BR112020011341A2 - sistema e método de cromatografia de tecnologia radial aplicada - Google Patents

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Abstract

A presente invenção refere-se a um sistema e método de cromatografia de tecnologia radial aplicada usando uma pluralidade de contas, com cada conta compreendendo um ou mais poros na mesma tendo um diâmetro de cerca de 250 Å a cerca de 5000 Å, e cada conta tendo um raio médio entre cerca de 100 µm a cerca de 250 µm. A presente invenção também se refere a processos para selecionar contas para uso em uma coluna de cromatografia de fluxo radial, e para purificar uma corrente de alimentação não clarificada usando uma coluna de cromatografia de fluxo radial.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "SISTEMA E MÉTODO DE CROMATOGRAFIA DE TECNOLOGIA RADIAL APLICADA".
CAMPO DA INVENÇÃO
[001] A presente invenção refere-se a cromatografia de coluna de fluxo radial, e mais particularmente a uma coluna de fluxo radial compreendendo contas de tamanho específico e parâmetros para reforçar a filtração de correntes de alimentação não clarificadas, e métodos de seleção das contas.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[002] Cromatografia, como é usado de modo geral, é uma técnica para a separação de vários componentes de uma mistura de amostras. Em um sistema de cromatografia líquida, uma amostra seguida por um fluido de elutriação é injetada para dentro de uma coluna de separação cromatográfica. A coluna de separação contém um material ou meio de matriz ou embalagem o qual interage com os vários componentes da amostra a ser separada. A composição do meio de separação depende do fluido sendo direcionado através do mesmo para efetuar a separação desejada. À medida que a amostra e os fluidos de elutriação passam através do meio de separação, os vários componentes da amostra passam em diferentes velocidades através do meio de separação em conseqüência de interações diferenciais. Estes componentes emergem separados na saída ou no efluente do meio de separação.
[003] São conhecidos na técnica vários tipos das colunas de separação de fluxo vertical e horizontal. Com a necessidade de cromatografia de alta performance, foram desenvolvidas colunas cromatográficas do tipo de fluxo horizontal. As colunas de fluxo horizontal ou radial referidas são descritas, por exemplo, nas Patentes
U.S. Nºs. 4.627.918 e 4.676.898. Nas colunas do tipo de fluxo horizontal ou radial, a amostra e os fluidos de elutriação são introduzidos por meio de um distribuidor até a periferia externa ou parede circunferencial ou superfície da matriz ou meio de separação, e os fluidos passam horizontalmente ou radialmente interiormente através do meio de separação até uma porta central ou de coleta e em seguida elutriam da coluna em momentos diferentes e em taxas diferentes.
[004] Posteriormente, foram desenvolvidos métodos e colunas cromatográficos para processamento direto de alimentações brutas para o isolamento de materiais biologicamente ativos, incluindo colheita de células/de fermentação, extratos de tecidos, algas, e materiais e células derivados de plantas, e plasma/sangue. Os meios de cromatografia de contas grandes são embalados dentro de uma coluna de cromatografia de baixa pressão de rotina, na qual telas de placa terminal são substituídas com telas de poros grandes (poros de 60 a 180 μm). Os poros grandes impedem o bloqueio da coluna. Como os tamanhos das partículas são grandes, o material celular escoa entre as contas no lúmen interpartículas, enquanto o produto solúvel é capturado por grupos funcionais sobre as contas.
[005] Tradicionalmente, o processamento a jusante de produtos biológicos de colheitas de cultura celular/de fermentação tem requerido duas operações principais: i) preparação de corrente de alimentação e ii) recuperação e purificação. A amostra precisa ser adequadamente preparada antes da aplicação em uma coluna. Isto tanto é demorado quanto pode ser bastante dispendioso. Se for necessário realizar preparação da amostra, geralmente a corrente de alimentação é diluída para reduzir a densidade celular, a viscosidade, e a concentração de sal, todas as quais são benéficas para aprimorar a recuperação e a purificação. Recuperação envolve a remoção de materiais celulares e particulados diversos por centrifugação e/ou microfiltração, bem como uma etapa de redução do volume inicial, tipicamente ultrafiltração. Como os meios de cromatografia convencionais são rapidamente obstruídos por detritos celulares, precisa ser preparada uma alimentação livre de partículas para a operação de purificação.
[006] Centrifugação e filtração são não somente operações demoradas e dispendiosas, como também comprometem a qualidade. As proteases liberadas pelas células quebradas podem degradar a proteína alvo, complicando ainda mais a tarefa de desenvolvimento do método de purificação e aumentando os custos da purificação. Quanto mais longo o tempo de contato com os detritos celulares concentrados, mais produto pode ser perdido.
[007] A captura do produto protéico diretamente a partir da alimentação não clarificada minimizaria a degradação do produto e melhoraria a qualidade do produto, o rendimento e a economia do processo. Além disso, a operação de recuperação de intensiva em capital seria bastante simplificada se as etapas de captura do produto e de remoção de células fossem combinadas em uma única operação.
[008] Existem duas abordagens para capturar produto diretamente a partir de uma alimentação não clarificada, tal como uma colheita de cultura celular/de fermentação ou outra amostra biológica (por exemplo, plasma sanguíneo). Uma abordagem propõe a fluidificação das partículas de resina de captura. Por meio de fluidificação, as partículas individuais são separadas, de modo que os detritos podem sair do leito da coluna não obstruída.
[009] Esta abordagem sofre de vários problemas. O sistema de leito fluidificado opera em uma taxa de alto fluxo predeterminada, e não existe nenhuma flexibilidade na operação ou meios para modificar o tamanho da coluna. O consumo de tampão do sistema é maior do que sobre sistemas de leito comprimido, o que é um fator de custo importante para produtos farmacêuticos de alto valor, muitos dos quais precisam de tampões especializados para sua purificação. A proporção do volume da coluna para o volume de partículas de fase sólida é muito elevada. Isto vai afetar negativamente a duração da permanência e a capacidade de ligação dentro da coluna, uma vez que não há tempo suficiente para a completa difusão da molécula alvo dentro da fase sólida. Além disso, as partículas vão colidir dentro do leito da coluna e fragmentos de fase sólida vão gerar os chamados "fines", e reduzir tanto a performance quanto o reuso da coluna. A operação de leito fluidificado também requer hardware e meios de cromatografia especializados e dispendiosos.
[0010] A outra abordagem é o uso de colunas de leito comprimido para remoção de particulados. Esta via tem permanecido em grande parte inexplorada pelo seguinte motivo. Para limpar detritos celulares sobre uma coluna de leito comprimido é necessário o uso de partículas grandes, preferencialmente esféricas. Estas partículas precisam de espaço suficiente no lúmen interpartículas para deixar as células ou outros particulados de tamanho comparável saírem da coluna.
[0011] A desvantagem do uso de partículas grandes (contas) é que a capacidade de ligação de proteínas é uma função da superfície disponível por unidade de volume de leito de gel. Portanto, com aumento dos diâmetros de partículas, é observada uma perda da capacidade de ligação. Quando o diâmetro das partículas é aumentado de 0,1 mm para 1 mm, tal como é requerido para lidar com suspensões celulares densas, é perdido aproximadamente 90% da capacidade de ligação de proteínas. Isto tornou as colunas de leito comprimido impraticáveis para o processamento de correntes de alimentação de processo bruto.
[0012] No entanto, a operação de colunas de leito comprimido,
oferece simplicidade, eficiência e economia. É flexível e relativamente fácil de escalar. Não existe a necessidade de partículas, equipamento ou treinamento especializados dos operadores. O espaço de produção é relativamente pequeno para cromatografia de rotina, e não existe a necessidade de modificação da altura da unidade de produção de modo a acomodar o equipamento de leito fluidificado.
[0013] A taxa de aplicação do produto é outra questão importante em termos de rendimento da operação. Isto é predeterminado para sistemas de leito fluidificado, mas, para sistemas de coluna comprimida, a cinética de ligação da reação é o fator limitante da taxa. Isto permite maior produtividade, até 3 a 10 vezes maior do que para sistemas de leito fluidificado.
[0014] Depois da captura do produto, o material celular residual é removido por breves pulsos de lavagem de alta velocidade. Em seguida, o produto é elutriado por métodos típicos de elutriação. Deste modo, as resinas de cromatografia de contas grandes conhecidas permitem o processamento direto do caldo de fermentação ou da cultura celular bem como outras alimentações não clarificadas em uma coluna de leito comprimido, combinando remoção celular com captura de produto simultânea.
[0015] A Patente U.S. Nº. 5.466.377 propôs um método e partículas de cromatografia contas grandes para a captura direta de um produto desejado a partir de licor do processo não clarificado sobre colunas de leito comprimido de cromatografia de baixa pressão, de rotina.
[0016] Ainda existe a necessidade de materiais e métodos cromatográficos aprimorados para realizar o processamento direto de alimentações brutas, tais como colheitas de cultura celular/de fermentação, extratos de tecidos, fragmentos celulares, vírus, plasma sanguíneo, correntes de alimentação de resíduos derivados de extratos de legumes, verduras ou frutos ou correntes de alimentação de resíduos derivados do processamento de leite ou outras fontes de materiais naturais, sobre colunas de leito comprimido.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0017] É descrita uma coluna de cromatografia de fluxo radial incluindo: uma pluralidade de contas, com cada conta compreendendo um ou mais poros na mesma, e canais intersticiais formados entre as contas. Cada poro tem um diâmetro de cerca de 250 Å a cerca de 5000 Å, no mínimo cerca de 80% da pluralidade de contas têm um diâmetro de cerca de 200 µm a cerca de 500 µm e as contas têm um raio médio R de entre cerca de 100 µm a cerca de 250 µm. As contas podem ser monodispersas (isto é, todas as contas tendo um raio de ± cerca de 10% de um raio visado ou marcado) ou podem ter r < 0,414 R ou r < 0,225 R removido.
[0018] Também é descrito um processo para selecionar contas para uso em uma coluna de cromatografia de fluxo radial. Esse processo compreende: a) identificar uma faixa de raio de contas R desejável estreita com base nos componentes (ou partículas de interesse) presentes na corrente de alimentação; b) remover contas de um raio definido r, as quais estão fora da faixa de contas desejável; e c) definir a percentagem de raio de contas R dentro da faixa de contas desejável. As contas de raio r podem ser removidas por peneiramento a úmido ou a seco e/ou elutriação. As contas sendo removidas podem ser aquelas tendo um raio r < 0,414 R ou r < 0,225 R.
[0019] Também é descrito no presente documento, neste requerimento de patente, um processo para purificar uma corrente de alimentação não clarificada usando uma coluna de cromatografia de fluxo radial incluindo: uma pluralidade de contas, com cada conta compreendendo um ou mais poros na mesma, e canais intersticiais formados entre as contas, em que cada poro tem um diâmetro de cerca de 250 Å a cerca de 5000 Å, no mínimo cerca de 80% da pluralidade de contas têm um diâmetro de cerca de 200 µm a cerca de 500 µm e as contas têm um raio médio R de entre cerca de 100 µm a cerca de 250 µm. Esse processo compreende as etapas de: a) embalar a coluna de fluxo radial com contas; b) processar uma corrente de alimentação clarificada contendo uma partícula de interesse de modo a calibrar as condições de purificação; c) determinar a ligação da partícula de interesse a partir dos resultados da etapa b; e d) processar uma corrente de alimentação não clarificada compreendendo a partícula de interesse.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0020] Colunas de fluxo radial e métodos de fabricação e uso das mesmas são proporcionados para filtração direta, isto é, processamento, de correntes de alimentação de produtos biológicos brutos, por exemplo, culturas celulares não clarificadas (isto é, não filtraDAS). A presente revelação realiza purificação em um custo substancialmente menor e com processamento mais rápido, especialmente comparada com métodos tais como cromatografia de leito comprimido e cromatografia de leito expandido. Exemplos de aplicações incluem fracionamento de plasma sanguíneo; bioprocessamento de culturas celulares para isolar e purificar proteínas (especificamente produtos farmacêuticos, tais como herceptina, insulina, avastina, etc.); captura e purificação de vírus e partículas semelhantes a vírus; purificação de correntes de alimentação de resíduos derivados de extratos de legumes, verduras ou frutos, e correntes de alimentação de resíduos derivados do processamento de leite ou outras fontes de materiais naturais.
[0021] A cromatografia descrita no presente documento, neste requerimento de patente, de maneira surpreendente e benéfica permite que células inteiras e outras partículas passem, sem serem danificadas, em torno e entre as contas descritas sem obstrução do leito de gel, e permite a passagem direta de correntes de alimentação não clarificadas (não filtradas) de culturas celulares, as quais contêm células inteiras, fragmentos celulares, homogenados de materiais vegetais nativos ou recombinantes, soluções de nano-partículas, e/ou outras partículas (as quais normalmente entopem colunas tendo contas pequenas). Também é capaz de ligar seletivamente alvos moleculares de interesse na corrente de alimentação, os quais podem ser recuperados em seguida. Por exemplo, para purificação de IgG, as contas podem ser funcionalizadas ligando de maneira covalente Proteína A ou Proteína G à superfície da conta de modo a permitir ligação reversível de IgG seguida por lavagem e subsequente elutriação. Para captura de vírus e de VLP, as contas podem ser modificadas para terem uma elevada área superficial externa e densidade de carga alta (positiva).
[0022] É descrita no presente documento, neste requerimento de patente, uma coluna de cromatografia de fluxo radial compreendendo uma pluralidade de contas, com cada conta compreendendo um ou mais poros na mesma, e canais intersticiais formados entre as contas.
[0023] A coluna de fluxo radial pode ser feita de acordo com qualquer coluna de fluxo radial conhecida, exceto pelas diferenças discutidas no presente documento, neste requerimento de patente, especificamente com respeito às contas, leitos de gel, poros e canais. A coluna de fluxo radial pode ter um comprimento do leito de cerca de 3 cm a cerca de 50 cm e o volume do leito (V) pode variar a partir de cerca de 5 ml a cerca de 1000 litros. A coluna de fluxo radial podem ser modelada como uma "rosquinha" (coluna de fluxo radial de tamanho completo, tendo a forma de um cilindro oco circular direito), uma fatia de "bolo" (tendo a forma de um prisma trapezoidal, isto é, pequena seção de rosquinha, tendo os mesmos comprimento/raio e curvatura do leito, porém de volume menor), ou um "cone" truncado (tendo a forma de um tronco ou cone truncado, originário de uma seção de um núcleo cilíndrico pequeno tirada de um bolo ou de uma rosquinha, tendo os mesmos comprimento/raio e curvatura do leito, porém de volume ainda menor do que o "bolo").
[0024] A coluna pode incluir uma ou mais fritas de filtro porosas. Frequentemente existe uma frita externa e uma frita interna. Cada frita pode ser desenhada para ter uma medida de poro entre cerca de 40 µm a cerca de 300 µm, entre cerca de 80 µm a cerca de 250 µm, ou entre cerca de 100 µm a cerca de 200 µm. A frita pode ser feita de qualquer material conhecido convencionalmente. Opcionalmente, pode ser feita de aço inoxidável, ou de aço inoxidável e um ou mais polímeros, tal como, mas não limitado a polietileno (PE) ou polipropileno (PP).
[0025] As colunas de fluxo radial do formato de "rosquinha", "bolo" ou "cone" todas têm proporções constantes da área da frita externa para a área da frita interna. Esta proporção pode estar dentro de uma faixa de 1,5:1 a 10:1. A faixa preferencial é de 2:1 a 4:1. A dinâmica de fluxo dos três diferentes formatos tendo comprimentos de leito idênticos e uma proporção de área da frita externa para área da frita interna são virtualmente idênticas.
[0026] As contas podem ser esféricas ou quase esféricas. As contas podem ser feitas de um polímero, vidro, alumina, metal ou outro material diferente cristalino, semi-cristalino ou amorfo, sílica, vidro de porosidade controlada (CPG), celulose, partículas de ferro encapsuladas, CPG encapsulado, sílica encapsulada, ou qualquer combinação dos mesmos. As contas de polímeros podem ser feitas de qualquer polímero conhecido para utilização na técnica, por exemplo, um poliacrilato, por exemplo, metacrilato, um poliestireno, ou um polissacarídeo, tal como dextrano, pululano, agarose, ou polissilicatos nativos ou ligados. As contas podem consistir em dois ou mais polímeros combinados homogeneamente ou heterogeneamente. As contas de polímeros podem ser contas de polissacarídeos esféricas (ou quase esféricas).
[0027] As contas podem ser diâmetros médios de entre cerca de 200 µm a cerca de 1000 µm, ou de cerca de 200 µm a cerca de 500 µm. Em uma modalidade, no mínimo cerca de 80% das contas de polímeros têm um diâmetro de cerca de 200 µm a cerca de 500 µm, ou no mínimo cerca de 85%, ou no mínimo cerca de 90% das contas de polímeros têm um diâmetro de cerca de 200 µm a cerca de 500 µm.
[0028] As contas podem ter um raio médio (R) de entre cerca de 100 µm a cerca de 500 µm, ou de cerca de 100 µm a cerca de 250 µm.
[0029] A maioria das contas não são geralmente monodispersas (todas do mesmo tamanho com o mesmo diâmetro) mas têm uma faixa de diâmetros os quais se estendem além da faixa dada. Portanto, por exemplo esta medida significa que 80% da massa total (ou do volume) das contas estão dentro de 200 a 500 µm. As outras 20% (independentemente de como a percentagem é definida) estão fora desta faixa, são menores ou maiores. De modo a que os canais intersticiais não entupam, é importante que as contas menores nos 20% fora da faixa dada sejam removidas ou no mínimo exauridas em algum momento antes de embalar a coluna. Se as contas menores que são quase do mesmo tamanho que o diâmetro do canal não forem exauridas ou removidas, um leito de gel de contas entre 200 a 500 µm pode conter contas pequenas suficientes para bloquear os canais parcialmente ou completamente.
[0030] Algumas contas de cromatografia estão disponíveis comercialmente e frequentemente são vendidas por diâmetro das contas. No entanto, o diâmetro dado é uma média dos diâmetros das contas; não significa que todas as contas têm aquele determinado diâmetro. Outras empresas podem vender contas listando uma faixa de diâmetros de contas. No entanto, esta é a faixa na qual se encontra uma determinada percentagem de contas, algumas vezes indefinida. A percentagem total de contas tendo um diâmetro o qual se encontra for a da faixa dada é então desconhecida; há raramente uma determinada percentagem de contas a qual se encontra acima ou abaixo da faixa.
[0031] As contas podem ter grupos funcionalizados (por exemplo, grupos de permuta iônica, grupos de interações hidrofóbicas, etc.), possibilitando que as mesmas se liguem seletivamente a alvos moleculares de interesse (para potencial recuperação posterior). Alvos potentiais incluem vírus, partículas semelhantes a vírus, proteínas (especificamente, mas não limitadas a, IgG, IgM, IgY, e proteínas do sangue), DNA, RNA, oligonucleotídeos, polipeptídeos e células.
[0032] As contas têm um ou mais poros nas mesmas. Cada poro tem um diâmetro de cerca de 250 Å a cerca de 5000 Å. Cada poro pode se estender parcialmente através do leito resultando em um final sem saída, ou podem ir todo o caminho através da conta até outro ponto de saída.
[0033] Canais intersticiais são formados entre contas embaladas e parcialmente compreendendo o volume vazio. Quando estes canais são suficientemente amplos de modo a permitir que as células e os fragmentos celulares passem através do leito de gel sem entupimento e quando os canais estão livres de contas menores as quais, devido a seu tamanho, podem restringir ou bloquear a passagem de células e de fragmentos celulares, o usuário pode utilizar as contas embaladas para evitar uma prejudicial filtração ou centrifugação, precipitação ou outras etapas dispendiosas, demoradas e que potencialmente perdem produto antes da etapa de purificação por cromatografia.
[0034] Contas esféricas monodispersas idealmente vão comprimir em arranjos de embalagem próxima hexagonal (HCP) ou de embalagem próxima cúbica (CCP). Ambos os arranjos de embalagem têm a mesma densidade máxima de contas (esferas) e ambos têm energias de embalagem similares, de modo que nenhum é claramente energeticamente favorecido em relação ao outro. Embora o arranjo de embalagem preferencial de contas de polímeros, por exemplo, polissacarídeos, não seja previsível, ambos os arranjos de embalagem formam canais (espaços intersticiais ou canais) entre as contas, cujo menor tamanho é importante para o sucesso ou fracasso do dispositivo e do sistema descritos no presente documento, neste requerimento de patente.
[0035] Os canais intersticiais devem ser: 1) suficientemente grandes de modo a permitir que células, fragmentos celulares e outras partículas interferentes passem direto sem obstrução do leito de gel; 2) livres de contas menores as quais sejam de tamanho similar ao próprio canal intersticial e portanto poderiam entupir os canais; e 3) formados de uma população de contas tendo uma faixa de diâmetros de contas tão estreita quanto possível, com contas monodispersas sento tão próximas ao tamanho ideal quanto possível.
[0036] Além disso, os canais intersticiais não devem ser comprimidos muito estreitamente, o que pode entupir os canais intersticiais, mas criar: i) uma taxa de fluxo muito elevada, ii) uma alta pressão também, ou iii) uma embalagem das contas altamente densa também. Os canais intersticiais devem ser abertos (isto é, livres de entupimentos) para proporcionar uma via contínua para processamento da corrente de alimentação. Além disso, uma taxa de fluxo muito elevada vai estreitar os canais intersticiais de um leito de gel não rígido. Portanto, o leito de gel deve ter rigidez suficiente para permitir taxas de fluxo de 0,1 volume de coluna até 10 volumes de coluna por minuto sem estreitar os canais intersticiais (através de compressão de contas) para permitir que as células e os fragmentos celulares passem através do leito de gel.
[0037] A rigidez do leito de gel também depende da rigidez das próprias contas. De modo a minimizar alterações no diâmetro/tamanho dos canais intersticiais entre as contas (presumindo que todas as contas sejam esféricas ou quase esféricas e com uma determinada distribuição de tamanho), é importante que a morfologia das contas não se altere sob as condições de fluxo.
[0038] Uma opção é usar contas muito rígidas que sejam inertes para os tampões usados em separações cromatográficas e, portanto, não vão apresentar alteração em seu tamanho ou formato; no entanto, contas feitas de sílica ou de vidro de porosidade controlada (CPG, Controlled Pore Glass), por exemplo, as quais têm excelentes estabilidade e rigidez mecânica, têm pouca ou nenhuma tolerância para NaOH.
[0039] Contas de polímeros, tais como, mas não limitadas a contas de metacrilato ou poliestireno, podem ser tornadas mais estáveis a reagentes e conservar a rigidez. Contas de polissacarídeos, tais como, mas não limitadas a contas de dextrano ou de agarose, são menos rígidas, mas são mais estáveis a reagentes tais como NaOH. No entanto, contas de polissacarídeos são frequentemente "mais moles" do que outras contas de polímeros e, portanto, mais propensas a se tornarem comprimidas. O grau no qual ocorre compressão vai depender da pressão aplicada a partir do líquido que escoa através do leito de gel comprimido. Compressão demais vai resultar em um leito não poroso através do qual não é possível nenhum fluxo i (oclusão tanto das redes de poros internos quanto dos espaços intersticiais). Os fatores chave os quais levam geralmente a este aumento em pressão e compressão são a taxa de fluxo do líquido aplicado (normalmente expressa como mL/min, CV/min ou cm/hr) e a viscosidade do líquido.
[0040] A estabilidade mecânica e a rigidez de contas de polissacarídeos mais moles podem ser reforçadas aplicando determinados procedimentos. Por exemplo, as abordagens que se seguem vão aprimorar a estabilidade mecânica e a rigidez das contas:
1. Reticulação dentro da estrutura do polissacarídeo. Isto vai tornar as contas mais resistentes a pressão e, deste modo, preservar a morfologia das contas. No entanto, dependendo da químíca de reticulação aplicada, o tamanho dos poros internos dentro da estrutura do leito pode ser afetado.
2. Aumento da densidade da quantidade de polissacarídeo usada na formulação das contas. Isto frequentemente é feito com partículas à base de agarose. As contas de agarose disponíveis comercialmente de rotina têm percentagens de agarose entre cerca de 2 e 10% (20 a 100 gramas de agarose por litro de contas formuladas). Uma conta tendo densidade aumentada pode ter ≥ cerca de 6% de agarose. No entanto, este aumento na densidade pode reduzir os tamanhos dos poros internos das contas:  4% das contas têm um corte de peso molecular médio de cerca de 20 milhões de Dalton  6% das contas têm um corte de peso molecular médio de cerca de 4 milhões de Dalton
[0041] O tamanho ótimo dos canais intersticiais, o qual é dependente do tamanho das contas, em última análise depende dos componentes presentes na corrente de alimentação. Especificamente,
o tamanho ótimo dos canais intersticiais depende das partículas que se deseja que passem através do leito de gel. O processo de determinação do melhor tamanho para os canais intersticiais pode ser como se segue:
1. Determinação do Tamanho das Contas: A partir do raio das células ou dos fragmentos que devem passar através do leito de gel, estimar o raio requerido do canal formado por três contas (o "Raio do canal mais estreito") e calcular o tamanho mínimo das contas necessário.
2. Determinação da Fração de Tamanho a ser Removida do Gel: A partir do raio das contas (raio de contas monodispersas ou média de raios de contas para contas polidispersas), calcular o comprimento dos raios dos sítios tetraédricos e octaédricos. Os raios destes sítios são os raios das maiores contas, as quais devem ser removidas do gel.
[0042] Em seguida, foi calculado o maior diâmetro teoricamente de uma esfera pequena a qual pode se encaixar através do menor canal formado entre três esferas idênticas perfeitas. O diâmetro do canal pode ser cerca de 3 a cerca de 10 vezes maior, ou cerca de 4 a cerca de 6 vezes maior do que a maior partícula (isto é, célula, fragmento celular, ou outra partícula) que esteja presente na corrente de alimentação não clarificada.
[0043] Para Embalagem Próxima Cúbica, Próxima Hexagonal, ou de Barlow de contas monodispersas, totalmente assentadas, vibradas até nenhuma alteração mensurável na densidade de embalagem (Conjetura de Kepler), o seguinte é verdadeiro:  Raio do sítio tetraédrico rtet = 0,225 R (R é o Raio da conta, rtet é o raio do sítio Tet)
 Raio do sítio octaédrico roct = 0,414 R (R é o Raio da conta, roct é o raio do sítio Oct)  Raio do canal mais estreito rcha= 0,155 R (R é o Raio da conta, rcha é o raio do canal)  Contas tendo um raio de x, onde 0,155 R < x < 0,414 R têm um tamanho o qual pode se encaixar e ocupar permanentemente um Sítio octaédrico.  Contas tendo um raio de x, onde 0,155 R < x < 0,225 R têm um tamanho o qual pode se encaixar e ocupar permanentemente um Sítio tetraédrico.
[0044] Tanto os "orifícios" tetraédricos quanto octaédricos estão sempre presentes em um leito de contas embaladas. Os orifícios são denominados tetraédricos ou octaédricos com base no número de contas que circundam e formam o orifício.
[0045] Para Embalagem Próxima Aleatória de contas polidispersas, os valores acima são um mínimo e os valores reais podem ser maiores. Canais de raio rcha = 0,155 R devem ser um mínimo de 1,1 vez (de modo preferencial cerca de 2 a cerca de 4 vezes) o raio da célula, fragmento ou particulado de modo a passar facilmente através do leito de gel.
[0046] As contas monodispersas podem ser preparadas por: a. fabricação de contas monodispersas com um raio ótimo e completa ausência de contas menores; b. fabricação de uma faixa estreita de contas polidispersas controlando cuidadosamente as condições durante um processo de emulsão. Estas condições incluem: adição de um tipo e quantidade ótimos de emulsificante, mantendo uma velocidade de agitação ótima, mantendo uma temperatura ótima, todos os quais contribuem para um estreitamento da distribuição de tamanho das contas formadas; c. peneiramento a úmido ou a seco de modo a remover a fração de partículas menores (ou maiores) do que um tamanho selecionado; e/ou d. elutriação de modo a remover a fração de partículas menores do que um tamanho determinado.
[0047] De modo a aprimorar a filtração, contas menores que podem obstruir os canais intersticiais podem ser removidas antes da compressão do leito de gel.
[0048] Os canais intersticiais podem ser aprimorados na forma e na função seguindo algumas ou todas as etapas que se seguem: a. Calcular/determina o raio de conta médio desejado R de modo a permitir que as células, fragmentos de células, ou outros particulados passem através, por exemplo, usando as informações mostradas nas Tabelas 1 a 3 abaixo. b. Formar um leito de gel onde foram removidas contas tendo raio r < 0,414 R. i. Remoção de todas as contas tendo raio r < 0,414 R vai criar um leito de gel com máximos fluxo e porosidade, e caminho mais curto. Um benefício da mesma é processamento de purificação mais rápido. c. Formar um leito de gel onde foram removidas contas tendo raio r < 0,225 R. i. Remoção de todas as contas tendo raio r < 0,225 R vai criar um leito de gel com porosidade um tanto reduzida, um comprimento do caminho aumentado, e aumento da duração da permanência. Um benefício da mesma é purificação mais eficiente. d.
Remoção das contas menores tendo raio r < 0,225 R ou r < 0,414 R vai prevenir bloqueio/entupimento de canais intersticiais no leito de gel.
Isto também vai reduzir a quantidade de limpeza do leito de gel requerida entre os ciclos de purificação. e.
Aumento do raio r das contas a serem removidas por até 25% (isto é, as contas sendo removidas têm um raio r que é 25% maior do que indicado de outro modo). f.
Estreitamento da distribuição de tamanho das contas tanto quanto possível de modo a obter uma reduzida densidade de Embalagem Próxima Randomizada e a aproximar da densidade de Embalagem Próxima Cúbica/Próxima Hexagonal.
Tabela 1
Diâmetro dos Diâmetro Médio Canais Intersticiais das Contas (µm) (µm)
100 15,5 150 23,2 200 30,9 Tamanhos dos Canais Alvo 250 38,7 300 46,4 350 54,1 400 61,9 450 69,6 500 77,4 750 116 1000 154,7
Tabela 2 Célula/Partícula de Diâmetro Médio Vai se encaixar dentro de Canais interesse (µm) Intersticiais de (µm, 3 vezes no máximo) Célula de E. Coli 2 6 Célula HEK-293 13 39 Célula CHO 15 45 Célula de Levedura 5 15 Tobacco Célula BY-2 35 - 100 105 - 300 de Tabaco Célula Vero 8 24 Vírus 0,017 - 0,5 0,05 - 1,5 DNA de Plasmídeo 0,001 - 0,003 0,003 - 0,010 Tabela 3 Proteína/Partícula de Diâmetro Vai se encaixar dentro de Poros de interesse Médio (Å) Contas de (Å, 6 vezes no máximo) IgG 120 720 IgM 350 - 600 2100 - 3600 DNA de Plasmídeo 12 - 30 72 Vírus 170 - 2500 1020 - 15000
[0049] Outra modalidade é um processo para selecionar contas para uso em um leito de gel de cromatografia radial, o qual inclui: a) identificar uma faixa de diâmetros de contas desejável estreito (ou raios) com base nos componentes (ou partículas de interesse) presentes na corrente de alimentação; b) remover contas de um diâmetro definido (ou raios) fora da faixa de diâmetros de contas desejável; e c) definir a percentagem de diâmetros de contas (raios) dentro da faixa de diâmetros de contas desejável.
[0050] Ainda outra modalidade é um processo para filtrar uma corrente de alimentação não clarificada usando uma coluna de fluxo radial descrita acima compreendendo as etapas de: a. embalar a coluna de fluxo radial com contas; b. processar uma corrente de alimentação clarificada contendo uma partícula de interesse de modo a calibrar as condições de purificação; c. determinar a ligação da partícula de interesse a partir dos resultados da etapa b; e d. processar uma corrente de alimentação não clarificada compreendendo a proteína selecionada.
[0051] A partícula de interesse pode ser uma célula inteira, um fragmento celular, vírus, ou proteína. Pode ser um VLP, DNA, RNA, antígeno, lipossoma, oligo- ou polissacarídeo.
[0052] Depois de embalar a coluna de fluxo radial com as contas, uma corrente de alimentação clarificada é usada para calibrar condições de purificação ótimas antes da purificação de rotina real das correntes de alimentação não clarificadas. Isto proporciona um entendimento de como a partícula de interesse, tal como proteína, se liga sobre a coluna (RFC, Zetacell™). Para purificação de correntes não clarificadas, pode ser usada tanto lavagem para frente quanto para trás para remover traços de células/fragmentos celulares. Podem ser usados formatos de bolo ou de cone para otimização em pequena escala antes de escalar/uso de formato de rosquinha. O processo pode ser usado em conjunto com "leito móvel simulado" ("SMB")/processos contínuos.
[0053] Dependendo dos sistemas de reagentes usados durante a cromatografia, as contas de polímeros vão encolher e dilatar, deste modo aumentando e diminuindo tanto os diâmetros dos poros internos como os espaços intersticiais entre as contas (esféricas). Isto não ocorre com partículas de sílica e CPG, mas ocorre para todos os leitos de gel à base de partículas de polímeros e polissacarídeos. Os efeitos da dilatação e do encolhimento podem ser controlados, em sua totalidade, em sua quase totalidade, ou no mínimo em parte, por seleção cuidadosa do perito na técnica do sistema tampão usado para comprimir a coluna e usado durante operação de rotina.
[0054] Depois de otimizar o processo com correntes de alimentação clarificadas diretamente sobre uma pequena coluna de cromatografia de fluxo radial contendo contas de polímeros como um leito de gel, pode ser realizado escalonamento linear até uma maior escala do processo, mantendo o comprimento do leito, mantendo a proporção de áreas de frita externa para interna e mantendo todos os parâmetros operacionais (taxa de fluxo, número de volumes de coluna por unidade de tempo, composição de tampão, duração da permanência, fase sólida, pressão, e temperatura) para cada etapa do processo (carregamento de corrente de alimentação clarificada ou não clarificada, lavagem em direções para diante e reversa de modo a remover células, detritos celulares e materiais não ligados, elutriação para liberar alvo capturado diretamente da fase sólida, regeneração para limpar e preparar a coluna e fase sólida para reuso subsequente). Se em qualquer momento houver a necessidade de recalibrar, reotimizar ou modificar de outro modo o sistema de purificação em larga escala, também é realizado escalonamento linear até uma coluna de RFC pequena e manejável, mantendo o comprimento do leito, mantendo a proporção de áreas de frita externa para interna e mantendo todos os parâmetros operacionais (taxa de fluxo, número de volumes de coluna por unidade de tempo, composição de tampão,
duração da permanência, fase sólida, pressão, e temperatura) para cada etapa do processo (carregamento de corrente de alimentação clarificada ou não clarificada, lavagem em direções para diante e reversa de modo a remover células, detritos celulares e materiais não ligados, elutriação para liberar alvo capturado diretamente da fase sólida, regeneração para limpar e preparar a coluna e fase sólida para reuso subsequente).
[0055] O precedente ilustra algumas das possibilidades para a prática da invenção. Portanto, embora tenham sido descritas modalidades de exemplos específicos, será evidente que podem ser feitas várias modificações e alterações para estas modalidades sem se afastar do âmbito mais amplo da invenção; são possíveis muitas outras modalidades dentro do âmbito e do espírito da invenção. Várias características são agrupadas juntas em uma única modalidade para o fim de simplificar a descrição. Este método de descrição não deve ser interpretado como refletindo que as modalidades reivindicadas têm mais características do que são expressamente mencionadas em cada reivindicação. Antes, como as reivindicações que se seguem refletem, o tema da invenção reside em menos do que todas as características de uma única modalidade descrita. Portanto, as reivindicações que se seguem são por este incorporadas dentro da Descrição da Invenção acima, com cada reivindicação por si só como uma modalidade de exemplo separada.
[0056] Deve ser observado que é previsto que qualquer característica ou elemento que seja identificado positivamente neste documento também pode ser especificamente excluído como uma característica ou elemento de uma modalidade da presente invenção como definido nas reivindicações. Também deve ser observado que é previsto que qualquer característica ou elemento que seja identificado positivamente (ou que seja excluído, quer especificamente ou por implicação) pode ser usado em combinação com qualquer outra característica ou elemento que seja identificado positivamente (ou que seja excluído, quer especificamente ou por implicação).

Claims (16)

REIVINDICAÇÕES
1. Coluna de cromatografia de fluxo radial, caracterizada pelo fato de que compreende: uma pluralidade de contas, com cada conta compreendendo um ou mais poros na mesma, e canais intersticiais formados entre as contas, em que cada poro tem um diâmetro de cerca de 250 Å a cerca de 5000 Å, em que no mínimo cerca de 80% da pluralidade de contas têm um diâmetro de cerca de 200 µm a cerca de 500 µm e em que as contas têm um raio médio R de cerca de 100 µm a cerca de 250 µm.
2. Coluna de cromatografia de fluxo radial de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a conta é feita de um polímero, vidro, alumina, sílica, vidro de porosidade controlada (CPG), celulose, partículas de ferro encapsuladas, CPG encapsulado, ou sílica encapsulada.
3. Coluna de cromatografia de fluxo radial de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a conta é uma conta de polímero.
4. Coluna de cromatografia de fluxo radial de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que foram removidas quaisquer contas tendo r < 0,414 R.
5. Coluna de cromatografia de fluxo radial de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que foram removidas quaisquer contas tendo r < 0,225 R.
6. Coluna de cromatografia de fluxo radial de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que os canais intersticiais têm: um raio do sítio tetraédrico rtet = 0,225 R, um raio do sítio octaédrico roct = 0,414 R, ou ambos.
7. Coluna de cromatografia de fluxo radial de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que os canais intersticiais têm um raio do canal mais estreito rcha= 0,155 R.
8. Coluna de cromatografia de fluxo radial de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que as contas são monodispersas.
9. Processo para selecionar contas para uso em uma coluna de cromatografia de fluxo radial, caracterizado pelo fato de que compreende: a) identificar uma faixa de raio de contas R desejável estreita com base nos componentes presentes na corrente de alimentação; b) remover contas de um raio definido r, as quais estão fora da faixa de contas desejável; e c) definir a percentagem de raio de contas R dentro da faixa de contas desejável.
10. Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a conta é feita de um polímero, vidro, alumina, metal ou outro material diferente cristalino, semi-cristalino ou amorfo, sílica, vidro de porosidade controlada (CPG), celulose, partículas de ferro encapsuladas, CPG encapsulado ou sílica encapsulada.
11. Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a conta é uma conta de polímero.
12. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 11, caracterizado pelo fato de que as contas de raio r são removidas por peneiramento a úmido ou a seco, e/ou elutriação.
13. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 11, caracterizado pelo fato de que são removidas contas tendo raio r < 0,414 R.
14. Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que são removidas contas tendo raio r < 0,225 R.
15. Processo para purificar uma corrente de alimentação não clarificada usando a coluna de cromatografia de fluxo radial de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: a. embalar a coluna de fluxo radial com as contas; b. processar uma corrente de alimentação clarificada contendo uma partícula de interesse de modo a calibrar as condições de purificação; c. determinar a ligação da partícula de interesse a partir dos resultados da etapa b; d. processar uma corrente de alimentação não clarificada compreendendo a partícula de interesse.
16. Processo de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a partícula de interesse é uma proteína, vírus, VLP, DNA, RNA, antígeno, lipossoma, oligo- ou polissacarídeo, ou qualquer combinação dos mesmos.
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