CN114921457A - 一种提取dsRNA的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提取dsRNA的方法,主要包括粗提液的处理,正压‑钟罩式二联过滤和醇沉步骤,属于生物技术领域。本发明的提纯方法步骤简便,处理量大,处理时间短,制备的dsRNA纯度在97%以上,为大量dsRNA的大规模发酵法生产制备提供了可靠方法。与此同时,由于提取的dsRNA具有高纯度、高稳定性的特点,其在病虫害防治方面具有巨大的应用潜力。
Description
技术领域
本发明涉及一种提取dsRNA的方法,属于生物技术领域。
背景技术
目前在农业生产中,农业害虫防治主要以化学防治手段为主。虽然化学农药的防效显著,但是会诱发害虫产生抗药性,同时导致农药残留增加,破坏农田生态系统,这些副作用均严重影响了农业生产的可持续发展和人体健康。因此,研究新型、安全、高效的、无残留的害虫防治途径是农业生产可持续发展的重要内容。
RNA干扰技术(RNA silencing)也叫基因沉默技术,是根据目标基因的序列互补设计合成dsRNA(double-stranded RNA,dsRNA),dsRNA会特异性的降解该基因表达的mRNA,从而抑制该基因的表达,这项技术在医药和农业领域有非常广泛的应用前景。RNA干扰技术在农业害虫的防治方面,主要是通过抑制害虫必需基因的转录和翻译,从而降低害虫的适应性或致死害虫。dsRNA可以直接喷洒到植物表面作为外源性的杀虫剂,它可以通过害虫进食或与病原菌直接接触结合进行病虫害的防治。已经有报道证实饲喂靶向的dsRNA,对蚜虫和烟草天蛾幼虫具有很好的杀灭作用。
基于RNA干扰技术的应用,未来将给农业害虫防治带来革命性的变化。dsRNA是RNA病毒复制过程的中间产物,这些dsRNA的大小对应于RNA病毒的基因组,而正常的植物或真菌组织不含有或仅产生小分子量的dsRNA,RNA病毒复制过程会产生长度与基因组RNA相似的dsRNA,某些dsRNA病毒的子代基因组也是dsRNA,并且这些dsRNA相对于ssRNA稳定得多。dsRNA分析方法是利用CF-11纤维素能在一定的酒精浓度下特异吸附dsRNA的原理而发展起来的。dsRNA的提取方法包括生物法和化学法。如专利CN113811612A中公开的一种dsRNA合成方法:首先选择一植物基因的一核酸序列,该核酸序列编码一沉默分子,该沉默分子以一植物基因为目标,能够募集RNA依赖型RNA聚合酶(RdRp);随后修饰该核酸序列,从而针对有害生物基因赋予沉默特异性,使植物基因的转录物与能够募集RdRp的沉默分子形成碱基互补,以产生dsRNA分子,该dsRNA分子能够沉默植物细胞中的有害生物基因。但上述生物法涉及酶催化合成,得到的dsRNA纯度低,得率低。化学方法通常为过柱层析法,一般包括如下步骤:采用具有典型症状的食用菌组织,剪碎后用液氮研磨成粉末;用STE缓冲液及酚/氯仿/异戊醇混合液抽提,低速离心;上清液用无水乙醇调至特定浓度,注入平衡过的纤维素(CF-11)柱中,随后洗脱;洗脱液用异丙醇、乙醇沉淀后真空抽干,即为dsRNA。但以上方法操作繁琐,价格昂贵,处理量小,提取量小,无法实现规模化提取。因此,仍需寻找一种高效提取dsRNA的方法。
发明内容
为解决上述问题,本发明提供了一种高效提纯dsRNA的方法,主要包括粗提液的处理,正压-钟罩式二联过滤和醇沉步骤。本发明步骤简便,处理量大,处理时间短,制备的dsRNA纯度在97%以上,为大量dsRNA的大规模发酵法生产制备提供了可靠方法。
本发明提供一种提取dsRNA的方法,包括以下步骤:
(1)将生物体或组织粉碎,得到粗提液,使用缓冲液A调节粗提液pH至7-10,离心收集上清液;其中,缓冲液A的组成为:(i)碳酸氢钠、碳酸钠、氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钙、碳酸氢钠或磷酸氢二钾,(ii)四硼酸钠、盐酸、硼酸、氯化钾、氢氧化钠或柠檬酸,以及(iii)氯化钠、三羟甲基氨基甲烷、盐酸、巴比妥酸或二甲亚砜;
(2)使用缓冲液B调节上述上清液pH至4-7,再次离心收集上清液;其中,缓冲液B的组成为:(i)醋酸、磷酸、柠檬酸、乙酸、硫酸铵、氯化铵或磷酸二氢钾,(ii)四硼酸钠、盐酸、硼酸、氯化钾、氢氧化钠或柠檬酸,以及(iii)氯化钠、三羟甲基氨基甲烷、盐酸、巴比妥酸或二甲亚砜;
(3)对步骤(2)得到的上清液进行正压过滤,过滤期间通气干燥,洗脱得到滤液,其中,填料由珍珠岩、硅藻土和纤维素混合得到,所述珍珠岩、硅藻土和纤维素均经过醇溶液浸泡;实际操作中,可先将填料原料在醇溶液中浸泡,再按一定比例混合,也可以混合后再用醇溶液浸泡,醇溶液可以增加填料原料间的极性,通过调节原料混合比例和醇浓度来控制极性,在适合不同大小的dsRNA分子的范围内,通过极性实现特异性吸附;
(4)将正压过滤得到的滤液进行钟罩式过滤,收集滤液;
(5)将步骤(4)中钟罩式过滤得到的滤液进行醇沉,所述醇沉为多级醇沉,具体地,向滤液中加入醇溶液至终浓度(v/v)为10%-30%,离心收集上清,再加入醇溶液至终浓度(v/v)为50%-80%,离心收集沉淀,得到纯化后的dsRNA。
本发明中,首先选择合适的缓冲体系与离心手段配合,在保持dsRNA稳定性的基础上以去除细胞碎片和大分子,随后进行正压-钟罩式二联过滤;正压过滤中,由于dsRNA分子量和大分子基因、蛋白有明显差异,调节填料各组分的比例和醇浓度控制极性,通过极性特异性吸附,拦截大分子杂质,目标产物流穿收集;钟罩式过滤中,由于二联过滤第一步去除了大部分的杂质,液体已经不粘稠,筛选得到最适合dsRNA收集的过滤柱滤芯——纤维素滤芯,利用dsRNA分子量和大分子基因、蛋白有明显差异,通过控制柱压和进样速度,进一步拦截大分子杂质,目标产物流穿收集。最后,依次采用10%-30%(v/v)和50%-80%(v/v)的醇溶液洗脱,去除大部分的盐离子和小分子蛋白,得到目标dsRNA,纯度达到97%以上。
进一步地,在步骤(1)中,使用缓冲液A调节粗提液pH之前,还包括对粗提液进行水浴和超声预处理的步骤。
进一步地,在步骤(1)中,缓冲液A的组成为:(i)0.01-0.8M碳酸氢钠、碳酸钠、氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钙、碳酸氢钠或磷酸氢二钾,(ii)0.01-0.95M四硼酸钠、盐酸、硼酸、氯化钾、氢氧化钠或柠檬酸,以及(iii)0.01-0.95M氯化钠、三羟甲基氨基甲烷、盐酸、巴比妥酸或二甲亚砜;pH6.5-9.5。
进一步地,在步骤(2)中,缓冲液B的组成为:(i)0.01-0.95M醋酸、磷酸、柠檬酸、乙酸、硫酸铵、氯化铵或磷酸二氢钾,(ii)0.01-0.95M四硼酸钠、盐酸、硼酸、氯化钾、氢氧化钠或柠檬酸,以及(iii)0.01-0.95M氯化钠、三羟甲基氨基甲烷、盐酸、巴比妥酸或二甲亚砜;pH3.5-6.5。
进一步地,在步骤(3)中,正压过滤时,压力为0.1Mpa-0.6Mpa。
进一步地,在步骤(3)中,填料的总质量为上清液体积的1%-10%。
进一步地,在步骤(3)中,浸泡填料原料的醇溶液浓度(v/v)为50%-90%,浸泡12-36h。
进一步地,在步骤(4)中,钟罩式过滤时,压力为0.05Mpa-0.3Mpa。
进一步地,在步骤(4)中,钟罩式过滤时,滤芯的材质为纤维素,孔径根据不同dsRNA的大小选择;优选地,过滤柱为30KD,100KD,300KD,0.22μm,0.45μm,1μm孔径中的1种或2种串联。
进一步地,醇溶液选自乙醇、丙醇、异丙醇、异丁醇、异戊醇和正丁醇中的一种或几种。
进一步地,在步骤(5)中,边搅拌(转速500rpm-3000rpm)边添加醇溶液至终浓度(v/v)为10%-30%,收集上清液之后,静置使上清液的表面形成胶冻状,低速搅拌(转速500rpm-3000rpm),再添加醇溶液至终浓度(v/v)为50%-80%。其中,静置温度条件为0℃-25℃。
进一步地,离心时,转速为9000rpm-15000rpm,温度为0℃-25℃,离心时间为5min-60min。
本发明纯化得到的dsRNA具有纯度高的特点,在农业害虫防治领域中具有巨大的应用潜力,可用于制备杀虫剂、杀菌剂或抗病毒试剂。
本发明的有益效果:
本发明提供了一种高效提纯dsRNA的方法,主要包括粗提液的处理、正压-钟罩式二联过滤以及醇梯度沉淀,该提纯方法步骤简便,处理量大,制备的dsRNA纯度在97%以上,收率高达92%,为大量dsRNA的大规模发酵法生产制备提供了可靠方法。
上述说明仅是本发明技术方案的概述,为了能够更清楚了解本发明的技术手段,并可依照说明书的内容予以实施,以下以本发明的较佳实施例并配合详细附图说明如后。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解,下面根据本发明的具体实施例并结合附图,对本发明作进一步详细的说明。
图1为实施例1提纯的烟草花叶病毒dsRNA沉淀的色谱图;
图2为实施例2提纯的小菜蛾dsRNA沉淀的色谱图;
图3为实施例3提纯的马铃薯甲虫dsRNA沉淀的色谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明,以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施,但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1烟草花叶病毒dsRNA粗提液的提纯
(1)对表达TMV外壳蛋白cp基因的dsRNA重组大肠杆菌破壁得到的dsRNA粗提液进行水浴和超声预处理,使用缓冲液A调节pH至8,使用管式离心机,转速13000rpm,温度10℃,离心20min,离心收集上清液。其中,缓冲液A由60mL 0.15M碳酸氢钠、20mL 0.014M四硼酸钠和20mL 0.48M氯化钠配制而成,pH8.5。
(2)使用缓冲液B调节pH至6,使用管式离心机进行离心,转速15000rpm,温度5℃,离心时间20min,离心收集上清液。其中,缓冲液B由10mL 0.15M柠檬酸、20mL 0.18M盐酸、10mL 0.22M三羟甲基氨基甲烷和60mL 0.62M氯化钠配制而成,pH4.5。
(3)上清液使用正压-钟罩式二联过滤,先用含量为处理液5%的填料进行预先处理,填料成分为珍珠岩:硅藻土:纤维素=1:1:2,经过70%(v/v)的乙醇提前浸泡12h。加入上清液后,缓慢调节空压机进气口使压力稳定在0.4Mpa,过滤期间不停通气干燥,洗脱得到滤液,去除大分子基因组79%和蛋白72%。
(4)打开不锈钢管阀门,使上述正压过滤滤液流入钟罩式过滤器,过滤柱为0.22μm孔径,纤维素滤芯,调节压力使压力稳定在0.1Mpa。去除大分子基因组95%和蛋白96%。其中,正压过滤装置与钟罩式过滤装置通过专用的不锈钢管连接,整套装置通过空压机提供驱动力,省去了钟罩式过滤用到的蠕动泵,且过程密闭降低操作中可能的污染。
(5)将上述钟罩式过滤液使用乙醇梯度沉淀,2000rpm低速搅拌,设置蠕动泵流速为蠕动泵全速的30%添加无水乙醇,至乙醇终浓度30%(v/v),使用管式离心机进行离心,转速10000rpm,温度4℃,离心20min,收集上清。去除盐离子92%和小分子蛋白85%。
(6)上清放置于10℃过夜,待表面形成胶冻状,继续1000rpm低速搅拌,设置蠕动泵流速为20%添加无水乙醇,至乙醇终浓度70%(v/v),使用管式离心机转速15000rpm,温度4℃,离心40min,收集沉淀。去除盐离子99%和小分子蛋白99%,烟草花叶dsRNA含量提高至98%。
对烟草花叶病毒dsRNA提纯的沉淀进行检测,结果见图1。烟草花叶病毒dsRNA保留时间在10.202min,峰形对称,纯度高。
实施例2小菜蛾dsRNA粗提液的提纯
(1)对表达小菜蛾蜕皮激素受体EcR基因的dsRNA重组大肠杆菌破壁得到的dsRNA粗提液进行水浴和超声预处理,使用缓冲液A调节pH至7,使用管式离心机进行离心,转速13000rpm,温度5℃,离心30min,离心收集上清液。其中,缓冲液A由40mL 0.25M碳酸氢钠、25mL 0.03M四硼酸钠和35mL 0.53M氯化钠配制而成,pH8.0。
(2)使用缓冲液B调节pH至7,使用管式离心机进行离心,转速15000rpm,温度10℃,离心时间30min,离心收集上清液。
其中,缓冲液B由15mL 0.4M柠檬酸、15mL 0.3M盐酸、15mL 0.5M三羟甲基氨基甲烷和55mL 0.58M氯化钠配制而成,pH4.2。
(3)上清液使用正压-钟罩式二联过滤,先用含量为处理液7.5%的填料进行预先处理,填料成分为珍珠岩:硅藻土:纤维素=1:1:1,经过90%(v/v)的乙醇提前浸泡12h。加入上清液后,缓慢调节空压机进气口使压力稳定在0.5Mpa。去除大分子基因组80%和蛋白78%。
(4)打开不锈钢管阀门,使上述正压过滤清液流入钟罩式过滤器,过滤柱为0.45μm孔径和100KD孔径串联,纤维素滤芯,调节压力使压力稳定在0.05Mpa,过滤期间不停通气干燥,洗脱得到滤液,去除大分子基因组98%和蛋白99%。
(5)将上述钟罩式过滤液使用乙醇梯度沉淀,2000rpm低速搅拌,设置蠕动泵流速为20%添加无水乙醇,至乙醇终浓度20%(v/v),使用管式离心机进行离心,转速12000rpm,温度4℃,离心30min,收集上清。去除盐离子93%和小分子蛋白87%。
(6)上清放置于15℃过夜,待表面形成胶冻状,继续1000rpm低速搅拌,设置蠕动泵流速为30%添加无水乙醇,至乙醇终浓度80%(v/v),使用管式离心机转速13000rpm,温度4℃,离心50min,收集沉淀。去除盐离子99%和小分子蛋白99%。小菜蛾dsRNA含量提高至98.5%。
对小菜蛾dsRNA提纯的沉淀进行检测,结果见图2。小菜蛾dsRNA保留时间在10.743min,峰形对称,纯度高。
实施例3马铃薯甲虫dsRNA粗提液的提纯
(1)对表达马铃薯甲虫可溶性NSF附着蛋白snap基因的dsRNA重组大肠杆菌破壁得到的dsRNA粗提液进行水浴和超声预处理,使用缓冲液A调节pH至9,使用管式离心机进行离心,转速13000rpm,温度0℃,离心30min,离心收集上清液。其中,缓冲液A由40mL 0.05M碳酸氢钠、20mL 0.05M四硼酸钠和40mL 0.5M氯化钠配制而成,pH8.5。
(2)使用缓冲液B调节pH至5,使用管式离心机转速15000rpm,温度0℃,离心时间30min,离心收集上清液。
其中,缓冲液B由12mL 0.3M柠檬酸、15mL 0.15M盐酸、20mL 0.15M三羟甲基氨基甲烷和43mL 0.25M氯化钠配制配制而成,pH4。
(3)上清液使用正压-钟罩式二联过滤,先用含量为处理液10%的填料进行预先处理,填料成分为珍珠岩:硅藻土:纤维素=1:2:1,经过50%(v/v)的乙醇提前浸泡24h。加入上清液后,缓慢调节空压机进气口使压力稳定在0.5Mpa。去除大分子基因组83%和蛋白82%。
(4)打开不锈钢管阀门,使上述正压过滤清液流入钟罩式过滤器,过滤柱为过滤柱为0.22μm孔径和30KD孔径串联,纤维素滤芯,调节压力使压力稳定在0.1Mpa,过滤期间不停通气干燥,洗脱得到滤液,去除大分子基因组99%和蛋白99%。
(5)将上述钟罩式过滤液使用乙醇梯度沉淀,1500rpm低速搅拌,设置蠕动泵流速为25%添加无水乙醇,至乙醇终浓度10%(v/v),使用管式离心机进行离心,转速12000rpm,温度0℃,离心30min,收集上清。去除盐离子90%和小分子蛋白86%。
(6)上清放置于5℃过夜,待表面形成胶冻状,继续1500rpm低速搅拌,设置蠕动泵流速为10%添加无水乙醇,至乙醇终浓度60%(v/v),使用管式离心机进行离心,转速15000rpm,温度0℃,离心40min,收集沉淀。去除盐离子99%和小分子蛋白99%,马铃薯甲虫dsRNA含量提高至98.5%。
对马铃薯甲虫dsRNA提纯的沉淀进行检测,结果见图3。马铃薯甲虫dsRNA保留时间在10.743min,峰形对称,纯度高。
实施例4
替换钟罩式过滤中的滤芯为折叠式PP滤芯,其余操作同实施例1。
对比例1
(1)对表达TMV外壳蛋白cp基因的dsRNA重组大肠杆菌破壁得到的dsRNA粗提液进行水浴和超声预处理,使用缓冲液A调节pH至8,使用管式离心机,转速13000rpm,温度10℃,离心20min,离心收集上清液。其中,缓冲液A由40mL 0.1M碳酸氢钠和60mL 0.5M氯化钠配制而成,pH8.8。
(2)使用缓冲液B调节pH至6,使用管式离心机进行离心,转速15000rpm,温度5℃,离心时间20min,离心收集上清液。其中,缓冲液B由10mL 0.15M柠檬酸、20mL 0.18M盐酸、10mL 0.22M三羟甲基氨基甲烷和60mL 0.62M氯化钠配制而成,pH4.5。
(3)上清液使用正压-钟罩式二联过滤,先用含量为处理液5%的填料进行预先处理,填料成分为珍珠岩:硅藻土:纤维素=1:1:2,经过70%(v/v)的乙醇提前浸泡12h。加入上清液后,缓慢调节空压机进气口使压力稳定在0.4Mpa,过滤期间不停通气干燥,洗脱得到滤液。
(4)打开不锈钢管阀门,使上述正压过滤滤液流入钟罩式过滤器,过滤柱为0.22μm孔径,纤维素滤芯,调节压力使压力稳定在0.1Mpa。其中,正压过滤装置与钟罩式过滤装置通过专用的不锈钢管连接,整套装置通过空压机提供驱动力,省去了钟罩式过滤用到的蠕动泵,且过程密闭降低操作中可能的污染。
(5)将上述钟罩式过滤液使用乙醇梯度沉淀,2000rpm低速搅拌,设置蠕动泵流速为蠕动泵全速的30%添加无水乙醇,至乙醇终浓度30%(v/v),使用管式离心机进行离心,转速10000rpm,温度4℃,离心20min,收集上清。
(6)上清放置于10℃过夜,待表面形成胶冻状,继续1000rpm低速搅拌,设置蠕动泵流速为20%添加无水乙醇,至乙醇终浓度70%(v/v),使用管式离心机转速15000rpm,温度4℃,离心40min,收集沉淀。
对比例2
填料未经醇溶液浸泡,其余操作同实施例1。
对比例3
(1)对表达TMV外壳蛋白cp基因的dsRNA重组大肠杆菌破壁得到的dsRNA粗提液进行水浴和超声预处理,使用缓冲液A调节pH至8,使用管式离心机,转速13000rpm,温度10℃,离心20min,离心收集上清液。其中,缓冲液A由60mL 0.15M碳酸氢钠、20mL 0.014M四硼酸钠和20mL 0.48M氯化钠配制而成,pH8.5。
(2)使用缓冲液B调节pH至6,使用管式离心机进行离心,转速15000rpm,温度5℃,离心时间20min,离心收集上清液。其中,缓冲液B由20mL 0.15M盐酸、10mL 0.2M三羟甲基氨基甲烷和70mL 0.62M氯化钠配制而成,pH4.0。
(3)上清液使用正压-钟罩式二联过滤,先用含量为处理液5%的填料进行预先处理,填料成分为珍珠岩:硅藻土:纤维素=1:1:2,经过70%(v/v)的乙醇提前浸泡12h。加入上清液后,缓慢调节空压机进气口使压力稳定在0.4Mpa,过滤期间不停通气干燥,洗脱得到滤液。
(4)打开不锈钢管阀门,使上述正压过滤滤液流入钟罩式过滤器,过滤柱为0.22μm孔径,纤维素滤芯,调节压力使压力稳定在0.1Mpa。其中,正压过滤装置与钟罩式过滤装置通过专用的不锈钢管连接,整套装置通过空压机提供驱动力,省去了钟罩式过滤用到的蠕动泵,且过程密闭降低操作中可能的污染。
(5)将上述钟罩式过滤液使用乙醇梯度沉淀,2000rpm低速搅拌,设置蠕动泵流速为蠕动泵全速的30%添加无水乙醇,至乙醇终浓度30%(v/v),使用管式离心机进行离心,转速10000rpm,温度4℃,离心20min,收集上清。
(6)上清放置于10℃过夜,待表面形成胶冻状,继续1000rpm低速搅拌,设置蠕动泵流速为20%添加无水乙醇,至乙醇终浓度70%(v/v),使用管式离心机转速15000rpm,温度4℃,离心40min,收集沉淀。
对比例4
(1)对表达TMV外壳蛋白cp基因的dsRNA重组大肠杆菌破壁得到的dsRNA粗提液进行水浴和超声预处理,使用缓冲液A调节pH至8,使用管式离心机,转速13000rpm,温度10℃,离心20min,离心收集上清液。其中,缓冲液A由60mL 0.15M碳酸氢钠、20mL 0.014M四硼酸钠和20mL 0.48M氯化钠配制而成,pH8.5。
(2)使用缓冲液B调节pH至6,使用管式离心机进行离心,转速15000rpm,温度5℃,离心时间20min,离心收集上清液。其中,缓冲液B由10mL 0.15M柠檬酸、20mL 0.18M盐酸、10mL 0.22M三羟甲基氨基甲烷和60mL 0.62M氯化钠配制而成,pH4.5。
(3)上清液使用正压-钟罩式二联过滤,先用含量为处理液5%的填料进行预先处理,填料成分为珍珠岩:硅藻土:纤维素=1:1:2,经过70%(v/v)的乙醇提前浸泡12h。加入上清液后,缓慢调节空压机进气口使压力稳定在0.4Mpa,过滤期间不停通气干燥,洗脱得到滤液。
(4)打开不锈钢管阀门,使上述正压过滤滤液流入钟罩式过滤器,过滤柱为0.22μm孔径,纤维素滤芯,调节压力使压力稳定在0.1Mpa。其中,正压过滤装置与钟罩式过滤装置通过专用的不锈钢管连接,整套装置通过空压机提供驱动力,省去了钟罩式过滤用到的蠕动泵,且过程密闭降低操作中可能的污染。
(5)将上述钟罩式过滤液使用乙醇梯度沉淀,2000rpm低速搅拌,设置蠕动泵流速为蠕动泵全速的30%添加无水乙醇,至乙醇终浓度60%(v/v),使用管式离心机进行离心,转速10000rpm,温度4℃,离心20min,收集上清。
(6)上清放置于10℃过夜,待表面形成胶冻状,继续1000rpm低速搅拌,设置蠕动泵流速为20%添加无水乙醇,至乙醇终浓度70%(v/v),使用管式离心机转速15000rpm,温度4℃,离心40min,收集沉淀。
对实施例1-4和对比例1-4提纯的dsRNA进行检测,结果如表1所示:
表1实施例和对比例提纯的dsRNA纯度和产率
从表1中可看出,实施例的整体纯度和收率均明显高于对比例,可见缓冲体系、过滤方式、过滤材料、醇浓度梯度等都对提纯方法有着至关重要的影响,发明人经过无数次的尝试,最终确定了较优的工艺和材料,其有机配合、相辅相成,实现dsRNA的高效提纯,且具有较高的收率,进一步地,实施例1得到的dsRNA纯度与其余实施例相当,但收率得到明显提升。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例,本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换,均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
Claims (10)
1.一种提取dsRNA的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)将生物体或组织粉碎,得到粗提液,使用缓冲液A调节粗提液pH至7-10,离心收集上清液;其中,所述缓冲液A的组成为:(i)碳酸氢钠、碳酸钠、氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钙、碳酸氢钠或磷酸氢二钾,(ii)四硼酸钠、盐酸、硼酸、氯化钾、氢氧化钠或柠檬酸,以及(iii)氯化钠、三羟甲基氨基甲烷、盐酸、巴比妥酸或二甲亚砜;
(2)使用缓冲液B调节步骤(1)所得上清液pH至4-7,离心收集上清液;其中,缓冲液B的组成为:(i)醋酸、磷酸、柠檬酸、乙酸、硫酸铵、氯化铵或磷酸二氢钾,(ii)四硼酸钠、盐酸、硼酸、氯化钾、氢氧化钠或柠檬酸,以及(iii)氯化钠、三羟甲基氨基甲烷、盐酸、巴比妥酸或二甲亚砜;
(3)对步骤(2)所得上清液进行正压过滤,洗脱得到滤液,其中,填料由珍珠岩、硅藻土和纤维素混合得到,所述珍珠岩、硅藻土和纤维素均经过醇溶液浸泡;
(4)将步骤(3)所得滤液进行钟罩式过滤,收集滤液;
(5)将步骤(4)所得滤液进行醇沉,所述醇沉为向滤液中加入醇溶液至终浓度(v/v)为10%-30%,离心收集上清,再加入醇溶液至终浓度(v/v)为50%-80%,离心收集沉淀,得到纯化后的dsRNA。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述缓冲液A的组成为:(i)0.01-0.95M碳酸氢钠、碳酸钠、氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钙、碳酸氢钠或磷酸氢二钾,(ii)0.01-0.95M四硼酸钠、盐酸、硼酸、氯化钾、氢氧化钠或柠檬酸,以及(iii)0.01-0.95M氯化钠、三羟甲基氨基甲烷、盐酸、巴比妥酸或二甲亚砜;pH6.5-9.5。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述缓冲液B的组成为:(i)0.01-0.95M醋酸、磷酸、柠檬酸、乙酸、硫酸铵、氯化铵或磷酸二氢钾,(ii)0.01-0.95M四硼酸钠、盐酸、硼酸、氯化钾、氢氧化钠或柠檬酸,以及(iii)0.01-0.95M氯化钠、三羟甲基氨基甲烷、盐酸、巴比妥酸或二甲亚砜;pH3.5-6.5。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:在步骤(3)中,所述正压过滤的压力为0.1Mpa-0.6Mpa。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:在步骤(3)中,所述醇溶液的浓度(v/v)为50%-90%。
6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:在步骤(4)中,所述钟罩式过滤的压力为0.05Mpa-0.3Mpa。
7.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:在步骤(4)中,钟罩式过滤时滤芯的材质为纤维素。
8.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述醇溶液选自乙醇、丙醇、异丙醇、异丁醇、异戊醇和正丁醇中的一种或几种。
9.权利要求1-8任一项所述的方法提纯得到的dsRNA。
10.权利要求9所述的dsRNA在制备杀虫剂、杀菌剂或抗病毒试剂中的应用。
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