他最佳化全局對準方法(包括Needleman-Wunsch演算法)更快地產生對核苷酸及蛋白序列之全局對準。本文中描述其他工具，尤其在下文「一致性」之定義中。
如本文所用，術語「同源性」係指聚合分子之間，例如核酸分子(例如DNA分子及/或RNA分子)及/或多肽分子之間的總體相關性。共有藉由匹配殘基之對準所測定之臨界水準之類似性或一致性的聚合分子(例如核酸分子(例如DNA分子及/或RNA分子)及/或多肽分子)被稱為同源。同源性為描述分子之間的關係之定性術語且可基於定量之類似性或一致性。類似性或一致性為定義兩種比較序列之間的序列匹配程度之定量術語。在一些實施例中，若聚合分子之序列至少25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%一致或類似，則認為其彼此「同源」。 術語「同源」必定係指至少兩種序列(聚核苷酸或多肽序列)之間的比較。若兩種聚核苷酸序列編碼之多肽對於至少一個具有至少20個胺基酸之延伸段而言至少50%、60%、70%、80%、90%、95%或甚至99%，則認為該兩種序列同源。在一些實施例中，同源聚核苷酸序列由編碼具有至少4至5個獨特規定胺基酸之延伸段之能力表徵。對於長度小於60個核苷酸之聚核苷酸序列而言，同源性由編碼具有至少4至5個獨特規定胺基酸之延伸段之能力來測定。若兩種蛋白對於至少一個具有至少20個胺基酸之延伸段而言至少50%、60%、70%、80%或90%一致，則認為該兩種蛋白序列同源。
同源性暗示比較序列在進化中自共同起源偏離。術語「同源物」係指第一胺基酸序列或核酸序列(例如，基因(DNA或RNA)或蛋白序列)與第二胺基酸序列或核酸序列因來自共同祖先序列之血統而有關聯。術語「同源物」可適用於因物種形成事件隔開之基因及/或蛋白之間的關係或因基因複製事件隔開之基因及/或蛋白之間的關係。
多蛋白及多組分疫苗
本發明涵蓋包含各自編碼單一抗原性多肽之多種RNA(例如，mRNA)聚核苷酸之RSV疫苗，以及包含編碼一種以上抗原性多肽(例如，融合多肽)之單一RNA聚核苷酸之RSV疫苗。因此，應瞭解，一種包含具有編碼第一RSV抗原性多肽之開放閱讀框架之RNA聚核苷酸及具有編碼第二RSV抗原性多肽之開放閱讀框架之RNA聚核苷酸的疫苗組合物涵蓋(a)包含編碼第一RSV抗原性多肽之第一RNA聚核苷酸及編碼第二RSV抗原性多肽之第二RNA聚核苷酸的疫苗，及(b)包含編碼第一及第二RSV抗原性多肽(例如，融合多肽)之單一RNA聚核苷酸的疫苗。在一些實施例中，本發明之RSV RNA疫苗包含2至10種(例如，2、3、4、5、6、7、8、9或10種)或10種以上具有開放閱讀框架 之RNA聚核苷酸，其各自編碼不同RSV抗原性多肽(或編碼2至10種或10種以上不同RSV抗原性多肽之單一RNA聚核苷酸)。在一些實施例中，RSV RNA疫苗包含具有編碼融合(F)醣蛋白之開放閱讀框架之RSV RNA聚核苷酸，具有編碼附著(G)蛋白之開放閱讀框架之RSV RNA聚核苷酸，具有編碼核蛋白(N)之開放閱讀框架之RSV RNA聚核苷酸，具有編碼磷蛋白(P)之開放閱讀框架之RSV RNA聚核苷酸，具有編碼大聚合酶蛋白(L)之開放閱讀框架之RSV RNA聚核苷酸，具有編碼基質蛋白(M)之開放閱讀框架之RSV RNA聚核苷酸，具有編碼小疏水性蛋白(SH)之開放閱讀框架之RSV RNA聚核苷酸，具有編碼非結構蛋白1(NS1)之開放閱讀框架之RSV RNA聚核苷酸，及具有編碼非結構蛋白2(NS2)之開放閱讀框架之RSV RNA聚核苷酸。在一些實施例中，RSV RNA疫苗包含具有編碼融合(F)蛋白之開放閱讀框架之RSV RNA聚核苷酸及具有編碼附著蛋白(G)之開放閱讀框架之RSV RNA聚核苷酸。在一些實施例中，RSV RNA疫苗包含具有編碼F蛋白之開放閱讀框架之RSV RNA聚核苷酸。在一些實施例中，RSV RNA疫苗包含具有編碼N蛋白之開放閱讀框架之RSV RNA聚核苷酸。在一些實施例中，RSV RNA疫苗包含具有編碼M蛋白之開放閱讀框架之RSV RNA聚核苷酸。在一些實施例中，RSV RNA疫苗包含具有編碼L蛋白之開放閱讀框架之RSV RNA聚核苷酸。在一些實施例中，RSV RNA疫苗包含具有編碼P蛋白之開放閱讀框架之RSV RNA聚核苷酸。在一些實施例中，RSV RNA疫苗包含具有編碼SH蛋白之開放閱讀框架之RSV RNA聚核苷酸。在一些實施例中，RSV RNA疫苗包含具有編碼NS1蛋白之開放閱讀框架之RSV RNA聚核苷酸。在一些實施例中，RSV RNA疫苗包含具有編碼NS2蛋白之開放閱讀框架之RSV RNA聚核苷酸。
在一些實施例中，RNA聚核苷酸編碼與信號肽(例如，SEQ ID NO：281或SEQ ID NO：282)融合之RSV抗原性多肽。因此，提供RSV疫苗，該等疫苗包含至少一種核糖核酸(RNA)聚核苷酸，其具有編碼連接至RSV抗原性肽之信號肽之開放閱讀框架。
本文進一步提供RSV疫苗，其包含與信號肽融合之本文所揭示之任何RSV抗原性多肽(例如，F、G、M、N、L、P、SH、NS1、NS2或其任何抗原性片段)。該信號肽可與RSV抗原性多肽之N或C末端融合。
信號肽
在一些實施例中，由RSV聚核苷酸編碼之抗原性多肽包含信號肽。佔蛋白之N末端15至60個胺基酸的信號肽通常為以分泌途徑跨膜轉運所需的，且因此普遍地控制真核細胞及原核細胞中之大多數蛋白進入分泌途徑。信號肽通常包括三個區域：具有不同長度之N末端區域，其通常包含帶正電荷之胺基酸；疏水性區域；及短羧基末端肽區域。在真核細胞中，初生前驅體蛋白(前蛋白)之信號肽將核糖體導向粗糙內質網(ER)膜且開始使生長之肽鏈跨膜運輸。然而，信號肽並不負責成熟蛋白之最終目的地。在其序列中不含其他地址標籤之分泌型蛋白係默認經分泌至外部環境。信號肽藉由內質網(ER)駐留信號肽酶自前驅體蛋白裂解或其保持不裂解且充當膜錨。近年來，關於信號肽已演變出一種更先進之觀點，表明某些信號肽之功能及免疫優勢比先前預期之更多樣得多。
信號肽通常起促使新合成之蛋白靶向內質網(ER)以便加工之作用。ER加工產生成熟之包膜蛋白，其中信號肽通常由宿主細胞之信號肽酶裂解。信號肽亦可促使蛋白靶向細胞膜。本發明之RSV疫苗可包含例如編碼人工信號肽之RNA聚核苷酸，其中信號肽編碼序列可操作性地連接至RSV抗原性多肽之編碼序列且與其同框。因此，在一些實施例中，本發明之RSV疫苗產生抗原性多肽包含與信號肽融合之 RSV抗原性多肽。在一些實施例中，信號肽與RSV抗原性多肽之N末端融合。在一些實施例中，信號肽為與RSV抗原性多肽之C末端融合。
在一些實施例中，與RSV抗原性多肽融合之信號肽為人工信號肽。在一些實施例中，由RSV RNA(例如，mRNA)疫苗編碼之與RSV抗原性多肽融合之人工信號肽係自免疫球蛋白獲得，例如IgE信號肽或IgG信號肽。在一些實施例中，由RSV RNA(例如，mRNA)疫苗編碼之與RSV抗原性多肽融合之信號肽為具有以下序列Ig重鏈ε-1信號肽(IgE HC SP)：MDWTWILFLVAAATRVHS(SEQ ID NO：281)。在一些實施例中，由RSV RNA(例如，mRNA)疫苗編碼之與RSV抗原性多肽融合之信號肽為具有序列METPAQLLFLLLLWLPDTTG(SEQ ID NO：282)之IgGk鏈V-III區域HAH信號肽(IgGk SP)。在一些實施例中，由RSV RNA(例如，mRNA)疫苗編碼之RSV抗原性多肽具有與SEQ ID NO：281或SEQ ID NO：282之信號肽融合的SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：28中之一者所述之胺基酸序列。本文所揭示之實例不欲限制且根據本發明可使用在此項技術中已知用於促使蛋白靶向ER以便加工及/或蛋白靶向細胞膜之任何信號肽。
信號肽可具有15至60個胺基酸之長度。舉例而言，信號肽可具有15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60個胺基酸之長度。在一些實施例中，信號肽可具有20至60、25至60、30至60、35至60、40至60、45至60、50至60、55至60、15至55、20至55、25至55、30至55、35至55、40至55、45至55、50至55、15至50、20至50、25至50、30至50、35至50、40至50、45至50、15至45、20至45、25至45、30至45、35至45、40至45、15至40、20至40、 25至40、30至40、35至40、15至35、20至35、25至35、30至35、15至30、20至30、25至30、15至25、20至25或15至20個胺基酸之長度。
信號肽通常在ER加工期間在裂解接合處由初生多肽裂解。由本發明之RSV RNA疫苗產生之成熟RSV抗原性多肽通常不包含信號肽。
化學修飾
在一些實施例中，本發明之RNA(例如，mRNA)疫苗包含至少一種核糖核酸(RNA)聚核苷酸，其具有編碼至少一種呼吸道融合病毒(RSV)抗原性多肽之開放閱讀框架，其中該RNA包含至少一個化學修飾。
術語「化學修飾」及「經化學修飾」係指關於腺苷(A)、鳥苷(G)、尿苷(U)、胸苷(T)或胞苷(C)核糖核苷或去氧核糖核苷對其位置、模式、百分比或群體中至少一者之修飾。通常，此等術語並不係指天然存在之5'末端mRNA帽部分之核糖核苷酸修飾。
聚核苷酸之修飾包括(但不限於)本文所述之彼等修飾，且包括(但不明確限於)包含化學修飾之彼等修飾。聚核苷酸(例如，RNA聚核苷酸，諸如mRNA聚核苷酸)可包含天然存在、非天然存在之修飾或聚核苷酸可包含天然存在及非天然存在之修飾之組合。聚核苷酸可包括對例如糖、核鹼基或核苷間鍵聯(例如，對連接磷酸酯，對磷酸二酯鍵聯或對磷酸二酯主鏈)之任何適用之修飾。
關於多肽，術語「修飾」係指關於典型20個胺基酸之組之修飾。若如本文所提供之多肽含有胺基酸取代、插入或取代與插入之組合，則其亦視為「經修飾」。
在一些實施例中，聚核苷酸(例如，RNA聚核苷酸，諸如mRNA聚核苷酸)包含各種(一種以上)不同修飾。在一些實施例中，聚核苷酸之特定區域含有一種、兩種或兩種以上(視情況不同之)核苷或核苷酸修飾。在一些實施例中，引入細胞或有機體中之經修飾之RNA聚核苷 酸(例如，經修飾之mRNA聚核苷酸)在細胞或有機體中相對於未經修飾之聚核苷酸而言分別展現降解減少。在一些實施例中，引入細胞或有機體中之經修飾之RNA聚核苷酸(例如，經修飾之mRNA聚核苷酸)在細胞或有機體中可分別展現免疫原性減小(例如，先天性反應減少)。
在一些實施例中，聚核苷酸(例如，RNA聚核苷酸，諸如mRNA聚核苷酸)包含在聚核苷酸合成期間或在聚核苷酸合成後引入之經非天然修飾之核苷酸以達成所需之功能或特性。修飾可呈現於核苷酸間鍵聯、嘌呤或嘧啶鹼基或糖上。修飾可經化學合成或經聚合酶在鏈末端或鏈之任意其他處引入。聚核苷酸之任何區域均可經化學修飾。
本發明提供聚核苷酸(例如，RNA聚核苷酸，諸如mRNA聚核苷酸)之經修飾之核苷及核苷酸。「核苷」係指與有機鹼基(例如，嘌呤或嘧啶)或其衍生物(本文中亦稱為「核鹼基」)組合之含有糖分子(例如，戊糖或核糖)或其衍生物之化合物。「核苷酸」係指核苷，包括磷酸酯基。經修飾之核苷酸可藉由諸如化學、酶促或重組之任何適用方法合成，以包括一或多種經修飾或非天然之核苷。聚核苷酸可包含所連接核苷之一或多個區域。該等區域可具有可變之主鏈鍵聯。該等鍵聯可為標準磷酸二酯鍵聯，在此情況下聚核苷酸將包含核苷酸之區域。
經修飾之核苷酸鹼基配對不僅涵蓋標準腺苷-胸腺嘧啶、腺苷-尿嘧啶或鳥苷-胞嘧啶鹼基對，而且涵蓋在核苷酸及/或經修飾之核苷酸之間形成之鹼基對，包含非標準或經修飾之鹼基，其中氫鍵供體及氫鍵受體之排列允許在非標準鹼基與標準鹼基之間或在兩個互補非標準鹼基結構(例如具有至少一個化學修飾之彼等聚核苷酸中)之間進行氫鍵結。該等非標準鹼基配對之一個實例為經修飾之核苷酸肌苷與腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶之間的鹼基配對。鹼基/糖或連接子之任何組合 均可併入本發明之聚核苷酸中。
適用於本發明之組合物、疫苗、方法及合成製程中之聚核苷酸(例如，RNA聚核苷酸，諸如mRNA聚核苷酸)修飾包括(但不限於)以下：2-甲硫基-N6-(順-羥基異戊烯基)腺苷；2-甲硫基-N6-甲基腺苷；2-甲硫基-N6-蘇胺醯基胺甲醯基腺苷；N6-甘胺酸基胺甲醯基腺苷；N6-異戊烯基腺苷；N6-甲基腺苷；N6-蘇胺醯基胺甲醯基腺苷；1,2'-O-二甲基腺苷；1-甲基腺苷；2'-O-甲基腺苷；2'-O-核糖基腺苷(磷酸酯)；2-甲基腺苷；2-甲硫基-N6異戊烯基腺苷；2-甲硫基-N6-羥基正纈胺醯基胺甲醯基腺苷；2'-O-甲基腺苷；2'-O-核糖基腺苷(磷酸酯)；異戊烯基腺苷；N6-(順-羥基異戊烯基)腺苷；N6,2'-O-二甲基腺苷；N6,2'-O-二甲基腺苷；N6,N6,2'-O-三甲基腺苷；N6,N6-二甲基腺苷；N6-乙醯基腺苷；N6-羥基正纈胺醯基胺甲醯基腺苷；N6-甲基-N6-蘇胺醯基胺甲醯基腺苷；2-甲基腺苷；2-甲硫基-N6-異戊烯基腺苷；7-去氮雜-腺苷；N1-甲基-腺苷；N6,N6(二甲基)腺嘌呤；N6-順-羥基-異戊烯基-腺苷；α-硫基-腺苷；2(胺基)腺嘌呤；2(胺基丙基)腺嘌呤；2(甲硫基)N6(異戊烯基)腺嘌呤；2-(烷基)腺嘌呤；2-(胺基烷基)腺嘌呤；2-(胺基丙基)腺嘌呤；2-(鹵基)腺嘌呤；2-(鹵基)腺嘌呤；2-(丙基)腺嘌呤；2'-胺基-2'-去氧基-ATP；2'-疊氮基-2'-去氧基-ATP；2'-去氧基-2'-a-胺基腺苷TP；2'-去氧基-2'-a-疊氮基腺苷TP；6(烷基)腺嘌呤；6(甲基)腺嘌呤；6-(烷基)腺嘌呤；6-(甲基)腺嘌呤；7(去氮雜)腺嘌呤；8(烯基)腺嘌呤；8(炔基)腺嘌呤；8(胺基)腺嘌呤；8(硫烷基)腺嘌呤；8-(烯基)腺嘌呤；8-(烷基)腺嘌呤；8-(炔基)腺嘌呤；8-(胺基)腺嘌呤；8-(鹵基)腺嘌呤；8-(羥基)腺嘌呤；8-(硫烷基)腺嘌呤；8-(硫醇)腺嘌呤；8-疊氮基-腺苷；氮雜腺嘌呤；去氮雜腺嘌呤；N6(甲基)腺嘌呤；N6-(異戊基)腺嘌呤；7-去氮雜-8-氮雜-腺苷；7-甲基腺嘌呤；1-去氮雜腺苷TP；2'氟-N6-Bz-去氧基腺苷TP；2'-OMe-2- 胺基-ATP；2'O-甲基-N6-Bz-去氧基腺苷TP；2'-a-乙炔基腺苷TP；2-胺基腺嘌呤；2-胺基腺苷TP；2-胺基-ATP；2'-a-三氟甲基腺苷TP；2-疊氮基腺苷TP；2'-b-乙炔基腺苷TP；2-溴腺苷TP；2'-b-三氟甲基腺苷TP；2-氯腺苷TP；2'-去氧基-2',2'-二氟腺苷TP；2'-去氧基-2'-a-巰基腺苷TP；2'-去氧基-2'-a-硫基甲氧基腺苷TP；2'-去氧基-2'-b-胺基腺苷TP；2'-去氧基-2'-b-疊氮基腺苷TP；2'-去氧基-2'-b-溴腺苷TP；2'-去氧基-2'-b-氯腺苷TP；2'-去氧基-2'-b-氟腺苷TP；2'-去氧基-2'-b-碘腺苷TP；2'-去氧基-2'-b-巰基腺苷TP；2'-去氧基-2'-b-硫基甲氧基腺苷TP；2-氟腺苷TP；2-碘腺苷TP；2-巰基腺苷TP；2-甲氧基-腺嘌呤；2-甲硫基-腺嘌呤；2-三氟甲基腺苷TP；3-去氮雜-3-溴腺苷TP；3-去氮雜-3-氯腺苷TP；3-去氮雜-3-氟腺苷TP；3-去氮雜-3-碘腺苷TP；3-去氮雜腺苷TP；4'-疊氮基腺苷TP；4'-碳環腺苷TP；4'-乙炔基腺苷TP；5'-高-腺苷TP；8-氮雜-ATP；8-溴-腺苷TP；8-三氟甲基腺苷TP；9-去氮雜腺苷TP；2-胺基嘌呤；7-去氮雜-2,6-二胺基嘌呤；7-去氮雜-8-氮雜-2,6-二胺基嘌呤；7-去氮雜-8-氮雜-2-胺基嘌呤；2,6-二胺基嘌呤；7-去氮雜-8-氮雜-腺嘌呤、7-去氮雜-2-胺基嘌呤；2-硫基胞苷；3-甲基胞苷；5-甲醯基胞苷；5-羥甲基胞苷；5-甲基胞苷；N4-乙醯基胞苷；2'-O-甲基胞苷；2'-O-甲基胞苷；5,2'-O-二甲基胞苷；5-甲醯基-2'-O-甲基胞苷；立西啶(Lysidine)；N4,2'-O-二甲基胞苷；N4-乙醯基-2'-O-甲基胞苷；N4-甲基胞苷；N4,N4-二甲基-2'-OMe-胞苷TP；4-甲基胞苷；5-氮雜-胞苷；假-異-胞苷；吡咯并-胞苷；α-硫基-胞苷；2-(硫基)胞嘧啶；2'-胺基-2'-去氧基-CTP；2'-疊氮基-2'-去氧基-CTP；2'-去氧基-2'-a-胺基胞苷TP；2'-去氧基-2'-a-疊氮基胞苷TP；3(去氮雜)5(氮雜)胞嘧啶；3(甲基)胞嘧啶；3-(烷基)胞嘧啶；3-(去氮雜)5(氮雜)胞嘧啶；3-(甲基)胞苷；4,2'-O-二甲基胞苷；5(鹵基)胞嘧啶；5(甲基)胞嘧啶；5(丙炔基)胞嘧啶；5(三氟甲基)胞嘧啶；5-(烷基)胞嘧 啶；5-(炔基)胞嘧啶；5-(鹵基)胞嘧啶；5-(丙炔基)胞嘧啶；5-(三氟甲基)胞嘧啶；5-溴-胞苷；5-碘-胞苷；5-丙炔基胞嘧啶；6-(偶氮基)胞嘧啶；6-氮雜-胞苷；氮雜胞嘧啶；去氮雜胞嘧啶；N4(乙醯基)胞嘧啶；1-甲基-1-去氮雜-假異胞苷；1-甲基-假異胞苷；2-甲氧基-5-甲基-胞苷；2-甲氧基-胞苷；2-硫基-5-甲基-胞苷；4-甲氧基-1-甲基-假異胞苷；4-甲氧基-假異胞苷；4-硫基-1-甲基-1-去氮雜-假異胞苷；4-硫基-1-甲基-假異胞苷；4-硫基-假異胞苷；5-氮雜-澤布拉林(zebularine)；5-甲基-澤布拉林；吡咯并-假異胞苷；澤布拉林；(E)-5-(2-溴-乙烯基)胞苷TP；2,2'-脫水-胞苷TP鹽酸鹽；2'氟-N4-Bz-胞苷TP；2'氟-N4-乙醯基-胞苷TP；2'-O-甲基-N4-乙醯基-胞苷TP；2'O-甲基-N4-Bz-胞苷TP；2'-a-乙炔基胞苷TP；2'-a-三氟甲基胞苷TP；2'-b-乙炔基胞苷TP；2'-b-三氟甲基胞苷TP；2'-去氧基-2',2'-二氟胞苷TP；2'-去氧基-2'-a-巰基胞苷TP；2'-去氧基-2'-a-硫基甲氧基胞苷TP；2'-去氧基-2'-b-胺基胞苷TP；2'-去氧基-2'-b-疊氮基胞苷TP；2'-去氧基-2'-b-溴胞苷TP；2'-去氧基-2'-b-氯胞苷TP；2'-去氧基-2'-b-氟胞苷TP；2'-去氧基-2'-b-碘胞苷TP；2'-去氧基-2'-b-巰基胞苷TP；2'-去氧基-2'-b-硫基甲氧基胞苷TP；2'-O-甲基-5-(1-丙炔基)胞苷TP；3'-乙炔基胞苷TP；4'-疊氮基胞苷TP；4'-碳環胞苷TP；4'-乙炔基胞苷TP；5-(1-丙炔基)阿糖-胞苷TP；5-(2-氯-苯基)-2-硫基胞苷TP；5-(4-胺基-苯基)-2-硫基胞苷TP；5-胺基烯丙基-CTP；5-氰基胞苷TP；5-乙炔基阿糖-胞苷TP；5-乙炔基胞苷TP；5'-高-胞苷TP；5-甲氧基胞苷TP；5-三氟甲基-胞苷TP；N4-胺基-胞苷TP；N4-苄醯基-胞苷TP；假異胞苷；7-甲基鳥苷；N2,2'-O-二甲基鳥苷；N2-甲基鳥苷；懷俄苷(懷俄苷)；1,2'-O-二甲基鳥苷；1-甲基鳥苷；2'-O-甲基鳥苷；2'-O-核糖基鳥苷(磷酸酯)；2'-O-甲基鳥苷；2'-O-核糖基鳥苷(磷酸酯)；7-胺基甲基-7-去氮雜鳥苷；7-氰基-7-去氮雜鳥苷；古嘌苷(Archaeosine)；甲基懷俄苷；N2,7-二甲 基鳥苷；N2,N2,2'-O-三甲基鳥苷；N2,N2,7-三甲基鳥苷；N2,N2-二甲基鳥苷；N2,7,2'-O-三甲基鳥苷；6-硫基-鳥苷；7-去氮雜-鳥苷；8-側氧基-鳥苷；N1-甲基-鳥苷；α-硫基-鳥苷；2(丙基)鳥嘌呤；2-(烷基)鳥嘌呤；2'-胺基-2'-去氧基-GTP；2'-疊氮基-2'-去氧基-GTP；2'-去氧基-2'-a-胺基鳥苷TP；2'-去氧基-2'-a-疊氮基鳥苷TP；6(甲基)鳥嘌呤；6-(烷基)鳥嘌呤；6-(甲基)鳥嘌呤；6-甲基-鳥苷；7(烷基)鳥嘌呤；7(去氮雜)鳥嘌呤；7(甲基)鳥嘌呤；7-(烷基)鳥嘌呤；7-(去氮雜)鳥嘌呤；7-(甲基)鳥嘌呤；8(烷基)鳥嘌呤；8(炔基)鳥嘌呤；8(鹵基)鳥嘌呤；8(硫烷基)鳥嘌呤；8-(烯基)鳥嘌呤；8-(烷基)鳥嘌呤；8-(炔基)鳥嘌呤；8-(胺基)鳥嘌呤；8-(鹵基)鳥嘌呤；8-(羥基)鳥嘌呤；8-(硫烷基)鳥嘌呤；8-(硫醇)鳥嘌呤；氮雜鳥嘌呤；去氮雜鳥嘌呤；N(甲基)鳥嘌呤；N-(甲基)鳥瞟呤；1-甲基-6-硫基-鳥苷；6-甲氧基-鳥苷；6-硫基-7-去氮雜-8-氮雜-鳥苷；6-硫基-7-去氮雜-鳥苷；6-硫基-7-甲基-鳥苷；7-去氮雜-8-氮雜-鳥苷；7-甲基-8-側氧基-鳥苷；N2,N2-二甲基-6-硫基-鳥苷；N2-甲基-6-硫基-鳥苷；1-Me-GTP；2'氟-N2-異丁基-鳥苷TP；2'O-甲基-N2-異丁基-鳥苷TP；2'-a-乙炔基鳥苷TP；2'-a-三氟甲基鳥苷TP；2'-b-乙炔基鳥苷TP；2'-b-三氟甲基鳥苷TP；2'-去氧基-2',2'-二氟鳥苷TP；2'-去氧基-2'-a-巰基鳥苷TP；2'-去氧基-2'-a-硫基甲氧基鳥苷TP；2'-去氧基-2'-b-胺基鳥苷TP；2'-去氧基-2'-b-疊氮基鳥苷TP；2'-去氧基-2'-b-溴鳥苷TP；2'-去氧基-2'-b-氯鳥苷TP；2'-去氧基-2'-b-氟鳥苷TP；2'-去氧基-2'-b-碘鳥苷TP；2'-去氧基-2'-b-巰基鳥苷TP；2'-去氧基-2'-b-硫基甲氧基鳥苷TP；4'-疊氮基鳥苷TP；4'-碳環鳥苷TP；4'-乙炔基鳥苷TP；5'-高-鳥苷TP；8-溴-鳥苷TP；9-去氮雜鳥苷TP；N2-異丁基-鳥苷TP；1-甲基肌苷；肌苷；1,2'-O-二甲基肌苷；2'-O-甲基肌苷；7-甲基肌苷；2'-O-甲基肌苷；環氧基Q核苷(Epoxyqueuosine)；半乳糖基-Q核苷；甘露糖基Q核苷；Q核苷；烯丙 基胺基-胸苷；氮雜胸苷；去氮雜胸苷；去氧基-胸苷；2'-O-甲基尿苷；2-硫尿苷；3-甲基尿苷；5-羧甲基尿苷；5-羥基尿苷；5-甲基尿苷；5-牛磺酸甲基-2-硫尿苷；5-牛磺酸甲基尿苷；二氫尿苷；假尿苷；(3-(3-胺基-3-羧丙基)尿苷；1-甲基-3-(3-胺基-5-羧丙基)假尿苷；1-甲基假尿苷；1-乙基-假尿苷；2'-O-甲基尿苷；2'-O-甲基假尿苷；2'-O-甲基尿苷；2-硫基-2'-O-甲基尿苷；3-(3-胺基-3-羧丙基)尿苷；3,2'-O-二甲基尿苷；3-甲基-假-尿苷TP；4-硫尿苷；5-(羧基羥甲基)尿苷；5-(羧基羥甲基)尿苷甲酯；5,2'-O-二甲基尿苷；5,6-二氫-尿苷；5-胺基甲基-2-硫尿苷；5-胺甲醯基甲基-2'-O-甲基尿苷；5-胺甲醯基甲基尿苷；5-羧基羥甲基尿苷；5-羧基羥甲基尿苷甲酯；5-羧基甲胺基甲基-2'-O-甲基尿苷；5-羧基甲胺基甲基-2-硫尿苷；5-羧基甲胺基甲基尿苷；5-羧基甲胺基甲基尿苷；5-胺甲醯基甲基尿苷TP；5-甲氧羰基甲基-2'-O-甲基尿苷；5-甲氧羰基甲基-2-硫尿苷；5-甲氧羰基甲基尿苷；5-甲基尿苷、5-甲氧基尿苷；5-甲基-2-硫尿苷；5-甲胺基甲基-2-硒基尿苷；5-甲胺基甲基-2-硫尿苷；5-甲胺基甲基尿苷；5-甲基二氫尿苷；5-氧基乙酸-尿苷TP；5-氧基乙酸-甲酯-尿苷TP；N1-甲基-假-尿嘧啶；N1-乙基-假-尿嘧啶；尿苷5-氧基乙酸；尿苷5-氧基乙酸甲酯；3-(3-胺基-3-羧丙基)-尿苷TP；5-(異戊烯基胺基甲基)-2-硫尿苷TP；5-(異戊烯基胺基甲基)-2'-O-甲基尿苷TP；5-(異戊烯基胺基甲基)尿苷TP；5-丙炔基尿嘧啶；α-硫基-尿苷；1(胺基烷基胺基-羰基乙烯基)-2(硫基)-假尿嘧啶；1(胺基烷基胺基羰基乙烯基)-2,4-(二硫基)假尿嘧啶；1(胺基烷基胺基羰基乙烯基)-4(硫基)假尿嘧啶；1(胺基烷基胺基羰基乙烯基)-假尿嘧啶；1(胺基羰基乙烯基)-2(硫基)-假尿嘧啶；1(胺基羰基乙烯基)-2,4-(二硫基)假尿嘧啶；1(胺基羰基乙烯基)-4(硫基)假尿嘧啶；1(胺基羰基乙烯基)-假尿嘧啶；1經取代之2(硫基)-假尿嘧啶；1經取代之2,4-(二硫基)假尿嘧啶；1經取代之4(硫基) 假尿嘧啶；1經取代之假尿嘧啶；1-(胺基烷基胺基-羰基乙烯基)-2-(硫基)-假尿嘧啶；1-甲基-3-(3-胺基-3-羧丙基)假尿苷TP；1-甲基-3-(3-胺基-3-羧丙基)假-UTP；1-甲基-假-UTP；1-乙基-假-UTP；2(硫基)假尿嘧啶；2'去氧基尿苷；2'氟尿苷；2-(硫基)尿嘧啶；2,4-(二硫基)假尿嘧啶；2'甲基、2'胺基、2'疊氮基、2'氟-鳥苷；2'-胺基-2'-去氧基-UTP；2'-疊氮基-2'-去氧基-UTP；2'-疊氮基-去氧基尿苷TP；2'-O-甲基假尿苷；2'去氧基尿苷；2'氟尿苷；2'-去氧基-2'-a-胺基尿苷TP；2'-去氧基-2'-a-疊氮基尿苷TP；2-甲基假尿苷；3(3胺基-3羧基丙基)尿嘧啶；4(硫基)假尿嘧啶；4-(硫基)假尿嘧啶；4-(硫基)尿嘧啶；4-硫基尿嘧啶；5(1,3-二唑-1-烷基)尿嘧啶；5(2-胺基丙基)尿嘧啶；5(胺基烷基)尿嘧啶；5(二甲胺基烷基)尿嘧啶；5(胍鎓烷基)尿嘧啶；5(甲氧羰基甲基)-2-(硫基)尿嘧啶；5(甲氧羰基-甲基)尿嘧啶；5(甲基)2(硫基)尿嘧啶；5(甲基)2，4(二硫基)尿嘧啶；5(甲基)4(硫基)尿嘧啶；5(甲胺基甲基)-2(硫基)尿嘧啶；5(甲胺基甲基)-2,4(二硫基)尿嘧啶；5(甲胺基甲基)-4(硫基)尿嘧啶；5(丙炔基)尿嘧啶；5(三氟甲基)尿嘧啶；5-(2-胺基丙基)尿嘧啶；5-(烷基)-2-(硫基)假尿嘧啶；5-(烷基)-2,4(二硫基)假尿嘧啶；5-(烷基)-4(硫基)假尿嘧啶；5-(烷基)假尿嘧啶；5-(烷基)尿嘧啶；5-(炔基)尿嘧啶；5-(烯丙基胺基)尿嘧啶；5-(氰基烷基)尿嘧啶；5-(二烷胺基烷基)尿嘧啶；5-(二甲胺基烷基)尿嘧啶；5-(胍鎓烷基)尿嘧啶；5-(鹵基)尿嘧啶；5-(1,3-二唑-1-烷基)尿嘧啶；5-(甲氧基)尿嘧啶；5-(甲氧羰基甲基)-2-(硫基)尿嘧啶；5-(甲氧羰基-甲基)尿嘧啶；5-(甲基)2(硫基)尿嘧啶；5-(甲基)2,4(二硫基)尿嘧啶；5-(甲基)4(硫基)尿嘧啶；5-(甲基)-2-(硫基)假尿嘧啶；5-(甲基)-2,4(二硫基)假尿嘧啶；5-(甲基)-4(硫基)假尿嘧啶；5-(甲基)假尿嘧啶；5-(甲胺基甲基)-2(硫基)尿嘧啶；5-(甲胺基甲基)-2,4(二硫基)尿嘧啶；5-(甲胺基甲基)-4-(硫基)尿嘧啶；5-(丙炔基)尿嘧 啶；5-(三氟甲基)尿嘧啶；5-胺基烯丙基-尿苷；5-溴-尿苷；5-碘-尿苷；5-尿嘧啶；6(偶氮基)尿嘧啶；6-(偶氮基)尿嘧啶；6-氮雜-尿苷；烯丙基胺基-尿嘧啶；氮雜尿嘧啶；去氮雜尿嘧啶；N3(甲基)尿嘧啶；假-UTP-1-2-乙酸；假尿嘧啶；4-硫基-假-UTP；1-羧甲基-假尿苷；1-甲基-1-去氮雜-假尿苷；1-丙炔基-尿苷；1-牛磺酸甲基-1-甲基-尿苷；1-牛磺酸甲基-4-硫基-尿苷；1-牛磺酸甲基-假尿苷；2-甲氧基-4-硫基-假尿苷；2-硫基-1-甲基-1-去氮雜-假尿苷；2-硫基-1-甲基-假尿苷；2-硫基-5-氮雜-尿苷；2-硫基-二氫假尿苷；2-硫基-二氫尿苷；2-硫基-假尿苷；4-甲氧基-2-硫基-假尿苷；4-甲氧基-假尿苷；4-硫基-1-甲基-假尿苷；4-硫基-假尿苷；5-氮雜-尿苷；二氫假尿苷；(±)1-(2-羥基丙基)假尿苷TP；(2R)-1-(2-羥基丙基)假尿苷TP；(2S)-1-(2-羥基丙基)假尿苷TP；(E)-5-(2-溴-乙烯基)阿糖-尿苷TP；(E)-5-(2-溴-乙烯基)尿苷TP；(Z)-5-(2-溴-乙烯基)阿糖-尿苷TP；(Z)-5-(2-溴-乙烯基)尿苷TP；1-(2,2,2-三氟乙基)-假-UTP；1-(2,2,3,3,3-五氟丙基)假尿苷TP；1-(2,2-二乙氧基乙基)假尿苷TP；1-(2,4,6-三甲基苄基)假尿苷TP；1-(2,4,6-三甲基-苄基)假-UTP；1-(2,4,6-三甲基-苯基)假-UTP；1-(2-胺基-2-羧基乙基)假-UTP；1-(2-胺基-乙基)假-UTP；1-(2-羥基乙基)假尿苷TP；1-(2-甲氧基乙基)假尿苷TP；1-(3,4-雙-三氟甲氧基苄基)假尿苷TP；1-(3,4-二甲氧基苄基)假尿苷TP；1-(3-胺基-3-羧丙基)假-UTP；1-(3-胺基-丙基)假-UTP；1-(3-環丙基-丙-2-炔基)假尿苷TP；1-(4-胺基-4-羧基丁基)假-UTP；1-(4-胺基-苄基)假-UTP；1-(4-胺基-丁基)假-UTP；1-(4-胺基-苯基)假-UTP；1-(4-疊氮基苄基)假尿苷TP；1-(4-溴苄基)假尿苷TP；1-(4-氯苄基)假尿苷TP；1-(4-氟苄基)假尿苷TP；1-(4-碘苄基)假尿苷TP；1-(4-甲磺醯基苄基)假尿苷TP；1-(4-甲氧基苄基)假尿苷TP；1-(4-甲氧基-苄基)假-UTP；1-(4-甲氧基-苯基)假-UTP；1-(4-甲基苄基)假尿苷TP；1-(4-甲基-苄基)假-UTP；1- (4-硝基苄基)假尿苷TP；1-(4-硝基-芣基)假-UTP；1(4-硝基-苯基)假-UTP；1-(4-硫基甲氧基苄基)假尿苷TP；1-(4-三氟甲氧基芣基)假尿苷TP；1-(4-三氟甲基苄基)假尿苷TP；1-(5-胺基-戊基)假-UTP；1-(6-胺基-己基)假-UTP；1,6-二甲基-假-UTP；1-[3-(2-{2-[2-(2-胺基乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-丙醯基]假尿苷TP；1-{3-[2-(2-胺基乙氧基)-乙氧基]-丙醯基}假尿苷TP；1-乙醯基假尿苷TP；1-烷基-6-(1-丙炔基)-假-UTP；1-烷基-6-(2-丙炔基)-假-UTP；1-烷基-6-烯丙基-假-UTP；1-烷基-6-乙炔基-假-UTP；1-烷基-6-高烯丙基-假-UTP；1-烷基-6-乙烯基-假-UTP；1-烯丙基假尿苷TP；1-胺基甲基-假-UTP；1-苄醯基假尿苷TP；1-苄氧基甲基假尿苷TP；1-苄基-假-UTP；1-生物素基-PEG2-假尿苷TP；1-生物素基假尿苷TP；1-丁基-假-UTP；1-氰基甲基假尿苷TP；1-環丁基甲基-假-UTP；1-環丁基-假-UTP；1-環庚基甲基-假-UTP；1-環庚基-假-UTP；1-環己基甲基-假-UTP；1-環己基-假-UTP；1-環辛基甲基-假-UTP；1-環辛基-假-UTP；1-環戊基甲基-假-UTP；1-環戊基-假-UTP；1-環丙基甲基-假-UTP；1-環丙基-假-UTP；1-乙基-假-UTP；1-己基-假-UTP；1-高烯丙基假尿苷TP；1-羥甲基假尿苷TP；1-異-丙基-假-UTP；1-Me-2-硫基-假-UTP；1-Me-4-硫基-假-UTP；1-Me-α-硫基-假-UTP；1-甲磺醯基甲基假尿苷TP；1-甲氧基甲基假尿苷TP；1-甲基-6-(2,2,2-三氟乙基)假-UTP；1-甲基-6-(4-嗎啉基)-假-UTP；1-甲基-6-(4-硫基嗎啉基)-假-UTP；1-甲基-6-(經取代之苯基)假-UTP；1-甲基-6-胺基-假-UTP；1-甲基-6-疊氮基-假-UTP；1-甲基-6-溴-假-UTP；1-甲基-6-丁基-假-UTP；1-甲基-6-氯-假-UTP；1-甲基-6-氰基-假-UTP；1-甲基-6-二甲胺基-假-UTP；1-甲基-6-乙氧基-假-UTP；1-甲基-6-羧酸乙酯-假-UTP；1-甲基-6-乙基-假-UTP；1-甲基-6-氟-假-UTP；1-甲基-6-甲醯基-假-UTP；1-甲基-6-羥基胺基-假-UTP；1-甲基-6-羥基-假-UTP；1-甲基-6-碘-假-UTP；1-甲基-6-異-丙 基-假-UTP；1-甲基-6-甲氧基-假-UTP；1-甲基-6-甲胺基-假-UTP；1-甲基-6-苯基-假-UTP；1-甲基-6-丙基-假-UTP；1-甲基-6-第三丁基-假-UTP；1-甲基-6-三氟甲氧基-假-UTP；1-甲基-6-三氟甲基-假-UTP；1-嗎啉基甲基假尿苷TP；1-戊基-假-UTP；1-苯基-假-UTP；1-三甲基乙醯基假尿苷TP；1-丙炔基假尿苷TP；1-丙基-假-UTP；1-丙炔基-假尿苷；1-對甲苯基-假-UTP；1-第三丁基-假-UTP；1-硫基甲氧基甲基假尿苷TP；1-硫基嗎啉基甲基假尿苷TP；1-三氟乙醯基假尿苷TP；1-三氟甲基-假-UTP；1-乙烯基假尿苷TP；2,2'-脫水-尿苷TP；2'-溴-去氧基尿苷TP；2'-F-5-甲基-2'-去氧基-UTP；2'-OMe-5-Me-UTP；2'-OMe-假-UTP；2'-a-乙炔基尿苷TP；2'-a-三氟甲基尿苷TP；2'-b-乙炔基尿苷TP；2'-b-三氟甲基尿苷TP；2'-去氧基-2',2'-二氟尿苷TP；2'-去氧基-2'-a-巰基尿苷TP；2'-去氧基-2'-a-硫基甲氧基尿苷TP；2'-去氧基-2'-b-胺基尿苷TP；2'-去氧基-2'-b-疊氮基尿苷TP；2'-去氧基-2'-b-溴尿苷TP；2'-去氧基-2'-b-氯尿苷TP；2'-去氧基-2'-b-氟尿苷TP；2'-去氧基-2'-b-碘尿苷TP；2'-去氧基-2'-b-巰基尿苷TP；2'-去氧基-2'-b-硫基甲氧基尿苷TP；2-甲氧基-4-硫基-尿苷；2-甲氧基尿苷；2'-O-甲基-5-(1-丙炔基)尿苷TP；3-烷基-假-UTP；4'-疊氮基尿苷TP；4'-碳環尿苷TP；4'-乙炔基尿苷TP；5-(1-丙炔基)阿糖-尿苷TP；5-(2-呋喃基)尿苷TP；5-氰基尿苷TP；5-二甲胺基尿苷TP；5'-高-尿苷TP；5-碘-2'-氟-去氧基尿苷TP；5-苯基乙炔基尿苷TP；5-三氘甲基-6-氘尿苷TP；5-三氟甲基-尿苷TP；5-乙烯基阿糖尿苷TP；6-(2,2,2-三氟乙基)-假-UTP；6-(4-嗎啉基)-假-UTP；6-(4-硫基嗎啉基)-假-UTP；6-(經取代之苯基)-假-UTP；6-胺基-假-UTP；6-疊氮基-假-UTP；6-溴-假-UTP；6-丁基-假-UTP；6-氯-假-UTP；6-氰基-假-UTP；6-二甲胺基-假-UTP；6-乙氧基-假-UTP；6-羧酸乙酯-假-UTP；6-乙基-假-UTP；6-氟-假-UTP；6-甲醯基-假-UTP；6-羥基胺基-假-UTP；6-羥基-假-UTP；6-碘 -假-UTP；6-異-丙基-假-UTP；6-甲氧基-假-UTP；6-甲胺基-假-UTP；6-甲基-假-UTP；6-苯基-假-UTP；6-苯基-假-UTP；6-丙基-假-UTP；6-第三丁基-假-UTP；6-三氟甲氧基-假-UTP；6-三氟甲基-假-UTP；α-硫基-假-UTP；假尿苷1-(4-甲基苯磺酸)TP；假尿苷1-(4-甲基苯甲酸)TP；假尿苷TP 1-[3-(2-乙氧基)]丙酸；假尿苷TP 1-[3-{2-(2-[2-(2-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基)-乙氧基}]丙酸；假尿苷TP 1-[3-{2-(2-[2-{2(2-乙氧基)-乙氧基}-乙氧基]-乙氧基)-乙氧基}]丙酸；假尿苷TP 1-[3-{2-(2-[2-乙氧基]-乙氧基)-乙氧基}]丙酸；假尿苷TP 1-[3-{2-(2-乙氧基)-乙氧基}]丙酸；假尿苷TP 1-甲基膦酸；假尿苷TP 1-甲基膦酸二乙酯；假-UTP-N1-3-丙酸；假-UTP-N1-4-丁酸；假-UTP-N1-5-戊酸；假-UTP-N1-6-己酸；假-UTP-N1-7-庚酸；假-UTP-N1-甲基-對苯甲酸；假-UTP-N1-對-苯甲酸；懷丁苷(Wybutosine)；羥基懷丁苷；異懷俄苷；過氧基懷丁苷；未完全修飾之羥基懷丁苷；4-去甲基懷俄苷；2,6-(二胺基)嘌呤；1-(氮雜)-2-(硫基)-3-(氮雜)-啡噁嗪-1-基；1,3-(二氮雜)-2-(側氧基)-啡噻嗪-1-基；1,3-(二氮雜)-2-(側氧基)-啡噁嗪-1-基；1,3,5-(三氮雜)-2,6-(二氧雜)-萘；2(胺基)嘌呤；2,4,5-(三甲基)苯基；2'甲基、2'胺基、2'疊氮基、2'氟-胞苷；2'甲基、2'胺基、2'疊氮基、2'氟-腺嘌呤；2'甲基、2'胺基、2'疊氮基、2'氟-尿苷；2'-胺基-2'-去氧基核糖；2-胺基-6-氯-嘌呤；2-氮雜-肌苷基；2'-疊氮基-2'-去氧基核糖；2'氟-2'-去氧基核糖；經2'-氟-修飾之鹼基；2'-O-甲基-核糖；2-側氧基-7-胺基吡啶并嘧啶-3-基；2-側氧基-吡啶并嘧啶-3-基；2-吡啶酮；3硝基吡咯；3-(甲基)-7-(丙炔基)異喹諾酮；3-(甲基)異喹諾酮；4-(氟)-6-(甲基)苯并咪唑；4-(甲基)苯并咪唑；4-(甲基)吲哚基；4,6-(二甲基)吲哚基；5硝基吲哚；5經取代之嘧啶；5-(甲基)異喹諾酮；5-硝基吲哚；6-(氮雜)嘧啶；6-(偶氮基)胸腺嘧啶；6-(甲基)-7-(氮雜)吲哚基；6-氯-嘌呤；6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基；7-(胺基烷基羥基)-1-(氮 雜)-2-(硫基)-3-(氮雜)-啡噻嗪-1-基；7-(胺基烷基羥基)-1-(氮雜)-2-(硫基)-3-(氮雜)-啡噁嗪-1-基；7-(胺基烷基羥基)-1,3-(二氮雜)-2-(側氧基)-啡噁嗪-1-基；7-(胺基烷基羥基)-1,3-(二氮雜)-2-(側氧基)-啡噻嗪-1-基；7-(胺基烷基羥基)-1,3-(二氮雜)-2-(側氧基)-啡噁嗪-1-基；7-(氮雜)吲哚基；7-(胍鎓烷基羥基)-1-(氮雜)-2-(硫基)-3-(氮雜)-啡噁嗪-基；7-(胍鎓烷基羥基)-1-(氮雜)-2-(硫基)-3-(氮雜)-啡噻嗪-1-基；7-(胍鎓烷基羥基)-1-(氮雜)-2-(硫基)-3-(氮雜)-啡噁嗪-1-基；7-(胍鎓烷基羥基)-1,3-(二氮雜)-2-(側氧基)-啡噁嗪-1-基；7-(胍鎓烷基-羥基)-1,3-(二氮雜)-2-(側氧基)-啡噻嗪-1-基；7-(胍鎓烷基羥基)-1,3-(二氮雜)-2-(側氧基)-啡噁嗪-1-基；7-(丙炔基)異喹諾酮；7-(丙炔基)異喹諾酮，丙炔基-7-(氮雜)吲哚基；7-去氮雜-肌苷基；7-經取代之1-(氮雜)-2-(硫基)-3-(氮雜)-啡噁嗪-1-基；7-經取代之1,3-(二氮雜)-2-(側氧基)-啡噁嗪-1-基；9-(甲基)-咪唑并吡啶基；胺基吲哚基；蒽基；雙-原-(胺基烷基羥基)-6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基；雙-鄰位經取代之6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基；二氟甲苯基；次黃嘌呤；咪唑并吡啶基；肌苷基；異喹諾酮；異鳥苷；N2-經取代之嘌呤；N6-甲基-2-胺基-嘌呤；N6-經取代之嘌呤；N-烷基化衍生物；萘基；硝基苯并咪唑基；硝基咪唑基；硝基吲唑基；硝基吡唑基；努布拉林(Nubularine)；O6-經取代之嘌呤；O-烷基化衍生物；鄰-(胺基烷基羥基)-6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基；鄰位經取代之6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基；氧代間型黴素(Oxoformycin)TP；對-(胺基烷基羥基)-6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基；對位經取代之6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基；并五苯基；苯蒽基；苯基；丙炔基-7-(氮雜)吲哚基；芘基；吡啶并嘧啶-3-基；吡啶并嘧啶-3-基、2-側氧基-7-胺基-吡啶并嘧啶-3-基；吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基；吡咯并嘧啶基；吡咯并吡嗪基；芪基；經取代之1,2,4-三唑；并四苯基；殺結核菌素(tubercidine)；黃嘌呤；黃嘌呤核苷酸-5'- TP；2-硫基-澤布拉林；5-氮雜-2-硫基-澤布拉林；7-去氮雜-2-胺基-嘌呤；吡啶-4-酮核糖核苷；2-胺基-核糖苷基-TP；間型黴素A TP；間型黴素B TP；吡咯核苷TP(Pyrrolosine TP)；2'-OH-阿糖-腺苷TP；2'-OH-阿糖-胞苷TP；2'-OH-阿糖-尿苷TP；2'-OH-阿糖-鳥苷TP；5-(2-甲氧羰基乙烯基)尿苷TP；及N6-(19-胺基-五氧雜十九烷基)腺苷TP。
在一些實施例中，聚核苷酸(例如，RNA聚核苷酸，諸如mRNA聚核苷酸)包括至少兩種(例如，2種、3種、4種或4種以上)前述經修飾之核鹼基之組合。
在一些實施例中，聚核苷酸(例如，RNA聚核苷酸，諸如mRNA聚核苷酸)中經修飾之核鹼基係選自由以下組成之群：假尿苷(ψ)、2-硫尿苷(s2U)、4'-硫尿苷、5-甲基胞嘧啶、2-硫基-1-甲基-1-去氮雜-假尿苷、2-硫基-1-甲基-假尿苷、2-硫基-5-氮雜-尿苷、2-硫基-二氫假尿苷、2-硫基-二氫尿苷、2-硫基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫基-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫基-1-甲基-假尿苷、4-硫基-假尿苷、5-氮雜-尿苷、二氫假尿苷、5-甲基尿苷、5-甲氧基尿苷、2'-O-甲基尿苷、1-甲基-假尿苷(m1ψ)、1-乙基-假尿苷(e1ψ)、5-甲氧基-尿苷(mo5U)、5-甲基-胞苷(m5C)、α-硫基-鳥苷、α-硫基-腺苷、5-氰基尿苷、4'-硫基尿苷7-去氮雜-腺嘌呤、1-甲基-腺苷(m1A)、2-甲基-腺嘌呤(m2A)、N6-甲基-腺苷(m6A)、及2,6-二胺基嘌呤、(I)、1-甲基-肌苷(m1I)、懷俄苷(imG)、甲基懷俄苷(mimG)、7-去氮雜-鳥苷、7-氰基-7-去氮雜-鳥苷(preQ0)、7-胺基甲基-7-去氮雜-鳥苷(preQ1)、7-甲基-鳥苷(m7G)、1-甲基-鳥苷(m1G)、8-氧代-鳥苷、7-甲基-8-氧代-鳥苷、2,8-二甲基腺苷、2-香葉基硫尿苷、2-立西啶、2-硒基尿苷、3-(3-胺基-3-羧基丙基)-5,6-二氫尿苷、3-(3-胺基-3-羧基丙基)假尿苷、3-甲基假尿苷、5-(羧基羥甲基)-2'-O-甲基尿苷甲酯、5-胺基甲基-2-香葉基硫尿苷、5-胺基甲基-2-硒基尿苷、5-胺基甲基尿苷、5-胺甲醯基羥甲基尿苷、5-胺 甲醯基甲基-2-硫尿苷、5-羧基甲基-2-硫尿苷、5-羧基甲胺基甲基-2-香葉基硫尿苷、5-羧基甲胺基甲基-2-硒基尿苷、5-氰基甲基尿苷、5-羥基胞苷、5-甲胺基甲基-2-香葉基硫尿苷、7-胺基羧基丙基-去甲基懷俄苷、7-胺基羧基丙基懷俄苷、7-胺基羧基丙基懷俄苷甲酯、8-甲基腺苷、N4,N4-二甲基胞苷、N6-甲醯基腺苷、N6-羥甲基腺苷、胍丁胺胞苷(agmatidine)、環狀N6-蘇胺醯基胺甲醯基腺苷、麩胺醯基-喹啉、甲基化修飾不完全之羥基懷丁苷(hydroxywybutosine)、N4,N4,2'-O-三甲基胞苷、香葉基化5-甲胺基甲基-2-硫尿苷、香葉基化5-羧基甲胺基甲基-2-硫尿苷、Qbase、preQ0base、preQ1base及其兩種或兩種以上之組合。在一些實施例中，至少一種經化學修飾之核苷係選自由以下組成之群：假尿苷、1-甲基-假尿苷、1-乙基-假尿苷、5-甲基胞嘧啶、5-甲氧基尿苷及其組合。在一些實施例中，聚核糖核苷酸(例如，RNA聚核糖核苷酸，諸如mRNA聚核糖核苷酸)包括至少兩種(例如，2種、3種、4種或4種以上)前述經修飾之核鹼基之組合。在一些實施例中，聚核苷酸(例如，RNA聚核苷酸，諸如mRNA聚核苷酸)包括至少兩種(例如，2種、3種、4種或4種以上)前述經修飾之核鹼基之組合。
在一些實施例中，聚核苷酸(例如，RNA聚核苷酸，諸如mRNA聚核苷酸)中之經修飾之核鹼基係選自由以下組成之群：1-甲基-假尿苷(m1ψ)、1-乙基-假尿苷(e1ψ)、5-甲氧基-尿苷(mo5U)、5-甲基-胞苷(m5C)、假尿苷(ψ)、α-硫基-鳥苷及α-硫基-腺苷。在一些實施例中，聚核糖核苷酸包括至少兩種(例如，2種、3種、4種或4種以上)前述經修飾之核鹼基之組合。
在一些實施例中，聚核苷酸(例如，RNA聚核苷酸，諸如mRNA聚核苷酸)包含假尿苷(ψ)及5-甲基-胞苷(m5C)。在一些實施例中，聚核糖核苷酸(例如，RNA，諸如mRNA)包含1-甲基-假尿苷(m1ψ)。在 一些實施例中，聚核糖核苷酸(例如，RNA，諸如mRNA)包含1-乙基-假尿苷(e1ψ)。在一些實施例中，聚核糖核苷酸(例如，RNA，諸如mRNA)包含1-甲基-假尿苷(m1ψ)及5-甲基-胞苷(m5C)。在一些實施例中，聚核糖核苷酸(例如，RNA，諸如mRNA)包含1-乙基-假尿苷(e1ψ)及5-甲基-胞苷(m5C)。在一些實施例中，聚核糖核苷酸(例如，RNA，諸如mRNA)包含2-硫尿苷(s2U)。在一些實施例中，聚核糖核苷酸(例如，RNA，諸如mRNA)包含2-硫尿苷及5-甲基-胞苷(m5C)。在一些實施例中，聚核糖核苷酸(例如，RNA，諸如mRNA)包含甲氧基-尿苷(mo5U)。在一些實施例中，聚核糖核苷酸(例如，RNA，諸如mRNA)包含5-甲氧基-尿苷(mo5U)及5-甲基-胞苷(m5C)。在一些實施例中，聚核糖核苷酸(例如，RNA，諸如mRNA)包含2'-O-甲基尿苷。在一些實施例中，聚核糖核苷酸(例如，RNA，諸如mRNA)包含2'-O-甲基尿苷及5-甲基-胞苷(m5C)。在一些實施例中，聚核糖核苷酸(例如，RNA，諸如mRNA)包含N6-甲基-腺苷(m6A)。在一些實施例中，聚核糖核苷酸(例如，RNA，諸如mRNA)包含N6-甲基-腺苷(m6A)及5-甲基-胞苷(m5C)。
在一些實施例中，聚核苷酸(例如，RNA聚核苷酸，諸如mRNA聚核苷酸)經均勻修飾(例如，完全修飾、在整個序列中經修飾)以用於特定修飾。舉例而言，聚核苷酸可經1-甲基-假尿苷均勻修飾，意謂mRNA序列中之所有尿苷殘基經1-甲基-假尿苷置換。類似地，聚核苷酸可藉由經諸如上文所述之彼等殘基的經修飾之殘基置換而經均勻修飾為序列中存在之任何類似之核苷殘基。
具有經修飾之胞嘧啶之例示性核鹼基及核苷包括N4-乙醯基-胞苷(ac4C)、5-甲基-胞苷(m5C)、5-鹵基-胞苷(例如，5-碘-胞苷)、5-羥甲基-胞苷(hm5C)、1-甲基-假異胞苷、2-硫基-胞苷(s2C)及2-硫基-5-甲基-胞苷。
在一些實施例中，經修飾之核鹼基為經修飾之尿苷。具有經修飾之尿苷之例示性核鹼基及核苷包括1-甲基-假尿苷(m1ψ)、1-乙基-假尿苷(e1ψ)、5-甲氧基尿苷、2-硫基尿苷、5-氰基尿苷、2'-O-甲基尿苷及4'-硫基尿苷。
在一些實施例中，經修飾之核鹼基為經修飾之腺嘌呤。具有經修飾之腺嘌呤之例示性核鹼基及核苷包括7-去氮雜-腺嘌呤、1-甲基-腺苷(m1A)、2-甲基-腺嘌呤(m2A)及N6-甲基-腺苷(m6A)。
在一些實施例中，經修飾之核鹼基為經修飾之鳥嘌呤。具有經修飾之鳥嘌呤之例示性核鹼基及核苷包括肌苷(I)、1-甲基-肌苷(m1I)、懷俄苷(imG)、甲基懷俄苷(mimG)、7-去氮雜-鳥苷、7-氰基-7-去氮雜-鳥苷(preQ0)、7-胺基甲基-7-去氮雜-鳥苷(preQ1)、7-甲基-鳥苷(m7G)、1-甲基-鳥苷(m1G)、8-氧代-鳥苷及7-甲基-8-氧代-鳥苷。
本發明之聚核苷酸沿分子之整個長度可經部分或完全修飾。舉例而言，在本發明之聚核苷酸中，或在其特定預定序列區域中(例如，在包括或不包括polyA尾之mRNA中)，一或多種或所有或特定類型之核苷酸(例如，嘌呤或嘧啶，或A、G、U、C中之任何一或多種或全部)可經均勻修飾。在一些實施例中，在本發明之聚核苷酸中(或在其特定序列區域中)所有核苷酸X均為經修飾之核苷酸，其中X可為核苷酸A、G、U、C中之任一者，或組合A+G、A+U、A+C、G+U、G+C、U+C、A+G+U、A+G+C、G+U+C或A+G+C中之任一者。
聚核苷酸可含有約1%至約100%經修飾之核苷酸(相對於總核苷酸含量，或相對於一或多種類型之核苷酸，亦即A、G、U或C中之任何一或多者)或任何介於中間之百分比(例如，1%至20%、1%至25%、1%至50%、1%至60%、1%至70%、1%至80%、1%至90%、1%至95%、10%至20%、10%至25%、10%至50%、10%至60%、10%至 70%、10%至80%、10%至90%、10%至95%、10%至100%、20%至25%、20%至50%、20%至60%、20%至70%、20%至80%、20%至90%、20%至95%、20%至100%、50%至60%、50%至70%、50%至80%、50%至90%、50%至95%、50%至100%、70%至80%、70%至90%、70%至95%、70%至100%、80%至90%、80%至95%、80%至100%、90%至95%、90%至100%及95%至100%)。應瞭解任何其餘百分比為未經修飾之A、G、U或C之存在所佔。
聚核苷酸可含有最小1%及最大100%經修飾之核苷酸，或任何介於中間之百分比，諸如至少5%經修飾之核苷酸、至少10%經修飾之核苷酸、至少25%經修飾之核苷酸、至少50%經修飾之核苷酸、至少80%經修飾之核苷酸或至少90%經修飾之核苷酸。舉例而言，聚核苷酸可含有經修飾之嘧啶，諸如經修飾之尿嘧啶或胞嘧啶。在一些實施例中，聚核苷酸中至少5%、至少10%、至少25%、至少50%、至少80%、至少90%或100%之尿嘧啶由經修飾之尿嘧啶(例如，5-經取代之尿嘧啶)置換。經修飾之尿嘧啶可由具有單一獨特結構之化合物置換，或可由複數種具有不同結構(例如，2、3、4或4種以上獨特結構)之化合物置換。在一些實施例中，聚核苷酸中至少5%、至少10%、至少25%、至少50%、至少80%、至少90%或100%之胞嘧啶由經修飾之胞嘧啶(例如，5-經取代之胞嘧啶)置換。經修飾之胞嘧啶可由具有單一獨特結構之化合物置換，或可由複數種具有不同結構(例如，2、3、4或4種以上獨特結構)之化合物置換。
在一些實施例中，經修飾之核鹼基為經修飾之尿嘧啶。具有經修飾之尿嘧啶之例示性核鹼基及核苷包括假尿苷(ψ)、吡啶-4-酮核糖核苷、5-氮雜-尿苷、6-氮雜-尿苷、2-硫基-5-氮雜-尿苷、2-硫基-尿苷(s2U)、4-硫基-尿苷(s4U)、4-硫基-假尿苷、2-硫基-假尿苷、5-羥基-尿苷(ho5U)、5-胺基烯丙基-尿苷、5-鹵基-尿苷(例如，5-碘-尿苷或5- 溴-尿苷)、3-甲基-尿苷(m3U)、5-甲氧基-尿苷(mo5U)、尿苷5-氧基乙酸(cmo5U)、尿苷5-氧基乙酸甲酯(mcmo5U)、5-羧甲基-尿苷(cm5U)、1-羧甲基-假尿苷、5-羧基羥甲基-尿苷(chm5U)、5-羧基羥甲基-尿苷甲酯(mchm5U)、5-甲氧羰基甲基-尿苷(mcm5U)、5-甲氧羰基甲基-2-硫基-尿苷(mcm5s2U)、5-胺基甲基-2-硫基-尿苷(nm5s2U)、5-甲胺基甲基-尿苷(mnm5U)、5-甲胺基甲基-2-硫基-尿苷(mnm5s2U)、5-甲胺基甲基-2-硒基-尿苷(mnm5se2U)、5-胺甲醯基甲基-尿苷(ncm5U)、5-羧基甲胺基甲基-尿苷(cmnm5U)、5-羧基甲胺基甲基-2-硫基-尿苷(cmnm5s2U)、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-尿苷(τm5U)、1-牛磺酸甲基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫基-尿苷(τm5s2U)、1-牛磺酸甲基-4-硫基-假尿苷、5-甲基-尿苷(m5U，亦即具有核鹼基去氧胸腺嘧啶)、1-甲基-假尿苷(m1ψ)、1-乙基-假尿苷(e1ψ)、5-甲基-2-硫基-尿苷(m5s2U)、1-甲基-4-硫基-假尿苷(m1s4ψ)、4-硫基-1-甲基-假尿苷、3-甲基-假尿苷(m3ψ)、2-硫基-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-去氮雜-假尿苷、2-硫基-1-甲基-1-去氮雜-假尿苷、二氫尿苷(D)、二氫假尿苷、5,6-二氫尿苷、5-甲基-二氫尿苷(m5D)、2-硫基-二氫尿苷、2-硫基-二氫假尿苷、2-甲氧基-尿苷、2-甲氧基-4-硫基-尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫基-假尿苷、N1-甲基-假尿苷、3-(3-胺基-3-羧丙基)尿苷(acp3U)、1-甲基-3-(3-胺基-3-羧丙基)假尿苷(acp3 ψ)、5-(異戊烯基胺基甲基)尿苷(inm5U)、5-(異戊烯基胺基甲基)-2-硫基-尿苷(inm5s2U)、α-硫基-尿苷、2'-O-甲基-尿苷(Um)、5,2'-O-二甲基-尿苷(m5Um)、2'-O-甲基-假尿苷(ψm)、2-硫基-2'-O-甲基-尿苷(s2Um)、5-甲氧羰基甲基-2'-O-甲基-尿苷(mcm5Um)、5-胺甲醯基甲基-2'-O-甲基-尿苷(ncm5Um)、5-羧基甲胺基甲基-2'-O-甲基-尿苷(cmnm5Um)、3,2'-O-二甲基-尿苷(m3Um)及5-(異戊烯基胺基甲基)-2'-O-甲基-尿苷(inm5Um)、1-硫基-尿苷、去氧胸苷、2'-F-阿糖-尿苷、2'-F-尿苷、2'-OH-阿糖-尿 苷、5-(2-甲氧羰基乙烯基)尿苷及5-[3-(1-E-丙烯基胺基)]尿苷。
在一些實施例中，經修飾之核鹼基為經修飾之胞嘧啶。具有經修飾之胞嘧啶之例示性核鹼基及核苷包括5-氮雜-胞苷、6-氮雜-胞苷、假異胞苷、3-甲基-胞苷(m3C)、N4-乙醯基-胞苷(ac4C)、5-甲醯基-胞苷(f5C)、N4-甲基-胞苷(m4C)、5-甲基-胞苷(m5C)、5-鹵基-胞苷(例如，5-碘-胞苷)、5-羥甲基-胞苷(hm5C)、1-甲基-假異胞苷、吡咯并-胞苷、吡咯并-假異胞苷、2-硫基-胞苷(s2C)、2-硫基-5-甲基-胞苷、4-硫基-假異胞苷、4-硫基-1-甲基-假異胞苷、4-硫基-1-甲基-1-去氮雜-假異胞苷、1-甲基-1-去氮雜-假異胞苷、澤布拉林、5-氮雜-澤布拉林、5-甲基-澤布拉林、5-氮雜-2-硫基-澤布拉林、2-硫基-澤布拉林、2-甲氧基-胞苷、2-甲氧基-5-甲基-胞苷、4-甲氧基-假異胞苷、4-甲氧基-1-甲基-假異胞苷、立西啶(k2C)、α-硫基-胞苷、2'-O-甲基-胞苷(Cm)、5,2'-O-二甲基-胞苷(m5Cm)、N4-乙醯基-2'-O-甲基-胞苷(ac4Cm)、N4,2'-O-二甲基-胞苷(m4Cm)、5-甲醯基-2'-O-甲基-胞苷(f5Cm)、N4,N4,2'-O-三甲基-胞苷(m4 2Cm)、1-硫基-胞苷、2'-F-阿糖-胞苷、2'-F-胞苷及2'-OH-阿糖-胞苷。
在一些實施例中，經修飾之核鹼基為經修飾之腺嘌呤。具有經修飾之腺嘌呤之例示性核鹼基及核苷包括2-胺基-嘌呤、2,6-二胺基嘌呤、2-胺基-6-鹵基-嘌呤(例如，2-胺基-6-氯-嘌呤)、6-鹵基-嘌呤(例如，6-氯-嘌呤)、2-胺基-6-甲基-嘌呤、8-疊氮基-腺苷、7-去氮雜-腺嘌呤、7-去氮雜-8-氮雜-腺嘌呤、7-去氮雜-2-胺基-嘌呤、7-去氮雜-8-氮雜-2-胺基-嘌呤、7-去氮雜-2,6-二胺基嘌呤、7-去氮雜-8-氮雜-2,6-二胺基瞟呤、1-甲基-腺苷(m1A)、2-甲基-腺嘌呤(m2A)、N6-甲基-腺苷(m6A)、2-甲硫基-N6-甲基-腺苷(ms2m6A)、N6-異戊烯基-腺苷(i6A)、2-甲硫基-N6-異戊烯基-腺苷(ms2i6A)、N6-(順-羥基異戊烯基)腺苷(io6A)、2-甲硫基-N6-(順-羥基異戊烯基)腺苷(ms2io6A)、N6-甘胺 酸基胺甲醯基-腺苷(g6A)、N6-蘇胺醯基胺甲醯基-腺苷(t6A)、N6-甲基-N6-蘇胺醯基胺甲醯基-腺苷(m6t6A)、2-甲硫基-N6-蘇胺醯基胺甲醯基-腺苷(ms2g6A)、N6,N6-二甲基-腺苷(m62A)、N6-羥基正纈胺醯基胺甲醯基-腺苷(hn6A)、2-甲硫基-N6-羥基正纈胺醯基胺甲醯基-腺苷(ms2hn6A)、N6-乙醯基-腺苷(ac6A)、7-甲基-腺嘌呤、2-甲硫基-腺嘌呤、2-甲氧基-腺嘌呤、α-硫基-腺苷、2'-O-甲基-腺苷(Am)、N6,2'-O-二甲基-腺苷(m6Am)、N6,N6,2'-O-三甲基-腺苷(m6 2Am)、1,2'-O-二甲基-腺苷(m1Am)、2'-O-核糖基腺苷(磷酸酯)(Ar(p))、2-胺基-N6-甲基-嘌呤、1-硫基-腺苷、8-疊氮基-腺苷、2'-F-阿糖-腺苷、2'-F-腺苷、2'-OH-阿糖-腺苷及N6-(19-胺基-五氧雜十九烷基)-腺苷。
在一些實施例中，經修飾之核鹼基為經修飾之鳥嘌呤。具有經修飾之鳥嘌呤之例示性核鹼基及核苷包括肌苷(I)、1-甲基-肌苷(m1I)、懷俄苷(imG)、甲基懷俄苷(mimG)、4-去甲基-懷俄苷(imG-14)、異懷俄苷(imG2)、懷丁苷(yW)、過氧懷丁苷(o2yW)、羥基懷丁苷(OhyW)、未完全修飾之羥基懷丁苷(OhyW*)、7-去氮雜-鳥苷、Q核苷(Q)、環氧基Q核苷(oQ)、半乳糖基-Q核苷(galQ)、甘露糖-Q核苷(manQ)、7-氰基-7-去氮雜-鳥苷(preQ0)、7-胺基甲基-7-去氮雜-鳥苷(preQ1)、古嘌苷(G+)、7-去氮雜-8-氮雜-鳥苷、6-硫基-鳥苷、6-硫基-7-去氮雜-鳥苷、6-硫基-7-去氮雜-8-氮雜-鳥苷、7-甲基-鳥苷(m7G)、6-硫基-7-甲基-鳥苷、7-甲基-肌苷、6-甲氧基-鳥苷、1-甲基-鳥苷(m1G)、N2-甲基-鳥苷(m2G)、N2,N2-二甲基-鳥苷(m2 2G)、N2,7-二甲基-鳥苷(m2,7G)、N2,N2,7-二甲基-鳥苷(m2,2,7G)、8-側氧基-鳥苷、7-甲基-8-側氧基-鳥苷、1-甲基-6-硫基-鳥苷、N2-甲基-6-硫基-鳥苷、N2,N2-二甲基-6-硫基-鳥苷、α-硫基-鳥苷、2'-O-甲基-鳥苷(Gm)、N2-甲基-2'-O-甲基-鳥苷(m2Gm)、N2,N2-二甲基-2'-O-甲基-鳥苷(m2 2Gm)、1-甲基-2'-O-甲基-鳥苷(m1Gm)、N2,7-二甲基-2'-O-甲基-鳥 苷(m2,7Gm)、2'-O-甲基-肌苷(Im)、1,2'-O-二甲基-肌苷(m1Im)、2'-O-核糖基鳥苷(磷酸酯)(Gr(p))、1-硫基-鳥苷、O6-甲基-鳥苷、2'-F-阿糖-鳥苷及2'-F-鳥苷。
在一些實施例中，RNA疫苗包含5'UTR元件、視情況經密碼子最佳化之開放閱讀框架及3'UTR元件、poly(A)序列及/或多腺苷酸化信號，其中RNA未經化學修飾。
RSV RNA疫苗-RNA(例如，mRNA)之活體外轉錄
本發明之RSV疫苗包含至少一種RNA聚核苷酸，諸如mRNA(例如，經修飾之mRNA)。舉例而言，mRNA自模板DNA活體外轉錄，稱為「活體外轉錄模板」。在一些實施例中，至少一種RNA聚核苷酸具有至少一個化學修飾。至少一個化學修飾可包括(但不明確限於)本文所述之任何修飾。
RNA之活體外轉錄在此項技術中已知且在國際公開案WO/2014/152027中描述，該案以全文引用的方式併入本文中。舉例而言，在一些實施例中，在活體外轉錄反應中使用非擴增、線性化DNA模板產生RNA轉錄物以產生RNA轉錄物。在一些實施例中，RNA轉錄物經由酶促封端來封端。在一些實施例中，RNA轉錄物經由層析方法純化，例如使用寡聚dT受質。一些實施例不包括使用DNA酶。在一些實施例中，經由酶促活體外轉錄反應，利用所需化學性質之T7噬菌體RNA聚合酶及核苷酸三磷酸，自編碼所關注基因之非擴增、線性DNA模板合成RNA轉錄物。任何數目之RNA聚合酶或變異體可用於本發明之方法中。聚合酶可選自(但不限於)噬菌體RNA聚合酶(例如，T7 RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶、SP6 RNa聚合酶)，及/或突變聚合酶，諸如(但不限於)能夠合併經修飾之核酸及/或經修飾之核苷酸(包括經化學修飾之核酸及/或核苷酸)之聚合酶。
在一些實施例中，利用非擴增、線性化質體DNA作為活體外轉 錄之模板DNA。在一些實施例中，模板DNA為分離之DNA。在一些實施例中，模板DNA為cDNA。在一些實施例中，cDNA藉由RNA聚核苷酸之逆轉錄形成，例如(但不限於)RSV RNA，例如RSV mRNA。在一些實施例中，細胞(例如，細菌細胞，例如大腸桿菌(E.coli)，例如DH-1細胞)經質體DNA模板轉染。在一些實施例中，培養經轉染之細胞以複製質體DNA，隨後將其分離及純化。在一些實施例中，DNA模板包括RNA聚合酶啟動子，例如位於所關注基因之5'及可操作性地連接至所關注基因之T7啟動子。
在一些實施例中，活體外轉錄模板編碼5'非轉譯(UTR)區，含有開放閱讀框架，且編碼3' UTR及polyA尾。活體外轉錄模板之特定核酸序列組合物及長度將取決於由模板所編碼之mRNA。
「5'非轉譯區」(UTR)係指直接位於起始密碼子(亦即，由核糖體轉譯之mRNA轉錄物之第一密碼子)上游(亦即，5')之不編碼多肽之mRNA區域。
「3'非轉譯區」(UTR)係指直接位於終止密碼子(亦即，傳導轉譯終止信號之mRNA轉錄物之密碼子)下游(亦即，3')之不編碼多肽之mRNA區域。
「開放閱讀框架」為以起始密碼子(例如，甲硫胺酸(ATG))開始且以終止密碼子(例如，TAA、TAG或TGA)結束並編碼多肽之DNA之連續延伸段。
「polyA尾」為位於含有多個連續單磷酸腺苷之3' UTR下游，例如直接位於其下游(亦即，3')之mRNA區域。polyA尾可含有10至300個單磷酸腺苷。舉例而言，polyA尾可含有10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290或300個單磷酸腺苷。在一些實施例中，polyA尾含有50至250個單磷酸 腺苷。在相關生物學情境中(例如，在細胞中、活體內)，poly(A)尾用以保護mRNA以免酶促降解，例如在細胞質中，且有助於轉錄終止及/或mRNA自核輸出及轉譯。
在一些實施例中，聚核苷酸包括200至3,000個核苷酸。舉例而言，聚核苷酸可包括200至500、200至1000、200至1500、200至3000、500至1000、500至1500、500至2000、500至3000、1000至1500、1000至2000、1000至3000、1500至3000或2000至3000個核苷酸)。
治療方法
本文所提供用於在人類及其他哺乳動物中預防及/或治療RSV之組合物(例如，醫藥組合物)、方法、套組及試劑。RSV RNA(例如mRNA)疫苗可用作治療劑或預防劑。其可用於藥物中來預防及/或治療傳染病。在例示性態樣中，本發明之RSV RNA疫苗用於提供針對RSV之預防性保護作用。在投與本發明之RSV RNA疫苗後可達成針對RSV之預防性保護作用。疫苗可投與一次、兩次、三次、四次或四次以上，但可能投與一次疫苗(視情況隨後單次補強)即足夠。儘管較不理想，但可能向受感染個體投與疫苗來達成治療性反應。給藥可需要相應調整。
本發明之態樣中提供一種在個體中引發針對RSV之免疫反應的方法。該方法涉及向個體投與RSV RNA疫苗，該疫苗包含至少一種具有編碼至少一種RSV抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架的RNA聚核苷酸，由此在個體中誘發對RSV抗原性多肽或其免疫原性片段具有特異性之免疫反應，其中個體中之抗-抗原性多肽抗體效價在疫苗接種後相對於經預防有效劑量之針對RSV之傳統(例如，非核酸)疫苗進行疫苗接種之個體中之抗-抗原性多肽抗體效價而言增加。「抗-抗原性多肽抗體」為特異性結合抗原性多肽之血清抗體。
預防有效劑量為以臨床上可接受之水準預防病毒感染之治療有效劑量。在一些實施例中，治療有效劑量為疫苗之包裝插頁中所列之劑量。如本文所用，傳統疫苗係指除本發明之mRNA疫苗以外之疫苗。舉例而言，傳統疫苗包括(但不限於)活微生物疫苗、死微生物疫苗、次單位疫苗、蛋白抗原疫苗、DNA疫苗等。
在一些實施例中，個體中之抗-抗原性多肽抗體效價在疫苗接種後相對於經預防有效劑量之針對RSV之傳統疫苗進行疫苗接種之個體中之抗-抗原性多肽抗體效價而言增加1 log至10 log。
在一些實施例中，個體中之抗-抗原性多肽抗體效價在疫苗接種後相對於經預防有效劑量之針對RSV之傳統疫苗進行疫苗接種之個體中之抗-抗原性多肽抗體效價而言增加1 log。
在一些實施例中，個體中之抗-抗原性多肽抗體效價在疫苗接種後相對於經預防有效劑量之針對RSV之傳統疫苗進行疫苗接種之個體中之抗-抗原性多肽抗體效價而言增加2 log。
在一些實施例中，個體中之抗-抗原性多肽抗體效價在疫苗接種後相對於經預防有效劑量之針對RSV之傳統疫苗進行疫苗接種之個體中之抗-抗原性多肽抗體效價而言增加3 log。
在一些實施例中，個體中之抗-抗原性多肽抗體效價在疫苗接種後相對於經預防有效劑量之針對RSV之傳統疫苗進行疫苗接種之個體中之抗-抗原性多肽抗體效價而言增加5 log。
在一些實施例中，個體中之抗-抗原性多肽抗體效價在疫苗接種後相對於經預防有效劑量之針對RSV之傳統疫苗進行疫苗接種之個體中之抗-抗原性多肽抗體效價而言增加10 log。
本發明之其他態樣中提供一種在個體中引發針對RSV之免疫反應的方法。該方法涉及向個體投與RSV RNA疫苗，該疫苗包含至少一種具有編碼至少一種RSV抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框 架的RNA聚核苷酸，由此在個體中誘發對RSV抗原性多肽或其免疫原性片段具有特異性之免疫反應，其中個體中之免疫反應等於在經相對於RNA疫苗而言2倍至100倍劑量水準之針對RSV之傳統疫苗進行疫苗接種之個體中之免疫反應。
在一些實施例中，個體中之免疫反應等於在經相對於RSV RNA疫苗而言兩倍劑量水準之傳統疫苗進行疫苗接種之個體中之免疫反應。
在一些實施例中，個體中之免疫反應等於在經相對於RSV RNA疫苗而言三倍劑量水準之傳統疫苗進行疫苗接種之個體中之免疫反應。
在一些實施例中，個體中之免疫反應等於在經相對於RSV RNA疫苗而言4倍劑量水準之傳統疫苗進行疫苗接種之個體中之免疫反應。
在一些實施例中，個體中之免疫反應等於在經相對於RSV RNA疫苗而言5倍劑量水準之傳統疫苗進行疫苗接種之個體中之免疫反應。
在一些實施例中，個體中之免疫反應等於在經相對於RSV RNA疫苗而言10倍劑量水準之傳統疫苗進行疫苗接種之個體中之免疫反應。
在一些實施例中，個體中之免疫反應等於在經相對於RSV RNA疫苗而言50倍劑量水準之傳統疫苗進行疫苗接種之個體中之免疫反應。
在一些實施例中，個體中之免疫反應等於在經相對於RSV RNA疫苗而言100倍劑量水準之傳統疫苗進行疫苗接種之個體中之免疫反應。
在一些實施例中，個體中之免疫反應等於在經相對於RSV RNA 疫苗而言10倍至1000倍劑量水準之傳統疫苗進行疫苗接種之個體中之免疫反應。
在一些實施例中，個體中之免疫反應等於在經相對於RSV RNA疫苗而言100倍至1000倍劑量水準之傳統疫苗進行疫苗接種之個體中之免疫反應。
在其他實施例中，藉由測定個體中之[蛋白]抗體效價來評估免疫反應。
在其他態樣中，本發明係在個體中引起針對RSV之免疫反應之方法，其藉由向個體投與RSV RNA疫苗，該疫苗包含至少一種具有編碼至少一種RSV抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架的RNA聚核苷酸，由此在個體中誘發對RSV抗原性多肽或其免疫原性片段具有特異性之免疫反應，其中個體中之免疫反應相對於在經預防有效劑量之針對RSV之傳統疫苗進行疫苗接種之個體中所誘發之免疫反應而言早2天至10週誘發。在一些實施例中，個體中之免疫反應係在經相對於RNA疫苗而言2倍至100倍劑量水準之預防有效劑量之傳統疫苗免疫接種之個體中誘發。
在一些實施例中，個體中之免疫反應係相對於在經預防有效劑量之傳統疫苗進行疫苗接種之個體中誘發之免疫反應而言早2天誘發。
在一些實施例中，個體中之免疫反應係相對於在經預防有效劑量之傳統疫苗進行疫苗接種之個體中誘發之免疫反應而言早3天誘發。
在一些實施例中，個體中之免疫反應係相對於在經預防有效劑量之傳統疫苗進行疫苗接種之個體中誘發之免疫反應而言早1週誘發。
在一些實施例中，個體中之免疫反應係相對於在經預防有效劑 量之傳統疫苗進行疫苗接種之個體中誘發之免疫反應而言早2週誘發。
在一些實施例中，個體中之免疫反應係相對於在經預防有效劑量之傳統疫苗進行疫苗接種之個體中誘發之免疫反應而言早3週誘發。
在一些實施例中，個體中之免疫反應係相對於在經預防有效劑量之傳統疫苗進行疫苗接種之個體中誘發之免疫反應而言早5週誘發。
在一些實施例中，個體中之免疫反應係相對於在經預防有效劑量之傳統疫苗進行疫苗接種之個體中誘發之免疫反應而言早10週誘發。
廣譜RSV疫苗
預期可存在人具有感染一種以上RSV菌株之風險的情形。RNA(例如，mRNA)治療性疫苗由於多種因素而尤其符合組合疫苗接種方法，包括(但不限於)製造速度、快速調整疫苗以適應可見之地理威脅之能力及其類似因素。此外，因為疫苗利用人體來產生抗原性蛋白，故疫苗符合產生更大、更複雜抗原性蛋白，從而允許在人類個體中適當摺疊、表面表現、抗原呈現等。為提供針對RSV菌株之保護作用，可投與組合疫苗，其包括編碼第一RSV之至少一種抗原性多肽蛋白(或其抗原性部分)之RNA且進一步包括編碼第二RSV之至少一種抗原性多肽蛋白(或其抗原性部分)之RNA。RNA(mRNA)可例如在單一脂質奈米粒子(LNP)中共調配，或可在單獨LNP中調配，目的在於共投藥。
鞭毛蛋白佐劑
鞭毛蛋白係約500個胺基酸之單體蛋白，其聚合形成與細菌運動相關之鞭毛。鞭毛蛋白係由多種有鞭毛之細菌(例如鼠傷寒沙氏桿菌 (Salmonella typhimurium))以及無鞭毛之細菌(諸如大腸桿菌)表現。先天性免疫系統細胞(樹枝狀細胞、巨噬細胞等)對鞭毛蛋白之感知係由T011樣受體5(TLR5)以及Nod樣受體(NLR)Ipaf及Naip5介導。TLR及NLR已經鑑定為在先天性免疫反應及適應性免疫反應之活化中起作用。因此，鞭毛蛋白在疫苗中提供佐劑作用。
編碼已知鞭毛蛋白多肽之核苷酸及胺基酸序列係在NCBI GenBank資料庫中公開可得。已知來自鼠傷寒沙氏桿菌、幽門螺旋桿菌(H.Pylori)、霍亂弧菌(V.Cholera)、黏質沙雷氏菌(S.marcesens)、弗氏志賀氏菌(S.flexneri)、梅毒螺旋菌(T.Pallidum)、嗜肺軍團菌(L.pneumophila)、伯氏疏螺旋菌(B.burgdorferei)、艱難梭狀芽孢桿菌(C.difficile)、苜蓿根瘤菌(R.meliloti)、根癌農桿菌(A.tumefaciens)、羽扇豆根瘤菌(R.lupini)、克氏巴爾通體(B.clarridgeiae)、奇異變形桿菌(P.Mirabilis)、枯草芽孢桿菌(B.subtilus)、單核球增多性李斯特菌(L.monocytogene)、綠膿桿菌(P.aeruginosa)及大腸桿菌之鞭毛蛋白序列。
如本文所用，鞭毛蛋白多肽係指全長鞭毛蛋白、其免疫原性片段及與鞭毛蛋白或其免疫原性片段具有至少50%序列一致性之肽。例示性鞭毛蛋白包括來自傷寒沙氏桿菌(Salmonella typhi)(UniPro Entry編號：Q56086)、鼠傷寒沙氏桿菌(A0A0C9DG09)、腸炎沙氏桿菌(Salmonella enteritidis)(A0A0C9BAB7)及豬霍亂沙氏桿菌(Salmonella choleraesuis)(Q6V2X8)及SEQ ID NO：173至175之鞭毛蛋白。在一些實施例中，鞭毛蛋白多肽與鞭毛蛋白或其免疫原性片段具有至少60%、70%、75%、80%、90%、95%、97%、98%、或99%序列一致性。
在一些實施例中，鞭毛蛋白多肽為免疫原性片段。免疫原性片段為鞭毛蛋白中引發免疫反應之一部分。在一些實施例中，免疫反應 為TLR5免疫反應。免疫原性片段之實例為其中鉸鏈區之全部或一部分已刪除或由其他胺基酸置換之鞭毛蛋白。舉例而言，抗原性多肽可插入鉸鏈區中。鉸鏈區為鞭毛蛋白之高變區。鞭毛蛋白之鉸鏈區亦稱為「D3結構域或區域」、「螺旋槳構域或區域」、「高變結構域或區域」及「可變結構域或區域」。如本文所用，「鉸鏈區之至少一部分」係指鞭毛蛋白之鉸鏈區之任何部分，或整個鉸鏈區。在其他實施例中、鞭毛蛋白之免疫原性片段為鞭毛蛋白之20、25、30、35或40個胺基酸之C末端片段。
鞭毛蛋白單體由結構域D0至D3形成。形成莖稈之D0及D1由串聯之長α螺旋構成且在不同細菌中高度保守。D1結構域包括適用於TLR5活化之若干個胺基酸延伸段。整個D1結構域或結構域中之一或多個活性區域為鞭毛蛋白之免疫原性片段。D1結構域中之免疫原性區域之實例包括殘基88至114及殘基411至431(在鼠傷寒沙氏桿菌F1iC鞭毛蛋白中)。在88至100區域中之13個胺基酸中，在沙氏桿菌(Salmonella)鞭毛蛋白與仍然保持TLR5活化之其他鞭毛蛋白之間允許至少6個取代。因此，鞭毛蛋白之免疫原性片段包括類鞭毛蛋白序列，其活化TLR5且含有與沙氏桿菌序列在FliC之88至100(LQRVRELAVQSAN；SEQ ID NO：286)中53%或53%以上一致之13個胺基酸之基元。
在一些實施例中，RNA(例如，mRNA)疫苗包括編碼鞭毛蛋白與一或多種抗原性多肽之融合蛋白之RNA。如本文所用，「融合蛋白」係指連接構築體之兩種組分。在一些實施例中，抗原性多肽之羧基末端與鞭毛蛋白多肽之胺基末端融合或連接。在其他實施例中，抗原性多肽之胺基末端與鞭毛蛋白多肽之羧基末端融合或連接。融合蛋白可包括例如連接至一種、兩種、三種、四種、五種、六種或六種以上抗原性多肽之一種、兩種、三種、四種、五種、六種或六種以上鞭毛蛋 白多肽。當兩種或兩種以上鞭毛蛋白多肽及/或兩種或兩種以上抗原性多肽連接時，該構築體可稱為「多聚體」。
融合蛋白之每一組分可直接相互連接或其可經由連接子連接。舉例而言，連接子可為胺基酸連接子。由RNA(例如，mRNA)疫苗編碼以連接融合蛋白之組分之胺基酸連接子可包括例如至少一種選自由以下組成之群的成員：離胺酸殘基、麩胺酸殘基、絲胺酸殘基及精胺酸殘基。在一些實施例中，連接子之長度為1至30、1至25、1至25、5至10、5、15或5至20個胺基酸。
在其他實施例中，RNA(例如，mRNA)疫苗包括至少兩種單獨RNA聚核苷酸，一種編碼一或多種抗原性多肽且另一種編碼鞭毛蛋白多肽。至少兩種RNA聚核苷酸可在諸如脂質奈米粒子之載體中共調配。
治療性及預防性組合物
本文所提供用於例如在人類及其他哺乳動物中預防、治療或診斷RSV之組合物(例如，醫藥組合物)、方法、套組及試劑。RSV RNA(例如，mRNA)疫苗可用作治療性或預防劑。其可用於藥物中以預防及/或治療傳染病。在一些實施例中，本發明之RSV疫苗可預期用於免疫效應細胞致敏，例如用於離體活化外周血單核細胞(PBMC)，隨後輸注(再輸注)至個體中。
在例示性實施例中，含有如本文所述之RNA聚核苷酸之RSV疫苗可向個體(例如，哺乳動物個體，諸如人類個體)投與，且RNA聚核苷酸經活體內轉譯以產生抗原性多肽。
RSV RNA疫苗可經誘發用於在細胞、組織或有機體中轉譯多肽(例如，抗原或免疫原)。在例示性實施例中，該轉譯發生在活體內，但可預期存在該轉譯發生在離體、在培養物中或在活體外之實施例。在例示性實施例中，使細胞、組織或有機體與有效量之含有RSV RNA疫苗之組合物接觸，該等疫苗含有具有至少一種編碼抗原性多肽之可轉譯區的聚核苷酸。
「有效量」之RSV RNA疫苗係至少部分基於標靶組織、標靶細胞類型、投藥方式、聚核苷酸之物理特徵(例如，經修飾核苷之大小及程度)及RSV RNA疫苗之其他組分及其他決定因素來提供。一般而言，有效量之RSV RNA疫苗組合物提供隨細胞中之抗原產生而變化之誘發或補強之免疫反應。一般而言，有效量之含有具有至少一個化學修飾之RNA聚核苷酸之RSV RNA疫苗較佳比含有編碼相同抗原或肽抗原之相應未經修飾之聚核苷酸的組合物更有效。抗原產生增加可由細胞轉染增加(經RNA疫苗轉染之細胞之百分比)、自聚核苷酸之蛋白轉譯增加、核酸降解減少(如例如藉由自經修飾之聚核苷酸進行蛋白轉譯之持續時間增加所示)或宿主細胞之抗原特異性免疫反應改變來證明。
術語「醫藥組合物」係指活性藥劑與惰性或活性載劑之組合，從而產生尤其適於活體內或離體診斷性或治療性用途之組合物。「醫藥學上可接受之載劑」在向或對個體投與後不會引起不合需要之生理作用。醫藥組合物中之載劑在其與活性成分相容且可能夠使其穩定化之意義上亦必須為「可接受之」。一或多種增溶劑可用作醫藥學載劑以傳遞活性藥劑。醫藥學上可接受之載劑之實例包括(但不限於)生物相容性媒劑、佐劑、添加劑及稀釋劑以達成可用作劑型之組合物。其他載劑之實例包括膠態二氧化矽、硬脂酸鎂、纖維素及十二烷基硫酸鈉。其他合適之醫藥學載劑及稀釋劑，以及用於其用途之醫藥學輔料係描述於Remington's Pharmaceutical Sciences中。
在一些實施例中，根據本發明，RNA疫苗(包括聚核苷酸及其編碼之多肽)可用於治療或預防RSV。
RSV RNA疫苗可作為主動免疫接種流程之一部分向健康個體或 在感染早期在潛伏期或在症狀發作後之活動性感染期預防性或治療性地投與。在一些實施例中，提供給細胞、組織或個體之本發明之RNA疫苗的量可為對於免疫預防有效之量。
RSV RNA(例如，mRNA)疫苗可與其他預防性或治療性化合物一起投與。作為非限制性實例，預防性或治療性化合物可為佐劑或補強劑。如本文所用，當提及預防性組合物(諸如疫苗)時，術語「補強劑」係指額外投與預防性(疫苗)組合物。補強劑(或補強劑疫苗)可在早期投與預防性組合物後給予。初始投與預防性組合物與補強劑間之投藥時間可為(但不限於)1分鐘、2分鐘、3分鐘、4分鐘、5分鐘、6分鐘、7分鐘、8分鐘、9分鐘、10分鐘、15分鐘、20分鐘、35分鐘、40分鐘、45分鐘、50分鐘、55分鐘、1小時、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、7小時、8小時、9小時、10小時、11小時、12小時、13小時、14小時、15小時、16小時、17小時、18小時、19小時、20小時、21小時、22小時、23小時、1天、36小時、2天、3天、4天、5天、6天、1週、10天、2週、3週、1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月、1年、18個月、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年、11年、12年、13年、14年、15年、16年、17年、18年、19年、20年、25年、30年、35年、40年、45年、50年、55年、60年、65年、70年、75年、80年、85年、90年、95年或99年以上。在例示性實施例中，初始投與預防性組合物與補強劑間之投與時間可為(但不限於)1週、2週、3週、1個月、2個月、3個月、6個月或1年。
在一些實施例中，RSV RNA疫苗可類似於此項技術中已知之滅活疫苗之投與經肌肉內、鼻內或皮內投與。
RSV RNA疫苗視感染之盛行率或未滿足醫學需求之程度或水準而可用於各種情境中。作為非限制性實例，RNA疫苗可用於治療及/ 或預防多種傳染病。在許多情況下，RNA疫苗之優越特性在於其與市售抗病毒劑相比產生大得多之抗體效價且更早地產生反應。
本文提供醫藥組合物，其包括RSV RNA疫苗及RNA疫苗組合物及/或視情況與一或多種醫藥學上可接受之賦形劑組合之複合物。
RSV RNA(例如，mRNA)疫苗可單獨調配或投與或與一或多種其他組分結合調配或投與。舉例而言，RSV RNA疫苗(疫苗組合物)可包含其他組分，包括(但不限於)佐劑。
在一些實施例中，RSV RNA疫苗不包括佐劑(其不含佐劑)。
RSV RNA(例如，mRNA)疫苗可與一或多種醫藥學上可接受之賦形劑組合調配或投與。在一些實施例中，疫苗組合物包含至少一種其他活性物質，例如治療活性物質、預防活性物質或兩者之組合。疫苗組合物可為無菌的、不含熱原質或無菌又不含熱原質。醫藥劑(諸如疫苗組合物)之調配及/或製造中之一般考慮因素可例如見於Remington：The Science and Practice of Pharmacy第21版，Lippincott Williams & Wilkins,2005(其全文以引用的方式併入本文中)。
在一些實施例中，向人類、人類患者或個體投與RSV RNA疫苗。出於本發明之目的，片語「活性成分」通常係指RNA疫苗或其中所含之聚核苷酸，例如編碼抗原性多肽之RNA聚核苷酸(例如，mRNA聚核苷酸)。
本文所述之疫苗組合物之調配物可藉由已知或後來在藥理學技術中研發之任何方法來製備。一般而言，該等製備方法包括以下步驟：使活性成分(例如，mRNA聚核苷酸)與賦形劑及/或一或多種其他輔助成分締合，且隨後，必要及/或需要時，將產物分份、成形及/或包裝成所需之單劑量或多劑量單位。
根據本揭示內容，醫藥組合物中之活性成分、醫藥學上可接受之賦形劑及/或任何其他成分之相對量將視受治療個體之特性、體型 及/或病況且進一步視將投與組合物之途徑而變化。舉例而言，組合物可包含介於0.1%與100%之間，例如介於0.5與50%之間、介於1至30%之間、介於5至80%之間、至少80%(w/w)之活性成分。
RSV RNA疫苗可使用一或多種賦形劑來調配以：(1)增加穩定性；(2)增加細胞轉染；(3)允許持續或延遲釋放(例如，來自儲存調配物)；(4)改變生物分佈(例如，靶向特異性組織或細胞類型)；(5)增加所編碼蛋白之活體內轉譯；及/或(6)改變所編碼蛋白(抗原)之活體內釋放概況。除了諸如任何及所有溶劑、分散液培養基、稀釋劑或其他液體媒劑之傳統賦形劑以外，分散液或懸浮液助劑、表面活性劑、等張劑、增稠劑或乳化劑、防腐劑、賦形劑可包括(不限於)類脂質、脂質體、脂質奈米粒子、聚合物、脂質體複合物(lipoplex)、核殼奈米粒子、肽、蛋白、經RSV RNA疫苗轉染之細胞(例如，用於移植至個體中)、玻尿酸酶、奈米粒子模擬物及其組合。
穩定化元件
已發現天然存在之真核mRNA分子除了諸如5'-端帽結構或3'-poly(A)尾之其他結構特徵以外還含有穩定化元件，其包括(但不限於)位於其5'-末端之非轉譯區(UTR)(5'UTR)及/或位於其3'-末端之非轉譯區(UTR)(3'UTR)。5'UTR與3'UTR兩者通常均由基因組DNA轉錄且為未成熟mRNA之元件。通常在mRNA加工期間向經轉錄(未成熟)之mRNA中增加成熟mRNA之特徵性結構特徵，諸如5'-端帽及3'-poly(A)尾。3'-poly(A)尾通常為添加至經轉錄之mRNA之3'-末端之腺嘌呤核苷酸的延伸段。其可包含多達約400個腺嘌呤核苷酸。在一些實施例中，3'-poly(A)尾之長度可為相對於個別mRNA之穩定性而言之必需元件。
在一些實施例中，RNA疫苗可包括一或多種穩定化元件。穩定化元件可包括例如組蛋白莖環。已識別莖環結合蛋白(SLBP)，一種32 kDa蛋白。其與位於核與細胞質中之組蛋白信使之3'-末端的組蛋白莖環締合。其表現水準由細胞週期來調節；其在S期期間達到峰值，此時組蛋白mRNA含量亦升高。已顯示蛋白為由U7 snRNP對組蛋白前mRNA之3'-末端進行有效加工所必需的。SLBP在加工後繼續與莖環締合，且隨後刺激成熟組蛋白mRNA在細胞質中轉譯為組蛋白。SLBP之RNA結合結構域在後生動物及原生動物中係保守的；其與組蛋白莖環之結合取決於環之結構。最小結合位點相對於莖環而言包括至少三個核苷酸5'及兩個核苷酸3'。
在一些實施例中，RNA疫苗包括編碼區、至少一個組蛋白莖環及視情況存在之poly(A)序列或多腺苷酸化信號。poly(A)序列或多腺苷酸化信號通常應增強所編碼蛋白之表現水準。在一些實施例中，所編碼蛋白並非組蛋白、報告子蛋白(例如，螢光素酶、GFP、EGFP、β-半乳糖苷酶、EGFP)或標記或選擇蛋白(例如，α-球蛋白、半乳糖激酶及黃嘌呤：鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶(GPT))。
在一些實施例中，poly(A)序列或多腺苷酸化信號與至少一個組蛋白莖環之組合儘管實際上均表示替代機制，但仍協同作用以增加蛋白表現超越由任一個別元件所觀察到之水準。已發現，poly(A)與至少一個組蛋白莖環之組合之協同作用並不取決於元件之次序或poly(A)序列之長度。
在一些實施例中，RNA疫苗不包含組蛋白下游元件(HDE)。「組蛋白下游元件」(HDE)包括位於天然存在之莖環的3'之約15至20個核苷酸之富含嘌呤之聚核苷酸延伸段，表示U7 snRNA之結合位點，其在將組蛋白前mRNA加工為成熟組蛋白mRNA中有所涉及。在一些實施例中，核酸不包括內含子。
在一些實施例中，RNA疫苗可含有或可不含增強子及/或啟動子序列，其可經修飾或未經修飾或可為活化或未活化的。在一些實施例 中，組蛋白莖環通常源自組蛋白基因，且包括由間隔基分開、由短序列組成之兩個相鄰的部分或完全反向互補序列之分子內鹼基配對，其形成該結構之環。非配對環區域通常無法與莖環元件之任一者進行鹼基配對。其更常發生在RNA中，因其係多種RNA二級結構之重要組分，但亦可存在於單股DNA中。莖環結構之穩定性通常取決於長度、錯配或凸起之數量及配對區域之鹼基組成。在一些實施例中，可產生不穩定之鹼基配對(非Watson-Crick鹼基配對)。在一些實施例中，至少一個組蛋白莖環序列包含15至45個核苷酸之長度。
在其他實施例中，RNA疫苗可移除一或多個富含AU之序列。此等序列(有時稱為AURES)係在3'UTR中發現之去穩定化序列。AURES可自RNA疫苗移除。或者，AURES可保留在RNA疫苗中。
在一些實施例中，RNA聚核苷酸不包括穩定化元件。
奈米粒子調配物
在一些實施例中，RSV RNA疫苗(例如，mRNA)係在奈米粒子中調配。在一些實施例中，RSV RNA疫苗係在脂質奈米粒子中調配。在一些實施例中，RSV RNA疫苗係在脂質-聚陽離子複合物(稱為陽離子型脂質奈米粒子)中調配。脂質奈米粒子之形成可藉由此項技術中已知之方法及/或如美國公開案第20120178702號中所述之方法來實現，該案以全文引用的方式併入本文中。作為非限制性實例，陽離子型脂質奈米粒子可包括陽離子型肽或多肽，諸如(但不限於)聚離胺酸、聚鳥胺酸及/或聚精胺酸及國際公開案第WO2012013326號或美國專利公開案第US20130142818號中所述之陽離子型肽；其各自以全文引用的方式併入本文中。在一些實施例中，RSV RNA疫苗係在包括非陽離子型脂質，諸如(但不限於)膽固醇或二油醯基磷脂醯基乙醇胺(DOPE)之脂質奈米粒子中調配。
脂質奈米粒子調配物可受(但不限於)陽離子型脂質組分之選擇、 陽離子型脂質之飽和程度、PEG化之性質、所有組分之比率及生物物理學參數(諸如尺寸)的影響。在Semple等人(Nature Biotech.2010 28：172-176；其以全文引用的方式併入本文中)之一個實例中，脂質奈米粒子調配物由57.1%陽離子型脂質、7.1%二棕櫚醯基磷脂醯膽鹼、34.3%膽固醇及1.4% PEG-c-DMA組成。作為另一實例，顯示改變陽離子型脂質之組成更有效地將siRNA傳遞至各種抗原呈現細胞(Basha等人Mol Ther.2011 19：2186-2200；其以全文引用的方式併入本文中)。
在一些實施例中，脂質奈米粒子調配物可包含35至45%陽離子型脂質、40%至50%陽離子型脂質、50%至60%陽離子型脂質及/或55%至65%陽離子型脂質。在一些實施例中，脂質奈米粒子中之脂質與RNA(例如，mRNA)之比率可為5：1至20：1、10：1至25：1、15：1至30：1及/或至少30：1。
在一些實施例中，脂質奈米粒子調配物中PEG之比率可增加或減少，及/或PEG脂質之碳鏈長度可自C14修飾為C18以改變脂質奈米粒子調配物之藥物動力學及/或生物分佈。作為非限制性實例，與陽離子型脂質、DSPC及膽固醇相比，脂質奈米粒子調配物可含有0.5%至3.0%、1.0%至3.5%、1.5%至4.0%、2.0%至4.5%、2.5%至5.0%及/或3.0%至6.0%之脂質莫耳比之PEG-c-DOMG(R-3-[(ω-甲氧基-聚(乙二醇)2000)胺甲醯基)]-1,2-二肉豆蔻氧基丙基-3-胺)(本文中亦稱為PEG-DOMG)。在一些實施例中，PEG-c-DOMG可由PEG脂質替代，諸如(但不限於)PEG-DSG(1,2-二硬脂醯基-sn-甘油、甲氧基聚乙二醇)、PEG-DMG(1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油)及/或PEG-DPG(1,2-二棕櫚醯基-sn-甘油、甲氧基聚乙二醇)。陽離子型脂質可選自此項技術中已知之任何脂質，諸如(但不限於)DLin-MC3-DMA、DLin-DMA、C12-200及DLin-KC2-DMA(參見例如美國公開案第20130245107 A1號)。
在一些實施例中，RSV RNA(例如，mRNA)疫苗調配物為包含至少一種脂質之奈米粒子。脂質可選自(但不限於)DLin-DMA、DLin-K-DMA、98N12-5、C12-200、DLin-MC3-DMA、DLin-KC2-DMA、DODMA、PLGA、PEG、PEG-DMG、PEG化脂質及胺基醇脂質。在一些實施例中，脂質可為陽離子型脂質，諸如(但不限於)DLin-DMA、DLin-D-DMA、DLin-MC3-DMA、DLin-KC2-DMA、DODMA及胺基醇脂質。胺基醇陽離子型脂質可為美國公開案第US20130150625號中所述及/或由其中所述之方法製得之脂質，該案以全文引用的方式併入本文中。作為非限制性實例，陽離子型脂質可為2-胺基-3-[(9Z,12Z)-十八-9,12-二烯-1-基氧基]-2-{[(9Z,2Z)-十八-9,12-二烯-1-基氧基]甲基}丙-1-醇(US20130150625中之化合物1)；2-胺基-3-[(9Z)-十八-9-烯-1-基氧基]-2-{[(9Z)-十八-9-烯-1-基氧基]甲基}丙-1-醇(US20130150625中之化合物2)；2-胺基-3-[(9Z,12Z)-十八-9,12-二烯-1-基氧基]-2-[(辛基氧基)甲基]丙-1-醇(US20130150625中之化合物3)；及2-(二甲胺基)-3-[(9Z,12Z)-十八-9,12-二烯-1-基氧基]-2-{[(9Z,12Z)-十八-9,12-二烯-1-基氧基]甲基}丙-1-醇(US20130150625中之化合物4)；或其任何醫藥學上可接受之鹽或立體異構體。
脂質奈米粒子調配物通常包含脂質，尤其為可電離之陽離子型脂質，例如2,2-二亞油基-4-二甲胺基乙基-[1,3]-二氧戊環(DLin-KC2-DMA)、二亞油基-甲基-4-二甲胺基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)、9-((4-(二甲胺基)丁醯基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L319)、(12Z,15Z)-N,N-二甲基-2-壬基二十一烷-12,15-二烯-1-胺(L608)或N,N-二甲基-1-[(1S,2R)-2-辛基環丙基]十七烷-8-胺(L530)，且進一步包含中性脂質、固醇及能夠減少粒子聚集之分子，例如PEG或經PEG改質之脂質。
在一些實施例中，脂質奈米粒子調配物基本上由以下組成：(i) 至少一種選自以下各物組成之群之脂質：2,2-二亞油基-4-二甲胺基乙基-[1,3]-二氧戊環(DLin-KC2-DMA)、二亞油基-甲基-4-二甲胺基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)、9-((4-(二甲胺基)丁醯基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L319)、(12Z,15Z)-N,N-二甲基-2-壬基二十一烷-12,15-二烯-1-胺(L608)及N,N-二甲基-1-[(1S,2R)-2-辛基環丙基]十七烷-8-胺(L530)；(ii)選自DSPC、DPPC、POPC、DOPE及SM之中性脂質；(iii)固醇，例如膽固醇；及(iv)PEG-脂質，例如PEG-DMG或PEG-cDMA，其莫耳比為20至60%陽離子型脂質：5至25%中性脂質：25至55%固醇；0.5至15% PEG-脂質。
在一些實施例中，脂質奈米粒子調配物包括以莫耳濃度計25%至75%選自由2,2-二亞油基-4-二甲胺基乙基-[1,3]-二氧戊環(DLin-KC2-DMA)、二亞油基-甲基-4-二甲胺基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)、9-((4-(二甲胺基)丁醯基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L319)、(12Z,15Z)-N,N-二甲基-2-壬基二十一烷-12,15-二烯-1-胺(L608)及N,N-二甲基-1-[(1S,2R)-2-辛基環丙基]十七烷-8-胺(L530)組成之陽離子型脂質，例如以莫耳濃度計35至65%、45至65%、60%、57.5%、50%或40%。
在一些實施例中，脂質奈米粒子調配物包括以莫耳濃度計0.5%至15%中性脂質，例如以莫耳濃度計3至12%、5至10%或15%、10%或7.5%。中性脂質之實例包括(不限於)DSPC、POPC、DPPC、DOPE及SM。在一些實施例中，調配物包括以莫耳濃度計5%至50%固醇(例如，以莫耳濃度計15至45%、20至40%、40%、38.5%、35%或31%)。固醇之非限制性實例為膽固醇。在一些實施例中，脂質奈米粒子調配物包括以莫耳濃度計0.5%至20% PEG或經PEG改質之脂質(例如，以莫耳濃度計0.5至10%、0.5至5%、1.5%、0.5%、1.5%、3.5%或5%)。在一些實施例中，PEG或經PEG改質之脂質包含平均分子量為2,000 Da之PEG分子。在一些實施例中，PEG或經PEG改質之脂質包含平均分子量小於2,000，例如約1,500Da、約1,000Da或約500Da之PEG分子。經PEG改質之脂質之非限制性實例包括PEG-二硬脂醯基甘油(PEG-DMG)(本文中亦稱為PEG-C14或C14-PEG)、PEG-cDMA(在Reyes等人J.Controlled Release,107,276-287(2005)中進一步論述，其內容以全文引用的方式併入本文中)。
在一些實施例中，脂質奈米粒子調配物包括以莫耳濃度計25至75%選自由2,2-二亞油基-4-二甲胺基乙基-[1,3]-二氧戊環(DLin-KC2-DMA)、二亞油基-甲基-4-二甲胺基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)、9-((4-(二甲胺基)丁醯基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L319)、(12Z,15Z)-N,N-二甲基-2-壬基二十一烷-12,15-二烯-1-胺(L608)及N,N-二甲基-1-[(1S,2R)-2-辛基環丙基]十七烷-8-胺(L530)組成之陽離子型脂質、0.5至15%中性脂質、5至50%固醇及0.5至20% PEG或經PEG改質之脂質。
在一些實施例中，脂質奈米粒子調配物包括以莫耳濃度計35至65%選自由2,2-二亞油基-4-二甲胺基乙基-[1,3]-二氧戊環(DLin-KC2-DMA)、二亞油基-甲基-4-二甲胺基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)、9-((4-(二甲胺基)丁醯基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L319)、(12Z,15Z)-N,N-二甲基-2-壬基二十一烷-12,15-二烯-1-胺(L608)及N,N-二甲基-1-[(1S,2R)-2-辛基環丙基]十七烷-8-胺(L530)組成之陽離子型脂質、3至12%中性脂質、15至45%固醇及0.5至10% PEG或經PEG改質之脂質。
在一些實施例中，脂質奈米粒子調配物包括以莫耳濃度計45至65%選自由2,2-二亞油基-4-二甲胺基乙基-[1,3]-二氧戊環(DLin-KC2-DMA)、二亞油基-甲基-4-二甲胺基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)、9-((4-(二甲胺基)丁醯基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L319)、 (12Z,15Z)-N,N-二甲基-2-壬基二十一烷-12,15-二烯-1-胺(L608)及N,N-二甲基-1-[(1S,2R)-2-辛基環丙基]十七烷-8-胺(L530)組成之陽離子型脂質、5至10%中性脂質、25至40%固醇及0.5至10% PEG或經PEG改質之脂質。
在一些實施例中，脂質奈米粒子調配物包括以莫耳濃度計60%選自由2,2-二亞油基-4-二甲胺基乙基-[1,3]-二氧戊環(DLin-KC2-DMA)、二亞油基-甲基-4-二甲胺基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)、9-((4-(二甲胺基)丁醯基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L319)、(12Z,15Z)-N,N-二甲基-2-壬基二十一烷-12,15-二烯-1-胺(L608)及N,N-二甲基-1-[(1S,2R)-2-辛基環丙基]十七烷-8-胺(L530)組成之陽離子型脂質、7.5%中性脂質、31%固醇及1.5% PEG或經PEG改質之脂質。
在一些實施例中，脂質奈米粒子調配物包括以莫耳濃度計50%選自由2,2-二亞油基-4-二甲胺基乙基-[1,3]-二氧戊環(DLin-KC2-DMA)、二亞油基-甲基-4-二甲胺基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)、9-((4-(二甲胺基)丁醯基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L319)、(12Z,15Z)-N,N-二甲基-2-壬基二十一烷-12,15-二烯-1-胺(L608)及N,N-二甲基-1-[(1S,2R)-2-辛基環丙基]十七烷-8-胺(L530)組成之陽離子型脂質、10%中性脂質、38.5%固醇及1.5% PEG或經PEG改質之脂質。
在一些實施例中，脂質奈米粒子調配物包括以莫耳濃度計50%選自由2,2-二亞油基-4-二甲胺基乙基-[1,3]-二氧戊環(DLin-KC2-DMA)、二亞油基-甲基-4-二甲胺基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)、9-((4-(二甲胺基)丁醯基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L319)、(12Z,15Z)-N,N-二甲基-2-壬基二十一烷-12,15-二烯-1-胺(L608)及N,N-二甲基-1-[(1S,2R)-2-辛基環丙基]十七烷-8-胺(L530)組成之陽離子型脂質、10%中性脂質、35%固醇、4.5%或5% PEG或經PEG改質之脂質及0.5%標靶脂質。
在一些實施例中，脂質奈米粒子調配物包括以莫耳濃度計40%選自由2,2-二亞油基-4-二甲胺基乙基-[1,3]-二氧戊環(DLin-KC2-DMA)、二亞油基-甲基-4-二甲胺基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)、9-((4-(二甲胺基)丁醯基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L319)、(12Z,15Z)-N,N-二甲基-2-壬基二十一烷-12,15-二烯-1-胺(L608)及N,N-二甲基-1-[(1S,2R)-2-辛基環丙基]十七烷-8-胺(L530)組成之陽離子型脂質、15%中性脂質、40%固醇及5% PEG或經PEG改質之脂質。
在一些實施例中，脂質奈米粒子調配物包括以莫耳濃度計57.2%選自由2,2-二亞油基-4-二甲胺基乙基-[1,3]-二氧戊環(DLin-KC2-DMA)、二亞油基-甲基-4-二甲胺基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)、9-((4-(二甲胺基)丁醯基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L319)、(12Z,15Z)-N,N-二甲基-2-壬基二十一烷-12,15-二烯-1-胺(L608)及N,N-二甲基-1-[(1S,2R)-2-辛基環丙基]十七烷-8-胺(L530)組成之陽離子型脂質、7.1%中性脂質、34.3%固醇及1.4% PEG或經PEG改質之脂質基。
在一些實施例中，脂質奈米粒子調配物包括以莫耳濃度計57.5%陽離子型脂質(選自PEG脂質，其為PEG-cDMA，PEG-cDMA在Reyes等人(J.Controlled Release,107,276-287(2005)中進一步論述，其內容以全文引用的方式併入本文中))、7.5%中性脂質、31.5%固醇及3.5% PEG或經PEG改質之脂質。
在一些實施例中，脂質奈米粒子調配物基本上由莫耳比為20至70%陽離子型脂質：5至45%中性脂質：20至55%膽固醇：0.5至15%經PEG改質之脂質之脂質混合物組成。在一些實施例中，脂質奈米粒子調配物基本上由莫耳比為20至60%陽離子型脂質：5至25%中性脂質：25至55%膽固醇：0.5至15%經PEG改質之脂質之脂質混合物組成。
在一些實施例中，脂質之莫耳比為50/10/38.5/1.5(mol%陽離子型 脂質/中性脂質，例如DSPC/Chol/經PEG改質之脂質，例如PEG-DMG、PEG-DSG或PEG-DPG)、57.2/7.1134.3/1.4(mol%陽離子型脂質/中性脂質，例如DPPC/Chol/經PEG改質之脂質，例如PEG-cDMA)、40/15/40/5(mol%陽離子型脂質/中性脂質，例如DSPC/Chol/經PEG改質之脂質，例如PEG-DMG)、50/10/35/4.5/0.5(mol%陽離子型脂質/中性脂質，例如DSPC/Chol/經PEG改質之脂質，例如PEG-DSG)、50/10/35/5(陽離子型脂質/中性脂質，例如DSPC/Chol/經PEG改質之脂質，例如PEG-DMG)、40/10/40/10(mol%陽離子型脂質/中性脂質，例如DSPC/Chol/經PEG改質之脂質，例如PEG-DMG或PEG-cDMA)、35/15/40/10(mol%陽離子型脂質/中性脂質，例如DSPC/Chol/經PEG改質之脂質，例如PEG-DMG或PEG-cDMA)或52/13/30/5(mol%陽離子型脂質/中性脂質，例如DSPC/Chol/經PEG改質之脂質，例如PEG-DMG或PEG-cDMA)。
脂質奈米粒子組合物及其製備方法之非限制性實例例如在Semple等人(2010)Nat.Biotechnol.28：172-176；Jayarama等人(2012),Angew.Chem.Int.編，51：8529-8533；及Maier等人(2013)Molecular Therapy 21,1570-1578(其各自之內容以全文引用的方式併入本文中)中描述。
在一些實施例中，脂質奈米粒子調配物可包含陽離子型脂質、PEG脂質及結構脂質且視情況包含非陽離子型脂質。作為非限制性實例，脂質奈米粒子可包含40至60%陽離子型脂質、5至15%非陽離子型脂質、1至2% PEG脂質及30至50%結構脂質。作為另一非限制性實例，脂質奈米粒子可包含50%陽離子型脂質、10%非陽離子型脂質、1.5% PEG脂質及38.5%結構脂質。作為又一非限制性實例，脂質奈米粒子可包含55%陽離子型脂質、10%非陽離子型脂質、2.5% PEG脂質及32.5%結構脂質。在一些實施例中，陽離子型脂質可為本文所述之 任何陽離子型脂質，諸如(但不限於)DLin-KC2-DMA、DLin-MC3-DMA、L319、L608及L520。
在一些實施例中，本文所述之脂質奈米粒子調配物可為4組分脂質奈米粒子。脂質奈米粒子可包含陽離子型脂質、非陽離子型脂質、PEG脂質及結構脂質。作為非限制性實例，脂質奈米粒子可包含40至60%陽離子型脂質、5至15%非陽離子型脂質、1至2% PEG脂質及30至50%結構脂質。作為另一非限制性實例，脂質奈米粒子可包含50%陽離子型脂質、10%非陽離子型脂質、1.5% PEG脂質及38.5%結構脂質。作為又一非限制性實例，脂質奈米粒子可包含55%陽離子型脂質、10%非陽離子型脂質、2.5% PEG脂質及32.5%結構脂質。在一些實施例中，陽離子型脂質可為本文所述之任何陽離子型脂質，諸如(但不限於)DLin-KC2-DMA、DLin-MC3-DMA、L319、L608及L520。
在一些實施例中，本文所述之脂質奈米粒子調配物可包含陽離子型脂質、非陽離子型脂質、PEG脂質及結構脂質。作為非限制性實例，脂質奈米粒子包含50%陽離子型脂質DLin-KC2-DMA、10%非陽離子型脂質DSPC、1.5% PEG脂質PEG-DOMG及38.5%結構脂質膽固醇。作為非限制性實例，脂質奈米粒子包含50%陽離子型脂質DLin-MC3-DMA、10%非陽離子型脂質DSPC、1.5% PEG脂質PEG-DOMG及38.5%結構脂質膽固醇。作為非限制性實例，脂質奈米粒子包含50%陽離子型脂質DLin-MC3-DMA、10%非陽離子型脂質DSPC、1.5% PEG脂質PEG-DMG及38.5%結構脂質膽固醇。作為又一非限制性實例，脂質奈米粒子包含55%陽離子型脂質L319、L608及L520、10%非陽離子型脂質DSPC、2.5% PEG脂質PEG-DMG及32.5%結構脂質膽固醇。
疫苗組合物中之活性成分、醫藥學上可接受之賦形劑及/或任何 其他成分之相對量可視受治療個體之特性、體型及/或病況且進一步視將投與組合物之途徑而變化。舉例而言，組合物可包含介於0.1%與99%(w/w)之間的活性成分。舉例而言，組合物可包含介於0.1%與100%之間，例如介於0.5與50%之間、介於1與30%之間、介於5與80%之間、至少80%(w/w)之活性成分。
在一些實施例中，RNA疫苗組合物可包含調配在包含PEG2000-DMG、膽固醇、DSPC及PEG2000-DMG之脂質奈米粒子中之本文所述之聚核苷酸、緩衝液檸檬酸三鈉、蔗糖及注射用水。作為非限制性實例，組合物包含：2.0mg/mL藥物物質(例如，編碼RSV之聚核苷酸)、21.8mg/mL MC3、10.1mg/mL膽固醇、5.4mg/mL DSPC、2.7mg/mL PEG2000-DMG、5.16mg/mL檸檬酸三鈉、71mg/mL蔗糖及1.0mL注射用水。
在一些實施例中，奈米粒子(例如，脂質奈米粒子)具有10至500nm、20至400nm、30至300nm、40至200nm之平均直徑。在一些實施例中，奈米粒子(例如，脂質奈米粒子)具有50至150nm、50至200nm、80至100nm或80至200nm之平均直徑。
脂質體、脂質體複合物及脂質奈米粒子
在一些實施例中，RNA疫苗醫藥組合物可在諸如(但不限於)DiLa2脂質體(Marina Biotech,Bothell,WA)之脂質體、SMARTICLES®(Marina Biotech,Bothell,WA)、基於中性DOPC(1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼)之脂質體(例如，用於卵巢癌之siRNA傳遞(Landen等人Cancer Biology & Therapy 2006 5(12)1708-1713)；其以全文引用的方式併入本文中)及塗有玻尿酸之脂質體(Quiet Therapeutics,Israel)中調配。
在一些實施例中，RNA疫苗可在如美國公開案第US2012060293號中所述之凍乾之凝膠相脂質體組合物中調配，該案以全文引用的方 式併入本文中。
奈米粒子調配物可包含磷酸酯結合物。磷酸酯結合物可增加活體內循環時間及/或增加奈米粒子之靶向傳遞。用於本發明之磷酸酯結合物可藉由國際公開案第WO2013033438號或美國公開案第US20130196948號中所述之方法製得，其各自之內容以全文引用的方式併入本文中。作為非限制性實例，磷酸酯結合物可包括國際公開案第WO2013033438號中所述之任何一種式之化合物，該案以全文引用的方式併入本文中。
奈米粒子調配物可包含聚合物結合物。聚合物結合物可為水溶性結合物。聚合物結合物可具有如美國公開案第20130059360號中所述之結構，該案之內容以全文引用的方式併入本文中。在一些態樣中，具有本發明之聚核苷酸之聚合物結合物可使用美國公開案第20130072709號中所述之方法及/或分段聚合試劑來製得，該案以全文引用的方式併入本文中。在其他態樣中，聚合物結合物可具有包含環部分之懸垂側基，諸如(但不限於)美國公開案第US20130196948號中所述之聚合物結合物，該案之內容以全文引用的方式併入本文中。
奈米粒子調配物可包含增強本發明之奈米粒子在個體中之傳遞之結合物。此外，結合物可抑制奈米粒子在個體中之吞噬細胞清除。在一些態樣中，結合物可為自人類膜蛋白CD47設計之「自體」肽(例如，由Rodriguez等人(Science 2013,339,971-975)所述之「自體」粒子，其以全文引用的方式併入本文中)。如由Rodriguez等人所示，自體肽延遲奈米粒子之巨噬細胞介導之清除，從而增強奈米粒子之傳遞。在其他態樣中，結合物可為膜蛋白CD47(例如，參見Rodriguez等人Science 2013,339,971-975，其以全文引用的方式併入本文中)。Rodriguez等人展示，類似於「自體」肽，與亂序肽及塗有PEG之奈米粒子相比，CD47可增加個體中之循環粒子比率。
在一些實施例中，本發明之RNA疫苗係在包含增強本發明之奈米粒子在個體中之傳遞之結合物的奈米粒子中調配。結合物可為CD47膜或結合物可衍生自CD47膜蛋白，諸如先前所述之「自體」肽。在其他實施例中，奈米粒子可包含PEG及CD47或其衍生物之結合物。在其他實施例中，奈米粒子可包含上文所述之「自體」肽與膜蛋白CD47兩者。
在一些實施例中，「自體」肽及/或CD47蛋白可結合成類病毒粒子或假病毒體，如本文所述用於傳遞本發明之RNA疫苗。
在其他實施例中，RNA疫苗醫藥組合物包含本發明之聚核苷酸及可具有可降解之鍵聯之結合物。結合物之非限制性實例包括包含可電離之氫原子之芳族部分、間隔基部分及水溶性聚合物。作為非限制性實例，包含具有可降解之鍵聯之結合物的醫藥組合物及用於傳遞該等醫藥組合物之方法係在美國公開案第US20130184443號中描述，該案之內容以全文引用的方式併入本文中。
奈米粒子調配物可為包含碳水化合物載體及RNA疫苗之碳水化合物奈米粒子。作為非限制性實例，碳水化合物載體可包括(但不限於)經酸酐修飾之植物肝醣或肝醣型物質、辛烯基琥珀酸植物肝醣、植物肝醣β-糊精、經酸酐修飾之植物肝醣β-糊精。(參見例如，國際公開案第WO2012109121號，其內容以全文引用的方式併入本文中)。
本發明之奈米粒子調配物可塗有界面活性劑或聚合物以改善粒子之傳遞。在一些實施例中，奈米粒子可塗有親水性塗層，諸如(但不限於)PEG塗層及/或具有中性表面電荷之塗層。親水性塗層可有助於在中樞神經系統中傳遞具有較大淨荷之奈米粒子，諸如(但不限於)RNA疫苗。作為非限制性實例，包含親水性塗層之奈米粒子及製備該等奈米粒子之方法係在美國公開案第US20130183244號中描述，該案之內容以全文引用的方式併入本文中。
在一些實施例中，本發明之脂質奈米粒子可為親水性聚合物粒子。親水性聚合物粒子及製備親水性聚合物粒子之方法之非限制性實例係在美國公開案第US20130210991號中描述，該案之內容以全文引用的方式併入本文中。
在其他實施例中，本發明之脂質奈米粒子可為疏水性聚合物粒子。
脂質奈米粒子調配物可藉由用稱為快速消除之脂質奈米粒子(reLNP)的生物可降解之陽離子型脂質替代陽離子型脂質來改善。已顯示可電離之陽離子型脂質，諸如(但不限於)DLinDMA、DLin-KC2-DMA及DLin-MC3-DMA，隨時間累積在血漿及組織且可為潛在毒性來源。快速消除之脂質之快速代謝可使脂質奈米粒子之耐受性及治療指數在大鼠中自1mg/kg劑量至10mg/kg劑量改善一個數量級。包含酶促降解之酯鍵聯可改善陽離子型組分之降解及代謝概況，而仍然維持reLNP調配物之活性。酯鍵聯可位於脂質鏈內部或其可位於脂質鏈之末端。內部酯鍵聯可置換脂質鏈中之任何碳。
在一些實施例中，內部酯鍵聯可位於飽和碳之任一側。
在一些實施例中，免疫反應可藉由傳遞可包括奈米物質、聚合物及免疫原之脂質奈米粒子來引發。(美國公開案第20120189700號及國際公開案第WO2012099805號，其各自以全文引用的方式併入本文中)。
聚合物可囊封奈米物質或部分囊封奈米物質。免疫原可為重組蛋白、經修飾之RNA及/或本文所述之聚核苷酸。在一些實施例中，脂質奈米粒子可經調配用於疫苗中，諸如(但不限於)針對病原體之疫苗。
脂質奈米粒子可經工程化以改變粒子之表面特性，故脂質奈米粒子可穿透黏膜屏障。黏液位於黏膜組織上，諸如(但不限於)口腔(例 如，頰及食道膜及扁桃體組織)、眼部、胃腸(例如，胃部、小腸、大腸、結腸、直腸)、鼻部、呼吸道(例如，鼻部、咽部、氣管及枝氣管膜)、生殖器(例如，陰道、宮頸及尿道膜)。一直認為對於較高藥物囊封效率及提供大量藥物之持續傳遞之能力較佳的大於10至200nm之奈米粒子過大以至於無法快速擴散通過黏膜屏障。黏液連續分泌，流出，丟棄或消化及再循環，故大部分所捕獲之粒子可在數秒內或在數小時內自黏膜組織移除。已密集地塗有低分子量聚乙二醇(PEG)之大的聚合奈米粒子(直徑為200nm至500nm)擴散通過黏液比相同粒子在水中之擴散低僅4至6倍(Lai等人PNAS 2007 104(5)：1482-487；Lai等人Adv Drug Deliv Rev.2009 61(2)：158-171；其各自以全文引用的方式併入本文中)。奈米粒子之運輸可使用穿透率及/或螢光顯微鏡檢查技術來測定，包括(但不限於)光漂泊螢光恢復術(FRAP)及高解析度多粒子跟蹤(MPT)。作為非限制性實例，可穿透黏膜屏障之組合物可如美國專利第8,241,670號或國際公開案第WO2013110028號中所述來製得，其各自之內容以全文引用的方式併入本文中。
經工程化以穿透黏液之脂質奈米粒子可包含聚合物質(例如，聚合核心)及/或聚合物-維生素結合物及/或三嵌段共聚物。聚合物質可包括(但不限於)聚胺、聚醚、聚醯胺、聚酯、聚胺基甲酸酯、聚脲、聚碳酸酯、聚(苯乙烯)、聚醯亞胺、聚碸、聚胺基甲酸酯、聚乙炔、聚乙烯、聚乙烯亞胺、聚異氰酸酯、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯腈及聚芳酯。聚合物質可為生物可降解及/或生物相容性的。生物相容性聚合物之非限制性實例係在國際公開案第WO2013116804號中描述，該案之內容以全文引用的方式併入本文中。聚合物質可另外經照射。作為非限制性實例，聚合物質可經γ照射(參見例如，國際公開案第WO201282165號，其以全文引用的方式併入本文中)。特異性聚合物之非限制性實例包括聚(己內酯)(PCL)、乙烯乙酸乙烯酯聚 合物(EVA)、聚(乳酸)(PLA)、聚(L-乳酸)(PLLA)、聚(乙醇酸)(PGA)、聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、聚(L-乳酸-共-乙醇酸)(PLLGA)、聚(D,L-丙交酯)(PDLA)、聚(L-丙交酯)(PLLA)、聚(D,L-丙交酯-共-己內酯)、聚(D,L-丙交酯-共-己內酯-共-乙交酯)、聚(D,L-丙交酯-共-PEO-共-D,L-丙交酯)、聚(D,L-丙交酯-共-PPO-共-D,L-丙交酯)、聚氰基丙烯酸烷基酯、聚胺基甲酸酯、聚-L-離胺酸(PLL)、甲基丙烯酸羥丙酯(HPMA)、聚乙烯二醇、聚-L-麩胺酸、聚(羥酸)、聚酸酐、聚原酸酯、聚(酯醯胺)、聚醯胺、聚(酯醚)、聚碳酸酯、聚伸烷基(諸如聚乙烯及聚丙烯)、聚烷二醇(諸如聚(乙二醇)(PEG))、聚氧化烯(PEO)、聚對苯二甲酸伸烷酯(諸如聚(對本二甲酸乙酯))、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯醚、聚乙烯酯(諸如聚(乙酸乙烯酯))、聚鹵化乙烯(諸如聚(氯乙烯)(PVC))、聚乙烯吡咯啶酮、聚矽氧烷、聚苯乙烯(PS)、聚胺基甲酸酯、衍生化纖維素(諸如烷基纖維素)、羥基烷基纖維素、纖維素醚、纖維素酯、硝基纖維素、羥丙基纖維素、羧甲基纖維素、丙烯酸聚合物(諸如聚((甲基)丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚((甲基)丙烯酸乙酯)、聚((甲基)丙烯酸丁酯)、聚((甲基)丙烯酸異丁酯)、聚((甲基)丙烯酸己酯)、聚((甲基)丙烯酸異癸酯)、聚((甲基)丙烯酸月桂酯)、聚((甲基)丙烯酸苯酯)、聚(丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸異丙酯)、聚(丙烯酸異丁酯)、聚(丙烯酸十八烷酯)及其共聚物及混合物)、聚二氧環己酮及其共聚物、聚羥基烷酸酯、聚富馬酸丙二醇酯、聚甲醛、泊洛沙姆(poloxamer)、聚(原酸)酯、聚(丁酸)、聚(戊酸)、聚(丙交酯-共-己內酯)、PEG-PLGA-PEG及三亞甲基碳酸酯、聚乙烯吡咯啶酮。脂質奈米粒子可塗有共聚物或與共聚物締合，諸如(但不限於)嵌段共聚物(諸如國際公開案第WO2013012476號中所述之分支聚醚-聚醯胺嵌段共聚物，該案以全文引用的方式併入本文中)，及(聚(乙二醇))-(聚(氧化丙烯))-(聚(乙二醇))三嵌段共聚物(參見例如，美國公開案 20120121718及美國公開案20100003337以及美國專利第8,263,665號，其各自以全文引用的方式併入本文中)。共聚物可為通常視為安全(GRAS)之聚合物且脂質奈米粒子之形成可為未產生新化學實體之如此方式。舉例而言，脂質奈米粒子可包含塗有泊洛沙姆之PLGA奈米粒子而不形成仍然能夠快速穿透人類黏液之新化學實體(Yang等人Angew.Chem.Int.Ed.2011 50：2597-2600，其內容以全文引用的方式併入本文中)。產生可穿透人類黏液之奈米粒子之非限制性可擴展方法係由Xu等人(參見例如，J Control Release 2013,170(2)：279-86，其內容以全文引用的方式併入本文中)描述。
聚合物-維生素結合物之維生素可為維生素E。結合物之維生素部分可經其他合適之組分取代，諸如(但不限於)維生素A、維生素E、其他維生素、膽固醇、疏水性部分或其他界面活性劑之疏水性組分(例如，固醇鏈、脂肪酸、烴鏈及氧化烯鏈)。
在一些實施例中，RNA(例如，mRNA)疫苗醫藥組合物可在諸如(但不限於)DiLa2脂質體(Marina Biotech,Bothell,WA)之脂質體、SMARTICLES®(Marina Biotech,Bothell,WA)、基於中性DOPC(1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼)之脂質體(例如，用於卵巢癌之siRNA傳遞(Landen等人Cancer Biology & Therapy 20065(12)1708-1713，其以全文引用的方式併入本文中))及塗有玻尿酸之脂質體(Quiet Therapeutics,Israel)中調配。
在一些實施例中，RNA疫苗可在如美國公開案第US2012060293號中所述之凍乾之凝膠相脂質體組合物中調配，該案以全文引用的方式併入本文中。
奈米粒子調配物可包含磷酸酯結合物。磷酸酯結合物可增加活體內循環時間及/或增加奈米粒子之靶向傳遞。用於本發明之磷酸酯結合物可藉由國際公開案第WO2013033438號或美國公開案第 20130196948號中所述之方法製得，其各自之內容以全文引用的方式併入本文中。作為非限制性實例，磷酸酯結合物可包括國際公開案第WO2013033438號中所述之任何一種式之化合物，該案以全文引用的方式併入本文中。
奈米粒子調配物可包含聚合物結合物。聚合物結合物可為水溶性結合物。聚合物結合物可具有如美國申請案第20130059360號中所述之結構，該案之內容以全文引用的方式併入本文中。在一些態樣中，具有本發明之聚核苷酸之聚合物結合物可使用美國專利申請案第20130072709號中所述之方法及/或分段聚合試劑來製得，該案以全文引用的方式併入本文中。在其他態樣中，聚合物結合物可具有包含環部分之懸垂側基，諸如(但不限於)美國公開案第US20130196948號中所述之聚合物結合物，該案之內容以全文引用的方式併入本文中。
奈米粒子調配物可包含增強本發明之奈米粒子在個體中之傳遞之結合物。此外，結合物可抑制奈米粒子在個體中之吞噬細胞清除。在一些態樣中，結合物可為自人類膜蛋白CD47設計之「自體」肽(例如，由Rodriguez等人(Science 2013,339,971-975)所述之「自體」粒子，其以全文引用的方式併入本文中)。如由Rodriguez等人所示，自體肽延遲奈米粒子之巨噬細胞介導之清除，從而增強奈米粒子之傳遞。在其他態樣中，結合物可為膜蛋白CD47(例如，參見Rodriguez等人Science 2013,339,971-975，其以全文引用的方式併入本文中)。Rodriguez等人展示，類似於「自體」肽，與亂序肽及塗有PEG之奈米粒子相比，CD47可增加個體中之循環粒子比率。
在一些實施例中，本發明之RNA疫苗係在包含增強本發明之奈米粒子在個體中之傳遞之結合物的奈米粒子中調配。結合物可為CD47膜或結合物可衍生自CD47膜蛋白，諸如先前所述之「自體」肽。在其他態樣中，奈米粒子可包含PEG及CD47或其衍生物之結合 物。在其他態樣中，奈米粒子可包含上文所述之「自體」肽與膜蛋白CD47兩者。
在其他態樣中，「自體」肽及/或CD47蛋白可結合成類病毒粒子或假病毒體，如本文所述用於傳遞本發明之RNA疫苗。
在其他實施例中，RNA疫苗醫藥組合物包含本發明之聚核苷酸及可具有可降解之鍵聯之結合物。結合物之非限制性實例包括包含可電離之氫原子之芳族部分、間隔基部分及水溶性聚合物。作為非限制性實例，包含具有可降解之鍵聯之結合物的醫藥組合物及用於傳遞該等醫藥組合物之方法係在美國公開案第US20130184443號中描述，該案之內容以全文引用的方式併入本文中。
奈米粒子調配物可為包含碳水化合物載體及RNA(例如，mRNA)疫苗之碳水化合物奈米粒子。作為非限制性實例，碳水化合物載體可包括(但不限於)經酸酐修飾之植物肝醣或肝醣型物質、辛烯基琥珀酸植物肝醣、植物肝醣β-糊精、經酸酐修飾之植物肝醣β-糊精。(參見例如，國際公開案第WO2012109121號；其內容以全文引用的方式併入本文中)。
本發明之奈米粒子調配物可塗有界面活性劑或聚合物以改善粒子之傳遞。在一些實施例中，奈米粒子可塗有親水性塗層，諸如(但不限於)PEG塗層及/或具有中性表面電荷之塗層。親水性塗層可有助於在中樞神經系統中傳遞具有較大淨荷之奈米粒子，諸如(但不限於)RNA疫苗。作為非限制性實例，包含親水性塗層之奈米粒子及製備該等奈米粒子之方法係在美國公開案第US20130183244號中描述，該案之內容以全文引用的方式併入本文中。
在一些實施例中，本發明之脂質奈米粒子可為親水性聚合物粒子。親水性聚合物粒子及製備親水性聚合物粒子之方法之非限制性實例係在美國公開案第US20130210991號中描述，該案之內容以全文引 用的方式併入本文中。
在其他實施例中，本發明之脂質奈米粒子可為疏水性聚合物粒子。
脂質奈米粒子調配物可藉由用稱為快速消除之脂質奈米粒子(reLNP)的生物可降解之陽離子型脂質替代陽離子型脂質來改善。已顯示可電離之陽離子型脂質，諸如(但不限於)DLinDMA、DLin-KC2-DMA及DLin-MC3-DMA，隨時間累積在血漿及組織且可為潛在毒性來源。快速消除之脂質之快速代謝可使脂質奈米粒子之耐受性及治療指數在大鼠中自1mg/kg劑量至10mg/kg劑量改善一個數量級。包含酶促降解之酯鍵聯可改善陽離子型組分之降解及代謝概況，而仍然維持reLNP調配物之活性。酯鍵聯可位於脂質鏈內部或其可位於脂質鏈之末端。內部酯鍵聯可置換脂質鏈中之任何碳。
在一些實施例中，內部酯鍵聯可位於飽和碳之任一側。
在一些實施例中，免疫反應可藉由傳遞可包括奈米物質、聚合物及免疫原之脂質奈米粒子來引發。(美國公開案第20120189700號及國際公開案第WO2012099805號，其各自以全文引用的方式併入本文中)。
脂質奈米粒子可經工程化以改變粒子之表面特性，故脂質奈米粒子可穿透黏膜屏障。黏液位於黏膜組織上，諸如(但不限於)口腔(例如，頰及食道膜及扁桃體組織)、眼部、胃腸(例如，胃部、小腸、大腸、結腸、直腸)、鼻部、呼吸道(例如，鼻部、咽部、氣管及枝氣管膜)、生殖器(例如，陰道、宮頸及尿道膜)。一直認為對於較高藥物囊封效率及提供大量藥物之持續傳遞之能力較佳的大於10至200nm之奈米粒子過大以至於無法快速擴散通過黏膜屏障。黏液連續分泌，流出，丟棄或消化及再循環，故大部分所捕獲之粒子可在數秒內或在數小時內自黏膜組織移除。已密集地塗有低分子量聚乙二醇(PEG)之大 的聚合奈米粒子(直徑為200nm至500nm)擴散通過黏液比相同粒子在水中之擴散低僅4至6倍(Lai等人PNAS 2007 104(5)：1482-487；Lai等人Adv Drug Deliv Rev.200961(2)：158-171；其各自以全文引用的方式併入本文中)。奈米粒子之運輸可使用穿透率及/或螢光顯微鏡檢查技術來測定，包括(但不限於)光漂泊螢光恢復術(FRAP)及高解析度多粒子跟蹤(MPT)。作為非限制性實例，可穿透黏膜屏障之組合物可如美國專利第8,241,670號或國際公開案第WO2013110028號中所述來製得，其各自之內容以全文引用的方式併入本文中。
經工程化以穿透黏液之脂質奈米粒子可包含聚合物質(亦即，聚合核心)及/或聚合物-維生素結合物及/或三嵌段共聚物。聚合物質可包括(但不限於)聚胺、聚醚、聚醯胺、聚酯、聚胺基甲酸酯、聚脲、聚碳酸酯、聚(苯乙烯)、聚醯亞胺、聚碸、聚胺基甲酸酯、聚乙炔、聚乙烯、聚乙烯亞胺、聚異氰酸酯、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯腈及聚芳酯。聚合物質可為生物可降解及/或生物相容性的。生物相容性聚合物之非限制性實例係在國際公開案第WO2013116804號中描述，該案之內容以全文引用的方式併入本文中。聚合物質可另外經照射。作為非限制性實例，聚合物質可經γ照射(參見例如，國際公開案第WO201282165號，其以全文引用的方式併入本文中)。特異性聚合物之非限制性實例包括聚(己內酯)(PCL)、乙烯乙酸乙烯酯聚合物(EVA)、聚(乳酸)(PLA)、聚(L-乳酸)(PLLA)、聚(乙醇酸)(PGA)、聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、聚(L-乳酸-共-乙醇酸)(PLLGA)、聚(D,L-丙交酯)(PDLA)、聚(L-丙交酯)(PLLA)、聚(D,L-丙交酯-共-己內酯)、聚(D,L-丙交酯-共-己內酯-共-乙交酯)、聚(D,L-丙交酯-共-PEO-共-D,L-丙交酯)、聚(D,L-丙交酯-共-PPO-共-D,L-丙交酯)、聚氰基丙烯酸烷基酯、聚胺基甲酸酯、聚-L-離胺酸(PLL)、甲基丙烯酸羥丙酯(HPMA)、聚乙烯二醇、聚-L-麩胺酸、聚(羥酸)、聚酸 酐、聚原酸酯、聚(酯醯胺)、聚醯胺、聚(酯醚)、聚碳酸酯、聚伸烷基(諸如聚乙烯及聚丙烯)、聚烷二醇(諸如聚(乙二醇)(PEG))、聚氧化烯(PEO)、聚對苯二甲酸伸烷酯(諸如聚(對本二甲酸乙酯))、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯醚、聚乙烯酯(諸如聚(乙酸乙烯酯))、聚鹵化乙烯(諸如聚(氯乙烯)(PVC))、聚乙烯吡咯啶酮、聚矽氧烷、聚苯乙烯(PS)、聚胺基甲酸酯、衍生化纖維素(諸如烷基纖維素)、羥基烷基纖維素、纖維素醚、纖維素酯、硝基纖維素、羥丙基纖維素、羧甲基纖維素、丙烯酸聚合物(諸如聚((甲基)丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚((甲基)丙烯酸乙酯)、聚((甲基)丙烯酸丁酯)、聚((甲基)丙烯酸異丁酯)、聚((甲基)丙烯酸己酯)、聚((甲基)丙烯酸異癸酯)、聚((甲基)丙烯酸月桂酯)、聚((甲基)丙烯酸苯酯)、聚(丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸異丙酯)、聚(丙烯酸異丁酯)、聚(丙烯酸十八烷酯)及其共聚物及混合物)、聚二氧環己酮及其共聚物、聚羥基烷酸酯、聚富馬酸丙二醇酯、聚甲醛、泊洛沙姆、聚(原酸)酯、聚(丁酸)、聚(戊酸)、聚(丙交酯-共-己內酯)、PEG-PLGA-PEG及三亞甲基碳酸酯、聚乙烯吡咯啶酮。脂質奈米粒子可塗有共聚物或與共聚物締合，諸如(但不限於)嵌段共聚物(諸如國際公開案第WO2013012476號中所述之分支聚醚-聚醯胺嵌段共聚物，該案以全文引用的方式併入本文中)，及(聚(乙二醇))-(聚(氧化丙烯))-(聚(乙二醇))三嵌段共聚物(參見例如，美國公開案20120121718及美國公開案20100003337及美國專利第8,263,665號，其各自以全文引用的方式併入本文中)。共聚物可為通常視為安全(GRAS)之聚合物且脂質奈米粒子之形成可為未產生新化學實體之如此方式。舉例而言，脂質奈米粒子可包含塗有泊洛沙姆之PLGA奈米粒子而不形成仍然能夠快速穿透人類黏液之新化學實體(Yang等人Angew.Chem.Int.Ed.2011 50：2597-2600，其內容以全文引用的方式併入本文中)。產生可穿透人類黏液之奈米粒子之非限制性可擴展方法係由Xu等人(參見例 如，J Control Release 2013,170(2)：279-86，其內容以全文引用的方式併入本文中)描述。
聚合物-維生素結合物之維生素可為維生素E。結合物之維生素部分可經其他合適之組分取代、諸如(但不限於)維生素A、維生素E、其他維生素、膽固醇、疏水性部分或其他界面活性劑之疏水性組分(例如，固醇鏈、脂肪酸、烴鏈及氧化烯鏈)。
經工程化以穿透黏液之脂質奈米粒子可包括表面改變劑，諸如(但不限於)聚核苷酸、陰離子型蛋白(例如，牛血清白蛋白)、界面活性劑(例如，陽離子型界面活性劑，例如溴化二甲基二-十八烷基-銨)、糖或糖衍生物(例如，環糊精)、核酸、聚合物(例如，肝素、聚乙二醇及泊洛沙姆)、黏液溶解劑(例如，N-乙醯基半胱胺酸、艾草、鳳梨蛋白酶、木瓜蛋白酶、大青(clerodendrum)、乙醯基半胱胺酸、溴己新(bromhexine)、羧甲司坦(carbocisteine)、依普拉酮(eprazinone)、美司鈉(mesna)、氨溴素(ambroxol)、索布瑞醇(sobrerol)、多米奧醇(domiodol)、來托司坦(letosteine)、司替羅寧(stepronin)、硫普羅寧(tiopronin)、凝溶膠蛋白(gelsolin)、胸腺素B4鏈道酶α、奈替克星(neltenexine)、厄多司坦(erdosteine))及各種DNA酶(包括rhDNA酶)。表面改變劑可嵌入或陷入粒子表面或置於(例如，藉由塗佈、吸附、共價鍵聯或其他過程)脂質奈米粒子之表面上(參見例如，美國公開案20100215580及美國公開案20080166414及US20130164343，其各自之內容以全文引用的方式併入本文中)。
在一些實施例中，穿透黏液之脂質奈米粒子可包含至少一種本文所述之聚核苷酸。聚核苷酸可囊封於脂質奈米粒子中及/或置於粒子表面上。聚核苷酸可與脂質奈米粒子共價耦合。穿透黏液之脂質奈米粒子之調配物可包含複數種奈米粒子。此外，調配物可含有可與黏液相互反應且改變周圍黏液之結構及/或黏著特性之粒子以減少黏液 黏附，從而可增加穿透黏液之脂質奈米粒子傳遞至黏膜組織。
在其他實施例中，穿透黏液之脂質奈米粒子可為低滲性調配物，包含黏膜穿透增強塗層。調配物對於其所傳遞至之上皮而言可為低滲性的。
低滲性調配物之非限制性實例可見於國際公開案第WO2013110028號，該案之內容以全文引用的方式併入本文中。
在一些實施例中，為了增強傳遞穿過黏膜屏障，RNA疫苗調配物可包含或為低滲性溶液。發現低滲性溶液增加諸如(但不限於)黏液穿透粒子之黏膜惰性粒子能夠到達陰道上皮表面之速率(參見例如，Ensign等人Biomaterials 2013，34(28)：6922-9，其內容以全文引用的方式併入本文中)。
在一些實施例中，RNA疫苗經調配為脂質體複合物，諸如(但不限於)來自Silence Therapeutics(London,United Kingdom)之ATUPLEXTM系統、DACC系統、DBTC系統及其他siRNA-脂質體複合物技術，來自STEMGENT®(Cambridge,MA)之STEMFECTTM，及基於聚乙烯亞胺(PEI)或魚精蛋白之核酸之靶向及非靶向傳遞(Aleku等人Cancer Res.2008 68：9788-9798；Strumberg等人Int J Clin Pharmacol Ther 2012 50：76-78；Santel等人，Gene Ther 2006 13：1222-1234；Santel等人，Gene Ther 2006 13：1360-1370；Gutbier等人，Pulm Pharmacol.Ther.2010 23：334-344；Kaufmann等人Microvasc Res 2010 80：286-293；Weide等人J Immunother.2009 32：498-507；Weide 等人J Immunother.2008 31：180-188；Pascolo,Expert Opin.Biol.Ther.4：1285-1294；Fotin-Mleczek等人，2011 J.Immunother.34：1-15；Song等人，Nature Biotechnol.2005,23：709-717；Peer等人，Proc Natl Acad Sci U S A.2007 6；104：4095-4100；deFougerolles Hum Gene Ther.2008 19：125-132；其各自以全文引用的方式併入本文中)。
在一些實施例中，該等調配物亦可經構築或為經改變以使得其在活體內被動或主動地導向不同細胞類型之組合物，該等細胞類型包括(但不限於)肝細胞、免疫細胞、腫瘤細胞、內皮細胞、抗原呈現細胞及白細胞(Akinc等人Mol Ther.2010 18：1357-1364；Song等人，Nat Biotechnol.2005 23：709-717；Judge等人，J Clin Invest.2009 119：661-673；Kaufmann等人，Microvasc Res 2010 80：286-293；Santel等人，Gene Ther 2006 13：1222-1234；Santel等人，Gene Ther 2006 13：1360-1370；Gutbier等人，Pulm Pharmacol.Ther.2010 23：334-344；Basha等人，Mol.Ther.2011 19：2186-2200；Fenske及Cullis,Expert Opin Drug Deliv.2008 5：25-44；Peer等人，Science.2008 319：627-630；Peer及Lieberman,Gene Ther.2011 18：1127-1133；其各自以全文引用的方式併入本文中)。將調配物被動靶向至肝細胞之一個實例包括基於DLin-DMA、DLin-KC2-DMA及DLin-MC3-DMA之脂質奈米粒子調配物，已顯示其結合至載脂蛋白E且在活體內促進此等調配物結合及攝入肝細胞中(Akinc等人Mol Ther.2010 18：1357-1364；其以全文引用的方式併入本文中)。調配物可亦經由其表面上之如由(但不限於)葉酸鹽、轉鐵蛋白、N-乙醯基半乳糖胺(GalNAc)所例示之不同配位體的表現，及抗體靶向方法來選擇性靶向(Kolhatkar等人，Curr Drug Discov Technol.2011 8：197-206；Musacchio及Torchilin,Front Biosci.2011 16：1388-1412；Yu等人，Mol Membr Biol.2010 27：286-298；Patil等人，Crit Rev Ther Drug Carrier Syst.2008 25：1-61；Benoit等人，Biomacromolecules.2011 12：2708-2714；Zhao等人，Expert Opin Drug Deliv.2008 5：309-319；Akinc等人，Mol Ther.2010 18：1357-1364；Srinivasan等人，Methods Mol Biol.2012 820：105-116；Ben-Arie等人，Methods Mol Biol.2012 757：497-507；Peer 2010 J Control Release.20：63-68；Peer等人，Proc Natl Acad Sci U S A.2007 104：4095-4100； Kim等人，Methods Mol Biol.2011 721：339-353；Subramanya等人，Mol Ther.2010 18：2028-2037；Song等人，Nat Biotechnol.2005 23：709-717；Peer等人，Science.2008 319：627-630；Peer及Lieberman,Gene Ther.2011 18：1127-1133；其各自以全文引用的方式併入本文中)。
在一些實施例中，RNA(例如，mRNA)疫苗經調配為固體脂質奈米粒子。固體脂質奈米粒子(SLN)可為具有介於10nm及1000nm之間之平均直徑之球形。SLN具備可溶解親脂性分子且可經界面活性劑及/或乳化劑穩定化之固體脂質核心基質。在其他實施例中，脂質奈米粒子可為自體組裝脂質-聚合物奈米粒子(參見Zhang等人，ACS Nano,2008,2(8)，第1696-1702頁；其內容以全文引用的方式併入本文中)。作為非限制性實例，SLN可為國際公開案第WO2013105101號中所述之SLN，該案之內容以全文引用的方式併入本文中。作為另一非限制性實例，SLN可藉由國際公開案第WO2013105101號中所述之方法或製程來製得，該案之內容以全文引用的方式併入本文中。
脂質體、脂質體複合物或脂質奈米粒子可用於改善引導蛋白產生之聚核苷酸之功效，因為此等調配物可能能夠藉由RNA疫苗增加細胞轉染；及/或增加所編碼蛋白之轉譯。一個該種實例涉及使用脂質囊封來使得能夠達成polyplex質體DNA之有效全身性傳遞(Heyes等人，Mol Ther.2007 15：713-720；其以全文引用的方式併入本文中)。脂質體、脂質體複合物或脂質奈米粒子亦可用於增加聚核苷酸之穩定性。
在一些實施例中，本發明之RNA(例如，mRNA)疫苗可經調配用於控制釋放及/或靶向傳遞。如本文所用，「控制釋放」係指遵循特定釋放模式以實現治療性結果之醫藥組合物或化合物釋放概況。在一些實施例中，RNA疫苗可經囊封至本文所述及/或此項技術中已知用於控制釋放及/或靶向傳遞之傳遞藥劑。如本文所用，術語「囊封」意謂包封、包圍或包裹。因為其係關於本發明之化合物之調配物，囊封 可為大量、全部或部分。術語「經大量囊封」意謂至少大於50、60、70、80、85、90、95、96、97、98、99、99.9、99.9或大於99.999%之本發明之醫藥組合物或化合物可經包封、包圍或包裹在傳遞藥劑中。「經部分囊封」意謂小於10、10、20、30、40、50或50以下之本發明之醫藥組合物或化合物可經包封、包圍或包裹在傳遞藥劑中。有利地，囊封可藉由使用螢光及/或電子顯微照片量測本發明之醫藥組合物或化合物之逃逸或活性來測定。舉例而言，至少1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、85、90、95、96、97、98、99、99.9、99.99或大於99.99%之本發明之醫藥組合物或化合物經囊封在傳遞藥劑中。
在一些實施例中，控制釋放調配物可包括(但不限於)三嵌段共聚物。作為非限制性實例，調配物可包括兩種不同類型之三嵌段共聚物(國際公開案第WO2012131104號及第WO2012131106號；其各自之內容以全文引用的方式併入本文中)。
在其他實施例中，RNA疫苗可經囊封至脂質奈米粒子或快速消除之脂質奈米粒子中且脂質奈米粒子或快速消除之脂質奈米粒子可隨後經囊封至本文所述及/或此項技術中已知之聚合物、水凝膠及/或手術密封膠中。作為非限制性實例，聚合物、水凝膠或手術密封膠可為PLGA、乙烯乙酸乙烯酯(EVAc)、泊洛沙姆、GELSITE ®(Nanotherapeutics,Inc.Alachua,FL)、HYLENEX®(Halozyme Therapeutics,San Diego CA)、諸如纖維蛋白原聚合物之手術密封膠(Ethicon Inc.Cornelia,GA)、TISSELL®(Baxter International,Inc Deerfield,IL)、基於PEG之密封膠及COSEAL®(Baxter International,Inc Deerfield,IL)。
在其他實施例中，脂質奈米粒子可經囊封至此項技術中已知之任何聚合物中，其可形成注入個體中之凝膠。作為另一非限制性實 例，脂質奈米粒子可經囊封至可為生物可降解之聚合物基質中。
在一些實施例中，用於控制釋放及/或靶向傳遞之RNA疫苗調配物亦可包括至少一種控制釋放塗層。控制釋放塗層包括(但不限於)OPADRY®、聚乙烯吡咯啶酮/乙酸乙烯酯共聚物、聚乙烯吡咯啶酮、羥丙基甲基纖維素、羥丙基纖維素、羥乙基纖維素、EUDRAGITRL®、EUDRAGIT RS®及纖維素衍生物(諸如乙基纖維素水性分散液(AQUACOAT®及SURELEASE ®))。
在一些實施例中，RNA(例如，mRNA)疫苗控制釋放及/或靶向傳遞調配物可包含至少一種可降解之聚酯，其可含有聚陽離子型側鏈。可降解之聚酯包括(但不限於)聚(絲胺酸酯)、聚(L-丙交酯-共-L-離胺酸)、聚(4-羥基-L-脯胺酸酯)及其組合。在其他實施例中，可降解之聚酯可包括PEG結合以形成PEG化聚合物。
在一些實施例中，包含至少一種聚核苷酸之RNA疫苗控制釋放及/或靶向傳遞調配物可包含如美國專利第8,404,222號中所述之至少一種PEG及/或PEG相關聚合物衍生物，該案以全文引用的方式併入本文中。
在其他實施例中，包含至少一種聚核苷酸之RNA疫苗控制釋放傳遞調配物可為美國公開案第20130130348號中所述之控制釋放聚合物系統，該案以全文引用的方式併入本文中。
在一些實施例中，本發明之RNA(例如，mRNA)疫苗可經囊封於治療性奈米粒子中，本文稱為「治療性奈米粒子RNA疫苗」。治療性奈米粒子可藉由本文所述及此項技術中已知之方法來調配，諸如(但不限於)國際公開案第WO2010005740號、第WO2010030763號、第WO2010005721號、第WO2010005723號、第WO2012054923號、美國公開案第US20110262491號、第US20100104645號、第US20100087337號、第US20100068285號、第US20110274759號、第 US20100068286號、第US20120288541號、第US20130123351號及第US20130230567號及美國專利第8,206,747號、第8,293,276號、第8,318,208號及第8,318,211號，其各自之內容以全文引用的方式併入本文中。在其他實施例中，治療性聚合物奈米粒子可藉由美國公開案第US20120140790號中所述之方法來鑑定，該案之內容以全文引用的方式併入本文中。
在一些實施例中，治療性奈米粒子RNA疫苗可經調配用於持續釋放。如本文所用，「持續釋放」係指在特定之時間段內遵循釋放速率之醫藥組合物或化合物。該時間段可包括(但不限於)數小時、數天、數週、數月及數年。作為非限制性實例，持續釋放奈米粒子可包含聚合物及治療性藥劑，諸如(但不限於)本發明之聚核苷酸(參見國際公開案第2010075072號及美國公開案第US20100216804號、第US20110217377號及第US20120201859號，其各自以全文引用的方式併入本文中)。在另一非限制性實例中，持續釋放調配物可包含允許持續生物可用性之藥劑，諸如(但不限於)晶體、巨分子凝膠及/或顆粒懸浮液(參見美國公開案第US20130150295號，其內容以全文引用的方式併入本文中)。
在一些實施例中，治療性奈米粒子RNA疫苗可經調配以具有標靶特異性。作為非限制性實例，治療性奈米粒子可包括皮質類固醇(參見國際公開案第WO2011084518號，其以全文引用的方式併入本文中)。作為非限制性實例，治療性奈米粒子可在國際公開案第WO2008121949號、第WO2010005726號、第WO2010005725號、第WO2011084521號及美國公開案第US20100069426號、第US20120004293號及第US20100104655號中所述之奈米粒子中調配，該等案各自以全文引用的方式併入本文中。
在一些實施例中，本發明之奈米粒子可包含聚合基質。作為非 限制性實例，奈米粒子可包含兩種或兩種以上聚合物、諸如(但不限於)聚乙烯、聚碳酸酯、聚酸酐、聚羥酸、聚丙基富馬酸酯、聚己內酯、聚醯胺、聚縮醛、聚醚、聚酯、聚(原酸酯)、聚氰基丙烯酸酯、聚乙烯醇、聚胺基甲酸酯、聚磷腈、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚氰基丙烯酸酯、聚脲、聚苯乙烯、聚胺、聚離胺酸、聚(乙二胺)、聚(絲胺酸酯)、聚(L-丙交酯-共-L-離胺酸)、聚(4-羥基-L-脯胺酸酯)或其組合。
在一些實施例中，治療性奈米粒子包含二嵌段共聚物。在一些實施例中，二嵌段共聚物可包括與聚合物組合之PEG，該聚合物諸如(但不限於)聚乙烯、聚碳酸酯、聚酸酐、聚羥酸、聚丙基富馬酸酯、聚己內酯、聚醯胺、聚縮醛、聚醚、聚酯、聚(原酸酯)、聚氰基丙烯酸酯、聚乙烯醇、聚胺基甲酸酯、聚磷腈、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚氰基丙烯酸酯、聚脲、聚苯乙烯、聚胺、聚離胺酸、聚(乙二胺)、聚(絲胺酸酯)、聚(L-丙交酯-共-L-離胺酸)、聚(4-羥基-L-脯胺酸酯)或其組合。在其他實施例中，二嵌段共聚物可為高X二嵌段共聚物，諸如國際公開案第WO2013120052號中所述之彼等共聚物，該案之內容以全文引用的方式併入本文中。
作為非限制性實例，治療性奈米粒子包含PLGA-PEG嵌段共聚物(參見美國公開案第US20120004293號及美國專利第8,236,330號，其各自以全文引用的方式併入本文中)。在另一非限制性實例中，治療性奈米粒子為包含PEG及PLA或PEG及PLGA之二嵌段共聚物之隱形奈米粒子(參見美國專利第8,246,968號及國際公開案第WO2012166923號，其各自之內容以全文引用的方式併入本文中)。在又一非限制性實例中，治療性奈米粒子為如美國公開案第20130172406號中所述之隱形奈米粒子或標靶特異性隱形奈米粒子，該案之內容以全文引用的方式併入本文中。
在一些實施例中，治療性奈米粒子可包含多嵌段共聚物(參見例如，美國專利第8,263,665號及第8,287,910號及美國公開案第20130195987號，其各自之內容以全文引用的方式併入本文中)。
在又一非限制性實例中，脂質奈米粒子包含嵌段共聚物PEG-PLGA-PEG(參見例如，熱敏性水凝膠(PEG-PLGA-PEG)，其在Lee等人.「Thermosensitive Hydrogel as a Tgf-β1 Gene Delivery Vehicle Enhances Diabetic Wound Healing.」Pharmaceutical Research,2003 20(12)：1995-2000用作TGF-β1基因傳遞媒劑；及在Li等人「Controlled Gene Delivery System Based on Thermosensitive Biodegradable Hydrogel」Pharmaceutical Research 2003 20(6)：884-888；及Chang等人，「Non-ionic amphiphilic biodegradable PEG-PLGA-PEG copolymer enhances gene delivery efficiency in rat skeletal muscle.」J Controlled Release.2007 118：245-253中用作控制基因傳遞系統；其各自以全文引用的方式併入本文中)。本發明之RNA(例如，mRNA)疫苗可在包含PEG-PLGA-PEG嵌段共聚物脂質奈米粒子中調配。
在一些實施例中，本文所述之嵌段共聚物可包括在包含非聚合微胞及嵌段共聚物之聚離子複合物中。(參見例如，美國公開案第20120076836號，其以全文引用的方式併入本文中)。
在一些實施例中，治療性奈米粒子可包含至少一種丙烯酸系聚合物。丙烯酸系聚合物包括(但不限於)丙烯酸、甲基丙烯酸、丙烯酸及甲基丙烯酸共聚物、甲基甲基丙烯酸酯共聚物、乙氧基乙基甲基丙烯酸酯、氰基乙基甲基丙烯酸酯、胺基烷基甲基丙烯酸酯共聚物、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、聚氰基丙烯酸酯及其組合。
在一些實施例中，治療性奈米粒子可包含至少一種聚(乙烯基酯)聚合物。聚(乙烯基酯)聚合物可為共聚物，諸如無規共聚物。作為非 限制性實例，無規共聚物可具有結構，諸如國際公開案第WO2013032829號或美國公開案第20130121954號中所述之彼等結構，該等案之內容以全文引用的方式併入本文中。在一些態樣中，聚(乙烯基酯)聚合物可結合成本文所述之聚核苷酸。
在一些實施例中，治療性奈米粒子可包含至少一種二嵌段共聚物。二嵌段共聚物可為(但不限於)聚(乳)酸-聚(伸乙基)二醇共聚物(參見例如，國際公開案第WO2013044219號；其以全文引用的方式併入本文中)。作為非限制性實例，治療性奈米粒子可用於治療癌症(參見國際公開案第WO2013044219號，其以全文引用的方式併入本文中)。
在一些實施例中，治療性奈米粒子可包含本文所述及/或此項技術中已知之至少一種陽離子型聚合物。
在一些實施例中，治療性奈米粒子可包含至少一種含胺聚合物，諸如(但不限於)聚離胺酸、聚乙烯亞胺、聚(胺基醯胺)樹狀物、聚(β-胺基酯)(參見例如，美國專利第8,287,849號，其以全文引用的方式併入本文中)及其組合。在其他實施例中，本文所述之奈米粒子可包含胺陽離子型脂質，諸如國際公開案第WO2013059496號中所述之彼等脂質，該案之內容以全文引用的方式併入本文中。在一些態樣中，陽離子型脂質可具有胺基-胺或胺基-醯胺部分。
在一些實施例中，治療性奈米粒子可包含至少一種可降解之聚酯，其可含有聚陽離子型側鏈。可降解之聚酯包括(但不限於)聚(絲胺酸酯)、聚(L-丙交酯-共-L-離胺酸)、聚(4-羥基-L-脯胺酸酯)及其組合。在其他實施例中，可降解之聚酯可包括PEG結合以形成PEG化聚合物。
在其他實施例中，治療性奈米粒子可包括至少一種靶向配位體之結合。靶向配位體可為此項技術中已知之任何配位體，諸如(但不限於)單株抗體(Kirpotin等人，Cancer Res.2006 66：6732-6740，其以全 文引用的方式併入本文中)。
在一些實施例中，治療性奈米粒子可在水性溶液中調配，其可用於標靶癌症(參見國際公開案第WO2011084513號及美國公開案第20110294717號，其各自以全文引用的方式併入本文中)。
在一些實施例中，治療性奈米粒子RNA疫苗(例如包含至少一種RNA疫苗之治療性奈米粒子)可使用由Podobinski等人之美國專利第8,404,799號所述之方法來調配，該案之內容以全文引用的方式併入本文中。
在一些實施例中，RNA(例如，mRNA)疫苗可囊封在合成奈米載體中，與合成奈米載體連接及/或締合。合成奈米載體包括(但不限於)國際公開案第WO2010005740號、第WO2012149454號及第WO2013019669號、及美國公開案第US20110262491號、第US20100104645號、第US20100087337號及第US20120244222號中所述之彼等合成奈米載體，該等案各自以全文引用的方式併入本文中。合成奈米載體可使用此項技術中已知及/或本文所述之方法來調配。作為非限制性實例，合成奈米載體可藉由國際公開案第WO2010005740號、第WO2010030763號及第WO201213501號及美國公開案第US20110262491號、第US20100104645號、第US20100087337號及第US2012024422號中所述之方法來調配，該等案各自以全文引用的方式併入本文中。在其他實施例中，合成奈米載體調配物可藉由國際公開案第WO2011072218號及美國專利第8,211,473號中所述之方法凍乾，該等案各自之內容以全文引用的方式併入本文中。在其他實施例中，本發明之調配物，包括(但不限於)合成奈米載體，可藉由美國公開案第20130230568號中所述之方法來凍乾或復原，該案之內容以全文引用的方式併入本文中。
在一些實施例中，合成奈米載體可含有反應性基團以釋放本文 所述之聚核苷酸(參見國際公開案第WO20120952552號及美國公開案第US20120171229號，其各自以全文引用的方式併入本文中)。
在一些實施例中，合成奈米載體可含有免疫刺激劑以增強自傳遞合成奈米載體所產生之免疫反應。作為非限制性實例，合成奈米載體可包含Th1免疫刺激劑，其可增強免疫系統之基於Th1之反應(參見國際公開案第WO2010123569號及美國公開案第20110223201號，其各自以全文引用的方式併入本文中)。
在一些實施例中，合成奈米載體可經調配用於靶向釋放。在一些實施例中，合成奈米載體經調配以在指定pH值下及/或在所需時間間隔後釋放聚核苷酸。作為非限制性實例，合成奈米粒子可經調配以在24小時後及/或在pH 4.5下釋放RNA疫苗(參見國際公開案第WO2010138193號及第WO2010138194號及美國公開案第US20110020388號及第US20110027217號，其各自以全文引用的方式併入本文中)。
在一些實施例中，合成奈米載體可經調配用於本文所述之聚核苷酸之控制及/或持續釋放。作為非限制性實例，用於持續釋放之合成奈米載體可藉由此項技術中已知、本文所述及/或如國際公開案第WO2010138192號及美國公開案第20100303850號中所述之方法來調配，該等案各自以全文引用的方式併入本文中。
在一些實施例中，RNA疫苗可經調配用於控制及/或持續釋放，其中調配物包含至少一種為結晶側鏈(CYSC)聚合物之聚合物。CYSC聚合物係在美國專利第8,399,007號中描述，其以全文引用的方式併入本文中。
在一些實施例中，合成奈米載體可經調配以用作疫苗。在一些實施例中，合成奈米載體可囊封至少一種編碼至少一種抗原之聚核苷酸。作為非限制性實例，合成奈米載體可包括至少一種抗原及用於疫 苗劑型之賦形劑(參見國際公開案第WO2011150264號及美國公開案第20110293723號，其各自以全文引用的方式併入本文中)。作為另一非限制性實例，疫苗劑型可包括具有相同或不同抗原及賦形劑之至少兩種合成奈米載體(參見國際公開案第WO2011150249號及美國公開案第20110293701號，其各自以全文引用的方式併入本文中)。疫苗劑型可藉由本文所述、此項技術中已知及/或國際公開案第WO2011150258號及美國公開案第US20120027806號中所述之方法來選擇，該等案各自以全文引用的方式併入本文中。
在一些實施例中，合成奈米載體可包含至少一種編碼至少一種佐劑(例如，鞭毛蛋白)之聚核苷酸。在一些實施例中，合成奈米載體可包含至少一種佐劑。作為非限制性實例，佐劑可包含溴化二甲基二-十八烷基銨、氯化二甲基二-十八烷基銨、磷酸二甲基二-十八烷基銨或乙酸二甲基二-十八烷基銨(DDA)及分枝桿菌之全部脂質萃取物之非極性餾分或該非極性餾分之一部分(參見例如，美國專利第8,241,610號；其以全文引用的方式併入本文中)。在其他實施例中，合成奈米載體可包含至少一種聚核苷酸及佐劑。作為非限制性實例，包含、視情況包含佐劑之合成奈米載體可藉由國際公開案第WO2011150240號及美國公開案第US20110293700號中所述之方法來調配，該等案各自以全文引用的方式併入本文中。
在一些實施例中，合成奈米載體可囊封至少一種編碼來自病毒之肽、片段或區域之聚核苷酸。作為非限制性實例，合成奈米載體可包括(但不限於)國際公開案第WO2012024621號、第WO201202629號、第WO2012024632號及美國公開案第US20120064110號、第US20120058153號及第US20120058154號中所述之奈米載體，該等案各自以全文引用的方式併入本文中。
在一些實施例中，合成奈米載體可耦合至可為能夠觸發體液及/ 或細胞毒性T淋巴細胞(CTL)反應之聚核苷酸(參見例如，國際公開案第WO2013019669號，其以全文引用的方式併入本文中)。
在一些實施例中，RNA疫苗可囊封在兩性離子脂質中，與兩性離子脂質連接及/或締合。兩性離子脂質之非限制性實例及使用兩性離子脂質之方法係在美國公開案第20130216607號描述，該案之內容以全文引用的方式併入本文中。在一些態樣中，兩性離子脂質可用於本文所述之脂質體及脂質奈米粒子中。
在一些實施例中，RNA疫苗可在如美國公開案第20130197100號中所述之膠態奈米載體中調配，該案之內容以全文引用的方式併入本文中。
在一些實施例中，奈米粒子可經最佳化用於經口投藥。奈米粒子可包含至少一種陽離子型生物聚合物，諸如(但不限於)殼聚糖或其衍生物。作為非限制性實例，奈米粒子可藉由美國公開案第20120282343號中所述之方法來調配；該案以全文引用的方式併入本文中。
在一些實施例中，LNP包含脂質KL52(美國申請公開案第2012/0295832號中所揭示之胺基-脂質，該案明確地以全文引用的方式併入本文中)。LNP投藥之活性及/或安全性(如藉由檢查ALT/AST、白血球計數及細胞介素誘導中之一或多者所量測)可藉由合併該等脂質來改善。包含KL52之LNP可經靜脈內及/或以一或多次劑量投與。在一些實施例中，與包含MC3之LNP相比，投與包含KL52之LNP導致相等或改善之mRNA及/或蛋白表現。
在一些實施例中，RNA疫苗可使用較小LNP傳遞。該等粒子可包含低於0.1μm至100nm之直徑，諸如(但不限於)小於0.1μm、小於1.0μm、小於5μm、小於10μm、小於15μm、小於20μm、小於25μm、小於30μm、小於35μm、小於40μm、小於50μm、小於55μm、小於 60μm、小於65μm、小於70μm、小於75μm、小於80μm、小於85μm、小於90μm、小於95μm、小於100μm、小於125μm、小於150μm、小於175μm、小於200μm、小於225μm、小於250μm、小於275μm、小於300μm、小於325μm、小於350μm、小於375μm、小於400μm、小於425μm、小於450μm、小於475μm、小於500μm、小於525μm、小於550μm、小於575μm、小於600μm、小於625μm、小於650μm、小於675μm、小於700μm、小於725μm、小於750μm、小於775μm、小於800μm、小於825μm、小於850μm、小於875μm、小於900μm、小於925μm、小於950μm或小於975μm。
在其他實施例中，RNA(例如，mRNA)疫苗可使用較小LNP傳遞，其可包含如下直徑：約1nm至約100nm、約1nm至約10nm、約1nm至約20nm、約1nm至約30nm、約1nm至約40nm、約1nm至約50nm、約1nm至約60nm、約1nm至約70nm、約1nm至約80nm、約1nm至約90nm、約5nm至約100nm、約5nm至約10nm、約5nm至約20nm、約5nm至約30nm、約5nm至約40nm、約5nm至約50nm、約5nm至約60nm、約5nm至約70nm、約5nm至約80nm、約5nm至約90nm、約10至約50nm、約20至約50nm、約30至約50nm、約40至約50nm、約20至約60nm、約30至約60nm、約40至約60nm、約20至約70nm、約30至約70nm、約40至約70nm、約50至約70nm、約60至約70nm、約20至約80nm、約30至約80nm、約40至約80nm、約50至約80nm、約60至約80nm、約20至約90nm、約30至約90nm、約40至約90nm、約50至約90nm、約60至約90nm及/或約70至約90nm。
在一些實施例中，該等LNP係使用包含微流體混合器之方法來合成。例示性微流體混合器可包括(但不限於)分開指叉型微混合器，包括(但不限於)由Microinnova(Allerheiligen bei Wildon,Austria)製造之 彼等混合器及/或交錯鯡魚骨式微混合器(SHM)(Zhigaltsev,I.V.等人，Bottom-up design and synthesis of limit size lipid nanoparticle systems with aqueous and triglyceride cores using millisecond microfluidic mixing have been published(Langmuir.2012.28：3633-40；Belliveau,N.M.等人，Microfluidic synthesis of highly potent limit-size lipid nanoparticles for in vivo delivery of siRNA.Molecular Therapy-NucleicAcids.2012.1：e37；Chen,D.等人，Rapid discovery of potent siRNA-containing lipid nanoparticles enabled by controlled microfluidic formulation.J Am Chem Soc.2012.134(16)：6948-51；其各自以全文引用的方式併入本文中)。
在一些實施例中，包含SHM之LNP產生方法進一步包括混合至少兩個輸入流，其中混合藉由微結構誘發之混沌對流(MICA)發生。根據此方法，流體流流過以鯡魚骨圖案存在之通道，從而引起旋轉流且在彼此周圍疊加。此方法亦可包含用於流體混合之表面，其中該表面改變流體循環期間之取向。使用SHM產生LNP之方法包括美國申請公開案第2004/0262223號及第2012/0276209號中所揭示之彼等方法，該等案各自明確地以全文引用的方式併入本文中。
在一些實施例中，本發明之RNA疫苗可在使用微混合器製造之脂質奈米粒子中調配，該微混合器諸如(但不限於)來自Institut für Mikrotechnik Mainz GmbH(Mainz Germany)之分開指叉型微結構混合器(SIMM-V2)或標準分開指叉型微混合器(SSIMM)或履帶式(CPMM)或碰撞流型(IJMM)。
在一些實施例中，本發明之RNA(例如，mRNA)疫苗可在使用微流體技術製造之脂質奈米粒子中調配(參見Whitesides,George M.The Origins and the Future of Microfluidics.Nature,2006 442：368-373；及Abraham等人Chaotic Mixer for Microchannels.Science,2002 295： 647-651；其各自以全文引用的方式併入本文中)。作為非限制性實例，對照微流體調配物包括用於在低雷諾數(Reynolds number)下將穩定壓力驅動流混合於微通道中之被動方法(參見例如，Abraham等人Chaotic Mixer for Microchannels.Science,2002 295：647651；其以全文引用的方式併入本文中)。
在一些實施例中，本發明之RNA(例如，mRNA)疫苗可在使用微混合器晶片製造之脂質奈米粒子中調配，該微混合器晶片諸如(但不限於)來自Harvard Apparatus(Holliston,MA)或Dolomite Microfluidics(Royston,UK)之彼等微混合器晶片。微混合器晶片可用於以分開及重組機制快速混合兩個或兩個以上流體流。
在一些實施例中，本發明之RNA(例如，mRNA)疫苗可經調配用於使用國際公開案第WO2013063468號或美國專利第8,440,614號中所述之藥物囊封微球體傳遞，該等案各自以全文引用的方式併入本文中。微球體可包含如國際公開案第WO2013063468號中所述之式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)或(VI)之化合物，該案之內容以全文引用的方式併入本文中。在其他態樣中，胺基酸、肽、多肽、脂質(APPL)適用於將本發明之RNA疫苗傳遞至細胞(參見國際公開案第WO2013063468號，該案之內容以全文引用的方式併入本文中)。
在一些實施例中，本發明之RNA(例如，mRNA)疫苗可在具有約10至約100nm之直徑之脂質奈米粒子中調配，該直徑諸如(但不限於)約10至約20nm、約10至約30nm、約10至約40nm、約10至約50nm、約10至約60nm、約10至約70nm、約10至約80nm、約10至約90nm、約20至約30nm、約20至約40nm、約20至約50nm、約20至約60nm、約20至約70nm、約20至約80nm、約20至約90nm、約20至約100nm、約30至約40nm、約30至約50nm、約30至約60nm、約30至約70nm、約30至約80nm、約30至約90nm、約30至約100nm、約40至約 50nm、約40至約60nm、約40至約70nm、約40至約80nm、約40至約90nm、約40至約100nm、約50至約60nm、約50至約70nm約50至約80nm、約50至約90nm、約50至約100nm、約60至約70nm、約60至約80nm、約60至約90nm、約60至約100nm、約70至約80nm、約70至約90nm、約70至約100nm、約80至約90nm、約80至約100nm及/或約90至約100nm。
在一些實施例中，脂質奈米粒子可具有約10至500nm之直徑。
在一些實施例中、脂質奈米粒子可具有大於100nm、大於150nm、大於200nm、大於250nm、大於300nm、大於350nm、大於400nm、大於450nm、大於500nm、大於550nm、大於600nm、大於650nm、大於700nm、大於750nm、大於800nm、大於850nm、大於900nm、大於950nm或大於1000nm之直徑。
在一些態樣中，脂質奈米粒子可為國際公開案第WO2013059922號中所述之極限尺寸脂質奈米粒子，該案之內容以全文引用的方式併入本文中。極限尺寸脂質奈米粒子可包含包圍水性核心或疏水性核心之脂質雙層；其中脂質雙層可包含磷脂，諸如(但不限於)二醯基磷脂醯膽鹼、二醯基磷脂醯乙醇胺、神經醯胺、鞘磷脂、二氫鞘磷脂、腦磷脂、腦苷脂、C8-C20脂肪酸二醯基磷脂醯膽鹼及1-棕櫚醯基-2-油醯基磷脂醯膽鹼(POPC)。在其他態樣中，極限尺寸脂質奈米粒子可包含聚乙二醇-脂質諸如(但不限於)DLPE-PEG、DMPE-PEG、DPPC-PEG及DSPE-PEG。
在一些實施例中，RNA疫苗可使用國際公開案第WO2013063530號中所述之傳遞方法在特定位置傳遞、定位及/或集中，該案之內容以全文引用的方式併入本文中。作為非限制性實例，可在將RNA疫苗傳遞至個體之前、同時或之後向個體投與空心聚合粒子。空心聚合粒子一旦與個體接觸後經歷體積變化且變成存放、嵌入、固定或俘獲在 個體中之特定位置。
在一些實施例中，RNA疫苗可在活性物質釋放系統中調配(參見例如，美國公開案第US20130102545號，其內容以全文引用的方式併入本文中)。活性物質釋放系統可包含1)至少一種鍵結至與催化活性核酸雜交之寡聚核苷酸抑制劑股之奈米粒子，及2)鍵結至至少一種鍵結至治療活性物質(例如，本文所述之聚核苷酸)之受質分子之化合物，其中治療活性物質係藉由催化活性核酸裂解受質分子來釋放。
在一些實施例中，RNA(例如，mRNA)疫苗可在包含含非細胞物質之內部核心及含細胞膜之外部表面之奈米粒子中調配。細胞膜可源自細胞或源自病毒之膜。作為非限制性實例，奈米粒子可藉由國際公開案第WO2013052167號中所述之方法來製得，該案以全文引用的方式併入本文中。作為另一非限制性實例，國際公開案第WO2013052167號中所述之奈米粒子可用於傳遞本文所述之RNA疫苗，該案以全文引用的方式併入本文中。
在一些實施例中，RNA疫苗可在多孔奈米粒子支撐之脂質雙層(原生細胞)中調配。原生細胞係在國際公開案第WO2013056132號中描述，該案之內容以全文引用的方式併入本文中。
在一些實施例中，本文所述之RNA疫苗可在如美國專利第8,420,123號及第8,518,963號及歐洲專利第EP2073848B1號中所述之聚合奈米粒子中調配或藉由該等案中所述之方法來製得，該等案各自之內容以全文引用的方式併入本文中。作為非限制性實例，聚合奈米粒子可具有高玻璃轉化溫度，諸如美國專利第8,518,963號中所述之奈米粒子或藉由該案中所述之方法所製得之奈米粒子，該案之內容以全文引用的方式併入本文中。作為另一非限制性實例，用於口服及非經腸調配物之聚合物奈米粒子可藉由歐洲專利第EP2073848B1號中所述之方法來製得，該案之內容以全文引用的方式併入本文中。
在其他實施例中，本文所述之RNA(例如，mRNA)疫苗可在用於成像之奈米粒子中調配。奈米粒子可為脂質體奈米粒子，諸如美國公開案第20130129636號中所述之彼等脂質體奈米粒子，該案以全文引用的方式併入本文中。作為非限制性實例，脂質體可包含釓(III)2-{4,7-雙-羧甲基-10-[(N,N-二硬脂醯基醯胺基甲基-N'-醯胺基-甲基]-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1-基}-乙酸及中性、完全飽和磷脂組分(參見例如，美國公開案第US20130129636號，其內容以全文引用的方式併入本文中)。
在一些實施例中，可用於本發明中之奈米粒子係藉由美國專利申請案第20130130348號中所述之方法來形成，該案之內容以全文引用的方式併入本文中。
本發明之奈米粒子可進一步包括營養物，諸如(但不限於)缺乏可導致自貧血至神經管缺陷之健康危害之彼等營養物(參見例如，國際專利公開案第WO2013072929號中所述之奈米粒子，該案之內容以全文引用的方式併入本文中)。作為非限制性實例，營養物可為亞鐵鹽、鐵鹽或元素鐵形式之鐵、碘、葉酸、維生素或微量營養物。
在一些實施例中，本發明之RNA(例如，mRNA)疫苗可在可溶脹奈米粒子中調配。可溶脹奈米粒子可為(但不限於)美國專利第8,440,231號中所述之彼等奈米粒子，該案之內容以全文引用的方式併入本文中。作為非限制性實施例，可溶脹奈米粒子可用於將本發明之RNA(例如，mRNA)疫苗傳遞至肺部系統(參見例如，美國專利第8,440,231號，其內容以全文引用的方式併入本文中)。
本發明之RNA(例如，mRNA)疫苗可在聚酸酐奈米粒子中調配，諸如(但不限於)美國專利第8,449,916號中所述之彼等奈米粒子，該案之內容以全文引用的方式併入本文中。本發明之奈米粒子及微粒子可經幾何學工程化以調節巨噬細胞及/或免疫反應。在一些態樣中，經 幾何學工程化之粒子可具有各種形狀、尺寸及/或表面電荷以合併本發明之聚核苷酸用於靶向傳遞，諸如(但不限於)肺部傳遞(參見例如，國際公開案第WO2013082111號，其內容以全文引用的方式併入本文中)。幾何學工程化粒子可具有之其他物理特徵包括(但不限於)可改變與細胞及組織之相互作用之開窗、角度臂、不對稱性及表面粗糙度、電荷。作為非限制性實例，本發明之奈米粒子可藉由國際公開案第WO2013082111號中所述之方法來製得，該案之內容以全文引用的方式併入本文中。
在一些實施例中，本發明之奈米粒子可為水溶性奈米粒子，諸如(但不限於)國際公開案第WO2013090601號中所述之彼等奈米粒子，該案之內容以全文引用的方式併入本文中。奈米粒子可為無機奈米粒子，其具有緊密及兩性離子配位體以展現良好水溶性。奈米粒子亦可具有小流體動力學直徑(HD)，相對於時間、pH值及鹽度之穩定性，及低程度之非特異性蛋白結合。
在一些實施例中，本發明之奈米粒子可藉由美國公開案第US20130172406號中所述之方法來研發，該案之內容以全文引用的方式併入本文中。
在一些實施例中，本發明之奈米粒子為隱形奈米粒子或標靶特異性隱形奈米粒子，諸如(但不限於)美國公開案第20130172406號中所述之彼等奈米粒子，該案之內容以全文引用的方式併入本文中。本發明之奈米粒子可藉由美國公開案第20130172406號中所述之方法來製得，該案之內容以全文引用的方式併入本文中。
在其他實施例中，隱形或標靶特異性隱形奈米粒子可包含聚合基質。聚合基質可包含兩種或兩種以上聚合物、諸如(但不限於)聚乙烯、聚碳酸酯、聚酸酐、聚羥酸、聚丙基富馬酸酯、聚己內酯、聚醯胺、聚縮醛、聚醚、聚酯、聚(原酸酯)、聚氰基丙烯酸酯、聚乙烯 醇、聚胺基甲酸酯、聚磷腈、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚氰基丙烯酸酯、聚脲、聚苯乙烯、聚胺、聚酯、聚酸酐、聚醚、聚胺基甲酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸酯、聚氰基丙烯酸酯或其組合。
在一些實施例中，奈米粒子可為具有高密度核酸層之奈米粒子-核酸雜交結構。作為非限制性實例，奈米粒子-核酸雜交結構可藉由美國公開案第20130171646號中所述之方法來製得，該案之內容以全文引用的方式併入本文中。奈米粒子可包含核酸，諸如(但不限於)本文所述及/或此項技術中已知之聚核苷酸。
本發明之奈米粒子中之至少一者可為嵌入奈米結構之核心或塗有低密度多孔3-D結構或塗層，其能夠在奈米結構內或表面上帶有至少一個淨荷或與其締合。包含至少一種奈米粒子之奈米結構之非限制性實例係在國際公開案第WO2013123523號中描述，該案之內容以全文引用的方式併入本文中。
疫苗投與模式
RSV RNA(例如，mRNA)疫苗可藉由產生治療有效結果之任何途徑來投與。此等途徑包括(但不限於)皮內、肌肉內、鼻內及/或皮下投藥。本發明提供包括向有需要之個體投與RNA疫苗之方法。所需之確切量將視個體之物種、年齡及總體狀況、疾病之嚴重性、特定組合物、其投藥模式、其活性模式及其類似因素而在個體之間變化。RSV RNA(例如，mRNA)組合物通常調配為單位劑型以便於投藥及劑量之均一性。然而，應瞭解，RSV RNA(例如，mRNA)組合物之每日總用量可由主治醫師在合理醫學判斷之範疇內決定。對於任何特定患者之特異性治療有效、預防有效或適當成像劑量水準將取決於各種因素，包括受治療之病症及病症之嚴重性；所採用之特定化合物之活性、所採用之特定組合物；患者之年齡、體重、一般健康狀況、性別及飲食；投藥時間、投藥途徑及所採用之特定化合物之排泄速率；治療之 持續時間；與所採用之特定化合物組合或同步使用之藥物；及醫學技術中熟知之類似因素。
在一些實施例中，RSV RNA(例如，mRNA)疫苗組合物可以足以傳遞每天按個體體重計0.0001mg/kg至100mg/kg、0.001mg/kg至0.05mg/kg、0.005mg/kg至0.05mg/kg、0.001mg/kg至0.005mg/kg、0.05mg/kg至0.5mg/kg、0.01mg/kg至50mg/kg、0.1mg/kg至40mg/kg、0.5mg/kg至30mg/kg、0.01mg/kg至10mg/kg、0.1mg/kg至10mg/kg或1mg/kg至25mg/kg之劑量水準每天、每週、每月等投與一或多次，以獲得所需之治療、診斷、預防或成像作用(參見例如，國際公開案第WO2013078199號中所述之單位劑量範圍，其全文以引用方式併入本文中)。所需劑量可按每天三次、每天兩次、每天一次、每隔一天、每三天、每週、每兩週、每三週、每四週、每2個月、每三個月、每6個月等傳遞。在某些實施例中，所需劑量可使用多次投藥來傳遞(例如，兩次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次、十一次、十二次、十三次、十四次或十四次以上投藥)。當採用多次投藥時，可使用諸如本文所述之彼等分開給藥方案。在例示性實施例中，RSV RNA(例如，mRNA)疫苗組合物可以足以傳遞0.0005mg/kg至0.01mg/kg、例如約0.0005mg/kg至約0.0075mg/kg、例如約0.0005mg/kg、約0.001mg/kg、約0.002mg/kg、約0.003mg/kg、約0.004mg/kg或約0.005mg/kg之劑量水準投與。
在一些實施例中，RSV RNA(例如，mRNA)疫苗組合物可以足以傳遞0.025mg/kg至0.250mg/kg、0.025mg/kg至0.500mg/kg、0.025mg/kg至0.750mg/kg或0.025mg/kg至1.0mg/kg之劑量水準投與一次或兩次(或兩次以上)。
在一些實施例中，RSV RNA(例如，mRNA)疫苗組合物可以0.0100mg、0.025mg、0.050mg、0.075mg、0.100mg、0.125mg、 0.150mg、0.175mg、0.200mg、0.225mg、0.250mg、0.275mg、0.300mg、0.325mg、0.350mg、0.375mg、0.400mg、0.425mg、0.450mg、0.475mg、0.500mg、0.525mg、0.550mg、0.575mg、0.600mg、0.625mg、0.650mg、0.675mg、0.700mg、0.725mg、0.750mg、0.775mg、0.800mg、0.825mg、0.850mg、0.875mg、0.900mg、0.925mg、0.950mg、0.975mg或1.0mg之總劑量或以足以傳遞該等總劑量之劑量水準投與兩次(例如，第0天及第7天、第0天及第14天、第0天及第21天、第0天及第28天、第0天及第60天、第0天及第90天、第0天及第120天、第0天及第150天、第0天及第180天、第0天及3個月後、第0天及6個月後、第0天及9個月後、第0天及12個月後、第0天及18個月後、第0天及2年後、第0天及5年後或第0天及10年後)。本發明涵蓋更高及更低之投藥劑量及頻率。舉例而言，RSV RNA(例如，mRNA)疫苗組合物可投與三次或四次。
在一些實施例中，RSV RNA(例如，mRNA)疫苗組合物可以0.010mg、0.025mg、0.100mg或0.400mg之總劑量或以足以傳遞該等總劑量之劑量水準投與兩次(例如，第0天及第7天、第0天及第14天、第0天及第21天、第0天及第28天、第0天及第60天、第0天及第90天、第0天及第120天、第0天及第150天、第0天及第180天、第0天及3個月後、第0天及6個月後、第0天及9個月後、第0天及12個月後、第0天及18個月後、第0天及2年後、第0天及5年後或第0天及10年後)。
在一些實施例中，用於對個體進行疫苗接種之方法中之RSV RNA(例如，mRNA)疫苗係以對個體進行疫苗接種之有效量向個體投與單次劑量介於10μg/kg與400μg/kg之間的核酸疫苗。在一些實施例中，用於對個體進行疫苗接種之方法中之RNA疫苗係以對個體進行疫苗接種之有效量向個體投與單次劑量介於10μg與400μg之間的核酸疫苗。在一些實施例中，用於對個體進行疫苗接種之方法中之RSV RNA(例如，mRNA)疫苗係以25至1000μg之單次劑量(例如，單次劑量之編碼RSV抗原之mRNA)向個體投與。在一些實施例中，RSV RNA疫苗係以25、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000μg之單次劑量向個體投與。舉例而言，RSV RNA疫苗可以25至100、25至500、50至100、50至500、50至1000、100至500、100至1000、250至500、250至1000或500至1000μg之單次劑量向個體投與。在一些實施例中，用於對個體進行疫苗接種之方法中之RSV RNA(例如，mRNA)疫苗係以兩次劑量向個體投與，其組合等於25至1000μg之RSV RNA(例如，mRNA)疫苗。
本文所述之RSV RNA(例如，mRNA)疫苗醫藥組合物可經調配為本文所述之劑型，諸如鼻內、氣管內或可注射(例如，靜脈內、眼內、玻璃體內、肌肉內、皮內、心臟內、腹膜內及皮下)。
RSV RNA疫苗調配物及使用方法
本發明之一些態樣提供RSV RNA(例如，mRNA)疫苗之調配物，其中RSV RNA疫苗以有效量調配以在個體中產生抗原特異性免疫反應(例如，產生對抗-RSV抗原性多肽具有特異性之抗體)。「有效量」為有效產生抗原特異性免疫反應之RSV RNA(例如，mRNA)疫苗之劑量。本文亦提供在個體中誘發抗原特異性免疫反應之方法。
在一些實施例中，抗原特異性免疫反應係藉由量測抗-RSV抗原性多肽在經投與如本文所提供之RSV RNA(例如，mRNA)疫苗之個體中產生之抗體效價來表徵。抗體效價係對個體中之抗體之量的度量，例如對特定抗原(例如，抗-RSV抗原性多肽)或抗原之抗原決定基具有特異性之抗體。抗體效價通常表述為提供正結果之最大稀釋度之倒數。酶聯免疫吸附劑檢定(ELISA)係例如用於測定抗體效價之常用檢定。
在一些實施例中，抗體效價用於評估個體是否感染或確定是否需要免疫接種。在一些實施例中，抗體效價用於確定自體免疫反應之強度、確定是否需要補強免疫接種、確定先前之疫苗是否有效及鑑別任何最近或先前之感染。根據本發明，抗體效價可用於確定由RSV RNA(例如，mRNA)疫苗在個體中誘發之免疫反應之強度。
在一些實施例中，抗-RSV抗原性多肽在個體中產生之抗體效價相對於對照物(例如，對照疫苗)而言增加至少1 log。舉例而言，抗-RSV抗原性多肽在個體中產生之抗體效價相對於對照物(例如，對照疫苗)而言可增加至少1.5、至少2、至少2.5或至少3 log。在一些實施例中，抗-RSV抗原性多肽在個體中產生之抗體效價相對於對照物(例如，對照疫苗)而言增加1、1.5、2、2.5或3 log。在一些實施例中，抗-RSV抗原性多肽在個體中產生之抗體效價相對於對照物(例如，對照疫苗)而言增加1至3 log。舉例而言，抗-RSV抗原性多肽在個體中產生之抗體效價相對於對照物(例如、對照疫苗)而言可增加1至1.5、1至2、1至2.5、1至3、1.5至2、1.5至2.5、1.5至3、2至2.5、2至3或2.5至3 log。
在一些實施例中，抗-RSV抗原性多肽在個體中產生之抗體效價相對於對照物(例如，對照疫苗)而言增加至少2倍。舉例而言，抗-RSV抗原性多肽在個體中產生之抗體效價相對於對照物(例如、對照疫苗)而言可增加至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍或至少10倍。在一些實施例中，抗-RSV抗原性多肽在個體中產生之抗體效價相對於對照物(例如，對照疫苗)而言增加2、3、4、5、6、7、8、9或10倍。在一些實施例中，抗-RSV抗原性多肽在個體中產生之抗體效價相對於對照物(例如，對照疫苗)而言增加2至10倍。舉例而言，抗-RSV抗原性多肽在個體中產生之抗體效價相對於對照物(例如，對照疫苗)而言可增加2至10、2至9、2至8、2至 7、2至6、2至5、2至4、2至3、3至10、3至9、3至8、3至7、3至6、3至5、3至4、4至10、4至9、4至8、4至7、4至6、4至5、5至10、5至9、5至8、5至7、5至6、6至10、6至9、6至8、6至7、7至10、7至9、7至8、8至10、8至9或9至10倍。
在一些實施例中，對照物為抗-RSV抗原性多肽在未經投與RSV RNA(例如，mRNA)疫苗之個體中產生之抗體效價。在一些實施例中，對照物為抗-RSV抗原性多肽在經投與活的減毒RSV疫苗之個體中產生之抗體效價。減毒疫苗為藉由降低活疫苗(活的)之致病性所產生之疫苗。減毒病毒係以使其相對於活的未經修飾病毒而言無害或低致病性之方式進行改變。在一些實施例中，對照物為抗-RSV抗原性多肽在經投與滅活之RSV疫苗之個體中產生之抗體效價。在一些實施例中，對照物為抗-RSV抗原性多肽在經投與重組或經純化之RSV蛋白疫苗之個體中產生之抗體效價。重組蛋白疫苗通常包括在異源表現系統(例如，細菌或酵母)中產生或自大量病原性有機體純化之蛋白抗原。在一些實施例中，對照物為抗-RSV抗原性多肽在經投與RSV類病毒粒子(VLP)疫苗(例如，含有病毒衣殼蛋白但缺少病毒基因組及因此無法複製/產生後代病毒之粒子)之個體中產生之抗體效價。在一些實施例中，對照物為包含融合前或融合後F蛋白或包含兩者組合之VLP RSV疫苗。
在一些實施例中，RSV RNA(例如，mRNA)疫苗之有效量為與重組RSV蛋白疫苗之護理標準劑量相比減少之劑量。如本文所提供之「護理標準」係指醫學或心理學治療準則且可為一般或特定的。「護理標準」基於在對既定病況之治療中涉及之醫學專業人員之間的科學證據及協作來指定適當治療。其為醫師/臨床醫師對於某種類型之患者、疾病或臨床情形應遵循之診斷及治療過程。如本文所提供之「護理標準劑量」係指醫師/臨床醫師或其他醫學專業人員將向個體投與 來治療或預防RSV或RSV相關病況，同時遵循用於治療或預防RSV或RSV相關病況之護理標準準則的重組或經純化之RSV蛋白疫苗或活的減毒或滅活RSV疫苗或RSV VLP疫苗之劑量。
在一些實施例中，抗-RSV抗原性多肽在經投與有效量之RSV RNA疫苗之個體中產生之抗體效價等於抗-RSV抗原性多肽在經投與護理標準劑量之重組或經純化之RSV蛋白疫苗或活的減毒或滅活RSV疫苗或RSV VLP疫苗之對照個體中產生之抗體效價。
在一些實施例中，RSV RNA(例如，mRNA)疫苗之有效量為等於比重組或經純化之RSV蛋白疫苗之護理標準劑量減少至少2倍之劑量。舉例而言，RSV RNA疫苗之有效量可為等於比重組或經純化之RSV蛋白疫苗之護理標準劑量減少至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍或至少10倍之劑量。在一些實施例中，RSV RNA疫苗之有效量為等於比重組或經純化之RSV蛋白疫苗之護理標準劑量減少至少100倍、至少500倍或至少1000倍之劑量。在一些實施例中，RSV RNA疫苗之有效量為等於比重組或經純化之RSV蛋白疫苗之護理標準劑量減少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、50倍、100倍、250倍、500倍或1000倍之劑量。在一些實施例中，抗-RSV抗原性多肽在經投與有效量之RSVRNA疫苗之個體中產生之抗體效價等於抗-RSV抗原性多肽在經投與護理標準劑量之重組或經純化之RSV蛋白疫苗或活的減毒或滅活RSV疫苗或RSV VLP疫苗之對照個體中產生之抗體效價。在一些實施例中，RSV RNA(例如，mRNA)疫苗之有效量為等於比重組或經純化之RSV蛋白疫苗之護理標準劑量減少2倍至1000倍(例如，2倍至100倍、10倍至1000倍)之劑量，其中抗-RSV抗原性多肽在個體中產生之抗體效價等於抗-RSV抗原性多肽在經投與護理標準劑量之重組或經純化之RSV蛋白疫苗或活的減毒或滅活RSV疫苗或RSV VLP疫苗之對照個 體中產生之抗體效價。
在一些實施例中，RSV RNA(例如，mRNA)疫苗之有效量為等於比重組RSV蛋白疫苗之護理標準劑量減少2至1000倍、2至900倍、2至800倍、2至700倍、2至600倍、2至500倍、2至400倍、2至300倍、2至200倍、2至100倍、2至90倍、2至80倍、2至70倍、2至60倍、2至50倍、2至40倍、2至30倍、2至20倍、2至10倍、2至9倍、2至8倍、2至7倍、2至6倍、2至5倍、2至4倍、2至3倍、3至1000倍、3至900倍、3至800倍、3至700倍、3至600倍、3至500倍、3至400倍、3至300倍、3至200倍、3至100倍、3至90倍、3至80倍、3至70倍、3至60倍、3至50倍、3至40倍、3至30倍、3至20倍、3至10倍、3至9倍、3至8倍、3至7倍、3至6倍、3至5倍、3至4倍、4至1000倍、4至900倍、4至800倍、4至700倍、4至600倍、4至500倍、4至400倍、4至300倍、4至200倍、4至100倍、4至90倍、4至80倍、4至70倍、4至60倍、4至50倍、4至40倍、4至30倍、4至20倍、4至10倍、4至9倍、4至8倍、4至7倍、4至6倍、4至5倍、4至4倍、5至1000倍、5至900倍、5至800倍、5至700倍、5至600倍、5至500倍、5至400倍、5至300倍、5至200倍、5至100倍、5至90倍、5至80倍、5至70倍、5至60倍、5至50倍、5至40倍、5至30倍、5至20倍、5至10倍、5至9倍、5至8倍、5至7倍、5至6倍、6至1000倍、6至900倍、6至800倍、6至700倍、6至600倍、6至500倍、6至400倍、6至300倍、6至200倍、6至100倍、6至90倍、6至80倍、6至70倍、6至60倍、6至50倍、6至40倍、6至30倍、6至20倍、6至10倍、6至9倍、6至8倍、6至7倍、7至1000倍、7至900倍、7至800倍、7至700倍、7至600倍、7至500倍、7至400倍、7至300倍、7至200倍、7至100倍、7至90倍、7至80倍、7至70倍、7至60倍、7至50倍、7至40倍、7至30倍、7至20倍、7至10倍、7至9倍、7至8倍、8至1000倍、8至900倍、8至800倍、8至700倍、8至600倍、8至500倍、8至400倍、8 至300倍、8至200倍、8至100倍、8至90倍、8至80倍、8至70倍、8至60倍、8至50倍、8至40倍、8至30倍、8至20倍、8至10倍、8至9倍、9至1000倍、9至900倍、9至800倍、9至700倍、9至600倍、9至500倍、9至400倍、9至300倍、9至200倍、9至100倍、9至90倍、9至80倍、9至70倍、9至60倍、9至50倍、9至40倍、9至30倍、9至20倍、9至10倍、10至1000倍、10至900倍、10至800倍、10至700倍、10至600倍、10至500倍、10至400倍、10至300倍、10至200倍、10至100倍、10至90倍、10至80倍、10至70倍、10至60倍、10至50倍、10至40倍、10至30倍、10至20倍、20至1000倍、20至900倍、20至800倍、20至700倍、20至600倍、20至500倍、20至400倍、20至300倍、20至200倍、20至100倍、20至90倍、20至80倍、20至70倍、20至60倍、20至50倍、20至40倍、20至30倍、30至1000倍、30至900倍、30至800倍、30至700倍、30至600倍、30至500倍、30至400倍、30至300倍、30至200倍、30至100倍、30至90倍、30至80倍、30至70倍、30至60倍、30至50倍、30至40倍、40至1000倍、40至900倍、40至800倍、40至700倍、40至600倍、40至500倍、40至400倍、40至300倍、40至200倍、40至100倍、40至90倍、40至80倍、40至70倍、40至60倍、40至50倍、50至1000倍、50至900倍、50至800倍、50至700倍、50至600倍、50至500倍、50至400倍、50至300倍、50至200倍、50至100倍、50至90倍、50至80倍、50至70倍、50至60倍、60至1000倍、60至900倍、60至800倍、60至700倍、60至600倍、60至500倍、60至400倍、60至300倍、60至200倍、60至100倍、60至90倍、60至80倍、60至70倍、70至1000倍、70至900倍、70至800倍、70至700倍、70至600倍、70至500倍、70至400倍、70至300倍、70至200倍、70至100倍、70至90倍、70至80倍、80至1000倍、80至900倍、80至800倍、80至700倍、80至600倍、80至500倍、80至400倍、80至300倍、80至200倍、80至 100倍、80至90倍、90至1000倍、90至900倍、90至800倍、90至700倍、90至600倍、90至500倍、90至400倍、90至300倍、90至200倍、90至100倍、100至1000倍、100至900倍、100至800倍、100至700倍、100至600倍、100至500倍、100至400倍、100至300倍、100至200倍、200至1000倍、200至900倍、200至800倍、200至700倍、200至600倍、200至500倍、200至400倍、200至300倍、300至1000倍、300至900倍、300至800倍、300至700倍、300至600倍、300至500倍、300至400倍、400至1000倍、400至900倍、400至800倍、400至700倍、400至600倍、400至500倍、500至1000倍、500至900倍、500至800倍、500至700倍、500至600倍、600至1000倍、600至900倍、600至800倍、600至700倍、700至1000倍、700至900倍、700至800倍、800至1000倍、800至900倍或900至1000倍之劑量。在一些實施例(諸如前述實施例)中，抗-RSV抗原性多肽在個體中產生之抗體效價等於抗-RSV抗原性多肽在經投與護理標準劑量之重組或經純化之RSV蛋白疫苗或活的減毒或滅活RSV疫苗或RSV VLP疫苗之對照個體中產生之抗體效價。在一些實施例中，有效量為等於(或等於至少)比重組RSV蛋白疫苗之護理標準劑量減少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、110倍、120倍、130倍、140倍、150倍、160倍、170倍、1280倍、190倍、200倍、210倍、220倍、230倍、240倍、250倍、260倍、270倍、280倍、290倍、300倍、310倍、320倍、330倍、340倍、350倍、360倍、370倍、380倍、390倍、400倍、410倍、420倍、430倍、440倍、450倍、4360倍、470倍、480倍、490倍、500倍、510倍、520倍、530倍、540倍、550倍、560倍、5760倍、580倍、590倍、600倍、610倍、620倍、630倍、640倍、650倍、660倍、670倍、680倍、690倍、700倍、710倍、720倍、730倍、740倍、750倍、760倍、770 倍、780倍、790倍、800倍、810倍、820倍、830倍、840倍、850倍、860倍、870倍、880倍、890倍、900倍、910倍、920倍、930倍、940倍、950倍、960倍、970倍、980倍、990至或1000倍之劑量。在一些實施例(諸如前述實施例)中，抗-RSV抗原性多肽在個體中產生之抗體效價等於抗-RSV抗原性多肽在經投與護理標準劑量之重組或經純化之RSV蛋白疫苗或活的減毒或滅活RSV疫苗或RSV VLP疫苗之對照個體中產生之抗體效價。
在一些實施例中，RSV RNA(例如，mRNA)疫苗之有效量為50至1000μg之總劑量。在一些實施例中，RSV RNA(例如，mRNA)疫苗之有效量為50至1000、50至900、50至800、50至700、50至600、50至500、50至400、50至300、50至200、50至100、50至90、50至80、50至70、50至60、60至1000、60至900、60至800、60至700、60至600、60至500、60至400、60至300、60至200、60至100、60至90、60至80、60至70、70至1000、70至900、70至800、70至700、70至600、70至500、70至400、70至300、70至200、70至100、70至90、70至80、80至1000、80至900、80至800、80至700、80至600、80至500、80至400、80至300、80至200、80至100、80至90、90至1000、90至900、90至800、90至700、90至600、90至500、90至400、90至300、90至200、90至100、100至1000、100至900、100至800、100至700、100至600、100至500、100至400、100至300、100至200、200至1000、200至900、200至800、200至700、200至600、200至500、200至400、200至300、300至1000、300至900、300至800、300至700、300至600、300至500、300至400、400至1000、400至900、400至800、400至700、400至600、400至500、500至1000、500至900、500至800、500至700、500至600、600至1000、600至900、600至900、600至700、700至1000、700至900、700至800、800至1000、800至900或900至 1000μg之總劑量。在一些實施例中，RSV RNA(例如，mRNA)疫苗之有效量為50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000μg之總劑量。在一些實施例中，有效量為總計兩次向個體投與之25至500μg之劑量。在一些實施例中，RSV RNA(例如，mRNA)疫苗之有效量為總計兩次向個體投與之25至500、25至400、25至300、25至200、25至100、25至50、50至500、50至400、50至300、50至200、50至100、100至500、100至400、100至300、100至200、150至500、150至400、150至300、150至200、200至500、200至400、200至300、250至500、250至400、250至300、300至500、300至400、350至500、350至400、400至500或450至500μg之劑量。在一些實施例中，RSV RNA(例如，mRNA)疫苗之有效量為總計兩次向個體投與之25、50、100、150、200、250、300、350、400、450或500μg之總劑量。
其他實施例
1.一種呼吸道融合病毒(RSV)疫苗，其包含：至少一種信使核糖核酸(mRNA)聚核苷酸，其具有5'端帽、編碼至少一種RSV抗原性多肽之開放閱讀框架及3' polyA尾。
2.如第1段之疫苗，其中該至少一種mRNA聚核苷酸由經SEQ ID NO：257標識之序列編碼。
3.如第1段之疫苗，其中該至少一種mRNA聚核苷酸由經SEQ ID NO：258標識之序列編碼。
4.如第1段之疫苗，其中該至少一種mRNA聚核苷酸由經SEQ ID NO：259標識之序列編碼。
5.如第1段之疫苗，其中該至少一種mRNA聚核苷酸包含經SEQ ID NO：278標識之序列。
6.如第1段之疫苗，其中該至少一種mRNA聚核苷酸包含經SEQ ID NO：279標識之序列。
7.如第1段之疫苗，其中該至少一種mRNA聚核苷酸包含經SEQ ID NO：280標識之序列。
8.如第1段至第7段中任一段之疫苗，其中該5'端帽為或包含7mG(5')ppp(5')NlmpNp。
9.如第1段至第8段中任一段之疫苗，其中該開放閱讀框架中100%之尿嘧啶經修飾以在尿嘧啶之5位處包括N1-甲基假尿苷。
10.如第1段至第9段中任一段之疫苗，其中該疫苗係在脂質奈米粒子中調配，該脂質奈米粒子包含：DLin-MC3-DMA；膽固醇；1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DSPC)；及聚乙二醇(PEG)2000-DMG。
11.如第10段之疫苗，其中該脂質奈米粒子進一步包含檸檬酸鈉緩衝液、蔗糖及水。
12.一種呼吸道融合病毒(RSV)疫苗，其包含：至少一種信使核糖核酸(mRNA)聚核苷酸，其具有5'端帽7mG(5')ppp(5')NlmpNp、經SEQ ID NO：278標識之序列及3' polyA尾，其中該經SEQ ID NO：278標識之序列之尿嘧啶核苷酸經修飾以在尿嘧啶核苷酸之5位處包括N1-甲基假尿苷，視情況其中該疫苗係在脂質奈米粒子中調配，該脂質奈米粒子包含DLin-MC3-DMA、膽固醇、1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DSPC)及聚乙二醇(PEG)2000-DMG。
13.一種呼吸道融合病毒(RSV)疫苗，其包含：至少一種信使核糖核酸(mRNA)聚核苷酸，其具有5'端帽7mG(5')ppp(5')NlmpNp、經SEQ ID NO：279標識之序列及3' polyA尾，其中該經SEQ ID NO：279標識之序列之尿嘧啶核苷酸經修飾以在尿嘧啶核苷酸之5位處包括N1-甲基假尿苷，視情況其中該疫苗係在脂 質奈米粒子中調配，該脂質奈米粒子包含DLin-MC3-DMA、膽固醇、1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DSPC)及聚乙二醇(PEG)2000-DMG。
14.一種呼吸道融合病毒(RSV)疫苗，其包含：至少一種信使核糖核酸(mRNA)聚核苷酸，其具有5'端帽7mG(5')ppp(5')NlmpNp、經SEQ ID NO：280標識之序列及3' polyA尾，其中該經SEQ ID NO：280標識之序列之尿嘧啶核苷酸經修飾以在尿嘧啶核苷酸之5位處包括N1-甲基假尿苷，視情況其中該疫苗係在脂質奈米粒子中調配，該脂質奈米粒子包含DLin-MC3-DMA、膽固醇、1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DSPC)及聚乙二醇(PEG)2000-DMG。
15.一種呼吸道融合病毒(RSV)疫苗，其包含：至少一種信使核糖核酸(mRNA)聚核苷酸，其具有5'端帽、編碼至少一種RSV抗原性多肽之開放閱讀框架及3' polyA尾。
16.如第15段之疫苗，其中該至少一種mRNA聚核苷酸由經SEQ ID NO：5標識之序列編碼。
17.如第15段之疫苗，其中該至少一種mRNA聚核苷酸包含經SEQ ID NO：262標識之序列。
18.如第15段之疫苗，其中該至少一種RSV抗原性多肽包含經SEQ ID NO：6標識之序列。
19.如第15段之疫苗，其中該至少一種RSV抗原性多肽包含經SEQ ID NO：290標識之序列。
20.如第15段之疫苗，其中該mRNA聚核苷酸由經SEQ ID NO：7標識之序列編碼。
21.如第15段之疫苗，其中該mRNA聚核苷酸包含經SEQ ID NO：263標識之序列。
22.如第15段之疫苗，其中該至少一種RSV抗原性多肽包含經SEQ ID NO：8標識之序列。
23.如第15段之疫苗，其中該至少一種RSV抗原性多肽包含經SEQ ID NO：291標識之序列。
24.如第15段至第23段中任一段之疫苗，其中該5'端帽為或包含7mG(5')ppp(5')NlmpNp。
25.如第15段至第24段中任一段之疫苗，其中該開放閱讀框架中100%之尿嘧啶經修飾以在尿嘧啶之5位處包括N1-甲基假尿苷。
26.如第15段至第25段中任一段之疫苗，其中該疫苗係在脂質奈米粒子中調配，該脂質奈米粒子包含：DLin-MC3-DMA；膽固醇；1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DSPC)；及聚乙二醇(PEG)2000-DMG。
27.如第26段之疫苗，其中該脂質奈米粒子進一步包含檸檬酸鈉緩衝液、蔗糖及水。
28.一種呼吸道融合病毒(RSV)疫苗，其包含：至少一種信使核糖核酸(mRNA)聚核苷酸，其具有5'端帽7mG(5')ppp(5')NlmpNp、經SEQ ID NO：262標識之序列及3' polyA尾，其中該經SEQ ID NO：262標識之序列之尿嘧啶核苷酸經修飾以在尿嘧啶核苷酸之5位處包括N1-甲基假尿苷，視情況其中該疫苗係在脂質奈米粒子中調配，該脂質奈米粒子包含DLin-MC3-DMA、膽固醇、1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DSPC)及聚乙二醇(PEG)2000-DMG。
29.一種呼吸道融合病毒(RSV)疫苗，其包含：至少一種信使核糖核酸(mRNA)聚核苷酸，其具有5'端帽7mG(5')ppp(5')NlmpNp、經SEQ ID NO：263標識之序列及3' polyA尾，其中該經SEQ ID NO：263標識之序列之尿嘧啶核苷酸經修飾以在 尿嘧啶核苷酸之5位處包括N1-甲基假尿苷，視情況其中該疫苗係在脂質奈米粒子中調配，該脂質奈米粒子包含DLin-MC3-DMA、膽固醇、1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DSPC)及聚乙二醇(PEG)2000-DMG。
本發明不限於下文描述中所述或圖式中所說明之構築詳情及組分配置。本發明能夠具有其他實施例且能夠以各種方式實踐或進行。又，本文所用之片語及術語係出於描述之目的且不應理解為限制。本文中使用「包括」、「包含」或「具有」、「含有」、「涉及」及其變化形式意欲涵蓋下文所列之項目及其等效物以及其他項目。
實例
實例1：聚核苷酸之製造
根據本發明，可利用標題為「Manufacturing Methods for Production of RNA Transcripts」之國際公開案WO2014/152027中所教示之方法來實現聚核苷酸及/或其部分或區域之製造，該案之內容以全文引用的方式併入本文中。
純化方法可包括國際申請案WO2014/152030及國際申請案WO2014/152031中所教示之彼等方法，該等案各自以全文引用的方式併入本文中。
聚核苷酸之偵測及表徵方法可如國際公開案WO2014/144039中所教示來進行，該案以全文引用的方式併入本文中。
本發明之聚核苷酸之表徵可為實現使用聚核苷酸圖譜、逆轉錄物酶測序、電荷分佈分析、偵測RNA雜質或前述兩者或兩者以上之任何組合。「表徵」包含例如測定RNA轉錄物序列、測定RNA轉錄物之純度或測定RNA轉錄物之電荷異質性。該等方法係在例如國際公開案WO2014/144711及國際公開案WO2014/144767中教示，該等案各自之內容以全文引用的方式併入本文中。
實例2：嵌合聚核苷酸合成
根據本發明，嵌合聚核苷酸之兩個區域或部分可使用三磷酸酯化學物連接或接合。100個或100個以下核苷酸之第一區域或部分係例如由5'單磷酸酯及末端3'desOH或嵌段OH化學合成而得到。若該區域長於80個核苷酸，則其可合成為用於接合之兩股。
若第一區域或部分係使用活體外轉錄(IVT)來合成為經非定位修飾之區域或部分，則隨後可轉化5'單磷酸酯，隨後對3'末端進行封端。
單磷酸酯保護基可選自此項技術中已知之彼等單磷酸酯保護基中之任一者。
嵌合聚核苷酸之第二區域或部分可使用化學合成或IVT方法來合成。IVT方法可包括可利用具有經修飾帽之引子的RNA聚合酶。或者，具有多達130個核苷酸之帽可經化學合成且與IVT區域或部分耦合。
對於接合方法而言，由DNA T4接合酶接合，繼而由DNA酶處理應易於避免串接。
整個嵌合聚核苷酸無需由磷酸酯-糖骨架來製造。若該等區域或部分之一編碼多肽，則該等區域或部分可較佳包含磷酸酯-糖骨架。
隨後使用任何已知之鍵擊化學、鄰位鍵擊化學、溶聯(solulink)或熟習此項技術者已知之其他生物結合化學方法來進行接合。
合成途徑
嵌合聚核苷酸可使用一系列起始區段來製得。該等區段包括：
(a)包含正常3'OH之經封端且受保護之5'區段(SEG.1)
(b)可包括多肽之編碼區及正常3'OH之5'三磷酸酯區段(SEG.2)
(c)用於包含蟲草素或無3'OH之嵌合聚核苷酸之3'末端(例如，尾部)之5'單磷酸酯區段(SEG.3)
在合成(化學或IVT)之後，可以蟲草素處理區段3(SEG.3)且隨後以焦磷酸酶處理以產生5'單磷酸酯。
隨後可使用RNA接合酶使區段2(SEG.2)接合至SEG.3。隨後純化所接合之聚核苷酸且以焦磷酸酶處理來裂解二磷酸酯。隨後可純化經處理之SEG.2-SEG.3構築體且使SEG.1接合至5'末端。可進行嵌合聚核苷酸之進一步純化步驟。
當嵌合聚核苷酸編碼多肽時，所接合或連接之區段可表示為：5'UTR(SEG.1)、開放閱讀框架或ORF(SEG.2)及3'UTR+PolyA(SEG.3)。
每一步驟之產率可多達90至95%。
實例3：用於cDNA產生之PCR
使用Kapa Biosystems(Woburn,MA)之2x KAPA HIFITM HotStart ReadyMix進行用於製備cDNA之PCR程序。此系統包括2x KAPA ReadyMix 12.5μl；正向引子(10μM)0.75μl；反向引子(10μM)0.75μl；模板cDNA 100ng；及稀釋至25.0μl之dH2O。反應條件可為在95℃下5分鐘。該反應可進行25個循環之98℃下20秒，隨後58℃下15秒，隨後72℃下45秒，隨後72℃下5分鐘，隨後4℃下終止反應。
根據製造商之說明，可使用Invitrogen之PURELINKTM PCR微套組(Carlsbad,CA)清理反應(至多5μg)。較大之反應可能需要使用具有較大容量之產品來清理。清理之後，可使用NANODROPTM對cDNA定量且藉由瓊脂糖凝膠電泳進行分析以確認cDNA為預期大小。隨後可提交cDNA用於測序分析，之後繼續進行活體外轉錄反應。
實例4：活體外轉錄(IVT)
活體外轉錄反應產生RNA聚核苷酸。該等聚核苷酸可包含本發明之聚核苷酸之區域或部分，包括經化學修飾之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸。經化學修飾之RNA聚核苷酸可為經均勻修飾之聚核苷酸。 活體外轉錄反應利用核苷酸三磷酸(NTP)之定製混合物。NTP可包含經化學修飾之NTP，或天然及經化學修飾之NTP之混合物，或天然NTP。
典型活體外轉錄反應包括以下：
粗IVT混合物可在4℃下儲存隔夜以供清理第二天。隨後可使用1U無RNA酶之DNA酶消化初始模板。在37℃下培育15分鐘後，根據製造商之說明，可使用Ambion之MEGACLEARTM套組(Austin,TX)純化mRNA。此套組可純化多達500μg RNA。清理之後，可使用NANODROPTM對RNA聚核苷酸定量且藉由瓊脂糖凝膠電泳進行分析以確認RNA聚核苷酸為適當大小且RNA未發生降解。
實例5：酶促封端
如下進行RNA聚核苷酸之封端，其中混合物包括：IVT RNA 60μg至180μg及dH2O至多72μl。在65℃下培育該混合物5分鐘以使RNA變性，且隨後立即轉移至冰上。
該方案隨後涉及混合10×封端緩衝液(0.5M Tris-HCl(pH 8.0)、60mM KCl、12.5mM MgCl2)(10.0μl)；20mM GTP(5.0μl)；20mM S-腺苷甲硫胺酸(2.5μl)；RNA酶抑制劑(100U)；2'-O-甲基轉移酶(400U)；牛痘封端酶(鳥苷醯基轉移酶)(40U)；dH2O(至多28μl)；及 對於60μg RNA而言在37℃下培育30分鐘或對於180μg RNA而言培育至多2小時。
根據製造商之說明，隨後可使用Ambion之MEGACLEARTM套組(Austin,TX)純化RNA聚核苷酸。清理之後，可使用NANODROPTM(ThermoFisher,Waltham,MA)對RNA定量且藉由瓊脂糖凝膠電泳進行分析以確認RNA聚核苷酸為適當大小且RNA未發生降解。RNA聚核苷酸產物亦可藉由進行逆轉錄PCR以產生用於測序之cDNA來進行測序。
實例6：Poly-A加尾反應
在cDNA中無聚胸苷酸(poly-T)之情況下，必須在清潔最終產物之前進行Poly-A加尾反應。此係藉由混合經封端之IVT RNA(100μl)；RNA酶抑制劑(20U)；10x加尾緩衝液(0.5M Tris-HCl(pH 8.0)、2.5M NaCl、100mM MgCl2)(12.0μl)；20mM ATP(6.0μl)；Poly-A聚合酶(20U)；dH2O至多123.5μl來進行且在37℃下培育30min。若polyA尾已在轉錄物中，則可跳過加尾反應且直接以Ambion之MEGACLEARTM套組(Austin,TX)(至多500μg)進行清理。Poly-A聚合酶可為在酵母中表現之重組酶。
應瞭解，polyA加尾反應之持續性或完整性可能不會總產生確切大小之polyA尾。因此，具有約40至200個核苷酸，例如約40、50、60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、150至165、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164或165個核苷酸之polyA尾係在本發明之範疇內。
實例7：封端檢定
蛋白表現檢定
可在相等濃度下將含有本文教示之任何帽之聚核苷酸(例如， mRNA)編碼多肽轉染至細胞中。可在轉染後6、12、24及/或36小時藉由ELISA檢定分泌至培養基中之蛋白量。將較高含量之蛋白分泌至培養基中之合成聚核苷酸對應於具有較高轉譯能力帽結構之合成聚核苷酸。
純度分析合成
可使用變性瓊脂糖-尿素凝膠電泳或HPLC分析比較含有本文教示之任何帽之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸編碼多肽之純度。與具有多個條帶或拖尾條帶之聚核苷酸相比，藉由電泳得到單一條帶之RNA聚核苷酸對應於較高純度產物。具有單一HPLC峰值之經化學修飾之RNA聚核苷酸亦對應於較高純度產物。具有較高效率之封端反應提供更純之聚核苷酸群體。
細胞介素分析
可在多種濃度下將含有本文教示之任何帽之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸編碼多肽轉染至細胞中。在轉染後6、12、24及/或36小時藉由ELISA檢定分泌至培養基中之促炎性細胞介素(諸如TNF-α及IFN-β)的量。使較高含量之促炎性細胞介素分泌至培養基中之RNA聚核苷酸對應於含有免疫活化帽結構之聚核苷酸。
封端反應效率
可在核酸酶處理後藉由LC-MS分析含有本文教示之任何帽之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸編碼多肽的封端反應效率。對經封端之聚核苷酸之核酸酶處理產生藉由LC-MS可偵測到之游離核苷酸與經封端之5'-5-三磷酸酯帽結構之混合物。在LC-MS譜圖上封端產物之量可表示為由反應而得之總聚核苷酸百分比且對應於封端反應效率。根據LC-MS，具有較高封端反應效率之帽結構具有較高量之封端產物。
實例8：經修飾之RNA或RT PCR產物之瓊脂糖凝膠電泳
根據製造商方案，可將個別RNA聚核苷酸(20μl體積中之200至 400ng)或經逆轉錄之PCR產物(200至400ng)加載於非變性1.2%瓊脂糖E-凝膠(Invitrogen,Carlsbad,CA)上之孔中且進行12至15分鐘。
實例9：NANODROP TM 經修飾之RNA定量及UV光譜資料
對於NANODROPTM UV吸光度讀數使用TE緩衝液(1μl)中之經化學修飾之RNA聚核苷酸以對由化學合成或活體外轉錄反應而得之每一聚核苷酸之產量進行定量。
實例10：使用類脂質調配經修飾之mRN4
可在添加至細胞之前藉由在設定比率下混合聚核苷酸與類脂質來調配RNA(例如，mRNA)聚核苷酸以用於活體外實驗。活體內調配物可需要添加額外成分以促使整個身體內之循環。為測試此等類脂質形成適於活體內作用之粒子之能力，可使用用於siRNA-類脂質調配物之標準調配過程作為起點。形成粒子後，添加聚核苷酸且允許與複合物整合。使用標準染料排除檢定測定囊封效率。
實例11：RSV RNA疫苗
RSV RNA(例如，mRNA)疫苗可包含例如至少一種由以下序列中之至少一者或由以下序列之至少一個片段或由其衍生物及變異體編碼之RNA聚核苷酸。RSV RNA疫苗可包含例如至少一種具有至少一個化學修飾之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸，例如RSV疫苗可包含例如至少一種由以下(DNA)序列中之至少一者或由以下序列之至少一個片段或由其衍生物或變異體編碼之經化學修飾之RNA(例如，mRNA)聚核苷酸：
RSV#1
(SEQ ID NO：1)
RSV#2
(SEQ ID NO：2)
RSV疫苗可包含例如至少一種RNA(例如，mRNA)聚核苷酸，其具有編碼以下抗原性多肽序列中之至少一者或以下序列之至少一個片段之開放閱讀框架：
RSV#1
(SEQ ID NO：3)
下劃線區域表示信號肽序列。下劃線區域可經達成相同或類似功能之替代序列取代，或其可經刪除。
RSV#2
(SEQ ID NO：4)
下劃線區域表示信號肽序列。下劃線區域可經達成相同或類似功能之替代序列取代，或其可經刪除。
實例12：小鼠免疫原性
在此實例中，進行檢定以評估與蛋白抗原相比對使用mRNA/LNP平臺傳遞之RSV疫苗抗原之免疫反應。
向雌性Balb/c(CRL)小鼠(6至8週齡；N=每組10隻小鼠)投與RSV mRNA疫苗或蛋白疫苗。產生mRNA疫苗且在MC3脂質奈米粒子中調配。此研究中所評估之mRNA疫苗包括：
MRK-1膜結合RSV F蛋白
MRK-4膜結合DS-CAV1(穩定化之融合前F蛋白)
MRK-5 RSV F構築體
MRK-6 RSV F構築體
MRK-7 RSV F構築體
MRK8 RSV F構築體
MRK9膜結合RSV G蛋白
MRK11截短RSV F蛋白(僅胞外結構域)；經修飾以包括Ig分泌物肽信號序列之構築體
MRK12 DS-CAV1(非膜結合形式)；經修飾以包括Ig分泌物肽信號序列
經修飾以包括Ig分泌物肽信號序列之MRK13：MRK-5構築體
經修飾以包括Ig分泌物肽信號序列之MRK14：MRK-6構築體
經修飾以包括Ig分泌物肽信號序列之MRK16：MRK-8構築體
下文列出編碼上文所提及之12種mRNA之DNA序列及相關胺基酸序列。
MRK-1膜結合RSV F蛋白/MRK_01_F(全長，Merck A2菌株)/SQ-030268： (SEQ ID NO：5)
(SEQ ID NO：6)
下劃線區域表示信號肽序列。下劃線區域可經達成相同或類似功能之替代序列取代，或可經刪除，如下文所示。
(SEQ ID NO：290)
MRK-4膜結合DS-CAV1(穩定化之融合前F蛋白)/MRK_04_融合前F/DS-CAV1(全長，S155C/S290C/S190F/V207L)/SQ-030271： (SEQ ID NO：7)
(SEQ ID NO：8)
下劃線區域表示信號肽序列。下劃線區域可經達成相同或類似功能之替代序列取代，或可經刪除，如下文所示。
(SEQ ID NO：291)
MRK-5 RSV F構築體： (SEQ ID NO：9)
(SEQ ID NO：10)
下劃線區域表示信號肽序列。下劃線區域可經達成相同或類似功能之替代序列取代，或其可經刪除，如下文所示。
(SEQ ID NO：292)
MRK-6 RSV F構築體： (SEQ ID NO：11)
下劃線區域表示編碼摺疊子之序列。下劃線區域可經達成相同或類似功能之替代序列取代，或可經刪除。
(SEQ ID NO：12)
第一下劃線區域表示信號肽序列。第一下劃線區域可經達成相同或類似功能之替代序列取代，或可經刪除，如下文所示。第二下劃線區域表示摺疊子。第二下劃線區域可經達成相同或類似功能之替代序列取代。
(SEQ ID NO：293)
MRK-7 RSV F構築體： (SEQ ID NO：13)
(SEQ ID NO：14)
下劃線區域表示信號肽序列。下劃線區域可經達成相同或類似功能之替代序列取代，或可經刪除，如下文所示。
(SEQ ID NO：294)
MRK8 RSV F構築體： (SEQ ID NO：15)
下劃線區域表示編碼GCN4之區域。下劃線區域可經達成相同或類似功能之替代序列取代。
(SEQ ID NO：16)
第一下劃線區域表示信號肽序列。下劃線區域可經達成相同或類似功能之替代序列取代，或可經刪除，如下文所示。第二下劃線區域表示GCN4。下劃線區域可經達成相同或類似功能之替代序列取代，或可經刪除。
(SEQ ID NO：295)
MRK9膜結合RSV G蛋白： (SEQ ID NO：17)
下劃線區域表示編碼跨膜結構域之區域。下劃線區域可經達成相同或類似功能之替代序列取代，或可經刪除。
(SEQ ID NO：18)
下劃線區域表示跨膜結構域。下劃線區域可經達成相同或類似功能之替代序列取代。
MRK11截短RSV F蛋白(僅胞外結構域)；經修飾以包括Ig分泌物肽信號序列之構築體： (SEQ ID NO：19)
第一下劃線區域表示編碼人類Igκ信號肽之區域，第二下劃線區域表示編碼摺疊子之區域。下劃線區域可經達成相同或類似功能之替代序列取代，或可經刪除。
(SEQ ID NO：20)
第一下劃線區域表示人類Igκ信號肽，第二下劃線區域表示摺疊子。下劃線區域可經達成相同或類似功能之替代序列取代，或可經刪除，如下文所示。
(SEQ ID NO：296)
MRK12 DS-CAV1(非膜結合形式)；經修飾以包括Ig分泌物肽信號序列： (SEQ ID NO：21)
第一下劃線區域表示編碼人類Igκ信號肽之區域，第二下劃線區域表示編碼摺疊子之區域。下劃線區域可經達成相同或類似功能之替代序列取代，或可經刪除。
(SEQ ID NO：22)
第一下劃線區域表示人類Igκ信號肽，第二下劃線區域表示摺疊子。下劃線區域可經達成相同或類似功能之替代序列取代，或可經刪除，如下文所示。
(SEQ ID NO：297)
MRK13 MRK-5經修飾以包括Ig分泌物肽信號序列之構築體： (SEQ ID NO：23)
下劃線區域表示編碼人類Igκ信號肽之區域。下劃線區域可經達成相同或類似功能之替代序列取代，或可經刪除。
(SEQ ID NO：24)
下劃線區域表示人類Igκ信號肽。下劃線區域可經達成相同或類似功能之替代序列取代，或可經刪除，如下文所示。
(SEQ ID NO：298)
MRK14 MRK-6經修飾以包括Ig分泌物肽信號序列之構築體： (SEQ ID NO：25)
第一下劃線區域表示編碼人類Igκ信號肽之區域，第二下劃線區域表示編碼摺疊子之區域。下劃線區域可經達成相同或類似功能之替代序列取代，或可經刪除。
(SEQ ID NO：26)
第一下劃線區域表示人類Igκ信號肽，第二下劃線區域表示摺疊子。下劃線區域可經達成相同或類似功能之替代序列取代，或可經刪除，如下文所示。
(SEQ ID NO：299)
經修飾以包括Ig分泌物肽信號序列之MRK16 MRK-8構築體： (SEQ ID NO：27)
第一下劃線區域表示編碼人類Igκ信號肽之區域，第二下劃線區域表示編碼GCN4之區域。下劃線區域可經達成相同或類似功能之替代序列取代，或可經刪除。
(SEQ ID NO：28)
第一下劃線區域表示人類Igκ信號肽，第二下劃線區域表示GCN4。下劃線區域可經達成相同或類似功能之替代序列取代，或可經刪除，如下文所示。
(SEQ ID NO：300)。
如McLellan等人Science 342,592(2013)中所述，此研究中所評估之蛋白疫苗為DS-CAV1穩定化之融合前F蛋白(1mg/mL)。將該蛋白在50mM Hepes、300mM NaCl中進行緩衝且用Adju-phos調配。
簡言之，用以下疫苗對各組之10隻小鼠經肌肉內進行免疫接種：
在實驗之第0天及第21天對動物進行免疫接種。在第14及35天，自每一動物抽血且將血用於血清學檢定。在第42及49天，處死一小組動物且收穫脾臟以支持ELISPOT及細胞內細胞介素染色研究。
A.RSV中和檢定：
匯集來自每一組之小鼠血清且使用以下程序對RSV-A(Long菌株)之中和進行評估：
1.藉由置於設定為56℃之乾式恆溫箱中30分鐘來對所有血清樣品進行熱滅活。隨後將樣品及對照血清以1：3稀釋於病毒稀釋劑(含2% FBS之EMEM)中且將重複樣品添加至檢定培養盤中並進行連續稀釋。
2.自冰箱移出RSV-Long病毒儲備液且在37℃水浴中快速解凍。在病毒稀釋劑中將病毒稀釋至2000pfu/mL
3.將經稀釋之病毒添加至96孔培養盤之每一孔中，除了一個管柱之細胞。
4.用胰蛋白酶處理HEp-2細胞，洗滌，以1.5×105個細胞/ml再懸浮於病毒稀釋劑，且將100mL經懸浮之細胞添加至96孔培養盤之每一孔中。隨後在37℃、5% CO2下將培養盤培育72小時。
5.培育72小時之後，用PBS洗滌細胞，且在16至24℃下使用溶解於PBS中之80%丙酮固定10至20分鐘。移除固定劑且使培養盤風乾。
6.隨後用PBS+0.05% Tween徹底洗滌培養盤。將偵測單株抗體143-F3-1B8及34C9稀釋至2.5，隨後用PBS+0.05%徹底洗滌培養盤。隨後用PBS+0。徹底洗滌50個培養盤之96孔培養盤之孔。隨後在16至24℃下將培養盤在濕度箱中在振盪器上培育60至75分鐘
7.培育之後，徹底洗滌培養盤。
8.將經生物素標記之馬抗-小鼠IgG以1：200稀釋於檢定稀釋劑中且添加至96孔培養盤之每一孔中。如上文培育培養盤並洗滌。
9.在檢定稀釋劑中製備IRDye 800CW抗生物素蛋白鏈菌素(1：1000最終稀釋液)、Sapphire 700(1：1000稀釋液)及5mM DRAQ5溶液(1：10,000稀釋液)之混合物且將50mL混合物添加至96孔培養盤之每一孔中。如上文在黑暗中培育培養盤，洗滌，且使其風乾。
10.隨後使用Aerius Imager讀取培養盤。隨後在Graphpad Prism中使用4參數曲線擬合計算血清中和效價。
在圖1中展示劑量1後(PD1)及劑量2後(PD2)所量測之用於小鼠免疫原性研究之血清中和抗體效價。下文亦以表格形式提供PD2血清中和抗體效價：
結果指示中和抗體效價為穩健的且mRNA疫苗中之若干個種(包括RSV mF疫苗及RSVmDS-CAV1 mRNA疫苗)引發比DS-CAV1蛋白/adjuv-phos疫苗高之中和抗體效價。
B.用於細胞免疫反應之檢定：
小鼠IFN-γ ELISPOT檢定程序
I.製備脾細胞：
將脾臟置於60-mm組織培養皿中且用注射器手柄上下觸摸以移除細胞。隨後將切碎之脾臟轉移至15-mL試管中，在1200rpm下離心10min，再懸浮於氯化銨鉀(ACK)細胞溶解緩衝液中且在室溫下培育5分鐘。將R10培養基添加至試管且在1200rpm下將細胞離心10分鐘，且隨後用R10培養基再洗滌一次。第二次離心之後，將細胞再懸浮於10mL R10培養基中且經由70μm耐綸細胞濾網過濾至50mL離心管中。用另外10mL培養基沖洗濾網且將此添加至細胞中。在血球計數器上對細胞計數且在各組之間對細胞濃度進行標準化。
II.ELISPOT檢定：
1)用以10μg/ml PBS在Bio-Hood(1：100稀釋液)中之MABTECH經純化之抗-小鼠IFN-γ、純系AN18塗佈96孔MultiScreen-IP無菌白色過濾板且在4℃下培育隔夜
2)第二天早晨，用無菌PBS洗滌培養盤且在37℃下用R10培養基阻斷4小時。
3)將脾細胞以4×105個細胞/孔添加至培養盤中，且對於RSV-F及RSV-G用肽匯集物刺激細胞。肽匯集物如下。
對於RSV-F：
對於RSV-G：
4)在37℃、5% CO2下將培養盤培育20至24小時。
5)第二天，徹底洗滌培養盤且將100μL/孔MABTECH偵測抗體即純系R4-6A2添加至每一孔中達在PSB/1% FBS(1：4000稀釋液)中之0.25μg/ml。將培養盤培育2小時且隨後用PBS/0.05% Tween 20徹底洗滌
6)將抗生物素蛋白鏈菌素-AP以1：3000稀釋於PSB/1% FBS中且對各孔均添加100μL。
7)在室溫下將培養盤培育60min且用PBS/Tween 20(0.05%)徹底洗滌。
8)將100μl 1-步驟NBT/BCIP添加至每一孔中，在室溫下將培養盤保持若干分鐘，用自來水洗滌，且使其乾燥隔夜。
9)使用AID成像儀系統使培養盤成像且處理資料以計算每百萬個脾細胞中IFN-γ分泌細胞之數目。
資料顯示RNA/LNP疫苗產生與用明礬調配之蛋白抗原相比高得多之細胞免疫反應，該蛋白抗原引發極少至無可偵測到之細胞免疫反應。參見圖2，其中具有*之管柱指示各組干擾素γ之數目過高以至於無法精確計數。
III.細胞內細胞介素染色：
如上文所述收穫脾細胞。在R10培養基中以每毫升1×107個細胞使剛剛收穫之脾細胞靜置隔夜。第二天早晨，根據培養盤模板，對於1×106個細胞/孔之最終數目，將100μL細胞添加至每一孔中。使用匯集之RSV-F或RSV-G肽刺激細胞。RSV-F肽匯集物如上文所述。RSV-G肽匯集物如上文所述或購自JPT(目錄PM-RSV-MSG)。在37℃下將細胞培育1小時，且將BFA及莫能菌素添加至每一孔中達各自5μg之最終濃度。
為了使細胞染色，將20μL 20mM EDTA添加至每一細胞孔中，且在室溫(RT)下將細胞培育15分鐘。在500xg下將培養盤離心5分鐘且吸出上清液。隨後用PBS洗滌培養盤且再次離心。用DMSO復原ViVidye且稀釋於PBS中。將125μL經稀釋之ViVidye添加至每一孔中且在室溫下培育15分鐘。將培養盤離心，移除上清液且用175μL FACSWash再次洗滌培養盤。將BD cytofix/cytoperm溶液添加至每一孔中，且在2至8℃下將培養盤培育20至25分鐘。隨後將培養盤離心並用BD perm wash緩衝液洗滌兩次。最後，以每孔125mL之體積添加FC block至在BD perm wash緩衝液中0.01mg/mL之最終濃度。用如下製得之細胞內抗體混合物使細胞染色：a)IL-10 FITC：b)IL-17A PE：c)IL-2 PCF594：d)CD4 PerCPcy5.5： e)TNF PE Cy7：f)IFNg APC：g)CD8a BV510：h)CD3 APC Cy7：i)Perm Wash：在2至8℃下將細胞與抗體混合物(每測試孔20uL)一起培育35分鐘，用BD perm wash緩衝液洗滌兩次，且再懸浮於每孔200μL BD穩定化固定劑。在LSRII上獲得樣品且使用Flojo軟體分析資料。對肽匯集物產生反應且產生Ifn-γ、IL-2或TNFα之CD4+脾細胞百分比展示於圖3A、3B及3C中且對肽匯集物產生反應且產生Ifn-γ、IL-2或TNFα之CD8+脾細胞百分比展示於圖4A、4B及4C中。資料為RSV-F mRNA/LNP疫苗及RSV-G mRNA/LNP疫苗而非DS-CAV1蛋白抗原在小鼠中引發穩健之Th1偏向性CD4+免疫反應。另外，RSV-F mRNA/LNP疫苗而非RSV-G mRNA/LNP疫苗或DS-CAV1蛋白抗原在小鼠中引發穩健之Th1偏向性CD8+免疫反應。
實例13：小鼠免疫原性
在此實例中，進行其他檢定以評估與蛋白抗原相比對使用mRNA/LNP平臺傳遞之RSV疫苗抗原之免疫反應。
此外，向雌性Balb/c(CRL)小鼠(6至8週齡；N=每組10隻小鼠)投與mRNA疫苗或蛋白疫苗。產生mRNA疫苗且在MC3脂質奈米粒子中調配。此研究中所評估之mRNA疫苗包括以下：
MRK-1膜結合RSV F蛋白
MRK-2分泌RSV F蛋白
MRK-3分泌DS-CAV1
MRK-4膜結合DS-CAV1(穩定化之融合前F蛋白)
MRK-5 RSV F構築體
MRK-7 RSV F構築體
MRK8 RSV F構築體
MRK9膜結合RSV G蛋白
流感病毒M1
下文列出編碼用於MRK-2、MRK-3及流感病毒M1之mRNA序列之DNA序列。亦展示相應胺基酸序列。本文別處提供所有其他序列。
MRK-2非膜結合形式RSV F蛋白/MRK_02_F(可溶性，Merck A2菌株)/
(SEQ ID NO：242)下劃線區域表示編碼摺疊子之區域。下劃線區域可經達成相同或類似功能之替代序列取代。
(SEQ ID NO：243)
第一下劃線區域表示信號肽序列。第一下劃線區域可經達成相同或類似功能之替代序列取代，或其可經刪除。第二下劃線區域表示摺疊子。第二下劃線區域可經達成相同或類似功能之替代序列取代。
MRK-3非膜結合形式DS-CAV1(穩定化之融合前F蛋白)//MRK_03_DS-CAV1(可溶性，S155C/S290C/S190F/V207L)/SQ-030271： (SEQ ID NO：244)
下劃線區域表示編碼摺疊子之區域。下劃線區域可經達成相同或類似功能之替代序列取代。
(SEQ ID NO：245)
第一下劃線區域表示信號肽序列。第一下劃線區域可經達成相同或類似功能之替代序列取代，或其可經刪除。第二下劃線區域表示摺疊子。第二下劃線區域可經達成相同或類似功能之替代序列取代。
流感病毒M-1(A/加利福尼亞/04/2009(H1N1)，ACP44152)+hIgκ
(SEQ ID NO：246)
下劃線區域表示編碼人類Igκ信號肽之區域。下劃線區域可經達成相同或類似功能之替代序列取代。
(SEQ ID NO：247)
下劃線區域表示人類Igκ信號肽。下劃線區域可經達成相同或類似功能之替代序列取代。
將流感病毒M1 mRNA與MRK-1、MRK-4或MRK-9組合，以努力藉由使攝取mRNA之細胞製造類病毒粒子(VLP)來增加免疫反應。
此研究中所評估之蛋白疫苗為如McLellan等人Science 342,592(2013)中所述之DS-CAV1穩定化之融合前F蛋白；1mg/mL。將該蛋白在50mM Hepes、300mM NaCl中進行緩衝且用Adju-phos調配。
用100μL疫苗對100組(每組10隻)小鼠經肌肉內進行免疫接種，以50μL注射液傳遞至每一四頭肌中。用以下疫苗對各組進行疫苗接種：
在實驗之第0天及第21天對動物進行免疫接種。在第14及35天，自每一動物抽血且將血用於血清學檢定。在第42天，處死一小組動物且收穫脾臟以支持ELISPOT及細胞內細胞介素染色研究。
在第27天，以1×106PFU RSV A2對小鼠經鼻內進行攻毒。接種後四天，藉由CO2吸入處死動物且移出肺及鼻甲並在濕冰上在10體積之含有SPG之漢氏平衡鹽溶液(Hanks Balanced Salt Solution)(Lonza)中進行勻漿化。藉由在2000rpm下離心10分鐘來使樣品澄清，將試樣等分，速凍，且立即在-70℃下冷凍儲存。
A.RSV中和檢定：
如上文所述測定中和抗體效價。該等效價展示於圖5中(PD1=劑量1後取得之樣品，PD2=劑量2後取得之樣品)。如先前實驗中所證明，結果顯示mRNA/LNP疫苗具有強免疫原性且引發高中和抗體效價。對藉由將表現流感病毒M1之mRNA與表現膜結合蛋白抗原之mRNA共傳遞來產生顯著較高之中和抗體之嘗試並未成功。
B.細胞內細胞介素染色。
以上文實例13中所述之相同方式進行細胞內細胞介素染色。對RSV-F及G肽匯集物之CD4 ICS反應展示於圖6A、6B及6C中。如先前 研究中，ICS結果顯示表現RSV-F及RSV-G之mRNA疫苗引發穩健之Th1-偏向性CD4免疫反應。
CD8 ICS反應展示於圖7A、7B及7C中。資料證實了先前的觀察結果，即表現RSV-F抗原之mRNA而非表現RSV-G之mRNA或DS-CAV1蛋白/adju phos引發穩健之Th1偏向性CD8反應。
C.小鼠攻毒結果
下文概述用於量測病毒效價之程序。簡言之，將樣品稀釋且一式兩份添加至含有匯合HEp-2細胞單層之24孔培養盤。在37℃下將培養盤培育一小時。培育一小時之後，吸出樣品接種物且添加1ml含有0.75%甲基纖維素之覆蓋層。在37℃下將培養盤培育5天。培育5天之後，將細胞固定且用結晶紫/戊二醛溶液進行染色。對溶菌斑進行計數且效價表示為pfu/公克組織。如圖8中所示，自經與MC3 LNP一起調配之mRNA疫苗免疫接種之任何小鼠的肺部未發現病毒且在較低劑量之DS-CAV1蛋白/adju phos疫苗下僅一隻動物在鼻部具有可偵測到之任何病毒。
實例14：棉鼠免疫原性及功效
在此實例中，進行檢定以測試mRNA/LNP疫苗在棉鼠RSV攻毒模型中之免疫原性及功效。
更具體而言，使用雌性棉鼠(SAGE)且在3至7週齡時開始免疫接種。產生所用之mRNA疫苗且在MC3脂質奈米粒子中調配。此研究中所評估之mRNA疫苗包括：
MRK-1膜結合RSV F蛋白
MRK-2分泌RSV F蛋白(截短胞外結構域)
MRK-3分泌DS-CAV1(三聚胞外結構域)
MRK-4膜結合DS-CAV1(穩定化之融合前F蛋白)
MRK9膜結合RSV G蛋白
流感病毒M1蛋白
此研究中所評估之蛋白疫苗為如McLellan等人Science 342,592(2013)中所述之DS-CAV1穩定化之融合前F蛋白；1mg/mL。將蛋白在50mM Hepes、300mM NaCl中進行緩衝且用Adju-phos調配。
用120μL疫苗對各組之10隻棉鼠經肌肉內進行免疫接種，以60μL注射液傳遞至每一四頭肌中。用以下如表2中所示之疫苗對各組進行疫苗接種：
在實驗之第0天及第28天對動物進行免疫接種。在第28及56天，自每一動物抽血且用於血清學檢定。在第56天，以1×105.5PFU RSV A2對棉鼠經鼻內進行攻毒。接種後四天，藉由CO2吸入處死動物且移出肺(左葉)及鼻甲並在濕冰上在10體積之含有SPG之漢氏平衡鹽溶液(Lonza)中進行勻漿化。藉由在2000rpm下離心10分鐘使樣品澄清，將試樣等分，速凍，且立即在-70℃下冷凍儲存。
A.RSV中和檢定
如上文所述來測定中和抗體效價。
劑量1後及劑量2後所測定之效價展示於圖9中。在單次免疫接種 後中和效價在棉鼠中為穩健的且總體比藉由用adju-phos調配之DS-CAV1蛋白抗原引發之彼等效價高若干倍或經RSV A2病毒感染。最高中和抗體效價係藉由表現全長RSV-F蛋白、截短F-蛋白(胞外結構域)、mDS-CAV1(含有RSV F跨膜結構域之穩定化之融合前F蛋白)及sDS-CAV1(穩定化之融合前F蛋白之截短形式)之RNA疫苗以及包括全長F蛋白及流感病毒M1(在上文圖表中稱為「VLP/mF」)之mRNA組合引發。
劑量二後所測定之效價指示，總體而言，對於mRNA疫苗及DS-CAV1蛋白比較物而言中和抗體效價相當高。令人驚訝地，在此研究中，如在兩項小鼠免疫原性研究中，在第二劑量之疫苗後對於mG及mG+流感病毒M1 mRNA疫苗組觀察到相對高之中和抗體效價。在用於傳遞RSV-G抗原之其他疫苗形態情況下，據報告除非檢定中包括補充物，否則活體外未觀察到中和抗體活性。
B.競爭ELISA
表徵對用於中和抗體之RSV F-蛋白上之特異性抗原決定基的免疫反應。抗原性位點II為用於帕利珠單抗之結合位點，帕利珠單抗係一種經研發用於在處於風險中之嬰兒及幼兒中預防下呼吸道RSV感染之單株抗體。抗原性位點為用於藉由天然RSV感染引發之更有效力之中和抗體的結合位點。發展競爭ELISA來表徵對各種基於mRNA之疫苗之抗原性位點及抗原性位點II反應。
方法
用融合前F蛋白或融合後F蛋白塗佈ELISA培養盤(McLellan等人，2013)。塗佈後，洗滌培養盤且用阻斷緩衝液(PBST/3%脫脂奶粉)阻斷。隨後用阻斷緩衝液稀釋來自棉鼠攻毒研究之測試血清且在ELISA培養盤中滴定。將經生物素標記之D25(結合至抗原性位點之單株抗體)或經生物素標記之帕利珠單抗(結合至抗原性位點II之單株抗體)稀 釋於阻斷緩衝液中且添加至ELISA培養盤之每一孔中(僅將經生物素標記之D25用於塗有融合前F蛋白之培養盤；可將經生物素標記之帕利珠單抗用於塗有融合前或融合後F蛋白之培養盤，因為抗原性位點II存在於兩種形式之抗原上)。培育之後，洗滌培養盤且將抗生物素蛋白鏈菌素標記之馬蘿蔔過氧化酶添加至ELISA培養盤之每一孔中。在室溫下將培養盤培育1小時，洗滌，且與TMB受質(ThermoScientific)一起培育。使顏色顯影10分鐘且隨後用100μL 2N硫酸淬滅並在微量盤讀取器上在450nM下讀取培養盤。結果展示於圖10中。圖10說明棉鼠血清與結合至融合前F蛋白之D25或結合至融合後F蛋白之帕利珠單抗競爭之能力。
在未處理小鼠中及在經mG或經VLP/mG(其均不會表現由D25或帕利珠單抗結合之抗原決定基)免疫接種之彼等小鼠中可見背景結合效價。在實驗中包括未標記之單株抗體作為陽性對照物且彼等資料展示於圖10之右欄中。在經MRK01、MRK02、MRK09、MRK10+MRK01或MRK10+MRK9免疫接種之棉鼠中明顯無D25競爭性效價。僅使用編碼DS-CAV1序列(MRK04、MRK03及MRK10+MRK04)之mRNA進行免疫接種引發D25競爭性抗體效價，說明此等mRNA產生主要呈融合前構型之形式之RSV F蛋白。相比之下，帕利珠單抗競爭性效價在經MRK01或MKR02 mRNA免疫接種之動物中遠遠高得多，說明此等mRNA在棉鼠中以融合後RSV F蛋白產生。
C.棉鼠攻毒結果
如上文對於小鼠所述遵循用於在棉鼠鼻部量測RSV效價之程序。鼻部效價展示於圖11中。在此檢定中，偵測極限為40pfu/公克組織。發現僅一隻接種疫苗之動物(一隻經與MC3 LNP一起囊封之mDS-CAV1(MRK4)mRNA進行疫苗接種之小鼠)在鼻部存在可偵測到之任何病毒。相比之下，RSV A2病毒在未接種疫苗但在同一研究中進行 攻毒之動物中之幾何平均效價為>10,000pfu/公克組織。
實例15：非洲綠猴免疫原性及功效
在此實例中，進行檢定以測試mRNA/LNP疫苗在非洲綠猴RSV攻毒模型中之免疫原性及功效。
更具體而言，使用體重在1.3至3.75kg範圍內之雄性及雌性成年非洲綠猴，藉由中和抗體效價證實其呈RSV陰性。產生所用之mRNA疫苗且在MC3脂質奈米粒子中調配。此研究中所評估之mRNA疫苗包括：
MRK01膜結合RSV F蛋白
MRK04膜結合DS-Cav1(穩定化之融合前F蛋白)
用1000μL疫苗對各組之四隻非洲綠猴經肌肉內進行免疫接種，以500μL注射液傳遞至每一三角肌中。用以下如表3中所示之疫苗對各組進行疫苗接種。
在實驗之第0天、第28天及第56天對動物進行免疫接種。在第0、14、28、42、56及70天，自每一動物抽血且用於血清學檢定。在第70天，用1×105.5PFU RSV A2對非洲綠猴經鼻內進行攻毒。在第1至12、14天及在攻毒後第18天收集鼻咽部拭子，且在攻毒後第3、5、7、9、12、14及18天收集肺灌洗樣品以測試病毒複製。
A.RSV中和檢定
如上文所述測定中和抗體效價(NT50)。在劑量1後及劑量2後所測定之NT50效價展示於圖12中。對於接受mRNA疫苗之兩組以及接受RSV A2之組而言可見效價在每一劑量後增加。在第10週(劑量3後2週)使用mRNA疫苗獲得之GMT比接受RSV A2之動物高2個以上數量級。
B.競爭ELISA
使用上文所述之競爭檢定表徵對用於中和抗體之RSV F-蛋白上之特異性抗原決定基的免疫反應。
在第10週(PD3 2週)量測之帕利珠單抗及D25競爭性抗體效價呈現於圖13A至13B中。GMT帕利珠單抗競爭性效價在接受mF或mF+mDS-Cav1組合之組中與接受mDS-Cav1之組相比高5倍。而GMT D25競爭性抗體效價在接受mDS-Cav1或mF+mDS-Cav1組合之組中比在接受mF mRNA之組中高2倍。融合前F穩定化之抗原(mDS-Cav1)能夠引發融合前特異性反應。
C.非洲綠猴攻毒結果
如上文所提及，為了評估疫苗功效，在疫苗接種後第70天以1×105.5PFU RSV A2對非洲綠猴經鼻內進行攻毒且在攻毒後收集鼻咽部拭子及肺灌洗樣品以測試病毒之存在。
為了量測在非洲綠猴鼻咽部拭子及肺灌洗樣品中之RSV效價，如下進行用以偵測RSV A之RSV RT-qPCR檢定：
1)設備及材料：
A.設備
1.Stratagene Mx3005P實時PCR系統及MxPro軟體
2.Jouan GR422離心機或等效物
3.Jouan培養盤承載物或等效物
B.試劑
1.Quantitect®探針Rt-PCR套組(1000)，目錄# 204445
2.水，分子生物學級，無DNA酶及無蛋白酶，5級優質，目錄# 2900136
3.TE緩衝液，10mM Tris，1mM EDTA ph 8.0，Fisher Bioreagents，目錄# BP2473-100
4.病毒引子：RSV A正向及反向引子，Sigma定製，經HPLC純化。在分子級水中將引子儲備液復原至100μM且在-20℃下儲存。
5.RSV雙標記探針，Sigma定製，經HPLC純化。在TE緩衝液中將探針儲備液復原至100μM且在-20℃下避光儲存。
6.在內部產生RSV A標準物且在-20℃下儲存。藉由對RSV A之N基因設計引子對來產生用於檢定之標準物。RSV A標準物之產物長度為885bp。使用QIAGEN OneStep RT-PCR產生此標準物。
7.Promega，Maxwell® 16病毒總核酸純化套組(產品#AS1150)
C.補充物
1.Stratagene Optical 8連管蓋，目錄# 401425
2.Stratagene Mx3000P 96孔培養盤，有襯邊，目錄# 401334
3.ART過濾型吸管尖
2)RT-PCR反應及設置
A.製備完全主體混合物
1.遵循以下用於50μL最終反應體積之設置製備完全主體混合物。下表為每孔體積。最終引子濃度為300nM且最終探針濃度為200nM。
2.將45μL完全主體混合物添加至每一孔中。將培養盤蓋覆蓋培養盤且以鋁箔包裹以避光。
B.製備標準曲線
1.自-20℃移出標準物。
2.使用10倍稀釋液將標準物稀釋至1×106個複本/5μL至1個複本/5μL之最終濃度。
C.樣品製備
1.製備鼻咽部拭子及肺灌洗樣品以用於使用Maxwell® 16病毒總核酸純化套組(Promega，產品#AS1150)進行RT-PCR反應
2.遵循製造商之方案萃取200μL樣品且溶離至50μL中以用於PCR反應。
D.添加樣品
1.將5μL經萃取之樣品添加至適當孔中。添加樣品之後，在添加標準曲線之前小心地對樣品孔加蓋。
2.將5μL經稀釋之標準物添加至適當孔中並加蓋。
3.將5μL分子級水添加至無模板對照(NTC)孔。
4.以鋁箔包裹培養盤且將培養盤轉移至離心機中。
5.在100rpm下將培養盤離心2min以拉下可能位於孔側面之任何樣品或主體混合物。
6.以鋁箔包裹培養盤且轉移至Stratagene儀器中。
E.熱循環儀：Stratagene MX 3005P
1.將培養盤置於Stratagene Mx3005P且設置熱概況條件：
2.使用Stratagene Mx3005p軟體分析結果
在肺部及鼻部樣品中所偵測到之平均RNA複本數呈現於圖14A至14B中。類似於經RSV A2免疫接種之對照組，接受在MC3中調配之編碼mF、mDS-Cav1或mF+mDS-Cav1之mRNA的動物在肺部顯示得到完全保護(未偵測到病毒)。接受mRNA疫苗之動物亦顯示在大部分檢定日在鼻部所偵測到之病毒與無疫苗對照組相比減少2 log以上。
實例16：在經歷過RSV之非洲綠猴中之免疫原性
在經歷過RSV之非洲綠猴中測試在MC3 LNP中調配之mRNA疫苗之免疫原性。
選擇藉由ELISA及中和抗體效價證實為RSV血清陽性、重量超過1.3kg之任意性別之健康成年非洲綠猴(每組n=5)來用於研究。選擇用於此研究之動物集合已在先前疫苗研究中以實驗方式感染RSV且基於 其預先研究RSV中和效價而分佈在研究組中，以使得所有組均將在研究開始時具有類似組GMT。經歷過RSV之動物提供對疫苗接種之免疫記憶回憶反應模型，其可反映可在血清陽性人類成年人中預測到之反應。
在第0週藉由肌肉內(IM)途徑向每一動物投與單次疫苗劑量。研究設計中亦包括僅接受MC3 LNP之對照組。如表7中所述投與疫苗。疫苗接種之後，針對接種位點之任何改變或活力或攝食習性之其他改變，每天觀察動物，該等改變可指示對疫苗之不良反應，但未注意到任何改變。收集血清樣品以用於評估RSV中和抗體效價，以及帕利珠單抗(位點II)及D25(位點)競爭性抗體效價。收集PBMC樣品以評估細胞介導之免疫反應。
在基線及疫苗接種後2週使用上文所述之方法所收集之血清樣品中量測個別動物NT50效價，且結果展示於圖15中。用mRNA疫苗進行疫苗接種導致血清中和效價平均增加150倍。對於所有mRNA疫苗而言增加倍數為類似的。在僅LNP疫苗對照組中觀察到效價未增加。藉由在疫苗接種後每2至4週量測效價來評估血清中和效價之持久性。在疫苗接種後第24週所量測出之每一組之GMT呈現於圖16中。效價在第24週仍比基線高約50倍。
為了評估接種疫苗動物中之補強反應之品質，測定帕利珠單抗(位點II)與D25(位點)競爭性抗體效價。如上文所述，抗原性位點II為存在於F蛋白之融合前與融合後構型上之中和抗原決定基，而位點為融合前特異性中和抗原決定基。在疫苗接種後4週使用上文所述之方法所量測之帕利珠單抗(位點II)及D25(位點)競爭性抗體效價總結於圖17A至17B中。所有mRNA疫苗均導致帕利珠單抗競爭性效價自基線升高約7倍。儘管在免疫接種之前，在所有動物中，除了僅MC3 LNP對照組中之一隻動物，D25競爭性抗體效價均低於檢定偵測之極限，但在接受基於mRNA之疫苗之所有動物中均引發D25競爭性抗體效價。GMT在接受mDS-Cav1或mF+mDS-Cav1組合之組中為最高。在僅LNP對照組中可見帕利珠單抗或D25(位點)競爭性抗體效價未增加。
如在疫苗接種後6週藉由ICS檢定所測定，亦發現mRNA疫苗在經歷過RSV之非洲綠猴中增強T細胞反應(圖18A至18B)。
如下進行用於非洲綠猴之ICS檢定：
A.第1天：將PBMC解凍
1.自液氮移出PBMC小瓶且置於乾冰上直至準備解凍。
2.在37℃設定點水浴中在輕柔攪動下將細胞快速解凍。
3.對於每一個體，使用血清學移液管將細胞懸浮液轉移至經適當標記之15mL或50mL試管。
4.將約0.5mL R10培養基緩慢添加至細胞中，隨後使其輕柔地渦旋以混合培養基與細胞懸浮液。
5.隨後將三倍冷凍細胞體積之R10培養基逐滴添加至每一試管中，在添加0.5mL至1.0mL R10培養基後使每一者渦旋。
6.隨後以一次1.0mL至2.0mL之速率添加R10培養基直至將約10至15mL添加至每一試管中。
7.使試管渦旋以混合培養基與細胞懸浮液，且隨後在室溫下在250xg(設定點)下離心8至10分鐘。
8.移除上清液且將細胞輕輕地再懸浮於5mL R10培養基中。
9.隨後將細胞懸浮液轉移至12孔組織培養盤中。
10.將組織培養盤置於37℃+/-2℃、4%至6% CO2培育箱中隔夜。
B.第2天：用於PBMC之計數及刺激程序
PBMC計數
1.將來自12孔組織培養盤之每一孔之PBMC置於經標記之50mL圓錐管中。
2.隨後藉由在血球計數器上進行錐蟲藍排除法或藉由Guava PC對細胞進行計數且再懸浮至每毫升1×107個細胞。
刺激設置
1.隨後將100μL再懸浮之PBMC添加至96孔無菌U型底組織培養盤之每一孔中以達1×106個細胞/孔之最終數目。
2.如下產生對應於RSV F蛋白序列之肽匯集物。為了得到最佳結果，將肽組合於兩個匯集物，RSV F1及RSV F2中。RSVF1包括以下清單中之頭71種肽，且RSV F2包括以下70種肽：
3.將肽匯集物(RSV F1或RSV F2匯集物)添加至細胞中達2.5μg/mL之最終濃度。
4.為每一個體準備一個模擬孔。將對應於肽匯集物體積之DMSO體積添加至模擬孔中。
5.用PMA(20ng/mL)/離子黴素(1.25μg/mL)溶液刺激陽性對照孔。
6.將CD28/CD49d混合物以2μg/mL之最終濃度添加至每一孔中。
7.添加肽及CD28/CD49d混合物之後，將培養盤在37度培育箱中培育30至60分鐘。
8.隨後將5mL布雷菲德菌素A(0.5mg/mL)添加至每一孔中，且隨後將培養盤在37℃ 5% CO2培育箱中再培育4至5小時。
9.隨後移出培養盤且將20μL 20mM EDTA(溶解於1XPBS中)添加至每一細胞孔中。
10.隨後將培養盤保持在4℃下隔夜。
C.第3天：染色
1.在500 x g下將培養盤離心5min，且移除上清液。
2.用175mL FACS Wash洗滌每一孔，且再次在500 x g下將培養盤離心5min，且移除上清液。
3.根據製造商所推薦之體積，如下用細胞外抗體將PBMC染 色：
i.CD8 APCH7：每次測試5μL
ii.CD3 PE：每次測試20μL
iii.CD4 PCF594：每次測試5μL
iv.ViVidye：每次測試3μL
4.將混合物添加至所有孔中之後，將120μL FACSwash添加至每一孔中並混合。在室溫下將培養盤在黑暗中培育25至30分鐘。
5.隨後對培養盤在500xg下進行培養盤離心5分鐘並用每孔175μL FACS wash洗滌。
6.將200μL BD Cytofix/cytoperm溶液添加至每一孔中且將培養盤在4℃下培育20至25分鐘。
7.隨後對培養盤在500xg下進行培養盤離心5分鐘並用每孔175μL PD perm wash緩衝液洗滌兩次。
8.隨後如下用細胞內抗體將PBMC染色：
i.IFN-g FITC 每次測試20μL
ii.TNF PEcy7 每次測試5μL
iii.IL-2 APC 每次測試20μL
9.將混合物添加至所有孔中之後，將120μL BD PermWash添加至每一孔中，且在室溫下將培養盤在黑暗中培育25分鐘。
10.培育之後，將培養盤在500xg下離心5分鐘，用175μL BD perm wash緩衝液洗滌且隨後將細胞再懸浮於每孔200μL BD穩定化固定劑中。隨後在4℃下將樣品儲存隔夜且在固定24小時內在LSRII上獲得。
如於圖18A至18B中所示，mRNA疫苗(mF、mDS-Cav1或mF+mDS-Cav1)導致對於IFN-γ、IL-2及TNF-α呈陽性之RSV F特異性CD4+及CD8+ T細胞反應增加。總體而言，該等反應在所有mRNA疫苗組中 均為類似的。T細胞反應在僅MC3 LNP對照組中未升高。
實例17：在棉鼠中針對RSV-B之免疫原性及功效；經MC3囊封之mRNA疫苗之有效性
在棉鼠中測試針對用RSV-B攻毒之實驗性mRNA RSV疫苗調配物之免疫原性及功效。該研究比較囊封於MC3脂質奈米粒子中之編碼不同形式之RSV-F蛋白之mRNA。
更具體而言，使用雌性棉鼠(SAGE)且在3至7週齡時開始免疫接種。此研究中所評估之mRNA疫苗包括：MRK01膜結合RSV F蛋白
MRK04膜結合DS-Cav1(穩定化之融合前F蛋白)
研究中所包括之組總結於表9中。研究以25mg之單次劑量評估所有mRNA疫苗。研究中所包括之對照組接受RSV A2(1×105.5pfu)或不接受疫苗。向每一動物(在第0及4週)投與兩次劑量之疫苗，除了接受RSV A2之組，其在第0週接受單一鼻內接種物。收集血清樣品以用於評估RSV中和抗體效價。在第8週，以RSV B菌株RSV 18537對棉鼠經鼻內進行攻毒。攻毒四天後，使動物安樂死且收集鼻部及肺部組織以藉由量測組織中之RSV含量評估疫苗功效。
在第4週(劑量1後4週)及第8週(劑量2後4週；攻毒日)收集之血清樣品中量測個別動物中和抗體(NT50)效價。在第4週，所有動物均對 用mRNA疫苗及用RSV A2攻毒之疫苗接種產生反應。在第二次免疫接種後，效價在兩個mRNA疫苗組中皆增加。mRNA疫苗與RSV A2感染皆導致針對RSV A及RSV B之大約相等的中和抗體效價。在第4及8週(劑量1後(PD1)4週及劑量2後(PD2；攻毒日)4週)所量測之個別動物及組幾何平均NT50效價呈現於圖19中。
在使用上文所述之方法以RSV B菌株18537進行攻毒後，藉由在經免疫接種之棉鼠之肺部及鼻部通道中量測對病毒複製之抑制來評估各種疫苗調配物之活體內功效。資料展示於圖20中。在經wt RSV A2免疫接種之棉鼠的肺部及鼻部中觀察到病毒複製受到完全抑制。儘管基於來自RSV A之序列進行設計，mF與mDS-Cav1 mRNA仍完全保護肺部與鼻部不受RSV B 18537攻毒。當mF與mDS-Cav1 mRNA疫苗與MC3脂質奈米粒子一起調配時，其針對RSV B攻毒同樣有效。
本文所述之序列中之每一者涵蓋經化學修飾之序列或不包括化學修飾的未經修飾之序列。
實例18：小鼠免疫原性
在此實例中，進行檢定以評估與蛋白抗原相比對使用未經化學修飾之mRNA/LNP平臺傳遞之RSV疫苗抗原之免疫反應。
向雌性Balb/c(CRL)小鼠(6至8週齡；N=每組10隻小鼠)投與RSV mRNA疫苗或蛋白疫苗。產生mRNA疫苗且在MC3脂質奈米粒子中調配。此研究中所評估之mRNA疫苗包括(各自呈未經化學修飾之形式)：
MRK-1膜結合RSV F蛋白
MRK-4膜結合DS-CAV1(穩定化之融合前F蛋白)
MRK-5 RSV F構築體
MRK-6 RSV F構築體
MRK-7 RSV F構築體
MRK8 RSV F構築體
MRK9膜結合RSV G蛋白
MRK11截短RSV F蛋白(僅胞外結構域)；經修飾以包括Ig分泌物肽信號序列之構築體
MRK12 DS-CAV1(非膜結合形式)；經修飾以包括Ig分泌物肽信號序列
MRK13：經修飾以包括Ig分泌物肽信號序列之MRK-5構築體
MRK14：經修飾以包括Ig分泌物肽信號序列之MRK-6構築體
MRK16：經修飾以包括Ig分泌物肽信號序列之MRK-8構築體
在實驗之第0天及第21天對動物進行免疫。在第14天及第35天，自各動物抽取血液且用其進行血清學檢定。在第42天及第49天，處死一子組動物且收集脾臟以支持ELISPOT及細胞內細胞介素染色研究。
A.RSV中和檢定：
匯集來自每一組之小鼠血清且使用以下程序對RSV-A(Long菌株)之中和進行評估：
11.藉由置於設定為56℃之乾式恆溫箱中30分鐘來對所有血清樣品進行熱滅活。隨後將樣品及對照血清以1：3稀釋於病毒稀釋劑(含2% FBS之EMEM)中且將重複樣品添加至檢定培養盤中並進行連續稀釋。
12.自冰箱移出RSV-Long病毒儲備液且在37℃水浴中快速解凍。在病毒稀釋劑中將病毒稀釋至2000pfu/mL
13.將經稀釋之病毒添加至96孔培養盤之每一孔中，除了一個管柱之細胞。
14.用胰蛋白酶處理HEp-2細胞，洗滌，以1.5×105個細胞/ml再懸浮於病毒稀釋劑，且將100mL經懸浮之細胞添加至96孔培養盤之每一孔中。隨後在37℃、5% CO2下將培養盤培育72小時。
15.培育72小時之後，用PBS洗滌細胞，且在16至24℃下使用溶解於PBS中之80%丙酮固定10至20分鐘。移除固定劑且使培養盤風乾。
16.隨後用PBS+0.05% Tween徹底洗滌培養盤。將偵測單株抗體143-F3-1B8及34C9稀釋至2.5，隨後用PBS+0.05%徹底洗滌培養盤。隨後用PBS+0.徹底洗滌50個培養盤之96孔培養盤之孔。隨後在16至24℃下將培養盤在濕度箱中在振盪器上培育60至75分鐘
17.培育之後，徹底洗滌培養盤。
18.將經生物素標記之馬抗-小鼠IgG以1：200稀釋於檢定稀釋劑中且添加至96孔培養盤之每一孔中。如上文培育培養盤並洗滌。
19.在檢定稀釋劑中製備IRDye 800CW抗生物素蛋白鏈菌素(1：1000最終稀釋液)、Sapphire 700(1：1000稀釋液)及5mM DRAQ5溶液(1：10,000稀釋液)之混合物且將50mL混合物添加至96孔培養盤之每一孔中。如上文在黑暗中培育培養盤，洗滌，且使其風乾。
20.隨後使用Aerius Imager讀取培養盤。隨後在Graphpad Prism中使用4參數曲線擬合計算血清中和效價。
在劑量1後(PD1)及劑量2後(PD2)量測用於小鼠免疫原性研究之血清中和抗體效價。
其他mRNA疫苗
MRK_04
SQ-030271
(SEQ ID NO：7)
MRK_04_no AAALys
SQ-038059
(SEQ ID NO：257)
MRK_04_no4A
SQ-038058
(SEQ ID NO：258)
MRK_04_nopolyA_3mut
SQ-038057
(SEQ ID NO：259)
等效內容
熟習此項技術者將認識到或能夠僅使用常規實驗法確定本文所述之本發明之具體實施例的許多等效內容。該等等效內容意欲由以下申請專利範圍涵蓋。
本文所揭示之所有參考案，包括專利文獻，均以全文引用的方式併入本文中。
<110> 美商現代公司
<120> 呼吸道融合病毒疫苗
<130> M1378.70026WO00
<140> Not Yet Assigned
<141> Concurrently Herewith
<150> US 62/245,031
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<150> US 62/245,208
<151> 2015-10-22
<150> US 62/247,563
<151> 2015-10-28
<150> US 62/248,250
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<210> 1
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<212> DNA
<213> 呼吸道融合病毒
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 200
<210> 201
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 201
<210> 202
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 202
<210> 203
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 203
<210> 204
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 204
<210> 205
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 205
<210> 206
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 206
<210> 207
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 207
<210> 208
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 208
<210> 209
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 209
<210> 210
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 210
<210> 211
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 211
<210> 212
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 212
<210> 213
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 213
<210> 214
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 214
<210> 215
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 215
<210> 216
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 216
<210> 217
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 217
<210> 218
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 218
<210> 219
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 219
<210> 220
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 220
<210> 221
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 221
<210> 222
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 222
<210> 223
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 223
<210> 224
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 224
<210> 225
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 225
<210> 226
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 226
<210> 227
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 227
<210> 228
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 228
<210> 229
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 229
<210> 230
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 230
<210> 231
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 231
<210> 232
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 232
<210> 233
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 233
<210> 234
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 234
<210> 235
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 235
<210> 236
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 236
<210> 237
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 237
<210> 238
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 238
<210> 239
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 239
<210> 240
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 240
<210> 241
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 241
<210> 242
<211> 1632
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<400> 242
<210> 243
<211> 544
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 243
<210> 244
<211> 1632
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<400> 244
<210> 245
<211> 544
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 245
<210> 246
<211> 813
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<400> 246
<210> 247
<211> 271
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 247
<210> 248
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<400> 248
<210> 249
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<400> 249
<210> 250
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<400> 250
<210> 251
<211> 1729
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<400> 251
<210> 252
<211> 1518
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<400> 252
<210> 253
<211> 1790
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<400> 253
<210> 254
<211> 506
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 254
<210> 255
<211> 698
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 255
<210> 256
<211> 692
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 256
<210> 257
<211> 1722
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<400> 257
<210> 258
<211> 1722
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<400> 258
<210> 259
<211> 1722
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<400> 259
<210> 260
<211> 1722
<212> RNA
<213> 呼吸道融合病毒
<400> 260
<210> 261
<211> 1722
<212> RNA
<213> 呼吸道融合病毒
<400> 261
<210> 262
<211> 1722
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<400> 262
<210> 263
<211> 1722
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<400> 263
<210> 264
<211> 1503
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<400> 264
<210> 265
<211> 1563
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<400> 265
<210> 266
<211> 1692
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<400> 266
<210> 267
<211> 1539
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<400> 267
<210> 268
<211> 894
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<400> 268
<210> 269
<211> 1629
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<400> 269
<210> 270
<211> 1629
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<400> 270
<210> 271
<211> 1500
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<400> 271
<210> 272
<211> 1560
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<400> 272
<210> 273
<211> 1536
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<400> 273
<210> 274
<211> 1632
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<400> 274
<210> 275
<211> 1632
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<400> 275
<210> 276
<211> 813
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<400> 276
<210> 277
<211> 1722
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<400> 277
<210> 278
<211> 1722
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<400> 278
<210> 279
<211> 1722
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<400> 279
<210> 280
<211> 1722
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<400> 280
<210> 281
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 281
<210> 282
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 282
<210> 283
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 283
<210> 284
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 284
<210> 285
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 285
<210> 286
<211> 13
<212> PRT
<213> 鼠傷寒沙氏桿菌
<400> 286
<210> 287
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<400> 287
<210> 288
<211> 60
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<400> 288
<210> 289
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 289
<210> 290
<211> 553
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 290
<210> 291
<211> 553
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 291
<210> 292
<211> 480
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 292
<210> 293
<211> 469
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 293
<210> 294
<211> 543
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 294
<210> 295
<211> 464
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 295
<210> 296
<211> 492
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 296
<210> 297
<211> 492
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 297
<210> 298
<211> 480
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 298
<210> 299
<211> 469
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 299
<210> 300
<211> 464
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 300

Claims (163)

  1. 一種呼吸道融合病毒(RSV)疫苗，其包含：至少一種核糖核酸(RNA)聚核苷酸，其具有編碼至少一種RSV抗原性多肽或其免疫原性片段之開放閱讀框架，及醫藥學上可接受之載劑。
  2. 如請求項1之RSV疫苗，其中該至少一種抗原性多肽為醣蛋白G或其免疫原性片段。
  3. 如請求項1之RSV疫苗，其中該至少一種抗原性多肽為醣蛋白F或其免疫原性片段。
  4. 如請求項1至3中任一項之RSV疫苗，其進一步包含佐劑。
  5. 如請求項1之RSV疫苗，其中該至少一種RNA聚核苷酸由至少一種選自由SEQ ID NO：1、2、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25及27組成之群之核酸序列編碼，及/或其中該至少一種RNA聚核苷酸包含SEQ ID NO：260至280中之任一者之至少一種核酸序列。
  6. 如請求項1之RSV疫苗，其中該至少一種RNA聚核苷酸由選自由SEQ ID NO：1、2、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25及27組成之群之核酸序列的至少一個片段編碼，及/或其中該至少一種RNA聚核苷酸包含SEQ ID NO：260至280中之任一者之核酸序列的至少一個片段。
  7. 如請求項1之RSV疫苗，其中該RSV抗原性多肽之胺基酸序列係選自由SEQ ID NO：3、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26及28組成之群之胺基酸序列。
  8. 如請求項1至7中任一項之RSV疫苗，其中該開放閱讀框架經密碼子最佳化。
  9. 如請求項1至8中任一項之RSV疫苗，其中該疫苗係多價的。
  10. 如請求項1至9中任一項之RSV疫苗，其中該至少一種RNA聚核苷酸編碼至少2種抗原性多肽。
  11. 如請求項10之RSV疫苗，其中該至少一種RNA聚核苷酸編碼至少10種抗原性多肽。
  12. 如請求項11之RSV疫苗，其中該至少一種RNA聚核苷酸編碼至少100種抗原性多肽。
  13. 如請求項1至9中任一項之RSV疫苗，其中該至少一種RNA聚核苷酸編碼2至100種抗原性多肽。
  14. 如請求項1至13中任一項之RSV疫苗，其中該至少一種RNA聚核苷酸包含至少一個化學修飾。
  15. 如請求項14之RSV疫苗，其中該化學修飾係選自由以下組成之群：假尿苷、N1-甲基假尿苷、2-硫尿苷、4'-硫尿苷、5-甲基胞嘧啶、2-硫基-1-甲基-1-去氮雜-假尿苷、2-硫基-1-甲基-假尿苷、2-硫基-5-氮雜-尿苷、2-硫基-二氫假尿苷、2-硫基-二氫尿苷、2-硫基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫基-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫基-1-甲基-假尿苷、4-硫基-假尿苷、5-氮雜-尿苷、二氫假尿苷、5-甲氧基尿苷及2'-O-甲基尿苷。
  16. 如請求項1至15中任一項之RSV疫苗，其在奈米粒子中調配。
  17. 如請求項16之RSV疫苗，其中該奈米粒子具有50至200nm之平均直徑。
  18. 如請求項16或17之RSV疫苗，其中該奈米粒子為脂質奈米粒子。
  19. 如請求項18之RSV疫苗，其中該脂質奈米粒子包含陽離子型脂質、經PEG改質之脂質、固醇及非陽離子型脂質。
  20. 如請求項19之RSV疫苗，其中該陽離子型脂質為可電離之陽離 子型脂質且該非陽離子型脂質為中性脂質，且該固醇為膽固醇。
  21. 如請求項20之RSV疫苗，其中該陽離子型脂質係選自由2,2-二亞油基-4-二甲胺基乙基-[1,3]-二氧戊環(DLin-KC2-DMA)、二亞油基-甲基-4-二甲胺基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)、9-((4-(二甲胺基)丁醯基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L319)、(12Z,15Z)-N,N-二甲基-2-壬基二十一烷-12,15-二烯-1-胺(L608)及N,N-二甲基-1-[(1S,2R)-2-辛基環丙基]十七烷-8-胺(L530)組成之群。
  22. 如請求項16至21中任一項之RSV疫苗，其中該奈米粒子具有小於0.4之多分散性值。
  23. 如請求項16至21中任一項之RSV疫苗，其中該奈米粒子在中性pH值下具有淨中性電荷。
  24. 一種RSV疫苗，其包含：至少一種核糖核酸(RNA)聚核苷酸，其具有編碼至少一種RSV抗原性多肽之開放閱讀框架、至少一種5'端帽及至少一個化學修飾，該RSV疫苗係在脂質奈米粒子中調配。
  25. 如請求項24之RSV疫苗，其中該5'端帽為7mG(5')ppp(5')NlmpNp。
  26. 如請求項24或25之RSV疫苗，其中該至少一個化學修飾係選自由以下組成之群：假尿苷、N1-甲基假尿苷、2-硫尿苷、4'-硫尿苷、5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿苷、2-硫基-1-甲基-1-去氮雜-假尿苷、2-硫基-1-甲基-假尿苷、2-硫基-5-氮雜-尿苷、2-硫基-二氫假尿苷、2-硫基-二氫尿苷、2-硫基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫基-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫基-1-甲基-假尿苷、4-硫基-假尿苷、5-氮雜-尿苷、二氫假尿苷、5-甲氧基尿苷及2'-O-甲基尿 苷。
  27. 如請求項16至26中任一項之RSV疫苗，其中該脂質奈米粒子包含陽離子型脂質、經PEG改質之脂質、固醇及非陽離子型脂質。
  28. 如請求項27之RSV疫苗，其中該陽離子型脂質為可電離之陽離子型脂質且該非陽離子型脂質為中性脂質，且該固醇為膽固醇。
  29. 如請求項28之RSV疫苗，其中該陽離子型脂質係選自由2,2-二亞油基-4-二甲胺基乙基-[1,3]-二氧戊環(DLin-KC2-DMA)、二亞油基-甲基-4-二甲胺基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)、9-((4-(二甲胺基)丁醯基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L319)、(12Z,15Z)-N,N-二甲基-2-壬基二十一烷-12,15-二烯-1-胺(L608)及N,N-二甲基-1-[(1S,2R)-2-辛基環丙基]十七烷-8-胺(L530)組成之群。
  30. 一種RSV疫苗，其包含：至少一種核糖核酸(RNA)聚核苷酸，其具有編碼至少一種RSV抗原性多肽之開放閱讀框架，其中該開放閱讀框架中至少80%之尿嘧啶具有化學修飾。
  31. 如請求項30之RSV疫苗，其中該開放閱讀框架中100%之尿嘧啶具有化學修飾。
  32. 如請求項30或31之RSV疫苗，其中該化學修飾位於尿嘧啶之5位。
  33. 如請求項30至32中任一項之RSV疫苗，其中該化學修飾為N1-甲基假尿苷。
  34. 如請求項30至33中任一項之RSV疫苗，其中該疫苗係在脂質奈米粒子中調配。
  35. 一種在個體中誘發抗原特異性免疫反應之方法，其包括向該個 體投與有效產生抗原特異性免疫反應之量之如請求項1至34中任一項之RSV疫苗。
  36. 如請求項35之方法，其中該抗原特異性免疫反應包含T細胞反應。
  37. 如請求項35之方法，其中該抗原特異性免疫反應包含B細胞反應。
  38. 如請求項35至37中任一項之方法，其中該誘發抗原特異性免疫反應之方法涉及單次投與該RSV疫苗。
  39. 如請求項35至37中任一項之方法，其進一步包括投與補強劑量之該疫苗。
  40. 如請求項35至39中任一項之方法，其中藉由皮內或肌肉內注射向該個體投與該疫苗。
  41. 如請求項1至34中任一項之RSV疫苗，其用於在個體中誘發抗原特異性免疫反應之方法中，該方法包括向該個體投與有效產生抗原特異性免疫反應之量之該RSV疫苗。
  42. 如請求項1至34中任一項之RSV疫苗，其用於製造用於在個體中誘發抗原特異性免疫反應之方法中的藥物，該方法包括向該個體投與有效產生抗原特異性免疫反應之量之該RSV疫苗。
  43. 如請求項3之RSV疫苗，其中該醣蛋白F或其免疫原性片段經設計以維持融合前構型。
  44. 如請求項1至34中任一項之RSV疫苗，其以在個體中產生抗原特異性免疫反應之有效量調配。
  45. 如請求項44之RSV疫苗，其中抗-RSV抗原性多肽在該個體中產生之抗體效價相對於對照物而言增加至少1 log。
  46. 如請求項45之RSV疫苗，其中該抗-RSV抗原性多肽在該個體中產生之抗體效價相對於對照物而言增加1至3 log。
  47. 如請求項44之RSV疫苗，其中該抗-RSV抗原性多肽在該個體中產生之抗體效價相對於對照物而言增加至少2倍。
  48. 如請求項47之RSV疫苗，其中該抗-RSV抗原性多肽在該個體中產生之抗體效價相對於對照物而言增加至少5倍。
  49. 如請求項48之RSV疫苗，其中該抗-RSV抗原性多肽在該個體中產生之抗體效價相對於對照物而言增加至少10倍。
  50. 如請求項47之RSV疫苗，其中該抗-RSV抗原性多肽在該個體中產生之抗體效價相對於對照物而言增加2至10倍。
  51. 如請求項44至50中任一項之RSV疫苗，其中該對照物為抗-RSV抗原性多肽在未經投與RSV疫苗之個體中產生之抗體效價。
  52. 如請求項44至50中任一項之RSV疫苗，其中該對照物為抗-RSV抗原性多肽在經投與活的減毒或滅活RSV疫苗之個體中產生之抗體效價。
  53. 如請求項44至50中任一項之RSV疫苗，其中該對照物為抗-RSV抗原性多肽在經投與重組或經純化之RSV蛋白疫苗之個體中產生之抗體效價。
  54. 如請求項44至50中任一項之RSV疫苗，其中該對照物為抗-RSV抗原性多肽在經投與RSV類病毒粒子(VLP)疫苗之個體中產生之抗體效價。
  55. 如請求項44至54中任一項之RSV疫苗，其中該有效量為等於比重組RSV蛋白疫苗之護理標準劑量減少至少2倍之劑量，且其中抗-RSV抗原性多肽在該個體中產生之抗體效價等於抗-RSV抗原性多肽在經投與護理標準劑量之重組或經純化之RSV蛋白疫苗或活的減毒或滅活RSV疫苗或RSV VLP疫苗之對照個體中產生之抗體效價。
  56. 如請求項55之RSV疫苗，其中該有效量為等於比重組RSV蛋白疫 苗之護理標準劑量減少至少4倍之劑量，且其中抗-RSV抗原性多肽在該個體中產生之抗體效價等於抗-RSV抗原性多肽在經投與護理標準劑量之重組或經純化之RSV蛋白疫苗或活的減毒或滅活RSV疫苗或RSV VLP疫苗之對照個體中產生之抗體效價。
  57. 如請求項56之RSV疫苗，其中該有效量為等於比重組RSV蛋白疫苗之護理標準劑量減少至少10倍之劑量，且其中抗-RSV抗原性多肽在該個體中產生之抗體效價等於抗-RSV抗原性多肽在經投與護理標準劑量之重組或經純化之RSV蛋白疫苗或活的減毒或滅活RSV疫苗或RSV VLP疫苗之對照個體中產生之抗體效價。
  58. 如請求項57之RSV疫苗，其中該有效量為等於比重組RSV蛋白疫苗之護理標準劑量減少至少100倍之劑量，且其中抗-RSV抗原性多肽在該個體中產生之抗體效價等於抗-RSV抗原性多肽在經投與護理標準劑量之重組或經純化之RSV蛋白疫苗或活的減毒或滅活RSV疫苗或RSV VLP疫苗之對照個體中產生之抗體效價。
  59. 如請求項58之RSV疫苗，其中該有效量為等於比重組RSV蛋白疫苗之護理標準劑量減少至少1000倍之劑量，且其中抗-RSV抗原性多肽在該個體中產生之抗體效價等於抗-RSV抗原性多肽在經投與護理標準劑量之重組或經純化之RSV蛋白疫苗或活的減毒或滅活RSV疫苗或RSV VLP疫苗之對照個體中產生之抗體效價。
  60. 如請求項55之RSV疫苗，其中該有效量為等於比重組RSV蛋白疫苗之護理標準劑量減少2至1000倍之劑量，且其中抗-RSV抗原性多肽在該個體中產生之抗體效價等於抗-RSV抗原性多肽在經投與護理標準劑量之重組或經純化之RSV蛋白疫苗或活的減毒或滅活RSV疫苗或RSV VLP疫苗之對照個體中產生之抗體效價。
  61. 如請求項44至60中任一項之RSV疫苗，其中該有效量為25至 1000μg或50至1000μg之總劑量。
  62. 如請求項61之RSV疫苗，其中該有效量為100μg之總劑量。
  63. 如請求項61之RSV疫苗，其中該有效量為總計兩次向該個體投與之25μg之劑量。
  64. 如請求項61之RSV疫苗，其中該有效量為總計兩次向該個體投與之100μg之劑量。
  65. 如請求項61之RSV疫苗，其中該有效量為總計兩次向該個體投與之400μg之劑量。
  66. 如請求項61之RSV疫苗，其中該有效量為總計兩次向該個體投與之500μg之劑量。
  67. 如請求項44至66中任一項之RSV疫苗，其中該有效量之該RSV疫苗導致針對RSV之血清中和抗體相對於對照物而言增加5至200倍。
  68. 如請求項67之RSV疫苗，其中單次劑量之該RSV疫苗導致針對RSV之血清中和抗體相對於對照物而言增加約2至10倍。
  69. 如請求項68之RSV疫苗，其中單次劑量之該RSV疫苗導致針對RSV之血清中和抗體相對於對照物而言增加約5倍。
  70. 如請求項35之方法，其中抗-RSV抗原性多肽在該個體中產生之抗體效價相對於對照物而言增加至少1 log。
  71. 如請求項70之方法，其中抗-RSV抗原性多肽在該個體中產生之抗體效價相對於對照物而言增加1至3 log。
  72. 如請求項70之方法，其中該抗-RSV抗原性多肽在該個體中產生之抗體效價相對於對照物而言增加至少2倍。
  73. 如請求項72之方法，其中該抗-RSV抗原性多肽在該個體中產生之抗體效價相對於對照物而言增加至少5倍。
  74. 如請求項73之方法，其中該抗-RSV抗原性多肽在該個體中產生 之抗體效價相對於對照物而言增加至少10倍。
  75. 如請求項72之方法，其中該抗-RSV抗原性多肽在該個體中產生之抗體效價相對於對照物而言增加2至10倍。
  76. 如請求項70至75中任一項之方法，其中該對照物為抗-RSV抗原性多肽在未經投與RSV疫苗之個體中產生之抗體效價。
  77. 如請求項70至75中任一項之方法，其中該對照物為抗-RSV抗原性多肽在經投與活的減毒或滅活RSV疫苗之個體中產生之抗體效價。
  78. 如請求項70至75中任一項之方法，其中該對照物為抗-RSV抗原性多肽在經投與重組或經純化之RSV蛋白疫苗之個體中產生之抗體效價。
  79. 如請求項70至75中任一項之方法，其中該對照物為抗-RSV抗原性多肽在經投與RSV VLP疫苗之個體中產生之抗體效價。
  80. 如請求項70至75中任一項之方法，其中該有效量為等於比重組RSV蛋白疫苗之護理標準劑量減少至少2倍之劑量，且其中抗-RSV抗原性多肽在該個體中產生之抗體效價等於抗-RSV抗原性多肽在經投與護理標準劑量之重組RSV蛋白疫苗或活的減毒RSV疫苗或RSV VLP疫苗之對照個體中產生之抗體效價。
  81. 如請求項80之方法，其中該有效量為等於比重組RSV蛋白疫苗之護理標準劑量減少至少4倍之劑量，且其中抗-RSV抗原性多肽在該個體中產生之抗體效價等於抗-RSV抗原性多肽在經投與護理標準劑量之重組或經純化之RSV蛋白疫苗或活的減毒或滅活RSV疫苗或RSV VLP疫苗之對照個體中產生之抗體效價。
  82. 如請求項81之方法，其中該有效量為等於比重組RSV蛋白疫苗之護理標準劑量減少至少10倍之劑量，且其中抗-RSV抗原性多肽在該個體中產生之抗體效價等於抗-RSV抗原性多肽在經投與 護理標準劑量之重組或經純化之RSV蛋白疫苗或活的減毒或滅活RSV疫苗或RSV VLP疫苗之對照個體中產生之抗體效價。
  83. 如請求項82之方法，其中該有效量為等於比重組RSV蛋白疫苗之護理標準劑量減少至少100倍之劑量，且其中抗-RSV抗原性多肽在該個體中產生之抗體效價等於抗-RSV抗原性多肽在經投與護理標準劑量之重組或經純化之RSV蛋白疫苗或活的減毒或滅活RSV疫苗或RSV VLP疫苗之對照個體中產生之抗體效價。
  84. 如請求項83之方法，其中該有效量為等於比重組RSV蛋白疫苗之護理標準劑量減少至少1000倍之劑量，且其中抗-RSV抗原性多肽在該個體中產生之抗體效價等於抗-RSV抗原性多肽在經投與護理標準劑量之重組或經純化之RSV蛋白疫苗或活的減毒或滅活RSV疫苗或RSV VLP疫苗之對照個體中產生之抗體效價。
  85. 如請求項80之方法，其中該有效量為等於比重組RSV蛋白疫苗之護理標準劑量減少2至1000倍之劑量，且其中抗-RSV抗原性多肽在該個體中產生之抗體效價等於抗-RSV抗原性多肽在經投與護理標準劑量之重組或經純化之RSV蛋白疫苗或活的減毒或滅活RSV疫苗或RSV VLP疫苗之對照個體中產生之抗體效價。
  86. 如請求項70至85中任一項之方法，其中該有效量為50至1000μg之總劑量。
  87. 如請求項86之方法，其中該有效量為100μg之總劑量。
  88. 如請求項86之方法，其中該有效量為總計兩次向該個體投與之25μg之劑量。
  89. 如請求項86之方法，其中該有效量為總計兩次向該個體投與之100μg之劑量。
  90. 如請求項86之方法，其中該有效量為總計兩次向該個體投與之400μg之劑量。
  91. 如請求項86之方法，其中該有效量為總計兩次向該個體投與之500μg之劑量。
  92. 如請求項70至91中任一項之方法，其中該疫苗針對RSV之功效大於60%。
  93. 如請求項92之方法，其中該疫苗針對RSV之功效大於65%。
  94. 如請求項93之方法，其中該疫苗針對RSV之功效大於70%。
  95. 如請求項94之方法，其中該疫苗針對RSV之功效大於75%。
  96. 如請求項95之方法，其中該疫苗針對RSV之功效大於80%。
  97. 如請求項96之方法，其中該疫苗針對RSV之功效大於85%。
  98. 如請求項97之方法，其中該疫苗針對RSV之功效大於90%。
  99. 如請求項70至98中任一項之方法，其中該疫苗使該個體對RSV免疫長達1年或長達2年。
  100. 如請求項70至98中任一項之方法，其中該疫苗使該個體對RSV免疫2年以上。
  101. 如請求項100之方法，其中該疫苗使該個體對RSV免疫3年以上。
  102. 如請求項101之方法，其中該疫苗使該個體對RSV免疫4年以上。
  103. 如請求項102之方法，其中該疫苗使該個體對RSV免疫5至10年。
  104. 如請求項70至103中任一項之方法，其中該個體為約5歲或5歲以下，其中個體介於約1歲與約5歲之間，其中個體介於為約6個月與約1歲之間，其中該個體為約6個月或6個月以下，或其中該個體為約12個月或12個月以下。
  105. 如請求項70至103中任一項之方法，其中該個體為約60歲、約70歲或70歲以上之老年個體。
  106. 如請求項70至103中任一項之方法，其中該個體為介於約20歲與約50歲之間的年輕成年人。
  107. 如請求項70至106中任一項之方法，其中該個體為足月出生。
  108. 如請求項70至106中任一項之方法，其中該個體在妊娠約36週或更早時早產，其中該個體在妊娠約32週或更早時早產，或其中該個體在妊娠約32週與約36週之間早產。
  109. 如請求項70至106中任一項之方法，其中該個體為孕婦。
  110. 如請求項70至109中任一項之方法，其中該個體患有慢性肺病(例如，慢性阻塞性肺病(COPD)或氣喘)。
  111. 如請求項70至110中任一項之方法，其中該個體已暴露於RSV，其中該個體已感染RSV，或其中該個體存在感染RSV之風險。
  112. 如請求項70至111中任一項之方法，其中該個體免疫受損。
  113. 如請求項70至112中任一項之方法，其進一步包括投與第二(補強)劑量及視情況第三劑量之該RSV疫苗。
  114. 如請求項70至113中任一項之方法，其中該有效量之該RSV疫苗導致針對RSV之血清中和抗體相對於對照物而言增加5至200倍。
  115. 如請求項114之RSV疫苗，其中單次劑量之該RSV疫苗導致針對RSV之血清中和抗體相對於對照物而言增加約2至10倍。
  116. 一種呼吸道融合病毒(RSV)疫苗，其包含與RSV抗原性多肽連接之信號肽。
  117. 如請求項116之RSV疫苗，其中該抗原性多肽為融合(F)醣蛋白或其免疫原性片段、附著(G)蛋白或其免疫原性片段、核蛋白(N)或其免疫原性片段、磷蛋白(P)或其免疫原性片段、大聚合酶蛋白(L)或其免疫原性片段、基質蛋白(M)或其免疫原性片段、小疏水性蛋白(SH)或其免疫原性片段、非結構蛋白1(NS1)或其免疫原性片段或非結構蛋白2(NS2)及其免疫原性片段。
  118. 如請求項116或117之RSV疫苗，其中該信號肽為IgE信號肽或IgGκ信號肽。
  119. 如請求項118之RSV疫苗，其中該IgE信號肽為IgE HC(Ig重鏈ε-1)信號肽。
  120. 如請求項119之RSV疫苗，其中該IgE HC信號肽具有序列MDWTWILFLVAAATRVHS(SEQ ID NO：281)。
  121. 如請求項118之RSV疫苗，其中該IgGκ信號肽具有序列METPAQLLFLLLLWLPDTTG(SEQ ID NO：282)。
  122. 如請求項116至119中任一項之RSV疫苗，其中該信號肽係選自：日本腦炎PRM信號序列(MLGSNSGQRVVFTILLLLVAPAYS；SEQ ID NO：283)、VSVg蛋白信號序列(MKCLLYLAFLFIGVNCA；SEQ ID NO：284)、日本腦炎JEV信號序列(MWLVSLAIVTACAGA；SEQ ID NO：285)及MELLILKANAITTILTAVTFC(SEQ ID NO：289)。
  123. 一種編碼如請求項116至122中任一項之RSV疫苗之核酸。
  124. 一種呼吸道融合病毒(RSV)疫苗，該疫苗包含至少一種核糖核酸(RNA)聚核苷酸，其具有編碼與RSV抗原性肽連接之信號肽之開放閱讀框架。
  125. 如請求項124之RSV疫苗，其中該RSV抗原性肽為RSV附著蛋白(G)或其免疫原性片段。
  126. 如請求項124之RSV疫苗，其中該RSV抗原性肽為RSV融合(F)醣蛋白或其免疫原性片段。
  127. 如請求項124之RSV疫苗，其中該RSV抗原性肽為核蛋白(N)或其免疫原性片段。
  128. 如請求項124之RSV疫苗，其中該RSV抗原性肽為磷蛋白(P)或其免疫原性片段。
  129. 如請求項124之RSV疫苗，其中該RSV抗原性肽為大聚合酶蛋白(L)或其免疫原性片段。
  130. 如請求項124之RSV疫苗，其中該RSV抗原性肽為基質蛋白(M)或其免疫原性片段。
  131. 如請求項124之RSV疫苗，其中該RSV抗原性肽為小疏水性蛋白(SH)或其免疫原性片段。
  132. 如請求項124之RSV疫苗，其中該RSV抗原性肽為非結構蛋白1(NS1)或其免疫原性片段。
  133. 如請求項124之RSV疫苗，其中該RSV抗原性肽為非結構蛋白2(NS2)或其免疫原性片段。
  134. 如請求項124至133中任一項之RSV疫苗，其中該信號肽為IgE信號肽或IgGκ信號肽。
  135. 如請求項134之RSV疫苗，其中該IgE信號肽為IgE HC(Ig重鏈ε-1)信號肽。
  136. 如請求項135之RSV疫苗，其中該IgE HC信號肽具有序列MDWTWILFLVAAATRVHS(SEQ ID NO：281)。
  137. 如請求項134之RSV疫苗，其中該IgGκ信號肽具有序列METPAQLLFLLLLWLPDTTG(SEQ ID NO：282)。
  138. 如請求項124至137中任一項之RSV疫苗，其中該信號肽係選自：日本腦炎PRM信號序列(MLGSNSGQRVVFTILLLLVAPAYS；SEQ ID NO：283)、VSVg蛋白信號序列(MKCLLYLAFLFIGVNCA；SEQ ID NO：284)及日本腦炎JEV信號序列(MWLVSLAIVTACAGA；SEQ ID NO：285)。
  139. 一種呼吸道融合病毒(RSV)疫苗，其包含：至少一種核糖核酸(RNA)聚核苷酸，其具有編碼膜結合RSV F蛋白、膜結合DS-Cav1(穩定化之融合前RSV F蛋白)或膜結合 RSV F蛋白與膜結合DS-Cav1之組合之開放閱讀框架，及醫藥學上可接受之載劑。
  140. 如請求項139之RSV疫苗，其中該至少一種RNA聚核苷酸包含如SEQ ID NO：5所述之序列。
  141. 如請求項139或140之RSV疫苗，其中該至少一種RNA聚核苷酸包含如SEQ ID NO：7、257、258或259所述之序列。
  142. 如請求項139至141中任一項之RSV疫苗，其中單次劑量之該RSV疫苗導致針對RSV之血清中和抗體相對於對照物而言增加2至10倍。
  143. 如請求項142之RSV疫苗，其中單次劑量之該RSV疫苗導致針對RSV之血清中和抗體相對於對照物而言增加約5倍。
  144. 如請求項142或143之RSV疫苗，其中該等血清中和抗體係針對RSVA及/或RSVB。
  145. 如請求項139至144中任一項之RSV疫苗，其中該RSV疫苗係在MC3脂質奈米粒子中調配。
  146. 一種在個體中誘發抗原特異性免疫反應之方法，該方法包括向個體投與在個體中產生抗原特異性免疫反應之有效量之如請求項139至145中任一項之RSV疫苗。
  147. 如請求項146之方法，其進一步包括投與補強劑量之該RSV疫苗。
  148. 如請求項147之方法，其進一步包括投與第二補強劑量之該RSV疫苗。
  149. 一種呼吸道融合病毒(RSV)疫苗，其包含：至少一種信使核糖核酸(mRNA)聚核苷酸，其具有5'端帽、編碼至少一種RSV抗原性多肽之開放閱讀框架及3' polyA尾。
  150. 如請求項149之疫苗，其中該至少一種mRNA聚核苷酸由經SEQ ID NO：5標識之序列編碼。
  151. 如請求項149之疫苗，其中該至少一種mRNA聚核苷酸包含經SEQ ID NO：262標識之序列。
  152. 如請求項149之疫苗，其中該至少一種RSV抗原性多肽包含經SEQ ID NO：6標識之序列。
  153. 如請求項149之疫苗，其中該至少一種RSV抗原性多肽包含經SEQ ID NO：290標識之序列。
  154. 如請求項149之疫苗，其中該mRNA聚核苷酸由經SEQ ID NO：7標識之序列編碼。
  155. 如請求項149之疫苗，其中該mRNA聚核苷酸包含經SEQ ID NO：263標識之序列。
  156. 如請求項149之疫苗，其中該至少一種RSV抗原性多肽包含經SEQ ID NO：8標識之序列。
  157. 如請求項149之疫苗，其中該至少一種RSV抗原性多肽包含經SEQ ID NO：291標識之序列。
  158. 如請求項149至157中任一項之疫苗，其中該5'端帽為或包含7mG(5')ppp(5')NlmpNp。
  159. 如請求項149至158中任一項之疫苗，其中該開放閱讀框架中100%之尿嘧啶經修飾以在尿嘧啶之5位處包括N1-甲基假尿苷。
  160. 如請求項149至159中任一項之疫苗，其中該疫苗係在脂質奈米粒子中調配，該脂質奈米粒子包含：DLin-MC3-DMA；膽固醇；1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DSPC)；及聚乙二醇(PEG)2000-DMG。
  161. 如請求項160之疫苗，其中該脂質奈米粒子進一步包含檸檬酸鈉緩衝液、蔗糖及水。
  162. 一種呼吸道融合病毒(RSV)疫苗，其包含： 至少一種信使核糖核酸(mRNA)聚核苷酸，其具有5'端帽7mG(5')ppp(5')NlmpNp、經SEQ ID NO：262標識之序列及3' polyA尾，該疫苗係在脂質奈米粒子中調配，該脂質奈米粒子包含DLin-MC3-DMA、膽固醇、1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DSPC)及聚乙二醇(PEG)2000-DMG，其中該經SEQ ID NO：262標識之序列之尿嘧啶核苷酸經修飾以在尿嘧啶核苷酸之5位處包括N1-甲基假尿苷。
  163. 一種呼吸道融合病毒(RSV)疫苗，其包含：至少一種信使核糖核酸(mRNA)聚核苷酸，其具有5'端帽7mG(5')ppp(5')NlmpNp、經SEQ ID NO：263標識之序列及3' polyA尾，該疫苗係在脂質奈米粒子中調配，該脂質奈米粒子包含DLin-MC3-DMA、膽固醇、1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DSPC)及聚乙二醇(PEG)2000-DMG，其中該經SEQ ID NO：263標識之序列之尿嘧啶核苷酸經修飾以在尿嘧啶核苷酸之5位處包括N1-甲基假尿苷。
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