TW202214852A - Rna純化法 - Google Patents
Rna純化法 Download PDFInfo
- Publication number
- TW202214852A TW202214852A TW110122661A TW110122661A TW202214852A TW 202214852 A TW202214852 A TW 202214852A TW 110122661 A TW110122661 A TW 110122661A TW 110122661 A TW110122661 A TW 110122661A TW 202214852 A TW202214852 A TW 202214852A
- Authority
- TW
- Taiwan
- Prior art keywords
- ssrna
- dsrna
- rna
- filter
- present
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
- C12N15/1017—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by filtration, e.g. using filters, frits, membranes
Abstract
本發明概要而言係與RNA純化方法之領域有關。明確地說,其係與一種用於降低RNA樣本中之dsRNA含量,並因而在此等樣本中增加ssRNA濃度之方法有關。該方法係以對含有ssRNA、dsRNA以及至少一種鹽類之RNA樣本中進行之過濾步驟為基礎。
Description
本發明概要來說係與RNA純化法之領域有關。尤其係與一種用於從dsRNA中分離ssRNA的方法有關;例如減少在RNA樣本中之dsRNA含量,並對應地增加此類樣本中之ssRNA濃度,反之亦然。該方法係以針對含有ssRNA、dsRNA以及至少一種鹽類之RNA樣本進行過濾步驟為基礎。
從所活體外轉錄所生成的RNA,係由兩個不同的亞群所組成:單股RNA (ssRNA)與雙股RNA (dsRNA)。依據所預想之應用方式,將這些亞群之一加以純化會是較為有利的,例如針對於RNA干擾而言,dsRNA係為較佳者,而對於治療用途來說,ssRNA則可能是較佳的,因為dsRNA帶有免疫原性,且因此該活體外轉錄之RNA應該在進行治療用途前除去dsRNA。
在文獻中先前已經描述了單股RNA (ssRNA)與雙股RNA (dsRNA),可以使用可變濃度之氯化鋰來選擇性地進行沉澱(Voloudakis等人,2015)。此外,ssRNA與dsRNA也已經被描述可以使用纖維素層析法來分離,其中dsRNA係與纖維素材料結合,而允許ssRNA流過(EP3445850A1,Baiersdörfer等人,2019)。然而,這些技術難以放大到工業批次層級。
儘管如此,目前仍需要進一步的RNA純化方法,以得到超純RNA部分,其中盡可能地降低dsRNA或ssRNA的殘留部分,並且可以將其放大至工業批次層級。
本發明針對於產物中間體之濃縮與滲濾,開發了一種以切向流過濾(TFF)作用為基礎之方法,以作為開發此種新穎純化方法的部分技術。儘管具有治療效用之mRNA通常具有數百千道爾頓(several hundred kilodalton)之莫耳質量,但令人驚訝地發現的是,在使用標稱截止值低至30kD之過濾器時,仍會發生顯著的產物損耗。本案發明人的進一步研究顯示,這一觀測結果係源自於RNA的二級結構主要是線性的,從而解釋了為什麼較高質量之分子,能夠移動通過具有較低質量截止值之濾膜。基於這些觀察結果,本案發明人據此開發了一種運用過濾步驟來分離dsRNA與ssRNA的方法,其包括會使dsRNA與ssRNA採用不同二級結構之條件,而因此,dsRNA與ssRNA對於所採用的過濾器會有不同的表現。
在第一態樣中,本發明係與一種自dsRNA中分離ssRNA的方法有關;該方法包括以下步驟:
a)提供一樣本,其包含至少一種鹽類、ssRNA與dsRNA;
b)將步驟a)的該樣本施加到一過濾器上,從而將該ssRNA與該dsRNA分離。
在另一具體實施例中,該鹽類包含選自下列包括一價陽離子、三價陽離子、一價陰離子、二價陰離子、三價陰離子或是其等組合的離子。
在再進一步的具體實施例中,該鹽類係選自下列包含鈉鹽、鉀鹽、鋰鹽或銨鹽,特別是NaCl、LiCl、NH
4Cl、KCl、Na
3PO
4或Na
2SO
4。
該鹽可以介於例如大約5mM和2M之間的濃度存在;例如大約5mM和1M之間,大約5mM和500mM之間;或者是大約且介於15mM至2M之間;例如大約且介於100mM至1M之間。
在本發明的另一特定實施例中,該樣本還可以包含至少一種醇類,該醇類可以例如選自於下列包括乙醇、異丙醇、丙醇。該醇類可以是例如以大約且介於10%-30%(v/v)之間的濃度而存在。
在另一具體實施例中,該過濾器具有大約30kD至300kD之間的孔徑。
在又一具體實施例中,該樣本還包含Tris-HCl及/或EDTA。
在一非常特定的具體實施例中,該樣本包含大約且介於10mM EDTA,以及大約且介於100mM的該鹽類,並且具有大約7.8的pH值。
在本發明方法的又一具體實施例中,步驟b)可以使用選自於切向流過濾、滲濾(diafiltration)、濾餅過濾(dead-end filtration)或是其組合的方法來進行。
在進一步的具體實施例中,該方法不包括以纖維素為基礎之層析步驟,及/或以纖維素為基礎之過濾器。
在另一態樣中,本發明還提供了從樣本中分離dsRNA與ssRNA之過濾步驟的用途。
在另一態樣中,本發明提供了藉由如在此所界定之方法,所獲得之ssRNA或dsRNA分子,以及其等在人類及/或獸醫學中之用途。
現在將進一步描述本發明。在以下段落中,更詳細地界定了本發明之不同態樣。除非有明確相對指明,否則如此界定之每個態樣,都可以與任何其他態樣或多個態樣組合。特別地,被指明為較佳或較有利之任何特徵,均可以與被指明為較佳或有利的任何其他特徵組合。
此處所用的「大約」或「約略」用語,在指述例如參數、數量、持續時間等等之可測量值時,係代表包括+/-10%或更少的變化量,較佳地為該特定數值之+/-5%或更少,更佳地為+/-1%或更少,又更佳地為+/-0.1%或更少,只要這樣此一變化量係適合運用於所揭露之發明中。應當理解的是,「大約」或「約略」修飾用語的數值本身,也是明確的且係較佳地已被揭露的。
在本案發明說明書與隨附申請專利範圍中,除非在上下文另外有明確指明,所使用之單數形式「一」、「一種」與「該」均包括複數所指述對象。
如在上文所詳細描述者,本發明提供了一種用於分離ssRNA與dsRNA的方法,其包括一過濾步驟。就本案發明人所知,ssRNA與dsRNA之分離,尚未藉由使用過濾器來進行。相較之下,在文獻中已描述單股RNA (ssRNA)與雙股RNA (dsRNA)可以藉著使用不同濃度之氯化鋰來選擇性沉澱(Voloudakis等人,2015);或者是使用纖維素層析法,其中dsRNA係與纖維素材料結合,並允許ssRNA流過而分離(EP3445850A1,Baiersdörfer等人,2019)。本發明與這些揭露內容的不同之處,在於本發明係使用過濾器而不是以纖維素為基礎之管柱。明確地說,習知技術方法係有賴於使用選擇性結合劑,例如會與dsRNA結合之纖維素材料。因此,藉著從液體中分離該選擇性黏合劑(+dsRNA),便可以達成ssRNA與dsRNA之間的分離。其與本發明的技術之間的主要區別,在於在本發明之分離作用事實上係有賴於一個簡單的過濾步驟,而不需要例如纖維素材料之選擇性黏合劑。這兩種技術完全不同,並且無法輕易置換。雖然過濾器已經被用於生產RNA,例如總RNA之分離及/或純化,但其等尚未用於ssRNA之特定分離作用中。
因此,本發明因而提供了一種從dsRNA中分離ssRNA之方法;該方法包括以下步驟:
a)提供一樣本,其包括至少一鹽類、ssRNA與dsRNA;
b)藉著過濾技術來將該ssRNA與該dsRNA分離。
或者,本發明提供了一種從dsRNA中分離ssRNA之方法;該方法包括以下步驟:
a)提供一樣本,其包括至少一鹽類、ssRNA與dsRNA;
b)將步驟a)的該樣本於不存在例如纖維素之選擇性黏合劑的情況下,施加至一過濾器從而將該ssRNA與該dsRNA分離。
特別是,本發明因此供了一種從dsRNA中分離ssRNA之方法;該方法包括以下步驟:
a)提供一樣本,其包括至少一鹽類、ssRNA與dsRNA;
b)將步驟a)的該樣本施加於一過濾器,從而將該ssRNA與該dsRNA分離。
換言之,本發明還提供了一種ssRNA的純化方法;該方法包括以下步驟:
a)提供待純化之RNA樣本,其中該樣本係包含或補充有至少一鹽類;
b)將步驟 a)的該樣本施加於一過濾器,從而自任何dsRNA污染中純化該ssRNA樣本。
再者,本發明提供了一種dsRNA的純化方法;該方法包括以下步驟:
a)提供待純化之一RNA樣本,其中該樣本係包含或補充有至少一鹽類;
b)將步驟a)的該樣本施加於一過濾器,從而自任何ssRNA污染中純化該dsRNA樣本。
又或者,本發明提供了一種提供單股RNA(ssRNA)的方法,包括:
(i)提供RNA製備物,其包含dsRNA與ssRNA;
(ii)在選擇性地允許單股RNA(ssRNA)流過過濾器而為滲透物的條件下,使該RNA物與過濾器接觸;並且其允許該dsRNA保留在滲餘物中
(iii)獲得含有該ssRNA的滲透物。
又或者,本發明提供了一種提供雙股RNA(dsRNA)的方法,包括:
(i)提供RNA製備物,其包含dsRNA與ssRNA;
(ii)在選擇性地允許該單股RNA(ssRNA)流過過濾器而為滲透物的條件下,使該RNA製備物與過濾器接觸;並且其允許該dsRNA保留在滲餘物中
(iii)獲得含有該dsRNA的滲餘物。
在本文中所採用的「選擇性地允許ssRNA流過該過濾器的條件…」之描述內容,係指誘使ssRNA及/或dsRNA之構形及/或結構產生變化(例如,增進變化)的條件,從而迫使此兩種類型的分子進入不同的形式,而可以使用過濾器來選擇性地分離。舉例來說,可以選擇該條件以使得dsRNA被強迫形成為大體積3D結構,而在相同的條件下卻可允許ssRNA維持線性。很顯然地相較於線性結構,大體積3D結構在被施加到過濾器時的行為並不相同,而因此可以有效地彼此分離。
在本發明的內容中,「過濾器」用語係指在過濾步驟中所採用之結構,以物理的、生物的或化學的運作方式,將兩種或多種成分彼此分離。明確地說,本發明之過濾器係藉著使用一種會迫使兩種物質進入不同3維構形之介質,而允許將dsRNA和ssRNA彼此分離。藉著改變該過濾器的孔徑,可以在良好的分離作用與足夠的產量之間找到平衡。在特定具體實施例中,所採用之過濾器係具有介於30kD和300kD之間,例如介於50kD和100kD之間的標稱截止值;或者是大約30kD、大約50kD、大約70kD、大約100kD、大約150kD、大約200kD、大約250kD、大約300kD或介於其間的任何數值。
令人驚訝地發現的是,即使該標稱截止值比所施加之ssRNA與dsRNA之分子量低上得多,因而被預期這些分子之間並無法使用這些過濾器來取得分離作用,這些過濾器仍然適用於本發明之範圍內。然而,藉由改變該介質之條件,特別是藉著使其存在有至少一種鹽類,而出人意料地可以獲得了良好的分離作用。
在本發明的內容中,「標稱截止值」或者是「截留分子量」用語係指其中被該過濾器保留90%之物質的最低分子量。
本發明的方法可被應用於包括一過濾步驟之任何類型的純化方法中,例如但不限於切向流過濾、滲濾、濾餅過濾或是其等之組合。
用語「切向流過濾」或「掃流過濾」(cross-flow filtration)係為一種過濾類型,其中進料流係通過一過濾器或過濾床,且其中該等固體係被截留在過濾器中,同時濾液則被釋放於過濾器的另外一端。掃流過濾代表著大部分進料流,例如在濾餅過濾中,係切向地橫越過該過濾器表面,而不是進入過濾器。掃流過濾的優點在於,在過濾過程中會阻塞過濾器之濾餅被連續且大量地沖走,從而增加了過濾器單元可進行操作之時間長度。與批次式濾餅過濾相反的是,其也可以應用於連續程序中。掃流過濾之主要驅動力係為跨膜壓,其係為過濾器兩側壓力差的量測值。該進料流係在相對該滲透側之正壓下切向地橫越過該過濾器。一部分小於膜孔徑之物質會成為滲透物或濾液通過該濾膜,其他所有物質則成為滲留物而保留在膜的進料側。
「滲濾作用」用語係指一種稀釋過程,其涉及藉著使用微分子滲透過濾器,依據分子大小來移除或分離溶液成分(例如,像鹽類、小型蛋白質、溶劑等等之可滲透分子),以獲得純化的溶液。滲濾作用也可與切向流過濾結合,其中新鮮的溶劑係以與滲透物流速相同之速度,添加至進料流來替換滲透物之體積,以使得該系統中之體積保持恆定,同時該滲透物成分係被有效地從漿液中移除。
濾餅過濾係為一種物理性、生物性或化學性操作,其係以具有複雜結構之過濾介質,來將固體物質與流體從混合物中分離出來,而只有特定尺寸之顆粒才能通過。不能通過該過濾介質之固體顆粒係被稱為尺寸過大顆粒,而所通過之流體(含有較小顆粒)則稱為過濾液。尺寸過大顆粒可能會在該過濾器頂部形成一濾餅,也可能會堵塞該過濾器晶格,而阻止流體相穿過該過濾器,其係被稱為堵塞現象。
在一具體實施例中,本發明的方法不包括以纖維素為基礎之層析步驟,及/或以纖維素為基礎之過濾器。在以纖維素為基礎之層析法中,含有例如RNA之分子可以使用這些纖維素管柱來純化。這種類型的管柱並未運用其中分子係自膜的一側,穿越至該膜到另一側之傳統過濾原理。
迫使dsRNA與ssRNA進入不同之3D構形,從而允許其等分離之樣本條件,可以藉由包含有該dsRNA與ssRNA之介質的組成物(例如緩衝液之組成物)來控制。在此一態樣中,「組成物」係指在該介質中(例如,在緩衝液中),所包含之成分的種類與含量。
因此,在一具體實施例中,該條件可以藉著一種包含水分和一定濃度之鹽類的介質(例如,緩衝液)來達成,該鹽類的濃度可以誘使該dsRNA與ssRNA產生不同的3D構形。因此,為了滿足這些條件,該RNA製備物可以一種包含ssRNA、dsRNA與該介質(例如緩衝液)之液體來提供。
本案發明人驚訝地發現,dsRNA與ssRNA可以在至少一種鹽類存在下,使用過濾器而選擇性地分離。在一具體實施例中,該介質包含濃度大約且介於5mM與2M之間的鹽類;較佳地為大約且介於5mM至1M之間;更佳地為大約且介於5mM和500mM之間;或者,該鹽類可以大約且介於15mM至2M之間,較佳地為20mM至1M,例如50mM至1M或100mM至1M之濃度而存在。
本發明中之鹽類特別可以包含選自於下列包括一價陽離子、三價陽離子、一價陰離子、二價陰離子、三價陰離子或其等之組合的離子。
在本發明的內容中,「離子」用語係指具有淨電荷之粒子、原子或分子。陽離子係為帶正電的離子,其之電子比質子少,而陰離子則帶負電,其具有比質子更多之電子。離子的價數決定了正電荷或負電荷之數量。因此,一價陽離子係為具有一個正電荷的離子,三價陽離子係為具有三個正電荷的離子,一價陰離子係為具有一個負電荷的離子,二價陰離子係為具有兩個負電荷的離子,三價陰離子則係為具有三個負電荷的離子。
在該介質中之鹽類係較佳地選自鈉鹽、鉀鹽、鋰鹽或銨鹽,諸如選自於NaCl、LiCl、NH
4Cl、KCl、Na
3PO
4、或Na
2SO
4。在使用氯化鈉鹽時,較佳的濃度範圍係為10mM至500mM,更佳地為50mM至250mM,最佳地為100mM至200mM。在使用氯化鋰鹽時,較佳的濃度範圍係為100mM至2M,更佳地為250mM至1M,最佳地為500mM至1M。然而,基於本申請案中所提供之資訊與數據,習於此技術者可以輕易地確認適合用於本發明之方法中之介質的其他鹽類及其之濃度。
除了上述鹽類之外,該介質還可以包含或補充有至少一種醇類,以例如用於進一步提高製程效率及/或產率。該醇類係較佳地以10%至30%(v/v)的濃度存在於或補充至該介質中。因此,在一具體實施例中,上述所界定之條件可以藉著包含有至少一種如上述所指定之鹽類,以及濃度為10至25%(v/v),較佳地為14至19%(v/v),更佳地為14至18%(v/v),例如14至17%(v/v)、14至16%(v/v)、15至19%(v/v)、15至18%(v/v)、15至17%(v/v)、16至19%(v/v)或16至18%(v/v)的醇類之介質來實現。在特定實施例中,該介質係較佳地包含濃度至少為10%之醇類,例如至少11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%。
該介質中進一步可選擇之成分,可以包括緩衝物質(例如TRIS或HEPES),及/或螯合劑(例如EDTA或氮基三醋酸EDTA)。在一具體實施例中,緩衝物質在介質中的濃度為5至100mM,較佳地為10至100mM,例如10至50毫米,8至20mM或10至15mM。在一具體實施例中,該介質之pH值係為6.5至8.0,較佳地為6.7至7.8,例如為6.8至7.2(例如,在以TRIS作為緩衝物質時)或7.3至7.7(例如,在以HEPES作為緩衝物質時)。在一具體實施例中,在該介質中之該螯合劑的濃度係為0.5至50mM,較佳地為0.5至30mM,例如1至5mM。在一具體實施例中,該介質包含水、鹽類(例如氯化鈉)、醇類(例如乙醇)、TRIS與EDTA,其等係較佳地處於上述所指明的濃度內。然而,基於本申請案中所提供之資訊與數據,習於此技術者可以輕易地確認適合用於本發明之方法中之介質中,除了TRIS以外的緩衝物質、及/或除了EDTA以外的螯合劑、及/或除了氯化鈉以外的鹽類,以及其等之濃度。
在進一步的具體實施例中,該介質包含16%至24%的含量之乙醇、以及50至150mM的含量之氯化鈉。在另一具體實施例中,該介質還包含0.5至5mM的含量之EDTA、及/或5至20mM的含量之TRIS。
例如,在一具體實施例中,該介質包含10mM的Tris-HCl pH=7.5、100mM的NaCl、1mM的EDTA、以及16%v/v的乙醇。在另一具體實施例中,該介質包含10mM的Tris-HCl pH=7.8,100mM的鹽類,以及1mM的EDTA。
在另一具體實施例中,該介質包含10mM的Tris-HCl pH=7.5、100mM的NaCl、1mM的EDTA、以及24%v/v的乙醇。在又另一具體實施例中,該介質包含的10mM的Tris-HCl pH=7.5、1M的LiCl、1mM的EDTA、以及16%v/v的乙醇。
藉著本發明之任何方法所獲得的ssRNA或dsRNA,可以進行例如沉澱及/或修改作用之進一步的處理。舉例來說,藉著本發明之方法所獲得的ssRNA或dsRNA,可以使用傳統方法(例如,使用「乙酸鈉/異丙醇」沉澱法或是「LiCl」沉澱法)來進行沉澱,以得到處於乾燥形式下之ssRNA或dsRNA製備物。乾燥的ssRNA或dsRNA可以進行儲存(例如,在-70°C下),或者可以被溶解於適當的溶劑中(例如,水或TE緩衝液(10mM的TRIS,1mM的EDTA)),然後加以儲存(例如,在-70°C下)或進一步加以運用(例如,用於製備醫藥組成物)。任擇地或另外地,該ssRNA或dsRNA可以在其等進行儲存(例如,在-70°C下),或是進行運用(例如,用於製備醫藥組成物)之前,進一步被修改,例如移除無帽5'-三磷酸酯(uncapped 5'-triphosphates)、及/或加入端帽結構(cap structure)。
如本申請案的具體實施例中所證實者,本發明之方法提供許多優點,例如相較於HPLC方法,本發明之方法更具有成本效益並且更簡單(不需要複雜的設備),避免有毒物質(例如乙腈),並以相對較高之純度與產量來提供經純化RNA。此外,本發明之方法可以輕易地放大規模,並且比傳統的HPLC方法耗時更短。在這一方面,需要注意的是傳統的HPLC方法,通常會受到層析柱尺寸以及在使用大型層析柱時所出現之背壓問題所侷限。本發明之方法不會出現這些狀況。
本文在此所採用的「鹽類」用語,係指由酸和鹼的中和反應產生的任何離子化合物。較佳地,該鹽類(i)並不是緩衝物質,(ii)不是螯合劑,或(iii)既不是緩衝物質也不是螯合劑。酸類之具體實施例包括無機酸(例如鹽酸、氫溴酸、氫碘酸、硫酸、硝酸、磷酸、硼酸與過氯酸),以及有機酸(例如,單羧酸,較佳地為具有1至5(例如1、2或3)個碳原子,例如甲酸、乙酸和丙酸),較佳地為無機酸。鹼類之具體實施例包括無機鹼(例如NaOH、氫氧化銨(NH
4OH)、以及金屬的氧化物與氫氧化物,較佳地為鹼金屬、土金屬與鹼土金屬之氧化物與氫氧化物(例如Li、Na、K、Rb、Be、Mg、Ca、Sr、Al和Zn之氧化物和氫氧化物)),以及有機鹼(例如胺類,諸如單烷基、二烷基或三烷基胺),較佳地為無機鹼,更佳地為Li、Na、K、Mg、Ca、Al和Zn的氧化物與氫氧化物,更佳地為Li、Na、K和Zn的氧化物與氫氧化物,例如Li、Na和K的氧化物與氫氧化物。可以用於本案方法之例示的鹽類包括LiCl、NaCl、NH
4Cl、KCl、Na
3PO
4、或Na
2SO
4;例如LiCl或NaCl;較佳地為NaCl。
如本文在此所採用的「緩衝物質」與「緩衝劑」該些用語,係指即使將強酸或強鹼加入溶液中也能將溶液之pH值維持在幾乎恆定之化合物的混合物。在一具體實施例中,緩衝物質或緩衝劑係為弱酸與其之共軛鹼的混合物。在另一具體實施例中,緩衝物質或緩衝劑係為弱鹼與其之共軛酸的混合物。較佳地,該緩衝物質並不是螯合劑。適用於本發明內容中之緩衝物質的具體實施例,包括有參(羥甲基)胺基甲烷(TRIS)、4-(2-羥基乙基1)-1-哌乙磺酸(HEPES)、3-啉基-2-羥基丙磺酸(MOPSO)、3-(N-啉基)丙磺酸(MOPS)、N,N-雙(2-羥乙基)-2-胺基乙磺酸(BES)、2-[(2-羥基-1,1-雙(羥甲基))乙基)胺基]乙磺酸(TES)、哌-N,N'-雙(2-乙磺酸)(PIPES)、以及3-(N,N-雙[2-羥乙基]胺基)-2-羥基丙磺酸酸(DIPSO),較佳地為TRIS或HEPES,更佳地為TRIS。所需之pH值(例如pH6.5至8.0,較佳地為pH6.6至7.8,例如pH6.8至7.6、pH6.8至7.2、pH6.9至7.5、pH6.9至7.3、pH7.0至7.7、pH7.0至7.5、pH7.0至7.3、pH7.3至7.8、pH7.3至7.7或pH7.3至7.6)可以藉由將足量的酸(例如無機酸,例如鹽酸),加入至對應的鹼(例如TRIS),或是藉由將足量的鹼(例如,無機鹼,如氫氧化鈉),加入至對應的酸而達成。
如本文在此所採用的「螯合劑」用語,係指一種化合物(較佳地為有機化合物),其係為一種多牙配位體,並且能夠與單一個中心原子(較佳為單一個金屬陽離子,例如Ca或Mg離子),形成兩個或更多個(較佳地為三個或更多個,例如四個或更多個)配位鍵。在此一方面,「多牙」係指在單一個配位體分子中具有多於一個(也就是,兩個或更多個,較佳地為三個或更多個,例如四個或更多個)供體基團的配位體,其中供體基團係較佳地包括具有自由電子對之原子。較佳地,該螯合劑並不是緩衝物質。該螯合劑的具體實施例包括有EDTA、氮基三醋酸、檸檬酸鹽(例如檸檬酸鈉)、1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)、1,4,7-三氮雜環壬烷-1,4,7-三乙酸(NOTA)、3,6,9,15-四氮雜雙環[9.3.1]十五碳-1(15),11,13-三烯-3,6,9-三乙酸(PCTA)、以及1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7-三乙酸(D03A),較佳地為EDTA或氮基三醋酸,更佳地為EDTA。
如本文在此與ssRNA或包含ssRNA之RNA製備物,一起採用的「基本上不含dsRNA」用語(其中該ssRNA或包含ssRNA之RNA製備物係經過本發明之方法處理),係指相較於該ssRNA或包含ssRNA之RNA製備物,以本發明的方法處理之前的該ssRNA或包含ssRNA之RNA製備物中之dsRNA含量而言,ssRNA或包含ssRNA之RNA製備物中之dsRNA含量已減少了至少70%(較佳地至少75%、至少80%、至少82%、至少84%、至少86%、至少88%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%)。
如本文在此中與dsRNA或包含dsRNA之RNA製備物,一起使用之「基本上不含ssRNA」用語(其中該dsRNA或包含dsRNA之RNA製備物係經過本發明之方法處理),係指相較於該dsRNA或包含dsRNA之RNA製備物,以本發明的方法處理之前的dsRNA或包含dsRNA之RNA製備物中之ssRNA含量而言,dsRNA或包含dsRNA之RNA製備物中之ssRNA含量已減少了至少70%(較佳地為至少75%、至少80%、至少82%、至少84%、至少86%、至少88%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%)。
較佳地,已經以本發明之方法處理的該ssRNA或包含ssRNA之RNA製備物,所具有之dsRNA的含量,可以使得該ssRNA或包含ssRNA之RNA製備物,在施用於受試者時基本上不會在受試者中,誘發非所欲的反應(例如誘發非所欲之發炎細胞激素(例如,IFN-a),及/或非所欲地活化會導致自該本發明的ssRNA之蛋白質合成受到抑制的效應物酵素)。
舉例來說,「基本上不含dsRNA」與「基本上不會誘發非所欲的反應」該等用語,可以代表相較於對照組ssRNA(也就是,ssRNA或未經本發明之方法處理的包含ssRNA之RNA製備物),當該ssRNA或包含ssRNA之RNA製備物(其中該ssRNA或包含ssRNA之RNA製備物係已經過本發明之方法處理)施用於受試者時,所誘發之發炎性細胞激素(特別是IFN-a)的含量,已減少了至少60%(例如,至少62%、至少64%、至少66%、至少68%、至少70%、至少72%、至少74%、至少76%、至少78%、至少80%)。較佳地,「基本上不含dsRNA」與「基本上不會誘發非所欲的反應」該等用語,可以代表當該ssRNA或包含ssRNA之RNA製備物(其中該ssRNA或包含ssRNA之RNA製備物係已經過本發明之方法處理,並且該ssRNA編碼胜肽或蛋白質)施用於受試者時,會使得該ssRNA在給藥後轉譯成胜肽或蛋白質至少10小時(例如,至少12小時、至少14小時、至少16小時、至少18小時、至少20小時、至少22小時或至少24小時)。舉例來說,在該ssRNA或包含ssRNA之RNA製備物(其中該ssRNA或包含ssRNA之RNA製備物係已經過本發明之方法處理)中之dsRNA的含量,基於該ssRNA或包含ssRNA之RNA製備物的總重量,可以為至多為5重量%(較佳地為至多4重量%、至多3重量%、至多2重量%、至多1重量%、至多0.5重量%、至多0.1重量%、至多0.05重量%、至多0.01重量%、至多0.005重量%、至多0.001重量%)。
在本發明的內容中,「核酸」係指去氧核糖核酸(DNA)或較佳地係為核糖核酸(RNA),更佳地為mRNA。依據本發明,核酸包括基因體DNA、cDNA、mRNA、重組產生的以及化學合成的分子。依據本發明,核酸可以是單股或雙股的,並且係為線性或共價閉合而形成環之分子形式。核酸可以採用例如從DNA模板通過體外轉錄而製備的RNA之形式,而被用來引入(也就是轉染)至細胞內。此外,RNA更可以在應用前藉由穩定序列、端帽作用(capping)、及/或多腺苷酸化來進行修改。
在本發明的內容中,「RNA」用語係關於一種包含核糖核苷酸殘基之分子,並且係較佳地完全地或基本上由核糖核苷酸殘基所構成之分子。「核糖核苷酸」係與在β-D-呋喃核糖基之2'-位置具有羥基之核苷酸有關。該用語包括雙股RNA、單股RNA、經分離RNA,例如部分純化RNA、實質上純RNA、合成RNA、重組產生RNA,以及藉由添加、刪除、取代及/或改變一或多個核苷酸,而與天然存在之RNA不同的經修改RNA。此種改變可以包括例如在RNA之一或多個核苷酸處,添加非核苷酸物質(例如添加至RNA的末端或內部)。在RNA分子中之核苷酸還可以包含非標準核苷酸,例如非天然存在之核苷酸,或是化學合成的核苷酸或脫氧核苷酸。這些經改變的RNA可以被稱為類似物。該核酸可以包含在一載體中。如在此所採用的「載體」用語包括習於此技術者所已知的任何載體,包括質體載體、黏接載體、噬菌體載體(例如λ噬菌體)、病毒載體(例如腺病毒或桿狀病毒載體),或是人工染色體載體(例如細菌人工染色體(BAC)、酵母人工載體或天然存在RNA之類似物)。
依據本發明,「RNA」用語包括且係較佳地係與意指「信使RNA」之「mRNA」有關,並且係與可以使用DNA作為模板而產生,同時編碼了胜肽或蛋白質之「轉錄本」有關。mRNA通常包含5'-非轉譯區(5'-UTR)、蛋白質或胜肽編碼區、以及3'-非轉譯區(3'-UTR)。mRNA在細胞內與活體外均只具備有限之半衰期。較佳地,mRNA是使用DNA模板藉由活體外轉錄作用而產生。在本發明的一具體實施例中,該RNA係藉著活體外轉錄作用或化學合成作用而取得的。該活體外轉錄方法係為習於此技術者所已知的。舉例來說,市面上已有許多種可商業上取得之活體外轉錄套組。
RNA可以從細胞中分離,可以由DNA模板製備,或者可以使用本技術領域所已知的方法以化學合成。在較佳具體實施例中,RNA是由DNA模板於活體外合成的。在一特別較佳具體實施例中,例如mRNA或抑制性ssRNA(例如,反義RNA、siRNA或miRNA)之RNA(特別是ssRNA),係由DNA模板藉由活體外轉錄作用而產生。在一特別較佳具體實施例中,該RNA係為活體外轉錄RNA(IVT RNA)。為了提供經修改的RNA,例如經修改之天然存在核苷酸、非天然存在核苷酸、及/或經修改非天然存在核苷酸之對應修改核苷酸,可以在合成(較佳地於活體外轉錄作用)期間被併入其中,或者也可以在轉錄後進行修改及/或添加至RNA中。
依據本發明,「RNA」包括mRNA、tRNA、rRNA、snRNA、ssRNA、dsRNA以及抑制性RNA。依據本發明,「ssRNA」包括mRNA與抑制性ssRNA(例如反義ssRNA、siRNA或miRNA)。「ssRNA」係指單股RNA,「dsRNA」則係指雙股RNA,其係為具有兩條部分或完全互補股之RNA。
依據本發明,「mRNA」用語係指「信使-RNA」,並且係與藉著使用DNA作為模板而產生之「轉錄本」有關,同時編碼了胜肽或蛋白質。通常,mRNA包含有5'-UTR、蛋白質編碼區以及3'-UTR。在本發明的內容中,mRNA較佳地係由一DNA模板由活體外轉錄作用而產生。如上所述,該活體外轉錄方法是技術人員已知的,並且已有許多種可商業上取得之活體外轉錄套組。mRNA在細胞內與活體外均只具備有限之半衰期。因此,依據本發明,可以依照需求來修改RNA的安定性與轉譯效率。舉例來說,mRNA可以藉由一或多種具有安定效果及/或提高轉譯效率之修改,來安定mRNA並且增加其之轉譯作用。為了促進本發明之mRNA的表現,較佳地在編碼區(也就是編碼了所欲表現之胜肽或蛋白質之序列)內,可以在未改變所欲表現之胜肽或蛋白質的序列下進行修改,以增加其之GC含量來增加mRNA安定性並進行密碼子優化,從而增進在細胞中之轉譯作用。
在本發明的一具體實施例中,該mRNA分子係為編碼了免疫調節蛋白之mRNA分子。
在本發明的內容中,「編碼了免疫調節蛋白的mRNA分子」用語,係指編碼了可以修改抗原呈現細胞之功能性的蛋白質之mRNA分子;尤其是樹突狀細胞。此類分子可以選自於下列各者包括CD40L、CD70、caTLR4、IL-12p70、EL-選擇素、CCR7、及/或4-1 BBL、ICOSL、OX40L、IL-21;尤其是,CD40L、CD70與caTLR4中之一或多者。在本發明的方法中所使用之免疫刺激因子的較佳組合,係為CD40L和caTLR4(即「DiMix」)。在另一較佳具體實施例中,係採用CD40L、CD70和caTLR4免疫刺激分子之組合,其在本文中也稱為「TriMix」。
本文在此所使用或提及之mRNA或DNA,可以是裸露mRNA或DNA,或是受保護mRNA或DNA。保護DNA或mRNA可以增加其之安定性,同時保有將mRNA或DNA用於疫苗接種之目的的能力。保護mRNA和DNA之非限制性具體實施例可以是:脂質體囊裝、魚精蛋白保護、(陽離子)脂質脂質複合化((cationic) lipid lipoplexation)、脂質的、陽離子的或聚陽離子的組成物、甘露糖化脂質複合化(mannosylated lipoplexation)、氣泡脂質體化(bubble liposomation)、聚乙烯亞胺(PEI)保護、脂質體加載微泡保護等等。
在此整體描述內容中所採用之「標的」用語,並未侷限於在此所描述之特定具體實施例。任何例如病毒、細菌或真菌之傳染媒介物,都可以當成標的。此外,也可以把任何腫瘤或癌細胞當作標的。
在另一具體實施例中,該mRNA分子係為編碼了抗原及/或疾病專一性蛋白質之mRNA分子。
依據本發明,「抗原」用語包括任何分子,較佳地係為胜肽或蛋白質,其包含會引發免疫反應及/或免疫反應係針對其之至少一抗原決定位。較佳地,在本發明內容中之抗原係為任擇地在經處理後,會誘發免疫反應之分子,該免疫反應係較佳地對於該抗原或是表現該抗原之細胞具有專一性。特別地,「抗原」係與一種在任擇地經處理後,會由MHC分子所呈現並專一性地與T淋巴細胞(T細胞)反應之分子。
在一具體實施例中,該抗原係為標的專一性抗原,其可以是一腫瘤抗原,或是細菌、病毒或真菌之抗原。該標的專一性抗原可以源自以下任一種:從標的細胞分離之總mRNA、一或多種專一性標的mRNA分子、標的細胞之蛋白質裂解物、來自標的細胞之特定蛋白質、或是合成標的專一性胜肽或蛋白質、以及編碼了標的專一性抗原或其之衍生胜肽之合成mRNA或DNA。
依據本發明之ssRNA(較佳地為mRNA)可以具有經修改核糖核苷酸,以增加其之安定性及/或降低細胞毒性。例如,在一具體實施例中,在依據本發明之ssRNA(較佳地為mRNA)中,5-甲基胞核苷係被用來部分地或完全地(較佳地為完全地)取代胞核苷。再者或另外,在一具體實施例中,在依據本發明之ssRNA(較佳地為mRNA)中,假尿核苷或N(1)-甲基假尿核苷係係被用來部分地或完全地(較佳地為完全地)取代尿核苷。以假尿核苷修改(部分地或完全地(較佳地為完全地)取代尿核苷)之RNA(較佳地為ssRNA,例如mRNA),在本文中係被稱為「Ψ-修改的」,而「N1Ψ-修改的」用語,則係指包含N(1)-甲基假尿核苷(部分地或完全地(較佳地為完全地)取代尿核苷)之RNA(較佳地為ssRNA,例如mRNA)。
在一具體實施例中,「修改」用語係與提供一種具有5’-端帽或5’-端帽類似物之RNA(較佳地為ssRNA,例如mRNA)。「5’-帽」用語係指位於RNA(較佳地為ssRNA,例如mRNA)分子5'-末端之端帽結構,其通常係由藉著不常見之5'至5'三磷酸酯鏈接,而連接至該RNA(較佳地為ssRNA,例如mRNA)的鳥核苷酸所組成。在一具體實施例中,該鳥核苷酸係在7-位置被甲基化。「傳統5’-端帽」用語係指天然存在之RNA 5’-端帽,較佳地為7-甲基鳥核苷酸端帽(m7G)。在本發明的內容中,「5’-端帽」用語包括類似於RNA端帽結構之一5’-端帽類似物,其並且係被修改以較佳地於體內及/或在細胞中被連接於RNA上時,具備安定RNA(較佳地為ssRNA,例如mRNA)及/或增強RNA(較佳地為ssRNA,例如mRNA)轉譯作用之能力。
在本發明的內容中,「轉錄」用語係與將DNA序列中之遺傳密碼轉錄成RNA之過程有關。接著,RNA可以被轉譯成蛋白質。依據本發明,「轉錄」用語包括「活體外轉錄」,其中「活體外轉錄」用語,係與RNA(特別是ssRNA,例如mRNA)在無細胞系統中,於活體外合成的過程有關。較佳地,選殖載體係被用於產生轉錄本。這些選殖載體通常係被稱為轉錄載體,並且依據本發明係為「載體」用語所涵蓋。依據本發明,RNA製備物包含藉由活體外轉錄作用,特別是適當之DNA模板的活體外轉錄作用所產生的ssRNA。控制轉錄作用的啟動子,可以是任何RNA聚合酶之任何啟動子。RNA聚合酶之具體實施例為T7、T3與SP6 RNA聚合酶。較佳地,活體外轉錄作用係由T7、T3或SP6啟動子所控制。用於活體外轉錄之DNA模板,可以藉由選殖核酸(特別是cDNA),並將其引入用於活體外轉錄之適當載體中而獲得。該cDNA可以通過RNA的反轉錄作用而獲得。
在另一態樣中,本發明還提供一種藉由如在此所界定之方法所獲得的ssRNA分子,以及其在人類及/或獸醫學中之用途,例如用於治療癌症或傳染病及/或用於疫苗接種目的中。
具體實施例
具體實施例1:採用過濾方法來移除dsRNA之概念驗證
所有實驗均係在Repligen KR2i TFF系統上進行。起始實驗係採用具有50kD之標稱截止值的空心纖維過濾器(Repligen, C04-E050-05-N)來進行。
製備以下溶液:
- 10ml之配置於1M LiCl中的0.25mg/ml雙重沉澱RNA(RG-mRNA_huCD40L_280219_LiNa)
- 10ml之配置於STE+16% EtOH(10mM Tris-HCl pH=7.5,100mM NaCl,16%乙醇v/v)中的0.25mg/ml雙重沉澱RNA(RG-mRNA_huCD40L_280219_LiNa)
TFF系統係以0.5M NaOH消毒並以100mM Tris-HCl pH=7.5來中和。將該溶液以輔助泵引入進料容器,並分別用1M LiCl或STE+16%EtOH來進行滲濾。滲濾長度設置為20滲濾體積(diavolumes;200ml)。
在進行滲濾之後,以標稱截止值為30kD之Amicon Ultra-15離心過濾器(Merck,UFC903096)來處理滲透物與滲留物部分,以進行濃縮並將緩衝液交換成水。
在將緩衝液更換為水之後所回收之RNA的量係被表列於表1中。
表1:使用50kD過濾器在1M LiCl或STE+16%EtOH中進行滲濾後所回收之RNA
處理條件 | 所 回收 的 RNA (µg) | 回收率 (%) |
RG-mRNA_huCD40L_280219_LiNa_T(50kD, Li,滲透物) | 2,5 | 0.1% |
RG-mRNA_huCD40L_280219_LiNa_T(50kD, Li,滲留物) | 33 | 1.32% |
RG-mRNA_huCD40L_280219_16%EtOHNa_T (50kD,16%EtOH,滲透物) | 1705 | 68.2% |
RG-mRNA_huCD40L_280219_16%EtOHNa_T (50kD, 16%EtOH,滲留物) | 630 | 25.2% |
該些樣本之dsRNA的含量係使用抗dsRNAJ2抗體(Scicons),而以窄縫印漬法(slot blot)來進行分析。
如圖1中所示,配置於1M LiCl中之RNA的超過濾作用,可以導致在滲透物部分中之dsRNA含量,比起滲留物部分大幅減少。如表1所示,在此條件下之回收率很低。
在STE+16%EtOH經純化物質之滲透物部分中,也可以觀察到比起滲留物明確地減少,這代表該方法允許在相對較高之回收率下,由總RNA混合物中移除dsRNA。
由於上述兩種純化ssRNA的方法(藉著添加LiCl和或是NaCl與乙醇),所需要的條件與標準的RNA沉澱法(LiCl沉澱法或NaCl/EtOH沉澱法)中所採用的條件非常相似,因此假設這些條件可能係以不同的方式作用於ss-和dsRNA上,進而導致其中一亞群沉澱或是二級結構發生變化,而另一亞群則不受影響。由於其中一亞群將係為球狀而不是線性的,這兩個亞群便可以運用可以允許線性而不是球狀之RNA通過的中間物截斷過濾膜,來加以分離。
此一假說最初係使用Repligen空心纖維過濾器(mPES,40cm²,截止值為50kD),而於Repligen KR2i TFF系統上進行測試。RNA溶液係被製備於STE+16%乙醇(0.25mg/mlRNA、10mM Tris-HCl pH=7.5、100mM NaCl、1mM EDTA、16%乙醇v/v)中,並進行由20滲濾體積(DV)所構成之滲濾步驟。雖然在滲透物部分(移動通過該過濾器)中所回收之RNA相對較少,但是相較於起始材料或滲留部分(未移動通過該過濾器),該部分所包含的之dsRNA含量明顯降低。
在進一步的實驗中,該過濾器之標稱截止值係被增加到100kD,以提高純化程序之產量。使用此一調整方法之後,該程序之產率增加到86%,而不會對所獲得之RNA的純化廓線(profile)產生負面影響。
具體實施例2:緩衝組成物之優化
為了增加dsRNA清除率,具體實施例1中所描述之實驗,係採用STE+24%EtOH(10mM Tris-HCl pH=7.5、1mM EDTA、100mM NaCl、24%乙醇v/v),而不是STE+16% EtOH下重複進行。
該圖2中所呈現之資料,代表示該程序對於從配置於STE+16%EtOH與STE+24%EtOH兩者之RNA混合物中移除dsRNA來說都是有效的,而在這兩種條件之間並沒有可分辨的差異。
具體實施例3:不同孔徑之評估
從前述實驗中可以確定,在使用標稱截止值為30kD(Repligen, C04-E030-05-N)之空心纖維過濾器時,並沒有RNA移動至滲透物中,並且ssRNA與dsRNA可以使用標稱截止值為50kD之空心纖維過濾器,來進行分離。進一步測試該技術是否可以採用標稱截止值為70kD (Repligen, C04-E070-05-N)與100kD (Repligen, C04-E100-05-N)之過濾器。
製備以下溶液:10ml之配置於STE+16%乙醇中的0.15 mg/ml RNA (RG-mRNA_huCD40L_280219_LiNa)。TFF系統係以0.5M NaOH消毒,並以100mM Tris-HCl pH=7.5來中和。
以STE+16%EtOH對該溶液進行滲濾。滲濾長度係被設定為20DV(200ml)。經過滲濾之後,測定滲透物與滲留物部分之總RNA含量(參見表2)。
表2:使用70kD或100kD過濾器在以STE+16%EtOH進行滲濾之後所回收的RNA
條件 | 所 回收 的 RNA(µg) | 回收率 (%) |
RG-mRNA_huCD40L_280219_LiNa_T(70kD,滲透物) | 958.51 | 95.851% |
RG-mRNA_huCD40L_280219_LiNa_T (70kD,滲留物) | 22.065 | 2.2065% |
RG-mRNA_huCD40L_280219_LiNa_T(100kD,滲透物) | 859.32 | 85.932% |
RG-mRNA_huCD40L_280219_LiNa_T (100kD,滲留物) | 1.860 | 0.186% |
從表1和表2中所呈現之數據清楚可知,增加空心纖維過濾器之孔徑會使得滲透物中之回收率恢復。雖然截止值增加從70kD到100kD,並沒有使得回收率進一步增加,但是其確實使得處理時間顯著減少。
具體實施例4:濾餅過濾
由於滲濾作用會大幅增加該程序之緩衝液消耗並增長處理時間,因而對於此一步驟是否為該程序能有效所必需進行了研究。在第一個實驗中,切向流過濾係以離心過濾器上之濾餅過濾所取代。
製備以下溶液:10ml之配置於STE+16%乙醇中的0.1 mg/ml RNA (RG-mRNA_huCD40L_280219_LiNa)。此一該溶液係被載入至到截止值為100kD (Merck,UFC910096)之Amicon ultra-15離心過濾單元上,並以4000g離心10分鐘。然後,以15ml STE+16% EtOH洗滌該過濾器兩次。將滲透物收集在個別管件中。殘留在過濾器上的部分以H
2O洗滌兩次並再次收集滲透物。
將STE+16%和H
2O部分載入至截止值為30kD (Merck,UFC903096)之Amicon ultra-15離心過濾單元上,並以4000g離心10分鐘。持續進行此一程序直到整個體積都通過該過濾器。然後以15ml H
2O來洗滌該過濾器5次。這些過濾程序之滲透物係被丟棄。
經過洗滌之後,將滲留物轉移至微量離心管(eppendorf tube)中,並以200μl H
2O來洗滌該過濾器。測定回收溶液之體積和濃度。
從表3中明顯可以看出,在STE+16% EtOH中進行濾餅過濾後,只能回收非常有限的ssRNA。由於在使用切向流過濾而應用類似設定條件時並未遭遇到此一問題,因此該材料與過濾膜之黏附現象,可能會造成問題。
表3:使用100kD過濾器進行濾餅過濾後所回收的RNA
條件 | 所 回收的 RNA (µg) | 回收率 (%) |
RG-mRNA_huCD40L_280219_LiNa_STE+16% | 1.86 | 0.186% |
RG-mRNA_huCD40L_280219_LiNa_H20 | 859.32 | 85.932% |
在第二個實驗中,係採用Repligen KR2i TFF系統,而沒有對該樣本施用滲濾作用。相對地,該樣本係在該空心纖維上循環,直到進料容器為流空。
表4:在沒有滲濾作用的情況下,使用100kD過濾器進行切向流過濾之後所回收的RNA
條件 | 所 回收的 RNA (µg) | 回收率 (%) |
RG-mRNA_huCD40L_280219_LiNa_T (16%EtOH, NoDF,滲透物) | 874,169 | 87.419% |
從表4中明顯可以看出,滲濾作用並不是必需的,在使用標準切向流過濾作用來過濾RNA時,仍可以回收大部分的起始材料。
使用dsRNA窄縫印漬法再次分析所回收部分之dsRNA含量(參見圖3)。
雖然在運用濾餅過濾時,所回收之RNA含量較低時(如表3所示),圖3中所呈現之數據顯示,其仍然使得該樣本中所存在的dsRNA含量顯著降低。在TFF在未進行滲濾步驟的情況下進行應用時,在滲透物測試中所存在之RNA,相較於來源材料,所存在的dsRNA係顯著地降低。雖然其之產量與施用滲濾作用時相當,但是dsRNA的清除率較低。
具體實施例5:
進行進一步的實驗以確認對於有效率地移除dsRNA,乙醇是否為必需。
製備以下溶液:10ml之配置於不添加乙醇的STE中之0.15mg/ml RNA (RG-mRNA_huCD40L_280219_LiNa)。該TFF系統係以0.5M NaOH消毒,並以100mMTris-HCl pH=7.5來加以中和。
以STE對該溶液進行滲濾。滲濾長度係被設定為20DV (200ml)。經過滲濾之後,該來源材料與滲透物部分之dsRNA含量係使用該抗dsRNA J2抗體(Scicons;圖4),而以窄縫印漬法來進行分析。
如圖4所示,ssRNA之純化效能並不需要乙醇的存在。
具體實施例6:針對不同條件之測試
在本實驗中,使用不同鹽緩衝液來測試RNA樣本之超過濾作用。此外,我們比較了所採用之鹽類條件下的產量與dsRNA含量,並將經純化材料與採用標準方法運用STE緩衝液來純化之材料進行了比較:
所測試之鹽緩衝液:
• ATE:10mM Tris-HCl、1mM EDTA、100mM NH
4Cl pH 7.8
• KTE:10mM Tris-HCl、1mM EDTA、100mM KCl pH 7.8
• LTE:10mM Tris-HCl、1mM EDTA、100mM LiCl pH 7.8
• MTE:10mM Tris-HCl、1mM EDTA、100mM MgCl
2pH 7.8
• Na
3PO
4TE:10mM Tris-HCl、1mM EDTA、100mM Na
3PO
4pH 7.8
• Na
2SO
4TE:10mM Tris-HCl、1mM EDTA、100mM Na
2SO
4pH 7.8
• MgSO
4TE:10mM Tris-HCl、1mM EDTA、100mM MgSO
4pH 7.8
• STE-比較實施例-10mM Tris-HCl、1mM EDTA、100mM NaOH -pH 7.8
將RNA與等體積之2X鹽緩衝液混合,以在適當的鹽緩衝液中產生10ml之0.5mg/ml RNA的最終溶液。該溶液被然後倒置15次,之後將其使用適當的鹽緩衝液進行滲濾(超過濾步驟:10DV,剪切速率6000/s,0.6巴),以消耗該RNA中之dsRNA的含量。
在將該RNA溶液超過濾之後,於CFC模式下將該RNA濃縮至25ml,並將緩衝液更換為WFI (13DV,8000/s,0.6bar)。
該實驗的結果係被詳述於表5中:
表5:在過程中之不同步驟的產量計算:不同鹽緩衝液之UF產率、TFF產率與總產率。在測量濃度之前,UF之後/TFF之前的樣本係經過LiCl沉澱並重新懸浮於WFI中
「+」代表產率為<20%;「++」代表產率為20-50%;「+++」代表產率>50%
STE | ATE | KTE | LTE | MTE | Na 3 PO 4 TE | Na 2 SO 4 TE | MgSO 4TE | |
UF產率(%) | +++ | +++ | +++ | +++ | + | ++ | +++ | + |
TFF產率(%) | +++ | +++ | +++ | +++ | ++ | +++ | +++ | + |
總產率(%) | +++ | +++ | +++ | +++ | + | +++ | +++ | + |
如表5中所述,不同的鹽緩衝液之產率都非常高。僅有含二價陽離子鹽緩衝劑(也就是鎂(MTE和MgSO
4TE))較低。在這兩種情況下,當RNA部分與2x鹽緩衝液混合時,會出現混濁。在該超過濾步驟之後,該混濁狀態仍保留在滲留物部分中。因此,並未進一步分析這些樣本。
dsRNA含量係使用窄縫印漬法。實驗1-7之起始材料係為配置於WFI中之RNA(1mg/ml)。
對於所有的處理條件而言,在鹽緩衝液中進行UF,然後使用TFF將緩衝液更換為WFI之後,可以觀察到dsRNA減少。由於使用了兩種不同的起始材料,因此必須將結果與正確起始部分(標示為「留存」)進行比較。對於所有轉換為QC之實驗,在以UF/TFF處理之樣本與原始RNA之間進行比較時,可以發現dsRNA明顯減少(圖5和6)。
此外,進一步的實驗顯示,dsRNA超過濾方法係與剪切速率以及跨膜壓力等參數無關(圖7和8)。
此外,我們評估了鹽濃度對於減少dsRNA之影響。如圖9中之數據所示,使用100mM NaCl已經可以得到非常好之結果,然而,增加鹽類的量可以進一步減少dsRNA的量,從而證實鹽類在本發明之內容中的關鍵角色。
最後,我們評估了過濾器孔徑與最大限度地減少dsRNA含量之相關性。從圖10中所示,使用標稱直徑介於30kD和300kD之間的過濾器,可以達到良好的dsRNA含量降低效果。
總之,除了含鎂的鹽類緩衝液以外,所有的其他實驗都呈現出類似的結果。
所有實驗的總產率都落在相同的範圍內。無論用於超過濾之鹽緩衝液為何,RNA的完整性都能保持,並且相較於其等之起始部分,在所有的樣本中都可以觀察到dsRNA顯著減少。
可以導出結論,含鎂之鹽緩衝液(MTE和MgSO
4TE)並不適用於UF步驟中,然而所有其他的緩衝液都顯著地減少了dsRNA。
參考資料
Voloudaki等人之Efficient Double-Stranded RNA Production Methods for Utilization in Plant Virus Control (2015).
Baiersdörfer等人之A Facile Method for the Removal of dsRNA Contaminant from In Vitro-Transcribed mRNA (2019)
無。
現在具體地參照隨附圖式,應該要強調的是所顯示的細節僅係作為具體實施例,並且僅係用於例示討論本發明的不同實施例之目的。其等係以提供被認為對於描述本發明之原理及概念態樣,最為有用且最易於理解而呈現。在這一方面,在此並未嘗試更詳細地呈現比起基本理解本發明所需之本發明結構細節。該揭露內容在結合隨附圖式下,將可以使得習於此技術者清楚明白本發明的幾種形式,可以如何實際付諸實施。
圖1:在RNA樣本中之相對dsRNA含量,其係在1M LiCl或STE+16%乙醇(v/v)中,使用50kD過濾器以來進行純化。
圖2:在RNA樣本中之相對dsRNA含量,其係在STE+16%乙醇(v/v)或STE+24%乙醇(v/v)中,使用50kD過濾器以來進行純化。
圖3:在樣本中之相對dsRNA含量,其係在STE+16% EtOH中,使用100kD過濾器之濾餅過濾,或是不經過100kD過濾器之滲濾作用而以切向流過濾(TFF)作用來進行純化。
圖4:在樣本中之相對dsRNA含量,其係在STE中使用100kD過濾器來進行純化。
圖5:以窄縫印漬法(slot blot)來顯示在適當的鹽緩衝液中,並使用TFF(5000 ng/樣本)將緩衝液更換為WFI下,經過超過濾後之RNA的相對dsRNA含量。dsRNA標準品:25ng/ml(A1, H6)、12.5ng/ml(B1, G6)、6.25ng/ml(C1, F6)、3.13ng/ml(D1, E6)、1.56ng/ml(E1, F6)、0.78ng/ml(F1, C6)、0.39ng/ml(G1, B6)、WFI(H1, A6)。在以加鹽緩衝液進行UF(超過濾作用),接著進行TFF之後的RNA樣本:STE(A2, A4)、Hold(B2, B4)、ATE(C2, C4)、KTE(E2, E4)、LTE(F2, F4)、Hold(G2, G4)、Na
3PO
4TE(H2, H4)、Na
2SO
4(A5, A7)。
圖6:在進行由使用不同鹽緩衝液之超過濾,然後將緩衝液更換為WFI所構成之純化過程前後,總RNA中之相對dsRNA含量。
圖7:在不同跨膜壓(TMP)條件下,經超過濾後之dsRNA含量。
圖8:在不同剪切速率條件下,經超過濾後之dsRNA含量。
圖9:在使用不同濃度之鹽類進行超過濾後之dsRNA含量。
圖10:在使用具有不同孔徑之過濾器超過濾後的dsRNA含量。
無。
Claims (14)
- 一種從dsRNA中分離ssRNA的方法,該方法包括以下步驟: a)提供一樣本,其包括至少一鹽類、ssRNA及dsRNA; b)在不存在纖維素的情況下,將步驟a)的該樣本施加至一過濾器,從而將該ssRNA與該dsRNA分離。
- 如請求項1的方法,其中該鹽類包含選自於包含下列列表之離子:一價陽離子、三價陽離子、一價陰離子、二價陰離子、三價陰離子或其等之組合。
- 如請求項1或2的方法,其中該鹽類係選自於包含下列之列表:鈉鹽、鉀鹽、鋰鹽或銨鹽,例如選自於NaCl、LiCl、NH 4Cl、KCl、Na 3PO 4或Na 2SO 4。
- 如請求項1至3中之任一項的方法,其中該樣本進一步包含至少一種醇類。
- 如請求項4的方法,其中該醇類係選自於包括乙醇、丙醇或異丙醇之列表。
- 如請求項1至5中之任一項的方法,其中該步驟b)係使用選自於切向流過濾、滲濾(diafiltration)、濾餅過濾(dead-end filtration)或其等之組合的方法來進行。
- 如請求項1至6中之任一項的方法,其中該樣本包含濃度大約介於5mM與2M之間的鹽類;較佳地為大約介於5mM至1M之間;更佳地為大約介於5mM與500mM之間。
- 如請求項1至7中之任一項的方法,其中該樣本包含濃度大約介於-10至30% (v/v)之間的醇類。
- 如請求項1至8中之任一項的方法,其中該過濾器係具有大約介於30kD至300kD之間的孔徑。
- 如請求項1至9中之任一項的方法,其中該樣本進一步包含Tris-HCl及EDTA。
- 如請求項10的方法,其中該樣本包含大約10mM的Tris-HCl,大約1mM EDTA,大約100mM 之該鹽類,並且具有大約為7.8之pH值。
- 如請求項1至11中之任一項的方法,其中該方法不包括以纖維素為基礎之層析步驟。
- 一種過濾步驟之用途,其係用於從一樣本中分離dsRNA與ssRNA。
- 一種ssRNA分子,其係自如請求項1至12中之任一項的方法所獲得。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP20181010 | 2020-06-19 | ||
EP20181010.8 | 2020-06-19 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
TW202214852A true TW202214852A (zh) | 2022-04-16 |
Family
ID=71111284
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
TW110122661A TW202214852A (zh) | 2020-06-19 | 2021-06-21 | Rna純化法 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20230174966A1 (zh) |
EP (1) | EP4168544A1 (zh) |
CN (1) | CN115715324A (zh) |
CA (1) | CA3186282A1 (zh) |
TW (1) | TW202214852A (zh) |
WO (1) | WO2021255297A1 (zh) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2022162027A2 (en) | 2021-01-27 | 2022-08-04 | Curevac Ag | Method of reducing the immunostimulatory properties of in vitro transcribed rna |
WO2024019762A1 (en) * | 2022-07-20 | 2024-01-25 | Agilent Technologies, Inc. | Methods and apparatus for duplex nucleotide purification |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
PL3144389T3 (pl) * | 2011-12-30 | 2018-10-31 | Cellscript, Llc | WYTWARZANIE I STOSOWANIE ZSYNTETYZOWANEGO IN VITRO ssRNA DO WPROWADZANIA DO SSACZYCH KOMÓREK W CELU INDUKCJI EFEKTU BIOLOGICZNEGO LUB BIOCHEMICZNEGO |
ES2900272T3 (es) | 2016-04-22 | 2022-03-16 | BioNTech SE | Métodos para proporcionar ARN monocatenario |
-
2021
- 2021-06-21 CN CN202180043552.9A patent/CN115715324A/zh active Pending
- 2021-06-21 TW TW110122661A patent/TW202214852A/zh unknown
- 2021-06-21 US US18/000,962 patent/US20230174966A1/en active Pending
- 2021-06-21 EP EP21733143.8A patent/EP4168544A1/en active Pending
- 2021-06-21 CA CA3186282A patent/CA3186282A1/en active Pending
- 2021-06-21 WO PCT/EP2021/066861 patent/WO2021255297A1/en unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN115715324A (zh) | 2023-02-24 |
CA3186282A1 (en) | 2021-12-23 |
EP4168544A1 (en) | 2023-04-26 |
WO2021255297A1 (en) | 2021-12-23 |
US20230174966A1 (en) | 2023-06-08 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US20210214388A1 (en) | Rna purification methods | |
US20220325273A1 (en) | Method for producing and purifying rna, comprising at least one step of tangential flow filtration | |
TW202214852A (zh) | Rna純化法 | |
JP2019048844A (ja) | 莢膜Streptococcus pneumoniae多糖の生産のための短縮された精製プロセス | |
EP3663401B1 (en) | Purification process for biological molecules such as plasmid dna using anionic exchange chromatography | |
AU2020275885A1 (en) | Methods for purification of messenger RNA | |
US6235892B1 (en) | Process for the purification of nucleic acids | |
Feng et al. | Messenger RNA chromatographic purification: advances and challenges | |
EP2622067B1 (de) | Verfahren zur abtrennung von viren aus einem kontaminanten enthaltenden flüssigen medium | |
US10457931B2 (en) | Purification of nucleic acid from a sample containing nucleic acid and endotoxin | |
PT1242442E (pt) | Processo para a purificação de adn de lasmídeo adaptável a outra escala | |
EP1633763A1 (en) | Process for the concentration and/or isolation of nucleic acid or nucleic acid-containing species | |
JP5101102B2 (ja) | 核酸を抽出するための方法 | |
Yuan et al. | Extracellular Vesicle Isolation by a Tangential-Flow Filtration-Based Large-Scale Purification Method | |
KR20170018834A (ko) | 고순도의 저급 내독소 탄수화물(hple) 조성물, 및 그것의 분리방법 | |
JP2023544167A (ja) | メッセンジャーrnaの精製のための方法 | |
CN103052399A (zh) | 用于减少病毒组合物中dna杂质的方法 | |
JP2005112828A (ja) | 核酸の分離方法 | |
JP2004290028A (ja) | 植物dna溶出試薬及び植物dna抽出キット | |
ITMI950123A1 (it) | Procedimento per la purificazione del dna genomico da materiale biologico e relativo kit |