SU687120A1 - Способ получени антивирусных препаратов из дрожжей - Google Patents

Description

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИВИРУСПЫХ ПРЕПАРАТОВ

ИЗ ДРОЖЖЕЙ

1

Изобретение относитс  к технологии получении физиологически активных веществ дл  сельского хоз йства.

Известен способ получени  антивирусных веществ, преимущественно из дрожжей Candida tropicalis3B и Candida агЬогеа KA/V1..1, выращиваемых на солодовом сусле I. Этот способ включает операции отделени  дрожжевых клеток от культуральной жидкости, концентрировани  культуральной жидкости в вакууме, центрифугировани , диализа и осаждени  целевого продукта органическим растворителем, обработки рибонуклеазой, фенолом и органическим растворителе .м.

Недостатком известного способа  вл етс  низкий , мала  активность получаемого продукта.

Целью изобретени   вл етс  повыщение активности и выхода антивирусных препаратов .

Это достигаетс  применением расы К-41 Cajidida tropicalis в качестве продуцента антивирусных веществ, отличающейс  от ранее использованных дрожжей более высокой продуктивностью и способностью усваивать углерод из пищевого сырь  при повышенных температурных режимах культиви-ровани . Применение минеральной среды Ри дер с глюкозой и биотипом дл  выращивани  дрожжей способствует накоплению значительных количеств антивирусных веществ. Кроме того, концентрирование и очистка веществ с антивирусной активностью достигаютс  диализом через полупроницаемую мембрану против высокомолекул рного гидрофильного вещества - полиэтиленгликол .

из технологической схемы приготовлени  антивирусных препаратов исключаетс  дорогосто ща  рибонуклеазна  обработка, а окончательное высушивание препарата производитс  путем сублимации, что обеспечивает его хорошую растворимость в воде и высокую активность.

По предлагаемо.му способу можно выделить антивирусные препараты как из клеток дрожжей, так и из культуральной жидкости . При этом необходимо последовательное выполнение следующих операций.

Дрожжи Candida tropicalis К-41 выращивают в ферментерах на аэоиоованной

жидкой среде Ридер следующего состава (г/л): (NH4)2SO4 3, NaCl 0,3; MgSO4 0,4; КН2РО4 I; K2HPO/ 0,1; глюкоза 25; биотин 2 мкг/л.

Дрожжевые клетки от культуральной жидкости отдел ют центрифугированием (3000 об/мин в течение 15 мин), высушивают в сублимационной сушке при 30°С, давлении Ю н/м и используют отдельно дл  получени  различных препаратов.

Биомассу дрожжей гомогенизируют в сухом и влажном виде в присутствии абразива , растворимые вещества экстрагируют теплой (до 45°С) водой и концентрируют с помощью водного раствора высокомолекул рного по тиэтиленгликол  (молекул рна  масса 15000) через полупроницаемую (цел-, лофановую) мембрану. Растворенные в воде концентраты культуральной жидкости или дрожжевого, экстракта центрифугируют (5000 об/мин в течение 15мин) дл  удалени  нерастворимого остатка, добавл ют равный объем смеси водонасыщенного фенола к «-бутанола (10;1) и эмульгируют при ко.мнатной температуре в течение 30 мин. Водную фазу отдел ют центрифугирование.м (3000 об/мин в течение 30 мин), диализируют против проточной воды (48 час) дл  удалени  остатков феноал и н-бутанола и концентрируют до минимального объема (0,2-0,3 лJ с помощью полиэтиленгликол  через полупроницаемую мембрану. Целевой продукт из концентрата осаждают органическим растворителем (80 %-ньш этанолом) при низкой (2°С) температуре. Осадок уплотн ют центрифугированием (5000 об/мин в течение 15 мин) и раствор ют в теплой (до 45°С) воде. Раствор центрифугируют (5000 об/мин в течение 15 мин) осадок отбрасывают, а сунернатант повторно обрабатывают фенолом и органическими растворител ми, как указано выще. Окончательное высушивание препарата из водного раствора осуществл ют в субли.мационной сушке (-30°С, 10 н/м).

Пример 1. В качестве источника антивирусного препарата использована био.масса дрожжей Candida tropicalis К-41. Из 500 г су.хих дрожжей ио предлагаемому способу получено 11,0 г препарата, что составл ет 2,2 вес. % исходного материала. Препарат имеет вид а.морфного белого порощка, хорощо растворим в воде, в растворе термостабилен . Влажность лиофилизированного препарата 5,0%, препарат слабо гигроскопичен , может длительное врем  хранитьс  в сухом месте без изменени  физических свойств и антивирусной активности.

Пример 2. В качестве источника антивирусного препарата использована культура льна  жидкость, не содержаща  дрожжевых клеток. Из 20 л культуральной жидкости (около 50 г сухих веществ) по предлагаемому способу получено 2,2 г препарата, т. е. около 4,4 вес. % исходного продукта. Выделенный препарат - белый аморфный порошок , хорошо растворим в воде, в растворе термостабилен, его влажность не превыщает 6%; может хранитьс  длительное врем  в сухом месте без потери порошковидной консистенции, растворимости и антивирусной активности.

Общий выход препаратов из биомассы и культуральной жидкости дрожжей достигает 3,3% сухого веса исходного материала.

В табл. 1 приведены сведени  о хи.мическом составе препаратов, в табл. 2 и 3 - результаты испытани  их активности в отнощении вируса табачной мозаики и Х-вируса картофел .

Препараты состо т преимущественно из полисахаридов (около 70%), примеси белков не превыщают I-3%, нуклеиновых кислот 0.21-0,26% (табл. 1). Седиметационным анализом установлена гомогенность пренарата , выделенного из дрожжевых клеток, молекул рна  масса присутствующего в нем полисахарида маннана равна 14000. Препарат , полученный из культуральной жидкости дрожжей - полидисперсный.

Оба препарата обладают выраженной активностью в отношении вируса табачной мозаики и Х-вируса картофел ; 50%-ное снижение инфекционности вируса табачной мозаики наблюдаетс  в 0,0001-0,001/о-ной концентрации препаратов (табл. 2). Препараты подавл ют накопление Х-вируса картофел  в листь х дурмана, реагирующих системным заболеванием на заражение этим вирусом (табл. 3), и увеличивают выход безвирусных растений в культуре апикальных меристем. Хвмвческвй составакгёвирусных -препаратов, полученных нз К-41 (% сухого веса препарата)

Источввх Редудирукидие вещества. Белки Нуклеиновые обнаруженные в гнаро-кислоты

лизатах(РНК)

микромето- автроновым дом Хаге- методом дорка-Иенсева

Инактиваци  вируса табачной мозаики препаратами, полученными из дрожжей Canc/tc/д iropicali К-41 Примечани

Таблица 1

Фосфор

ОбщийНуклеотвдный

Таблида2 е: Опытные половивкн листьев Sifa.mon.wmннокулировалн вирусом табачной мозаики в присутствии антивирусного препарата в соответствующей концентрации, контрольные - вирусом без антивирусного препарата. дрожжей Canctc/a troptcafts

Влв Еве автввнрусвых препаратов йа рвп(5одукнвю Х- вируса картлзфеп  в листь х

Datura. Stra.m.on.t.um.

Ивфекциоввость ввруса в экстрактах

Концентраци  из листьев Bltuf-a Stramoaiunt препарата, % культивируемых

ва растворе ингибитора

Р ОД

 

42

ОД

Р 0,5 Примечани :

Claims (2)

1. Формула изобретени 

   Способ получени  антивирусных препаратов из дрожжей, включающий культивирование дрожжей, отделение от культуральной жидкости дрожжевых клеток и раздельную обработку их путем концентрировани  культуральной жидкости в вакууме, а дрожжевых клеток путем гомогенизации, экстракции, концентрировани  экстракта, диализа, осаждени  целевого продукта, обработки его фенолом и органическими растворител ми , отличающийс  тем, что, с целью повышени  активности и выхода антивирусного препарата, в качестве исходной

   ТабпнааЗ

   Снижение инфекпионности,

   %

   на воде

   87,5

   187

   культуры дрожжей используют расу К-41 Candida tropicalis, культивирование которой провод т на минеральной среде Ридер с глюкозой и биотином, а концентрирование дрожжевого экстракта провод т полиэтиленгликолем через полупроницаемую мембрану и после обработки фенолом и органическим растворителем целевой продукт из дрожжевого экстракта высушивают сублимацией .

   Источники информации, прин тые во внимание при экспертизе 1. Авторское свидетельство СССР № 302368, кл. С 12 К 5/00, 1971. 1. Опытные половинки листьев содержат в течение 2 дней на растворе ингибитора у контрольные - на воде, а затем инокупируют X-вирусом картофел , титр вируса определ ют на 7-в день опыта путем подсчета местных некрозов, образовавшихс  в результате ннокул ции экстрактами листьев гомфрены.
2. 2. Р- уровень значимости разности инфекдионности вируса в опыте и контроле, %.