CN114921457B - 一种提取dsRNA的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提取dsRNA的方法，主要包括粗提液的处理，正压‑钟罩式二联过滤和醇沉步骤，属于生物技术领域。本发明的提纯方法步骤简便，处理量大，处理时间短，制备的dsRNA纯度在97％以上，为大量dsRNA的大规模发酵法生产制备提供了可靠方法。与此同时，由于提取的dsRNA具有高纯度、高稳定性的特点，其在病虫害防治方面具有巨大的应用潜力。

Description

一种提取dsRNA的方法
技术领域
本发明涉及一种提取dsRNA的方法，属于生物技术领域。
背景技术
目前在农业生产中，农业害虫防治主要以化学防治手段为主。虽然化学农药的防效显著，但是会诱发害虫产生抗药性，同时导致农药残留增加，破坏农田生态系统，这些副作用均严重影响了农业生产的可持续发展和人体健康。因此，研究新型、安全、高效的、无残留的害虫防治途径是农业生产可持续发展的重要内容。
RNA干扰技术(RNA silencing)也叫基因沉默技术，是根据目标基因的序列互补设计合成dsRNA(double-stranded RNA，dsRNA)，dsRNA会特异性的降解该基因表达的mRNA，从而抑制该基因的表达，这项技术在医药和农业领域有非常广泛的应用前景。RNA干扰技术在农业害虫的防治方面，主要是通过抑制害虫必需基因的转录和翻译，从而降低害虫的适应性或致死害虫。dsRNA可以直接喷洒到植物表面作为外源性的杀虫剂，它可以通过害虫进食或与病原菌直接接触结合进行病虫害的防治。已经有报道证实饲喂靶向的dsRNA，对蚜虫和烟草天蛾幼虫具有很好的杀灭作用。
基于RNA干扰技术的应用，未来将给农业害虫防治带来革命性的变化。dsRNA是RNA病毒复制过程的中间产物，这些dsRNA的大小对应于RNA病毒的基因组，而正常的植物或真菌组织不含有或仅产生小分子量的dsRNA，RNA病毒复制过程会产生长度与基因组RNA相似的dsRNA，某些dsRNA病毒的子代基因组也是dsRNA，并且这些dsRNA相对于ssRNA稳定得多。dsRNA分析方法是利用CF-11纤维素能在一定的酒精浓度下特异吸附dsRNA的原理而发展起来的。dsRNA的提取方法包括生物法和化学法。如专利CN113811612A中公开的一种dsRNA合成方法：首先选择一植物基因的一核酸序列，该核酸序列编码一沉默分子，该沉默分子以一植物基因为目标，能够募集RNA依赖型RNA聚合酶(RdRp)；随后修饰该核酸序列，从而针对有害生物基因赋予沉默特异性，使植物基因的转录物与能够募集RdRp的沉默分子形成碱基互补，以产生dsRNA分子，该dsRNA分子能够沉默植物细胞中的有害生物基因。但上述生物法涉及酶催化合成，得到的dsRNA纯度低，得率低。化学方法通常为过柱层析法，一般包括如下步骤：采用具有典型症状的食用菌组织，剪碎后用液氮研磨成粉末；用STE缓冲液及酚/氯仿/异戊醇混合液抽提，低速离心；上清液用无水乙醇调至特定浓度，注入平衡过的纤维素(CF-11)柱中，随后洗脱；洗脱液用异丙醇、乙醇沉淀后真空抽干，即为dsRNA。但以上方法操作繁琐，价格昂贵，处理量小，提取量小，无法实现规模化提取。因此，仍需寻找一种高效提取dsRNA的方法。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种高效提纯dsRNA的方法，主要包括粗提液的处理，正压-钟罩式二联过滤和醇沉步骤。本发明步骤简便，处理量大，处理时间短，制备的dsRNA纯度在97％以上，为大量dsRNA的大规模发酵法生产制备提供了可靠方法。
本发明提供一种提取dsRNA的方法，包括以下步骤：
(1)将生物体或组织粉碎，得到粗提液，使用缓冲液A调节粗提液pH至7-10，离心收集上清液；其中，缓冲液A的组成为：(i)碳酸氢钠、碳酸钠、氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钙、碳酸氢钠或磷酸氢二钾，(ii)四硼酸钠、盐酸、硼酸、氯化钾、氢氧化钠或柠檬酸，以及(iii)氯化钠、三羟甲基氨基甲烷、盐酸、巴比妥酸或二甲亚砜；
(2)使用缓冲液B调节上述上清液pH至4-7，再次离心收集上清液；其中，缓冲液B的组成为：(i)醋酸、磷酸、柠檬酸、乙酸、硫酸铵、氯化铵或磷酸二氢钾，(ii)四硼酸钠、盐酸、硼酸、氯化钾、氢氧化钠或柠檬酸，以及(iii)氯化钠、三羟甲基氨基甲烷、盐酸、巴比妥酸或二甲亚砜；
(3)对步骤(2)得到的上清液进行正压过滤，过滤期间通气干燥，洗脱得到滤液，其中，填料由珍珠岩、硅藻土和纤维素混合得到，所述珍珠岩、硅藻土和纤维素均经过醇溶液浸泡；实际操作中，可先将填料原料在醇溶液中浸泡，再按一定比例混合，也可以混合后再用醇溶液浸泡，醇溶液可以增加填料原料间的极性，通过调节原料混合比例和醇浓度来控制极性，在适合不同大小的dsRNA分子的范围内，通过极性实现特异性吸附；
(4)将正压过滤得到的滤液进行钟罩式过滤，收集滤液；
(5)将步骤(4)中钟罩式过滤得到的滤液进行醇沉，所述醇沉为多级醇沉，具体地，向滤液中加入醇溶液至终浓度(v/v)为10％-30％，离心收集上清，再加入醇溶液至终浓度(v/v)为50％-80％，离心收集沉淀，得到纯化后的dsRNA。
本发明中，首先选择合适的缓冲体系与离心手段配合，在保持dsRNA稳定性的基础上以去除细胞碎片和大分子，随后进行正压-钟罩式二联过滤；正压过滤中，由于dsRNA分子量和大分子基因、蛋白有明显差异，调节填料各组分的比例和醇浓度控制极性，通过极性特异性吸附，拦截大分子杂质，目标产物流穿收集；钟罩式过滤中，由于二联过滤第一步去除了大部分的杂质，液体已经不粘稠，筛选得到最适合dsRNA收集的过滤柱滤芯——纤维素滤芯，利用dsRNA分子量和大分子基因、蛋白有明显差异，通过控制柱压和进样速度，进一步拦截大分子杂质，目标产物流穿收集。最后，依次采用10％-30％(v/v)和50％-80％(v/v)的醇溶液洗脱，去除大部分的盐离子和小分子蛋白，得到目标dsRNA，纯度达到97％以上。
进一步地，在步骤(1)中，使用缓冲液A调节粗提液pH之前，还包括对粗提液进行水浴和超声预处理的步骤。
进一步地，在步骤(1)中，缓冲液A的组成为：(i)0.01-0.8M碳酸氢钠、碳酸钠、氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钙、碳酸氢钠或磷酸氢二钾，(ii)0.01-0.95M四硼酸钠、盐酸、硼酸、氯化钾、氢氧化钠或柠檬酸，以及(iii)0.01-0.95M氯化钠、三羟甲基氨基甲烷、盐酸、巴比妥酸或二甲亚砜；pH6.5-9.5。
进一步地，在步骤(2)中，缓冲液B的组成为：(i)0.01-0.95M醋酸、磷酸、柠檬酸、乙酸、硫酸铵、氯化铵或磷酸二氢钾，(ii)0.01-0.95M四硼酸钠、盐酸、硼酸、氯化钾、氢氧化钠或柠檬酸，以及(iii)0.01-0.95M氯化钠、三羟甲基氨基甲烷、盐酸、巴比妥酸或二甲亚砜；pH3.5-6.5。
进一步地，在步骤(3)中，正压过滤时，压力为0.1Mpa-0.6Mpa。
进一步地，在步骤(3)中，填料的总质量为上清液体积的1％-10％。
进一步地，在步骤(3)中，浸泡填料原料的醇溶液浓度(v/v)为50％-90％，浸泡12-36h。
进一步地，在步骤(4)中，钟罩式过滤时，压力为0.05Mpa-0.3Mpa。
进一步地，在步骤(4)中，钟罩式过滤时，滤芯的材质为纤维素，孔径根据不同dsRNA的大小选择；优选地，过滤柱为30KD，100KD，300KD，0.22μm，0.45μm，1μm孔径中的1种或2种串联。
进一步地，醇溶液选自乙醇、丙醇、异丙醇、异丁醇、异戊醇和正丁醇中的一种或几种。
进一步地，在步骤(5)中，边搅拌(转速500rpm-3000rpm)边添加醇溶液至终浓度(v/v)为10％-30％，收集上清液之后，静置使上清液的表面形成胶冻状，低速搅拌(转速500rpm-3000rpm)，再添加醇溶液至终浓度(v/v)为50％-80％。其中，静置温度条件为0℃-25℃。
进一步地，离心时，转速为9000rpm-15000rpm，温度为0℃-25℃，离心时间为5min-60min。
本发明纯化得到的dsRNA具有纯度高的特点，在农业害虫防治领域中具有巨大的应用潜力，可用于制备杀虫剂、杀菌剂或抗病毒试剂。
本发明的有益效果：
本发明提供了一种高效提纯dsRNA的方法，主要包括粗提液的处理、正压-钟罩式二联过滤以及醇梯度沉淀，该提纯方法步骤简便，处理量大，制备的dsRNA纯度在97％以上，收率高达92％，为大量dsRNA的大规模发酵法生产制备提供了可靠方法。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合详细附图说明如后。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明。
图1为实施例1提纯的烟草花叶病毒dsRNA沉淀的色谱图；
图2为实施例2提纯的小菜蛾dsRNA沉淀的色谱图；
图3为实施例3提纯的马铃薯甲虫dsRNA沉淀的色谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1烟草花叶病毒dsRNA粗提液的提纯
(1)对表达TMV外壳蛋白cp基因的dsRNA重组大肠杆菌破壁得到的dsRNA粗提液进行水浴和超声预处理，使用缓冲液A调节pH至8，使用管式离心机，转速13000rpm，温度10℃，离心20min，离心收集上清液。其中，缓冲液A由60mL 0.15M碳酸氢钠、20mL 0.014M四硼酸钠和20mL 0.48M氯化钠配制而成，pH8.5。
(2)使用缓冲液B调节pH至6，使用管式离心机进行离心，转速15000rpm，温度5℃，离心时间20min，离心收集上清液。其中，缓冲液B由10mL 0.15M柠檬酸、20mL 0.18M盐酸、10mL 0.22M三羟甲基氨基甲烷和60mL 0.62M氯化钠配制而成，pH4.5。
(3)上清液使用正压-钟罩式二联过滤，先用含量为处理液5％的填料进行预先处理，填料成分为珍珠岩：硅藻土：纤维素＝1:1:2，经过70％(v/v)的乙醇提前浸泡12h。加入上清液后，缓慢调节空压机进气口使压力稳定在0.4Mpa，过滤期间不停通气干燥，洗脱得到滤液，去除大分子基因组79％和蛋白72％。
(4)打开不锈钢管阀门，使上述正压过滤滤液流入钟罩式过滤器，过滤柱为0.22μm孔径，纤维素滤芯，调节压力使压力稳定在0.1Mpa。去除大分子基因组95％和蛋白96％。其中，正压过滤装置与钟罩式过滤装置通过专用的不锈钢管连接，整套装置通过空压机提供驱动力，省去了钟罩式过滤用到的蠕动泵，且过程密闭降低操作中可能的污染。
(5)将上述钟罩式过滤液使用乙醇梯度沉淀，2000rpm低速搅拌，设置蠕动泵流速为蠕动泵全速的30％添加无水乙醇，至乙醇终浓度30％(v/v)，使用管式离心机进行离心，转速10000rpm，温度4℃，离心20min，收集上清。去除盐离子92％和小分子蛋白85％。
(6)上清放置于10℃过夜，待表面形成胶冻状，继续1000rpm低速搅拌，设置蠕动泵流速为20％添加无水乙醇，至乙醇终浓度70％(v/v)，使用管式离心机转速15000rpm，温度4℃，离心40min，收集沉淀。去除盐离子99％和小分子蛋白99％，烟草花叶dsRNA含量提高至98％。
对烟草花叶病毒dsRNA提纯的沉淀进行检测，结果见图1。烟草花叶病毒dsRNA保留时间在10.202min，峰形对称，纯度高。
实施例2小菜蛾dsRNA粗提液的提纯
(1)对表达小菜蛾蜕皮激素受体EcR基因的dsRNA重组大肠杆菌破壁得到的dsRNA粗提液进行水浴和超声预处理，使用缓冲液A调节pH至7，使用管式离心机进行离心，转速13000rpm，温度5℃，离心30min，离心收集上清液。其中，缓冲液A由40mL 0.25M碳酸氢钠、25mL 0.03M四硼酸钠和35mL 0.53M氯化钠配制而成，pH8.0。
(2)使用缓冲液B调节pH至7，使用管式离心机进行离心，转速15000rpm，温度10℃，离心时间30min，离心收集上清液。
其中，缓冲液B由15mL 0.4M柠檬酸、15mL 0.3M盐酸、15mL 0.5M三羟甲基氨基甲烷和55mL 0.58M氯化钠配制而成，pH4.2。
(3)上清液使用正压-钟罩式二联过滤，先用含量为处理液7.5％的填料进行预先处理，填料成分为珍珠岩：硅藻土：纤维素＝1:1:1，经过90％(v/v)的乙醇提前浸泡12h。加入上清液后，缓慢调节空压机进气口使压力稳定在0.5Mpa。去除大分子基因组80％和蛋白78％。
(4)打开不锈钢管阀门，使上述正压过滤清液流入钟罩式过滤器，过滤柱为0.45μm孔径和100KD孔径串联，纤维素滤芯，调节压力使压力稳定在0.05Mpa，过滤期间不停通气干燥，洗脱得到滤液，去除大分子基因组98％和蛋白99％。
(5)将上述钟罩式过滤液使用乙醇梯度沉淀，2000rpm低速搅拌，设置蠕动泵流速为20％添加无水乙醇，至乙醇终浓度20％(v/v)，使用管式离心机进行离心，转速12000rpm，温度4℃，离心30min，收集上清。去除盐离子93％和小分子蛋白87％。
(6)上清放置于15℃过夜，待表面形成胶冻状，继续1000rpm低速搅拌，设置蠕动泵流速为30％添加无水乙醇，至乙醇终浓度80％(v/v)，使用管式离心机转速13000rpm，温度4℃，离心50min，收集沉淀。去除盐离子99％和小分子蛋白99％。小菜蛾dsRNA含量提高至98.5％。
对小菜蛾dsRNA提纯的沉淀进行检测，结果见图2。小菜蛾dsRNA保留时间在10.743min，峰形对称，纯度高。
实施例3马铃薯甲虫dsRNA粗提液的提纯
(1)对表达马铃薯甲虫可溶性NSF附着蛋白snap基因的dsRNA重组大肠杆菌破壁得到的dsRNA粗提液进行水浴和超声预处理，使用缓冲液A调节pH至9，使用管式离心机进行离心，转速13000rpm，温度0℃，离心30min，离心收集上清液。其中，缓冲液A由40mL 0.05M碳酸氢钠、20mL 0.05M四硼酸钠和40mL 0.5M氯化钠配制而成，pH8.5。
(2)使用缓冲液B调节pH至5，使用管式离心机转速15000rpm，温度0℃，离心时间30min，离心收集上清液。
其中，缓冲液B由12mL 0.3M柠檬酸、15mL 0.15M盐酸、20mL 0.15M三羟甲基氨基甲烷和43mL 0.25M氯化钠配制配制而成，pH4。
(3)上清液使用正压-钟罩式二联过滤，先用含量为处理液10％的填料进行预先处理，填料成分为珍珠岩：硅藻土：纤维素＝1:2:1，经过50％(v/v)的乙醇提前浸泡24h。加入上清液后，缓慢调节空压机进气口使压力稳定在0.5Mpa。去除大分子基因组83％和蛋白82％。
(4)打开不锈钢管阀门，使上述正压过滤清液流入钟罩式过滤器，过滤柱为过滤柱为0.22μm孔径和30KD孔径串联，纤维素滤芯，调节压力使压力稳定在0.1Mpa，过滤期间不停通气干燥，洗脱得到滤液，去除大分子基因组99％和蛋白99％。
(5)将上述钟罩式过滤液使用乙醇梯度沉淀，1500rpm低速搅拌，设置蠕动泵流速为25％添加无水乙醇，至乙醇终浓度10％(v/v)，使用管式离心机进行离心，转速12000rpm，温度0℃，离心30min，收集上清。去除盐离子90％和小分子蛋白86％。
(6)上清放置于5℃过夜，待表面形成胶冻状，继续1500rpm低速搅拌，设置蠕动泵流速为10％添加无水乙醇，至乙醇终浓度60％(v/v)，使用管式离心机进行离心，转速15000rpm，温度0℃，离心40min，收集沉淀。去除盐离子99％和小分子蛋白99％，马铃薯甲虫dsRNA含量提高至98.5％。
对马铃薯甲虫dsRNA提纯的沉淀进行检测，结果见图3。马铃薯甲虫dsRNA保留时间在10.743min，峰形对称，纯度高。
实施例4
替换钟罩式过滤中的滤芯为折叠式PP滤芯，其余操作同实施例1。
对比例1
(1)对表达TMV外壳蛋白cp基因的dsRNA重组大肠杆菌破壁得到的dsRNA粗提液进行水浴和超声预处理，使用缓冲液A调节pH至8，使用管式离心机，转速13000rpm，温度10℃，离心20min，离心收集上清液。其中，缓冲液A由40mL 0.1M碳酸氢钠和60mL 0.5M氯化钠配制而成，pH8.8。
(2)使用缓冲液B调节pH至6，使用管式离心机进行离心，转速15000rpm，温度5℃，离心时间20min，离心收集上清液。其中，缓冲液B由10mL 0.15M柠檬酸、20mL 0.18M盐酸、10mL 0.22M三羟甲基氨基甲烷和60mL 0.62M氯化钠配制而成，pH4.5。
(3)上清液使用正压-钟罩式二联过滤，先用含量为处理液5％的填料进行预先处理，填料成分为珍珠岩：硅藻土：纤维素＝1:1:2，经过70％(v/v)的乙醇提前浸泡12h。加入上清液后，缓慢调节空压机进气口使压力稳定在0.4Mpa，过滤期间不停通气干燥，洗脱得到滤液。
(4)打开不锈钢管阀门，使上述正压过滤滤液流入钟罩式过滤器，过滤柱为0.22μm孔径，纤维素滤芯，调节压力使压力稳定在0.1Mpa。其中，正压过滤装置与钟罩式过滤装置通过专用的不锈钢管连接，整套装置通过空压机提供驱动力，省去了钟罩式过滤用到的蠕动泵，且过程密闭降低操作中可能的污染。
(5)将上述钟罩式过滤液使用乙醇梯度沉淀，2000rpm低速搅拌，设置蠕动泵流速为蠕动泵全速的30％添加无水乙醇，至乙醇终浓度30％(v/v)，使用管式离心机进行离心，转速10000rpm，温度4℃，离心20min，收集上清。
(6)上清放置于10℃过夜，待表面形成胶冻状，继续1000rpm低速搅拌，设置蠕动泵流速为20％添加无水乙醇，至乙醇终浓度70％(v/v)，使用管式离心机转速15000rpm，温度4℃，离心40min，收集沉淀。
对比例2
填料未经醇溶液浸泡，其余操作同实施例1。
对比例3
(1)对表达TMV外壳蛋白cp基因的dsRNA重组大肠杆菌破壁得到的dsRNA粗提液进行水浴和超声预处理，使用缓冲液A调节pH至8，使用管式离心机，转速13000rpm，温度10℃，离心20min，离心收集上清液。其中，缓冲液A由60mL 0.15M碳酸氢钠、20mL 0.014M四硼酸钠和20mL 0.48M氯化钠配制而成，pH8.5。
(2)使用缓冲液B调节pH至6，使用管式离心机进行离心，转速15000rpm，温度5℃，离心时间20min，离心收集上清液。其中，缓冲液B由20mL 0.15M盐酸、10mL 0.2M三羟甲基氨基甲烷和70mL 0.62M氯化钠配制而成，pH4.0。
(3)上清液使用正压-钟罩式二联过滤，先用含量为处理液5％的填料进行预先处理，填料成分为珍珠岩：硅藻土：纤维素＝1:1:2，经过70％(v/v)的乙醇提前浸泡12h。加入上清液后，缓慢调节空压机进气口使压力稳定在0.4Mpa，过滤期间不停通气干燥，洗脱得到滤液。
(4)打开不锈钢管阀门，使上述正压过滤滤液流入钟罩式过滤器，过滤柱为0.22μm孔径，纤维素滤芯，调节压力使压力稳定在0.1Mpa。其中，正压过滤装置与钟罩式过滤装置通过专用的不锈钢管连接，整套装置通过空压机提供驱动力，省去了钟罩式过滤用到的蠕动泵，且过程密闭降低操作中可能的污染。
(5)将上述钟罩式过滤液使用乙醇梯度沉淀，2000rpm低速搅拌，设置蠕动泵流速为蠕动泵全速的30％添加无水乙醇，至乙醇终浓度30％(v/v)，使用管式离心机进行离心，转速10000rpm，温度4℃，离心20min，收集上清。
(6)上清放置于10℃过夜，待表面形成胶冻状，继续1000rpm低速搅拌，设置蠕动泵流速为20％添加无水乙醇，至乙醇终浓度70％(v/v)，使用管式离心机转速15000rpm，温度4℃，离心40min，收集沉淀。
对比例4
(1)对表达TMV外壳蛋白cp基因的dsRNA重组大肠杆菌破壁得到的dsRNA粗提液进行水浴和超声预处理，使用缓冲液A调节pH至8，使用管式离心机，转速13000rpm，温度10℃，离心20min，离心收集上清液。其中，缓冲液A由60mL 0.15M碳酸氢钠、20mL 0.014M四硼酸钠和20mL 0.48M氯化钠配制而成，pH8.5。
(2)使用缓冲液B调节pH至6，使用管式离心机进行离心，转速15000rpm，温度5℃，离心时间20min，离心收集上清液。其中，缓冲液B由10mL 0.15M柠檬酸、20mL 0.18M盐酸、10mL 0.22M三羟甲基氨基甲烷和60mL 0.62M氯化钠配制而成，pH4.5。
(3)上清液使用正压-钟罩式二联过滤，先用含量为处理液5％的填料进行预先处理，填料成分为珍珠岩：硅藻土：纤维素＝1:1:2，经过70％(v/v)的乙醇提前浸泡12h。加入上清液后，缓慢调节空压机进气口使压力稳定在0.4Mpa，过滤期间不停通气干燥，洗脱得到滤液。
(4)打开不锈钢管阀门，使上述正压过滤滤液流入钟罩式过滤器，过滤柱为0.22μm孔径，纤维素滤芯，调节压力使压力稳定在0.1Mpa。其中，正压过滤装置与钟罩式过滤装置通过专用的不锈钢管连接，整套装置通过空压机提供驱动力，省去了钟罩式过滤用到的蠕动泵，且过程密闭降低操作中可能的污染。
(5)将上述钟罩式过滤液使用乙醇梯度沉淀，2000rpm低速搅拌，设置蠕动泵流速为蠕动泵全速的30％添加无水乙醇，至乙醇终浓度60％(v/v)，使用管式离心机进行离心，转速10000rpm，温度4℃，离心20min，收集上清。
(6)上清放置于10℃过夜，待表面形成胶冻状，继续1000rpm低速搅拌，设置蠕动泵流速为20％添加无水乙醇，至乙醇终浓度70％(v/v)，使用管式离心机转速15000rpm，温度4℃，离心40min，收集沉淀。
对实施例1-4和对比例1-4提纯的dsRNA进行检测，结果如表1所示：
表1实施例和对比例提纯的dsRNA纯度和产率
从表1中可看出，实施例的整体纯度和收率均明显高于对比例，可见缓冲体系、过滤方式、过滤材料、醇浓度梯度等都对提纯方法有着至关重要的影响，发明人经过无数次的尝试，最终确定了较优的工艺和材料，其有机配合、相辅相成，实现dsRNA的高效提纯，且具有较高的收率，进一步地，实施例1得到的dsRNA纯度与其余实施例相当，但收率得到明显提升。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (8)

1.一种提取dsRNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将生物体或组织粉碎，得到粗提液，使用缓冲液A调节粗提液pH至7-10，离心收集上清液；其中，所述缓冲液A的组成为：（i）碳酸氢钠、碳酸钠、氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钙、碳酸氢钠或磷酸氢二钾，（ii）四硼酸钠、盐酸、硼酸、氯化钾、氢氧化钠或柠檬酸，以及（iii）氯化钠、三羟甲基氨基甲烷、盐酸、巴比妥酸或二甲亚砜；
（2）使用缓冲液B调节步骤（1）所得上清液pH至4-7，离心收集上清液；其中，缓冲液B的组成为：（i）醋酸、磷酸、柠檬酸、乙酸、硫酸铵、氯化铵或磷酸二氢钾，（ii）四硼酸钠、盐酸、硼酸、氯化钾、氢氧化钠或柠檬酸，以及（iii）氯化钠、三羟甲基氨基甲烷、盐酸、巴比妥酸或二甲亚砜；
（3）对步骤（2）所得上清液进行正压过滤，洗脱得到滤液，其中，填料由珍珠岩、硅藻土和纤维素混合得到，所述珍珠岩、硅藻土和纤维素均经过醇溶液浸泡；
（4）将步骤（3）所得滤液进行钟罩式过滤，收集滤液；
（5）将步骤（4）所得滤液进行醇沉，所述醇沉为向滤液中加入醇溶液至终浓度（v/v）为10%-30%，离心收集上清，再加入醇溶液至终浓度（v/v）为50%-80%，离心收集沉淀，得到纯化后的dsRNA。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述缓冲液A的组成为：（i）0.01-0.95M 碳酸氢钠、碳酸钠、氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钙、碳酸氢钠或磷酸氢二钾，（ii）0.01-0.95M 四硼酸钠、盐酸、硼酸、氯化钾、氢氧化钠或柠檬酸，以及（iii）0.01-0.95M 氯化钠、三羟甲基氨基甲烷、盐酸、巴比妥酸或二甲亚砜；pH6.5-9.5。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述缓冲液B的组成为：（i）0.01-0.95M醋酸、磷酸、柠檬酸、乙酸、硫酸铵、氯化铵或磷酸二氢钾，（ii）0.01-0.95M四硼酸钠、盐酸、硼酸、氯化钾、氢氧化钠或柠檬酸，以及（iii）0.01-0.95M氯化钠、三羟甲基氨基甲烷、盐酸、巴比妥酸或二甲亚砜；pH3.5-6.5。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在步骤（3）中，所述正压过滤的压力为0.1Mpa-0.6Mpa。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在步骤（3）中，所述醇溶液的浓度（v/v）为50%-90%。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在步骤（4）中，所述钟罩式过滤的压力为0.05Mpa-0.3Mpa。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在步骤（4）中，钟罩式过滤时滤芯的材质为纤维素。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述醇溶液选自乙醇、丙醇、异丙醇、异丁醇、异戊醇和正丁醇中的一种或几种。
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