CN108623701B - 一种超滤膜应用于隐甲藻胞外多糖的分离方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种超滤膜应用于隐甲藻胞外多糖的分离方法，包括以下步骤：将隐甲藻胞外多糖的发酵液离心分离，经微孔滤膜过滤去除藻体，获得发酵上清液；将发酵上清液，经喷雾干燥机喷雾干燥后采用蒸馏水复溶，获得浓缩液；在浓缩液中加入无水乙醇，静置离心获得沉淀；将沉淀复溶于蒸馏水，然后置于透析袋，收集透析截留液；将透析截留液采用超滤组器进行超滤。本发明工艺简便、有机溶剂用量小，分离提取隐甲藻胞外多糖纯度高。本发明具有很强的应用性。
Description
技术领域
本发明涉及一种膜分离方法，特别涉及一种超滤膜应用于隐甲藻胞外多糖的分离方法。
背景技术
生物多糖具有对人体无毒无害、安全系数高等优点，被用作增稠剂、乳化剂等食品添加剂，广泛应用于食品加工领域；同时，多糖还具有抗氧化、抑制肿瘤、抗病毒、抗凝血等生物活性，在医药方面应用前景也十分广阔。在食品和医药临床领域应用的多糖，主要由中药等植物多糖、大型海藻多糖、细菌多糖占据。由于海洋微藻的生长条件和环境特点，决定了其可能具有一些有别于陆生植物多糖的结构和功能，因此，海洋微藻胞外多糖在医药和医学领域中的应用潜力越来越引起人们对其的研究兴趣。与植物多糖相比，微藻胞外多糖可通过发酵进行合成、产物易于与藻体分离，降低了生产成本；不受季节、气候、地理位置和病虫害的限制、生产周期短，更具有价格稳定的优势，市场竞争力更强。
隐甲藻作为一种常用的二十二碳六烯酸(DHA)生产菌株，2015年才在陈峰等人公开的专利《寇氏隐甲藻胞外多糖的制备方法以及该胞外多糖的应用》中报道其具有产胞外多糖能力，且胞外多糖具备抗氧化活性，能够有效运用于制备抗氧化剂及具有抗氧化功能的保健食品，其应用前景受到更多的关注。但该专利所述制备工艺中，仅简单采取超滤浓缩和乙醇沉淀，获得的隐甲藻胞外多糖浓度较低，且未提及回收率和纯度，不适于制备工艺的放大。而传统的胞外多糖制备工艺中，去除藻体的发酵上清液经醇沉得粗多糖，再用Sevage法去除蛋白，获得较高纯度的，但有机溶剂用量大、分离成本较高、多糖中易存在有机试剂残留，不适合快速大量生产。因此，需要针对隐甲藻胞外多糖的发酵液成分、杂质组成及目标产物特性，开发特异性的分离制备工艺，以提高胞外多糖的提取率和产物纯度。与传统分离方法相比，膜分离方法具有效率高、工作条件温和、可连续操作等优点，因此在规模化生物分离上得到了越来越广泛的应用。
发明内容
本发明的目的在于克服已有技术的缺点，提供一种高效、环保、能够实现快速分离的超滤膜应用于隐甲藻胞外多糖的分离方法。
本发明的技术方案如下：
本发明的一种超滤膜应用于隐甲藻胞外多糖的分离方法，包括以下步骤：
(1)将隐甲藻胞外多糖的发酵液在5000～10000rpm的转速下离心分离10～30min，经孔直径为0.22μm的微孔滤膜过滤去除藻体，获得发酵上清液；
(2)将所述的发酵上清液，经喷雾干燥机喷雾干燥后采用蒸馏水复溶，获得浓缩液；
所述喷雾干燥条件为：喷雾干燥机的进口温度80～140℃、喷雾干燥机的出口温度60～80℃、喷雾干燥机的进料速度300～1000mL/h；
(3)在所述的浓缩液中加入无水乙醇，静置离心获得沉淀；无水乙醇与所述的浓缩液的体积比为2～4；
(4)将所述的沉淀复溶于蒸馏水，然后置于截留分子量为8～14KDa的透析袋，将透析袋密封后置于蒸馏水中，在2～10℃温度下透析1～3天，除去小分子糖和离子等杂质，收集透析截留液；
(5)将所述的透析截留液采用超滤组器在0.05～0.2Mpa操作压力下进行超滤，收集截留液，干燥后获得粉末状隐甲藻胞外多糖，所述的超滤组器所用的超滤膜是截留分子量为5～30KDa的超滤膜。
本发明工艺简便、有机溶剂用量小，分离提取隐甲藻胞外多糖纯度高。本发明具有很强的应用性。
附图说明
图1为本发明超滤膜应用于隐甲藻胞外多糖的分离方法的流程简图；
图2为采用本发明实施例1方法获得的隐甲藻胞外多糖溶液的凝胶渗透色谱图谱；
图3为采用本发明实施例2方法获得的隐甲藻胞外多糖溶液的凝胶渗透色谱图谱；
图4为采用本发明实施例3方法获得的隐甲藻胞外多糖溶液的凝胶渗透色谱图谱。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明的技术方案做进一步的描述。
本发明的一种超滤膜应用于隐甲藻胞外多糖的分离方法，包括以下步骤：
(1)将隐甲藻胞外多糖的发酵液在5000～10000rpm的转速下离心分离10～30min，经孔直径为0.22μm的微孔滤膜过滤去除藻体，获得发酵上清液。隐甲藻胞外多糖的发酵液可以通过发酵培养隐甲藻细胞获得，发酵培养隐甲藻细胞的方法可以参见Bin Liu(刘宾)等公开的《Mutation Breeding of Extracellular Polysaccharide-ProducingMicroalga Crypthecodinium cohnii by a Novel Mutagenesis with Atmospheric andRoom Temperature Plasma》(International Journal of Molecular Sciences,2015,16(4),8201-8212)(《常压室温等离子体诱变寇氏隐甲藻产胞外多糖》，国际分子科学期刊，2015,16(4),8201-8212)文章中隐甲藻培养方法即可。
(2)将所述的发酵上清液，经喷雾干燥机喷雾干燥后采用蒸馏水复溶，获得浓缩液。
制备浓缩液可以减少有机溶剂用量，优选的发酵上清液的体积是浓缩液体积的10～15倍。
所述喷雾干燥的条件为：喷雾干燥机的进口温度为80～140℃、喷雾干燥机的出口温度为60～80℃、喷雾干燥机的进料速度为300～1000mL/h。
(3)在所述的浓缩液中加入无水乙醇，静置离心获得沉淀；无水乙醇与所述的浓缩液的体积比为2～4。
(4)将所述的沉淀复溶于蒸馏水，然后置于截留分子量为8～14KDa的透析袋，将透析袋密封后置于蒸馏水中，在2～10℃温度下透析1～3天，除去小分子糖和离子等杂质，收集透析截留液；优选的在透析过程中将蒸馏水换1～3次/天，这样可以提高小分子杂质去除率。
(5)将所述的透析截留液采用超滤组器在0.05～0.2MPa操作压力下进行超滤，收集截留液，干燥(可以采用冷冻干燥或喷雾干燥)后获得粉末状隐甲藻胞外多糖，所述的超滤组器所用的超滤膜是截留分子量为5～30KDa的聚砜、聚醚砜和醋酸纤维素等材质的超滤膜，所述的超滤组器的反应器型式为中空纤维膜、卷式膜及平板膜等任何型式。
实施例1
(1)选取隐甲藻胞外多糖的发酵液，在5000rpm的转速下离心15min，取上清液经孔直径为0.22μm的微孔滤膜过滤后，获得去除藻体的发酵上清液；
(2)将所述的发酵上清液1L，经喷雾干燥机喷雾干燥后采用蒸馏水复溶，获得浓缩液；所述的发酵上清液的体积是浓缩液体积的10倍。
所述喷雾干燥条件为：喷雾干燥机的进口温度120℃、喷雾干燥机的出口温度70℃、喷雾干燥机的进料速度500mL/h；
(3)在所述的浓缩液中加入无水乙醇，静置离心获得沉淀；无水乙醇与所述的浓缩液的体积比为3；
(4)将所述的沉淀复溶于蒸馏水，然后置于截留分子量为8～14KDa的透析袋，将透析袋密封后置于蒸馏水中，在4℃温度下透析1天，期间换3次水，除去小分子糖和离子等杂质，收集透析截留液；
(5)将所述的透析截留液采用5KDa截留分子量的醋酸纤维素超滤膜，采用平板膜形式，在0.2MPa操作压力下进行超滤，收集截留液，冷冻干燥后获得粉末状隐甲藻胞外多糖。
对本实施例制备的隐甲藻胞外多糖产物纯度测定：
凝胶渗透色谱检测发现，多糖产物的谱图中有一主峰，并且峰形为狭窄对称，显示此多糖主要含有一种分子量的组分，说明该多糖纯度较高。再经苯酚-浓硫酸法(公知的测试方法)测得该多糖样品中隐甲藻胞外多糖纯度为80.33％。
实施例2
(1)选取隐甲藻胞外多糖的发酵液，在10000rpm的转速下离心20min，取上清液经孔直径为0.22μm的微孔滤膜过滤后，获得去除藻体的发酵上清液；
(2)将所述的发酵上清液1L，经喷雾干燥机喷雾干燥后采用蒸馏水复溶，获得浓缩液；所述的发酵上清液的体积是浓缩液体积的15倍；
所述喷雾干燥条件为：喷雾干燥机的进口温度80℃、喷雾干燥机的出口温度60℃、喷雾干燥机的进料速度300mL/h；
(3)在所述的浓缩液中加入无水乙醇，静置离心获得沉淀；无水乙醇与所述的浓缩液的体积比为2；
(4)将所述的沉淀复溶于蒸馏水，然后置于截留分子量为8～14KDa的透析袋，将透析袋密封后置于蒸馏水中，在10℃温度下透析2天，期间换1次水，除去小分子糖和离子等杂质，收集透析截留液；
(5)将所述的透析截留液采用10KDa截留分子量的聚醚砜超滤膜，采用中空纤维膜形式，在0.07MPa操作压力下进行超滤，收集截留液，冷冻干燥后获得粉末状隐甲藻胞外多糖。
对本实施例制备的隐甲藻胞外多糖产物纯度测定：
凝胶渗透色谱检测发现，多糖产物的谱图中有一主峰，并且峰形为狭窄对称，显示此多糖主要含有一种分子量的组分，说明该多糖纯度较高。再经苯酚-浓硫酸法(公知的测试方法)测得该多糖样品中隐甲藻胞外多糖纯度为81.45％。
实施例3
(1)选取隐甲藻胞外多糖的发酵液，在8000rpm的转速下离心30min，取上清液经孔直径为0.22μm的微孔滤膜过滤后，获得去除藻体的发酵上清液；
(2)将所述的发酵上清液1L，经喷雾干燥机喷雾干燥后采用蒸馏水复溶，获得浓缩液；所述的发酵上清液的体积是浓缩液体积的12倍；
所述喷雾干燥条件为：喷雾干燥机的进口温度140℃、喷雾干燥机的出口温度80℃、喷雾干燥机的进料速度1000mL/h；
(3)在所述的浓缩液中加入无水乙醇，静置离心获得沉淀；无水乙醇与所述的浓缩液的体积比为4；
(4)将所述的沉淀复溶于蒸馏水，然后置于截留分子量为8～14KDa的透析袋，将透析袋密封后置于蒸馏水中，在2℃温度下透析3天，期间换2次水，除去小分子糖和离子等杂质，收集透析截留液；
(5)将所述的透析截留液采用30KDa截留分子量的聚砜超滤膜，采用平板膜形式，在0.05MPa操作压力下进行超滤，收集截留液，喷雾干燥后获得粉末状隐甲藻胞外多糖。
对本实施例制备的隐甲藻胞外多糖产物纯度测定：
凝胶渗透色谱检测发现，多糖产物的谱图中有一主峰，并且峰形为狭窄对称，显示此多糖主要含有一种分子量的组分，说明该多糖纯度较高。再经苯酚-浓硫酸法(公知的测试方法)测得该多糖样品中隐甲藻胞外多糖纯度为81.86％。
Claims (4)
1.一种超滤膜应用于隐甲藻胞外多糖的分离方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)将隐甲藻胞外多糖的发酵液在5000～10000rpm的转速下离心分离10～30min，经孔直径为0.22μm的微孔滤膜过滤去除藻体；
(2)将所述的发酵上清液，经喷雾干燥机喷雾干燥后采用蒸馏水复溶，获得浓缩液，所述的发酵上清液的体积是浓缩液体积的10～15倍；
所述喷雾干燥的条件为：喷雾干燥机的进口温度为80～140℃、喷雾干燥机的出口温度为60～80℃、喷雾干燥机的进料速度为300～1000mL/h；
(3)在所述的浓缩液中加入无水乙醇，静置离心获得沉淀；无水乙醇与所述的浓缩液的体积比为2～4；
(4)将所述的沉淀复溶于蒸馏水，然后置于截留分子量为8～14KDa的透析袋，将透析袋密封后置于蒸馏水中，在2～10℃温度下透析1～3天，除去小分子糖和离子杂质，收集透析截留液；
(5)将所述的透析截留液采用超滤组器在0.05～0.2Mpa操作压力下进行超滤，收集截留液，干燥后获得粉末状隐甲藻胞外多糖。
2.根据权利要求1所述的超滤膜应用于隐甲藻胞外多糖的分离方法，其特征在于：所述的超滤组器所用的超滤膜是截留分子量为5～30KDa的聚砜、聚醚砜或者醋酸纤维素材质的超滤膜。
3.根据权利要求2所述的超滤膜应用于隐甲藻胞外多糖的分离方法，其特征在于：在所述的步骤(4)的透析过程中将蒸馏水换1～3次/天。
4.根据权利要求3所述的超滤膜应用于隐甲藻胞外多糖的分离方法，其特征在于：所述的步骤(5)中的干燥采用冷冻干燥或喷雾干燥。
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