CN115725559A - 一种细胞壁合成相关蛋白ugma及其编码基因与应用 - Google Patents

一种细胞壁合成相关蛋白ugma及其编码基因与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种细胞壁合成相关蛋白UGMA及其编码基因与应用，属于生物技术领域。细胞壁合成相关蛋白UGMA或编码该蛋白的基因的应用，包括如下任一项：在降低植物真菌病原致病力方面的应用；在抑制植物真菌病原生长发育方面的应用；在筛选和/或制备UGMA蛋白抑制剂方面的应用；在筛选和/或制备植物真菌病害药物方面的应用；所述UGMA的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明通过敲除病原菌中的ugmA基因，获得ugmA基因缺失突变体，发现其生长及致病能力受到严重抑制，细胞壁异常增厚。本发明还通过虚拟筛选获得靶向化合物，为绿色农药的研发提供了新的途径。

Description

一种细胞壁合成相关蛋白UGMA及其编码基因与应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种细胞壁合成相关蛋白UGMA及其编码基因与应用。
背景技术
小麦赤霉病是全球温暖潮湿地区广泛流行的毁灭性真菌病害，也是我国小麦生产上的最重要病害之一，包括江苏省在内的长江中下游冬麦区是我国小麦赤霉病的多发区和重发区。除了造成严重的产量和经济损失，发病籽粒积累的脱氧雪腐镰刀菌烯醇等真菌毒素可在食物链中长期存留，引起人畜中毒，导致严重的食品安全问题。如何有效控制赤霉病的发生和流行是当前亟待解决的重大生产问题。
目前小麦赤霉病的防控主要依靠化学防治，可供选用的杀菌剂主要限于戊唑醇、氰烯菌酯、氟唑菌酰羟胺和多菌灵等。由于长期大量用药，病原菌对常规杀菌剂的抗药性和耐药性问题日益显现。同时药剂连续大量使用带来的农药残留、水生态污染、食品安全等问题愈发严峻。天然产物在临床药物研发中具有不可忽视和无法替代的地位。鉴于天然产物低毒、环境友好等特征，目前也越来越受到杀菌剂研发领域的重视。发掘安全有效的天然产物继而开发成高效、无毒的生物农药将具有良好的可持续发展前景。
目前病原真菌蛋白作为药物靶标数量极少，具有药敏性高、相对安全的杀菌剂分子靶标更是屈指可数，导致小麦赤霉病及其他重大病害缺少新型绿色农药，因此探索新的潜在安全靶标具有重要意义。真菌细胞壁是真菌特有的细胞表面结构，主要成分包括β-葡聚糖、几丁质和甘露糖蛋白等，通过抑制或者干扰这些组分的合成能够有效的抑制和杀死真菌，由于哺乳动物没有细胞壁，植物具有细胞壁但组分与真菌细胞壁差异很大，因此真菌细胞壁合成相关蛋白是十分理想的安全药剂靶标。
发明内容
本发明的目的是提供一种细胞壁合成相关蛋白UGMA及其编码基因与应用，以解决上述现有技术存在的问题，UGMA蛋白作为药物研发的分子靶标，为真菌病害绿色药物研发提供基础。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种细胞壁合成相关蛋白UGMA的应用，所述应用包括如下任一项：
(1)在降低植物真菌病原致病力方面的应用；
(2)在抑制植物真菌病原生长发育方面的应用；
(3)在筛选和/或制备防治UGMA蛋白抑制剂方面的应用；
(4)在筛选和/或制备防治植物真菌病害药物方面的应用；
所述UGMA的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示：
MANTNVDVLVIGMGPTGLGAAKRLNHINGPSWLIVDSSDKAGGLASTDTTPEGFLYDVGGHVIFSHYKYFDDCIDEALPKDDDWYTHQRISYVRYKGLWVPYPFQNNISMLPKEDQVDCIEGIIDSALECRVANTKPKDFDEWIVRMMGEGIANIFMRPYNYKVWAVPTKKMQCQWLGERVAAPDAKLVTKNVILNKVAGNWGPNATFRFPARDGTGGIWIAVAETIPKEKKRFGKQGEVTKIDGEKKIAYFADGSTISYNKLVNTMAVDHLAEKLGNQELMTLTKQLYYSTTHVIGVGIRGERPERIGDKCWLYFPEDNCPFYRATIFSNYSPYNQPQKDAKLPTLYLANGEKAASSEAKEGPYWSIMLEVSQSTMKPVDVENLLKDSIQGLINTEMIKPEDEIVSTYHRAFDHGYPTPTLEREGVLKQVLPKLESMDILSRGRFGSWRYEVGNQDHSFMLGVEAVDAIHSGAVELTLNYPDFVNSRQNTERRLTQNFVFSTPQTNGIPSHSKAQ。
本发明还提供编码所述的UGMA的基因的应用，所述应用包括如下任一项：
(1)在降低植物真菌病原致病力方面的应用；
(2)在抑制植物真菌病原生长发育方面的应用；
(3)在筛选和/或制备防治UGMA蛋白抑制剂方面的应用；
(4)在筛选和/或制备防治植物真菌病害药物方面的应用；
所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示：
ATGGCCAATACGTGAGTTGCCCTCCTCAGCCTGTCGTTGCGATTGATCGATGGCAACGCTCGCCACGATAGGCTTTCTGTTGTTCAACAGAGTTTACTGACTTTTATGCTTTTTCAGTAACGTCGATGTCCTCGTTATTGGCATGGGACCTACTGGTCTCGGTGCTGCCAAGCGTCTCAACCACATTGTATGCCCTCACCGCCACCTCTAACAAGAGGCAAGAATCTCAACTGACGATGTATACAGAACGGCCCTTCATGGCTGATTGTCGACTCTTCTGACAAGGCTGGTGGTCTTGCCAGCACTGACACCACCCCCGAGGGTTTCGTAAGTTGTTGCTGGTAAATCTTGTTTGAAAACTTTGTGCTAACCTGAATTTTTTCCAGCTCTACGATGTCGGTGGCCACGTTATCTTCTCCCACTACAAGTACTTCGACGACTGCATCGACGAGGCTCTCCCCAAGGATGATGACTGGTACACCCACCAGCGAATCTCCTACGTTCGCTACAAGGGCCTCTGGGTTCCTTACCCCTTCCAGAACAACATCTCCATGCTCCCCAAGGAGGACCAGGTCGACTGCATCGAGGGTATCATTGACTCTGCTCTCGAGTGCCGTGTTGCCAACACCAAGCCCAAGGACTTTGACGAGTGGATTGTGCGCATGATGGGTGAGGGAATTGCCAACATCTTCATGCGACCTTACAACTACAAGGTCTGGGCCGTTCCCACCAAGAAGGTACGCTATCATGCCCCATGGAGAAGACGGTGAAGGCGGTGTACTAACAAGCTGCAGATGCAATGCCAGTGGCTCGGTGAGCGTGTCGCCGCTCCTGACGCTAAGCTTGTTACCAAGAACGTTATCCTCAACAAGGTTGCCGGTAACTGGGGCCCCAACGCTACCTTCCGATTCCCCGCCCGTGATGGTACCGGTGGTATCTGGATCGCTGTCGCCGAGACCATCCCCAAGGAGAAGAAGCGATTCGGCAAGCAGGGTGAGGTTACCAAGATTGACGGCGAGAAGAAGATTGCCTACTTCGCCGACGGTAGCACCATCAGCTACAACAAGCTTGTCAACACCATGGCTGTTGACCACCTCGCCGAGAAGCTCGGTAACCAGGAGCTCATGACCCTCACCAAGCAGCTCTACTACTCTACCACTCACGTCATTGGTGTCGGTATCCGAGGTGAGCGCCCTGAGCGCATCGGTGACAAGTGCTGGTTGTACTTCCCTGAGGACAACTGCCCCTTCTACCGTGCCACCATCTTCTCCAACTACTCCCCCTACAACCAGCCTCAGAAGGACGCCAAGCTTCCTACTCTCTACCTTGCCAACGGTGAGAAGGCTGCTTCTTCCGAGGCTAAGGAGGGTCCTTACTGGTCCATCATGCTCGAGGTTTCTCAGTCTACCATGAAGCCTGTCGATGTTGAGAACCTCCTCAAGGACAGCATCCAGGGTCTTATCAACACCGAGATGATCAAGCCCGAGGACGAGATCGTCTCCACCTACCACCGTGCTTTCGACCACGGTTACCCCACCCCCACTCTCGAGCGTGAGGGCGTCCTCAAGCAGGTCCTCCCCAAGCTCGAGTCCATGGACATCCTCTCCCGTGGCCGCTTCGGCAGCTGGCGATACGAGGTTGGTAACCAGGACCACTCCTTCATGCTCGGTGTTGAGGCTGTCGATGCCATCCACAGCGGTGCTGTCGAGCTGACCCTCAACTACCCCGACTTCGTCAACTCCCGCCAGAACACTGAGCGTCGTCTCACCCAGAACTTCGTTTTCAGCACTCCTCAGACCAACGGGATCCCCAGCCACTCCAAGGCCCAGTAA。
优选的是，通过抑制UGMA蛋白的表达或敲除ugmA基因，降低植物真菌病原致病力。
优选的是，所述植物真菌病原包括镰刀菌属的病原菌。更优选的是，镰刀菌属的病原菌包括禾谷镰刀菌(小麦赤霉病的病原菌)和假禾谷镰刀菌(小麦茎基腐病的病原菌)。
优选的是，所述抑制植物真菌病原生长发育包括抑制植物真菌病原的细胞壁结构形成、生长速度以及产孢量。
优选的是，所述植物包括禾本科植物。
优选的是，所述禾本科植物包括小麦。
优选的是，所述植物真菌病害包括小麦赤霉病和小麦茎基腐病。
本发明还提供一种培育降低植物真菌病原致病力的转基因植物的方法，包括向受体植物中转入真菌病原ugmA基因的dsRNA片段，构建降低植物病原真菌致病力的转基因植物；所述ugmA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
优选的是，所述真菌病原包括镰刀菌属的病原菌；所述受体植物包括小麦。
本发明公开了以下技术效果：
基于UDP-Galf是真菌中普遍存在但动植物中没有的五元环呋喃糖，参与真菌细胞壁的组成，UGMA是合成Galf的关键酶，本发明以之为靶标筛选相对安全的天然产物库，获得了能与UGMA结合的天然产物分子。本发明通过实验验证了，UGMA作为靶标蛋白，通过敲除ugmA基因抑制其蛋白的表达，可以显著的降低植物真菌病原致病力，提高植物抗真菌病原侵染的能力。
本发明通过在相对安全的天然产物库中寻找该靶标蛋白的抑制剂，并且提供了虚拟筛选获得的候选靶向化合物。这种基于真菌特有的安全靶标与低毒的天然产物“双保险”条件下进行有效筛选，对人畜和环境友好药剂的开发方面具有重要意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为敲除盒构建示意图；
图2为透射电镜观察标准菌株PH-1和突变体ΔugmA细胞壁结构；
图3为以烟曲霉(Aspergillus fumigatus)AfUGMA的晶体结构(PDB ID:3UKL)为模板，利用SWISS-MODEL构建禾谷镰刀菌UGMA的3D模型；
图4为禾谷镰刀菌UGMA与PDB ID:3UKL的结构重叠图；
图5为虚拟筛选得到的代表性化合物与UGMA的结合模式；
图6为初筛得到的474个小分子化合物聚类信息和指纹图谱；
图7为虚拟筛选得到的化合物与UGMA相互作用的指纹图谱(A)和相互作用关键氨基酸占比分析(B)。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
UGMA及其同源蛋白在丝状真菌中较为保守，本发明对所述真菌的种类不做具体限定，适用于所有种类的丝状真菌病害。优选为包括由镰刀菌属引起的植物病害。本发明对所述由镰刀菌属引起的植物病害的种类不做特殊限制，选择本领域所熟知的由镰刀菌属引起的植物病害的种类即可，例如小麦赤霉病(病原菌为禾谷镰刀菌)和/或小麦茎基腐病(病原菌为假禾谷镰刀菌)等。下面以具体的实施例对UGMA的功能做进一步说明。
实施例1
为了明确UGMA蛋白的生物学功能，通过基因敲除的方法构建敲除盒，转入禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)中，观察镰刀菌的生物性状的变化。
(1)禾谷镰刀菌ugmA基因敲除盒的构建方法
根据EnsemblFungi数据库下载FGSG_05997基因序列，采用同源重组的方法(参考Catlett et al.,2003；Split-Marker recombination for efficient targeteddeletion of fungal genes)构建ugmA基因敲除盒(如图1所示)，利用A1F和A1R引物扩增ugmA基因编码区上游A，用B1F和B1R引物扩增目的ugmA基因编码区的下游B。利用H1F和H2F引物扩增潮霉素基因编码区上游H1，用H2F和H2R引物扩增潮霉素基因编码区的下游H2。
A1F：ATGGAGTAAGCGGTGACGA(SEQ ID NO:3)；
A1R：TTGACCTCCACTAGCTCCAGCCAAGCCAGTGGAGCGACTGGAAAGA(SEQ ID NO:4)；
B1F：GAATAGAGTAGATGCCGACCGCGGGTTATTGAGTTGGGCACGTTGT(SEQ ID NO:5)；
B1R：CCTTCCTGTCCATCCCTTT(SEQ ID NO:6)；
H1F：GGCTTGGCTGGAGCTAGTGGAGGTCAA(SEQ ID NO:7)；
H1R：GTATTGACCGATTCCTTGCGGTCCGAA(SEQ ID NO:8)；
H2F：GATGTAGGAGGGCGTGGATATGTCCT(SEQ ID NO:9)；
H2R：AACCCGCGGTCGGCATCTACTCTATTC(SEQ ID NO:10)。
利用引物A1F和H1R、H2F和B1R运用重叠PCR的方法(参见现有技术：The CHY-TypeZinc Finger Protein FgChy1 Regulates Polarized Growth,Pathogenicity,andMicrotubule Assembly in Fusarium graminearum)分别将A和H1、B和H2融合。
重叠PCR反应体系(25μL)：
第一步：2×Phanta Max Buffer 12.5μL，A(B)和H1(H2)片段各100ng，补水至25μL。
第二步：2×Phanta Max Buffer 12.5μL，引物A1F(H2F)和H1R(B1R)各1μL，补水至25μL。
重叠PCR程序：
第一步：95℃预变性3min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸2min，15个循环，72℃充分延伸10min，15℃保持；
第二步：95℃预变性3min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸2min，35个循环，72℃充分延伸10min，15℃保持。
获得的融合片段AH1和BH2用于原生质转化。
(2)原生质体转化的方法：
将禾谷镰刀菌标准菌株PH-1在PDA培养基(马铃薯200g煮沸过滤去渣，葡萄糖20g，琼脂15g，纯水定容至1L，高温高压灭菌)上培养2-3天，取新鲜菌块于CMC培养基(羧甲基纤维素钠15g，NH4NO3 1g，KH2PO3 1g，MgSO4·7H2O 0.5g，酵母提取物1g，纯水定容至1L，高温高压灭菌)摇培5-7天诱导产孢，过滤孢子转移至YEPD培养基(酵母提取物3g，蛋白胨10g，葡萄糖20g，纯水定容至1L，高温高压灭菌)中，过夜培养12～14h。用尼龙膜过滤，用0.7M NaCl溶液冲洗并收集菌丝。用10mL细胞壁裂解混合液(0.15g裂解酶，0.5g崩溃酶，0.7M NaCl溶液配制，3000rpm离心10min，取上清)酶解菌丝，置于摇床中30℃、100rpm裂解2h。再用3层擦镜纸过滤裂解液，收集滤液1500rpm条件下离心5min。弃上清，然后用10mL 0.7M NaCl溶液轻悬浮，1500rpm条件下离心5min弃上清，STC溶液悬浮沉淀，调原生质体终浓度至1.5×107个/mL。将200μL原生质体悬浮液、10μg制备的ugmA基因重叠片段，轻轻混匀，冰上静置20min；加入1mL PTC溶液，混匀，25℃静置20min；加入15mL TB3培养基(酵母提取物3g，酸水解酪蛋白3g，蔗糖200g)，纯水定容至1L，高温高压灭菌)，25℃复苏培养过夜，第二天将此混合液加入到100mL冷却至45℃的含潮霉素的TB3固体培养基(酵母提取物3g，酸水解酪蛋白3g，蔗糖200g，琼脂16g)中，摇匀倒平板，25℃培养3天，待长出菌落。
(3)通过4对引物进行PCR验证ugmA基因缺失菌株
挑取抗性平板上长出的单个菌落转接到含有300μg/mL潮霉素平板上。选择能够在含有潮霉素平板上生长的转化子，提取其DNA。
四对引物分别是目的基因、目的基因上游、目的基因下游、潮霉素片段，均以转化子的基因组DNA为模板。
目的基因的验证：
引物TF和TR，PH-1作为对照，通过PCR扩增ugmA基因片段，扩增不出条带的即为正确的转化子，进行下一步潮霉素序列及上下游序列的验证。
TF：CCCGAGGGTTTCGTAAGTT(SEQ ID NO:11)；
TR：AGATGGTGGCACGGTAGAA(SEQ ID NO:12)。
潮霉素基因验证：引物HsF和HsR，以载体pCB1003作为对照，通过PCR扩增潮霉素基因片段，扩增出条带且大小正确的即为正确的转化子，进行下一步上下游序列的验证。
HsF：TTGTCCGTCAGGACATTGTT(SEQ ID NO:13)；
HsR：AACTCACCGCGACGTCTGTC(SEQ ID NO:14)；
上下游片段的验证：引物UpF和UpR(上游)，DownF和DownR(下游)，PH-1作为对照，通过PCR扩增有条带且条带大小正确的即为阳性转化子。
UpF：GGAAATTACAAACAACGCTC(SEQ ID NO:15)；
UpR：GCTGATCTGACCAGTTGC(SEQ ID NO:16)；
DownF：GTCGATGCGACGCAATCGT(SEQ ID NO:17)；
DownR：GGATCATCTTGGCCCTGTT(SEQ ID NO:18)。
以上检测PCR反应总体系25μL：DNA模板0.6μL，2×Taq PCRbuffer 12.5μL，正反向引物各0.6μL，加水到25μL(PCR反应所用试剂购自诺唯赞生物科技股份有限公司)。PCR反应条件为：95℃20s，56℃30s，72℃2min，35个循环；72℃延伸10min。
获得PCR检测的阳性转化子两个及以上生物学表型完全一致，表明已经得到正确的禾谷镰刀菌ugmA基因缺失菌株ΔugmA。
(4)ΔugmA突变体细胞壁结构观察
接种突变体菌株ΔugmA和标准菌株PH-1于PDA平板，25℃培养3天，取菌丝块接种CMC产孢培养基内25℃摇培5天，过滤孢子并转移至YEPD培养基，孢子萌发培养20个小时，收集菌丝，根据现有技术首先将菌丝固定在2.5％戊二醛溶液中，超纯水清洗三次，每次10min，用1％的锇酸固定2h，超纯水清洗三次，每次10min，用50％、70％、80％、90％丙酮分别梯度脱水，每次15min，用纯丙酮脱水三次，每次30min，用纯丙酮：环氧树脂按照3：1(1h)，1：1(3h)，1：3(过夜)置换，使用纯树脂包埋样品，包埋板放入烘箱按照37℃，45℃，60℃分别浸渍24h，24h，48h，使用Leica EM UC7超薄切片机制成超薄切片，经磷钨酸-醋酸铀双染色后使用日立H-7650透射电子显微镜观察。
结果如图2所示，与标准菌株PH-1相比，ugmA基因的缺失严重限制病原菌的生长速度，同时缺失突变体ΔugmA细胞壁增厚、几乎丧失侵染扩展能力。因此，证明UGMA参与病原菌的细胞壁构成，在生长及侵染过程中起到至关重要的作用，可以用于抑制真菌特有组织发育，通过抑制UGMA蛋白防治植物真菌病害。
(5)ΔugmA生长能力测定试验
接种突变体菌株ΔugmA和标准菌株PH-1于PDA平板，25℃培养3天，在菌落的边缘取相同大小的菌碟，将菌碟接种在PDA、CM培养基(葡萄糖10g，蛋白胨2g，酵母提取物1g，酸水解酪蛋白1g，NaNO3 6g，KCl 0.5g；MgSO4·7H2O 1.023g，KH2PO4 0.5g；纯水定容至1L，琼脂粉15g，高温高压灭菌后常温保存)平板上25℃培养3天。
结果如表1所示，突变体ΔugmA在PDA、CM培养基上的生长严重受限，证明UGMA的缺失导致真菌生长发育停滞，可以用于抑制病原菌的生长发育。
(6)测定禾谷镰刀菌ΔugmA突变体的致病能力
突变体菌株ΔugmA和标准菌株PH-1在25℃条件下培养3天，取菌丝块至产孢培养基中培养3天，收集孢子，用无菌水重悬孢子并调孢子浓度到2×105个/mL。通过单花滴柱将孢子液接种至杨花的小麦穗部，套袋保湿48h，待15天后统计发病结果。
结果如表1所示，ΔugmA突变体仅在接种点表现出轻微的症状，而同等情况下PH-1已经扩展3/4麦穗；证明UGMA的缺失会显著降低病原菌的侵染能力，可以用于抑制病原真菌的致病力和防治植物病害。
表1ugmA基因的缺失对生长、产孢及致病力的影响
Figure BDA0003907024370000091
实施例2
本实施例为解析UGMA的蛋白三维结构，通过计算机辅助虚拟筛选获得以UGMA蛋白为把标的候选抑制剂，这些候选抑制剂来自于天然产物库。
一、UGMA三维结构预测
以烟曲霉AfUGMA与抑制剂UDP结合的三维结构(PDB ID:3UKL)为模板，利用SWISS-MODEL构建了禾谷镰刀菌UGMA的3D模型(如图3所示)，两者有79％同源性，证明该模型具有一定的可靠性。
鉴于两个蛋白的高同源性，本发明根据结构重叠(如图4所示)首次提供了禾谷镰刀菌UGMA结合UDP的关键氨基酸位点。
二、以UDP结合位点作为虚拟筛选口袋进行靶向化合物虚拟筛选
从SWISS-MODEL数据库下载预测的UGMA的三维结构，使用Schrodinger的Maestro软件对靶点结构进行准备。加氢，采用PROPKA方法在pH 7.0下进行质子化及氢键优化，用OPLS3力场进行限制性能量优化，使重原子的RMSD收敛于
Figure BDA0003907024370000101
根据上述的分析，定义抑制剂UDP的结合位点为虚拟筛选位点，关键氨基酸包括VAL93，TYR102，PHE104，GLN105，PHE156，MET157，TYR160，ASN161，TRP165，TRP176，ARG180，AL181，TYR315，ARG325，TYR417，TYR451等，用于后续虚拟筛选。
小分子化合物库购买自上海筛杰生物医药有限公司。使用Maestro的LigPrep模块在OPLS3力场下对化合物库进行准备。采用Epik方法在pH 7.0±2.0条件下进行质子化，去盐，生成互变异构体，保持原有原子手性。为了保证虚拟筛选过程中小分子全局构象，对小分子进行构象生成，每个小分子最多生成32个构象。将准备好的化合物库保存，用于后续虚拟筛选。
虚拟筛选在安装CentOS 6.4操作系统的服务器(CPU:64,Memory：64G)上进行，利用Schrodinger 2015-3软件的Maestro中Virtual Screening Workflow模块进行UGMA(禾谷镰刀菌中基因编号：FGRAMPH1_01T19255)抑制剂的虚拟筛选。导入上述准备好的UGMA三维结构和小分子化合物库，采用step-wise strategy(即HTVS[高通量虚拟筛选模式]→SP[标准精度模式]→XP[超高精度模式])的精确度逐步提高的三步筛选模式，每步都采用小分子柔性对接方式，对接后进行能量优化，每步保留对接打分前40％的小分子进入下一轮筛选。最后保留打分值小于-13.0的分子进行分析。
通过计算UGMA和小分子化合物基于结合能的对接打分，得到L6020和L6030数据库中对接打分＜-13.0的分子474个。以代表性化合物为例获得结合模式图(如图5所示)。
计算474个分子的分子量、水溶性、氢键受供体数量、成药可能性，并使用FCFP_6算法计算每个小分子的指纹图谱并进行多样性分类，计算得到20个分类(如图6所示)，包含474个小分子的指纹图谱和聚类信息。
通过MOE软件的蛋白-配体相互作用指纹图谱PLIF计算虚拟筛选得到的分子与FGRAMPH1_01T19255的结合指纹图谱。由图7可知，虚拟筛选得到的小分子与FGRAMPH1_01T19255相互作用的主要氨基酸残基包括Tyr102，Phe104，Gln105，Arg180，Asn205，Arg325，Tyr417和Tyr451。因此，人工筛选时，综合考虑小分子的聚类信息及与受体的作用模式，优先保留与Tyr102，Phe104，Gln105，Arg180，Asn205，Arg325，Tyr417和Tyr451形成氢键作用、盐键作用、疏水作用等的化合物。
为保证多样性和后续实验的顺利进行，我们从筛选出的每类化合物中选择亲和力相对较高且与Tyr102，Phe104，Gln105，Arg180，Asn205，Arg325，Tyr417和Tyr451有多种关键作用的化合物，最终获得200个理论上具有靶向FGRAMPH1_01T19255的候选化合物(表2)，待后续实验验证，其结构、ID号、聚类、对接打分等信息如表2所示。
表2UGMA虚拟筛选获得的候选化合物
Figure BDA0003907024370000111
Figure BDA0003907024370000121
Figure BDA0003907024370000131
Figure BDA0003907024370000141
Figure BDA0003907024370000151
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种细胞壁合成相关蛋白UGMA的应用，其特征在于，所述应用包括如下任一项：
(1)在降低植物真菌病原致病力方面的应用；
(2)在抑制植物真菌病原生长发育方面的应用；
(3)在筛选和/或制备UGMA蛋白抑制剂方面的应用；
(4)在筛选和/或制备防治植物真菌病害药物方面的应用；
所述UGMA的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.编码如权利要求1中所述的细胞壁合成相关蛋白UGMA的基因的应用，其特征在于，所述应用包括如下任一项：
(1)在降低植物真菌病原致病力方面的应用；
(2)在抑制植物真菌病原生长发育方面的应用；
(3)在筛选和/或制备UGMA蛋白抑制剂方面的应用；
(4)在筛选和/或制备防治植物真菌病害药物方面的应用；
所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，通过抑制UGMA蛋白的表达或敲除ugmA基因，降低植物真菌病原致病力。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述植物真菌病原包括镰刀菌属的病原菌。
5.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述抑制植物真菌病原生长发育包括抑制植物真菌病原的细胞壁结构形成、生长速度以及产孢量。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述植物包括禾本科植物。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述禾本科植物包括小麦。
8.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述植物真菌病害包括小麦赤霉病和小麦茎基腐病。
9.一种培育降低植物真菌病原致病力的转基因植物的方法，其特征在于包括向受体植物中转入真菌病原ugmA基因的dsRNA片段，构建降低植物病原真菌致病力的转基因植物；所述ugmA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述真菌病原包括镰刀菌属的病原菌；所述受体植物包括小麦。
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