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Abstract

本发明公开了一种简易快速的蛋白质分离纯化方法，包括如下步骤：在透析管中添加亲和层析填料，用Buffer 1平衡，将待分离蛋白溶液添加到透析管中，混匀数次，静置或慢速离心；将收集液同样反复处理三到四次；用Buffer 2洗脱杂蛋白；用Buffer 3将目的蛋白洗脱下来；将收集得到的蛋白溶液，进行SDS‑PAGE电泳检测；亲和层析填料用Buffer 4反复清洗离心管三到四次，用20％乙醇溶液液封，置于4℃层析柜保存备用。本发明能够快速有效地去除杂蛋白，富集目标蛋白；提高了蛋白质的分离和纯化效率，大大降低了蛋白质的损失；操作简便，设备均可回收重复使用。

Description

一种简易快速的蛋白质分离纯化方法
技术领域
本发明涉及蛋白质分离领域，具体涉及一种简易快速的蛋白质分离纯化方法。
背景技术
大多数蛋白质在组织细胞中都是和核酸等生物分子结合在一起，而且每种类型的细胞都含有成千上万种不同的蛋白质。许多蛋白质在结构、性质上有许多相似之处，所以蛋白质的分离纯化是一项复杂的工作。蛋白质的分离纯化是用生物工程下游技术从缓冲溶液中分离纯化出某种目的蛋白的方法，在蛋白质工程和分子生物学中应用广泛，为研究蛋白质结构与功能打下了坚实基础。现有蛋白质分离纯化技术主要包括：沉淀法、吸附层析、离子交换层析、凝胶过滤、亲和层析、聚焦层析、气相色谱、高效液相色谱等方法。但到目前为止，还没有一套通用现成的方法能把任何一种蛋白质从复杂的混合物中提取出来，并且蛋白质分离纯化技术过程复杂，需要多种设备配合，提取效率低，可批次间稳定性差，仅可用于蛋白质的实验室研究，而无法达到规模生产要求。
为了提高蛋白质分离纯化的效果，提高提纯率、提纯产量和提取稳定性，出现了具有高度集成的蛋白质分离纯化设备，这些设备的可重复好，提取效率高。但是，这些蛋白质分离纯化的设备大都非常昂贵(如AKTA分离纯化系统)，耗时较长，对于科研经费紧张的科研院所与企业不易大量的推广。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种简易快速的蛋白质分离纯化方法，该方法无需昂贵的蛋白质分离纯化设备即可进行带有组氨酸的蛋白以及多肽的分离纯化工作。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
本发明提供一种简易快速的蛋白质分离纯化方法，包括如下步骤：
S1、在透析管中均匀添加一定量的亲和层析填料，用Buffer 1平衡后，将待分离蛋白溶液缓慢添加到透析管中，上下颠倒混匀数次，静置使溶液缓慢流下或2000rpm慢速离心；
S2、将步骤S1收集管得到的溶液重新倒回分离管中，上下颠倒混匀数次，静置，如此反复三到四次；
S3、将步骤S2最后一次结合的离心液弃掉，在分离管中加入Buffer 2洗脱杂蛋白；
S4、将步骤S3最后一次结合的离心液弃掉，在分离管中加入Buffer 3将目的蛋白洗脱下来；
S5、取步骤S4收集管收集的蛋白溶液，进行SDS-PAGE电泳检测；
S6、纯化之后用Buffer 4反复清洗离心管三到四次，用20％乙醇溶液液封，置于4℃层析柜保存备用。
优选地，所述亲和层析填料为镍离子金属鳌合亲和层析介质(Ni-NTA)。
优选地，所述Buffer 1包含以下组分：
20mmol/L Tris.base,300mmol/L NaCl,15mmol/L imidazole,1mmol/Lβ-ME,溶液终浓度为pH 8.0。
优选地，所述Buffer 2包含以下组分：
20mmol/L Tris.base,50mmol/L NaCl,15mmol/L imidazole,1mmol/Lβ-ME,溶液终浓度为pH 8.0。
优选地，所述Buffer 3包含以下组分：
20mmol/L Tris.base,50mmol/L NaCl,150mmol/L imidazole,1mmol/Lβ-ME,溶液终浓度为pH 8.0。
优选地，所述Buffer 4包含以下组分：
20mmol/L Tris.base,200mmol/L NaCl,250mmol/L imidazole,1mmol/L EDTA,1mmol/Lβ-ME,溶液终浓度为pH 7.5。
本方法可选择型的纯化含有多个组氨酸的蛋白以及多肽。
本发明优点在于：
本发明提供一种简易快速的蛋白质分离纯化方法，通过填装镍离子金属鳌合亲和层析介质，以及经过不同缓冲液的洗脱，能够快速去除杂蛋白，富集目标蛋白；提高了蛋白质的分离和纯化效率，大大降低了蛋白质的损失；该方法能够一次性处理1g-500g带有组氨酸的蛋白或多肽的大肠杆菌，达到电泳纯(>95％)，根据表达的可溶性外源蛋白的量，纯化的外源蛋白产量可达到10mg至10g蛋白。该方法操作简便，材料可回收重复使用，节约资源。该方法可用于所有使用镍离子金属鳌合亲和层析介质的含有多个组氨酸的蛋白以及多肽。
附图说明
图1为MDM2蛋白结构示意图。
图2为pET-28a(+)的质粒图谱。
图3为本发明提供的简易快速的蛋白质分离纯化方法的提纯的MDM2蛋白的SDS-PAGE电泳检测结果图。
具体实施方式
为了使本发明的分离纯化优势更加明确，结合以下实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明所用Ni-NTA琼脂糖购自武汉金益肽生物有限公司，货号：JYT-M0007。
本发明所用其他试剂均为分析纯。
人类MDM2蛋白含有491个氨基酸，可以分成：N末端p53结合区，中央酸性区，锌指区域和C末端RING指，如图1所示(聂海祺等，2006)。其N末端p53结合区和C末端RING区是p53泛素化和出核所必需的(Boyd,S.D.,Tsai,K.Y.,and Jacks,T.2000.An intact HDM2RING-finger domain is required for nuclear exclusion of p53.Nat.Cell Biol.2:563–568.；Honda,R.and Yasuda,H.2000.Activity of MDM2,a ubiquitin ligase,towardp53or itself is dependent on the RING finger domain of the ligase.Oncogene19:1473–1476.)。其中，中央酸性区和锌指结构与许多调节MDM2功能的蛋白质相结合。为了获得表达MDM2蛋白的大肠杆菌，将与MDM2功能蛋白质相结合的锌指结构和部分中央酸性区域(第250-402位氨基酸)，序列见SEQ ID No.2的DNA编码序列(见SEQ ID No.1)克隆到如图2所示的带有组氨酸标签(组氨酸标签的编码序列位于载体的第270-287位)的表达质粒载体pET-28a(+)的克隆位点Nde1和BamH1之间，得到表达载体pET28a-MDM2，然后将该表达载体转化到大肠杆菌(E.coli)DH5α中，对鉴定转化成功的大肠杆菌菌株进行扩增，获得用于表达大肠杆菌的菌体。上述所采用的方法均为分子生物学领域常规方法。
实施例1从大肠杆菌中分离和纯化MDM2蛋白
称取1g冻存于-80℃冰箱中表达MDM2蛋白的大肠杆菌(E.coli)菌体，加入10mlBuffer1，上下颠倒混匀。超声工作时间为工作3s，间歇5s，循环90+30次，功率为360W。13000rpm，4℃离心1h，留上清，弃沉淀。
取0.5ml Ni-NTA琼脂糖于2ml透析管中，加入1ml Buffer1(20mM Tris.base,300mM NaCl,15mM imidazole,1mMβ-ME,pH 8.0)平衡，静置5分钟后，2000rpm离心30s。平衡两次。
将细胞破碎后的上清分次加入到平衡后的透析管中，将收集管中的液体再倒回透析管中重复一次，使用混匀仪混匀，使蛋白与Ni-NTA beads充分接触，2000rpm离心30s。
再用2ml Buffer2(20mM Tris.base,50mM NaCl,15mM imidazole,1mMβ-ME,pH8.0)于透析管中，上下颠倒混匀，静置约2分钟，2000rpm离心30s。倒掉收集管中的液体，再重复步骤5次，取第五次的滤出液测OD260，看非特异性蛋白残留，如果需要，多洗几次，每次均需2000rpm离心30s。直至OD260接近0。
加入0.5ml Buffer3(20mM Tris.base,50mM NaCl,150mM imidazole,1mMβ-ME,pH8.0)于透析管中，静置5分钟，2000rpm离心30s，保留滤出液，再加入0.5ml Buffer3于透析管中，静置5分钟，2000rpm离心30s，两次滤出液合并，取10ul，电泳检测蛋白质纯度，OD260检测MDM2蛋白质浓度，浓缩至10mg/ml。
Ni-NTAbeads的回收。加入1ml Buffer4(20mM Tris.base,200mM NaCl,250mMimidazole,1mM EDTA,1mMβ-ME,pH 7.5)于透析管中，清洗两次。用20％乙醇液封透析管4℃保存。
MDM2蛋白分离纯化结果通过SDS-PAGE电泳进行检测，其结果如图3所示：其中M为标准蛋白Marker；T为超声破碎后溶液；S为超声破碎离心上清液；P为超声破碎离心沉淀；S1为纯化Buffer2洗脱液；S2为纯化蛋白MDM2。
由S2蛋白条带可判断MDM2的分子量约为22.4kDa，且条带清晰，说明亲和层析纯化MDM2效果很好，可直接用于进行后续实验研究。经计算MDM2蛋白的提取率，采用1g菌体，获得了20mg电泳纯的蛋白质。
从上述实施例可以看出，本发明提供的简易快速的蛋白质分离纯化方法，在提取带有组氨酸的蛋白以及多肽时，通过镍离子金属鳌合亲和层析介质和不同缓冲液的洗脱，可以快速去除杂蛋白，富集目标蛋白，提高了蛋白质的分离和纯化效率，大大降低了蛋白质的损失，操作简便，层析材料可以回收重复使用，节约成本，该方法能够一次性处理1g-500g带有组氨酸的蛋白或多肽的大肠杆菌，达到电泳纯(>95％)，根据表达的可溶性外源蛋白的量，纯化的外源蛋白产量可达到10mg至10g蛋白，可用于单一蛋白质的生产，而无需购买专门的蛋白纯化设备，为研究和生产人员节省了设备的购买和维护成本。

Claims (2)

1.一种简易快速的蛋白质分离纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、在透析管中均匀添加一定量的亲和层析填料，用Buffer 1平衡后，将待分离蛋白溶液缓慢添加到透析管中，上下颠倒混匀数次，静置使溶液缓慢流下或2000rpm慢速离心；
S2、将步骤S1收集管得到的溶液重新倒回分离管中，上下颠倒混匀数次，静置，如此反复三到四次；
S3、将步骤S2最后一次结合的离心液弃掉，在分离管中加入Buffer 2洗脱杂蛋白；
S4、将步骤S3最后一次结合的离心液弃掉，在分离管中加入Buffer 3将目的蛋白洗脱下来；
S5、取步骤S4收集管收集的蛋白溶液，进行SDS-PAGE电泳检测；
S6、纯化之后用Buffer 4反复清洗离心管三到四次，用20％乙醇溶液液封，置于4℃层析柜保存备用；
其中，所述Buffer 1包含以下组分：
20mmol/L Tris.base,300mmol/L NaCl,15mmol/L imidazole,1mmol/Lβ-ME,溶液终浓度为pH 8.0；
所述Buffer 2包含以下组分：
20mmol/L Tris.base,50mmol/L NaCl,15mmol/L imidazole,1mmol/Lβ-ME,溶液终浓度为pH 8.0；
所述Buffer 3包含以下组分：
20mmol/L Tris.base,50mmol/L NaCl,150mmol/L imidazole,1mmol/Lβ-ME,溶液终浓度为pH 8.0；
所述Buffer 4包含以下组分：
20mmol/L Tris.base,200mmol/L NaCl,250mmol/L imidazole,1mmol/L EDTA,1mmol/Lβ-ME,溶液终浓度为pH 7.5。
2.根据权利要求1所述的一种简易快速的蛋白质分离纯化方法，其特征在于，所述亲和层析填料为镍离子金属鳌合亲和层析介质。
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人胰蛋白酶原-2 在大肠杆菌中的表达、纯化与活性测定;涂艳等;《复旦学报(自然科学版)》;20041231;第43卷(第6期);第1067-1072、1078页
基于Fe3O4@ SiO2 / Ni-NTA 磁性微球的His鄄tag 融合蛋白纯化体系的建立;王文加;《高等学校化学学报》;20120229;第33卷(第2期);第3030-307页

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