CN103842499A - 产量增加的疫霉抗性马铃薯的开发 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及具有增加的致病疫霉(Phytophthora infestans)抗性并且与野生型马铃薯植物相比马铃薯块茎产量相当的转基因马铃薯植物，其中blb1基因和blb2基因被整合到马铃薯植物中的特定遗传背景之中。
Description
本发明涉及具有增加的致病疫霉(Phytophthora infestans)抗性并且与野生型马铃薯植物相比马铃薯块茎产量相当的转基因马铃薯植物，其中blb1基因和blb2基因在特定的遗传背景下被整合到马铃薯植物中。
由卵菌致病疫霉引起的晚疫病是全世界马铃薯生产最严重的威胁之一。尽管多年来一直在进行抗性育种，但是防止作物欠收或产量降低的唯一有效的方法是应用预防或治愈致病疫霉感染的杀菌剂。由于晚疫病的疾病发展极快，因此执行严密的杀菌剂方案是必需的，其必须在第一次症状出现之前即开始。此外，致病疫霉似乎对于适应特定的杀菌剂并且发展出抗性具有很高的潜能，如在甲霜灵-杀菌剂的案例中所见(Gisi U，Cohen Y(1996)Resistance to phenylamide fungicides：A case study withPhytophthora infestans involving mating type and race structure Annual RevPhytopathol.34：549-572)。
在一些西欧国家，就特定杀菌剂的应用而言，关于植物保护产品使用的立法变得更具有约束性，这使得疾病的化学控制以及抗性发展的预防更加困难。
杀菌剂使用的备选的和/或补充性方法是开发对致病疫霉具有改良抗性的马铃薯栽培品种。
近年来，通过常规育种开发出含有球栗薯(S.bulbocastanum)衍生抗性的两个马铃薯品种。这两个品种，Toluca和Bionica，都含有赋予针对致病疫霉的全部抗性的单个球栗薯抗性基因。但是从农艺学的角度来看，就产量潜能而言这两个马铃薯品种不符合现代马铃薯品种的标准。
由于将球栗薯衍生抗性渐渗入至现代马铃薯品种中被证实是困难且耗时的，更为有效的方法是分离球栗薯中编码疫霉抗性的基因，并且通过生物技术方法将它们转移至现有的马铃薯栽培品种中。
为了产生持久抗性的马铃薯植物，使Rpi-blb1基因和Rpi-blb2基因在其天然调控元件的控制下组合。所得到的载体构建体包含处于天然Rpi-blb1启动子和Rpi-blb1终止子控制之下的Rpi-blb1基因的基因组序列(这些序列全部衍生自球栗薯)以及处于天然Rpi-blb2启动子和Rpi-blb2终止子控制之下的Rpi-blb2基因的基因组序列(这些序列全部来自球栗薯)(WO2008/034876)。所获得的表达blb1蛋白和blb2蛋白的转基因马铃薯针对致病疫霉显示出增加的抗性。然而，发现所开发的马铃薯植物的产量降低。
本发明的一个目的是提供具有改良的致病疫霉抗性并且与野生型马铃薯产量相当的马铃薯植物。
通过参考本发明优选实施方式的以下详细描述和本文所包括的实施例，可以更容易地理解本发明。除非另有说明，本文所使用的术语将根据相关领域普通技术人员的常规用法进行理解。除了本文所提供的术语定义之外，分子生物学中常见术语的定义也可以在Rieger等人，1991Glossary of genetics：classical and molecular，第5版，Berlin：Springer-Verlag和Current Protocols in Molecular Biology，F.M.Ausubel等人编著，CurrentProtocols，a joint venture between Greene Publishing Associates，Inc.andJohn Wiley & Sons，Inc.，(1998Supplement)中找到。将要理解的是，如在说明书和权利要求中所使用，“一个”可以指一个或多个，取决于其被使用的上下文。因此，例如，“一个细胞”可以是指可以利用至少一个细胞。将要理解的是，本文中所使用的术语仅仅出于描述具体实施方式的目的，其并非意在进行限制。
整个申请中引用了多篇出版物。所有这些出版物以及在那些出版物中所引用的那些参考文献的公开内容在这里作为整体通过引用并入到本申请中，以更完整地描述本发明所属领域的状况。克隆、DNA分离、扩增和纯化的标准技术，涉及DNA连接酶、DNA聚合酶、限制性内切酶等酶促反应的标准技术以及多种分离技术是已知的并且本领域技术人员常用的那些。一些标准技术描述于Sambrook等人，1989Molecular Cloning，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory，Plainview，N.Y.；Maniatis等人，1982Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Laboratory，Plainview，N.Y.；Wu(编著)1993Meth.Enzymol.218，Part I；Wu(Ed.)1979Meth Enzymol.68；Wu等人，(编著)1983Meth.Enzymol.100和101；Grossman和Moldave(编著)1980Meth.Enzymol.65；Miller(编著)1972Experiments inMolecular Genetics，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.；Old和Primrose，1981Principles of Gene Manipulation，University ofCalifornia Press，Berkeley；Schleif和Wensink，1982Practical Methods inMolecular Biology；Glover(编著)1985DNA Cloning Vol.I和II，IRL Press，Oxford，UK；Hames和Higgins(编著)1985Nucleic Acid Hybridization，IRLPress，Oxford，UK以及Setlow和Hollaender1979Genetic Engineering：Principles and Methods，Vols.1-4，Plenum Press，New York.中。当采用缩写和命名时，则被视为是本领域标准的和专业期刊(例如本文所引用的那些)中常用的。
本发明的目的通过提供具有blb1基因和blb2基因特异性整合位点的疫霉抗性转基因马铃薯植物或其种子、块茎、植物细胞或组织而解决。
根据本发明的一个实施方式提供了疫霉抗性的转基因马铃薯植物、种子、块茎、植物细胞或组织，优选其包含与SEQ ID NO：1具有至少80％同一性的核苷酸序列(参见图2a)。
根据本发明的一个实施方式提供了疫霉抗性的转基因马铃薯植物、种子、块茎、植物细胞或组织，其包含与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3具有至少80％同一性的核苷酸序列，所述核苷酸序列的侧翼为与SEQ IDNO：20和/或SEQ ID NO：21具有至少80％同一性的侧翼区域(参见图2b、c、e)。
SEQ ID NO：1是指插入到植物基因组中的重组构建体的一部分，其包含blb1基因、blb2基因和ahas基因，其中SEQ ID NO：1进一步包含植物的侧翼基因组序列(参见图2a)。
SEQ ID NO：2是指插入到植物基因组中的重组构建体的一部分，其包含blb1基因，blb2基因和ahas基因。优选地，如果将与SEQ ID NO：2具有至少80％同一性的序列插入到植物基因组中，则blb1基因、blb2基因以及任选地ahas基因表达。优选地，如果将与SEQ ID NO：2具有至少80％同一性的序列插入到植物基因组中，则其表达blb1基因、blb2基因和/或ahas基因会表达(参见图2b)。
SEQ ID NO：3是指插入到植物基因组中的重组构建体的一部分，其包含blb1基因、blb2基因，但无ahas标志基因。优选地，如果将与SEQID NO：3具有至少80％同一性的序列插入到植物基因组中，则blb1基因、blb2基因表达(参见图2c)。
SEQ ID NO：2和/或3在后文中可称作插入片段。
SEQ ID NO：20是指具有序列SEQ ID NOs：2或3的插入片段的左侧翼区域。
SEQ ID NO：21是指具有序列SEQ ID NOs：2或3的插入片段的右侧翼区域。
术语“侧翼区域”是指位于整合到植物基因组中的插入片段右侧或左侧位点的侧翼的植物基因组区域。
根据本发明的一个实施方式提供了疫霉抗性转基因马铃薯植物或其种子、块茎、植物细胞或组织，其包含：
a)与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3具有至少80％同一性的重组构建体，以及进一步包含选自由以下组成的组中的连接序列：
b)
i)能用于利用具有SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5的核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应从而扩增介于126和136个碱基对之间的核苷酸片段的核酸序列，
ii)能用于利用具有SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7的核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应从而扩增介于505和515个碱基对之间的核苷酸片段的核酸序列，
iii)能用于利用具有SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9的核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应从而扩增介于625和635个碱基对之间的核苷酸片段的核酸序列，
iv)能用于利用具有SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11的核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应从而扩增介于4752和4762个碱基对之间的核苷酸片段的核酸序列，
和/或进一步包含选自由以下组成的组中的连接序列：
v)能用于利用具有SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13的核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应从而扩增介于282和292个碱基对之间的核苷酸片段的核酸序列，
vi)能用于利用具有SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15的核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应从而扩增介于877和887个碱基对之间的核苷酸片段的核酸序列，
vii)能用于利用具有SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17的核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应从而扩增介于827和837个碱基对之间的核苷酸片段的核酸序列，
viii)能用于利用具有SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19的核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应从而扩增介于9905和9915个碱基对之间的核苷酸片段的核酸序列。
本发明的优选实施方式提供了疫霉抗性的转基因马铃薯或其种子、块茎、植物细胞或组织
a)与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3具有至少80％同一性的重组构建体，以及进一步包含选自由以下组成的组中的连接序列：
b)
i)能用于利用具有SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应从而扩增131个碱基对的核苷酸片段的核酸序列，
ii)能用于利用具有SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应从而扩增510个碱基对的核苷酸片段的核酸序列，
iii)能用于利用具有SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应从而扩增630个碱基对的核苷酸片段的核酸序列，和/或
iv)能用于利用具有SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应从而扩增4757个碱基对的核苷酸片段的核酸序列，
和/或进一步包含选自由以下组成的组中的连接序列：
v)能用于利用具有SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应从而扩增287个碱基对的核苷酸片段的核酸序列，
vi)能用于利用具有SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应从而扩增882个碱基对的核苷酸片段的核酸序列，
vii)能用于利用具有SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应从而扩增832个碱基对的核苷酸片段的核酸序列，
viii)能用于利用具有SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应从而扩增9910个碱基对的核苷酸片段的核酸序列。
可用于利用两条引物进行聚合酶链反应从而扩增特定长度的核苷酸片段的核酸序列是指利用两条引物进行所述聚合酶链反应的产物。特别地，其是指利用两条引物进行聚合酶链反应从而扩增至特定长度的核苷酸片段的核酸序列。
连接序列包括插入到植物基因组中的重组构建体的右侧或左侧部分，并且部分地包括重组构建体的所述右侧或左侧部分的侧翼区域的植物基因组序列。特别地，连接序列包含与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3具有至少80％同一性的重组构建体的左侧部分以及与SEQ ID NO：20具有至少80％同一性的侧翼区域部分，或者与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3具有至少80％同一性的重组构建体的右侧部分以及与SEQ ID NO：21具有至少80％同一性的侧翼区域部分。在这种情况下，关于重组构建体部分序列的同一性是指对于所述重组构建体左侧或右侧部分的全长而言的同一性(图2e)。
特别地，与SEQ ID NO：2或3具有至少80％同一性的重组构建体左侧部分的一部分和与SEQ ID NO：22具有至少80％同一性的连接序列之间，或者与SEQ ID NO：2或3具有至少80％同一性的重组构建体右侧部分的一部分和与SEQ ID NO：23具有至少80％同一性的连接序列之间，至少有部分重叠。在这种情况下，关于重组构建体部分序列的同一性是指对于重组构建体左侧或右侧部分的全长而言的同一性(图2e)。
PCR是指聚合酶链反应，即利用所述核酸的特异性引物通过采用Taq聚合酶等从核酸的混合物中选择性富集指定长度的核酸(US5,656,493；Sambrook等人，1989，Molecular Cloning，第二版，Cold Spring HarborLaboratory，Plainview，N.Y.)。
备选的实施方式提供了疫霉抗性的转基因马铃薯、种子、块茎、植物细胞或组织，其包含
a)与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3具有至少80％同一性的重组构建体，以及进一步包含选自由与SEQ ID NO：22和/或SEQ ID NO：23具有至少80％同一性的序列组成的组中的连接序列。
可以通过繁殖或使马铃薯植物与由原种事件D的上述植物种子所获得的马铃薯植物杂交并随后使用上面所定义的引物对进行PCR检测来选择携带重组构建体的植物，来获得根据本发明的、包含可进行如上所定义扩增的重组构建体的转基因马铃薯植物、种子、块茎、植物细胞或组织。含有的浆果可以就近手工收获、提取和干燥。种子可以储藏于室温。可用0.04％GA(赤霉素)处理种子，以打破休眠并且促进发芽。
在杂交的一个实施方式中，父本植物的花粉从其雄蕊中转移到母本植物分离的雌蕊中。收获真正含有种子的浆果，并将种子从浆果的外壳和果肉中分离出来。重新种植种子，生长成植株，随后通过使用上面所定义的引物对进行PCR检测从而选择携带重组构建体的植物。
母本植物和/或父本植物可以是根据本发明的疫霉抗性转基因马铃薯植物。在一个实施方式中，母本植物是根据本发明的疫霉抗性转基因马铃薯植物，父本植物可以是例如选自Agria、Sarpo Mira、Cara、Valor、Innovator、Diamant和Bintje的非转基因植物。在备选的实施方式中，父本植物是根据本发明的疫霉抗性转基因马铃薯植物，母本植物可以是例如选自Agria、Sarpo Mira、Cara、Valor、Innovator、Diamant和Bintje的非转基因植物。
本发明的一个实施方式提供了一种提供疫霉抗性转基因马铃薯植物或其部分的方法，其包括以下步骤：
a)将与SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3具有至少80％同一性的重组核酸序列导入到马铃薯植物细胞的基因组中，
b)将所述重组核酸整合到基因组中，
c)由所述植物细胞再生植物，
d)选择包含与SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3具有至少80％同一性的核酸序列和如下连接序列的植物，所述连接序列选自与SEQID NO.22和/或SEQ ID NO.23具有至少80％同一性的序列组成的组。
本发明的一个实施方式提供了一种提供疫霉抗性转基因马铃薯植物或其部分的方法，其包括以下步骤：
a)将与SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3具有至少80％同一性的重组核酸序列导入到马铃薯植物细胞的基因组中，
b)将所述重组核酸整合到基因组中，
c)由所述植物细胞再生植物，
d)选择包含与SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3具有至少80％同一性的核酸序列和选自由以下组成的组中的连接序列的植物：
i)能用于利用具有SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5的核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应从而扩增介于126和136个碱基对之间的核苷酸片段的核酸序列，
ii)能用于利用具有SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7的核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应从而扩增介于505和515个碱基对之间的核苷酸片段的核酸序列，
iii)能用于利用具有SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9的核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应从而扩增介于625和635个碱基对之间的核苷酸片段的核酸序列，和/或
iv)能用于利用具有SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11的核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应从而扩增介于4752和4762个碱基对之间的核苷酸片段的核酸序列，
和/或进一步包含选自由以下组成的组中的连接序列：
v)能用于利用具有SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13的核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应从而扩增介于282和292个碱基对之间的核苷酸片段的核酸序列，
vi)能用于利用具有SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15的核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应从而扩增介于877和887个碱基对之间的核苷酸片段的核酸序列，
vii)能用于利用具有SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17的核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应从而扩增介于827和837个碱基对之间的核苷酸片段的核酸序列，和/或
viii)能用于利用具有SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19的核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应从而扩增介于9905和9915个碱基对之间的核苷酸片段的核酸序列。
本发明的一种方法提供了一种提供疫霉抗性转基因马铃薯植物或其部分的方法，
其中，在步骤d)中，选择包含与SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3具有至少80％同一性的核酸序列和选自由以下组成的组中的连接序列的植物：
i)能用于利用具有SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5的核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应从而扩增131个碱基对的核苷酸片段的核酸序列，
ii)能用于利用具有SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7的核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应从而扩增510个碱基对的核苷酸片段的核酸序列，
iii)能用于利用具有SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9的核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应从而扩增630个碱基对的核苷酸片段的核酸序列，和/或
iv)能用于利用具有SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11的核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应从而扩增4757个碱基对的核苷酸片段的核酸序列，
和/或：
v)能用于利用具有SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13的核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应从而扩增287个碱基对的核苷酸片段的核酸序列，
vi)能用于利用具有SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15的核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应从而扩增882个碱基对的核苷酸片段的核酸序列，
vii)能用于利用具有SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17的核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应从而扩增832个碱基对的核苷酸片段的核酸序列，和/或
viii)能用于利用具有SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19的核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应从而扩增9910个碱基对的核苷酸片段的核酸序列。
本发明的一个实施方式提供了用于检测特定整合位点，特别是用于检测原种事件D的试剂盒，其包含引物对：
SEQ ID NO：4和5，
SEQ ID NO：6和7，
SEQ ID NO：8和9，
SEQ ID NO：10和11，
SEQ ID NO：12和13，
SEQ ID NO：14和15，
SEQ ID NO：16和17，和/或
SEQ ID NO：18和19。
所公开的试剂盒可以用于质量控制(例如种子批次的纯度)、检测植物材料中或者包含或衍生自植物材料的材料(例如炸薯条、马铃薯粉、马铃薯泥等，但不限于食物或饲料产品)中特定整合位置的目的。
简而言之，通过PCR对基因组DNA进行扩增，其中利用特异性识别原种事件D中插入位点5’或3’侧翼序列的引物，特别是上述引物对，例如分别为引物对SEQ ID NO：4和5、SEQ ID NO：6和7、SEQ ID NO：8和9、SEQ ID NO：10和11、SEQ ID NO：12和13、SEQ ID NO：14和15、SEQ ID NO：16和17、SEQ ID NO：18和19。如果使用上述引物组合对植物材料进行的PCR分别产生如下片段：
126至136bp(131bp)，
505至515bp(510bp)，
625至536bp(630bp)，
282至292bp(287bp)，
877至887bp(882bp)，
827至837bp(832bp)，
4752至4762bp(4757bp)，
9905至9915bp(9910bp)，
则确定转基因植物具有本文所定义的特定整合位置，例如所选择的原种事件D。可以通过凝胶电泳使用标记物从而确定片段长度(Sambrook等人，1989Molecular Cloning，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory，plainview，N.Y.)。
本发明的一个实施方式提供了一种检测特定整合位置，优选鉴定原种事件D的方法，其包括如下步骤：
a)从马铃薯植物中分离DNA作为测试样品，
b)将测试样品、阳性和阴性样品、如上所定义的引物对暴露于PCR条件之下，以及
c)评估与所述阳性和阴性对照相比时如下DNA片段的扩增：
i)当使用具有SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5的核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应时具有介于126和136个碱基对的片段，
ii)当使用具有SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7的核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应时具有介于505和515个碱基对的片段，
iii)当使用具有SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9的核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应时具有介于625和635个碱基对的片段，和/或
iv)当使用具有SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11的核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应时具有介于4752和4762个碱基对的片段，
和/或
v)当使用具有SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13的核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应时具有介于282和292个碱基对的片段，
vi)当使用具有SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15的核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应时具有介于877和292个碱基对的片段，
vii)当使用具有SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17的核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应时具有介于827和837个碱基对的片段，和/或
viii)当使用具有SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19的核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应时具有介于9905和9915个碱基对的片段。
在一个优选实施方式中，在步骤e)中评估是指与所述阳性和阴性对照相比时选自由以下核苷酸片段组成的组中的核苷酸片段的扩增：
i)当使用具有SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5的核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应时具有131个碱基对的片段，
ii)当使用具有SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7的核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应时具有510个碱基对的片段，
iii)当使用具有SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9的核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应时具有630个碱基对的片段，和/或
iv)当使用具有SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11的核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应时具有4757个碱基对的片段，
和/或选自如下的核苷酸片段的扩增：
v)当使用具有SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13的核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应时具有287个碱基对的片段，
vi)当使用具有SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15的核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应时具有882个碱基对的片段，
vii)当使用具有SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17的核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应时具有832个碱基对的片段，
viii)当使用具有SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19的核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应时具有9910个碱基对的片段。
测试样品包含从转化的植物材料中，例如从植物、其种子、块茎、植物细胞或组织中分离的基因组DNA。阳性样品是包括从包含SEQ IDNO：1的植物中分离出的基因组DNA的样品。阴性样品是包括从用于转化的非转基因原始品种(例如，Fontane品种)中分离出的基因组DNA的样品。
可以用多种DNA聚合酶运行PCR反应，例如Pfu Ultra、Pfu Turbo或Herculase DNA聚合酶(Agilent Technologies，Santa Clara，CA，US)。用于Pfu Ultra、Pfu Turbo或Herculase DNA聚合酶操作方案的组合物可以如下：1×PCR缓冲液，每种dNTP各0.2mM，1μg样品基因组DNA，50pmol正向引物，50pmol反向引物，1u Pfu Ultra、Pfu Turbo或HerculaseDNA聚合酶。
扩增循环可以如下：
98℃60秒1个循环，随后以98℃10秒，下面表格所示退火温度30秒，以及72℃每1000bp产物长度(见下面的表格)60秒进行35个循环，随后72℃10分钟1个循环，然后4℃。
表1
根据本发明的一个实施方式提供了可被如上所定义的试剂盒或如上所定义的检测方法检测的植物、块茎、种子。
本发明的一个实施方式提供了包含如下的多核苷酸：
a)与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3具有至少80％同一性的重组核酸，以及
b)进一步包含选自由以下组成的组中的连接序列：
i)能用于利用具有SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5的核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应从而扩增介于126和136个碱基对之间的核苷酸片段的核酸序列，
ii)能用于利用具有SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7的核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应从而扩增介于505和515个碱基对之间的核苷酸片段的核酸序列，
iii)能用于利用具有SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9的核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应从而扩增介于625和635个碱基对之间的核苷酸片段的核酸序列，和/或
iv)能用于利用具有SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11的核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应从而扩增介于4752和4762个碱基对之间的核苷酸片段的核酸序列，
和/或进一步包含选自由以下组成的组中的连接序列：
v)能用于利用具有SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13的核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应从而扩增介于282和292个碱基对之间的核苷酸片段的核酸序列，
vi)能用于利用具有SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15的核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应从而扩增介于877和887个碱基对之间的核苷酸片段的核酸序列，
vii)能用于利用具有SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17的核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应从而扩增介于827和837个碱基对之间的核苷酸片段的核酸序列，和/或
viii)能用于利用具有SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19的核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应从而扩增介于9905和9915个碱基对之间的核苷酸片段的核酸序列。
本发明的一个优选实施方式提供了稳定整合到马铃薯植物细胞核中的多核苷酸，其包含：
a)与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3具有至少80％同一性的重组核酸，以及
b)进一步包含选自由以下组成的组中的连接序列：
i)能用于利用具有SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5的核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应从而扩增131个碱基对的核苷酸片段的核酸序列，
ii)能用于利用具有SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7的核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应从而扩增510个碱基对的核苷酸片段的核酸序列，
iii)能用于利用具有SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9的核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应从而扩增630个碱基对的核苷酸片段的核酸序列，和/或
iv)能用于利用具有SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11的核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应从而扩增4757个碱基对的核苷酸片段的核酸序列，
和/或：
v)能用于利用具有SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13的核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应从而扩增287个碱基对的核苷酸片段的核酸序列，
vi)能用于利用具有SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15的核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应从而扩增882个碱基对的核苷酸片段的核酸序列，
vii)能用于利用具有SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17的核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应从而扩增832个碱基对的核苷酸片段的核酸序列，和/或
viii)能用于利用具有SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19的核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应从而扩增9910个碱基对的核苷酸片段的核酸序列。
本发明的一个实施方式提供了与SEQ ID NO：22或23具有至少80％同一性的多核苷酸。
根据本发明的一个优选实施方式是包含与SEQ ID NO：1具有至少80％同一性的核苷酸序列的多核苷酸，优选其稳定整合到马铃薯植物细胞核中。
在又一个实施方式中，多核苷酸包含与SEQ ID NO：1、2、3或44具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的核苷酸序列，优选其稳定整合到马铃薯植物细胞的基因组中。
在另一个实施方式中，多核苷酸包含与SEQ ID NO：1、2、3、44和/或45具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性并且包含blb1和blb2基因的核苷酸序列，其稳定整合到马铃薯植物细胞的基因组中。多核苷酸还可以进一步在插入片段的侧翼区域中包含SEQ ID NO：4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18和/或19中的一个或多个。
在一个实施方式中，多核苷酸包含与SEQ ID NO：1、44和/或45至少具有80％同一性的核苷酸序列，并且包含blb1和blb2基因以及在插入片段的侧翼区域中包含SEQ ID NO：4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18和/或19中的一个或多个。
根据本发明的“多核苷酸”可以是分离的多核苷酸和/或重组多核苷酸。重组多核苷酸或重组构建体是指通过例如人为进行基因技术修饰所产生的任何多核苷酸。基因技术修饰可以是优选利用农杆菌用核苷酸序列转化植物细胞。
两条核酸和/或两条核酸之间的“同一性”在每种情况下是指基于核酸的全长。
例如，同一性可以通过Informax公司(USA)Vector NTI Suite7.1程序工具实施Clustal Method(Higgins DG，Sharp PM.Fast and sensitivemultiple sequence alignments on a microcomputer.Comput Appl.Biosci.1989Apr；5(2)：151-1)而计算，设定如下：
多序列比对参数：
缺口开放罚分 10
缺口延伸罚分 10
缺口分离罚分范围 8
缺口分离罚分 关
比对延迟同一性％ 40
残基特异性缺口 关
亲水残基缺口 关
过渡权重 0
配对比对参数
FAST算法 开
K-元组大小 1
缺口罚分 3
窗口大小 5
最佳对角线数 5
备选地，同一性可根据Chenna，Ramu，Sugawara，Hideaki，Koike，Tadashi，Lopez，Rodrigo，Gibson，Toby J，Higgins，Desmond G，Thompson，Julie D.Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs.(2003)Nucleic Acides Res31(13)：3497-500而确定，网页：http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/index.html，设定如下：
DNA缺口开放罚分 15.0
DNA缺口延伸罚分 6.66
DNA矩阵 同一性
蛋白缺口开放罚分 10.0
蛋白缺口延伸罚分 0.2
蛋白矩阵 Gonnet
蛋白质/DNA ENDGAP-1
蛋白质/DNA GAPDIST4
本文所提及的所有核酸序列可以用已知方法由核苷酸基础材料通过化学合成产生，例如通过双螺旋的个别重叠、互补核酸基础材料的片段富集。例如，寡核苷酸的化学合成可以用已知方法，通过磷酸酰胺法(phosphoamidite)(Voet，Voet，第二版，Wiley Press，New York，第896-897页)来实施。利用DNA聚合酶Klenow片段和连接反应以及普通克隆技术所进行的合成寡核苷酸累积以及缺口填补描述于Sambrook等人，1989Molecular Cloning，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory中。
序列同一性可通过本领域已知的序列比较和比对算法(见Gribskovand Devereux，Sequence Analysis Primer，Stockton Press，1991，以及本文所引用的参考文献)来进行优化，并且通过，例如BESTFIT软件程序所执行的Smith-Waterman算法采用默认参数(例如，Wisconsin GeneticComputing Group大学)来计算核苷酸序列之间的差异百分数。优选与具有SEQ ID NO：1、2、3、20、21、22、23、24和/或45的核酸具有至少80％序列同一性，优选至少85％序列同一性，尤其优选至少90％，至少95％，至少98％，至少99％序列同一性，甚至100％序列同一性。
重组构建体可包含相对于所述未修饰核酸的核酸替换、缺失和/或插入的核苷酸，其中由此类核酸编码的蛋白质与其所衍生自的未经修饰核酸所编码的未经修饰蛋白相比具有相似或更高的功能活性。在替换中可基于简并的氨基酸密码。
“缺失”是指从蛋白质中移除一个或多个氨基酸或从DNA中移除一个或多个核酸。
“插入”是指一个或多个核酸残基被导入进核酸的预定位点之中。
操作DNA序列以产生蛋白质的替换、插入或缺失变体的方法在本领域是已知的。例如，在DNA的预定位点进行替换突变的技术是本领域技术人员所熟知的，包括M13诱变，T7基因体外诱变(USB，Cleveland，OH)，QuickChange位点定向诱变(Stratagene，San Diego，CA)，PCR介导的位点定向诱变或其它位点定向诱变方法。
正如本文所使用的，术语“重组构建体”是指与SEQ ID NO：2和/或3具有至少80％同一性的表达盒。在一个实施方式中，表达盒的同源物在DNA水平上基于SEQ ID NO：2和/或3的全部DNA区域具有至少80％，优选至少90％，尤其优选至少95％，非常尤其优选至少98％，至少99％或100％同一性。优选地，重组构建体包含包括blb1启动子和blb1-1终止子的blb1基因，以及包括blb2启动子和blb1-2终止子的blb2基因，如下所定义，以及包括p-nos-启动子和t-nos-启动子的突变ahas基因，该重组构建体优选能够表达blb1和blb2基因，并且任选地表达ahas基因。所述重组构建体可通过基因技术方法，例如农杆菌转化，导入到植物细胞中。
在一个实施方式中，重组构建体或表达盒或转基因植物包含SEQ IDNO：1、2、3、44和/或45的核苷酸序列。
正如本文所使用的术语“blb1基因”是指与SEQ ID NO：46具有至少80％同一性的基因。在一个实施方式中，blb1基因的同源物在DNA水平上基于SEQ ID NO：46的全部DNA区域具有至少90％，优选至少95％，特别优选至少98％、至少99％或100％同一性。
正如本文所使用的术语“blb2基因”是指与SEQ ID NO：47具有至少80％同一性的基因。在一个实施方式中，blb2基因的同源物在DNA水平上基于SEQ ID NO：47的全部DNA区域具有至少90％，优选至少95％，特别优选至少98％、至少99％或100％同一性。
正如本文所使用的术语“突变的ahas基因”是指与SEQ ID NO：48具有至少80％同一性的基因。在一个实施方式中，突变的ahas基因的同源物在DNA水平上基于SEQ ID NO：48的全部DNA区域具有至少90％，优选至少95％，特别优选至少98％、至少99％或100％同一性。
优选地，疫霉抗性转基因马铃薯植物、其种子、块茎、植物细胞或组织表达对应于blb1基因和blb2基因以及任选地ahas基因的功能性蛋白。优选地，疫霉抗性转基因马铃薯植物、其种子、块茎、植物细胞或组织表达SEQ ID NOs：46和47以及任选地SEQ ID NO：48和/或相应的蛋白(参见图2h)。
根据本发明的转基因植物、种子、块茎、植物细胞或组织与野生型植物相比具有疫霉抗性。
野生型植物是与疫霉抗性增加的转基因植物具有相似，更优选一致基因型的植物，但野生型植物不含包括优选由其各自天然启动子和终止子所调控的blb1基因和blb2基因的重组核酸。
正如本文所使用的术语“疫霉抗性”或“疫霉抗性的”，是指减少或防止致病疫霉感染。疫霉抗性并不是暗示植物对所述感染必然具有100％的抗性。在优选实施方式中，与对致病疫霉不具抗性的野生型植物相比，抗性植物针对致病疫霉感染的抗性要高10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。
本文所使用的术语“疫霉抗性”是指当与野生型植物相比时，植物所具有的避免致病疫霉感染，避免被致病疫霉杀死，阻止、降低、延缓或停止致病疫霉的发育、生长和/或复制的能力。可以用多种方式来确定植物的致病疫霉抗性水平，例如评分/测量与整个叶片面积相比的感染叶片面积。确定抗性水平的另一种可能是对植物上的致病疫霉菌落进行计数，或者测量由这些菌落所产生的孢子的数量。确定真菌染病程度的另一种方式是通过定量PCR特异性地测量致病疫霉的数量(例如，Llorente等人(2010)A quantitative real-time PCR method for in planta monitoring ofPhytophthora infestans growth.Lett Appl Microbiol.51(6)：603-10)。
此外，根据本发明的转基因植物、种子、块茎、植物细胞或组织提供了与野生型植物、种子、块茎、植物细胞或组织“相当的产量”。
本文所使用的术语“相当的产量”是指转基因马铃薯植物可提供与野生型植物类似的块茎量的能力。类似的块茎量意为基于野生型块茎产量/ha(kg/ha)，转基因块茎的相对产量是野生型块茎产量/ha的至少95％，优选至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或更优选与野生型块茎产量/ha相同或高于野生型块茎产量/ha。
根据如下计算％相对产量：
％＝转基因块茎(kg/ha)×100％/野生型块茎(kg/ha)
术语“植物”意在包括处于任何成熟或发育阶段的植物，以及除非文中另有清楚说明，还包括衍生自或取自任意此类植物中的任意组织或器官(植物部分)。植物部分包括，但不限于，植物细胞、茎、根、胚珠、雄蕊、种子、叶、胚芽、分生区、愈合组织、花粉培养物、配子体、孢子、花粉、小孢子、原生质体、发根培养物，和/或等。正如本文所使用的，“植物细胞”包括，但不限于，原生质体、产配子细胞以及再生成整个植株的细胞。植物各种组织的组织培养以及由此发生的植物再生在本领域是熟知并且广泛使用的。
本发明还包括由本发明的植物所产生的种子。优选地，该种子包含与SEQ ID NO：1具有至少80％同一性的核酸序列。所产生的经转化的植物可通过克隆繁殖法或经典育种技术来繁殖。
为了本发明的目的，“重组构建体”或“重组核酸”意为包含blb1基因和blb2基因及其天然启动子和终止子的表达盒或载体构建体。包含blb1基因、blb2基因、blb1启动子、blb2启动子，blb1终止子和blb2终止子的所述表达盒在上文中定义。
如本文所使用的，术语“转基因”优选是指含有优选通过本质上非生物学过程，优选农杆菌转化进行导入的重组构建体或其部分的任何植物、植物细胞、块茎、愈合组织、植物组织或植物部分。重组构建体或其部分稳定整合进染色体中，以便通过克隆繁殖、无性繁殖或有性繁殖将其传递给后代。所述后代也是转基因的。本质上生物学过程可以是植物杂交和/或天然重组。
为了本发明目的的转基因马铃薯植物、种子块茎、植物细胞或组织因此被理解为意为重组盒被整合进基因组中的那些。优选地，原始植物的基因组中并不存在blb1基因和/或blb2基因和/或ahas基因，以及优选blb1基因和/或blb2基因和/或ahas基因存在于转基因植物的基因组中，但不处于它们在原始植物基因组中的天然位点上。
天然位点意为特定染色体的位点，优选位于某些基因之间的位点，更优选是与被转化的原始植物相同的序列背景。
优选地，转基因马铃薯植物、种子块茎、植物细胞或其组织表达blb1基因和blb2基因。术语“表达”或“进行表达”意为一个特定基因或多个特定基因或特定基因载体构建体的转录。术语“表达”或“进行表达”特别地是指一个基因或多个基因或基因载体构建体转录成结构RNA(rRNA、tRNA)或mRNA，优选随后将后者翻译成蛋白质。
本文所使用的术语“增加的表达”或“过量表达”或“含量的增加”意为在原始野生型水平上所增加的任意形式的表达。为了本发明的目的，原始野生型表达水平也可以为0(缺失表达或缺失相应的基因)。
可以用如上所述重组构建体的其中之一来转化野生型植物细胞。用于转化宿主细胞(包括植物细胞)的合适的方法在植物生物技术领域是熟知的。任何方法都可以用于将重组表达载体转化进植物细胞中以产生本发明的转基因植物。野生型植物细胞可以来自于，例如，Fontane、Agria、Bientje、Sarpo Mira、Cara、Valor、Innovator、Diament。
也可通过利用农杆菌进行的细菌感染(例如EP0116718)，利用病毒载体进行的病毒感染(EP0067553，US4407956，WO95/34668，WO93/03161)，或者利用花粉(EP0270356，WO85/01856，US4684611)来实施转化。基于农杆菌的转化技术在本领域是熟知的。农杆菌菌株(例如，根癌农杆菌或发根农杆菌)包含质粒(Ti质粒或Ri质粒)和在农杆菌感染之后转移到植物中的T-DNA元件。T-DNA(转移DNA)被整合进植物细胞的基因组中。T-DNA可以定位于Ri质粒或Ti质粒中或者单独包含在所谓的二元载体中。农杆菌介导的转化的方法描述于，例如Horsch RB等人(1985)Science225：1229中。用农杆菌转化马铃薯的方法描述于例如WO2008/034876中。转化可导致瞬时的或稳定的转化和表达。尽管本发明的核苷酸序列可插入到属于这些广泛类别的任何植物和植物细胞中，但其特别地用于马铃薯植物细胞中。
可通过本领域技术人员所熟悉的所有方法来再生经遗传修饰的植物细胞。可在上述出版物中找到合适的方法，即S.D.Kung和R.Wu(WhiteFF，Vectors for Gene Transfer in Higher Plants，Transgenic Plants，Vol.1，Engineering and Utilization，S.D.Kung和R.Wu编著，Academic Press，1993，pp.15-38；Jenes B等人Techniques for Gene Transfer，Transgenic Plants，Vol.1，Engineering and Utilization，S.D.Kung和R.Wu编著，AcademicPress，1993，pp.128-143)Potrykus(Potrykus(1991)Annu Rev Plant PhysiolPlant Molec Biol42：205-225.)或Hofgen and Willmitzer(Hofgen R，Willmitzer L(1988)Storage of competent cells for Agrobacteriumtransformation.Nucleic Acids Res16：9877)。
重组构建体可包含突变的ahas基因作为选择标记。携带该构建体的植物对咪唑啉具有抗性。可使用抑制AHAS酶的化合物来选择转基因马铃薯植物。有用的化合物是咪唑啉类除草剂。尤其有用的除草剂选自如下组中：咪唑乙烟酸()，甲氧咪草烟(
)，咪草酸(
)，灭草烟(
)，甲咪唑烟酸()和imazaquinon(
)。可使用Duggleby，R.G.和Pang，S.S.在Journal of Biochemistryand Molecular Biology33(1)，1-36(2000)的综述文章中所描述的化合物来选择转基因植物。
可将经转化的植物组织暴露于0.5μM的甲氧咪草烟下，以此来选择携带构建体的植物材料。
在DNA转移和再生之后，还可以例如利用Southern分析针对完整重组构建体的存在、拷贝数量和/或基因组结构来评估推定的经转化的植物。
植物中的基因靶向是可行的，但却是非常罕见的事件(Hanin &Paszkowski2003Current Opinion Plant Biol.6(2)：157-62)。然而，本领域技术人员将知道如何改善基因靶向的频率。例如，可通过表达促进同源重组过程的蛋白质来提高基因靶向的频率，例如酵母RAD54(Shaked等人2005Pro Natl Acad Sci USA102(34)：12265-9)。另一个方法是利用强大的阳性-阴性选择系统来促进基因靶向系的检测(Iida & Terada2005Plant Mol.Biol59：205-219)。在此种方法中，阴性选择标记位于转化构建体上同源序列的外侧。结果，只有那些转基因序列是随机插入的植物才含有阴性选择标记，而通过基因靶向所获得的转基因品系则不包含阴性选择标记。
此外，通过在所期望的插入位点上或在所期望的插入位点附近导入DNA双链断裂可大大地提高基因靶向频率。本领域技术人员知晓如何实现该目的。例如，可对天然存在的归巢内切酶(也称之为大范围核酸酶，例如I-CreI)进行修饰，以便它们识别和切割新的DNA序列，即基因组中所期望的插入位点上或其附近的序列(WO07/047859，WO07/049156)。另外，可以设计所谓的锌指核酸酶，其由连接到锌指的非特异性核酸酶结构域(常常由FokI核酸酶获得)组成，其特异性识别所期望的DNA序列(例如Trends Biotechnol.200523(12)：567-9；Cell Mol Life Sci.200764(22)：2933-44；WO08/021207)。另外一种方法是使用连接到DNA特异性核酸酶的TAL(转录激活子样)效应子，如Mahfouz等人2011.Denovo-engineered transcription activator-like effector(TALE)hybrid nucleasewith novel DNA binding specificity creates double-strand breaks；PNAS108(6)2623-2628中所描述。通过使用该方法，可通过改变与DNA结合的明确定义的氨基酸(其密码可在WO/2010/079430中找到)很容易地产生与所期望靶序列结合的TAL效应子变体。
通过在与原种事件D中所发现的基本上相同的插入位点处插入包含重组构建体的转基因构建体，基因靶向可被用于获得与原种事件D类似的品系。本领域技术人员将知晓插入位点可能会在几个碱基对或直至几千个碱基对上有所不同，但仍然获得具有类似有益特性的类似品系。基因靶向可特别地用于在除Fontane之外的马铃薯品种中建立与原种事件D类似的品系。可能会感兴趣去基于在不同马铃薯生长区域中所发现更加特别适合环境条件的其他品种建立这种相应的品系。
附图简述
图1：载体卡VCPMA16
图2：本申请的序列
图3：引物概况
图4：将事件A至D，Bintje(标准品种)相对于Fontane(事件A至D的母本品种)的相对产量进行比较的图表。在3年时间内在田地的15个地点测量Fontane、事件A-D和Bintje的平均产量/ha。Fontane品种的平均产量/ha设定为100％，据此计算事件A-D和Bintje的相对产量。
图5：图表显示了Fontane与事件A至D和Bientje相比进行疫霉筛选的结果。天然感染后，在田地中对患病叶片面积进行评分。母本品种Fontane设定为100％。所有事件对致病疫霉都显示出充分的抗性。
实施例
下列实施例并不意在将权利要求的范围限制到本发明，而意在为某些具体实施方式的示例。本领域技术人员所能想到的任何示例性方法变体意在落入本发明的范围之内。
实施例1：通用方法
为了本发明目的所实施的克隆步骤，例如，限制性酶切、琼脂糖凝胶电泳、DNA片段的纯化、将核酸转移至硝化纤维素膜和尼龙膜上、连接DNA片段、转化大肠杆菌(E.coli)细胞、细菌培养、噬菌体繁殖以及重组DNA的序列分析，如Smabrook等人Cold Spring HarborLaboratory Press(1989)，ISBN0-87969-309-6中的描述来实施。
可通过已知的方式，例如亚磷酰胺法(Voet，Voet，第二版，Wiley PressNew York，pages896-897)来实现寡核苷酸的化学合成。按照制造商的说明书使用MWG-Licor激光荧光DNA测序仪基于Sanger方法(Sanger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA74,5463(1977))来对重组DNA分子进行测序。
实施例2：转化载体VC-PMA16的克隆
pSUNAHSmod用作构建VCPMA16的骨架。pSUNAHSmod基于质粒pSUN1(WO02/00900)。pSUNAHSmod的T-DNA含有突变的AHAS(乙酰羟酸合酶)基因(S653N)，其增强了经转化的植物对咪唑啉酮除草剂(例如，甲氧咪草烟：(R/S)-2-(4-异丙基-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基)-5-甲氧基甲基烟酸)的抗性。突变的AHAS基因用作选择标记的用途描述于Andersson等人(2003)Plant Cell Rep22：261-267和WO2004/005516中。通过将来自于pGPTVKan的nos启动子片段(Becker等人，Molecularplant Biology20，1195-1197)，来自于农杆菌的突变AHAS基因以及来自于pGPTVKan的nos终止子(Becker等人，Molecular plant Biology20，1195-1197)融合来构建AHAS选择盒。
利用XbaI限制性位点将blb1基因片段(包括1173bp的blb1启动子区域和406bp的blb1终止子区域)连接进pSUNAHSmod中。blb2基因表达盒包含Rpi-blb2基因(3890bp)，blb2启动子序列(1530bp)和2530bp的blb2终止子序列。为了将blb2表达盒插入到含有blb1的pSUNAHSmod中，用PstI切割载体。将所得到的粘性限制性位点补平，用平末端连接插入blb2表达盒。将所得到的载体命名为VCPMA16(图1)。
实施例3：用VCPMA16转化根癌农杆菌(A.tumefaciens)
利用如Walkerpeach & Velten所描述的直接转化(Agrobacterium-mediated gene transfer to plant cells：co-integrate and binaryvector systems，Gelvin SB Schioperoot RA(Hrsg.)，Plant Molecular BiologyManual，第2版，Kluwer Academic Publishers，Dordrecht，Netherlands，pp.B1/1-B1/19，1994)将构建体VCPMA16转化进根癌农杆菌菌株LBA4404、AGL0或AGL1中。经转化的细菌在含有1μg/ml壮观霉素的YEB琼脂平板上生长。
实施例4：栽培以及使用根癌农杆菌转化马铃薯栽培种Fontane
使用如Visser所描述的农杆菌介导的转化(Visser RGF，1991，“Regeneration and transformation of potato by Agrobacterium tumefaciens.”在Lindsey K(编著)，“Plant Culture Manual”一书中，Kluwer AcademicPublishers，Dordrecht，Netherlands，Seiten B5/1-B5/9)用VCPMA16转化马铃薯品种Fontane，但使用甲氧咪草烟作为选择标记(WO2004/005516；Andersson等人，2003，plant Cell Rep22：2261-267)。
将马铃薯叶片或幼苗部分在覆盖有1.5-2ml液体M100培养基(4.4g/lMS培养基，30g/l蔗糖，0.5mg/ml盐酸硫胺，0.5mg/ml盐酸吡哆醇，lmg/l烟酸，0.5mg/l凯因庭，29.8mg/l FeSO4*7H2O，lmg/l2，4-D，2g/l酪蛋白水解物，pH6.5)以及用无菌滤纸覆盖的MC平板(M300平板(4.4g/l MS培养基，2mg/l NAA，1mg/l BAP，30g/l蔗糖，pH5.2))上孵育1-3天。
1-3天之后，在MS10-培养基(4.4g/l MS培养基，10g/l蔗糖，pH5.8)中将组织部分与根癌农杆菌(含有VCPMA16)孵育。8-10分钟后，将组织片部分转移至M300平板上(见上)。1-3天后，将组织部分转移至MS400平板(4.4g/l MS培养基，2mg/l玉米素，0.01mg/l NAA，0.1mg/lGA3，10g/l蔗糖，400mg/l凯福隆(Claforane)或羧苄青霉素，pH5.8)，再孵育3-5天。
实施例5：选择经转化的马铃薯小植株
3-5天之后，将组织部分转移至含有0.5umol甲氧咪草烟作为选择剂的MS400平板(见上)。每隔两周就将组织部分转至新的含有0.5umol甲氧咪草烟的MS400平板上。收获所生长(再生)的幼苗，并转移至MS30平板(4.4g/l MS培养基，30g/l蔗糖，200mg/l凯福隆，pH5.8)上以进行进一步的栽培。
实施例6：从经转化的马铃薯幼苗中提取DNA
利用Wizard Magnetic96DNA Plant System(Promega，Mannheim)试剂盒根据制造商的操作说明从推定的转基因幼苗中提取DNA。
实施例7：利用实时PCR检测经转化马铃薯植物中的Rpi-blb1和Rpi-blb2
为了检测blb1和blb2的存在，利用来自于推定的转基因马铃薯幼苗中的DNA(见上)作为模板进行实时PCR。使用如下引物：
blb1：
5’-TGT TGAACA CTG TAA CAT GCT AAA ATG-3’(正向引物；SEQID No.49)
5’-AGT TGT GGA CAT CCC CGA ATT-3’(反向引物；SEQ ID No.50)
5’-AGA GGG ATT GCA GCA CCT AAC AAC CCT C-3’(探针；SEQID No.51)
blb2：
5’-TTC AAA ACC CCA AAT AAG TTT CAA C-3’(正向引物；SEQID No.52)
5’-CCA TGC TTG CTG TAC TTT GCA-3’(反向引物；SEQ ID No.53)
5’-CGT TAC CCA GTC CTT CGG CG-3’(探针；SEQ ID No.54)
利用Roche Lightcycler480，在1×LightCycler480Probe Master(详细方案见制造商的手册)中使用20-50ng基因组DNA，900mM PCR引物(见上)，200nM探针(见上)来分析样品。
PCR的扩增循环为：
95℃15分钟1个循环以进行变性，随后是95℃(斜坡速率(Ramp Rate)4.8℃/秒)10秒，60℃(斜坡速率2.5℃/秒)30秒的40个循环。
如果两条片段的PCR都得到了阳性信号，就将幼苗转移到温室中以实施疫霉抗性测试。
实施例8：确定含有blb1和blb2的转基因马铃薯幼苗针对致病疫霉的抗性水平
将含有blb1和blb2的转基因马铃薯幼苗(如上所确定)转移到土壤中，并在生长箱中以12h白昼长和100％湿度在22℃使其适应土壤2天。随后使植物在类似条件下(除湿度为70％)的温室或植物室中生长。
4周之后，将植物与致病疫霉孢子孵育。为了证实blb1和blb2介导的广谱抗性，对从全世界范围内收集的大量不同的疫霉分离株(无论是以混合物形式还是单独的分离株)，例如，Blue13，Us-22和许多当地收集的菌株，进行测试。
所有的疫霉分离株都在如表2中所述的豌豆琼脂中培养
表2豌豆琼脂制备物
| 豌豆琼脂 | -150g豌豆 |
| -1000ml Millipore水 | |
| -在蒸锅中煮75分钟 | |
| -冷却～1h，室温下孵育24h | |
| -过滤培养基，用11Millipore水重新注满 | |
| -加入5g葡萄糖和20g琼脂-琼脂 | |
| -调整pH至6.5 | |
| -高压灭菌15分钟 | |
| -在无菌条件下倾倒于平板 |
以孢子密度为2.5×E05个孢子/ml来接种植物。孢子密度是利用Thoma计数室来估算的。为了进行接种，用孢子悬浮液喷洒整个植物并将其转移至黑雾室中。12-18小时之后，将植物移至温室中(21℃，12h光照，＞90％湿度)，培养1周。
首次疾病症状出现在约1周之后。疾病症状的等级评定是通过专业人士对患病叶片面积、坏死斑、褪绿病变和致病疫霉潜在孢子形成进行评估来完成的。
将这些数值整合进范围为0-100％的疾病等级中。在评分系统中，0％疾病是指没有肉眼可见的症状，而100％则意味着所有经接种的叶片完全呈褐色，并铺满菌丝，于是该植物已基本上死亡。对易感母本品种Fontane马铃薯品种的接种一般都导致所有叶片被严重感染。所有叶片感染严重，绿色组织稀少。相反，接种经转化的Fontane，事件A至D总是导致完全健康的植物，这些植物对使用的所有疫霉分离株疾病定级都为0％。使用标准品种Bintje作为易感对照，已知该品种对疫霉感染是充分易感的。
实施例9：用于FST鉴定的DNA分离和定量方法
收集真菌抗性马铃薯事件的幼叶组织以用于DNA分离和表征。收集之后，用液氮冷冻叶片并冻干。
使用经修饰的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法(Carlson等人，1991)从马铃薯叶片组织中分离DNA。用研棒和研体将干燥的叶片组织磨碎。经研磨的组织于预热的提取缓冲液中在74℃孵育20分钟，该提取缓冲液由2％(w/v)CTAB，100mM Tris-HCl，1.4M NaCl，1％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，20mM乙二胺四乙酸(EDTA)，pH9.5(5ml/lg新鲜叶片组织)以及β-巯基乙醇(2.5μl/ml缓冲液)组成。在2440×g下离心10分钟之后，用等体积的氯仿/异戊醇(24∶1)抽提上清液两次。用0.7体积的异丙醇沉淀DNA并溶解于TE缓冲液(10mM Tris-HCl，1mMEDTA，pH8.0)中，向其中加入0.5mg/ml的RNaseA(Invitrogen；Carlsbad，CA92008USA)使其终浓度约为500ng/μl。用小牛胸腺DNA(Invitrogen)作为DNA标准品，采用Hoechst33258染料(Invitrogen)根据荧光计使用手册在FLx800TMMicroplate Reader(BioTek Instruments，Winooski，VT05404，USA)上对分离的DNA进行定量。
实施例10：侧翼序列的Tail-PCR扩增
寡核苷酸引物：合成分别与AHAS编码序列和VC-PMA16中的blb2启动子区域互补的T-DNA特异性引物(表3)。
表3用于通过Tail PCR克隆侧翼序列的T-DNA特异性引物
LB＝左侧翼引物，RB＝右侧翼引物
此外，根据Liu等人1995合成4个随机简并(AD)引物：
TG(A/T)GNAG(A/T)ANCA(G/C)AGA-3′(ADI)(SEQ ID NO：61)，AG(A/T)GNAG(A/T)ANCA(A/T)AGG-3′(AD2)(SEQ ID NO：62)，CA(A/T)CGICNGAIA(G/C)GAA-3′(AD3，I是指次黄苷)(SEQ ID NO：63)，以及TC(G/C)TICGNACIT(A/T)GGA-3′(AD4)(SEQ ID NO：64)。这些AD引物的平均Tm为47-48℃，其通过公式69.3+0.41(％GC)-650/L来计算，其中L是引物长度(参见图21)。
Tail PCR基本上是根据Liu等人的步骤(Liu等人1995)来实施的。一级TAIL-PCR反应(20μl)含有1×PCR缓冲液(10mM Tris-HCl pH8.3，50mM KCl，1.5或2.0mM MgCl2，0.001％明胶)，dNTPs各200μM，25ng基因组DNA，1单位Taq聚合酶(Invitrogen)，0.2μM T-DNA特异性引物(07-038_P25和07-038_P26)以及指定的AD引物(AD12μM，AD23μM或AD3和AD44μM)。根据Liu等人(1995)的PCR程序在Perkin-Elmer热循环仪9700中实施一级TAIL-PCR。从50倍稀释的一级PCR产物中取出等分试样(1μl)直接进行二级TAIL-PCR反应(20μl)，该二级反应含有1×PCR缓冲液，1单位Taq DNA聚合酶(Invitrogen)，dNTPs各200μM，0.2μM T-DNA特异性引物(07-038_P27和07-038_P28)以及与一级反应中相同的AD引物(AD11.5μM，AD2、AD3和AD42μM)。在12个超级循环的扩增之后，将二级TAIL-PCR产物(10倍稀释的1μl等分试样)在50μl三级反应中再次扩增20个严格性降低的循环。组分及其浓度与二级反应中的相同，除了使用了另外的巢式PCR引物(LB为07-038_P29以及RB为07-038_P30)。通过琼脂糖凝胶电泳分析反应中得到的扩增产物。回收强扩增的产物，并用Zymoclean Gel DNA回收试剂盒(Zymo Research，CA92614，USA)纯化。用小牛胸腺DNA(Invitrogen)作为DNA标准品，采用Hoechst33258染料(Invitrogen)根据荧光计使用手册在FLx800TMMicroplate Reader(BioTek Instruments，Winooski，VT05404，USA)上对纯化的DNA进行定量。
实施例11：DNA测序
根据制造商的方案使用BigDye terminator v3.0试剂盒(AppliedBiosystems，California92008，USA)采用Sanger测序法对经纯化的三级PCR产物进行测序。使用与三级PCR中所使用的相同的引物(未标记)来进行测序。
实施例12：通过PCR鉴定特异性事件
除非另有说明，使用的都是如Sambrook等人，Molecular Cloning：Alaboratory manual，Cold Spring Harbor1989，Cold Spring Harbor LaboratoryPress中所描述的标准方法。
利用用于处理单个样品的DNeasy Plant Mini Kit(Quiagen)或用于处理96孔形式的样品的DNeasy96Plant Kit(Quiagen)来从特定的马铃薯事件中制备基因组DNA。根据手册中所描述的说明使用这两个试剂盒。通过如Phusion热启动，Pfu Ultra，Pfu Turbo或Herculase DNA聚合酶(Stratagene，Santa Clara，CA，US)的操作方案中所描述的PCR从cDNA中扩增侧翼区域和T-DNA插入物之间的连接序列。
Pfu Ultra，Pfu Turbo或Herculase DNA聚合酶操作方案的组成为：1×PCR缓冲液，dNTPs各0.2mM，100ng拟南芥cDNA(Columbia-0品种)cDNA，50pmol正向引物，50pmol反向引物，1u Pfu Ultra，Pfu Turbo或Herculase DNA聚合酶。
扩增循环如下：
98℃60秒的1个循环，然后每个循环为98℃10秒，特定退火温度(见表格)30秒以及72℃60秒的35个循环，随后是72℃10分钟的1个循环，然后是4℃。
使用下述的引物序列和退火温度特异性地扩增事件特异性FST-T-DNA连接序列。
表4
在1.5％的琼脂糖凝胶上分析所得到的PCR产物。特异性地产生PCR产物以鉴定事件。表4中给出了详细的条件。
实施例13：通过田间试验确定产量
在田间检测不同的马铃薯事件以确定它们的产量潜能。事件A、B、C和原种事件D(全部都显示出充分的疫霉抗性)的产量与不患病条件下(根据良好农业规范的转基因事件和对照品种的完全植物保护体系)的非转基因母本品系Fontane以及其他标准马铃薯品种例如Bintje比较。
3年间(2008-2010年)在超过15个地点实施了产量试验。对于每个实验都使用具有3-5个区块重复的随机区块设计。每个区块约10-15m2大小，每m2种植有4-6株马铃薯。
根据当地条件在四月或五月种植马铃薯。所有的植物栽培管理，包括植物保护都是基于良好农业规范(GAP)来实施的。于九月/十月进行茎秆杀死，两周之后收获马铃薯块茎。可通过手工或机器来进行收获。在收获地对新鲜收获的马铃薯进行称重，以此来确定块茎产量/ha。使用马铃薯品种Bintje作为对照。标准马铃薯品种Fontane的产量/ha被设定为100％，计算非转基因品系Bintje和经转化的Fontane事件A至D的相对产量。
只有原种事件D展示出与非转基因目标品系相同的产量/ha，而其他事件(如A、B、C)显示出～10％产量的降低(参见图4)。
实施例14：通过田间试验确定疫霉抗性
在田间检测不同的马铃薯事件以确定它们针对致病疫霉的抗性表型。所有事件和非转基因对照(Fontane作为非转基因母本品系；以及Bintje作为易感标准品种)都在田间生长，并不对它们进行针对致病疫霉的杀菌剂处理。5年间(2006-2010年)在超过20个地点实施抗性试验。对于每个实验都使用具有3-5个区块重复的随机区块设计。每个区块约1-15m2大小，每m2种植有4-6株马铃薯。
根据当地条件在四月或五月种植马铃薯。所有的植物栽培管理，除了植物保护之外都是基于良好农业规范(GAP)来实施的。疫霉感染是自然发生的。
疾病症状的等级评定是通过专业人士对患病叶片面积、坏死斑、褪绿病变和致病疫霉潜在孢子形成进行评估来完成的。
将这些数值整合进范围为0-100％的疾病等级中。在评分系统中，0％疾病是指没有肉眼可见的症状，而100％则意味着所有经接种的叶片完全呈褐色，并铺满菌丝，于是该植物已基本上死亡。对易感母本品种Fontane品种的接种一般都导致所有叶片被严重感染。所有叶片感染严重，绿色组织稀少。相反，所有事件A至D的接种导致完全健康的植物，所述植物均具有0％的疾病定级。使用标准品种Bintje作为易感对照，已知该品种对疫霉感染是完全易感的并表现出严重的感染(图5)。
Claims (15)
1.包含与SEQ ID NO：1具有至少80％同一性的核苷酸序列的疫霉抗性转基因马铃薯植物、其种子、块茎、植物细胞或组织。
2.疫霉抗性转基因马铃薯植物、或其种子、块茎、植物细胞或组织，包含：
a)与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3具有至少80％同一性的重组构建体，
b)以及还包含选自以下组中的连接序列：
i)能用于利用具有核苷酸序列SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5的两条引物进行聚合酶链反应扩增介于126和136个碱基对之间的核苷酸片段的核酸序列，
ii)能用于利用具有核苷酸序列SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7的两条引物进行聚合酶链反应扩增介于505和515个碱基对之间的核苷酸片段的核酸序列，
iii)能用于利用具有核苷酸序列SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9的两条引物进行聚合酶链反应扩增介于625和635个碱基对之间的核苷酸片段的核酸序列，和/或
iv)能用于利用具有核苷酸序列SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11的两条引物进行聚合酶链反应扩增介于4752和4762个碱基对之间的核苷酸片段的核酸序列，
和/或还包含选自以下组中的连接序列：
v)能用于利用具有核苷酸序列SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13的两条引物进行聚合酶链反应扩增介于282和292个碱基对之间的核苷酸片段的核酸序列，
vi)能用于利用具有核苷酸序列SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15的两条引物进行聚合酶链反应扩增介于877和887个碱基对之间的核苷酸片段的核酸序列，
vii)能用于利用具有核苷酸序列SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17的两条引物进行聚合酶链反应扩增介于827和837个碱基对之间的核苷酸片段的核酸序列，和/或
viii)能用于利用具有核苷酸序列SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19的两条引物进行聚合酶链反应扩增介于9905和9915个碱基对之间的核苷酸片段的核酸序列。
3.根据权利要求1的疫霉抗性转基因马铃薯、其种子、块茎、植物细胞或组织，包含
a)与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3具有至少80％同一性的重组构建体，以及还包含选自以下组中的连接序列：
b)
i)能用于利用具有核苷酸序列SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5的两条引物进行聚合酶链反应扩增131个碱基对的核苷酸片段的核酸序列，
ii)能用于利用具有核苷酸序列SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7的两条引物进行聚合酶链反应扩增510个碱基对的核苷酸片段的核酸序列，
iii)能用于利用具有核苷酸序列SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9的两条引物进行聚合酶链反应扩增630个碱基对的核苷酸片段的核酸序列，和/或
iv)能用于利用具有核苷酸序列SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11的两条引物进行聚合酶链反应扩增4757个碱基对的核苷酸片段的核酸序列，
和/或还包含选自以下组中的连接序列：
v)能用于利用具有核苷酸序列SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13的两条引物进行聚合酶链反应扩增287个碱基对的核苷酸片段的核酸序列，
vi)能用于利用具有核苷酸序列SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15的两条引物进行聚合酶链反应扩增882个碱基对的核苷酸片段的核酸序列，
vii)能用于利用具有核苷酸序列SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17的两条引物进行聚合酶链反应扩增832个碱基对的核苷酸片段的核酸序列，和/或
viii)能用于利用具有核苷酸序列SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19的两条引物进行聚合酶链反应扩增9910个碱基对的核苷酸片段的核酸序列。
4.提供疫霉抗性转基因马铃薯植物的方法，包括如下步骤：
a)将与SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3具有至少80％同一性的重组核酸导入到马铃薯植物细胞的基因组中，
b)将所述重组核酸整合进基因组，
c)由所述植物细胞再生植物，
d)选择包含与SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3具有至少80％同一性的核酸和选自以下组中的连接序列的植物：
i)能用于利用具有核苷酸序列SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5的两条引物进行聚合酶链反应扩增介于126和136个碱基对之间的核苷酸片段的核酸序列，
ii)能用于利用具有核苷酸序列SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7的两条引物进行聚合酶链反应扩增介于505和515个碱基对之间的核苷酸片段的核酸序列，
iii)能用于利用具有核苷酸序列SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9的两条引物进行聚合酶链反应扩增介于625和635个碱基对之间的核苷酸片段的核酸序列，和/或
iv)能用于利用具有核苷酸序列SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11的两条引物进行聚合酶链反应扩增介于4752和4762个碱基对之间的核苷酸片段的核酸序列，
和/或还包含选自以下组中的连接序列：
v)能用于利用具有核苷酸序列SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13的两条引物进行聚合酶链反应扩增介于282和292个碱基对之间的核苷酸片段的核酸序列，
vi)能用于利用具有核苷酸序列SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15的两条引物进行聚合酶链反应扩增介于877和887个碱基对之间的核苷酸片段的核酸序列，
vii)能用于利用具有核苷酸序列SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17的两条引物进行聚合酶链反应扩增介于827和837个碱基对之间的核苷酸片段的核酸序列，和/或
viii)能用于利用具有核苷酸序列SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19的两条引物进行聚合酶链反应扩增介于9905和9915个碱基对之间的核苷酸片段的核酸序列。
5.根据权利要求4所述的、提供疫霉抗性转基因马铃薯植物的方法，其中在步骤d)中，选择包含与SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3具有至少80％同一性的核酸和选自以下组中的连接序列的植物：
i)能用于利用具有核苷酸序列SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5的两条引物进行聚合酶链反应扩增131个碱基对的核苷酸片段的核酸序列，
ii)能用于利用具有核苷酸序列SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7的两条引物进行聚合酶链反应扩增510个碱基对的核苷酸片段的核酸序列，
iii)能用于利用具有核苷酸序列SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9的两条引物进行聚合酶链反应扩增630个碱基对的核苷酸片段的核酸序列，和/或
iv)能用于利用具有核苷酸序列SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11的两条引物进行聚合酶链反应扩增4757个碱基对的核苷酸片段的核酸序列，
和/或还包含选自以下组中的连接序列：
v)能用于利用具有核苷酸序列SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13的两条引物进行聚合酶链反应扩增287个碱基对的核苷酸片段的核酸序列，
vi)能用于利用具有核苷酸序列SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15的两条引物进行聚合酶链反应扩增882个碱基对的核苷酸片段的核酸序列，
vii)能用于利用具有核苷酸序列SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17的两条引物进行聚合酶链反应扩增832个碱基对的核苷酸片段的核酸序列，和/或
viii)能用于利用具有核苷酸序列SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19的两条引物进行聚合酶链反应扩增9910个碱基对的核苷酸片段的核酸序列。
6.包含用于检测特定整合位置的引物对的试剂盒，所述引物对选自由如下组成的组中：
SEQ ID NO：4和5，
SEQ ID NO：6和7，
SEQ ID NO：8和9，
SEQ ID NO：10和11，
SEQ ID NO：12和13，
SEQ ID NO：14和15，
SEQ ID NO：16和17，和/或
SEQ ID NO：18和19。
7.检测特定整合位置的检测方法，包括：
a)从马铃薯植物、其种子、块茎、植物细胞或组织中分离核酸序列作为测试样品，
b)在PCR条件下将所述测试样品、阳性和阴性样品暴露于选自权利要求6所定义的引物对中至少一组的核苷酸序列，以及评估与所述阳性和阴性对照相比时选自如下组的核苷酸片段的扩增：
i)当使用具有SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应时具有介于126和135个碱基对的核苷酸片段，
ii)当使用具有SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应时具有介于505和515个碱基对的核苷酸片段，
iii)当使用具有SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应时具有介于625和635个碱基对的核苷酸片段，和/或
iv)当使用具有SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应时具有介于4752和4762个碱基对的核苷酸片段，
和/或选自如下组的核苷酸片段的扩增：
v)当使用具有SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应时具有介于282和292个碱基对的核苷酸片段，
vi)当使用具有SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应时具有介于877和292个碱基对的核苷酸片段，
vii)当使用具有SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应时具有介于827和837个碱基对的核苷酸片段，和/或
viii)当使用具有SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应时具有介于9905和9915个碱基对的核苷酸片段。
8.根据权利要求7的检测方法，评估与所述阳性和阴性对照相比时选自以下组的核苷酸片段的扩增：
i)当使用具有SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应时具有131个碱基对的核苷酸片段，
ii)当使用具有SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应时具有510个碱基对的核苷酸片段，
iii)当使用具有SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应时具有630个碱基对的核苷酸片段，和/或
iv)当使用具有SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应时具有4757个碱基对的核苷酸片段，
和/或评估与所述阳性和阴性对照相比时选自以下组的核苷酸片段的扩增：
v)当使用具有SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应时具有287个碱基对的核苷酸片段，
vi)当使用具有SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应时具有882个碱基对的核苷酸片段，
vii)当使用具有SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应时具有832个碱基对的核苷酸片段，和/或
viii)当使用具有SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应时具有9910个碱基对的核苷酸片段。
9.可被权利要求6的试剂盒或权利要求7或8的检测方法检测的植物、其种子、块茎、植物细胞或组织。
10.稳定整合进马铃薯植物细胞核中的多核苷酸，其包含：
a)与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3具有至少80％同一性的重组核酸，以及
b)还包含选自以下组的连接序列：
i)能用于利用具有核苷酸序列SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5的两条引物进行聚合酶链反应扩增131个碱基对的核苷酸片段的核酸序列，
ii)能用于利用具有核苷酸序列SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7的两条引物进行聚合酶链反应扩增510个碱基对的核苷酸片段的核酸序列，
iii)能用于利用具有核苷酸序列SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9的两条引物进行聚合酶链反应扩增630个碱基对的核苷酸片段的核酸序列，和/或
iv)能用于利用具有核苷酸序列SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11的两条引物进行聚合酶链反应扩增4757个碱基对的核苷酸片段的核酸序列，
和/或
iv)能用于利用具有核苷酸序列SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13的两条引物进行聚合酶链反应扩增287个碱基对的核苷酸片段的核酸序列，
v)能用于利用具有核苷酸序列SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15的两条引物进行聚合酶链反应扩增882个碱基对的核苷酸片段的核酸序列，
vi)能用于利用具有核苷酸序列SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17的两条引物进行聚合酶链反应扩增832个碱基对的核苷酸片段的核酸序列，和/或
vii)能用于利用具有核苷酸序列SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19的两条引物进行聚合酶链反应扩增13234个碱基对的核苷酸片段的核酸序列。
11.稳定整合进马铃薯植物细胞核中的多核苷酸，其包含与SEQ IDNO：1具有至少80％同一性的核苷酸序列。
12.权利要求10或11的多核苷酸，其中与SEQ ID NO：1具有至少80％同一性的核苷酸序列包含blb1基因和blb2基因。
13.权利要求12的多核苷酸，其中多核苷酸序列还包含SEQ IDNO：4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18和/或19中的一个或多个。
14.包含权利要求10、11、12或13的多核苷酸的疫霉抗性转基因马铃薯植物、其种子、块茎、植物细胞或组织。
15.权利要求1、2或3的疫霉抗性转基因马铃薯植物、其种子、块茎、植物细胞或组织，其中核苷酸序列或重组构建体包含blb1基因和blb2基因。
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