CN110731977B - 一种柞树皮提取物的制备方法和应用 - Google Patents

一种柞树皮提取物的制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN110731977B
CN110731977B CN201911192915.6A CN201911192915A CN110731977B CN 110731977 B CN110731977 B CN 110731977B CN 201911192915 A CN201911192915 A CN 201911192915A CN 110731977 B CN110731977 B CN 110731977B
Authority
CN
China
Prior art keywords
oak bark
extracting
extract
bark extract
extraction
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201911192915.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110731977A (zh
Inventor
朴玉兰
张春杨
钱琨
孙继红
杨淑芳
王茹
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
JILIN SERICULTURE SCIENTIFIC RESEARCH INSTITUTE
Original Assignee
JILIN SERICULTURE SCIENTIFIC RESEARCH INSTITUTE
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by JILIN SERICULTURE SCIENTIFIC RESEARCH INSTITUTE filed Critical JILIN SERICULTURE SCIENTIFIC RESEARCH INSTITUTE
Priority to CN201911192915.6A priority Critical patent/CN110731977B/zh
Publication of CN110731977A publication Critical patent/CN110731977A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110731977B publication Critical patent/CN110731977B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
    • A61K2236/30—Extraction of the material
    • A61K2236/33—Extraction of the material involving extraction with hydrophilic solvents, e.g. lower alcohols, esters or ketones
    • A61K2236/333—Extraction of the material involving extraction with hydrophilic solvents, e.g. lower alcohols, esters or ketones using mixed solvents, e.g. 70% EtOH
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
    • A61K2236/30—Extraction of the material
    • A61K2236/39—Complex extraction schemes, e.g. fractionation or repeated extraction steps
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
    • A61K2236/50—Methods involving additional extraction steps
    • A61K2236/51—Concentration or drying of the extract, e.g. Lyophilisation, freeze-drying or spray-drying
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
    • A61K2236/50—Methods involving additional extraction steps
    • A61K2236/53—Liquid-solid separation, e.g. centrifugation, sedimentation or crystallization

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Alternative & Traditional Medicine (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)

Abstract

本发明提供了一种柞树皮提取物的制备方法和应用，属于天然药物提取技术领域，包括以下步骤：1)将柞树皮与乙醇溶液混合后进行提取、过滤，将得到的滤液干燥，得到干燥物；2)将所述步骤1)得到的干燥物溶解于水中，得到混合液，将所述混合液经等体积的石油醚萃取，得到石油醚相和水相；3)将所述步骤2)得到的水相经等体积的乙酸乙酯萃取，得到萃取液，除去萃取液中的乙酸乙酯、干燥，得到柞树皮提取物。采用本发明的方法得到的柞树皮提取物中含有黄酮，总黄酮的含量为8.262％，柞树皮提取物能够抑制15‑羟基前列腺素脱氢酶，还能够促进伤口愈合。

Description

一种柞树皮提取物的制备方法和应用
技术领域
本发明属于天然药物提取技术领域，尤其涉及一种柞树皮提取物的制备方法和应用。
背景技术
随着功能基因在人生理、生化及发病过程中所起作用不断认识，利用功能基因寻求药物作用的新靶点，进而发现新作用机智的新药。15-羟基前列腺素脱氢酶(15-PGDH)是前列腺素(Prostaglandins，PGs)的降解酶，可将其转变为没有活性的PGE2。环氧合酶2(Cyclooxygenase2，COX2)是合成PGs的限速酶。15-羟基前列腺素脱氢酶是前列腺素生物降解关键酶，对环氧和酶-2(COX-2)具有生理性拮抗作用，其表达与多种肿瘤发生、发展有关系。前列腺素是存在于动物和人体中的一类不饱和脂肪酸组成的、具有多种生理作用的活性物质。
随着生命科学基础研究的不断发展和许多生命科学技术使用，越来越多的药物作用新靶点、新模型和药物研究新方法被发现，不断促进新药研究的飞速发展。药物筛选是新药发现的关键步骤，药物筛选技术包括高通量筛选技术。是利用生命科学基础研究中发现新靶点，研究细胞、分子和基因水平微量、快速、准确的新型药物筛选模型和方法。但是现有技术中还未有关于从柞树中提取活性物质来抑制15-羟基前列腺素脱氢酶的报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种柞树皮提取物的制备方法和应用，采用本发明提供的方法从柞树皮中提取得到的柞树皮提取物，能够抑制15-羟基前列腺素脱氢酶，还能够促进伤口愈合。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种柞树皮提取物的制备方法，包括以下步骤：
1)将柞树皮与乙醇溶液混合后进行提取、过滤，将得到的滤液干燥，得到干燥物；
2)将所述步骤1)得到的干燥物溶解于水中，得到混合液，将所述混合液经等体积的石油醚萃取，得到石油醚相和水相；
3)将所述步骤2)得到的水相经等体积的乙酸乙酯萃取，得到萃取液，除去萃取液中的乙酸乙酯、干燥，得到柞树皮提取物。
优选的，所述步骤1)乙醇溶液的体积百分含量为60～70％。
优选的，所述步骤1)提取的条件包括：所述提取的温度为60～70℃，所述提取的时间为80～100min，所述提取的次数为2次。
优选的，所述柞树皮的粒径为50～70目，所述柞树皮的质量与乙醇溶液的体积比为1g:25～32ml。
优选的，所述步骤2)石油醚萃取的条件包括：震荡25～35min后静置1～2h，萃取3次。
优选的，所述步骤2)乙酸乙酯萃取的条件包括：震荡25～35min后静置1～2h，萃取3次。
本发明还提供了上述技术方案所述的制备方法制备得到的柞树皮提取物在制备抑制15-羟基前列腺素脱氢酶的药物中的应用。
本发明还提供了上述技术方案所述的制备方法制备得到的柞树皮提取物在制备促进伤口愈合的药物中的应用。
本发明提供了一种柞树皮提取物的制备方法和应用，包括以下步骤：1)将柞树皮与乙醇溶液混合后进行提取、过滤，将得到的滤液干燥，得到干燥物；2)将所述步骤1)得到的干燥物溶解于水中，得到混合液，将所述混合液经等体积的石油醚萃取，得到石油醚相和水相；3)将所述步骤2)得到的水相经等体积的乙酸乙酯萃取，得到萃取液，除去萃取液中的乙酸乙酯、干燥，得到柞树皮提取物。采用本发明的方法得到的柞树皮提取物中含有黄酮，总黄酮的含量为8.262％，柞树皮提取物能够抑制15-羟基前列腺素脱氢酶，还能够促进伤口愈合。
附图说明
图1为PGEX-4T-15PGDH重组DNA的双酶切电泳图，其中M：DNA ladder，1：重组15-PGDH DNA；
图2为分离纯化后的15-PGDH蛋白质结果，其中M:Protein marker，1：10μg纯化15-PGDH蛋白质，2：5μg纯化15-PGDH蛋白质；
图3为不同浓度QMB-Ea在HaCaT细胞中PGE2释放效果；
图4为在HaCaT细胞中空白组、对照组TGF-β1和QMB-Ea的增长效果；
图5为空白组、对照组和QMB-Ea的细胞中伤口愈合效率；
图6为第0天、第3天、第6天、第9天、第12天和第15天的空白组和QMB-Ea药物组老鼠的伤口愈合；
图7为第4天、第7天和第15天的大鼠脱颈处死后取身上伤口愈合的组织进行固定包埋和HE染色结果。
具体实施方式
本发明提供了一种柞树皮提取物的制备方法，包括以下步骤：
1)将柞树皮与乙醇溶液混合后进行提取、过滤，将得到的滤液干燥，得到干燥物；
2)将所述步骤1)得到的干燥物溶解于水中，得到混合液，将所述混合液经等体积的石油醚萃取，得到石油醚相和水相；
3)将所述步骤2)得到的水相经等体积的乙酸乙酯萃取，得到萃取液，除去萃取液中的乙酸乙酯、干燥，得到柞树皮提取物。
本发明将柞树皮与乙醇溶液混合后进行提取、过滤，将得到的滤液干燥，得到干燥物。
在本发明中，所述柞树皮的粒径优选为50～70目，更优选为60目；所述柞树皮的质量与乙醇溶液的体积比优选为1g:25～32ml，更优选为1g:29ml。在本发明中，所述乙醇溶液的体积百分含量优选为60～70％，更优选为65％。在本发明中，所述乙醇溶液提取的条件包括：所述提取的温度优选为60～70℃，更优选为64℃；所述提取的时间优选为80～100min，更优选为90min；所述提取的次数优选为2次。在本发明中，所述柞树皮与乙醇溶液混合后进行提取，得到提取液，将所述提取液过滤、干燥后得到干燥物，本发明对所述过滤的条件没有特殊限定，采用常规过滤条件即可，所述干燥优选采用常规方法将过滤液中的乙醇和水蒸发去掉。在本发明中，所述干燥物中含有黄酮，总黄酮的含量为0.674％，纯度为7.16％。
本发明将得到的干燥物溶解于水中，得到混合液，将所述混合液经等体积的石油醚萃取，得到石油醚相和水相。
在本发明中，若干燥物不能完全溶于水，采用超声或者加热处理方法，使干燥物完全溶于水中，所述干燥物与水的质量比优选为4.0194:30。
在本发明中，所述石油醚萃取的条件优选包括：震荡25～35min后静置1～2h，萃取3次；所述震荡的时间更优选为30min，所述静置的时间更优选为1.5h。在本发明中，所述震荡优选人工手动用力震荡。在本发明中，所述水相中含有黄酮。在本发明中，所述石油醚除去一些极性很小的化学成分，如挥发油类成分，萜类成分等。
本发明将得到的水相经等体积的乙酸乙酯萃取，得到萃取液，除去萃取液中的乙酸乙酯、干燥，得到柞树皮提取物。
在本发明中，所述乙酸乙酯萃取的条件优选包括：震荡25～35min后静置1～2h，萃取3次。在本发明中，所述震荡的时间更有选为30min，所述静置的时间更有选为1.5h。在本发明中，所述震荡优选人工手动用力震荡。
本发明对除去萃取液中的乙酸乙酯和干燥的条件没有特殊限定，采用常规条件即可。在本发明中，所述柞树皮提取物中含有黄酮，总黄酮的含量为8.262％。
本发明还提供了上述技术方案所述的制备方法制备得到的柞树皮提取物在制备抑制15-羟基前列腺素脱氢酶的药物中的应用。本发明对所述药物的剂型没有特殊限定，采用柞树皮提取物在医学上可接收的剂型种类即可，本发明对所述药物中含有的柞树皮提取物的含量没有特殊限定，采用常规药物中活性物质含有的量即可。本发明对所述药物的制备方法没有特殊限定，采用药物相应剂型的常规制备方法即可。
本发明还提供了上述技术方案所述的制备方法制备得到的柞树皮提取物在制备促进伤口愈合的药物中的应用。本发明对所述药物的剂型没有特殊限定，采用柞树皮提取物在医学上可接收的剂型种类即可，本发明对所述药物中含有的柞树皮提取物的含量没有特殊限定，采用常规药物中活性物质含有的量即可。本发明对所述药物的制备方法没有特殊限定，采用药物相应剂型的常规制备方法即可。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
柞树皮提取物的分离提取：
取新鲜柞树皮，自然晾干，晾干后粉碎并过60目筛，以65％乙醇、提取温度为64℃、料液比为1：29、提取时间为90min、过滤后重复提取两次，合并两次滤液，冷却后将溶剂蒸发，得到干燥固体称为干燥物(以下简称QMB-TF)，其中总黄酮提取率为0.647％，总黄酮纯度为7.16％。
取4.0194g完全干燥后的QMB-TF，加入25ml蒸馏水搅拌溶解，并在搅拌过程中缓缓补加5ml蒸馏水，不溶物用超声或者加热处理。先用等体积的石油醚，用力震摇30min后静置1.5h后分液，萃取三次，石油醚相合并保存。取萃取后的水相，加入等体积的乙酸乙酯，用力震摇30min后静置1.5h后分液，萃取三次并合并三次的乙酸乙酯萃取相，回收萃取溶剂，得到0.9g干燥固体，即柞树皮提取物(以下简称QMB-Ea)。柞树皮提取物中总黄酮含量为8.262％。
实施例2
构建15-PGDH(15-羟基前列腺素脱氢酶)表达体系
15-PGDH(15-羟基前列腺素脱氢酶)基因合成以及目的基因扩增
(1)在NCBI基因库中搜索15-羟基前列腺素脱氢酶的核苷酸序列，序列如SEQ IDNo.1所示，具体如下：
tgcacgtgaacggcaaagtggcgctggtgaccggcgcggctcagggcataggcagagcctttgcagaggcgctgctgcttaagggcgccaaggtagcgctggtggattggaatcttgaagcaggtgtacagtgtaaagctgccctggatgagcagtttgaacctcagaagactctgttcatccagtgcgatgtggctgaccagcaacaactgagagacacttttagaaaagttgtagaccactttggaagactggacattttggtcaataatgctggagtgaataatgagaaaaactgggaaaaaactctgcaaattaatttggtttctgttatcagtggaacctatcttggtttggattacatgagtaagcaaaatggaggtgaaggcggcatcattatcaatatgtcatctttagcaggactcatgcccgttgcacagcagccggtttattgtgcttcaaagcatggcatagttggattcacacgctcagcagcgttggctgctaatcttatgaacagtggtgtgagactgaatgccatttgtccaggctttgttaacacagccatccttgaatcaattgaaaaagaagaaaacatgggacaatatatagaatataaggatcatatcaaggatatgattaaatactatggaattttggacccaccattgattgccaatggattgataacactcattgaagatgatgctttaaatggtgctattatgaagatcacaacttctaagggaattcattttcaagactatgatacaactccatttcaagcaaaaacccaatga。
(2)已知目的15-羟基前列腺素脱氢酶基因的核苷酸序列，核苷酸合成由闪晶生物技术公司完成。
(3)根据NCBI收录的15-羟基前列腺素脱氢酶基因的核苷酸序列，设计了引物。
表1 引物序列
Primer 序号 Sequences
Forword SEQ ID No.2 tgcgagcaaaggattcctg
Reverse SEQ ID No.3 gtgcggctggtgcgaaacgcg
(4)根据设计的引物，以合成的15-PGDH基因为模板，进行了PCR，PCR反应体系下表所示：
表2 PCR反应体系
Figure BDA0002294025280000061
(5)PCR反应程序设置如下：94℃2min；95℃1min，55℃30s，72℃1min，30cycles；72℃5min；反应完成后4℃保存。
(6)PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测(120V,30min)。
PCR产物纯化：
PCR产物一般都含有过量的引物、Taq酶、及dNTP,这些成分的存在将直接影响到后续的PCR产物测序的等过程，因此需要把PCR产物纯化后进行了下一步骤。本实验用1％琼脂糖凝胶电泳PCR产物，然后利用天根生产的PCR回收试剂盒来回收PCR产物。
限制性酶切
利用限制内切酶(BamHI/XhoI)，酶切15-PGDH pcr产物及质粒载体PGEX-4T-1。
表3 酶切反应
Figure BDA0002294025280000071
把反应液37℃下放置2小时，65℃下失活。然后利用天根生产的普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒来回收PCR产物。具体回收DNA操作如下：
(1)柱平衡步骤：向吸附柱CA2中(吸附柱放入收集管中)加入500μl平衡液BL，12000rpm离心1min。
(2)将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下，放入干净的离心管中，称取重量。
(3)向胶块中加入等倍体积溶液PN，50℃水浴放置，期间不断温和上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。
(4)将上一步所得溶液加入一个吸附柱CA2中，室温放置2min，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中废液，将吸附柱CA2放入收集管中。
(5)向吸附柱CA2中加入600μl漂洗液PW，12000rpm离心1min，倒掉收集管中废液，将吸附柱CA2放入收集管中。
(6)重复操作步骤5。
(7)将吸附柱CA2放回收集管中，12000rpm离心2min。
(8)将吸附柱CA2放到一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12000rpm离心2min收集DNA溶液。
PCR产物和载体连接
表4 连接反应液
Figure BDA0002294025280000081
(1)混匀样品冰短暂离心使样品全部沉于管底。
(2)将反应液放置16℃下过夜。
连接产物转化
(1)取100μl贮存于-70℃钙化菌DH5a，冰浴化开。
(2)加入适量连接产物，轻轻混匀，冰浴30min。
(3)于42℃热休克90s，迅速转移至冰浴中，继续冰浴2min。
(4)加入LB液体培养基200μl，于37℃缓摇孵育45min。
(5)将培养物适量涂于1.5％琼脂LB平板，待胶表面没有液体流动时，37℃温箱倒置培养12-16hr。
转化产物确认
将转化后的质粒菌利用质粒DNA纯化试剂盒来回收PCR产物。具体回收DNA操作如下：
(1)挑取LB固体培养基上生长的单菌落，接种于2.0ml LB(含相应抗生素)液体培养基中，37℃、200rpm振荡培养过夜。
(2)取1.5ml培养物入微量离心管中，室温离心8000g×1min，弃上清，将离心管倒置，使液体尽可能流尽。将剩余的培养物贮存于4℃。
(3)将细菌沉淀重悬于100μl预冷的溶液Ⅰ中，剧烈振荡，使菌体分散混匀。须确使细菌沉淀在溶液Ⅰ中完全分散，将两个微量离心管的管底部互相接触震荡，可使沉淀迅速分散。
(4)加200μl新鲜配制的溶液Ⅱ，颠倒数次混匀(不要剧烈振荡)，并将离心管放置于冰上2-3min，使细胞膜裂解(溶液Ⅱ为裂解液，故离心管中菌液逐渐变清)。
(5)加入150μl预冷的溶液Ⅲ，将管温和颠倒数次混匀，见白色絮状沉淀，可在冰上放置3-5min。溶液Ⅲ为中和溶液，此时质粒DNA复性，染色体和蛋白质不可逆变性，形成不可溶复合物，同时K+使SDS-蛋白复合物沉淀。
(6)加入450μl的苯酚/氯仿/异戊醇，振荡混匀，4℃离心12000g×10min。
(7)小心移出上清于一新微量离心管中，加入2.5倍体积预冷的无水乙醇，混匀，室温放置2-5min，4℃离心12000g×15min。
(8)1ml预冷的70％乙醇洗涤沉淀1-2次，4℃离心8000g×7min，弃上清，将沉淀在室温下晾干。
(9)沉淀溶于20μl TE(含RNaseA20μg/ml)，37℃水浴30min以降解RNA分子，-20℃保存备用。
(10)纯化后的质粒DNAl利用限制酶BamHI、XhoI双酶切后，1％琼脂糖凝胶电泳检测(120V，30min)。
结果如图1所示，从图1中可以得出成功构建了重组15-PGDH蛋白质的表达载体。
15-PGDH(15-羟基前列腺素脱氢酶)蛋白质纯化
工程菌发酵
(1)挑取少量PGEX-4T-1-15-PGDH/BL21(DE3)菌体接种于含Amp(终浓度100μg/ml)的500ml LB液体培养基中，于37℃培养过夜。
(2)以1％的接种量将上述一级培养物接种于含Amp(终浓度100μg/ml)的500ml LB液体培养基中，恒温培养2h后(OD600约为0.5)，加入诱导剂IPTG终浓度1mM，继续37℃培养。
(3)诱导后培养12h后收集菌体，4℃、6000rpm离心10min，弃上清液，菌体沉淀置于-20℃保存待用。
细胞破碎
(1)将重组菌的培养液(500ml)置于离心杯中,4000r/min，常温离心20min，分别收集菌体，置于塑料离心管，-20℃保存。
(2)在重组菌中加入20ml 0.01mol/LpH8.0 Tris-HCl缓冲液，搅拌混匀。
(3)将上述菌体悬浮液盛放在10ml小烧杯中，冰浴条件下在超声波仪中进行细胞破壁，超声波仪设定：功率400W，工作5s，间隔5s，工作60次。
(4)将细胞破壁液置于塑料离心管中，低温高速离心机，于4℃、12000r/min、离心20min。
重组蛋白质分离纯化
(1)将菌体沉淀溶于适量裂解液2(Lysis buffer under denaturingconditions)中，室温下搅拌和吹打沉淀，避免泡沫生成。
(2)10000g、4℃离心30min，收集上清液。
(3)将谷胱甘肽琼脂糖树脂充填柱子，并连接于Pharmarcia低压液相层析系统，用5倍柱体积的裂解液2平衡谷胱甘肽琼脂糖树脂，调节A280值至零线。
(4)将适量上清液上样到谷胱甘肽琼脂糖树脂柱子中，并用lysis buffer冲洗至A280值低于0.01。
(5)分别用5～10倍柱体积的清洗液1和清洗液2(Washbuffer 1and2)清洗柱子，直至A280值低于0.01。
(6)用洗脱液(Elutionbuffer)洗脱重组蛋白质，在A280值监测下，收集出现峰线后含有重组蛋白的所有洗脱液。
结果如图2所示，图2为分离纯化后的15-PGDH蛋白质。
实施例3
实施例1得到的QMB-TF、QMB-Ea的15-PGDH抑制活性及HaCaT细胞毒性
QMB-TF、QMB-Ea对这两种柞树皮提取物进行了细胞毒性以及15-PGDH的抑制活性。
细胞毒性实验
在96孔板里加入5×104/ml HaCaT细胞90μl，5％CO2，37℃孵育18小时。加药(6个梯度，分别为500μg/ml、166.67μg/ml、55.56μg/ml、18.52μg/ml、6.17μg/ml、2.06μg/ml)，5％CO2，37℃孵育48小时后加入10μl MTT，继续培养4小时。4小时后再加入150μl DMSO，振摇10min后在OD540nm处利用酶标仪检测吸光值。
15-PGDH抑制活性
比色皿里加入50mM Tris–HCl(pH 7.5)、0.1mM DTT、0.25mMNAD+、10μg分离纯化的15-PGDH蛋白质(实施例2制备)、21μM PGE2和不同浓度(浓度分别为0μg/ml、2μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml)的15-PGDH抑制剂(QMB-TF、QMB-Ea)，在激发波长340nm、发射波长468nm用荧光分光光度计测定反应所形成的NADH的含量，利用绘制的NADH标准曲线测定15-PGDH抑制效能。
表5 15PGDH抑制活性及细胞毒性
序列号 抑制剂 15-PGDH抑制IC50 细胞毒性IC50
1 QMB-TF 20.49(μg/ml) >500(μg/ml)
2 QMB-Ea 2.16(μg/ml) >500(μg/ml)
从表5中可以得出，QMB-TF和QMB-Ea在HaCaT细胞的毒性大于500μg/ml，QMB-TF的15-PGDH的抑制效能IC50为20.49μg/ml和QMB-Ea的15-PGDH的抑制效能IC50为2.16μg/ml。
PGE2的释放
在6孔板里加入2.5×105/ml HaCaT细胞2ml，5％CO2，37℃孵育18小时。不同浓度加药(6个浓度，分别为0μg/ml、2μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml)，5％CO2，37℃孵育12小时后取上清液。PGE2释放量利用PGE2试剂盒检测。结果如图3所示。
从图3中可以看出，QMB-Ea在HaCaT细胞中释放的PGE2的含量，随着浓度的增加而明显增加，当药物浓度为30μg/ml时PGE2的释放量比空白组增加了5.76倍。但QMB-TF在HaCaT细胞中释放的PGE2的含量，根据浓度的变化无明显变化。
实施例4
细胞划痕
细胞培养
Hacat细胞采用含10％胎牛血清，1％双抗(青链霉素混合液)的DMEM培养液，置于37℃、5％CO2的培养箱中进行培养。显微镜下观察细胞为贴壁细胞。
实验方法
(1)将对照组和实验组细胞消化计数后取8×105个分入35mm2培养皿中培养过夜；
(2)在盘底用记号笔画线作为标记，吸去培养液，用10μL枪头垂直于记号笔标记划去盘中细胞；
(3)用PBS冲洗去除划下的细胞，进行处理，每组2复孔，实验分组如下：
空白组：加入正常无血清培养液。
TGF-β1：加入含1ng/ml样品1的无血清培养液。
QMB-Ea：加入含20μg/ml样品2的无血清培养液。
置于37℃培养箱中培养。
(4)在划痕0h/24h/48h，取各时间点分别拍照，拍照时选取记号笔画的线和细胞划痕的交点作为观察点，以定点观察。
为了研究体外伤口愈合的效果，在HaCaT细胞系中进行了划痕实验结果见图4和图5。图4是在HaCaT细胞中空白组、对照组TGF-β1和QMB-Ea的增长效果，图5表示空白组、对照组和QMB-Ea的细胞中伤口愈合效率。结果在48小时后TGF-β1相对空白组有169％细胞生长的效果，QMB-Ea相对空白组有151％的细胞生长(P<0.05)。
实施例5
伤口愈合invivo实验
模型构建
大鼠适应性饲养一周后，用乙醚麻醉SD大鼠后，用剃毛机把大鼠背部毛发剃干净，并用酒精擦拭皮肤，在大鼠背部皮肤后剪切1cm*1cm的圆形伤口，为了防止由于皮肤收缩而影响实验结果，伤口周围用橡胶圈缝好固定周围皮肤。
给药方法
空白组：生理盐水使用无菌0.9％氯化钠溶液每天上午和下午用移液枪分别吸取0.2ml溶液滴在伤口上，伤口照片每隔三天进行拍照。
QMB-Ea(实施例1)：提供样本剂量是5mg，稀释至0.15mg/mL(生理盐水)的浓度进行涂抹给药(每次给药200μL，即30μg/只/次)。将配置好的药物每天上午和下午用移液枪分别吸取0.2ml溶液滴在伤口上，伤口照片每隔三天进行拍照
取材
手术饲养第四天，将每组大鼠抽选一只脱颈处死后，取伤口未愈合的皮肤的进行固定包埋，以备做后续HE染色。
手术饲养第七天，再将每组大鼠抽选一只脱颈处死后，取伤口未愈合的皮肤的进行固定包埋，以备做后续HE染色。
实验结束后，将全部大鼠脱颈处死，取身上伤口愈合的组织进行固定包埋，以备做后续的HE染色。
HE染色样本包埋与固定
取材和固定
切取组织时应使用锋利的刀、剪，切取组织块时，从刀的根部开始向后拉动切开组织。组织块的厚度约为0.2～0.3cm，大小为1.5cm×1.5cm x 0.3cm为宜。取好的组织块置于10％福尔马林中固定48小时。
洗涤与脱水
将固定后的组织用流水冲洗，去除残留的固定液和杂质。不同浓度的乙醇逐级脱水，50％、70％、85％、95％直至纯酒精(无水乙醇)，每级2小时。脱水必须在有盖的瓶中进行，以防止高浓度乙醇吸收空气中水分导致浓度降低而使脱水不彻底。需要保存的材料可脱水至70％乙醇时停留其中，如需长期保存，可加入等量的甘油。
透明
将组织块置入纯乙醇和二甲苯的等体积混合液中2小时，再进入纯二甲苯两小时，再一次纯二甲苯两小时；材料经过透明，会显示出前一步脱水的效果如何，若脱水彻底，组织则显现透明状态，如组织中有白色云雾状，说明脱水不净，须返工处理，但返工的效果往往不好。使用二甲苯透明时，应避免其挥发和吸收空气中的水分，并保持其无水状态。
浸蜡
浸蜡须在恒温箱中进行。先把组织材料块放在熔化的石蜡和二甲苯的等量混合液浸渍1～2小时，再先后移入2个熔化的石蜡液中浸渍各3小时左右。
包埋
包埋是使浸透蜡的组织块包裹在石蜡中。具体做法是：先准备好纸盒，将熔蜡倒入盒内，迅速用预温的镊子夹取组织块平放在纸盒底部，切面朝下，再轻轻提起纸盒，平放在冷水中，待表面石蜡凝固后立即将纸盒按入水中，使其迅速冷却凝固，30min后取出。
切片
切片前将蜡块在-20℃冰箱中至少放置30min，以增加硬度。将切片刀装在刀片机的刀架上并固定紧，固定蜡块底座或蜡块，调整蜡块与刀至合适位置，刀刃与蜡块表面呈5度角。调整切片机上的切片厚度为4-7μm，然后切片。
HE染色
将玻片置于65℃恒温烘箱中烤片30min；置于二甲苯I中浸泡15min，再置于二甲苯II中浸泡15min。将脱蜡后的切片经100％酒精、95％酒精、85％酒精、75％酒精分别浸泡5min，自来水冲洗10min。将已入蒸馏水后的切片放入苏木素水溶液中染色5min，氨水中分色，数秒钟。流水冲洗15min，入70％和90％酒精中脱水各10min。入酒精伊红染色液染色1-2min，染色后的切片经纯酒精脱水。将玻片置于二甲苯中透明3min×2次，中性树胶封片，放入65℃烘箱中15min。
通过显微镜拍照，采集分析样本相关部位，结果见图6和图7。
图6是第0天、第3天、第6天、第9天、第12天和第15天的空白组和QMB-Ea药物组老鼠的伤口愈合照片。QMB-EaF药物组对比空白组，第3天开始就有明显的治愈伤口效果，到第15天时QMB-EaF药物组的伤口已基本上治愈。QMB-Ea药物组的伤口愈合效果明显的比对照组伤口愈合好。图7是第4天、第7天和第15天的大鼠脱颈处死，取身上伤口愈合的组织进行固定包埋和HE染色。第4天和第7天HE染色结果QMB-Ea药物组的伤口明显小于空白组伤口，在第15天QMB-EaF药物组伤口比空白组出现很多囊以及毛球，还有QMB-EaF药物组比空白组表皮层比空白组薄。说明QMB-Ea药物组具有很好的伤口愈合效果。
由以上实施例可以得出，采用本发明的制备方法提取得到的柞树皮提取物能够抑制15-羟基前列腺素脱氢酶，还能够促进伤口愈合。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 吉林省蚕业科学研究院
<120> 一种柞树皮提取物的制备方法和应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 800
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgcacgtgaa cggcaaagtg gcgctggtga ccggcgcggc tcagggcata ggcagagcct 60
ttgcagaggc gctgctgctt aagggcgcca aggtagcgct ggtggattgg aatcttgaag 120
caggtgtaca gtgtaaagct gccctggatg agcagtttga acctcagaag actctgttca 180
tccagtgcga tgtggctgac cagcaacaac tgagagacac ttttagaaaa gttgtagacc 240
actttggaag actggacatt ttggtcaata atgctggagt gaataatgag aaaaactggg 300
aaaaaactct gcaaattaat ttggtttctg ttatcagtgg aacctatctt ggtttggatt 360
acatgagtaa gcaaaatgga ggtgaaggcg gcatcattat caatatgtca tctttagcag 420
gactcatgcc cgttgcacag cagccggttt attgtgcttc aaagcatggc atagttggat 480
tcacacgctc agcagcgttg gctgctaatc ttatgaacag tggtgtgaga ctgaatgcca 540
tttgtccagg ctttgttaac acagccatcc ttgaatcaat tgaaaaagaa gaaaacatgg 600
gacaatatat agaatataag gatcatatca aggatatgat taaatactat ggaattttgg 660
acccaccatt gattgccaat ggattgataa cactcattga agatgatgct ttaaatggtg 720
ctattatgaa gatcacaact tctaagggaa ttcattttca agactatgat acaactccat 780
ttcaagcaaa aacccaatga 800
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgcgagcaaa ggattcctg 19
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtgcggctgg tgcgaaacgc g 21

Claims (5)

1.柞树皮提取物在制备促进伤口愈合的药物中的应用，其特征在于，所述柞树皮提取物由以下步骤制备得到：
1)将柞树皮与乙醇溶液混合后进行提取、过滤，将得到的滤液干燥，得到干燥物；
2)将所述步骤1)得到的干燥物溶解于水中，得到混合液，将所述混合液经等体积的石油醚萃取，得到石油醚相和水相；
3)将所述步骤2)得到的水相经等体积的乙酸乙酯萃取，得到萃取液，除去萃取液中的乙酸乙酯、干燥，得到柞树皮提取物；
所述步骤1)乙醇溶液的体积百分含量为60～70％。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述步骤1)提取的条件包括：所述提取的温度为60～70℃，所述提取的时间为80～100min，所述提取的次数为2次。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述柞树皮的粒径为50～70目，所述柞树皮的质量与乙醇溶液的体积比为1g:25～32ml。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述步骤2)石油醚萃取的条件包括：震荡25～35min后静置1～2h，萃取3次。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述步骤2)乙酸乙酯萃取的条件包括：震荡25～35min后静置1～2h，萃取3次。
CN201911192915.6A 2019-11-28 2019-11-28 一种柞树皮提取物的制备方法和应用 Active CN110731977B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911192915.6A CN110731977B (zh) 2019-11-28 2019-11-28 一种柞树皮提取物的制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911192915.6A CN110731977B (zh) 2019-11-28 2019-11-28 一种柞树皮提取物的制备方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110731977A CN110731977A (zh) 2020-01-31
CN110731977B true CN110731977B (zh) 2021-11-26

Family

ID=69274097

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201911192915.6A Active CN110731977B (zh) 2019-11-28 2019-11-28 一种柞树皮提取物的制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110731977B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112724275B (zh) * 2021-01-29 2022-07-26 吉林化工学院 一种柞树皮多糖的制备及应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RO128713A2 (ro) * 2012-01-16 2013-08-30 Andrei-Gheorghe Zbuchea Unguent pentru tratamentul arsurilor şi plăgilor, cu acţiune complexă, realizat exclusiv din produse naturale
RU2517065C1 (ru) * 2012-12-05 2014-05-27 Любовь Степановна Ермолова Ранозаживляющий препарат

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101849977A (zh) * 2010-05-27 2010-10-06 东北林业大学 一种从蒙古栎叶片中提取多酚的方法
KR102000550B1 (ko) * 2017-10-27 2019-07-16 대한민국(농촌진흥청장) 신갈나무 화분으로부터 분리된 폴리아민계 화합물을 함유하는 미백용 조성물

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RO128713A2 (ro) * 2012-01-16 2013-08-30 Andrei-Gheorghe Zbuchea Unguent pentru tratamentul arsurilor şi plăgilor, cu acţiune complexă, realizat exclusiv din produse naturale
RU2517065C1 (ru) * 2012-12-05 2014-05-27 Любовь Степановна Ермолова Ранозаживляющий препарат

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Determining the Effect of an Oak Bark;Stephen C.et;《OstomyWound Management》;20081031;第54卷(第10期);第16-25页 *
MMP-2 Assessment as an Indicator of Wound Healing:;Refaat B. Karim .et;《ADVANCES IN SKIN & WOUND CARE》;20060831;第19卷(第6期);第324-327页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN110731977A (zh) 2020-01-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109957515B (zh) 一株拟茎点霉菌株及其在对雷公藤红素进行生物转化中的应用
Walsby et al. Isolation and purification of intact gas vesicles from a Blue–Green alga
CN110731977B (zh) 一种柞树皮提取物的制备方法和应用
CN107365778B (zh) 调控叶黄素合成的转录因子基因及其应用
CN116004429A (zh) 一种用于防治苹果腐烂病的生防菌株及其应用
CN109956991B (zh) 一种新化合物及其在制备细菌抑制剂中的应用
US20140193456A1 (en) Method for Drying-Conservation of Natural Substances
CN102120996A (zh) 葡萄白藜芦醇-氧-甲基转移酶催化白藜芦醇生成紫檀芪的方法
Border et al. Viruses of Penicillium and Aspergillus species.
Kumar et al. Isolation of high quality RNA from Phyllanthus emblica and its evaluation by downstream applications
CN113308378A (zh) 高产麦角硫因的灵芝菌株及其应用
CN110343648A (zh) 一种简易分离烟草青枯病菌的方法
CN107200684B (zh) 一种从海洋球石藻中提取肉豆蔻酸的方法
CN114736907A (zh) 扶桑绵粉蚧的蜡质合成基因PsFAR及其应用
CN110089623B (zh) 栅藻及其作为饵料/饵料添加剂的应用
CN104497120B (zh) 石斑鱼翻译控制肿瘤蛋白tctp及其编码基因在抗鱼类神经坏死病毒方面的应用
CN103626864A (zh) 一种促进大黄鱼生长的可溶性重组蛋白及其制备
CN110042107B (zh) 红花CtACO1基因、其编码蛋白质及应用
CN102533809A (zh) 枣树谷胱甘肽过氧化物酶基因
CN104067936A (zh) 一种促使青天葵球茎多长叶芽的方法
CN1899331A (zh) 槭树科槭树属植物的提取物及其提取方法与应用
JPS595274B2 (ja) けい藻類の増殖方法
CN102676502B (zh) 一种南美蟛蜞菊总rna的提取方法
CN115058347B (zh) 一株花脸香蘑、其非糖类提取物的制备及其应用
CN115093972B (zh) 一种蛹虫草菌株及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant