ES2900272T3

ES2900272T3 - Métodos para proporcionar ARN monocatenario

Info

Publication number: ES2900272T3
Application number: ES17722695T
Authority: ES
Inventors: Markus Baiersdörfer; Katalin Kariko
Original assignee: Biontech SE
Current assignee: Biontech SE
Priority date: 2016-04-22
Filing date: 2017-04-19
Publication date: 2022-03-16
Anticipated expiration: 2037-04-19
Also published as: RU2018136601A3; JP7335313B2; CY1124845T1; CN109072232B; BR112018069417A2; MA44732A; EP4008782A1; MD3445850T2; KR20180135451A; LT3445850T; JP2022058394A; HRP20211745T1; KR20220041247A; JP7000343B2; AU2017251983B2; IL262304A; EP3445850A1; MA44732B1; CN109072232A; PL3445850T3

Abstract

Un método para proporcionar ARN monocatenario (ARNmc), que comprende: (i) producir una preparación de ARN que comprende ARNmc mediante transcripción in vitro; (ii) poner en contacto la preparación de ARN con un material de celulosa en condiciones que permitan la unión de ARN bicatenario (ARNbc) al material de celulosa y no permitan la unión de ARNmc al material de celulosa; y (iii) separar el ARNmc del material de celulosa en condiciones que permitan la unión de ARNbc al material de celulosa y no permitan la unión de ARNmc al material de celulosa, en el que en la etapa (ii) la preparación de ARN se proporciona como un líquido que comprende ARNmc y un primer tampón y/o el material de celulosa se proporciona como una suspensión en un primer tampón, en el que el primer tampón comprende agua, etanol y una sal en una concentración que permita la unión de ARNbc al material de celulosa y que no permita la unión de ARNmc al material de celulosa; y la concentración de etanol en el primer tampón es del 14 al 20% (v/v) y la concentración de la sal en el primer tampón es de 15 a 70 mM.

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos para proporcionar ARN monocatenario

Campo técnico de la invención

La presente invención se refiere a métodos para proporcionar ARN monocatenario (ARNmc).

Antecedentes de la invención

Durante la síntesis del ARNm por transcripción in vitro (TIV) usando ARN polimerasa T7 (véase Yin et al. Cell 116 (2004), 393-404) se producen cantidades significativas de productos aberrantes, incluido ARN bicatenario (ARNbc) debido a la actividad no convencional de la enzima (véase Triana-Alonso et al., JSC 270 (1995), 6298-6307; Cazenave et al., PNAS USA 91 (1994), 6972-6976; Gong et al., JBC 281 (2006), 23533-23544). Dado que el ARNbc induce citocinas inflamatorias y activa las enzimas efectoras (véase Kariko et al., Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 10 (2007), 523-532) que conduce a la inhibición de la síntesis de proteínas, es importante eliminar el ARNbc del ARNm de la TIV que se utilizará como compuesto terapéutico.

Hasta la fecha se han descrito dos métodos diferentes para la eliminación del ARNbc del ARNm de TIV. Un método es la purificación del ARNm de TIV mediante HPLC de fase reversa de pares iónicos utilizando una matriz de poliestireno-divinilbenceno (PS-DVB) C18 no porosa (véase Weissman et al., Methods Mol. Biol. 969 (2013), 43-54) o porosa (véase el documento US 8.383.340 B2). Sin embargo, los métodos que utilizan HPLC para purificar ARN tienen varias desventajas, tales como equipos complejos; uso de disolventes tóxicos como acetonitrilo; larga duración del proceso de purificación estándar; escalamiento difícil; costes; y degradación del ARN largo debido al cizallamiento.

Alternativamente, se ha establecido un método de base enzimática utilizando RNasa III de E. coli que hidroliza específicamente el ARNbc pero no el ARNmc, eliminando así los contaminantes del ARNbc de las preparaciones de ARNm TIV (véase el documento WO 2013/102203 A1). Sin embargo, es posible que la RNasa III induzca reacciones no deseadas (tales como una reacción inmunitaria no deseada) en el paciente que se va a tratar con el ARN. Por tanto, antes de administrar el ARN al paciente, es necesario eliminar la enzima aumentando así la complejidad y el coste del método. Además, el uso de RNasa III a menudo conduce a una degradación parcial del ARNmc, especialmente del ARNmc largo, durante la incubación. Es probable que esto se deba a la hidrólisis catalizada por RNasa Ill de estructuras secundarias bicatenarias contenidas en el ARNmc.

En 1966 se describió una interacción no iónica entre el polvo de celulosa CF-11 sin modificar y el ARN en presencia de EtOH, y se utilizó para separar ARNs ("ARN soluble") del ARN ribosómico (ARNr) mediante cromatografía (Barber, R. Biochim Biophys. Acta 114 (1966), 422 - 424). Mientras que el ARNm se eluía con EtOH al 35% de la columna, el ARNr se podía eluir selectivamente reduciendo la concentración de EtOH del tampón de cromatografía al 15%.

Franklin et al. (PNAS USA 55 (1966), 1504-1511) utilizó el mismo principio de separación para aislar el ARN intermedio replicativo (RI) del bacteriófago R17 del ARN del ARN total de E. coli. Aquí, el ARN RI unido a celulosa, identificado como ARNbc resistente a la RNasa A, se eluyó de manera eficiente solo en tampón libre de EtOH. Esta técnica se adaptó para aislar ARNbc de Cryphonectria parasítica, un hongo parásito del castaño (Day et al., Phytopathology 67 (1977), 1393).

Morris y Dodds (Phytopathology 69 (1977), 854-858) simplificaron los procedimientos basados en celulosa previamente descritos al eliminar selectivamente el ARNbc viral de los aislados del ARN fúngico y vegetal en presencia de EtOH al 15% (v/v). Este procedimiento se ha utilizado durante décadas para aislar ARNbc y ha sufrido solo modificaciones menores durante los años, por ejemplo, utilizando minicolumnas comerciales empaquetadas con celulosa CF-11, para acelerar el proceso y aumentar el rendimiento de la muestra (véase Castillo et al. , Virol. J. 8 (2011), 38; Okada et al., Arch. Virol. 159 (2014), 807-809).

Pe'ery et al. (Methods 11 (1997), 371-381) describen la síntesis y purificación del ARNmc para su uso en experimentos. con PKR y en sistemas de traducción sin células. Karikó et al. (Nucl. Acids Res. 39 (2011), e142) informan que los contaminantes del ARN transcrito in vitro son una fuente de activación inmune innata y su eliminación aumenta la traducción del ARN y elimina el interferón de tipo I y la secreción de citocinas inflamatorias. Urayama et al. (Microbes Environ. 30 (2015), 199-203) describen un método de fraccionamiento y recuperación de la composición y estructura del ácido nucleico iónico basado en genomas virales utilizando cromatografía en columna en tándem.

Es un objeto de la presente invención proporcionar medios que aborden uno o más de los problemas descritos anteriormente. En particular, es un objeto de la presente invención proporcionar un método alternativo para proporcionar ARNmc que sea rentable, sencillo y requiera menos tiempo que los métodos basados en HPLC; que evita sustancias tóxicas; que se puede ampliar fácilmente; que proporciona ARNmc con un rendimiento y una pureza comparable al ARNmc obtenido mediante HPLC; que no afecta a los ARN largos; y/o que no degrada el ARN. Dichos objetivos subyacentes a la presente invención se resuelven mediante el contenido que se describe o se define en cualquier lugar del presente documento, por ejemplo, mediante el contenido de las reivindicaciones adjuntas.

Sumario de la invención

En un primer aspecto, la presente invención proporciona un método para proporcionar ARNmc, que comprende (i) proporcionar una preparación de ARN que comprende ARNmc producido por transcripción in vitro: (ii) poner en contacto la preparación de ARN con un material de celulosa en condiciones que permitan la unión de ARN de cadena doble (ARNbc) al material de celulosa y no permitir la unión de ARNmc al material de celulosa; y (iii) separar el ARNmc del material de celulosa en condiciones que permitan la unión de ARNbc al material de celulosa y no permitir la unión de ARNmc al material de celulosa, en el que en la etapa (ii) la preparación de ARN se proporciona como un líquido que comprende ARNmc y un primer tampón y/o el material de celulosa se proporciona como una suspensión en un primer tampón, en el que el primer tampón comprende agua, etanol y una sal en una concentración que permita la unión de ARNbc al material de celulosa y que no permita la unión de ARNmc al material de celulosa; y la concentración de etanol en el primer tampón es del 14 al 20% (v/v) y la concentración de la sal en el primer tampón es de 15 a 70 mM.

Por lo tanto, en el primer aspecto, las etapas (ii) y (iii) se llevan a cabo en condiciones que permitan la unión de ARNbc al material de celulosa y no permitan la unión de ARNmc al material de celulosa (este primer aspecto algunas veces se denomina en el presente documento procedimiento de purificación "negativa" porque permita la unión selectiva del ARNbc al material de celulosa, mientras que el ARNmc permanece sin unirse).

En una realización del procedimiento de purificación negativa, la etapa (ii) comprende mezclar la preparación de ARN que comprende ARNmc con el material de celulosa mediante batido y/o agitación, preferiblemente durante al menos 5 min, más preferiblemente durante al menos 10 min.

En una realización del procedimiento de purificación negativa, en la etapa (ii) la sal comprendida en el primer tampón es cloruro de sodio. En una realización, la concentración de etanol en el primer tampón es del 14 al 16% (v/v). En una realización, la concentración de la sal en el primer tampón es de 20 a 60 mM. En una realización, el primer tampón comprende además una sustancia de tamponamiento, preferiblemente tris(hidroximetil)aminometano (TRIS), y/o un agente quelante, preferiblemente EDTA.

En una realización del procedimiento de purificación negativa, en la etapa (ii) y/o (iii) la mezcla de la preparación de ARN, el material de celulosa y el primer tampón se proporciona en un tubo y la etapa (iii) comprende (1) aplicar gravedad o fuerza centrífuga en el tubo de manera que se separen las fases líquida y sólida; y (2) recoger el sobrenadante que comprende ARNmc o eliminar el material de celulosa. En una realización alternativa, en la etapa (ii) y/o (iii) la mezcla de la preparación de ARN, el material de celulosa y el primer tampón se proporciona en una columna de centrifugación o dispositivo filtrante y la etapa (iii) comprende (1') aplicar gravedad, fuerza centrífuga, presión o vacío a la columna de centrifugación o al dispositivo filtrante, de modo que las fases líquida y sólida se separan; y (2') recoger el flujo de salida que comprende ARNmc.

En una realización del procedimiento de purificación negativa, las etapas (ii) y (iii) se repiten una o dos o más veces, en las que se usa la preparación de ARNmc obtenida después de la etapa (iii) de un ciclo de las etapas (ii) y (iii) como preparación de ARN en la etapa (ii) del siguiente ciclo y en la etapa (ii) de cada ciclo de las etapas (ii) y (iii) se usa material de celulosa fresco.

En un segundo aspecto, la presente invención proporciona un método para proporcionar ARNmc, que comprende: (i) producir una preparación de ARN que comprende ARNmc mediante transcripción in vitro; (ii) poner en contacto la preparación de ARN con un material de celulosa en condiciones que permitan la unión de ARNbc y ARNmc al material de celulosa; y (iii) separar el ARNmc del material de celulosa en condiciones que permitan la unión de ARNbc al material de celulosa y no permitir la unión de ARNmc al material de celulosa, en el que el paso (iii) comprende: (1) mezclar el material de celulosa al que ARNbc y ARNmc se unen con un primer tampón mediante batido y/o agitación, en el que el primer tampón comprende agua, etanol y una sal en una concentración que permita la unión de ARNbc al material de celulosa y no permita la unión de ARNmc al material de celulosa; y (2) separar la fase líquida que comprende ARNmc del material de celulosa; y la concentración de etanol en el primer tampón es del 14 al 20% (v/v) y la concentración de la sal en el primer tampón es de 15 a 70 mM.

Por lo tanto, en el segundo aspecto, la etapa (ii) se lleva a cabo en condiciones que permitan la unión de ARNbc y ARNmc al material de celulosa; y la etapa (iii) se lleva a cabo en condiciones que permitan la unión de ARNbc al material de celulosa y no permitan la unión de ARNmc al material de celulosa (este segundo aspecto a veces se denomina en el presente documento procedimiento de purificación "positiva", porque el primer ARNbc y ARNmc se unen al material de celulosa y luego el ARNmc se libera selectivamente del material de celulosa, mientras que el ARNbc permanece unido).

En una realización del procedimiento de purificación positiva, la etapa (ii) comprende (1) mezclar la preparación de ARN que comprende ARNmc con el material de celulosa mediante batido y/o agitación, preferiblemente durante al menos 5 min, más preferiblemente durante al menos 10 min; y (2) separar el material de celulosa al que se unen ARNbc y ARNmc del resto.

En una realización del procedimiento de purificación positiva, en la etapa (ii) la preparación de ARN se proporciona como un líquido que comprende ARNmc y un segundo tampón y/o el material de celulosa se proporciona como una suspensión en un segundo tampón, en el que el segundo tampón comprende agua, etanol y una sal, preferiblemente cloruro de sodio, en una concentración que permita la unión de ARNbc y ARNmc al material de celulosa. En una realización, la concentración de etanol en el segundo tampón es al menos del 35% (v/v), preferiblemente del 38 a 42% (v/v). En una realización, la concentración de la sal en el segundo tampón es de 15 a 70 mM, preferiblemente de 20 a 60 mM. En una realización, el segundo tampón comprende además una sustancia de tamponamiento, preferiblemente tris(hidroximetil)aminometano (TRIS), y/o un agente quelante, preferiblemente EDTA.

En una realización del procedimiento de purificación positiva, en la etapa (ii)(1) y/o (ii)(2) la mezcla de la preparación de ARN y el material de celulosa obtenido en la etapa (ii)(1) se proporciona en un tubo y la etapa (ii)(2) comprende (2a) aplicar gravedad o fuerza centrífuga al tubo de manera que se separen las fases líquida y sólida; y (2b) eliminar el sobrenadante o recoger el material de celulosa al que se unen ARNbc y ARNmc. En una realización alternativa, en la etapa (ii)(1) y/o (ii)(2) la mezcla de la preparación de ARN y el material de celulosa obtenido en la etapa (ii)(1) se proporciona en una columna de centrifugación o dispositivo filtrante y la etapa (ii)(2) comprende (2a') aplicar gravedad, fuerza centrífuga, presión o vacío a la columna de centrifugación o al dispositivo filtrante de modo que las fases líquida y sólida se separen; y (2b') descartar el flujo de salida.

En una realización del procedimiento de purificación positiva, la etapa (ii) comprende además (3) añadir una alícuota del segundo tampón al material de celulosa al que se unen ARNbc y ARNmc; (4) incubar la mezcla resultante mediante batido y/o agitación, preferiblemente durante al menos 5 min, más preferiblemente durante al menos 10 min; y (5) separar el material de celulosa al que se unen ARNbc y ARNmc de la fase líquida; y opcionalmente (6) repetir las etapas (3) a (5) una o dos o más veces.

En una realización del procedimiento de purificación positiva, en la etapa (iii)(1) el material de celulosa al que el ARNbc y el ARNmc se une se mezcla con el primer tampón mediante batido y/o agitación durante al menos 5 min, preferiblemente durante al menos 10 minutos. En una realización, la sal comprendida en el primer tampón es cloruro de sodio. En una forma de realización, la concentración de etanol en el primer tampón es del 14 al 16% (v/v). En una realización, la concentración de la sal en el primer tampón es 20 hasta 60 mM. En una realización, el primer tampón comprende además una sustancia de tamponamiento, preferiblemente tris(hidroximetil)aminometano (TRIS) y/o un agente quelante, preferiblemente EDTA.

En una realización del procedimiento de purificación positiva, en la etapa (iii) la mezcla del material de celulosa y el primer tampón se proporciona en un tubo y la etapa (iii)(2) comprende (2a) aplicar gravedad o fuerza centrífuga al tubo de tal manera que se separan las fases líquida y sólida; y (2b) recoger el sobrenadante que comprende ARNmc o eliminar el material de celulosa. En una realización alternativa, en la etapa (iii) la mezcla del material de celulosa y el primer tampón se proporciona en una columna de centrifugación o dispositivo filtrante y la etapa (iii) (2) comprende (2a') aplicar gravedad, fuerza centrífuga, presión, o vacío a la columna de centrifugación o al dispositivo filtrante; y (2b') recoger el flujo de salida que comprende ARNmc.

En una realización del procedimiento de purificación positiva, las etapas (ii) y (iii) se repiten una o dos o más veces, en las que se usa la preparación de ARNmc obtenida después de la etapa (iii) de un ciclo de las etapas (ii) y (iii) como preparación de ARN en la etapa (ii) del siguiente ciclo y en la etapa (ii) de cada ciclo de las etapas (ii) y (iii) se usa material de celulosa fresco.

En una realización del procedimiento de purificación positiva, en la etapa (ii) el material de celulosa se proporciona en una columna, la etapa (ii) comprende cargar la preparación de ARN en la columna en condiciones que permitan la unión de ARNbc y ARNmc al material de celulosa, y la etapa (iii) comprende eluir el ARNmc del material de celulosa en condiciones que permitan la unión de ARNbc al material de celulosa y no permitan la unión de ARNmc al material de celulosa. En una realización, en la etapa (ii) la preparación de ARN se proporciona y se carga en la columna como un líquido que comprende ARNmc y un segundo tampón, en el que el segundo tampón comprende agua, etanol y una sal, preferiblemente cloruro de sodio, en una concentración que permita unión de ARNbc y ARNmc al material de celulosa. En una realización, la concentración de etanol en el segundo tampón es al menos del 35% (v/v), preferiblemente del 38 a 42% (v/v). En una realización, la concentración de la sal en el segundo tampón es de 15 a 70 mM, preferiblemente de 20 a 60 mM. En una realización, el segundo tampón comprende además una sustancia de tamponamiento, preferiblemente tris(hidroximetil)aminometano (TRIS), y/o un agente quelante, preferiblemente EDTA. En una realización, la etapa (iii) se lleva a cabo utilizando un primer tampón como eluyente, en el que preferiblemente la sal comprendida en el primer tampón es cloruro de sodio. En una realización, la concentración de etanol en el primer tampón es del 14 al 16% (v/v). En una realización, la concentración de la sal en el primer tampón es de 20 a 60 mM. En una realización, el primer tampón comprende además una sustancia de tamponamiento, preferiblemente tris(hidroximetil)aminometano (TRIS), y/o un agente quelante, preferiblemente EDTA.

En una realización del primer y el segundo aspectos, la preparación de ARN se produce usando una ARN polimerasa seleccionada del grupo que consiste en ARN polimerasas T3, T7 y SP6.

En una realización del primer y segundo aspectos, antes de la etapa (ii) la preparación de ARN se somete a al menos un tratamiento de purificación previa. En una realización, al menos un tratamiento de purificación previa comprende uno o más de los siguientes: precipitación de ácidos nucleicos, preferiblemente usando cloruro de litio; unión de ácidos nucleicos a perlas magnéticas; ultrafiltración; y degradación del ADN, preferiblemente usando nucleasa específica de dúplex (DSN).

En una realización del primer y segundo aspectos, el ARNmc es ARNm o un ARN inhibidor (tal como un ARN antisentido, ARNip o miARN).

En una realización del primer aspecto, el ARNmc tiene una longitud de al menos 2.700 nt, preferiblemente al menos 2.800 nt, al menos 2.900 nt, al menos 3.000 nt, al menos 3.100 nt, al menos 3.200 nt, al menos 3.300 nt, al menos 3.400 nt, como al menos 3.500 nt, al menos 3.600 nt, al menos 3.700 nt, al menos 3.800 nt, al menos 3.900 nt, al menos 4.000 nt, al menos 4.100 nt, al menos 4.200 nt, al menos 4.300 nt, al menos 4.400 nt, o al menos 4.500 nt.

En una realización del primer y segundo aspectos, el material de celulosa comprende fibras de celulosa, preferiblemente fibras de celulosa de un grado adecuado para su uso como reactivo de cromatografía de partición. En una realización, antes de ponerse en contacto con la preparación de ARN en la etapa (ii), el material de celulosa se proporciona como un material de celulosa lavado. En una realización, el lavado del material de celulosa incluye (I) mezclar el material de celulosa con una solución de lavado mediante batido y/o agitación, preferiblemente durante al menos 5 min, más preferiblemente durante al menos 10 min; y (II) retirar el líquido o recoger el material de celulosa; y opcionalmente (III) repetir las etapas (I) y (II) una o dos o más veces. En una realización, la solución de lavado tiene la composición de (A) el primer tampón como se define más arriba o más abajo si la etapa (ii) se realiza en condiciones que permitan la unión de ARNbc al material de celulosa lavado y no permitan la unión de ARNmc al material de celulosa lavado (es decir, en las realizaciones del procedimiento de purificación "negativa"), o (B) el segundo tampón como se define más arriba o más abajo si la etapa (ii) se realiza en condiciones que permitan la unión de ARNbc y ARNmc al material de celulosa lavado (es decir, en las realizaciones del procedimiento de purificación "positiva").

También se describe en el presente documento ARNmc que se puede obtener mediante cualquier método del primer o segundo aspectos. El ARNmc está sustancialmente libre del ARNbc y/o sustancialmente libre de ADN, preferiblemente sustancialmente libre del ARNbc y ADN. Este ARNmc puede usarse en terapia.

Otros aspectos, así como ventajas y características novedosas de la presente invención resultarán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada, opcionalmente junto con los dibujos adjuntos.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1: La extracción de péptidos del ARNbc a partir del ARN TIV por celulosa. Después de la incubación con un material de celulosa en presencia de tampón STE 1x que contenía EtOH al 16% (v/v), se analizaron las fracciones unidas y no unidas de 50 |jg del ARN TIV modificado con m 1^ de 2.500 nt de longitud para detectar contaminantes del ARNbc mediante transferencia de puntos utilizando anticuerpo J2 específico del ARNbc. Para la comparación, se analizó en paralelo el ARN no purificado (entrada). Se cargaron 180 ng, 900 ng y 1.800 ng del ARN de los ARN correspondientes para el análisis de transferencia de puntos. Para controlar la integridad del ARN, se cargaron 80 ng de los ARN en un gel de agarosa al 1,4% (p/v) y se separaron por electroforesis.

Figura 2: El impacto de diferentes concentraciones de EtOH en la eficiencia de la eliminación del ARNbc del ARN TIV por celulosa. Después de la incubación con un material de celulosa en presencia de tampón STE 1x que contiene EtOH al 16% (v/v), 18% (v/v) o 20% (v/v), las fracciones unidas y no unidas de 50 jg del ARN TIV modificado con ^ de 1.500 nt de largo y con protección de D2 se analizaron para detectar contaminantes del ARNbc e híbridos del ARN/ADN mediante transferencia de puntos utilizando anticuerpo J2 específico del ARNbc o anticuerpo S 9.6 específico de híbrido del ARN-ADN, respectivamente. Para la comparación, se analizó en paralelo el ARN no purificado (entrada). Se cargaron 40 ng, 200 ng y 1.000 ng del ARN de los a Rn correspondientes en dos membranas separadas, cada una de las cuales se hibridó con los anticuerpos indicados en el análisis de transferencia de puntos.

Figura 3: Comparación de la purificación con celulosa del ARN TIV con el tratamiento con RNasa III y la purificación por HPLC. Se purificaron 100 |jg del ARN TIV modificado con m 1^ de 2.500 nt de longitud 1x, 2x o 3x con celulosa usando columnas de centrifugación de microcentrífuga y tampón STE 1x que contenía EtOH al 16% (v/v). Se analizaron 200 ng, 1.000 ng y 3.000 ng del ARN purificado con celulosa en busca de contaminantes del ARNbc mediante transferencia de puntos utilizando un anticuerpo J2 específico del ARNbc. A modo de comparación, se cargaron las mismas cantidades del ARN sin purificar, así como ARN tratados con RNasa lII y purificados por HPLC en la membrana de transferencia de puntos. Las señales de hibridación se cuantificaron mediante densitometría y los valores se expresan como porcentaje del ARNbc eliminado del ARN no purificado. Para controlar la integridad del ARN, se cargaron 80 ng de los ARN en un gel de agarosa al 1,4% (p/v) y se separaron por electroforesis.

Figura 4: Comparación del rendimiento de diferentes tipos de celulosa en la eliminación del ARNbc del ARN TIV. Las fracciones unidas y no unidas de 100 jg del ARN TIV modificado con m 1^ de 1,500 nt de longitud después de 1 ciclo de purificación utilizando diferentes celulosas (Sigma, C6288; Macherey-Nagel, MN 100 y MN 2100), columnas de centrifugación de microcentrífugas y tampón STE 1x que contenía EtOH al 16% (v/v) se analizaron mediante transferencia de puntos. Se analizaron muestras de 80 ng, 400 ng y 2.000 ng del ARN para detectar contaminantes del ARNbc usando anticuerpo J2 específico del ARNbc. A modo de comparación, se cargó la misma cantidad del ARN sin purificar (ARN de entrada) en la membrana de transferencia de puntos. Las señales de hibridación se cuantificaron mediante densitometría y los valores se expresan como porcentaje del ARNbc eliminado del ARN no purificado. Para controlar la integridad del ARN, se cargaron 80 ng de los ARN en un gel de agarosa al 1,4% (p/v) y se separaron por electroforesis.

Figura 5: El método de purificación con celulosa es escalable. Se purificaron 5 mg del ARN TIV con caperuza de D1 de 1.900 nt de longitud 1 x o 2 veces con celulosa usando dispositivos de filtro impulsados por vacío y tampón STE 1 x que contenía EtOH al 16% (v/v). Se analizaron 40 ng, 200 ng y 1000 ng del ARN purificado con celulosa en busca de contaminantes del ARNbc mediante transferencia de puntos utilizando un anticuerpo J2 específico del ARNbc. A modo de comparación, se cargaron las mismas cantidades del ARN sin purificar (ARN de entrada) en la membrana de transferencia de puntos. Las señales de hibridación se cuantificaron mediante densitometría y los valores se expresan como porcentaje del ARNbc eliminado del ARN no purificado. Para controlar la integridad del ARN, se cargaron 80 ng de los ARN en un gel de agarosa al 1,4% (p/v) y se separaron por electroforesis. Se indican las tasas de recuperación del ARN para ambas muestras.

Figura 6: Purificación del ARN TIV con diferente longitud usando un procedimiento de purificación "positiva". Para 2 ciclos de purificación con celulosa se utilizaron 400 |jg del ARN TIV con caperuza de D1 de > 10.000 nt de longitud, ARN TIV con caperuza de D2 de 1.300 nt de longitud (A) y ARN TIV de 2.500 nt de longitud (sin proteger) (B). Ninguno de los ARN contenía modificaciones de nucleósidos. Durante el primer ciclo, los ARN se unieron completamente a la celulosa usando STE 1x que contenía EtOH al 40% (v/v) antes de la elución con tampón que contenía 16% (v/v) y se transfirieron a una segunda columna de microcentrífuga que contenía un material de celulosa (purificación "positiva"). Las cantidades indicadas de los ARN purificados se analizaron en busca de contaminantes del ARNbc mediante transferencia de puntos utilizando un anticuerpo J2 específico del ARNbc. A modo de comparación, se cargaron las mismas cantidades del ARN sin purificar en las membranas de transferencia de puntos. Para controlar la integridad del ARN, se cargaron 80 ng de los ARN en geles de agarosa al 1,4% (p/v) y se separaron por electroforesis.

Figura 7: Purificación del ARN TIV usando tampones con diferente fuerza iónica. Se purificaron por celulosa 250 |jg (A) o 160 jg (B) del ARN TIV modificado con m 1^ de 1.300 nt de longitud usando tampones STE 1x que contenían NaCl 25-150 mM (A) o NaCl 0-50 mM (B). Antes de la elución con los tampones correspondientes que contenían EtOH al 16% (v/v) seguido de elución con tampones de EtOH al 0% (v/v), el ARN se unió completamente a la celulosa en presencia de EtOH al 40% (v/v). Se analizaron 40 ng, 200 ng, 1.000 ng y 3.000 ng de los ARN eluidos en busca de contaminantes del ARNbc mediante transferencia de puntos utilizando anticuerpo J2 específico del ARNbc. Debido a la baja recuperación, sólo se pudieron cargar 40 ng, 200 ng y 1000 ng del ARN eluido con EtOH al 0% (v/v) para el análisis de transferencia de puntos en (B). A modo de comparación, se cargaron las mismas cantidades del ARN sin purificar (ARN de entrada) en las membranas de transferencia de puntos. Las señales de hibridación se cuantificaron mediante densitometría y los valores se expresan como porcentaje del ARNbc eliminado del ARN no purificado. Para controlar la integridad del ARN, se cargaron 80 ng de los ARN en geles de agarosa al 1,4% (p/v) y se separaron por electroforesis.

Figura 8: Purificación por celulosa del ARN TIV por FPLC. (A) Se muestra un cromatograma FPLC de 500 jg del ARN TIV modificado con m 1^ de 1.300 nt de longitud, en el que el ARN se cargó en una columna XK 16/20 empaquetada con 4 g de un material de celulosa. La unión se realizó con STE 1x que contenía 40% (v/v) de EtOH, los contaminantes ARNmc y ARNbc se eluyeron disminuyendo la concentración de EtOH del tampón de procesamiento al 16% (v/v) y 0% (v/v), respectivamente. Se recogieron las fracciones indicadas por un recuadro gris en el cromatograma (F1: eluato de EtOH al 16%, F2: eluato de EtOH al 0%). (B) Se analizaron 40 ng, 200 ng, 1.000 ng y 3.000 ng de los ARN recuperados de las fracciones F1 y F2 en busca de contaminantes del ARNbc mediante transferencia de puntos utilizando anticuerpo J2 específico del ARNbc. A modo de comparación, se cargaron las mismas cantidades del ARN sin purificar (ARN de entrada) en la membrana de transferencia de puntos. Las señales de hibridación se cuantificaron mediante densitometría y los valores se expresan como porcentaje del ARNbc eliminado del ARN no purificado. Para controlar la integridad del ARN, se cargaron 80 ng de los ARN en un gel de agarosa al 1,4% (p/v) y se separaron por electroforesis.

Figura 9: Purificación del ARN TIV usando diferentes concentraciones de EtOH para la elución del ARNmc. Se purificaron con celulosa 200 jg del ARN TIV con caperuza de D1 de 1.500 nt de longitud utilizando tampón STE 1x que contenía EtOH al 6%, 10%, 12%, 14%, 16, 18%, 20% o 24% (v/v) para eluir ARNmc. Antes de la elución, el ARN se unió completamente a la celulosa en presencia de EtOH al 40% (v/v). Se analizaron 200 ng, 1.000 ng y 3.000 ng de los ARNmc eluidos en busca de contaminantes del ARNbc mediante transferencia de puntos utilizando anticuerpo J2 específico del ARNbc (A). A modo de comparación, se cargaron las mismas cantidades del ARN sin purificar (a Rn de entrada) en la membrana de transferencia de puntos. Para controlar la integridad del ARN, se cargaron 80 ng de los ARN en un gel de agarosa al 1,4% (p/v) y se separaron por electroforesis. (B) Las señales de hibridación se cuantificaron por densitometría y los valores (expresados como porcentaje del ARNbc eliminado del ARN no purificado) se graficaron frente a las concentraciones de EtOH utilizadas para la elución (línea continua) y se compararon con las tasas del ARN recuperado de eluatos individuales (línea discontinua).

Figura 10: Determinación de la capacidad de unión de la celulosa al ARN. Se incubaron 0,1 g de celulosa (Sigma, C6288) con 25 |jg, 50 |jg, 100 |jg, 250 |jg, 500 g, 750 |jg, 1.000 |jg o 1.500 |jg del ARN TIV con caperuza de D1 de 1.500 nt de longitud en 500 jil de STE 1x que contenía EtOH al 40% (v/v) en una columna de microcentrífuga. Después de la separación del ARN no unido por centrifugación, el ARN unido a celulosa se eluyó por etapas, primero con STE 1x que contenía EtOH al 16% (v/v) y finalmente con H2O (EtOH al 0% (v/v)). Después de la precipitación, las cantidades del ARN recuperadas del flujo de salida (A, B; EtOH al 40% (v/v), línea continua), el eluato de EtOH al 16% (v/v) (A, B; línea discontinua) y el eluato de EtOH% al 0% (v/v) (A, B; línea de puntos) se determinaron por espectrofotometría y se representó frente a la cantidad total del ARN usado para la purificación. Los valores se presentan como tasa de recuperación en relación con la cantidad total del ARN usado (A) o como el rendimiento total del ARN recuperado (B). Se analizaron 200 ng, 1.000 ng y 3.000 ng del ARN recuperado de los eluatos al 16% (v/v) en busca de contaminantes del ARNbc mediante transferencia de puntos utilizando anticuerpo J2 específico del ARNbc (C). A modo de comparación, se cargaron las mismas cantidades del ARN sin purificar (ARN de entrada) en la membrana de transferencia de puntos. Para controlar la integridad del ARN, se cargaron 80 ng de estos ARN en un gel de agarosa al 1,4% (p/v) y se separaron por electroforesis. Las señales de hibridación se cuantificaron por densitometría y los valores (expresados como porcentaje del ARNbc eliminado del ARN no purificado) se representaron frente a la cantidad total del ARN utilizado para la purificación (D; línea continua) y se compararon con las tasas del ARN recuperado de eluatos de EtOH al 16% (v/v) individuales (D; línea discontinua).

Figura 11: Impacto de la purificación con celulosa del ARN TIV sobre su traducibilidad e inmunogenicidad. El ARN TIV con caperuza de D1 (200 jig) que codifica la eritropoyetina murina (EPO) se dejó sin purificar o se purificó mediante un procedimiento de 2 etapas usando 2 columnas de centrifugación llenas cada una con un material de celulosa: 1a columna: purificación positiva del ARN TIV (es decir, unión de ARNbc y ARNmc usando tampón STE 1x que contiene EtOH al 40% (v/v); elución del ARNmc usando tampón STE 1x que contiene EtOH al 16% (v/v)); 2a columna: purificación negativa del eluato de la 1a columna (es decir, el eluato que contiene ARNmc y obtenido de la 1a columna usando tampón STE 1x que contiene EtOH al 16%)). El flujo de salida obtenido de la segunda columna se precipitó con isopropanol/acetato de sodio y se redisolvió en H2O. Después de la formulación con TransIT (Mirus Bio), los ARN TIV se inyectaron intraperitonealmente en ratones (n = 4) a una dosis de 3 jig del ARN/animal. Se extrajo sangre a las 2, 6 y 24 h después de la inyección y se recolectaron muestras de plasma. A los ratones de control se les inyectó únicamente TransIT. Los niveles de interferón alfa murino (A) y EPO murino (B) se midieron utilizando ensayos ELISA específicos (ELISA específico de interferón alfa murino (eBioscience); kit de desarrollo de ELISA DuoSet específico de EPO murino (R&D)).

Descripción detallada de la presente invención

Aunque la presente invención se describe adicionalmente con más detalle a continuación, debe entenderse que esta invención no se limita a las metodologías, protocolos y reactivos particulares descritos en este documento, ya que estos pueden variar. También debe entenderse que la terminología utilizada en el presente documento tiene el propósito de describir únicamente realizaciones particulares, y no pretende limitar el alcance de la presente invención, que estará limitada únicamente por las reivindicaciones adjuntas. A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen los mismos significados que los entendidos comúnmente por un experto en la técnica.

A continuación, se describirán con más detalle los elementos de la presente invención. Estos elementos se enumeran con realizaciones específicas, sin embargo, debe entenderse que pueden combinarse de cualquier manera y en cualquier número para crear realizaciones adicionales. Los ejemplos y las realizaciones preferidas descritos de forma diversa no deben interpretarse como que limitan la presente invención únicamente a las realizaciones descritas explícitamente. Debe entenderse que esta descripción apoya y engloba realizaciones que combinan las realizaciones descritas explícitamente con cualquier número de los elementos descritos y/o preferidos. Además, cualquiera de las permutaciones y combinaciones de todos los elementos descritos en esta solicitud deben considerarse divulgadas por la descripción de la presente solicitud a menos que el contexto indique lo contrario. Por ejemplo, si en una realización preferida el ARNmc comprende una cola de poli(A) que consta de 120 nucleótidos y en otra realización preferida la molécula del ARNmc comprende un análogo de caperuza 5', entonces en una realización preferida, el ARNmc comprende la cola de poli(A) que consta de 120 nucleótidos y el análogo de caperuza 5'. Asimismo, si en una realización preferida la concentración de EtOH en el primer tampón es del 14 al 16% (v/v) y en otra realización preferida la concentración de un agente quelante en el primer tampón es de 15 a 40 mM, entonces en una realización preferida, el primer tampón comprende EtOH en una concentración de 14 a 16% (v/v) y el agente quelante en una concentración de 15 a 40 mM.

Preferiblemente, los términos usados en este documento se definen como se describe en "A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", H.G.W. Leuenberger, B. Nagel, y H. Kolbl, Eds., Helvetica Chimica Acta, CH-4010. Basilea, Suiza, (1995).

La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, métodos convencionales de química, bioquímica y técnicas de ADN recombinante que se explican en la bibliografía pertinente en dicho campo (véase, por ejemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2da Edición, J. Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989).

A lo largo de esta memoria descriptiva y las reivindicaciones que siguen, a menos que el contexto requiera lo contrario, se entenderá que la palabra "comprende" y variaciones tales como "que comprende" implican la inclusión de un elemento, número entero o etapa o grupo de elementos, números enteros o etapas, pero no la exclusión de ningún otro elemento, número entero o etapa o grupo de elementos, números enteros o etapas. El término "que consiste esencialmente en" significa que excluye otros elementos, números enteros o etapas de cualquier significado esencial. El término "que comprende" abarca el término "que consiste esencialmente en" el cual, a su vez, abarca el término "que consiste en". Por tanto, en cada aparición en la presente solicitud, el término "que comprende" puede reemplazarse por el término "que consiste esencialmente en" o "que consiste en". Asimismo, en cada aparición en la presente solicitud, el término "que consiste esencialmente en" puede reemplazarse por el término "que consiste en".

Los términos "un", "uno, una" y "el, la" y referencias similares utilizadas en el contexto de la descripción de la invención (especialmente en el contexto de las reivindicaciones) deben interpretarse para cubrir tanto el singular como el plural, a menos que se indique lo contrario en el presente documento o claramente sea contradicho por el contexto. La mención de intervalos de valores en el presente documento está destinada simplemente a servir como un método abreviado de hacer referencia individualmente a cada valor separado que se encuentre dentro del intervalo. A menos que se indique lo contrario en el presente documento, cada valor individual se incorpora a la memoria descriptiva como si se mencionara individualmente en el presente documento. Todos los métodos descritos en el presente documento se pueden realizar en cualquier orden adecuado a menos que se indique lo contrario en el presente documento o bien que el contexto lo contradiga claramente. El uso de todos y cada uno de los ejemplos, o ejemplo de expresión (por ejemplo, "tal como"), proporcionado en el presente documento está destinado simplemente a ilustrar mejor la invención y no supone una limitación en el alcance de la invención reivindicada de otro modo. Ninguna expresión en la memoria descriptiva debe interpretarse como que indica algún elemento esencial no reivindicado para la práctica de la invención.

Se citan varios documentos a lo largo del texto de esta memoria descriptiva. Nada en este documento debe interpretarse como una admisión de que la invención no tiene derecho a anteceder a dicha divulgación en virtud de la invención anterior.

La expresión "condiciones que permitan la unión de ARNbc al material de celulosa" como se usa en este documento significa condiciones que favorecen (por ejemplo, mejoran) la unión (preferiblemente la unión o adsorción no covalente) del ARNbc al material de celulosa, inhiben la liberación del ARNbc unido al material de celulosa del material de celulosa, y/o reducen la cantidad del ARNbc libre (es decir, ARNbc que no está unido al material de celulosa). Estas condiciones pueden ser tales que permitan o no la unión de ARN distintos del ARNbc (por ejemplo, ARNmc) al material de celulosa. Por tanto, en una realización, la expresión "condiciones que permitan la unión de ARNbc al material de celulosa" son "condiciones que permitan la unión de ARNbc al material de celulosa y no permitan la unión de ARNmc al material de celulosa". En esta realización, las condiciones (i) favorecen (por ejemplo, mejoran) la unión (preferiblemente la unión o adsorción no covalente) del ARNbc al material de celulosa, inhiben la liberación del ARNbc unido al material de celulosa del material de celulosa, y/o reducen la cantidad del ARNbc libre (es decir, la cantidad del ARNbc no unido al material de celulosa), y (ii) favorecer (por ejemplo, mejorar) el estado no unido del ARNmc (es decir, el estado del ARNmc no unido o adsorbido al material de celulosa), reducir la cantidad del ARNmc unido (preferiblemente, adsorbido o unido no covalentemente) al material de celulosa, y/o inhibir la unión (preferiblemente, unión o adsorción no covalente) del ARNmc al material de celulosa. En una realización alternativa, la expresión "condiciones que permitan la unión de ARNbc al material de celulosa" son "condiciones que permitan la unión de ARNbc y ARNmc al material de celulosa". En esta realización alternativa, las condiciones favorecen (por ejemplo, mejoran) la unión (preferiblemente la unión o adsorción no covalente) del ARNbc y ARNmc al material de celulosa, inhiben la liberación del ARNbc y ARNmc unidos al material de celulosa del material de celulosa y/o reducir la cantidad del ARNbc y ARNmc libres (es decir, la cantidad del ARNbc y ARNmc no unidos al material de celulosa).

Las condiciones anteriores que permitan o no la unión de ARNbc/ARNmc al material de celulosa pueden controlarse mediante la composición del medio (como la composición de un tampón) en el que se disuelve la preparación de ARN que comprende ARNbc/ARNmc o que es añadido al material de celulosa. A este respecto, "composición" significa el tipo y la cantidad de los componentes contenidos en el medio (por ejemplo, en el tampón).

Por lo tanto, en una realización, las "condiciones que permitan la unión de ARNbc al material de celulosa y no permitan la unión de ARNmc al material de celulosa" se pueden lograr mediante un primer medio (por ejemplo, un primer tampón) que comprende agua, etanol y una sal en una concentración que permita la unión de ARNbc al material de celulosa y que no permita la unión de ARNmc al material de celulosa. Por lo tanto, para cumplir estas condiciones, en la etapa (ii) la preparación de ARN se puede proporcionar como un líquido que comprende ARNmc y el primer medio (por ejemplo, el primer tampón); el material de celulosa se puede proporcionar como una suspensión en el primer medio (por ejemplo, el primer tampón) (por ejemplo, como un material de celulosa lavado, en el que el primer medio (por ejemplo, el primer tampón) se ha utilizado como solución de lavado); la preparación de ARN puede proporcionarse como un líquido que comprende ARNmc y el primer medio (por ejemplo, el primer tampón) y el material de celulosa puede proporcionarse como una suspensión en el primer medio (por ejemplo, el primer tampón); o la preparación de ARN se puede proporcionar como un líquido que comprende ARNmc y el primer medio (por ejemplo, el primer tampón) y el material de celulosa se puede proporcionar como material de celulosa lavado (en el que el primer medio (por ejemplo, el primer tampón) se ha utilizado como solución de lavado), ya sea en forma seca o como suspensión en el primer medio (por ejemplo, el primer tampón).

La expresión "en una concentración que permita la unión de ARNbc al material de celulosa y que no permita la unión de ARNmc al material de celulosa" significa que la concentración de los componentes (en particular agua, etanol y una sal) en el primer medio (por ejemplo, en el primer tampón) es suficiente para (i) favorecer (por ejemplo, mejorar) la unión (preferiblemente la unión o adsorción no covalente) del ARNbc al material de celulosa, inhibir la liberación del ARNbc unido al material de celulosa del material de celulosa en el primer medio (por ejemplo, en el primer tampón) y/o reducir la cantidad del ARNbc libre (es decir, la cantidad del ARNbc no unido al material de celulosa) en el primer medio (por ejemplo, en el primer tampón), y (ii) favorecer (por ejemplo, mejorar) el estado no unido del ARNmc (es decir, el estado del ARNmc no unido o adsorbido al material de celulosa), reducir la cantidad del ARNmc unido (preferiblemente, unido o adsorbido no covalentemente) al material de celulosa, y/o inhibir la unión (preferiblemente, unión o adsorción no covalente) del ARNmc al material de celulosa.

Además, en una realización, las "condiciones que permitan la unión de ARNbc y ARNmc al material de celulosa" se pueden lograr mediante un segundo medio (por ejemplo, un segundo tampón) que comprende agua, etanol y una sal en una concentración que permita la unión de ARNbc y ARNmc al material de celulosa. Por lo tanto, para cumplir estas condiciones, en la etapa (ii) la preparación de ARN puede proporcionarse como un líquido que comprende ARNmc y el segundo medio (por ejemplo, el segundo tampón); el material de celulosa se puede proporcionar como una suspensión en el segundo medio (por ejemplo, el segundo tampón) (por ejemplo, como un material de celulosa lavado, en el que el segundo medio (por ejemplo, el segundo tampón) se ha utilizado como solución de lavado); la preparación de ARN se puede proporcionar como un líquido que comprende ARNmc y el segundo medio (por ejemplo, el segundo tampón) y el material de celulosa se puede proporcionar como una suspensión en el segundo medio (por ejemplo, el segundo tampón); o la preparación de ARN se puede proporcionar como un líquido que comprende ARNmc y el segundo medio (por ejemplo, el segundo tampón) y el material de celulosa se puede proporcionar como material de celulosa lavado (en el que el segundo medio (por ejemplo, el segundo tampón) se ha utilizado como solución de lavado), ya sea en forma seca o como suspensión en el segundo medio (por ejemplo, el segundo tampón).

La expresión "en una concentración que permita la unión de ARNbc y ARNmc al material de celulosa" significa que la concentración de los componentes (en particular agua, etanol y una sal) en el segundo medio (por ejemplo, en el segundo tampón) es suficiente para favorecer (por ejemplo, mejorar) la unión (preferiblemente la unión o adsorción no covalente) del ARNbc y ARNmc al material de celulosa, inhibir la liberación del ARNbc y ARNmc unidos al material de celulosa desde el material de celulosa al segundo medio (por ejemplo, en el segundo tampón) y/o reducir la cantidad del ARNbc y ARNmc libres (es decir, la cantidad del ARNbc y ARNmc no unidos al material de celulosa) en el segundo medio (por ejemplo, en el segundo tampón).

Los presentes inventores han descubierto sorprendentemente que el ARNbc, pero no el ARNmc, se une selectivamente a un material de celulosa en presencia de etanol en una concentración del 14 al 20% (v/v). Por lo tanto, en una realización, las "condiciones que permitan la unión de ARNbc al material de celulosa y no permitan la unión de ARNmc al material de celulosa" se pueden lograr mediante el primer medio (por ejemplo, el primer tampón) como se especificó anteriormente que contiene etanol en una concentración del 14 al 20% (v/v), preferiblemente del 14 al 19% (v/v), más preferiblemente del 14 al 18% (v/v), tal como del 14 al 17% (v/v), 14 al 16% (v/v), del 15 al 19% (v/v), del 15 al 18% (v/v), del 15 al 17% (v/v), del 16 al 19% (v/v), o 16 a 18% (v/v). En una realización, el primer medio (por ejemplo, el primer tampón) comprende, además de etanol en los intervalos descritos anteriormente, la sal en una concentración de 15 a 70 mM, preferiblemente de 20 a 60 mM tal como de 25 a 50 mM o 30 hasta 50 mM. La sal en el primer medio (por ejemplo, el primer tampón) es preferiblemente cloruro de sodio. Sin embargo, basándose en la información y los datos proporcionados en la presente solicitud, el experto en la materia puede determinar fácilmente otras sales y sus concentraciones que sean adecuadas para el primer medio (por ejemplo, el primer tampón) que se utilizará en los métodos de la presente invención. Otros componentes opcionales del primer medio (por ejemplo, el primer tampón) comprenden una sustancia tampón (preferiblemente TRIS o HEPES, más preferiblemente TRIS) y/o un agente quelante (preferiblemente EDTA o ácido nitrilotriacético, más preferiblemente EDTA). En una realización, la concentración de la sustancia tampón en el primer medio (por ejemplo, el primer tampón) es de 5 a 40 mM, preferiblemente de 6 a 30 mM, tal como de 8 a 20 mM o de 10 a 15 mM. En una realización, el pH del primer medio (por ejemplo, el primer tampón) es de 6,5 a 8,0, preferiblemente de 6,7 a 7,8, tal como de 6,8 a 7,2 (por ejemplo, cuando TRIS es la sustancia de tamponamiento) o de 7,3 a 7,7 (por ejemplo, cuando HEPES es la sustancia de tamponamiento). En una realización, la concentración del agente quelante en el primer medio (por ejemplo, el primer tampón) es de 10 a 50 mM, preferiblemente de 15 a 40 mM, tal como de 20 a 30 mM.

En una realización, el primer medio (por ejemplo, el primer tampón) comprende agua, etanol, TRIS y EDTA (tal como agua, etanol, la sal (preferiblemente cloruro de sodio), TRIS y EDTA), preferiblemente en las concentraciones especificadas anteriormente para el primer medio (por ejemplo, el primer tampón). Sin embargo, basándose en la información y los datos proporcionados en la presente solicitud, el experto en la materia puede determinar fácilmente sustancias de tamponamiento distintas de TRIS y/o agentes quelantes distintos de EDTA y/o sales distintas de cloruro de sodio, así como sus concentraciones que son adecuadas para el primer medio (por ejemplo, el primer tampón) que se utilizará en los métodos de la presente invención. Por ejemplo, en una realización, el primer medio (por ejemplo, el primer tampón) comprende, además de etanol en los intervalos descritos anteriormente (es decir, 1 a 20% (v/v), etc.), TRIS en una cantidad de 5 a 40 mM y la sal (preferiblemente cloruro de sodio) en una cantidad de 15 a 70 mM. En otra realización, el primer medio (por ejemplo, el primer tampón) comprende, además de etanol en los intervalos descritos anteriormente (es decir, 14 a 20% (v/v), etc.), HEPES en una cantidad de 5 a 40 mM y la sal (preferiblemente cloruro de sodio) en una cantidad de 100 a 150 mM (por ejemplo, 110 a 140 mM o 120 a 130 mM).

En una realización, las "condiciones que permitan la unión de ARNbc y ARNmc al material de celulosa" pueden lograrse mediante el segundo medio (por ejemplo, el segundo tampón) como se especificó anteriormente, que contiene etanol en una concentración de al menos 35% (v/v), preferiblemente al menos 36% (v/v), al menos 37% (v/v), al menos 38% (v/v), al menos 39% (v/v), al menos 40% (v/v), tal como 35 a 45% (v/v), 36 a 45% (v/v), 37 a 45% (v/v), 38 a 45% (v/v), 38 a 42% (v/v), o 39 a 41% (v/v). En una realización, el segundo medio (por ejemplo, el segundo tampón) comprende, además de etanol en los intervalos descritos anteriormente (es decir, al menos 35% (v/v), al menos 36% (v/v), al menos 37% (v/v), al menos 38% (v/v), etc.), la sal en una concentración de 15 a 70 mM, preferiblemente de 20 a 60 mM tal como 25 a 50 mM o 30 a 50 mM. La sal en el segundo medio (por ejemplo, el segundo tampón) es preferiblemente cloruro de sodio. Sin embargo, basándose en la información y los datos proporcionados en la presente solicitud, el experto en la materia puede determinar fácilmente otras sales y sus concentraciones que sean adecuadas para el segundo medio (por ejemplo, el segundo tampón) que se utilizará en los métodos de la presente invención. Otros componentes opcionales del segundo medio (por ejemplo, el segundo tampón) comprenden una sustancia tampón (preferiblemente TRIS o HEPES, más preferiblemente TRIS) y/o un agente quelante (preferiblemente EDTA o ácido nitrilotriacético, más preferiblemente EDTA). En una realización, la concentración de la sustancia tampón en el segundo medio (por ejemplo, el segundo tampón) es de 5 a 40 mM, preferiblemente de 6 a 30 mM, tal como de 8 a 20 mM o de 10 a 15 mM. En una realización, el pH del segundo medio (por ejemplo, el segundo tampón) es de 6,5 a 8,0 preferiblemente de 6,7 a 7,8, tal como 6,8 a 7,2 (por ejemplo, cuando TRIS es la sustancia de tamponamiento) o de 7,3 a 7,7 (por ejemplo, cuando HEPES es la sustancia de tamponamiento). En una realización, la concentración del agente quelante en el segundo medio (por ejemplo, el segundo tampón) es de 10 a 50 mM, preferiblemente de 15 a 40 mM, tal como de 20 a 30 mM.

En una realización, el segundo medio (por ejemplo, el segundo tampón) comprende agua, etanol, TRIS y EDTA (tal como agua, etanol, la sal (preferiblemente cloruro de sodio), TRIS y EDTA), preferiblemente en las concentraciones especificadas anteriormente para el segundo medio (por ejemplo, el segundo tampón). Sin embargo, basándose en la información y los datos proporcionados en la presente solicitud, el experto en la materia puede determinar fácilmente sustancias de tamponamiento distintas de TRIS y/o agentes quelantes distintos de EDTA y/o sales distintas de cloruro de sodio, así como sus concentraciones que son adecuadas para el segundo medio (por ejemplo, el segundo tampón) que se utilizará en los métodos de la presente invención. En una realización, el segundo medio (por ejemplo, el segundo tampón) comprende, además de etanol en los intervalos descritos anteriormente (es decir, al menos 35% (v/v), al menos 36% (v/v), al menos 37% (v/v), al menos 38% (v/v), etc.), TRIS en una cantidad de 5 a 40 mM y la sal (preferiblemente cloruro de sodio) en una cantidad de 15 a 70 mM. En otra realización, el segundo medio (por ejemplo, el segundo tampón) comprende, además de etanol en los intervalos descritos anteriormente (es decir, al menos 35% (v/v), al menos 36% (v/v), al menos 37% (v/v), al menos 38% (v/v), etc.), HEPES en una cantidad de 5 a 40 mM y la sal (preferiblemente cloruro de sodio) en una cantidad de 10 a 150 mM (por ejemplo , 110 a 140 mM o 120 a 130 mM).

En una realización, el primer y segundo medios (es decir, el primer y segundo tampones) difieren no solo en la concentración de etanol sino también en el tipo y/o concentración de uno o más de los otros componentes (como la sal, la sustancia de tamponamiento y/o el agente quelante opcional). En una realización preferida, el primer y segundo medios (es decir, el primer y segundo tampones) tienen la misma composición (es decir, con respecto al tipo y concentración de los componentes distintos del agua, como la sal, la sustancia tampón opcional y el agente quelante opcional) con la excepción de la concentración de etanol.

La expresión "separar el ARNmc del material de celulosa en condiciones que permitan la unión de ARNbc al material de celulosa", como se usa en el presente documento, significa que la fase que comprende ARNmc (siendo dicha fase preferiblemente líquida) debe aislarse del material de celulosa al que está unido el ARNbc. Tal aislamiento/separación se puede lograr de varias formas conocidas por el experto, por ejemplo, eliminando selectivamente solo el material de celulosa al que está unido el ARNbc (por ejemplo, usando, como material de celulosa, una celulosa que está acoplada covalentemente a perlas magnéticas y usando un imán) o recolectando solo la fase que comprende ARNmc (por ejemplo, usando una pipeta).

Por ejemplo, en una realización, la mezcla de la preparación de ARN, el material de celulosa y el primer tampón se proporcionan en un tubo (en esta realización, se prefiere que (a) la preparación de ARN se proporcione como un líquido que comprende ARNmc y el primer tampón y/o (p) el material de celulosa se proporciona como material de celulosa lavado (en el que el primer tampón se ha utilizado como solución de lavado), ya sea en forma seca o como suspensión en el primer medio (por ejemplo, el primer tampón), y/o (y) la preparación de ARN, el material de celulosa y el primer tampón se mezclan mediante batido y/o agitación (preferiblemente durante al menos 5 min, más preferiblemente durante al menos 10 min, tal como durante 5 a 30 min o 10 a 20 min); lo más preferido es que (a) la preparación de ARN se proporcione como un líquido que comprenda ARNmc y el primer tampón, (p) el material de celulosa se proporcione como material de celulosa lavado (en el que el primer tampón se ha utilizado como solución de lavado), ya sea en forma seca o como suspensión en el primer medio (por ejemplo, el primer tampón) y (y) la preparación de ARN, el material de celulosa y el primer tampón se mezclan mediante batido y/o agitación, por ejemplo, durante 5 a 30 min o 10 a 20 min). En esta realización, se prefiere que la etapa (iii) comprenda (1) aplicar fuerza de gravedad o centrífuga (por ejemplo, 10.000 x g a 15.000 x g durante 1 a 5 min) al tubo de tal manera que las fases líquida y sólida se separen (preferiblemente se separen completamente); y (2) recolectar el sobrenadante que comprende ARNmc (por ejemplo, usando una pipeta) o eliminar el material de celulosa (por ejemplo, usando, como material de celulosa, una celulosa que está acoplada covalentemente a perlas magnéticas y usando un imán). Las etapas (ii) y (iii) pueden repetirse una o dos o más veces (tal como una, dos o tres veces). Si se repiten las etapas (ii) y (iii), la preparación de ARNmc obtenida después de la etapa (iii) de un ciclo se utiliza como preparación de ARN en la etapa (ii) del ciclo siguiente (es decir, inmediatamente siguiente) y en cada ciclo se utiliza material de celulosa fresco (preferiblemente material de celulosa recién lavado).

En una realización alternativa, la mezcla de la preparación de ARN, el material de celulosa y el primer tampón se proporciona en una columna de centrifugación o dispositivo filtrante (en esta realización, se prefiere que (a) la preparación de ARN se proporcione como un líquido que comprende ARNmc y el primer tampón y/o (p) el material de celulosa se proporciona como material de celulosa lavado (en el que el primer tampón se ha utilizado como solución de lavado), ya sea en forma seca o como suspensión en el primer medio (por ejemplo, el primer tampón), y/o (y) la preparación de ARN, el material de celulosa, y el primer tampón se mezclan mediante batido y/o agitación (preferiblemente durante al menos 5 min, más preferiblemente durante al menos 10 min, tal como durante 5 a 30 min o 10 a 20 min); lo más preferido es que (a) la preparación de ARN se proporcione como un líquido que comprenda ARNmc y el primer tampón, (p) el material de celulosa se proporcione como material de celulosa lavado (en el que el primer tampón ha sido utilizado como solución de lavado), ya sea en forma seca o como suspensión en el primer medio (por ejemplo, el primer tampón) y (y) la preparación de ARN, el material de celulosa y el primer tampón se mezclan mediante batido y/o agitación, por ejemplo, durante 5 a 30 min o 10 a 20 min). En esta realización, se prefiere que la etapa (iii) comprenda (1') aplicar gravedad, fuerza centrífuga (por ejemplo, 10.000 x g a 15.000 x g durante 1 a 5 min), presión (por ejemplo, 1000 hPa a 3000 hPa) o vacío (por ejemplo, 100 hPa a 900 hPa, tal como 200 hPa a 800 hPa) a la columna de centrifugación o al dispositivo filtrante de modo que las fases líquida y sólida se separen (preferiblemente completamente separadas); y (2') recoger el flujo de salida que comprende ARNmc. Las etapas (ii) y (iii) pueden repetirse una o dos o más veces (tal como una, dos o tres veces). Si se repiten las etapas (ii) y (iii), la preparación de ARNmc obtenida después de la etapa (iii) de un ciclo se utiliza como preparación de ARN en la etapa (ii) del ciclo siguiente (es decir, inmediatamente siguiente) y en cada ciclo se utiliza material de celulosa fresca (preferiblemente material de celulosa recién lavado).

La expresión "separar el material de celulosa al que se unen ARNbc y ARNmc del resto", como se usa en este documento, significa que la fase sólida (es decir, material de celulosa) a la que se unen ARNbc y ARNmc (preferiblemente adsorbidos o adsorbidos de forma no covalente) es para ser aislado de la otra fase (siendo dicha otra fase preferiblemente líquida). Tal aislamiento/separación se puede lograr de varias formas conocidas por el experto, por ejemplo, recolectando selectivamente solo el material de celulosa al que están unidos ARNbc y ARNmc (por ejemplo, usando, como material de celulosa, una celulosa que se acopla covalentemente a perlas magnéticas y usando un imán) o eliminando selectivamente solo la otra fase (por ejemplo, usando una pipeta).

Por ejemplo, en una realización, la mezcla de la preparación de ARN, el material de celulosa y el segundo tampón se proporcionan en un tubo (en esta realización, se prefiere que (a') la preparación de ARN se proporcione como un líquido que comprende ARNmc y el segundo tampón y/o (p') el material de celulosa se proporciona como material de celulosa lavado (en el que el segundo tampón se ha utilizado como solución de lavado), ya sea en forma seca o como suspensión en el segundo medio (por ejemplo, el segundo tampón), y/o (y') la preparación de ARN, el material de celulosa y el segundo tampón se mezclan mediante batido y/o agitación (preferiblemente durante al menos 5 min, más preferiblemente durante al menos 10 min, tal como durante 5 a 30 min o 10 a 20 min); lo más preferido es que (a') la preparación de ARN se proporcione como un líquido que comprenda ARNmc y el segundo tampón, (p') el material de celulosa se proporcione como material de celulosa lavado (en el que el segundo tampón se ha utilizado como solución de lavado), ya sea en forma seca o como suspensión en el segundo medio (por ejemplo, el segundo tampón) y (y') la preparación de ARN, el material de celulosa y el segundo tampón se mezclan mediante batido y/o agitación, por ejemplo, durante 5 a 30 min o 10 a 20 min). En esta realización, se prefiere que la etapa (ii)(2) (es decir, "separar el material de celulosa al que se unen el ARNbc y el ARNmc del resto") comprenda (2a) aplicar fuerza de gravedad o centrífuga (por ejemplo, 10.000 x g a 15.000 x g durante 1 a 5 min) al tubo de manera que las fases líquida y sólida se separen (preferiblemente completamente separadas); y (2b) ya sea eliminando el sobrenadante (por ejemplo, usando una pipeta) o recolectando el material de celulosa al cual se unen ARNbc y ARNmc (por ejemplo, usando, como material de celulosa, una celulosa que está acoplada covalentemente a perlas magnéticas y usando un imán). La etapa (ii) puede comprender además (3) agregar una alícuota del segundo tampón (preferiblemente la alícuota es de 0,5 a 3 veces (tal como 1 a 2 veces) el volumen del material de celulosa) al material de celulosa al que ARNbc y ARNmc están unidos; (4) incubar la mezcla resultante mediante batido y/o agitación (preferiblemente durante 5 a 20 min o 10 a 15 min); y (5) separar el material de celulosa al que están unidos ARNbc y ARNmc de la fase líquida (preferiblemente la separación se lleva a cabo de la misma manera que se define en las etapas (2a) y (2b), anteriores); y opcionalmente (6) repetir las etapas (3) a (5) una o dos o más veces (tal como una, dos o tres veces). La etapa (iii) puede comprender (1) mezclar el material de celulosa al que se unen ARNbc y ARNmc con un primer tampón como se especificó anteriormente (por ejemplo, que tenga una concentración de EtOH de 14 a 20% (v/v), preferiblemente 14 a 16% (v/v)) mediante batido y/o agitación (preferiblemente durante al menos 5 min, más preferiblemente durante al menos 10 min, tal como durante 5 a 30 min o 10 a 20 min); y (2) separar la fase líquida que comprende ARNmc del material de celulosa (preferiblemente la etapa de separar la fase líquida que comprende ARNmc del material de celulosa se lleva a cabo como se especificó anteriormente, por ejemplo, aplicando fuerza de gravedad o centrífuga (por ejemplo, 10.000 x g a 15.000 x g durante 1 a 5 min) al tubo de manera que las fases líquida y sólida se separen (preferiblemente completamente separadas); y (2) recolectar el sobrenadante que comprende ARNmc (por ejemplo, usando una pipeta) o removiendo el material de celulosa (por ejemplo, utilizando como material de celulosa una celulosa acoplada covalentemente a perlas magnéticas y utilizando un imán). Las etapas (ii) y (iii) pueden repetirse una o dos o más veces (tal como una, dos o tres veces). Si se repiten las etapas (ii) y (iii), la preparación de ARNmc obtenida después de la etapa (iii) de un ciclo se utiliza como preparación de a Rn en la etapa (ii) del siguiente ciclo (es decir, inmediatamente después) y en cada ciclo se utiliza de material de celulosa fresco (preferiblemente material de celulosa lavado recientemente).

En una realización alternativa, la mezcla de la preparación de ARN, el material de celulosa y el segundo tampón se proporcionan en una columna de centrifugación o dispositivo de filtro (en esta realización, se prefiere que (a') la preparación de ARN se proporcione como un líquido que comprende ARNmc y el segundo tampón y/o (p’) el material de celulosa se proporcione como material de celulosa lavado (en el que el segundo tampón se ha utilizado como solución de lavado), ya sea en forma seca o como suspensión en el segundo medio (por ejemplo, el segundo tampón), y/o (y’) la preparación de ARN, el material de celulosa y el segundo tampón se mezclan mediante batido y/o agitación (preferiblemente durante al menos 5 min, más preferiblemente durante al menos 10 min, tal como durante 5 a 30 min o 10 a 20 min); lo más preferido es que (a’) la preparación de ARN se proporcione como un líquido que comprenda ARNmc y el segundo tampón, (p') el material de celulosa se proporcione como material de celulosa lavado (en el que el segundo tampón se ha utilizado como solución de lavado), ya sea en forma seca o como suspensión en el segundo medio (por ejemplo, el segundo tampón) y (y’) la preparación de ARN, el material de celulosa y el segundo tampón se mezclan mediante batido y/o agitación, por ejemplo, durante 5 a 30 min o 10 a 20 min). En esta realización, se prefiere que la etapa (ii)(2) (es decir, "separar el material de celulosa al que se unen el ARNbc y el ARNmc del resto") comprenda (2a') aplicar fuerza de gravedad, fuerza centrífuga (por ejemplo, 10.000 x g a 15.000 x g durante 1 a 5 min), presión (por ejemplo, 1.000 hPa a 3.000 hPa), o vacío (por ejemplo, 100 hPa a 900 hPa, tal como 200 hPa a 800 hPa) a la columna de centrifugación o dispositivo de filtro de manera que las fases líquida y sólida se separen (preferiblemente completamente separadas); y (2b') descartando el flujo de salida. La etapa (ii) puede comprender además (3) agregar una alícuota del segundo tampón (preferiblemente la alícuota es de 0,5 a 3 veces (tal como 1 a 2 veces) el volumen del material de celulosa) al material de celulosa al que ARNbc y ARNmc están unidos; (4) incubar la mezcla resultante mediante batido y/o agitación (preferiblemente durante 5 a 20 min o 10 a 15 min); y (5) separar el material de celulosa al que están unidos ARNbc y ARNmc de la fase líquida (preferiblemente la separación se lleva a cabo de la misma manera que se define en las etapas (2a') y (2b'), anteriores); y opcionalmente (6) repetir las etapas (3) a (5) una o dos o más veces (tal como una, dos o tres veces). La etapa (iii) comprende (1) mezclar el material de celulosa al que se unen ARNbc y ARNmc con un primer tampón como se especificó anteriormente (por ejemplo, que tenga una concentración de EtOH de 14 a 20% (v/v), preferiblemente 14 a 16% (v/v)) mediante batido y/o agitación (preferiblemente durante al menos 5 min, más preferiblemente durante al menos 10 min, tal como durante 5 a 30 min 0 10 a 20 min); y (2) separar la fase líquida que comprende ARNmc del material de celulosa (preferiblemente la etapa de separar la fase líquida que comprende ARNmc del material de celulosa se lleva a cabo como se especificó anteriormente, por ejemplo, aplicando fuerza de gravedad o centrífuga (por ejemplo, 10.000 x g a 15.000 x g durante 1 a 5 min), presión (por ejemplo, 1.000 hPa a 3.000 hPa), o vacío (por ejemplo, 100 hPa a 900 hPa, tal como 200 hPa a 800 hPa) a la columna de centrifugación o dispositivo de filtro de manera que las fases líquida y sólida se separen (preferiblemente completamente separadas); y recolectar el flujo de salida que comprende ARNmc. Las etapas (ii) y (iii) pueden repetirse una o dos o más veces (tal como una, dos o tres veces). Si se repiten las etapas (ii) y (iii), la preparación de ARNmc obtenida después de la etapa (iii) de un ciclo se utiliza como preparación de ARN en la etapa (ii) del siguiente ciclo (es decir, inmediatamente después) y en cada ciclo se utiliza de material de celulosa fresco (preferiblemente material de celulosa lavado recientemente).

En una realización del procedimiento de purificación positiva, el material de celulosa se proporciona en una columna (en esta realización, se prefiere que el material de celulosa se proporcione como material de celulosa lavado, en el que un segundo tampón como se especificó anteriormente (es decir, que tiene una concentración de EtOH) de al menos 35% (v/v), al menos 36% (v/v), al menos 37% (v/v), al menos 38% (v/v), etc.) se ha utilizado como solución de lavado). En esta realización, se prefiere que antes de que la preparación de ARN se cargue en la columna en la etapa (ii), la columna que comprende el material de celulosa se equilibre (es decir, se lave) con el segundo tampón como se especificó anteriormente (por ejemplo, con una alícuota de dicho segundo tampón). Posteriormente, la preparación de a Rn (que se proporciona preferiblemente como un líquido que comprende ARNmc y dicho segundo tampón) se carga en la columna (preferiblemente mediante inyección) y preferiblemente la columna se lava con dicho segundo tampón (por ejemplo, con una alícuota adicional de dicho segundo tampón, preferiblemente de 0,5 a 2 veces el volumen del material de celulosa contenido en la columna). Se prefiere esta etapa de lavado porque puede eliminar contaminantes distintos del ARN (tales contaminantes incluyen particularmente los materiales de partida utilizados para generar ARN TIV (que está opcionalmente modificado) y sus productos de degradación, por ejemplo, una plantilla de ADN; una ARN polimerasa (tal como T7, T3 o SP6); monorribonucleótidos en forma no modificada (por ejemplo, rATP, rGTP, rCTP, rUTP y sus análogos que tienen solo uno o dos grupos fosfato) o en forma modificada (por ejemplo, r(1m^) TP o r'+'TP y sus análogos que tienen solo uno o dos grupos fosfato); pirofosfato; un reactivo de protección (es decir, un reactivo para introducir una caperuza 5' o un análogo de caperuza 5'); y aditivos utilizados para generar ARN TIV (por ejemplo, agentes de tamponamiento, sales, agentes antioxidantes, poliaminas (tales como espermidina)). La etapa (iii) se lleva a cabo preferiblemente utilizando un primer tampón como se especificó anteriormente (es decir, que tenga una concentración de EtOH del 14 al 20% (v/v), preferiblemente del 14 al 16% (v/v )) como eluyente, liberando así el ARNmc del material de celulosa. Los compuestos (en particular ARNmc, opcionalmente también ARNbc) que se eluyen o se lavan de la columna se pueden detectar y/o monitorear usando medios convencionales (por ejemplo, un detector UV/VIS como un detector de matriz de diodos), por ejemplo, a una longitud de onda de 260 nm (para la detección de ácidos nucleicos) y/o 215 nm (para la detección de péptidos/proteínas) y/o 280 nm (para la detección de péptidos/proteínas que contienen aminoácidos aromáticos).

El ARNmc obtenido por cualquiera de los métodos de la presente invención (en particular independientemente de si se ha utilizado el procedimiento de purificación "negativa" o "positiva") puede someterse a tratamientos adicionales, tales como precipitación y/o modificación. Por ejemplo, el ARNmc obtenido mediante los métodos de la presente invención puede precipitarse usando métodos convencionales (por ejemplo, utilizando el método de precipitación con "acetato de sodio/isopropanol" o el método de precipitación con "LiCl") dando como resultado una preparación de ARNmc en forma seca. El ARNmc seco puede almacenarse (por ejemplo, a -70 °C) o puede resolverse en un disolvente apropiado (por ejemplo, agua o tampón TE (TRIS 10 mM, e DtA 1 mM)) y luego almacenarse (por ejemplo, a -70 °C) o utilizado adicionalmente (por ejemplo, para la preparación de una composición farmacéutica). Alternativa o adicionalmente, el ARNmc se puede modificar adicionalmente, por ejemplo, eliminando 5'-trifosfatos sin proteger y/o añadiendo una estructura de caperuza, antes de que se almacene (por ejemplo, a -70 °C) o se utilice (por ejemplo, para la preparación de una composición farmacéutica).

Como se demuestra en los ejemplos de la presente solicitud, los métodos de la invención proporcionan varias ventajas, tal como una o más de las siguientes. Por ejemplo, los métodos de la presente invención ofrecen un amplio espectro de diferentes técnicas de purificación, que incluyen etapas de centrifugación simples, columnas de centrifugación de microcentrífugas, sistemas de filtrado impulsados por vacío y FPLC. En comparación con los métodos de HPLC, los métodos de la presente invención son rentables y simples (sin necesidad de equipos complejos), evitan sustancias tóxicas (como acetonitrilo) y proporcionan ARNmc con una pureza y un rendimiento comparativamente altos. Además, debido a que la celulosa es un producto natural, se puede esperar que un método de la presente invención que se basa en celulosa y que es eficaz en la purificación del ARNmc (en particular ARNmc de TIV) encuentre menos complejidad cuando se transfiera a entornos regulados por GMP. Además, se ha demostrado en la presente solicitud que los métodos de la presente invención pueden ampliarse fácilmente y consumen menos tiempo que los métodos de HPLC convencionales. A este respecto, se observa que los métodos de HPLC convencionales (tales como los descritos en Weissman et al., citado más arriba) están generalmente limitados por el tamaño de la columna y el problema de la contrapresión que implica el uso de columnas grandes. Este no es el caso de los métodos de la presente invención. Por ejemplo, como se demuestra en la presente solicitud (véase el Ejemplo 5), la purificación de 50 a 100 mg del ARN TIV se puede lograr en menos de 2 h cuando se utilizan los métodos de la presente invención. Por el contrario, la columna de HPLC utilizada en el Ejemplo 3 (Semi-Prep RNASep 100 x 21,1 mm, Transgenomic) con un volumen de columna de 35 ml tiene una capacidad máxima de unión de 1 mg del ARN TIV. Debido a que un ciclo de purificación estándar usando una columna de HPLC de este tipo toma más de 60 min, la purificación de 50 mg del ARN TIV tomaría aproximadamente 50 h en comparación con solo 2 h usando los métodos de la presente invención. Además, la purificación de los ARN largos de TIV utilizando métodos convencionales basados en HPLC causa problemas y, a menudo, conduce a (a) una gran pérdida del ARN TIV (en particular, cuando el ARN TIV tiene una longitud de al menos aproximadamente 2.700 nt (preferiblemente al menos 2.800 nt, al menos 2.900 nt, al menos 3.000 nt, al menos 3.100 nt, al menos 3.200 nt, al menos 3.300 nt, al menos 3.400 nt, más preferiblemente al menos 3.500 nt, al menos 3.600 nt, al menos 3.700 nt, al menos al menos 3.800 nt, al menos 3.900 nt, al menos 4.000 nt, al menos 4.100 nt, al menos 4.200 nt, al menos 4.300 nt, al menos 4.400 nt, más preferiblemente al menos 4.500 nt, al menos 4.600 nt, al menos 4.700 nt, al menos 4.800 nt, al menos 4.900 nt, al menos 5.000 nt), porque los ARN TIV que tienen tal longitud no eluyen en los métodos convencionales basados en HPLC como un pico definido, sino que eluyen como un pico ancho, lo que requiere la recolección del eluato (que comprende ARNmc) durante un período prolongado de tiempo para minimizar la pérdida del ARNmc) y/o, lo que es más importante , (b) la degradación del ARN TIV (en particular, cuando el ARN TIV largo (por ejemplo, tiene un tamaño de al menos 3.500 nt, tal como al menos 4.000 nt, al menos 4.500 nt, al menos 5.000 nt, al menos 5.500 nt) , al menos 6.000 nt, al menos 6.500 nt, al menos 7.000 nt, al menos 7.500 nt, al menos 8.000 nt, al menos 8.500 nt, al menos 9.000 nt o al menos 9.500 nt) debe ser purificado probablemente debido al cizallamiento durante el paso del ARN largos a través del material de la columna densamente empaquetada). Por el contrario, como se demuestra en la presente solicitud, el uso de los métodos de la presente invención para purificar ARN TIV que tienen un tamaño de aproximadamente 10.000 nt o más no da como resultado la degradación del ARN. Además, se encontró que mediante el uso de los métodos de la presente invención, es posible eluir ARNmc de TIV (en particular ARNmc de TIV que tienen una longitud de al menos aproximadamente 2.700 nt (preferiblemente al menos 2.800 nt, al menos 2.900 nt, al menos 3.000 nt, al menos 3.100 nt, al menos 3.200 nt, al menos 3.300 nt, al menos 3.400 nt, más preferiblemente al menos 3.500 nt, al menos 3.600 nt, al menos 3.700 nt, al menos 3.800 nt, al menos 3.900 nt, al menos 4.000 nt, al menos 4.100 nt, al menos 4.200 nt, al menos 4.300 nt, al menos 4.400 nt, más preferiblemente al menos 4.500 nt, al menos 4.600 nt, al menos 4.700 nt, al menos 4.800 nt, al menos 4.900 nt, al menos 5.000 nt)) del material de celulosa en un pico definido, reduciendo así la cantidad (es decir, el volumen) de eluato (que comprende ARNmc) a recoger al mínimo. Finalmente, la integridad del ARN purificado hace que los métodos de la presente invención sean superiores en comparación con los métodos convencionales que utilizan RNasa III de E. coli, que a menudo resultan en una degradación parcial del ARNmc, especialmente el ARNmc largo, durante la incubación (probablemente debido a la hidrólisis catalizada por RNasa III de estructuras secundarias bicatenarias contenidas en el ARNmc).

El término "batir y/o agitar" como se usa en este documento significa cualquier acción que sea adecuada para mezclar (preferiblemente mezclar a fondo) una mezcla, por ejemplo, una mezcla que comprende una fase sólida (tal como un material de celulosa) y una fase líquida (tal como un medio (por ejemplo, un tampón), una solución de lavado o una preparación de ARN disuelta en un medio (por ejemplo, un tampón)). Los expertos conocen ejemplos de dispositivos para lograr "batido y/o agitación" e incluyen un agitador, un mezclador (por ejemplo, un mezclador de vórtice o un mezclador estático), un agitador magnético (que incluye una barra de agitación) y una varilla de agitación, que están disponibles en diferentes tamaños dependiendo del volumen a mezclar. La batido y/o agitación de la mezcla se puede realizar durante un tiempo suficiente para lograr una mezcla completa, por ejemplo, durante un tiempo de al menos 1 min (tal como al menos 2 min, al menos 3 min, al menos 4 min, al menos 5 min, al menos 8 min, al menos 10 min). El tiempo máximo para batir y/o agitar la mezcla puede ser de hasta 40 min (tal como hasta 35 min, hasta 30 min, hasta 28 min, hasta 26 min, hasta 24 min, hasta 22 min, o hasta 20 min). Por lo tanto, los ejemplos de intervalos de tiempo para la batido y/o agitación de la mezcla son de 5 a 40 minutos, de 5 a 30 minutos, de 5 a 20 minutos, de 10 a 40 minutos, de 10 a 30 minutos, de 10 a 20 minutos, de 15 a 40 minutos, de 15 a 30 min o de 15 a 20 min. Generalmente, la duración de la batido y/o agitación dependerá de factores tales como el uso pretendido (por ejemplo, lavado de un material de celulosa o unión de ARN a un material de celulosa) y la cantidad de sólido a mezclar. Por ejemplo, para el lavado de un material de celulosa, la duración del batido y/o agitación puede estar en el intervalo de 1 a 15 min, tal como de 5 a 10 min. Para la unión de ARN a un material de celulosa, la duración de la batido y/o agitación puede estar en el intervalo de 5 a 20 min (tal como 10 a 20 min) cuando se usa hasta 1 g de material de celulosa, o en el intervalo de 10 a 30 minutos (por ejemplo, de 15 a 30 minutos) cuando se usa más de 1 g de material de celulosa. Asimismo, para la liberación del ARN (en particular ARNm) unido a un material de celulosa a partir del material de celulosa, la duración de la batido y/o agitación puede estar en el intervalo de 5 a 20 min (tal como 10 a 20 min) cuando se usa hasta 1 g de material de celulosa, o en el intervalo de 10 a 30 min (tal como 15 a 30 min) cuando se usa más de 1 g de material de celulosa.

El término "sal" como se usa con respecto al primer y segundo medios (por ejemplo, el primer y segundo tampones) significa cualquier compuesto iónico que resulte de la reacción de neutralización de un ácido y una base. Preferiblemente, la sal (i) no es una sustancia de tamponamiento, (ii) no es un agente quelante, o (iii) no es una sustancia de tamponamiento ni un agente quelante. Los ejemplos de ácidos incluyen ácidos inorgánicos (tales como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido yodhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, ácido bórico y ácido perclórico) y ácidos orgánicos (por ejemplo, ácidos monocarboxílicos, preferiblemente los que tienen de 1 a 5 (tales como como 1, 2 o 3) átomos de carbono, por ejemplo, ácido fórmico, ácido acético y ácido propiónico), preferiblemente ácidos inorgánicos. Las ejemplos de bases incluyen bases inorgánicas (tales como NH³, hidróxido de amonio (NH⁴OH) y los óxidos e hidróxidos de metales, preferiblemente los óxidos e hidróxidos de metales alcalinos, térreos y alcalinotérreos (por ejemplo, los óxidos e hidróxidos de Li, Na, K, Rb, Be, Mg, Ca, Sr, Al. Y Zn)) y bases orgánicas (tales como aminas, por ejemplo, monoalquil, dialquil o trialquilaminas), preferiblemente bases inorgánicas, más preferiblemente los óxidos e hidróxidos de Li, Na, K, Mg, Ca, Al y Zn, más preferiblemente los óxidos e hidróxidos de Li, Na, K y Zn, tales como los óxidos e hidróxidos de Li, Na y K. Ejemplos de sales que pueden usarse con respecto al primer y segundo medios (por ejemplo, el primer y segundo tampones) incluyen LiCl, NaCl y KCl, y una sal especialmente preferida a este respecto es el NaCl. Preferiblemente, la sal se usa en el primer y segundo medios (por ejemplo, el primer y segundo tampones) en una concentración que no da como resultado la precipitación del ARN en dicho medio. En una realización, la concentración de la sal en el primer y/o segundo medios (por ejemplo, el primer y/o segundo tampones) es de 15 a 70 mM, por ejemplo, de 20 a 60 mM, de 25 a 50 mM o de 30 a 50 mM, en particular si la sustancia de tamponamiento es TRIS. En una realización, la concentración de la sal en el primer o segundo medio (por ejemplo, el primer y/o segundo tampón) es de 100 a 200 mM, por ejemplo, de 110 a 190 mM, de 120 a 180 mM, de 130 a 170 mM, 140 a 160 mM o 145 a 155 mM, en particular si la sustancia tampón es HEPES.

Los términos "sustancia de tamponamiento" y "agente tamponador" como se usan en este documento significan una mezcla de compuestos capaces de mantener el pH de una solución casi constante incluso si se agrega un ácido o base fuerte a la solución. En una realización, la sustancia de tamponamiento o el agente tamponador es una mezcla de un ácido débil y su base conjugada. En otra realización, la sustancia de tamponamiento o el agente tamponador es una mezcla de una base débil y su ácido conjugado. Preferiblemente, la sustancia de tamponamiento no es un agente quelante. Ejemplos de sustancias tampón adecuadas para el primer y segundo medios (por ejemplo, el primer y segundo tampones) incluyen tris(hidroximetil)aminometano (TRIS), ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazin-etanosulfónico (HEPES), ácido 3-morfolino-2-hidroxipropanosulfónico (MOPSO), ácido 3-(N-morfolino)propanosulfónico (MOPS), ácido N,N-bis(2-hidroxietil)-2-ammoetanosiilfónico (BES), ácido 2-[(2-hidroxi-1,1-bis(hidroximetil)etil)amino] etanosulfónico (TES), piperazina-N,N'-bis(ácido 2-etanosulfónico) (PIPES) y ácido 3-(N,N-bis[2-hidroxietil]amino)-2-hidroxipropanosulfónico (DIPSO), preferiblemente TRIS o HEPES, más preferiblemente TRIS. El valor de pH deseado (tal como pH 6,5 a 8,0, preferiblemente pH 6,6 a 7,8, tal como pH 6,8 a 7,6, pH 6,8 a 7,2, pH 6,9 a 7,5, pH 6,9 a 7,3, pH 7,0 a 7,7, pH 7,0 a 7,5, pH 7,0 a 7,3, pH 7,3 a 7,8, pH 7,3 a 7,7 o pH 7,3 a 7,6) se puede lograr agregando una cantidad suficiente de ácido (por ejemplo, ácido inorgánico tal como ácido clorhídrico) a la base correspondiente (por ejemplo, TRIS) o añadiendo una cantidad suficiente de base (por ejemplo, base inorgánica tal como hidróxido de sodio) al ácido correspondiente (por ejemplo, PIPES si se desea un pH por encima de su pKa de 6,76 (tal como un pH de 7,0 o 7,3 a 7,7)). En una realización, la concentración de la sustancia tampón en el primer y/o segundo medio (por ejemplo, el primer y/o segundo tampón) es de 5 a 40 mM, por ejemplo, de 6 a 30 mM, de 8 a 20 mM o de 10 a 15 mM.

El término "agente quelante" como se usa en este documento con respecto al primer y segundo medios (por ejemplo, el primer y segundo tampones) significa un compuesto (preferiblemente un compuesto orgánico) que es un ligando polidentado y que es capaz de formar dos o más (preferiblemente tres o más, tal como cuatro o más) enlaces coordinados con un solo átomo central (preferiblemente un solo catión metálico tal como Ca²⁺o Mg²⁺). A este respecto, "polidentado" se refiere a un ligando que tiene más de uno (es decir, dos o más, preferiblemente tres o más, tal como cuatro o más) grupos donantes en una única molécula de ligando, en el que los grupos donantes incluyen preferiblemente átomos que tienen pares de electrones libres (por ejemplo, O^-, =O, -NH², -NRH (en el que R es una fracción orgánica tal como alquilo, en particular alquilo C^{1 -3}) y -NR²(en el que cada R es independientemente una fracción orgánica tal como alquilo, en particular alquilo C^{1 -3})). Preferiblemente, el agente quelante no es una sustancia tampón. Ejemplos de agentes quelantes incluyen EDTA, ácido nitrilotriacético, sales de citrato (por ejemplo, citrato de sodio), ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7,10-tetraacético (DOTA), ácido 1,4,7-triazaciclononano-1,4,7-trisacético (NOTA), ácido 3,6,9,15-tetraazabiciclo[9.3.1]pentadeca-1(15),11,13-trieno-3,6,9-triacético (PCTA), y ácido 1,4,7,10-tetraazaciclidodecano-1,4,7-triacético (DO3A), preferiblemente EDTA o ácido nitrilotriacético, más preferiblemente EDTA. En una realización, la concentración del agente quelante en el primer y/o segundo medio (por ejemplo, el primer y/o segundo tampón) es de 10 a 50 mM, por ejemplo, de 15 a 40 mM o de 20 a 30 mM.

El término "material de celulosa", como se usa en este documento, se refiere a cualquier fibra de celulosa, preferiblemente que tenga un grado adecuado para su uso como reactivo de cromatografía de partición. Ejemplos particulares de material de celulosa adecuado para los métodos de la invención incluyen polvo de celulosa CF-11 y celulosas disponibles comercialmente tales como las de Sigma-Aldrich (por ejemplo, cat. # C6288) y Macherey-Nagel (por ejemplo, MN 100 o MN 2100). En una realización, el material de celulosa se lava antes de su uso en los métodos de la presente invención. Por lo tanto, en una realización preferida de los métodos de la presente invención, el material de celulosa se proporciona como un material de celulosa lavado, por ejemplo, en forma seca o como una suspensión en una solución de lavado (en la que dicha solución de lavado puede ser el primer o segundo medio (por ejemplo, el primer o segundo tampón) como se especifica en este documento). El lavado del material de celulosa puede incluir (I) mezclar el material de celulosa con una solución de lavado mediante batido y/o agitación (preferiblemente durante al menos 5 min, más preferiblemente durante al menos 10 min, tal como durante 5 a 10 min); y (II) retirar el líquido (por ejemplo, usando una pipeta) o recolectar el material de celulosa (por ejemplo, usando, como material de celulosa, una celulosa que está acoplada covalentemente a perlas magnéticas y usando un imán); y opcionalmente (III) repetir las etapas (I) y (II) una o dos o más veces (tal como una, dos o tres veces). Por ejemplo, cuando la mezcla del material de celulosa y la solución de lavado se proporciona en un tubo, se prefiere que la fuerza de gravedad o centrífuga (por ejemplo, 4.000 x g a 15.000 xg, tal como 5.000 x g a 10.000 x g durante 1 a 5 min) se aplique al tubo de manera que las fases líquida y sólida se separen (preferiblemente completamente separadas) y que se elimine el sobrenadante (por ejemplo, usando una pipeta) o se recolecte el material de celulosa (por ejemplo, usando, como material de celulosa, una celulosa que está acoplada covalentemente a perlas magnéticas y usando un imán). Alternativamente, cuando la mezcla del material de celulosa y la solución de lavado se proporcionan en una columna de centrifugación o dispositivo filtrante, se prefiere que la gravedad, la fuerza centrífuga (por ejemplo, 4.000 x g a 15.000 xg, tal como 5.000 x g a 10.000 x g durante 1 a 5 min), presión (por ejemplo, 1.000 hPa a 3.000 hPa), o se aplica vacío (por ejemplo, 100 hPa a 900 hPa, tal como 200 hPa a 800 hPa) a la columna de centrifugación o al dispositivo filtrante de modo que las fases líquida y sólida se separen (preferiblemente completamente separadas) y que el flujo de salida se descarte. La composición del tampón de lavado depende preferiblemente del modo previsto de unión selectiva de los ARN al material de celulosa lavado: (1) Si solo el ARNbc debe unirse selectivamente al material de celulosa lavado, mientras que el ARNmc debe permanecer sin unirse, la solución de lavado debe ser tal que permita la unión de ARNbc al material de celulosa y no permita la unión de ARNmc al material de celulosa. Por tanto, en una realización preferida de (1), la solución de lavado tiene la composición del primer medio (por ejemplo, el primer tampón) como se especificó anteriormente. (2) Si tanto el ARNbc como el ARNmc van a unirse al material de celulosa lavado, la solución de lavado debe ser tal que permita la unión de ARNbc y ARNmc al material de celulosa. Por tanto, en una realización preferida de (2), la solución de lavado tiene la composición del segundo medio (por ejemplo, el segundo tampón) como se especificó anteriormente.

Después de lavar, el material de celulosa lavado puede almacenarse (o usarse en los métodos de la presente invención) como producto seco (es decir, después de que la solución de lavado se haya eliminado completamente de la celulosa lavada como se especifica en el presente documento) o como una suspensión en la solución de lavado. Sin embargo, si el material de celulosa lavado almacenado en la solución de lavado se va a utilizar en los métodos de la invención, se prefiere que antes de que el material de celulosa lavado se ponga en contacto con la preparación de ARN, la fase líquida (es decir, la solución de lavado en la que el material de celulosa se suspende para su almacenamiento) se elimina del material de celulosa lavado (por ejemplo, aplicando fuerza de gravedad o centrífuga (como se especificó anteriormente con respecto al lavado del material de celulosa) si la celulosa lavada se proporciona en un tubo o aplicando gravedad, fuerza centrífuga, presión o vacío (como se especificó anteriormente con respecto al lavado del material de celulosa) si la celulosa lavada se proporciona en una columna de centrifugación o dispositivo filtrante) y el material de celulosa lavado resultante como tal (es decir, en forma seca) se usa luego en los métodos de la invención o se suspende en una solución de lavado (en la que dicha solución de lavado puede ser el primer o segundo medio (por ejemplo, el primero o segundo tampón) como se especifica en este documento) y luego se usa en los métodos de la invención.

El término "material de celulosa fresco" como se usa en este documento significa que dicho material de celulosa fresco no se ha puesto en contacto con una preparación de ARN. Dicho material de celulosa fresco puede lavarse o no lavarse. En una realización preferida, el material de celulosa fresco se proporciona como un material de celulosa lavado como se especificó anteriormente (por ejemplo, en forma seca o como una suspensión en la solución de lavado). Por lo tanto, dependiendo del uso previsto del material de celulosa fresco lavado (es decir, para unirse selectivamente ya sea a (1) ARNbc pero no a ARNmc o a (2) ARNbc y ARNmc), el material de celulosa fresco lavado se ha obtenido utilizando (1) el primer medio (por ejemplo, el primer tampón) como se especifica más arriba o (2) el segundo medio (por ejemplo, el segundo tampón) como se especifica más arriba.

La relación del ARN (contenido en la preparación de ARN) con respecto al material de celulosa en la etapa (ii) de los métodos de la invención es tal que no se excede la capacidad de unión de ARN del material de celulosa. En una realización preferida, la cantidad de ARN por 100 mg de material de celulosa es como máximo 250 |jg, más preferiblemente como máximo 200 jg , tal como como máximo 150 jg . Por lo tanto, en una realización, la cantidad del ARN por 100 mg de material de celulosa está en el intervalo de 10 a 250 |jg, tal como 20 a 220 |jg 30 a 200 |jg, 40 a 180 jg , 50 a 160 jg , 60 a 140 jg , 70 a 120 jg , 80 a 110 jg o 90 a 100 jg . Por lo tanto, en una realización, la cantidad de material de celulosa por 1 jg del ARN puede ser al menos 0,4 mg, preferiblemente al menos 0,5 mg, tal como al menos 0,67 mg. Por ejemplo, la cantidad de material de celulosa por 1 jg del ARN puede estar en el intervalo de 0,4 a 10 mg, tal como 0,45 a 5 mg, 0,5 a 3,3 mg, 0,56 a 2,5 mg, 0,63 a 2 mg, 0,71 a 1,67 mg, 0,83 a 1,43 mg, 0,91 a 1,25 mg o 1 a 1,11 mg.

El término "tubo" como se usa en este documento se refiere a un recipiente, en particular un recipiente alargado, que tiene sólo una abertura de manera que los compuestos y/o líquidos se pueden introducir y/o sacar del recipiente. En una realización preferida, la abertura del tubo está configurada de modo que pueda cerrarse mediante un medio adecuado, tal como una tapa de cierre que se pueda atornillar o que encaje en la abertura de manera que cierre herméticamente la abertura. En una realización, el tubo está configurado de tal manera que se pueda aplicar gravedad o fuerza centrífuga al tubo (con el fin de separar el contenido en el tubo con respecto a su gravedad específica) sin derramar ninguno de los contenidos y sin dañar la integridad del tubo.

Los términos "columna de centrifugación" y "dispositivo filtrante" como se usan en este documento se refieren a un recipiente, en particular un recipiente alargado, que tiene dos aberturas en lados opuestos y una frita o filtro, en el que la primera abertura es tal que los compuestos y/o líquidos pueden introducirse y/o retirarse del recipiente, mientras que la segunda abertura está separada de la primera abertura por la frita o el filtro de modo que los compuestos sólidos (en particular el material de celulosa) sean retenidos dentro del recipiente por la frita o el filtro, pero que los líquidos puedan pasar a la frita o filtro y a la segunda abertura. La frita o filtro tiene preferiblemente un tamaño de poro de como máximo 1 jm , tal como máximo 0,8 jm , tal como máximo 0,6 jm , por ejemplo, en el intervalo de 0,30 a 0,60 jm , tal como 0,35 a 0,55 jm . En una realización preferida, al menos la primera abertura de la columna de centrifugación o del dispositivo filtrante (preferiblemente cada una de las aberturas) está configurada de manera que pueda cerrarse mediante un medio adecuado, tal como una tapa que se puede atornillar o que encaja en el primera o segunda abertura de tal manera que selle herméticamente la abertura. En una realización, la columna de centrifugación o el dispositivo filtrante se configura de tal manera que se pueda aplicar gravedad, fuerza centrífuga, presión o vacío a la columna de centrifugación o al dispositivo filtrante (para separar el contenido en la columna de centrifugación o al dispositivo filtrante) sin dañar la integridad de la columna de centrifugación o del dispositivo filtrante. Los ejemplos de columnas de centrifugación adecuadas incluyen columnas de centrifugación de microcentrífugas (como las disponibles a través de Macherey-Nagel, por ejemplo, filtros NucleoSpin (cat. # 740606)), y ejemplos de dispositivos de filtrado adecuados incluyen dispositivos desechables de filtrado accionados por vacío (tal como los disponibles a través de Merck Chemicals GmbH/Millipore, por ejemplo, Steriflip-HV, tamaño de poro de 0,45 jm , PVDF (cat. # SE1M003M00)).

Los términos "líquido" y "fase líquida" como se usan en este documento se refieren a un fluido en condiciones estándar. Los ejemplos particulares de un líquido incluyen un medio (por ejemplo, un tampón), una solución de lavado y una preparación de ARN disuelta en un medio (por ejemplo, un tampón). Los términos "sólido" y "fase sólida" como se usan en este documento se refieren a una sustancia o mezcla de sustancias que tiene una forma y un volumen definidos pero que no es líquida ni gaseosa en condiciones estándar. Un ejemplo particular de un sólido incluye un material de celulosa.

El término "condiciones estándar", como se usa en este documento, se refiere a una temperatura de 20 °C y una presión absoluta de 1.013,25 hPa.

El término "sobrenadante" como se usa en este documento se refiere a la fase superior que se genera cuando se mezclan una fase líquida y una fase sólida y se deja que la mezcla se separe (por ejemplo, aplicando gravedad o fuerza centrífuga). En caso de que la fase sólida tenga un peso específico mayor en comparación con la fase líquida, la fase líquida será el sobrenadante.

El término "flujo de salida" como se usa en este documento se refiere a la fase líquida que pasa a través de una columna de centrifugación o un dispositivo filtrante.

El término "alícuota", como se usa en este documento, significa un volumen de un líquido que se agregará a un sólido o que se cargará en la fase estacionaria de una columna, en la que el volumen de la alícuota es generalmente de 0,1 a 10 veces (tal como de 0,5 a 5 veces, 1 a 4 veces, 1 a 3 veces, o 1 a 2 veces) el volumen de la fase sólida o estacionaria. En una realización, el líquido es un medio (por ejemplo, un tampón) (tal como el primer, segundo o tercer medio (por ejemplo, el primer, segundo o tercer tampón) como se especifica en este documento) o una solución de lavado. En una realización, el sólido es un material de celulosa tal como un material de celulosa lavado.

El término "aplicar gravedad", como se usa en este documento, significa que un recipiente, como un tubo, una columna de centrifugación o un dispositivo filtrante, está sujeto solo a la fuerza gravitacional "normal" de la tierra (aproximadamente 1 x g), es decir, no se aplica fuerza gravitacional además de la fuerza gravitacional "normal" de la tierra al contenedor (por ejemplo, se permite que un medio fluya pasivamente a través de la fase estacionaria de una columna, en la que la columna está dispuesta de tal manera que el eje longitudinal de la columna (es decir, la línea que atraviesa ambas aberturas de la columna) apunta al centro de la tierra). En una realización, se aplica gravedad al recipiente durante un tiempo suficiente para separar (preferiblemente separar completamente) las fases (tales como una fase líquida y una fase sólida) contenidas en el recipiente.

El término "aplicar fuerza centrífuga", como se usa en este documento, significa que un recipiente, como un tubo, columna de centrifugación o dispositivo filtrante, se somete a un múltiplo de la fuerza gravitacional normal de la tierra (es decir, más de 1 x g, tal como como al menos 2 x g, al menos 10 x g, al menos 100 x g y hasta 20.000 x g, tal como hasta 15.000 x g, hasta 1.000 x g, hasta 5.000 x g o hasta 4.000 x g). Un dispositivo adecuado capaz de generar tal fuerza centrífuga incluye una centrífuga. En una realización, se aplica fuerza centrífuga al recipiente durante un tiempo suficiente para separar (preferiblemente separar completamente) las fases (tales como una fase líquida y una fase sólida) contenidas en el recipiente. Los ejemplos de duraciones están en el intervalo de 1 minuto a 30 minutos (tal como 1, 2, 3, 4 o 5 minutos a 25 minutos, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 minutos a 20 minutos o 10 a 15 minutos). Generalmente, el nivel y la duración de la fuerza centrífuga aplicada dependerán de factores tales como el uso previsto (por ejemplo, lavado de un material de celulosa, unión de ARN a un material de celulosa o liberación del a Rn de un material de celulosa) y el volumen y peso del recipiente (incluido su contenido). Por ejemplo, una fuerza centrífuga alta (tal como 10.000 x g a 20.000 x g) aplicada durante un período corto (por ejemplo, de 1 a 5 min) puede ser suficiente para una separación (completa), mientras que una fuerza centrífuga baja (tal como hasta 100 x g) puede requerir una mayor duración (tal como 20 a 30 min) para una separación (completa). Asimismo, para un volumen y peso pequeños (por ejemplo, hasta un volumen de aproximadamente 2 ml y un peso de aproximadamente 2 g), se aplica una fuerza centrífuga alta (tal como 10.000 x g a 20.000 x g) durante un período corto (por ejemplo, 1 a 5 min) que puede ser suficiente para la separación (completa), mientras que para un mayor volumen y/o peso, en el que solo se puede aplicar una fuerza centrífuga más baja (tal como 200 x g a 10.000 x g), puede ser necesario una duración más larga (por ejemplo, de 20 a 30 min) para lograr una separación (completa).

El término "aplicar presión" como se usa en este documento significa que un recipiente, tal como una columna de centrifugación, un dispositivo filtrante o una columna, se somete a una fuerza positiva (en comparación con las condiciones estándar) aplicada a una abertura del recipiente. En particular, cuando el recipiente es una columna, aplicar presión significa que se bombea un líquido (como un medio o tampón) a través del recipiente, por ejemplo, utilizando una o más bombas. La presión aplicada en los métodos de la presente invención es mucho menor en comparación con la presión aplicada en los métodos de HPLC y preferiblemente es como máximo de 2 MPa (como como máximo de 1 MPa, como máximo de 5.000 hPa, como máximo de 4.000 hPa, como máximo de 3000 hPa, como máximo de 2.000 hPa).

El término "aplicar vacío", como se usa en este documento, significa que un recipiente, tal como una columna de centrifugación, un dispositivo filtrante o una columna, se somete a una presión negativa (en comparación con las condiciones estándar), en la que la presión negativa se aplica preferiblemente a una abertura de el contenedor. Preferiblemente, una presión negativa es como máximo de 900 hPa, como máximo de 800 hPa, como máximo de 700 hPa, como máximo de 600 hPa, como máximo de 500 hPa, como máximo de 400 hPa, como máximo de 300 hPa, como máximo de 200 hPa, o como máximo de 100 hPa. En una realización, se aplica vacío al recipiente durante un tiempo suficiente para separar (preferiblemente separar completamente) las fases (tales como una fase líquida y una fase sólida) contenidas en el recipiente. Los expertos en la técnica conocen dispositivos para generar una presión negativa e incluyen una bomba de vacío de chorro de agua.

La expresión "repetido una o dos o más veces" como se usa en este documento significa que la etapa o las etapas correspondientes se llevan a cabo al menos una vez, tal como dos o más veces, tres o más veces, cuatro o más veces, etc., preferiblemente una, dos o tres veces.

La expresión "un ciclo de las etapas (ii) y (iii)" como se usa en este documento significa que las etapas (ii) y (iii) se llevan a cabo cada una solo una vez. Si se completa un ciclo de las etapas (ii) y (iii), opcionalmente se puede llevar a cabo un ciclo adicional (también denominado en el presente documento "siguiente ciclo") de las etapas (ii) y (iii). Por ejemplo, en la etapa (ii) de dicho siguiente ciclo de las etapas (ii) y (iii), la preparación de ARN obtenida después de la etapa (iii) del ciclo anterior de las etapas (ii) y (iii) (es decir, una preparación de ARN que comprende preferiblemente ARNbc en menor cantidad en comparación con la preparación de ARN utilizada en la etapa (ii) del ciclo anterior) se usa como preparación de ARN, se prefiere que en cada ciclo de las etapas (ii) y (iii) se utilice material de celulosa fresco (para evitar la contaminación, por ejemplo, con ARNbc). Por lo tanto, al realizar las etapas (ii) y (iii) y, opcionalmente, repetir estas etapas una o dos o más veces, es posible eliminar el ARNbc de la preparación de ARNmc hasta tal punto que el ARNmc finalmente obtenido esté sustancialmente libre del ARNbc y/o sustancialmente libre de ADN, preferiblemente sustancialmente libre del ARNbc y ADN.

La expresión "preparación de ARN que comprende ARNbc en menor cantidad en comparación con la preparación de ARN utilizada en la etapa (ii) del ciclo anterior" significa que la realización de un ciclo de las etapas (ii) y (iii) es eficaz para eliminar el ARNbc de manera que la cantidad total del ARNbc en la preparación de ARN obtenida después de la etapa (iii) de un ciclo es menor que la cantidad total del ARNbc en la preparación de ARN usada en la etapa (ii) del ciclo anterior. Preferiblemente, el primer ciclo de las etapas (ii) y (iii) es eficaz para eliminar al menos el 70%, más preferiblemente al menos el 75% (tal como al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%) del ARNbc contenido en la preparación de ARN utilizada en la etapa (ii) del primer ciclo de las etapas (ii) y (iii). En una realización preferida, la realización de un total de dos, tres o cuatro ciclos de las etapas (ii) y (iii) es eficaz para eliminar al menos el 95%, más preferiblemente al menos el 96% (tal como al menos el 97%, al menos 98 %, al menos 99%) del ARNbc contenido en la preparación de ARN utilizada en la etapa (ii) del primer ciclo de las etapas (ii) y (iii).

El término "eluyente" como se usa en este documento significa un líquido que es capaz de alterar las propiedades de unión de un compuesto (tal como ARNbc o ARNmc) con respecto a una fase estacionaria (tal como un material de celulosa). "Alterar las propiedades de unión" significa aumentar o disminuir la capacidad de un compuesto (tal como ARNbc o ARNmc) para unirse a una fase estacionaria (tal como un material de celulosa). Preferiblemente, un eluyente es capaz de disminuir la capacidad de un compuesto (tal como ARNbc o ARNmc) para unirse a una fase estacionaria (tal como un material de celulosa). Por lo tanto, en esta realización preferida, (1) si el compuesto está unido a la fase estacionaria, la etapa de poner la fase estacionaria en contacto con el eluyente da como resultado la liberación del compuesto de la fase estacionaria, o (2) si el compuesto se disuelve en el eluyente, el eluyente disminuye la capacidad del compuesto para unirse a la fase estacionaria, preferiblemente el eluyente evita la unión del compuesto a la fase estacionaria. El término "eluir", como se usa en este documento, significa aplicar o cargar un eluyente (en) a una columna (incluida una columna de centrifugación) que contiene una fase estacionaria (tal como un material de celulosa) a la que se une un compuesto (tal como ARNmc) con el fin de liberar el compuesto de la fase estacionaria. Un eluyente preferido para ARNmc unido a un material de celulosa es el primer medio (por ejemplo, el primer tampón) como se especificó anteriormente, mientras que un eluyente preferido para ARNbc unido a un material de celulosa es un tercer medio (por ejemplo, un tercer tampón) que puede tener la misma composición que el primer o segundo medio (por ejemplo, el primer o segundo tampón) pero que no contiene EtOH (por ejemplo, el tercer medio puede ser agua). Una solución de lavado preferida que no libera ARNbc o ARNmc unidos a un material de celulosa es el segundo medio (por ejemplo, el segundo tampón) como se especificó anteriormente.

El término "eluato", como se usa en este documento, se refiere al líquido que sale de una columna, cuando se aplica o carga un eluyente en la columna.

El término "columna", como se usa en este documento, se refiere a un recipiente, en particular un recipiente cilíndrico, que tiene dos aberturas en lados opuestos, al menos una frita y una fase estacionaria (tal como un material de celulosa), en la que la primera abertura está configurada de manera que permita la introducción de líquidos (tal como un medio, por ejemplo, una solución de lavado o un medio, por ejemplo, un primer o segundo tampón) en el recipiente, mientras que la segunda abertura está separada de la primera abertura y la fase estacionaria por la frita de tal manera que (i) la fase estacionaria es retenida dentro de la columna por la frita pero (ii) se permite que los líquidos pasen a través de la frita y hacia la segunda abertura. Las columnas se pueden configurar para que sean utilizables en métodos de HPLC o en métodos de FPLC. Sin embargo, las columnas que se van a utilizar en los métodos de la presente invención se configuran preferiblemente para que se puedan utilizar en los métodos de FPLC.

El término "HPLC", como se usa en este documento, significa cromatografía líquida de alta presión, en la que una fase líquida se bombea a alta presión (típicamente al menos 5 MPa, tal como 5 a 35 MPa) a través de una columna para separar, identificar y/o cuantificar al menos un componente en una mezcla.

El término "FPLC", como se usa en este documento, significa cromatografía líquida de rendimiento rápido, en la que se permite que una fase líquida fluya a través de una columna para separar, identificar y/o cuantificar al menos un componente en una mezcla. El flujo del líquido a través de la columna FPLC se puede lograr aplicando gravedad o presión, en donde la presión preferiblemente es como máximo de 2 MPa (tal como máximo 1 Pa, como máximo 5.000 hPa, como máximo 4.000 hPa, como máximo 3.000 hPa, como máximo 2.000 hPa, o como máximo 1.000 hPa).

El término "tratamiento de purificación previa", como se usa en este documento con respecto a una preparación de ARN, significa un procedimiento para eliminar parcial o completamente los contaminantes de la preparación de ARN, en el que los contaminantes incluyen preferiblemente todos los compuestos distintos del ARN, tales como los materiales de partida utilizados para generar ARN TIV (que está opcionalmente modificado) y sus productos de degradación, por ejemplo, una plantilla de ADN; una ARN polimerasa (tal como T7, T3 o SP6); monorribonucleótidos en forma no modificada (por ejemplo, rATP, rGTP, rCTP, rUTP y sus análogos que tienen solo uno o dos grupos fosfato) o en forma modificada (por ejemplo, r(1m^)TP o r'+'TP y sus análogos que tienen solo uno o dos grupos fosfato) ; pirofosfato; un reactivo de protección (es decir, un reactivo para introducir caperuza 5' o un análogo de caperuza 5'); y aditivos usados para generar ARN TIV (por ejemplo, agentes de tamponamiento, sales, agentes antioxidantes y poliaminas (tales como espermidina)). Los ejemplos de tratamientos de purificación previa adecuados que son conocidos por el experto incluyen la precipitación de ácidos nucleicos (preferiblemente usando cloruro de litio); unión de ácidos nucleicos (en particular ARN) a perlas magnéticas (por ejemplo, los contaminantes que no se unen a las perlas magnéticas pueden lavarse luego usando un medio apropiado); ultrafiltración; y degradación del ADN, preferiblemente usando nucleasa específica de dúplex (DSN). Por ejemplo, el ARN se puede precipitar usando el método de precipitación "acetato de sodio/isopropanol" o el método de precipitación "LiCl" (preferiblemente mediante el método de precipitación "LiCl"), resultando ambos en una preparación de ARN en forma seca. En cada caso, el ARN precipitado y seco así obtenido se puede disolver en una cantidad adecuada de agua o tampón TE (TRIS 10 mM, EDTA 1 mM), ambos preferiblemente libres del RNasa.

El método de precipitación con "acetato de sodio/isopropanol" incluye las siguientes etapas: agregar 0,1 volúmenes de acetato de sodio 3 M (pH 4,0) y 1 volumen de isopropanol a una preparación de ARN, mezclar la mezcla resultante, incubar la mezcla a -20 °C durante 1 h, aplicando fuerza centrífuga (por ejemplo, 14.000 x g durante 10 min), eliminando el sobrenadante del sedimento del ARN, lavando el sedimento del ARN con 200 pl de EtOH al 70% (v/v) helado (es decir, agregando 200 pl de EtOH al 70% enfriado con hielo al sedimento del ARN, aplicando fuerza centrífuga (por ejemplo, 14.000 x g durante 5 min) y eliminando el sobrenadante del sedimento del ARN) y secando (preferiblemente al aire) el sedimento del ARN ( preferiblemente de tal manera que se elimine el etanol).

El método de precipitación con "LiCl" incluye las siguientes etapas: agregar cloruro de litio (LiCl) a una preparación de ARN de manera que la concentración final de LiCl sea 2,5 M, incubar la mezcla a -20 °C durante 30 min, aplicar fuerza centrífuga (por ejemplo, 14.000 xg durante 10 min), retirar el sobrenadante del sedimento del ARN, lavar el sedimento del ARN con 200 pl de EtOH al 70% (v/v) helado (es decir, agregar 200 pl de EtOH al 70% (v/v) helado al sedimento del ARN, aplicando fuerza centrífuga (por ejemplo, 14.000 x g durante 5 min) y eliminando el sobrenadante del sedimento del ARN) y secando (preferiblemente al aire) el sedimento del ARN (preferiblemente de tal manera que se elimine el etanol).

El término "ARN polimerasa", como se usa en el presente documento, se refiere a una ARN polimerasa dependiente de ADN que produce ARN de transcripción primaria. Ejemplos del ARN polimerasas adecuadas para generar ARN TIV de acuerdo con la presente invención incluyen las ARN polimerasas T7, T3 y SP6. Una ARN polimerasa preferida es la ARN polimerasa T7.

El término "sustancialmente libre del ARNbc" como se usa en este documento junto con ARNmc o una preparación de ARN que comprende ARNmc, en el que dicha preparación de ARNmc o ARN que comprende ARNmc se ha sometido a un método de la presente invención, significa que la cantidad del ARNbc en el ARNmc o la preparación de ARN que comprende ARNmc se ha reducido en al menos un 70% (preferiblemente al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 82%, al menos un 84%, al menos un 86%, al menos un 88%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99%) en comparación con la cantidad del ARNbc contenido en la preparación de ARNmc o ARN que comprende ARNmc antes de que dicha preparación de ARNmc o ARN que comprende ARNmc se haya sometido al método de la presente invención. Preferiblemente, dicha preparación de ARNmc o ARN que comprende ARNmc que ha sido sometida a un método de la presente invención tiene un contenido del ARNbc tal que dicha preparación de ARNmc o ARN que comprende ARNmc cuando se administra a un sujeto no induce sustancialmente una respuesta no deseada (tal como una inducción no deseada de citoquinas inflamatorias (por ejemplo, IFN-a) y/o una activación no deseada de la enzima efectora que conduce a una inhibición de la síntesis de proteínas a partir del ARNmc de la invención) en dicho sujeto. Por ejemplo, los términos "sustancialmente libre del ARNbc" y "no induce sustancialmente una respuesta no deseada" pueden significar que, cuando se administra a un sujeto, una preparación de ARNmc o ARN que comprende ARNmc, en la que dicha preparación de ARNmc o ARN se ha sometido a una método de la presente invención, induce citocinas inflamatorias (en particular IFN-a) en una cantidad que se reduce en al menos 60% (por ejemplo, al menos 62%, al menos 64%, al menos 66%, al menos 68%, al menos 70%, al menos 72%, al menos 74%, al menos 76%, al menos 78%, al menos 80%) en comparación con un ARNmc de control (es decir, una preparación de ARNmc o ARN que comprende ARNmc que no ha sido sometida a un método de la presente invención). Preferiblemente, los términos "sustancialmente libre del ARNbc" y "no induce sustancialmente una respuesta no deseada" significan que, cuando se administra a un sujeto, una preparación de ARNmc o ARN que comprende ARNmc, en la que dicha ARNmc o preparación de ARN se ha sometido a una método de la presente invención y dicho ARNmc codifica para un péptido o proteína, da como resultado la traducción del ARNmc en el péptido o proteína durante al menos 10 h (por ejemplo, al menos 12 h, al menos 14 h, al menos 16 h, al menos 18 h, al menos 20 h, al menos 22 h, o al menos 24 h) después de la administración. Por ejemplo, el contenido del ARNbc en ARNmc o una preparación de ARN que comprende ARNmc, en la que dicho ARNmc o preparación de ARN que comprende ARNmc se ha sometido a un método de la presente invención, puede ser como máximo del 5% en peso (preferiblemente como máximo del 4% en peso, como máximo 3% en peso, como máximo 2% en peso, como máximo 1% en peso, como máximo 0,5% en peso, como máximo 0,1% en peso, como máximo 0,05% en peso, como máximo 0,01% en peso, como máximo 0,005% en peso, como máximo 0,001% en peso), basado en el peso total de dicho ARNmc o preparación de ARN que comprende ARNmc.

El término "sustancialmente libre de ADN" como se usa en el presente documento junto con ARNmc o una preparación de ARN que comprende ARNmc, en el que dicho ARNmc o preparación de ARN que comprende ARNmc se ha sometido a un método de la presente invención, significa que la cantidad del ARNbc en el ARNmc o la preparación de ARN que comprende ARNmc puede ser como máximo 5% en peso (preferiblemente como máximo 4% en peso, como máximo 3% en peso, como máximo 2% en peso, como máximo 1% en peso, como máximo 0,5% en peso, como máximo 0,1% en peso, como máximo 0,05% en peso, como máximo 0,01% en peso, como máximo 0,005% en peso, como máximo 0,001% en peso), basado en el peso total de dicha preparación de ARNmc o ARN que comprende ARNmc.

El término "sustancialmente libre de ARNbc y ADN" como se usa en este documento junto con ARNmc o una preparación de ARN que comprende ARNmc, en la que dicha preparación de ARNmc o ARN que comprende ARNmc ha sido sometida a un método de la presente invención, significa que la cantidad de ARNbc en la preparación de ARNmc o ARN que comprende ARNmc está sustancialmente libre del ARNbc como se especificó anteriormente (por ejemplo, la traducción dura al menos 10 h después de la administración y/o el contenido del ARNbc es como máximo del 5% en peso) y está sustancialmente libre de ADN como se especificó anteriormente (por ejemplo, el contenido de ADN es como máximo del 5% en peso).

En el contexto de la presente invención, el término "ARN" se refiere a una molécula que comprende residuos de ribonucleótidos y preferiblemente está compuesta total o sustancialmente por residuos de ribonucleótidos. "Ribonucleótido" se refiere a un nucleótido con un grupo hidroxilo en la posición 2' de un grupo p-D-ribofuranosilo. El término "ARN" comprende ARN aislado tal como ARN parcial o completamente purificado, ARN esencialmente puro, ARN sintético y ARN generado de manera recombinante e incluye a Rn modificado que se diferencia del ARN natural por adición, eliminación, sustitución y/o alteración de uno o más nucleótidos. Tales alteraciones pueden incluir la adición de material no nucleotídico, tal como en el(los) extremo(s) de un ARN o internamente, por ejemplo en uno o más nucleótidos del ARN. Los nucleótidos en las moléculas del ARN también pueden comprender nucleótidos no estándar, tales como nucleótidos de origen no natural o nucleótidos o desoxinucleótidos sintetizados químicamente. Estos nucleótidos alterados/modificados pueden denominarse análogos de nucleótidos de origen natural, y los ARN correspondientes que contienen tales nucleótidos alterados/modificados (es decir, ARN alterados/modificados) pueden denominarse análogos del ARN de origen natural. Una molécula está "compuesta sustancialmente por residuos de ribonucleótidos" si el contenido de residuos de ribonucleótidos en la molécula es al menos del 40% (tal como al menos el 45%, al menos el 50%, al menos el 55%, al menos el 60%, al menos el 65%, al menos el 70%, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99%), basado en el número total de residuos de nucleótidos en la molécula. El número total de residuos de nucleótidos en una molécula es la suma de todos los residuos de nucleótidos (independientemente de si los residuos de nucleótidos son residuos de nucleótidos estándar (es decir, de origen natural) o análogos de los mismos).

El ARN se puede aislar de las células, se puede preparar a partir de una plantilla de ADN o se puede sintetizar químicamente usando métodos conocidos en la técnica. En realizaciones preferidas, el ARN se sintetiza in vitro a partir de una plantilla de ADN. En una realización particularmente preferida, el ARN, en particular el ARNmc tal como el ARNm o un ARNmc inhibidor (por ejemplo, ARN antisentido, ARNip o miARN), se genera mediante transcripción in vitro a partir de una plantilla de ADN. El experto en la materia conoce la metodología de transcripción in vitro; véase, por ejemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edición, J. Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989. Además, existe una variedad de kits de transcripción in vitro disponibles comercialmente, por ejemplo, de Thermo Fisher Scientific (tal como el kit de T7 TranscriptAidMR, el kit de T7 MEGAscript®, MAxiscript®), New England BioLabs Inc. (tal como el kit de T7 HiScribeMR, el kit de ARNm de ARCA T7 HiScribeMR), Promega (tal como los sistemas RiboMAXMR, HeLaScribe®, Riboprobe®), Jena Bioscience (tal como los kits de transcripción SP6 o T7) y Epicentre (como AmpliScribeMR). En una realización particularmente preferida, el ARN es ARN transcrito in vitro (ARN TIV). Para proporcionar ARN modificado, los nucleótidos modificados correspondientemente, tales como los nucleótidos de origen natural modificados, los nucleótidos de origen no natural y/o los nucleótidos de origen no natural modificados, se pueden incorporar durante la síntesis (preferiblemente la transcripción in vitro), o se pueden realizar modificaciones en y/o añadidos al ARN después de la transcripción.

De acuerdo con la invención, se prefieren como ARN oligonucleótidos sintéticos de 6 a 100, preferiblemente 10 a 50, en particular 15 a 30 o 15 a 20 nucleótidos o transcriptos más largos de más de 50 nucleótidos, preferiblemente 100 a 15.000, más preferiblemente 50 a 10.000, más preferiblemente de 100 a 5.000, en particular de 200 a 1.000 nucleótidos.

De acuerdo con la invención, "ARN" incluye ARNm, ARNt, ARNr, ARNns, ARNmc, ARNbc y ARN inhibidor.

De acuerdo con la invención, "ARNmc" incluye ARNm y ARNmc inhibidor (tal como ARNmc antisentido, ARNip o miARN).

"ARNmc" significa ARN monocatenario. El ARNmc puede contener secuencias autocomplementarias que permitan que partes del ARN se plieguen y se emparejen consigo mismas para formar hélices dobles. El tamaño del ARNmc puede variar de 6 nucleótidos a 15.000, preferiblemente de 10 a 12.000, en particular de 100 a 10.000, 150 a 8.000, 200 a 7.000, 250 a 6.000 o 300 a 5.000 nucleótidos. En una realización, el ARNmc tiene una longitud de al menos 2.700 nucleótidos (tal como al menos 2.800, al menos 2.900, al menos 3.000, al menos 3.100, al menos 3.200, al menos 3.300, al menos 3.400, al menos 3.500, al menos 3.600, al menos 3.700, al menos 3.800, al menos 3.900, al menos 4.000, al menos 4.100, al menos 4.200, al menos 4.300, al menos 4.400, al menos 4.500, al menos 4.600, al menos 4.700, al menos 4.800 , al menos 4.900, al menos 5.000 nucleótidos). ARNmc largo, como se usa en el presente documento, significa ARNmc que tiene un tamaño de al menos 3.500 nucleótidos (tal como al menos 3.600, al menos 3.700, al menos 3.800, al menos 3.900, al menos 4.000, al menos 4.100, al menos 4.200, al menos 4.300, al menos 4.400, al menos 4.500, al menos 4.600, al menos 4.700, al menos 4.800, al menos 4.900, al menos 5.000, al menos 5.500, al menos 6.000, al menos 6.500, al menos 7.000, al menos 7.500, al menos 8.000, al menos 8.500, al menos 9.000, al menos 9.500 nucleótidos), preferiblemente hasta 15.000, tal como hasta 14.000, hasta 13.000 o hasta 12.000 nucleótidos.

De acuerdo con la invención, "ARNbc" significa ARN bicatenario y es ARN con dos cadenas parcial o completamente complementarias. El tamaño de las cadenas puede variar de 6 nucleótidos a 10.000, preferiblemente de 10 a 8.000, en particular de 200 a 5.000, 200 a 2.000 o 200 a 1.000 nucleótidos.

De acuerdo con la presente invención, el término "ARNm" significa "ARN mensajero" y se refiere a un "transcrito" que puede generarse utilizando una plantilla de ADN y puede codificar un péptido o una proteína. Normalmente, un ARNm comprende una UTR 5', una región codificante de proteína y una UTR 3'. En el contexto de la presente invención, el ARNm se genera preferiblemente mediante transcripción in vitro a partir de una plantilla de ADN. Como se ha expuesto anteriormente, el experto en la materia conoce la metodología de transcripción in vitro y se encuentra disponible comercialmente una variedad de kits de transcripción in vitro. El tamaño del ARNm puede variar desde aproximadamente 1.000 nucleótidos hasta 15.000, preferiblemente 2.000 a 12.000, en particular 2.700 a 11.000, 3.000 a 10.000, 3.500 a 9.000, 4.000 a 9.000, 4.500 a 7.000 o 5.000 a 8.000 nucleótidos. En una realización, el ARNm tiene una longitud de al menos 2.700 nucleótidos (tal como al menos 2.800, al menos 2.900, al menos 3.000, al menos 3.100, al menos 3.200, al menos 3.300, al menos 3.400, al menos 3.500, al menos 3.600, al menos 3.700, al menos 3.800, al menos 3.900, al menos 4.000, al menos 4.100, al menos 4.200, al menos 4.300, al menos 4.400, al menos 4.500, al menos 4.600, al menos 4.700, al menos 4.800 , al menos 4.900, al menos 5.000 nucleótidos). ARNm largo significa ARNm que tiene un tamaño de al menos 3.500 nucleótidos (tal como al menos al menos 3.600, al menos 3.700, al menos 3.800, al menos 3.900, al menos 4.000, al menos 4.100, al menos 4.200, al menos 4.300, al menos al menos 4.400, al menos 4.500, al menos 4.600, al menos 4.700, al menos 4.800, al menos 4.900, al menos 5.000, al menos 5.500, al menos 6.000, al menos 6.500, al menos 7.000, al menos 7.500, al menos 8.000, al menos 8.500, al menos 9.000, al menos 9.500 nucleótidos), preferiblemente hasta 15.000, tal como hasta 14.000, hasta 13.000, hasta 12.000, hasta 11.000 o hasta 10.000 nucleótidos.

El ARNm solo posee una vida media limitada en las células e in vitro. Por tanto, de acuerdo con la invención, la estabilidad y la eficacia de traducción del ARN pueden modificarse según se requiera. Por ejemplo, el ARNm puede estabilizarse y aumentarse su traducción mediante una o más modificaciones que tienen un efecto estabilizador y/o un aumento de la eficiencia de traducción del ARNm. Tales modificaciones se describen, por ejemplo, en el documento WO 2007/036366, cuya descripción completa se incorpora aquí como referencia. Para aumentar la expresión del ARNm de acuerdo con la presente invención, se puede modificar dentro de la región codificante, es decir, la secuencia que codifica el péptido o proteína expresados, preferiblemente sin alterar la secuencia del péptido o proteína expresados, para aumentar el contenido de GC para incrementar la estabilidad del ARNm y realizar una optimización de codones y, por lo tanto, mejorar la traducción en las células.

El término "modificación" en el contexto del ARN, preferiblemente del ARNmc (tal como ARNm) de acuerdo con la presente invención incluye cualquier modificación de un ARN (preferiblemente ARNmc, tal como ARNm) que no está presente de forma natural en dicho ARN.

En una realización de la invención, el ARNmc (preferiblemente ARNm) divulgado en el presente documento no tiene 5'-trifosfatos sin caperuza. La eliminación de tales 5'-trifosfatos sin caperuza se puede lograr tratando ARNmc (preferiblemente ARNm) con una fosfatasa.

El ARNmc (preferiblemente ARNm) divulgado en el presente documento puede tener ribonucleótidos modificados para aumentar su estabilidad y/o disminuir la citotoxicidad. Por ejemplo, en una realización, en el ARNmc (preferiblemente ARNm) divulgado en el presente documento, la 5-metilcitidina, se sustituye parcial o completamente, preferiblemente completamente, por citidina. Alternativa o adicionalmente, en una realización, en el ARNmc (preferiblemente ARNm) divulgado en el presente documento, pseudouridina o N(1)-metilpseudouridina se sustituye parcial o completamente, preferiblemente completamente, por uridina. Un ARN (preferiblemente ARNmc tal como ARNm) que está modificado por pseudouridina (sustituyendo parcial o completamente, preferiblemente completamente, por uridina) se denomina aquí como "modificado por V", mientras que el término "modificado por 1mV" significa que el ARN (preferiblemente ARNmc tal como ARNm) contiene N(1)-metilpseudouridina (sustituyendo parcial o completamente, preferiblemente completamente, por uridina).

En una realización, el término "modificación" se refiere a proporcionar un ARN (preferiblemente ARNmc, tal como ARNm) con una caperuza 5' o análogo de caperuza 5'. El término "caperuza 5'" se refiere a una estructura de caperuza que se encuentra en el extremo 5' de una molécula del ARN (preferiblemente ARNmc, tal como ARNm) y generalmente consiste en un nucleótido de guanosina conectado al ARN (preferiblemente ARNmc, tal como ARNm) a través de un enlace trifosfato inusual de 5' a 5'. En una realización, esta guanosina está metilada en la posición 7. El término "caperuza 5' convencional” se refiere a una caperuza 5' del ARN de origen natural, preferiblemente a la caperuza de 7-metilguanosina (m7G). En el contexto de la presente invención, el término "caperuza 5'" incluye un análogo de caperuza 5' que se asemeja a la estructura de la caperuza del ARN y está modificado para poseer la capacidad de estabilizar el ARN (preferiblemente ARNmc, tal como ARNm) y/o mejorar la traducción del ARN (preferiblemente ARNmc, tal como ARNm) si está unido al mismo, preferiblemente in vivo y/o en una célula.

Preferiblemente, el extremo 5' del ARN (preferiblemente ARNmc, tal como ARNm) incluye una estructura de caperuza que tiene la siguiente fórmula general:

en la que R1 y R2 son independientemente hidroxi o metoxi y W, X y Y son independientemente oxígeno, azufre, selenio o BH3. En una realización preferida, R1 y R2 son hidroxi y W, X y Y son oxígeno. En una realización preferida adicional, uno de R1 y R2, preferiblemente R1 es hidroxi y el otro es metoxi y W, X y Y son oxígeno. En una realización preferida adicional, R1 y R2 son hidroxi y uno de W, X y Y, preferiblemente X es azufre, selenio o BH3, preferiblemente azufre, mientras que los otros son oxígeno. En una realización preferida adicional, uno de R1 y R2, preferiblemente R2 es hidroxi y el otro es metoxi y uno de W, X y Y, preferiblemente X es azufre, selenio o BH3, preferiblemente azufre mientras que el otro es oxígeno.

En la fórmula anterior, el nucleótido del lado derecho está conectado a la cadena del ARN (preferiblemente ARNmc, tal como ARNm) a través de su grupo 3'.

Aquellas estructuras de caperuza en las que al menos uno de W, X y Y es azufre, es decir, que tienen una fracción fosforotioato, existen en diferentes formas diastereoisoméricas, todas las cuales se incluyen en este documento. Además, la presente invención abarca todos los tautómeros y estereoisómeros de la fórmula anterior.

Por ejemplo, la estructura de caperuza que tiene la estructura anterior, en la que R1 es metoxi, R2 es hidroxi, X es azufre y W y Y son oxígeno existe en dos formas diastereoisoméricas (Rp y Sp). Estas pueden resolverse mediante HPLC de fase inversa y se denominan D1 y D2 de acuerdo con su orden de elución de la columna de HPLC de fase inversa. De acuerdo con la invención, el isómero D1 de m27,2'"°GppspG es particularmente preferido. En consecuencia, el término "caperuza de D1", como se usa en este documento, se refiere a un ARN (preferiblemente ARNmc, tal como ARNm) que tiene la caperuza con el isómero D1 de m272'-°GppspG como se especificó anteriormente. De manera similar, el término "con caperuza de D2", como se usa en este documento, se refiere a un ARN (preferiblemente ARNmc, tal como ARNm) que tiene caperuza con el isómero D2 de m272'-°GppspG como se ha especificado anteriormente. El experto en la materia conoce otros ejemplos de estructuras de caperuza e incluyen los descritos en el documento WO 2008/157688.

Proporcionar un ARN (preferiblemente ARNmc, tal como ARNm) con un caperuza 5' o un análogo de caperuza 5' puede lograrse mediante la transcripción in vitro de una plantilla de ADN en presencia de dicha caperuza 5' o análogo de caperuza 5', en el que dicha caperuza 5' se incorpora cotranscripcionalmente en la cadena del ARN generada (preferiblemente ARNmc, como ARNm), o el ARN (preferiblemente ARNmc, tal como ARNm) se puede generar, por ejemplo, mediante transcripción in vitro, y la caperuza 5' puede unirse al ARN (preferiblemente ARNmc, tal como ARNm) postranscripcionalmente usando enzimas de protección, por ejemplo, enzimas de protección del virus vaccinia.

El ARN (preferiblemente ARNmc, tal como ARNm) puede comprender modificaciones adicionales. Por ejemplo, una modificación adicional del ARNmc divulgada en el presente documento puede ser una extensión o truncamiento de la cola poli(A) de origen natural o una alteración de las regiones sin traducir 5' o 3' (también llamada "no traducidas 5' o 3'") (UTR).

El ARN (preferiblemente ARNmc, tal como ARNm) que tiene una secuencia de poli-A sin enmascarar se traduce de manera más eficiente que el ARN (preferiblemente ARNmc, tal como ARNm) que tiene una secuencia de poli-A enmascarada. El término "cola de poli(A)" o "secuencia de poli-A" se refiere a una secuencia de residuos de adenosina (en particular, adenililo) (A) que normalmente se encuentra en el extremo 3' de un ARN (preferiblemente ARNmc, tal como ARNm) y "secuencia de poli-A sin mascara" significa que la secuencia de poli-A en el extremo 3' de una molécula del ARN (preferiblemente ARNmc, tal como ARNm) termina con una A de la secuencia de poli-A y no va seguida de nucleótidos distintos de A ubicados en el extremo 3', es decir, secuencia abajo, de la secuencia de poli-A. Además, una secuencia de poli-A larga que tiene una longitud de aproximadamente 120 nucleótidos da como resultado una estabilidad de transcripción y una eficacia de traducción óptimas de un ARN (preferiblemente ARNmc, tal como ARNm).

Por lo tanto, para aumentar la estabilidad y/o la expresión del ARN, preferiblemente del ARNmc (tal como el ARNm) de acuerdo con la presente invención, se puede modificar para que esté presente junto con una secuencia de poli-A, preferiblemente con una longitud de 10 a 500, más preferiblemente de 30 a 300, incluso más preferiblemente de 65 a 200 y especialmente de 100 a 150 residuos de adenosina (en particular adenililo). En una realización especialmente preferida, la secuencia de poli-A tiene una longitud de aproximadamente 120 residuos de adenosina (en particular adenililo). Para aumentar aún más la estabilidad y/o la expresión del ARN, preferiblemente del ARNmc (tal como ARNm) divulgada en el presente documento, se puede desenmascarar la secuencia de poli-A.

Además, la incorporación de una UTR 3' en la región 3' no traducida de una molécula del ARN (preferiblemente ARNmc, tal como ARNm) puede dar como resultado una mejora en la eficiencia de la traducción. Se puede lograr un efecto sinérgico incorporando dos o más de tales UTR 3'. Las UTR 3' pueden ser autólogas o heterólogas al ARN (preferiblemente ARNmc, tal como ARNm) en el que se introducen. En una realización particular, la UTR 3' se deriva de un gen de globina o ARNm, tal como un gen o ARNm de alfa2-globina, alfa1-globina o beta-globina, preferiblemente beta-globina, más preferiblemente beta-globina humana.

Una combinación de las modificaciones descritas anteriormente, es decir, incorporación de una secuencia de poli-A, desenmascaramiento de una secuencia de poli-A, incorporación de una o más UTR 3' y reemplazo de uno o más nucleótidos naturales con nucleótidos sintéticos (por ejemplo, 5-metilcitidina para citidina y/o pseudouridina (^ ) o N(1)-metilipseudouridina (1m ^) para uridina), tiene una influencia sinérgica sobre la estabilidad del ARN (preferiblemente ARNmc, tal como ARNm) y aumenta la eficiencia de la traducción.

El término "ARN inhibidor" como se usa en este documento significa ARN que hibrida se selectivamente con y/o es específico para el ARNm diana, inhibiendo así (por ejemplo, reduciendo) la transcripción y/o traducción del mismo. El a Rn inhibidor incluye moléculas del ARN que tienen secuencias en la orientación antisentido con respecto al ARNm diana. Los oligonucleótidos inhibidores adecuados varían típicamente en longitud de cinco a varios cientos de nucleótidos, más típicamente de aproximadamente 20 a 70 nucleótidos de longitud o más cortos, incluso más típicamente de aproximadamente 10 a 30 nucleótidos de longitud. Los ejemplos del ARN inhibidor incluyen ARN antisentido, ribozima, ARNi, ARNip y miARN.

El término "ARN antisentido" como se usa en este documento se refiere a un ARN que se hibrida en condiciones fisiológicas con el ADN que comprende un gen particular o con el ARNm de dicho gen, inhibiendo así la transcripción de dicho gen y/o la traducción de dicho ARNm. Un transcripto antisentido de un ácido nucleico o de una parte del mismo puede formar un dúplex con el ARNm de origen natural y así evitar la acumulación o la traducción del ARNm. Otra posibilidad es el uso de ribozimas para inactivar un ácido nucleico. El ARN antisentido puede hibridar con un sitio del terminal N o secuencia arriba de 5' tal como un sitio de inicio de la traducción, un sitio de inicio de la transcripción o un sitio promotor. En realizaciones adicionales, el ARN antisentido puede hibridar con una región no traducida 3' o un sitio de corte y empalme del ARNm.

El tamaño del ARN antisentido puede variar de 15 nucleótidos a 15.000, preferiblemente de 20 a 12.000, en particular de 100 a 10.000, de 150 a 8.000, de 200 a 7.000, de 250 a 6.000, de 300 a 5.000 nucleótidos, tal como de 15 a 2.000, de 20 a 1.000, 25 a 800, 30 a 600, 35 a 500, 40 a 400, 45 a 300, 50 a 250, 55 a 200, 60 a 150 o 65 a 100 nucleótidos. En una realización, el ARN antisentido tiene una longitud de al menos 2.700 nucleótidos (tal como al menos 2.800, al menos 2.900, al menos 3.000, al menos 3.100, al menos 3.200, al menos 3.300, al menos 3.400, al menos 3.500, al menos 3.600, al menos 3.700, al menos 3.800, al menos 3.900, al menos 4.000, al menos 4.100, al menos 4.200, al menos 4.300, al menos 4.400, al menos 4.500, al menos 4.600, al menos 4.700, al menos 4.800, al menos 4.900, al menos 5.000 nucleótidos). ARN antisentido largo como se usa en este documento significa ARN antisentido que tiene un tamaño de al menos 3.500 nucleótidos (tal como al menos 3.600, al menos 3.700, al menos 3.800, al menos 3.900, al menos 4.000, al menos 4.100, al menos 4.200, al menos 4.300, al menos 4.400, al menos 4.500, al menos 4.600, al menos 4.700, al menos 4.800, al menos 4.900, al menos 5.000, al menos 5.500, al menos 6.000, al menos 6.500, al menos 7.000, al menos 7.500 , al menos 8.000, al menos 8.500, al menos 9.000, al menos 9.500 nucleótidos), preferiblemente hasta 15.000, tal como hasta 14.000, hasta 13.000, hasta 12.000, hasta 11.000 o hasta 10.000 nucleótidos.

La estabilidad del ARN antisentido puede modificarse según sea necesario. Por ejemplo, el ARN antisentido puede estabilizarse mediante una o más modificaciones que tengan un efecto estabilizador. Tales modificaciones incluyen enlaces fosfodiéster modificados (tal como enlaces metilfosfonato, fosforotioato, fosforoditioato o fosforamidato en lugar de enlaces fosfodiéster naturales) y sustituciones 2' (por ejemplo, 2'-fluoro, 2'-O-alquilo (tal como 2'-O-metilo, 2'-O-propilo o 2'-O-pentilo) y 2'-O-alilo). Por ejemplo, en una realización del ARN antisentido, los enlaces fosforotioato se sustituyen parcialmente por enlaces fosfodiéster. Alternativa o adicionalmente, en una realización del ARN antisentido, la fracción de ribosa está sustituida parcialmente en la posición 2' con O-alquilo (tal como 2'-O-metilo).

Un ARN antisentido puede dirigirse a cualquier tramo de aproximadamente 19 a 25 nucleótidos contiguos en cualquiera de las secuencias del ARNm diana (la "secuencia diana"). Generalmente, una secuencia diana en el ARNm diana puede seleccionarse de una secuencia de ADNc dada correspondiente al ARNm diana, preferiblemente comenzando de 50 a 100 nt secuencia abajo (es decir, en la dirección 3') desde el codón de inicio. Sin embargo, la secuencia diana puede estar ubicada en las regiones no traducidas 5' o 3', o en la región cercana al codón de inicio.

El ARN antisentido se puede obtener usando varias técnicas conocidas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, el ARN antisentido se puede sintetizar químicamente o producir de manera recombinante usando métodos conocidos en la técnica. Preferiblemente, el ARN antisentido se transcribe a partir de plásmidos de ADN recombinantes circulares o lineales usando cualquier promotor adecuado.

La selección de plásmidos adecuados para expresar ARN antisentido, los métodos para insertar secuencias de ácido nucleico para expresar el ARN antisentido en el plásmido y los métodos TIV de transcripción in vitro de dicho ARN antisentido están dentro del conocimiento de la técnica.

Un "ARNmc antisentido" se refiere a un ARN antisentido como se especificó anteriormente que es monocatenario.

Por "ARN interferente pequeño" o "ARNip" como se usa en este documento se entiende una molécula del ARN, preferiblemente de más de 10 nucleótidos de longitud, más preferiblemente de más de 15 nucleótidos de longitud y lo más preferiblemente de 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 nucleótidos de longitud que es capaz de unirse específicamente a una porción de un ARNm diana. Esta unión induce un proceso, en el que dicha porción del ARNm diana se corta o degrada y, por lo tanto, se inhibe la expresión génica de dicho ARNm diana. Un intervalo de 19 a 25 nucleótidos es el tamaño más preferido para los ARNip. Aunque, en principio, las cadenas sentido y antisentido del ARNip pueden comprender moléculas del ARN monocatenario complementarias, los ARNip divulgados en el presente documento comprenden una sola molécula en la que dos porciones complementarias tienen bases emparejadas y están unidas covalentemente por un área de "horquilla" monocatenaria. Es decir, la región sentido y la región antisentido pueden conectarse covalentemente mediante una molécula enlazadora. La molécula enlazadora puede ser un enlazador polinucleotídico o no nucleotídico, pero preferiblemente es un enlazador polinucleotídico. Sin desear estar ligado a ninguna teoría, se cree que el área de horquilla de la molécula del ARNip monocatenario es escindida intracelularmente por la proteína "Dicer" (o su equivalente) para formar un ARNip de dos moléculas del ARN de dos bases individuales emparejadas.

El ARNip también puede comprender una saliente 3'. Como se usa en este documento, una "saliente 3'" se refiere a al menos un nucleótido desapareado que se extiende desde el extremo 3' de una cadena del ARN. Por tanto, en una realización, el ARNip comprende al menos una saliente 3' de 1 a aproximadamente 6 nucleótidos (que incluye ribonucleótidos o desoxinucleótidos) de longitud, preferiblemente de 1 a aproximadamente 5 nucleótidos de longitud, más preferiblemente de 1 a aproximadamente 4 nucleótidos de longitud, y particularmente preferiblemente de aproximadamente 2 a aproximadamente 4 nucleótidos de longitud. En la realización en la que ambas cadenas de la molécula del ARNip (es decir, después de que la molécula del ARNip monocatenario es escindida intracelularmente por la proteína "Dicer") comprenden una saliente 3', la longitud de las salientes puede ser igual o diferente para cada cadena. En una realización más preferida, el saliente 3' está presente en ambas cadenas del ARNip y tiene 2 nucleótidos de longitud. Por ejemplo, cada cadena del ARNip puede comprender salientes 3' de ácido didesoxitimidílico ("TT") o ácido diuridílico ("uu").

Para mejorar la estabilidad del ARNip, las salientes 3' también pueden estabilizarse frente a la degradación. En una realización, las salientes se estabilizan incluyendo nucleótidos de purina, tales como nucleótidos de adenosina o guanosina. Alternativamente, la sustitución de nucleótidos de pirimidina por análogos modificados, por ejemplo, la sustitución de nucleótidos de uridina en las salientes 3' con 2'-desoxitimidina, se tolera y no afecta la eficacia de la degradación del ARNi. En particular, la ausencia de un 2'-hidroxilo en la 2'-desoxitimidina mejora significativamente la resistencia a la nucleasa de la saliente 3' en el medio de cultivo de tejidos.

Como se usa en el presente documento, "ARNm diana" se refiere a una molécula del ARN que es una diana para la subregulación.

El ARNip de acuerdo con la invención puede dirigirse a cualquier tramo de aproximadamente 19 a 25 nucleótidos contiguos en cualquiera de las secuencias del ARNm diana (la "secuencia diana"). Las técnicas para seleccionar secuencias diana para ARNip se presentan, por ejemplo, en Tuschl T. et al., "The ARNip User Guide", revisada el 11 de octubre de 2002. "The ARNip User Guide" está disponible en la red mundial en un sitio web mantenido por el Dr. Thomas Tuschl, Laboratorio de Biología Molecular del ARN, Universidad Rockefeller, Nueva York, EE. UU., y se puede encontrar accediendo al sitio web de la Universidad Rockefeller y buscando con la palabra clave "ARNip". Puede encontrar más orientación con respecto a la selección de secuencias diana y/o el diseño del ARNip en las páginas web de Protocol Online (www.protocol-online.com) utilizando la palabra clave "ARNip". Por tanto, en una realización, la cadena sentido del ARNip divulgada en el presente documento comprende una secuencia de nucleótidos sustancialmente idéntica a cualquier tramo contiguo de aproximadamente 19 a aproximadamente 25 nucleótidos en el ARNm diana.

Generalmente, una secuencia diana en el ARNm diana puede seleccionarse de una secuencia de ADNc dada correspondiente al ARNm diana, preferiblemente comenzando 50 a 100 nt secuencia abajo (es decir, en la dirección 3') desde el codón de inicio. Sin embargo, la secuencia diana puede estar ubicada en las regiones no traducidas 5' o 3', o en la región cercana al codón de inicio.

El ARNip se puede obtener usando varias técnicas conocidas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, el ARNip se puede sintetizar químicamente o producir de manera recombinante usando métodos conocidos en la técnica, tales como el sistema in vitro de Drosophila descrito en la solicitud de patente de los Estados Unidos No. 2002/0086356 de Tuschl et al.. El ARNip se puede expresar a partir de vectores de expresión de pol III sin un cambio en el sitio de direccionamiento, ya que se cree que la expresión del ARN de los promotores de pol III solo es eficaz cuando el primer nucleótido transcrito es una purina.

Preferiblemente, el ARNip se transcribe a partir de plásmidos de ADN recombinantes circulares o lineales usando cualquier promotor adecuado. Los promotores adecuados para transcribir ARNip de la invención a partir de un plásmido incluyen, por ejemplo, las secuencias promotoras pol III del ARN U6 o HI y el promotor de citomegalovirus. La selección de otros promotores adecuados está dentro del conocimiento de la técnica.

La selección de plásmidos adecuados para transcribir ARNip, los métodos para insertar secuencias de ácido nucleico para expresar el ARNip en el plásmido y los métodos de TIV de transcripción in vitro de dicho ARNip están dentro del conocimiento de la técnica.

El término "miARN" (microARN) como se usa en este documento se refiere a ARN no codificantes que tienen una longitud de 21 a 25 (tal como 21 a 23, preferiblemente 22) nucleótidos y que inducen la degradación y/o previenen la traducción de los ARNm diana. Los miARN se encuentran típicamente en plantas, animales y algunos virus, en los que son codificados por ADN nuclear eucariota en plantas y animales y por ADN viral (en virus cuyo genoma se basa en ADN), respectivamente. Los miARN son reguladores postranscripcionales que se unen a secuencias complementarias en transcripciones del ARN mensajero diana (ARNm), lo que generalmente da como resultado la represión de la traducción o la degradación de la diana y el silenciamiento génico.

El miARN puede obtenerse usando una serie de técnicas conocidas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, el ARN antisentido se puede sintetizar químicamente o producir de manera recombinante usando métodos conocidos en la técnica (por ejemplo, usando kits disponibles comercialmente tales como el kit de síntesis de ADNc de miARN vendido por Applied Biological Materials Inc.). Preferiblemente, el ARN antisentido se transcribe a partir de plásmidos de ADN recombinantes circulares o lineales usando cualquier promotor adecuado. Las técnicas para predecir la estructura secundaria de los ARN se presentan, por ejemplo, en Sato et al. (Nucleic Acids Res. 37 (2009): W277-W280), Hamada et al. (Nucleic Acids Res. 39 (2011): W100-W1062011), y Reuter y Mathews (BMC Bioinformatics 11 (2010): 129).

El término "nucleósido" se refiere a compuestos que pueden considerarse nucleótidos sin un grupo fosfato. Mientras que un nucleósido es una nucleobase unida a un azúcar (por ejemplo, ribosa o desoxirribosa), un nucleótido está compuesto por un nucleósido y uno o más grupos fosfato. Los ejemplos de nucleósidos incluyen citidina, uridina, adenosina y guanosina.

Los cinco nucleósidos estándar que componen los ácidos nucleicos son uridina, adenosina, timidina, citidina y guanosina. Los cinco nucleósidos se abrevian comúnmente con sus códigos de una letra U, A, T, C y G, respectivamente. Sin embargo, la timidina se escribe más comúnmente como "dT" ("d" representa "desoxi") ya que contiene una fracción 2'-desoxirriboruranosa en lugar del anillo de ribofuranosa que se encuentra en la uridina. Esto se debe a que la timidina se encuentra en el ácido desoxirribonucleico (ADN) y no en el ácido ribonucleico (ARN). Por el contrario, la uridina se encuentra en el ARN y no en el ADN. Los tres nucleósidos restantes se pueden encontrar tanto en el ARN como en el ADN. En el ARN, se representarían como A, C y G, mientras que en el ADN se representarían como dA, dC y dG.

El término "estabilidad" del ARN (preferiblemente ARNmc, tal como ARNm) se refiere a la "vida media" del ARN. La "vida media" se refiere al período de tiempo que se necesita para eliminar la mitad de la actividad, cantidad o número de moléculas. En el contexto de la presente invención, la vida media de un ARN (preferiblemente ARNmc, tal como ARNm o ARNmc inhibidor) es indicativa de la estabilidad de dicho ARN.

Por supuesto, si de acuerdo con la presente invención se desea disminuir la estabilidad del ARN (preferiblemente ARNmc tal como ARNm o ARNmc inhibidor), es posible modificar el ARN (preferiblemente ARNmc tal como ARNm o ARNmc inhibidor) para interferir con la función de los elementos como se describió anteriormente aumentando la estabilidad del ARN (preferiblemente ARNmc tal como ARNm o ARNmc inhibidor).

En una realización, el ARNmc divulgado en el presente documento es ARNmc (modificado), en particular ARNm (modificado), que codifica un péptido o una proteína. De acuerdo con la invención, el término "ARNmc que codifica un péptido o proteína" significa que el ARNmc, si está presente en el entorno apropiado, preferiblemente dentro de una célula, puede dirigir el ensamblaje de aminoácidos para producir, es decir, expresar, el péptido o proteína durante el proceso de traducción. Preferiblemente, ARNmc (tal como ARNm) divulgado en el presente documento es capaz de interactuar con la maquinaria de traducción celular permitiendo la traducción del péptido o proteína.

El término "expresión" se usa de acuerdo con la invención en su significado más general y comprende la producción del ARN y/o péptidos o proteínas, por ejemplo, mediante transcripción y/o traducción. Con respecto al ARN, el término "expresión" o "traducción" se refiere en particular a la producción de péptidos o proteínas. También comprende la expresión parcial de ácidos nucleicos. Además, la expresión puede ser transitoria o estable.

En el contexto de la presente invención, el término "transcripción" se refiere a un proceso, en el que el código genético en una secuencia de ADN se transcribe en ARN. Posteriormente, el ARN puede traducirse en proteína. De acuerdo con la presente invención, el término "transcripción" comprende "transcripción in vitro", en el que el término "transcripción in vitro" se refiere a un proceso, en el que el ARN, en particular el ARNmc, tal como el ARNm, se sintetiza in vitro en un sistema libre de células, preferiblemente usando extractos celulares apropiados. Preferiblemente, los vectores de clonación se aplican para la generación de transcripciones. Estos vectores de clonación se designan generalmente como vectores de transcripción y, de acuerdo con la presente invención, están englobados por el término "vector". De acuerdo con la presente invención, la preparación de ARN comprende ARNmc producido por transcripción in vitro, en particular transcripción in vitro de una plantilla de ADN apropiada. El promotor para controlar la transcripción puede ser cualquier promotor de cualquier ARN polimerasa. Ejemplos particulares de ARN polimerasas son las ARN polimerasas T7, T3 y SP6. Preferiblemente, la transcripción in vitro está controlada por un promotor T7, T3 o SP6. Puede obtenerse una plantilla de ADN para la transcripción in vitro clonando un ácido nucleico, en particular ADNc, e introduciéndolo en un vector apropiado para la transcripción in vitro. El ADNc puede obtenerse mediante transcripción inversa del ARN.

La plantilla de vector que contiene ADNc puede comprender vectores que portan diferentes insertos de ADNc que después de la transcripción dan como resultado una población de diferentes moléculas del ARN opcionalmente capaces de expresar diferentes péptidos o proteínas o pueden comprender vectores que portan solo una especie de inserto de ADNc que después de la transcripción solo da como resultado una población de una especie del ARN capaz de expresar solo un péptido o proteína. Por tanto, es posible producir ARN capaz de expresar un único péptido o proteína solamente o producir composiciones de diferentes ARN tales como bibliotecas del ARN y ARN de células completas capaces de expresar más de un péptido o proteína, por ejemplo, una composición de péptidos o proteínas. La presente invención prevé la introducción de todos esos ARN en las células.

El término "traducción" de acuerdo con la invención se refiere al proceso en los ribosomas de una célula mediante el cual una cadena del ARNm dirige el ensamblaje de una secuencia de aminoácidos para producir un péptido o una proteína.

El término "péptido" como se usa en este documento comprende oligo y polipéptidos y se refiere a sustancias que comprenden dos o más, preferiblemente 3 o más, preferiblemente 4 o más, preferiblemente 6 o más, preferiblemente 8 o más, preferiblemente 10 o más, preferiblemente 13 o más, preferiblemente 16 más, preferiblemente 21 o más y hasta preferiblemente 8, 10, 20, 30, 40 o 50, en particular 100 aminoácidos unidos covalentemente por enlaces peptídicos. El término "proteína" se refiere preferentemente a péptidos grandes, preferentemente a péptidos con más de 100 residuos de aminoácidos, pero en general los términos "péptido" y "proteína" son sinónimos y se usan indistintamente en el presente documento.

De acuerdo con la presente invención, el ARNmc tal como ARNm puede codificar un péptido o una proteína. Por consiguiente, el ARNmc puede contener una región codificante (marco de lectura abierto (ORF)) que codifica un péptido o una proteína. Por ejemplo, el ARNmc puede codificar y expresar un antígeno o un péptido o proteína farmacéuticamente activo tal como un compuesto inmunológicamente activo (que preferiblemente no es un antígeno). A este respecto, un "marco de lectura abierto" u "ORF" es un tramo continuo de codones que comienza con un codón de inicio y termina con un codón de terminación.

El término "péptido o proteína farmacéuticamente activo" incluye un péptido o proteína que puede usarse en el tratamiento de un sujeto en el que la expresión de un péptido o proteína sería beneficiosa, por ejemplo, para mejorar los síntomas de una enfermedad o trastorno. Por ejemplo, una proteína farmacéuticamente activa puede reemplazar o aumentar la expresión de la proteína en una célula que normalmente no expresa una proteína o que expresa en forma errónea una proteína, por ejemplo, una proteína farmacéuticamente activa puede compensar una mutación suministrando una proteína deseable. Además, un "péptido o proteína farmacéuticamente activo" puede producir un resultado beneficioso en un sujeto, por ejemplo, puede usarse para producir una proteína con la que se vacuna a un sujeto contra una enfermedad infecciosa. Preferiblemente, un "péptido o proteína farmacéuticamente activo" tiene un efecto positivo o ventajoso sobre la condición o estado de enfermedad de un sujeto cuando se administra al sujeto en una cantidad terapéuticamente eficaz. Preferiblemente, un péptido o proteína farmacéuticamente activo tiene propiedades curativas o paliativas y se puede administrar para mejorar, aliviar, paliar, revertir, retrasar el inicio o disminuir la gravedad de uno o más síntomas de una enfermedad o trastorno. Un péptido o proteína farmacéuticamente activo puede tener propiedades profilácticas y puede usarse para retrasar la aparición de una enfermedad o para disminuir la gravedad de dicha enfermedad o condición patológica. El término "péptido o proteína farmacéuticamente activo" incluye proteínas o polipéptidos completos, y también puede referirse a fragmentos farmacéuticamente activos de los mismos. También puede incluir análogos farmacéuticamente activos de un péptido o proteína. El término "péptido o proteína farmacéuticamente activo" incluye péptidos y proteínas que son antígenos, es decir, el péptido o proteína provoca una respuesta inmunitaria en un sujeto que puede ser terapéutica o protectora parcial o totalmente.

Ejemplos de proteínas farmacéuticamente activas incluyen, pero no se limitan a, citocinas y proteínas del sistema inmunológico tales como compuestos inmunológicamente activos (por ejemplo, interleucinas, factor estimulante de colonias (CSF), factor estimulador de colonias de granulocitos (G-CSF), factor estimulador de colonias de granulocitosmacrófagos (GM-CSF), eritropoyetina, factor de necrosis tumoral (TNF), interferones, integrinas, adresinas, selectinas, receptores de alojamiento (homing), receptores de células T, inmunoglobulinas, antígenos solubles del complejo principal de histocompatibilidad, antígenos inmunológicamente activos como antígenos bacterianos, parasitarios o virales, alérgenos, autoantígenos, anticuerpos), hormonas (insulina, hormona tiroidea, catecolaminas, gonadotrofinas, hormonas tróficas, prolactina, oxitocina, dopamina, somatotropina bovina, leptinas y similares), hormonas de crecimiento (por ejemplo, hormona de crecimiento humano), factores de crecimiento (por ejemplo, factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento nervioso, factor de crecimiento similar a la insulina y similares), receptores del factor de crecimiento, enzimas (activador de plasminógeno tisular, estreptoquinasa, colesterol biosintético o degradante, enzimas esteroidogénicas, quinasas, fosfodiesterasas, metilasas, desmetilasas, deshidrogenasas, celulasas, proteasas, lipasas, fosfolipasas, aromatasas, citocromos, adenilato o guanilato ciclasas, neuramidasas y similares), receptores (receptores de hormonas esteroides, receptores de péptidos), proteínas de unión (proteínas de unión a la hormona del crecimiento o factor de crecimiento y similares), factores de transcripción y traducción, proteínas supresoras del crecimiento tumoral (por ejemplo, proteínas que inhiben la angiogénesis), proteínas estructurales (tales como colágeno, fibroína, fibrinógeno, elastina, tubulina, actina y miosina) y proteínas sanguíneas (trombina, albúmina sérica, Factor VII, Factor VIII, insulina, Factor IX, Factor X, activador de plasminógeno tisular, proteína C, factor de von Willebrand, antitrombina III, glucocerebrosidasa, factor estimulante de colonias de granulocitos de eritropoyetina (GCSF) o Factor VIII modificado, anticoagulantes y similares).

En una realización, la proteína farmacéuticamente activa es una citocina que participa en la regulación de la homeostasis linfoide, preferiblemente una citocina que participa y preferiblemente induce o potencia el desarrollo, cebado, expansión, diferenciación y/o supervivencia de las células T. En una realización, la citocina es una interleucina. En una realización, la proteína farmacéuticamente activa es una interleucina seleccionada del grupo que consiste en IL-2, 1L-7, IL-12, IL-15 e IL-21.

El término "compuesto inmunológicamente activo" se refiere a cualquier compuesto que altere una respuesta inmunitaria, preferiblemente induciendo y/o suprimiendo la maduración de las células inmunes, induciendo y/o suprimiendo la biosíntesis de citocinas y/o alterando la inmunidad humoral estimulando la producción de anticuerpos por las células B. Los compuestos inmunológicamente activos poseen una potente actividad inmunoestimulante que incluye, pero no se limita a, actividad antiviral y antitumoral, y también pueden regular negativamente otros aspectos de la respuesta inmunitaria, por ejemplo, alejando la respuesta inmunitaria de una respuesta inmunitaria TH2, que es útil para tratar una amplia gama de enfermedades mediadas por TH2. Los compuestos inmunológicamente activos pueden ser útiles como adyuvantes de vacunas.

En una realización, se administra a un mamífero ARNmc (tal como ARNm) que codifica un antígeno tal como antígeno asociado a enfermedad, en particular si se desea tratar a un mamífero que tiene una enfermedad que implica o expresa el antígeno (antígeno asociado a la enfermedad). El ARNmc se recoge preferiblemente en las células presentadoras de antígenos del mamífero (monocitos, macrófagos, células dendríticas u otras células). Se forma un producto de traducción antigénica del ARNmc y el producto se presenta en la superficie de las células para que lo reconozcan las células T. En una realización, el antígeno o un producto producido mediante su procesado opcional se presenta en la superficie celular en el contexto de moléculas de MHC para su reconocimiento por las células T a través de su receptor de células T que conduce a su activación.

Los interferones son citocinas importantes caracterizadas por actividades antivirales, antiproliferativas e inmunomoduladoras. Los interferones son proteínas que alteran y regulan la transcripción de genes dentro de una célula al unirse a los receptores de interferón en la superficie de la célula regulada, evitando así la replicación viral dentro de las células. Los interferones se pueden agrupar en dos tipos. IFN-gamma es el único interferón de tipo II; todos los demás son interferones de tipo I. Los interferones tipo I y tipo II difieren en la estructura genética (los genes del interferón tipo II tienen tres exones; del tipo I, uno), la ubicación en el cromosoma (en los seres humanos, el tipo II se encuentra en el cromosoma 12; los genes del interferón tipo I están vinculados y en el cromosoma 9), y los tipos de tejidos donde se producen (los interferones de tipo I se sintetizan de forma ubicua, los de tipo II por linfocitos). Los interferones de tipo I inhiben competitivamente la unión de los demás a los receptores celulares, mientras que el interferón de tipo II tiene un receptor distinto. De acuerdo con la invención, el término "interferón" o "IFN" se refiere preferiblemente a interferones de tipo I, en particular IFN-alfa e IFN-beta.

En una realización, el ARN, en particular el ARN que se va a expresar en una célula, es un ARN autorreplicante monocatenario. En una realización, el ARN autorreplicante es ARN monocatenario de sentido positivo. En una realización, el ARN autorreplicante es ARN viral o ARN derivado del ARN viral. En una realización, el ARN autorreplicante es ARN genómico alfaviral o se deriva del ARN genómico alfaviral. En una realización, el ARN autorreplicante es un vector de expresión génica viral. En una realización, el virus es el virus del bosque Semliki. En una realización, el ARN autorreplicante contiene uno o más transgenes que, en una realización, si el ARN es ARN viral, pueden reemplazar parcial o completamente secuencias virales tales como secuencias virales que codifican proteínas estructurales.

El término "preparación de ARN", como se usa en este documento, se refiere a cualquier composición que comprende al menos un tipo de los diversos tipos del ARN especificados anteriormente (es decir, ARNm, ARNt, ARNr, ARNns, ARNmc, ARNbc y ARNmc inhibidor (tal como Ar N antisentido, ARNip o miARN)). El término "preparación de ARN que comprende ARNmc", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier composición que comprende al menos ARNmc (sin embargo, dicha composición también puede comprender ARNbc). El término "preparación de ARN que comprende ARNmc producido por transcripción in vitro" se refiere a cualquier composición que comprende al menos ARNmc, en la que dicho ARNmc se ha generado mediante transcripción in vitro.

El término "transcripción in vitro" o "TIV", como se usa en este documento, significa que la transcripción (es decir, la generación del ARN) se realiza sin células. Es decir, TIV no usa células vivas/cultivadas sino más bien la maquinaria de transcripción extraída de las células (por ejemplo, lisados celulares o los componentes aislados de los mismos, incluida una ARN polimerasa (preferiblemente polimerasa T7, T3 o SP6)).

El término "opcional" u "opcionalmente" como se usa en este documento significa que el evento, circunstancia o condición descrita posteriormente puede ocurrir o no, y que la descripción incluye casos en los que ocurre dicho evento, circunstancia o condición y casos en los que no ocurre.

Los "isómeros" son compuestos que tienen la misma fórmula molecular pero difieren en estructura ("isómeros estructurales") o en la posición geométrica de los grupos funcionales y/o átomos ("estereoisómeros"). Los "enantiómeros" son un par de estereoisómeros que son imágenes especulares no superponibles entre sí. Una "mezcla racémica" o "racemato" contiene un par de enantiómeros en cantidades iguales y se indica con el prefijo (±). Los "diastereómeros" son estereoisómeros que son imágenes especulares no superponibles entre sí. Los "tautómeros" son isómeros estructurales de la misma sustancia química que se interconvierten espontáneamente entre sí, incluso cuando son puros.

Términos como "disminuir", "reducir" o "inhibir" se refieren a la capacidad de causar una disminución general, preferiblemente del 5% o más, del 10% o más, del 20% o más, más preferiblemente del 50% o más, y lo más preferiblemente del 75% o más, en el nivel. Esto también incluye una disminución completa o esencialmente completa, es decir, una disminución a cero o esencialmente a cero.

Términos como "aumentar", "mejorar" o "prolongar" se refieren preferiblemente a un aumento, mejora o prolongación en aproximadamente al menos un 10%, preferiblemente al menos un 20%, preferiblemente al menos un 30%, preferiblemente al menos un 40%, preferiblemente al menos 50%, preferiblemente al menos 80%, preferiblemente al menos 100%, preferiblemente al menos 200% y en particular al menos 300%. Estos términos también pueden referirse a un aumento, mejora o prolongación desde cero o un nivel no medible o no detectable hasta un nivel de más de cero o un nivel que es medible o detectable.

El término "de origen natural", como se usa en este documento, se refiere al hecho de que un objeto se puede encontrar en la naturaleza. Por ejemplo, una proteína o ácido nucleico que está presente en un organismo (incluidos los virus), se puede aislar de una fuente en la naturaleza y no ha sido modificado intencionalmente por el hombre en el laboratorio, se presenta de forma natural.

El ARNmc divulgado en el presente documento puede marcarse isotópicamente, es decir, uno o más átomos del ARNmc se reemplazan por un átomo correspondiente que tiene el mismo número de protones pero que difiere en el número de neutrones. Por ejemplo, un átomo de hidrógeno puede reemplazarse por un átomo de deuterio. Los ejemplos de isótopos que pueden usarse en el ARNmc de la presente invención incluyen deuterio, 11C, 13C, 14C, 15N, 18F, 32S, 36Cl y 125I. El ARNmc marcado isotópicamente se puede producir utilizando nucleótidos marcados con isótopos correspondientemente durante la transcripción in vitro o añadiendo tales nucleótidos marcados con isótopos correspondientemente después de la transcripción.

También se describe en el presente documento una composición farmacéutica que comprende un ARNmc de la invención y uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. En una realización, la composición farmacéutica comprende un ARNmc de la invención, uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables y uno o más compuestos activos adicionales/suplementarios.

También se divulga en el presente documento un ARNmc como se especificó anteriormente o una composición farmacéutica como se especifica en este documento para su uso en terapia.

Por ejemplo, el ARNmc y las composiciones farmacéuticas de la invención pueden usarse en el tratamiento (incluido el tratamiento profiláctico) de una afección, trastorno o enfermedad seleccionada del grupo que consiste en enfermedades infecciosas (por ejemplo, las causadas por virus, bacterias, hongos u otras microorganismos); una inflamación indeseable (tal como un trastorno inmunológico); y cáncer.

Por tanto, también se divulga (i) un ARNmc divulgado en el presente documento (o una composición farmacéutica que comprende tal ARNmc opcionalmente junto con un excipiente farmacéuticamente aceptable) para su uso en un método de tratamiento de una afección, trastorno o enfermedad como se especifica en el presente documento, en particular, una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en enfermedades infecciosas (por ejemplo, las causadas por un virus, bacteria, hongo u otro microorganismo); una inflamación indeseable; y cáncer; y (ii) un método para tratar a un individuo con una necesidad del mismo, que comprende administrar una cantidad farmacéuticamente eficaz de un ARNmc de la invención (o una composición farmacéutica que comprende tal ARNmc opcionalmente junto con un excipiente farmacéuticamente aceptable) al individuo. En una realización, el individuo padece, es susceptible o corre el riesgo de, una o más de las afecciones, trastornos o enfermedades descritas en el presente documento. La afección, trastorno o enfermedad se puede seleccionar del grupo que consiste en enfermedades infecciosas (por ejemplo, las causadas por un virus, bacteria, hongo u otro microorganismo); una inflamación indeseable; y cáncer. Además, el individuo es preferiblemente un mamífero y más preferiblemente un ser humano.

El cáncer (término médico: neoplasia maligna) es una clase de enfermedades en las que un grupo de células muestra un crecimiento descontrolado (división más allá de los límites normales), invasión (intrusión y destrucción de tejidos adyacentes) y, a veces, metástasis (diseminación a otras ubicaciones en el cuerpo a través de la linfa o la sangre). Estas tres propiedades malignas de los cánceres los diferencian de los tumores benignos, que son autolimitados y no invaden ni hacen metástasis. La mayoría de los cánceres forman un tumor, es decir, una inflamación o lesión formada por un crecimiento anormal de células (llamadas células neoplásicas o células tumorales), pero algunos, como la leucemia, no lo hacen. El término "cáncer" de acuerdo con la invención comprende leucemias, seminomas, melanomas, teratomas, linfomas, neuroblastomas, gliomas, cáncer de recto, cáncer de endometrio, cáncer de riñón, cáncer suprarrenal, cáncer de tiroides, cáncer de sangre, cáncer de piel, cáncer de cerebro, cáncer de cuello uterino, cáncer intestinal, cáncer de hígado, cáncer de colon, cáncer de estómago, cáncer de intestino, cáncer de cabeza y cuello, cáncer gastrointestinal, cáncer de ganglio linfático, cáncer de esófago, cáncer colorrectal, cáncer de páncreas, cáncer de oído, nariz y garganta (ENT), cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de útero, cáncer de ovario y cáncer de pulmón y sus metástasis. Ejemplos de los mismos son carcinomas de pulmón, carcinomas de mama, carcinomas de próstata, carcinomas de colon, carcinomas de células renales, carcinomas de cuello uterino o metástasis de los tipos de cáncer o tumores descritos anteriormente. El término cáncer de acuerdo con la invención también comprende metástasis de cáncer.

Los ejemplos de cánceres tratables con el ARNmc y las composiciones farmacéuticas de la presente invención incluyen melanoma maligno, todos los tipos de carcinoma (colon, células renales, vejiga, próstata, carcinoma de pulmón de células pequeñas y no pequeñas, etc.), linfomas, sarcomas, blastomas, gliomas, etc.

El melanoma maligno es un tipo grave de cáncer de piel. Se debe al crecimiento descontrolado de las células pigmentarias, llamadas melanocitos.

De acuerdo con la invención, un "carcinoma" es un tumor maligno derivado de células epiteliales. Este grupo representa los cánceres más comunes, incluidas las formas comunes de cáncer de mama, próstata, pulmón y colon.

El linfoma y la leucemia son neoplasias derivadas de células hematopoyéticas (formadoras de sangre).

Un sarcoma es un cáncer que surge de células transformadas en uno de varios tejidos que se desarrollan a partir del mesodermo embrionario. Por tanto, los sarcomas incluyen tumores de hueso, cartílago, tejido adiposo, muscular, vascular y hematopoyético.

Un tumor blástico o blastoma es un tumor (generalmente maligno) que se asemeja a un tejido inmaduro o embrionario. Muchos de estos tumores son más comunes en los niños.

Un glioma es un tipo de tumor que comienza en el cerebro o la columna. Se llama glioma porque surge de las células gliales. El sitio más común de gliomas es el cerebro.

Por "metástasis" se entiende la diseminación de las células cancerosas desde su sitio original a otra parte del cuerpo. La formación de metástasis es un proceso muy complejo y depende del desprendimiento de células malignas del tumor primario, la invasión de la matriz extracelular, la penetración de las membranas basales endoteliales para ingresar a la cavidad corporal y los vasos, y luego, después de ser transportadas por la sangre, infiltración de órganos diana. Finalmente, el crecimiento de un nuevo tumor, es decir, un tumor secundario o un tumor metastásico, en el sitio diana depende de la angiogénesis. La metástasis tumoral a menudo ocurre incluso después de la extirpación del tumor primario porque las células o componentes tumorales pueden permanecer y desarrollar potencial metastásico. En una realización, el término "metástasis" de acuerdo con la invención se refiere a "metástasis distante" que se refiere a una metástasis que está alejada del tumor primario y del sistema de ganglios linfáticos regionales.

Los ejemplos de trastornos inmunes incluyen, pero no se limitan a, enfermedades autoinmunes (por ejemplo, diabetes mellitus, artritis (incluyendo artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, osteoartritis y artritis psoriásica), esclerosis múltiple, encefalomielitis, miastenia grave, lupus eritematosis sistémico, tiroiditis, dermatitis (incluyendo dermatitis atópica y dermatitis eccematosa), psoriasis, síndrome de Sjogren, enfermedad de Crohn, úlcera aftosa, iritis, conjuntivitis, queratoconjuntivitis, colitis ulcerosa, asma, asma alérgica, sepsis y choque séptico, trastorno inflamatorio del intestino, lupus cutáneo eritematoso, esclerodermia, vaginitis, proctitis, erupciones farmacológicas, reacciones de reversión de la lepra, eritema nudoso leproso, uveítis autoinmune, encefalomielitis alérgica, encefalopatía hemorrágica necrotizante aguda, hipoacusia neurosensorial progresiva bilateral idiopática, anemia aplásica, anemia de glóbulos rojos pura, trombocitopenia idiopática, policondritis, granulomatosis de Wegener, hepatitis crónica activa, síndrome de Stevens-Johnson, glomerulonefritis, esprúe idiopático, liquen plano, enfermedad de Graves, sarcoidosis, cirrosis biliar primaria, uveítis posterior y fibrosis pulmonar intersticial), enfermedad de injerto contra huésped, casos de trasplante, y alergia tal como alergia atópica.

Los ejemplos de virus incluyen, entre otros, el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), el virus de Epstein-Barr (EBV), el citomegalovirus (CMV) (por ejemplo, CMV5), los herpesvirus humanos (HHV) (por ejemplo, HHV6, 7 o 8), virus del herpes simple (HSV), virus del herpes bovino (BHV) (por ejemplo, BHV4), virus del herpes equino (EHV) (por ejemplo, EHV2), virus de la leucemia de células T humanas (HTLV) 5, virus de la varicela-zoster (VZV), virus del sarampión, papovavirus (JC y BK), virus de la hepatitis (por ejemplo, VHB o VHC), virus del mixoma, adenovirus, parvovirus, virus del polioma, virus de la influenza, virus del papiloma y poxvirus como el virus vaccinia y el virus contagioso del molusco (MCV) y lissavirus. Dicho virus puede o no expresar un inhibidor de la apoptosis. Los ejemplos de enfermedades causadas por una infección viral incluyen, pero no se limitan a, varicela, infecciones por citomegalovirus, herpes genital, hepatitis B y C, influenza, herpes y rabia.

Los ejemplos de bacterias incluyen, pero no se limitan a, Campylobacter jejuni, especies de Enterobacter, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Escherichia coli (por ejemplo, F. coli 0157: H7), estreptococos del grupo A, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, listeria, Mycobacterium tuberculosis, Pseudomonas aeruginosa, S. pneumoniae, Salmonella, Shigella, Staphylococcus aureus y Staphylococcus epidermidis, y Borrelia y Rickettsia. Los ejemplos de enfermedades causadas por una infección bacteriana incluyen, pero no se limitan a, ántrax, cólera, difteria, enfermedades transmitidas por alimentos, lepra, meningitis, úlcera péptica, neumonía, sepsis, choque séptico, sífilis, tétanos, tuberculosis, fiebre tifoidea e infección del tracto urinario, enfermedad de Lyme y fiebre maculosa de las Montañas Rocosas.

Ejemplos particulares de enfermedades infecciosas tratables con el ARNmc y las composiciones farmacéuticas de la presente invención incluyen enfermedades infecciosas virales, tales como SIDA (VIH), hepatitis A, B o C, herpes, herpes zoster (varicela), sarampión alemán (virus de la rubéola), fiebre amarilla, dengue; enfermedades infecciosas causadas por flavivirus; influenza; enfermedades infecciosas hemorrágicas (virus de Marburgo o del Ébola); enfermedades infecciosas bacterianas (como la enfermedad del legionario (Legionella), úlcera gástrica (Helicobacter), cólera (Vibrio), infecciones por E. coli, Staphylococci, Salmonella o Streptococci (tétanos); infecciones por patógenos protozoarios como malaria, enfermedad del sueño, leishmaniasis, toxoplasmosis, es decir, infecciones por Plasmodium, Trypanosoma, Leishmania y Toxoplasma; o infecciones fúngicas, que son causadas, por ejemplo, por Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis, Blastomyces dermatitidis o Candida albicans.

El ARNmc y las composiciones farmacéuticas divulgadas en el presente documento se pueden usar solos o junto con uno o más compuestos activos adicionales/suplementarios que se pueden administrar antes, simultáneamente o después de la administración del ARNmc o la composición farmacéutica de la presente invención. Dichos uno o más compuestos activos adicionales/suplementarios incluyen fármacos quimioterapéuticos para pacientes con cáncer (por ejemplo, gemcitabina, etopofos, cis-platino, carbo-platino), agentes antivirales, agentes antiparasitarios, agentes antibacterianos, agentes inmunoterapéuticos (por ejemplo, antígenos o fragmentos de los mismos (en particular fragmentos inmunogénicos del mismo)) y adyuvantes, y, si se administra simultáneamente con el ARNmc de la presente invención, pueden estar presentes en una composición farmacéutica de la presente invención.

En particular, el uno o más compuestos activos adicionales/suplementarios pueden comprender un agente inmunoterapéutico, preferiblemente un agente inmunoterapéutico que induce o efectúa una reacción inmunitaria dirigida, es decir, específica. Por tanto, en una realización, el ARNmc y las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden usarse junto con un agente inmunoterapéutico, preferiblemente un agente inmunoterapéutico que induce o efectúa una reacción inmunitaria dirigida, es decir, específica. Dichos agentes inmunoterapéuticos incluyen agentes dirigidos contra un antígeno asociado a una enfermedad, tales como anticuerpos terapéuticos o agentes que inducen una respuesta inmunitaria dirigida contra un antígeno asociado a una enfermedad o células que expresan un antígeno asociado a una enfermedad. Los agentes inmunoterapéuticos útiles incluyen proteínas o péptidos que inducen una respuesta de células B o células T contra el antígeno asociado a la enfermedad o células que expresan el antígeno asociado a la enfermedad. Estas proteínas o péptidos pueden comprender una secuencia esencialmente correspondiente o idéntica a la secuencia del antígeno asociado a la enfermedad o uno o más fragmentos del mismo. En una realización, la proteína o péptido comprende la secuencia de un péptido presentado por MHC derivado del antígeno asociado a la enfermedad. En lugar de administrar la proteína o el péptido, también es posible administrar el ácido nucleico, preferiblemente el ARNm, que codifica la proteína o el péptido. El ARN que codifica la proteína o el péptido puede ser el ARNmc de la presente invención. Alternativa o adicionalmente, el ARN que codifica la proteína o el péptido puede ser un ARN diferente que no esté de acuerdo con la presente invención, cuyo ARN se puede administrar simultáneamente (en este caso, el ARN puede formar parte de una composición farmacéutica de la invención) y/o antes, y/o después de la administración de una composición farmacéutica de la invención. Por consiguiente, la composición farmacéutica de la presente invención puede usarse en vacunación genética, en la que se estimula una respuesta inmunitaria mediante la introducción en un sujeto de una molécula de ácido nucleico adecuada (ADN o ARNm) que codifica un antígeno o un fragmento del mismo.

En una realización, un antígeno asociado a una enfermedad es un antígeno asociado a un tumor. En esta realización, el ARNmc y las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden ser útiles para tratar el cáncer o la metástasis del cáncer. Preferiblemente, el órgano o tejido enfermo se caracteriza por células enfermas tales como células cancerosas que expresan un antígeno asociado con la enfermedad y/o se caracterizan por la asociación de un antígeno asociado con la enfermedad con su superficie. La inmunización con antígeno asociado a tumor intacto o sustancialmente intacto o fragmentos del mismo, tal como péptidos o ácidos nucleicos del MHC de clase I y clase II, en particular ARNm, que codifica dicho antígeno o fragmento, hace posible provocar una respuesta del MHC de clase I y/o de clase II y, por tanto, estimular las células T tales como los linfocitos T citotóxicos CD8+ que son capaces de lisar células cancerosas y/o células T CD4+. Tal inmunización también puede provocar una respuesta inmunitaria humoral (respuesta de células B) que da como resultado la producción de anticuerpos contra el antígeno asociado al tumor. Además, las células presentadoras de antígenos (APC), tal como las células dendríticas (DC), pueden cargarse con péptidos presentados por el MHC de clase I directamente o mediante transfección con ácidos nucleicos que codifican antígenos tumorales o péptidos antigénicos tumorales in vitro y administrados a un paciente.

De acuerdo con la presente invención, un antígeno asociado a un tumor comprende preferiblemente cualquier antígeno que sea característico de tumores o cánceres así como de células tumorales o cancerosas con respecto al tipo y/o nivel de expresión. En una realización, el término "antígeno asociado a tumor" se refiere a proteínas que se encuentran en condiciones normales, es decir, en un sujeto sano, expresadas específicamente en un número limitado de órganos y/o tejidos o en etapas específicas de desarrollo, por ejemplo, el antígeno asociado al tumor puede expresarse en condiciones normales específicamente en el tejido del estómago, preferiblemente en la mucosa gástrica, en los órganos reproductores, por ejemplo, en los testículos, en el tejido trofoblástico, por ejemplo, en la placenta, o en las células de la línea germinal, y se expresan o se expresan de forma aberrante en uno o más tejidos tumorales o cancerosos. En este contexto, "un número limitado" significa preferiblemente no más de 3, más preferiblemente no más de 2 o 1. Los antígenos asociados a tumores en el contexto de la presente invención incluyen, por ejemplo, antígenos de diferenciación, preferiblemente antígenos de diferenciación específicos del tipo celular, es decir, proteínas que están en condiciones normales expresadas específicamente en un cierto tipo de célula en una determinada etapa de diferenciación, antígenos de cáncer/testículo, es decir, proteínas que en condiciones normales son expresadas específicamente en los testículos y, a veces, en la placenta, y antígenos específicos de la línea germinal. En el contexto de la presente invención, el antígeno asociado a tumor se asocia preferiblemente con la superficie celular de una célula cancerosa y preferiblemente no se expresa o solo rara vez se expresa en tejidos normales. Preferiblemente, el antígeno asociado al tumor o la expresión aberrante del antígeno asociado al tumor identifica las células cancerosas. En el contexto de la presente invención, el antígeno asociado a tumor que es expresado por una célula cancerosa en un sujeto, por ejemplo, un paciente que padece una enfermedad cancerosa, es preferiblemente una proteína propia en dicho sujeto. En realizaciones preferidas, el antígeno asociado a tumor en el contexto de la presente invención se expresa en condiciones normales específicamente en un tejido u órgano que no es esencial, es decir, tejidos u órganos que cuando son dañados por el sistema inmunológico no conducen a la muerte del sujeto, o en órganos o estructuras del cuerpo que no son o sólo difícilmente accesibles por el sistema inmunológico. En una realización, la secuencia de aminoácidos del antígeno asociado al tumor es idéntica entre el antígeno asociado al tumor que se expresa en tejidos normales y el antígeno asociado al tumor que se expresa en tejidos cancerosos. Preferiblemente, un antígeno asociado a tumor se presenta en el contexto de moléculas del MHC por una célula cancerosa en la que se expresa.

Ejemplos de antígenos de diferenciación que cumplen idealmente los criterios para antígenos asociados a tumores contemplados por la presente invención como estructuras diana en inmunoterapia tumoral, en particular, en vacunación tumoral son las proteínas de superficie celular de la familia de las claudinas, tales como CLDN6 y CLDN18.2. Estos antígenos de diferenciación se expresan en tumores de diversos orígenes y son particularmente adecuados como estructuras diana en relación con la inmunoterapia contra el cáncer mediada por anticuerpos debido a su expresión selectiva (sin expresión en un tejido normal relevante para la toxicidad) y localización en la membrana plasmática.

Otros ejemplos de antígenos que pueden ser útiles en la presente invención son p53, ART-4, BAGE, beta-catenina/m, Bcr-abL CAMEL, CAP-1, CASP-8, CDC27/m, CDK4/m, CEA, CLAUDINA-12, c-MYC, CT, Cyp-B, DAM, ELF2M, ETV6-AML1, G250, GAGE, GnT-V, Gap 100, HAGE, HER-2/neu, HPV-E7, HPV-E6, HAST -2, hTERT (o hTRT), LAGE, LDLR/FUT, MAGE-A, preferiblemente MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11 o MAGE-A12, MAGE-B, MAGE-C, MART-1/Melan-A, MC1R, Miosina/m, MUC1, MUM-1, MUM-2, MUM-3, NA88-A, NF1, NY-ESO-1, NY-BR-1, p190 BCR-abL menor, Pm1/RARa, PRAME, proteinasa 3, PSA, PSM, RAGE, RU1 o RU2 , SAGE, SART-1 o SART-3, SCGB3A2, SCP1, SCP2, SCP3, SSX, SURVIVINA, TEL/AML1, TPI/m, TRP-1, TRP-2, TRP-2/I T2, TPTE y WT, preferiblemente WT-1.

Por "antígeno" se entiende cualquier estructura que pueda provocar la formación de anticuerpos y/o la activación de una respuesta inmunitaria celular. Ejemplos de antígenos son polipéptidos, proteínas, células, extractos celulares, carbohidratos/polisacáridos, conjugados de polisacáridos, lípidos y glicolípidos. Estos antígenos pueden ser antígenos tumorales o antígenos o alérgenos virales, bacterianos, fúngicos y de protozoos. El término "antígeno" también incluye antígenos derivatizados como sustancia secundaria que se vuelve antigénica, y sensibilizante, solo a través de la transformación (por ejemplo, de forma intermedia en la molécula, al completarse con proteína corporal), y antígenos conjugados que, mediante la incorporación artificial de grupos atómicos (por ejemplo, isocianatos, sales de diazonio), presentan una nueva especificidad constitutiva. El antígeno puede estar presente en la vacuna divulgada en el presente documento en forma de un hapteno acoplado a un portador adecuado. Los portadores adecuados son conocidos por los expertos en la técnica e incluyen, por ejemplo albúmina de suero humano (HSA), polietilenglicoles (PEG). El hapteno puede acoplarse al portador mediante procesos bien conocidos en la técnica anterior, por ejemplo, en el caso de un portador polipeptídico mediante un enlace amida a un residuo de Lys.

El término "inmunogenicidad" se refiere a la capacidad de una sustancia particular, en particular ARN (preferiblemente ARNmc, tal como ARNm), para provocar una respuesta inmunitaria en el cuerpo de un sujeto tal como un ser humano. En otras palabras, la inmunogenicidad es la capacidad de inducir una respuesta inmunitaria.

"Inducir una respuesta inmunitaria" puede significar que no hubo una respuesta inmunitaria antes de inducir una respuesta inmunitaria, pero también puede significar que hubo un cierto nivel de respuesta inmunitaria antes de inducir una respuesta inmunitaria y después de inducir una respuesta inmunitaria dicha respuesta inmunitaria está mejorada. Por tanto, "inducir una respuesta inmunitaria" incluye "potenciar una respuesta inmunitaria". Preferiblemente, después de inducir una respuesta inmunitaria en un sujeto, dicho sujeto está protegido de desarrollar una enfermedad tal como un cáncer o una enfermedad infecciosa o la condición de la enfermedad mejora induciendo una respuesta inmunitaria.

El término "inmunoterapia" se refiere a un tratamiento que implica preferiblemente una reacción inmunitaria específica y/o una función o funciones efectoras inmunitarias.

El término "inmunización" o "vacunación" describe el proceso de tratar a un sujeto por razones terapéuticas o profilácticas.

Los términos "sujeto", "paciente" o "individuo" se refieren a los vertebrados. Por ejemplo, los vertebrados en el contexto de la presente invención son mamíferos, aves (por ejemplo, aves de corral), reptiles, anfibios, peces óseos y peces cartilaginosos, en particular animales domesticados de cualquiera de los anteriores así como animales en cautiverio tales como animales de zoológicos, y preferiblemente son mamíferos. Los mamíferos en el contexto de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, humanos, primates no humanos, mamíferos domesticados, tales como perros, gatos, ovejas, vacas, cabras, cerdos, caballos, etc., mamíferos de laboratorio tales como ratones, ratas, conejos, cobayas, etc. así como mamíferos en cautiverio tal como mamíferos de zoológicos. El término "sujeto", como se usa en el presente documento, también incluye seres humanos.

Términos tales como "transferir", "transfectar" o "introducir en las células" se usan indistintamente en este documento y se refieren a la introducción de ácidos nucleicos, en particular ácidos nucleicos exógenos o heterólogos, en particular ARNmc en una célula. De acuerdo con la presente invención, la célula puede formar parte de un órgano, un tejido y/o un organismo.

Las composiciones farmacéuticas divulgadas en el presente documento se aplican generalmente en "cantidades farmacéuticamente aceptables" y en "preparaciones farmacéuticamente aceptables". El término "farmacéuticamente aceptable" se refiere a la no toxicidad de un material que no interactúa con la acción del agente o agentes activos de la composición farmacéutica.

De acuerdo con la presente invención, la administración de un ácido nucleico (tal como ARNmc) se consigue como ácido nucleico desnudo o en combinación con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. Preferiblemente, la administración de ácidos nucleicos se realiza en forma de ácidos nucleicos desnudos. Preferiblemente, el ARN se administra en combinación con sustancias estabilizantes tales como inhibidores de RNasa. La presente invención también prevé la introducción repetida de ácidos nucleicos en las células para permitir una expresión sostenida durante períodos de tiempo prolongados.

Las células se pueden transfectar con cualquier excipiente (en particular, portadores) con los que se pueda asociar el ARNmc, por ejemplo, formando complejos con el ARNmc o formando vesículas en las que el ARNmc está encerrado o encapsulado, lo que da como resultado una mayor estabilidad del ARNmc en comparación con el ARNmc desnudo. Los excipientes (en particular portadores) útiles de acuerdo con la invención incluyen, por ejemplo, vehículos que contienen lípidos tales como lípidos catiónicos, liposomas, en particular liposomas catiónicos y micelas y nanopartículas. Los lípidos catiónicos pueden formar complejos con ácidos nucleicos cargados negativamente. Se puede usar cualquier lípido catiónico de acuerdo con la invención. Además, las células pueden tomarse de un sujeto, las células pueden transfectarse con ARNmc o una composición farmacéutica de la invención, y las células transfectadas pueden insertarse en el sujeto.

Preferiblemente, la introducción del ARNmc que codifica un péptido o polipéptido en una célula, en particular en una célula presente in vivo, da como resultado la expresión de dicho péptido o polipéptido en la célula. En realizaciones particulares, se prefiere el direccionamiento de los ácidos nucleicos a células particulares. En tales realizaciones, un portador que se aplica para la administración del ácido nucleico a una célula (por ejemplo, un retrovirus o un liposoma) exhibe una molécula diana. Por ejemplo, una molécula tal como un anticuerpo que es específico para una proteína de membrana de superficie en la célula diana o un ligando para un receptor en la célula diana puede incorporarse al portador de ácido nucleico o puede unirse al mismo. En caso de que el ácido nucleico se administre mediante liposomas, las proteínas que se unen a una proteína de la membrana de la superficie que está asociada con la endocitosis pueden incorporarse en la formulación de liposomas para permitir el direccionamiento y/o la captación. Dichas proteínas abarcan proteínas de la cápside o fragmentos de las mismas que son específicas para un tipo celular particular, anticuerpos contra proteínas que están internalizadas, proteínas que se dirigen a una ubicación intracelular, etc.

El término "excipiente" cuando se usa en este documento pretende indicar todas las sustancias en una composición farmacéutica que no son agentes activos (por ejemplo, que son ingredientes terapéuticamente inactivos que no exhiben ningún efecto terapéutico en la cantidad/concentración utilizada), tales como, por ejemplo, sales, vehículos, aglutinantes, lubricantes, espesantes, agentes tensioactivos, agentes dispersantes, conservantes, emulsionantes, agentes de tamponamiento, agentes humectantes, agentes saborizantes, colorantes, agentes estabilizantes (tales como inhibidores de RNasa) o antioxidantes, todos los cuales son preferiblemente farmacéuticamente aceptables.

Las "sales farmacéuticamente aceptables" comprenden, por ejemplo, sales de adición de ácido que pueden, por ejemplo, formarse usando un ácido farmacéuticamente aceptable tal como ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, ácido fumárico, ácido maleico, ácido succínico, ácido acético, ácido benzoico, ácido cítrico, ácido tartárico, ácido carbónico o ácido fosfórico. Además, las sales farmacéuticamente aceptables adecuadas pueden incluir sales de metales alcalinos (por ejemplo, sales de sodio o potasio); sales de metales alcalinotérreos (por ejemplo, sales de calcio o magnesio); amonio (NH4+); y sales formadas con ligandos orgánicos adecuados (por ejemplo, amonio cuaternario y cationes amina formados usando contraaniones tales como haluro, hidróxido, carboxilato, sulfato, fosfato, nitrato, alquilsulfonato y arilsulfonato). Los ejemplos ilustrativos de sales farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, acetato, adipato, alginato, arginato, ascorbato, aspartato, bencenosulfonato, benzoato, bicarbonato, bisulfato, bitartrato, borato, bromuro, butirato, edetato de calcio, canforato, canforsulfonato, camsilato, carbonato, cloruro, citrato, clavulanato, ciclopentanopropionato, digluconato, dihidrocloruro, dodecilsulfato, edetato, edisilato, estolato, esilato, etanosulfonato, formiato, fumarato, galactato, galacturonato, gluceptato, glucoheptonato, gluconato, glutamato, glicerofosfato, glicolilarsanilato, hemisulfato, heptanoato, hexanoato, hexilresorcinato, hidrabamina, bromhidrato, clorhidrato, yodhidrato, 2-hidroxietanosulfonato, hidroxinaftoato, yoduro, isobutirato, isotionato, lactato, lactobionato, laurato, lauril sulfato, malato, maleato, malonato, mandelato, mesilato, metanosulfonato, metilsulfato, mucato, 2-naftalenosulfonato, napsilato, nicotinato, nitrato, sal de amonio de N-metilglucamina, oleato, oxalato, pamoato (embonato), palmitato, pantotenato, pectinato, persulfato, 3-fenilpropionato, fosfato/difosfato, ftalato, picrato, pivalato, poligalacturonato, propionato, salicilato, estearato, sulfato, suberato, succinato, tanato, tartrato, teoclato, tosilato, trietioduro, undecanoato, valerato y similares (véase, por ejemplo, SM Berge et al., Pharmaceutical Salts, J. Pharm. Sci., 66, págs. 1 - 19 (1977)). Las sales que no son farmacéuticamente aceptables pueden usarse para preparar sales farmacéuticamente aceptables y están incluidas en la invención.

Las composiciones de acuerdo con la presente invención pueden comprender un vehículo farmacéuticamente aceptable. Como se usa en el presente documento, "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción y similares que sean fisiológicamente compatibles. El "vehículo farmacéuticamente aceptable" puede estar en forma de sólido, semisólido, líquido o combinaciones de los mismos.

Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles, soluciones o dispersiones estériles no acuosas y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. El uso de tales medios y agentes para agentes farmacéuticamente activos es conocido en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el agente activo, se contempla su uso en las composiciones farmacéuticas de la invención. Los ejemplos de vehículos farmacéuticamente aceptables para una formulación inyectable incluyen agua, una solución salina tamponada isotónica (por ejemplo, Ringer o lactato de Ringer), etanol, polioles (por ejemplo, glicerol), polialquilenglicoles (por ejemplo, propilenglicol y polietilenglicol líquido), naftalenos hidrogenados y, en particular, polímeros de lactida biocompatibles (por ejemplo, copolímeros de lactida/glicólido o copolímeros de polioxietileno/polioxipropileno).

Los ejemplos de antioxidantes farmacéuticamente aceptables incluyen: (1) antioxidantes solubles en agua, tales como ácido ascórbico, clorhidrato de cisteína, bisulfato de sodio, metabisulfito de sodio, sulfito de sodio y similares; (2) antioxidantes solubles en aceite, tales como palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, galato de propilo, alfa-tocoferol y similares; y (3) agentes quelantes de metales, tales como ácido cítrico, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico y similares.

Los agentes de tamponamiento adecuados para su uso en las composiciones farmacéuticas de la invención incluyen ácido acético en una sal, ácido cítrico en una sal, ácido bórico en una sal y ácido fosfórico en una sal.

Los conservantes adecuados para usar en las composiciones farmacéuticas de la invención incluyen varios agentes antibacterianos y antifúngicos, tales como cloruro de benzalconio, clorobutanol, parabeno, ácido sórbico y timerosal. La prevención de la presencia de microorganismos también puede garantizarse mediante procedimientos de esterilización (por ejemplo, filtración para esterilización, en particular microfiltración para esterilización).

La composición farmacéutica divulgada en el presente documento puede administrarse a un individuo por cualquier vía, preferiblemente por vía parenteral. Las expresiones "administración parenteral" y "administrado por vía parenteral" como se usan en este documento significan modos de administración distintos de la administración enteral ("administración enteral" y "administrado por vía enteral" como se usan en este documento significan que el fármaco administrado es absorbido por el estómago y/o el intestino). La administración parenteral suele ser por inyección y/o infusión e incluye, sin limitación, administración intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraósea, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, intracerebral, intracerebroventricular, subaracnoidea, intraespinal, epidural intraesternal y tópica.

El ARNmc o la composición farmacéutica de la presente invención se puede administrar mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica. Como apreciará el experto en la técnica, la vía y/o el modo de administración variarán dependiendo de los resultados deseados.

Los agentes activos (es decir, el ARNmc de la invención y opcionalmente uno o más compuestos activos adicionales/suplementarios) se pueden preparar con vehículos que protegerán a los compuestos contra la liberación rápida, tal como una formulación de liberación controlada, que incluye implantes, parches transdérmicos y sistemas de liberación microencapsulados. Se pueden usar polímeros biodegradables y biocompatibles, tales como etileno acetato de vinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Los métodos para la preparación de tales formulaciones son generalmente conocidos por los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1978.

Para administrar el agente activo (es decir, el ARNmc de la invención y opcionalmente uno o más compuestos activos adicionales/suplementarios) por determinadas vías de administración, puede ser necesario recubrir el agente activo con, o coadministrar el compuesto con, un material para prevenir su inactivación y/o aumentar la eficacia del agente activo (en particular el ARNmc de la invención) que se va a traducir. Por ejemplo, el agente activo se puede administrar a un individuo en un vehículo apropiado, por ejemplo, vehículos que contienen lípidos (en particular lípidos catiónicos), liposomas (tales como emulsiones de CGF de agua en aceite en agua así como liposomas (Strejan et al., J. Neuroimmunol. 7: 27 (1984)), en particular liposomas catiónicos), micelas, nanopartículas en las que el ARNmc está incluido o encapsulado, o un diluyente. Los diluyentes farmacéuticamente aceptables incluyen soluciones tamponadas salinas y acuosas.

Las composiciones farmacéuticas típicamente deben ser estériles y estables en las condiciones de fabricación y almacenamiento. La composición se puede formular como una solución, microemulsión, liposoma u otra estructura ordenada adecuada para una alta concentración de fármaco. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares), mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales, tales como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables, tales como oleato de etilo. La fluidez adecuada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un material de revestimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y mediante el uso de tensioactivos. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes como manitol, sorbitol o cloruro de sodio en la composición farmacéutica. Puede conseguirse una absorción prolongada de las composiciones inyectables incluyendo en la composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina.

Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el agente activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son el secado al vacío y el secado por congelación (liofilización) que producen un polvo del agente activo más cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una solución previamente esterilizada filtrada del mismo.

Los regímenes de dosificación se ajustan para proporcionar la respuesta óptima deseada (por ejemplo, una respuesta terapéutica). Por ejemplo, se puede administrar un solo bolo, se pueden administrar varias dosis divididas a lo largo del tiempo o la dosis se puede reducir o aumentar proporcionalmente de acuerdo con lo indiquen las exigencias de la situación terapéutica. Es especialmente ventajoso formular composiciones farmacéuticas en forma de dosificación unitaria para facilitar la administración y uniformidad de la dosificación. La forma de dosificación unitaria, como se usa en este documento, se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas tal como dosis unitarias para los individuos a tratar; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de agente activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. La memoria descriptiva de las formas de dosificación unitaria de la invención está dictada y depende directamente de (a) las características únicas del agente activo y el efecto terapéutico particular que se pretende lograr, y (b) las limitaciones inherentes a la técnica de la preparación de compuestos de este tipo tal como un agente activo para el tratamiento de la sensibilidad en individuos. La cantidad de agente activo (en particular, la cantidad del ARNmc) que se puede combinar con un material portador para producir una composición farmacéutica (tal como una forma de dosificación única) variará dependiendo del individuo que se esté tratando y el modo particular de administración. La cantidad de agente activo que se puede combinar con un material portador para producir una única forma de dosificación será generalmente la cantidad de la composición que produce un efecto terapéutico.

Generalmente, del 100% (para las formulaciones/composiciones farmacéuticas), la cantidad de agente activo (en particular, la cantidad del ARNmc de la presente invención, opcionalmente junto con uno o más compuestos activos adicionales/suplementarios, si están presentes en el formulaciones/composiciones farmacéuticas) variará de aproximadamente 0,01% a aproximadamente 99%, preferiblemente de aproximadamente 0,1% a aproximadamente 70%, más preferiblemente de aproximadamente 1% a aproximadamente 30%, en el que el resto se compone preferiblemente de uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.

La cantidad de agente activo, por ejemplo, un ARNmc de la invención, en una forma de dosificación unitaria y/o cuando se administra a un individuo o se usa en terapia, puede variar de aproximadamente 0,001 mg a aproximadamente 1.000 mg (por ejemplo, de aproximadamente 0,01 mg a aproximadamente 500 mg, de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 100 mg, tal como de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 50 mg) por unidad, administración o terapia. En determinadas realizaciones, se puede calcular una cantidad adecuada de dicho agente activo utilizando la masa o el área de superficie corporal del individuo, incluidas cantidades de entre aproximadamente 0,1 mg/kg y 10 mg/kg (por ejemplo, entre aproximadamente 0,2 mg/kg y 5 mg/kg), o entre aproximadamente 0,1 mg/m2 y aproximadamente 400 mg/m2 (tal como entre aproximadamente 0,3 mg/m2 y aproximadamente 350 mg/m2 o entre aproximadamente 1 mg/m2 y aproximadamente 200 mg/m2).

Independientemente de la vía de administración seleccionada, los agentes activos (es decir, el ARNmc y opcionalmente uno o más compuestos activos adicionales/suplementarios), que pueden usarse en una forma hidratada adecuada, y/o las composiciones farmacéuticas de la presente invención, se formulan en formas de dosificación farmacéuticamente aceptables mediante métodos convencionales conocidos por los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Remington, "The Science and Practice of Pharmacy" editado por Allen, Loyd V., Jr., decimosegunda edición. Pharmaceutical Sciences, septiembre de 2012; Ansel et al., "Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems", séptima edición, Lippincott Williams & Wilkins Publishers, 1999).

Los niveles de dosificación reales de los agentes activos en las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden variar para obtener una cantidad del agente activo que sea eficaz para lograr la respuesta terapéutica deseada para un paciente particular, composición y modo de administración, sin que sea tóxico para el paciente. El nivel de dosificación seleccionado dependerá de una variedad de factores farmacocinéticos que incluyen la actividad de las composiciones particulares empleadas de la presente invención, la vía de administración, el tiempo de administración, la velocidad de excreción del agente activo particular que se está empleando, la duración del tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o materiales usados en combinación con las composiciones particulares empleadas, la edad, sexo, peso, condición, estado general de salud e historial médico previo del paciente que está siendo tratado, y factores similares bien conocidos en las técnicas médicas.

Un médico o veterinario que tenga una experiencia normal en la técnica puede determinar y prescribir fácilmente la cantidad eficaz de la composición farmacéutica requerida. Por ejemplo, el médico o veterinario podría comenzar con dosis de los agentes activos empleados en la composición farmacéutica en niveles inferiores a los requeridos para lograr el efecto terapéutico deseado y aumentar gradualmente la dosis hasta lograr el efecto deseado. En general, una dosis diaria adecuada de una composición farmacéutica de la invención será la cantidad del agente activo que sea la dosis más baja eficaz para producir un efecto terapéutico. Una dosis tan eficaz dependerá generalmente de los factores descritos anteriormente. Se prefiere que la administración sea parenteral, tal como intravenosa, intramuscular, intraperitoneal o subcutánea, preferiblemente administrada proximal al sitio objetivo. La administración también puede ser intratumoral. Si se desea, la dosis diaria eficaz de una composición farmacéutica se puede administrar como dos, tres, cuatro, cinco, seis o más subdosis administradas por separado a intervalos apropiados a lo largo del día, opcionalmente, en formas de dosificación unitaria. Si bien es posible que un agente activo (en particular ARNm) de la presente invención se administre solo, es preferible administrar el agente activo como una formulación/composición farmacéutica.

En una realización, el ARNmc o las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden administrar mediante infusión, preferiblemente infusión continua lenta durante un período prolongado, tal como más de 24 horas, con el fin de reducir los efectos secundarios tóxicos. La administración también puede realizarse mediante infusión continua durante un período de 2 a 24 horas, tal como de 2 a 12 horas. Dicho régimen puede repetirse una o más veces según sea necesario, por ejemplo, después de 6 meses o 12 meses.

La composición farmacéutica de la invención puede formularse para administración parenteral mediante inyección, por ejemplo, mediante inyección en bolo o infusión continua. Las formulaciones para inyección se pueden presentar en forma de dosificación unitaria (por ejemplo, en ampollas, en envases multidosis) y con un conservante añadido. La composición farmacéutica de la invención puede tomar formas tales como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos aceitosos o acuosos, y puede contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilizantes o dispersantes. Alternativamente, el agente puede estar en forma de polvo para reconstituirlo con un vehículo adecuado (por ejemplo, agua estéril sin pirógenos) antes de su uso. Normalmente, las composiciones farmacéuticas para administración intravenosa son soluciones en tampón acuoso isotónico estéril. Cuando sea necesario, la composición farmacéutica también puede incluir un agente solubilizante y un anestésico local como lidocaína para aliviar el dolor en el lugar de la inyección. Generalmente, los ingredientes se suministran por separado o mezclados juntos en forma de dosificación unitaria, por ejemplo, como un polvo liofilizado seco o concentrado libre de agua en un recipiente herméticamente cerrado como una ampolla o bolsita que indica la cantidad de agente activo. Cuando la composición farmacéutica se va a administrar por infusión, se puede dispensar con una botella de infusión que contenga agua o solución salina estéril de calidad farmacéutica. Cuando la composición se administra mediante inyección, se puede proporcionar una ampolla de agua estéril para inyección o solución salina para que los ingredientes se puedan mezclar antes de la administración.

Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar con dispositivos médicos conocidos en la técnica. Por ejemplo, en una realización preferida, una composición farmacéutica de la invención se puede administrar con un dispositivo de inyección hipodérmica sin aguja, tal como los dispositivos descritos en los documentos US 5.399.163; US 5.383.851; US 5.312.335; US 5.064.413; US 4.941.880; US 4.790.824; o US 4.596.556. Ejemplos de implantes y módulos bien conocidos útiles en la presente invención incluyen los descritos en los documentos: US 4.487.603, que describe una bomba de microinfusión implantable para dispensar la medicación a una velocidad controlada; el documento US 4.486.194, que describe un dispositivo terapéutico para administrar medicamentos a través de la piel; el documento US 4.447.233, que describe una bomba de infusión de medicación para administrar la medicación a una velocidad de infusión precisa; el documento US 4.447.224, que describe un aparato de infusión implantable de flujo variable para la administración continua de fármacos; el documento US 4.439.196, que describe un sistema osmótico de administración de fármacos que tiene compartimentos de múltiples cámaras; y el documento US 4.475.196, que describe un sistema de administración de fármacos osmóticos.

Los expertos en la técnica conocen muchos otros implantes, sistemas de administración y módulos de este tipo. En determinadas realizaciones, las composiciones farmacéuticas o ARNmc de la invención pueden formularse para asegurar una distribución adecuada in vivo. Por ejemplo, la barrera hematoencefálica (BBB) excluye muchos compuestos altamente hidrófilos. Para asegurar que el ARNmc o las composiciones farmacéuticas de la invención crucen la BBB (si se desea), se pueden formular, por ejemplo, en liposomas. Para métodos de fabricación de liposomas, véanse, por ejemplo, los documento US 4.522.811; US 5.374.548; y US 5.399.331. Los liposomas pueden comprender una o más fracciones que se transportan selectivamente a células u órganos específicos y, por tanto, potencian la administración dirigida de fármacos (véase, por ejemplo, V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29: 685). Los ejemplos de fracciones de direccionamiento incluyen folato o biotina (véase, por ejemplo, el documento US 5.416.016 de Low et al.); manósidos (Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153: 1038); anticuerpos (P.G. Bloeman et al., (1995) FEBS Lett. 357: 140; M. Owais et al., (1995) Antimicrob. Agents Chemother.

39: 180); y receptor de proteína A tensioactivo (Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233: 134).

El ARNmc divulgado en el presente documento se puede formular en liposomas. En una realización más preferida, los liposomas incluyen una fracción de direccionamiento. En una realización más preferida, el ARNmc en los liposomas se administra mediante inyección en bolo en un sitio próximo al área deseada. Dicha composición basada en liposomas debe ser fluida en la medida en que pueda salir fácilmente de la jeringa, debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe conservarse frente a la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos.

Una "dosis terapéuticamente eficaz" para el tratamiento se puede medir mediante respuestas objetivas que pueden ser completas o parciales. Una respuesta completa (RC) se define como ninguna evidencia clínica, radiológica o de otro tipo de una afección, trastorno o enfermedad. Una respuesta parcial (RP) resulta de una reducción de la enfermedad de más del 50%. El tiempo medio hasta la progresión es una medida que caracteriza la durabilidad de la respuesta objetiva.

Una "dosis terapéuticamente eficaz" para el tratamiento también se puede medir por su capacidad para estabilizar la progresión de una afección, trastorno o enfermedad, por ejemplo, utilizando sistemas de modelos animales apropiados y/o ensayos in vitro conocidos por el experto. Una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente activo se refiere a la cantidad que logra una reacción deseada o un efecto deseado sola o junto con dosis adicionales. En el caso del tratamiento de una enfermedad particular o de una afección particular, la reacción deseada se refiere preferiblemente a la inhibición del curso de la enfermedad. Esto comprende ralentizar el progreso de la enfermedad y, en particular, interrumpir o revertir el progreso de la enfermedad. La reacción deseada en un tratamiento de una enfermedad o de una afección también puede ser un retraso del inicio o una prevención del inicio de dicha enfermedad o dicho estado. Por tanto, una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente activo puede curar, sanar, aliviar, mitigar, alterar, remediar, mejorar, curar o afectar la afección, trastorno o enfermedad o los síntomas de la afección, trastorno o enfermedad o la predisposición a la afección, trastorno o enfermedad en un individuo. Un experto en la materia sería capaz de determinar tales cantidades basándose en factores tales como la enfermedad, trastorno o afección a tratar, la gravedad de la enfermedad, trastorno o afección, los parámetros del individuo a tratar (incluida la edad), condición fisiológica, tamaño y peso), la duración del tratamiento, el tipo de terapia acompañante (si está presente), la vía específica de administración y factores similares. Por consiguiente, las dosis administradas de los agentes activos descritos en este documento pueden depender de varios de dichos parámetros. En el caso de que una reacción en un individuo/paciente sea insuficiente con una dosis inicial, se pueden usar dosis más altas (o dosis efectivamente más altas logradas por una vía de administración diferente, más localizada).

La composición farmacéutica divulgada en el presente documento puede tomar la forma de una preparación de vacuna que comprende ARNmc de la invención y al menos un antígeno tal como un antígeno como se discutió anteriormente o un fragmento del mismo (en particular un fragmento inmunogénico del mismo), o un ácido nucleico, en particular ARN, que codifica dicho antígeno o fragmento.

La composición farmacéutica de la invención también puede, si se desea, presentarse en un empaque, kit o dispositivo dispensador que puede contener una o más formas de dosificación unitarias que contienen el agente activo (es decir, el ARNmc y opcionalmente uno o más compuestos activos adicionales/suplementarios). El empaque puede comprender, por ejemplo, una hoja de metal o plástico, tal como un blíster. El empaque, kit o dispositivo dispensador puede ir acompañado de instrucciones para la administración.

El uno o más compuestos activos adicionales/suplementarios pueden comprender un agente inmunomodulador tal como reactivos anti-CTL-A4 o anti-PDI o anti-PDLI o anti-reguladores de células T tales como un anticuerpo anti-CD25 o ciclofosfamida.

Las composiciones farmacéuticas divulgadas en el presente documento pueden administrarse junto con sustancias complementarias que mejoran la inmunidad tales como uno o más adyuvantes y pueden comprender una o más sustancias que mejoran la inmunidad para aumentar aún más su eficacia, preferiblemente para lograr un efecto sinérgico de inmunoestimulación.

El término "adyuvante" se refiere a compuestos que prolongan, potencian o aceleran una respuesta inmunitaria. A este respecto, son posibles varios mecanismos, dependiendo de los diversos tipos de adyuvantes. Por ejemplo, compuestos que permitan la maduración de las CD, por ejemplo, lipopolisacáridos o ligando CD40, forman una primera clase de adyuvantes adecuados. Generalmente, cualquier agente que influya en el sistema inmunológico del tipo de una "señal de peligro" (LPS, GP96, ARNbc, etc.) o citocinas, tales como GM-CSF, puede usarse como adyuvante que permita intensificar una respuesta inmunitaria y/o influenciar de manera controlada. Opcionalmente, también se pueden usar oligodesoxinucleótidos CpG en este contexto, aunque deben considerarse sus efectos secundarios que se producen en determinadas circunstancias, como se explicó anteriormente. En caso de que el ARNmc (preferiblemente ARNm) de la invención en una realización pueda codificar un agente inmunoestimulante y dicho agente inmunoestimulante codificado por dicho ARNmc actúe como el inmunoestimulante primario, sin embargo, solo se necesita una cantidad relativamente pequeña de ADN con CpG (en comparación con inmunoestimulación con solo ADN con CpG). Los adyuvantes particularmente preferidos son citocinas, tales como monoquinas, linfocinas, interleucinas o quimiocinas, por ejemplo, IL-1, 1L-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IFN-a, IFN-y, GM-CSF, LT -a o factores de crecimiento, por ejemplo hGH. Los lipopéptidos, tales como Pam3Cys, también son adecuados para su uso como adyuvantes en las composiciones farmacéuticas de la presente invención.

El tratamiento se puede proporcionar en el hogar, en el consultorio del médico, en una clínica, en el departamento para pacientes ambulatorios de un hospital o en un hospital. El tratamiento generalmente comienza bajo supervisión médica para que el personal médico pueda observar de cerca los efectos del tratamiento y hacer los ajustes necesarios. La duración del tratamiento depende de la edad y el estado del paciente, así como de cómo responde el paciente al tratamiento.

Una persona que tenga un mayor riesgo de desarrollar una afección, trastorno o enfermedad puede recibir tratamiento profiláctico para inhibir o retrasar los síntomas de la afección, trastorno o enfermedad.

El término "tratamiento" es conocido por el experto en la materia e incluye la aplicación o administración de un agente activo (por ejemplo, una composición farmacéutica que contiene dicho agente activo) o un procedimiento a un individuo/paciente o la aplicación o administración de un agente activo (por ejemplo, una composición farmacéutica que contiene dicho agente activo) o procedimiento a una célula, cultivo celular, línea celular, muestra, tejido u órgano aislado de un sujeto, que tiene una afección, trastorno o enfermedad, un síntoma de la afección, trastorno o enfermedad o predisposición a una afección, trastorno o enfermedad, con el propósito de curar, curar, sanar, aliviar, alterar, remediar, mejorar, curar, afectar o prevenir la afección, trastorno o enfermedad, los síntomas de la afección, trastorno o enfermedad o la predisposición a la afección, trastorno o enfermedad (por ejemplo, para prevenir o eliminar una enfermedad, incluida la reducción del tamaño de un tumor o la cantidad de tumores en un sujeto; detener o retrasar una enfermedad en un sujeto; inhibir o retrasar el desarrollo de una nueva enfermedad en un sujeto; disminuir la frecuencia o gravedad de los síntomas y/o las recurrencias en un sujeto que actualmente tiene o que ha tenido una enfermedad anteriormente; y/o prolongar, es decir, aumentar la vida útil del sujeto). En particular, el término "tratamiento de una enfermedad" incluye curar, acortar la duración, mejorar, prevenir, ralentizar o inhibir la progresión o empeoramiento, o prevenir o retrasar la aparición de una enfermedad o los síntomas de la misma. Por tanto, el término "tratamiento" puede incluir el tratamiento profiláctico de una afección, trastorno o enfermedad, o el síntoma de una afección, trastorno o enfermedad. Un agente activo, cuando se usa en el tratamiento, incluye el ARNmc de la invención así como el uno o más compuestos activos adicionales/suplementarios descritos en este documento e incluye, pero no se limita a, otros compuestos terapéuticamente activos que pueden ser moléculas pequeñas, péptidos, peptidomiméticos, polipéptidos/proteínas, anticuerpos, otros polinucleótidos tales como ADN o ARNbc, células, virus, ribozimas y oligonucleótidos antisentido.

La presente invención se ilustra mediante los siguientes ejemplos que ilustran realizaciones preferidas de la invención y no debe interpretarse como limitantes del alcance de la presente invención tal como se define en las reivindicaciones. Los ejemplos que no están cubiertos por las reivindicaciones adjuntas se presentan solo con fines comparativos.

Ejemplos

Abreviaturas

EtOH: etanol

h: hora(s)

hPa: hectopascal

min: minuto(s)

mM: milimolar (10‘3 mol/l)

MPa: mega pascal

nt: nucleótido(s)

seg.: segundo(s)

v/v: % en volumen

Procedimientos experimentales

Purificación por celulosa del ARN TIV

A menos que se indique lo contrario, se usó polvo de celulosa que consistía en fibras de tamaño mediano (Sigma-Aldrich, cat. # C6288) y tampón STE 1x (TRIS 10 mM, pH 7,0, NaCl 50 mM, EDTA 20 mM) para los procedimientos de purificación. Todos los experimentos fueron realizados a temperatura ambiente.

Procedimiento de purificación "negativa"

El procedimiento de purificación "negativa" se basa en la incubación del ARN TIV con celulosa en tampón STE 1x que contiene EtOH al 16%. Esta condición permite la unión selectiva del ARNbc a la celulosa mientras que el ARNmc permanece en la fracción soluble.

La celulosa se suspendió primero en tampón STE 1x que contenía EtOH al 16% (v/v) a una concentración de 0,2 g de celulosa/ml y se incubó durante 10 min con agitación vigorosa. Después de centrifugar durante 5 min a 4.000 x g, la celulosa se resuspendió en tampón STE 1x que contenía EtOH al 16% (v/v) a una concentración de 0,2 g de celulosa/ml (celulosa lavada).

Para los experimentos de extracción, se transfirieron 500 pl de suspensión de celulosa lavada a un tubo de 1,5 ml y se centrifugó durante 5 min a 14.000 x g. Después de la eliminación del sobrenadante, se añadieron a la celulosa 50 |jg del ARN TIV en 100 j l de tampón STE 1x que contenía EtOH al 16% (v/v) y se incubó durante 15 min con agitación vigorosa. Después de centrifugar durante 5 min a 14.000 x g, se eliminó el sobrenadante y se precipitaron los ácidos nucleicos. Después, la celulosa se incubó durante 15 min con 100 pl de tampón STE 1x que no contenía EtOH bajo agitación vigorosa para liberar los ácidos nucleicos unidos. Después de centrifugar durante 5 min a 14.000 x g, se eliminó el sobrenadante y se precipitaron los ácidos nucleicos eluidos.

Para la purificación con celulosa utilizando columnas de centrifugación de microcentrífuga (filtros NucleoSpin, Macherey-Nagel, cat. # 740606), se transfirieron 600 j l de suspensión de celulosa previamente lavada (0,12 g de celulosa) a una columna de centrifugación y se centrifugó durante 60 segundos a 14.000 x g. Se descartó el flujo de salida y se añadieron 500 pl de tampón STE 1x que contenía EtOH al 16% (v/v) a la columna de centrifugación y se incubó durante 5 min con agitación vigorosa para resuspender la celulosa. Después de centrifugar durante 60 segundos a 14.000 x g, se descartó el flujo de salida y se añadió ARN TIV (50-500 jg ) en 300-500 pl de tampón STE 1x que contenía EtOH al 16% (v/v) a la columna de centrifugación y se incubó durante 20 min bajo agitación vigorosa para resuspender la celulosa. Después, la columna de centrifugación se centrifugó durante 60 segundos a 14.000 x g y el flujo de salida se recogió para la precipitación del ácido nucleico. Cuando se realizaron múltiples ciclos de purificación con celulosa, el flujo de salida se transfirió directamente a una columna de centrifugación de celulosa recién preparada y se repitió el procedimiento. Finalmente, mediante la adición de 300-500 j l de tampón STE 1x, los ácidos nucleicos unidos a la celulosa se liberaron durante la incubación durante 20 min con agitación vigorosa y centrifugación de la columna de centrifugación durante 60 segundos a 14.000 x g.

El escalamiento del proceso de purificación se realizó en tubos de 50 ml usando 1,5 g de celulosa y 5 mg del ARN TIV en 15 ml de tampón STE 1x que contenía EtOH al 16% (v/v). El ARN se añadió a la celulosa seca y se incubó con agitación magnética durante 30 min. Los ácidos nucleicos no unidos se recuperaron mediante filtración usando un dispositivo filtrante desechable accionado por vacío (Steriflip-HV, tamaño de poro de 0,45 pm, PVDF, Merck Chemicals GmbH/Millipore, cat. # SE1M003M00). Cuando se indicó, el filtrado se utilizó para un segundo ciclo de purificación añadiendo 1,5 g de celulosa fresca y repitiendo el proceso. Finalmente, los ácidos nucleicos en el filtrado se precipitaron añadiendo un volumen igual de isopropanol.

Procedimiento de purificación "positiva"

El principio del procedimiento de purificación "positiva" es unir primero todo el ARN a la celulosa mediante la incubación del ARN TIV con celulosa en tampón STE 1x que contenía EtOH al 40%. En una segundo etapa, el ARNmc se libera selectivamente mediante incubación en tampón STE 1x que contiene EtOH al 16%, mientras que bajo estas condiciones el ARNbc permanece unido a las fibras de celulosa.

Antes de su uso, la celulosa se suspendió en tampón STE 1x que contenía EtOH al 40% (v/v) a una concentración de 0,2 g de celulosa/ml y se incubó durante 10 min con agitación vigorosa. Después de centrifugar durante 5 min a 4.000 x g, la celulosa se resuspendió en tampón STE 1x que contenía EtOH al 40% (v/v) a una concentración de 0,2 g de celulosa/ml (celulosa lavada).

Para la purificación con celulosa utilizando columnas de centrifugación de microcentrífuga (filtros NucleoSpin, Macherey-Nagel, cat. # 740606), se transfirieron 600 pl de suspensión de celulosa lavada (0,12 g de celulosa) a una columna de centrifugación y se centrifugaron durante 60 segundos a 14.000 x g. Se descartó el flujo de salida y se añadieron 500 pl de tampón STE 1x que contenía EtOH al 40% (v/v) a la columna de centrifugación y se incubó durante 5 min con agitación vigorosa para resuspender la celulosa. Después de centrifugar a 14.000 x g durante 60 segundos, se descartó el flujo de salida y se añadió ARN TIV (50-500 pg) en 300-500 pl de tampón STE 1x que contenía EtOH al 40% (v/v) a la columna de centrifugación y se incubó durante 20 min. bajo vigorosa agitación para resuspender la celulosa. Después, la columna de centrifugación se centrifugó a 14.000 x g durante 60 segundos y el flujo de salida se recogió para la precipitación del ácido nucleico. Mediante la adición de 300-500 pl de tampón STE 1x que contenía EtOH al 16% (v/v), se liberó el ARNmc de la celulosa durante la incubación durante 20 min con agitación vigorosa y centrifugación de la columna de centrifugación durante 60 segundos a 14.000 x g. Cuando se realizaron múltiples ciclos de purificación con celulosa, el flujo de salida se transfirió directamente a una columna de centrifugación de celulosa recién preparada y se repitió el procedimiento. Finalmente, mediante la adición de 300-500 pl de tampón STE 1x, los ácidos nucleicos unidos a celulosa se liberaron durante la incubación durante 20 min con agitación vigorosa y centrifugación de la columna de centrifugación durante 60 segundos a 14.000 x g.

Para FPLC usando celulosa como fase estacionaria, primero se preparó una suspensión de celulosa (0,2 g/ml) en tampón STE 1x que contenía EtOH al 40% (v/v) y se agitó durante 30 min. Se usaron 20 ml de esta suspensión (4 g de celulosa) para empaquetar una columna XK 16/20 (GE Healthcare Life Sciences, Cat # 28-9889-37). El lecho de la columna tenía una altura final de aproximadamente 5 cm. La cromatografía se realizó usando un sistema AKTA Avant 25 (GE Healthcare Life Sciences) y monitoreando la absorbancia de UV (260 nm). Como tampón de unión se usó tampón STE 1x que contenía EtOH al 40% (v/v) (tampón B) y como tampón de elución se uso tampón STE 1x (tampón A). La columna se equilibró durante 15 min con tampón B al 100% a un caudal de 2 ml/min. Después de la inyección de 500 pg de ARN (volumen de muestra: 500 pl), el caudal se redujo a 1 ml/min durante 40 min. El ARNmc se eluyó usando tampón B al 40% (EtOH al 1% (v/v)) durante 40 min a un caudal de 2 ml/min. Finalmente, cambiando la composición del tampón a tampón B al 0% (EtOH al 0%), se eluyó el ARNbc de la columna. Se recogieron los picos cromatográficos y se precipitaron los ácidos nucleicos para su posterior análisis.

Precipitación de ácidos nucleicos con isopropanol

El ARN obtenido de las purificaciones de celulosa se precipitó añadiendo 0,1 volúmenes de acetato de sodio 3 M (pH 4,0) y 1 volumen de isopropanol. Después de agitar con vórtice, las muestras se incubaron durante 1 h a -20 °C seguido de centrifugación durante 10 min a 14.000 x g. El sedimento del ARN se lavó con 200 pl de EtOH al 70% (v/v) enfriado con hielo, se secó al aire y se disolvió en un volumen adecuado de H2O libre de nucleasas. Las concentraciones del ARN se midieron espectrofotométricamente utilizando el sistema Nanodrop (Eppendorf).

Análisis de transferencia de puntos

Para determinar la cantidad de contaminantes híbridos del ARNbc y ARN-ADN, se prepararon diluciones seriadas de muestras del ARN con diferentes concentraciones y se colocaron (0,5 pl) y cantidades crecientes del ARN (generalmente 40 ng, 200 ng y 1.000 ng) en una membrana de nailon para transferencia (Membrana de nailon transferencia Nytran SuPerCharge (SPC) (GE Healthcare Life Sciences, cat. # 10416216)). Después, la membrana se bloqueó durante 1 hora en tampón Tb S-T (TRIS 20 mM pH 7,4, NaCl 137 mM, TWEEN-20 al 0,1% (v/v)) que contenía leche desnatada en polvo al 5% (p/v). Para la detección del ARNbc, la membrana se incubó durante 1 h con mAb de ratón específico de ARNbc de J2 (English & Scientific Consulting, Szirak, Hungría) diluido en una proporción de 1: 10.000 en tampón TBS-T que contenía leche desnatada en polvo al 1% (p/v). Donde se indica se diluyó mAb IgG2a S 9.6 de ratón específico del híbrido de ARN-ADN (KeraFAST, cat. # ENH001) en una proporción de 1: 10.000 para detectar los contaminantes híbridos de ARN-ADN. Después de lavar con TBS-T, la membrana se incubó durante 1 hora con IgG de burro anti-ratón conjugado con HRP (Jackson ImmunoResearch, cat. # 715-035-150) diluido en una proporción de 1:10.000 en tampón TBS-T que contenía leche desnatada en polvo al 1% p/v, lavada con TBS-T y revelada con el reactivo de detección de transferencia Western Amersham ECL Prime (Fisher Scientific, cat. # RPN2232) y el sistema de obtención de imágenes ChemiDoc MP (BIO-RAD). Donde se indica, las intensidades de la señal de hibridación se cuantificaron mediante densitometría utilizando el software Image Lab 5.1 (BIO-RAD).

Electroforesis en gel de agarosa

Para controlar la integridad de los ARN purificados y verificar las cantidades cargadas en las transferencias de puntos, se utilizó electroforesis en gel de agarosa. Se analizaron cantidades iguales del ARN (por ejemplo, 2 j l) de la dilución del ARN en serie de 40 ng/jl preparada para transferencia de puntos. Las muestras del a Rn se desnaturalizaron de acuerdo con Masek et al. (Anal. Biochem. 336 (2005), 46-50) mezclando 2 j l del ARN (80 ng) con 6 j l de formamida e incubando durante 5 min a 65 °C antes de cargarlo en un gel de agarosa al 1,4% (p/v) que contenía tinción en gel de ácido nucleico GelRedMR al 0,005% (v/v) (Biotium Inc., cat. #41003). La electroforesis se realizó a 100 V durante 20 min usando TAE (acetato de TRIS 40 mM, EDTA 1 mM) como tampón de procesamiento seguido de formación de imágenes del gel usando el sistema Gel DocMR EZ Imager (BIO-RAD).

Ejemplo 1 - Extracción del ARNbc del ARN TIV usando celulosa

Para probar la viabilidad de aplicar celulosa para eliminar los contaminantes del ARNbc del ARN TIV, primero se realizó un simple experimento de extracción. Se incubaron 50 |jg de un ARN TIV modificado con N1-metilpseudouridina (m 1^) de 2.500 nt de longitud, que se purificó previamente mediante precipitación con cloruro de litio (LiCl) de la reacción de TIV, con 0,1 g de celulosa en presencia de tampón STE 1x que contenía EtOH al 16% (v/v). Después de la centrifugación, se precipitó el ARN no unido en el sobrenadante. El ARN unido a celulosa se recuperó mediante resuspensión de la celulosa en STE 1x que no contenía EtOH, centrifugación y precipitación del sobrenadante. El contenido del ARNbc del ARN de ambas fracciones, así como del material del a Rn de partida, se analizó mediante transferencia de puntos utilizando el anticuerpo J2 específico del ARNbc. La integridad de los ARN se controló mediante electroforesis en gel de agarosa.

El análisis de transferencia de puntos muestra que, en comparación con el ARN TIV de entrada sin tratar, el contenido del ARNbc en la fracción del ARN no unido después de la incubación con celulosa se reduce fuertemente (Fig. 1). Esto se debe a la unión selectiva del ARNbc contaminante al material de celulosa en presencia de EtOH al 16% (v/v) que permita la separación del ARNbc del ARNmc por sedimentación de la celulosa. Después de la separación, los contaminantes del ARNbc se pueden liberar de la celulosa utilizando un tampón que no contiene EtOH. Esto se confirma al demostrar cantidades significativas del ARN reactivo con J2 en la fracción del ARN unido (Fig. 1). Además, la electroforesis del ARN demuestra que la integridad del ARN se conserva durante este procedimiento de purificación con celulosa. Este ejemplo demuestra el uso exitoso de la celulosa para eliminar los contaminantes del ARNbc del ARN TIV.

Ejemplo 2 - Impacto de diferentes concentraciones de EtOH en la eficiencia de la eliminación del ARNbc del ARN TIV mediante celulosa

En una etapa siguiente, se adaptó el método de purificación descrito anteriormente (véase el Ejemplo 1) para usar columnas de centrifugación de microcentrífugas para separar el ARN no unido de la celulosa. La ventaja de esta técnica es la eliminación completa del líquido y, por lo tanto, del ARN no unido de la celulosa mediante centrifugación. Además, se probó si el aumento de la concentración de EtOH durante la incubación del ARN TIV con celulosa hasta el 18% (v/v) o el 20% (v/v) aumentará la eficiencia de la eliminación del ARNbc. En primer lugar, se incubaron 50 jg del ARN TIV modificado con pseudouridina (^ ) de 1.500 nt de longitud y con caperuza de D2, que se purificó previamente a partir de la reacción de TIV mediante perlas magnéticas, en una columna de centrifugación de microcentrífuga con 0,1 g de celulosa en presencia de tampón STE 1x que contenía EtOH al 16% (v/v), 18% (v/v) o 20% (v/v). Después de la centrifugación, se recogió el ARN no unido mediante centrifugación de la columna y se precipitó. El ARN unido a celulosa se recuperó añadiendo STE 1x que no contenía EtOH a la columna, resuspensión de la celulosa mediante agitación vigorosa y finalmente centrifugación y precipitación. El contenido del ARNbc del ARN de ambas fracciones, así como del material del ARN de partida, se analizó mediante transferencia de puntos utilizando el anticuerpo J2 específico del ARNbc. Se cargó una segunda membrana con las mismas cantidades de las diferentes fracciones del ARN y se hibridó con el anticuerpo S 9.6 específico del híbrido del ARN y ADN para probar si estos contaminantes del ARN TIV también pueden eliminarse mediante purificación con celulosa.

En comparación con el ARN TIV no purificado, el contenido del ARNbc en todas las fracciones del ARN no unidas (flujo de salida) se reduce fuertemente después de la incubación con celulosa (Fig. 2). Sin embargo, la cantidad de híbridos del ARN/ADN en estas fracciones solo disminuye ligeramente, lo que demuestra que los híbridos del ARN/ADN no se unen eficazmente a la celulosa en las condiciones analizadas y, por lo tanto, no se pueden eliminar del ARN TIV utilizando celulosa. El aumento de la concentración de EtOH al 16% (v/v) al 18% (v/v) o al 20% (v/v) no aumenta significativamente la eficiencia de la eliminación del ARNbc. Las altas cantidades del ARN reactivo con J2 en las fracciones del ARN unido indican el enriquecimiento del ARNbc (Fig. 2), lo que confirma la separación de contaminantes del ARNbc y ARNmc por este método. Este resultado muestra además la adaptación exitosa del procedimiento de purificación "negativa" con celulosa a un formato de columna de centrifugación con microcentrífuga.

Ejemplo 3 - Comparación de la purificación con celulosa con el tratamiento con RNasa III y la purificación por HPLC

Para probar si múltiples ciclos de purificación con celulosa de acuerdo con el método descrito anteriormente (véase el Ejemplo 2) usando columnas de centrifugación de microcentrífuga mejoran la eficiencia de la eliminación del ARNbc, se purificaron 1x, 2x o 3x como se describió anteriormente usando tampón STE 1x que contenía EtOH al 16% (v/v) 100 |jg ARN TIV modificado con m 1^ de 2.500 nt de largo, que se purificó mediante precipitación con cloruro de litio (LiCl) de la reacción de TIV. Además, los ARN purificados con celulosa se compararon con el ARN TIV que se trató con RNasa III de E. coli (0,2 U/100 jg de ARN) durante 30 min a 37 °C o se purificó por HPLC de acuerdo con el protocolo descrito por Weissman et al. (citado anteriormente). El contenido del ARNbc de todos los ARN se analizó mediante transferencia de puntos usando el anticuerpo J2 específico del ARNbc y se cuantificó mediante análisis densitométrico de las señales de hibridación. La integridad del ARN se controló mediante electroforesis en gel de agarosa.

El aumento del número de ciclos de purificación con celulosa aumenta la cantidad del ARNbc eliminado del ARN TIV (Fig. 3). Mientras que un ciclo de purificación elimina aproximadamente el 90% de los contaminantes del ARNbc, esta cantidad aumenta hasta un 95% y 97%, cuando se realizan 2 y 3 ciclos de purificación, respectivamente. Curiosamente, un ciclo de purificación con celulosa elimina casi la misma cantidad del ARNbc que el tratamiento de ARN TIV con RNasa III. Además, la realización de 3 ciclos de purificación con celulosa se acerca mucho a la eficiencia de la purificación por HPLC. Por tanto, la eficacia de la purificación con celulosa oscila entre la del tratamiento con RNasa III y la purificación por HPLC.

Ejemplo 4 - Comparación del rendimiento de diferentes marcas de celulosa en la eliminación del ARNbc del ARN TIV

Para probar si la eliminación de los contaminantes del ARNbc está restringida a una marca de celulosa específica utilizada en el experimento descrito anteriormente (Sigma-Aldrich, cat. # C6288) o si también se puede usar celulosa de otros proveedores, se probó el desempeño de otros dos tipos de celulosa de Macherey-Nagel (MN 100, MN 2100). Primero, se incubaron 100 jg del ARN TIV modificado con m 1^ de 1.500 nt de longitud, que se purificó previamente mediante precipitación con cloruro de litio (LiCl) de la reacción de TIV, en una columna de centrifugación de microcentrífuga con 0,15 g de los diferentes tipos de celulosa en presencia de tampón STE 1x que contenía EtOH al 16% (v/v). Después de la centrifugación, se recogió el ARN no unido centrifugando la columna y precipitando el ARN en el flujo de salida. El ARN unido a celulosa se recuperó añadiendo STE 1x a la columna, seguido de resuspensión de la celulosa mediante agitación vigorosa y finalmente centrifugación y precipitación. El contenido del ARNbc de todas las muestras del ARN se analizó mediante transferencia de puntos usando el anticuerpo J2 específico del ARNbc y se cuantificó mediante análisis densitométrico de las señales de hibridación. La integridad del ARN se controló mediante electroforesis en gel de agarosa.

Independientemente de la celulosa utilizada para la purificación, el contenido del ARNbc en todas las fracciones del ARN no unidas se reduce considerablemente en comparación con el ARN de entrada no purificado (Fig. 4). Las altas cantidades del ARN reactivo con J2 en las fracciones del ARN unido indican el enriquecimiento del ARNbc, lo que confirma la separación de los contaminantes del ARNbc y ARNmc por todos los tipos de celulosa analizados.

Ejemplo 5: Escalabilidad del método de purificación con celulosa

Un punto importante fue probar si el método de purificación con celulosa es escalable. Por lo tanto, se realizó un experimento para eliminar los contaminantes de ARNbc de 5 mg de ARN TIV con caperuza de D1 de 1.900 nt de longitud, que se purificó previamente a partir de la reacción de TIV mediante perlas magnéticas. El ARN se incubó con 1,5 g de celulosa (Sigma, cat. # C6288) en 15 ml de tampón STE 1x que contenía EtOH al 16% (v/v). El ARN no unido se separó de la celulosa mediante un dispositivo filtrante accionado por vacío (tamaño de poro de 0,45 j M) y se precipitó. Con otros 5 mg del mismo ARN se realizaron 2 ciclos de purificación. El contenido del ARNbc de ambos ARN purificados se analizó mediante transferencia de puntos utilizando el anticuerpo J2 específico del ARNbc y se cuantificó mediante análisis densitométrico de las intensidades de las señales de hibridación. La integridad del ARN se controló mediante electroforesis en gel de agarosa.

El resultado del análisis de transferencia de puntos muestra que después de 1 ciclo de purificación con 1,5 g de celulosa, se elimina el 72% de los contaminantes del ARNbc de 5 mg del ARN TIV. La eficacia de purificación se puede aumentar aún más hasta un 83% mediante un segundo ciclo de purificación con 1,5 g de celulosa fresca. Como se esperaba, la tasa de recuperación del ARN disminuye del 67% después de 1 ciclo de purificación al 53% después del segundo ciclo, lo que sigue siendo aceptable y es comparable a la tasa de recuperación de aproximadamente 50% lograda por el protocolo de purificación por HPLC descrito por Weismann et al., (citado anteriormente). Este resultado demuestra claramente que el método de purificación con celulosa de la presente invención se puede escalar para eliminar los contaminantes del ARNbc de varios mg del ARN TIV en una purificación de un solo lote.

Ejemplo 6 - Purificación del ARN TIV con diferente longitud usando un procedimiento de purificación "positiva"

En una etapa siguiente, se probó si es factible unir primero todos los componentes del ARN de una preparación de ARN TIV a celulosa en presencia de altas concentraciones de EtOH antes de liberar selectivamente la fracción del ARNmc disminuyendo la concentración de EtOH al 16% (v/v). En esta condición, los contaminantes del ARNbc deben permanecer unidos al material de celulosa y, por lo tanto, deben separarse del ARNmc (purificación "positiva"). Este procedimiento sería ventajoso sobre la purificación "negativa" ya que también permitiría la eliminación de contaminantes diferentes de ácido nucleico (por ejemplo, proteínas, nucleótidos libres), que no se unen a la celulosa en presencia de EtOH. Por lo tanto, se realizaron experimentos en los que 400 |jg de tres ARN TIV con diferentes longitudes (1.300 nt, 2.500 nt y > 10.000 nt) y estructuras de caperuza (D1, D2, sin caperuza) se unieron completamente a 0,12 g de celulosa en una columna de centrifugación de microcentrífuga usando tampón STE 1x que contenía EtOH al 40% (v/v). Los ARNmc se eluyeron con tampón STE 1x que contenía EtOH al 16% (v/v) y se transfirieron a una segunda columna de centrifugación que contenía 1,2 mg de celulosa fresca. Después de la incubación bajo agitación vigorosa y después de la centrifugación, los ARN en el flujo de salida se precipitaron y se analizaron en busca de contaminantes de ARNbc mediante transferencia de puntos utilizando el anticuerpo J2 específico del ARNbc. Las integridades del ARN se controlaron mediante electroforesis en gel de agarosa.

Independientemente de la longitud del ARN, el contenido del ARNbc de todos los ARN TIV se reduce significativamente a un nivel apenas detectable después de la purificación con celulosa (Fig. 6), lo que demuestra la viabilidad del procedimiento de purificación "positiva" descrito anteriormente. Inesperadamente, también el ARN TIV de > 10.000 nt de longitud podría purificarse exitosamente a partir de contaminantes del ARNbc (Fig. 6A). Esto muestra que la purificación no está restringida a ARN más corto (tal como 1.300 - 2.500 nt) y sugiere que la longitud del ARN no es un factor limitante para una purificación exitosa. Sin embargo, en comparación con la tasa de recuperación del ARN de 1.300 nt y 2.500 nt de longitud (45-55% de recuperación), la tasa de recuperación del ARN TIV largo es menor (35% de recuperación). Aunque la integridad del ARN TIV de > 10.000 nt de longitud es menor que la de ambos ARN TIV más cortos, no se ve afectada negativamente por el método de purificación con celulosa de acuerdo con la presente invención. Dado que los ARN utilizados para estos experimentos tenían diferentes estructuras de caperuza 5' (10.000 nt: caperuza de Dl, 1,300 nt: caperuza de D2, 2.500 nt: sin caperuza), dichos ejemplos demuestran que esta característica estructural no es un factor crítico para la purificación exitosa del ARN TIV por celulosa.

Ejemplo 7 - Purificación del ARN TIV utilizando tampones con diferente fuerza iónica

La estabilidad de los ácidos nucleicos bicatenarios está influenciada por la fuerza iónica del entorno. Mientras que las altas concentraciones de sal promueven la formación de estructuras bicatenarias, su disociación en ácidos nucleicos monocatenarios aumenta en concentraciones bajas de sal. Analizar el impacto de la fuerza iónica del tampón sobre la eficiencia de la eliminación del ARNbc por celulosa, un ARN TIV modificado con m1^ de 1.300 nt de longitud, que se purificó previamente mediante precipitación con cloruro de litio (LiCl) de la reacción de TIV, se incubó en un tubo de 1,5 ml con 0,1 g de celulosa en 500 j l de tampón STE 1x que contenía EtOH al 40% (v/v) y diferentes concentraciones de NaCl (0-150 mM). Después de la centrifugación, se eliminó el sobrenadante y se resuspendió la celulosa en 500 pl de los correspondientes tampones de STE 1x que contenían EtOH al 16% (v/v) para liberar el ARNmc. Después de la centrifugación, se recogió el sobrenadante y se recuperó el ARN por precipitación. En una etapa final, la celulosa se resuspendió en 500 pl de los correspondientes tampones STE 1x que no contenían EtOH, se centrifugó y se recuperó el ARN por precipitación del sobrenadante. El contenido de ARNbc del ARN de ambas fracciones (eluato de EtOH al 16%, eluato de EtOH al 0%) así como del material de ARN de partida (ARN TIV) se analizó mediante transferencia de puntos utilizando el anticuerpo J2 específico de ARNbc y se cuantificó mediante análisis densitométrico del señales de hibridación. La integridad de los ARN se controló mediante electroforesis en gel de agarosa.

La eficacia de la eliminación del ARNbc por la celulosa está influenciada por la concentración de NaCl en el tampón STE. En presencia de NaCl 25 mM o 50 mM, el 94% -98% de los contaminantes del ARNbc se eliminan del eluato de EtOH al 16% (Fig. 7 A, B). Aumentando la concentración de NaCl a 75 mM (Fig. 7A) o disminuyéndola a 10 mM (Fig. 7B) se reduce la eficacia de la purificación. Las concentraciones de NaCl por encima de 125 mM conducen a una disminución significativa en la eficiencia de purificación (Fig. 7A). Este resultado demuestra que la concentración de NaCl del tampón STE utilizado puede influir en la eficacia de purificación, que es la más alta en un intervalo entre 25 y 50 mM de NaCl. La fuerte reactividad de todos los eluatos de EtOH al 0%, excepto la muestra de NaCl 150 mM (Fig. 7A), con el anticuerpo J2 refleja el enriquecimiento de contaminantes de ARNbc en estas muestras.

Ejemplo 8 - Purificación por celulosa de ARN TIV por FPLC

Dado que la separación del ARNmc de contaminantes de ARNbc por celulosa usando un procedimiento de purificación "positiva" es factible (véanse los Ejemplos 6 y 7), se intentó adaptar el protocolo de purificación para FPLC. Se utilizaron 4 g de celulosa como fase estacionaria para empaquetar una columna XK 16/20. Después del equilibrio con tampón STE 1x que contenía EtOH al 40% (v/v), se cargaron 500 jg de ARN TIV modificado con m1^ de 1.300 nt de longitud, que se purificó previamente mediante precipitación con cloruro de litio (LiCl) de la reacción TIV, en la columna. Se eluyeron ARNmc y ARNbc unidos reduciendo la concentración de EtOH del tampón a 16% (v/v) y 0% (v/v), respectivamente, y se recogieron las fracciones. El ARN se recuperó por precipitación y el contenido de ARN bicatenario del ARN de ambas fracciones (Fl: eluato de EtOH al 16%, F2: eluato de EtOH al 0%) así como el material de ARN de partida (ARN de entrada) se analizó mediante transferencia de puntos utilizando el anticuerpo J2 específico de ARNbc. La integridad de los ARN se controló mediante electroforesis en gel de agarosa.

El perfil de elución (absorbancia a 260 nm) del cromatograma muestra que un alto porcentaje de ARN TIV cargado se une al material de celulosa en presencia de EtOH al 40% (v/v). Solo pequeñas cantidades de ARN permanecen sin unir y eluyen de la columna en estas condiciones (Fig. 8A). Al disminuir la concentración de EtOH al 16% (v/v), la mayor parte del ARN se eluye indicado por un pico único agudo en la absorbancia de UV. Este pico se recogió (fracción F1) y contiene el ARNmc purificado. En comparación con el ARN de entrada no purificado, aproximadamente el 88% del contenido de ARNbc se eliminó de esta fracción (Fig. 8B). Después de reducir la concentración de EtOH del tampón hasta 0% (v/v), sólo eluyen cantidades menores de ARN de la columna (fracción F2). El análisis de transferencia de puntos reveló que el ARNbc está enriquecido en esta fracción de ARN (Fig. 8B). Esto confirma la separación del ARNmc del ARNbc y demuestra el uso exitoso de celulosa como fase estacionaria para la purificación por FPLC de ARN TIV para eliminar contaminantes del ARNbc.

Ejemplo 9 - Purificación del ARN TIV usando diferentes concentraciones de EtOH para la elución del ARNmc

Para optimizar el protocolo del procedimiento de purificación "positiva" con celulosa, se probó el impacto de diferentes concentraciones de EtOH sobre la eficiencia de la eliminación del ARNbc y la recuperación de ARN. Se incubaron 200 |jg de ARN TIV con caperuza de D1 de 1.500 nt de longitud, que se purificó previamente a partir de la reacción de TIV mediante perlas magnéticas, con 0,1 g de celulosa lavada en 500 j l de tampón STE 1x que contenía EtOH al 40% (v/v) en una columna de centrifugación de microcentrífuga. El ARNmc unido a celulosa se eluyó con tampón STE 1x que contenía EtOH al 6, 10, 12, 14, 16, 18, 20 o 24% (v/v) y se recuperó del eluato mediante precipitación. El contenido de ARNbc del ARN obtenido de los diferentes eluatos así como del material de ARN de partida (ARN de entrada) se analizó mediante transferencia de puntos utilizando el anticuerpo J2 específico del ARNbc y se cuantificó mediante análisis densitométrico de las señales de hibridación. La integridad de los ARN se confirmó mediante electroforesis en gel de agarosa.

El intervalo óptimo de concentraciones de EtOH para la elución del ARNmc durante un procedimiento de purificación "positiva" es de 14-16% (v/v) (Fig. 9 A, B). A estas concentraciones de EtOH, el 83-84% del ARNbc permaneció unido a la celulosa y el 58-64% del ARNmc se recuperó de los correspondientes eluatos. Aumentar el EtOH al 18% (v/v) o al 20% (v/v) mejora aún más la eficiencia de la eliminación del ARNbc (85% o 90%, respectivamente) pero reduce significativamente la tasa de recuperación del ARN (47% o 36%, respectivamente). Por el contrario, disminuir la concentración de EtOH al 12% (v/v) empeora la eficiencia de purificación (63% del ARNbc eliminado) sin mejorar significativamente la recuperación del ARN. Este resultado demuestra que la eficacia de la eliminación del ARNbc y la tasa de recuperación del ARN de los eluatos se correlacionan inversamente. Además, la pureza relativa del ARNmc con respecto a los contaminantes de ARNbc puede controlarse mediante la concentración de EtOH utilizada para la elución. Sin embargo, concentraciones más altas de EtOH conducen a una eliminación más eficaz del ARNbc a costa de una menor recuperación del ARNmc. Por lo tanto, mediante el ajuste de la concentración de EtOH para la elución del ARNmc, la tasa de contaminantes de ARNdc/recuperación de a Rn se puede ajustar para cumplir con los requisitos de pureza/coste del ARN TIV para diferentes aplicaciones.

Ejemplo 10 - Determinación de la capacidad de unión de ARN a la celulosa

Para escalar el procedimiento de purificación "positiva" de celulosa, es importante conocer la capacidad de unión de ARN a la celulosa para minimizar la pérdida del ARN causada por sobrecarga. Para determinar la capacidad de unión de ARN, se incubo una cantidad fija de celulosa lavada (100 mg, Sigma, C6288) con 25 jg , 50 |jg, 100 |jg, 250 jg 500 |jg, 750 jg , 1.000 jg o 1.500 jg de ARN TIV con caperuza de D1 de 1.500 nt de longitud, que se purificó previamente a partir de la reacción de TIV mediante perlas magnéticas, en tampón en 500 j l de tampón STE 1x que contiene EtOH al 40% (v/v) en una columna de centrifugación de microcentrífuga. Después de la centrifugación, el ARNmc se eluyó con 500 j l de tampón STE 1x que contenía EtOH al 16% (v/v). Finalmente, el ARN que todavía estaba unido a la celulosa se liberó mediante incubación con H2O (EtOH al 0% (v/v)). Ambos, el ARN en el flujo de salida (40% (v/v) EtOH) y el eluato al 16% (v/v) como al 0% (v/v) se recuperaron por precipitación y la cantidad del ARN recuperado se determinó por espectrofotometría. Además, el contenido del ARNbc del ARN obtenido de los eluidos de EtOH al 16% (v/v), así como del material del ARN de partida (ARN de entrada) se analizó mediante transferencia de puntos utilizando el anticuerpo J2 específico de ARNbc para controlar la eficacia de la eliminación del ARNbc en las muestras individuales. La integridad de estos ARN se controló mediante electroforesis en gel de agarosa.

La capacidad de unión máxima del ARN de la celulosa probada (Sigma, C6288) varía entre 100 jg y 250 jg de ARN por 100 mg de celulosa, lo que corresponde a 1-2,5 mg de ARN por 1 g de celulosa. Esto se refleja en el hecho de que la tasa de recuperación del ARN (Figura 10A) y el rendimiento del ARN (Figura 10B) recuperado del flujo de salida de EtOH al 40% (v/v), que representa la fracción de ARN no unida, aumenta constantemente cuando se utilizan 250 jg o más del ARN para la purificación con 100 mg de celulosa. Sin embargo, la cantidad del ARN unido en los eluatos de EtOH al 16% (v/v) y EtOH al 0% (v/v) no aumenta en consecuencia cuando se utilizan 250 jg o más del ARN para la purificación, lo que en consecuencia conduce a una menor tasa de recuperación de ARN de ambas fracciones (Fig. 10A, B). La tasa máxima de recuperación del ARN del eluato de EtOH al 16% (v/v) se logra cuando se usaron 100 jg del ARN para la purificación con 100 mg de celulosa (68% de recuperación del ARN). Además, a esta proporción de ARN: celulosa se alcanza la mayor eficiencia de purificación de 88% de eliminación del ARNbc (Fig. 10 C, D). Curiosamente, la cantidad relativa del ARNbc eliminada del ARN TIV no disminuye significativamente cuando se excede la capacidad de unión de ARN a la celulosa.

Ejemplo 11 - Impacto de la purificación con celulosa del ARN TIV sobre su capacidad de traducción e inmunogenicidad

Como se estableció anteriormente, ARN TIV contiene contaminantes del ARNbc debido a la actividad aberrante de la ARN polimerasa T7. Sin embargo, el ARNbc induce citocinas inflamatorias (tal como el interferón) activando diferentes sensores celulares, incluidos RIG-I, MDA5 y TLR3, y también inhibe la traducción directamente activando la proteína quinasa R (PKR) y la oligoadenilato sintetasa (OAS). Para probar si el ARN TIV sometido a un método de la presente invención induce menos citocinas inflamatorias y/o puede traducirse de manera más eficiente en comparación con el ARN TIV que no se ha sometido a un método de la presente invención, el ARN TIV que codifica eritropoyetina murina (EPO) se dejó sin purificar o se purificó mediante un procedimiento de 2 etapas usando 2 columnas de centrifugación cada una llena con un material de celulosa (0,12 g de celulosa (Sigma, C6288)). En primer lugar, el ARN TIV se sometió a un procedimiento de purificación positiva como se describió anteriormente utilizando la columna del primer centrifugado (es decir, incubando el ARN TIV con el material de celulosa en la columna del primer centrifugado y en presencia de tampón STE 1x que contenía EtOH al 40% (v/v) para la unión de ARNbcy ARNmc al material de celulosa; aplicar fuerza a la columna primera columna de centrifugación; descartar el flujo; eluir el ARNmc de la primera columna de centrifugación añadiendo tampón STE 1x que contenía EtOH al 16% (v/v) y aplicar fuerza centrífuga a la primera columna de centrifugación). Luego, el eluato así obtenido que contenía ARNmc se sometió a un procedimiento de purificación negativa como se describió anteriormente usando la segunda columna de centrifugación (es decir, incubando el eluato que contenía el ARNmc con el material de celulosa en la segunda columna de centrifugación; aplicar fuerza centrifugan a la segunda columna de centrifugación; y recolectar el flujo de salida). El flujo de salida obtenido de la segunda columna de centrifugación se precipitó luego con isopropanol/acetato de sodio y se redisolvió en H2O. Después de la formulación con TransIT (Mirus Bio), los ARN TIV se inyectaron intraperitonealmente en ratones (n = 4) a una dosis de 3 |jg de ARN/animal. Se extrajo sangre a las 2, 6 y 24 h después de la inyección y se recolectaron muestras de plasma. A los ratones de control se les inyectó únicamente TransIT. Los niveles de interferón alfa murino (IFN -a) y EPO murino se midieron utilizando ensayos ELISA específicos (ELISA específico de interferón alfa murino (eBioscience); kit de desarrollo de ELISA DuoSet ELISA específico de EPO murino (R&D)).

Como se muestra en la Fig. 11A, el ARN TIV sometido a un método de la presente invención indujo significativamente menos IFN-a en comparación con el ARN TIV no purificado. Por lo tanto, este ejemplo demuestra que el método de la presente invención elimina eficazmente las moléculas contaminantes bicatenarias del ARN TIV. Lo más probable es que el IFN-a residual inducido por el ARN TIV purificado con celulosa se deba a la activación de TLR7 por el ARNmc que contiene uridinas.

Además, la Fig.11B muestra que una preparación de ARN TIV que codifica EPO que se ha sometido a un método de la presente invención, que carece por lo tanto del ARNbc inhibidor de la síntesis de proteínas, se traduce de manera muy eficiente, lo que da como resultado niveles altos de EPO en el plasma incluso 24 h después de la administración del ARN TIV purificado de acuerdo con la presente invención. Por el contrario, una preparación de ARN TIV que codifica EPO que no se ha sometido a un método de la presente invención pero que se dejó sin purificar se tradujo menos eficientemente debido a la inhibición de la síntesis de proteínas por los efectos directos y mediados por IFN-a de ARNbc.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para proporcionar ARN monocatenario (ARNmc), que comprende:

(i) producir una preparación de ARN que comprende ARNmc mediante transcripción in vitro;

(ii) poner en contacto la preparación de ARN con un material de celulosa en condiciones que permitan la unión de ARN bicatenario (ARNbc) al material de celulosa y no permitan la unión de ARNmc al material de celulosa; y (iii) separar el ARNmc del material de celulosa en condiciones que permitan la unión de ARNbc al material de celulosa y no permitan la unión de ARNmc al material de celulosa,

en el que

en la etapa (ii) la preparación de ARN se proporciona como un líquido que comprende ARNmc y un primer tampón y/o el material de celulosa se proporciona como una suspensión en un primer tampón, en el que el primer tampón comprende agua, etanol y una sal en una concentración que permita la unión de ARNbc al material de celulosa y que no permita la unión de ARNmc al material de celulosa; y

la concentración de etanol en el primer tampón es del 14 al 20% (v/v) y la concentración de la sal en el primer tampón es de 15 a 70 mM.

2. Un método para proporcionar ARN monocatenario (ARNmc), que comprende:

(ii) poner en contacto la preparación de ARN con un material de celulosa en condiciones que permitan la unión de ARN bicatenario (ARNbc) y ARNmc al material de celulosa; y

(iii) separar el ARNmc del material de celulosa en condiciones que permitan la unión de ARNbc al material de celulosa y no permitan la unión de ARNmc al material de celulosa,

en el que

la etapa (iii) comprende:

(1) mezclar el material de celulosa al que se unen ARNbc y ARNmc con un primer tampón mediante batido y/o agitación, en la que el primer tampón comprende agua, etanol y una sal en una concentración que permita la unión de ARNbc al material de celulosa y no permita la unión de ARNmc al material de celulosa; y

(2) separar la fase líquida que comprende ARNmc del material de celulosa;

y

3. El método de la reivindicación 1, en el que la etapa (ii) comprende mezclar la preparación de ARN que comprende ARNmc con el material de celulosa mediante batido y/o agitación, preferiblemente durante al menos 5 min, más preferiblemente durante al menos 10 min.

4. El método de la reivindicación 3, en el que

(a) la sal comprendida en el primer tampón es cloruro de sodio; y/o

(b) la concentración de etanol en el primer tampón es del 14 al 16% (v/v); y/o

(c) la concentración de la sal en el primer tampón es de 20 a 60 mM; y/o

(d) el primer tampón comprende además una sustancia de tamponamiento, preferiblemente tris(hidroximetil) aminometano (TRIS), y/o un agente quelante, preferiblemente EDTA; y/o

(e) en la etapa (iii)

(a) la mezcla de la preparación de ARN, el material de celulosa y el primer tampón se proporcionan en un tubo y la etapa (iii) comprende (1) aplicar gravedad o fuerza centrífuga al tubo de manera que las fases líquida y sólida se separan; y (2) recoger el sobrenadante que comprende ARNmc o eliminar el material de celulosa; o

(p) la mezcla de la preparación de ARN, el material de celulosa, y el primer tampón se proporcionan en una columna de centrifugación o dispositivo filtrante y la etapa (iii) comprende (1') aplicar gravedad, fuerza centrífuga, presión, o vacío a la columna de centrifugación o al dispositivo filtrante de modo que se separen las fases líquida y sólida; y (2') recolectando el flujo de salida que comprende ARNmc.

5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 3 y 4, en el que las etapas (ii) y (iii) se repiten una vez o dos o más veces, en el que la preparación de ARNmc obtenida después de la etapa (iii) de un ciclo de las etapas (ii) y (iii) se utiliza como preparación de ARN en la etapa (ii) del siguiente ciclo y en la etapa (ii) de cada ciclo de las etapas (ii) y (iii) se usa material de celulosa fresco.

6. El método de la reivindicación 2, en el que la etapa (ii) comprende

(1) mezclar la preparación de ARN que comprende ARNmc con el material de celulosa mediante batido y/o agitación, preferiblemente durante al menos 5 min, más preferiblemente durante al menos 10 min; y

(2) separar el material de celulosa al que se unen ARNbc y ARNmc del resto.

7. El método de la reivindicación 6, en el que en la etapa (ii) la preparación de ARN se proporciona como un líquido que comprende ARNmc y un segundo tampón y/o el material de celulosa se proporciona como una suspensión en un segundo tampón, en el que el segundo tampón comprende agua, etanol y una sal, preferiblemente cloruro de sodio, en una concentración que permita la unión de ARNbc y ARNmc al material de celulosa.

8. El método de la reivindicación 7, en el que

(a) la concentración de etanol en el segundo tampón es al menos del 35% (v/v), preferiblemente del 38 a 42% (v/v); y/o

(b) la concentración de la sal en el segundo tampón es de 15 a 70 mM, preferiblemente de 20 a 60 mM; y/o (c) el segundo tampón comprende además una sustancia de tamponamiento, preferiblemente tris(hidroximetil) aminometano (TRIS), y/o un agente quelante, preferiblemente EDTA; y/o

(d) en la etapa (ii)(2)

(a) la mezcla de la preparación de ARN y el material de celulosa obtenido en la etapa (ii)(1) se proporcionan en un tubo y la etapa (ii)(2) comprende (2a) aplicar gravedad o fuerza centrífuga al tubo de manera que el líquido y las fases sólidas se separen; y (2b) eliminar el sobrenadante o recolectar el material de celulosa al que se unen ARNbc y ARNmc; o

(р) la mezcla de la preparación de ARN y el material de celulosa obtenido en la etapa (ii)(1) se proporcionan en una columna de centrifugación o dispositivo filtrante y la etapa (ii)(2) comprende (2a') aplicar gravedad, fuerza centrífuga, presión, o vacío a la columna de centrifugación o al dispositivo filtrante de modo que se separen las fases líquida y sólida; y (2b') descartando el flujo de salida; y/o

(e) la etapa (ii) comprende además (3) añadir una alícuota del segundo tampón al material de celulosa al que ARNbc y ARNmc están unidos; (4) incubar la mezcla resultante mediante batido y/o agitación, preferiblemente durante al menos 5 min, más preferiblemente durante al menos 10 min; y (5) separar el material de celulosa al que ARNbc y ARNmc se unen a partir de la fase líquida; y opcionalmente (6) repetir las etapas (3) a (5) una o dos o más veces.

9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 2 y 6 a 8, en el que

(a) en la etapa (iii)(1) el material de celulosa al que se unen ARNbc y ARNmc se mezcla con el primer tampón mediante batido y/o agitación durante al menos 5 min, preferiblemente durante al menos 10 min; y/o

(b) la sal comprendida en el primer tampón es cloruro de sodio; y/o

(с) la concentración de etanol en el primer tampón es del 14 al 16% (v/v); y/o

(d) la concentración de la sal en el primer tampón es de 20 a 60 mM; y/o

(e) el primer tampón comprende además una sustancia tampón, preferiblemente tris(hidroximetil)aminometano (TRIS), y/o un agente quelante, preferiblemente EDTA; y/o

(f) en la etapa (iii)

(a) la mezcla del material de celulosa y el primer tampón se proporcionan en un tubo y la etapa (iii)(2) comprende (2a) aplicar gravedad o fuerza centrífuga al tubo de manera que se separen las fases líquida y sólida;

y (2b) recoger el sobrenadante que comprende ARNmc o eliminar el material de celulosa; o

(p) la mezcla del material de celulosa y el primer tampón se proporcionan en una columna de centrifugación o dispositivo filtrante y la etapa (iii)(2) comprende (2a') aplicar gravedad, fuerza centrífuga, presión, o vacío a la columna de centrifugación o dispositivo filtrante; y (2b') recoger el flujo de salida que comprende ARNmc; y/o

(g) las etapas (ii) y (iii) se repiten una o dos o más veces, en las que la preparación de ARNmc obtenida después la etapa (iii) de un ciclo de las etapas (ii) y (iii) se utiliza como preparación de ARN en la etapa (ii) del siguiente ciclo y en la etapa (ii) de cada ciclo de las etapas (ii) y (iii) se usa material de celulosa fresco.

10. El método de la reivindicación 2, en el que en la etapa (ii) el material de celulosa se proporciona en una columna, la etapa (ii) comprende cargar la preparación de ARN en la columna en condiciones que permitan la unión de ARNbc y ARNmc al material de celulosa, y la etapa (iii) comprende eluir el ARNmc del material de celulosa en condiciones que permitan la unión de ARNbc al material de celulosa y no permitan la unión de ARNmc al material de celulosa.

11. El método de la reivindicación 10, en el que en la etapa (ii) la preparación de ARN se proporciona y se carga en la columna como un líquido que comprende ARNmc y un segundo tampón, en el que el segundo tampón comprende agua, etanol y una sal, preferiblemente cloruro de sodio, en una concentración que permita la unión de ARNbc y ARNmc al material de celulosa.

12. El método de la reivindicación 11, en el que

(d) la etapa (iii) se lleva a cabo utilizando el primer tampón como eluyente, en el que el primer tampón es preferiblemente el primer tampón definido en la reivindicación 9(b), la reivindicación 9(c), la reivindicación 9(d), y/o la reivindicación 9(e).

13. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que

(a) la preparación de ARN se produce utilizando una ARN polimerasa seleccionada del grupo que consiste en ARN polimerasas T3, T7 y SP6; y/o

(b) antes de la etapa (ii) la preparación de ARN se somete a al menos un tratamiento de purificación previa, en el que al menos un tratamiento de purificación previa comprende preferiblemente uno o más de los siguientes: precipitación de ácidos nucleicos; unión de ácidos nucleicos a perlas magnéticas; ultrafiltración; y degradación del ADN; y/o (c) el ARNmc es ARNm o un ARN inhibidor, tal como ARN antisentido, ARNip o miARN; y/o

(d) el ARNmc tiene una longitud de al menos 2.700 nt, preferiblemente al menos 3.000 nt, más preferiblemente al menos 3.500 nt, más preferiblemente al menos 4.500 nt; y/o

(e) el material de celulosa comprende fibras de celulosa, preferiblemente fibras de celulosa de un grado adecuado para su uso como reactivo de cromatografía de partición; y/o

(f) antes de entrar en contacto con la preparación de ARN en la etapa (ii) el material de celulosa se proporciona como un material de celulosa lavado.

14. El método de la reivindicación 13(f), en el que el lavado del material de celulosa incluye

(I) mezclar el material de celulosa con una solución de lavado mediante batido y/o agitación, preferiblemente durante al menos 5 min; y

(II) remover el líquido o recolectar el material de celulosa; y opcionalmente

(III) repetir las etapas (I) y (II) una o dos o más veces.

15. El método de la reivindicación 14, en el que

(A) si la etapa (ii) se realiza en condiciones que permitan la unión de ARNbc al material de celulosa lavado y no permitan la unión de ARNmc al material de celulosa lavado, la solución de lavado tiene la composición del primer tampón definido en la reivindicación 1, la reivindicación 4(a), la reivindicación 4(b), la reivindicación 4(c) y/o la reivindicación 4(d), o

(B) si la etapa (ii) se realiza en condiciones que permitan la unión de ARNbc y ARNmc al material de celulosa lavada la solución de lavado tiene la composición del segundo tampón definido en la reivindicación 7, reivindicación 8(a), reivindicación 8(b) y/o reivindicación 8(c).