CN111602050B - 应用径向技术色谱的系统和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种使用多个珠粒的应用径向技术色谱的系统和方法，其中每个珠粒中包括一个或多个直径为约至约

Description

应用径向技术色谱的系统和方法
技术领域
本发明涉及径向流柱色谱，更具体地，涉及一种包含特定尺寸和参数的珠粒以增强未澄清的进料流过滤的径向流柱，以及选择珠粒的方法。
背景技术
如通常所使用，色谱是一种用于分离样品混合物中各种组分的技术。在液相色谱系统中，将样品，随后是洗脱液注入色谱分离柱中。分离柱包含与待分离样品的各种组分相互作用的填料、基质介质或物质。分离介质的组成取决于被导入通过的液体以实现所需的分离。当样品和洗脱液通过分离介质时，由于不同的相互作用，样品的不同组分会以不同的速率通过分离介质。这些组分在出口或流出物处与分离介质出现分离。
各种类型的垂直流和水平流分离柱在本技术领域中是已知的。由于高效色谱的需要，水平流型色谱柱已得到发展。这种水平流或径向流柱被描述在，例如美国专利号4,627,918和4,676,898中。在水平流或径向流类型的柱中，样本和洗脱液通过分配器引入到分离介质或基质的外周或圆周壁或表面，液体水平地或径向地向内穿过分离介质到达中央或收集端口，然后以不同的时间和不同的速率从柱中洗脱。
之后，色谱柱和方法被发展为对粗进料的直接处理，来用于分离生物活性物质，所述生物活性物质包括细胞/发酵收获物、组织提取物、藻类、植物来源的细胞和物质以及血浆/血液。大珠粒色谱介质被填充到一个标准的、低压色谱柱中，该色谱柱中端板筛被替换为大孔筛(60-180μm孔)。大孔隙可防止柱堵塞。由于颗粒尺寸大，细胞物质在珠粒之间的颗粒间内腔流动，而可溶性产物会被珠粒上的官能团捕获。
传统上，细胞培养/发酵收获的生物制剂的下游处理需要两个主要操作：i)制备进料流和ii)回收和纯化。在施用至柱前，应该适当地制备样品。这既耗时又可能十分昂贵。如果需要制备样品，一般会稀释进料流以降低细胞密度、粘度和盐浓度，所有这些操作都有利于改善回收和纯化。回收涉及通过离心和/或微滤去除细胞和其他颗粒物质，以及减少初始体积的步骤，通常是超滤。由于常规的色谱介质很快被细胞碎片污染，因此纯化操作必须是无颗粒进料。
离心和过滤不仅是漫长和昂贵的操作，它们还会有损质量。从破裂的细胞中释放的蛋白酶会降解目标蛋白，进一步复杂化纯化方法发展的任务，增加纯化成本。与浓缩的细胞碎片接触的时间越长，失去的产物就会越多。
从未澄清的进料中直接捕获蛋白产品将使产品降解最小化，提高产品质量、产量和方法经济性。此外，如果将产品捕获和细胞去除步骤合并为一个单一的操作，将大大简化资本密集型回收操作。
从未澄清的进料中直接捕获产品有两种方法，所述未澄清的进料如细胞培养/发酵收获物或其他生物样品(如血浆)。一种方法提出了捕获树脂颗粒的流态化(fluidization)。通过流态化，单个颗粒被分离，使碎片能够畅通无阻地离开柱床。
这种方法存在几个问题。流态化床系统以预定的高流速运行，并且在改变柱尺寸的操作或方法上没有灵活性。该系统的缓冲液消耗量高于填充床系统，这是高价值药物产品的一个主要的成本因素，其中许多需要专门的缓冲液来对其进行纯化。柱体积与固相颗粒体积的比率非常高。由于没有足够的时间使目标分子完全扩散到固相中，这将负面地影响柱内的停留时间和结合能力。此外，颗粒会在柱床内碰撞，固相碎片会产生所谓的“细粉”，降低柱的性能和再利用。流态化床的操作也需要专门的、昂贵的硬件和色谱介质。
另一种方法是使用填充床柱来去除颗粒。由于以下原因，这一途径在很大程度上仍未得到探索。清除在填充床柱上的细胞碎片需要使用大的，最好是球形颗粒。这些颗粒在颗粒间内腔中需要足够的空间来使细胞或其他同等尺寸的颗粒离开柱子。
使用大颗粒(珠粒)的缺点是其蛋白质的结合能力为每单位体积的凝胶床的可用表面的功能。因此，随着颗粒直径的增加，可以观察到结合能力的损失。当颗粒直径从0.1mm增加到1mm时，比如用于处理致密的细胞悬浮液时，大约90％的蛋白质结合能力会损失。这使得填充床柱对于处理粗品加工的进料流是不实用的。
然而，填充床柱操作提供简单性、高效和经济性。它是灵活的，并且相对容易按比例扩大。不需要专门的颗粒、设备或培训操作人员。标准色谱的生产所占空间相对较小，并且不需要调整生产设备的高度以适应流态化床设备。
产品应用率是操作通量方面的另一个重要问题。对于流化态床系统，这是预先确定的，但对于填充柱系统，只有反应结合动力学是速率的限制因素。这允许更高的通量，比流态化床系统高3-10倍。
在产品捕获后，通过短暂的高速清洗脉冲去除残留的细胞物质。然后用经典的洗脱方法洗脱该产品。因此，已知的大珠粒色谱树脂可通过结合细胞去除和同时捕获产品，在填充床柱中直接处理细胞培养物或发酵液以及其他未澄清的进料。
美国专利号5,466,377提出了一种方法和大珠粒色谱颗粒，用于在标准的、低压的填充床色谱柱上从未澄清的工艺液体中直接捕获所需产品。
用改进的色谱材料和方法在填充床柱上来实现粗进料的直接处理仍存在需求，所述粗进料例如细胞培养/发酵收获物、组织提取物、细胞碎片、病毒、血浆、来源于蔬菜或水果提取物的废弃物进料流或来源于乳汁处理或其他天然材料来源的废弃物进料流。
发明内容
本发明公开了一种径向流色谱柱，包括：多个珠粒，每个珠粒中包括一个或多个孔，和在珠粒之间形成的间隙通道。每个孔的直径为约至约/>至少约80％的珠粒直径为约200μm至约500μm，并且珠粒的平均半径R在约100μm至约250μm之间。珠粒可以是单分散的(即所有珠粒的半径为目标半径或标记半径的±约10％)或可以具有r<0.414R或r<0.225R的已被去除。
本发明还公开了一种选择用于径向流色谱柱中的珠粒的方法。该方法包括：a)基于进料流中存在的成分(或感兴趣的颗粒)确定窄的所需珠粒半径R范围；b)去除在所需珠粒范围外的所定义半径r的珠粒；和c)定义在所需珠粒范围内的珠粒半径R的百分比。半径为r的珠粒可以通过湿筛或干筛和/或淘洗去除。被去除的珠粒可以是具有半径r<0.414R或r<0.225R的珠粒。
本发明在此还公开了一种使用径向流色谱柱纯化未澄清的进料流的方法，包括：多个珠粒，每个珠粒中包括一个或多个孔，和在珠粒之间形成的间隙通道，其中每个孔的直径为约至约/>至少约80％的多个珠粒的直径为约200μm至约500μm，并且珠粒的平均半径R在约100μm至约250μm之间。该方法包括：a)用珠粒填充径向流柱；b)处理含有感兴趣颗粒的澄清的进料流，以校准纯化条件；c)从步骤b的结果确定感兴趣颗粒的结合；d)处理含有感兴趣颗粒的未澄清的进料流。
具体实施方式
本发明提供了径向流柱及其制备和使用方法，用于粗生物进料流的直接过滤(即处理)，所述粗生物进料流例如，未澄清的(即未过滤的)细胞培养物。本公开主题以实质上更低的成本和更快的处理实现了纯化，特别地，相比于如填充床色谱和膨胀床色谱的方法。示例性应用包括血浆的分离；细胞培养物的生物处理以分离和纯化蛋白(特别是药物，如赫赛汀、胰岛素、阿瓦斯汀等)；病毒和病毒样(vims-like)颗粒的捕获和纯化；来源于蔬菜或水果提取物的废弃物进料流和来源于乳汁处理或其他天然物质来源的废物进料流的纯化。
本发明公开的色谱能够惊人地和有效地允许整个细胞和其他颗粒无损坏地通过所公开的珠粒的周围和之间，而不堵塞凝胶床，并且允许细胞培养物的未澄清的(未过滤的)进料流直接通过，所述细胞培养物包括整个细胞、细胞碎片、天然或重组植物物质的匀浆、纳米颗粒溶液和/或其他颗粒(通常堵塞具有小珠粒的柱子)。它还能够在进料流中选择性地结合感兴趣的分子目标，随后可以回收这些分子目标。例如，对于IgG的纯化，可以通过将蛋白A或蛋白G共价结合到珠粒的表面使珠粒能够功能化，从而允许可逆的IgG结合，然后进行清洗和随后的洗脱。对于病毒和VLP捕获，可以将珠粒修饰为具有高外表面积和高(正)电荷密度。
本发明所公开的是一种径向流色谱柱，其包括多个珠粒，每个珠粒中包括一个或多个孔，和在珠粒之间形成的间隙通道。
所述径向流柱可以按照任何已知的径向流柱制成，但本文特别讨论的关于珠粒、凝胶床、孔和通道的不同之处除外。径向流柱结晶态的床长度为约3cm至约50cm，和床体积(V)的范围为约5ml至约1000公升。所述径向流柱的形状可以为“圆环(donut)”(全尺寸径向流柱，具有正圆空心圆柱的形式)、“块状物(cake)”片(具有梯形棱柱的形式，即小部分的圆环状，具有相同的床长度/半径和曲率，但是更小体积)，或截断“圆锥体(cone)”(具有截头体或截断的圆锥体的形式，从块状物或圆环中取出小圆柱芯段产生，具有相同的床长度/半径和曲率，但是具有比“块状物”更小的体积)。
所述柱可以包括一个或多个多孔过滤玻璃料。通常具有外部芯玻璃料和内部芯玻璃料。每个过滤玻璃料的孔径可以在约40μm至约300μm之间，约80μm至约250μm之间，或约100μm至约200μm之间。该芯玻璃料可以由任何传统已知的材料制成。可选地，它可以由不锈钢或不锈钢和一种或多种聚合物(例如，但不限于聚乙烯(PE)或聚丙烯(PP))制成。
“圆环”、“块状物”或“圆锥体”形状的径向流柱都具有外部芯玻璃料面积与内部芯玻璃料面积的恒定比率。这个比率可以是在1.5：1至10：1的范围。优选的范围是2：1至4：1。具有相同床长度和外部到内部外芯玻璃料面积比率的三种不同形状的流体动力学实际上是相同的。
珠粒可以是球形或近球形的。珠粒可以由聚合物、玻璃、氧化铝、金属或其他、半结晶态或非晶态材料、二氧化硅、可控微孔玻璃(CPG)、纤维素、囊封的铁颗粒、囊封的CPG、囊封的二氧化硅或其任何组合制成。聚合物珠粒可以由任何本领域使用的已知的聚合物制成，例如聚丙烯酸酯(如甲基丙烯酸酯)、聚苯乙烯或多糖(如葡聚糖、普鲁兰、琼脂糖)或天然或结合的聚硅酸盐。所述珠粒可由两种或以上的均匀或不均匀混合的聚合物组成。聚合物珠粒可以是球形(或近球形)的多糖珠粒。
所述珠粒的平均直径可以在约200μm至约1000μm之间，或者在约200μm至约500μm之间。在一个实施方式中，至少80％的聚合物珠粒的直径为约200μm至约500μm，或至少约85％，或至少约90％的聚合物珠粒的直径为约200μm至约500μm。
这些珠粒的平均半径(R)在约100μm至约500μm之间，或者在约100μm至约250μm之间。
大多数珠粒通常不是单分散的(所有尺寸相同的，直径相同)，而是有一个超出给定范围的直径范围。因此，例如，这种测量意味着珠粒总质量(或体积)的80％落在200-500μm内。其余20％(与如何定义百分比无关)在范围之外，更小或更大。为了使间隙通道不堵塞，重要的是，在柱子填充前的一定时间内去除或至少耗尽给定范围外的20％的较小的珠粒。如果与通道直径几乎相同尺寸的较小的珠粒没有被耗尽或去除，200-500μm之间的珠粒的凝胶床可能包含足够的小珠粒，会使得通道部分地或完全地阻塞。
一些色谱珠粒可商业购得，通常是按珠粒的直径出售的。然而，给定的直径是珠粒直径的平均值；这并不意味着所有的珠粒都有着给定的直径。其他公司可能通过列出珠粒直径的一个范围来销售珠粒。然而，这是一个其中特定的、有时未被定义的珠粒百分比会落入其中的范围。那么，具有超出给定范围直径的珠粒的总百分比是未知的；很少有落在该范围以上或以下的给定百分比的珠粒。
这些珠粒可能具有官能化基团(例如，离子交换基团、疏水相互作用基团等)，这使得它们能够选择性地结合感兴趣的分子目标(为了以后潜在的回收)。潜在目标包括病毒、病毒样颗粒、蛋白(具体地，但不限于，IgG、IgM、IgY和血液蛋白)、DNA、RNA、寡核苷酸、多肽和细胞。
珠粒中有一个或多个孔。每个孔的直径为约至约/>每个孔可以部分地穿过珠粒而形成末端(dead-end)，也可以穿过珠粒而到达另一个出口点。
间隙通道在填充珠粒之间形成，部分地包括空隙体积。当这些通道宽度足以允许细胞和细胞碎片通过凝胶床而不被堵塞时，并且当没有较小的珠粒时(由于其尺寸，所述较小的珠粒能够限制或阻止细胞和细胞碎片的通过)，使用者可以在色谱纯化步骤之前利用这些填充珠粒来避免不利的过滤或离心、沉淀或其他昂贵、耗时和潜在产品损失的步骤。
单分散的球状珠粒将理想地填充在六方紧密堆积(HCP)或立方紧密堆积(CCP)的配置中。两种填充配置都有相同的最大珠粒(球)密度和相似的填充能量，所以在能量上没有明显的一个优于另一个。尽管聚合物(如多糖、珠粒)的优选的填充配置是不可预测的，但两种填充配置都在珠粒之间形成通道(间隙空间或通道)，其最小尺寸对本文所公开的装置和系统的成功或失败是重要的。
该间隙通道应该为：1)足够大，可以允许细胞、细胞碎片和其他干扰颗粒通过而不堵塞凝胶床；2)没有较小的珠粒，这些珠粒与间隙通道本身的尺寸相似，因此可能堵塞通道；和3)由珠粒直径范围尽可能窄的珠粒群形成，单分散的珠粒的尺寸尽可能接近理想尺寸。
此外，间隙通道不能被压缩得太窄，这样因造成：i)流速太高，ii)压力太高，或iii)珠粒的填充密度太高，从而堵塞间隙通道。间隙通道应该是开放的(即无堵塞)，为处理进料流提供连续的路径。此外，流速过高会使非刚性凝胶床的间隙通道变窄。因此，凝胶床必须有足够的刚性，以允许保证每分钟0.1柱体积到10柱体积的流速，而不使间隙通道变窄(通过珠粒压缩)，而允许细胞和细胞碎片通过凝胶床。
凝胶床的刚性也取决于珠粒本身的刚性。为了使珠粒之间的间隙通道的直径/尺寸的变化最小(假设所有的珠粒都是球形或近球形并且具有给定的尺寸分布)，重要的是颗粒的形态在流动条件下不改变。
一种选择是使用非常坚硬的珠粒，这种珠粒对用于色谱分离的缓冲液是惰性的，因此它们的尺寸和形状不会发生变化；然而，例如用硅或CPG(可控微孔玻璃)制成的珠粒，具有优良的机械刚性和稳定性，但对于氢氧化钠具有很少或不具有耐受性。
聚合物珠粒，例如但不限于甲基丙烯酸酯珠粒或聚苯乙烯珠粒，可以对更多试剂稳定，并且保持刚性。多糖珠粒，例如但不限于葡聚糖珠粒或琼脂糖珠粒，刚性较低，但可以对一些试剂(如NaOH)更稳定。然而，多糖珠粒往往比其他聚合物珠粒“柔软”，因此更容易变为被压缩的。压缩发生的程度取决于液体流过填充的凝胶床所施加的压力。太大的压缩会导致没有流体可能通过的无孔床(其内部孔网络和间隙空间是封闭的)。通常导致压力和压缩增加的关键因素是所施加的液体的流速(通常用mL/min、CV/min或cm/hr表示)和液体粘度。
柔软的多糖珠粒的机械稳定性和刚性可以通过应用某些方式来提高。例如，以下方法将提高珠粒的机械稳定性和刚性：
1.在多糖结构内交联。这将使珠粒更耐压，从而保持珠粒的形态。然而，取决于所应用的交联化学，珠粒结构内的内部孔的尺寸可能会受到影响。
2.增加珠粒配方中使用的一定量的多糖的密度。这通常是用琼脂糖基颗粒完成的。标准商业可购得的琼脂糖珠粒的琼脂糖百分比在约2％至10％之间(每升所制备的珠粒中含有20g至100g琼脂糖)。密度增加的珠粒可能含有≥约6％的琼脂糖。然而，这种密度的增加可能会减小珠粒的内部孔尺寸：
·4％的珠粒的平均分子量截留为约2000万道尔顿；
·6％的珠粒的平均分子量截留为约400万道尔顿。
最佳的间隙通道尺寸取决于珠粒的尺寸，最终取决于进料流中存在的成分。具体地，间隙通道的最佳尺寸取决于想要通过凝胶床的颗粒。确定间隙通道的最优尺寸的方法如下：
1.珠粒尺寸的测定：从将要通过凝胶床的细胞或碎片半径，估计由三个珠粒形成的通道所需的半径(“最窄的通道半径”)，并计算所需的最小珠粒尺寸。
2.从凝胶去除尺寸分数的确定：从珠粒的半径(单分散珠粒半径或多分散珠粒半径的平均值)，计算四面体和八面体位置的半径长度。这些位置的半径是必须从凝胶中去除的最大的珠粒的半径。
然后，计算了理论上可以通过三个完全相同的球体之间形成的最小通道的小球体的最大直径。通道的直径可能比存在于未澄清的进料流中最大颗粒(即细胞、细胞碎片或其他颗粒)的直径大约3至约10倍，或约4至约6倍。
对于单分散珠粒的立方紧密堆积、六方紧密堆积或巴洛堆积，完全固定，振动到无填充密度的可测量的变化(开普勒猜想)，以下成立：
·四面体位置半径rtet＝0.225R(R是珠粒的半径，rtet是四面体位置的半径)；
·八面体位置半径roct＝0.414R(R为珠粒的半径，roct为八面体位置的半径)；
·最窄通道半径rcha＝0.155R(R是珠粒的半径，rcha是通道的半径)；
·半径为x的珠粒，其中0.155R<x<0.414R，其尺寸可适合并永久占据一个八面体位置。
·半径为x的珠粒，其中0.155R<x<0.225R，其尺寸可适合并永久占据一个四面体位置。
四面体和八面体“洞”总是存在于填充珠粒的床中。这些洞是基于围绕并形成洞的珠粒的数量，被命名为四面体或八面体。
对于多分散珠粒的随机紧密堆积，上述数值为最小值，实际值可能更大。通道半径rcha＝0.155R应当是细胞、碎片或颗粒半径的1.1倍(优选地约2至约4倍)的最小值，以便细胞、碎片或颗粒可以容易地通过凝胶床。
单分散珠粒可通过以下制备：
a.生产具有最佳半径和完全不含小珠粒的单分散珠粒；
b.在乳化过程中，通过严格控制条件来制备范围窄的多分散珠粒。这些条件包括：加入最佳类型和最佳量的乳化剂，保持最佳的搅拌速度，保持最佳的温度，这些条件都有助于使所形成的珠粒的尺寸分布变窄；
c.湿筛或干筛，以去除比所选尺寸更小(或更大)的颗粒；和/或
d.淘洗以去除比确定尺寸更小的颗粒。
为了改善过滤，可以在填充凝胶床之前去除可能堵塞间隙通道的更小珠粒。
采取以下一些或全部步骤，可改善间隙通道的形式和功能：
a.例如，使用下表1-3所示的信息，计算/确定所需平均珠粒半径R，以允许细胞、细胞碎片或其他颗粒通过。
b.形成凝胶床，其中半径r<0.414R的珠粒已被去除。
i.去除所有半径r<0.414R的珠粒，将会形成具有最大流量和孔隙度，较短路径的凝胶床。其优点是更快速的纯化处理。
c.形成凝胶床，其中半径r<0.225R的珠粒已被去除。
i.去除所有半径r<0.225R的珠粒，将会形成具有在一定程度的降低的孔隙率、增加的路径长度和增加的停留时间的凝胶床。其优点是更有效的纯化。
d.去除半径r<0.225R或r<0.414R的小珠粒，可防止凝胶床的间隙通道拥堵/堵塞。这也将会减少纯化周期期间需要的凝胶床的清洗量。
e.将要去除的珠粒的半径r最多增加25％(即，被去除的珠粒的半径r比其他珠粒的半径r大25％)。
f.尽可能使珠粒的尺寸分布变窄，以实现降低随机紧密堆积密度，和接近立方紧密堆积/六方紧密堆积密度。
表1
表2
表3
另一个实施方式是选择用于径向色谱凝胶床的珠粒的方法，该方法包括：a)基于进料流中存在的成分(或感兴趣的颗粒)确定窄的所需珠粒的直径(或半径)范围；b)去除在所需珠粒直径范围外的所定义直径(或半径)的珠粒；和c)定义在所需珠粒直径范围内的珠粒直径(或半径)的百分比。
另一个实施方式是使用上述公开的径向流柱过滤未澄清的进料流的方法，包括以下步骤：
a.用珠粒填充径向流柱；
b.处理含有感兴趣颗粒的澄清的进料流以校准纯化条件；
c.从步骤b的结果确定感兴趣颗粒的结合；和
d.处理包括选择蛋白质的未澄清的进料流。
感兴趣颗粒可能是整个细胞、细胞片段、病毒或蛋白质。其也可能是VLP、DNA、RNA、抗原、脂质体、寡糖或多糖。
用珠粒填充径向流柱后，在实际对未澄清的进料流进行常规纯化之前，使用澄清的进料流计算最佳的纯化条件。这有助于了解感兴趣颗粒(如蛋白质)如何与柱(RFC，ZetacellTM)结合。为了未澄清流的纯化，可以使用正向和反向清洗以去除细胞/细胞碎片痕迹。在按比例扩大/使用圆环形状之前，可以使用块状物或圆锥体形状进行小规模优化。该方法可与“模拟移动床”(“SMB”)/连续方法一起进行。
根据色谱中使用的试剂系统，聚合物珠粒会收缩和膨胀，从而增加和减少内部孔直径和珠粒(球形)之间的间隙空间。具有二氧化硅和CPG的颗粒不会出现这种情况，但所有以聚合物和多糖颗粒为基础的凝胶床都会出现这种情况。通过普通技术人员谨慎选择用于填充柱和在常规操作使用的缓冲系统，膨胀和收缩的影响可以得到控制(全部地，几乎全部地，或至少部分地)。
在使用直接在含有聚合物珠粒作为凝胶床的小径向流色谱柱上的澄清的进料流最佳化该方法后，线性按比例扩大至更大工艺规模可以通过以下实现：保持床长度、保持外部与内部玻璃料面积的比率和保持该方法(负载澄清或未澄清的进料流，正向和反向清洗以去除细胞、细胞碎片和非结合物质，洗脱以从固相中释放直接捕获的目标，再生以清洁和制备柱和固相用于后续再使用)的每一步的所有操作参数(流速、单位时间内柱体积量、缓冲液成分、保留时间、固相、压力和温度)。如果在任何时候需要重新校准、重新优化或以其他方式改变该大规模纯化系统，线性按比例缩小到可控的，以及小的RFC柱也可以通过以下实现：保持床长度、保持外部与内部玻璃料面积的比率和保持该方法的每一步(负载澄清或未澄清的进料流，正向和反向清洗以去除细胞、细胞碎片和非结合物质，洗脱以从固相中释放直接捕获的目标，再生以清洁和制备柱和固相用于后续再使用)的所有操作参数(流速、单位时间内柱体积量、缓冲液成分、保留时间、固相、压力和温度)。
上述说明了实施本发明的一些可能性。因此，虽然已经描述了具体的示例实施方式，但显然可以对这些实施方式进行各种修改和变更，而在不偏离本发明的更广泛的范围的情况下；在本发明的范围和精神内，许多其他实施方式是可能的。为了简化本发明的目的，将各种特性组合在一个单一的实施方式中。本发明的方法不应解释为反映所要求保护的实施方式具有比在每个权利要求中明确列举的更多的特征。相反，正如下列权利要求所反映的，发明主题内容在于少于单一公开实施方式的所有特征。因此，下列权利要求特此并入本发明的上述说明书，每一项权利要求单独地作为一个示例实施方式。
应当注意的是，可以设想，在本文中明确标识的任何特征或元素也可以被确切地排除为如权利要求中所限定的本发明的实施例的特征或元素。还应注意的是，可以设想，任何被明确标识(或确切地或暗示地被排除)的特征或元素，可与其他任何被明确标识(或确切地或暗示地被排除)的特征或元素的结合使用。

Claims (18)

1. 一种径向流色谱柱，用于通过直接过滤未澄清的进料流来纯化感兴趣的颗粒，其包括：
多个珠粒，所述珠粒填充在径向流色谱柱中，和
珠粒之间形成的未堵塞的间隙通道，
其中所述径向流色谱柱的床长度为3cm至50cm，
其中每个珠粒包括一个或多个孔，
其中每个孔的直径为250 Å至5000 Å，
其中至少80%的多个珠粒的直径为200 μm至500 μm，
其中所述珠粒的平均半径R为100 μm至250 μm，和
其中所述珠粒在每分钟0.1柱体积至10柱体积的流速下保持其尺寸，
其中所述珠粒是单分散的，其中所有珠粒的半径为目标半径的±10%，并且半径r <0.225 R的小珠粒在填充柱之前已经被除去。
2.根据权利要求1所述的径向流色谱柱，其中，所述珠粒是由聚合物、氧化铝、二氧化硅、可控微孔玻璃、纤维素，或囊封的铁颗粒制成。
3.根据权利要求2所述的径向流色谱柱，其中所述可控微孔玻璃是囊封的可控微孔玻璃，或其中所述二氧化硅是囊封的二氧化硅。
4.根据权利要求2所述的径向流色谱柱，其中所述珠粒是聚合物珠粒。
5. 根据权利要求1-4中任一项所述的径向流色谱柱，其中任何具有r<0.414 R的珠粒已被去除。
6. 根据权利要求1-4中任一项所述的径向流色谱柱，其中所述间隙通道具有：四面体位置半径rtet=0.225 R、八面体位置半径roct=0.414 R，或两者。
7. 根据权利要求1-4中任一项所述的径向流色谱柱，其中所述间隙通道具有最窄通道半径Rcha=0.155 R。
8.根据权利要求1所述的径向流色谱柱，其中感兴趣颗粒是蛋白质、病毒、病毒样颗粒、DNA、RNA、抗原、脂质体、寡糖、多糖或它们的任意组合。
9.根据权利要求8所述的径向流色谱柱，其中所述感兴趣的颗粒是病毒或选自IgG和IgM的蛋白。
10.一种选择用于权利要求1-9任一项所述的径向流色谱柱中的珠粒的方法，包括：a）基于进料流中存在的成分确定窄的所需珠粒半径R范围；b）去除在所需珠粒半径R范围外的所定义半径r的珠粒；和c）定义在所需珠粒半径R范围内的珠粒半径R的百分比。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述珠粒是由聚合物、氧化铝、金属、二氧化硅、可控微孔玻璃、纤维素，或囊封的铁颗粒制成。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述可控微孔玻璃是囊封的可控微孔玻璃，或其中所述二氧化硅是囊封的二氧化硅。
13.根据权利要求10所述的方法，其中所述珠粒是聚合物珠粒。
14.根据权利要求10至12中任一项所述的方法，其中半径r的珠粒通过湿筛去除，或干筛去除，或湿筛和淘洗去除，或干筛和淘洗去除。
15. 根据权利要求10至12中任一项所述的方法，其中半径r<0.414 R的珠粒被去除。
16.一种使用权利要求1所述的径向流色谱柱纯化未澄清的进料流的方法，包括以下步骤：
a.用所述珠粒填充所述径向流色谱柱；
b.处理含有感兴趣颗粒的澄清的进料流以校准纯化条件；
c.从步骤b的结果确定感兴趣颗粒的结合；
d.处理含有感兴趣颗粒的未澄清的进料流。
17.根据权利要求16所述的方法，其中感兴趣颗粒是蛋白质、病毒、病毒样颗粒、DNA、RNA、抗原、脂质体、寡糖、多糖，或它们的任意组合。
18.根据权利要求16所述的方法，其中感兴趣颗粒是病毒或选自IgG和IgM的蛋白。
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