JP2016512212A - Rna精製方法 - Google Patents
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- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
- C12N15/1017—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by filtration, e.g. using filters, frits, membranes
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
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- B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
- B01D15/38—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving specific interaction not covered by one or more of groups B01D15/265 - B01D15/36
- B01D2015/3838—Ligand exchange chromatography, e.g. complexation chromatography, chelation chromatography, metal interaction chromatography
Abstract
Description
本出願は、2013年3月15日に出願された米国仮出願第61/799,705号の利益を主張するものであり、この全内容は、あらゆる目的で引用することにより本明細書の一部とされる。
本発明は、RNA精製の分野であり、特に、医薬用途のための、例えば、動物への免疫付与に使用するための、RNAのin vitro転写後に得られたサンプルなどの複雑なサンプルから大きなRNAを大規模精製および処方するための方法である。
RNAは、様々な医薬用途のための革新的な候補として浮上しているが、効率的な精製は課題であり続けている。これは、一つには、サンプル中の種々のタイプおよび組合せの所望でない夾雑物によるものであり、純粋なRNAサンプルを得るためにはこれらを所望のRNA種から分離する必要がある。このような夾雑物は、一般に、任意の上流プロセス、例えば、RNA製造の成分および副産物である。大きなRNAを製造するためにin vitro転写が使用される場合、転写が成功した後、サンプルは、一般に、所望のRNA種を、所望でないRNA種、タンパク質、DNAまたはその断片、ピロホスフェートおよび遊離ヌクレオチドなどの様々な夾雑物と一緒に含んでいる。
これらの必要性に対応するために、本発明は、サンプルからRNAを精製するための方法であって、タンジェンシャルフローフィルトレーション、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、コアビーズフロースルークロマトグラフィー、またはそれらの任意の組合せの1以上の工程を含んでなる方法を提供する。これらの技術は個々に有用であるが、組み合わせて使用する場合、または特定の順序で行う場合に、極めて高い性能を示す。それらの方法は、RNAから夾雑物が実質的に取り除かれている組成物を提供するために、効力または安定性を過度に損なうことなく極めて効率的にRNAを精製することができる。さらに、それらは、有機溶媒を必要とせずに行うことができ、本発明の方法は水性条件で行われることが好ましい。本発明のさらなる利点は、基本的に使い捨て可能な部品を使用することであり、それらが徹底的に清浄化された形態(特に、RNアーゼ不含形態)で調製され、一度だけ使用され、その後、廃棄され得るため、実施間キャリースルーコンタミネーション(carry-through run-to-run contamination)を回避することができ、そしてそのことはRNアーゼ夾雑を回避する場合に特に有用であることを意味する。また、それらの方法は極めて迅速である。
本発明によれば、所望のRNAは、RNA含有サンプルから精製される。本発明の所望のRNAは、二本鎖であり得るが、好ましくは、一本鎖である。RNAが一本鎖、例えば、mRNAまたは自己複製するRNAレプリコンである場合、それは、一般に、1以上のタンパク質をコードし、これらの少なくとも1つは、後述のように、免疫原であることが有用であるが、目的の任意の非免疫原性治療または予防用タンパク質(例えば、遺伝子治療用医薬の成分として)でもあり得る。本発明の所望のRNAは、環状であり得るが、好ましくは、線状である。
本発明によれば、所望のRNAがRNA含有サンプルから精製される。サンプルの組成はRNAの供給源および先行する精製工程によるところが大きい。本発明の方法は、in vitro転写(IVT)源からの所望のRNAの精製に特に有用である。これらの実施形態では、サンプルは、所望のRNA種と、一般に所望でないRNA、DNA(例えば、IVT由来の鋳型DNA)、タンパク質(例えば、RNAポリメラーゼ、キャッピング酵素、DNアーゼ、RNアーゼ阻害剤)、ピロホスフェートおよび/または遊離ヌクレオチドを含む夾雑物を含有する。遊離ヌクレオチドは、IVT混合物中に、未反応RNA前駆体(例えば、リボヌクレオシド三リン酸)として、またはDNA消化由来の分解産物(例えば、デオキシヌクレオシド一リン酸)として見られる。IVT反応の典型的バッファーはTris系バッファー、例えば、50mM Tris pH8.0である。IVTを使用することの特定の利点は、制御された反応において大過剰量の所望のRNA種が産生されること、および修飾塩基がRNAに容易に導入できることである。
RNA精製は、目的の特定のRNAを含んでなる組成物から不純物を除去するために使用される。その組成物の非RNA成分(例えば、DNAおよびタンパク質)から、ならびに他の夾雑RNAから、目的のRNAを単離するためには、種々の精製工程が使用可能である。
本発明によれば、低分子量種を除去することにより目的のRNAを精製するためにタンジェンシャルフローフィルトレーション(TFF)が使用される。従って、本発明の方法は、TFFの1以上の工程を含んでなり得る。TFFは、大きなRNA種の精製に特に有用である。本発明者らは、RNA精製にTFFを用いて、精製されたRNAの安定性および効力を保持しつつ、高収率(少なくとも90〜95%)および高純度(少なくとも90〜99.9%)が達成できたことを示した。有用には、TFFはまた、精製と同時にバッファー交換(透析)を可能とする(またはTFFは、例えば、最終処方バッファーに交換するための別のバッファー交換工程として、精製されたRNAとともに使用することができる)。TFFは、時間効率の高い操作(RNA精製とバッファー交換の療法にわずか約70分)が容易であり、閉鎖系として操作可能であるために、夾雑(例えば、RNアーゼの夾雑)が避けられる。TFFは、IVT混合物からの遊離ヌクレオチドの除去に特に有用である。
本発明者らは、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを用いてIVT混合物から大きなRNAを精製するために特に有用であるが、短鎖RNA(例えば、siRNA)および中等度のRNA(例えば、mRNA)の精製にも使用可能な、工業的にスケーラブルなプロセスを考案した。よって、本発明の方法は、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーの1以上の工程を含んでなり得る。
本発明によれば、RNAは、コアビーズフロースルークロマトグラフィーを用いて精製することができる。よって、本発明の方法は、コアビーズフロースルークロマトグラフィーの1以上の工程を含んでなり得る。本発明者らは、この技術が高収率で純粋なRNAを得るための迅速な工業規模の精製プロセスを可能とし、例えば、IVT反応サンプルにおいて所望のRNA種からタンパク質夾雑物を除去するために特に有利であることを見出した。本発明者らは、3メガダルトンを超えるものを含んでなる極めて大きなRNA種がこの方法を用いて精製可能であることを示した。本発明者らの知る限り、特にIVT後に、コアビーズクロマトグラフィーまたは他の任意の方法を用いてこのように大きなRNA種の精製を可能とする従来技術の方法はない。しかしながら、この方法は大きなRNA分子の精製に限定されず、下記のように好適なビーズ孔径が選択される限り、いずれのサイズのRNA分子(例えば、中等度のRNA)もこの方法で精製可能である。
開示される方法はいずれも、RNA精製の少なくとも1つの工程、および場合により、さらなるバッファー交換の工程を含んでなるプロセスで単独でまたは組み合わせて使用することができる。例えば、TFF、コアビーズフロースルークロマトグラフィー、またはヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーは、RNA精製に使用され、場合により、その後、バッファー交換および/またはRNA精製のためのさらなるTFF工程が行われる。
本発明の1つの利点は、使い捨て可能な部品を使用することである。よって、本発明の方法は、その方法が実施される装置の一部または全部を、その方法が実施された後に廃棄する工程を含むことができる。例えば、任意のTFFカラム、ヒドロキシアパタイト支持体、および/またはコアビーズフロースルーカラムが廃棄でき、それらを接続するために使用されていた配管およびコネクターも同様に廃棄できる。これらの部品は、生物有害廃棄物として廃棄することができる。
前述のように、本発明は、サンプルからRNAを精製するための方法であって、RNAが12時間以内に少なくとも99%純度まで精製される方法を提供する。
本発明により精製されたRNAは、例えば、対象を様々な疾患に対して免疫する際にワクチンとして使用するための医薬組成物中の成分として有用である。これらの組成物は一般に、RNAと薬学的に許容可能な担体とを含む。薬学的に許容可能な担体の詳細な考察は、Gennaro et al.において得られる。本発明の医薬組成物はまた、小分子免疫増強剤(例えば、TLRアゴニスト)などの1以上の付加的成分も含み得る。本発明の医薬組成物はまた、RNAの送達系、例えば、リポソーム、水中油型エマルション、または微粒子も含み得る。
本発明の医薬組成物は、in vivoにおいて目的の免疫原に対する免疫応答を惹起するために使用することができる。
本発明の実施には、特に断りのない限り、当技術分野の技能の範囲内で化学、生化学、分子生物学、免疫学および薬理学の従来の方法を使用する。このような技術は文献で十分に説明されている。
実施例1:RNA収率およびヌクレオチド除去率を定量するための方法
RNAは、サンプル中で、RNA特異的蛍光色素(RiboGreen(商標))を用いて定量した。精製前と後のRNAレベルを比較し、RNA収率%を計算した。RiboGreen(商標)は遊離ヌクレオチドを検出しない。
10kb RNAレプリコンは、in vitro転写ならびに完全に化学的に定義された酵素、鋳型、物質およびバッファーによるキャッピングによって産生された。単一の閉鎖系でRNA精製とバッファー交換の両方のためにKrosFlo Research IIiタンジェンシャルフローフィルトレーションシステムを用いた(Spectrum Laboratories)。下記に示すように最適な結果を得るために様々なパラメーターを試験した:膜化学、膜孔径、膜面積、膜間差圧、剪断速度(保持液速度)、バッファー体積、緩衝能、バッファーpH、サンプルの塩濃度、およびバッファー中のEDTAの存在。
ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーが大きなRNAの精製に有用であり得るかどうか調べるために、in vitro転写反応物から塩化リチウムにより精製した80μgの10kb RNA(レプリコン)をヒドロキシアパタイトカラムにロードし、様々な割合のバッファーA(10mMリン酸バッファー、pH6.8)およびバッファーB(500mMリン酸バッファー、pH6.8)から構成されるリン酸直線勾配で溶出させた。mRNAはヒドロキシアパタイトカラムに効率的に結合させ、それから回収できることが判明した。RNA収率/回収率は、in vitro転写反応物から塩化リチウムにより精製した同一量のmRNAをヒドロキシアパタイトカラムにロードするか、またはカラムを迂回するクロマトグラフィーシステムに送ることによって測定した。溶出ピーク下の面積を計算し、カラム通過精製無しに対するカラム通過後の比をRNA収率の指標として用いた(1401.25mAu/ml対1934.76mAu/ml)。RNA収率は72%と計算された。in vitro転写反応物から塩化リチウムにより精製された10kb RNA(レプリコン)をヒドロキシアパタイトカラムにロードし、リン酸バッファーを用いて溶出させた。回収した画分4、5および6を変性RNAゲルにロードしたところ、光学密度の読み取り値がRNAに関連付けられることが確認された。
タンジェンシャルフローフィルトレーションと、その後のヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーの組合せを、in vitro転写反応物サンプルからのRNA精製の効率の改善に関して、特に、サンプルがヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーに使用される前のヌクレオチドの除去に関して調べた。10kb RNAレプリコン産物を含有する未精製in vitro転写反応物を出発サンプルとして使用した。図3Aおよび3Bは、このような方法の組合せが、タンジェンシャルフローフィルトレーション工程ではヌクレオチドの、また、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー工程ではDNA(精製RNA1mg当たりDNA5.93ngに低減)およびタンパク質(検出レベルを下回るまでに低減)の効率的除去を可能とし、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー工程(実施例3に記載のように段階的溶出勾配を溶出に使用した)の後には純粋なRNA(>80%)の回収が可能とすることを示す。これは、全RNA精製手順から鋳型DNAの消化を省くことができ、より速い操作時間をもたらすので、特に有用である。
コアビーズフロースルークロマトグラフィーをRNAの精製に関して試験した。10kb RNAレプリコン産物を含有する未精製in vitro転写反応物(Tris 50mM、pH8.0中)を出発サンプルとして使用した。GE AKTAa Explorer 100 FPLCシステムで、まず、HiScreen Capto(商標)Core 700カラム(製品コード:17−5481−15)を使用した。サンプルを、Tris 50mM、pH8.0のバッファーで、RNA終濃度が600ng/μl(最終容量:5.1mgのRNAを含有する8.5ml)となるように希釈した。このサンプルをカラムに注入し、サンプルの溶出が完了するまでTrisバッファー(50mM)でチェイスした。流速は1ml/分(125cm/時に相当)に設定した。カラム定置洗浄(CIP)および再生は、製造者の説明書に従った。RNAはカラムの通過画分中に回収できることが判明した(例えば、in vitro転写反応物サンプル、5.1mgRNA、RNAは通過画分に溶出した)。図4Aおよび4Bは、RNAはカラムの通過画分から高レベルの収率で回収され(図4Bレーン2対レーン1)、コアビーズフロースルークロマトグラフィー前に比べて低いレベルのタンパク質不純物を含有する(図4Aレーン2対レーン1)ことを示す。
出発サンプルとして10kb RNAレプリコン産物を含有する未精製in vitro転写反応物を用い、ヌクレオチドおよびタンパク質除去率を、タンジェンシャルフローフィルトレーションまたはコアビーズフロースルークロマトグラフィーのいずれかを用いて比較した(サンプル中、0、250または500mMの塩化カリウム濃度を使用)。図6Bおよび6Dは、タンジェンシャルフローフィルトレーションがヌクレオチド不純物を効率的に除去することを示す。図6Cは、コアビーズフロースルークロマトグラフィーが塩化カリウムの存在下でタンパク質不純物を効率的に除去することを示す。従って、ヌクレオチドおよびタンパク質不純物を除去することが望まれる場合には、コアビーズフロースルークロマトグラフィーの後にタンジェンシャルフローフィルトレーションを行うことが望ましい。
サンプルバッファーおよび/またはチェイスバッファー中の、塩化カリウムなどの付加的塩の存在は、場合により所望されないこともある。出発サンプルとして10kb RNAレプリコンを含有する未精製in vitro転写反応物を用い、コアビーズフロースルークロマトグラフィー(付加的塩を用いない、すなわち、0mM塩化カリウム)単独またはその後にヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー(この場合も付加的塩を用いない、すなわち、0mM塩化ナトリウム)を用いてタンパク質除去率を比較した。図6C(レーン「CC0HTP0」対レーン「CC0」)は、コアビーズフロースルークロマトグラフィーの後にヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを行った場合、付加的塩の不在下であっても効率的なタンパク質除去が達成できることを示す。
4種類の異なるプロセス流(P1〜P4)をRNA精製のために考案し(表3)、およびRNA回収率/収率および純度に関して比較を行った(図6A〜6G)。
タンジェンシャルフローフィルトレーションとその後のヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーの組合せを、in vitro転写反応物サンプルからの分取RNA精製に用いた。6mgの10kb RNAキャップレプリコン産物を含有する未精製in vitro転写反応物を出発サンプルとして用いた。タンジェンシャルフローフィルトレーションは、10mM Tris pH8.0を用いて行った。RNA含有画分が保持された。このサンプルに終濃度500mMで塩化カリウムを加え、そのサンプルをヒドロキシアパタイトカラム(GE Hi Scale 26カラム、高さ20cm、100ml中、CHT(商標)CeramicヒドロキシアパタイトタイプII、40μm粒径、Biorad;GE AKTA explorer 100で実施;流速10ml/分;線形速度300cm/時)に適用した。溶出バッファーは、バッファーA(10mMリン酸カリウム、pH6.5)およびバッファーB(1Mリン酸カリウム、pH6.5)であった。RNAを、18%バッファーB(180mMリン酸カリウム)で選択的に溶出させた。結果は、この方法が大規模分取RNA精製を高収率かつ高純度で達成することを示す。
Claims (17)
- サンプルからRNAを精製するための方法であって、タンジェンシャルフローフィルトレーション、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、コアビーズフロースルークロマトグラフィー、またはそれらの任意の組合せの1以上の工程を含んでなる、方法。
- (a)タンジェンシャルフローフィルトレーションまたはコアビーズフロースルークロマトグラフィーの工程、および
(b)ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーの工程
を含んでなる、請求項1に記載の方法。 - 前記RNAが分取規模で精製される、請求項1または2に記載の方法。
- 塩化リチウム、有機溶媒、70℃を超える温度、および/またはDNAの酵素消化の使用を含まない、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- RNAまたは所望のRNA種を含有しない材料を廃棄し、RNAまたは所望のRNAを含有する材料を維持することを含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記サンプルが、RNAと、プラスミドDNA、デオキシオリゴヌクレオチド、デオキシヌクレオシド一リン酸、リボヌクレオシド三リン酸およびタンパク質の1種以上とを含有し、場合により、前記サンプルが、ゲノムDNAおよび/または細胞膜もしくはその断片を含有しない、例えば、前記サンプルが、in vitro転写反応物サンプルである、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記サンプルが、RNAと、プラスミドDNA、デオキシオリゴヌクレオチド、デオキシヌクレオシド一リン酸、リボヌクレオシド三リン酸およびタンパク質の4種以下とを含有し、場合により、前記サンプルが、ゲノムDNAおよび/または細胞膜もしくはその断片を含有しない、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記RNAが、一本鎖RNA、例えば、mRNAである、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記RNAが、少なくとも1,000ヌクレオチド、例えば、少なくとも5,000ヌクレオチドの線状配列を含んでなる、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 親水性固定相および/または親水性膜を使用する、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- タンジェンシャルフローフィルトレーションを含んでなるバッファー交換の1以上の工程をさらに含んでなる、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 例えば、RNAのin vitro転写を用いたRNA製造の工程をさらに含んでなる、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
- サンプルからRNAを精製するための方法であって、RNAが12時間以内に少なくとも99%の純度に精製される、方法。
- RNA、DNA、ピロホスフェート、および遊離ヌクレオチドを含有するサンプルからRNAを精製するための方法であって、DNA、ピロホスフェート、および遊離ヌクレオチドを含まない最終材料を12時間以内に提供する、方法。
- 医薬組成物を製造するための方法であって、
(a)請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法によってRNAを精製する工程、および
(b)精製されたRNAを医薬組成物として処方する工程
を含んでなる、方法。 - 請求項15に記載の方法によって製造される医薬組成物であって、DNA、デオキシオリゴヌクレオチド、デオキシヌクレオシド一リン酸、リボヌクレオシド三リン酸、ポリメラーゼ酵素およびRNAキャッピング酵素のうち1種以上を実質的に含まない、医薬組成物。
- 医薬に使用するための、請求項16に記載の医薬組成物。
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