KR20220041247A - 단일가닥 rna 제공 방법 - Google Patents

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KR20220041247A
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Abstract

본 발명은 단일가닥 RNA (ssRNA)를 제공하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 수득 가능한 ssRNA 및 치료에서의 이러한 ssRNA의 용도에 관한 것이다.

Description

단일가닥 RNA 제공 방법{METHODS FOR PROVIDING SINGLE-STRANDED RNA}
본 발명은 단일가닥 RNA (ssRNA)를 제공하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 수득 가능한 ssRNA 및 치료에서의 이러한 ssRNA의 용도에 관한 것이다.
T7 RNA 중합효소 (문헌[Yin et al., Cell 116 (2004), 393-404] 참조)를 사용하여 시험관내 전사 (IVT)에 의한 mRNA의 합성 동안에, 효소의 비통상적인 활성으로 인해 이중가닥 RNA (dsRNA)를 포함하는 상당한 양의 이상 생성물이 생성된다 (문헌[Triana-Alonso et al., JBC 270 (1995), 6298-6307]; 문헌[Cazenave et al., PNAS USA 91(1994), 6972-6976]; 문헌[Gong et al., JBC 281 (2006), 23533-23544] 참조). dsRNA는 염증성 사이토카인을 유도하고 단백질 합성 억제로 인한 이펙터 효소를 활성화하므로 (문헌[Kariko et al., Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 10 (2007), 523-532] 참조) 치료제로 사용될 IVT mRNA에서 dsRNA를 제거하는 것이 중요하다.
현재까지 IVT mRNA로부터 dsRNA를 제거하기 위한 두 가지 다른 방법이 기술되어 있다. 한 가지 방법은 비-다공성 (문헌[Weissman et al., Methods Mol. Biol. 969 (2013), 43-54] 참조) 또는 다공성 (미국 특허 제8,383,340 B2호 참조) C-18 폴리스티렌-디비닐벤젠 (PS-DVB) 매트릭스를 사용한 이온쌍 역상 HPLC에 의해 IVT mRNA를 정제하는 것이다. 그러나, RNA를 정제하기 위해 HPLC를 이용하는 방법은 복잡한 장비; 아세토니트릴과 같은 독성 용매의 사용; 장기간의 표준 정제 작업; 어려운 스케일업; 비용; 및 절단에 의한 긴 RNA의 분해와 같은 몇 가지 단점을 가지고 있다.
대안적으로, dsRNA는 특이적으로 가수분해하지만 ssRNA는 분해하지 않는 E. coli RNaseIII를 사용하여 IVT mRNA 제제로부터 dsRNA 오염물을 제거하는 효소 기반 방법을 확립하였다 (WO 2013/102 203 A1 참조). 그러나, RNA로 치료할 환자에게 RNaseIII가 목적하지 않는 반응 (예컨대 원치않는 면역 반응)을 유도시킬 가능성이 있다. 따라서, 환자에게 RNA를 투여하기 전에, 효소를 제거할 필요가 있었으나, 방법의 복잡성 및 비용이 증가되었다. 더욱이, RNaseIII의 사용은 인큐베이션 중 종종 ssRNA, 특히 긴 ssRNA의 부분적 분해를 유도하였다. 이것은 ssRNA에 포함된 이중가닥 이차구조의 RNaseIII가 촉매 작용으로 가수분해됨으로써 야기된 것으로 보인다.
1966년 문헌에 EtOH 존재 하에서 비변형된 셀룰로스 분말 CF-11과 RNA 간의 비이온성 상호작용이 기술되어 있으며, 크로마토크래피를 통해 sRNA ("수용성 RNA")를 리보솜 RNA (rRNA)로부터 분리하는데 사용하였다 (Barber, R. Biochim. Biophys. Acta 114 (1966), 422-424). sRNA를 컬럼으로부터 35% EtOH로 용리시키는 동안, rRNA는 크로마토크래피 완충액의 EtOH 농도를 15%로 감소시킴으로써 선택적으로 용리될 수 있었다.
문헌[Franklin et al. (PNAS USA 55 (1966), 1504-1511)]에서, E. coli의 전체 RNA로부터 RNA 박테리오파지 R17의 복제중간체(RI) RNA를 분리하기 위해 동일한 분리 원리를 사용하였다. 여기에서, RNase A-내성 dsRNA로 확인된 셀룰로스-결합된 RI RNA를 EtOH가 없는 완충액에서만 효율적으로 용리시켰다. 이 기술은 밤나무의 기생 균류인 Cryphonectria parasitica로부터 dsRNA를 분리하기 위해 채택되었다 (Day et al., Phytopathology 67 (1977), 1393).
문헌[Morris and Dodds (Phytopathology 69 (1977), 854-858)]에는, 15% (v/v) EtOH의 존재 하에서 식물 및 균류 RNA 분리물로부터 바이러스 dsRNA를 선택적으로 끌어냄으로써 이전에 기술된 셀룰로스-기반 과정을 단순화시켰다. 이 과정은 dsRNA를 분리하기 위해 수십 년 동안 사용되어 왔으며, 예를 들어 공정 속도를 향상시키고 시료 처리량을 증가시키는 CF-11 셀룰로스로 포장된 시판용 미니컬럼을 사용하는 등의 수년 동안 약간의 수정만 행하였다 (문헌[Castillo et al., Virol. J. 8 (2011), 38]; 문헌[Okada et al., Arch. Virol. 159 (2014), 807-809] 참조).
본 발명의 목적은 상술한 하나 이상의 문제를 해결하는 수단을 제공하는 것이다. 특히, 본 발명의 목적은 HPLC에 기초한 방법보다 대안적인 ssRNA 제공 방법을 제공하는 것이고, 이는 경제적이거나, 간단하거나, 시간 소모가 적거나, 독성 물질을 피할 수 있거나, 용이하게 업스케일될 수 있거나, HPLC를 사용하여 수득한 ssRNA에 비해 높은 수율 및 순도의 ssRNA를 제공하거나, 길이가 긴 RNA에는 영향을 미치지 않거나, RNA를 분해하지 않는다. 본 발명의 이러한 근본적인 목적은 본 명세서에서 개시되거나 정의된 내용에 의해, 예를 들어 첨부된 청구범위의 내용에 의해 뒷받침된다.
본 발명은 단일가닥 RNA (ssRNA)를 제공하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 수득 가능한 ssRNA 및 치료에서의 이러한 ssRNA의 용도에 관한 것이다.
제 1 양상에서, 본 발명은 (i) 시험관내 전사에 의해 생성된 ssRNA를 포함하는 RNA 제제를 제공하는 단계; (ii) 셀룰로스 물질에 이중가닥 RNA (dsRNA)의 결합을 허용하는 조건 하에서 셀룰로스 물질과 RNA 제제를 접촉시키는 단계; 및 (iii) dsRNA를 셀룰로스 물질에 결합시키는 조건 하에서 셀룰로스 물질로부터 ssRNA를 분리하는 단계를 포함하는, ssRNA 제공 방법을 제공한다.
제 1 양상의 일 실시형태에서, 상기 방법은 시험관내 전사에 의해 ssRNA를 포함하는 RNA 제제를 생산하는 단계를 추가로 포함한다.
제 1 양상의 제 1 주요 실시형태에서, 단계 (ii) 및 (iii)은 dsRNA를 셀룰로스 물질에 결합시키고 ssRNA를 셀룰로스 물질에 결합시키지 않는 조건 하에서 수행된다 (ssRNA가 비결합 상태로 유지되는 반면, dsRNA가 셀룰로스 물질에 선택적으로 결합할 수 있기 때문에 때때로 제 1 양상의 이러한 주요 실시형태는 본원에서 "음성" 정제 과정으로 지칭된다).
음성 정제 과정의 일 실시형태에서, 단계 (ii)는 진탕 및/또는 교반 하에서, 바람직하게는 적어도 5분 동안, 보다 바람직하게는 적어도 10분 동안 ssRNA를 포함하는 RNA 제제를 셀룰로스 물질과 혼합하는 단계를 포함한다.
음성 정제 과정의 일 실시형태에서, 단계 (ii)에서 RNA 제제는 ssRNA 및 제 1 완충액을 포함하는 액체로서 제공되고/제공되거나 셀룰로스 물질은 제 1 완충액 중의 현탁액으로서 제공되고, 여기서 제 1 완충액은 dsRNA를 셀룰로스 물질에 결합시키고 ssRNA를 셀룰로스 물질에 결합시키지 않는 농도로 물, 에탄올 및 염, 바람직하게는 염화나트륨을 포함한다. 일 실시형태에서, 제 1 완충액 중의 에탄올의 농도는 14 내지 20% (v/v)이고, 바람직하게는 14 내지 16% (v/v)이다. 일 실시형태에서, 제 1 완충액 중의 염의 농도는 15 내지 70mM이고, 바람직하게는 20 내지 60mM이다. 일 실시형태에서, 제 1 완충액은 완충 물질, 바람직하게는 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄 (TRIS), 및/또는 킬레이트제, 바람직하게는 EDTA를 추가로 포함한다.
음성 정제 과정의 일 실시형태에서, 단계 (ii) 및/또는 (iii)에서 RNA 제제, 셀룰로스 물질 및 제 1 완충액의 혼합물은 튜브 내에 제공되고 단계 (iii)은 (1) 중력 또는 원심력을 튜브에 가하여 액체 및 고체상을 분리시키는 단계; 및 (2) ssRNA를 포함하는 상등액을 회수하거나 또는 셀룰로스 물질을 제거하는 단계를 포함한다. 또 다른 일 실시형태에서, 단계 (ii) 및/또는 단계 (iii)에서 RNA 제제, 셀룰로스 물질 및 제 1 완충액의 혼합물은 스핀 컬럼 또는 여과 장치에 제공되고 단계 (iii)은 (1') 중력, 원심력, 압력, 또는 진공을 스핀 컬럼 또는 여과 장치에 가하여 액체 및 고체상을 분리시키는 단계; 및 (2') ssRNA를 포함하는 통과액을 회수하는 단계를 포함한다.
음성 정제 과정의 일 실시형태에서, 단계 (ii) 및 (iii)을 1회 또는 2회 이상 반복하고, 여기서 단계 (ii) 및 (iii)의 하나의 사이클 중 단계 (iii) 이후에 수득된 ssRNA 제제는 다음 사이클의 단계 (ii)에서 RNA 제제로서 사용되고 단계 (ii) 및 (iii)의 각각의 사이클의 단계 (ii)에서는 신선한 셀룰로스 물질이 사용된다.
제 1 양상의 제 2 주요 실시형태에서, 단계 (ii)는 dsRNA 및 ssRNA를 셀룰로스 물질에 결합시키는 조건 하에서 수행되고; 단계 (iii)은 dsRNA를 셀룰로스 물질에 결합시키고 ssRNA를 셀룰로스 물질에 결합시키지 않는 조건 하에서 수행된다 (먼저 dsRNA 및 ssRNA가 셀룰로스 물질에 결합하고 나서, dsRNA는 결합 상태로 유지되는 반면 ssRNA는 셀룰로스 물질로부터 선택적으로 방출되기 때문에 때때로 제 1 양상의 이러한 제 2 주요 실시형태는 본원에서 "양성" 정제 과정으로 지칭된다).
양성 정제 과정의 일 실시형태에서, 단계 (ii)는 (1) 진탕 및/또는 교반 하에서, 바람직하게는 적어도 5분 동안, 보다 바람직하게는 적어도 10분 동안 ssRNA를 포함하는 RNA 제제를 셀룰로스 물질과 혼합하는 단계; 및 (2) dsRNA 및 ssRNA가 결합된 셀룰로스 물질을 잔여물로부터 분리하는 단계를 포함한다.
양성 정제 과정의 일 실시형태에서, 단계 (ii)에서 RNA 제제는 ssRNA 및 제 2 완충액을 포함하는 액체로서 제공되고/제공되거나 셀룰로스 물질은 제 2 완충액 중의 현탁액으로서 제공되며, 여기서 제 2 완충액은 dsRNA 및 ssRNA를 셀룰로스 물질에 결합시키는 농도로 물, 에탄올 및 염, 바람직하게는 염화나트륨을 포함한다. 일 실시형태에서, 제 2 완충액 중 에탄올의 농도는 적어도 35% (v/v)이고, 바람직하게는 38 내지 42% (v/v)이다. 일 실시형태에서, 제 2 완충액 중의 염의 농도는 15 내지 70mM이고, 바람직하게는 20 내지 60mM이다. 일 실시형태에서, 제 2 완충액은 완충 물질, 바람직하게는 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄 (TRIS), 및/또는 킬레이트제, 바람직하게는 EDTA를 추가로 포함한다.
양성 정제 과정의 일 실시형태에서, 단계 (ii)(1) 및/또는 (ii)(2)에서는 단계 (ii)(1)에서 수득된 RNA 제제와 셀룰로스 물질의 혼합물은 튜브 내에 제공되고, 단계 (ii)(2)는 (2a) 중력 또는 원심력을 튜브에 가하여 액체 및 고체상을 분리시키는 단계; 및 (2b) 상등액을 제거하거나 dsRNA 및 ssRNA가 결합된 셀룰로스 물질을 회수하는 단계를 포함한다. 또 다른 일 실시형태에서, 단계 (ii)(1) 및/또는 (ii)(2)에서는 단계 (ii)(1)에서 수득된 RNA 제제와 셀룰로스 물질의 혼합물을 스핀 컬럼 또는 여과 장치에 제공하고 단계 (ii)(2)는 (2a') 중력, 원심력, 압력, 또는 진공을 스핀 컬럼 또는 여과 장치에 가하여 액체 및 고체상을 분리시키는 단계; 및 (2b') 통과액을 폐기하는 단계를 포함한다.
양성 정제 과정의 일 실시형태에서, 단계 (ii)는 (3) dsRNA 및 ssRNA가 결합된 셀룰로스 물질에 제 2 완충액의 분취량을 첨가하는 단계; (4) 진탕 및/또는 교반 하에서, 바람직하게는 적어도 5분 동안, 보다 바람직하게는 적어도 10분 동안 얻어진 혼합물을 인큐베이팅하는 단계; 및 (5) dsRNA 및 ssRNA가 결합된 셀룰로스 물질을 액체상으로부터 분리하는 단계; 및 선택적으로 (6) 단계 (3) 내지 (5)를 1회 또는 2회 이상 반복하는 단계를 추가로 포함한다.
양성 정제 과정의 일 실시형태에서, 단계 (iii)은 (1) 진탕 및/또는 교반 하에서, 바람직하게는 적어도 5분 동안, 보다 바람직하게는 적어도 10분 동안 dsRNA 및 ssRNA가 결합되어있는 셀룰로스 물질을 제 1 완충액과 혼합하는 단계, 여기서 제 1 완충액은 dsRNA를 셀룰로스 물질에 결합시키고 ssRNA를 셀룰로스 물질에 결합시키지 않는 농도로 물, 에탄올 및 염, 바람직하게는 염화나트륨을 포함하고; 및 (2) 셀룰로스 물질로부터 ssRNA를 포함하는 액체상을 분리하는 단계를 포함한다. 일 실시형태에서, 제 1 완충액 중의 에탄올의 농도는 14 내지 20% (v/v)이고, 바람직하게는 14 내지 16% (v/v)이다. 일 실시형태에서, 제 1 완충액 중의 염의 농도는 15 내지 70mM이고, 바람직하게는 20 내지 60mM이다. 일 실시형태에서, 제 1 완충액은 완충 물질, 바람직하게는 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄 (TRIS), 및/또는 킬레이트제, 바람직하게는 EDTA를 추가로 포함한다.
양성 정제 과정의 일 실시형태에서, 단계 (iii)에서 셀룰로스 물질과 제 1 완충액의 혼합물은 튜브 내에 제공되고, 단계 (iii)(2)는 (2a) 중력 또는 원심력을 튜브에 가하여 액체 및 고체상을 분리시키는 단계; 및 (2b) ssRNA를 포함하는 상등액을 회수하거나 또는 셀룰로스 물질을 제거하는 단계를 포함한다. 또 다른 일 실시형태에서, 단계 (iii)에서 셀룰로스 물질과 제 1 완충액의 혼합물은 스핀 컬럼 또는 여과 장치에 제공되고, 단계 (iii)(2)는 (2a') 중력, 원심력, 압력, 또는 진공을 스핀 컬럼 또는 여과 장치에 가하는 단계; 및 (2b') ssRNA를 포함하는 통과액을 회수하는 단계를 포함한다.
양성 정제 과정의 일 실시형태에서, 단계 (ii) 및 (iii)을 1회 또는 2회 이상 반복하고, 여기서 단계 (ii) 및 단계 (iii)의 하나의 사이클 중 단계 (iii) 이후에 수득된 ssRNA 제제는 다음 사이클의 단계 (ii)에서 RNA 제제로서 사용되고 단계 (ii) 및 (iii)의 각각의 사이클의 단계 (ii)에서는 신선한 셀룰로스 물질이 사용된다.
양성 정제 과정의 일 실시형태에서, 단계 (ii)에서 셀룰로스 물질을 컬럼에 제공하고, 단계 (ii)는 dsRNA 및 ssRNA를 셀룰로스 물질에 결합시키는 조건 하에서 컬럼 상에 RNA 제제를 로딩하는 단계를 포함하고, 단계 (iii)은 dsRNA를 셀룰로스 물질에 결합시키고 ssRNA를 셀룰로스 물질에 결합시키지 않는 조건 하에서 셀룰로스 물질로부터 ssRNA를 용리시키는 단계를 포함한다. 일 실시형태에서, 단계 (ii)에서 RNA 제제는 ssRNA 및 제 2 완충액을 포함하는 액체로서 컬럼 상에 제공 및 로딩되고, 여기서 제 2 완충액은 dsRNA 및 ssRNA를 셀룰로스 물질에 결합시키는 농도로 물, 에탄올 및 염, 바람직하게는 염화나트륨을 포함한다. 일 실시형태에서, 제 2 완충액 중 에탄올의 농도는 적어도 35% (v/v)이고, 바람직하게는 38 내지 42% (v/v)이다. 일 실시형태에서, 제 2 완충액 중의 염의 농도는 15 내지 70mM이고, 바람직하게는 20 내지 60mM이다. 일 실시형태에서, 제 2 완충액은 완충 물질, 바람직하게는 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄 (TRIS), 및/또는 킬레이트제, 바람직하게는 EDTA를 추가로 포함한다. 일 실시형태에서, 단계 (iii)은 용출액으로서 제 1 완충액을 사용하여 수행되며, 여기서 제 1 완충액은 dsRNA를 셀룰로스 물질에 결합시키고 ssRNA를 셀룰로스 물질에 결합시키지 않는 농도로 물, 에탄올 및 염, 바람직하게는 염화나트륨을 포함한다. 일 실시형태에서, 제 1 완충액 중의 에탄올의 농도는 14 내지 20% (v/v)이고, 바람직하게는 14 내지 16% (v/v)이다. 일 실시형태에서, 제 1 완충액 중의 염의 농도는 15 내지 70mM이고, 바람직하게는 20 내지 60mM이다. 일 실시형태에서, 제 1 완충액은 완충 물질, 바람직하게는 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄 (TRIS), 및/또는 킬레이트제, 바람직하게는 EDTA를 추가로 포함한다.
제 1 양상의 일 실시형태에서, RNA 제제는 T3, T7 및 SP6 RNA 중합효소로 이루어진 군으로부터 선택된 RNA 중합효소를 사용하여 제조된다.
제 1 양상의 일 실시형태에서, 단계 (ii) 전에 RNA 제제는 적어도 하나의 예비-정제 처리를 행한다. 일 실시형태에서, 적어도 하나의 예비-정제 처리는 바람직하게는 염화리튬을 사용한 핵산의 침전; 자성 비드에 핵산의 결합; 한외여과; 및 바람직하게는 듀플렉스-특이적 핵산분해효소 (DSN)를 사용하여 DNA의 분해 중 하나 이상을 포함한다.
제 1 양상의 일 실시형태에서, ssRNA는 mRNA 또는 억제성 RNA (예컨대 안티센스 RNA, siRNA, 또는 miRNA)이다.
제 1 양상의 일 실시형태에서, ssRNA는 적어도 2,700 nt, 바람직하게는 적어도 2,800 nt, 적어도 2,900 nt, 적어도 3,000 nt, 적어도 3,100 nt, 적어도 3,200 nt, 적어도 3,300 nt, 적어도 3,400 nt, 예컨대 적어도 3500 nt, 적어도 3,600 nt, 적어도 3,700 nt, 적어도 3,800 nt, 적어도 3,900 nt, 적어도 4,000 nt, 적어도 4,100 nt, 적어도 4,200 nt, 적어도 4,300 nt, 적어도 4,400 nt, 또는 적어도 4500 nt의 길이를 갖는다.
제 1 양상의 일 실시형태에서, 셀룰로스 물질은 셀룰로스 섬유, 바람직하게는 분배 크로마토크래피 시약으로서 사용하기에 적절한 등급의 셀룰로스 섬유를 포함한다. 일 실시형태에서, 단계 (ii)에서 RNA 제제와 접촉시키기 전에, 셀룰로스 물질은 세정된 셀룰로스 물질로서 제공된다. 일 실시형태에서, 셀룰로스 물질의 세정은 (I) 진탕 및/또는 교반 하에서, 바람직하게는 적어도 5분 동안, 보다 바람직하게는 적어도 10분 동안 셀룰로스 물질을 세정액과 혼합하는 단계; 및 (II) 액체를 제거하거나 셀룰로스 물질을 회수하는 단계; 및 선택적으로 (III) 단계 (I) 및 (II)를 1회 또는 2회 이상 반복하는 단계를 포함한다. 일 실시형태에서, 세정액은 (A) dsRNA를 세정된 셀룰로즈 물질에 결합시키고 ssRNA를 세정된 셀룰로즈 물질에 결합시키지 않는 조건 하에서 단계 (ii)가 수행되는 경우에, 상기 또는 하기에 정의된 바와 같은 제 1 완충액 (즉, "음성" 정제 과정의 실시형태에서), 또는 (B) dsRNA 및 ssRNA를 세정된 셀룰로즈 물질에 결합시키는 조건 하에서 단계 (ii)가 수행되는 경우, 상기 또는 하기에 정의된 바와 같은 제 2 완충액 (즉, "양성" 정제 과정의 실시형태에서)의 조성을 갖는다.
제 2 양상에서, 본 발명은 임의의 제 1 양상의 방법에 의해 수득 가능한 ssRNA를 제공한다. 제 2 양상의 일 실시형태에서, ssRNA는 실질적으로 dsRNA가 없고 및/또는 실질적으로 DNA가 없으며, 바람직하게는 실질적으로 dsRNA 및 DNA가 없다.
제 3 양상에서, 본 발명은 치료에 사용하기 위한 제 2 양상의 ssRNA를 제공한다.
본 발명의 다른 양상뿐만 아니라 장점 및 새로운 특징은 첨부된 도면과 함께 이하의 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다.
본 발명을 통해서 단일가닥 RNA (ssRNA)를 제공하는 방법하고, 본 발명의 방법에 의해 수득 가능한 ssRNA를 치료 용도로 사용할 수 있다.
도 1은 셀룰로스에 의한 IVT RNA로부터의 dsRNA 풀다운을 나타내는 도면이다. 16% (v/v) EtOH을 함유한 1x STE 완충액 존재 하에서 셀룰로스 물질로 인큐베이션한 후, 50㎍의 2,500nt 길이의 m1Ψ-변형된 IVT RNA의 비결합된 분획물 및 결합된 분획물은 dsRNA-특이적 J2 항체를 사용하여 도트블롯팅에 의해 dsRNA 오염물을 분석하였다. 비교를 위해 비정제된 RNA (투입)를 병렬로 분석하였다. 해당 RNA 중 180 ng, 900 ng 및 1,800 ng RNA는 도트블롯 분석을 위해 적재하였다. RNA 무결성을 제어하기 위해 80 ng의 RNA를 1.4% (w/v) 아가로스겔 상에 적재하고 전기영동으로 분리하였다.
도 2는 셀룰로스에 의한 IVT RNA로부터의 dsRNA 제거 효율에 대한 EtOH의 상이한 농도의 영향을 나타내는 도면이다. 16% (v/v), 18% (v/v) 또는 20% (v/v) EtOH을 함유한 1x STE 완충액의 존재 하에 셀룰로스 물질로 인큐베이션한 후, 50㎍의 1,500 nt-길이인 Ψ-변형된 및 D2-캡핑된 IVT RNA의 비결합된 분획물 및 결합된 분획물은 dsRNA-특이적 J2 항체 또는 RNA-DNA 혼성-특이적 S 9.6 항체를 각각 사용하여 도트블롯팅에 의해 dsRNA 및 RNA/DNA 혼성 오염물을 분석하였다. 비교를 위해 비정제된 RNA (투입)를 병렬로 분석하였다. 해당 RNA 중 40 ng, 200 ng 및 1,000 ng RNA는 2개의 분리막 상에 적재하고, 각각 도트블롯 분석에서 표시된 항체와 홍성화하였다.
도 3은 RNase III 처리에 대한 IVT RNA의 셀룰로스 정제와 HPLC 정제의 비교를 나타내는 도면이다. 100㎍의 2,500 nt 길이의 m1Ψ-변형된 IVT RNA는 마이크로원심분리 스핀 컬럼 및 16% (v/v) EtOH을 함유한 1x STE 완충액을 사용하여 셀룰로스로 1x, 2x 또는 3x 정제하였다. dsRNA-특이적 J2 항체를 이용한 도트블롯팅으로 200 ng, 1,000 ng, 3,000 ng의 셀룰로스-정제된 RNA는 dsRNA 오염물에 대해 분석하였다. 비교를 위해 동일한 양의 비정제뿐만 아니라 RNaseIII 처리된 RNA 및 HPLC-정제된 RNA를 도트블롯 막에 적재하였다. 혼성화 신호는 농도계측에 의해 정량화되었고, 값은 비정제된 RNA로부터 제거된 dsRNA의 백분율로서 표시된다. RNA 무결성을 제어하기 위해 80 ng의 RNA를 1.4% (w/v) 아가로스겔에 로딩하고 전기영동으로 분리하였다.
도 4는 IVT RNA로부터 dsRNA를 제거할 때 셀룰로스의 여러 유형의 성능 비교를 나타내는 도면이다. 상이한 셀룰로스 (Sigma, C6288; Macherey-Nagel, MN 100 및 MN 2100), 마이크로원심분리 스핀 컬럼 및 16% (v/v) EtOH를 함유한 1x STE 완충액을 사용하여, 1 사이클의 정제 후 1,500nt-길이의 m1Ψ-변형된 IVT RNA 100㎍의 결합된 분획물 및 결합된 분획물은 도트블롯팅으로 분석하였다. dsRNA-특이적 J2 항체를 사용하여 dsRNA 오염물에 대해 80 ng, 400 ng 및 2,000 ng의 RNA 시료를 분석하였다. 비교를 위해 동일한 양의 비정제된 RNA (투입 RNA)를 도트블롯 막에 적재하였다. 혼성화 신호는 농도계측에 의해 정량화되었고, 값은 비정제된 RNA로부터 제거된 dsRNA의 백분율로서 표시된다. RNA 무결성을 모니터하기 위해 80 ng의 RNA을 1.4% (w/v) 아가로스겔에 로딩하고 전기영동으로 분리하였다.
도 5는 셀룰로스 정제 방법의 확장 가능성을 나타내는 도면이다. 1,900nt 길이의 D1-캡핑된 IVT RNA 5 mg을 진공 구동 여과 장치 및 16% (v/v) EtOH을 함유하는 1x STE 완충액을 사용하여 셀룰로스로 1x 또는 2x 정제하였다. dsRNA-특이적 J2 항체를 이용한 도트블롯팅으로 dsRNA 오염물에 대해서 40 ng, 200 ng, 1,000 ng의 셀룰로스-정제된 RNA를 분석하였다. 비교를 위해 동일한 양의 비정제된 RNA (투입 RNA)는 도트블롯 막에 적재하였다. 혼성화 신호는 농도계측에 의해 정량화되었고, 값은 비정제된 RNA로부터 제거된 dsRNA의 백분율로서 표시된다. RNA 무결성을 제어하기 위해 80 ng의 RNA를 1.4% (w/v) 아가로스겔에 로딩하고 전기영동으로 분리하였다. 두 시료의 RNA 회수율을 표시하였다.
도 6은 "양성" 정제 과정을 사용하여 다른 길이를 가진 IVT RNA의 정제를 나타내는 도면이다. 400㎍의 >10,000 nt-길이의 D1-캡핑된 IVT RNA, 1,300 nt 길이의 D2-캡핑된 IVT RNA (A) 및 2,500 nt 길이의 IVT RNA (비캡핑된) (B)는 2 사이클의 셀룰로스 정제에 사용하였다. 어떤 RNA도 뉴클레오사이드 변형을 포함하지 않았다. 첫 번째 사이클 동안 RNA는 16% (v/v) 함유한 완충액으로 용출 전에 40% (v/v) EtOH을 함유한 1x STE를 사용하여 셀룰로스에 완전히 결합시켰고, 셀룰로스 물질을 함유한 두 번째 마이크로원심분리 컬럼으로 옮겼다 ("양성" 정제). 표시된 양의 정제된 RNA는 dsRNA-특이적 J2 항체를 사용하는 도트블롯팅으로 dsRNA 오염물에 대해 분석하였다. 비교를 위해 동일한 양의 비정제된 RNA가 도트블롯 막에 적재하였다. RNA 무결성을 모니터링하기 위해 80 ng의 RNA를 1.4% (w/v) 아가로스겔에 로딩하고 전기영동으로 분리하였다.
도 7은 상이한 이온 강도를 갖는 완충액을 사용하는 IVT RNA의 정제를 나타내는 도면이다. 1,300 nt-길이의 m1Ψ-변형된 IVT RNA의 250㎍ (A) 또는 160㎍ (B)는 25-150mM NaCl (A) 또는 0-50mM NaCl (B)를 함유한 1x STE 완충액을 사용하여 셀룰로스-정제하였다. 16% (v/v) EtOH을 함유한 해당 완충액으로 용출한 후에, 0% (v/v) EtOH 완충액으로 용출시키기 전에, RNA는 40% (v/v) EtOH의 존재 하에서 셀룰로스에 완전히 결합하였다. 용출된 RNA의 40 ng, 200 ng, 1,000 ng 및 3,000 ng은 dsRNA-특이적 J2 항체를 사용하는 도트블롯팅으로 dsRNA 오염물에 대해 분석하였다. 낮은 회수율로 인해 40 ng, 200 ng 및 1,000 ng의 0% (v/v) EtOH로 용출된 RNA만 (B)의 도트블롯 분석을 위해 적재하였다. 비교를 위해 같은 양의 비정제된 RNA (투입 RNA)를 도트블롯 막에 적재하였다. 혼성화 신호는 농도계측에 의해 정량화되었고, 값은 비정제된 RNA로부터 제거된 dsRNA의 백분율로서 표시된다. RNA 무결성을 모니터링하기 위해 80 ng의 RNA를 1.4% (w/v) 아가로스겔에 로딩하고 전기영동으로 분리하였다.
도 8은 FPLC에 의한 IVT RNA의 셀룰로스 정제를 나타내는 도면이다. (A) 500㎍의 1,300 nt-길이의 m1Ψ-변형된 IVT RNA의 FPLC-크로마토그램을 나타내고, 여기서 RNA는 4 g의 셀룰로스 물질로 채워진 XK 16/20 컬럼 상에 로딩된다. 40% (v/v) EtOH을 함유하는 1x STE로 결합을 행하였고, 런닝 완충액의 EtOH 농도를 각각 16% (v/v) 및 0% (v/v)로 감소시킴으로써 ssRNA 및 dsRNA 오염물을 용출시켰다. 크로마토그램에서 회색 상자로 표시된 분획을 회수하였다 (F1: 16% EtOH 용출액, F2: 0% EtOH 용출액). (B) 분획 F1 및 F2로부터 회수된 RNA 40 ng, 200 ng, 1,000 ng 및 3000 ng은 dsRNA-특이적 J2 항체를 사용한 도트블롯팅으로 dsRNA 오염물에 대해 분석하였다. 비교를 위해 같은 양의 비정제된 RNA (투입 RNA)는 도트블롯 막에 적재하였다. 혼성화 신호는 농도계측에 의해 정량화되었고, 값은 비정제된 RNA로부터 제거된 dsRNA의 백분율로서 표시된다. RNA 무결성을 모니터하기 위해 RNA의 80ng을 1.4% (w/v) 아가로스겔에 로딩하고 전기영동으로 분리하였다.
도 9는 ssRNA 용출을 위한 다른 EtOH 농도를 사용하는 IVT RNA의 정제를 나타내는 도면이다. 1,500 nt-길이의 D1-캡핑된 IVT RNA 200㎍은 6%, 10%, 12%, 14%, 16, 18%, 20% 또는 24% (v/v) EtOH을 함유하는 1x STE 완충액을 사용하여 셀룰로스 -정제하고 ssRNA를 용출시켰다. 용출 전에 RNA는 40% (v/v) EtOH의 존재 하에서 셀룰로스에 완전히 결합되었다. 용출된 ssRNA의 200 ng, 1,000 ng 및 3,000 ng은 dsRNA-특이적 J2 항체 (A)를 사용한 도트블롯팅으로 dsRNA 오염물에 대해 분석하였다. 비교를 위해 같은 양의 비정제된 RNA (투입 RNA)가 도트블롯 막에 적재하였다. RNA 무결성을 모니터하기 위해 RNA의 80ng을 1.4% (w/v) 아가로스겔에 로딩하고 전기영동으로 분리하였다. (B) 혼성화 신호를 농도계측기로 정량하고 용출에 사용된 EtOH 농도 (실선)에 대해 값 (비정제된 RNA로부터 제거된 dsRNA의 백분율로 표시)을 플롯팅하고 개별 용출액로부터 회수된 RNA의 속도 (파선)와 비교하였다.
도 10은 셀룰로스의 RNA 결합능을 측정한 도면이다. 0.1 g 셀룰로스 (Sigma, C6288)는 마이크로원심분리 컬럼에서 40% (v/v) EtOH를 함유한 1x STE 500㎕에서 25㎍, 50㎍, 100㎍, 250㎍, 500㎍, 750㎍, 1,000㎍ 또는 1,500㎍의 1,500 nt-길이의 D1-캡핑된 IVT RNA로 인큐베이팅하였다. 원심분리에 의한 비결합된 RNA의 분리 후, 16% (v/v) EtOH 및 마지막으로 H2O (0% (v/v) EtOH)를 함유하는 1x STE로 셀룰로스-결합된 RNA를 단계적으로 용리시키는데, 우선은 16% (v/v) EtOH을 함유한 1x STE로 용리하고 최종적으로 H2O (0% (v/v) EtOH)로 용리하였다. 침전 후 통과액으로부터 회수된 RNA의 양 (A, B; 40% (v/v) EtOH, 실선), 16% (v/v) EtOH 용출액 (A, B; 파선) 및 0% (v/v) EtOH 용출액 (A, B; 점선)은 분광광도법에 의해 결정되었고, 정제에 사용된 RNA의 총량에 대해 플롯팅하였다. 값은 사용된 RNA의 총량 (A) 또는 회수된 RNA의 총 수율 (B)에 대한 회수율로 표시된다. 16% (v/v) 용출액에서 회수된 200ng, 1,000ng 및 3,000ng의 RNA는 dsRNA-특이적 J2 항체 (C)를 사용한 도트블롯팅으로 dsRNA 오염물에 대해 분석하였다. 비교를 위해 같은 양의 비정제된 RNA (투입 RNA)가 도트블롯 막에 적재하였다. RNA 무결성을 모니터링하기 위해 80 ng의 이들 RNA를 1.4% (w/v) 아가로스겔에 로딩하고 전기영동으로 분리하였다. 혼성화 신호를 농도계측기로 정량하고 값 (비정제된 RNA로부터 제거된 dsRNA의 백분율로 표시)을 정제에 사용된 RNA의 총량에 대해 플롯팅하고 (D; 실선) 개별적인 16% (v/v) EtOH 용출액으로부터 회수된 RNA의 속도와 비교하였다 (D; 파선).
도 11은 IVT RNA의 셀룰로스 정제가 번역 가능성과 면역원성에 미치는 영향을 나타내는 도면이다. 뮤린 에리스로포이에틴 (EPO)을 코딩하는 D1-캡핑된 IVT RNA (200 ㎍)는 미정제된 상태로 남겨 두거나, 셀룰로스 물질로 각각 채워진 2개의 스핀 컬럼을 사용하는 2-단계 절차에 의해 정제되었다: 제 1 컬럼: IVT RNA의 양성 정제 (즉, 40% (v/v) EtOH을 함유한 1x STE 완충액을 사용한 dsRNA 및 ssRNA의 결합; 16% (v/v) EtOH을 함유한 1x STE 완충액을 사용한 ssRNA의 용출); 제 2 컬럼: 제 1 컬럼으로부터 용출액의 음성 정제 (즉, ssRNA를 함유하고 16% EtOH을 함유한 1x STE 완충액을 사용함으로써 제 1 컬럼으로부터 얻은 용출액). 제 2컬럼으로부터 얻은 통과액은 이소프로판올/아세트산나트륨으로 침전시키고 H2O에 재용해시켰다. TransIT (Mirus Bio)로 제형화한 후, IVT RNA는 3㎍ RNA/동물의 용량으로 마우스 (n=4)에 복강내 주사하였다. 주사 후 2, 6 및 24시간에 혈액을 채취하고 혈장 시료를 회수하였다. 대조군 마우스에는 TransIT만이 주입되었다. 특이적 ELISA 분석 (뮤린 인터페론 알파-특이적 ELISA (eBioscience); 뮤린 EPO-특이적 DuoSet ELISA Development 키트(R&D))를 사용하여 뮤린 인터페론 알파 (A) 및 뮤린 EPO (B)의 수준을 측정하였다.
비록 본 발명을 하기에서 자세하게 설명할 것이나, 본 발명이 본 명세서에 기술된 특정 방법론, 프로토콜 및 시약에 한정되는 것으로 이해되어서는 안되며, 변화 가능할 수 있다. 또한 본원에 사용된 바와 같은 용어는 특정 구체적인 예를 설명하기 위함일 뿐이고, 첨부된 청구범위에 의해서만 제한되는 본 발명의 범위를 제한하고자 함이 아니다. 달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 사용된 기술 및 과학 용어는 당업계의 통상의 기술자가 일반적으로 이해하는 의미와 동일한 의미를 갖는다.
이하, 본 발명의 구성요소에 대하여 설명한다. 이들 요소는 특정 구체적인 예와 함께 열거되지만, 추가 구체적인 예를 생성하기 위해 임의의 방식 및 임의의 수로 조합될 수 있다고 이해되어야 한다. 다양하게 기술된 구체적인 예들 및 바람직한 구체적인 예들은 명시적으로 설명된 구체적인 예들로만 제한하여 본 발명을 해석하지 않는다. 본 명세서는 본 명세서에 개시된 및/또는 바람직한 요소들과 명시적으로 설명된 예를 결합한 구체적인 예를 개시하고 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 나아가, 본 명세서에 기술된 모든 요소의 순열 및 조합은 문맥상 달리 나타내지 않는 한 본 출원의 명세서에 의해 개시되는 것으로 고려되어야 한다. 예를 들어, 바람직한 실시형태에서 ssRNA가 120개의 뉴클레오타이드로 구성된 폴리(A)-꼬리를 포함하고 또 다른 바람직한 실시형태에서 ssRNA 분자가 5'-캡 유사체를 포함하는 경우, 바람직한 실시형태에서 ssRNA는 120개의 뉴클레오타이드로 구성된 폴리(A)-꼬리 및 5'-캡 유사체를 포함한다. 마찬가지로, 바람직한 실시형태에서 제 1 완충액 중의 EtOH 농도가 14 내지 16% (v/v)이고 또 다른 바람직한 실시형태에서 제 1 완충액 중의 킬레이트제의 농도가 15 내지 40mM인 경우, 바람직한 실시형태에서 제 1 완충액은 14 내지 16% (v/v)의 농도의 EtOH 및 15 내지 40mM의 농도의 킬레이트제를 포함한다.
바람직하게는, 본 발명에서 사용된 용어는 "A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)"(H.G.W. Leuenberger, B. Nagel, 및 H. Koelbl, Eds., Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland, (1995))에 설명된 바에 의하여 정의된다.
본 발명의 실시는 달리 명시하지 않는 한, 당 분야의 문헌에서 설명되는 화학, 생화학, 세포 생물학, 면역학 및 재조합 DNA 기술의 종래 방법을 사용할 것이다 (예를 들어, 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, J. Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989] 참고).
본 명세서 및 이하 청구범위 전반에 걸쳐 달리 명시하지 않는 한, 단어 "포함하다" 및 "포함하는" 및 "포함하는"과 같은 변형은 명시된 구성원, 정수 또는 단계 또는 구성원, 정수 또는 단계의 그룹을 포함하지만 임의의 다른 구성원, 정수 또는 단계 또는 구성원, 정수 또는 단계의 그룹을 제외하지 않아야 됨을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 용어 "본질적으로 구성된"은 본질적으로 중요한 임의의 다른 구성원, 정수 또는 단계를 제외하는 것을 의미한다. 용어 "포함하는"은 "본질적으로 구성된"이라는 용어를 포함하고, 이는 다시 "구성된"이라는 용어를 포함한다. 따라서, 본 명세서에서 각각의 경우에 "포함하는"이라는 용어는 "본질적으로 구성된" 또는 "구성된"이라는 용어로 대체될 수 있다. 마찬가지로, 본 명세서에서 각각의 경우에 "본질적으로 구성된"이라는 용어는 "구성된"이라는 용어로 대체될 수 있다.
본 발명을 설명하는 문맥에서(특히, 본 청구범위의 문맥상) 사용되는 용어 "하나"와 "한(부정관사)" 및 "정관사" 및 유사한 참조용어는 본원에서 달리 명시되지 않거나 문맥에 의해 분명하게 부정되지 않는 한, 단수와 복수 둘 모두를 포함하는 것으로 해석될 수 있다. 본 발명의 값들을 범위로 인용하는 것은 단지 해당 범위에 속하는 각각의 별개의 값들을 개별적으로 손쉽게 칭하기 위한 것이다. 본원에서 달리 명시되지 않으면, 각각의 개별 값은 본원에서 개별적으로 지칭되는 것처럼 본 명세서 내로 편입된 것으로 간주한다. 본원에서 설명되는 모든 방법은 본원에서 달리 명시되지 않거나 문맥에 의해 명백하게 부정되지 않으면, 적절한 임의의 순서로 수행될 수 있다. 본원에서 제공된, 임의 및 모든 실례, 또는 예시적 어법(가령, "예를 들면")의 이용은 단지 본 발명을 더욱 잘 조명하기 위해 의도된 것이고, 청구되는 본 발명의 범위에 한정을 달리 부가하는 것은 아니다. 본 명세서에서 어떠한 어법도 발명의 실시에 필수적인 임의의 청구되지 않은 구성 요소를 지칭하는 것으로 해석되어서는 안된다.
본 명세서의 본문 전반에 걸쳐 몇가지 문헌들이 인용된다. 본원에서 인용된 각각의 상기 또는 하기 문헌들(모든 특허, 특허출원, 과학간행물, 제조업체의 설명서, 지침서 등)은 그 내용 전체가 그 이상 또는 그 이하를 불문하고 본원에 참조 병합된다. 이들 문헌들이 선행발명임을 이유로, 본 발명이 이러한 개시내용에 선행한다고 하지 못함을 인정하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
본원에 사용된 바와 같이 "dsRNA를 셀룰로스 물질에 결합시키는 조건"이란 셀룰로스 물질에 dsRNA의 부착 (바람직하게는 비공유 부착 또는 흡착)을 선호하고(예를 들어, 향상시키고), 셀룰로스 물질로부터 셀룰로스 물질에 결합된 dsRNA의 방출을 억제하고/하거나 유리 dsRNA (즉, 셀룰로스 물질에 결합되지 않은 dsRNA)의 양을 감소시키는 조건을 의미한다. 이들 조건은 셀룰로스 물질에 dsRNA 이외의 RNA (예를 들어, ssRNA)을 결합시키거나 결합시키지 않는 조건일 수 있다. 따라서, 일 실시형태에서, 표현 "dsRNA를 셀룰로스 물질에 결합시키는 조건"은 "dsRNA를 셀룰로스 물질에 결합시키고 ssRNA를 셀룰로스 물질에 결합시키지 않는 조건"이다. 이 실시형태에서, 조건은 (i) 셀룰로스 물질에 dsRNA의 부착 (바람직하게는 비공유 부착 또는 흡착)을 선호하고(예를 들어, 향상시키고), 셀룰로스 물질로부터 셀룰로스 물질에 결합된 dsRNA의 방출을 억제하고, 및/또는 유리 dsRNA의 양 (즉, 셀룰로스 물질에 결합되지 않은 dsRNA의 양)을 감소시키며, (ii) ssRNA의 비결합 상태(즉, 셀룰로스 물질에 부착 또는 흡착되지 않은 ssRNA의 상태)를 선호하고(예를 들어, 향상시키고), 셀룰로스 물질에 부착된(바람직하게는, 비공유적으로 부착 또는 흡착된) ssRNA의 양을 감소시키고, 및/또는 셀룰로스 물질에 ssRNA의 부착(바람직하게는, 비공유 부착 또는 흡착)을 억제시킨다. 또 다른 일 실시형태에서, 표현 "dsRNA를 셀룰로스 물질에 결합시키는 조건"은 "dsRNA 및 ssRNA를 셀룰로스 물질에 결합시키는 조건"이다. 이러한 또 다른 실시형태에서, 조건은 dsRNA 및 ssRNA를 셀룰로스 물질에 대한 부착 (바람직하게는 비공유 부착 또는 흡착)을 선호하고(예를 들어, 향상시키고), 셀룰로스 물질로부터 셀룰로스 물질에 결합된 dsRNA 및 ssRNA의 방출을 억제하고 및/또는 유리 dsRNA 및 ssRNA의 양 (즉, 셀룰로스 물질에 결합되지 않은 dsRNA 및 ssRNA의 양)을 감소시킨다.
dsRNA/ssRNA를 셀룰로스 물질에 결합시키거나 결합시키지 않는 상기 조건은 dsRNA/ssRNA를 포함하는 RNA 제제가 용해되거나 셀룰로스 물질에 첨가되는 배지 조성물(예컨대, 완충액의 조성물)에 의해 제어할 수 있다. 이와 관련하여, "조성물"은 배지(예를 들어, 완충액 내)에 함유된 성분의 유형 및 양을 의미한다.
따라서, 일 실시형태에서, "dsRNA를 셀룰로스 물질에 결합시키고 ssRNA를 셀룰로스 물질에 결합시키지 않는 조건"은 dsRNA를 셀룰로스 물질에 결합시키고 ssRNA를 셀룰로스 물질에 결합시키지 않는 농도로 물, 에탄올 및 염을 포함하는 제 1 배지 (예를 들어, 제 1 완충액)에 의해 달성될 수 있다. 따라서, 이러한 조건을 충족시키기 위해서, 단계 (ii)에서의 RNA 제제는 ssRNA 및 제 1 배지 (예를 들어, 제 1 완충액)을 포함하는 액체로서 제공될 수 있거나; 셀룰로스 물질은 제 1 배지 (예를 들어, 제 1 완충액) 중의 현탁액으로서 제공될 수 있거나 (예를 들어, 세정된 셀룰로스 물질로서는, 제 1 배지 (예를 들어, 제 1 완충액)이 세정액으로 사용되고 있다); RNA 제제는 ssRNA 및 제 1 배지 (예를 들어, 제 1 완충액)을 포함하는 액체로서 제공될 수 있고 셀룰로스 물질은 제 1 배지 (예를 들어, 제 1 완충액) 중의 현탁액으로서 제공될 수 있거나; RNA 제제는 ssRNA 및 제 1 배지 (예를 들어, 제 1 완충액)를 포함하는 액체로서 제공될 수 있고 셀룰로스 물질은 건식형으로 세정된 셀룰로스 물질로서 (여기서 제 1 배지 (예를 들어, 제 1 완충액)는 세정액으로 사용되고 있다) 또는 제 1 배지 (예를 들어, 제 1 완충액) 내 현탁액으로서 제공될 수 있다.
"dsRNA를 셀룰로스 물질에 결합시키고 ssRNA를 셀룰로스 물질에 결합시키지 않는 농도"라는 표현은 제 1 배지(예를 들어, 제 1 완충액) 중의 성분들(특히 물, 에탄올 및 염)의 농도가 셀룰로스 물질에 dsRNA의 부착 (바람직하게는 비공유 부착 또는 흡착)을 선호하고(예를 들어, 향상시키고), 제 1 배지 (예를 들어, 제 1 완충액) 내에서 셀룰로스 물질로부터 셀룰로스 물질에 결합된 dsRNA의 방출을 억제하고, 및/또는 제 1 배지 (예를 들어, 제 1 완충액) 내에서 유리 dsRNA의 양 (즉, 셀룰로스 물질에 결합되지 않은 dsRNA의 양)을 감소시키며, (ii) ssRNA의 비결합 상태 (즉, 셀룰로스 물질에 부착 또는 흡착되지 않은 ssRNA의 상태)를 선호하고(예를 들어, 향상시키고), 셀룰로스 물질에 부착된 (바람직하게는, 비공유적으로 부착 또는 흡착된) ssRNA의 양을 감소시키고, 및/또는 셀룰로스 물질에 ssRNA의 부착 (바람직하게는 비공유 부착 또는 흡착)을 억제하기에 충분한 농도인 것을 의미한다.
또한, 일 실시형태에서, "dsRNA 및 ssRNA를 셀룰로스 물질에 결합시키는 조건"은 dsRNA 및 ssRNA를 셀룰로스 물질에 결합시키는 농도로 물, 에탄올 및 염을 포함하는 제 2의 배지 (예를 들어, 제 2 완충액)에 의해 달성될 수 있다. 따라서, 이들 조건을 충족시키기 위해, 단계 (ii)에서 RNA 제제는 ssRNA 및 제 2 배지 (예를 들어, 제 2 완충액)를 포함하는 액체로서 제공될 수 있거나; 셀룰로스 물질은 제 2 배지 (예를 들어, 제 2 완충액) 중의 현탁액으로서 제공될 수 있거나 (예를 들어, 세정된 셀룰로스 물질로서는 제 2 배지 (예를 들어, 제 2 완충액)가 세정액으로서 사용되고 있다); RNA 제제는 ssRNA 및 제 2 배지 (예를 들어, 제 2 완충액)를 포함하는 액체로서 제공될 수 있고 셀룰로스 물질은 제 2 배지 (예를 들어, 제 2 완충액) 중의 현탁액으로서 제공될 수 있거나; RNA 제제는 ssRNA 및 제 2 배지 (예를 들어, 제 2 완충액)를 포함하는 액체로서 제공될 수 있고 셀룰로스 물질은 건식형으로 세정된 셀룰로스 물질로서 (여기서 제 2 배지 (예를 들어, 제 2 완충액)는 세정액으로 사용되고 있다) 또는 제 2 배지 (예를 들어, 제 2 완충액) 내 현탁액으로서 제공될 수 있다.
"dsRNA 및 ssRNA를 셀룰로스 물질에 결합시키는 농도"라는 표현은 제 2 배지 (예를 들어, 제 2 완충액) 중의 성분들(특히 물, 에탄올 및 염)의 농도가 셀룰로스 물질에 dsRNA 및 ssRNA의 부착 (바람직하게는 비공유 부착 또는 흡착)을 선호하고(예를 들어, 향상시키고), 제 2 배지 (예를 들어, 제 2 완충액) 내에서 셀룰로스 물질로부터 셀룰로스 물질에 결합된 dsRNA 및 ssRNA의 방출을 억제하고, 및/또는 제 2 배지 (예를 들어, 제 2 완충액) 내에서 유리 dsRNA 및 ssRNA의 양 (즉, 셀룰로스 물질에 결합되지 않은 dsRNA 및 ssRNA의 양)을 감소시키기에 충분한 농도인 것을 의미한다.
본 발명자들은 놀랍게도 ssRNA가 아닌 dsRNA가 14 내지 20% (v/v)의 농도로 에탄올의 존재 하에 셀룰로스 물질에 선택적으로 결합한다는 것을 발견하였다. 따라서, 일 실시형태에서 "dsRNA를 셀룰로스 물질에 결합시키고 ssRNA를 셀룰로스 물질에 결합시키지 않는 조건"은 상기 명시된 바와 같이 14 내지 20% (v/v), 바람직하게는 14 내지 19% (v/v), 보다 바람직하게는 14 내지 18% (v/v), 예컨대 14 내지 17% (v/v), 14 내지 16% (v/v), 15 내지 19% (v/v), 15 내지 18% (v/v), 15 내지 17% (v/v), 16 내지 19% (v/v), 또는 16 내지 18% (v/v)의 농도로 에탄올을 함유하는 제 1 배지 (예를 들어, 제 1 완충액)에 의해 달성될 수 있다. 일 실시형태에서, 제 1 배지 (예를 들어, 제 1 완충액)는 상기 개시된 범위의 에탄올뿐만 아니라 15 내지 70mM, 바람직하게는 20 내지 60mM 예컨대 25 내지 50mM 또는 30 내지 50 mM의 농도로 염을 포함한다. 제 1 배지 (예를 들어, 제 1 완충액) 중의 염은 바람직하게는 염화나트륨이다. 그러나, 본 명세서에 제공된 정보 및 데이터에 기초하여, 당업자는 본 발명의 방법에 사용되는 제 1 배지 (예를 들어, 제 1 완충액)에 적합한 다른 염 및 이들의 농도를 용이하게 결정할 수 있다. 제 1 배지 (예를 들어, 제 1 완충액) 중의 추가적인 임의의 성분들은 완충 물질 (바람직하게는 TRIS 또는 HEPES, 보다 바람직하게는 TRIS) 및/또는 킬레이트제 (바람직하게는 EDTA 또는 니트릴로트리아세트산, 보다 바람직하게는 EDTA)를 포함한다. 일 실시형태에서, 제 1 배지 (예를 들어, 제 1 완충액) 중의 완충 물질의 농도는 5 내지 40mM, 바람직하게는 6 내지 30mM, 예컨대 8 내지 20mM 또는 10 내지 15mM이다. 일 실시형태에서, 제 1 배지 (예를 들어, 제 1 완충액)의 pH는 6.5 내지 8.0, 바람직하게는 6.7 내지 7.8, 예컨대 6.8 내지 7.2 (예를 들어, TRIS가 완충 물질인 경우) 또는 7.3 내지 7.7 (예를 들어, HEPES가 완충 물질인 경우)이다. 일 실시형태에서, 제 1 배지 (예를 들어, 제 1 완충액) 중의 킬레이트제의 농도는 10 내지 50mM, 바람직하게는 15 내지 40mM 예컨대 20 내지 30mM이다.
일 실시형태에서, 제 1 배지 (예를 들어, 제 1 완충액)는 바람직하게는 제 1 배지 (예를 들어, 제 1 완충액)에 대해 상기 명시된 농도로 물, 에탄올, TRIS 및 EDTA (예컨대 물, 에탄올, 염 (바람직하게는 염화나트륨), TRIS 및 EDTA)를 포함한다. 그러나, 본원에 제공된 정보 및 데이터에 기초하여, 당업자는 TRIS 이외의 완충 물질 및/또는 EDTA 이외의 킬레이트제 및/또는 염화나트륨 이외의 염뿐만 아니라 본 발명의 방법에 사용될 제 1 배지 (예를 들어, 제 1 완충액)에 적합한 이들의 농도를 용이하게 결정할 수 있다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 제 1 배지 (예를 들어, 제 1 완충액)는 상기 개시된 범위 (즉, 14 내지 20% (v/v) 등)의 에탄올에 추가하여, 5 내지 40mM의 양인 TRIS 및 15 내지 70mM의 양인 염 (바람직하게는 염화나트륨)을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 제 1 배지 (예를 들어, 제 1 완충액)는 상기 개시된 범위 (즉, 14 내지 20% (v/v) 등)의 에탄올에 추가하여, 5 내지 40mM의 양인 HEPES 및 100 내지 150mM (예를 들어, 110 내지 140mM 또는 120 내지 130 mM)의 양인 염 (바람직하게는 염화나트륨)을 포함한다.
일 실시형태에서, "dsRNA 및 ssRNA를 셀룰로스 물질에 결합시키는 조건"은 상기 명시된 바와 같이 적어도 35% (v/v), 바람직하게는 적어도 36% (v/v), 적어도 37% (v/v), 적어도 38% (v/v), 적어도 39% (v/v), 적어도 40% (v/v), 예컨대 35 내지 45% (v/v), 36 내지 45% (v/v), 37 내지 45% (v/v), 38 내지 45% (v/v), 38 내지 42% (v/v), 또는 39 내지 41% (v/v)의 농도로 에탄올을 함유하는 제 2 배지 (예를 들어, 제 2 완충액)에 의해 달성될 수 있다. 일 실시형태에서, 제 2 배지 (예를 들어, 제 2 완충액)는 상기 개시된 범위 (즉, 적어도 35% (v/v), 적어도 36% (v/v), 적어도 37% (v/v), 적어도 38% (v/v) 등)의 에탄올에 추가하여, 15 내지 70mM, 바람직하게는 20 내지 60mM 예컨대 25 내지 50mM 또는 30 내지 50 mM의 농도로 염을 포함한다. 제 2 배지 (예를 들어, 제 2 완충액) 중의 염은 바람직하게는 염화나트륨이다. 그러나, 본원에 제공된 정보 및 데이터에 기초하여, 당업자는 본 발명의 방법에서 사용될 제 2의 배지 (예를 들어, 제 2 완충액)에 적합한 다른 염 및 이들의 농도를 용이하게 결정할 수 있다. 제 2 배지의 추가적인 임의의 성분들 (예를 들어, 제 2 완충액)은 완충 물질 (바람직하게는 TRIS 또는 HEPES, 보다 바람직하게는 TRIS) 및/또는 킬레이트제 (바람직하게는 EDTA 또는 니트릴로트리아세트산, 보다 바람직하게는 EDTA)를 포함한다. 일 실시형태에서, 제 2 배지 (예를 들어, 제 2 완충액) 중의 완충 물질의 농도는 5 내지 40mM, 바람직하게는 6 내지 30mM, 예컨대 8 내지 20mM 또는 10 내지 15mM이다. 일 실시형태에서, 제 2 배지 (예를 들어, 제 2 완충액)의 pH는 6.5 내지 8.0, 바람직하게는 6.7 내지 7.8, 예컨대 6.8 내지 7.2 (예를 들어, TRIS가 완충 물질인 경우) 또는 7.3 내지 7.7 (예를 들어, HEPES가 완충 물질인 경우)이다. 일 실시형태에서, 제 2 배지 (예를 들어, 제 2 완충액) 중의 킬레이트제의 농도는 10 내지 50mM, 바람직하게는 15 내지 40mM 예컨대 20 내지 30mM이다.
일 실시형태에서, 제 2 배지 (예를 들어, 제 2 완충액)는 바람직하게는 제 2 배지 (예를 들어, 제 2 완충액)에 대해 상기 명시된 농도로 물, 에탄올, TRIS 및 EDTA (예컨대 물, 에탄올, 염 (바람직하게는 염화나트륨), TRIS 및 EDTA)를 포함한다. 그러나, 본원에 제공된 정보 및 데이터에 기초하여, 당업자는 TRIS 이외의 완충 물질 및/또는 EDTA 이외의 킬레이트제 및/또는 염화나트륨 이외의 염뿐만 아니라 본 발명의 방법에 사용될 제 2 배지 (예를 들어, 제 2 완충액)에 적합한 이들의 농도를 용이하게 결정할 수 있다. 일 실시형태에서, 제 2 배지 (예를 들어, 제 2 완충액)는 상기 개시된 범위 (즉, 적어도 35% (v/v), 적어도 36% (v/v), 적어도 37% (v/v), 적어도 38% (v/v) 등)의 에탄올에 추가하여, 5 내지 40mM의 양인 TRIS 및 15 내지 70mM의 양인 염 (바람직하게는 염화나트륨)을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 제 2 배지 (예를 들어, 제 2 완충액)는 상기 개시된 범위 (즉, 적어도 35% (v/v), 적어도 36% (v/v), 적어도 37% (v/v), 적어도 38% (v/v) 등)의 에탄올에 추가하여, 5 내지 40mM의 양인 HEPES 및 100 내지 150mM (예를 들어, 110 내지 140mM 또는 120 내지 130 mM)의 양인 염 (바람직하게는 염화나트륨)을 포함한다.
일 실시형태에서, 제 1 및 제 2 배지 (즉, 제 1 및 제 2 완충액)는 에탄올의 농도뿐만 아니라 하나 이상의 다른 성분들 (예컨대 염, 임의의 완충 물질 및/또는 임의의 킬레이트제)의 유형 및/또는 농도에서 상이하다. 바람직한 일 실시형태에서, 제 1 및 제 2 배지 (즉, 제 1 및 제 2 완충액)는 에탄올의 농도를 제외하고는 동일한 조성 (즉, 물 이외의 성분들, 예컨대 염, 임의의 완충 물질 및 임의의 킬레이트제의 유형 및 농도에 대하여)을 갖는다.
본원에 사용된 바와 같이 "dsRNA를 셀룰로스 물질에 결합시키는 조건 하에서 셀룰로스 물질로부터 ssRNA를 분리하는"이라는 표현은 ssRNA를 포함하는 상 (상기상은 바람직하게는 액체이다)이 dsRNA가 결합된 셀룰로스 물질로부터 분리되어야 한다는 것을 의미한다. 이러한 단리/분리는 당업자에게 공지된 여러 가지 방법, 예를 들어 dsRNA가 결합된 셀룰로스 물질만을 선택적으로 제거(예를 들어, 셀룰로스 물질로서 자성 비드에 공유결합된 셀룰로스를 사용하고 자석을 사용하여)함으로써 또는 ssRNA를 포함하는 상만을 회수(예컨대 피펫을 사용하여)함으로써 달성될 수 있다.
예를 들어, 일 실시형태에서, RNA 제제, 셀룰로스 물질 및 제 1 완충액의 혼합물은 튜브 내에 제공된다 (본 실시형태에서, (α) RNA 제제는 ssRNA 및 제 1 완충액을 포함하는 액체로서 제공되고, (β) 셀룰로스 물질은 건식형으로 세정된 셀룰로스 물질로서 (여기서 제 1 완충액은 세정액으로 사용되고 있다) 또는 제 1 배지 (예를 들어, 제 1 완충액) 내 현탁액으로서 제공되고, 및/또는 (γ) RNA 제제, 셀룰로스 물질, 및 제 1 완충액은 진탕 및/또는 교반 하에서 (바람직하게는 적어도 5분 동안, 보다 바람직하게는 적어도 10분 동안, 예컨대 5 내지 30분 또는 10 내지 20분 동안) 혼합하는 것이 바람직하고; (α) RNA 제제는 ssRNA 및 제 1 완충액을 포함하는 액체로서 제공되고, (β) 셀룰로스 물질은 건식형으로 세정된 셀룰로스 물질로서 (여기서 제 1 완충액은 세정액으로 사용되고 있다) 또는 제 1 배지 (예를 들어, 제 1 완충액) 내 현탁액으로서 제공되고, 및 (γ) RNA 제제, 셀룰로스 물질, 및 제 1 완충액은 진탕 및/또는 교반 하에서, 예를 들어, 5 내지 30분 또는 10 내지 20분 동안 동안 혼합하는 것이 바람직하다). 이 실시형태에서, 단계 (iii)은 (1) 중력 또는 원심력 (예를 들어, 10,000xg 내지 15,000xg 1 내지 5분 동안)을 튜브에 가하여 액체 및 고체상을 분리시키는(바람직하게는 완전하게 분리시키는) 단계; 및 (2) (예컨대 피펫을 사용하여) ssRNA를 포함하는 상등액을 회수하거나 (예를 들어, 셀룰로스 물질로서 자성 비드에 공유결합된 셀룰로스를 사용하고 자석을 사용하여) 셀룰로스 물질을 제거하는 단계를 포함하는 것이 바람직하다. 단계 (ii) 및 (iii)은 1회 또는 2회 이상 (예를 들어, 1회, 2회 또는 3회) 반복될 수 있다. 단계 (ii) 및 (iii)이 반복되는 경우, 하나의 사이클의 단계 (iii) 이후에 수득된 ssRNA 제제는 다음 (즉, 바로 다음) 사이클의 단계 (ii)에서 RNA 제제로서 사용되고 각 사이클에서 신선한 셀룰로스 물질 (바람직하게는 세정된 신선한 셀룰로스 물질)이 사용된다.
또 다른 일 실시형태에서, RNA 제제, 셀룰로스 물질 및 제 1 완충액의 혼합물은 스핀 컬럼 또는 여과 장치에 제공된다 (본 실시형태에서, (α) RNA 제제는 ssRNA 및 제 1 완충액을 포함하는 액체로서 제공되고 및/또는 (β) 셀룰로스 물질은 건식형으로 세정된 셀룰로스 물질로서 (여기서 제 1 완충액은 세정액으로 사용되고 있다) 또는 제 1 배지 (예를 들어, 제 1 완충액) 내 현탁액으로서 제공되고, 및/또는 (γ) RNA 제제, 셀룰로스 물질, 및 제 1 완충액은 진탕 및/또는 교반 하에서 (바람직하게는 적어도 5분 동안, 보다 바람직하게는 적어도 10분 동안, 예컨대 5 내지 30분 또는 10 내지 20분 동안) 혼합되는 것이 바람직하고; (α) RNA 제제는 ssRNA 및 제 1 완충액을 포함하는 액체로서 제공되고, (β) 셀룰로스 물질은 건식형으로 세정된 셀룰로스 물질로서 (여기서 제 1 완충액은 세정액으로 사용되고 있다) 또는 제 1 배지 (예를 들어, 제 1 완충액) 내 현탁액으로서 제공되고, (γ) RNA 제제, 셀룰로스 물질, 및 제 1 완충액은 진탕 및/또는 교반 하에서, 예를 들어, 5 내지 30분 또는 10 내지 20분 동안 혼합되는 것이 가장 바람직하다). 이 실시형태에서, 단계 (iii)은 (1') 스핀 컬럼 또는 여과 장치에 중력, 원심력 (예를 들어, 10,000xg 내지 15,000xg 1 내지 5분 동안), 압력 (예를 들어, 1000hPa 내지 3000hPa), 또는 진공 (예를 들어, 100hPa 내지 900hPa, 예컨대 200hPa 내지 800hPa)을 가하여 액체 및 고체상을 분리시키는(바람직하게는 완전하게 분리시키는) 단계; 및 (2') ssRNA를 포함하는 통과액을 회수하는 단계를 포함하는 것이 바람직하다. 단계 (ii) 및 (iii)은 1회 또는 2회 이상 (예컨대 1회, 2회 또는 3회) 반복될 수 있다. 단계 (ii) 및 (iii)이 반복되는 경우, 하나의 사이클의 단계 (iii) 이후에 수득된 ssRNA 제제는 다음 (즉, 바로 다음) 사이클의 단계 (ii)에서 RNA 제제로서 사용되고 각 사이클에서 신선한 셀룰로스 물질 (바람직하게는 세정된 신선한 셀룰로스 물질)이 사용된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "dsRNA 및 ssRNA가 결합된 셀룰로스 물질을 잔여물로부터 분리하는"이라는 표현은 dsRNA 및 ssRNA가 부착된 (바람직하게는 비공유적으로 부착 또는 흡착된) 고체상 (즉, 셀룰로스 물질)이 다른 상 (바람직하게는 액체인 상기 다른 상)으로부터 단리될 수 있는 것을 의미한다. 이러한 단리/분리는 당업자에게 공지된 여러 가지 방법, 예를 들어 dsRNA 및 ssRNA가 결합된 셀룰로스 물질만을 선택적으로 회수(예를 들어, 셀룰로스 물질로서 자성 비드에 공유결합된 셀룰로스를 사용하고 자석을 사용하여)함으로써 또는 다른 상만을 제거(예컨대 피펫을 사용하여)함으로써 달성될 수 있다.
예를 들어, 일 실시형태에서, RNA 제제, 셀룰로스 물질 및 제 2 완충액의 혼합물은 튜브 내에 제공된다 (본 실시형태에서, (α') RNA 제제는 ssRNA 및 제 2 완충액을 포함하는 액체로서 제공되고 및/또는 (β') 셀룰로스 물질은 건식형으로 세정된 셀룰로스 물질로서 (여기서 제 2 완충액은 세정액으로 사용되고 있다) 또는 제 2 배지 (예를 들어, 제 2 완충액) 내 현탁액으로서 제공되고, 및/또는 (γ') RNA 제제, 셀룰로스 물질, 및 제 2 완충액은 진탕 및/또는 교반 하에서 (바람직하게는 적어도 5분 동안, 보다 바람직하게는 적어도 10분 동안, 예컨대 5 내지 30분 또는 10 내지 20분 동안) 혼합되는 것이 바람직하고; (α') RNA 제제는 ssRNA 및 제 2 완충액을 포함하는 액체로서 제공되고, (β') 셀룰로스 물질은 건식형으로 세정된 셀룰로스 물질로서 (여기서 제 2 완충액은 세정액으로 사용되고 있다) 또는 제 2 배지 (예를 들어, 제 2 완충액) 내 현탁액으로서 제공되고, (γ') RNA 제제, 셀룰로스 물질, 및 제 2 완충액은 진탕 및/또는 교반 하에서 예를 들어, 5 내지 30분 또는 10 내지 20분 동안 혼합되는 것이 가장 바람직하다). 이 실시형태에서, 단계 (ii)(2) (즉, "dsRNA 및 ssRNA가 결합된 셀룰로스 물질을 잔여물로부터 분리하는 단계")는 (2a) 중력 또는 원심력 (예를 들어, 10,000xg 내지 15,000xg 1 내지 5분 동안)을 튜브에 가하여 액체 및 고체상을 분리시키는(바람직하게는 완전하게 분리시키는) 단계; (2b) 상등액을 제거하거나 (예컨대 피펫을 사용하여) 또는 (예컨대 셀룰로스 물질로서 자성 비드에 공유결합된 셀룰로스를 사용하고 자석을 사용하여) dsRNA와 ssRNA가 결합된 셀룰로스 물질을 회수하는 단계를 포함하는 것이 바람직하다. 단계 (ii)는 (3) dsRNA 및 ssRNA가 첨가된 셀룰로스 물질에 제 2 완충액의 분취량 (바람직하게는 셀룰로스 물질의 부피의 0.5 내지 3배 (예컨대 1 내지 2배)인 분취량)을 첨가하는 단계; (4) 진탕 및/또는 교반 하에서 얻어진 혼합물을 (바람직하게는 5 내지 20분 또는 10 내지 15분 동안) 인큐베이팅하는 단계; 및 (5) dsRNA 및 ssRNA가 결합된 셀룰로스 물질을 액체상으로부터 분리하는 단계 (바람직하게는 분리는 상기 단계 (2a) 및 (2b)에서 정의된 바와 동일한 방식으로 수행된다); 및 선택적으로 (6) 단계 (3) 내지 (5)를 1회 또는 2회 이상 (예를 들어, 1회, 2회 또는 3회) 반복하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 단계 (iii)은 (1) 진탕 및/또는 교반 하에서 (바람직하게는 적어도 5분 동안, 보다 바람직하게는 적어도 10분 동안, 예컨대 5 내지 30분 또는 10 내지 20분 동안) dsRNA 및 ssRNA가 결합된 셀룰로스 물질을 상기 명시된 바와 같은 제 1 완충액 (예를 들어, EtOH 농도는 14 내지 20% (v/v), 바람직하게는 14 내지 16% (v/v)이다)과 혼합하는 단계; 및 (2) ssRNA를 포함하는 액체상을 셀룰로스 물질로부터 분리하는 단계 (바람직하게는 ssRNA를 포함하는 액체상을 셀룰로스 물질로부터 분리하는 단계는 상기 명시된 바와 같이, 예를 들어, 중력 또는 원심력 (예를 들어, 10,000xg 내지 15,000xg 1 내지 5분 동안)을 튜브에 가하여 액체 및 고체상을 분리(바람직하게는 완전하게 분리)시킴으로써 수행된다); 및 (2) (예를 들어 피펫을 사용하여) ssRNA를 포함하는 상등액을 회수하거나 (예를 들어, 셀룰로스 물질로서 자성 비드에 공유결합된 셀룰로스를 사용하고 자석을 사용하여) 셀룰로스 물질을 제거하는 단계를 포함할 수 있다. 단계 (ii) 및 (iii)은 1회 또는 2회 이상 (예를 들어, 1회, 2회 또는 3회) 반복될 수 있다. 단계 (ii) 및 (iii)을 반복하는 경우, 하나의 사이클의 단계 (iii) 이후에 수득된 ssRNA 제제는 다음 (즉, 바로 다음) 사이클의 단계 (ii)에서 RNA 제제로서 사용되고 각 사이클에서 신선한 셀룰로스 물질 (바람직하게는 세정된 신선한 셀룰로스 물질)이 사용된다.
또 다른 일 실시형태에서, RNA 제제, 셀룰로스 물질, 및 제 2 완충액의 혼합물은 스핀 컬럼 또는 여과 장치에 제공된다 (이 실시형태에서, (α') RNA 제제는 ssRNA 및 제 2 완충액을 포함하는 액체로서 제공되고 및/또는 (β') 셀룰로스 물질은 건식형으로 세정된 셀룰로스 물질로서 (여기서 제 2 완충액은 세정액으로 사용되고 있다) 또는 제 2 배지 (예를 들어, 제 2 완충액) 내 현탁액으로서 제공되고, 및/또는 (γ') RNA 제제, 셀룰로스 물질, 및 제 2 완충액은 진탕 및/또는 교반 하에서 (바람직하게는 적어도 5분 동안, 보다 바람직하게는 적어도 10분 동안, 예컨대 5 내지 30분 또는 10 내지 20분 동안) 혼합되는 것이 바람직하고; (α') RNA 제제는 ssRNA 및 제 2 완충액을 포함하는 액체로서 제공되고, (β') 셀룰로스 물질은 건식형으로 세정된 셀룰로스 물질로서 (여기서 제 2 완충액은 세정액으로 사용되고 있다) 또는 제 2 배지 (예를 들어, 제 2 완충액) 내 현탁액으로서 제공되고, 및 (γ') RNA 제제, 셀룰로스 물질, 및 제 2 완충액은 진탕 및/또는 교반 하에서 예를 들어, 5 내지 30분 또는 10 내지 20분 동안 혼합되는 것이 가장 바람직하다). 이 실시형태에서, 단계 (ii)(2) (즉, "dsRNA 및 ssRNA가 결합된 셀룰로스 물질을 잔여물로부터 분리하는 단계")는 (2a') 중력, 원심력 (예를 들어, 10,000xg 내지 15,000xg 1 내지 5분 동안), 압력 (예를 들어, 1000hPa 내지 3000hPa), 또는 진공 (예를 들어, 100hPa 내지 900hPa, 예컨대 200hPa 내지 800hPa)을 스핀 컬럼 또는 여과 장치에 가하여 액체 및 고체상을 분리시키는(바람직하게는 완전하게 분리시키는) 단계; 및 (2b') 통과액을 폐기하는 단계를 포함하는 것이 바람직하다. 단계 (ii)는 (3) dsRNA 및 ssRNA가 결합된 셀룰로스 물질을 제 2 완충액의 분취량 (바람직하게는 셀룰로스 물질의 부피의 0.5 내지 3배 (예컨대 1 내지 2배)인 분취량)을 첨가하는 단계; (4) 진탕 및/또는 교반 하에서 (바람직하게는 5 내지 20분 또는 10 내지 15분 동안) 얻어진 혼합물을 인큐베이팅하는 단계; 및 (5) dsRNA 및 ssRNA가 결합된 셀룰로스 물질을 액체상으로부터 분리하는 단계 (바람직하게는 분리는 상기 단계 (2a') 및 (2b')에서 정의된 바와 동일한 방식으로 수행된다); 및 선택적으로 (6) 단계 (3) 내지 (5)를 1회 또는 2회 이상 (예컨대 1회, 2회 또는 3회) 단계를 추가로 포함할 수 있다. 단계 (iii)은 (1) 진탕 및/또는 교반 하에서 (바람직하게는 적어도 5분 동안, 보다 바람직하게는 적어도 10분 동안, 예컨대 5 내지 30분 또는 10 내지 20분 동안) dsRNA 및 ssRNA가 결합된 셀룰로스 물질을 상기 명시된 바와 같은 제 1 완충액 (예를 들어, EtOH 농도는 14 내지 20% (v/v), 바람직하게는 14 내지 16% (v/v)이다)과 혼합하는 단계; 및 (2) ssRNA를 포함하는 액체상을 셀룰로스 물질로부터 분리하는 단계 (바람직하게는 ssRNA를 포함하는 액체상을 셀룰로스 물질로부터 분리하는 단계는 상기 명시된 바와 같이, 예를 들어, 중력 또는 원심력 (예를 들어, 10,000xg 내지 15,000xg 1 내지 5분 동안), 압력 (예를 들어, 1000hPa 내지 3000hPa), 또는 진공 (예를 들어, 100hPa 내지 900hPa, 예컨대 200hPa 내지 800hPa)을 스핀 컬럼 또는 여과 장치에 가하여 액체 및 고체상을 분리(바람직하게는 완전하게 분리)시킴으로써 수행된다); 및 ssRNA를 포함하는 통과액을 회수하는 단계를 포함할 수 있다. 단계 (ii) 및 (iii)은 1회 또는 2회 이상 (예를 들어, 1회, 2회 또는 3회) 반복될 수 있다. 단계 (ii) 및 (iii)을 반복하는 경우, 하나의 사이클의 단계 (iii) 이후에 수득된 ssRNA 제제는 다음 (즉, 바로 다음) 사이클의 단계 (ii)에서 RNA 제제로서 사용되고 각 사이클에서 신선한 셀룰로스 물질 (바람직하게는 세정된 신선한 셀룰로스 물질)이 사용된다.
양성 정제 절차의 일 실시형태에서, 셀룰로스 물질은 컬럼 내에 제공된다 (이 실시형태에서, 셀룰로스 물질은 세정된 셀룰로스 물질로서 제공되는 것이 바람직하며, 여기서 상기에서 명시된 바와 같은 제 2 완충액 (즉, EtOH 농도가 적어도 35% (v/v), 적어도 36% (v/v), 적어도 37% (v/v), 적어도 38% (v/v) 등이다)은 세정액으로 사용된다). 이 실시형태에서, RNA 제제가 단계 (ii)에서 컬럼 상에 로딩되기 전에, 셀룰로스 물질을 포함하는 컬럼은 상기 명시된 바와 같은 제 2 완충액으로 평형화 (즉, 세정된)시키는 것이 바람직하다 (예를 들어, 상기 제 2 완충액의 분취량). 그 후, RNA 제제 (바람직하게는 ssRNA 및 상기 제 2 완충액을 포함하는 액체로서 제공된다)를 컬럼 상에 로딩시키고 (바람직하게는 주입에 의해), 바람직하게는 컬럼을 상기 제 2 완충액으로 세정한다 (예를 들어, 상기 제 2 완충액의 추가 분취량으로, 바람직하게는 컬럼에 함유된 셀룰로스 물질의 부피의 0.5 내지 2배이다). 이 세정 단계는 RNA 이외의 오염물 (이러한 오염물은 특히 IVT RNA (임의로 변형된)을 생성하기 위해 사용되는 출발 물질을 포함한다) 및 이의 분해 산물, 예를 들어 DNA 주형; RNA 중합효소 (예컨대 T7, T3 또는 SP6); 변형되지 않은 형태의 모노리보뉴클레오타이드 (예컨대 rATP, rGTP, rCTP, rUTP 및 하나 또는 두 개의 인산기를 갖는 이의 유사체) 또는 변형된 형태 (예컨대 r(1mΨ)TP 또는 rΨTP 및 하나 또는 두 개의 인산기를 갖는 이의 유사체); 피로포스페이트; 캡 시약 (즉, 5'-캡 또는 5'-캡 유사체를 도입하는 시약); 및 IVT RNA를 생성하기 위해 사용되는 첨가제 (예를 들어, 완충제, 염, 항산화제, 폴리아민 (예컨대 스페르미딘))를 세척할 수 있기 때문에 바람직하다. 단계 (iii)은 바람직하게는 상기 명시된 바와 같은 제 1 완충액 (즉, EtOH 농도가 14 내지 20% (v/v), 바람직하게는 14 내지 16% (v/v)이다)을 용출액으로 사용하여 셀룰로스 물질로부터 ssRNA를 방출시킴으로써 수행된다. 컬럼으로부터 용리 또는 세정된 (특정 ssRNA, 또한 임의의 dsRNA 중의) 화합물은 종래의 수단 (예를 들어, UV/VIS-검출기 예컨대 다이오드-분석-검출기)을 사용하여 예를 들어, 260 nm (핵산의 검출을 위한) 및/또는 215 nm (펩타이드/단백질의 검출을 위한) 및/또는 280 nm (방향족 아미노산을 함유한 펩타이드/단백질의 검출을 위한)의 파장에서 검출 및/또는 모니터링할 수 있다.
본 발명의 임의의 방법에 의해 수득된 ssRNA는 (특히 "음성" 또는 "양성" 정제 절차가 사용되었는지 여부에 상관없이) 침전 및/또는 변형과 같은 추가 처리를 수행할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법에 의해 수득된 ssRNA는 종래의 방법을 사용하여 (예를 들어, "아세트산나트륨/이소프로판올" 침전법 또는 "LiCl" 침전법을 사용하여) 침전시켜 건식형 ssRNA 제제를 생성시킬 수 있다. 건조된 ssRNA는 (예를 들어, -70℃에서) 보관할 수 있거나 적절한 용매 (예를 들어, 물 또는 TE 완충액 (10mM TRIS, 1mM EDTA))에 용해시킨 후 (예를 들어, -70℃에서) 보관하거나 (예를 들어, 약학 조성물의 제조를 위해) 추가로 사용될 수 있다. 또한, ssRNA는 예를 들어, (예를 들어, -70℃에서) 보관되거나 (예를 들어, 약학 조성물의 제조를 위해) 사용되기 전에 캡핑되지 않은 5'-트리포스페이트를 제거함으로써 및/또는 캡 구조를 첨가함으로써 추가로 변형될 수 있다.
본원의 실시예에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 방법은 하나 이상의 하기한 바와 같은 몇 가지 이점을 제공한다. 예를 들어, 본 발명의 방법은 단순한 원심분리 단계, 마이크로원심분리 스핀 컬럼, 진공-구동식 여과 시스템 및 FPLC를 포함하는 다양한 정제 기술을 제공한다. HPLC 방법과 비교하여, 본 발명의 방법은 비용 효율적이고 간단하며 (복잡한 장비를 필요로 하지 않음), 독성 물질 (예컨대 아세토니트릴)을 방지하고 비교적 높은 순도 및 수율로 ssRNA를 제공한다. 또한, 셀룰로스가 천연 산물이기 때문에, 셀룰로스를 기본으로 하고 ssRNA (특히 IVT ssRNA에서)를 정제하는데 효과적인 본 발명의 방법은 GMP-조절된 환경으로 전달될 때 덜 복잡할 것으로 예상될 수 있다. 또한, 본원에서, 본 발명의 방법은 용이하게 고가치화될 수 있고 종래의 HPLC 방법보다 시간이 소요된다는 것이 입증되었다. 이와 관련하여, 종래의 HPLC 방법 (상기 문헌[Weissman et al.]에 개시된 바와 같은 방법들)은 일반적으로 큰 컬럼을 사용함에 있어서의 컬럼 크기 및 배압 문제에 의해 제한된다는 것이 주목된다. 이것은 본 발명의 방법에 관한 것은 아니다. 예를 들어, 본원에서 입증된 바와 같이 (실시예 5 참조), 50 내지 100 mg IVT RNA의 정제는 본 발명의 방법을 사용할 때 2시간 이내에 달성될 수 있다. 대조적으로, 35ml의 컬럼 부피를 갖는 실시예 3에서 사용된 HPLC 컬럼 (Semi-Prep RNASep 100 x 21.1mM, Transgenomic)은 1mg IVT RNA의 최대 결합 용량을 갖는다. 이러한 HPLC 컬럼을 사용하는 표준 정제 공정은 60분 넘게 소요되기 때문에, 50 mg IVT RNA의 정제는 본 발명의 방법을 사용하면 단지 2시간인 것에 비해 약 50시간이 소요될 것이다. 또한, 종래의 HPLC-기반 방법을 사용하여 긴 IVT RNA를 정제하는 것은 문제들을 야기하며, 종종 (a) IVT RNA의 높은 손실 (특히, IVT RNA가 약 2,700nt의 길이를 갖는 경우 (바람직하게는 적어도 2,800 nt, 적어도 2,900 nt, 적어도 3,000 nt, 적어도 3,100 nt, 적어도 3,200 nt, 적어도 3,300 nt, 적어도 3,400 nt, 보다 바람직하게는 적어도 3,500 nt, 적어도 3,600 nt, 적어도 3,700 nt, 적어도 3,800 nt, 적어도 3,900 nt, 적어도 4,000 nt, 적어도 4,100 nt, 적어도 4,200 nt, 적어도 4,300 nt, 적어도 4,400 nt, 보다 바람직하게는 적어도 4,500 nt, 적어도 4,600 nt, 적어도 4,700 nt, 적어도 4,800 nt, 적어도 4,900 nt, 적어도 5,000 nt), 이러한 길이를 갖는 IVT RNA는 정의된 샤프한 피크로서 종래의 HPLC-기반 방법에서 용출되지 않지만 ssRNA의 손실을 최소화하기 위해 연장된 기간에 걸쳐 용출액 (ssRNA를 포함한다)의 회수를 필요로 함으로써 브로드한 피크로서 용출되기 때문이다) 및/또는 보다 중요하게는, (b) IVT RNA의 분해 (특히, 길이가 긴 IVT RNA (예를 들어, 적어도 3,500 nt, 예컨대 적어도 4,000 nt, 적어도 4,500 nt, 적어도 5,000 nt, 적어도 5,500 nt, 적어도 6,000 nt, 적어도 6,500 nt, 적어도 7,000 nt, 적어도 7,500 nt, 적어도 8,000 nt, 적어도 8,500 nt, 적어도 9,000 nt, 또는 적어도 9,500 nt의 크기인 경우)가 단단히 채워진 컬럼 물질을 통해 긴 RNA가 통과하는 동안 전단 작용으로 인해 아마 정제되는 경우)를 초래한다. 대조적으로, 본원에서 증명된 바와 같이, 약 10,000nt 또는 그 이상의 크기를 갖는 IVT RNA를 정제하기 위해 본 발명의 방법을 사용하는 것은 RNA의 분해를 초래하지 않는다. 더욱이, 본 발명의 방법을 사용함으로써, 정의된 샤프한 피크에서 셀룰로스 물질로부터 IVT ssRNA (특히, 길이가 적어도 약 2,700 nt (바람직하게는 적어도 2,800 nt, 적어도 2,900 nt, 적어도 3,000 nt, 적어도 3,100 nt, 적어도 3,200 nt, 적어도 3,300 nt, 적어도 3,400 nt, 보다 바람직하게는 적어도 3,500 nt, 적어도 3,600 nt, 적어도 3,700 nt, 적어도 3,800 nt, 적어도 3,900 nt, 적어도 4,000 nt, 적어도 4,100 nt, 적어도 4,200 nt, 적어도 4,300 nt, 적어도 4,400 nt, 보다 바람직하게는 적어도 4,500 nt, 적어도 4,600 nt, 적어도 4,700 nt, 적어도 4,800 nt, 적어도 4,900 nt, 적어도 5,000 nt)인 특정 IVT ssRNA에서)를 용출시켜, 회수될 용출액 (ssRNA를 포함함)의 양 (즉, 부피)을 최소로 감소시키는 것이 가능하다. 최종적으로, 정제된 RNA의 무결성은 인큐베이션 중 ssRNA, 특히 긴 ssRNA가 부분적으로 분해되는 경우가 많은 (아마도 ssRNA에 포함된 이중가닥 이차구조의 RNaseIII-촉매화된 가수분해하기 때문에) E.coli RNaseIII를 사용하는 종래의 방법과 비교하여 본 발명의 방법을 우수함을 입증하는 것이다.
본원에 사용된 바와 같이 "진탕 및/또는 교반"이라는 용어는 혼합물, 예를 들어 고체상 (예컨대 셀룰로스 물질) 및 액체상 (예컨대 배지 (예를 들어, 완충액), 세정액, 또는 배지 (예를 들어, 완충액)에 용해된 RNA 제제)을 포함하는 혼합물을 혼합 (바람직하게는 완전히 혼합)하기에 적합한 임의의 작용을 의미한다. "진탕 및/또는 교반"을 달성하기 위한 예시적인 장치는 당업자에게 공지되어 있는 것이며, 진탕기, 혼합기 (예를 들어, 와류 혼합기 또는 정적 혼합기), 자기 교반기 (교반바를 포함한다) 및 교반 막대를 포함하며, 이들은 혼합될 혼합물의 부피에 따라 상이한 크기로 이용 가능하다. 혼합물의 진탕 및/또는 교반은 철저한 혼합을 달성하기에 충분한 시간 동안, 예를 들어, 적어도 1분 (예컨대 적어도 2분, 적어도 3분, 적어도 4분, 적어도 5분, 적어도 8분, 적어도 10분) 동안 실시할 수 있다. 혼합물의 진탕 및/또는 교반의 최대 시간은 40분 이하 (예컨대 35분 이하, 30분 이하, 28분 이하, 26분 이하, 24분 이하, 22분 이하, 또는 20분 이하)일 수 있다. 따라서, 혼합물의 진탕 및/또는 교반을 위한 예시적인 시간 범위는 5 내지 40분, 5 내지 30분, 5 내지 20분, 10 내지 40분, 10 내지 30분, 10 내지 20분, 15 내지 40분, 15 내지 30분, 또는 15 내지 20분이다. 일반적으로, 진탕 및/또는 교반의 지속시간은 의도된 용도 (예를 들어, 셀룰로스 물질의 세정 또는 셀룰로스 물질에 대한 RNA의 결합) 및 혼합될 고체의 양과 같은 요인에 좌우될 것이다. 예를 들어, 셀룰로스 물질의 세정을 위해, 진탕 및/또는 교반의 지속시간은 1 내지 15분, 예컨대 5 내지 10분의 범위일 수 있다. 셀룰로스 물질에 RNA를 결합시키기 위해, 1g 이하의 셀룰로스 물질을 사용하는 경우에는 진탕 및/또는 교반의 지속시간이 5 내지 20분 (예컨대 10 내지 20분)의 범위일 수 있거나, 1g 초과의 셀룰로스 물질을 사용하는 경우에는 10 내지 30분 (예컨대 15 내지 30분)의 범위일 수 있다. 마찬가지로, 셀룰로스 물질로부터 셀룰로스 물질에 결합된 RNA (특히 ssRNA)를 방출하기 위해, 진탕 및/또는 교반의 지속시간은 1g 이하의 셀룰로스 물질을 사용하는 경우에 5 내지 20분 (예컨대 10 내지 20분)의 범위이거나, 1g 초과의 셀룰로스 물질을 사용하는 경우에 10 내지 30분 (예컨대 15 내지 30분)의 범위일 수 있다.
제 1 및 제 2 배지 (예를 들어, 제 1 및 제 2 완충액)에 대해 사용된 바와 같이 용어 "염"은 산 및 염기의 중화 반응으로부터 생성된 임의의 이온성 화합물을 의미한다. 바람직하게는, 염은 (i) 완충 물질이 아니거나, (ii) 킬레이트제가 아니거나, 또는 (iii) 완충 물질 또는 킬레이트제가 아닌 것이다. 예시적인 산으로는 무기산 (예컨대 염산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 황산, 질산, 인산, 붕산, 및 과염소산) 및 유기산 (예를 들어, 모노카복실산, 바람직하게는 1 내지 5개 (예컨대 1, 2 또는 3개)의 탄소원자를 갖는 것들, 예를 들어, 포름산, 아세트산, 및 프로피온산), 바람직하게는 무기산을 들 수 있다. 예시적인 염기로는 무기염기 (예컨대 NH3, 수산화암모늄 (NH4OH), 및 금속의 산화물 및 수산화물, 바람직하게는 알칼리, 토류 및 알칼리 토금속의 산화물 및 수산화물 (예를 들어, Li, Na, K, Rb, Be, Mg, Ca, Sr, Al, 및 Zn의 산화물 및 수산화물)) 및 유기염기 (예컨대 아민, 예를 들어, 모노알킬, 디알킬 또는 트리알킬아민), 바람직하게는 무기염기, 보다 바람직하게는 Li, Na, K, Mg, Ca, Al, 및 Zn의 산화물 및 수산화물, 보다 바람직하게는 Li, Na, K, 및 Zn의 산화물 및 수산화물, 예컨대 Li, Na, 및 K의 산화물 및 수산화물을 들 수 있다. 제 1 및 제 2 배지 (예를 들어, 제 1 및 제 2 완충액)에 대해 사용될 수 있는 예시적인 염으로는 LiCl, NaCl 및 KCl을 들 수 있고, 이와 관련하여 하나의 특히 바람직한 염은 NaCl이다. 바람직하게는, 염은 상기 배지에서 RNA의 침전을 발생시키지 않는 농도로 제 1 및 제 2 배지 (예를 들어, 제 1 및 제 2 완충액)에 사용된다. 일 실시형태에서, 제 1 및/또는 제 2 배지 (예를 들어, 제 1 및/또는 제 2 완충액) 중의 염의 농도는 특히 완충 물질이 TRIS인 경우에 15 내지 70mM, 예를 들어, 20 내지 60mM, 25 내지 50mM 또는 30 내지 50mM이다. 일 실시형태에서, 제 1 및/또는 제 2 배지 (예를 들어, 제 1 및/또는 제 2 완충액) 중의 염의 농도는 특히 완충 물질이 HEPES인 경우에 100 내지 200mM, 예를 들어, 110 내지 190mM, 120 내지 180mM, 130 내지 170mM, 140 내지 160mM 또는 145 내지 155mM이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "완충 물질" 및 "완충제"는 강산 또는 강염기가 용액에 첨가되더라도 용액의 pH를 거의 일정하게 유지할 수 있는 화합물의 혼합물을 의미한다. 일 실시형태에서, 완충 물질 또는 완충제는 약산 및 이의 짝염기의 혼합물이다. 또 다른 실시형태에서, 완충 물질 또는 완충제는 약염기 및 이의 짝산의 혼합물이다. 바람직하게는, 완충 물질은 킬레이트제가 아니다. 제 1 및 제 2 배지 (예를 들어, 제 1 및 제 2 완충액)에 적합한 완충 물질의 예로서는 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄 (TRIS), 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산 (HEPES), 3-모르폴리노-2-하이드록시프로판설폰산 (MOPSO), 3-(N-모르폴리노)프로판설폰산 (MOPS), N,N-비스(2-하이드록시에틸)-2-아미노에탄설폰산 (BES), 2-[(2-하이드록시-1,1-비스(하이드록시메틸)에틸)아미노]에탄설폰산 (TES), 피페라진-N,N'-비스(2-에탄설폰산) (PIPES), 및 3-(N,N-비스[2-하이드록시에틸]아미노)-2-하이드록시프로판설폰산 (DIPSO), 바람직하게는 TRIS 또는 HEPES, 보다 바람직하게는 TRIS를 들 수 있다. 목적하는 pH 값 (예컨대 pH 6.5 내지 8.0, 바람직하게는 pH 6.6 내지 7.8, 예컨대 pH 6.8 내지 7.6, pH 6.8 내지 7.2, pH 6.9 내지 7.5, pH 6.9 내지 7.3, pH 7.0 내지 7.7, pH 7.0 내지 7.5, pH 7.0 내지 7.3, pH 7.3 내지 7.8, pH 7.3 내지 7.7, 또는 pH 7.3 내지 7.6)은 상응하는 염기 (예를 들어, TRIS)에 충분한 양의 산 (예를 들어, 무기산 예컨대 염산)을 첨가하거나 상응하는 산 (예를 들어, 이의 pKa가 6.76 이상인 pH (예컨대 pH가 7.0 또는 7.3 내지 7.7이다)인 경우 PIPES가 바람직하다)에 충분한 양의 염기 (예를 들어, 무기 염기 예컨대 수산화나트륨)을 첨가함으로써 달성될 수 있다. 일 실시형태에서, 제 1 및/또는 제 2 배지 (예를 들어, 제 1 및/또는 제 2 완충액) 중의 완충 물질의 농도는 5 내지 40mM, 예를 들어 6 내지 30mM, 8 내지 20mM 또는 10 내지 15mM이다.
본원에 사용된 바와 같이 제 1 및 제 2 배지 (예를 들어, 제 1 및 제 2 완충액)와 관련하여 용어 "킬레이트제"는 다배위 리간드이고 2개 이상 (바람직하게는 3개 이상, 예컨대 4개 이상) 배위결합을 단일 중심원자 (바람직하게는 단일 금속 양이온 예컨대 Ca2+ 또는 Mg2+)에 형성 가능한 화합물 (바람직하게는 유기 화합물)을 의미한다. 이와 관련하여, "다배위자"는 단일 리간드 분자에서 1개를 초과하는 (즉, 2개 이상, 바람직하게는 3개 이상, 예컨대 4개 이상) 공여기를 갖는 리간드를 일컫는데, 여기서 공여기는 바람직하게는 자유 전자쌍을 갖는 원자 (예를 들어, O-, =O, -NH2, -NRH (여기서 R은 유기 부분 예컨대 알킬, 특히 C1-3 알킬이다), 및 -NR2 (여기서 각각의 R은 독립적으로 유기 부분 예컨대 알킬, 특히 C1-3 알킬이다))를 포함한다. 바람직하게는, 킬레이트제는 완충 물질이 아니다. 킬레이트제의 예로는 EDTA, 니트릴로트리아세트산, 구연산염 (예를 들어, 구연산나트륨), 1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산 (DOTA), 1,4,7-트리아자사이클로노난-1,4,7-트리스아세트산 (NOTA), 3,6,9,15-테트라아자비사이클로[9.3.1]펜타데카-1(15),11,13-트리엔-3,6,9-트리아세트산 (PCTA), 및 1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7-트리아세트산 (DO3A), 바람직하게는 EDTA 또는 니트릴로트리아세트산, 보다 바람직하게는 EDTA를 들 수 있다. 일 실시형태에서, 제 1 및/또는 제 2 배지 (예를 들어, 제 1 및/또는 제 2 완충액) 중의 킬레이트제의 농도는 10 내지 50mM, 예를 들어, 15 내지 40mM 또는 20 내지 30 mM이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "셀룰로스 물질"은 바람직하게는 분배 크로마토크래피 시약으로 사용하기에 적합한 등급을 갖는 임의의 셀룰로스 섬유를 지칭한다. 본 발명의 방법에 적합한 셀룰로스 물질의 특정 예로는 CF-11 셀룰로스 분말 및 시판되는 셀룰로스 예컨대 Sigma-Aldrich (예를 들어, Cat. #C6288) 및 Macherey-Nagel (예를 들어, MN 100 또는 MN 2100)사로부터의 시판품을 들 수 있다. 일 실시형태에서, 셀룰로스 물질은 본 발명의 방법으로 사용하기 전에 세정한다. 따라서, 본 발명의 방법의 바람직한 일 실시형태에서, 셀룰로스 물질은 세정된 셀룰로스 물질, 예를 들어 건식형으로서 또는 세정액 중의 현탁액으로서 제공된다 (여기서 상기 세정액은 본원에서 명시된 바와 같이 제 1 또는 제 2 배지 (예를 들어, 제 1 또는 제 2 완충액)일 수 있다). 셀룰로스 물질의 세정은 (I) 진탕 및/또는 교반 하에서 (바람직하게는 적어도 5분 동안, 보다 바람직하게는 적어도 10분 동안, 예컨대 5 내지 10분) 셀룰로스 물질을 세정액과 혼합하는 단계; 및 (II) (예를 들어, 피펫을 사용하여) 액체를 제거하거나 (예를 들어, 셀룰로스 물질로서 자성 비드에 공유결합된 셀룰로스를 사용하고 자석을 사용하여) 셀룰로스 물질을 회수하는 단계; 및 선택적으로 단계 (iii) (I) 및 (II)를 1회 또는 2회 이상 (예를 들어, 1회, 2회 또는 3회) 반복하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들면, 셀룰로스 물질 및 세정액의 혼합물을 튜브 내에 제공하는 경우, 중력 또는 원심력 (예를 들어, 4,000xg 내지 15,000xg, 예컨대 5,000xg 내지 10,000xg, 1 내지 5분 동안)을 튜브에 가하여 액체 및 고체상을 분리시키거나 (바람직하게는 완전히 분리시킴) (예컨대 피펫을 사용하여) 상등액을 제거하거나 셀룰로스 물질을 회수(예를 들어, 셀룰로스 물질로서 자성 비드에 공유결합된 셀룰로스를 사용하고 자석을 사용하여)하는 것이 바람직하다. 또는, 셀룰로스 물질과 세정액의 혼합물은 스핀 컬럼 또는 여과 장치에 제공되는 경우, 중력, 원심력 (예를 들어, 4,000xg 내지 15,000xg, 예컨대 5,000xg 내지 10,000xg 1 내지 5분 동안), 압력 (예를 들어, 1000hPa 내지 3000hPa), 또는 진공 (예를 들어, 100hPa 내지 900hPa, 예컨대 200hPa 내지 800hPa)을 스핀 컬럼 또는 여과 장치에 가하여 액체상 및 고체상을 분리(바람직하게는 완전히 분리)시키고 통과액을 버리는 것이 바람직하다. 세정 완충액의 조성물은 바람직하게는 세정된 셀룰로스 물질에 대한 의도된 형태의 RNA의 선택적 결합에 따라 달라진다: (1) dsRNA만이 세정된 셀룰로스 물질에 선택적으로 결합하는 반면, ssRNA는 결합되지 않은 상태로 유지되는 경우, 세정액은 dsRNA를 셀룰로스 물질에 결합시키고 ssRNA를 셀룰로스 물질에 결합시키지 않는 것이어야 한다. 따라서, (1)의 바람직한 일 실시형태에서, 세정액은 상기 명시된 바와 같이 제 1 배지 (예를 들어, 제 1 완충액)의 조성물을 갖는다. (2) dsRNA와 ssRNA가 세정된 셀룰로스 물질에 결합하는 경우, 세정액은 dsRNA 및 ssRNA를 셀룰로스 물질에 결합시키는 것이어야 한다. 따라서, (2)의 바람직한 일 실시형태에서, 세정액은 상기 명시된 바와 같이 제 2 배지 (예를 들어, 제 2 완충액)의 조성물을 갖는다.
세정 후에 세정된 셀룰로스 물질은 건조 생성물로서 (즉, 세정액이 본원에 명시된 바와 같이 세정된 셀룰로스로부터 완전히 제거된 후) 또는 세정액 중의 현탁액으로서 보관될 수 있다 (또는 본 발명의 방법에 사용될 수 있다). 그러나, 세정액에 보관된 세정된 셀룰로스 물질이 본 발명의 방법에 사용되는 경우, 세정된 셀룰로스 물질이 RNA 제제와 접촉되기 전에, 액체상 (즉, 셀룰로스 물질이 보관을 위해 현탁되어 있는 세정액)은 세정된 셀룰로스 물질로부터 제거시키고 (예를 들어, 세정된 셀룰로스가 튜브 내에 제공되는 경우에는 중력 또는 원심력 (상기 명시된 바와 같이 셀룰로스 물질의 세정에 대해서)을 가하거나 세정된 셀룰로스가 스핀 컬럼 또는 여과 장치에 제공되는 경우에는 중력, 원심력, 압력, 또는 진공 (상기 명시된 바와 같이 셀룰로스 물질의 세정에 대해서)을 가함으로써) 그 후 얻어진 세정된 셀룰로스 물질 (즉, 건식형)은 본 발명의 방법에 사용하거나 세정액 (여기서 상기 세정액은 본원에서 명시된 바와 같이 제 1 또는 제 2 배지 (예를 들어, 제 1 또는 제 2 완충액)일 수 있다)에 현탁시키고나서 본 발명의 방법에 사용하는 것이 바람직하다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "신선한 셀룰로스 물질"은 상기 신선한 셀룰로스 물질이 RNA 제제와 접촉하지 않았음을 의미한다. 이러한 신선한 셀룰로스 물질은 세정되지 않거나 세정될 수 있다. 바람직한 일 실시형태에서, 신선한 셀룰로스 물질은 상기 명시된 바와 같이 세정된 셀룰로스 물질 (예를 들어, 건식형 또는 세정액 중의 현탁액)로서 제공된다. 따라서, 세정된 신선한 셀룰로스 물질의 의도된 용도 (즉, (1) dsRNA는 선택적으로 결합하지만 ssRNA는 결합하지 않거나 (2) dsRNA 및 ssRNA는 결합하는 경우)에 따라, 세정된 신선한 셀룰로스 물질은 (1) 상기 명시된 바와 같은 제 1 배지 (예를 들어, 제 1 완충액) 또는 (2) 상기 명시된 바와 같은 제 2 배지 (예를 들어, 제 2 완충액)를 사용함으로써 수득될 수 있다.
본 발명의 방법의 단계 (ii)에서 셀룰로스 물질에 대한 RNA (RNA 제제에 함유된)의 비율은 셀룰로스 물질의 RNA 결합능을 초과하지 않도록 하는 것이다. 바람직한 일 실시형태에서, 셀룰로스 물질 100mg당 RNA의 양은 250㎍ 이하, 보다 바람직하게는 200㎍ 이하, 예컨대 150㎍ 이하이다. 따라서, 일 실시형태에서, 셀룰로스 물질 100mg당 RNA의 양은 10 내지 250㎍, 예컨대 20 내지 220㎍, 30 내지 200㎍, 40 내지 180㎍, 50 내지 160㎍, 60 내지 140㎍, 70 내지 120㎍, 80 내지 110㎍, 또는 90 내지 100㎍의 범위이다. 따라서, 일 실시형태에서, RNA 1㎍당 셀룰로스 물질의 양은 적어도 0.4 mg, 바람직하게는 적어도 0.5 mg, 예컨대 적어도 0.67 mg일 수 있다. 예를 들어, RNA 1㎍당 셀룰로스 물질의 양은 0.4 내지 10 mg, 예컨대 0.45 내지 5 mg, 0.5 내지 3.3 mg, 0.56 내지 2.5 mg, 0.63 내지 2 mg, 0.71 내지 1.67 mg, 0.83 내지 1.43 mg, 0.91 내지 1.25 mg, 또는 1 내지 1.11 mg의 범위일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "튜브"는 화합물 및/또는 액체가 용기 내로 도입 및/또는 용기로부터 제거될 수 있도록 단 하나의 개구부를 갖는 용기, 특히 가늘고 긴 용기를 지칭한다. 바람직한 일 실시형태에서, 튜브의 개구부는 나사 결합 가능하거나 개구를 단단히 밀봉하도록 개구부에 끼워지는 덮개 뚜껑과 같은 적절한 수단에 의해 밀폐될 수 있도록 구성된다. 일 실시형태에서, 튜브는 중력 또는 원심력이 임의의 내용물을 유출시키지 않고 튜브의 무결성을 손상시키지 않으면서 (이의 비중에 대해 튜브 내에서 내용물을 분리하기 위해) 튜브에 적용될 수 있는 방식으로 구성된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "스핀 컬럼" 및 "여과 장치"는 대향 양상 상에 2개의 개구부 및 프릿 또는 필터를 갖는 용기, 특히 가늘고 긴 용기를 지칭하며, 여기서 제 1 개구부는 화합물 및/또는 액체가 용기 내로 도입 및/또는 용기로부터 제거될 수 있도록 형성되어 있는 반면에, 제 2개구부는 고체 화합물 (특히 셀룰로스 물질)이 프릿 또는 필터에 의해 용기 내에 보류되지만 액체는 프릿 또는 필터 및 제 2개구로 통과하도록 프릿 또는 필터에 의해 제 1 개구부와 분리되어 있다. 프릿 또는 필터는 바람직하게는 기공 크기가 1㎛ 이하, 예컨대 0.8㎛ 이하, 0.6㎛ 이하이고, 예를 들어, 0.30 내지 0.60㎛, 예컨대 0.35 내지 0.55㎛의 범위이다. 바람직한 일 실시형태에서, 스핀 컬럼 또는 여과 장치의 적어도 제 1 개구부 (바람직하게는 각각의 개구부)는 나사 결합이 가능하거나 개구를 단단히 밀봉하도록 제 1 또는 제 2개구부에 끼워지는 덮개 뚜껑과 같은 적절한 수단에 의해 밀폐될 수 있도록 구성된다. 일 실시형태에서, 스핀 컬럼 또는 여과 장치는 중력, 원심력, 압력, 또는 진공이 스핀 컬럼 또는 여과 장치의 무결성을 손상시키지 않으면서 스핀 컬럼 또는 여과 장치에 적용될 수 있는 방식으로 구성된다 (스핀 컬럼 또는 여과 장치 내의 내용물을 분리하기 위해). 스핀 컬럼의 적절한 예로는 마이크로원심분리 스핀 컬럼 (예컨대 Macherey-Nagel, 예를 들어, NucleoSpin Filters (Cat. #740606)에서 시판되는 것)을 들 수 있고, 여과 장치의 적절한 예로는 일회용 진공-구동식 여과 장치 (예컨대 Merck Chemicals GmbH/Millipore, 예를 들어, Steriflip-HV, 0.45㎛ 기공 크기, PVDF (Cat. #SE1M003M00)에서 시판되는 것)를 들 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "액체" 및 "액체상"은 표준 조건에서의 유체를 지칭한다. 액체의 특정 예로는 배지 (예컨대 완충액), 세정액 및 배지 (예컨대 완충액)에 용해된 RNA 제제를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "고체" 및 "고체상"은 뚜렷한 형상 및 부피를 가지나 표준 조건에서 비-액체 및 비-기체인 물질 또는 물질의 혼합물을 지칭한다. 고체의 특정 예로는 셀룰로스 물질을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "표준 조건"은 20℃의 온도 및 1,013.25hPa의 절대 압력을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "상등액"은 액체상 및 고체상이 혼합되고 혼합물이 분리될 때 (예를 들어, 중력 또는 원심력을 가함으로써) 생성되는 상부 상을 지칭한다. 고체상이 액체상에 비해 비중이 높으면 액체상이 상등액이 될 것이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "통과액"은 스핀 컬럼 또는 여과 장치를 통과하는 액체상을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "분취량"은 고체에 첨가되거나 컬럼의 고정상에 로딩되는 액체의 부피를 의미하며, 여기서 분취량의 부피는 일반적으로 고체상 또는 고정상의 부피의 0.1 내지 10배 (예컨대 0.5 내지 5배, 1 내지 4배, 1 내지 3배, 또는 1 내지 2배)이다. 일 실시형태에서, 액체는 배지 (예를 들어, 완충액) (예컨대 본원에서 명시된 바와 같은 제 1, 제 2 또는 제 3 배지 (예를 들어, 제 1, 제 2 또는 제 3 완충액)) 또는 세정액이다. 일 실시형태에서, 고체는 셀룰로스 물질 예컨대 세정된 셀룰로스 물질이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "중력을 가하는 것"은 용기, 예컨대 튜브, 스핀 컬럼, 또는 여과 장치가 지구의 "정상" 중력 (약 1xg)만을 실시하는 것이고, 즉 지구의 "정상" 중력뿐만 아니라 중력을 적용하지 않는 것(예를 들어, 배지는 컬럼의 고정상을 통해 수동적으로 유동할 수 있고, 상기 컬럼은 컬럼의 길이방향 축 (즉, 컬럼의 두 개구부를 통과하는 라인)이 기하학중심을 가리키는 방식으로 배치된다)을 의미한다. 일 실시형태에서, 용기에 포함된 상들(예컨대 액체상 및 고체상)을 분리(바람직하게는 완전히 분리)하기에 충분한 기간 동안 중력을 용기에 적용시킨다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "원심력을 가하는 것"은 용기, 예컨대 튜브, 스핀 컬럼, 또는 여과 장치가 지구의 정상 중력의 배수 (즉, 1xg 초과, 예컨대 적어도 2xg, 적어도 10xg, 적어도 100xg, 및 20,000xg 이하, 예컨대 15,000xg 이하, 10,000xg 이하, 5,000xg 이하, 또는 4,000xg 이하)로 실시하는 것을 의미한다. 이러한 원심력을 발생시킬 수 있는 적절한 장치는 원심분리기를 포함한다. 일 실시형태에서, 용기에 포함된 상들(예컨대 액체상 및 고체상)을 분리 (바람직하게는 완전히 분리)하기에 충분한 기간 동안 원심력을 용기에 적용시킨다. 예시적인 기간은 1분 내지 30분 (예컨대 1, 2, 3, 4, 또는 5분 내지 25분, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10분 내지 20분 또는 10 내지 15분)의 범위이다. 일반적으로, 적용된 원심력의 수준 및 기간은 요인들, 예컨대 의도된 용도 (예를 들어, 셀룰로스 물질의 세정, 셀룰로스 물질에 대한 RNA의 결합, 또는 셀룰로스 물질로부터 RNA의 방출) 및 용기의 부피와 중량 (이의 내용물 포함)에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, 단시간 (예를 들어, 1 내지 5분) 동안 적용된 높은 원심력 (예컨대 10,000xg 내지 20,000xg)은 (완전한) 분리에 충분할 수 있지만, 낮은 원심력 (예컨대 100xg 이하)은 (완전한) 분리를 위해 더 긴 지속시간 (예컨대 20 내지 30분)이 필요할 수 있다. 마찬가지로, 작은 부피 및 중량 (예를 들어, 약 2ml 이하의 부피 및 약 2g 이하의 중량)에 대해, 짧은 기간 (예를 들어, 1 내지 5분) 동안 적용된 높은 원심력 (예컨대 10,000xg 내지 20,000xg)이 (완전한) 분리에 충분할 수 있지만, 보다 낮은 원심력 (예컨대 200xg 내지 10,000xg)이 적용될 수 있는 더 큰 부피 및/또는 중량의 경우, 더 긴 지속 기간 (예를 들어, 20 내지 30분 동안)이 (완전한) 분리를 달성하기 위해 필요할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "압력을 가하는"은 용기, 예컨대 스핀 컬럼, 여과 장치, 또는 컬럼이 용기의 하나의 개구에 적용되는 (표준 조건에 비해) 양성의 힘을 가하는 것을 의미한다. 특히, 용기가 컬럼일 때, 압력을 가하는 것은 액체 (예를 들어, 배지 또는 완충액)가 예를 들어 하나 이상의 펌프를 사용함으로써 용기를 통해 펌핑되는 것을 의미한다. 본 발명의 방법에 적용되는 압력은 HPLC 방법에 적용되는 압력에 비해 훨씬 낮으며, 바람직하게는 2MPa 이하 (예컨대 1MPa 이하, 5000hPa 이하, 4000hPa 이하, 3000hPa 이하, 2000hPa 이하)이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "진공을 가하는"은 본원에 사용된 바와 같이 용기, 예컨대 스핀 컬럼, 여과 장치, 또는 컬럼이 부압 (표준 조건에 비하여)을 실시하는 것을 의미하고, 여기서 부압은 바람직하게는 용기의 개구부에 적용된다. 바람직하게는, 부압은 900hPa 이하, 예컨대 800hPa 이하, 700hPa 이하, 600hPa 이하, 500hPa 이하, 400hPa 이하, 300hPa 이하, 200hPa, 또는 100hPa 이하이다. 일 실시형태에서, 진공은 용기에 함유된 상 (예컨대 액체상 및 고체상)을 분리 (바람직하게는 완전히 분리)하기에 충분한 기간 동안 용기에 가해진다. 부압을 발생시키는 장치는 당업자에게 공지되어 있고 초고압수 진공 펌프를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 "1회 또는 2회 이상 반복된"이라는 표현은 상응하는 단계 또는 단계(들)을 적어도 1회 예컨대 2회 이상, 3회 이상, 4회 이상 등, 바람직하게는 1회, 2회 또는 3회 수행한다는 것을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은 "단계 (ii) 및 (iii)의 하나의 사이클"이라는 표현은 단계 (ii) 및 (iii)이 각각 단 한번 수행된다는 것을 의미한다. 단계 (ii) 및 (iii)의 한 사이클이 완료되면, 선택적으로 단계 (ii) 및 (iii)의 추가 사이클 (본 명세서에서 "다음 사이클"이라고도 함)이 수행될 수 있다. 예를 들어, 단계 (ii) 및 단계 (iii)의 이러한 다음 사이클의 단계 (ii)에서, 단계 (ii) 및 단계 (iii)의 이전 사이클의 단계 (iii) 후에 수득된 RNA 제제 (즉, 바람직하게는 이전 사이클의 단계 (ii)에서 사용된 RNA 제제와 비교하여 더 적은 양의 dsRNA를 포함하는 RNA 제제)를 RNA 제제로서 사용한다. 단계 (ii) 및 (iii)의 각각의 사이클에서 신선한 셀룰로스 물질이 사용되는 것이 바람직하다 (예를 들어, dsRNA에 의한 오염을 피하기 위해). 따라서, 단계 (ii) 및 (iii)을 수행하고 선택적으로 이러한 단계들을 1회 내지 2회 이상 반복함으로써, 최종적으로 수득된 ssRNA가 실질적으로 dsRNA를 포함하지 않는 정도 및/또는 DNA를 실질적으로 포함하지 않는 정도로, 바람직하게는 dsRNA 및 DNA를 실질적으로 포함하지 않는 정도로 ssRNA 제제로부터 dsRNA를 제거하는 것이 가능하다.
"이전 사이클의 단계 (ii)에서 사용된 RNA 제제와 비교하여 더 적은 양의 dsRNA를 포함하는 RNA 제제"라는 표현은 단계 (ii) 및 (iii)의 한 사이클을 수행하는 것이 dsRNA를 제거하는데 효과적이서 하나의 사이클의 단계 (iii) 후에 수득된 RNA 제제에서 dsRNA의 총량은 이전 사이클의 단계 (ii)에서 사용된 RNA 제제에서의 dsRNA 총량보다 적다는 것을 의미한다. 바람직하게는, 단계 (ii) 및 단계 (iii)의 첫 번째 사이클은 단계 (ii) 및 (iii)의 첫 번째 사이클 중 단계 (ii)에서 사용된 RNA 제제에 함유된 dsRNA를 적어도 70%, 보다 바람직하게는 적어도 75% (예컨대 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%) 제거하는데 효과적이다. 바람직한 일 실시형태에서, 단계 (ii) 및 (iii)의 총 2, 3 또는 4 사이클을 수행하는 것은 단계 (ii) 및 (iii)의 첫 번째 사이클 중 단계 (ii)에서 사용된 RNA 제제에 함유된 dsRNA를 적어도 95%, 보다 바람직하게는 적어도 96% (예컨대 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%)제거하는데 효과적이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "용출액"은 고정상 (예를 들어, 셀룰로스 물질)에 대한 화합물 (예컨대 dsRNA 또는 ssRNA)의 결합 특성을 변경시킬 수 있는 액체를 의미한다. "결합 특성을 변경시키는 것"은 화합물 (예컨대 dsRNA 또는 ssRNA)이 고정상 (예컨대 셀룰로스 물질)에 결합하는 능력을 증가 또는 감소시키는 것을 의미한다. 바람직하게는, 용출액은 화합물 (예컨대 dsRNA 또는 ssRNA)의 고정상 (예컨대 셀룰로스 물질)에 결합하는 능력을 감소시킬 수 있다. 따라서, 이 바람직한 실시형태에서, (1) 화합물이 고정상에 결합되는 경우, 고정상을 용출액과 접촉시키는 단계는 고정상으로부터 화합물의 방출을 야기하거나, (2) 화합물이 용출액에 용해되는 경우, 용출액은 고정상에 결합하는 화합물의 능력을 감소시키며, 바람직하게는 용출액은 고정상에 대한 화합물의 결합을 방지한다. 본원에 사용된 바와 같은 "용리시키는"이라는 용어는 고정상으로부터 화합물을 방출시키기 위해 화합물 (예컨대, ssRNA)이 결합된 고정상 (예를 들어, 셀룰로스 물질)을 포함하는 컬럼 (스핀 컬럼을 포함한다) (상)에 용출액을 적용 또는 로딩하는 것을 의미한다. 셀룰로스 물질에 결합된 ssRNA에 대한 바람직한 용출액은 상기 명시된 바와 같이 제 1 배지 (예를 들어, 제 1 완충액)인 반면에, 셀룰로스 물질에 결합된 dsRNA에 대한 바람직한 용출액은 제 1 또는 제 2 배지 (예를 들어, 제 1 또는 제 2 완충액)와 동일한 조성물일 수 있지만 EtOH (예를 들어, 제 3 배지는 물일 수 있다)을 함유하지 않는 제 3 배지 (예를 들어, 제 3 완충액)이다. 셀룰로스 물질에 결합된 dsRNA 또는 ssRNA를 방출하지 않는 바람직한 세정액은 상기 명시된 바와 같이 제 2 배지 (예를 들어, 제 2 완충액)이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "용출액"은 용출액이 컬럼 상에 적용되거나 로딩될 때 컬럼을 용출하는 액체를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "컬럼"은 대향 양상 상에 2개의 개구부, 적어도 하나의 프릿, 및 고정상 (예컨대 셀룰로스 물질)을 갖는 용기, 특히 원통형 용기를 지칭하며, 여기서 제 1 개구부는 액체 (예컨대 배지, 예를 들어, 세정액 또는 배지, 예를 들어, 제 1 또는 제 2 완충액)를 용기 내로 도입하도록 구성되는 반면, 제 2 개구부는 제 1 개구부 및 고정상으로부터 분리되어 (i) 고정상이 프릿에 의해 컬럼 내에서 보류되지만, (ii) 액체가 프릿 및 제 2 개구부를 통과하도록 구성된다. 컬럼은 HPLC 방법 또는 FPLC 방법에서 사용 가능하도록 구성될 수 있다. 그러나, 본 발명의 방법에서 사용될 컬럼은 바람직하게는 FPLC 방법에서 사용 가능하도록 구성된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "HPLC"는 고압 액체 크로마토크래피를 의미하며, 여기서 액체상은 혼합물 중 적어도 하나의 성분을 분리, 동정, 및/또는 정량하기 위해 컬럼을 통해 고압 (전형적으로 적어도 5MPa, 예컨대 5 내지 35MPa) 하에 펌핑된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "FPLC"는 고속 성능 액체 크로마토크래피를 의미하고, 여기서 액체상은 혼합물 중 적어도 하나의 성분을 분리, 동정 및/또는 정량하기 위해 컬럼을 통해 유동하게 한다. FPLC 컬럼을 통한 액체의 흐름은 중력 또는 압력을 가함으로써 달성될 수 있으며, 여기서 압력은 바람직하게는 2MPa 이하 (예컨대 1MPa 이하, 5,000hPa 이하, 4,000hPa 이하, 3,000hPa 이하, 2,000hPa 이하, 또는 1,000hPa 이하)이다.
본원에 사용된 바와 같이 RNA 제제에 대하여 용어 "예비-정제 처리"는 RNA 제제의 오염물을 부분적으로 또는 완전히 제거하기 위한 절차를 의미하며, 여기서 오염물은 바람직하게는 RNA 이외의 모든 화합물, 예컨대 (임의로 변형된) IVT RNA를 발생시키는데 사용되는 개시 물질 및 이들의 분해 산물, 예를 들어, DNA 주형; RNA 중합효소 (예컨대 T7, T3 또는 SP6); 비변형된 형태 (예를 들어, rATP, rGTP, rCTP, rUTP, 및 오직 1개 또는 2개 인산기를 갖는 이의 유사체) 또는 변형된 형태 (예를 들어, r(1mΨ)TP 또는 rΨTP 및 오직 1개 또는 2개 인산기를 갖는 이의 유사체)의 모노리보뉴클레오타이드; 피로인산; 캡 시약 (즉, 5'-캡 또는 5'-캡 유사체를 도입하는 시약); 및 IVT RNA를 발생시키는데 사용되는 첨가제 (예를 들어, 완충제, 염, 항산화제, 및 폴리아민 (예컨대 스페르미딘))을 포함한다. 당업자에게 공지된 적절한 예비-정제 처리의 예로서는 핵산의 침전 (바람직하게는 염화리튬을 사용한다); 자성 비드 (예를 들어, 자성 비드에 결합하지 않는 오염물은 적합한 배지를 사용하여 세정할 수 있다)에 핵산 (특히 RNA)의 결합; 한외여과; 및 DNA의 분해, 바람직하게는 듀플렉스-특이적 핵산분해효소 (DSN)를 사용한 DNA의 분해를 포함한다. 예를 들어, RNA는 "아세트산나트륨/이소프로판올" 침전법 또는 "LiCl" 침전법 (바람직하게는 "LiCl" 침전법에 의해)을 사용하여 침전될 수 있으며, 둘 다 건식형 RNA 제제를 생성한다. 각각의 경우에, 침전되고 건조되어 이렇게 수득된 RNA는 적당한 양의 물 또는 TE 완충액 (10mM TRIS, 1mM EDTA)에 용해될 수 있으며, 이들 모두 바람직하게는 RNase가 없다.
"아세트산나트륨/이소프로판올" 침전법은 하기와 같은 단계를 포함한다: 0.1 볼륨의 3M 아세트산나트륨 (pH 4.0) 및 1 볼륨의 이소프로판올을 RNA 제제에 첨가하는 단계, 얻어진 혼합물을 혼합하는 단계, -20℃에서 1시간 동안 혼합물을 인큐베이팅하는 단계, 원심력 (예를 들어, 10분 동안 14,000xg)을 가하는 단계, RNA 펠렛에서 상등액을 제거하는 단계, 200㎕의 얼음으로 차게 한 70% (v/v) EtOH로 RNA 펠렛을 세정하는 단계 (즉, 200㎕의 얼음으로 차게 한 70% (v/v) EtOH을 RNA 펠렛에 첨가하고, 원심력 (예를 들어, 5분 동안 14,000xg)을 가하며, RNA 펠렛에서 상등액을 제거하는 단계), 및 RNA 펠렛을 건조 (바람직하게는 풍건)시키는 단계 (바람직하게는 에탄올을 제거하기 위한 이러한 방식).
"LiCl" 침전법은 하기와 같은 단계를 포함한다: 최종 LiCl 농도가 2.5M이 되도록 RNA 제제에 염화리튬 (LiCl)을 첨가하는 단계, -20℃에서 30분 동안 혼합물을 인큐베이팅하는 단계, 원심력 (예를 들어, 10분 동안 14,000xg)을 가하는 단계, RNA 펠렛에서 상등액을 제거하는 단계, 200㎕의 얼음으로 차게 한 70% (v/v) EtOH로 RNA 펠렛을 세정하는 단계 (즉, 200㎕의 얼음으로 차게 한 70% (v/v) EtOH을 RNA 펠렛에 첨가하고, 원심력 (예를 들어, 5분 동안 14,000xg)을 가하며, RNA 펠렛에서 상등액을 제거하는 단계), 및 RNA 펠렛을 건조 (바람직하게는 풍건)시키는 단계 (바람직하게는 에탄올을 제거하기 위한 이러한 방식).
본원에 사용된 바와 같은 용어 "RNA 중합효소"는 일차 전사 RNA를 생성하는 DNA-의존성 RNA 중합효소를 의미한다. 본 발명에 따른 IVT RNA를 생성하기에 적합한 RNA 중합효소의 예로는 T7, T3 및 SP6 RNA 중합효소가 포함된다. 바람직한 RNA 중합효소는 T7 RNA 중합효소이다.
본원에 사용된 바와 같이 ssRNA 또는 ssRNA를 포함하는 RNA 제제와 관련하여 "실질적으로 dsRNA가 없다"라는 용어는 ssRNA 또는 ssRNA를 포함하는 RNA 제제 내의 dsRNA의 양이 상기 ssRNA 또는 ssRNA를 포함하는 RNA 제제를 본 발명의 방법으로 수행하기 전에 ssRNA 또는 ssRNA를 포함하는 RNA 제제에 함유된 dsRNA의 양에 비해 적어도 70% (바람직하게는 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 82%, 적어도 84%, 적어도 86%, 적어도 88%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%)으로 감소되는 것을 의미하고, 여기서 상기 ssRNA 또는 ssRNA를 포함하는 RNA 제제가 본 발명의 방법으로 수행된 것이다. 바람직하게는, 본 발명의 방법으로 수행된 상기 ssRNA 또는 ssRNA를 포함하는 RNA 제제는 대상체에 투여될 때 상기 대상체에서 상기 ssRNA 또는 ssRNA를 포함하는 RNA 제제가 원치않는 반응 (예컨대 염증성 사이토카인 (예를 들어, IFN-α)의 원치않는 유도 및/또는 본 발명의 ssRNA로부터 단백질 합성의 억제를 유도하는 이펙터 효소의 원치않는 활성화)을 실질적으로 유도하지 않도록 하는 dsRNA의 함량을 갖는다. 예를 들어, "실질적으로 dsRNA가 없다" 및 "원치않는 반응을 실질적으로 유도하지 않는다"라는 용어는 대상체에 투여할 때 ssRNA 또는 ssRNA를 포함하는 RNA 제제가 대조군 ssRNA (즉, 본 발명의 방법으로 수행하지 않는 ssRNA 또는 ssRNA를 포함하는 RNA 제제)에 비해 적어도 60% (예를 들어, 적어도 62%, 적어도 64%, 적어도 66%, 적어도 68%, 적어도 70%, 적어도 72%, 적어도 74%, 적어도 76%, 적어도 78%, 적어도 80%)로 감소된 양의 염증성 사이토카인 (특히 IFN-α)을 유도하는 것을 의미할 수 있고, 여기서 상기 ssRNA 또는 ssRNA를 포함하는 RNA 제제는 본 발명의 방법으로 수행된 것이다. 바람직하게는, "실질적으로 dsRNA가 없다" 및 "원치않는 반응을 실질적으로 유도하지 않는다"는 용어는 대상체에 투여할 때 ssRNA 또는 ssRNA를 포함하는 RNA 제제가 투여 후 적어도 10시간 (예를 들어, 적어도 12시간, 적어도 14시간, 적어도 16시간, 적어도 18시간, 적어도 20시간, 적어도 22시간, 또는 적어도 24시간) 동안 펩타이드 또는 단백질로 ssRNA의 번역을 야기하는 것을 의미하며, 여기서 상기 ssRNA 또는 RNA 제제는 본 발명의 방법으로 수행된 것이고 상기 ssRNA는 펩타이드 또는 단백질에 대해 암호화하는 것이다. 예를 들어, ssRNA 또는 ssRNA를 포함하는 RNA 제제 중 dsRNA의 함량은 상기 ssRNA 또는 ssRNA를 포함하는 RNA 제제의 총 중량에 기반하여 5중량% 이하(바람직하게는 4중량% 이하, 3중량% 이하, 2중량% 이하, 1중량% 이하, 0.5중량% 이하, 0.1중량% 이하, 0.05중량% 이하, 0.01중량% 이하, 0.005중량% 이하, 0.001중량% 이하일 수 있고, 여기서 상기 ssRNA 또는 ssRNA를 포함하는 RNA 제제는 본 발명의 방법으로 수행된 것이다.
본원에 사용된 바와 같이 ssRNA 또는 ssRNA를 포함하는 RNA 제제와 관련하여 "실질적으로 DNA가 없다"라는 용어는 ssRNA 또는 ssRNA를 포함하는 RNA 제제 중 dsRNA의 함량이 상기 ssRNA 또는 ssRNA를 포함하는 RNA 제제의 총 중량에 기반하여 5중량% 이하 (바람직하게는 4중량% 이하, 3중량% 이하, 2중량% 이하, 1중량% 이하, 0.5중량% 이하, 0.1중량% 이하, 0.05중량% 이하, 0.01중량% 이하, 0.005중량% 이하, 0.001중량% 이하) 일 수 있다는 의미이고, 여기서 상기 ssRNA 또는 ssRNA를 포함하는 RNA 제제는 본 발명의 방법으로 수행된 것이다.
본원에 사용된 바와 같이 ssRNA 또는 ssRNA를 포함하는 RNA 제제와 관련하여 "실질적으로 dsRNA 및 DNA가 없다"라는 용어는 상기 ssRNA 또는 ssRNA를 포함하는 RNA 제제에는 상기 명시된 바와 같이 실질적으로 dsRNA가 없고(예를 들어, 투여 후 적어도 10시간 번역이 지속되고 및/또는 dsRNA 함량이 5중량% 이하이다), 상기 명시된 바와 같이 실질적으로 DNA가 없다(예를 들어, DNA 함량이 5중량% 이하이다)는 의미이고, 여기서 상기 ssRNA 또는 ssRNA를 포함하는 RNA 제제는 본 발명의 방법으로 수행된 것이다.
본 발명과 관련하여, 용어 "RNA"는 리보뉴클레오타이드 잔기를 포함하는 분자에 관한 것이고, 바람직하게는 완전히 또는 대체로 리보뉴클레오타이드 잔기로 이루어진 분자에 관한 것이다. 용어 "리보뉴클레오타이드"는 β-D-리보푸라노실기의 2'-위치에 수산기를 갖는 뉴클레오타이드에 관한 것이다. 용어 "RNA"는 분리된 RNA, 예컨대 부분적으로 또는 완전히 정제된 RNA, 본질적으로 순수한 RNA, 합성 RNA, 및 재조합적으로 발생된 RNA를 포함하고, 하나 이상의 뉴클레오타이드의 부가, 결실, 치환 및/또는 변경에 의해 자연 발생적인 RNA와 상이한 변형된 RNA를 포함한다. 이러한 변경은 예를 들어, RNA 중 하나 이상의 뉴클레오타이드에서, RNA의 말단(들)에 또는 내부적으로, 비-뉴클레오타이드 물질을 첨가하는 것을 포함할 수 있다. 또한, RNA 분자의 뉴클레오타이드는 비-표준 뉴클레오타이드, 예컨대 비-자연 발생적인 뉴클레오타이드 또는 화학적으로 합성된 뉴클레오타이드 또는 데옥시뉴클레오타이드도 포함할 수 있다. 이들 변경된/변형된 뉴클레오타이드는 자연 발생적인 뉴클레오타이드의 유사체로 지칭될 수 있고, 이러한 변경된/변형된 뉴클레오타이드를 함유하는 상응하는 RNA (즉, 변경/변형된 RNA)는 자연 발생적인 RNA의 유사체로 지칭할 수 있다. 분자 내에서 리보뉴클레오타이드 잔기의 함량이 분자 내 뉴클레오타이드 잔기의 총 수에 기반하여 적어도 40% (예컨대 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%)일 경우에, 분자는 "실질적으로 리보뉴클레오타이드 잔기로 구성된 것"이다. 분자 내 뉴클레오타이드 잔기의 총 수는 (뉴클레오타이드 잔기가 표준 (즉, 자연 발생적인) 뉴클레오타이드 잔기 또는 이의 유사체인지 여부에 상관없이) 모든 뉴클레오타이드 잔기의 합이다
RNA는 세포로부터 분리될 수 있거나, DNA 주형으로부터 제조될 수 있거나, 당업계에 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, RNA는 DNA 주형으로부터 시험관내 합성된다. 특히 바람직한 일 실시형태에서, RNA, 특히 ssRNA 예컨대 mRNA 또는 억제성 ssRNA (예를 들어, 안티센스 RNA, siRNA 또는 miRNA)는 DNA 주형으로부터 시험관내 전사에 의해 생성된다. 시험관내 전사 방법론은 당업자에게 공지되어 있는 것이고; 예를 들어, 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, J. Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989]을 참고한다. 또한, 시판되고 있는 다양한 시험관내 전사 키트, 예를 들어, Thermo Fisher Scientific (예컨대 전사체AidTM T7 키트, MEGAscript® T7 kit, MAXIscript®), New England BioLabs Inc. (예컨대 HiScribeTM T7 kit, HiScribeTM T7 ARCA mRNA 키트), Promega (예컨대 RiboMAXTM, HeLaScribe®, Riboprobe® 시스템), Jena Bioscience (예컨대 SP6 또는 T7 전사 키트), 및 Epicentre (예컨대 AmpliScribeTM)를 들 수 있다. 특히 바람직한 일 실시형태에서, RNA는 시험관내 전사된 RNA (IVT RNA)이다. 변형된 RNA를 제공하기 위해, 상응하게 변형된 뉴클레오타이드, 예컨대 상응하게 변형된 뉴클레오타이드, 예컨대 변형된 자연 발생적인 뉴클레오타이드, 비-자연 발생적인 뉴클레오타이드 및/또는 변형된 비-자연 발생적인 뉴클레오타이드는 합성 (바람직하게는 시험관내 전사) 동안에 혼입될 수 있거나, 변형체들은 RNA에 영향을 미칠 수 있고 및/또는 전사 후 RNA에 첨가될 수 있다.
본 발명에 따르면, RNA로서는 6 내지 100, 바람직하게는 10 내지 50, 특히 15 내지 30 또는 15 내지 20의 뉴클레오타이드의 합성 올리고뉴클레오타이드 또는 50 초과의 뉴클레오타이드, 바람직하게는 100 내지 15,000, 보다 바람직하게는 50 내지 10,000, 보다 바람직하게는 100 내지 5,000, 특히 200 내지 1,000 뉴클레오타이드의 보다 긴 전사체인 것이 바람직하다.
본 발명에 따르면, "RNA"는 mRNA, tRNA, rRNA, snRNA, ssRNA, dsRNA, 및 억제성 RNA를 포함한다.
본 발명에 따르면, "ssRNA"는 mRNA 및 억제성 ssRNA (예컨대 안티센스 ssRNA, siRNA, 또는 miRNA)를 포함한다.
"ssRNA"는 단일가닥 RNA를 의미한다. ssRNA는 RNA의 일부가 접히고 이중 나선을 형성하기 위해 자체적으로 쌍을 이루도록 하는 자체-상보 서열을 포함할 수 있다. ssRNA의 크기는 6 내지 15,000 뉴클레오타이드, 바람직하게는 10 내지 12,000, 특히 100 내지 10,000, 150 내지 8,000, 200 내지 7,000, 250 내지 6,000, 또는 300 내지 5,000 뉴클레오타이드로 다양할 수 있다. 일 실시형태에서, ssRNA는 적어도 2,700 뉴클레오타이드 (예컨대 적어도 2,800, 적어도 2,900, 적어도 3,000, 적어도 3,100, 적어도 3,200, 적어도 3,300, 적어도 3,400, 적어도 3,500, 적어도 3,600, 적어도 3,700, 적어도 3,800, 적어도 3,900, 적어도 4,000, 적어도 4,100, 적어도 4,200, 적어도 4,300, 적어도 4,400, 적어도 4,500, 적어도 4,600, 적어도 4,700, 적어도 4,800, 적어도 4,900, 적어도 5,000 뉴클레오타이드)의 길이를 갖는다. 본원에 사용된 바와 같이 길이가 긴 ssRNA는 적어도 3,500 뉴클레오타이드 (예컨대 적어도 3,600, 적어도 3,700, 적어도 3,800, 적어도 3,900, 적어도 4,000, 적어도 4,100, 적어도 4,200, 적어도 4,300, 적어도 4,400, 적어도 4,500, 적어도 4,600, 적어도 4,700, 적어도 4,800, 적어도 4,900, 적어도 5,000, 적어도 5,500, 적어도 6,000, 적어도 6,500, 적어도 7,000, 적어도 7,500, 적어도 8,000, 적어도 8,500, 적어도 9,000, 적어도 9,500 뉴클레오타이드), 바람직하게는 15,000 이하, 예컨대 14,000 이하, 13,000 이하 또는 12,000 이하의 뉴클레오타이드인 길이를 갖는 ssRNA를 의미한다.
본 발명에 따르면, "dsRNA"는 이중가닥 RNA를 의미하며, 2개의 부분적으로 또는 완전히 상보적인 가닥을 갖는 RNA이다. 가닥의 크기는 6 뉴클레오타이드 내지 10,000, 바람직하게는 10 내지 8,000, 특히 200 내지 5,000, 200 내지 2,000 또는 200 내지 1,000 뉴클레오타이드로 다양할 수 있다.
본 발명에 따르면, 용어 "mRNA"는 "메신저-RNA"를 의미하며, DNA 주형을 사용하여 생성될 수 있고 펩타이드 또는 단백질을 코딩할 수 있는 "전사체"에 관한 것이다. 전형적으로, mRNA는 5'-UTR, 단백질 코딩 영역 및 3'-UTR을 포함한다. 본 발명과 관련하여, mRNA는 바람직하게는 DNA 주형으로부터 시험관내 전사에 의해 생성된다. 상술한 바와 같이, 시험관내 전사 방법론은 당업자에게 공지되어 있는 것이며, 다양한 시험관내 전사 키트가 시판되고 있다. mRNA의 크기는 약 1,000 내지 15,000 뉴클레오타이드, 바람직하게는 2,000 내지 12,000, 특히 2,700 내지 11,000, 3000 내지 10,000, 3,500 내지 9,000, 4,000 내지 9,000, 4,500 내지 7,000, 또는 5,000 내지 8,000 뉴클레오타이드로 다양할 수 있다. 일 실시형태에서, mRNA는 적어도 2,700 뉴클레오타이드 (예컨대 적어도 2,800, 적어도 2,900, 적어도 3,000, 적어도 3,100, 적어도 3,200, 적어도 3,300, 적어도 3,400, 적어도 3,500, 적어도 3,600, 적어도 3,700, 적어도 3,800, 적어도 3,900, 적어도 4,000, 적어도 4,100, 적어도 4,200, 적어도 4,300, 적어도 4,400, 적어도 4,500, 적어도 4,600, 적어도 4,700, 적어도 4,800, 적어도 4,900, 적어도 5,000 뉴클레오타이드)의 길이를 갖는다. 길이가 긴 mRNA는 적어도 3,500 뉴클레오타이드 (예컨대 적어도 적어도 3,600, 적어도 3,700, 적어도 3,800, 적어도 3,900, 적어도 4,000, 적어도 4,100, 적어도 4,200, 적어도 4,300, 적어도 4,400, 적어도 4,500, 적어도 4,600, 적어도 4,700, 적어도 4,800, 적어도 4,900, 적어도 5,000, 적어도 5,500, 적어도 6,000, 적어도 6,500, 적어도 7,000, 적어도 7,500, 적어도 8,000, 적어도 8,500, 적어도 9,000, 적어도 9,500 뉴클레오타이드), 바람직하게는 15,000 이하, 예컨대 14,000 이하, 13,000 이하, 12,000 이하, 11,000 이하, 또는 10,000 뉴클레오타이드 이하의 크기를 갖는 mRNA를 의미한다.
mRNA는 세포 및 시험관내에서 제한된 반감기만을 가지고 있다. 따라서, 본 발명에 따르면, RNA의 안정성 및 번역 효율성은 필요에 따라 변형될 수 있다. 예를 들어, mRNA는 안정화될 수 있고 이의 번역은 안정화 효과 및/또는 mRNA의 번역 효율을 증가시키는 하나 이상의 변형에 의해 증가될 수 있다. 이러한 변형은 예를 들어, WO 2007/036366에 기재되어 있으며, 그 전체 내용은 본원에 참고로 인용되어 있다. 본 발명에 따른 mRNA의 발현을 증가시키기 위하여, 발현된 펩타이드 또는 단백질을 코딩하는 서열, 바람직하게는 발현된 펩타이드 또는 단백질의 서열을 변경하지 않고 코딩 영역 내에서 변형시켜, mRNA 안정성을 증가시키기 위한 GC-함량을 증가시키고 코돈 최적화를 수행하여 세포에서 번역을 향상시킬 수 있다.
본 발명에 따른 RNA, 바람직하게는 ssRNA (예컨대 mRNA)와 관련하여 용어 "변형"은 상기 RNA에 자연적으로 존재하지 않는 RNA (바람직하게는 ssRNA, 예컨대 mRNA)의 임의의 변형을 포함한다.
본 발명의 일 실시형태에서, 본 발명에 따른 ssRNA (바람직하게는 mRNA)는 캡핑되지 않은 5'-트리포스페이트를 갖지 않는다. 이러한 캡핑되지 않은 5'-트리포스페이트의 제거는 ssRNA (바람직하게는 mRNA)를 인산가수분해효소로 처리함으로써 달성될 수 있다.
본 발명에 따른 ssRNA (바람직하게는 mRNA)는 이의 안정성을 증가시키고 및/또는 세포 독성을 감소시키기 위해 변형된 리보뉴클레오타이드를 가질 수 있다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 본 발명에 따른 ssRNA (바람직하게는 mRNA)에서 5-메틸시티딘은 부분적으로 또는 완전히, 바람직하게는 완전히 시티딘으로 치환된다. 또는, 일 실시형태에서, 본 발명에 따른 ssRNA (바람직하게는 mRNA)에서 슈도우리딘 또는 N(1)-메틸슈도우리딘은 부분적으로 또는 완전히, 바람직하게는 완전히 우리딘으로 치환된다. 슈도우리딘에 의해 변형된(부분적으로 또는 완전히, 바람직하게는 완전히 우리딘으로 치환된) RNA (바람직하게는 ssRNA 예컨대 mRNA)는 본원에서 "Ψ-변형된" 것으로 지칭되는 반면, 용어 "1mΨ-변형된"은 RNA (바람직하게는 ssRNA 예컨대 mRNA)가 N(1)-메틸슈도우리딘 (부분적으로 또는 완전히, 바람직하게는 완전히 우리딘으로 치환된)을 포함하는 것을 의미한다.
일 실시형태에서, 용어 "변형"은 5'-캡 또는 5'-캡 유사체를 갖는 RNA (바람직하게는 ssRNA, 예컨대 mRNA)를 제공하는 것에 관한 것이다. 용어 "5'-캡"은 RNA (바람직하게는 ssRNA, 예컨대 mRNA) 분자의 5'-말단에서 발견되는 캡 구조를 지칭하며, 일반적으로 비정상적인 5' 내지는 5' 트리포스페이트 연결을 통해 RNA (바람직하게는 ssRNA, 예컨대 mRNA)에 연결된 구아노신 뉴클레오타이드로 이루어진 것이다. 일 실시형태에서, 이 구아노신은 7-위치에서 메틸화된다. "통상적인 5'-캡"이라는 용어는 자연 발생적인 RNA 5'-캡, 바람직하게는 7-메틸구아노신 캡 (m7G)을 지칭한다. 본 발명과 관련하여, 용어 "5'-캡"은 RNA 캡 구조와 유사하고 RNA (바람직하게는 ssRNA, 예컨대 mRNA)를 안정화시키는 능력을 갖도록 변형되고 및/또는 바람직하게는 생체내 및/또는 세포 내에서 RNA (바람직하게는 ssRNA, 예컨대 mRNA)에 결합하는 경우에 이의 번역을 향상시키는 5'-캡 유사체를 포함한다.
바람직하게는, RNA (바람직하게는 ssRNA, 예컨대 mRNA)의 5' 말단은 하기 일반 화학식을 갖는 캡 구조를 포함한다:
Figure pat00001
여기서 R1 및 R2는 독립적으로 독립적으로 하이드록시 또는 메톡시이고, W, X 및 Y는 독립적으로 산소, 황, 셀레늄, 또는 BH3이다. 바람직한 일 실시형태에서, R1 및 R2는 하이드록시이고, W, X 및 Y는 산소이다. 또 다른 바람직한 일 실시형태에서, R1 및 R2 중 하나, 바람직하게는 R1은 하이드록시이고 다른 하나는 메톡시이고 W, X 및 Y는 산소이다. 또 다른 바람직한 일 실시형태에서, R1 및 R2는 하이드록시이고 W, X 및 Y 중 하나, 바람직하게는 X는 황, 셀레늄 또는 BH3이고, 바람직하게는 황이며, 다른 하나는 산소이다. 또 다른 바람직한 일 실시형태에서, R1 및 R2 중 하나, 바람직하게는 R2는 하이드록시이고 다른 하나는 메톡시이고 W, X 및 Y 중 하나, 바람직하게는 X는 황, 셀레늄 또는 BH3이고, 바람직하게는 황이고 다른 하나는 산소이다.
상기 화학식에서, 우측의 뉴클레오타이드는 이의 3' 기를 통해 RNA (바람직하게는 ssRNA, 예컨대 mRNA) 사슬과 연결된다.
W, X 및 Y 중 적어도 하나가 황인, 즉 포스포로티오에이트 부분을 갖는 캡 구조체는 모두 본원에 포함되는 상이한 부분입체이성질체 형태로 존재한다. 또한, 본 발명은 상기 화학식의 모든 호변이성질체 및 입체이성질체를 포함한다.
예를 들어, R1이 메톡시이고, R2가 하이드록시이고, X가 황이고, W 및 Y가 산소인 상기 구조를 갖는 캡 구조는 2개의 부분입체이성질체 형태 (Rp 및 Sp)로 존재한다. 이들은 역상 HPLC에 의해 분석될 수 있으며, 역상 HPLC 컬럼으로부터의 용출 순서에 따라 D1 및 D2로 명명된다. 본 발명에 따르면, m2 7,2'- O GppSpG의 D1 이성질체가 특히 바람직하다. 결과적으로, 본원에 사용된 바와 같은 용어 "D1-캡핑된"은 상기 명시된 바와 같이 m2 7,2'- O GppSpG의 D1 이성질체로 캡핑된 RNA (바람직하게는 ssRNA, 예컨대 mRNA)를 지칭한다. 유사하게, 본원에 사용된 바와 같은 용어 "D2-캡핑된"은 상기 명시된 바와 같이 m2 7,2'- O GppSpG의 D2 이성질체로 캡핑된 RNA (바람직하게는 ssRNA, 예컨대 mRNA)를 지칭한다. 캡 구조의 다른 예로서는 당업자에게 공지되어 있는 것이며, 그 전체 내용이 본원에 참고로 인용된 WO 2008/157688에 기재된 것들을 포함한다.
5'-캡 또는 5'-캡 유사체와 함께 RNA (바람직하게는 ssRNA, 예컨대 mRNA)를 제공하는 것은 상기 5'-캡 또는 5'-캡 유사체의 존재 하에 DNA 주형의 시험관내 전사에 의해 달성될 수 있으며, 여기서 상기 5'-캡은 생성된 RNA (바람직하게는 ssRNA, 예컨대 mRNA) 가닥에 공-전사적으로 혼입되거나, RNA (바람직하게는 ssRNA, 예컨대 mRNA)가 예를 들어 시험관내 전사에 의해 생성될 수 있고, 5'-캡은 캡핑 효소, 예를 들어 백시니아바이러스의 캡핑 효소를 사용하여 전사 후 RNA (바람직하게는 ssRNA, 예컨대 mRNA)에 부착될 수 있다.
RNA (바람직하게는 ssRNA, 예컨대 mRNA)는 추가의 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 ssRNA의 추가 변형은 자연 발생적인 폴리(A) 꼬리의 연장이나 절단 또는 5'- 또는 3'-비번역 ("5'- 또는 3'-비-번역된"이라고도 한다) 영역 (UTR)의 변경일 수 있다.
비마스킹 폴리-A 서열을 갖는 RNA (바람직하게는 ssRNA, 예컨대 mRNA)는 마스크된 폴리-A 서열을 갖는 RNA (바람직하게는 ssRNA, 예컨대 mRNA)보다 효율적으로 번역된다. 용어 "폴리(A) 꼬리" 또는 "폴리-A 서열"은 전형적으로 RNA (바람직하게는 ssRNA, 예컨대 mRNA) 분자의 3'-말단에 위치하는 아데노신 (특히 아데닐릴) (A) 잔기의 서열에 관한 것이고, "비마스킹 폴리-A 서열"은 RNA (바람직하게는 ssRNA, 예컨대 mRNA) 분자의 3' 말단에서 폴리-A 서열이 폴리-A 서열의 A로 끝나고 폴리-A 서열의 3' 말단, 즉 하류에 위치한 A 이외의 뉴클레오타이드가 이어지지 않는다는 것을 의미한다. 또한, 길이가 약 120 뉴클레오타이드인 긴 폴리-A 서열은 RNA (바람직하게는 ssRNA, 예컨대 mRNA)의 최적의 전사 안정성 및 번역 효율을 초래한다.
따라서, 본 발명에 따른 RNA, 바람직하게는 ssRNA (예컨대 mRNA)의 안정성 및/또는 발현을 증가시키기 위해, 폴리-A 서열과 함께 존재하도록 변형될 수 있고, 바람직하게는 길이가 10 내지 500, 보다 바람직하게는 30 내지 300, 더욱 바람직하게는 65 내지 200, 특히 바람직하게는 100 내지 150개의 아데노신 (특히 아데닐릴) 잔기를 갖는다. 특히 바람직한 일 실시형태에서, 폴리-A 서열은 약 120개 아데노신 (특히 아데닐릴) 잔기의 길이를 갖는다. 본 발명에 따른 RNA, 바람직하게는 ssRNA (예를 들어, mRNA)의 안정성 및/또는 발현을 추가로 증가시키기 위해, 폴리-A 서열을 마스킹하지 않을 수 있다.
또한, RNA (바람직하게는 ssRNA, 예컨대 mRNA) 분자의 3'-비번역 영역에 3'-UTR을 도입하면 번역 효율이 향상될 수 있다. 시너지 효과는 이러한 3'-UTR 중 둘 이상을 혼입함으로써 달성될 수 있다. 3'-UTR은 이들이 도입된 RNA (바람직하게는 ssRNA, 예컨대 mRNA)에 대해 자가 또는 이종일 수 있다. 특정 일 실시형태에서, 3'-UTR은 글로빈 유전자 또는 mRNA, 예컨대 알파2-글로빈, 알파1-글로빈, 또는 베타-글로빈, 바람직하게는 베타-글로빈, 보다 바람직하게는 인간 베타-글로빈의 유전자 또는 mRNA로부터 유도된다.
상기한 변형의 조합, 즉 폴리-A 서열의 혼입, 폴리-A 서열의 비마스킹, 하나 이상의 3'-UTR의 혼입 및 하나 이상의 자연 발생적인 뉴클레오타이드를 합성 뉴클레오타이드로의 대체(예를 들어, 시티딘에 대한 5-메틸시티딘 및/또는 우리딘에 대한 슈도우리딘 (Ψ) 또는 N(1)-메틸슈도우리딘 (1mΨ))의 경우에는 RNA (바람직하게는 ssRNA, 예컨대 mRNA)의 안정성 및 번역 효율의 증가에 상승적인 영향을 미친다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "억제성 RNA"는 표적 mRNA에 선택적으로 혼성화 및/또는 표적 mRNA에 대해 특이적인 RNA를 의미하며, 이에 의해 이의 전사 및/또는 번역을 억제(예를 들어, 감소)시킨다. 억제성 RNA는 표적 mRNA에 대하여 안티센스 배향으로 서열을 갖는 RNA 분자를 포함한다. 적합한 억제성 올리고뉴클레오타이드는 전형적으로 길이가 5 내지 수백 개의 뉴클레오타이드, 보다 전형적으로는 길이가 약 20 내지 70개의 뉴클레오타이드 또는 더 짧고, 더욱 전형적으로는 길이가 약 10 내지 30개의 뉴클레오타이드이다. 억제성 RNA의 예로서는 안티센스 RNA, 리보자임, iRNA, siRNA 및 miRNA를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "안티센스 RNA"는 생리학적 조건 하에서 특정 유전자 또는 상기 유전자의 mRNA를 포함하는 DNA에 혼성화하는 RNA를 지칭하며, 이에 의해 상기 유전자의 전사 및/또는 상기 mRNA의 번역을 억제한다. 핵산의 안티센스 전사체 또는 이의 일부는 자연 발생적인 mRNA와 이중가닥을 형성하여 mRNA의 축적 또는 번역을 방지할 수 있다. 다른 가능성은 핵산을 불활성화시키기 위한 리보자임을 사용하는 것이다. 안티센스 RNA는 번역 개시 부위, 전사 개시 부위 또는 프로모터 부위와 같은 N-말단 또는 5' 상류 부위, 예컨대 번역 개시 부위, 전사 개시 부위 또는 프로모터 부위와 혼성화할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 안티센스 RNA는 3'-비번역 영역 또는 mRNA 스플라이싱 부위와 혼성화할 수 있다.
안티센스 RNA의 크기는 15 내지 15,000 뉴클레오타이드, 바람직하게는 20 내지 12,000, 특히 100 내지 10,000, 150 내지 8,000, 200 내지 7,000, 250 내지 6,000, 300 내지 5,000 뉴클레오타이드, 예컨대 15 내지 2,000, 20 내지 1,000, 25 내지 800, 30 내지 600, 35 내지 500, 40 내지 400, 45 내지 300, 50 내지 250, 55 내지 200, 60 내지 150, 또는 65 내지 100 뉴클레오타이드로 다양할 수 있다. 일 실시형태에서, 안티센스 RNA는 길이가 적어도 2,700 뉴클레오타이드 (예컨대 적어도 2,800, 적어도 2,900, 적어도 3,000, 적어도 3,100, 적어도 3,200, 적어도 3,300, 적어도 3,400, 적어도 3,500, 적어도 3,600, 적어도 3,700, 적어도 3,800, 적어도 3,900, 적어도 4,000, 적어도 4,100, 적어도 4,200, 적어도 4,300, 적어도 4,400, 적어도 4,500, 적어도 4,600, 적어도 4,700, 적어도 4,800, 적어도 4,900, 적어도 5,000 뉴클레오타이드)이다. 본원에 사용된 바와 같이, 길이가 긴 안티센스 RNA는 적어도 3,500 뉴클레오타이드 (예컨대 적어도 3,600, 적어도 3,700, 적어도 3,800, 적어도 3,900, 적어도 4,000, 적어도 4,100, 적어도 4,200, 적어도 4,300, 적어도 4,400, 적어도 4,500, 적어도 4,600, 적어도 4,700, 적어도 4,800, 적어도 4,900, 적어도 5,000, 적어도 5,500, 적어도 6,000, 적어도 6,500, 적어도 7,000, 적어도 7,500, 적어도 8,000, 적어도 8,500, 적어도 9,000, 적어도 9,500 뉴클레오타이드), 바람직하게는 15,000 이하, 예컨대 14,000 이하, 13,000 이하, 12,000 이하, 11,000 이하, 또는 10,000 이하의 뉴클레오타이드의 사이즈를 갖는 안티센스 RNA를 의미한다.
안티센스 RNA의 안정성은 필요에 따라 변형될 수 있다. 예를 들어, 안티센스 RNA는 안정화 효과를 갖는 하나 이상의 변형에 의해 안정화될 수 있다. 이러한 변형은 변형된 포스포디에스테르 결합 (예컨대 자연 발생적인 포스포디에스테르 결합 대신에 메틸포스포네이트, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 또는 포스포르아미데이트 결합) 및 2'-치환체 (예를 들어, 2'-플루오로, 2'-O-알킬 (예컨대 2'-O-메틸, 2'-O-프로필, 또는 2'-O-펜틸) 및 2'-O-알릴)를 포함한다. 예를 들어, 안티센스 RNA의 일 실시형태에서, 포스포로티오에이트 결합은 부분적으로 포스포디에스테르 결합에 대해 치환된다. 또는, 안티센스 RNA의 일 실시형태에서, 리보스 잔기는 부분적으로 2'-위치에서 O-알킬 (예컨대 2'-O-메틸)로 치환된다.
안티센스 RNA는 임의의 표적 mRNA 서열 ("표적 서열") 중 약 19 내지 25개의 인접 뉴클레오타이드의 임의의 스트레치를 표적으로 할 수 있다. 일반적으로, 표적 mRNA 상의 표적 서열은 표적 mRNA에 상응하는 주어진 cDNA 서열로부터 선택될 수 있고, 바람직하게는 시작코돈으로부터 하류 (즉, 3'-방향으로) 50 내지 100nt에서 시작할 것이다. 그러나, 표적 서열은 5'- 또는 3'-비번역 영역에 또는 시작코돈 근처의 영역에 위치할 수 있다.
안티센스 RNA는 당업자에게 공지된 다수의 기술을 사용하여 수득할 수 있다. 예를 들어, 안티센스 RNA는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성되거나 재조합적으로 생산될 수 있다. 바람직하게는, 안티센스 RNA는 임의의 적절한 프로모터를 사용하여 원형 또는 선형 DNA 재조합 플라스미드로부터 전사된다.
안티센스 RNA의 발현에 적합한 플라스미드의 선택, 플라스미드 내로 안티센스 RNA를 발현하기 위한 핵산 서열을 삽입하는 방법, 및 상기 안티센스 RNA의 시험관내 전사의 IVT 방법은 당해 기술 분야의 기술 범위 내에 있는 것이다.
"안티센스 ssRNA"는 상기 명시된 바와 같이 단일가닥인 안티센스 RNA에 관한 것이다.
본원에 사용된 바와 같이 "소간섭 RNA" 또는 "siRNA"는 RNA 분자, 바람직하게는 길이가 10개 초과인 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 길이가 15개 초과인 뉴클레오타이드, 가장 바람직하게는 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30개의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있으며, 이는 표적 mRNA의 일부에 특이적으로 결합할 수 있다. 이러한 결합은 표적 mRNA의 상기 일부가 절단되거나 분해되어 상기 표적 mRNA의 유전자 발현이 억제되는 과정을 유도한다. 19 내지 25개의 뉴클레오타이드의 범위가 siRNA의 가장 바람직한 크기이다. 원칙적으로, siRNA의 센스 및 안티센스 가닥은 2개의 상보적인 단일가닥 RNA 분자를 포함할 수 있지만, 본 발명에 따른 siRNA는 2개의 상보적인 부분이 염기쌍이 되어 단일가닥 "헤어핀" 영역에 의해 공유결합되어 있는 단일 분자를 포함한다. 즉, 센스 영역과 안티센스 영역은 링커 분자를 통해 공유결합될 수 있다. 링커 분자는 폴리뉴클레오타이드 또는 비-뉴클레오타이드 링커일 수 있지만, 바람직하게는 폴리뉴클레오타이드 링커이다. 특정 이론에 결부되기를 바라는 것 없이, 단일가닥 siRNA 분자의 헤어핀 영역은 "다이서(Dicer)" 단백질 (또는 이의 등가물)에 의해 세포 내에서 절단되어 2개의 개별 염기쌍 RNA 분자의 siRNA를 형성한다고 생각된다.
siRNA는 또한 3'-오버행을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "3'-오버행"은 RNA 가닥의 3'-말단으로부터 연장되는 적어도 하나의 쌍을 이루지 않는 뉴클레오타이드를 지칭한다. 따라서, 일 실시형태에서, siRNA는 길이가 1 내지 약 6 뉴클레오타이드 (리보뉴클레오타이드 또는 데옥시뉴클레오타이드를 포함한다), 바람직하게는 1 내지 약 5 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 1 내지 약 4 뉴클레오타이드, 특히 바람직하게는 약 2 내지 4 뉴클레오타이드, 특히 바람직하게는 약 2 내지 약 4 뉴클레오타이드인 적어도 하나의 3'-오버행을 포함한다. siRNA 분자의 두 가닥 (즉, 단일가닥 siRNA 분자가 "다이서" 단백질에 의해 세포 내에서 절단된 후에)이 3'-오버행을 포함하는 실시형태에서 오버행의 길이는 각각의 가닥에 대해 동일하거나 상이할 수 있다. 가장 바람직한 일 실시형태에서, 3'-오버행은 siRNA의 양 가닥 상에 존재하며 길이가 2 뉴클레오타이드이다. 예를 들어, siRNA의 각 가닥은 디데옥시티미딜산 ("TT") 또는 디우리딜산 ("uu")의 3'-오버행을 포함할 수 있다.
siRNA의 안정성을 향상시키기 위해, 3'-오버행은 또한 분해에 대해 안정화될 수 있다. 일 실시형태에서, 오버행은 퓨린 뉴클레오타이드, 예컨대 아데노신 또는 구아노신 뉴클레오타이드를 포함시킴으로써 안정화된다. 또는, 변형된 유사체에 의한 피리미딘 뉴클레오타이드의 치환, 예를 들어 3'-오버행에서 2'-데옥시티미딘으로 우리딘 뉴클레오타이드의 치환은 용인되고 RNAi 분해 효율에 영향을 미치지 않는다. 특히, 2'-데옥시티미딘에서 2'-하이드록실의 부재는 조직 배양 배지에서 3'-오버행의 핵산분해효소 내성을 유의적으로 향상시킨다.
본원에 사용된 바와 같이, "표적 mRNA"는 하향 조절에 대한 표적인 RNA 분자를 의미한다.
본 발명에 따른 siRNA는 임의의 표적 mRNA 서열 ("표적 서열") 중 약 19 내지 25개의 인접 뉴클레오타이드의 임의의 스트레치를 표적으로 할 수 있다. siRNA에 대한 표적 서열을 선택하기 위한 기술은 예를 들어, 2002년 10월 11일자로 개정된 문헌[Tuschl T. et al., "The siRNA User Guide"]에 기재되어 있고, 그 전체 내용은 본원에 참고로 인용된다. 문헌 "The siRNA User Guide"는 뉴욕의 Rockefeller 대학교의 RNA 분자 생물학 연구소 Thomas Tuschl 박사가 관리하는 웹 사이트에서 이용 가능하고, Rockefeller 대학교의 웹 사이트에 접속하여 키워드 "siRNA"로 검색하면 찾을 수 있다. 표적 서열의 선택 및/또는 siRNA의 디자인에 관한 추가 지침은 "siRNA"라는 키워드를 사용하여 Protocol Online (www.protocol-online.com)의 웹 페이지 상에서 찾을 수 있다. 따라서, 일 실시형태에서, 본 발명의 siRNA의 센스 가닥은 표적 mRNA 중 약 19 내지 약 25 뉴클레오타이드의 임의의 인접 스트레치와 실질적으로 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일반적으로, 표적 mRNA 상의 표적 서열은 표적 mRNA에 상응하는 주어진 cDNA 서열로부터 선택할 수 있고, 바람직하게는 시작코돈으로부터 하류 (즉, 3'-방향으로) 50 내지 100nt에서 시작할 것이다. 그러나, 표적 서열은 5'- 또는 3'-비번역 영역에 또는 시작코돈 근처의 영역에 위치할 수 있다.
siRNA는 당업자에게 공지된 다수의 기술을 사용하여 수득할 수 있다. 예를 들어, siRNA는 당업계에 공지된 방법, 예컨대 Tuschl 등의 미국 특허 출원 제 2002/0086356호에 기재된 Drosophila 시험관내 시스템을 사용하여 화학적으로 합성되거나 재조합적으로 생산될 수 있고, 그 전체 내용은 본 명세서에 참고로 포함된다. 최초 전사된 뉴클레오타이드가 퓨린일 때 pol III 프로모터로부터 RNA가 발현되는 것이 효율적이라고만 여겨지기는 하지만, 표적 부위의 변화 없이 pol III 발현 벡터로부터 siRNA를 발현시킬 수 있다.
바람직하게는, siRNA는 임의의 적합한 프로모터를 사용하여 원형 또는 선형 재조합 DNA 플라스미드로부터 전사된다. 플라스미드로부터 본 발명의 siRNA를 전사시키는 적절한 프로모터는 예를 들어 U6 또는 H1 RNA pol III 프로모터 서열 및 거대세포바이러스 프로모터를 포함한다. 당업계의 기술 범위 내에서 다른 적합한 프로모터를 선택할 수 있다.
siRNA를 전사시키는데 적합한 플라스미드를 선택하는 것, 플라스미드 내에서 siRNA를 발현하기 위한 핵산 서열을 삽입하는 방법, 및 상기 siRNA의 시험관내 전사의 IVT 방법은 당업계의 기술 범위 내에 있는 것이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "miRNA"(마이크로RNA)는 21 내지 25개(예컨대 21 내지 23, 바람직하게는 22개) 뉴클레오타이드 길이를 가지며 표적 mRNA의 분해를 유도하고 및/또는 표적 mRNA의 번역을 방지하는 비-코딩 RNA에 관한 것이다. miRNA는 전형적으로 식물, 동물 및 일부 바이러스에서 발견되며 식물 및 동물의 진핵세포 DNA 및 바이러스 DNA에 의해 (이의 게놈이 DNA를 기반으로 하는 바이러스에서) 각각 암호화된다. miRNA는 표적 메신저 RNA 전사체 (mRNA)의 상보 서열에 결합하여 전사후 조절인자이고, 이는 일반적으로 번역 억제 또는 표적 분해 및 유전자 사일런싱을 야기한다.
miRNA는 당업자에게 공지된 다수의 기술을 사용하여 수득할 수 있다. 예를 들어, 안티센스 RNA는 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 (예를 들어, Applied Biological Materials Inc.에 의해 판매되는 miRNA cDNA 합성 키트와 같이 시판되는 키트를 사용함으로써) 화학적으로 합성되거나 재조합적으로 생산될 수 있다. 바람직하게는, 안티센스 RNA는 임의의 적합한 프로모터를 사용하여 원형 또는 선형 재조합 DNA 플라스미드로부터 전사된다. RNA의 2차 구조를 예측하기 위한 기술은 예를 들어 문헌[Sato et al. (Nucleic Acids Res. 37(2009):W277-W280)], 문헌[Hamada et al. (Nucleic Acids Res. 39(2011):W100-W106 2011)], 및 문헌[Reuter and Mathews (BMC Bioinformatics 11(2010):129)]에 기재되어 있는 것이다.
용어 "뉴클레오사이드"는 인산기가 없는 뉴클레오타이드로 간주될 수 있는 화합물에 관한 것이다. 뉴클레오사이드는 당(예컨대 리보스 또는 데옥시리보스)에 연결된 핵염기인 반면, 뉴클레오타이드는 뉴클레오사이드 및 하나 이상의 인산기로 구성된다. 뉴클레오사이드의 예로는 시티딘, 우리딘, 아데노신, 및 구아노신이 포함된다.
핵산을 구성하는 5개의 표준 뉴클레오사이드는 우리딘, 아데노신, 티미딘, 시티딘 및 구아노신이다. 5개의 뉴클레오사이드는 일반적으로 각각 하나의 문자 코드 U, A, T, C 및 G로 축약된다. 그러나, 티미딘은 우리딘에서 발견되는 리보푸라노오스 고리 대신에 2'-데옥시리보푸라노오스 부분을 포함하고 있기 때문에 보다 일반적으로는 "dT"("d"는 "데옥시"를 나타낸다)로 쓰여진다. 이는 티미딘이 리보핵산 (RNA)이 아닌 데옥시리보핵산 (DNA)에서 발견되기 때문이다. 반대로, 우리딘은 DNA가 아니 RNA에서 발견된다. 나머지 3개의 뉴클레오사이드는 RNA와 DNA 모두에서 발견될 수 있다. RNA에서는 A, C, G로 표시되지만 DNA에서는 dA, dC 및 dG로 표시된다.
RNA (바람직하게는 ssRNA, 예컨대 mRNA)의 "안정성"이라는 용어는 RNA의 "반감기"와 관련이 있다. "반감기"는 분자의 활성, 양 또는 수의 절반을 제거하는 데 필요한 시간에 관한 것이다. 본 발명과 관련하여, RNA (바람직하게는 ssRNA, 예컨대 mRNA 또는 억제성 ssRNA)의 반감기는 상기 RNA의 안정성을 나타낸다.
물론, 본 발명에 따른 RNA (바람직하게는 ssRNA, 예컨대 mRNA 또는 억제성 ssRNA)의 안정성을 감소시키킬 원한다면, RNA (바람직하게는 ssRNA 예컨대 mRNA 또는 억제성 ssRNA)를 변형시켜 상술한 바와 같이 RNA (바람직하게는 ssRNA 예컨대 mRNA 또는 억제성 ssRNA)의 안정성을 증가시키는 요소의 기능을 억제하는 것이 가능하다.
일 실시형태에서, 본 발명에 따른 ssRNA는 펩타이드 또는 단백질을 코딩하는 (변형된) ssRNA, 특히 (변형된) mRNA이다. 본 발명에 따르면, 용어 "펩타이드 또는 단백질을 코딩하는 ssRNA"는 ssRNA가 적절한 환경, 바람직하게는 세포 내에 존재하는 경우에 번역 과정 중에 펩타이드 또는 단백질을 생산, 즉 발현시키기 위해 아미노산의 조립을 지시할 수 있음을 의미한다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 ssRNA (예컨대 mRNA)는 펩타이드 또는 단백질의 번역을 허용하는 세포 번역 기구와 상호작용할 수 있다.
용어 "발현"은 가장 일반적인 의미로 본 발명에 사용되며, 예를 들어 전사 및/또는 번역에 의한 RNA 및/또는 펩타이드 또는 단백질의 생산을 포함한다. RNA와 관련하여, 용어 "발현" 또는 "번역"은 특히 펩타이드 또는 단백질의 생산과 관련이 있다. 그것은 또한 핵산의 일부 발현을 포함한다. 또한, 발현은 일시적이거나 안정적일 수 있다.
본 발명과 관련하여, 용어 "전사"는 DNA 서열 내의 유전적 코드를 RNA로 전사하는 과정에 관한 것이다. 이어서, RNA는 단백질로 번역될 수 있다. 본 발명에 따르면, 용어 "전사"는 "시험관내 전사"를 포함하며, 여기서 "시험관내 전사"라는 용어는 RNA, 특히 ssRNA 예컨대 mRNA가 무세포 시스템에서, 바람직하게는 적절한 세포 추출물을 사용하여 시험관내 합성되는 과정에 관한 것이다. 바람직하게는, 클로닝 벡터(cloning vector)는 전사체의 생성을 위해 적용된다. 이러한 클로닝 벡터는 일반적으로 전사 벡터로 명시되며, 본 발명에 따르면 용어 "벡터"에 포함된다. 본 발명에 따르면, RNA 제제는 시험관내 전사, 특히 적절한 DNA 주형의 시험관내 전사에 의해 생성된 ssRNA를 포함한다. 전사를 제어하기 위한 프로모터는 임의의 RNA 중합효소에 대한 임의의 프로모터일 수 있다. RNA 중합효소의 특정 예로서는 T7, T3, 및 SP6 RNA 중합효소를 들 수 있다. 바람직하게는, 시험관내 전사는 T7, T3, 또는 SP6 프로모터에 의해 조절된다. 시험관내 전사를 위한 DNA 주형은 핵산, 특히 cDNA의 클로닝에 의해 수득되고, 시험관내 전사를 위한 적절한 벡터 내로 도입함으로써 수득할 수 있다. cDNA는 RNA의 역전사에 의해 수득될 수 있다.
cDNA 주형을 포함하는 벡터는 전사 후에 상이한 펩타이드 또는 단백질를 선택적으로 발현할 수 있는 상이한 RNA 분자 집단을 야기할 수 있는 상이한 cDNA 삽입물을 보유하는 벡터를 포함할 수 있거나, 전사 후에 오직 하나의 펩타이드 또는 단백질를 발현할 수 있는 하나의 RNA종 집단만을 야기할 수 있는 오직 한 종의 cDNA 삽입물을 보유하는 벡터를 포함할 수 있다. 따라서, 단일 펩타이드 또는 단백질만을 발현시킬 수 있는 RNA를 생산하거나, 둘 이상의 펩타이드 또는 단백질, 예를 들어 펩타이드 또는 단백질의 조성물을 발현할 수 있는 RNA 라이브러리 및 전체 세포 RNA와 같은 상이한 RNA의 조성물을 생산하는 것이 가능하다. 본 발명은 세포 내로 이러한 모든 RNA의 도입을 고려한 것이다.
본 발명에 따른 용어 "번역"은 mRNA의 가닥이 아미노산 서열의 조립을 지시하여 펩타이드 또는 단백질을 제조하는 세포의 리보솜에서의 공정에 관한 것이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "펩타이드"는 올리고- 및 폴리펩타이드를 포함하고, 펩타이드 결합에 의해 공유결합된 2 이상, 바람직하게는 3 이상, 바람직하게는 4 이상, 바람직하게는 6 이상, 바람직하게는 8 이상, 바람직하게는 10 이상, 바람직하게는 13 이상, 바람직하게는 16 이상, 바람직하게는 21 이상 및 바람직하게는 8, 10, 20, 30, 40 또는 50 이하, 특히 100개의 아미노산을 포함하는 물질을 지칭한다. 용어 "단백질"은 우선적으로 큰 펩타이드, 바람직하게는 100개 초과하는 아미노산 잔기를 갖는 펩타이드를 지칭하지만, 일반적으로 "펩타이드" 및 "단백질"이라는 용어는 동의어이며 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다.
본 발명에 따르면, ssRNA 예컨대 mRNA는 펩타이드 또는 단백질을 코딩할 수 있다. 따라서, ssRNA는 펩타이드 또는 단백질을 암호화하는 코딩 영역 (오픈 리딩 프레임 (ORF))을 포함할 수 있다. 예를 들어, ssRNA는 항원 또는 약학적 활성 펩타이드 또는 단백질 예컨대 면역학적으로 활성인 화합물 (바람직하게는 항원이 아닌 것)을 코딩 및 발현할 수 있다. 이와 관련하여, "오픈 리딩 프레임" 또는 "ORF"는 개시코돈으로 시작하여 종료 코돈으로 끝나는 코돈의 연속적인 스트레치이다.
용어 "약학적 활성 펩타이드 또는 단백질"은 펩타이드 또는 단백질의 발현이 예를 들어 질환 또는 장애의 증상을 개선시키는데 유익할 수 있는 대상체의 치료에 사용될 수 있는 펩타이드 또는 단백질을 포함한다. 예를 들어, 약학적 활성 단백질은 단백질을 정상적으로 발현시키지 않거나 단백질을 잘못 발현하는 세포에서 단백질 발현을 대체하거나 증대시킬 수 있으며, 예를 들어, 약학적 활성 단백질은 바람직한 단백질을 공급함으로써 돌연변이를 보상할 수 있다. 또한, "약학적 활성 펩타이드 또는 단백질"은 대상체에게 유익한 결과를 생성할 수 있으며, 예를 들어 감염성 질환에 대해 대상체에게 백신접종하는 단백질을 생산하는데 사용될 수 있다. 바람직하게는, "약학적 활성 펩타이드 또는 단백질"은 대상체에게 치료적 유효량으로 투여될 때 대상체의 상태 또는 질병 상태에 대해 긍정적이거나 유리한 효과를 갖는다. 바람직하게는, 약학적 활성 펩타이드 또는 단백질은 치유적 또는 완화된 성질을 가지며, 하나 이상의 질병 또는 장애 증상의 발병을 개선, 완화, 경감, 역전, 지연하거나 중증도를 줄이기 위해 투여될 수 있다. 약학적 활성 펩타이드 또는 단백질은 예방적 특성을 가질 수 있으며, 질병의 발병을 지연시키거나 그러한 질병 또는 병리학적 상태의 중증도를 줄이기 위해 사용될 수 있다. 용어 "약학적 활성 펩타이드 또는 단백질"은 전체 단백질 또는 폴리펩타이드를 포함하며, 그의 약학적 활성 단편을 지칭할 수도 있다. 또한 펩타이드 또는 단백질의 약학적 활성 유사체를 포함할 수 있다. "약학적 활성 펩타이드 또는 단백질"이라는 용어는 항원인 펩타이드 및 단백질을 포함하고, 즉, 펩타이드 또는 단백질은 치료적으로 또는 부분적으로 또는 완전히 보호할 수 있는 대상체에서 면역 반응을 유도한다.
약학적 활성 단백질의 예로서는 사이토카인 및 면역계 단백질 예컨대 면역학적 활성 화합물 (예를 들어, 인터루킨, 콜로니 자극 인자 (CSF), 과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF), 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF), 에리스로포이에틴, 종양괴사인자 (TNF), 인터페론, 인테그린, 주소단백질(addressins), 셀레틴(seletin), 귀소수용체, T 세포 수용체, 면역글로불린, 수용성 주요조직 적합유전자 복합체 항원, 면역학적 활성 항원 예컨대 세균 항원, 기생충 항원, 또는 바이러스 항원, 알러젠, 자가항원, 항체), 호르몬 (인슐린, 갑상선 호르몬, 카테콜라민, 생식선 자극 호르몬, 영양 호르몬(trophic hormones), 프로락틴, 옥시토신, 도파민, 소 소마토트로핀(bovine somatotropin), 및 렙틴 등), 성장 호르몬 (예를 들어, 인간 성장 호르몬), 성장 인자 (예를 들어, 표피생장인자, 신경성장인자, 및 인슐린-유사 성장인자 등), 성장 인자 수용체, 효소 (조직 플라스미노겐 활성제, 스트렙토키나제, 콜레스테롤 생합성 또는 분해성, 스테로이드 생성 효소, 키나아제, 포스포디에스테라아제, 메틸화효소, 디메틸화효소, 탈수소효소, 셀룰라아제, 프로테아제, 리파아제, 포스포리파제, 아로마타제, 시토크롬, 아데닐레이트 또는 구아닐고리화효소 및 뉴라미데이즈 등), 수용체 (스테로이드 호르몬 수용체, 펩티드 수용체), 결합 단백질 (성장 호르몬 또는 성장 인자 결합 단백질 등), 전사 및 번역 인자, 종양 성장 억제 단백질 (예를 들어, 혈관생성을 억제하는 단백질), 구조 단백질 (예컨대 콜라겐, 피브로인, 피브리노겐, 엘라스틴, 튜불린, 액틴 및 미오신), 혈액 단백질 (트롬빈, 혈청 알부민, 인자 VII, 인자 VIII, 인슐린, 인자 IX, 인자 X, 조직 플라스미노겐 활성제, 단백질 C, 폰빌레브란트 인자(von Wilebrand factor), 항트롬빈 III, 글루코세레브로시다아제, 에리스로포이에틴 과립구 콜로니 자극 인자 (GCSF) 또는 변형된 인자 VIII, 항응고제 등)를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
일 실시형태에서, 약학적 활성 단백질은 림프계 항상성의 조절에 관여하는 사이토킨, 바람직하게는 T 세포의 발달, 초회항원자극(priming), 팽창, 분화 및/또는 생존에 관여하고 바람직하게는 이를 유도 및/또는 증가시키는 사이토카인이다. 일 실시형태에서, 사이토킨은 인터루킨이다. 일 실시형태에서, 약학적 활성 단백질은 IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, 및 IL-21로 이루어진 군으로부터 선택된 인터루킨이다.
"면역학적 활성 화합물"이라는 용어는 바람직하게는 면역 세포의 성숙을 유도 및/또는 억제하고, 사이토카인 생합성을 유도 및/또는 억제하고, 및/또는 B 세포에 의한 항체 생산을 자극함으로써 체액성 면역을 변화시킴으로써 면역 반응을 변화시키는 임의의 화합물에 관한 것이다. 면역학적 활성 화합물은 항 바이러스 및 항암 활성을 포함하지만 이에 제한되지 않는 강력한 면역 자극 활성을 보유하고, 예를 들어 면역 반응을 TH2 면역 반응으로부터 멀리 이동시키는 것과 같은 면역 반응의 다른 양상을 하향 조절할 수 있으며, 이는 광범위한 TH2 매개성 질병 치료에 유용하다. 면역학적 활성 화합물은 백신 보조제로서 유용할 수 있다.
일 실시형태에서, 특히 항원 (질병-관련 항원)을 포함 또는 발현하는 질병을 갖는 포유류를 치료하길 목적하는 경우, 항원 예컨대 질병-관련 항원에 대해 코딩하는 ssRNA (예컨대 mRNA)를 포유류에 투여한다. ssRNA는 바람직하게는 포유류의 항원-제시 세포 (단핵구, 대식세포, 수지상세포 또는 다른 세포) 내에 흡수되는 것이다. ssRNA의 항원성 번역 산물이 형성되고, 그 산물은 T 세포에 의한 인지를 위해 세포 표면 상에 표시된다. 일 실시형태에서, 항원 또는 이의 임의 공정에 의해 생성된 생성물은 T 세포 수용체를 통한 T 세포에 의한 인지를 위해 MHC 분자와 관련하여 세포 표면 상에 표시되어 이들의 활성을 유도한다.
인터페론은 항 바이러스, 항 증식 및 면역 조절 작용을 특징으로 하는 중요한 사이토카인이다. 인터페론은 조절된 세포 표면의 인터페론 수용체에 결합함으로써 세포 내의 유전자 전사를 변경 및 조절하여 세포 내에서의 바이러스 복제를 방지하는 단백질이다. 인터페론은 두 가지 유형으로 분류할 수 있다. IFN-감마는 유일한 II형 인터페론이고; 다른 모든 것들은 I형 인터페론이다. I형 및 II형 인터페론은 유전자 구조 (II형 인터페론 유전자는 3개의 엑손을 가지고; I형은 1개의 엑손을 갖는다), 염색체 위치 (인간에서, II형 인터페론 유전자는 염색체-12 상에 위치하고; I형 인터페론 유전자는 연결되어 염색체-9 상에 위치한다), 및 이들이 생산되는 조직의 유형 (I형 인터페론은 편재하여 합성되고, II형 인터페론은 림프구에 의해 합성된다)이 다르다. I형 인터페론은 세포성 수용체에 대해 각각의 다른 결합을 경쟁적으로 억제하는 반면, II형 인터페론은 별개의 수용체를 가지고 있다. 본 발명에 따르면, 용어 "인터페론" 또는 "IFN"은 바람직하게는 I형 인터페론, 특히 IFN-알파 및 IFN-베타에 관한 것이다.
일 실시형태에서, RNA, 특히 세포에서 발현될 RNA는 단일가닥 자가-복제 RNA이다. 일 실시형태에서, 자가-복제 RNA는 양성 센스의 단일가닥 RNA이다. 일 실시형태에서, 자가-복제 RNA는 바이러스 RNA 또는 바이러스 RNA로부터 유도된 RNA이다. 일 실시형태에서, 자가-복제 RNA는 알파바이러스 게놈 RNA이거나 알파바이러스 게놈 RNA로부터 유도된다. 일 실시형태에서, 자가-복제 RNA는 바이러스 유전자 발현 벡터이다. 일 실시형태에서, 바이러스는 Semliki forest 바이러스이다. 일 실시형태에서, 자가-복제 RNA는 하나 이상의 전이유전자를 함유하는데, 일 실시형태에서 RNA가 바이러스 RNA인 경우, 구조 단백질을 코딩하는 바이러스 서열과 같은 바이러스 서열을 부분적으로 또는 완전히 대체할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "RNA 제제"는 상기 명시된 다양한 RNA 유형 (즉, mRNA, tRNA, rRNA, snRNA, ssRNA, dsRNA, 및 억제성 ssRNA (예컨대 안티센스 RNA, siRNA, 또는 miRNA)) 중 적어도 하나를 포함하는 임의의 조성물을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "ssRNA를 포함하는 RNA 제제"는 적어도 ssRNA를 포함하는 임의의 조성물을 지칭한다 (그러나, 상기 조성물은 또한 dsRNA를 포함할 수 있다). 용어 "시험관내 전사에 의해 생성된 ssRNA를 포함하는 RNA 제제"는 적어도 ssRNA를 포함하는 임의의 조성물을 지칭하며, 여기서 상기 ssRNA는 시험관내 전사에 의해 생성된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "시험관내 전사" 또는 "IVT"는 전사 (즉, RNA의 생성)가 무세포 방식으로 수행됨을 의미한다. 즉, IVT는 살아있거나/배양된 세포를 사용하지 않고 세포에서 추출한 전사 기구 (예를 들어, 세포 용해물 또는 RNA 중합효소 (바람직하게는 T7, T3 또는 SP6 중합효소)를 포함하는 이의 분리된 성분)를 사용한다.
본원에 사용된 바와 같은 "임의의" 또는 "선택적으로"라는 용어는 추후에 기술된 사건, 상황 또는 조건이 발생할 수도 있거나 발생하지 않을 수도 있음을 의미하며, 본 명세서는 상기 사건, 상황 또는 조건이 발생하는 경우 및 발생하지 않는 경우를 포함한다.
"이성질체"는 동일한 분자식을 갖지만 구조 ("구조이성질체") 또는 기능기 및/또는 원자 ("입체이성질체")의 기하학적 배치가 다른 화합물이다. "거울상이성질체"는 서로 겹치지 않는 거울상인 한 쌍의 입체이성질체이다. "라세미 혼합물" 또는 "라세미체"는 동일한 양의 거울상이성질체 쌍을 포함하며 접두사 (±)로 표시된다. "부분입체이성질체"는 서로 중첩되지 않는 거울상인 입체이성질체이다. "호변이성질체"는 순수 물질만 있는 경우에도 서로 자연적으로 상호 변환하는 동일한 화학 물질의 구조이성질체이다.
"감소", "저감" 또는 "억제"와 같은 용어는 전체 감소를 야기하는 능력에 관한 것이고, 그 수준을 바람직하게는 5% 이상, 10% 이상, 20% 이상, 보다 바람직하게는 50% 이상, 및 가장 바람직하게는 75% 이상 감소시키는 것이다. 이는 또한 완전히 또는 본질적으로 완전한 감소, 즉 0 또는 본질적으로 0으로의 감소를 포함한다.
"증가", "향상" 또는 "연장"과 같은 용어는 적어도 약 10%, 바람직하게는 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 30%, 바람직하게는 적어도 40%, 바람직하게는 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 100%, 바람직하게는 적어도 200% 및 특히 바람직하게는 적어도 300%까지 증가, 향상, 또는 연장에 관한 것이다. 또한, 이러한 용어는 0 또는 측정 불가 또는 감지 불가한 수준에서 0보다 큰 수준 또는 측정 가능하거나 감지 가능한 수준으로 증가, 향상 또는 연장되는 것과 관련될 수도 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "자연 발생적인"은 대상이 자연계에서 발견될 수 있다는 사실을 의미한다. 예를 들어, 유기체(바이러스를 포함함)에 존재하고 자연성 원천으로부터 분리할 수 있고 인간에 의해 실험실에서 인위적으로 변형된 바 없는 펩티드 또는 핵산은 자연성 발생적이다.
본 발명의 ssRNA는 동위원소로 표지될 수 있고, 즉, ssRNA 중 하나 이상의 원자가 같은 수의 양성자를 가지나 중성자의 수가 다른 상응하는 원자로 대체된다. 예를 들어, 수소 원자는 중수소 원자로 대체될 수 있다. 본 발명의 ssRNA에서 사용될 수 있는 예시적인 동위원소는 중수소, 11C, 13C, 14C, 15N, 18F, 32S, 36Cl, 및 125I를 포함한다. 동위원소 표지된 ssRNA는 시험관내 전사 중에 해당 동위원소 표지된 뉴클레오타이드를 사용하거나 전사 후 해당 동위원소 표지된 뉴클레오타이드를 첨가함으로써 생성될 수 있다.
하나의 양상에서, 본 발명은 본 발명의 ssRNA 및 하나 이상의 제약상 허용 가능한 부형제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 일 실시형태에서, 약학 조성물은 본 발명의 ssRNA, 하나 이상의 제약상 허용 가능한 부형제 및 하나 이상의 추가/보충 활성 화합물을 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 명세서는 상기 명시된 바와 같은 ssRNA 또는 치료에 사용하기 위해 본원에서 명시된 바와 같은 약학 조성물을 제공한다.
예를 들어, 본 발명의 ssRNA 및 약학 조성물은 감염성 질병 (예를 들어, 바이러스, 박테리아, 진균류 또는 다른 유기체들에 의해 야기되는 질병); 유해한 염증(예컨대 면역 장애); 및 암으로 이루어진 군으로부터 선택된 상태, 장애 또는 질병의 치료 (예방적 처치를 포함한다)에 사용될 수 있다.
따라서, 또 다른 양상에서, 본 발명은 (i) 본원에 명시된 바와 같은 상태, 장애 또는 질병, 특히 감염성 질병 (예를 들어, 바이러스, 박테리아, 진균류 또는 다른 미생물에 의해 야기되는 질병); 유해한 염증; 및 암으로 이루어진 군으로부터 선택된 질병을 치료하는 방법에 사용하기 위한 본 발명의 ssRNA (또는 선택적으로 제약상 허용 가능한 부형제와 함께 이러한 ssRNA를 포함하는 약학 조성물); 및 (ii) 본 발명의 ssRNA (또는 선택적으로 제약상 허용 가능한 부형제와 함께 이러한 ssRNA를 포함하는 약학 조성물)의 약학적 유효량을 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 개체를 치료하는 방법을 제공한다. 일 실시형태에서, 개체는 본원에 개시된 하나 이상의 상태, 장애 또는 질병을 앓고 있거나 이에 예민하거나 앓을 위험이 있다. 상태, 장애 또는 질병은 감염성 질환 (예컨대 바이러스, 박테리아, 진균류 또는 다른 미생물에 의해 야기되는 질병); 유해한 염증; 및 암으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 또한, 개체는 바람직하게는 포유류이고, 보다 바람직하게는 인간이다.
암(의학용어: 악성신생물)은 세포 집단이 조절되지 않는 성장 (정상 한계를 넘어서는 분열), 침투 (인접 조직에 대한 침투 및 파괴) 및 때때로 전이 (림프 또는 혈액을 통해 체내의 다른 위치로 전염)를 나타내는 질병의 한 종류이다. 암의 이러한 세가지 악성종양 특성은 양성종양과 차별화 되는데, 양성종양은 자가 제한적이고, 침투하거나 전이되지 않는다. 대부분의 암은 종양, 즉 비정상적인 세포성장으로 형성된 종창 또는 병변 신생종양 세포(neoplastic cells) 또는 종양 세포이라고 한다)을 형성하지만, 일부는 백혈병처럼 이들을 형성하지 않는다. 본 발명에 따른 용어 "암"은 백혈병, 정상피종, 흑색종, 기형종, 림프종, 신경아세포종, 신경교종, 직장암, 자궁내막암, 신장암, 부신암, 갑상선암, 혈액암, 피부암, 뇌의 암, 자궁경부암, 창자암, 간암, 결장암, 위암, 창자암, 두경부암, 위장암, 림프절암, 식도암, 결장암, 췌장암, 이비인후 (ENT) 암, 유방암, 전립선암, 자궁의 암, 난소암 및 폐암 및 이의 전이를 포함한다. 이의 예로서는 폐 암종, 유방 암종, 전립선 암종, 결장 암종, 신장 세포 암종, 자궁경부 암종, 또는 상기한 암 종류 또는 종양의 전이를 들 수 있다. 본 발명에 따른 용어 암은 또한 암 전이를 포함한다.
본 발명의 ssRNA 및 약학 조성물로 치료 가능한 암의 예로서는 악성종양 흑색종, 모든 종류의 암종 (결장, 신장 세포, 방광, 전립선, 비소세포성 및 소세포성 폐 암종 등), 림프종, 육종, 아세포종, 신경교종 등이 포함된다.
악성 흑색 종은 심각한 유형의 피부암이다. 이것은 멜라닌세포라고 불리는 색소 세포의 제어되지 않는 성장 때문이다.
본 발명에 따르면, "암종"은 상피 세포로부터 유래된 악성종양이다. 이 집단은 일반적인 형태의 유방암, 전립선암, 폐암 및 결장암을 포함하는 가장 흔한 암을 나타낸다.
림프종 및 백혈병은 조혈 (혈액-형성) 세포에서 유래된 악성종양이다.
육종은 배아중배엽에서 발생하는 수많은 조직 중 하나에서 형질전환된 세포에서 발생하는 암이다. 따라서, 육종은 뼈, 연골, 지방, 근육, 혈관 및 조혈 조직의 종양을 포함한다.
아구성 종양 또는 아세포종은 미숙 또는 배아 조직과 유사한 종양 (일반적으로 악성종양)이다. 이 종양 중 많은 수가 어린이에게 가장 흔한다.
신경교종은 뇌 또는 척추에서 시작되는 종양의 종류이다. 이는 신경아교세포에서 발생하기 때문에 신경교종이라고 한다. 신경교종의 가장 흔한 부위는 뇌이다.
"전이"란 암세포가 원래 위치에서 다른 신체 부위로 전파되는 것을 의미한다. 전이의 형성은 매우 복잡한 과정이며, 원발성 종양에서 악성 세포가 분리되고 세포외 기질이 침투하며 내피 기저막이 침투하여 체강과 혈관에 들어간 다음 혈액에 의해 운반된 후, 표적 기관의 침윤에 의한 것이다. 최종적으로, 새로운 종양, 즉 2 차종양 또는 전이성 종양이 표적 부위에서 성장하는 것은 혈관 신생에 의한 것이다. 종종 종양 세포 또는 성분이 전이 잠재성을 유지 및 발전시킬 수 있기 때문에 종양 전이가 원발 종양 제거 후에도 발생한다. 일 실시형태에서, 본 발명에 따른 용어 "전이"는 원발성 종양 및 국소 림프절 시스템으로부터 이격된 전이에 관련된 "원격 전이"에 관한 것이다.
면역 장애의 예로서는 자가면역 질병 (예를 들어, 진성 당뇨병, 관절염 (류마티스 관절염, 소아 류마티스 관절염, 골관절염 및 건선성 관절염을 포함한다), 다발성 경화증, 뇌척수염, 중증근무력증, 전신성 홍반성 낭창, 자가면역성 갑상선염, 피부염 (아토피 피부염 및 습진성 피부염을 포함한다), 건선, 쇼그렌 증후군, 크론병, 아프타성 궤양, 홍채염, 결막염, 각결막염, 궤양성 대장염, 천식, 알레르기 천식, 패혈증 및 패혈성 쇼크, 염증성 장질환, 전신홍반루푸스, 피부경화증, 질염, 직장염, 약물발진, 나병 역전반응, 나성결절홍반, 자가면역성 포도막염, 알레르기 뇌척수염, 급성괴사출혈뇌병, 특발성 양측 진행성 감음 신경성 청력 손실, 재생불량성 빈혈, 순적혈구 빈혈, 특발성 혈소판 감소증, 다발연골염, 베게너 육아종증, 만성활동간염, 스티븐스-존슨 증후군, 사구체 신염, 특발성 스프루, 편평태선, 그레이브스 질병, 사르코이드증, 원발성 담즙성 경변증, 후포도막염, 및 간질섬유증), 이식편대숙주병, 장기이식 사례, 및 알레르기 예컨대, 아토피 알레르기를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
바이러스의 예로서는 인간 면역결핍 바이러스 (HIV), Epstein-Barr 바이러스 (EBV), 거대세포바이러스 (CMV) (예를 들어, CMV5), 인간 허피스바이러스 (HHV) (예를 들어, HHV6, 7 또는 8), 단순성 포진 바이러스 (HSV), 소 허피스 바이러스 (BHV) (예를 들어, BHV4), 말 허피스 바이러스 (EHV) (예를 들어, EHV2), 인간 T-세포 백혈병 바이러스 (HTLV)5, 수두-대상포진 바이러스 (VZV), 홍역 바이러스, 파보바바이러스 (JC 및 BK), 간염 바이러스 (예를 들어, HBV 또는 HCV), 점액종 바이러스, 아데노바이러스, 파보바이러스, 폴리오마 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 파필로마바이러스 및 폭스바이러스 예컨대 백시니아바이러스, 및 전염성 연속증 바이러스 (MCV), 및 리사바이러스를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 바이러스는 세포예정사 억제제를 발현할 수 있거나 발현하지 않을 수 있다. 바이러스 감염에 의한 질병의 예로서는 수두, 거대세포바이러스 감염, 음부 허피스, B 및 C형 간염, 인플루엔자, 및 대상포진, 및 광견병을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
박테리아의 예로서는 Campylobacter jejuni, 엔테로박터 종, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Escherichia coli (예를 들어, F. coli O157:H7), A군 용혈연쇄구균, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, listeria, Mycobacterium tuberculosis, Pseudomonas aeruginosa, S. pneumoniae, Salmonella, Shigella, Staphylococcus aureus, 및 Staphylococcus epidermidis, 및 Borrelia 및 Rickettsia를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 박테리아 감염에 의한 질병의 예로서는 탄저병, 콜레라, 디프테리아, 식중독, 나병, 뇌수막염, 소화성 궤양질병, 폐렴, 패혈증, 패혈성 쇼크, 매독, 파상풍, 폐결핵, 장티푸스, 및 요로감염, 및 라임병 및 록키산홍반열을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 ssRNA 및 약학 조성물로 치료 가능한 감염성 질병의 특정 예로서는 바이러스 감염성 질병, 예컨대 AIDS (HIV), A, B 또는 C형 간염, 허피스, 대상포진 (수두), 풍진 (풍진 바이러스), 황열병, 뎅기열; 플라비바이러스에 의한 감염성 질병; 인플루엔자; 출혈성 감염 질병 (Marburg 또는 Ebola 바이러스); 박테리아 감염성 질병 (예컨대 레지오넬로시스 질병 (Legionella), 위궤양 (Helicobacter), 콜레라 (Vibrio), E. coli에 의한 감염병, Staphylococci, Salmonella 또는 Streptococci (파상풍); 원생동물 병원균에 의한 감염병 예컨대 말라리아, 수면병, 리슈마니아증, 톡소플라스마증, 즉 Plasmodium, Trypanosoma, Leishmania 및 Toxoplasma에 의한 감염병; 또는 균류 감염병 예를 들어, Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis, Blastomyces dermatitidis 또는 Candida albicans에 의한 감염병을 포함한다.
본 발명의 ssRNA 및 약학 조성물은 단독으로 또는 본 발명의 ssRNA 또는 약학 조성물의 투여 전에, 동시에 또는 후에 투여될 수 있는 하나 이상의 추가/보충 활성 화합물과 함께 조합하여 사용될 수 있다. 이러한 하나 이상의 추가/보충 활성 화합물은 암 환자용 화학요법 약물 (예를 들어 젬시타빈, 에토포포스, 시스-플라틴, 카보-플라틴), 항 바이러스제, 항 기생충제, 항균제, 면역치료제 (예를 들어, 항원 또는 이의 단편 (특히 이의 면역원성 단편)), 및 보조제를 포함하고, 본 발명의 ssRNA와 동시에 투여되는 경우, 본 발명의 약학 조성물에 존재할 수 있다.
특히, 하나 이상의 추가/보충 활성 화합물은 면역치료제, 바람직하게는 표적화된, 즉 특이적인 면역 반응을 유도 또는 수행하는 면역치료제를 포함할 수 있다. 따라서, 일 실시형태에서, 본 발명의 ssRNA 및 약학 조성물은 면역치료제, 바람직하게는 표적화된, 즉 특이적인 면역 반응을 유도 또는 수행하는 면역치료제와 함께 사용될 수 있다. 이러한 면역치료제는 질병-관련 항원에 대항하는 제제 예컨대 치료적 항체 또는 질병-관련 항원 또는 질병-관련 항원을 발현하는 세포에 대한 면역 반응을 유도하는 제제를 포함한다. 유용한 면역치료제는 질병-관련 항원 또는 질병-관련 항원을 발현하는 세포에 대한 B 세포 또는 T 세포 반응을 유도하는 단백질 또는 펩타이드를 포함한다. 이들 단백질 또는 펩타이드는 질병-관련 항원의 서열 또는 이의 하나 이상의 단편과 본질적으로 상응하거나 동일한 서열을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 단백질 또는 펩타이드는 질환 관련 항원으로부터 유래된 MHC 제시 펩타이드의 서열을 포함한다. 단백질 또는 펩타이드를 투여하는 대신에, 단백질 또는 펩타이드를 코딩하는 핵산, 바람직하게는 mRNA를 투여하는 것도 가능하다. 단백질 또는 펩타이드를 코딩하는 RNA는 본 발명의 ssRNA일 수 있다. 또는, 단백질 또는 펩타이드를 코딩하는 RNA는 본 발명에 따르지 않는 다른 RNA일 수 있으며, 이 RNA는 본 발명의 약학 조성물의 투여와 동시에 (RNA가 본 발명의 약학 조성물의 일부를 형성할 수 있는 경우에) 및/또는 이전에 및/또는 이후에 투여될 수 있다. 따라서, 본 발명의 약학 조성물은 항원 또는 이의 단편을 코딩하는 적절한 핵산 분자 (DNA 또는 mRNA)를 대상체에게 도입함으로써 면역 반응이 자극되는 유전자 백신접종에 사용될 수 있다.
일 실시형태에서, 질병-관련 항원은 종양-관련 항원이다. 이 실시형태에서, 본 발명의 ssRNA 및 약학 조성물은 암 또는 암전이를 치료하는데 유용할 수 있다. 바람직하게는, 병든 장기 또는 조직은 병든 세포 예컨대 질병-관련 항원을 발현하고 및/또는 질병-관련 항원과 이의 표면의 결합을 특징으로 하는 암세포를 특징으로 한다. 무손상 또는 실질적인 무손상 종양-관련 항원 또는 이의 단편, 예컨대 MHC 클래스 I 및 클래스 II 펩타이드 또는 핵산, 특히 이러한 항원 또는 단편을 코딩하는 mRNA로의 면역화는 MHC 클래스 I 및/또는 클래스 II 유형 반응을 유도하는 것이 가능하게 하고, 따라서 암세포를 용해시킬 수 있는 CD8+ 독성 T 림프구 및/또는 CD4+ T 세포와 같은 T 세포를 자극한다. 이러한 면역화는 또한 체액성 면역 반응 (B 세포 반응)을 유도하여 종양-관련 항원에 대한 항체를 생산하게 할 수 있다. 또한, 항원 제시 세포 (APC) 예컨대 수지상세포 (DC)는 종양 항원 또는 종양 항원 펩타이드를 시험관내 코딩하는 핵산으로 직접적으로 또는 형질주입함으로써 MHC 클래스 I-제시 펩타이드로 로딩될 수 있고, 환자에게 투여될 수 있다.
본 발명에 따르면, 종양-관련 항원은 바람직하게는 유형 및/또는 발현 수준과 관련된 종양 또는 암뿐만 아니라 종양 또는 암세포에 특유한 임의의 항원을 포함한다. 일 실시형태에서, 용어 "종양-관련 항원"은 정상 상태 하에서, 즉 건강한 대상체에서 제한된 수의 장기 및/또는 조직에서 또는 특정 발달 단계에서 특이적으로 발현되는 단백질에 관한 것이고, 예를 들어, 종양-관련 항원은 정상 상태 하에서, 즉 건강한 대상체에서 위 조직, 바람직하게는 위 점막, 생식 기관, 예를 들어 고환에서, 융모 조직에서, 예를 들어 태반에서, 또는 생식선 세포에서 특이적으로 발현되고, 하나 이상의 종양 또는 암 조직에서 발현되거나 비정상적으로 발현될 수 있다. 이러한 맥락에서 "제한된 수"는 바람직하게는 3 이하, 보다 바람직하게는 2 이하 또는 1을 의미한다. 본 발명의 문맥에서 종양-관련 항원은, 예를 들어 분화 항원, 바람직하게는 세포 유형 특이적 분화 항원, 즉 정상 상태 하에서 특정 분화 단계에서 특정 세포 유형에서 특이적으로 발현되는 단백질, 암/고환 항원, 즉 정상 상태 하에서 고환 및 때로는 태반에서 특이적으로 발현되는 단백질 및 생식선 특이적 항원을 포함한다. 본 발명과 관련하여, 종양-관련 항원은 바람직하게는 암세포의 세포 표면과 결합하고, 바람직하게는 정상 조직에서 발현되지 않거나 거의 발현되지 않는다. 바람직하게는, 종양-관련 항원 또는 종양-관련 항원의 이상 발현은 암세포를 확인하게 한다. 본 발명과 관련하여, 대상체, 예를 들어, 암 질환을 앓고 있는 환자에서 암세포에 의해 발현되는 종양-관련 항원은 바람직하게는 상기 대상체에서의 자가-단백질이다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 문맥에서의 종양-관련 항원은 비필수적인 조직 또는 기관, 즉 면역계에 의해 손상될 때 대상체의 죽음을 초래하지 않는 조직 또는 기관, 또는 면역계에 의해 거의 또는 전혀 접근할 수 없는 신체의 장기 또는 구조에서 정상 조건 하에서 특이적으로 발현된다. 일 실시형태에서, 종양-관련 항원의 아미노산 서열은 정상 조직에서 발현되는 종양-관련 항원과 암 조직에서 발현되는 종양-관련 항원 간에 동일하다. 바람직하게는, 종양-관련 항원은 이것이 발현되는 암세포에 의해 MHC 분자와 관련하여 제시된다.
종양 면역요법, 특히 종양 백신접종에서 본 발명에 의해 고려되는 바와 같이 표적 구조체로서 종양-관련 항원에 대한 기준을 이상적으로 충족시키는 분화 항원의 예로서는 CLDN6 및 CLDN18.2와 같은 클라우딘 계열의 세포 표면 단백질이다. 이러한 분화 항원은 다양한 기원의 종양에서 발현되며, 선택적 발현 (독성 관련 정상 조직에서는 발현되지 않음) 및 원형질막으로의 위치화로 인해 항체 매개성 암 면역 요법과 관련한 표적 구조체로서 특히 적합하다.
본 발명에서 유용할 수 있는 항원의 다른 예로서는 p53, ART-4, BAGE, 베타-카테닌/m, Bcr-abL CAMEL, CAP-1, CASP-8, CDC27/m, CDK4/m, CEA, 클라우딘-12, c-MYC, CT, Cyp-B, DAM, ELF2M, ETV6-AML1, G250, GAGE, GnT-V, Gap100, HAGE, HER-2/neu, HPV-E7, HPV-E6, HAST-2, hTERT (또는 hTRT), LAGE, LDLR/FUT, MAGE-A, 바람직하게는 MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11, 또는 MAGE-A12, MAGE-B, MAGE-C, MART-1/Melan-A, MC1R, Myosin/m, MUC1, MUM-1, -2, -3, NA88-A, NF1, NY-ESO-1, NY-BR-1, p190 마이너 BCR-abL, Pm1/RARa, PRAME, 단백질분해효소 3, PSA, PSM, RAGE, RU1 또는 RU2, SAGE, SART-1 또는 SART-3, SCGB3A2, SCP1, SCP2, SCP3, SSX, SURVIVIN, TEL/AML1, TPI/m, TRP-1, TRP-2, TRP-2/INT2, TPTE 및 WT, 바람직하게는 WT-1을 들 수 있다.
"항원"은 항체의 형성 및/또는 세포성 면역 반응의 활성화를 유발할 수 있는 임의의 구조를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 항원의 예로서는 폴리펩타이드, 단백질, 세포, 세포 추출물, 탄수화물/다당류, 다당류 접합체, 지질, 및 당지질을 들 수 있다. 이들 항원은 종양 항원 또는 바이러스성, 박테리아성, 균류 및 원생동물성 항원 또는 알러젠일 수 있다. 또한, 용어 "항원"은 형질전환을 통해서만 (예를 들어, 분자의 중간에서, 신체 단백질과 함께 완성됨으로써) 항원성이 생기는-민감해지는-2차 물질로서 유도된 항원, 및 새로운 구성 특이성을 나타내는 원자단 (예를 들어, 이소시아네이트류, 다이아조늄염류)의 인공적인 결합을 통해 컨쥬게이션된 항원을 포함한다. 항원은 적절한 담체에 결합된 합텐의 형태의 본 발명에 따른 백신으로 존재할 수 있다. 적합한 담체는 당업자에게 공지되어 있는 것이며, 예를 들어, 인간 혈청 알부민 (HSA), 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함한다. 예를 들어 Lys 잔기에의 아미드 결합을 통해 폴리펩타이드 담체의 경우에, 합텐은 선행 기술에서 잘 공지된 공정에 의해 담체에 결합될 수 있다.
용어 "면역원성"은 대상체 예컨대 인간의 신체에서 면역 반응을 일으키는 특정 물질, 특히 RNA (바람직하게는 ssRNA, 예컨대 mRNA)의 능력을 지칭한다. 즉, 면역원성은 면역 반응을 유도하는 능력이다.
"면역 반응 유도"는 면역 반응을 유도하기 전에 면역 반응이 없었음을 의미할 수도 있지만, 면역 반응을 유도하기 전에 일정 수준의 면역 반응이 있었고 면역 반응을 유도한 후에 면역 반응이 향상되었다는 것을 의미할 수도 있다. 따라서 "면역 반응 유도"에는 "면역 반응 향상"이 포함된다. 바람직하게는, 대상체에서 면역 반응을 유도한 후에, 상기 대상체는 질병 예컨대 암 또는 감염성 질병을 발달시키지는 것으로부터 보호되거나 면역 반응을 유도함으로써 질병 상태를 개선시킨다.
용어 "면역 요법"은 바람직하게는 특이적 면역 반응 및/또는 면역 효과기 기능(들)을 포함하는 치료에 관한 것이다.
용어 "면역화" 또는 "백신접종"은 치료적 또는 예방적 이유로 대상체를 치료하는 과정을 나타낸다.
"대상체", "환자" 또는 "개체"라는 용어는 척추동물과 관련이 있다. 예를 들어, 본 발명의 맥락에서의 척추동물은 포유류, 조류 (예를 들어, 가금류), 파충류, 양서류, 경골어류, 및 연골어류이고, 특히 상기한 것 중 임의의 가축 동물뿐만 아니라 감금된 동물, 예컨대 동물원의 동물을 들 수 있고, 바람직하게는 포유류이다. 본 발명의 맥락에서의 포유류는 인간, 비인간 영장류, 가축화된 포유류, 예컨대 개, 고양이, 양, 소, 염소, 돼지, 말 등, 실험용 동물, 예컨대 마우스, 랫, 토끼, 기니아 피그 등 뿐만 아니라 감금된 포유류, 예컨대 동물원의 포유류를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "대상체"는 또한 인간을 포함한다.
"전달", "형질주입" 또는 "세포 내 도입"과 같은 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용되고 핵산, 특히 외인성 또는 이종성 핵산, 특히 세포 내로의 ssRNA의 도입과 관련된다. 본 발명에 따르면, 세포는 기관, 조직 및/또는 유기체의 일부를 형성할 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 일반적으로 "제약상 허용 가능한 양" 및 "제약상 허용 가능한 제제"로 적용된다. 용어 "제약상 허용 가능한"은 약학 조성물의 활성제(들)의 작용과 상호작용하지 않는 물질의 무독성을 지칭한다.
본 발명에 따르면, 핵산 (예컨대, ssRNA)의 투여는 네이키드 핵산으로서 또는 하나 이상의 제약상 허용 가능한 부형제와 함께 달성된다. 바람직하게는, 핵산의 투여는 네이키드 핵산의 형태이다. 바람직하게는, RNA는 RNase 억제제와 같은 안정화 물질과 함께 투여된다. 본 발명은 또한 연장된 기간 동안 지속된 발현을 허용하기 위해 세포 내로 핵산의 반복 도입을 고려한다.
세포는 ssRNA가 결합될 수 있는 임의의 부형제 (특히 담체)로 형질주입될 수 있는데, 예를 들어, ssRNA와 복합체를 형성하거나 ssRNA가 봉입되거나 캡슐화된 소포를 형성함으로써, 네이키드 ssRNA와 비교하여 ssRNA의 안정성을 증가시킨다 . 본 발명에 따른 유용한 부형제 (특히 담체)는 예를 들어, 지질-함유 담체 예컨대 양이온성 지질, 리포솜, 특히 양이온성 리포솜, 및 미셀, 및 나노입자를 포함한다. 양이온성 지질은 음으로 하전된 핵산과 복합체를 형성할 수 있다. 임의의 양이온성 지질이 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 또한, 세포는 대상체로부터 취할 수 있고, 세포는 본 발명의 ssRNA 또는 약학 조성물로 형질주입될 수 있으며, 형질주입된 세포는 대상체에 삽입될 수 있다.
바람직하게는, 세포, 특히 생체 내에 존재하는 세포 내로, 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 코딩하는 ssRNA의 도입은 세포에서 상기 펩타이드 또는 폴리펩타이드의 발현을 초래한다. 특정 실시형태에서, 특정 세포에 대한 핵산의 표적화가 바람직하다. 이러일 실시형태에서, 핵산을 세포 (예를 들어, 레트로바이러스 또는 리포솜)에 투여하기 위해 적용되는 담체는 표적화 분자를 나타낸다. 예를 들어, 표적 세포 상의 표면 막 단백질에 특이적인 항체 또는 표적 세포상의 수용체에 대한 리간드와 같은 분자는 핵산 담체에 혼입되거나 그에 결합될 수 있다. 핵산이 리포솜에 의해 투여되는 경우, 표적화 및/또는 흡수를 가능하게 하기 위해 내포작용과 관련된 표면 막 단백질에 결합하는 단백질을 리포솜 제제에 혼입시킬 수 있다. 이러한 단백질은 특정 세포 유형에 특이적인 캡시드 단백질 또는 이의 단편, 내재화된 단백질에 대한 항체, 세포 내 위치를 표적으로 하는 단백질 등을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "부형제"는 활성제가 아닌 (예를 들어, 사용된 양/농도에서 임의의 치료 효과를 나타내지 않는 치료학적으로 불활성인 성분이다) 약학 조성물 내의 모든 물질, 예컨대, 바람직하게는 제약상 허용 가능한 모든 것, 예를 들어, 염, 담체, 바인더, 윤활유, 증점제, 표면 활성제, 분산제, 보존제, 유화제, 완충제, 습윤제, 착향료, 착색제, 안정화제 (예컨대 RNase 억제제) 또는 항산화제를 나타내도록 한다.
"제약상 허용 가능한 염"은 예를 들어, 제약상 허용 가능한 산, 예컨대 염산, 황산, 푸마르산, 말레산, 숙신산, 아세트산, 벤조산, 시트르산, 타르타르산, 탄산 또는 인산을 사용하여 형성될 수 있는 산 부가 염류를 포함한다. 또한, 적절한 제약상 허용 가능한 염은 알칼리 금속염 (예를 들어, 나트륨염 또는 칼륨염); 알칼리토금속염 (예를 들어, 칼슘염 또는 마그네슘염); 암모늄 (NH4 +); 및 적절한 유기 리간드로 형성된 염 (예를 들어, 4차 암모늄 및 상대음이온 예컨대 할로겐화물, 수산화물, 카복실산염, 황산염, 인산염, 질산염, 알킬 술폰산염 및 아릴 술폰산염을 사용하여 형성된 아민 양이온)을 포함할 수 있다. 제약상 허용 가능한 염의 예로서는 아세트산염, 아디핀산염, 알긴산염, 아르긴산염, 아스코르브산염, 아스파르트산염, 벤젠술폰산염, 벤조산염, 중탄산염, 중황산염, 중주석산염, 붕산염, 브롬화물, 낙산염, 칼슘 에데트산염, 캄포레이트, 캄포술폰산염, 캄실레이트, 카보네이트, 클로라이드, 시트레이트, 클라불라네이트, 사이클로펜탄프로피오네이트, 디글루코네이트, 디하이드로클로라이드, 도데실황산염, 에데트산염, 에디실레이트, 에스톨레이트, 에실레이트, 에탄술폰산염, 포메이트, 푸마레이트, 갈락테이트, 갈락투로네이트, 글루셉테이트, 글루코펩토네이트, 글루코네이트, 글루타메이트, 글리세로인산염, 글리콜일아사닐레이트(glycolylarsanilate), 헤미술페이트, 헵타노에이트, 헥사노에이트, 헥실레졸시네이트, 하이드랩아민(hydrabamine), 하이드로브롬화물, 하이드로클로라이드, 하이드로아이오다이드, 2-하이드록시-에탄술폰산염, 하이드록시나프토에이트 아이오다이드, 이소낙산염, 이소디오네이트, 락테이트, ㄹ락토비오네이트, 라우레이트, 라우릴 황산염, 말레이트, 말리에이트, 말로네이트, 만델레이트, 메실레이트, 메탄술폰산염, 메틸황산염, 무케이트(mucate), 2-나프탈렌술폰산염, 납실레이트, 니코티네이트, 질산염, N-메틸글루카민 암모늄염, 올레에이트, 옥살레이트, 파모에이트 (엠보네이트), 팔미테이트, 판토테네이트, 펙티네이트, 과황산염, 3-페닐프로피오네이트, 인산염/중인산염, 프탈레이트, 피크레이트, 피발레이트, 폴리갈락투로네이트, 프로피오네이트, 살리실레이트, 스테아레이트, 황산염, 수베레이트, 숙시네이트, 탄네이트, 타르트레이트, 테오클레이트, 토실레이트, 트리에티오디드, 운데카노에이트, 발레에이트 등 (예를 들어, 문헌[S. M. Berge et al., "Pharmaceutical Salts", J. Pharm. Sci., 66, pp. 1-19 (1977)] 참고)을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 제약상 허용 가능하지 않은 염은 제약상 허용 가능한 염을 제조하는데 사용될 수 있으면 본 발명에 포함된다.
본 발명에 따른 조성물은 제약상 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "제약상 허용 가능한 담체"는 생리학적으로 상용성이 있는 임의 용매 및 모든 용매, 분산 배지, 코팅제, 등장화제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. "제약상 허용 가능한 담체"는 고체, 반고체, 액체 또는 이들의 조합물의 형태 일 수 있다.
제약상 허용 가능한 담체는 멸균 수용액 또는 분산액, 멸균 비수용액 또는 분산액 및 멸균 주사 용액 또는 분산제의 즉석 제조용 멸균 분말을 포함한다. 약학 적 활성 약제에 대한 이러한 배지 및 제제의 용도는 당업계에 공지되어 있다. 종래의 임의의 배지 또는 제제가 활성제와 양립 불가능한 경우를 제외하고는, 본 발명의 약학 조성물에서의 이의 사용을 고려할 수 있다. 등장성 완충 생리식염수 (예컨대 링거 또는 링거 락테이트), 에탄올, 폴리올 (예컨대 글리세롤), 폴리 알킬렌 글리콜 (예컨대 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜), 수소화 나프탈렌, 및 특히 생체적합 락티드 중합체 (예컨대 락티드/글리콜라이드 공중합체 또는 폴리옥시에틸렌/폴리옥시-프로필렌 공중합체)를 포함한다.
제약상 허용 가능한 항산화제의 예로는 (1) 물 수용성 항산화제, 예컨대 아스코르브산, 시스테인 하이드로클로라이드, 나트륨 중황산염, 나트륨 메타비설파이트, 나트륨 설파이트 등; (2) 오일-수용성 항산화제, 예컨대 아스코르빌 팔미테이트, 부틸레이트화 하이드록시아니솔 (BHA), 부틸레이트화 하이드록시톨루엔 (BHT), 레시틴, 프로필 갈레이트, 알파-토코페롤, 등; 및 (3) 금속 킬레이트제, 예컨대 시트르산, 에틸렌디아민 테트라아세트산 (EDTA), 솔비톨, 타르타르산, 인산, 등을 포함한다.
본 발명의 약학 조성물에 사용하기에 적합한 완충제는 염 중 아세트산, 염 중 시트르산, 염 중 붕산 및 염 중 인산을 포함한다.
본 발명의 약학 조성물에 사용하기 적합한 보존제는 다양한 항박테리아제 및 항진균제, 예컨대 벤잘코늄 클로라이드, 클로로부탄올, 파라벤, 소르브산, 및 티메로살을 포함한다. 미생물 존재 방지는 또한 멸균 절차 (예를 들어, 멸균 여과, 특히 멸균 미세 여과)에 의해 보장될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 임의의 경로, 바람직하게는 비경구로 개체에게 투여될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "비경구 투여" 및 "비경구로 투여된"이라는 표현은 장관 투여 이외의 투여 방식 (본원에 사용된 바와 같이 "장관 투여" 및 "장관으로 투여된"은 투여된 약물이 위 및/또는 창자에 의해 흡수된 것을 의미한다)을 의미한다. 비경구 투여는 통상적으로 주사 및/또는 주입에 의한 것이며, 제한없이 정맥내, 근육내, 동맥내, 척수강내, 피막내, 골내, 안와내, 심장내, 진피내, 복강내, 경기관, 경피하, 각피하, 관절내, 피막하, 대뇌내, 뇌실내(intracerebroventricular), 지주막하, 척수내, 경막외 흉골내, 및 국소적 투여를 포함한다.
본 발명의 ssRNA 또는 약학 조성물은 당업계에 공지된 다양한 방법으로 투여될 수 있다. 당업자가 알 수 있는 바와 같이, 투여 경로 및/또는 투여 방식은 목적하는 결과에 따라 달라질 것이다.
활성제 (즉, 본 발명의 ssRNA 및 선택적으로 하나 이상의 추가/보충 활성 화합물)는 화합물을 신속 방출로부터 보호할 수 있는 담체, 예를 들어 임플란트, 경피 패치 및 마이크로 캡슐 전달 시스템을 포함하는 제어된 방출 제형으로 제조될 수 있다. 생분해성, 생체적합 중합체로는 예컨대 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오쏘에스터, 및 폴리젖산이 사용될 수 있다. 상기 제형의 제조 방법은 일반적으로 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.]을 참조한다.
특정 투여 경로로 활성제 (즉, 본 발명의 ssRNA 및 선택적으로 하나 이상의 추가/보조 활성 화합물)를 투여하기 위해, 이의 불활성화를 방지하고 및/또는 번역될 활성제 (특히 본 발명의 ssRNA)의 유효성을 증가시키기 위해 물질로 활성제를 코팅하거나, 물질과 화합물을 함께 투여할 필요가 있을 수 있다. 예를 들어, 활성제는 적절한 담체, 예를 들어, 지질-함유 담체 (특히 양이온성 지질), 리포솜 (예컨대 유중-수중-액체 CGF 유액뿐만 아니라 종래의 리포솜 (Strejan et al., J. Neuroimmunol. 7: 27 (1984)), 특히 양이온성 리포솜), 미셀, ssRNA가 봉입되거나 캡슐화된 나노입자, 또는 희석제로 개체에게 투여될 수 있다. 제약상 허용 가능한 희석제는 생리식염수 및 수성 완충 용액을 포함한다.
약학 조성물은 전형적으로 제조 및 저장 상태 하에서 멸균되고 안정해야 한다. 상기 조성물은 용액, 마이크로에멀젼, 리포솜, 또는 고농도 약물에 적합한 다른 규칙격자로 제형화될 수 있다. 담체는 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 적합한 혼합물, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 및 주사 가능한 유기 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트를 함유하는 용매 또는 분산 배지일 수 있다. 예를 들어 레시틴과 같은 코팅 물질을 사용하고, 분산의 경우 필요한 입자 크기를 유지하며 계면활성제를 사용함으로써 적절한 유동성이 유지될 수 있다. 많은 경우, 등장성 제제, 예를 들면 당, 폴리알코올, 예컨대 만니톨, 솔비톨 또는 염화나트륨을 약학 조성물에 포함시키는 것이 바람직할 것이다. 주사 가능한 조성물의 장기 흡수는 조성물에 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어 모노스테아린산염 및 젤라틴을 포함시킴으로써 초래할 수 있다.
일반적으로, 분산은 염기성 분산 배지 및 상기 열거된 것들로부터의 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클에 활성제를 혼입시킴으로써 준비된다. 멸균 주사 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 이전에 멸균 여과된 용액으로부터 추가로 목적하는 임의의 성분을 넣어 활성제의 분말을 생산하는 진공 건조 및 냉동 건조 (동결 건조)이다.
용량 요법은 최적의 목적하는 반응 (예를 들어, 치료 반응)을 제공하도록 조정된다. 예를 들어, 단일 농축괴(bolus)를 투여할 수 있고, 여러번 분할된 용량을 시간이 지남에 따라 투여할 수 있거나, 치료 상황의 긴급성에 의해 지시된 바와 같이 투여량은 비례적으로 감소되거나 증가될 수 있다. 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 단위 투약형으로 약학 조성물을 제형화하는 것이 특히 바람직하다. 본원에 사용된 바와 같은 단위 투약형은 치료될 개체에 대한 일원화된 투여량으로 적합한 물리적으로 분리된 단위를 지칭하고; 각 단위는 요구되는 약학적 담체와 관련하여 목적하는 치료 효과를 내도록 계산된 활성제를 소정의 양 함유한다. 본 발명의 단위 투약형에 대하여, (a) 활성제의 독특한 특성 및 달성될 특정 치료 효과, 및 (b) 개체에서 민감성을 치료하기 위해 이러한 활성제의 배합 기술에 내재된 한계에 의해 상세히 설명되고 직접적으로 영향을 미친다. 약학 조성물 (예를 들어, 단일 투여 형태)을 제조하기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 활성제 (특히, ssRNA의 양)의 양은 치료될 개체 및 투여의 특정 방식에 따라 달라질 것이다. 단일 투여 형태를 제조하기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 활성제의 양은 일반적으로 치료 효과를 생성하는 조성물의 양일 것이다.
일반적으로, 100% (약제학적 제형/조성물의 경우) 중에서, 활성제의 양 (특히, 약제학적 제형/조성물에 존재하는 경우, 선택적으로 하나 이상의 추가/보충 활성 화합물과 함께 본 발명의 ssRNA의 양)은 약 0.01% 내지 약 99%, 바람직하게는 약 0.1% 내지 약 70%, 가장 바람직하게는 약 1% 내지 약 30%의 범위일 것이며, 여기서 나머지는 바람직하게는 하나 이상의 제약상 허용 가능한 부형제로 구성된다.
단위 투약형 및/또는 개체에 투여되거나 치료에 사용되는 경우, 본 발명의 ssRNA와 같은 활성제의 양은 단위, 투여 또는 치료법당 약 0.001 mg 내지 약 1000 mg (예를 들어, 약 0.01 mg 내지 약 500 mg, 약 0.1 mg 내지 약 100 mg 예컨대 약 1 mg 내지 약 50 mg)의 범위일 수 있다. 특정 실시형태에서, 이러한 활성제의 적절한 양은 개체의 질량 또는 신체 표면적을 사용하여 계산될 수 있으며, 약 0.1 mg/kg 내지 10 mg/kg (예컨대 약 0.2 mg/kg 내지 5 mg/kg), 또는 약 0.1 mg/m2 내지 약 400 mg/m2 (예컨대 약 0.3 mg/m2 내지 약 350 mg/m2 또는 약 1 mg/m2 내지 약 200 mg/m2)의 양을 포함한다.
선택된 투여 경로와 상관없이, 적합한 수화된 형태로 사용될 수 있는 활성제 (즉, ssRNA 및 선택적으로 하나 이상의 추가/보충 활성 화합물) 및/또는 본 발명의 약학 조성물은 당해 분야의 숙련자에게 공지된 통상적인 방법에 의해 제약상 허용 가능한 투여 형태로 제형화될 수 있다 (예를 들어, 문헌[Remington, "The Science and Practice of Pharmacy" Allen, Loyd V., Jr.에 의해 편집됨, 22nd edition, Pharmaceutical Sciences, September 2012]; 문헌["Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems", 7th edition, Lippincott Williams & Wilkins Publishers, 1999]을 참조).
본 발명의 약학 조성물 중 활성제의 실제 투여 수준은 환자에게 유독하지만 않다면 특정 환자, 조성물, 및 투여 방식에 대해 목적하는 치료 반응을 달성하는데 효과적인 활성제의 양을 얻기 위해 다양해질 수 있다. 선택된 투여량 수준은 채용될 본 발명의 특정 조성물의 활성도, 투여 경로, 투여시간, 채용될 특정 활성제의 배설 속도, 치료 기간, 다른 약물, 채용된 특정 조성물과 조합하여 사용된 화합물 및/또는 물질, 치료될 환자의 나이, 성별, 체중, 상태, 전반적인 건강 및 이전의 병력, 및 의학 분야에서 잘 공지된 인자들을 포함하는 다양한 약물동태적 인자들에 의해 달라질 수 있다.
당업계의 통상적인 기술을 가진 의사 또는 수의사는 필요한 약학 조성물의 유효량을 용이하게 결정하고 처방할 수 있다. 예를 들어, 의사 또는 수의사는 목적하는 치료 효과를 달성하고 목적하는 효과가 달성될 때까지 점차 복용량을 증가시키기 위해 요구되는 수준보다 낮은 수준의 투여량으로 약학 조성물에 사용된 활성제의 투여를 시작할 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 약학 조성물의 적합한 일일 투여량은 치료 효과를 생성시키는데 효과적인 가장 최소 투여량인 활성제의 양일 것이다. 이러한 유효 용량은 일반적으로 상기 설명된 인자들에 따라 다를 것이다. 투여는 비경구, 예컨대 정맥내, 근육내, 복강내, 또는 경피하에 하는 것이 바람직하며, 바람직하게는 표적의 부위 근방에 투여된다. 투여는 또한 종양내일 수 있다. 목적하는 바가 있다면, 약학 조성물의 유효 일일 투여량은 하루 동안 적절한 간격으로, 선택적으로 단위 투약형으로 개별적으로 투여되는 2, 3, 4, 5, 6회 이상의 분할 용량으로 투여될 수 있다. 본 발명의 활성제 (특히 ssRNA)를 단독으로 투여하는 것이 가능하지만, 약제학적 제형/조성물로서 활성제를 투여하는 것이 바람직하다.
일 실시형태에서, 본 발명의 ssRNA 또는 약학 조성물은 유독한 부작용을 감소시키기 위해, 주입에 의해 투여되는데, 바람직하게는 24시간 초과와 같은 긴 기간에 걸쳐 느린 연속 주입에 의해 투여될 수 있다. 투여는 또한 2 내지 24시간, 예컨대 2 내지 12시간의 기간 동안 연속 주입에 의해 수행될 수 있다. 이러한 처방은 필요에 따라 예를 들어 6 개월 또는 12 개월 후에 1회 이상 반복될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 주사, 예를 들어, 농축괴 주사 또는 연속 주입에 의한 비경구 투여를 위해 제형화될 수 있다. 주사용 제형은 단위 투약형 (예를 들어, 작은 유리병에, 다중 투약 용기에)에 제공되고, 첨가된 방부제와 함께 제공될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 유성 또는 수성 비히클에 현탁액, 용액 또는 에멀전과 같은 형태를 취할 수 있고, 현탁제, 안정화제 또는 분산제와 같은 제형화제를 함유할 수 있다. 또는, 약제는 사용 전에 적절한 비히클 (예컨대 멸균성 무발열인자 물)로 구성하기 위한 분말 형태일 수 있다. 전형적으로, 정맥내 투여용 약학 조성물은 멸균 등장성 수성 완충액 중의 용액으로 이루어진다. 필요한 경우, 약학 조성물은 또한 주입 부위에서 고통을 완화시키기 위해 가용화제 및 국소 마취제 예컨대 리그노케인을 포함할 수 있다. 일반적으로, 성분은 별도로 공급되거나, 활성제의 양을 나타내는 앰플 또는 사셋과 같은 밀폐 포장된 용기에서 건식형 동결건조 분말 또는 무수 농축물과 같은 단위 투약형으로 함께 혼합되어 공급된다. 약학 조성물이 주입에 의해 투여되는 경우, 약제학적 등급의 멸균수 또는 생리식염수가 포함된 주입병으로 조제될 수 있다. 조성물을 주사로 투여하는 경우, 투여 전에 성분을 혼합할 수 있도록 주사용 멸균수 또는 생리식염수의 앰플을 제공할 수 있다.
약학 조성물은 당업계에 공지된 의료 장치로 투여될 수 있다. 예를 들어, 바람직한 일 실시형태에서, 본 발명의 약학 조성물은 무바늘 피하 주사 장치, 예컨대 미국 특허 제5,399,163호; 미국 특허 제5,383,851호; 미국 특허 제5,312,335호; 미국 특허 제5,064,413호; 미국 특허 제4,941,880호; 미국 특허 제4,790,824호; 또는 미국 특허 제4,596,556호에 개시된 장치로 투여될 수 있다. 공지된 임플란트 및 본 발명에서 유용한 모듈의 예로서는 제어된 속도로 약물을 분배하기 위한 이식 가능한 마이크로-주입 펌프를 개시하는 미국 특허 제4,487,603호; 피부를 통해 약물을 투여하기 위한 치료용 장치를 개시하는 미국 특허 제4,486,194호; 정확한 주입 속도로 약물을 전달하기 위한 약물 주입 펌프를 개시하는 미국 특허 제4,447,233호; 연속 약물 전달을 위한 가변 유동 임플란트 주입 장치를 개시하는 미국 특허 제4,447,224호; 다중 챔버 구획을 갖는 삼투성 약물 전달 시스템을 개시하는 미국 특허 제4,439,196호; 및 삼투성 약물 전달 시스템을 개시하는 미국 특허 제4,475,196호에 개시되어 있는 것을 포함한다.
이러한 다양한 다른 임플란트, 전달 시스템 및 모듈은 당업자에게 공지되어있는 것이다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 ssRNA 또는 약학 조성물은 생체내에서의 적절한 분포를 보장하도록 제형화될 수 있다. 예를 들어, 혈액-뇌 장벽 (BBB)은 많은 고도의 친수성 화합물을 배제시킨다. 본 발명의 ssRNA 또는 약학 조성물이 BBB를 가로지르는 것을 보장하기 위해 (목적한다면), 이들은 예를 들어 리포솜 내에서 제형화될 수 있다. 리포솜을 제조하는 방법에 대해서는, 예를 들어, 미국 특허 제4,522,811호; 미국 특허 제5,374,548호; 및 미국 특허 제5,399,331호를 참조한다. 리포솜은 특정 세포 또는 장기로 선택적으로 수송되는 하나 이상의 부분을 포함할 수 있으며, 따라서 표적 약물 전달을 향상시킬 수 있다 (예를 들어, 문헌[V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29: 685] 참조). 예시적인 표적 부분은 엽산 또는 비오틴 (예를 들어, Low 등의 미국 특허 제5,416,016호 참조); 만노 시드 (문헌[Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153: 1038]); 항체 (문헌 [P.G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357: 140]: 문헌[M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39: 180]); 및 계면 활성제 단백질 A 수용체 (문헌[Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233: 134])를 포함한다.
본 발명의 일 실시형태에서, 본 발명의 ssRNA는 리포솜에 제형화된다. 보다 바람직한 일 실시형태에서, 리포솜은 표적 부분을 포함한다. 가장 바람직한 일 실시형태에서, 리포솜 내의 ssRNA는 목적하는 영역에 인접한 부위에 농축괴 주사에 의해 전달된다. 이러한 리포솜-기반 조성물은 주사 용이성이 존재할 정도로 유동적이어야 하고, 제조 및 보관 조건 하에서 안정해야 하며 박테리아 및 진균류과 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다.
치료를 위한 "유효 치료 투여량"은 완전하거나 부분적인 객관적 반응에 의해 측정될 수 있다. 완전 반응 (complete response, CR)은 상태, 장애 또는 질병의 임상적, 방사선학적 또는 기타 증거가 없는 것으로 정의된다. 부분 반응 (partial response, PR)은 50%가 넘는 질병 감소로 인한 것이다. 진행의 평균 시간은 객관적 반응의 내구성을 특징으로 하는 척도이다.
치료를 위한 "유효 치료 투여량"은 또한 예를 들어, 적절한 동물 모델 시스템 및/또는 당업자에게 공지된 시험관내 분석을 사용함으로써 상태, 질환 또는 질병의 진행을 안정화시키는 이의 능력에 의해 측정될 수 있다. 활성제의 치료적 유효량은 단독으로 또는 추가 투여량과 함께 목적하는 반응 또는 목적하는 효과를 달성하는 양을 지칭한다. 특정 질환 또는 특정 상태의 치료의 경우에, 목적하는 반응은 바람직하게는 질환의 경과의 억제에 관한 것이다. 이것은 질병의 진행을 늦추고, 특히 질병의 진행을 방해하거나 역전시키는 것을 포함한다. 질병 또는 상태의 치료에서 목적하는 반응은 또한 상기 질병 또는 상기 증상의 발병 지연 또는 발병 예방일 수 있다. 따라서, 활성제의 치료적 유효량은 개체에서의 상태, 장애 또는 질병 또는 상태, 장애 또는 질병의 증상 또는 상태, 장애 또는 질병에 대한 소인을 치료, 치유, 경감, 완화, 변경, 해결, 개선, 향상시키거나 이에 영향을 미칠 수 있다. 당업자는 치료하고자 하는 질병, 장애 또는 상태, 질병, 장애 또는 상태의 중증도와 같은 요소, 치료될 개체의 매개변수 (연령, 생리학적 상태, 사이즈 및 중량을 포함한다), 치료 기간, 동반 요법의 유형 (존재하는 경우), 특정 투여 경로, 및 유사 인자에 기반하여 이러한 양을 결정할 수 있다. 따라서, 본원에 기술된 활성제의 투여량은 상기 매개변수의 다양성에 좌우될 수 있다. 개체/환자에서의 반응이 초기 투여량으로 불충분한 경우, 보다 많은 투여량 (또는 보다 국소화된 상이한 투여 경로에 의해 달성되는 보다 높은 투여량)이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 본 발명의 ssRNA 및 상술한 항원과 같은 적어도 하나의 항원 또는 이의 단편 (특히 이의 면역원성 단편), 또는 핵산, 특히 상기 항원을 코딩하는 RNA, 또는 단편을 포함하는 백신 제제의 형태를 취할 수 있다.
또한, 본 발명의 약학 조성물은 목적하는 경우에 활성제 (즉, ssRNA 및 선택적으로 하나 이상의 추가/보충 활성 화합물)을 함유하는 하나 이상의 단위 투약형을 포함할 수 있는 팩, 키트 또는 디스펜서 장치로 제공될 수 있다. 팩은 예를 들어 금속 또는 플라스틱 포장지, 예컨대 블리스터 팩을 포함할 수 있다. 팩, 키트 또는 디스펜서 장치에는 투여에 대한 지침서가 첨부될 수 있다.
하나 이상의 추가/보충 활성 화합물은 면역조절제 예컨대 항-CTL-A4 또는 항-PD1 또는 항-PDL1 또는 항-조절 T-세포 시약 예컨대 항-CD25 항체 또는 사이클로포스파미드를 포함할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 바람직하게는 면역자극의 상승 효과를 달성하기 위해 면역 강화 물질, 예컨대 하나 이상의 보강제를 함께 보충하여 투여될 수 있고, 그 유효성을 추가로 증가시키기 위한 하나 이상의 면역 강화 물질을 포함할 수 있다.
용어 "보조제"는 면역 반응을 연장하거나 촉진 또는 가속화시키는 화합물에 관한 것이다. 보조제의 다양한 유형에 따라, 이와 관련하여 다양한 메커니즘이 가능하다. 예를 들어, DC의 성숙을 가능하게 하는 화합물, 예를 들어 지질다당류 또는 CD40 리간드는 적절한 보조제의 제 1 부류를 형성한다. 일반적으로, "위험 신호"(LPS, GP96, dsRNA 등) 유형 또는 사이토카인, 예컨대 GM-CSF와 같이 면역계에 영향을 미치는 임의의 약제는 면역 반응을 심화시킬 수 있고 및/또는 통제된 방식으로 영향을 미칠 수 있는 보조제로서 사용될 수 있다. CpG 올리고데옥시뉴클레오타이드는 선택적으로 이 문맥에서 사용될 수 있지만, 상기 설명한 바와 같이 특정 상황 하에서 발생하는 부작용이 고려되어야 한다. 그러나, 일 실시형태에서 본 발명의 ssRNA (바람직하게는 mRNA)가 면역자극제를 코딩할 수 있고 상기 ssRNA에 의해 코딩되는 상기 면역자극제가 1차 면역자극제로서 작용하는 경우에, (CpG DNA으로만 면역자극한 경우에 비해) 상대적 소량의 CpG DNA만이 필요하다. 특히 바람직한 보조제는 사이토카인, 예컨대 모노카인, 림포카인, 인터루킨 또는 케모카인, 예를 들어 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IFN-α, IFN-γ, GM-CSF, LT-α, 또는 성장인자, 예를 들어 hGH이다. 지질펩타이드, 예컨대 Pam3Cys는 또한 본 발명의 약학 조성물에서 보조제로서 사용하기에 적합하다.
치료는 가정, 의사 진료실, 진료소, 병원의 외래 진료과 또는 병원에서 제공될 수 있다. 치료는 일반적으로 의료 감독 하에 시작되므로 의료 종사자는 치료 효과를 면밀히 관찰하고 필요한 모든 조정을 할 수 있다. 치료 기간은 환자의 연령 및 상태뿐만 아니라, 환자가 치료에 어떻게 반응하는지에 달려 있다.
상태, 장애 또는 질병을 발달시킬 위험이 더 큰 사람은 상태, 장애 또는 질병의 증상을 억제하거나 지연시키기 위한 예방적 치료를 받을 수 있다.
"치료"라는 용어는 당업자에게 공지되어 있는 것이고, 개체/환자에 대한 활성제 (예를 들어, 상기 활성제를 함유하는 약학 조성물)의 적용 또는 투여 또는 절차 또는 치료, 치유, 경감, 완화, 변경, 해결, 개선, 향상시키거나 이에 영향을 미칠 목적으로 또는 상태, 장애 또는 질병, 상태, 장애 또는 질병의 증상 또는 상태, 장애 또는 질병에 대한 소인을 방지할 목적으로, 상태, 장애 또는 질병, 상태, 장애 또는 질병의 증상 또는 상태, 장애 또는 질병에 대한 소인을 갖는 대상체로부터 분리된 세포, 세포배지, 세포주, 시료, 조직 또는 장기에 활성제 (예를 들어, 상기 활성제를 함유하는 약학 조성물)의 적용 또는 투여 또는 절차를 포함한다 (예를 들어, 대상체에서 종양의 크기 또는 종양의 수를 감소시키는 것을 포함하여, 질병을 방지하거나 제거하기 위해; 대상체에서 질병을 막거나 저감시키기 위해; 대상체에서 새로운 질병의 발달을 억제하거나 저감시키기 위해; 질병을 현재 앓고 있거나 이전에 앓았던 대상체에서 증상의 빈도 또는 중증도 및/또는 재발을 감소시키기 위해; 및/또는 연장, 즉 대상체의 수명을 증가시키기 위해). 특히, "질병의 치료"라는 용어는 치유, 지속 기간의 단축, 진행 또는 악화의 개선, 예방, 감속 또는 억제, 질병의 발병 또는 이의 증상의 예방 또는 지연을 포함한다. 따라서, "치료"라는 용어는 상태, 장애 또는 질병, 또는 상태, 장애 또는 질병의 증상의 예방적 치료를 포함할 수 있다. 치료에 사용되는 경우, 활성제는 본 발명의 ssRNA뿐만 아니라 본원에 기술된 하나 이상의 추가/보충 활성 화합물을 포함하며, 이에 한정되는 것은 아니지만 소분자, 펩타이드, 모방펩타이드, 폴리펩타이드/단백질, 항체, 기타 폴리뉴클레오타이드 예컨대 DNA 또는 dsRNA, 세포, 바이러스, 리보자임, 및 안티센스 올리고뉴클레오타이드일 수 있는 다른 치료적 활성 화합물을 포함한다.
본 발명은 본 발명의 바람직한 실시형태를 예시하는 하기 실시예에 의해 예시되고 청구범위에 정의된 바와 같이 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 첨부된 청구범위에 포함되지 않는 예들은 비교 목적으로만 제공된다.
실시예
약어
EtOH: 에탄올
h: 시간
hPa: 헥토파스칼
min: 분
mM: 밀리몰 (10-3 몰/ℓ)
MPa: 메가파스칼
nt: 뉴클레오타이드(들)
sec: 초
v/v: 부피%
실험 과정
IVT RNA의 셀룰로스 정제
달리 명시하지 않는 한, 중간 크기 섬유 (Sigma-Aldrich, Cat. #C6288) 및 1x STE 완충제 (10mM TRIS, pH 7.0, 50mM NaCl, 20mM EDTA)로 구성된 셀룰로스 분말을 정제 과정에 사용하였다. 모든 실험은 실온에서 수행하였다.
"음성" 정제 과정
"음성" 정제 과정은 16% EtOH이 함유된 1x STE 완충액에서 셀룰로스와 IVT RNA의 인큐베이션을 기본으로 하였다. 이 조건은 ssRNA가 수용성 분획에 남아있는 동안 dsRNA가 셀룰로스에 선택적으로 결합되도록 하였다.
셀룰로스는 0.2g 셀룰로스/ml의 농도로 16% (v/v) EtOH을 함유하는 1x STE 완충액에 먼저 현탁시키고, 격렬한 진탕 하에서 10분 동안 인큐베이팅하였다. 4,000xg에서 5분 동안 원심분리한 후, 0.2 g 셀룰로스/ml (세정된 셀룰로스)의 농도로 16% (v/v) EtOH을 함유하는 1x STE 완충액에 셀룰로스를 재현탁시켰다.
풀다운 실험을 위해 500㎕의 세정된 셀룰로스 슬러리를 1.5 ml 튜브에 옮기고 14,000xg에서 5분간 원심분리하였다. 상등액을 제거한 후, 16% (v/v) EtOH을 함유하는 100㎕ 1x STE 완충액 중의 50㎍ IVT RNA를 셀룰로스에 첨가하고 격렬한 진탕 하에서 15분 동안 인큐베이팅하였다. 14,000xg에서 5분 동안 원심분리한 후, 상등액을 제거하고 핵산을 침전시켰다. 이어서, 셀룰로스는 EtOH을 함유하지 않는 100㎕ 1x STE 완충액과 함께 15분 동안 격렬하게 진탕시키면서 결합된 핵산을 방출시켰다. 14,000xg에서 5분간 원심분리한 후, 상등액을 제거하고 용출된 핵산을 침전시켰다.
마이크로원심분리 스핀 컬럼 (NucleoSpin Filters, Macherey-Nagel, Cat. #740606)을 사용하여 셀룰로스 정제를 위해 미리 세정된 셀룰로스 슬러리 (셀룰로스 0.12g) 600㎕를 스핀 컬럼으로 옮기고 14,000xg에서 60초 동안 원심분리하였다. 통과액을 버리고 16% (v/v) EtOH을 함유하는 500㎕의 1x STE 완충액을 스핀 컬럼에 첨가하고 격렬한 진탕 하에서 5분 동안 인큐베이팅하여 셀룰로스를 재현탁시켰다. 14,000xg에서 60초 동안 원심분리한 후, 통과액을 버리고 16% (v/v) EtOH을 함유한 300-500㎕ 1x STE 완충액 중 IVT RNA (50-500㎍)를 스핀 컬럼에 첨가하고 20분 동안 인큐베이팅하여 셀룰로스를 재현탁시켰다. 이어서, 스핀 컬럼을 14,000xg에서 60초 동안 원심분리하고, 핵산 침전을 위해 통과액을 회수하였다. 여러 주기의 셀룰로스 정제를 수행할 때, 통과액은 새로 제조된 셀룰로스 스핀 컬럼으로 직접 옮기고 절차를 반복하였다. 최종적으로, 300-500㎕ 1x STE 완충액을 첨가함으로써 스핀 컬럼을 격렬한 진탕 및 14,000xg에서 60초 동안 원심분리 하에서 20분간 인큐베이션하는 동안 셀룰로스-결합된 핵산을 방출시켰다.
정제 공정의 업스케일링은 16% (v/v) EtOH을 함유하는 15 ml 1x STE 완충액에서 셀룰로스 1.5 g 및 IVT RNA 5 mg을 사용하여 50 ml 튜브에서 수행하였다. RNA를 건식형 셀룰로스에 첨가하고 30분 동안 자기 교반 하에서 인큐베이팅하였다. 결합되지 않은 핵산은 일회용 진공-구동 여과 장치 (Steriflip-HV, 기공 크기 0.45㎛, PVDF, Merck Chemicals GmbH/ Millipore, Cat. #SE1M003M00)를 사용하여 여과하여 회수하였다. 표시된 경우, 1.5 g의 신선한 셀룰로스를 첨가하고 공정을 반복함으로써 정제의 두번째 사이클에 여과액을 사용하였다. 최종적으로, 같은 부피의 이소프로판올을 첨가하여 여과액 중의 핵산을 침전시켰다.
"양성" 정제 과정
"양성" 정제 과정의 원리는 40% EtOH를 함유하는 1x STE 완충액에서 셀룰로스와 함께 IVT RNA를 인큐베이팅하여 모든 RNA를 먼저 셀룰로스에 결합시키는 것이다. 두 번째 단계에서, ssRNA는 16% EtOH을 포함하는 1x STE 완충액에서 인큐베이션에 의해 선택적으로 방출되는 반면, 이러한 조건에서는 dsRNA가 셀룰로스 섬유에 결합된 채로 유지된다.
사용하기 전에 셀룰로스를 0.2g 셀룰로스/ml의 농도로 40% (v/v) EtOH을 함유하는 1x STE 완충액에 현탁시키고 격렬하게 진탕시키면서 10분 동안 인큐베이팅하였다. 4,000xg에서 5분 동안 원심분리한 후, 0.2 g 셀룰로스/ml (세정된 셀룰로스)의 농도로 40% (v/v) EtOH을 함유하는 1x STE 완충액에 셀룰로스를 재현탁시켰다.
마이크로원심분리 스핀 컬럼 (NucleoSpin Filters, Macherey-Nagel, Cat. #740606)을 사용한 셀룰로스 정제를 위해 600㎕의 세정된 셀룰로스 슬러리 (0.12 g 셀룰로스)를 스핀 컬럼으로 옮기고 14,000xg에서 60초 동안 원심분리하였다. 통과액을 버리고 40% (v/v) EtOH을 함유하는 500㎕의 1x STE 완충액을 스핀 컬럼에 첨가하고 격렬한 진탕 하에 5분 동안 인큐베이팅하여 셀룰로스를 재현탁시켰다. 14,000xg에서 60초간 원심분리한 후, 통과액을 버리고 40% (v/v) EtOH을 포함하는 300-500㎕ 1x STE 완충액 중 IVT RNA (50-500㎍)를 스핀 컬럼에 첨가하고 격렬한 진탕 하에서 20분간 인큐베이팅하여 셀룰로스를 재현탁시켰다. 이어서, 스핀 컬럼을 14,000xg에서 60초 동안 원심분리하고, 핵산 침전을 위해 통과액을 회수하였다. 16% (v/v) EtOH을 포함하는 300-500㎕ 1x STE 완충액을 첨가함으로써 14,000xg에서 60초 동안 스핀 컬럼을 격렬하게 진탕 및 원심분리하여 20분 동안 인큐베이션하면서 셀룰로스로부터 ssRNA를 방출시켰다. 여러 주기의 셀룰로스 정제가 수행될 때, 통과액은 새로 제조된 셀룰로스 스핀 컬럼으로 직접 옮기고 절차를 반복하였다. 최종적으로, 300-500㎕ 1x STE 완충액을 첨가하여 14,000xg에서 60초 동안 스핀 컬럼을 격렬히 진탕하고 원심분리하여 20분 동안 인큐베이션하는 동안 셀룰로스-결합된 핵산을 방출시켰다.
고정상으로서 셀룰로스를 사용하는 FPLC의 경우, 먼저 40% (v/v) EtOH을 함유하는 1x STE 완충액 중의 셀룰로스 슬러리 (0.2g/ml)를 제조하고 30분 동안 교반 하였다. 20 ml의 이 슬러리 (4g 셀룰로스)를 사용하여 XK 16/20 컬럼 (GE Healthcare Life Sciences, Cat #28-9889-37)을 포장하였다. 컬럼 층의 최종 높이는 약 5cm이다. AEKTA Avant 25 시스템 (GE Healthcare Life Sciences)을 사용하여크로마토크래피를 수행하고 자외선 (260nm) 흡광도를 모니터링하였다. 결합 완충액으로서 40% (v/v) EtOH를 함유하는 1x STE 완충액을 사용하고 용출 완충액으로서 1x STE 완충액 (완충액 A)을 사용하였다. 컬럼을 100% 완충액 B로 15분 동안 2 ㎖/분의 유속으로 평형시켰다. 500㎍ RNA (시료 부피: 500㎕) 주사 후, 유속을 40분 동안 1 ml/min로 감소시켰다. ssRNA를 2 ml/분의 유속에서 40분 동안 40% 완충액 B (16% (v/v) EtOH)를 사용하여 용출시켰다. 최종적으로, 완충액 조성을 0% 완충액 B (0% EtOH)로 바꿈으로써 dsRNA를 컬럼으로부터 용리시켰다. 크로마토크래피 피크를 회수하고 추가 분석을 위해 핵산을 침전시켰다.
핵산의 이소프로판올 침전
셀룰로스 정제로부터 수득된 RNA는 0.1 볼륨의 3M 아세트산나트륨 (pH 4.0) 및 1 볼륨의 이소프로판올을 첨가함으로써 침전시켰다. 볼텍싱(vortexing) 후, 시료를 -20℃에서 1시간 동안 인큐베이팅한 다음 14,000xg에서 10분간 원심분리하였다. RNA 펠렛을 200㎕의 얼음으로 차게 한 70% (v/v) EtOH로 세정하고, 기건(air-dried)시키고 적당한 부피의 핵산분해효소가 없는 H2O에 용해시켰다. RNA 농도는 Nanodrop 시스템 (Eppendorf)을 사용하여 분광광도계로 측정하였다.
도트블롯 분석
dsRNA 및 RNA-DNA 혼성 오염물의 양을 결정하기 위해, 상이한 농도의 RNA 시료로 연속 희석물을 제조하고, 나일론 블롯팅 막 (Nytran SuPerCharge (SPC) Nylon Blotting Membrane (GE Healthcare Life Sciences, Cat. #10416216)) 상에 RNA의 증가된 양(일반적으로 40 ng, 200 ng 및 1,000 ng)을 발견하였다. 이어서, 5% (w/v) 탈지유 분말을 함유하는 TBS-T 완충액 (20mM TRIS pH 7.4, 137mM NaCl, 0.1% (v/v) TWEEN-20)에서 1시간 동안 막을 차단시켰다. dsRNA의 검출을 위해, 1% (w/v) 탈지유 분말을 함유하는 TBS-T 완충액 중 1:10,000의 비율로 희석된 J2 dsRNA-특이적 마우스 mAb (English & Scientific Consulting, Szirak, Hungary)으로 1시간 동안 막을 인큐베이팅하였다. 표시된 경우 1:10,000의 비율로 희석된 S 9.6 RNA-DNA-혼성-특이적 마우스 mAb IgG2a (KeraFAST, Cat. #ENH001)를 사용하여 RNA-DNA 혼성 오염물을 검출하였다. TBS-T로 세정한 후, HRP-컨쥬게이팅된 당나귀 항-마우스 IgG (Jackson ImmunoResearch, Cat. #715-035-150)로 1시간 동안 막을 인큐베이팅하고, TBS-T로 세정하며 Amersham ECL Prime Western Blotting Detection 시약 (Fisher Scientific, Cat. # RPN2232) 및 ChemiDoc MP 촬상 시스템 (BIO-RAD)을 사용하여 현상하였다. 표시된 경우 혼성화 신호 강도는 Image Lab 5.1 소프트웨어 (BIO-RAD)를 사용하여 농도계측기로 계측하였다.
아가로스겔 전기영동
정제된 RNA의 무결성을 모니터링하고 도트블롯 상에 로딩된 양을 확인하기 위해 아가로스겔 전기영동을 사용하였다. 도트블롯팅을 위해 준비된 40 ng/㎕ 일련 RNA 희석물 중 동일한 양의 RNA (예를 들어, 2 ㎕)를 분석하였다. RNA 시료는 문헌[Masek et al. (Anal. Biochem. 336 (2005), 46-50)]에 따라 변성시키고 2㎕의 RNA (80 ng)를 6㎕의 포름아미드와 혼합하고 65℃에서 5분간 인큐베이팅한 후, 0.005% (v/v) GelRedTM 핵산 Gel Stain (Biotium Inc., Cat. #41003)을 함유한 1.4% (w/v) 아가로스겔 상에 로딩하였다. 전기영동은 진행 완충액(running buffer)로서 TAE (40mM TRIS 아세테이트, 1mM EDTA)를 사용하여 100 V에서 20분간 수행한 후 Gel DocTM EZ 촬상 시스템 (BIO-RAD)을 사용하여 겔을 촬상하였다.
실시예 1-셀룰로스를 사용하여 IVT RNA로부터 dsRNA의 풀다운
IVT RNA로부터 dsRNA 오염물을 제거하기 위해 셀룰로스를 적용하는 가능성을 테스트하기 위해 간단한 풀다운 실험이 수행하였다. IVT 반응으로부터 염화리튬 (LiCl) 침전에 의해 예비-정제된 50㎍의 2,500 nt-길이의 N1-메틸-슈도우리딘 (m1Ψ)-변형된 IVT RNA는 16% (v/v) EtOH를 함유한 1x STE 완충액의 존재 하에서 0.1g 셀룰로스와 인큐베이팅하였다. 원심분리 후, 상등액 중 비결합 RNA를 침전시켰다. 셀룰로스-결합된 RNA는 EtOH을 함유하지 않은 1x STE 중에 셀룰로스를 재현탁시키고, 상등액을 원심분리 및 침전시켜 회수하였다. 2개의 분획 모두뿐만 아니라 RNA 출발물질의 RNA 중 dsRNA 함량은 dsRNA-특이적 J2 항체를 사용하여 도트블롯으로 분석하였다. RNA의 무결성은 아가로스겔 전기영동에 의해 모니터링하였다.
도트블롯 분석은 무처리된 투입물에 비해 셀룰로스와 인큐베이션 후에 비결합 RNA 분획 중 IVT RNA dsRNA 함량이 크게 감소함을 보여주었다 (도 1). 이는 16% (v/v) EtOH의 존재 하에서 셀룰로스 물질에 오염된 dsRNA를 선택적으로 결합시켜서 셀룰로스의 침강에 의해 ssRNA로부터 dsRNA를 분리하게 할 수 있기 때문이다. 분리 후, dsRNA 오염물은 EtOH을 함유하지 않는 완충액을 사용하여 셀룰로스로부터 방출시킬 수 있다. 이는 결합된 RNA 분획에서 J2 반응성 RNA의 상당한 양을 입증함으로써 확인하였다 (도 1). 또한, RNA의 전기영동은 이 셀룰로스 정제 과정 동안에 RNA 무결성이 보존되었음을 증명한 것이었다. 이 실시예는 IVT RNA로부터 dsRNA 오염물을 제거하기 위한 셀룰로스의 성공적인 사용을 확인하였다.
실시예 2-상이한 농도의 EtOH가 셀룰로스에 의한 IVT RNA로부터의 dsRNA 제거 효율에 미치는 영향
다음 단계에서, 마이크로원심분리 스핀 컬럼을 사용하여 비결합된 RNA를 셀룰로스로부터 분리하는 것에 상기한 정제 방법 (실시예 1 참조)을 적용하였다. 이 기술의 장점은 원심분리에 의해 액체를 완전히 제거하여 비결합된 RNA를 셀룰로스로부터 완전히 제거하는 것이다. 또한, IVT RNA를 셀룰로스와 함께 인큐베이션 동안에 18% (v/v) 또는 20% (v/v) 이하의 EtOH 농도를 증가시키는 것이 dsRNA 제거의 효율을 증가시킬지 여부를 시험하였다. 먼저, 자성 비드에 의한 IVT 반응으로부터 예비-정제된, 1,500nt의 길이인 슈도우리딘 (Ψ)-변형되고 D2-캡핑된 IVT RNA 50㎍은 16% (v/v), 18% (v/v) 또는 20% (v/v) EtOH을 함유한 1x STE 완충액 존재 하에서 0.1g 셀룰로스로 마이크로원심분리 스핀 컬럼에서 인큐베이팅하였다. 원심분리 후, 컬럼의 원심분리에 의해 비결합된 RNA를 회수하고 침전시켰다. EtOH을 함유하지 않는 1x STE를 컬럼에 첨가하고, 격렬한 진탕 및 최종 원심분리 및 침전에 의한 셀룰로스의 재현탁으로 셀룰로스-결합된 RNA를 회수하였다. 2개의 분획 모두뿐만 아니라 RNA 출발물질의 RNA 중 dsRNA 함량은 dsRNA-특이적 J2 항체를 사용하여 도트블롯으로 분석하였다. 두 번째 막에 동일한 양의 다른 RNA 분획을 로딩하고 RNA/DNA 혼성-특이적 S 9.6 항체와 혼성화하여 이들 IVT RNA 오염물이 셀룰로스 정제에 의해 제거될 수 있는지 여부를 시험하였다.
정제되지 않은 IVT RNA와 비교하여, 모든 비결합된 RNA 분획 (통과액) 중의 dsRNA 함량은 셀룰로스와 함께 항온 인큐베이션 후 크게 감소하였다 (도 2). 그러나, 이들 분획 중 RNA/DNA 혼성물의 양만 크게 감소하였고, 이는 RNA/DNA 혼성물이 시험 조건 하에서 셀룰로스를 효율적으로 결합하고 있지 않은 보여주는 것이며, 따라서 셀룰로스를 이용하여 IVT의 RNA로부터 제거할 수 없다. 16% (v/v) 내지 18% (v/v) 또는 20% (v/v)의 EtOH 농도를 증가시키면 dsRNA 제거 효율이 유의하게 증가하지 않았다. 결합된 RNA 분획 중의 J2-반응성 RNA이 다량 존재함으로 dsRNA가 풍부해짐을 확인하고 (도 2), 이 방법으로 dsRNA 오염물과 ssRNA의 분리를 확인하였다. 이 결과는 마이크로원심분리 스핀 컬럼 방식에 대한 "음성" 셀룰로스 정제 과정의 성공적인 적용임을 보여주었다.
실시예 3-RNaseIII 처리에 대한 셀룰로스 정제 및 HPLC 정제의 비교
마이크로원심분리 스핀 컬럼을 사용하여 상기 기재된 방법 (실시예 2 참조)에 따른 셀룰로오즈 정제의 다중 사이클이 dsRNA 제거의 효율을 증가시키는지를 시험하기 위해, IVT 반응으로부터의 염화리튬 (LiCl) 침전에 의해 예비-정제된, 2,500 nt의 길이인 m1Ψ-변형된 IVT RNA의 100㎍은 16% (v/v) EtOH을 함유한 1x STE 완충액을 사용하여 상술한 바와 같이 1x, 2x 또는 3x로 정제하였다. 또한, 셀룰로스로 정제된 RNA는 E. coli RNaseIII (0.2 U/100㎍ RNA)로 37℃에서 30분간 처리하거나 Weissman 등이 기술한 프로토콜(상기)에 따라 HPLC로 정제한 IVT RNA와 비교하였다. 모든 RNA 중 dsRNA 함량은 dsRNA-특이적 J2 항체를 사용하여 도트블롯으로 분석하고 혼성화 신호의 농도측정 분석으로 정량하였다. RNA 무결성을 아가로스겔 전기영동에 의해 모니터링하였다.
셀룰로스 정제 주기의 수를 늘리면 IVT RNA에서 제거된 dsRNA의 양이 증가하였다 (도 3). 1회 사이클의 정제 과정으로 dsRNA 오염물의 약 90%가 제거되는 반면, 이 양은 2회 및 3회 정제 사이클을 수행할 때 각각 95% 및 97%까지 증가하였다. 흥미롭게도, 셀룰로스 정제의 1회 사이클은 RNaseIII로 IVT RNA를 처리하는 것과 거의 동일한 양의 dsRNA를 제거한다. 또한, 3회 사이클의 셀룰로스 정제를 수행하는 것이 HPLC 정제 효율에 매우 근접하게 하였다. 따라서, 셀룰로스 정제 효율은 RNaseIII 처리한 정제와 HPLC 정제 사이의 범위이었다.
실시예 4-IVT RNA로부터 dsRNA를 제거할 때 다른 브랜드들의 셀룰로스의 성능 비교
dsRNA 오염물의 제거가 상기한 실험 (Sigma-Aldrich, Cat. #C6288)에서 사용된 특정 셀룰로스 브랜드로 제한되는지 여부 또는 다른 공급 업체의 셀룰로스로도 사용할 수 있는 여부를 시험하기 위해, Macherey-Nagel 사의 2개의 다른 셀룰로스 유형(MN 100, MN 2100)의 성능을 시험하였다. 먼저, IVT 반응으로부터 염화리튬 (LiCl) 침전에 의해 예비-정제된, 1,500nt 길이의 m1Ψ-변형된 IVT RNA 100㎍은 16% (v/v) EtOH을 함유하는 1x STE 완충액 존재 하에서 마이크로원심분리 스핀 컬럼에서 0.15g의 상이한 유형의 셀룰로스로 인큐베이팅하였다. 원심분리 후, 컬럼을 원심분리하고 통과액에서 RNA를 침전시켜 비결합된 RNA를 회수하였다. 셀룰로스-결합된 RNA는 컬럼에 1x STE를 첨가한 후 격렬한 진탕 및 최종 원심분리 및 침전에 의한 셀룰로스를 재현탁시켜 회수하였다. 모든 RNA 시료 중 dsRNA 함량은 dsRNA-특이적 J2 항체를 사용하여 도트블롯으로 분석하고 혼성화 신호의 농도측정 분석으로 정량하였다. RNA 무결성을 아가로스겔 전기영동에 의해 모니터링하였다.
정제에 사용된 셀룰로스와 무관하게 모든 비결합된 RNA 분획 중의 dsRNA 함량은 정제되지 않은 투입 RNA와 비교하여 크게 감소하였다 (도 4). 결합된 RNA 분획 중의 J2-반응성 RNA가 다량으로 존재함으로 dsRNA가 풍부해짐을 확인하고 시험 한 모든 셀룰로스 유형으로 dsRNA 오염물과 ssRNA의 분리를 확인하였다.
실시예 5-셀룰로스 정제 방법의 확장성
셀룰로스 정제 방법이 확장 가능한지 여부를 시험하는 것을 중요하였다. 따라서, 자성 비드에 의한 IVT 반응으로 예비-정제된 1,900nt 길이의 D1-캡핑된 IVT RNA 5mg으로부터 dsRNA 오염물을 제거하기 위한 실험을 수행하였다. 16% (v/v) EtOH을 함유하는 1x STE 완충액 15ml 중의 셀룰로스 (Sigma, Cat. #C6288) 1.5g과 함께 RNA를 인큐베이팅하였다. 비결합된 RNA를 진공-구동 여과 장치 (0.45㎛ 기공 크기)에 의해 셀룰로스로부터 분리하고 침전하였다. 동일한 RNA 5 ㎎을 각각 첨가하여 2회 정제 사이클을 수행하였다. 모든 정제된 RNA 중 dsRNA 함량은 dsRNA-특이적 J2 항체를 사용하여 도트블롯으로 분석하고 혼성화 신호의 강도에 대한 농도측정 분석으로 정량하였다. RNA 무결성을 아가로스겔 전기영동에 의해 모니터링하였다.
도트블롯 분석 결과, 1.5 g의 셀룰로스로 1 사이클 정제한 후, dsRNA 오염물의 72%가 5 mg의 IVT RNA에서 제거됨을 보여주었다. 정제 효율은 신선한 셀룰로스 1.5 g으로 두 번째 정제 사이클에 의해 83%까지 추가로 증가시킬 수 있다. 예상대로, RNA 회수율은 1 사이클 정제 후 67%에서 2번째 사이클 후 53%로 감소하는데, 이는 여전히 용인 가능한 수준이며 Weismann 등이 기술한 HPLC 정제 프로토콜(상기)에 의해 달성된 약 50%의 회수율과 비교할 만하였다. 이 결과는 본 발명의 셀룰로스 정제 방법이 하나의 단일 뱃치 정제에서 수 mg의 IVT RNA로부터 dsRNA 오염물을 제거하도록 업 스케일링될 수 있음을 명백히 보여주었다.
실시예 6 -"양성" 정제 과정을 사용하여 상이한 길이를 갖는 IVT RNA의 정제
다음 단계에서 EtOH 농도를 16% (v/v)로 감소시킴으로써 ssRNA 분획물을 선택적으로 방출하기 전에 높은 EtOH 농도의 존재 하에서 IVT RNA 제제 중 모든 RNA 성분을 셀룰로스에 우선적으로 결합시키는 것이 가능한지 여부를 시험하였다. 이 조건 하에서 dsRNA 오염물은 셀룰로스 물질에 결합된 상태로 유지되어야 하고 이에 따라 ssRNA로부터 분리시켰다 ("양성" 정제). 또한, 이 절차는 EtOH의 존재 하에서 셀룰로스에 결합하지 않는 비-핵산 오염물 (예를 들어, 단백질, 유리 뉴클레오타이드)을 제거하게 하기 때문에 "음성" 정제보다 유리하였다. 따라서, 길이가 다르고 (1,300 nt, 2,500 nt 및 >10,000 nt) 캡 구조 (D1, D2, 캡 없음)를 갖는 세 가지 IVT RNA 400㎍은 마이크로원심분리 스핀 컬럼에서 40% (v/v) EtOH을 함유한 1x STE 완충액을 사용하여 0.12g의 셀룰로스와 완전히 결합시키는 실험을 수행하였다. 16% (v/v) EtOH을 함유한 1x STE 완충액으로 ssRNA를 용출시키고, 1.2 mg 신선한 셀룰로스를 함유하는 두 번째 스핀 컬럼으로 옮겼다. 격렬한 진탕 하에서 인큐베이션하고 원심분리한 후, 통과액 중 RNA를 침전시키고 dsRNA-특이적 J2 항체를 사용하여 도트블롯팅에 의해 dsRNA 오염물을 분석하였다. RNA 무결성을 아가로스겔 전기영동에 의해 모니터링하였다.
RNA 길이와 무관하게 모든 IVT RNA 중의 dsRNA 함량은 상기한 "양성" 정제 과정의 실행 가능성을 입증한 셀룰로스 정제 (도 6) 이후에 간신히 검출 가능한 수준으로 상당히 감소하였다. 예기치 않게, >10,000 nt 길이의 IVT RNA도 dsRNA 오염물로부터 성공적으로 정제할 수 있었다 (도 6A). 이는 정제가 보다 짧은 RNA (예컨대 1,300 -2,500 nt)에 국한되지 않고 RNA 길이가 성공적인 정제를 위한 제한 요소가 아니라는 것을 보여주었다. 그러나, 1,300 nt와 2,500 nt 길이의 RNA의 회수율 (45-55% 회수율)에 비해, 긴 길이의 IVT RNA의 회수율은 더 낮았다 (35% 회수율). >10,000nt 길이의 IVT RNA의 무결성이 두 짧은 IVT RNA의 무결성보다 낮지만, 본 발명에 따른 셀룰로스 정제 방법에 의해 부정적인 영향을 받지는 않았다. 이 실험에 사용된 RNA는 다른 5' 캡 구조 (10,000 nt: D1 캡, 1,300 nt: D2 캡, 2,500 nt: 캡 없음)를 보유하기 때문에 상기 실시예는 이러한 구조적 특징이 셀룰로스에 의한 IVT RNA의 성공적인 정제에 중요한 인자는 아니라는 것을 입증하였다.
실시예 7-상이한 이온 강도를 갖는 완충액을 사용하는 IVT RNA의 정제
이중가닥 핵산의 안정성은 환경의 이온 강도에 의해 영향을 받았다. 높은 염 농도가 이중가닥 구조의 형성을 촉진하는 동안, 단일가닥 핵산에 대한 이들의 해리는 저농도의 염에서 강화되었다. 셀룰로스에 의한 dsRNA 제거 효율에 대한 완충액의 이온 강도의 영향을 분석하기 위해, IVT 반응으로부터 염화리튬 (LiCl) 침전에 의해 예비-정제된, 1300nt 길이의 m1Ψ-변형된 IVT RNA는 40% (v/v) EtOH 및 상이한 농도의 NaCl (0-150 mM)을 함유한 1x STE 완충액 500㎕에서 0.1g의 셀룰로스와 함께 1.5 ml 튜브에서 인큐베이팅하였다. 원심분리 후 상등액을 제거하고 셀룰로스를 16% (v/v) EtOH을 함유한 상응하는 1x STE 완충액 500㎕에 재현탁하여 ssRNA를 유리시켰다. 원심분리 후 상등액을 회수하고 RNA를 침전에 의해 회수하였다. 최종 단계에서 셀룰로스는 EtOH을 함유하지 않는 상응하는 1x STE 완충액 500㎕에 재현탁시키고, 원심분리하고 상등액 침전에 의해 RNA를 회수하였다. 두 분획물 (16% EtOH 용출액, 0% EtOH 용출액)뿐만 아니라 RNA 출발물질 (IVT RNA)로부터의 RNA 중 dsRNA 함량은 dsRNA-특이적 J2 항체를 사용하여 도트블롯으로 분석하고, 혼성화 신호의 농도측정 분석으로 정량하였다. RNA 무결성을 아가로스겔 전기영동에 의해 모니터링하였다.
셀룰로스에 의한 dsRNA 제거의 효율은 STE 완충액 중의 NaCl 농도에 의해 영향을 받는다. 25mM 또는 50mM NaCl의 존재 하에서 dsRNA 오염물의 94%-98%를 16% EtOH 용출액으로부터 제거하였다 (도 7A, B). NaCl 농도를 75 mM로 증가시키거나 (도 7A) 10 mM로 감소시키면 (도 7B) 정화 효율이 감소하였다. 125mM 이상의 NaCl 농도는 정제 효율을 현저하게 감소시켰다 (도 7A). 이 결과에서, 사용된 STE 완충액 중 NaCl 농도가 25 내지 50mM NaCl 범위에서 가장 높은 정화 효율에 영향을 줄 수 있음을 입증하였다. J2 항체를 사용하여, 150mM NaCl 시료를 제외하고는 (도 7A) 모든 0% EtOH 용출액의 강한 반응성은 이들 시료에서 dsRNA 오염물의 농축을 반영하였다.
실시예 8-FPLC에 의한 IVT RNA의 셀룰로스 정제
"양성" 정제 과정을 사용하여 셀룰로스에 의한 dsRNA 오염물로부터의 ssRNA 분리가 가능하기 때문에 (실시예 6 및 7 참조), FPLC에 대한 정제 프로토콜을 적응 시키려고 시도하였다. 4g의 셀룰로스를 고정상으로서 사용하여 XK 16/20 컬럼을 충전하였다. 40% (v/v) EtOH을 함유한 1x STE 완충액으로 평형화시킨 후, IVT 반응으로부터의 염화리튬 (LiCl) 침전에 의해 예비-정제된, 1,300nt 길이의 m1Ψ-변형된 IVT RNA 500㎍을 컬럼 상에 로딩하였다. 결합된 ssRNA 및 dsRNA는 완충액 중 EtOH 농도를 각각 16% (v/v) 및 0% (v/v)로 감소시켜 용출시키고, 분획을 회수하였다. RNA를 침전에 의해 회수하고 RNA 출발물질 (투입 RNA)뿐만 아니라 두 분획물 (F1: 16% EtOH 용출액, F2: 0% EtOH 용출액)로부터 RNA 중 dsRNA 함량은 dsRNA-특이적 J2 항체를 사용하여 도트블롯으로 분석하였다. RNA 무결성을 아가로스겔 전기영동에 의해 모니터링하였다.
크로마토그램의 용출 프로필 (260 nm에서의 흡광도)은 40% (v/v) EtOH의 존재 하에서 높은 비율의 로딩된 IVT RNA가 셀룰로스 물질에 결합함을 보여주었다. 이러한 조건 하에서 미량의 RNA만이 비결합 상태로 남아있어 컬럼으로부터 용출하였다 (도 8A). EtOH 농도를 16% (v/v)로 감소시키면 대부분의 RNA가 UV 흡광도에서 샤프한 단일 피크로 나타났다. 이 피크를 수집하였고 (분획 F1) 정제된 ssRNA를 포함하는 것이었다. 비정제된 투입 RNA에 비해, dsRNA 함량의 약 88%를 이 분획에서 제거하였다 (도 8B). 완충액의 EtOH 농도를 추가로 0% (v/v)로 감소시킨 후, 단지 소량의 RNA만을 컬럼으로부터 용리하였다 (분획 F2). 도트블롯 분석 결과, dsRNA가이 RNA 분획에서 풍부해지는 것을 확인하였다 (도 8B). 이는 dsRNA로부터 ssRNA의 분리를 확인하고, dsRNA 오염물을 제거하기 위한 IVT RNA의 FPLC 정제를 위해 고정상으로서 셀룰로스의 성공적인 사용을 입증하였다.
실시예 9-ssRNA 용출을 위한 상이한 EtOH 농도를 사용하는 IVT RNA의 정제
"양성" 셀룰로스 정제 절차의 프로토콜을 최적화하기 위해 dsRNA 제거 및 RNA 회수 효율에 대해 상이한 EtOH 농도의 영향을 시험하였다. 자성 비드에 의한 IVT 반응으로부터 예비-정제된, 1,500nt 길이의 D1-캡핑된 IVT RNA 200㎍은 마이크로원심분리 스핀 컬럼에서 40% (v/v) EtOH을 함유한 500㎕ 1x STE 완충액 중 0.1g의 세정된 셀룰로스와 함께 인큐베이팅하였다. 셀룰로스-결합된 ssRNA는 6, 10, 12, 14, 16, 18, 20 또는 24% (v/v) EtOH을 함유한 1x STE 완충액으로 용출하고, 침전법으로 용출액으로부터 회수하였다. 상이한 용출액뿐만 아니라 RNA 출발물질 (투입 RNA)로부터 얻어진 RNA 중 dsRNA 함량은 dsRNA-특이적 J2 항체를 사용하여 도트블롯으로 분석하고 혼성화 신호의 농도측정 분석으로 정량하였다. RNA 무결성을 아가로스겔 전기영동으로 확인하였다.
"양성" 정제 과정에서 ssRNA의 용출을 위한 EtOH 농도의 최적 범위는 14-16% (v/v)이다 (도 9A, B). 이러한 EtOH 농도에서 dsRNA의 83-84%는 셀룰로스에 결합하여 잔류하고 ssRNA의 58-64%는 해당 용출액으로부터 회수하였다. EtOH을 18% (v/v) 또는 20% (v/v)로 증가시키면 dsRNA 제거 효율(각각 85% 또는 90%)이 향상되지만 RNA 회수율(각각 47% 또는 36%)은 상당히 감소하였다. 대조적으로, EtOH 농도를 12% (v/v)로 감소시키면 RNA 회수를 현저히 개선하지 않으면서 정제 효율 (제거된 dsRNA의 63%)이 악화시켰다. 이 결과는 dsRNA 제거 효율 및 용출액으로부터의 RNA 회수율이 반비례함을 보여주었다. 또한, dsRNA 오염물에 대한 ssRNA의 상대적 순도는 용출에 사용된 EtOH 농도에 의해 제어할 수 있었다. EtOH 농도가 높을수록 dsRNA를 보다 효율적으로 제거할 수 있었지만, ssRNA 회수율은 저하시켰다. 따라서, ssRNA의 용출을 위한 EtOH 농도를 조정함으로써, dsRNA 오염물/RNA 회수율을 조정하여 상이한 적용에 대한 IVT RNA의 순도/비용 요구 사항을 충족시킬 수 있었다.
실시예 10-셀룰로스의 RNA 결합능 측정
"양성" 셀룰로스 정제 절차를 업스케일링하려면 과부하로 인한 RNA 손실을 최소화하기 위해 셀룰로스의 RNA 결합능을 아는 것이 중요하였다. RNA 결합능을 결정하기 위해, 40% (v/v) EtOH을 함유한 1x STE 완충액 500㎕에서 자성 비드에 의한 IVT 반응으로 예비-정제된, 1,500 nt 길이의 D1-캡핑된 IVT RNA의 25㎍, 50㎍, 100㎍, 250㎍, 500㎍, 750㎍, 1,000㎍ 또는 1,500㎍과 고정된 양의 세정된 셀룰로스 (100 mg, Sigma, C6288)를 마이크로원심분리 스핀 컬럼에서 인큐베이팅하였다. 원심분리 후, 16% (v/v) EtOH을 함유한 500㎕ 1x STE 완충액으로 ssRNA를 용출시켰다. 최종적으로, 셀룰로스에 여전히 결합된 RNA는 H2O (0% (v/v) EtOH)로 인큐베이션하여 방출시켰다. 통과액 (40% (v/v) EtOH) 및 두 16% (v/v)와 0% (v/v) 용출액 중 RNA를 침전에 의해 회수하고, 회수된 RNA의 양을 분광광도계로 측정하였다. 또한, dsRNA-특이적 J2 항체를 사용함으로써 16% (v/v) EtOH 용출액뿐만 아니라 RNA 출발물질 (투입 RNA)로부터 수득된 RNA 중 dsRNA 함량을 분석하여, 개체 시료에서 dsRNA의 제거 효율을 모니터링하였다. 이들 RNA 무결성을 아가로스겔 전기영동에 의해 모니터링하였다.
시험된 셀룰로스 (Sigma, C6288)의 최대 RNA 결합 용량은 셀룰로스 1g당 1-2.5 mg RNA에 상응하는 100mg 셀룰로스당 100㎍~250㎍ RNA의 범위이다. 이로부터, 비결합된 RNA 분획을 나타내는, 40% (v/v) EtOH 통과액으로부터 회수된 RNA 회수율 (도 10A) 및 RNA 수율 (도 10B)은 250㎍ 이상의 RNA를 100 mg 셀룰로스로의 정제에 사용한 경우에 점진적으로 증가한다는 사실을 반영하는 것이었다. 16% (v/v) EtOH 및 0% (v/v) EtOH 용출액에서 결합된 RNA의 양은 250㎍ 이상의 RNA를 정제에 사용한 경우에 이에 맞춰 증가하지 않았고, 결과적으로 두 분획물로부터 감소된 RNA 회수율을 초래하였다 (도 10A, B). 100㎍의 RNA를 100 mg 셀룰로스로 정제하는 경우에 (68% RNA 회수) 16% (v/v) EtOH 용출액으로부터 최대 RNA 회수율을 달성하였다. 또한, RNA:셀룰로스의 이러한 비율에서 88% dsRNA를 제거하는 가장 높은 정제 효율에 도달하였다 (도 10C, D). 흥미롭게도, IVT RNA로부터 제거된 dsRNA의 상대적 양은 셀룰로스에 결합한 RNA-용량을 초과하는 경우에 현저히 감소하지 않았다.
실시예 11-IVT RNA의 셀룰로스 정제가 번역 가능성 및 면역원성에 미치는 영향
상기한 바와 같이, IVT RNA는 T7 RNA 중합효소의 비정상적인 활성으로 인해 dsRNA 오염물을 함유하였다. 그러나, dsRNA는 RIG-I, MDA5 및 TLR3을 비롯한 다양한 세포 센서를 활성화함으로써 염증성 사이토카인 (인터페론 등)을 유도하고 단백질 키나아제 R (PKR) 및 올리고아데닐레이트 합성효소 (OAS)를 직접 활성화시킴으로써 번역을 직접 억제하였다. 본 발명의 방법에 적용된 IVT RNA가 본 발명의 방법에 적용되지 않은 IVT RNA와 비교하여 보다 적은 염증성 사이토카인을 유도하는지 여부 및/또는 보다 효율적으로 번역될 수 있는지 여부를 시험하기 위해, 뮤린 에리스로포이에틴 (EPT)을 코딩하는 IVT RNA는 비정제된 상태로 남겨 두거나 셀룰로스 물질 (0.12 g 셀룰로스 (Sigma, C6288))로 각각 채워진 2개의 스핀 컬럼을 사용하여 2단계 절차로 정제하였다. 먼저, IVT RNA를 제 1 스핀 컬럼을 사용하여 상술한 바와 같은 양성 정제 절차를 행하였다 (즉, 셀룰로스 물질에의 dsRNA 및 ssRNA의 결합에 대해 제 1 스핀 컬럼에서 40% (v/v)를 함유한 1x STE 완충액 존재 하에서 셀룰로스 물질과 IVT RNA를 인큐베이팅하고; 제 1 스핀 컬럼에 원심력을 가하고; 통과액을 폐기하고; 16% (v/v) EtOH을 함유한 1x STE 완충액을 첨가하고 제 1 스핀 컬럼에 원심력을 가함으로써 제 1 스핀 컬럼으로부터 ssRNA를 용출시켰다). 이어서, 이렇게 수득한 ssRNA를 함유한 용출액은 제 2 스핀 컬럼을 사용하여 상술한 바와 같은 음성 정제 절차를 행하였다 (즉, ssRNA를 함유한 용출액을 제 2 스핀 컬럼에서 셀룰로스 물질과 함께 인큐베이팅하고; 제 2 스핀 컬럼에 원심력을 가하며; 통과액을 회수하였다). 이어서, 제 2 스핀 컬럼으로부터 수득된 통과액은 이소프로판올/아세트산나트륨으로 침전시키고, H2O에 재용해시켰다. TransIT (Mirus Bio)로 제형화한 후, IVT RNA는 3㎍ RNA/동물의 용량으로 마우스 (n=4)의 복강내에 주사하였다. 주사 후 2, 6 및 24 시간에 혈액을 채취하고 혈장 시료를 회수하였다. 대조군 마우스에는 TransIT만을 주입하였다. 뮤린 인터페론 알파 (IFN-α) 및 뮤린 EPO의 수준은 특정 ELISA 분석 (뮤린 인터페론 알파-특이적 ELISA (eBioscience); 뮤린 EPO-특이적 DuoSet ELISA Development 키트 (R&D))를 사용하여 측정하였다.
도 11A에 도시된 바와 같이, 본 발명의 방법에 적용된 IVT RNA는 비정제된 IVT RNA에 비해 유의하게 적은 IFN-α를 유도하였다. 따라서, 본 실시예는 본 발명의 방법이 IVT RNA로부터 오염된 이중가닥 분자를 효율적으로 제거함을 입증하였다. 셀룰로스-정제된 IVT RNA에 의해 유도된 잔여 IFN-α는 필시 우리딘을 함유한 ssRNA에 의한 TLR7의 활성화에 기인한 것이었다.
또한, 도 11B는 본 발명의 방법을 실시하여 단백질 합성 억제 dsRNA가 결핍된 EPO-코딩한 IVT RNA 제제가 매우 효율적으로 번역되어, 본 발명에 따라 정제된 IVT RNA의 투여 후 24시간 후에도 혈장 내에서 높은 EPO 수준을 나타냄을 보여주었다. 대조적으로, 본 발명의 방법으로 행하지 않았으나 미정제되어 잔류하는 EPO-코딩한 IVT RNA 제제는 dsRNA의 직접 및 IFN-α-매개 작용으로 단백질 합성 억제로 인해 덜 효율적으로 번역되었다.

Claims (48)

  1. 단일가닥 RNA (ssRNA)를 제공하는 방법으로서,
    (i) 시험관내 전사에 의해 생성된 ssRNA를 포함하는 RNA 제제를 제공하는 단계;
    (ii) 이중가닥 RNA (dsRNA)를 셀룰로스 물질에 결합시키는 조건 하에서 셀룰로스 물질과 RNA 제제를 접촉시키는 단계; 및
    (iii) dsRNA를 셀룰로스 물질에 결합시키는 조건 하에서 셀룰로스 물질로부터 ssRNA를 분리하는 단계를 포함하는, 단일가닥 RNA (ssRNA) 제공 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    시험관내 전사에 의한 ssRNA를 포함하는 RNA 제제를 생산하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    단계 (ii) 및 (iii)은 dsRNA를 셀룰로스 물질에 결합시키고 ssRNA를 셀룰로스 물질에 결합시키지 않는 조건 하에서 수행되는 것인 방법.
  4. 제 3 항에 있어서,
    단계 (ii)는 진탕 및/또는 교반 하에서, 바람직하게는 적어도 5분 동안, 보다 바람직하게는 적어도 10분 동안 ssRNA를 포함하는 RNA 제제를 셀룰로스 물질과 혼합하는 단계를 포함하는 방법.
  5. 제 4 항에 있어서,
    단계 (ii)에서 RNA 제제는 ssRNA 및 제 1 완충액을 포함하는 액체로서 제공하고 및/또는 셀룰로스 물질은 제 1 완충액 중의 현탁액으로서 제공되고, 여기서 제 1 완충액은 dsRNA를 셀룰로스 물질에 결합시키고 ssRNA를 셀룰로스 물질에 결합시키지 않는 농도로 물, 에탄올 및 염, 바람직하게는 염화나트륨을 포함하는 방법.
  6. 제 5 항에 있어서,
    제 1 완충액 중의 에탄올의 농도가 14 내지 20% (v/v), 바람직하게는 14 내지 16% (v/v)인 방법.
  7. 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서,
    제 1 완충액 중의 염의 농도가 15 내지 70mM, 바람직하게는 20 내지 60mM인 방법.
  8. 제 5 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    제 1 완충액은 완충 물질, 바람직하게는 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄 (TRIS) 및/또는 킬레이트제, 바람직하게는 EDTA를 추가로 포함하는 방법.
  9. 제 5 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 (iii)에서는 RNA 제제, 셀룰로스 물질 및 제 1 완충액의 혼합물을 튜브 내에 제공하고 단계 (iii)은 (1) 중력 또는 원심력을 튜브에 가하여 액체 및 고체상을 분리시키는 단계; 및 (2) ssRNA를 포함하는 상등액을 회수하거나 셀룰로스 물질을 제거하는 단계를 포함하는 방법.
  10. 제 5 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 (iii)에서는 RNA 제제, 셀룰로스 물질 및 제 1 완충액의 혼합물을 스핀 컬럼 또는 여과 장치에 제공하고 단계 (iii)은 (1') 중력, 원심력, 압력, 또는 진공을 스핀 컬럼 또는 여과 장치에 가하여 액체 및 고체상을 분리시키는 단계; 및 (2') ssRNA를 포함하는 통과액을 회수하는 단계를 포함하는 방법.
  11. 제 3 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 (ii) 및 (iii)을 1회 또는 2회 이상 반복하고, 여기서 단계 (ii)와 (iii)의 하나의 사이클에서 단계 (iii) 후에 수득된 ssRNA 제제는 다음 사이클의 단계 (ii)에서 RNA 제제로 사용하고 단계 (ii)와 (iii) 각각 사이클의 단계 (ii)에서는 신선한 셀룰로스 물질을 사용하는 방법.
  12. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    단계 (ii)는 dsRNA 및 ssRNA를 셀룰로스 물질에 결합시키는 조건 하에서 수행하고; 단계 (iii)은 dsRNA를 셀룰로스 물질에 결합시키고 ssRNA를 셀룰로스 물질에 결합시키지 않는 조건 하에서 수행하는 방법.
  13. 제 12 항에 있어서,
    단계 (ii)는 (1) 진탕 및/또는 교반 하에서, 바람직하게는 적어도 5분 동안, 보다 바람직하게는 적어도 10분 동안 ssRNA를 포함하는 RNA 제제를 셀룰로스 물질과 혼합하는 단계; 및 dsRNA 및 ssRNA가 결합된 셀룰로스 물질을 잔여물로부터 분리하는 단계를 포함하는 방법.
  14. 제 13 항에 있어서,
    단계 (ii)에서 RNA 제제는 ssRNA 및 제 2 완충액을 포함하는 액체로서 제공하고 및/또는 셀룰로스 물질은 제 2 완충액 중의 현탁액으로서 제공되고, 여기서 제 2 완충액은 dsRNA 및 ssRNA를 셀룰로스 물질에 결합시키는 농도로 물, 에탄올 및 염, 바람직하게는 염화나트륨을 포함하는 방법.
  15. 제 14 항에 있어서,
    제 2 완충액 중의 에탄올의 농도는 적어도 35% (v/v)이고, 바람직하게는 38 내지 42% (v/v)인 방법.
  16. 제 14 항 또는 제 15 항에 있어서,
    제 2 완충액 중의 염의 농도가 15 내지 70mM이고, 바람직하게는 20 내지 60mM인 방법.
  17. 제 14 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서,
    제 2 완충액은 완충 물질, 바람직하게는 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄 (TRIS) 및/또는 킬레이트제, 바람직하게는 EDTA를 추가로 포함하는 방법.
  18. 제 14 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 (ii)(2)에서는 단계 (ii)(1)에서 수득된 RNA 제제 및 셀룰로스 물질의 혼합물을 튜브 내에 제공하고 단계 (ii)(2)는 (2a) 중력 또는 원심력을 튜브에 가하여 액체 및 고체상을 분리시키는 단계; 및 (2b) 상등액을 제거하거나 dsRNA 및 ssRNA가 결합된 셀룰로스 물질을 회수하는 단계를 포함하는 방법.
  19. 제 14 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 (ii)(2)에서는 단계 (ii)(1)에서 수득된 RNA 제제 및 셀룰로스 물질의 혼합물을 스핀 컬럼 또는 여과 장치에 제공하고 단계 (ii)(2)는 (2a') 중력, 원심력, 압력, 또는 진공을 스핀 컬럼 또는 여과 장치에 가하여 액체 및 고체상을 분리시키는 단계; 및 (2b') 통과액을 폐기하는 단계를 포함하는 방법.
  20. 제 14 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 (ii)는 (3) dsRNA 및 ssRNA가 결합된 셀룰로스 물질에 제 2 완충액의 분취량을 첨가하는 단계; (4) 진탕 및/또는 교반 하에서, 바람직하게는 적어도 5분 동안, 보다 바람직하게는 적어도 10분 동안 얻어진 혼합물을 인큐베이팅하는 단계; 및 (5) dsRNA 및 ssRNA가 결합된 셀룰로스 물질을 액체상으로부터 분리하는 단계; 및 선택적으로 (6) 단계 (3) 내지 (5)를 1회 또는 2회 이상 반복하는 단계를 포함하는 방법.
  21. 제 12 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 (iii)은 (1) 진탕 및/또는 교반 하에서, 바람직하게는 적어도 5분 동안, 보다 바람직하게는 적어도 10분 동안 dsRNA 및 ssRNA가 결합된 셀룰로스 물질을 제 1 완충액과 혼합하는 단계를 포함하고, 여기서 제 1 완충액은 dsRNA를 셀룰로스 물질에 결합시키고 ssRNA를 셀룰로스 물질에 결합시키지 않는 농도로 물, 에탄올 및 염, 바람직하게는 염화나트륨을 포함하고; 및 (2) ssRNA를 포함하는 액체상을 셀룰로스 물질로부터 분리하는 단계를 포함하는 방법.
  22. 제 21 항에 있어서,
    제 1 완충액 중의 에탄올의 농도는 14 내지 20% (v/v)이고, 바람직하게는 14 내지 16% (v/v)인 방법.
  23. 제 21 항 또는 제 22 항에 있어서,
    제 1 완충액 중의 염의 농도는 15 내지 70mM이고, 바람직하게는 20 내지 60mM인 방법.
  24. 제 21 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서,
    제 1 완충액은 완충 물질, 바람직하게는 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄 (TRIS) 및/또는 킬레이트제, 바람직하게는 EDTA를 추가로 포함하는 방법.
  25. 제 21 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 (iii)에서는 셀룰로스 물질 및 제 1 완충액의 혼합물을 튜브 내에 제공하고 단계 (iii)(2)는 (2a) 중력 또는 원심력을 튜브에 가하여 액체 및 고체상을 분리시키는 단계; 및 (2b) ssRNA를 포함하는 상등액을 회수하거나 셀룰로스 물질을 제거하는 단계를 포함하는 방법.
  26. 제 21 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 (iii)에서는 셀룰로스 물질 및 제 1 완충액의 혼합물을 스핀 컬럼 또는 여과 장치에 제공하고 단계 (iii)(2)는 (2a') 중력, 원심력, 압력, 또는 진공을 스핀 컬럼 또는 여과 장치에 가하는 단계; 및 (2b') ssRNA를 포함하는 통과액을 회수하는 단계를 포함하는 방법.
  27. 제 12 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 (ii) 및 (iii)은 1회 또는 2회 이상 반복하고, 여기서 단계 (ii)와 (iii)의 하나의 사이클에서 단계 (iii) 후에 수득된 ssRNA 제제는 다음 사이클의 단계 (ii)에서 RNA 제제로 사용하고 단계 (ii)와 (iii) 각각 사이클의 단계 (ii)에서는 신선한 셀룰로스 물질을 사용하는 방법.
  28. 제 12 항에 있어서,
    단계 (ii)에서는 셀룰로스 물질을 컬럼 내에 제공하고, 단계 (ii)는 dsRNA 및 ssRNA를 셀룰로스 물질에 결합시키는 조건 하에서 컬럼 상에 RNA 제제를 로딩하는 단계를 포함하고, 단계 (iii)은 dsRNA를 셀룰로스 물질에 결합시키고 ssRNA를 셀룰로스 물질에 결합시키지 않는 조건 하에서 셀룰로스 물질로부터 ssRNA를 용리시키는 단계를 포함하는 방법.
  29. 제 28 항에 있어서,
    단계 (ii)에서 RNA 제제는 ssRNA 및 제 2 완충액을 포함하는 액체로서 컬럼 상에 제공 및 로딩하고, 여기서 제 2 완충액은 dsRNA 및 ssRNA를 셀룰로스 물질에 결합시키는 농도로 물, 에탄올 및 염, 바람직하게는 염화나트륨을 포함하는, 방법.
  30. 제 29 항에 있어서,
    제 2 완충액 중의 에탄올의 농도는 적어도 35% (v/v)이고, 바람직하게는 38 내지 42% (v/v)인 방법.
  31. 제 29 항 또는 제 30 항에 있어서,
    제 2 완충액 중의 염의 농도는 15 내지 70mM이고, 바람직하게는 20 내지 60mM인 방법.
  32. 제 29 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 있어서,
    제 2 완충액은 완충 물질, 바람직하게는 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄 (TRIS) 및/또는 킬레이트제, 바람직하게는 EDTA를 추가로 포함하는 방법.
  33. 제 28 항 내지 제 32 항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 (iii)은 용출액으로서 제 1 완충액을 사용하여 수행하고, 여기서 제 1 완충액은 dsRNA를 셀룰로스 물질에 결합시키고 ssRNA를 셀룰로스 물질에 결합시키지 않는 농도로 물, 에탄올 및 염, 바람직하게는 염화나트륨을 포함하는 방법.
  34. 제 33 항에 있어서,
    제 1 완충액 중의 에탄올의 농도는 14 내지 20% (v/v)이고, 바람직하게는 14 내지 16% (v/v)인 방법.
  35. 제 33 항 또는 제 34 항에 있어서,
    제 1 완충액 중의 염의 농도는 15 내지 70mM이고, 바람직하게는 20 내지 60mM인 방법.
  36. 제 33 항 내지 제 35 항 중 어느 한 항에 있어서,
    제 1 완충액은 완충 물질, 바람직하게는 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄 (TRIS) 및/또는 킬레이트제, 바람직하게는 EDTA를 추가로 포함하는 방법.
  37. 제 1 항 내지 제 36 항 중 어느 한 항에 있어서,
    RNA 제제는 T3, T7 및 SP6 RNA 중합효소로 이루어진 군으로부터 선택되는 RNA 중합효소를 사용하여 제조하는 방법.
  38. 제 1 항 내지 제 37 항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 (ii) 전에 RNA 제제를 적어도 하나의 예비-정제 처리하는 방법.
  39. 제 38 항에 있어서,
    적어도 하나의 예비-정제 처리는 바람직하게는 염화리튬을 사용한 핵산의 침전; 자성 비드에 핵산의 결합; 한외여과; 및 바람직하게는 듀플렉스-특이적 핵산분해효소 (duplex-specific nuclease; DSN)를 사용한 DNA의 분해 단계 중 하나 이상을 포함하는 방법.
  40. 제 1 항 내지 제 39 항 중 어느 한 항에 있어서,
    ssRNA는 mRNA 또는 억제성 RNA, 예컨대 안티센스 RNA, siRNA, 또는 miRNA인 방법.
  41. 제 1 항 내지 제 40 항 중 어느 한 항에 있어서,
    ssRNA는 길이가 적어도 2700nt, 바람직하게는 적어도 3000nt, 보다 바람직하게는 적어도 3500nt, 더욱 바람직하게는 적어도 4500nt인 방법.
  42. 제 1 항 내지 제 41 항 중 어느 한 항에 있어서,
    셀룰로스 물질은 셀룰로스 섬유, 바람직하게는 분배 크로마토크래피 시약으로서 사용하기에 적합한 등급의 셀룰로스 섬유를 포함하는 방법.
  43. 제 1 항 내지 제 42 항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 (ii)에서 RNA 제제와 접촉시키기 전에 셀룰로스 물질은 세정된 셀룰로스 물질로서 제공하는 방법.
  44. 제 43 항에 있어서,
    셀룰로스 물질의 세정은 (I) 진탕 및/또는 교반 하에서, 바람직하게는 적어도 5분 동안, 보다 바람직하게는 적어도 10분 동안 셀룰로스 물질을 세정액과 혼합하는 단계; 및 (II) 액체를 제거하거나 셀룰로스 물질을 회수하는 단계; 및 선택적으로 단계 (iii) (I) 및 (II)를 1회 또는 2회 이상 반복하는 단계를 포함하는 방법.
  45. 제 44 항에 있어서,
    세정액은 (A) dsRNA를 세정된 셀룰로즈 물질에 결합시키고 ssRNA를 세정된 셀룰로즈 물질에 결합시키지 않는 조건 하에서 단계 (ii)를 수행하는 경우에 제 5 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 기재된 제 1 완충액, 또는 (B) dsRNA 및 ssRNA를 세정된 셀룰로즈 물질에 결합시키는 조건 하에서 단계 (ii)를 수행하는 경우에 제 14 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 기재된 제 2 완충액의 조성물을 갖는 방법.
  46. 제 1 항 내지 제 45 항 중 어느 한 항의 방법에 의해 수득 가능한 ssRNA.
  47. 제 46 항에 있어서,
    실질적으로 dsRNA가 없고, 바람직하게는 실질적으로 dsRNA 및 DNA가 없는 것 인 ssRNA.
  48. 제 46 항 또는 제 47 항에 있어서,
    치료에 사용하기 위한 ssRNA.
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