CN111812230A - 一种半定量测定dna中rna含量的sec-hplc检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种半定量测定DNA中RNA含量的SEC‑HPLC检测方法，该方法通过将样品色谱图与含一定量RNA的质粒DNA标准品的色谱图作叠图分析，比较两者在RNA位置的出峰情况，从而判断样品的RNA百分含量。该方法准确快捷，操作简便，重复性好。

Description

一种半定量测定DNA中RNA含量的SEC-HPLC检测方法

技术领域

本发明涉及核酸类分析技术领域，特别涉及一种测定质粒DNA中RNA百分含量的SEC-HPLC检测方法。

背景技术

随着科学技术的进步，基因技术显现多元化、精细化、精准化的发展，这就对生物体提取DNA样本的自动化、简易化、高质量有了更高的要求，尤其是DNA样本的纯度。

在很多的生物学试验中都对DNA样本的纯度有高的要求，但是在提取原核或真核生物体的DNA样本时，很难充分的去除宿主蛋白质，宿主RNA及多糖多酚的杂质，这些杂质会对进一步的分子生物学试验产生影响，甚至决定着试验的成败，因此提取高纯度DNA在基因技术深入研究中越来越受到重视。虽然目前生物体DNA的提取技术在不断的提高，但由于样本的种类复杂，提取的质量稳定性不尽如人意，这就需要对提取的DNA质量进行评价。

DNA重组技术的成熟促进了基因治疗技术商业化的快速发展。质粒DNA做为一种典型的基因治疗产品，在临床研究已得到广泛的应用。随着临床研究和药品上市的需要及质粒DNA的商业化生产，需要对质粒DNA的质量提出一定的要求。质粒DNA通常通过工程菌发酵获得，工程菌在纯化过程中，宿主蛋白质、宿主基因组DNA、宿主RNA及细菌内毒素是影响产品质量的主要杂质。质粒DNA做为基因治疗药品，其中RNA片段的残留在理论上有可能在受体细胞内引起致癌基因的编码，虽然这种概率小于10^-9，但出于安全性的考虑，通常会对宿主RNA的含量加以限制。美国FDA相关指导原则对RNA含量的建议应<1％。

本专利旨在分析DNA中杂质RNA的含量，可以用于生物实验研究及基因治疗用DNA等样本的质量评价。目前国内外生物制品相关指导原则所建议的方法为琼脂糖凝胶电泳，标准为不可检测到明显RNA条带。RNA的电泳检测方法操作相对复杂、检测灵敏度受结合染料的影响，稳定性较差，检测结果受主观判断影响且检测限度较低。现有的液相方法在做RNA分析时，均用于分离不同长度的RNA，未有分离DNA与RNA的方法。

发明内容

本发明提供一种高灵敏度的检测方法，解决分析质粒DNA中RNA百分含量的问题。采用分子排阻HPLC法分离DNA与RNA，并测定RNA相对DNA的含量，该方法准确快捷，操作简便，重复性好。

本发明技术方案如下：

半定量测定质粒DNA中RNA百分含量的SEC-HPLC方法，包括下列步骤：

a)配制分析溶液

用纯水稀释标准品和样品，制成分析溶液；

b)色谱条件

色谱柱为尺寸排阻色谱柱，所述尺寸排阻色谱柱选自聚甲基丙烯酸酯色谱柱；

以磷酸钠盐-氯化钠的混合液为流动相，流动相pH范围7～8；采用等梯度洗脱方法，流速为0.3-0.6ml/min；柱温为20-30℃，检测波长为260nm；运行时间30-60min；

c)上机测定

取步骤a)制成的分析溶液12-50μl注入高效液相色谱仪，进行色谱分析，并记录色谱图。并将样品色谱图与已知RNA含量的质粒DNA标准品的色谱图作叠图，比较RNA位置的出峰情况。所述标准品的RNA含量可以大于等于1％。

在一些实施例中，所述纯水为分子生物级别。

在一些实施例中，所述尺寸排阻色谱柱的填充剂为聚甲基丙烯酸酯色谱柱。

在一些实施例中，所述尺寸排阻色谱柱的规格为：柱长介于300mm-340mm之间，色谱柱内径介于5mm-10mm之间，粒径介于7-13μm之间，孔径介于20-200nm之间，优选为TSK5000PWXL(7.8mm×30cm，10μm)的聚甲基丙烯酸酯色谱柱。

在一些实施例中，所述磷酸钠盐-氯化钠混合溶液，磷酸钠盐的浓度为0.04-0.06mol/L，氯化钠溶液浓度为0.1-0.3mol/L，pH 7～8。优选为0.05mol/L磷酸钠盐，0.2mol/L氯化钠溶液，pH 7.4。

在一些实施例中，所述磷酸钠盐选自磷酸二氢钠或磷酸氢二钠的一种或几种，优选磷酸二氢钠。

步骤b所述尺寸排阻色谱柱为聚甲基丙烯酸酯色谱柱，所述流动相为磷酸二氢钠溶液与氯化钠混合溶液，磷酸二氢钠溶液0.05mol/L，氯化钠溶液0.2mol/L，所述流动相进行等梯度洗脱。

所述样品为生物实验用DNA样品或药用DNA样品。

进一步地，所述样品选自原核生物提取DNA样品、真核生物提取DNA样品、药用DNA中间品或成品中的一种或几种。

有益效果：

本发明能够对DNA样品中RNA含量进行有效的半定量分析，尤其实现了谱图中DNA和RNA较好的分离。

本发明的分析方法通过将样品色谱图与含一定量RNA的质粒DNA标准品的色谱图作叠图分析，比较两者在RNA位置的出峰情况，从而判断样品的RNA百分含量。在生物实验方面，所用DNA样品的DNA纯度可能会影响实验的结果及成功率，而本检测方法可以对所用DNA提取物的纯度进行判断，比传统的测定A260/A280方法更为可靠。在药物分析领域，该方法可以对质粒DNA药品的RNA含量进行中控检测和放行检测，从而保证产品质量可控，并可验证工艺对于质粒DNA的纯化效果。

附图说明

图1实例1方法标准品的色谱图；(图1中1为质粒DNA，2为RNA)

图2实例1方法样品的色谱图；(图2中1分为质粒DNA，2为RNA)

图3实例1方法标准品与样品叠图的谱图；(图3中1-3分别为质粒DNA、RNA及溶剂峰)

图4实例2方法DNA、RNA混合标准品的色谱图；(图4中1为质粒DNA，2为RNA)

图5实例3方法DNA标准品和RNA标准品的色谱图；(图5中1为质粒DNA，2为RNA)

具体实施方式

以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术人员所熟知的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1

(1)仪器与色谱条件

高效液相色谱仪：Agilent 1260infinity高效液相色谱系统及工作站；

色谱柱：TSK 5000PWXL(7.8mm×30cm，10μm)的聚甲基丙烯酸酯色谱柱；

配制0.05mol/L磷酸二氢钠，0.2mol/L氯化钠溶液，用1N NaOH调节pH至7.5为流动相，设置流速为0.5mL/min，检测波长为260nm，柱温20℃。

(2)实验步骤

取DNA标准品和RNA标准品，经稀释和混合后制得含0.036mg/mL RNA和0.12mg/mLDNA的标准品，作为标准品分析溶液，记为RNA、DNA混合标准品；

取上述混合标准品12μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果见附图1，1为DNA出峰，2为RNA出峰。

(3)结果分析

色谱图见下图1，可见样品成分中的RNA与DNA分离度较好，该方法可以用于半定量测定DNA样品中的RNA含量。

实施例2

(1)仪器与色谱条件

高效液相色谱仪：Agilent 1260infinity高效液相色谱系统及工作站；

色谱柱：TSK 5000PWXL(7.8mm×30cm，10μm)的聚甲基丙烯酸酯色谱柱；

配制0.05mol/L磷酸二氢钠，0.2mol/L氯化钠溶液，用1N NaOH调节pH至7.4为流动相，设置流速为0.5mL/min，检测波长为260nm，柱温25℃。

(2)实验步骤

取DNA标准品和RNA标准品，经稀释和混合后制得含0.0038mg/mL RNA和0.38mg/mLDNA的标准品(RNA浓度是DNA浓度的1％)，作为标准品分析溶液，记为RNA、DNA混合标准品；

取上述混合标准品12μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果见附图2，1为质粒DNA出峰，2为RNA出峰。

取待测的质粒DNA样品，稀释至0.38mg/mL，作为样品分析溶液；

取上述待测样品溶液12μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果见附图3，1为质粒DNA出峰，2为RNA出峰。

由于标准品和样品的RNA含量低，所以RNA色谱峰的峰高低，在全色谱图上不可见。叠图色谱图2和3并放大出峰区域后得图3，可见质粒DNA与RNA杂质具有一定的分离度，可通过比较样品与标准品的RNA峰出峰情况，来半定量测定样品的RNA百分含量。

(3)结果分析

实施例2依据本专利所述方法对样品及标准品进行检测，并对两张色谱图进行分析。叠图情况如图4所示，DNA与RNA分离效果较好，样品的RNA峰较标准品的低。样品的RNA含量低于1％，证明该方法可用于测定DNA样品中RNA含量的半定量测定。

实施例3

我们进行该方法的摸索时，发现尺寸排阻色谱柱的粒径和孔径对DNA和RNA的分离效果影响较大。

(1)仪器与色谱条件

高效液相色谱仪：Agilent 1260infinity高效液相色谱系统及工作站；

色谱柱：TSK 3000PWXL(7.8mm×30cm，10μm)的聚甲基丙烯酸酯色谱柱；

配制0.05mol/L磷酸二氢钠，0.2mol/L氯化钠溶液，用1N NaOH调节pH至7.0为流动相，设置流速为0.5mL/min，检测波长为260nm，柱温25℃。

(2)实验步骤

取DNA标准品，经稀释后得含0.12mg/mL DNA的标准品，作为标准品分析溶液，记为DNA标准品；

取RNA标准品，经稀释后得含0.12mg/mL RNA的标准品，作为标准品分析溶液，记为RNA标准品；

分别取上述标准品12μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果见附图5，1为DNA出峰，2为RNA出峰。

(3)结果分析

色谱图见下图5，可见用TSK 3000PWXL(7.8mm×30cm，10μm)色谱柱分离DNA和RNA时，其分离度劣于TSK 5000PWXL(7.8mm×30cm，10μm)色谱柱。

Claims (9)

1.一种半定量测定DNA中RNA百分含量的SEC-HPLC方法，包括下列步骤：

a)配制分析溶液

用纯水稀释标准品和样品，制成分析溶液；

b)色谱条件

色谱柱为尺寸排阻色谱柱；

以磷酸钠盐-氯化钠的混合液为流动相，流动相pH范围7～8；采用等梯度洗脱方法，流速为0.3-0.6ml/min；柱温为20-30℃；检测波长为260nm；

c)上机测定

取步骤a)制成的分析溶液12-50μl注入高效液相色谱仪，进行色谱分析，并记录色谱图。

2.根据权利要求1所述的SEC-HPLC方法，其特征在于：所述纯水为分子生物级别。

3.根据权利要求1所述的SEC-HPLC方法，其特征在于：所述尺寸排阻色谱柱的规格为：柱长介于300mm-340mm之间，色谱柱内径介于5mm-10mm之间，粒径介于7-13μm之间，孔径介于20-200nm之间。

4.根据权利要求3所述的SEC-HPLC方法，其特征在于：所述尺寸排阻色谱柱为TSK5000PWXL，柱长30cm，内径7.8mm，粒径10μm的聚甲基丙烯酸酯色谱柱。

5.根据权利要求1所述的SEC-HPLC方法，其特征在于：所述磷酸钠盐-氯化钠混合溶液，磷酸钠盐的浓度为0.04-0.06mol/L，氯化钠溶液浓度为0.1-0.3mol/L，pH 7～8。

6.根据权利要求5所述的SEC-HPLC方法，其特征在于：所述磷酸钠盐-氯化钠混合溶液，磷酸钠盐浓度为0.05mol/L，氯化钠溶液浓度为0.2mol/L，pH7.4。

7.根据权利要求4-6任一项所述的SEC-HPLC方法，其特征在于：所述磷酸钠盐选自磷酸二氢钠或磷酸氢二钠的一种或几种。

8.根据权利要求1所述的SEC-HPLC方法，其特征在于：所述尺寸排阻色谱柱为聚甲基丙烯酸酯色谱柱，所述流动相为磷酸钠盐溶液与氯化钠混合溶液，磷酸钠盐溶液0.05mol/L，氯化钠溶液0.2mol/L，所述流动相进行等梯度洗脱。

9.根据权利要求1所述的SEC-HPLC方法，其特征在于：所述样品为生物实验用DNA样品或药用DNA样品。

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