JP2023164537A - Rna癌ワクチン - Google Patents
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Abstract
【課題】本開示は、癌リボ核酸(RNA)ワクチン、ならびに当該ワクチン及び当該ワクチンを含む組成物の使用方法に関する。特に、本開示は、単一のmRNA構築物上にいくつかの癌エピトープをコードする、すなわち、ポリエピトープmRNA構築物又はポリネオエピトープ構築物である、コンカテマーmRNA癌ワクチンに関する。【解決手段】本開示はさらに、p53及びKRAS変異、ならびにSTINGなどの免疫増進剤の組み込みに関し、例えば、mRNA構築物は、免疫刺激剤又はアジュバントをさらにコードする。本開示はさらに、免疫応答の増強を誘発するテタヌス毒素又はジフテリア毒素などのユニバーサルT細胞エピトープの包含に関する。【選択図】なし
Description
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第119条(e)に基づき、2017年2月1日出願の「RNA CANCER VACCINES」と題する米国特許仮出願第62/453,444号、2017年2月1日出願の「IMMUNOMODULATORY THERAPEUTIC MRNA COMPOSITIONS ENCODING ACTIVATING ONCOGENE MUTATION PEPTIDES」と題する米国特許仮出願第62/453,465号、及び2017年9月13日出願の「CONCATAMERIC RNA CANCER VACCINES」と題する米国特許仮出願第62/558,238号の出願日の優先権を主張するものであり、当該出願のそれぞれの内容は、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
本出願は、米国特許法第119条(e)に基づき、2017年2月1日出願の「RNA CANCER VACCINES」と題する米国特許仮出願第62/453,444号、2017年2月1日出願の「IMMUNOMODULATORY THERAPEUTIC MRNA COMPOSITIONS ENCODING ACTIVATING ONCOGENE MUTATION PEPTIDES」と題する米国特許仮出願第62/453,465号、及び2017年9月13日出願の「CONCATAMERIC RNA CANCER VACCINES」と題する米国特許仮出願第62/558,238号の出願日の優先権を主張するものであり、当該出願のそれぞれの内容は、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
癌の進化における最近の理論は、ストレス誘発性のゲノム不安定性、集団の多様性または不均一性、及びゲノム媒介性の大進化を含む3つの段階に焦点を当てている。この理論は、既知の分子機序のほとんどが癌に関与する可能性があるものの、臨床例の大部分に対して優勢な単一の機序がない理由を説明している。しかしながら、一般的な機序は、癌ワクチンが癌治療の普遍的解決策を提供する可能性を示唆している。
癌ワクチンには、防止ワクチンまたは予防ワクチン(健康な人における癌の発症予防が意図される)、及び治療ワクチン(癌に対する体の自然防御力を強化することによる現存する癌の治療が意図される)が含まれる。癌防止ワクチンは、例えば、感染性疾患による癌の誘発を予防するために、癌の発症を誘発またはそれに寄与する感染病原体を標的とし得る。Gardasil(登録商標)及びCervarix(登録商標)は、市販の予防ワクチンの2つの例である。ワクチンはそれぞれ、HPVによる感染を防ぐものである。他の防止的な癌ワクチンは、未来において個体が癌を発症する可能性を増加させることが予測される宿主タンパク質または断片を標的とし得る。
Prior et al.Cancer Res.2012 May 15;72(10):2457-2467
Diaz et al.The molecular evolution of acquired resistance to targeted EGFR blockade in colorectal cancers,Nature 486:537(2012)
Misale et al.Emergence of KRAS muations and acquired resistance to anti-EGFR therapy in colorectal cancer,Nature 486:532(2012)
市販または開発中のワクチン(例えば、癌ワクチン)のほとんどが、微生物全体、タンパク質抗原、ペプチド、多糖、またはデオキシリボ核酸(DNA)ワクチン、及びそれらの組み合わせに基づくものである。DNAのワクチン接種は、抗原に対する体液性及び細胞性の免疫応答を刺激するために使用される技術の1つである。遺伝子操作されたDNA(例えば、裸のプラスミドDNA)を生存宿主に直接注射することにより、少数の宿主細胞から抗原を直接産生し、防御性の免疫応答を生じさせる。しかしながら、この技術には、癌遺伝子の活性化または腫瘍抑制遺伝子の阻害をもたらし得る挿入変異誘発の可能性を含む、ワクチンのゲノムへのDNA組み込みの潜在的な問題がつきまとう。
目的とするほぼ任意の癌タンパク質またはその断片を産生するように体の細胞機構を安全に誘導することができるRNA(例えば、メッセンジャーRNA(mRNA))のリボ核酸(RNA)癌ワクチンが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、RNAは、修飾RNAである。本開示のRNAワクチンを使用すると、例えば、挿入変異誘発が生じ得るというリスクを冒さずに、細胞性免疫と体液性免疫との両方を含む、癌に対するバランスのとれた免疫応答を誘導することができる。
RNAワクチンは、癌の有病率またはアンメットメディカルニーズの程度もしくはレベルに応じてさまざまな状況において利用してよい。RNAワクチンは、さまざまなステージまたは転移度の癌を治療及び/または予防するために利用してよい。癌ワクチンを含む代替の抗癌治療と比較して、RNAワクチンは、はるかに高い抗体価を生じさせ、より早く応答を生成する点で優れた特性を有する。理論に束縛されるものではないが、RNAワクチンは天然の細胞機構を取り入れているため、mRNAポリヌクレオチドであるRNAワクチンは、翻訳時に適切なタンパク質の立体構造を生成するように良好に設計されると考えられる。エクスビボで製造され、望ましくない細胞応答を誘発する可能性のある従来の治療法及びワクチンとは異なり、RNAワクチンは、より自然な方法で細胞系に提示される。
RNAワクチンは、少なくとも1つの癌抗原ポリペプチドまたはその免疫原性断片(例えば、癌に対する免疫応答を誘導する能力を有する免疫原性断片)をコードするオープンリーディングフレームを有するリボ核酸(RNA)ポリヌクレオチドを含み得る。他の実施形態は、癌に対する免疫応答を誘導する能力を有する2つ以上の抗原またはエピトープをコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも1つのリボ核酸(RNA)ポリヌクレオチドを含む。
本開示は、いくつかの態様では、脂質ナノ粒子に製剤化された、癌抗原ペプチドエピトープをコードするオープンリーディングフレームをそれぞれ有する1つまたは複数のmRNAのmRNA癌ワクチン及び薬学的に許容される担体または賦形剤であり、ここで、mRNAワクチンは、5~100のペプチドエピトープをコードし、ペプチドエピトープのうちの少なくとも2つは、個別化癌抗原である。
本開示、いくつかの態様では、個別化癌抗原である1~500のペプチドエピトープと、ユニバーサルタイプIIのT細胞エピトープとをコードする1つまたは複数のオープンリーディングフレームをそれぞれ有する1つまたは複数のmRNAを含む脂質ナノ粒子を含む、mRNA癌ワクチンを提供する。
本開示は、いくつかの態様では、次のうちの1つまたは複数を含む脂質ナノ粒子を含む、mRNA癌ワクチンを提供する:(a)個別化癌抗原である1~500のペプチドエピトープと、ユニバーサルタイプIIのT細胞エピトープとをコードする1つもしくは複数のオープンリーディングフレームをそれぞれ有する1つもしくは複数のmRNA、(b)活性化癌遺伝子変異ペプチドをコードするオープンリーディングフレームをそれぞれ有する1つもしくは複数のmRNAであって、任意選択で、mRNAは、ユニバーサルタイプIIのT細胞エピトープをさらに含む、mRNA、(c)癌抗原ペプチドエピトープをコードするオープンリーディングフレームをそれぞれ有する1つもしくは複数のmRNAであって、mRNAワクチンは、5~100のペプチドエピトープをコードし、ペプチドエピトープのうちの少なくとも2つは、個別化癌抗原であり、任意選択で、mRNAは、ユニバーサルタイプIIのT細胞エピトープをさらに含む、mRNA、及び/または(d)癌抗原ペプチドエピトープをコードするオープンリーディングフレームをそれぞれ有する1つもしくは複数のmRNAであって、mRNAワクチンは、5~100のペプチドエピトープをコードし、ペプチドエピトープのうちの少なくとも3つは、複合バリアントであり、ペプチドエピトープのうちの少なくとも2つは、点変異であり、任意選択で、mRNAは、ユニバーサルタイプIIのT細胞エピトープをさらに含む、mRNA。いくつかの実施形態では、mRNA癌ワクチンは、1~20のユニバーサルタイプIIのT細胞エピトープをコードする。他の実施形態では、ユニバーサルタイプIIのT細胞エピトープは、ILMQYIKANSKFIGI(テタヌス毒素;配列番号226)、FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE(テタヌス毒素;配列番号227)、QYIKANSKFIGITE(テタヌス毒素;配列番号228)QSIALSSLMVAQAIP(ジフテリア毒素;配列番号229)、及びAKFVAAWTLKAAA(汎DRエピトープ;配列番号230)からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、ユニバーサルタイプIIのT細胞エピトープは、mRNA全体にわたって同じユニバーサルタイプIIのT細胞エピトープである。他の実施形態では、ユニバーサルタイプIIのT細胞エピトープは、mRNA中1~20回繰り返される。1つの実施形態では、ユニバーサルタイプIIのT細胞エピトープは、mRNA全体にわたって互いに異なる。いくつかの実施形態では、ユニバーサルタイプIIのT細胞エピトープは、すべての癌抗原ペプチドエピトープの間に位置する。別の実施形態では、ユニバーサルタイプIIのT細胞エピトープは、癌抗原ペプチドエピトープの間に1つおきに位置する。1つの実施形態では、ユニバーサルタイプIIのT細胞エピトープは、癌抗原ペプチドエピトープの間に2つおきに位置する。
いくつかの実施形態では、次の条件のうちの1つまたは複数を満たす:(i)活性化癌遺伝子変異は、KRAS変異であること、(ii)KRAS変異は、G12変異であり、任意選択で、G12 KRAS変異は、G12D、G12V、G12S、G12C、G12A、及びG12R KRAS変異から選択されること、(iii)KRAS変異は、G13変異であり、任意選択で、G13 KRAS変異は、G13D KRAS変異であること、及び/または(iv)活性化癌遺伝子変異は、H-RASもしくはN-RAS変異であること。
いくつかの実施形態では、次の条件のうちの1つまたは複数を満たす:(A)mRNAは、2つ以上の活性化癌遺伝子変異ペプチドのコンカテマーをコードするオープンリーディングフレームを有すること、(B)ペプチドエピトープのうちの少なくとも2つは、1つのグリシンによって互いに分離されており、任意選択で、ペプチドエピトープのすべてが、1つのグリシンによって互いに分離されていること、(C)コンカテマーは、3~10の活性化癌遺伝子変異ペプチドを含むこと、及び/または(D)ペプチドエピトープのうちの少なくとも2つは、リンカーなしで互いに直接連結されていること。
ある特定の実施形態では、次の条件のうちの1つまたは複数を満たす:(i)ペプチドエピトープのうちの少なくとも1つは、従来型癌抗原であること、(ii)ペプチドエピトープのうちの少なくとも1つは、反復多型であること、(iii)反復多型は、p53における反復体細胞癌変異を含むこと、(iv)p53における反復体細胞癌変異は、(A)コドン位置T125に隣接する標準5’スプライス部位における変異であって、エピトープAVSPCISFVW(配列番号233)(HLA-B*57:01、HLA-B*58:01)、エピトープHPLASCQCFF(配列番号234)(HLA-B*35:01、HLA-B*53:01)、エピトープFVWNFGIPL(配列番号235)(HLA-A*02:01、HLA-A*02:06、HLA-B*35:01)を含むペプチド配列TAKSVTCTVSCPEGLASMRLQCLAVSPCISFVWNFGIPLHPLASCQCFFIVYPLNV(配列番号232)を有する保持型イントロンを誘導する変異;(B)コドン位置331に隣接する標準5’スプライス部位における変異であって、エピトープLQVLSLGTSY(配列番号237)(HLA-B*15:01)、エピトープFQSNTQNAVF(配列番号238)(HLA-B*15:01)を含むペプチド配列EYFTLQVLSLGTSYQVESFQSNTQNAVFFLTVLPAIGAFAIRGQ(配列番号236)を有する保持型イントロンを誘導する変異;(C)コドン位置126に隣接する標準3’スプライス部位における変異であって、エピトープCTMFCQLAK(配列番号240)(HLA-A*11:01)、エピトープKSVTCTMF(配列番号241)(HLA-B*58:01)を含む新規のスパニングペプチド配列AKSVTCTMFCQLAK(配列番号239)を生成する潜在性の代替エクソン3’スプライス部位を誘導する変異;及び/または(D)コドン位置224に隣接する標準5’スプライス部位における変異であって、エピトープVPYEPPEVW(配列番号243)(HLA-B*53:01、HLA-B*51:01)、エピトープLTVPPSTAW(配列番号244)(HLA-B*58:01、HLA-B*57:01)を含む新規のスパニングペプチド配列VPYEPPEVWLALTVPPSTAWAA(配列番号242)を生成する潜在性の代替イントロン5’スプライス部位を誘導する変異(転写コドン位置は、Ensemblのv83のヒトゲノムアノテーションに由来する標準の全長p53転写物であるENST00000269305(配列番号245)を参照したものである)からなる群から選択されること、及び/または(v)mRNA癌ワクチンは、安定剤を含まないこと。
いくつかの実施形態では、1つまたは複数のmRNAは、免疫増強剤をコードするオープンリーディングフレームをさらに含む。他の実施形態では、免疫増強剤は、脂質ナノ粒子に製剤化される。1つの実施形態では、免疫増強剤は、別個の脂質ナノ粒子に製剤化される。いくつかの実施形態では、免疫増強剤は、構造的に活性なヒトSTINGポリペプチドである。1つの実施形態では、構造的に活性なヒトSTINGポリペプチドは、配列番号1に示されるアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、構造的に活性なヒトSTINGポリペプチドをコードするmRNAは、配列番号170に示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、構造的に活性なヒトSTINGポリペプチドをコードするmRNAは、miR-122マイクロRNA結合部位を有する3’UTRを含む。1つの実施形態では、miR-122マイクロRNA結合部位は、配列番号175に示されるヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、1つまたは複数のmRNAはそれぞれ、配列番号176に示すヌクレオチド配列を含む5’UTRを含む。1つの実施形態では、1つまたは複数のmRNAはそれぞれ、ポリAテールを含む。1つの実施形態では、ポリAテールは、約100ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、1つまたは複数のmRNAはそれぞれ、5’キャップ1構造を含む。
いくつかの実施形態では、1つまたは複数のmRNAは、少なくとも1つの化学修飾を含む。1つの実施形態では、化学修飾は、N1-メチルシュードウリジンである。別の実施形態では、1つまたは複数のmRNAは、N1-メチルシュードウリジンで完全に修飾されている。
いくつかの実施形態では、1つまたは複数のmRNAは、45~55の個別化癌抗原をコードする。1つの実施形態では、1つまたは複数のmRNAは、52の個別化癌抗原をコードする。いくつかの実施形態では、個別化癌抗原のそれぞれは、別個のオープンリーディングフレームによってコードされる。別の実施形態では、ペプチドエピトープは、2~100のペプチドエピトープから構成されるコンカテマー癌抗原の形態であり、任意選択で、コンカテマー癌抗原は、5~100のペプチドエピトープから構成される。
いくつかの実施形態では、コンカテマー癌抗原は、a)2~100のペプチドエピトープもしくは5~100のペプチドエピトープが、切断感受性部位が間に入ることによって散在していること、b)それぞれのペプチドエピトープをコードするmRNAが、リンカーなしで互いに直接連結されていること、c)それぞれのペプチドエピトープをコードするmRNAが、単一のヌクレオチドリンカーで互いに連結されていること、d)それぞれのペプチドエピトープが、25~35アミノ酸を含み、かつ中央に位置するSNP変異を含むこと、e)ペプチドエピトープの少なくとも30%が、対象に由来するクラスIのMHC分子に対して最も高い親和性を有すること、f)ペプチドエピトープの少なくとも30%が、対象に由来するクラスIIのMHC分子に対して最も高い親和性を有すること、g)ペプチドエピトープの少なくとも50%が、HLA-A、HLA-B、及び/またはDRB1に対してIC>500nMの予測結合親和性を有すること、h)mRNAが、45~55のペプチドエピトープをコードすること、i)mRNAが、52のペプチドエピトープをコードすること、j)ペプチドエピトープの50%が、クラスIのMHCに対して結合親和性を有し、かつペプチドエピトープの50%が、クラスIIのMHCに対して結合親和性を有すること、k)ペプチドエピトープをコードするmRNAが、ペプチドエピトープの順序が偽エピトープ(pseudo-epitope)を最小化する順序になるように配置されること、l)ペプチドエピトープの少なくとも30%が、15アミノ酸長のMHCクラスI結合ペプチドであること、及び/またはm)ペプチドエピトープの少なくとも30%が、21アミノ酸長のMHCクラスII結合ペプチドであることのうちの1つまたは複数を含む。
いくつかの態様では、本開示は、脂質ナノ粒子に製剤化された、個別化癌抗原である45~55のペプチドエピトープをコードする1つまたは複数のオープンリーディングフレームをそれぞれ有する1つまたは複数のmRNAを含む、mRNA癌ワクチンを提供する。
いくつかの態様では、本開示は、脂質ナノ粒子に製剤化された、個別化癌抗原である45~55のペプチドエピトープをコードする1つまたは複数のオープンリーディングフレームをそれぞれ有する1つまたは複数のmRNAを含み、任意選択で、ペプチドエピトープのうちの少なくとも1つは、活性化癌遺伝子変異ペプチドまたは従来型癌抗原であり、任意選択で、ペプチドエピトープのうちの少なくとも3つは、複合バリアントであり、ペプチドエピトープのうちの少なくとも2つは、点変異である、mRNA癌ワクチンを提供する。
いくつかの実施形態では、1つまたは複数のmRNAは、48~54の個別化癌抗原をコードする。1つの実施形態では、1つまたは複数のmRNAは、52の個別化癌抗原をコードする。いくつかの実施形態では、個別化癌抗原のそれぞれは、別個のオープンリーディングフレームによってコードされる。
別の実施形態では、ペプチドエピトープは、2~100のペプチドエピトープから構成されるコンカテマー癌抗原の形態であり、任意選択で、コンカテマー癌抗原は、5~100のペプチドエピトープから構成される。いくつかの実施形態では、コンカテマー癌抗原は、a)2~100のペプチドエピトープもしくは5~100のペプチドエピトープが、切断感受性部位が間に入ることによって散在していること、b)それぞれのペプチドエピトープをコードするmRNAが、リンカーなしで互いに直接連結されていること、c)それぞれのペプチドエピトープをコードするmRNAが、単一のヌクレオチドリンカーで互いに連結されていること、d)それぞれのペプチドエピトープが、25~35アミノ酸を含み、かつ中央に位置するSNP変異を含むこと、e)ペプチドエピトープの少なくとも30%が、対象に由来するクラスIのMHC分子に対して最も高い親和性を有すること、f)ペプチドエピトープの少なくとも30%が、対象に由来するクラスIIのMHC分子に対して最も高い親和性を有すること、g)ペプチドエピトープの少なくとも50%が、HLA-A、HLA-B、及び/またはDRB1に対してIC>500nMの予測結合親和性を有すること、h)mRNAが、45~55のペプチドエピトープをコードすること、i)mRNAが、52のペプチドエピトープをコードすること、j)ペプチドエピトープの50%が、クラスIのMHCに対して結合親和性を有し、かつペプチドエピトープの50%が、クラスIIのMHCに対して結合親和性を有すること、k)ペプチドエピトープをコードするmRNAが、ペプチドエピトープの順序が偽エピトープ(pseudo-epitope)を最小化する順序になるように配置されること、l)ペプチドエピトープの少なくとも30%が、15アミノ酸長のMHCクラスI結合ペプチドであること、及び/またはm)ペプチドエピトープの少なくとも30%が、21アミノ酸長のMHCクラスII結合ペプチドであることのうちの1つまたは複数を含む。
いくつかの実施形態では、ペプチドエピトープのうちの少なくとも2つは、ユニバーサルタイプIIのT細胞エピトープによって互いに分離されている。1つの実施形態では、ペプチドエピトープのすべてが、ユニバーサルタイプIIのT細胞エピトープによって互いに分離されている。別の実施形態では、mRNA癌ワクチンは、1~20のユニバーサルタイプIIのT細胞エピトープをコードする。
いくつかの実施形態では、ユニバーサルタイプIIのT細胞エピトープは、ILMQYIKANSKFIGI(テタヌス毒素;配列番号226)、FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE(テタヌス毒素;配列番号227)、QYIKANSKFIGITE(テタヌス毒素;配列番号228)QSIALSSLMVAQAIP(ジフテリア毒素;配列番号229)、及びAKFVAAWTLKAAA(汎DRエピトープ;配列番号230)からなる群から選択される。
1つの実施形態では、ユニバーサルタイプIIのT細胞エピトープは、mRNA全体にわたって同じユニバーサルタイプIIのT細胞エピトープである。いくつかの実施形態では、ユニバーサルタイプIIのT細胞エピトープは、mRNA中1~20回繰り返される。別の実施形態では、ユニバーサルタイプIIのT細胞エピトープは、mRNA全体にわたって互いに異なる。1つの実施形態では、ユニバーサルタイプIIのT細胞エピトープは、すべてのペプチドエピトープの間に位置する。いくつかの実施形態では、ユニバーサルタイプIIのT細胞エピトープは、癌抗原ペプチドエピトープの間に1つおきに位置する。1つの実施形態では、ユニバーサルタイプIIのT細胞エピトープは、ペプチドエピトープの間に2つおきに位置する。
いくつかの実施形態では、1つまたは複数のmRNAは、免疫増強剤をコードするオープンリーディングフレームをさらに含む。1つの実施形態では、免疫増強剤は、脂質ナノ粒子に製剤化される。別の実施形態では、免疫増強剤は、別個の脂質ナノ粒子に製剤化される。いくつかの実施形態では、免疫増強剤は、構造的に活性なヒトSTINGポリペプチドである。1つの実施形態では、構造的に活性なヒトSTINGポリペプチドは、配列番号1に示されるアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、構造的に活性なヒトSTINGポリペプチドをコードするmRNAは、配列番号170に示されるヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、次の条件のうちの1つまたは複数を満たす:(i)活性化癌遺伝子変異は、KRAS変異であること、(ii)KRAS変異は、G12変異であり、任意選択で、G12 KRAS変異は、G12D、G12V、G12S、G12C、G12A、及びG12R KRAS変異から選択されること、(iii)KRAS変異は、G13変異であり、任意選択で、G13 KRAS変異は、G13D KRAS変異であること、及び/または(iv)活性化癌遺伝子変異は、H-RASもしくはN-RAS変異であること。
ある特定の実施形態では、次の条件のうちの1つまたは複数を満たす:(A)mRNAは、2つ以上の活性化癌遺伝子変異ペプチドのコンカテマーをコードするオープンリーディングフレームを有すること、(B)ペプチドエピトープのうちの少なくとも2つは、1つのグリシンによって互いに分離されており、任意選択で、ペプチドエピトープのすべてが、1つのグリシンによって互いに分離されていること、(C)コンカテマーは、3~10の活性化癌遺伝子変異ペプチドを含むこと、及び/または(D)ペプチドエピトープのうちの少なくとも2つは、リンカーなしで互いに直接連結されていること。
具体的な実施形態では、次の条件のうちの1つまたは複数を満たす:(i)ペプチドエピトープのうちの少なくとも1つは、従来型癌抗原であること、(ii)ペプチドエピトープのうちの少なくとも1つは、反復多型であること、(iii)反復多型は、p53における反復体細胞癌変異を含むこと、(iv)p53における反復体細胞癌変異は、(A)コドン位置T125に隣接する標準5’スプライス部位における変異であって、エピトープAVSPCISFVW(配列番号233)(HLA-B*57:01、HLA-B*58:01)、エピトープHPLASCQCFF(配列番号234)(HLA-B*35:01、HLA-B*53:01)、エピトープFVWNFGIPL(配列番号235)(HLA-A*02:01、HLA-A*02:06、HLA-B*35:01)を含むペプチド配列TAKSVTCTVSCPEGLASMRLQCLAVSPCISFVWNFGIPLHPLASCQCFFIVYPLNV(配列番号232)を有する保持型イントロンを誘導する変異;(B)コドン位置331に隣接する標準5’スプライス部位における変異であって、エピトープLQVLSLGTSY(配列番号237)(HLA-B*15:01)、エピトープFQSNTQNAVF(配列番号238)(HLA-B*15:01)を含むペプチド配列EYFTLQVLSLGTSYQVESFQSNTQNAVFFLTVLPAIGAFAIRGQ(配列番号236)を有する保持型イントロンを誘導する変異;(C)コドン位置126に隣接する標準3’スプライス部位における変異であって、エピトープCTMFCQLAK(配列番号240)(HLA-A*11:01)、エピトープKSVTCTMF(配列番号241)(HLA-B*58:01)を含む新規のスパニングペプチド配列AKSVTCTMFCQLAK(配列番号239)を生成する潜在性の代替エクソン3’スプライス部位を誘導する変異;及び/または(D)コドン位置224に隣接する標準5’スプライス部位における変異であって、エピトープVPYEPPEVW(配列番号243)(HLA-B*53:01、HLA-B*51:01)、エピトープLTVPPSTAW(配列番号244)(HLA-B*58:01、HLA-B*57:01)を含む新規のスパニングペプチド配列VPYEPPEVWLALTVPPSTAWAA(配列番号242)を生成する潜在性の代替イントロン5’スプライス部位を誘導する変異(転写コドン位置は、Ensemblのv83のヒトゲノムアノテーションに由来する標準の全長p53転写物であるENST00000269305(配列番号245)を参照したものである)からなる群から選択されること、及び/または(v)mRNA癌ワクチンは、安定剤を含まないこと。
本開示の別の態様は、(i)個別化癌抗原である1~500のペプチドエピトープをコードする1つまたは複数のオープンリーディングフレームをそれぞれ有する1つまたは複数のmRNAと、(ii)個別化癌抗原に対する免疫応答を高めるポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有するmRNAと、を含む、脂質ナノ粒子を含み、任意選択で、(i)及び(ii)は、およそ5:1の質量比で存在する、mRNA癌ワクチンである。
本開示の別の態様は、(i)個別化癌抗原である1~500のペプチドエピトープをコードする1つまたは複数のオープンリーディングフレームをそれぞれ有する1つまたは複数のmRNAと、(ii)個別化癌抗原に対する免疫応答を高めるポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有するmRNAと、を含む、脂質ナノ粒子を含み、任意選択で、(i)及び(ii)は、およそ5:1の質量比で存在し、任意選択で、ペプチドエピトープのうちの少なくとも1つは、活性化癌遺伝子変異ペプチドまたは従来型癌抗原であり、任意選択で、ペプチドエピトープのうちの少なくとも3つは、複合バリアントであり、ペプチドエピトープのうちの少なくとも2つは、点変異である、mRNA癌ワクチンである。
いくつかの実施形態では、免疫応答は、(i)I型インターフェロン経路のシグナル伝達を刺激すること、(ii)NFkB経路のシグナル伝達を刺激すること、(iii)炎症反応を刺激すること、(iv)サイトカイン産生を刺激すること、または(v)樹状細胞の発生、活性もしくは動員を刺激すること、及び(vi)(i)~(vi)のいずれかの組み合わせを特徴とする細胞性または体液性免疫応答を含む。
1つの実施形態では、mRNA癌ワクチンは、ペプチドエピトープと、個別化癌抗原に対する免疫応答を高めるポリペプチドとの両方をコードする単一のmRNA構築物を含む。別の実施形態では、ペプチドエピトープは、2~100のペプチドエピトープから構成されるコンカテマー癌抗原の形態であり、任意選択で、コンカテマー癌抗原は、5~100のペプチドエピトープから構成される。
いくつかの実施形態では、コンカテマー癌抗原は、a)2~100のペプチドエピトープもしくは5~100のペプチドエピトープが、切断感受性部位が間に入ることによって散在していること、b)それぞれのペプチドエピトープをコードするmRNAが、リンカーなしで互いに直接連結されていること、c)それぞれのペプチドエピトープをコードするmRNAが、単一のヌクレオチドリンカーで互いに連結されていること、d)それぞれのペプチドエピトープが、25~35アミノ酸を含み、かつ中央に位置するSNP変異を含むこと、e)ペプチドエピトープの少なくとも30%が、対象に由来するクラスIのMHC分子に対して最も高い親和性を有すること、f)ペプチドエピトープの少なくとも30%が、対象に由来するクラスIIのMHC分子に対して最も高い親和性を有すること、g)ペプチドエピトープの少なくとも50%が、HLA-A、HLA-B、及び/またはDRB1に対してIC>500nMの予測結合親和性を有すること、h)mRNAが、45~55のペプチドエピトープをコードすること、i)mRNAが、52のペプチドエピトープをコードすること、j)ペプチドエピトープの50%が、クラスIのMHCに対して結合親和性を有し、かつペプチドエピトープの50%が、クラスIIのMHCに対して結合親和性を有すること、k)ペプチドエピトープをコードするmRNAが、ペプチドエピトープの順序が偽エピトープ(pseudo-epitope)を最小化する順序になるように配置されること、l)ペプチドエピトープの少なくとも30%が、15アミノ酸長のMHCクラスI結合ペプチドであること、及び/またはm)ペプチドエピトープの少なくとも30%が、21アミノ酸長のMHCクラスII結合ペプチドであることのうちの1つまたは複数を含む。
いくつかの実施形態では、それぞれのペプチドエピトープは、中央に位置するSNP変異を含み、SNP変異の両側には15の隣接アミノ酸が存在する。
1つの実施形態では、対象において少なくとも1つの個別化癌抗原に対する免疫応答を高めるポリペプチドは、構造的に活性なヒトSTINGポリペプチドである。1つの実施形態では、構造的に活性なヒトSTINGポリペプチドは、V147L、N154S、V155M、R284M、R284K、R284T、E315Q、R375A、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される1つまたは複数の変異を含む。別の実施形態では、構造的に活性なヒトSTINGポリペプチドは、V155M変異を含む。別の実施形態では、構造的に活性なヒトSTINGポリペプチドは、変異R284M/V147L/N154S/V155Mを含む。
いくつかの実施形態では、それぞれのmRNAは、同じまたは異なる脂質ナノ粒子に製剤化される。別の実施形態では、癌個別化癌抗原をコードするそれぞれのmRNAは、同じまたは異なる脂質ナノ粒子に製剤化される。いくつかの実施形態では、個別化癌抗原に対する免疫応答を高めるポリペプチドをコードするそれぞれのmRNAは、同じまたは異なる脂質ナノ粒子に製剤化される。
いくつかの実施形態では、個別化癌抗原をコードするそれぞれのmRNAは、同じ脂質ナノ粒子に製剤化され、個別化癌抗原に対する免疫応答を高めるポリペプチドをコードするそれぞれのmRNAは、異なる脂質ナノ粒子に製剤化される。別の実施形態では、個別化癌抗原をコードするそれぞれのmRNAは、同じ脂質ナノ粒子に製剤化され、個別化癌抗原に対する免疫応答を高めるポリペプチドをコードするそれぞれのmRNAは、個別化癌抗原をコードするそれぞれのmRNAと同じ脂質ナノ粒子に製剤化される。いくつかの実施形態では、個別化癌抗原をコードするそれぞれのmRNAは、異なる脂質ナノ粒子に製剤化され、個別化癌抗原に対する免疫応答を高めるポリペプチドをコードするそれぞれのmRNAは、それぞれの個別化癌抗原をコードするそれぞれのmRNAと同じ脂質ナノ粒子に製剤化される。
いくつかの実施形態では、ペプチドエピトープは、T細胞エピトープ及び/またはB細胞エピトープである。他の実施形態では、ペプチドエピトープは、T細胞エピトープとB細胞エピトープの組み合わせを含む。1つの実施形態では、ペプチドエピトープのうちの少なくとも1つは、T細胞エピトープである。別の実施形態では、ペプチドエピトープのうちの少なくとも1つは、B細胞エピトープである。
いくつかの実施形態では、ペプチドエピトープは、対象のMHCに対する結合強度について最適化されている。他の実施形態では、それぞれのエピトープのTCR面は、内因性タンパク質に対する類似性が低い。
別の実施形態では、mRNA癌ワクチンは、リコール抗原をさらに含む。いくつかの実施形態では、リコール抗原は、感染性疾患抗原である。
1つの実施形態では、mRNA癌ワクチンは、1つまたは複数の従来型癌抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するmRNAをさらに含む。
1つの実施形態では、次の条件のうちの1つまたは複数を満たす:(i)活性化癌遺伝子変異は、KRAS変異であること、(ii)KRAS変異は、G12変異であり、任意選択で、G12 KRAS変異は、G12D、G12V、G12S、G12C、G12A、及びG12R KRAS変異から選択されること、(iii)KRAS変異は、G13変異であり、任意選択で、G13 KRAS変異は、G13D KRAS変異であること、及び/または(iv)活性化癌遺伝子変異は、H-RASもしくはN-RAS変異であること。
1つの実施形態では、次の条件のうちの1つまたは複数を満たす:(A)mRNAは、2つ以上の活性化癌遺伝子変異ペプチドのコンカテマーをコードするオープンリーディングフレームを有すること、(B)ペプチドエピトープのうちの少なくとも2つは、1つのグリシンによって互いに分離されており、任意選択で、ペプチドエピトープのすべてが、1つのグリシンによって互いに分離されていること、(C)コンカテマーは、3~10の活性化癌遺伝子変異ペプチドを含むこと、及び/または(D)ペプチドエピトープのうちの少なくとも2つは、リンカーなしで互いに直接連結されていること。
1つの実施形態では、次の条件のうちの1つまたは複数を満たす:(i)ペプチドエピトープのうちの少なくとも1つは、従来型癌抗原であること、(ii)ペプチドエピトープのうちの少なくとも1つは、反復多型であること、(iii)反復多型は、p53における反復体細胞癌変異を含むこと、(iv)p53における反復体細胞癌変異は、(A)コドン位置T125に隣接する標準5’スプライス部位における変異であって、エピトープAVSPCISFVW(配列番号233)(HLA-B*57:01、HLA-B*58:01)、エピトープHPLASCQCFF(配列番号234)(HLA-B*35:01、HLA-B*53:01)、エピトープFVWNFGIPL(配列番号235)(HLA-A*02:01、HLA-A*02:06、HLA-B*35:01)を含むペプチド配列TAKSVTCTVSCPEGLASMRLQCLAVSPCISFVWNFGIPLHPLASCQCFFIVYPLNV(配列番号232)を有する保持型イントロンを誘導する変異;(B)コドン位置331に隣接する標準5’スプライス部位における変異であって、エピトープLQVLSLGTSY(配列番号237)(HLA-B*15:01)、エピトープFQSNTQNAVF(配列番号238)(HLA-B*15:01)を含むペプチド配列EYFTLQVLSLGTSYQVESFQSNTQNAVFFLTVLPAIGAFAIRGQ(配列番号236)を有する保持型イントロンを誘導する変異;(C)コドン位置126に隣接する標準3’スプライス部位における変異であって、エピトープCTMFCQLAK(配列番号240)(HLA-A*11:01)、エピトープKSVTCTMF(配列番号241)(HLA-B*58:01)を含む新規のスパニングペプチド配列AKSVTCTMFCQLAK(配列番号239)を生成する潜在性の代替エクソン3’スプライス部位を誘導する変異;及び/または(D)コドン位置224に隣接する標準5’スプライス部位における変異であって、エピトープVPYEPPEVW(配列番号243)(HLA-B*53:01、HLA-B*51:01)、エピトープLTVPPSTAW(配列番号244)(HLA-B*58:01、HLA-B*57:01)を含む新規のスパニングペプチド配列VPYEPPEVWLALTVPPSTAWAA(配列番号242)を生成する潜在性の代替イントロン5’スプライス部位を誘導する変異(転写コドン位置は、Ensemblのv83のヒトゲノムアノテーションに由来する標準の全長p53転写物であるENST00000269305(配列番号245)を参照したものである)からなる群から選択されること、及び/または(v)mRNA癌ワクチンは、安定剤を含まないこと。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、約20~60%のイオン化可能なアミノ脂質:5~25%の中性脂質:25~55%のステロール;0.5~15%のPEG修飾脂質のモル比を含み、任意選択で、イオン化可能なアミノ脂質は、カチオン性脂質である。1つの実施形態では、脂質ナノ粒子は、約50%の化合物25:約10%のDSPC:約38.5%のコレステロール;約1.5%のPEG-DMGのモル比を含む。別の実施形態では、イオン化可能なアミノ脂質は、例えば、2,2-ジリノレイル-4-ジメチルアミノエチル-[1,3]-ジオキソラン(DLin-KC2-DMA)、ジリノレイル-メチル-4-ジメチルアミノブチレート(DLin-MC3-DMA)、及びジ((Z)-ノナ-2-エン-1-イル)9-((4-(ジメチルアミノ)ブタノイル)オキシ)ヘプタデカンジオエート(L319)からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、式(I)の化合物を含む。1つの実施形態では、式(I)の化合物は、化合物25である。別の実施形態では、脂質ナノ粒子は、0.4未満の多分散値を有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、中性のpH値で正味の中性電荷を有する。
1つの実施形態では、それぞれのエピトープのTCR面は、内因性タンパク質に対する類似性が低い。
別の実施形態では、mRNAは、免疫チェックポイント調節因子をコードするオープンリーディングフレームをさらに含む。1つの実施形態では、mRNA癌ワクチンは、追加の癌治療剤をさらに含み、任意選択で、追加の癌治療剤は、免疫チェックポイント調節因子である。別の実施形態では、免疫チェックポイント調節因子は、阻害性チェックポイントポリペプチドである。いくつかの実施形態では、阻害性チェックポイントポリペプチドは、PD1、PD-L1、CTLA4、TIM-3、VISTA、A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、IDO、KIR、LAG3、またはそれらの組み合わせを阻害する。
いくつかの実施形態では、チェックポイント阻害剤ポリペプチドは、抗体である。1つの実施形態では、阻害性チェックポイントポリペプチドは、CTLA4に特異的に結合する抗CTLA4抗体またはその抗原結合断片、PD1に特異的に結合する抗PD1抗体またはその抗原結合断片、PD-L1に特異的に結合する抗PD-L1抗体またはその抗原結合断片、及びそれらの組み合わせから選択される抗体である。1つの実施形態では、チェックポイント阻害剤ポリペプチドは、アテゾリズマブ、アベルマブ、またはデュルバルマブから選択される抗PD-L1抗体である。別の実施形態では、チェックポイント阻害剤ポリペプチドは、トレメリムマブまたはイピリムマブから選択される抗CTLA-4抗体である。いくつかの実施形態では、チェックポイント阻害剤ポリペプチドは、ニボルマブまたはペンブロリズマブから選択される抗PD1抗体である。
いくつかの実施形態では、化学修飾は、シュードウリジン、N1-メチルシュードウリジン、2-チオウリジン、4’-チオウリジン、5-メチルシトシン、2-チオ-1-メチル-1-デアザ-シュードウリジン、2-チオ-1-メチル-シュードウリジン、2-チオ-5-アザ-ウリジン、2-チオ-ジヒドロシュードウリジン、2-チオ-ジヒドロウリジン、2-チオ-シュードウリジン、4-メトキシ-2-チオ-シュードウリジン、4-メトキシ-シュードウリジン、4-チオ-1-メチル-シュードウリジン、4-チオ-シュードウリジン、5-アザ-ウリジン、ジヒドロシュードウリジン、5-メチルウリジン、5-メチルウリジン、5-メトキシウリジン、及び2’-O-メチルウリジンからなる群から選択される。
本開示は、別の態様では、癌を有する対象に、上記のmRNA癌ワクチンを投与することを含む、対象のワクチン接種方法を提供する。
いくつかの実施形態では、mRNAワクチンは、10μg~400μgのmRNAワクチンを送達するために十分な用量レベルで対象に投与される。1つの実施形態では、mRNAワクチンは、0.033mg、0.1mg、0.2mg、または0.4mgを送達するために十分な用量レベルで対象に投与される。別の実施形態では、mRNAワクチンは、2回、3回、4回またはそれより多い回数で対象に投与される。いくつかの実施形態では、mRNAワクチンは、3週間ごとに1日1回投与される。1つの実施形態では、mRNAワクチンは、皮内、筋肉内、及び/または皮下投与によって投与される。別の実施形態では、mRNAワクチンは、筋肉内投与によって投与される。
いくつかの実施形態では、方法は、追加の癌治療剤を投与することをさらに含み、任意選択で、追加の癌治療剤は、対象に対する免疫チェックポイント調節因子である。1つの実施形態では、免疫チェックポイント調節因子は、阻害性チェックポイントポリペプチドである。別の実施形態では、阻害性チェックポイントポリペプチドは、PD1、PD-L1、CTLA4、TIM-3、VISTA、A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、IDO、KIR、LAG3、またはそれらの組み合わせを阻害する。いくつかの実施形態では、チェックポイント阻害剤ポリペプチドは、抗体である。他の実施形態では、阻害性チェックポイントポリペプチドは、CTLA4に特異的に結合する抗CTLA4抗体またはその抗原結合断片、PD1に特異的に結合する抗PD1抗体またはその抗原結合断片、PD-L1に特異的に結合する抗PD-L1抗体またはその抗原結合断片、及びそれらの組み合わせから選択される抗体である。いくつかの実施形態では、チェックポイント阻害剤ポリペプチドは、アテゾリズマブ、アベルマブ、またはデュルバルマブから選択される抗PD-L1抗体である。別の実施形態では、チェックポイント阻害剤ポリペプチドは、トレメリムマブまたはイピリムマブから選択される抗CTLA-4抗体である。他の実施形態では、チェックポイント阻害剤ポリペプチドは、ニボルマブまたはペンブロリズマブから選択される抗PD1抗体である。
1つの実施形態では、免疫チェックポイント調節因子は、100~300mgを送達するために十分な用量レベルで対象に投与される。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント調節因子は、200mgを送達するために十分な用量レベルで対象に投与される。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント調節因子は、静脈内注入によって投与される。1つの実施形態では、免疫チェックポイント調節因子は、2回、3回、4回またはそれより多い回数で対象に投与される。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント調節因子は、mRNAワクチン投与と同じ日に対象に投与される。
いくつかの実施形態では、癌は、非小細胞肺癌(NSCLC)、小細胞肺癌、メラノーマ、膀胱尿路上皮癌、HPV陰性頭頸部扁平上皮癌(HNSCC)、及び高頻度マイクロサテライト(MSI H)/ミスマッチ修復(MMR)欠損である固形悪性腫瘍からなる群から選択される。1つの実施形態では、NSCLCは、EGFR感受性変異及び/またはALK転座がない。別の実施形態では、高頻度マイクロサテライト(MSI H)/ミスマッチ修復(MMR)欠損である固形悪性腫瘍は、結腸直腸癌、胃腺癌、食道腺癌、及び子宮内膜癌からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、癌は、膵臓、腹膜、大腸、小腸、胆道、肺、子宮内膜、卵巣、生殖管、胃腸管、子宮頸部、胃、尿路、結腸、直腸、ならびに造血系及びリンパ系組織の癌から選択される。
本開示は、いくつかの態様では、脂質ナノ粒子に製剤化された、癌抗原ペプチドエピトープをコードするオープンリーディングフレームをそれぞれ有する1つまたは複数のmRNAのmRNA癌ワクチン及び薬学的に許容される担体または賦形剤であり、ここで、mRNAワクチンは、5~100のペプチドエピトープをコードし、ペプチドエピトープのうちの少なくとも2つは、個別化癌抗原である。
他の態様では、本発明は、癌抗原ペプチドエピトープをコードするオープンリーディングフレームをそれぞれ有する1つまたは複数のmRNAと、薬学的に許容される担体または賦形剤と、を有するmRNA癌ワクチンであって、mRNAワクチンは、5~100のペプチドエピトープをコードし、ペプチドエピトープのうちの少なくとも3つは、複合バリアントであり、ペプチドエピトープのうちの少なくとも2つは、点変異である、mRNA癌ワクチンである。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、20~60%のカチオン性脂質:5~25%の非カチオン性脂質:25~55%のステロール;0.5~15%のPEG修飾脂質のモル比を含む。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、例えば、2,2-ジリノレイル-4-ジメチルアミノエチル-[1,3]-ジオキソラン(DLin-KC2-DMA)、ジリノレイル-メチル-4-ジメチルアミノブチレート(DLin-MC3-DMA)、及びジ((Z)-ノナ-2-エン-1-イル)9-((4-(ジメチルアミノ)ブタノイル)オキシ)ヘプタデカンジオエート(L319)からなる群から選択される。他の実施形態では、脂質ナノ粒子は、式(I)の化合物を含む。いくつかの実施形態では、式(I)の化合物は、化合物25である。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、0.4未満の多分散値を有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、中性のpH値で正味の中性電荷を有する。
いくつかの実施形態のワクチンは、5~100のペプチドエピトープから構成されるコンカテマー癌抗原をコードするオープンリーディングフレームを有する、mRNAである。さらに他の実施形態では、ペプチドエピトープのうちの少なくとも2つは、1つのグリシンによって互いに分離されている。さらに他の実施形態では、コンカテマー癌抗原は、20~40のペプチドエピトープを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドエピトープのすべてが、1つのグリシンによって互いに分離されている。いくつかの実施形態では、ペプチドエピトープのうちの少なくとも2つは、リンカーなしで互いに直接連結されている。
実施形態のそれぞれのペプチドエピトープは、25~35アミノ酸を含み、かつ中央に位置するSNP変異を含む。
いくつかの実施形態では、ペプチドエピトープの少なくとも30%は、対象に由来するクラスIのMHC分子に対して最も高い親和性を有する。さらに他の実施形態では、ペプチドエピトープの少なくとも30%は、対象に由来するクラスIIのMHC分子に対して最も高い親和性を有する。さらに他の実施形態では、ペプチドエピトープの少なくとも50%は、HLA-A、HLA-B及び/またはDRB1に対してIC>500nMの予測結合親和性を有する。
いくつかの実施形態では、本発明の1つまたは複数のmRNAは、最大20のペプチドエピトープをコードする。いくつかの実施形態では、本発明の1つまたは複数のmRNAは、最大50のエピトープをコードする。いくつかの実施形態では、本発明の1つまたは複数のmRNAは、最大100のエピトープをコードする。
他の実施形態によれば、ペプチドエピトープをコードするmRNAは、ペプチドエピトープの順序が偽エピトープ(pseudo-epitope)を最小化する順序になるように配置される。
それぞれのペプチドエピトープは、31アミノ酸を含み得、かつ中央に位置するSNP変異を含み、SNP変異の両側には15の隣接アミノ酸が存在する。
いくつかの実施形態では、それぞれのエピトープのTCR面は、内因性タンパク質に対する類似性が低い。
さらに他の実施形態では、mRNAは、リコール抗原をさらに含む。リコール抗原は、感染性疾患抗原であり得る。
他の実施形態では、ペプチドエピトープのうちの少なくとも1つは、従来型癌抗原である。ワクチンは、いくつかの実施形態では、1つまたは複数の反復多型をコードするオープンリーディングフレームを有するmRNAを含む。1つまたは複数の反復多型は、p53における反復体細胞癌変異を含み得る。p53における1つまたは複数の反復体細胞癌変異は、いくつかの実施形態では、(A)コドン位置T125に隣接する標準5’スプライス部位における変異であって、エピトープAVSPCISFVW(配列番号233)(HLA-B*57:01、HLA-B*58:01)、エピトープHPLASCQCFF(配列番号234)(HLA-B*35:01、HLA-B*53:01)、エピトープFVWNFGIPL(配列番号235)(HLA-A*02:01、HLA-A*02:06、HLA-B*35:01)を含むペプチド配列TAKSVTCTVSCPEGLASMRLQCLAVSPCISFVWNFGIPLHPLASCQCFFIVYPLNV(配列番号232)を有する保持型イントロンを誘導する変異;(B)コドン位置331に隣接する標準5’スプライス部位における変異であって、エピトープLQVLSLGTSY(配列番号237)(HLA-B*15:01)、エピトープFQSNTQNAVF(配列番号238)(HLA-B*15:01)を含むペプチド配列EYFTLQVLSLGTSYQVESFQSNTQNAVFFLTVLPAIGAFAIRGQ(配列番号236)を有する保持型イントロンを誘導する変異;(C)コドン位置126に隣接する標準3’スプライス部位における変異であって、エピトープCTMFCQLAK(配列番号240)(HLA-A*11:01)、エピトープKSVTCTMF(配列番号241)(HLA-B*58:01)を含む新規のスパニングペプチド配列AKSVTCTMFCQLAK(配列番号239)を生成する潜在性の代替エクソン3’スプライス部位を誘導する変異;及び/または(D)コドン位置224に隣接する標準5’スプライス部位における変異であって、エピトープVPYEPPEVW(配列番号243)(HLA-B*53:01、HLA-B*51:01)、エピトープLTVPPSTAW(配列番号244)(HLA-B*58:01、HLA-B*57:01)を含む新規のスパニングペプチド配列VPYEPPEVWLALTVPPSTAWAA(配列番号242)を生成する潜在性の代替イントロン5’スプライス部位を誘導する変異(転写コドン位置は、Ensemblのv83のヒトゲノムアノテーションに由来する標準の全長p53転写物であるENST00000269305(配列番号245)を参照したものである)からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、mRNAは、免疫チェックポイント調節因子をコードするオープンリーディングフレームをさらに含む。いくつかの実施形態では、mRNA癌ワクチンは、免疫チェックポイント調節因子を含む。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント調節因子は、阻害性チェックポイントポリペプチドである。いくつかの実施形態では、阻害性チェックポイントポリペプチドは、PD-1、TIM-3、VISTA、A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、CTLA-4、IDO、KIR及びLAG3からなる群から選択される分子に特異的に結合する抗体またはその断片である。いくつかの実施形態では、阻害性チェックポイントポリペプチドは、抗CTLA4または抗PD1抗体である。いくつかの実施形態では、抗PD-1抗体は、ペンブロリズマブである。
いくつかの実施形態では、mRNA癌ワクチンは、安定化剤を含まない。
いくつかの実施形態では、mRNAは、少なくとも1つの化学修飾を含む。化学修飾は、シュードウリジン、N1-メチルシュードウリジン、2-チオウリジン、4’-チオウリジン、5-メチルシトシン、2-チオ-1-メチル-1-デアザ-シュードウリジン、2-チオ-1-メチル-シュードウリジン、2-チオ-5-アザ-ウリジン、2-チオ-ジヒドロシュードウリジン、2-チオ-ジヒドロウリジン、2-チオ-シュードウリジン、4-メトキシ-2-チオ-シュードウリジン、4-メトキシ-シュードウリジン、4-チオ-1-メチル-シュードウリジン、4-チオ-シュードウリジン、5-アザ-ウリジン、ジヒドロシュードウリジン、5-メチルウリジン、5-メチルウリジン、5-メトキシウリジン、及び2’-O-メチルウリジンからなる群から選択され得る。
他の態様では、対象のワクチン接種方法が提供される。方法は、癌を有する対象に、本明細書に開示のmRNAワクチンを投与することを伴う。
いくつかの実施形態では、mRNAワクチンは、10μg~400μgのmRNAワクチンを送達するために十分な用量レベルで対象に投与される。いくつかの実施形態では、mRNAワクチンは、0.033mg、0.1mg、0.2mg、または0.4mgを送達するために十分な用量レベルで対象に投与される。いくつかの実施形態では、mRNAワクチンは、2回、3回、4回またはそれより多い回数で対象に投与される。いくつかの実施形態では、mRNAワクチンは、3週間ごとに1日1回投与される。
いくつかの実施形態では、mRNAワクチンは、皮内、筋肉内、及び/または皮下投与によって投与される。いくつかの実施形態では、mRNAワクチンは、筋肉内投与によって投与される。
いくつかの実施形態では、方法は、追加の癌治療剤を投与することをさらに含み、任意選択で、追加の癌治療剤は、対象に対する免疫チェックポイント調節因子である。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント調節因子は、阻害性チェックポイントポリペプチドである。いくつかの実施形態では、阻害性チェックポイントポリペプチドは、PD-1、TIM-3、VISTA、A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、CTLA-4、IDO、KIR及びLAG3からなる群から選択される分子に特異的に結合する抗体またはその断片である。いくつかの実施形態では、阻害性チェックポイントポリペプチドは、抗PD1抗体である。いくつかの実施形態では、抗PD-1抗体は、ペンブロリズマブである。
いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント調節因子は、100~300mgを送達するために十分な用量レベルで対象に投与される。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント調節因子は、200mgを送達するために十分な用量レベルで対象に投与される。
いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント調節因子は、静脈内注入によって投与される。
いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント調節因子は、2回、3回、4回またはそれより多い回数で対象に投与される。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント調節因子は、mRNAワクチン投与と同じ日に対象に投与される。
いくつかの実施形態では、癌は、非小細胞肺癌(NSCLC)、小細胞肺癌、メラノーマ、膀胱尿路上皮癌、HPV陰性頭頸部扁平上皮癌(HNSCC)、及び高頻度マイクロサテライト(MSI H)/ミスマッチ修復(MMR)欠損である固形悪性腫瘍からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、NSCLCは、EGFR感受性変異及び/またはALK転座がない。いくつかの実施形態では、高頻度マイクロサテライト(MSI H)/ミスマッチ修復(MMR)欠損である固形悪性腫瘍は、結腸直腸癌、胃腺癌、食道腺癌、及び子宮内膜癌からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、癌は、膵臓、腹膜、大腸、小腸、胆道、肺、子宮内膜、卵巣、生殖管、胃腸管、子宮頸部、胃、尿路、結腸、直腸、ならびに造血系及びリンパ系組織の癌から選択される。
mRNA癌ワクチンの調製方法が他の態様では提供される。方法は、対象から試料を単離することと、試料中の複数の癌抗原を同定することと、複数の癌抗原から免疫原性エピトープを決定することと、癌抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するmRNA癌ワクチンを調製することと、を伴う。本発明の他の態様では、1000~3000ヌクレオチドを含むコンカテマー癌抗原をコードするmRNAの生成方法が提供される。方法は、
(a)先行請求項のいずれか1項に記載の癌抗原をコードするオープンリーディングフレームを含む第1のポリヌクレオチド及び5’-UTRを含む第2のポリヌクレオチドの、固形担体に複合化したポリヌクレオチドへの結合と、
(b)第2のポリヌクレオチドの3’末端の、第1のポリヌクレオチドの5’末端への適切な条件下でのライゲーションであって、適切な条件がDNAリガーゼを含み、それによって、第1のライゲーション産物が生成するライゲーションと、
(c)3’-UTRを含む第3のポリヌクレオチドの5’末端の、第1のライゲーション産物の3’末端への、適切な条件下でのライゲーションであって、適切な条件がRNAリガーゼを含み、それによって、第2のライゲーション産物が生成するライゲーションと、
(d)固形担体からの第2のライゲーション産物の遊離と、
を含み、それによって、1000~3000ヌクレオチドを含むコンカテマー癌抗原をコードするmRNAが生成する。
(a)先行請求項のいずれか1項に記載の癌抗原をコードするオープンリーディングフレームを含む第1のポリヌクレオチド及び5’-UTRを含む第2のポリヌクレオチドの、固形担体に複合化したポリヌクレオチドへの結合と、
(b)第2のポリヌクレオチドの3’末端の、第1のポリヌクレオチドの5’末端への適切な条件下でのライゲーションであって、適切な条件がDNAリガーゼを含み、それによって、第1のライゲーション産物が生成するライゲーションと、
(c)3’-UTRを含む第3のポリヌクレオチドの5’末端の、第1のライゲーション産物の3’末端への、適切な条件下でのライゲーションであって、適切な条件がRNAリガーゼを含み、それによって、第2のライゲーション産物が生成するライゲーションと、
(d)固形担体からの第2のライゲーション産物の遊離と、
を含み、それによって、1000~3000ヌクレオチドを含むコンカテマー癌抗原をコードするmRNAが生成する。
他の態様では、本発明は、本明細書に記載の方法に従って調製可能なコンカテマー癌抗原を含む、mRNA癌ワクチンである。
本発明の他の態様に従って、個別化mRNA癌ワクチンでの対象の治療方法が提供される。方法は、患者特異的なミュータノーム(mutanome)を生成するための、試料に由来する患者のトランスクリプトーム及び/または患者のエクソームの解析によるネオエピトープのセットの同定と、MHCとの結合強度、MHCとの結合多様性、免疫原性の予測度合い、自己反応性の低さ、活性化癌遺伝子変異の存在及び/またはT細胞反応性に基づく、ワクチン向けネオエピトープのセットのミュータノームからの選択と、ネオエピトープのセットをコードするmRNAワクチンの調製と、対象からの試料の単離の2ヶ月以内に実施される、mRNAワクチンの対象への投与と、を含む。いくつかの実施形態では、同定は、対象由来試料から得た患者トランスクリプトーム及び/または患者エクソームを解析することを含む。いくつかの実施形態では、対象由来試料は、生物学的試料、例えば、生検である。いくつかの実施形態では、方法は、対象から試料を単離することをさらに含む。いくつかの実施形態では、同定は、利用可能なデータベースにおける組織特異的発現を解析することを含む。
本発明の他の態様では、ネオエピトープのセットをコードする1つまたは複数のポリヌクレオチドを有する個別化mRNA癌ワクチンにおける使用を目的とする、ネオエピトープのセットの同定方法が提供される。方法は、
a.患者のトランスクリプトーム及び患者のエクソームの解析による患者特異的なミュータノームの同定と、
b.患者のRNAシークエンシングにおける遺伝子もしくは転写物レベルの発現評価;バリアントコ-ル(variant call)信頼スコア;RNAシークエンシングに基づく対立遺伝子特異的発現;保存的アミノ酸置換と非保存的アミノ酸置換との比較;点変異の位置(TCRの関与増加についての中心スコア(Centering Score));点変異の位置(HLAとの結合の差異についての固定スコア(Anchoring Score));独自性(Selfness):患者のWESデータとのコアエピトープ相同性(<100%);8マー~11マーについてはHLA-A及びHLA-Bに対するIC50;15マー~20マーについてはHLA-DRB1に対するIC50;広範結合スコア(promiscuity Score)(すなわち、結合すると予測される患者HLAの数);8マー~11マーについてはHLA-Cに対するIC50;15マー~20マーについてはHLA-DRB3~5に対するIC50;15マー~20マーについてはHLA-DQB1/A1に対するIC50;15マー~20マーについてはHLA-DPB1/A1に対するIC50;クラスIとクラスIIとの比率比較;患者においてカバーされるHLA-Aアロタイプ、HLA-Bアロタイプ、及びHLA-DRB1アロタイプの多様性;点変異と複合エピトープ(例えば、フレームシフト)との比率比較;偽エピトープHLA結合スコア;RNAシークエンシングリードの存在及び/または存在量のうちの少なくとも3つに基づく、ネオエピトープに対する加重値を使用する、ミュータノームからの15~500のネオエピトープのサブセットの選択と、
c.最高加重値に基づく、サブセットからの、個別化mRNA癌ワクチンにおける使用を目的とするネオエピトープのセットの選択であって、ネオエピトープのセットが15~40のネオエピトープを含む選択と、を含む。
a.患者のトランスクリプトーム及び患者のエクソームの解析による患者特異的なミュータノームの同定と、
b.患者のRNAシークエンシングにおける遺伝子もしくは転写物レベルの発現評価;バリアントコ-ル(variant call)信頼スコア;RNAシークエンシングに基づく対立遺伝子特異的発現;保存的アミノ酸置換と非保存的アミノ酸置換との比較;点変異の位置(TCRの関与増加についての中心スコア(Centering Score));点変異の位置(HLAとの結合の差異についての固定スコア(Anchoring Score));独自性(Selfness):患者のWESデータとのコアエピトープ相同性(<100%);8マー~11マーについてはHLA-A及びHLA-Bに対するIC50;15マー~20マーについてはHLA-DRB1に対するIC50;広範結合スコア(promiscuity Score)(すなわち、結合すると予測される患者HLAの数);8マー~11マーについてはHLA-Cに対するIC50;15マー~20マーについてはHLA-DRB3~5に対するIC50;15マー~20マーについてはHLA-DQB1/A1に対するIC50;15マー~20マーについてはHLA-DPB1/A1に対するIC50;クラスIとクラスIIとの比率比較;患者においてカバーされるHLA-Aアロタイプ、HLA-Bアロタイプ、及びHLA-DRB1アロタイプの多様性;点変異と複合エピトープ(例えば、フレームシフト)との比率比較;偽エピトープHLA結合スコア;RNAシークエンシングリードの存在及び/または存在量のうちの少なくとも3つに基づく、ネオエピトープに対する加重値を使用する、ミュータノームからの15~500のネオエピトープのサブセットの選択と、
c.最高加重値に基づく、サブセットからの、個別化mRNA癌ワクチンにおける使用を目的とするネオエピトープのセットの選択であって、ネオエピトープのセットが15~40のネオエピトープを含む選択と、を含む。
本開示は、いくつかの態様では、癌抗原ペプチドエピトープをコードするオープンリーディングフレームをそれぞれ有する1つまたは複数のmRNAのmRNA癌ワクチンであり、ここで、mRNAは、miRNA結合部位をさらに含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、5~100のペプチドエピトープをコードする。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の核酸ワクチンは、化学的に修飾される。他の実施形態では、核酸ワクチンは、修飾されない。
さらに他の態様は、癌抗原エピトープをコードするオープンリーディングフレームを有する1つまたは複数のRNAポリヌクレオチドを含む核酸ワクチンの対象への投与を含む、対象のワクチン接種を目的とする組成物及び対象のワクチン接種方法を提供し、RNAポリヌクレオチドは安定化要素を含まず、ワクチンと共にアジュバントが同時製剤化または同時投与されることはない。
他の態様では、本発明は、第1の癌抗原エピトープをコードするオープンリーディングフレームを有する1つまたは複数のRNAポリヌクレオチドを含む核酸ワクチンの対象への投与を含む、対象のワクチン接種を目的とする組成物または対象のワクチン接種方法であり、対象に投与される核酸ワクチンの用量は、10μg/kg~400μg/kgである。いくつかの実施形態では、RNAポリヌクレオチドの用量は、用量当たり、1~5μg、5~10μg、10~15μg、15~20μg、10~25μg、20~25μg、20~50μg、30~50μg、40~50μg、40~60μg、60~80μg、60~100μg、50~100μg、80~120μg、40~120μg、40~150μg、50~150μg、50~200μg、80~200μg、100~200μg、120~250μg、150~250μg、180~280μg、200~300μg、50~300μg、80~300μg、100~300μg、40~300μg、50~350μg、100~350μg、200~350μg、300~350μg、320~400μg、40~380μg、40~100μg、100~400μg、200~400μg、または300~400μgである。いくつかの実施形態では、核酸ワクチンは、皮内注射または筋肉内注射によって対象に投与される。いくつかの実施形態では、核酸ワクチンは、0日目に対象に投与される。いくつかの実施形態では、第2の用量の核酸ワクチンは、21日目に対象に投与される。
いくつかの実施形態では、対象に投与される核酸ワクチンに含まれるRNAポリヌクレオチドの用量は、25マイクログラムである。いくつかの実施形態では、対象に投与される核酸ワクチンに含まれるRNAポリヌクレオチドの用量は、100マイクログラムである。いくつかの実施形態では、対象に投与される核酸ワクチンに含まれるRNAポリヌクレオチドの用量は、50マイクログラムである。いくつかの実施形態では、対象に投与される核酸ワクチンに含まれるRNAポリヌクレオチドの用量は、75マイクログラムである。いくつかの実施形態では、対象に投与される核酸ワクチンに含まれるRNAポリヌクレオチドの用量は、150マイクログラムである。いくつかの実施形態では、対象に投与される核酸ワクチンに含まれるRNAポリヌクレオチドの用量は、400マイクログラムである。いくつかの実施形態では、対象に投与される核酸ワクチンに含まれるRNAポリヌクレオチドの用量は、200マイクログラムである。いくつかの実施形態では、RNAポリヌクレオチドは、遠位リンパ節と比較して局所リンパ節に100倍高いレベルで蓄積する。他の実施形態では、核酸ワクチンは、化学的に修飾され、他の実施形態では、核酸ワクチンは、化学的に修飾されない。
いくつかの実施形態では、有効量は、1~100μgの総用量である。いくつかの実施形態では、有効量は、100μgの総用量である。いくつかの実施形態では、有効量は、対象に合計1回または2回投与される25μgの用量である。いくつかの実施形態では、有効量は、対象に合計2回投与される100μgの用量である。いくつかの実施形態では、有効量は、1回もしくは2回またはそれより多い回数で対象に投与され得る、1μg~10μg、1μg~20μg、1μg~30μg、5μg~10μg、5μg~20μg、5μg~30μg、5μg~40μg、5μg~50μg、10μg~15μg、10μg~20μg、10μg~25μg、10μg~30μg、10μg~40μg、10μg~50μg、10μg~60μg、15μg~20μg、15μg~25μg、15μg~30μg、15μg~40μg、15μg~50μg、20μg~25μg、20μg~30μg、20μg~40μg20μg~50μg、20μg~60μg、20μg~70μg、20μg~75μg、30μg~35μg、30μg~40μg、30μg~45μg30μg~50μg、30μg~60μg、30μg~70μg、30μg~75μgの用量である。
本発明の態様では、第1の抗原ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する1つまたは複数のRNAポリヌクレオチドと、薬学的に許容される担体または賦形剤と、を含む核酸ワクチンが提供され、RNAポリヌクレオチドは、安定化要素を含まず、ワクチンは、アジュバントを含まない。いくつかの実施形態では、安定化要素は、ヒストンステムループである。いくつかの実施形態では、安定化要素は、野生型配列と比較してGC含量が高まった核酸配列である。
態様は、少なくとも1つの化学修飾を含むか、または化学修飾を任意選択で含まないオープンリーディングフレームを有する1つまたは複数のRNAポリヌクレオチドを含み、オープンリーディングフレームが第1の抗原ポリペプチドをコードする核酸ワクチンを提供し、RNAポリヌクレオチドは、対象における抗原発現レベルが、安定化要素を有するか、またはアジュバントとともに製剤化された、第1の抗原ポリペプチドをコードするmRNAワクチンによってもたらされる抗原発現レベルよりも有意に大きくなるように対象へのインビボ投与のための製剤中に存在する。
他の態様では、少なくとも1つの化学修飾を含むか、または化学修飾を任意選択で含まないオープンリーディングフレームを有する1つまたは複数のRNAポリヌクレオチドを含み、オープンリーディングフレームが第1の抗原ポリペプチドをコードする核酸ワクチンが提供され、非修飾mRNAワクチンが同等の抗体価を生成するために必要となるものと比較して、ワクチンで必要になるRNAポリヌクレオチドは少なくとも10倍少ない。
本発明の態様では、使用ワクチン単位も提供され、当該単位は、少なくとも1つの化学修飾を含むか、または化学修飾を任意選択で含まないオープンリーディングフレームを有し、オープンリーディングフレームが第1の抗原ポリペプチドをコードする1つまたは複数のRNAポリヌクレオチドを10ug~400ugと、ヒト対象への送達を目的として製剤化された薬学的に許容される担体または賦形剤と、を含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、カチオン性脂質ナノ粒子をさらに含む。
本発明の態様は、本明細書に開示のmRNA癌ワクチンを含むバイアルを含むキットを提供する。いくつかの実施形態では、バイアルは、0.1mg~1mgのmRNAを収容する。いくつかの実施形態では、バイアルは、0.35mgのmRNAを収容する。いくつかの実施形態では、mRNAの濃度は、1mg/mLである。
いくつかの実施形態では、バイアルは、5~15mgの総脂質を収容する。いくつかの実施形態では、バイアルは、7mgの総脂質を収容する。いくつかの実施形態では、総脂質の濃度は、20mg/mLである。
いくつかの実施形態では、mRNA癌ワクチンは、液体である。
いくつかの実施形態では、キットは、シリンジをさらに含む。いくつかの実施形態では、シリンジは、筋肉内投与に好適である。
本発明の態様では、対象のワクチン接種方法が提供され、方法は、第1の抗原ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する1つまたは複数のRNAポリヌクレオチドを対象のワクチン接種に有効な量で含む核酸ワクチンの、25ug/kg~400ug/kgの単回用量での対象への投与を含む。
いくつかの態様では、本開示は、抗原として活性化癌遺伝子変異を含み得る、mRNA癌ワクチンである。いくつかの実施形態では、活性化癌遺伝子変異は、KRAS変異である。いくつかの実施形態では、KRAS変異は、G12変異である。いくつかの実施形態では、G12 KRAS変異は、G12D、G12V、G12S、G12C、G12A、及びG12R KRAS変異から選択され、例えば、G12 KRAS変異は、G12D、G12V、及びG12S KRAS変異から選択される。他の実施形態では、KRAS変異は、G13変異であり、例えば、G13 KRAS変異は、G13D KRAS変異である。いくつかの実施形態では、活性化癌遺伝子変異は、H-RASまたはN-RAS変異である。
いくつかの実施形態では、当業者は、本明細書に記載の指針に基づいて、KRAS変異、HLAサブタイプ及び腫瘍の種類を選択し、治療用のKRASワクチンを調製するであろう。いくつかの実施形態では、KRAS変異は、G12C、G12V、G12D、G13Dから選択される。いくつかの実施形態では、HLAサブタイプは、A*02:01、C*07:01、C*04:01、C*07:02から選択される。いくつかの実施形態では、腫瘍の種類は、結腸直腸、膵臓、肺、及び類内膜から選択される。
いくつかの実施形態では、HRAS変異は、コドン12、コドン13、またはコドン61における変異である。いくつかの実施形態では、HRAS変異は、12V、61L、または61R変異である。
いくつかの実施形態では、NRAS変異は、コドン12、コドン13、またはコドン61における変異である。いくつかの実施形態では、NRAS変異は、12D、13D、61K、または61R変異である。
本開示のいくつかの実施形態は、2つ以上の活性化癌遺伝子変異ペプチドのコンカテマーをコードするオープンリーディングフレームを有するmRNAを含む、mRNA癌ワクチンを提供する。いくつかの実施形態では、ペプチドエピトープのうちの少なくとも2つは、1つのグリシンによって互いに分離されている。いくつかの実施形態では、コンカテマーは、3~10の活性化癌遺伝子変異ペプチドを含む。いくつかのそのような実施形態では、ペプチドエピトープのすべてが、1つのグリシンによって互いに分離されている。他の実施形態では、ペプチドエピトープのうちの少なくとも2つは、リンカーなしで互いに直接連結される。
いくつかの実施形態では、mRNA癌ワクチンは、癌治療剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、mRNA癌ワクチンは、阻害性チェックポイントポリペプチドをさらに含む。例えば、いくつかの実施形態では、阻害性チェックポイントポリペプチドは、PD-1、TIM-3、VISTA、A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、CTLA-4、IDO、KIR及びLAG3からなる群から選択される分子に特異的に結合する抗体またはその断片である。他の実施形態では、mRNA癌ワクチンは、リコール抗原をさらに含む。例えば、いくつかの実施形態では、リコール抗原は、感染性疾患抗原である。
いくつかの実施形態では、mRNA癌ワクチンは、安定化剤を含まない。
いくつかの実施形態では、mRNAは、約20~60%のカチオン性脂質:5~25%の非カチオン性脂質:25~55%のステロール;0.5~15%のPEG修飾脂質のモル比を含む脂質ナノ粒子担体などの脂質ナノ粒子担体中に製剤化される。カチオン性脂質は、例えば、2,2-ジリノレイル-4-ジメチルアミノエチル-[1,3]-ジオキソラン(DLin-KC2-DMA)、ジリノレイル-メチル-4-ジメチルアミノブチレート(DLin-MC3-DMA)、及びジ((Z)-ノナ-2-エン-1-イル)9-((4-(ジメチルアミノ)ブタノイル)オキシ)ヘプタデカンジオエート(L319)からなる群から選択され得る。
いくつかの実施形態では、mRNAは、少なくとも1つの化学修飾を含む。化学修飾は、シュードウリジン、N1-メチルシュードウリジン、2-チオウリジン、4’-チオウリジン、5-メチルシトシン、2-チオ-1-メチル-1-デアザ-シュードウリジン、2-チオ-1-メチル-シュードウリジン、2-チオ-5-アザ-ウリジン、2-チオ-ジヒドロシュードウリジン、2-チオ-ジヒドロウリジン、2-チオ-シュードウリジン、4-メトキシ-2-チオ-シュードウリジン、4-メトキシ-シュードウリジン、4-チオ-1-メチル-シュードウリジン、4-チオ-シュードウリジン、5-アザ-ウリジン、ジヒドロシュードウリジン、5-メチルウリジン、5-メチルウリジン、5-メトキシウリジン、及び2’-O-メチルウリジンからなる群から選択され得る。
他の態様では、対象の治療方法が提供される。方法は、癌を有する対象に、前述の実施形態のいずれか1つのmRNA癌ワクチンを投与することを伴う。いくつかの実施形態では、mRNA癌ワクチンは、癌治療剤と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態では、mRNA癌ワクチンは、阻害性チェックポイントポリペプチドと組み合わせて投与される。例えば、いくつかの実施形態では、mRNA癌ワクチンは、PD-1、TIM-3、VISTA、A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、CTLA-4、IDO、KIR及びLAG3からなる群から選択される分子に特異的に結合する抗体またはその断片である。
本明細書で提供される方法は、癌を有する対象の治療に使用され得る。いくつかの実施形態では、癌は、膵臓、腹膜、大腸、小腸、胆道、肺、子宮内膜、卵巣、生殖管、胃腸管、子宮頸部、胃、尿路、結腸、直腸、ならびに造血系及びリンパ系組織の癌から選択される。いくつかの実施形態では、癌は、結腸直腸癌である。
いくつかの実施形態では、対象に投与されるmRNA癌ワクチンの用量は、用量当たり、1~5μg、5~10μg、10~15μg、15~20μg、10~25μg、20~25μg、20~50μg、30~50μg、40~50μg、40~60μg、60~80μg、60~100μg、50~100μg、80~120μg、40~120μg、40~150μg、50~150μg、50~200μg、80~200μg、100~200μg、120~250μg、150~250μg、180~280μg、200~300μg、50~300μg、80~300μg、100~300μg、40~300μg、50~350μg、100~350μg、200~350μg、300~350μg、320~400μg、40~380μg、40~100μg、100~400μg、200~400μg、または300~400μgである。いくつかの実施形態では、mRNA癌ワクチンは、皮内注射または筋肉内注射によって対象に投与される。いくつかの実施形態では、mRNA癌ワクチンは、0日目に対象に投与される。いくつかの実施形態では、第2の用量のmRNA癌ワクチンは、21日目に対象に投与される。
いくつかの実施形態では、25マイクログラムの用量のmRNA癌ワクチンが対象に投与される。いくつかの実施形態では、100マイクログラムの用量のmRNA癌ワクチンが対象に投与される。いくつかの実施形態では、50マイクログラムの用量のmRNA癌ワクチンが対象に投与される。いくつかの実施形態では、75マイクログラムの用量のmRNA癌ワクチンが対象に投与される。いくつかの実施形態では、150マイクログラムの用量のmRNA癌ワクチンが対象に投与される。いくつかの実施形態では、400マイクログラムの用量のmRNA癌ワクチンが対象に投与される。いくつかの実施形態では、200マイクログラムの用量のmRNA癌ワクチンが対象に投与される。いくつかの実施形態では、mRNA癌ワクチンは、遠位リンパ節と比較して局所リンパ節に100倍高いレベルで蓄積する。他の実施形態では、mRNA癌ワクチンは、化学的に修飾され、他の実施形態では、mRNA癌ワクチンは、化学的に修飾されない。
いくつかの実施形態では、有効量は、1~100μgの総用量である。いくつかの実施形態では、有効量は、100μgの総用量である。いくつかの実施形態では、有効量は、対象に合計1回または2回投与される25μgの用量である。いくつかの実施形態では、有効量は、対象に合計2回投与される100μgの用量である。いくつかの実施形態では、有効量は、1回もしくは2回またはそれより多い回数で対象に投与され得る、1μg~10μg、1μg~20μg、1μg~30μg、5μg~10μg、5μg~20μg、5μg~30μg、5μg~40μg、5μg~50μg、10μg~15μg、10μg~20μg、10μg~25μg、10μg~30μg、10μg~40μg、10μg~50μg、10μg~60μg、15μg~20μg、15μg~25μg、15μg~30μg、15μg~40μg、15μg~50μg、20μg~25μg、20μg~30μg、20μg~40μg20μg~50μg、20μg~60μg、20μg~70μg、20μg~75μg、30μg~35μg、30μg~40μg、30μg~45μg30μg~50μg、30μg~60μg、30μg~70μg、30μg~75μgの用量である。
本発明の態様は、1000~3000ヌクレオチドを含むコンカテマー癌抗原をコードするmRNAの生成方法であって、(a)請求項1~103のいずれか1項に記載の癌抗原をコードするオープンリーディングフレームを含む第1のポリヌクレオチド及び5’-UTRを含む第2のポリヌクレオチドの、固形担体に複合化したポリヌクレオチドへの結合と、(b)第2のポリヌクレオチドの3’末端の、第1のポリヌクレオチドの5’末端への適切な条件下でのライゲーションであって、適切な条件がDNAリガーゼを含み、それによって、第1のライゲーション産物が生成するライゲーションと、(c)3’-UTRを含む第3のポリヌクレオチドの5’末端の、第1のライゲーション産物の3’末端への、適切な条件下でのライゲーションであって、適切な条件がRNAリガーゼを含み、それによって、第2のライゲーション産物が生成するライゲーションと、(d)固形担体からの第2のライゲーション産物の遊離と、を含み、それによって、1000~3000ヌクレオチドを含むコンカテマー癌抗原をコードするmRNAが生成する、方法を提供する。
本発明の態様は、個別化mRNA癌ワクチンでの対象の治療方法であって、患者特異的なミュータノームを生成するためのネオエピトープのセットの同定と、MHCとの結合強度、MHCとの結合多様性、免疫原性の予測度合い、自己反応性の低さ、及び/またはT細胞反応性に基づく、ワクチン向けネオエピトープのセットのミュータノームからの選択と、ネオエピトープのセットをコードするmRNAワクチンの調製と、対象からの試料の単離の2ヶ月以内に実施される、mRNAワクチンの対象への投与と、を含む、方法を提供する。
本発明の態様は、ネオエピトープのセットをコードする1つまたは複数のポリヌクレオチドを有する個別化mRNA癌ワクチンにおける使用を目的とする、ネオエピトープのセットの同定方法であって、(a)患者のトランスクリプトーム及び患者のエクソームの解析による患者特異的なミュータノームの同定と、(b)患者のRNAシークエンシングにおける遺伝子もしくは転写物レベルの発現評価;バリアントコ-ル(variant call)信頼スコア;RNAシークエンシングに基づく対立遺伝子特異的発現;保存的アミノ酸置換と非保存的アミノ酸置換との比較;点変異の位置(TCRの関与増加についての中心スコア(Centering Score));点変異の位置(HLAとの結合の差異についての固定スコア(Anchoring Score));独自性(Selfness):患者のWESデータとのコアエピトープ相同性(<100%);8マー~11マーについてはHLA-A及びHLA-Bに対するIC50;15マー~20マーについてはHLA-DRB1に対するIC50;広範結合スコア;8マー~11マーについてはHLA-Cに対するIC50;15マー~20マーについてはHLA-DRB3~5に対するIC50;15マー~20マーについてはHLA-DQB1/A1に対するIC50;15マー~20マーについてはHLA-DPB1/A1に対するIC50;クラスIとクラスIIとの比率比較;患者においてカバーされるHLA-Aアロタイプ、HLA-Bアロタイプ、及びHLA-DRB1アロタイプの多様性;点変異と複合エピトープとの比率比較;偽エピトープHLA結合スコア;RNAシークエンシングリードの存在及び/または存在量のうちの少なくとも3つに基づく、ネオエピトープに対する加重値を使用する、ミュータノームからの15~500のネオエピトープのサブセットの選択と、(c)最高加重値に基づく、サブセットからの、個別化mRNA癌ワクチンにおける使用を目的とするネオエピトープのセットの選択であって、ネオエピトープのセットが15~40のネオエピトープを含む選択と、を含む、方法を提供する。
本発明の態様は、ネオエピトープのセットをコードする1つまたは複数のポリヌクレオチドを有する個別化mRNA癌ワクチンにおける使用を目的とする、ネオエピトープのセットの同定方法であって、(a)患者の腫瘍からRNAシークエンシング試料を生成して、RNAシークエンシングリードのセットを生成することと、(b)すべてのRNAシークエンシングリードからヌクレオチド配列の総数をコンパイルすることと、(c)腫瘍試料と、同じ組織種の正常組織の対応するデータベースとの間で配列情報を比較することと、(d)最高加重値に基づく、サブセットからの、個別化mRNA癌ワクチンにおける使用を目的とするネオエピトープのセットの選択であって、ネオエピトープのセットが15~40のネオエピトープを含む選択と、を含む、方法を提供する。
本発明のさまざまな実施形態の詳細は、下記の説明において示される。本発明の他の特徴、目的、及び利点は、説明及び図面、ならびに特許請求の範囲から明らかになるであろう。
前述及び他の目的、特徴、及び利点は、本発明の特定の実施形態の下記の説明から明らかになり、こうしたことは、添付の図面において例示され、こうした図面の中で同様の参照文字は異なる観点を通して同一の部分を指す。図面は、必ずしも寸法どおりではないが、代わりに、本発明のさまざまな実施形態の原理を例示することに重点が置かれている。
本開示の実施形態では、癌抗原をコードするポリヌクレオチドを含むRNA(例えば、mRNA)ワクチンが提供される。本明細書で提供される癌RNAワクチンを使用すると、DNAでのワクチン接種と関連するリスクの多くを伴うことなく、細胞性免疫及び/または体液性免疫を含むバランスのとれた免疫応答を誘導することができる。いくつかの実施形態では、ワクチンは、癌抗原をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも1つのRNA(例えば、mRNA)ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、癌抗原をコードする少なくとも1つのオープンリーディングフレームと、ユニバーサルタイプIIのT細胞エピトープをコードする少なくとも1つのオープンリーディングフレームと、を有する、少なくとも1つのRNA(例えば、mRNA)ポリヌクレオチドを含む。別の実施形態では、ワクチンは、癌抗原をコードする少なくとも1つのオープンリーディングフレームと、免疫増強剤(例えば、アジュバント)をコードする少なくとも1つのオープンリーディングフレームと、を有する、少なくとも1つのRNA(例えば、mRNA)ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、癌抗原(例えば、活性化癌遺伝子変異ペプチド)をコードするオープンリーディングフレームを有する、少なくとも1つのRNA(例えば、mRNA)ポリヌクレオチドを含む。
mRNA癌ワクチンを含む機能性RNAワクチンを生成するための試みがいくつもなされてきたが、こうしたRNAワクチンの治療効果は、依然として完全には確立されていない。非常に驚くべきことに、T細胞応答の増進を含む、顕著に増進しており、多くの点で相乗的な免疫応答を引き起こす、mRNAワクチンを送達するための製剤クラスを発明者らは発見した。本発明のワクチンには、従来型癌ワクチンならびに個別化癌ワクチンが含まれる。いくつかの態様では、本発明は、化学的に修飾及び非修飾のmRNAワクチンを含むmRNAワクチンの有効性を脂質ナノ粒子製剤が顕著に増進するという驚くべき知見を含む。
本明細書に記載の試験において使用した脂質ナノ粒子は、さまざまな動物モデルならびにヒトにおけるsiRNAの送達に以前に使用されたものである。脂質ナノ粒子製剤によるsiRNAの送達と関連して得られた知見を考慮すると、リポソームとは対照的に、脂質ナノ粒子が癌ワクチンにおいて有用であるという事実は非常に驚くべきものである。脂質ナノ粒子において製剤化されたsiRNAの治療的な送達では、一過性のIgM応答と関連する望ましくない炎症応答が生じる結果として、典型的には、抗原産生が減少し、免疫応答が損なわれることが観測されている。siRNAで観測された知見とは対照的に、本明細書に記載の脂質ナノ粒子-mRNA癌ワクチン製剤では、一過性のIgM応答ではなく、予防方法及び治療方法に十分となるIgGレベルの増進が生じることが示されている。本発明の脂質ナノ粒子は、リポソームではない。本明細書で使用されるリポソームは、脂質二重層または単層シェルを有し、コア内に核酸ペイロードを含む、脂質ベースの構造である。
ワクチン開発において標的ポリペプチド配列に対する所望の免疫応答(例えば、T細胞応答)を誘発する癌抗原の生成は、依然として難易度の高い課題である。本発明は、そのようなワクチン開発と関連するハードルを克服する技術を含むものである。本発明の技術を使用することで、適切なT細胞癌エピトープまたはB細胞癌エピトープを選択し、インビボでの有効な送達に向けてエピトープまたは抗原を製剤化することによって、所望の免疫応答を整えて導くことが可能である。追加的または代替的に、免疫応答は、適切なT細胞及び/またはB細胞癌エピトープまたは抗原に加えて送達される、1つまたは複数のユニバーサルタイプIIのT細胞エピトープを選択することによって、さらに増強することができる。
追加的または代替的に、mRNAワクチンは、活性化癌遺伝子変異ペプチド(例えば、KRAS変異ペプチド)を含み得る。以前の研究では、発癌性変異に特異的なT細胞を生産する能力には制限があることが示された。この研究のほとんどは、最も一般的なHLA対立遺伝子の環境(白色人種の約50%で生じるA2)で実施された。より最近の研究では、あまり一般的でないHLA対立遺伝子の環境(A11,C8)で、点変異に特異的なT細胞の生成が探究されている。これらの所見は、癌の治療に関して、重要な意味を有している。発癌性変異が多くの癌で認められている。これらの変異を標的にし、腫瘍を殺傷するのに十分なT細胞を生成する能力は、癌治療に広く適用することができる。ペプチドワクチンの送達に比べて、mRNAを使用した抗原の送達がこのような大きな利点を有することは、極めて驚くべきことである。したがって、本発明は、いくつかの態様では、mRNAの形態でインビボで送達される活性化発癌性変異抗原が、癌治療の有効性を顕著に増進するという驚くべき知見を含む。
HLAクラスI分子は、2つのポリペプチド鎖(重鎖及び軽鎖)から構成される、高度に多型の膜貫通糖タンパク質である。ヒト白血球型抗原であるヒト主要組織適合遺伝子複合体は、各個体に特異的であり、遺伝的特徴を有する。クラスIの重鎖は、3つの遺伝子:HLA-A、HLA-B及びHLA-Cによってコードされている。HLAクラスI分子は、内因性抗原をTリンパ球に提示することによって、免疫応答を確立するのに重要であり、それにより、細胞傷害性T細胞による腫瘍細胞の排除につながる一連の免疫応答が開始する。HLAクラスI抗原の産生レベルの変化は、悪性腫瘍で広く見られる現象であり、抗腫瘍T細胞機能の著しい抑制を伴う。これは、癌細胞が免疫監視機構を回避するために使用する主な機序の1つである。HLAクラスI抗原レベルの下方制御がNSCLC腫瘍の90%で検出された(n=65)。HLAの減少または喪失が膵臓腫瘍試料の76%で検出された(n=19)。結腸癌におけるHLAクラスI抗原の発現は、腫瘍試料(n=25)の96%で劇的に低下するか、または検出不可能であった。
多くの証拠は、腫瘍細胞が免疫監視機構を回避するために、免疫選択(免疫原性の低い腫瘍細胞バリアント)及び免疫破壊(免疫系の破壊)という2つの一般的な戦略を利用していることを示唆している。HLAクラスI抗原の変化と12のKRASコドン変異の存在との間には相関関係が示されており、これは、12のKRASコドン変異が癌進行におけるHLAクラスI抗原制御に対する誘導的作用を持つ可能性を示唆している。高頻度の癌変異は、高親和性(IC50≦50nM)7でHLAクラスI対立遺伝子に結合することが予測されており、予防用癌ワクチンに好適であり得る。
治療用mRNAは、単独で、または腫瘍に対する免疫応答を顕著に高めるチェックポイント阻害剤などの他の癌治療剤と組み合わせて送達することができる。チェックポイント阻害剤は、免疫応答の促進に対する障害のいくつかを排除することによって、活性化発癌性ペプチドをコードするmRNAの作用を高め、それにより、活性化T細胞が腫瘍に対する免疫応答を効率的に促進できるようになる。
本明細書に記載のmRNAワクチンは、現在のワクチンと比較していくつかの点で優れていることが発見された。第1に、脂質ナノ粒子(LNP)による送達は、文献に記載のリポソームまたはプロタミンに基づく手法を含む他の製剤より優れている。LNPを使用すると、化学的に修飾または非修飾のmRNAワクチンを効率的に送達することが可能になる。修飾及び非修飾のLNP製剤化mRNAワクチンは両方共、通常のワクチンより顕著に優れている。いくつかの実施形態では、本発明のmRNAワクチンは、通常のワクチンと比較して、少なくとも10倍、少なくとも20倍、少なくとも40倍、少なくとも50倍、少なくとも100倍、少なくとも500倍、または少なくとも1,000倍優れている。
mRNAワクチン及び自己複製RNAワクチンを含む機能性RNAワクチンを生成するための試みがいくつもなされてきたが、こうしたRNAワクチンの治療効果は、依然として完全には確立されていない。非常に驚くべきことに、抗原産生の増進及び中和能力を有する機能性抗体の産生を含む、顕著に増進しており、多くの点で相乗的な免疫応答を引き起こす、インビボでmRNAワクチンを送達するための製剤クラスを、本発明の態様に従って発明者らは発見した。こうした結果は、脂質に基づく他のクラスの製剤において使用されるmRNA用量と比較して顕著に低い用量のmRNAが投与されるときでさえ達成することができる。本発明の製剤は、予防剤及び治療剤としての機能性mRNAワクチンの効果を確立するために十分な、顕著な免疫応答をインビボで予想外に引き起こすことが示された。さらに、自己複製RNAワクチンでは、細胞に十分なRNAを送達するためにウイルスの複製経路を利用することで免疫応答が生成する。本発明の製剤では、ウイルス複製を必要とすることなく、強力な免疫応答の誘発に十分なタンパク質が産生する。したがって、本発明のmRNAは、自己複製RNAではなく、ウイルス複製に必要な要素を含まない。
いくつかの態様では、本発明は、脂質ナノ粒子(LNP)製剤が、化学的に修飾及び非修飾のmRNAワクチンを含むmRNAワクチンの有効性を顕著に増進するという驚くべき知見を含む。さらに、エピトープに対する免疫原性は、構築物内に含まれるエピトープの総数に関係なく、類似することがわかった。52マー構築物に含まれるエピトープは、エピトープ特異的IFNγ応答によって測定したとき、20マー構築物と比較して、同様の免疫原性を有する。mRNAの長さを増やすことが、エピトープの免疫原性に対して有害な影響がないと示されたことは、全く予想外であった。20マー及び52マー(SIINFEKL、配列番号231)にコードされた最後のエピトープが同等のものであったことから、これは、コンカテマーの完全な読み通しも示している。また、驚くべきことに、クラスIエピトープに対する抗原特異的応答は、ワクチンが構造的に活性な免疫増強剤とともに処方された場合、増大することがわかった。
本明細書に記載の試験において使用したLNPは、さまざまな動物モデルならびにヒトにおけるsiRNAの送達に以前に使用されたものである。LNP製剤によるsiRNAの送達と関連して得られた知見を考慮すると、LNPがワクチンにおいて有用であるという事実は非常に驚くべきものである。LNPにおいて製剤化されたsiRNAの治療的な送達では、一過性のIgM応答と関連する望ましくない炎症応答が生じる結果として、典型的には、抗原産生が減少し、免疫応答が損なわれることが観測されている。siRNAで観測された知見とは対照的に、本発明のLNP-mRNA製剤では、一過性のIgM応答ではなく、予防方法及び治療方法に十分となるIgGレベルの増進が生じることが本明細書に示されている。
mRNA癌ワクチンは、ペプチドに基づくワクチンまたはDNAワクチンの代わりとなる特有の治療選択肢を与えるものである。mRNA癌ワクチンが細胞に送達されると、mRNAは、細胞内機構によって処理されることでポリペプチドを生成し、この細胞内機構による処理を受けることで、生成したポリペプチドは腫瘍に対する免疫応答を刺激する能力を有する免疫感受性断片となることができる。
いくつかの実施形態では、mRNA癌ワクチンは、限定するものではないが、従来型癌ワクチンを含む、抗癌治療剤とともに投与され得る。mRNA癌ワクチン及び抗癌治療剤は、免疫治療応答をさらに増進するために組み合わせることができる。mRNA癌ワクチン及び他の治療剤は、同時または連続的に投与してよい。他の治療剤が同時に投与されるとき、それを同一の製剤または別々の製剤において投与することができるが、投与は同時に実施される。他の治療剤及びmRNA癌ワクチンの投与が時間的に別々であるとき、他の治療剤は、互いに連続的に投与され、かつmRNA癌ワクチンと連続的に投与される。こうした化合物の投与の時間間隔は、数分程度であり得るか、または例えば、数時間、数日、数週間、数ヶ月などの、より長い時間であり得る。他の治療剤には、限定はされないが、抗癌治療剤、アジュバント、サイトカイン、抗体、抗原などが含まれる。
本明細書に記載の癌ワクチンは、少なくとも1つの癌抗原ポリペプチドまたはその免疫原性断片(例えば、癌に対する免疫応答を誘導する能力を有する免疫原性断片)をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも1つのリボ核酸(RNA)ポリヌクレオチドを含む。抗原ペプチドは、個別化癌抗原エピトープ、及び/または再発性抗原であり得る。いくつかの好ましい実施形態では、ワクチンは、上記のそれぞれの組み合わせの複数のエピトープである。したがって、癌ワクチンは、従来型癌ワクチンもしくは個別化癌ワクチンまたはそれらの混合物であり得る。従来型癌ワクチンは、癌もしくは腫瘍に一般に見られることが知られる癌抗原、または特定の型の癌もしくは腫瘍において見られることが知られる癌抗原を含むワクチンである。腫瘍細胞においてまたは腫瘍細胞によって発現する抗原は、「腫瘍関連抗原」と称される。特定の腫瘍関連抗原は、非癌性細胞に発現し得るか、または発現し得ないこともある。多くの腫瘍変異が当該技術分野において知られている。
驚くべきことに、RNAベースのマルチエピトープ癌ワクチンが、個々のエピトープまたはコンカテマーとして製剤化されるかどうかに関係なく、MHCクラスIエピトープとMHCクラスIIエピトープの慎重なバランスにより、最適な免疫刺激をもたらすことができることが発見された。両方の構成成分をコードするRNAワクチンは、免疫原性が高い。
個別化ワクチンは、例えば、腫瘍に特異的な1つもしくは複数の既知の癌抗原または各対象に特異的な癌抗原をコードするRNAを含み得、こうした抗原は、ネオエピトープまたは対象特異的エピトープもしくは対象特異的抗原と称される(個別化抗原と称される)。「対象特異的癌抗原」は、特定の患者の腫瘍に発現することが同定された抗原である。対象特異的癌抗原は、典型的には、腫瘍試料に存在し得たり、または存在し得なかったりすることが一般的である。非癌性細胞では発現しないか、もしくはめったに発現しないか、または非癌性細胞におけるその発現が、癌性細胞におけるものと比較して顕著に減少しており、ワクチン接種時に誘導される免疫応答を誘導する腫瘍関連抗原は、ネオエピトープと称される。腫瘍関連抗原のようなネオエピトープは、体に対して完全に外来性であるため、健康な組織に対する免疫応答を生成しないか、または免疫系の防御成分によって遮蔽されると想定される。いくつかの実施形態では、ネオエピトープに基づく個別化ワクチンが望ましく、この理由は、そのようなワクチン製剤によって、患者特異的な腫瘍に対する特異性が最大化することになるためである。変異によって得られるネオエピトープは、タンパク質に異なるアミノ酸が生じる非同義変異である点変異、終止コドンが修飾または欠失し、C末端に新規の腫瘍特異的配列を有する長鎖化タンパク質の翻訳を引き起こすリードスルー変異、成熟mRNAにイントロンが含められるために、特有の腫瘍特異的タンパク質配列が生じるスプライス部位変異、2つのタンパク質のジャンクションに腫瘍特異的配列を有するキメラタンパク質が生じる染色体再編(すなわち、遺伝子融合)、新規の腫瘍特異的タンパク質配列を有する新たなオープンリーディングフレームが生じるフレームシフト変異または欠失、及び転座から生じ得る。したがって、いくつかの実施形態では、mRNA癌ワクチンは、フレームシフト変異及び組換えまたは本明細書に記載の他の変異のいずれかからなる群から選択される変異を含む少なくとも2つの癌抗原を含む。
個別化癌ワクチンの生成方法は、一般に、例えば核酸またはタンパク質のディープシークエンシング技術を使用する変異の同定と、例えば有効なペプチド-MHC結合予測アルゴリズム、または患者のHLA対立遺伝子に結合し得、腫瘍に存在する変異に基づく候補T細胞エピトープのセットを生成するための他の分析技術を適用するネオエピトープの同定と、選択されるネオエピトープを抗原特異的T細胞が標的とすることの任意選択の実証または候補ネオエピトープが腫瘍表面に存在するHLAタンパク質に結合することの任意選択の実証と、ワクチンの開発と、を含む。本発明のmRNA癌ワクチンは、単一のネオエピトープの複数のコピー、単一の型の変異、すなわち点変異に基づく複数の異なるネオエピトープ、さまざまな変異型に基づく複数の異なるネオエピトープ、腫瘍関連抗原またはリコール抗原などのネオエピトープ及び他の抗原を含み得る。
変異の同定技術の例には、限定はされないが、動的対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション(DASH)、マイクロプレートアレイダイアゴナルゲル電気泳動(microplate array diagonal gel electrophoresis)(MADGE)、パイロシークエンシング、オリゴヌクレオチド特異的ライゲーション、TaqManシステム、ならびにさまざまなDNA「チップ」技術、すなわちAffymetrix SNPチップ、ならびに浸潤性の切断によって小型シグナル分子を生成させた後、質量分析法、または固定化パドロックプローブ及びローリングサークル増幅を実施することに基づく方法が含まれる。
核酸またはタンパク質のディープシークエンシング技術は、当該技術分野において知られている。任意の型の配列解析方法を使用することができる。核酸シークエンシングは、全腫瘍ゲノム、腫瘍エクソーム(タンパク質コードDNA)、腫瘍トランスクリプトーム、またはエキソソームに対して実施してよい。合成ごとのリアルタイム1分子シークエンシング技術は、シークエンシングされる鋳型に相補的なDNA新生鎖に蛍光ヌクレオチドが組み込まれるたびにそれが検出されるということを利用するものである。迅速なハイスループットシークエンシング方法は他にも存在する。タンパク質シークエンシングは、腫瘍プロテオームに対して実施してよい。さらに、腫瘍細胞に存在するMHCタンパク質に結合した変異ペプチドが存在することを同定または検証をするために、タンパク質質量分析法を使用してよい。ペプチドは、腫瘍細胞から酸によって溶出させるか、または腫瘍から免疫沈降させたHLA分子から酸によって溶出させた後、質量分析法を使用して同定することができる。シークエンシングの結果は、既知の対照セットと比較するか、または患者の正常組織に対して実施されたシークエンシング解析と比較してよい。
したがって、本発明は、抗原のネオエピトープの同定方法及び/または検出方法に関する。具体的には、本発明は、対象における腫瘍特異的免疫応答の誘導において有用な腫瘍特異的ネオエピトープの同定方法及び/または検出方法を提供する。任意選択で、こうしたネオエピトープのいくつかは、野生型ペプチドと比較してクラスIのHLAタンパク質に強い親和性で結合し、及び/または抗腫瘍CD8 T細胞を活性化する能力を有する。他の物は、クラスIIに結合し、CD4+Tヘルパー細胞を活性化する。ワクチンにおいてクラスI抗原が果たす重要な役割は認識されているが、クラスI抗原とクラスII抗原のバランスから構成されるワクチンが、クラスIまたはクラスIIのみに基づくワクチンよりも強力な免疫応答を実際にもたらすことが本発明で発見された。
MHCクラスIタンパク質は、ほとんどの腫瘍細胞を含む、体のほとんどすべての細胞の表面に存在する。内在性タンパク質または細胞内に存在する病原体に通常は起源を有する抗原は、MHCクラスIタンパク質に負荷され、その後、こうした抗原は、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)に提示される。T細胞受容体は、MHCクラスI分子と複合化したペプチドを認識してそれに結合する能力を有する。細胞傷害性Tリンパ球はそれぞれ、MHC/ペプチド複合体に特異的に結合する能力を有する特有のT細胞受容体を発現する。
コンピューターアルゴリズムを使用すると、潜在的なネオエピトープを予測することが可能であり、こうしたネオエピトープは、すなわち、ペプチド提示複合体の形態のクラスIまたはクラスIIのMHC分子が結合した後、この形態においてTリンパ球のT細胞受容体によって認識されるペプチド配列である。MHCに結合することになるペプチドの同定に有用なプログラムの例には、例えば、Lonza Epibase、SYFPEITHI(Rammensee et al.,Immunogenetics,50(1999),213-219)、及びHLA_BIND(Parker et al.,J.Immunol.,152(1994),163-175)が含まれる。
推定ネオエピトープが選択されると、インビトロ及び/またはインビトロのアッセイを使用してそれをさらに試験することができる。それぞれの患者からの単離物を用いて、Elispotアッセイなどの、研究室において実施される通常のインビトロアッセイを使用することで、アルゴリズムによる予測に基づいて選択されたネオエピトープのリストを洗練してよい。
本発明のmRNA癌ワクチンは、医薬組成物を含む組成物である。本発明は、mRNA癌ワクチンの選択方法、設計方法、調製方法、製造方法、製剤化方法、及び/または使用方法も包含する。本明細書に記載のmRNA癌ワクチンの選択、設計、及び/または利用を目的とするシステム、プロセス、機器、及びキットも提供される。
本発明のmRNAワクチンは、1つまたは複数の癌抗原を含み得る。いくつかの実施形態では、mRNAワクチンは、45以上、46以上、47以上、48以上、49以上、50以上、51以上、52以上、53以上、54以上、または55以上の抗原から構成される。他の実施形態では、mRNAワクチンは、3以上、4以上、5以上、6以上、7以上、8以上、または9以上の抗原から構成される。他の実施形態では、mRNAワクチンは、1000以下、900以下、500以下、100以下、75以下、50以下、40以下、30以下、20以下、または100以下の癌抗原から構成される。さらに他の実施形態では、mRNAワクチンは、3~100、5~100、10~100、15~100、20~100、25~100、30~100、35~100、40~100、45~100、50~100、55~100、60~100、65~100、70~100、75~100、80~100、90~100、5~50、10~50、15~50、20~50、25~50、30~50、35~50、40~50、45~50、100~150、100~200、100~300、100~400、100~500、50~500、50~800、50~1,000、または100~1,000の癌抗原を有する。
いくつかの実施形態では、mRNA癌ワクチン及びワクチン接種方法は、特定の変異に基づくエピトープまたは抗原(ネオエピトープ)及び癌-生殖系列遺伝子が発現するもの(複数の患者に見られる腫瘍に共通する抗原)を含む。
本明細書で使用されるエピトープは、抗原決定基としても知られ、適切な状況では免疫系によって認識される抗原の一部分であり、具体的には、抗体、B細胞、またはT細胞によって認識される抗原の一部分である。エピトープには、B細胞エピトープ及びT細胞エピトープが含まれる。B細胞エピトープは、特定の抗体産生B細胞による認識に必要なペプチド配列である。B細胞エピトープは、抗体によって認識される抗原の特定領域を指す。エピトープに結合する抗体の一部分は、パラトープと呼ばれる。エピトープは、構造及びパラトープとの相互作用に基づく立体構造エピトープまたは直線状エピトープであり得る。直線状または連続的なエピトープは、タンパク質の特定領域の一次アミノ酸配列によって定義される。抗体と相互作用する配列は、連続的に互いに隣り合ってタンパク質に位置しており、エピトープは、通常、単一のペプチドによって模倣することができる。立体構造エピトープは、天然のタンパク質の立体構造によって定義されるエピトープである。こうしたエピトープは、連続的または非連続的であり得、すなわち、エピトープの構成要素は、タンパク質の異なる部分に位置し得、こうした異なる部分は、折り畳まれた天然のタンパク質構造において互いに近接化している。
T細胞エピトープは、APCに存在するタンパク質と会合し、特定のT細胞による認識に必要なペプチド配列である。T細胞エピトープは、細胞内でプロセシングを受けてからAPCの表面に提示され、APC表面で、MHCクラスII及びMHCクラスIを含むMHC分子に結合する。ペプチドエピトープは、エピトープとして適切な任意の長さであり得る。いくつかの実施形態では、ペプチドエピトープは、9~30のアミノ酸である。他の実施形態では、長さは、9~22、9~29、9~28、9~27、9~26、9~25、9~24、9~23、9~21、9~20、9~19、9~18、10~22、10~21、10~20、11~22、22~21、11~20、12~22、12~21、12~20、13~22、13~21、13~20、14~19、15~18、または16~17のアミノ酸である。
いくつかの実施形態では、ペプチドエピトープは、少なくとも1つのMHCクラスIエピトープ、及び少なくとも1つのMHCクラスIIエピトープを含む。いくつかの実施形態では、エピトープの少なくとも10%は、MHCクラスIエピトープである。いくつかの実施形態では、エピトープの少なくとも20%は、MHCクラスIエピトープである。いくつかの実施形態では、エピトープの少なくとも30%は、MHCクラスIエピトープである。いくつかの実施形態では、エピトープの少なくとも40%は、MHCクラスIエピトープである。いくつかの実施形態では、エピトープの少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、または少なくとも100%は、MHCクラスIエピトープである。いくつかの実施形態では、エピトープの少なくとも10%は、MHCクラスIIエピトープである。いくつかの実施形態では、エピトープの少なくとも20%は、MHCクラスIIエピトープである。いくつかの実施形態では、エピトープの少なくとも30%は、MHCクラスIIエピトープである。いくつかの実施形態では、エピトープの少なくとも40%は、MHCクラスIIエピトープである。いくつかの実施形態では、エピトープの少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、または少なくとも100%は、MHCクラスIIエピトープである。いくつかの実施形態では、MHCクラスIエピトープとMHCクラスIIエピトープとの比率は、約10%:約90%、約20%:約80%、約30%:約70%、約40%:約60%、約50%:約50%、約60%:約40%、約70%:約30%、約80%:約20%、約90%:約10%のMHCクラス1エピトープ:MHCクラスIIエピトープから選択される比率である。1つの実施形態では、MHCクラスIエピトープ:MHCクラスIIエピトープの比率は、3:1である。いくつかの実施形態では、MHCクラスIIエピトープとMHCクラスIエピトープとの比率は、約10%:約90%、約20%:約80%、約30%:約70%、約40%:約60%、約50%:約50%、約60%:約40%、約70%:約30%、約80%:約20%、約90%:約10%のMHCクラスIIエピトープ:MHCクラスIエピトープから選択される比率である。1つの実施形態では、MHCクラスIIエピトープ:MHCクラスIエピトープの比率は、1:3である。いくつかの実施形態では、癌ワクチンのペプチドエピトープのうちの少なくとも1つは、B細胞エピトープである。いくつかの実施形態では、癌ワクチンのT細胞エピトープは、8~11のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、癌ワクチンのB細胞エピトープは、13~17のアミノ酸を含む。
他の態様では、本発明の癌ワクチンは、1つまたは複数のユニバーサルタイプIIのT細胞エピトープが散在して配置された、複数のペプチドエピトープ抗原をコードするmRNAワクチンを含む。ユニバーサルタイプIIのT細胞エピトープには、ILMQYIKANSKFIGI(テタヌス毒素;配列番号226)、FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE(テタヌス毒素;配列番号227)、QYIKANSKFIGITE(テタヌス毒素;配列番号228)QSIALSSLMVAQAIP(ジフテリア毒素;配列番号229)、及びAKFVAAWTLKAAA(汎DRエピトープ(PADRE);配列番号230)が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、mRNAワクチンは、同じユニバーサルタイプIIのT細胞エピトープを含む。他の実施形態では、mRNAワクチンは、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、または20の異なるユニバーサルタイプIIのT細胞エピトープを含む。いくつかの実施形態では、1つまたは複数のユニバーサルタイプIIのT細胞エピトープ(複数可)は、すべての癌抗原の間に散在している。他の実施形態では、1つまたは複数のユニバーサルタイプIIのT細胞エピトープ(複数可)は、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、24、26、28、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、または100癌抗原ごとに散在している。
いくつかの態様では、本発明の癌ワクチンは、エピトープの間に単一のヌクレオチドスペーサーを挟んで配置されるか、またはエピトープの間にスペーサーを挟まずに互いに直接配置される複数のペプチドエピトープ抗原をコードするmRNAワクチンを含む。複数のエピトープ抗原には、MHCクラスIエピトープとMHCクラスIIエピトープとの混合物が含まれる。例えば、複数のペプチドエピトープ抗原は、次の構造:
(X-G-X)1-10(G-Y-G-Y)1-10(G-X-G-X)0-10(G-Y-G-Y)0-10、(X-G)1-10(G-Y)1-10(G-X)0-10(G-Y)0-10、(X-G-X-G-X)1-10(G-Y-G-Y)1-10(X-G-X)0-10(G-Y-G-Y)0-10、(X-G-X)1-10(G-Y-G-Y-G-Y)1-10(X-G-X)0-10(G-Y-G-Y)0-10、(X-G-X-G-X-G-X)1-10(G-Y-G-Y)1-10(X-G-X)0-10(G-Y-G-Y)0-10、(X-G-X)1-10(G-Y-G-Y-G-Y-G-Y)1-10(X-G-X)0-10(G-Y-G-Y)0-10、(X)1-10(Y)1-10(X)0-10(Y)0-10、(Y)1-10(X)1-10(Y)0-10(X)0-10、(XX)1-10(Y)1-10(X)0-10(Y)0-10、(YY)1-10(XX)1-10(Y)0-10(X)0-10、(X)1-10(YY)1-10(X)0-10(Y)0-10、(XXX)1-10(YYY)1-10(XX)0-10(YY)0-10、(YYY)1-10(XXX)1-10(YY)0-10(XX)0-10、(XY)1-10(Y)1-10(X)1-10(Y)1-10、(YX)1-10(Y)1-10(X)1-10(Y)1-10、(YX)1-10(X)1-10(Y)1-10(Y)1-10、(Y-G-Y)1-10(G-X-G-X)1-10(G-Y-G-Y)0-10(G-X-G-X)0-10、(Y-G)1-10(G-X)1-10(G-Y)0-10(G-X)0-10、(Y-G-Y-G-Y)1-10(G-X-G-X)1-10(Y-G-Y)0-10(G-X-G-X)0-10、(Y-G-Y)1-10(G-X-G-X-G-X)1-10(Y-G-Y)0-10(G-X-G-X)0-10、(Y-G-Y-G-Y-G-Y)1-10(G-X-G-X)1-10(Y-G-Y)0-10(G-X-G-X)0-10、(Y-G-Y)1-10(G-X-G-X-G-X-G-X)1-10(Y-G-Y)0-10(G-X-G-X)0-10、(XY)1-10(YX)1-10(XY)0-10(YX)0-10、(YX)1-10(XY)1-10(Y)0-10(X)0-10、(YY)1-10(X)1-10(Y)0-10(X)0-10、(XY)1-10(XY)1-10(X)0-10(X)0-10、(Y)1-10(YX)1-10(X)0-10(Y)0-10、(XYX)1-10(YXX)1-10(YX)0-10(YY)0-10、または(YYX)1-10(XXY)1-10(YX)0-10(XY)0-10
(Xは、10~40のアミノ酸長のMHCクラスIエピトープであり、Yは、10~40のアミノ酸長のMHCクラスIIエピトープであり、Gは、グリシンである)を有するポリペプチドであり得る。
(X-G-X)1-10(G-Y-G-Y)1-10(G-X-G-X)0-10(G-Y-G-Y)0-10、(X-G)1-10(G-Y)1-10(G-X)0-10(G-Y)0-10、(X-G-X-G-X)1-10(G-Y-G-Y)1-10(X-G-X)0-10(G-Y-G-Y)0-10、(X-G-X)1-10(G-Y-G-Y-G-Y)1-10(X-G-X)0-10(G-Y-G-Y)0-10、(X-G-X-G-X-G-X)1-10(G-Y-G-Y)1-10(X-G-X)0-10(G-Y-G-Y)0-10、(X-G-X)1-10(G-Y-G-Y-G-Y-G-Y)1-10(X-G-X)0-10(G-Y-G-Y)0-10、(X)1-10(Y)1-10(X)0-10(Y)0-10、(Y)1-10(X)1-10(Y)0-10(X)0-10、(XX)1-10(Y)1-10(X)0-10(Y)0-10、(YY)1-10(XX)1-10(Y)0-10(X)0-10、(X)1-10(YY)1-10(X)0-10(Y)0-10、(XXX)1-10(YYY)1-10(XX)0-10(YY)0-10、(YYY)1-10(XXX)1-10(YY)0-10(XX)0-10、(XY)1-10(Y)1-10(X)1-10(Y)1-10、(YX)1-10(Y)1-10(X)1-10(Y)1-10、(YX)1-10(X)1-10(Y)1-10(Y)1-10、(Y-G-Y)1-10(G-X-G-X)1-10(G-Y-G-Y)0-10(G-X-G-X)0-10、(Y-G)1-10(G-X)1-10(G-Y)0-10(G-X)0-10、(Y-G-Y-G-Y)1-10(G-X-G-X)1-10(Y-G-Y)0-10(G-X-G-X)0-10、(Y-G-Y)1-10(G-X-G-X-G-X)1-10(Y-G-Y)0-10(G-X-G-X)0-10、(Y-G-Y-G-Y-G-Y)1-10(G-X-G-X)1-10(Y-G-Y)0-10(G-X-G-X)0-10、(Y-G-Y)1-10(G-X-G-X-G-X-G-X)1-10(Y-G-Y)0-10(G-X-G-X)0-10、(XY)1-10(YX)1-10(XY)0-10(YX)0-10、(YX)1-10(XY)1-10(Y)0-10(X)0-10、(YY)1-10(X)1-10(Y)0-10(X)0-10、(XY)1-10(XY)1-10(X)0-10(X)0-10、(Y)1-10(YX)1-10(X)0-10(Y)0-10、(XYX)1-10(YXX)1-10(YX)0-10(YY)0-10、または(YYX)1-10(XXY)1-10(YX)0-10(XY)0-10
(Xは、10~40のアミノ酸長のMHCクラスIエピトープであり、Yは、10~40のアミノ酸長のMHCクラスIIエピトープであり、Gは、グリシンである)を有するポリペプチドであり得る。
本発明の癌ワクチンは、いくつかの態様では、中央に位置する一塩基多型(SNP)変異が配置され、SNP変異の両側には隣接アミノ酸が存在する、複数のペプチドエピトープ抗原をコードするmRNAワクチンを含む。いくつかの実施形態では、中央に位置するSNP変異の両側の隣接アミノ酸の数は、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、24、26、28、または30である。1つの実施形態では、癌ワクチンのエピトープは、各配列が7アミノ酸を含む2つのクラスI配列に挟まれたSNPを含む。別の実施形態では、癌ワクチンのエピトープは、各配列が10アミノ酸を含む2つのクラスII配列に挟まれたSNPを含む。いくつかの実施形態では、エピトープは、中央に位置するSNPと、クラスI配列の両方、クラスII配列の両方、または1つのクラスI及び1つのクラスII配列である隣接配列と、を含み得る。
免疫増強剤mRNA
本開示の1つの態様は、目的の癌抗原のうちの1つまたは複数に対する免疫応答を刺激または増進させるポリペプチドをコードするmRNAに関する。目的の癌抗原(複数可)に対する免疫応答を増進するそのようなmRNAは、本明細書で、免疫増強剤mRNA構築物または免疫増強剤mRNAと称され、化学的に修飾されたmRNA(mmRNA)を含む。本開示の免疫増強剤は、対象において、目的の抗原に対する免疫応答を増進する。増進される免疫応答は、細胞性応答、体液性応答またはその両方であってよい。本明細書で使用されるとき、「細胞性」免疫応答は、T細胞が関与または媒介する免疫応答を包含することが意図され、一方、「体液性」免疫応答は、B細胞が関与または媒介する免疫応答を包含することが意図される。免疫増強剤は、例えば、
(i)I型インターフェロン経路のシグナル伝達を刺激すること、
(ii)NFkB経路のシグナル伝達を刺激すること、
(iii)炎症反応を刺激すること、
(iv)サイトカイン産生を刺激すること、または
(v)樹状細胞の発生、活性もしくは動員を刺激すること、及び
(vi)(i)~(vi)のいずれかの組み合わせによって、免疫応答を増強し得る。
本開示の1つの態様は、目的の癌抗原のうちの1つまたは複数に対する免疫応答を刺激または増進させるポリペプチドをコードするmRNAに関する。目的の癌抗原(複数可)に対する免疫応答を増進するそのようなmRNAは、本明細書で、免疫増強剤mRNA構築物または免疫増強剤mRNAと称され、化学的に修飾されたmRNA(mmRNA)を含む。本開示の免疫増強剤は、対象において、目的の抗原に対する免疫応答を増進する。増進される免疫応答は、細胞性応答、体液性応答またはその両方であってよい。本明細書で使用されるとき、「細胞性」免疫応答は、T細胞が関与または媒介する免疫応答を包含することが意図され、一方、「体液性」免疫応答は、B細胞が関与または媒介する免疫応答を包含することが意図される。免疫増強剤は、例えば、
(i)I型インターフェロン経路のシグナル伝達を刺激すること、
(ii)NFkB経路のシグナル伝達を刺激すること、
(iii)炎症反応を刺激すること、
(iv)サイトカイン産生を刺激すること、または
(v)樹状細胞の発生、活性もしくは動員を刺激すること、及び
(vi)(i)~(vi)のいずれかの組み合わせによって、免疫応答を増強し得る。
本明細書で使用されるとき、「I型インターフェロン経路のシグナル伝達を刺激すること」とは、I型インターフェロンシグナル伝達経路の1つもしくは複数の構成成分を活性化すること(例えば、そのような構成成分のリン酸化、二量体化などを変更することによって経路を活性化すること)、インターフェロン感受性応答要素(ISRE)からの転写を刺激すること及び/またはI型インターフェロン(例えば、IFN-α、IFN-β、IFN-ε、IFN-κ及び/またはIFN-ω)の産生もしくは分泌を刺激することを包含することが意図される。本明細書で使用されるとき、「NFkB経路のシグナル伝達を刺激すること」とは、NFkBシグナル伝達経路の1つもしくは複数の構成成分を活性化すること(例えば、そのような構成成分のリン酸化、二量体化などを変更することによって経路を活性化すること)、NFkB部位からの転写を刺激すること及び/またはNFkBによって発現が制御されている遺伝子産物の産生を刺激することを包含することが意図される。本明細書で使用されるとき、「炎症反応を刺激すること」とは、炎症性サイトカイン(限定するものではないがI型インターフェロン、IL-6及び/またはTNFαを含む)の産生を刺激することを包含することが意図される。本明細書で使用されるとき、「樹状細胞の発生、活性もしくは動員を刺激すること」とは、樹状細胞の成熟、増殖及び/または機能活性を直接的または間接的に刺激することを包含することが意図される。
いくつかの態様では、本開示は、例えば、対象において、適応免疫を誘導すること(例えば、I型インターフェロン産生を刺激することによる)、炎症反応を刺激すること、NFkBシグナル伝達を刺激すること及び/または樹状細胞(DC)の発生、活性もしくは動員を刺激することによって、免疫応答を刺激または増進させることを、それを必要とする対象において行う(例えば、対象の免疫応答を増強する)ポリペプチドをコードするmRNAを提供する。いくつかの態様では、免疫増強剤mRNAの投与を、それを必要とする対象において行うと、対象の細胞性免疫(例えば、T細胞媒介性免疫)、体液性免疫(例えば、B細胞媒介性免疫)または細胞性免疫と体液性免疫の両方が増進する。いくつかの態様では、免疫増強剤mRNAの投与は、サイトカイン産生(例えば、炎症性サイトカイン産生)を刺激し、癌抗原特異的CD8+エフェクター細胞応答を刺激し、抗原特異的CD4+ヘルパー細胞応答を刺激し、エフェクターメモリーCD62LloT細胞集団を増加させ、B細胞活性を刺激し、または抗原特異的抗体産生を刺激する(前述の応答の組み合わせを含む)。いくつかの態様では、免疫増強剤mRNAの投与は、サイトカイン産生(例えば、炎症性サイトカイン産生)を刺激し、かつ抗原特異的CD8+エフェクター細胞応答を刺激する。いくつかの態様では、免疫増強剤mRNAの投与は、サイトカイン産生(例えば、炎症性サイトカイン産生)を刺激し、かつ抗原特異的CD4+ヘルパー細胞応答を刺激する。いくつかの態様では、免疫増強剤mRNAの投与は、サイトカイン産生(例えば、炎症性サイトカイン産生)を刺激し、かつエフェクターメモリーCD62LloT細胞集団を増加させる。いくつかの態様では、免疫増強剤mRNAの投与は、サイトカイン産生(例えば、炎症性サイトカイン産生)を刺激し、かつB細胞活性を刺激するか、抗原特異的抗体産生を刺激する。
1つの実施形態では、免疫増強剤は、癌抗原特異的CD8+エフェクター細胞応答(細胞性免疫)を増大させる。例えば、免疫増強剤は、限定するものではないが、CD8+T細胞の増殖及びCD8+T細胞のサイトカイン産生を含む、抗原特異的CD8+エフェクター細胞活性の1つまたは複数の指標を増加させることができる。例えば、1つの実施形態では、免疫増強剤は、抗原特異的CD8+T細胞によるIFN-γ、TNFα及び/またはIL-2の産生を増加させる。種々の実施形態では、免疫増強剤は、CD8+T細胞サイトカイン産生(例えば、IFN-γ、TNFα及び/またはIL-2産生)を、抗原に応答して、少なくとも5%または少なくとも10%または少なくとも15%または少なくとも20%または少なくとも25%または少なくとも30%または少なくとも35%または少なくとも40%または少なくとも45%または少なくとも50%増加させることができる(免疫増強剤がない状態でのCD8+T細胞サイトカイン産生と比較して)。例えば、治療対象から得られたT細胞を癌抗原を用いてインビトロで刺激することができ、CD8+T細胞サイトカイン産生をインビトロで評価することができる。CD8+T細胞サイトカイン産生は、当該技術分野において知られている標準的な方法によって決定することができ、これらには、限定するものではないが、サイトカイン産生の分泌量の測定(例えば、ELISAまたは当該技術分野において知られている上清中のサイトカインの量を決定するための他の好適な方法によるもの)及び/またはサイトカインに関する細胞内染色(ICS)が陽性であるCD8+T細胞のパーセンテージの決定が含まれる。例えば、IFN-γ、TNFα及び/またはIL-2の発現に関するCD8+T細胞の細胞内染色(ICS)は、当該技術分野において知られている方法によって実施することができる(例えば、実施例を参照のこと)。1つの実施形態では、免疫増強剤は、1つまたは複数のサイトカイン(例えば、IFN-γ、TNFα及び/またはIL-2)に関するICSが陽性であるCD8+T細胞のパーセンテージを、抗原に応答して、少なくとも5%または少なくとも10%または少なくとも15%または少なくとも20%または少なくとも25%または少なくとも30%または少なくとも35%または少なくとも40%または少なくとも45%または少なくとも50%増加させることができる(免疫増強剤がない状態でのサイトカイン(複数可)に関するICSが陽性であるCD8+T細胞のパーセンテージと比較して)。
さらに別の実施形態では、免疫増強剤は、免疫増強剤がない状態でのCD8+T細胞のパーセンテージと比較して、総T細胞集団(例えば、脾臓のT細胞及び/またはPBMC)中におけるCD8+T細胞のパーセンテージを増加させる。例えば、免疫増強剤は、免疫増強剤がない状態でのCD8+T細胞のパーセンテージと比較して、総T細胞集団中におけるCD8+T細胞のパーセンテージを、少なくとも5%または少なくとも10%または少なくとも15%または少なくとも20%または少なくとも25%または少なくとも30%または少なくとも35%または少なくとも40%または少なくとも45%または少なくとも50%増加させることができる。総T細胞集団中におけるCD8+T細胞の総パーセンテージは、当該技術分野において知られている標準的な方法によって決定することができ、これらには、限定するものではないが、蛍光標識細胞分取法(FACS)または磁気標識細胞分離法(MACS)が含まれる。
別の実施形態では、免疫増強剤は、免疫増強剤がない状態での腫瘍体積と比較して、免疫増強剤の存在下でのインビボにおける腫瘍体積の減少によって決定されるように、腫瘍特異的免疫細胞応答を増大させる。例えば、免疫増強剤は、腫瘍体積を、免疫増強剤がない状態での腫瘍体積と比較して、少なくとも5%または少なくとも10%または少なくとも15%または少なくとも20%または少なくとも25%または少なくとも30%または少なくとも35%または少なくとも40%または少なくとも45%または少なくとも50%減少させることができる。腫瘍体積の測定は、当該技術分野において十分に確立された方法によって、決定することができる。
別の実施形態では、免疫増強剤は、B細胞活性(体液性免疫応答)を、免疫増強剤がない状態での抗原特異的抗体産生と比較して、例えば、抗原特異的抗体産生の量を増加させることによって、増大させる。例えば、免疫増強剤は、抗原特異的抗体産生を、免疫増強剤がない状態での抗原特異的抗体産生と比較して、少なくとも5%または少なくとも10%または少なくとも15%または少なくとも20%または少なくとも25%または少なくとも30%または少なくとも35%または少なくとも40%または少なくとも45%または少なくとも50%増加させることができる。1つの実施形態では、抗原特異的IgG産生が評価される。抗原特異的抗体産生は、例えば、限定するものではないがELISA、RIA及び試料(例えば、血清試料)中の抗原特異的抗体(例えば、IgG)レベルを測定する同様のものを含む、当該技術分野において十分に確立された方法によって、評価することができる。
別の実施形態では、免疫増強剤は、エフェクターメモリーCD62LloT細胞集団を増加させる。例えば、免疫増強剤は、CD8+T細胞中におけるCD62LloT細胞の総%を増加させることができる。他の機能のなかでも、エフェクターメモリーCD62LloT細胞集団は、リンパ球の輸送において重要な機能を有することが示されている(例えば、Schenkel,J.M.and Masopust,D.(2014)Immunity 41:886-897を参照のこと)。種々の実施形態では、免疫増強剤は、抗原に応答して、CD8+T細胞中におけるエフェクターメモリーCD62LloT細胞の総パーセンテージを(免疫増強剤がない状態でのCD8+T細胞集団中におけるCD62LloT細胞の総パーセンテージと比較して)少なくとも5%または少なくとも10%または少なくとも15%または少なくとも20%または少なくとも25%または少なくとも30%または少なくとも35%または少なくとも40%または少なくとも45%または少なくとも50%増加させることができる。CD8+T細胞中におけるエフェクターメモリーCD62LloT細胞の総パーセンテージは、当該技術分野において知られている標準的な方法によって決定することができ、これらには、限定するものではないが、蛍光標識細胞分取法(FACS)または磁気標識細胞分離法(MACS)が含まれる。
癌抗原への免疫応答を増進させる免疫増強剤mRNA構築物の能力は、当該技術分野において知られているマウスモデル系で評価することができる。1つの実施形態では、免疫正常マウスモデル系が使用される。1つの実施形態では、マウスモデル系は、C57/Bl6マウスを含む(例えば、実施例に記載するものなどの癌抗原に対する抗原特異的CD8+T細胞応答を評価するため)。別の実施形態では、マウスモデル系は、BalbCマウスまたはCD1マウスを含む(例えば、抗原特異的抗体応答などのB細胞応答を評価するため)。
1つの実施形態では、本開示の免疫増強剤ポリペプチドは、少なくとも1つのToll様受容体(TLR)の下流で機能し、それにより、免疫応答を増進させる。したがって、1つの実施形態では、免疫増強剤は、TLRではなく、受容体自体から下流のTLRシグナル伝達経路内の分子である。
1つの実施形態では、免疫増強剤をコードする本開示のmRNAは、1つまたは複数の修飾核酸塩基を含み得る。好適な修飾については、以下にさらに考察される。
1つの実施形態では、免疫増強剤をコードする本開示のmRNAは、脂質ナノ粒子内に製剤化される。1つの実施形態では、脂質ナノ粒子は、癌抗原をコードするmRNAをさらに含む。1つの実施形態では、脂質ナノ粒子は、対象において、癌抗原に対する免疫応答を増進させるために、対象に投与される。好適なナノ粒子及び使用方法については、以下にさらに考察される。
I型インターフェロンを刺激する免疫増強剤mRNA
いくつかの態様では、本開示は、I型インターフェロン経路のシグナル伝達を刺激または増進させ、それにより、I型インターフェロン(IFN)の産生を刺激または増進させることによって、目的の抗原に対する免疫応答を刺激または増進させるポリペプチドをコードする、免疫増強剤mRNAを提供する。抗腫瘍または抗微生物適応免疫の誘導を成功させるには、I型IFNシグナル伝達が必要であることが確立されている(例えば、Fuertes,M.B.et al.(2013)Trends Immunol.34:67-73を参照のこと)。I型IFNの産生(IFN-α、IFN-β、IFN-ε、IFN-κ及びIFN-ωを含む)は、ウイルス感染などの微生物感染の排除に関与する。また、宿主細胞DNA(例えば、損失を受けた細胞または瀕死の細胞に由来するもの)がI型インターフェロン産生を誘導することができ、I型IFNシグナル伝達経路が抗腫瘍適応免疫の発生に関与することも認識されている。しかしながら、多くの病原体及び癌細胞は、I型インターフェロン応答を減少または抑制する機序を進化させてきた。したがって、I型IFNシグナル伝達経路の活性化(刺激及び/または増進を含む)を、それを必要とする対象において、本開示の免疫増強剤mRNAを当該対象に提供することによって行うことは、癌及び病原性感染の治療を含む多様な臨床状況において、また防御免疫をもたらすワクチン応答の増強において、対象の免疫応答を刺激または増進させる。
いくつかの態様では、本開示は、I型インターフェロン経路のシグナル伝達を刺激または増進させ、それにより、I型インターフェロン(IFN)の産生を刺激または増進させることによって、目的の抗原に対する免疫応答を刺激または増進させるポリペプチドをコードする、免疫増強剤mRNAを提供する。抗腫瘍または抗微生物適応免疫の誘導を成功させるには、I型IFNシグナル伝達が必要であることが確立されている(例えば、Fuertes,M.B.et al.(2013)Trends Immunol.34:67-73を参照のこと)。I型IFNの産生(IFN-α、IFN-β、IFN-ε、IFN-κ及びIFN-ωを含む)は、ウイルス感染などの微生物感染の排除に関与する。また、宿主細胞DNA(例えば、損失を受けた細胞または瀕死の細胞に由来するもの)がI型インターフェロン産生を誘導することができ、I型IFNシグナル伝達経路が抗腫瘍適応免疫の発生に関与することも認識されている。しかしながら、多くの病原体及び癌細胞は、I型インターフェロン応答を減少または抑制する機序を進化させてきた。したがって、I型IFNシグナル伝達経路の活性化(刺激及び/または増進を含む)を、それを必要とする対象において、本開示の免疫増強剤mRNAを当該対象に提供することによって行うことは、癌及び病原性感染の治療を含む多様な臨床状況において、また防御免疫をもたらすワクチン応答の増強において、対象の免疫応答を刺激または増進させる。
I型インターフェロン(IFN)は、典型的にはウイルス感染時に複数の異なる細胞型で急速に産生される、炎症促進性サイトカインであり、多様な作用を持つことが知られている。I型IFNのインビボ産生の標準的な帰結は、抗菌細胞プログラムの活性化ならびに自然免疫応答及び適応免疫応答の発生である。I型IFNは、感染細胞及び隣接細胞において、細胞固有の抗菌状態を誘導し、病原菌、特にウイルス性病原体の拡散を制限する。I型IFNはまた、自然免疫細胞活性化(例えば、樹状細胞の成熟)を調節して、抗原提示及びナチュラルキラー細胞の機能を促進する。I型IFNはまた、親和性の高い抗原特異的T細胞及びB細胞の応答ならびに免疫記憶の発生を促進する(Ivashkiv and Donlin(2014)Nat Rev Immunol 14(1):36-49)。
I型IFNは、樹状細胞(DC)を活性化し、オートクラインシグナル伝達を介して、自身のT細胞刺激能力を促す(Montoya et al.,(2002)Blood 99:3263-3271)。I型IFN曝露は、ケモカイン受容体及び接着分子(例えば、流入領域リンパ節へのDCの遊走を促進する)、共刺激分子、ならびにMHCクラスI及びクラスII抗原提示の発現を増加させることにより、DCの成熟を助長する。I型IFN曝露後に成熟するDCは、防御的T細胞応答を効果的に刺激することができる(Wijesundara et al.,(2014)Front Immunol 29(412)及び当該文献中の参考文献)。
I型IFNは、T細胞受容体シグナル伝達に対するI型IFNシグナル伝達のタイミングに大きく依存して、T細胞の活性化、増殖、分化及び生存を促進または阻害することができる(Crouse et al.,(2015)Nat Rev Immunol 15:231-242)。初期の研究では、最適なT細胞刺激、分化、拡大及び細胞溶解活性の要件であるMHC-Iの発現が、複数の細胞種において、I型IFNに応答して上方制御されることが明らかにされた(Lindahl et al.,(1976),J Infect Dis 133(Suppl):A66-A68;Lindahl et al.,(1976)Proc Natl Acad Sci USA 17:1284-1287)。I型IFNは、CD8 T細胞に対して強力な共刺激作用を発揮することができ、CD8 T細胞の増殖及び分化を増進させる(Curtsinger et al.,(2005)J Immunol 174:4465-4469;Kolumam et al.,(2005)J Exp Med 202:637-650)。
T細胞に対する作用と同様に、I型IFNシグナル伝達は、B細胞応答に対し、曝露のタイミング及び状況に応じて、正と負の両方の作用を有する(Braun et al.,(2002)Int Immunol 14(4):411-419;Lin et al,(1998)187(1):79-87)。未熟B細胞の生存及び成熟は、I型IFNシグナル伝達によって、抑制され得る。未熟B細胞とは対照的に、I型IFN曝露は、ウイルス感染後または実験的免疫付与後におけるB細胞の活性化、抗体産生及びアイソタイプスイッチを促進することが示されている(Le Bon et al.,(2006)J Immunol 176:4:2074-2078;Swanson et al.,(2010)J Exp Med 207:1485-1500)。
I型IFN経路のシグナル伝達に関与する構成成分は、STING、インターフェロン制御因子(IRF1、IRF3、IRF5、IRF7、IRF8、及びIRF9など)、TBK1、IKKi、MyD88ならびにTRAMを含む多数の構成成分が確立されている。I型IFN経路のシグナル伝達に関与するさらなる構成成分には、TRAF3、TRAF6、IRAK-1、IRAK-4、TRIF、IPS-1、TLR-3、TLR-4、TLR-7、TLR-8、TLR-9、RIG-1、DAI、及びIFI16が含まれる。
したがって、1つの実施形態では、免疫増強剤mRNAは、I型IFN経路のシグナル伝達に関与する前述の構成成分のいずれかをコードする。
STINGをコードする免疫増強剤mRNA
本開示は、免疫増強剤として、構造的に活性な形態のSTINGを含むSTINGをコードするmRNA(mmRNAを含む)を包含する。STING(インターフェロン遺伝子刺激因子;膜貫通タンパク質173(TMEM173)、IRF3活性化調節因子(MITA)、メチオニン-プロリン-チロシン-セリン(MPYS)、及びER IFN刺激因子(ERIS)としても知られる)は、379アミノ酸の小胞体(ER)局在膜貫通タンパク質であり、I型IFN及び炎症促進性サイトカインを含む免疫応答遺伝子の転写を調整するシグナル伝達分子として機能する(Ishikawa & Barber,(2008)Nature 455:647-678;Ishikawa et al.,(2009)Nature 461:788-792;Barber(2010)Nat Rev Immunol 15(12):760-770)。
本開示は、免疫増強剤として、構造的に活性な形態のSTINGを含むSTINGをコードするmRNA(mmRNAを含む)を包含する。STING(インターフェロン遺伝子刺激因子;膜貫通タンパク質173(TMEM173)、IRF3活性化調節因子(MITA)、メチオニン-プロリン-チロシン-セリン(MPYS)、及びER IFN刺激因子(ERIS)としても知られる)は、379アミノ酸の小胞体(ER)局在膜貫通タンパク質であり、I型IFN及び炎症促進性サイトカインを含む免疫応答遺伝子の転写を調整するシグナル伝達分子として機能する(Ishikawa & Barber,(2008)Nature 455:647-678;Ishikawa et al.,(2009)Nature 461:788-792;Barber(2010)Nat Rev Immunol 15(12):760-770)。
STINGは、DNAのサイトゾル検出をTBK1/IRF3/I型IFNシグナル伝達軸につなげるシグナル伝達アダプターとして機能する。STINGのシグナル伝達アダプター機能は、環状ジヌクレオチド(CDN)の直接的な感知を介して活性化される。CDNの例には、環状ジGMP(グアノシン5’-一リン酸)、環状ジAMP(アデノシン5’-一リン酸)及び環状GMP-AMP(cGAMP)が挙げられる。CDNは、当初は、偏在的な細菌セカンドメッセンジャーとして特徴付けられていたが、現在では、STINGとの直接的相互作用を介してTBK1/IRF3/I型IFNシグナル伝達軸を活性化する病原体関連分子パターン分子(PAMP)のクラスを構成することがわかっている。STINGは、細菌に由来するCDN、及び/または宿主タンパク質環状GMP-AMPシンターゼ(cGAS)に由来するCDNを含む、細胞のサイトゾル中の異常なDNA種及び/またはCDNを感知することができる。cGASタンパク質は、サイトゾル中のDNAの検出に応答して、cGAMPを産生するDNAセンサーである(Burdette et al.,(2011)Nature 478:515-518;Sun et al.,(2013)Science 339:786-791;Diner et al.,(2013)Cell Rep 3:1355-1361;Ablasser et al.,(2013)Nature 498:380-384)。
CDNに結合すると、STINGは二量体化し、立体構造変化を受け、TANK結合キナーゼ1(TBK1)との複合体形成が促進される(Ouyang et al.,(2012)Immunity 36(6):1073-1086)。この複合体は、核周囲のゴルジ体に移行し、TBK1をエンドリソソームコンパートメントに送達し、そこでIRF3及びNF-κB転写因子をリン酸化する(Zhong et al.,(2008)Immunity 29:538-550)。最近の研究では、STINGがTBK1及びIRF3の両方に結合することによって足場として機能して、TBK1によるIRF3のリン酸化を特異的に促進することが示された(Tanaka & Chen,(2012)Sci Signal 5(214):ra20)。IRF3、IRF7及びNF-κB依存性シグナル伝達経路の活性化は、I型IFNなどのサイトカイン及び他の免疫応答関連タンパク質の産生を誘導し、抗病原体及び/または抗腫瘍活性を促進する。
多数の研究が、体液性及び細胞性免疫応答を誘発する可能性のあるワクチンアジュバントまたは免疫調節剤として、STINGのCDNアゴニストの使用を探究している(Dubensky et al.,(2013)Ther Adv Vaccines 1(4):131-143及び当該文献中の参考文献)。初期の研究では、CDNのc-ジ-GMPの投与により、Staphylococcus aureus感染がインビボで緩和し、マウス感染モデルで回収された細菌細胞の数が減少したのに対し、インビトロでは、c-ジ-GMPは、細菌細胞に対する観察可能な阻害効果または殺菌効果はないことが示された。これは、細菌細胞の減少が、宿主免疫系に対する作用に起因することを示唆している(Karaolis et al.,(2005)Antimicrob Agents Chemother 49:1029-1038;Karaolis et al.,(2007)Infect Immun 75:4942-4950)。最近の研究では、合成CDN誘導体分子を顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)産生癌ワクチンとともに製剤化すると(STINGVAXと呼ばれる)、GM-CSFワクチン単独での免疫化と比較して、癌治療用動物モデルにおいてインビボで増進された抗腫瘍効果を誘発することが示された(Fu et al.,(2015)Sci Transl Med 7(283):283ra52)。これは、CDNが強力なワクチンアジュバントであることを示唆している。
ヒトTMEM173遺伝子にマッピングされた多型に起因する変異型STINGタンパク質は、機能獲得または構造的に活性な表現型を呈示することが記載されている。インビトロで発現させた場合、変異型STING対立遺伝子は、I型IFNの誘導を強力に刺激することが示された(Liu et al.,(2014)N Engl J Med 371:507-518;Jeremiah et al.,(2014)J Clin Invest 124:5516-5520;Dobbs et al.,(2015)Cell Host Microbe 18(2):157-168;Tang & Wang,(2015)PLoS ONE 10(3):e0120090;Melki et al.,(2017)J Allergy Clin Immunol In Press;Konig et al.,(2017)Ann Rheum Dis 76(2):468-472;Burdette et al.(2011)Nature 478:515-518)。
本明細書で提供されるのは、本明細書に記載の免疫増強剤として使用するための、変異型ヒトSTINGアイソフォームを含む構造的に活性な形態のSTINGをコードする、修飾mRNA(mmRNA)である。変異型ヒトSTINGアイソフォームを含む構造的に活性な形態のSTINGをコードするmmRNAは、本明細書の配列表に記載される。本明細書で使用される変異型ヒトSTINGポリペプチドのアミノ酸残基ナンバリングは、当該技術分野でGenbankアクセッション番号NP_938023として入手可能な379アミノ酸残基の野生型ヒトSTING(アイソフォーム1)に使用されているものに対応する。
したがって、1つの態様では、本開示は、アミノ酸残基155における変異、特にV155M変異などのアミノ酸置換を有する変異型ヒトSTINGタンパク質をコードする、mmRNAを提供する。1つの実施形態では、mmRNAは、配列番号1に記載のアミノ酸配列をコードする。1つの実施形態では、STING V155M変異体は、配列番号199に示されるヌクレオチド配列によってコードされる。1つの実施形態では、mmRNAは、配列番号209に示されるmiR122結合部位を含む3’UTR配列を含む。
他の態様では、本開示は、アミノ酸残基284におけるアミノ酸置換などの変異を有する変異型ヒトSTINGタンパク質をコードする、mmRNAを提供する。残基284置換の非限定的な例には、R284T、R284M及びR284Kが挙げられる。ある特定の実施形態では、変異型ヒトSTINGタンパク質は、R284T変異を有し、例えば、配列番号2に記載のアミノ酸配列を有するか、または配列番号200に示されるヌクレオチド配列によってコードされる。ある特定の実施形態では、変異型ヒトSTINGタンパク質は、R284M変異を有し、例えば、配列番号3に記載のアミノ酸配列を有するか、または配列番号201に示されるヌクレオチド配列によってコードされる。ある特定の実施形態では、変異型ヒトSTINGタンパク質は、R284K変異を有し、例えば、配列番号4もしくは224に記載のアミノ酸配列を有するか、または配列番号202もしくは225に示されるヌクレオチド配列によってコードされる。
他の態様では、本開示は、N154S変異などのアミノ酸残基154におけるアミノ酸置換などの変異を有する変異型ヒトSTINGタンパク質をコードする、mmRNAを提供する。ある特定の実施形態では、変異型ヒトSTINGタンパク質は、N154S変異を有し、例えば、配列番号5に記載のアミノ酸配列を有するか、または配列番号203に示されるヌクレオチド配列によってコードされる。
さらなる他の態様では、本開示は、V147L変異などのアミノ酸残基147におけるアミノ酸置換などの変異を有する変異型ヒトSTINGタンパク質をコードする、mmRNAを提供する。ある特定の実施形態では、V147L変異を有する変異型ヒトSTINGタンパク質は、配列番号6に記載のアミノ酸配列を有するか、または配列番号204に示されるヌクレオチド配列によってコードされる。
他の態様では、本開示は、E315Q変異などのアミノ酸残基315におけるアミノ酸置換などの変異を有する変異型ヒトSTINGタンパク質をコードする、mmRNAを提供する。ある特定の実施形態では、E315Q変異を有する変異型ヒトSTINGタンパク質は、配列番号7に記載のアミノ酸配列を有するか、または配列番号205に示されるヌクレオチド配列によってコードされる。
他の態様では、本開示は、R375A変異などのアミノ酸残基375におけるアミノ酸置換などの変異を有する変異型ヒトSTINGタンパク質をコードする、mmRNAを提供する。ある特定の実施形態では、R375A変異を有する変異型ヒトSTINGタンパク質は、配列番号8に記載のアミノ酸配列を有するか、または配列番号206に示されるヌクレオチド配列によってコードされる。
他の態様では、本開示は、前述の変異の1つもしくは複数または2、3、4もしくはそれ以上の組み合わせを有する変異型ヒトSTINGタンパク質をコードする、mmRNAを提供する。したがって、1つの態様では、本開示は、V147L、N154S、V155M、R284T、R284M、R284K、E315Q及びR375A、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される1つまたは複数の変異を有する変異型ヒトSTINGタンパク質をコードする、mmRNAを提供する。他の態様では、本開示は、V155MとR284T;V155MとR284M;V155MとR284K;V155MとV147L;V155MとN154S;V155MとE315Q;及びV155MとR375Aからなる群から選択される変異の組み合わせを有する変異型ヒトSTINGタンパク質をコードする、mmRNAを提供する。
他の態様では、本開示は、V155Mと、次の変異:R284T;R284M;R284K;V147L;N154S;E315Q;及びR375Aのうちの1、2、3またはそれ以上と、を有する変異型ヒトSTINGタンパク質をコードする、mmRNAを提供する。他の態様では、本開示は、V155M、V147L及びN154S変異を有する変異型ヒトSTINGタンパク質をコードする、mmRNAを提供する。他の態様では、本開示は、V155M、V147L、N154S変異と、任意選択で、アミノ酸284における変異と、を有する変異型ヒトSTINGタンパク質をコードする、mmRNAを提供する。さらなる他の態様では、本開示は、V155M、V147L、N154S変異と、R284T、R284M及びR284Kから選択されるアミノ酸284における変異と、を有する変異型ヒトSTINGタンパク質をコードする、mmRNAを提供する。他の態様では、本開示は、V155M、V147L、N154S、及びR284T変異を有する変異型ヒトSTINGタンパク質をコードする、mmRNAを提供する。他の態様では、本開示は、V155M、V147L、N154S、及びR284M変異を有する変異型ヒトSTINGタンパク質をコードする、mmRNAを提供する。他の態様では、本開示は、V155M、V147L、N154S、及びR284K変異を有する変異型ヒトSTINGタンパク質をコードする、mmRNAを提供する。
他の実施形態では、本開示は、アミノ酸残基147、154、155と、任意選択で、284とにおける変異の組み合わせ、特にV147L、N154S、V155M、任意選択で、R284Mなどのアミノ酸置換を有する変異型ヒトSTINGタンパク質をコードする、mmRNAを提供する。ある特定の実施形態では、変異型ヒトSTINGタンパク質は、配列番号9に記載のアミノ酸配列などのV147N、N154S及びV155M変異を有するか、または配列番号207に示されるヌクレオチド配列によってコードされる。ある特定の実施形態では、変異型ヒトSTINGタンパク質は、配列番号10に記載のアミノ酸配列などのR284M、V147N、N154S及びV155M変異を有するか、または配列番号208に示されるヌクレオチド配列によってコードされる。
別の実施形態では、本開示は、アミノ酸137~379からなる構造的に活性なヒトSTINGポリペプチドなどの、全長379アミノ酸の野生型タンパク質の構造的に活性な切断形態である変異型ヒトSTINGタンパク質をコードする、mmRNAを提供する。
抗原提示細胞の促進剤
いくつかの実施形態では、RNAワクチンは、例えば、非APCから偽APC(シュード-APC)への変換によって抗原提示細胞(APC)の産生を促進するための薬剤と組み合わせることができる。抗原提示は、免疫応答の開始、増幅、及び持続時間における重要な段階である。このプロセスでは、主要組織適合遺伝子複合体(MHC)またはヒト白血球抗原(HLA)を介して抗原の断片がT細胞に提示されることで、抗原特異的な免疫応答が推進される。免疫予防及び免疫治療については、この応答の増進が効果の改善に重要である。本発明のRNAワクチンは、効率的な抗原提示を推進するために設計または増強してよい。APCによるプロセシング及び提示の増進方法の1つは、抗原提示細胞(APC)へのRNAワクチンの標的指向性を向上させることである。別の手法は、免疫賦活性の製剤及び/または成分によるAPC細胞の活性化を含むものである。
いくつかの実施形態では、RNAワクチンは、例えば、非APCから偽APC(シュード-APC)への変換によって抗原提示細胞(APC)の産生を促進するための薬剤と組み合わせることができる。抗原提示は、免疫応答の開始、増幅、及び持続時間における重要な段階である。このプロセスでは、主要組織適合遺伝子複合体(MHC)またはヒト白血球抗原(HLA)を介して抗原の断片がT細胞に提示されることで、抗原特異的な免疫応答が推進される。免疫予防及び免疫治療については、この応答の増進が効果の改善に重要である。本発明のRNAワクチンは、効率的な抗原提示を推進するために設計または増強してよい。APCによるプロセシング及び提示の増進方法の1つは、抗原提示細胞(APC)へのRNAワクチンの標的指向性を向上させることである。別の手法は、免疫賦活性の製剤及び/または成分によるAPC細胞の活性化を含むものである。
あるいは、非APCを再プログラム化してAPCになりつつある状態にする方法を本発明のRNAワクチンとともに使用してよい。重要なことに、mRNA製剤を取り込み、かつその治療作用の標的である細胞のほとんどがAPCではない。それ故に、こうした細胞をAPCに変換する方法を設計すれば、効果にとって有利なものとなるであろう。非APCからAPCへのシフトも促進しつつ、例えばmRNAワクチンなどのRNAワクチンを細胞に送達する方法及び手法が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、APC再プログラム化分子をコードするmRNAは、RNAワクチンに含められるか、またはRNAワクチンとともに同時投与される。
本明細書で使用されるAPC再プログラム化分子は、非APC細胞からAPC様フェノタイプへの移行を促進する分子である。APC様フェノタイプは、MHCクラスIIプロセシングを可能にする特性である。したがって、APC様フェノタイプを有するAPC細胞は、1つまたは複数の外来性分子(APC再プログラム化分子)を有さない同一の細胞と比較してMHCクラスIIプロセシング能力が増進した、1つまたは複数の外来性分子を有する細胞である。いくつかの実施形態では、APC再プログラム化分子は、CIITA(MHCクラスII発現の中心制御因子)、CLIP、HLA-DO、HLA-DMなどのシャペロンタンパク質(MHCクラスIIへの抗原断片負荷のエンハンサー)、及び/またはCD40、CD80、CD86などのような共刺激分子(T細胞の抗原認識及びT細胞活性化のエンハンサー)である。
CIITAタンパク質は、クラスIIのプロモーター領域と会合するDNA結合タンパク質の保存されたセットと相互作用することによってMHCクラスII遺伝子の転写活性化を増進するトランス活性化因子である(Steimle et al.,1993,Cell 75:135-146)。CIITAの転写活性化機能は、アミノ末端の酸性ドメイン(アミノ酸26~137)に位置するとされている。CIITAと相互作用するタンパク質は、CIITA相互作用タンパク質104(本明細書ではCIP104とも称される)と呼ばれ、核酸分子にコードされる。CITTAとCIP104との両方が、MHCクラスIIのプロモーターからの転写を増進することが示されており、したがって本発明のAPC再プログラム化分子として有用である。いくつかの実施形態では、APC再プログラム化分子は、全長のCIITA、CIP104、もしくは他の関連分子、またはその活性断片であり、こうした活性断片は、CIITAのアミノ酸26~137、またはそれとの配列同一性が少なくとも80%であり、MHCクラスII遺伝子の転写活性化を増進する能力を維持するアミノ酸などである。
好ましい実施形態では、APC再プログラム化分子は、APC再プログラム化分子をコードするmRNAの形態で対象に送達される。したがって、本発明のRNAワクチンは、APC再プログラム化分子をコードするmRNAを含み得る。いくつかの実施形態では、mRNAは、モノシストロニックである。他の実施形態では、mRNAは、ポリシストロニックである。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の抗原をコードするmRNAは、APC再プログラム化分子をコードするmRNAとは別の製剤に存在する。他の実施形態では、1つまたは複数の抗原をコードするmRNAは、APC再プログラム化分子をコードするmRNAと同一の製剤に存在する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の抗原をコードするmRNAは、APC再プログラム化分子をコードするmRNAと同一回数、対象に投与される。他の実施形態では、1つまたは複数の抗原をコードするmRNAは、APC再プログラム化分子をコードするmRNAとは異なる回数、対象に投与される。例えば、APC再プログラム化分子をコードするmRNAは、1つまたは複数の抗原をコードするmRNAの前に投与してよい。APC再プログラム化分子をコードするmRNAは、抗原をコードするmRNAの直前、少なくとも1時間前、少なくとも1日前、少なくとも1週間前、または少なくとも1ヶ月前に投与してよい。
あるいは、APC再プログラム化分子をコードするmRNAは、1つまたは複数の抗原をコードするmRNAの後に投与してよい。APC再プログラム化分子をコードするmRNAは、抗原をコードするmRNAの直後、少なくとも1時間後、少なくとも1日後、少なくとも1週間後、または少なくとも1ヶ月後に投与してよい。いくつかの実施形態では、抗原は、患者特異的な抗原などの癌抗原である。他の実施形態では、抗原は、感染性疾患の抗原である。
いくつかの実施形態では、mRNAワクチンは、リコール抗原を含み得、リコール抗原は、メモリー抗原と称されることもある。リコール抗原は、個体が以前に遭遇したことのある抗原であり、その個体には、メモリーリンパ球が既に存在する。いくつかの実施形態では、リコール抗原は、インフルエンザ抗原などの、個体が遭遇した可能性のある感染性疾患抗原であり得る。リコール抗原は、より強固な免疫応答の促進に役立つ。
mRNAワクチンに含めるために選択される抗原またはネオエピトープとしては、典型的には、高親和性を有する結合ペプチドを選択することになる。いくつかの態様では、抗原またはネオエピトープは、野生型ペプチドと比較して高親和性でHLAタンパク質に結合する。いくつかの実施形態では、抗原またはネオエピトープが有するIC50は、少なくとも5000nM未満、少なくとも500nM未満、少なくとも250nM未満、少なくとも200nM未満、少なくとも150nM未満、少なくとも100nM未満、少なくとも50nM、またはそれ未満である。典型的には、予測IC50が50nM未満であるペプチドは、中程度から高度の親和性を有する結合ペプチドであると一般に考えられ、HLA結合の生化学的アッセイを使用してその親和性を実験的に試験するために選択されることになる。癌抗原は、個別化癌抗原であり得る。個別化RNA癌ワクチンは、例えば、それぞれの対象に特異的な腫瘍抗原または癌抗原に特異的な既知の癌抗原を1つまたは複数コードするRNAを含み得、こうした抗原は、ネオエピトープまたは対象特異的エピトープもしくは対象特異的抗原と称される。「対象特異的癌抗原」は、特定の患者の腫瘍に発現することが同定された抗原である。対象特異的癌抗原は、典型的には、腫瘍試料に存在し得たり、または存在し得なかったりすることが一般的である。非癌性細胞では発現しないか、もしくはめったに発現しないか、または非癌性細胞におけるその発現が、癌性細胞におけるものと比較して顕著に減少しており、ワクチン接種時に誘導される免疫応答を誘導する腫瘍関連抗原は、ネオエピトープと称される。腫瘍関連抗原のようなネオエピトープは、体に対して完全に外来性であるため、健康な組織に対する免疫応答を生成しないか、または免疫系の防御成分によって遮蔽されると想定される。いくつかの実施形態では、ネオエピトープに基づく個別化RNA癌ワクチンが望ましく、この理由は、そのようなワクチン製剤によって、患者特異的な腫瘍に対する特異性が最大化することになるためである。変異によって得られるネオエピトープは、タンパク質に異なるアミノ酸が生じる非同義変異である点変異、終止コドンが修飾または欠失し、C末端に新規の腫瘍特異的配列を有する長鎖化タンパク質の翻訳を引き起こすリードスルー変異、成熟mRNAにイントロンが含められるために、特有の腫瘍特異的タンパク質配列が生じるスプライス部位変異、2つのタンパク質のジャンクションに腫瘍特異的配列を有するキメラタンパク質が生じる染色体再編(すなわち、遺伝子融合)、新規の腫瘍特異的タンパク質配列を有する新たなオープンリーディングフレームが生じるフレームシフト変異または欠失、及び転座から生じ得る。したがって、いくつかの実施形態では、RNA癌ワクチンは、フレームシフト変異及び組換えまたは本明細書に記載の他の変異のいずれかからなる群から選択される変異を含む少なくとも1つの癌抗原を含む。
個別化RNA癌ワクチンの生成方法は、一般に、例えば核酸またはタンパク質のディープシークエンシング技術を使用する変異の同定と、例えば有効なペプチド-MHC結合予測アルゴリズム、または患者のHLA対立遺伝子に結合し得、腫瘍に存在する変異に基づく候補T細胞エピトープのセットを生成するための他の分析技術を適用するネオエピトープの同定と、選択されるネオエピトープを抗原特異的T細胞が標的とすることの任意選択の実証または候補ネオエピトープが腫瘍表面に存在するHLAタンパク質に結合することの任意選択の実証と、ワクチンの開発と、を含む。本発明のRNA癌ワクチンは、単一のネオエピトープの複数のコピー、単一の型の変異、すなわち点変異に基づく複数の異なるネオエピトープ、さまざまな変異型に基づく複数の異なるネオエピトープ、腫瘍関連抗原またはリコール抗原などのネオエピトープ及び他の抗原を含み得る。
変異の同定技術の例には、限定はされないが、動的対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション(DASH)、マイクロプレートアレイダイアゴナルゲル電気泳動(microplate array diagonal gel electrophoresis)(MADGE)、パイロシークエンシング、オリゴヌクレオチド特異的ライゲーション、TaqManシステム、ならびにさまざまなDNA「チップ」技術、すなわちAffymetrix SNPチップ、ならびに浸潤性の切断によって小型シグナル分子を生成させた後、質量分析法、または固定化パドロックプローブ及びローリングサークル増幅を実施することに基づく方法が含まれる。
核酸またはタンパク質のディープシークエンシング技術は、当該技術分野において知られている。任意の型の配列解析方法を使用することができる。核酸シークエンシングは、全腫瘍ゲノム、腫瘍エクソーム(タンパク質コードDNA)、腫瘍トランスクリプトーム、またはエキソソームに対して実施してよい。合成ごとのリアルタイム1分子シークエンシング技術は、シークエンシングされる鋳型に相補的なDNA新生鎖に蛍光ヌクレオチドが組み込まれるたびにそれが検出されるということを利用するものである。迅速なハイスループットシークエンシング方法は他にも存在する。タンパク質シークエンシングは、腫瘍プロテオームに対して実施してよい。さらに、腫瘍細胞に存在するMHCタンパク質に結合した変異ペプチドが存在することを同定または検証をするために、タンパク質質量分析法を使用してよい。ペプチドは、腫瘍細胞から酸によって溶出させるか、または腫瘍から免疫沈降させたHLA分子から酸によって溶出させた後、質量分析法を使用して同定することができる。シークエンシングの結果は、既知の対照セットと比較するか、または患者の正常組織に対して実施されたシークエンシング解析と比較してよい。
したがって、本発明は、T細胞エピトープなどの、抗原のネオエピトープの同定方法及び/または検出方法に関する。具体的には、本発明は、対象における腫瘍特異的免疫応答の誘導において有用な腫瘍特異的ネオエピトープの同定方法及び/または検出方法を提供する。任意選択で、こうしたネオエピトープは、野生型ペプチドと比較してクラスIのHLAタンパク質に強い親和性で結合し、及び/または抗腫瘍CD8 T細胞を活性化する能力を有する。任意の特定の遺伝子に同一の変異が腫瘍全体にみられることはめったにない。
MHCクラスIタンパク質は、ほとんどの腫瘍細胞を含む、体のほとんどすべての細胞の表面に存在する。内在性タンパク質または細胞内に存在する病原体に通常は起源を有する抗原は、MHCクラスIタンパク質に負荷され、その後、こうした抗原は、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)に提示される。T細胞受容体は、MHCクラスI分子と複合化したペプチドを認識してそれに結合する能力を有する。細胞傷害性Tリンパ球はそれぞれ、MHC/ペプチド複合体に特異的に結合する能力を有する特有のT細胞受容体を発現する。
コンピューターアルゴリズムを使用すると、T細胞エピトープなどの潜在的なネオエピトープを予測することが可能であり、こうしたネオエピトープは、すなわち、ペプチド提示複合体の形態のクラスIまたはクラスIIのMHC分子が結合した後、この形態においてTリンパ球のT細胞受容体によって認識されるペプチド配列である。MHCに結合することになるペプチドの同定に有用なプログラムの例には、例えば、Lonza Epibase、SYFPEITHI(Rammensee et al.,Immunogenetics,50(1999),213-219)、及びHLA_BIND(Parker et al.,J.Immunol.,152(1994),163-175)が含まれる。
推定ネオエピトープが選択されると、インビトロ及び/またはインビボのアッセイを使用してそれをさらに試験することができる。それぞれの患者からの単離物を用いて、Elispotアッセイなどの、研究室において実施される通常のインビトロアッセイを使用することで、アルゴリズムによる予測に基づいて選択されたネオエピトープのリストを洗練してよい。ネオエピトープワクチン、その使用方法及び調製方法は、PCT/US2016/044918にすべて記載されており、当該文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
RNA癌ワクチンに含めるために選択される活性化癌遺伝子変異ペプチドは、典型的には、高親和性結合ペプチドである。いくつかの態様では、活性化癌遺伝子変異ペプチドは、野生型ペプチドと比較して高親和性でHLAタンパク質に結合する。いくつかの実施形態では、活性化癌遺伝子変異ペプチドは、少なくとも5000nM未満、少なくとも500nM未満、少なくとも250nM未満、少なくとも200nM未満、少なくとも150nM未満、少なくとも100nM未満、少なくとも50nM未満、またはそれ未満のIC50を有する。典型的には、予測IC50が50nM未満であるペプチドは、中程度から高度の親和性を有する結合ペプチドであると一般に考えられ、HLA結合の生化学的アッセイを使用してその親和性を実験的に試験するために選択されることになる。
個別化癌ワクチンでは、対象特異的癌抗原は、患者の試料において同定してよい。例えば、試料は、組織試料または腫瘍試料であり得る。例えば、1つまたは複数の腫瘍細胞の試料において対象特異的癌抗原の存在を調べてよい。腫瘍試料は、対象特異的癌抗原を同定するために、全ゲノム、エクソーム、またはトランスクリプトームの解析を使用して調べてよい。
あるいは、対象特異的癌抗原は、対象のエキソソームにおいて同定してよい。ワクチン向けの抗原が、対象のエキソソームにおいて同定されると、そのような抗原は、対象のエキソソーム抗原の代表物であると言われる。
エキソソームは、細胞によって分泌される小さなマイクロベシクルであり、典型的には、およそ30~100nmの直径を有する。エキソソームは、古典的には内向きの陥入から形成され、最後のエンドソーム膜がくびれて切り離される結果、脂質二重層を有する小ベシクルを多く含む多胞体(MVB)が形成され、こうした小ベシクルのそれぞれが、親細胞の細胞質の試料を含む。MVBが細胞膜と融合すると、こうしたエキソソームが細胞から放出され、放出されたエキソソームは、血液、尿、脳脊髄液、または他の体液へと送達される。エキソソームは、こうした生体液のいずれからでも、さらなる分析に向けて回収することができる。
エキソソーム内の核酸は、腫瘍抗原のバイオマーカーとしての役割を有する。対象特異的癌抗原を同定するためのエキソソーム分析の利点は、この方法によれば生検を実施する必要がなくなることである。このことは、癌抗原の同定及びワクチン接種を含む数ラウンドの治療を患者が受ける必要があるときに特に有益であり得る。
生体試料からのエキソソームの単離方法については、当該技術分野において多くのものが説明されてきた。例えば、下記の方法を使用することができる:分画遠心、低速遠心、アニオン交換、及び/またはゲル浸透クロマトグラフィー、スクロース密度勾配もしくはオルガネラ電気泳動、磁気活性化細胞選別(magnetic activated cell sorting)(MACS)、ナノ膜限外濾過遠心、パーコール(Percoll)を用いた密度勾配による単離、及びマイクロ流体デバイスの使用。方法の例は、例えば、米国特許公開第2014/0212871号に記載されている。
「生体試料」という用語は、DNA、RNA、及びタンパク質などの生体材料を含む試料を指す。いくつかの実施形態では、生体試料は、対象に由来する体液を適切に含み得る。体液は、対象の体の任意の位置、好ましくは末梢位置から単離される液体であり得、こうした液体には、限定はされないが、例えば、血液、血漿、血清、尿、痰、髄液、脳脊髄液、胸水、乳頭吸引液、リンパ液、気道、腸管、及び尿生殖器に由来する液体、涙液、唾液、母乳、リンパ系に由来する液体、精液、脳脊髄液、臓器内系液、腹水、腫瘍嚢胞液(tumor cyst fluid)、羊水、ならびにそれらの組み合わせが含まれる。
いくつかの実施形態では、発現抗原の変化を同定するために癌の進行を監視することができる。したがって、いくつかの実施形態では、方法ではさらに、第2のセットの癌抗原を得るための、対象の試料に由来する少なくとも2つの癌抗原の同定と、対象に対する第2のセットの癌抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するmRNAワクチンの対象への投与とが、癌mRNAワクチンの投与から少なくとも1ヶ月後に実施される。いくつかの実施形態では、第2のセットの抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するmRNAワクチンは、第1のセットの癌抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するmRNAワクチンの2ヶ月後、3ヶ月後、4ヶ月後、5ヶ月後、6ヶ月後、8ヶ月後、10ヶ月後、または1年後に対象に投与される。他の実施形態では、第2のセットの抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するmRNAワクチンは、第1のセットの癌抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するmRNAワクチンの1年半後、2年後、2年半後、3年後、3年半後、4年後、4年半後、または5年後に対象に投与される。
ネオ抗原としてのホットスポット変異
癌の集団解析では、偶発するであろうと予測されるより高い割合の患者にある特定の変異が生じる。こうした「反復」変異または「ホットスポット」変異は、腫瘍において「ドライバー」の役割を有すると示されたことが多く、腫瘍の開始、維持、または転移に重要な癌細胞機能に何らかの変化をもたらし、それ故に、腫瘍が進化するために選択されるものである。腫瘍の生物学及び治療におけるその重要性に加えて、反復変異からは精密医療の機会が得られ、こうした精密医療では、患者集団は特定の治療に応答する可能性が高い群へと分類される。こうした特定の治療には、限定はされないが、変異タンパク質自体を標的とするものが含まれる。
癌の集団解析では、偶発するであろうと予測されるより高い割合の患者にある特定の変異が生じる。こうした「反復」変異または「ホットスポット」変異は、腫瘍において「ドライバー」の役割を有すると示されたことが多く、腫瘍の開始、維持、または転移に重要な癌細胞機能に何らかの変化をもたらし、それ故に、腫瘍が進化するために選択されるものである。腫瘍の生物学及び治療におけるその重要性に加えて、反復変異からは精密医療の機会が得られ、こうした精密医療では、患者集団は特定の治療に応答する可能性が高い群へと分類される。こうした特定の治療には、限定はされないが、変異タンパク質自体を標的とするものが含まれる。
反復変異については、非同義(または「ミスセンス」)の単一ヌクレオチド変異体(SNV)に重点が置かれ、多大な努力及び研究がなされてきたが、同義(または「サイレント」)、スプライス部位、複数ヌクレオチド変異体、挿入、及び欠失などの、さまざまな複雑性の高い(非SNV)変異分類のものも高頻度で生じ得ることが集団解析によって明らかになってきた。
p53遺伝子(正式記号TP53)は、ヒトの癌において他のどの遺伝子よりも高い頻度で変異する。p53に生じる変異のほとんどで、そのゲノム位置は1人または少数の患者のみに特有であるため、こうした変異は、特定の患者集団向けに設計される治療ワクチンのための反復ネオ抗原として使用できないことが大規模コホート研究によって示された。驚くべきことに、しかしながら、p53遺伝子座の小サブセットは実に「ホットスポット」のパターンを示しており、そこでは、遺伝子のいくつかの位置が相対的に高い頻度で変異するのである。際だったことに、反復して変異するこうした領域の大部分が、エクソンとイントロンとの境界付近に存在し、mRNAのスプライシング機構によって認識される標準のヌクレオチド配列モチーフを破壊する。スプライシングモチーフが変異すると、局所的なアミノ酸配列には変化が生じない(すなわち、同義変異またはイントロン変異)と予測されるとしても、最終的なmRNA配列には変化が生じ得る。それ故に、こうした変異によって予測不可能な様式でmRNAのスプライシングに変化が生じ得、翻訳されるタンパク質が著しい機能的影響を受け得るにもかかわらず、こうした変異は、一般的なアノテーションツールによって「ノンコーディング」として注解されてしまい、さらに解析されることなく無視されることが多い。代替的にスプライシングを受けたアイソフォームにインフレームの配列変化が生じる(すなわち、PTCが生じない)のであれば、こうしたアイソフォームはNMDによる排除を免れることができ、速やかに発現し、プロセシングを受けてHLA系によって細胞表面に提示される。さらに、変異に由来する代替的なスプライシングは、通常、「潜在性」であって、すなわち、正常組織では発現しないものであり、それ故に、T細胞によって非自己のネオ抗原として認識され得る。
いくつかの態様では、本発明は、p53におけるある特定の反復体細胞癌変異(限定はされないが、ミスセンスSNV)から得られ、代替的なスプライシングを引き起こすことが多いネオ抗原ペプチド配列を提供し、こうしたネオ抗原ペプチド配列は、治療的なワクチン接種のための標的としての使用を目的とする。いくつかの実施形態では、mRNAのスプライシング事象でネオ抗原ペプチド及び/またはHLA拘束性エピトープを生じさせる変異には、コドン位置T125に隣接する標準5’スプライス部位における変異であって、エピトープAVSPCISFVW(配列番号233)(HLA-B*57:01、HLA-B*58:01)、エピトープHPLASCQCFF(配列番号234)(HLA-B*35:01、HLA-B*53:01)、エピトープFVWNFGIPL(配列番号235)(HLA-A*02:01、HLA-A*02:06、HLA-B*35:01)を含むペプチド配列TAKSVTCTVSCPEGLASMRLQCLAVSPCISFVWNFGIPLHPLASCQCFFIVYPLNV(配列番号232)を有する保持型イントロンを誘導する変異が含まれる。
いくつかの実施形態では、mRNAのスプライシング事象でネオ抗原ペプチド及び/またはHLA拘束性エピトープを生じさせる変異には、コドン位置331に隣接する標準5’スプライス部位における変異であって、エピトープLQVLSLGTSY(配列番号237)(HLA-B*15:01)、エピトープFQSNTQNAVF(配列番号238)(HLA-B*15:01)を含むペプチド配列EYFTLQVLSLGTSYQVESFQSNTQNAVFFLTVLPAIGAFAIRGQ(配列番号236)を有する保持型イントロンを誘導する変異が含まれる。
いくつかの実施形態では、mRNAのスプライシング事象でネオ抗原ペプチド及び/またはHLA拘束性エピトープを生じさせる変異には、コドン位置126に隣接する標準3’スプライス部位における変異であって、エピトープCTMFCQLAK(配列番号240)(HLA-A*11:01)、エピトープKSVTCTMF(配列番号241)(HLA-B*58:01)を含む新規のスパニングペプチド配列AKSVTCTMFCQLAK(配列番号239)を生成する潜在性の代替エクソン3’スプライス部位を誘導する変異が含まれる。
いくつかの実施形態では、mRNAのスプライシング事象でネオ抗原ペプチド及び/またはHLA拘束性エピトープを生じさせる変異には、コドン位置224に隣接する標準5’スプライス部位における変異であって、エピトープVPYEPPEVW(配列番号243)(HLA-B*53:01、HLA-B*51:01)、エピトープLTVPPSTAW(配列番号244)(HLA-B*58:01、HLA-B*57:01)を含む新規のスパニングペプチド配列VPYEPPEVWLALTVPPSTAWAA(配列番号242)を生成する潜在性の代替イントロン5’スプライス部位を誘導する変異が含まれる。
前述の配列では、転写コドン位置は、Ensemblのv83のヒトゲノムアノテーションに由来する標準の全長p53転写物であるENST00000269305(配列番号245)を参照したものである。
先行技術のペプチドワクチンのネオエピトープを得るための変異は、典型的には、患者のDNAシークエンシングデータから得られる。一方、mRNA発現は、考えられるネオエピトープのグローバル空間をより直接的に測定するものである。例えば、いくつかの腫瘍特異的ネオエピトープは、スプライシングの変化、フレームシフトをもたらす挿入/欠失(InDel)、代替プロモーター、またはエピジェネティック修飾から生じ得、エクソームシークエンシングデータを使用するだけでは容易に同定されない。ネオ抗原ワクチンのために、これらの複雑な変異の種類を同定することは、患者固有のHLAアロタイプに結合することができるエピトープ数が増えることから、潜在的な価値がある。さらに、複合バリアントは、免疫原性がより高く、単一のアミノ酸変化から生じるバリアントと比較して、自己タンパク質との違いから、腫瘍に対して、より効果的な免疫応答をもたらし得る。
いくつかの態様では、本発明は、複雑な患者特異的変異を同定し、これらの変異を効果的な個別化mRNAワクチンに製剤化する方法を伴う。方法は、ショートリードRNAシークエンシングの使用を伴う。RNAシークエンシングにショートリードを使用することにおける固有の主な課題は、選択的スプライシング及び他の機序により、同じゲノム遺伝子座から複数のmRNA転写物アイソフォームが取得され得るという事実である。シークエンシングリードが全長mRNA転写物よりもかなり短いため、リードセットを既知の遺伝子アノテーションモデル内の正しい対応アイソフォームにマッピングすることが難しくなる。結果として、既知の遺伝子アノテーションから逸れる複合バリアント(癌では一般的)は、標準的なアプローチで発見するのは困難であり得る。しかし、本開示は、全長転写物の正確なエクソン組成ではなく、短いペプチドの同定を伴うものである。これらの複雑な変異を代表する短いペプチドを同定する方法は、複雑なバリアントのネオエピトープ予測に対する短いkマーカウントアプローチを伴う。
典型的な次世代シークエンシングのリードは、150塩基対であり、これは、コーディング領域をキャプチャする場合、50コドン、または長さ9(27ヌクレオチド)の41の異なるペプチドエピトープを分析することができる。したがって、簡単で計算可能なスケーラブル操作を使用してRNAシークエンシング試料からすべての27マーをカウントし、結果を、同じ試料に由来する正常組織に対して、または正常組織のRNAシークエンシングから得た27マーの事前に計算されたデータベース(例えば、GTEx)に対して比較することができる。
RNAシークエンシングデータから予想されたネオエピトープを含有するmRNAワクチンは、1)腫瘍試料のRNAシークエンシングのすべてのリードからすべての可能な27マーをカウントすることと、2)各リードのオープンリーディングフレームを、そのリード全体の任意の部分とトランスクリプトームとをアラインメントすることによって予測することと、3)27マーのカウントを、整合する正常試料及び/または同じ組織種に由来する正常組織のデータベースの対応する27マーのカウントと比較することと、4)同じ腫瘍から得たDNAシークエンシングデータを使用して、同じ遺伝子にみられる体細胞変異が存在する場合、ネオエピトープ予測に信頼度を追加することと、により、創出することができる。ポイント(4)に関して、多くの場合、変異は、転写変化またはスプライシング変化を引き起こすことがあり、変異自体から直接予測することができない、mRNA配列の変化が生じる。例えば、スプライス部位の変異は、エクソンスキッピングを引き起こすことが予想され得るが、その場所のスプライシング機序によってどの下流エクソンが選択されるかを確実に知ることはできない。
1つの実施形態では、本発明は、ネオ抗原ペプチド1~4をコードするオープンリーディングフレーム(ORF)を含むコンカテマーポリエピトープ構築物または個々のエピトープ構築物のセットを含むmRNAワクチンを提供する。
1つの実施形態では、本発明は、患者の腫瘍が上記の変異のいずれを含むかということに基づく、ペプチド1~4を含むか、またはコードするワクチンの選択投与を提供する。
1つの実施形態では、本発明は、1)患者の腫瘍が上記の変異のいずれを含むか、及び2)患者の正常なHLA型が、得られるネオ抗原に結合すると予測される対応HLA対立遺伝子を含むか、という二重の判断基準に基づく、ワクチンの選択投与を提供する。
本明細書に記載のmRNAワクチンは、現在のワクチンと比較していくつかの点で優れていることが発見された。第1に、脂質ナノ粒子(LNP)による送達は、文献に記載のリポソームまたはプロタミンに基づく手法を含む他の製剤より優れており、追加のアジュバントが必要になることはない。LNPを使用すると、化学的に修飾または非修飾のmRNAワクチンを効率的に送達することが可能になる。修飾及び非修飾のLNP製剤化mRNAワクチンは両方共、通常のワクチンより顕著に優れている。いくつかの実施形態では、本発明のmRNAワクチンは、通常のワクチンと比較して、少なくとも10倍、少なくとも20倍、少なくとも40倍、少なくとも50倍、少なくとも100倍、少なくとも500倍、または少なくとも1,000倍優れている。
mRNAワクチン及び自己複製RNAワクチンを含む機能性RNAワクチンを生成するための試みがいくつもなされてきたが、こうしたRNAワクチンの治療効果は、依然として完全には確立されていない。非常に驚くべきことに、抗原産生の増進及び中和能力を有する機能性抗体の産生を含む、顕著に増進しており、多くの点で相乗的な免疫応答を引き起こす、インビボでmRNAワクチンを送達するための製剤クラスを、本発明の態様に従って発明者らは発見した。こうした結果は、脂質に基づく他のクラスの製剤において使用されるmRNA用量と比較して顕著に低い用量のmRNAが投与されるときでさえ達成することができる。本発明の製剤は、予防剤及び治療剤としての機能性mRNAワクチンの効果を確立するために十分な、顕著な免疫応答をインビボで予想外に引き起こすことが示された。さらに、自己複製RNAワクチンでは、細胞に十分なRNAを送達するためにウイルスの複製経路を利用することで免疫応答が生成する。本発明の製剤では、ウイルス複製を必要とすることなく、強力な免疫応答の誘発に十分なタンパク質が産生する。したがって、本発明のmRNAは、自己複製RNAではなく、ウイルス複製に必要な要素を含まない。
いくつかの態様では、本発明は、脂質ナノ粒子(LNP)製剤が、化学的に修飾及び非修飾のmRNAワクチンを含むmRNAワクチンの有効性を顕著に増進するという驚くべき知見を含む。LNPにおいて製剤化されたmRNAワクチンの効果を、異なる腫瘍抗原をいくつか使用してインビボで調べた。免疫応答の増進誘発に加えて、本発明の製剤は、他の試験ワクチンと比較して少ない用量の抗原で、より迅速に免疫応答を生成する。さらに、異なる担体において製剤化されたワクチンと比較して、本発明のmRNA-LNP製剤は、量的かつ質的に優れた免疫応答を生成する。さらに、本発明のmRNA-LNP製剤は、他のワクチンと比較してmRNAの用量が少ないときでさえ、他のワクチンより優れている。
本明細書に記載の試験において使用したLNPは、さまざまな動物モデルならびにヒトにおけるsiRNAの送達に以前に使用されたものである。LNP製剤によるsiRNAの送達と関連して得られた知見を考慮すると、LNPがワクチンにおいて有用であるという事実は非常に驚くべきものである。LNPにおいて製剤化されたsiRNAの治療的な送達では、一過性のIgM応答と関連する望ましくない炎症応答が生じる結果として、典型的には、抗原産生が減少し、免疫応答が損なわれることが観測されている。siRNAで観測された知見とは対照的に、本発明のLNP-mRNA製剤では、一過性のIgM応答ではなく、予防方法及び治療方法に十分となるIgGレベルの増進が生じることが本明細書に示されている。
核酸/ポリヌクレオチド
本明細書で提供される癌ワクチンは、少なくとも1つの癌抗原ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも1つ(1つまたは複数)のリボ核酸(RNA)ポリヌクレオチドを含む。「核酸」という用語は、その最も広い意味では、ヌクレオチドのポリマーを含む任意の化合物及び/または物質を含む。こうしたポリマーは、ポリヌクレオチドと称される。
本明細書で提供される癌ワクチンは、少なくとも1つの癌抗原ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも1つ(1つまたは複数)のリボ核酸(RNA)ポリヌクレオチドを含む。「核酸」という用語は、その最も広い意味では、ヌクレオチドのポリマーを含む任意の化合物及び/または物質を含む。こうしたポリマーは、ポリヌクレオチドと称される。
核酸(ポリヌクレオチドとも称される)は、例えば、リボ核酸(RNA)、デオキシリボ核酸(DNA)、トレオース核酸(TNA)、グリコール核酸(GNA)、ペプチド核酸(PNA)、ロックド核酸(β-D-リボ配置を有するLNA、α-L-リボ配置を有するα-LNA(LNAのジアステレオマー)、2’-アミノ官能化された2’-アミノ-LNA、及び2’-アミノ官能化された2’-アミノ-α-LNAを含むLNA)、エチレン核酸(ENA)、シクロヘキセニル核酸(CeNA)、またはそのキメラもしくは組み合わせであり得るか、またはそれを含み得る。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、メッセンジャーRNA(mRNA)として機能する。「メッセンジャーRNA」(mRNA)は、(少なくとも1つの)ポリペプチド(天然起源のアミノ酸ポリマー、非天然起源のアミノ酸ポリマー、または修飾されたアミノ酸ポリマー)をコードし、翻訳されることで、コードされるポリペプチドをインビトロ、インビボ、インサイチュ、またはエクスビボで生成することができる任意のポリヌクレオチドを指す。
mRNA分子の基本構成要素には、典型的には、少なくとも1つのコード領域、5’非翻訳領域(UTR)、3’UTR、5’キャップ、及びポリA尾部が含まれる。本開示のポリヌクレオチドは、mRNAとして機能し得るが、核酸に基づく治療剤を使用してポリペプチドを効率的に発現させるという現存する問題の克服に役立つ機能的特徴及び/または構造設計特徴をそれが有している点において野生型mRNAとは区別することができる。
いくつかの実施形態では、癌ワクチンのRNAポリヌクレオチドは、2~10、2~9、2~8、2~7、2~6、2~5、2~4、2~3、3~10、3~9、3~8、3~7、3~6、3~5、3~4、4~10、4~9、4~8、4~7、4~6、4~5、5~10、5~9、5~8、5~7、5~6、6~10、6~9、6~8、6~7、7~10、7~9、7~8、8~10、8~9または9~10の抗原ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、癌ワクチンのRNAポリヌクレオチドは、少なくとも10、20、30、40、50、60、70、80、90または100の抗原ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、癌ワクチンのRNAポリヌクレオチドは、少なくとも100または少なくとも200の抗原ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、癌ワクチンのRNAポリヌクレオチドは、1~10、5~15、10~20、15~25、20~30、25~35、30~40、35~45、40~50、55~65、60~70、65~75、70~80、75~85、80~90、85~95、90~100、1~50、1~100、2~50または2~100の抗原ポリペプチドをコードする。
いくつかの実施形態では、癌ワクチンのRNAポリヌクレオチドは、2~10、2~9、2~8、2~7、2~6、2~5、2~4、2~3、3~10、3~9、3~8、3~7、3~6、3~5、3~4、4~10、4~9、4~8、4~7、4~6、4~5、5~10、5~9、5~8、5~7、5~6、6~10、6~9、6~8、6~7、7~10、7~9、7~8、8~10、8~9または9~10の活性化癌遺伝子変異ペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、癌ワクチンのRNAポリヌクレオチドは、少なくとも10、20、30、40、50、60、70、80、90または100の活性化癌遺伝子変異ペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、癌ワクチンのRNAポリヌクレオチドは、少なくとも100または少なくとも200の活性化癌遺伝子変異ペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、癌ワクチンのRNAポリヌクレオチドは、1~10、5~15、10~20、15~25、20~30、25~35、30~40、35~45、40~50、55~65、60~70、65~75、70~80、75~85、80~90、85~95、90~100、1~50、1~100、2~50または2~100の活性化癌遺伝子変異ペプチドをコードする。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、コドンが最適化される。コドンの最適化方法は、当該技術分野において知られており、本明細書で提供されるように使用してよい。いくつかの実施形態では、適切な折り畳みを維持するための、標的のコドン頻度と宿主生物のコドン頻度との整合、mRNAの安定性の向上もしくは二次構造の低減のためのGC含量の偏向化、遺伝子の構築もしくは発現を損ない得るタンデムリピートコドン及び塩基配列の最小化、転写制御領域及び翻訳制御領域のカスタマイズ、タンパク質輸送配列の挿入もしくは除去、コードされるタンパク質における翻訳後修飾部位(例えば、グリコシル化部位)の除去/付加、タンパク質ドメインの付加、除去、もしくはシャッフル、制限酵素部位の挿入もしくは除去、リボソーム結合部位及びmRNA分解部位の修飾、タンパク質のさまざまなドメインの適切な折り畳みを可能にするための翻訳速度の調節、またはポリヌクレオチド内の問題の二次構造の低減もしくは除外、を目的としてコドンの最適化を使用してよい。コドンの最適化するツール、アルゴリズム、及びサービスは、当該技術分野において知られており、例には限定はされないが、GeneArt(Life Technologies)から提供されるサービス、DNA2.0(Menlo Park CA)、及び/または独自の方法が含まれる。いくつかの実施形態では、オープンリーディングフレーム(ORF)配列は、最適化アルゴリズムを使用して最適化される。
いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、天然起源または野生型の配列(例えば、目的とするポリペプチドまたはタンパク質(例えば、抗原性のタンパク質またはポリペプチド)をコードする天然起源または野生型のmRNA配列)と95%未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、天然起源または野生型の配列(例えば、目的とするポリペプチドまたはタンパク質(例えば、抗原性のタンパク質またはポリペプチド)をコードする天然起源または野生型のmRNA配列)と90%未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、天然起源または野生型の配列(例えば、目的とするポリペプチドまたはタンパク質(例えば、抗原性のタンパク質またはポリペプチド)をコードする天然起源または野生型のmRNA配列)と85%未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、天然起源または野生型の配列(例えば、目的とするポリペプチドまたはタンパク質(例えば、抗原性のタンパク質またはポリペプチド)をコードする天然起源または野生型のmRNA配列)と80%未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、天然起源または野生型の配列(例えば、目的とするポリペプチドまたはタンパク質(例えば、抗原性のタンパク質またはポリペプチド)をコードする天然起源または野生型のmRNA配列)と75%未満の配列同一性を共有する。
いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、天然起源または野生型の配列(例えば、目的とするポリペプチドまたはタンパク質(例えば、抗原性のタンパク質またはポリペプチド)をコードする天然起源または野生型のmRNA配列)と65%~85%(例えば、約67%~約85%または約67%~約80%)の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、天然起源または野生型の配列(例えば、目的とするポリペプチドまたはタンパク質(例えば、抗原性のタンパク質またはポリペプチド)をコードする天然起源または野生型のmRNA配列)と65%~75%または約80%の配列同一性を共有する。
いくつかの実施形態では、コドン最適化RNAは、例えば、G/Cのレベルが増強されたものであり得る。核酸分子のG/C含量は、RNAの安定性に影響を与え得る。グアニン(G)残基及び/またはシトシン(C)残基の量が増加したRNAは、アデニン(A)ヌクレオチド及びチミン(T)ヌクレオチドまたはウラシル(U)ヌクレオチドを大量に含む核酸と比較して機能的により安定であり得る。WO02/098443では、翻訳領域の配列改変によって安定化したmRNAを含む医薬組成物が開示されている。遺伝コードは縮重しているため、得られるアミノ酸を変えることなくRNAの安定性向上を促進するコドンで現存コドンを置換することによって改変は機能する。この手法は、RNAのコード領域に限ったものではない。
抗原/抗原ポリペプチド
いくつかの実施形態では、癌ポリペプチド(例えば、活性化癌遺伝子変異ペプチド)は、5アミノ酸より長く、かつ50アミノ酸より短い。いくつかの実施形態では、癌ポリペプチドは、25アミノ酸より長く、かつ50アミノ酸よりも短い。したがって、ポリペプチドには、遺伝子産物、天然起源のポリペプチド、合成ポリペプチド、前述のもののホモログ、オルソログ、パラログ、断片及び他の同等形態、変異体、ならびに類似体が含まれる。ポリペプチドは、単一分子であり得るか、または二量体、三量体、もしくは四量体などの複数分子の複合体であり得る。ポリペプチドには、一本鎖のポリペプチド、または抗体もしくはインスリンなどの複数鎖のポリペプチドも含まれ得、ポリペプチドは、会合し得るか、または連結され得る。最も一般的には、複数鎖のポリペプチドにはジスルフィド結合が見られる。ポリペプチドという用語は、少なくとも1つのアミノ酸残基が、対応する天然起源のアミノ酸の人工的な化学類似体であるアミノ酸ポリマーにも適用され得る。
いくつかの実施形態では、癌ポリペプチド(例えば、活性化癌遺伝子変異ペプチド)は、5アミノ酸より長く、かつ50アミノ酸より短い。いくつかの実施形態では、癌ポリペプチドは、25アミノ酸より長く、かつ50アミノ酸よりも短い。したがって、ポリペプチドには、遺伝子産物、天然起源のポリペプチド、合成ポリペプチド、前述のもののホモログ、オルソログ、パラログ、断片及び他の同等形態、変異体、ならびに類似体が含まれる。ポリペプチドは、単一分子であり得るか、または二量体、三量体、もしくは四量体などの複数分子の複合体であり得る。ポリペプチドには、一本鎖のポリペプチド、または抗体もしくはインスリンなどの複数鎖のポリペプチドも含まれ得、ポリペプチドは、会合し得るか、または連結され得る。最も一般的には、複数鎖のポリペプチドにはジスルフィド結合が見られる。ポリペプチドという用語は、少なくとも1つのアミノ酸残基が、対応する天然起源のアミノ酸の人工的な化学類似体であるアミノ酸ポリマーにも適用され得る。
「ポリペプチド変異体」という用語は、天然配列または参照配列とはそのアミノ酸配列が異なる分子を指す。アミノ酸配列変異体は、天然配列または参照配列と比較して、アミノ酸配列内のある特定の位置に置換、欠失、及び/または挿入を有し得る。通常、変異体は、天然配列または参照配列に対して少なくとも50%の同一性を有する。いくつかの実施形態では、変異体は、天然配列または参照配列と少なくとも80%または少なくとも90%の同一性を共有する。
いくつかの実施形態では、「変異体模倣体」が提供される。本明細書で使用される「変異体模倣体」という用語は、活性化配列を模倣すると想定される少なくとも1つのアミノ酸を含むものである。例えば、グルタメートは、ホスホロ-スレオニン及び/またはホスホロ-セリンの模倣体として働き得る。あるいは、変異体模倣体は、活性を失うか、またはその模倣体を含む不活性化産物となり得るものであり、例えば、フェニルアラニンは、チロシンの不活性化置換として働き得、またはアラニンは、セリンの不活性化置換として働き得る。
「オルソログ」は、種分化によって共通の先祖遺伝子から進化した異なる種の遺伝子を指す。通常、オルソログは、進化の過程において同一の機能を保持する。オルソログの同定は、シークエンシングが新たに実施されたゲノムにおいて信頼できる遺伝子機能予測を実施するために極めて重要である。
「類似体」は、1つまたは複数のアミノ酸の変更によって異なるポリペプチド変異体を含むことが意図され、こうしたアミノ酸の変更は、例えば、親ポリペプチドまたは出発ポリペプチドの特性の1つまたは複数を依然として維持する、アミノ酸残基の置換、付加、または欠失である。
本開示は、変異体及び誘導体を含むポリヌクレオチドまたはポリペプチドに基づくいくつかの型の組成物を提供する。こうしたものには、例えば、置換、挿入、欠失、及び共有結合を有する変異体及び誘導体が含まれる。「誘導体」という用語は、「変異体」という用語と同義的に使用されるが、一般に、参照分子または出発分子と比較して任意の様式で修飾及び/または変更された分子を指す。
したがって、参照配列、具体的には、本明細書に開示のポリペプチド配列に関して置換、挿入、及び/または付加、欠失、ならびに共有結合修飾を含むペプチドまたはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、本開示の範囲内に含まれる。例えば、配列タグまたは1つもしくは複数のリジンなどのアミノ酸を(例えば、N末端またはC末端で)ペプチド配列に付加することができる。配列タグは、ペプチドの検出、精製、または位置決めに使用することができる。リジンは、ペプチドの溶解性の向上またはビオチン標識の実現に使用することができる。あるいは、ペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列のカルボキシ末端領域及びアミノ末端領域に位置するアミノ酸残基を任意選択で欠失させることで切断型配列としてよい。例えば、可溶性のより長い配列の一部としての配列の発現または固形担体に連結されるより長い配列の一部としての配列の発現などの、配列の用途に応じて、ある特定のアミノ酸(例えば、C末端残基またはN末端残基)を代替的に欠失させてよい。
ポリペプチドを指すとき、「置換変異体」は、天然配列または出発配列におけるアミノ酸残基の少なくとも1つが除去され、それが存在した位置と同一の位置に異なるアミノ酸が挿入されたものである。置換は、単一であり得、この場合、分子における1つのアミノ酸のみが置換されており、または置換は、複数であり得、この場合、2つ以上のアミノ酸が同一分子において置換されている。
本明細書で使用される「保存的アミノ酸置換」という用語は、配列に通常存在するアミノ酸と、同様のサイズ、電荷、または極性を有する異なるアミノ酸と、の置換を指す。保存的置換の例には、イソロイシン、バリン、及びロイシンなどの非極性(疎水性)残基と、別の非極性残基との置換が含まれる。同様に、保存的置換の例には、アルギニンとリジンとの置換、グルタミンとアスパラギンとの置換、及びグリシンとセリンとの置換などの、ある極性(親水性)残基と別のものとの置換が含まれる。さらに、リジン、アルギニン、もしくはヒスチジンなどの塩基性残基と別のものとの置換、またはアスパラギン酸もしくはグルタミン酸などの、ある酸性残基と別の酸性残基との置換が保存的置換の追加の例である。非保存的置換の例には、イソロイシン、バリン、ロイシン、アラニン、メチオニンなどの非極性(疎水性)アミノ酸残基と、システイン、グルタミン、グルタミン酸、もしくはリジンなどの極性(親水性)残基と、の置換、及び/または極性残基と非極性残基との置換が含まれる。
ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを指すとき、「特徴」は、それぞれ異なるアミノ酸配列に基づく分子構成要素または異なるヌクレオチドに基づく分子構成要素として定義される。ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの特徴には、表面出現部、局所的な立体構造形状、折り畳み、ループ、ハーフループ、ドメイン、ハーフドメイン、部位、末端、またはそれらの任意の組み合わせが含まれる。
ポリペプチドを指すとき、本明細書で使用される「ドメイン」という用語は、1つまたは複数の同定可能な構造的または機能的な特徴または特性(例えば、タンパク質-タンパク質相互作用のための部位として働く結合能力)を有するポリペプチドのモチーフを指す。
ポリペプチドを指すとき、アミノ酸に基づく実施形態に関して本明細書で使用される「部位」という用語は、「アミノ酸残基」及び「アミノ酸側鎖」と同義的に使用される。ポリヌクレオチドを指すとき、ヌクレオチドに基づく実施形態に関して本明細書で使用される「部位」という用語は、「ヌクレオチド」と同義的に使用される。部位は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに基づく分子内で修飾、操作、改変、誘導体化、または変更され得るペプチド内またはポリペプチド内またはポリヌクレオチド内の位置に相当する。
ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを指すとき、本明細書で使用される「termini(末端)」または「terminus(末端)」という用語は、それぞれポリペプチドまたはポリヌクレオチドの末端を指す。そのような末端は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの最初の部位または最後の部位のみに限定されず、末端領域のアミノ酸またはヌクレオチドを追加で含み得る。ポリペプチドに基づく分子は、N末端(遊離のアミノ基(NH2)を有するアミノ酸によって終結する)とC末端(遊離のカルボキシル基(COOH)を有するアミノ酸によって終結する)との両方を有するものとして特徴付けることができる。場合によっては、タンパク質は、ジスルフィド結合または非共有結合性の力によって共にまとまった複数のポリペプチド鎖から構成される(多量体、オリゴマー)。こうしたタンパク質は、複数のN末端及びC末端を有する。あるいは、ポリペプチドの末端は、修飾され得る結果として、場合によっては、有機複合体などの非ポリペプチドに基づく部分から始まるか、またはそれで終結し得る。
当業者によって認識されるタンパク質断片、機能性タンパク質ドメイン、及び相同タンパク質もまた、目的とするポリペプチドの範囲に含まれると考えられる。例えば、アミノ酸長が5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、または100を超える参照タンパク質の任意のタンパク質断片(参照ポリペプチド配列と比較してアミノ酸残基が少なくとも1つ少ない分短いということ以外は同一であるポリペプチド配列を意味する)が本明細書で提供される。別の例では、本明細書に記載の配列のいずれかに対する同一性が40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、または100%である10、20、30、40、50、または100のアミノ酸のストレッチを含む任意のタンパク質を本開示に従って利用することができる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、本明細書で提供または参照される配列のいずれかに示される変異を2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10、または11以上含む。別の例では、本明細書に記載の配列のいずれかに対する同一性が80%超、90%超、95%超、または100%である20、30、40、50、または100のアミノ酸のストレッチを含む任意のタンパク質であって、本明細書に記載の配列のいずれかに対する同一性が80%未満、75%未満、70%未満、65%未満、または60%未満である5、10、15、20、25、または30のアミノ酸のストレッチを有するタンパク質を本開示に従って利用することができる。
本開示のポリペプチド分子またはポリヌクレオチド分子は、例えば、当該技術分野において説明される分子(例えば、操作もしくは設計された分子または野生型分子)などの参照分子(例えば、参照ポリペプチドまたは参照ポリヌクレオチド)とある程度の配列類似性または配列同一性を共有し得る。当該技術分野において知られる「同一性」という用語は、2つ以上のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの配列間の関連性を指し、こうした関連性は、配列比較によって決定される。当該技術分野では、同一性は、それらの間の配列関連度も意味し、こうした関連度は、2つ以上のアミノ酸残基または核酸残基のストリング間の一致数によって決定される。同一性は、特定の数学モデルまたはコンピュータープログラム(例えば、「アルゴリズム」)によって実行されるアライメントでギャップ(存在する場合)を少なくした2つの配列間の同一一致パーセントの尺度である。関連ペプチドの同一性は、既知の方法によって容易に計算することができる。ポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列に適用される「同一性%」は、最大同一性パーセントを達成するために配列のアライメント及び必要であればギャップの導入が実施された後に、候補アミノ酸配列または候補核酸配列における残基(アミノ酸残基または核酸残基)が、第2の配列のアミノ酸配列または核酸配列における残基と同一である割合として定義される。アライメントを目的とする方法及びコンピュータープログラムは、当該技術分野においてよく知られている。同一性は、同一性パーセントの計算に依存するが、計算で導入されるギャップ及びペナルティに起因して値が変わり得ると理解される。一般に、特定のリヌクレオチドまたはポリペプチドの変異体は、特定の参照ポリヌクレオチドまたは参照ポリペプチドに対して、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%であるが100%未満の配列同一性を有し、こうした配列同一性は、本明細書に記載及び当業者に知られる配列アライメントのプログラム及びパラメーターによって決定される。そのようなアライメントツールには、BLASTスイートのもの(Stephen F.Altschul,et al(1997),“Gapped BLAST and PSI-BLAST:a new generation of protein database search programs”,Nucleic Acids Res.25:3389-3402)が含まれる。別の一般的な局所アライメント技術は、Smith-Watermanアルゴリズム(Smith,T.F.& Waterman,M.S.(1981)“Identification of common molecular subsequences.”J.Mol.Biol.147:195-197)に基づくものである。動的プログラミングに基づく一般的なグローバルアライメント技術は、Needleman-Wunschアルゴリズム(Needleman,S.B.& Wunsch,C.D.(1970)“A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequences of two proteins.”J.Mol.Biol.48:443-453.)である。Needleman-Wunschアルゴリズムを含む他の最適グローバルアライメント方法と比較してヌクレオチド配列及びタンパク質配列のグローバルアライメントを高速で実施するとされる高速最適グローバル配列アライメントアルゴリズム(FOGSAA)がごく最近開発された。ツールは、本明細書で他にも記載され、特に、下記の「同一性」の定義に記載される。
本明細書に記載の「相同性」という用語は、例えば、核酸分子(例えば、DNA分子及び/またはRNA分子)及び/またはポリペプチド分子などのポリマー分子の間の全体的な関連性を指す。残基の一致を見出すアライメントによって決定される類似性または同一性を許容限界レベルで共有するポリマー分子(例えば、核酸分子(例えば、DNA分子及び/またはRNA分子)及び/またはポリペプチド分子)は、相同的であると呼ばれる。相同性は、分子間の関連性を説明する定性的な用語であり、定量的な類似性または同一性に基づくことができる。類似性または同一性は、2つの比較配列の間の配列一致度を定義する定量的な用語である。いくつかの実施形態では、ポリマー分子は、それらの配列が少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも99%同一または類似しているのであれば、互いに「相同的」であると考えられる。「相同的」という用語は、必然的に、少なくとも2つの配列(ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列)の間の比較を指す。2つのポリヌクレオチド配列がコードするポリペプチドが、少なくとも20のアミノ酸を含む少なくとも1つのストレッチについて、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、または99%でさえも同一であるならば、2つのポリヌクレオチド配列は相同的であると考えられる。いくつかの実施形態では、相同的ポリヌクレオチド配列は、一意的に特定されたアミノ酸を少なくとも4~5つ含むストレッチをコードする能力によって特徴付けられる。ヌクレオチド長が60未満のポリヌクレオチド配列については、相同性は、一意的に特定されたアミノ酸を少なくとも4~5つ含むストレッチをコードする能力によって決定される。少なくとも20のアミノ酸を含む少なくとも1つのストレッチについて、タンパク質が少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、または少なくとも90%同一であるならば、2つのタンパク質配列は、相同的であると考えられる。
相同性は、比較される配列が共通の起源からの進化において分岐したことを暗示する。「ホモログ」という用語は、共通の祖先配列に由来する系統によって第2のアミノ酸配列または核酸配列と関連する第1のアミノ酸配列または核酸配列(例えば、遺伝子(DNAもしくはRNA)配列またはタンパク質配列)を指す。「ホモログ」という用語は、種分化の事象によって別れた遺伝子及び/またはタンパク質の間の関連性、または遺伝子重複の事象によって別れた遺伝子及び/またはタンパク質の間の関連性にも適用され得る。「オルソログ」は、種分化によって共通の先祖遺伝子(またはタンパク質)から進化した異なる種の遺伝子(またはタンパク質)である。典型的には、オルソログは、進化の過程において同一の機能を保持する。「パラログ」は、ゲノム内での重複によって関連する遺伝子(またはタンパク質)である。オルソログは、進化の過程において同一の機能を保持する一方で、パラログは、例え起源のものとの関連性が存在するとしても、新しい機能を発達させる。
「同一性」という用語は、例えば、ポリヌクレオチド分子(例えば、DNA分子及び/またはRNA分子)及び/またはポリペプチド分子などのポリマー分子の間の全体的な関連性を指す。2つのポリ核酸配列の同一性パーセントの計算は、例えば、比較の最適化を目的として2つの配列のアライメントをとることによって実施することができる(例えば、アライメントが最適化するように第1の核酸配列及び第2の核酸配列の1つまたは両方にギャップを導入することができ、比較を目的として同一でない配列は無視することができる)。ある特定の実施形態では、比較を目的としてアライメントされる配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、または100%である。続いて、対応するヌクレオチド位置でヌクレオチドが比較される。第1の配列における位置が、第2の配列において対応する位置のものと同一のヌクレオチドによって占有されているとき、分子はその位置で同一である。2つの配列間の同一性パーセントは、2つの配列のアライメントが最適化するように導入する必要があるギャップの数及びそれぞれのギャップの長さを考慮すると、配列が共有する同一位置の数の関数となる。2つの配列間の配列比較及び同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。例えば、Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.,ed.,Oxford University Press,New York,1988、Biocomputing:Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.,ed.,Academic Press,New York,1993、Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,Academic Press,1987、Computer Analysis of Sequence Data,Part I,Griffin,A.M.,and Griffin,H.G.,eds.,Humana Press,New Jersey,1994、及びSequence Analysis Primer,Gribskov,M.and Devereux,J.,eds.,M Stockton Press,New York,1991に記載されるものなどの方法を使用して2つの核酸配列の間の同一性パーセントを決定することができ、これらの文献はそれぞれ、参照によって本明細書に組み込まれる。例えば、2つの核酸配列の間の同一性パーセントは、Meyers and Miller(CABIOS,1989,4:11-17)のアルゴリズムを使用して決定することができ、このアルゴリズムは、ALIGNプログラム(バージョン2.0)に組み込まれており、PAM120加重残基表、12のギャップ長ペナルティ、及び4のギャップペナルティが使用される。あるいは、2つの核酸配列の間の同一性パーセントは、NWSgapdna.CMPマトリックスを使用し、GCGソフトウェアパッケージのGAPプログラムを使用して決定することができる。配列間の同一性パーセントを決定するために一般に用いられる方法には、限定はされないが、Carillo,H.,and Lipman,D.,SIAM J Applied Math.,48:1073(1988)に開示されるものが含まれ、当該文献は、参照によって本明細書に組み込まれる。同一性の決定技術は、公的に利用可能なコンピュータープログラムに組み込まれている。2つの配列間の相同性を決定するためのコンピューターソフトウェアの例には、限定はされないが、GCGプログラムパッケージ、Devereux,J.,et al.,Nucleic Acids Research,12(1),387(1984))、BLASTP、BLASTN、及びFASTA Altschul,S.F.et al.,J.Molec.Biol.,215,403(1990))が含まれる。
化学修飾
エピトープ抗原ポリペプチドをコードする修飾ヌクレオチド配列
いくつかの実施形態では、本開示のRNA(例えば、mRNA)ワクチンは、少なくとも1つの呼吸器多核体ウイルス(RSV)抗原ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも1つのリボ核酸(RNA)ポリヌクレオチドを含み、上記RNAは、少なくとも1つの化学修飾を含む。
エピトープ抗原ポリペプチドをコードする修飾ヌクレオチド配列
いくつかの実施形態では、本開示のRNA(例えば、mRNA)ワクチンは、少なくとも1つの呼吸器多核体ウイルス(RSV)抗原ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも1つのリボ核酸(RNA)ポリヌクレオチドを含み、上記RNAは、少なくとも1つの化学修飾を含む。
「化学修飾」及び「化学的に修飾された」という用語は、アデノシン(A)、グアノシン(G)、ウリジン(U)、チミジン(T)、またはシチジン(C)を含むリボヌクレオシドまたはデオキシリボヌクレオシドに関する、その位置、パターン、パーセント、または集団の少なくとも1つにおける修飾を指す。一般に、こうした用語は、mRNAの5’末端に天然に生じるキャップ部分におけるリボヌクレオチド修飾は指さない。
ポリヌクレオチドの修飾には、限定はされないが、本明細書に記載のものが含まれ、明確に限定されるわけではないが、化学修飾を含む修飾が含まれる。ポリヌクレオチド(例えば、mRNAポリヌクレオチドなどのRNAポリヌクレオチド)は、天然起源、非天然起源の修飾を含み得るか、またはポリヌクレオチドは、天然起源の修飾と非天然起源の修飾とを組み合わせて含み得る。ポリヌクレオチドは、例えば、糖、核酸塩基、またはヌクレオシド間結合の任意の有用な修飾(例えば、連結ホスフェート、ホスホジエステル結合、またはホスホジエステル骨格に対するもの)を含み得る。
ポリペプチドに関する「修飾」という用語は、標準セットの20のアミノ酸に対する修飾を指す。本明細書で提供されるポリペプチドは、それがアミノ酸の置換、挿入、または置換と挿入との組み合わせを含むこともまた、「修飾された」と考えられる。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド(例えば、mRNAポリヌクレオチドなどのRNAポリヌクレオチド)は、さまざまな(複数の)異なる修飾を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの特定領域は、1つ、2つ、またはそれを超える数の(任意選択で異なる)ヌクレオシド修飾またはヌクレオチド修飾を含む。いくつかの実施形態では、細胞または生物に導入される修飾RNAポリヌクレオチド(例えば、修飾mRNAポリヌクレオチド)は、非修飾ポリヌクレオチドと比較して、それぞれ細胞または生物における分解の低減を示す。いくつかの実施形態では、細胞または生物に導入される修飾RNAポリヌクレオチド(例えば、修飾mRNAポリヌクレオチド)は、それぞれ細胞または生物における免疫原性の低減(例えば、自然応答の低減)を示し得る。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド(例えば、mRNAポリヌクレオチドなどのRNAポリヌクレオチド)は、所望の機能または特性を達成するためにポリヌクレオチドの合成中または合成後に導入される非天然の修飾ヌクレオチドを含む。修飾は、ヌクレオチド間結合、プリン塩基もしくはピリミジン塩基、または糖に存在し得る。修飾は、鎖の末端または鎖の他の任意の場所に化学合成またはポリメラーゼ酵素を用いて導入してよい。ポリヌクレオチドの領域はいずれも、化学的に修飾してよい。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、化学的に修飾された核酸塩基を含む。本発明は、本明細書に記載のポリヌクレオチド(例えば、1つまたは複数の癌エピトープポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)を含む、修飾ポリヌクレオチドを含む。修飾ポリヌクレオチドは、化学的に修飾され得、及び/または構造的に修飾され得る。本発明のポリヌクレオチドが化学的及び/または構造的に修飾されている場合、当該ポリヌクレオチドは、「修飾ポリヌクレオチド」と称され得る。
本開示は、1つまたは複数の癌エピトープポリペプチドをコードする修飾されたヌクレオシド及びヌクレオチドのポリヌクレオチド(例えば、mRNAポリヌクレオチドなどのRNAポリヌクレオチド)を提供する。「ヌクレオシド」は、有機塩基(例えば、プリンもしくはピリミジン)またはその誘導体(本明細書では「核酸塩基」とも称される)と組み合わせて糖分子(例えば、ペントースもしくはリボース)またはその誘導体を含む化合物を指す。「ヌクレオチド」は、ホスフェート基を含むヌクレオシドを指す。修飾ヌクレオチドは、1つまたは複数の修飾または非天然のヌクレオシドを含めるための、例えば、化学的、酵素的、または組換え的なものなどの任意の有用な方法によって合成することができる。ポリヌクレオチドは、ヌクレオシドが連結された領域を1つまたは複数含み得る。そのような領域は、さまざまな骨格結合を有し得る。結合は、標準的なホスホジエステル結合であり得、この場合、ポリヌクレオチドはヌクレオチドの領域を含むと想定される。
本明細書に開示の修飾ポリヌクレオチドは、さまざまな異なる修飾を含み得る。いくつかの実施形態では、修飾ポリヌクレオチドは、1つ、2つ、またはそれを超える数の(任意選択で異なる)ヌクレオシドまたはヌクレオチド修飾を含有する。いくつかの実施形態では、細胞に導入される修飾ポリヌクレオチドは、非修飾ポリヌクレオチドと比較して、1つまたは複数の所望の特性、例えば、タンパク質発現の改善、免疫原性の低下、または細胞における分解の低減を示し得る。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド(例えば、1つまたは複数の癌エピトープポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)は、構造的に修飾される。本明細書で使用されるとき、「構造的」修飾は、ヌクレオチド自体に有意な化学修飾を行うことなく、2つ以上の連結されたヌクレオシドが、ポリヌクレオチドにおいて、挿入、欠失、複製、反転またはランダム化される修飾である。構造的修飾をもたらすために化学結合が必然的に破壊され再構築されるので、構造的修飾は、化学的性質のものであり、したがって、化学的修飾である。しかしながら、構造的修飾により、異なるヌクレオチド配列になる。例えば、ポリヌクレオチド「ATCG」は、「AT-5meC-G」に化学的に修飾され得る。同じポリヌクレオチドを「ATCG」から「ATCCCG」に構造的に修飾することができる。この場合、ジヌクレオチド「CC」が挿入された結果として、ポリヌクレオチドに構造的修飾が生じている。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、化学的に修飾される。ポリヌクレオチドに関して本明細書で使用されるとき、「化学修飾」または適宜「化学的に修飾された」という用語は、アデノシン(A)、グアノシン(G)、ウリジン(U)、またはシチジン(C)を含むリボヌクレオシドまたはデオキシリボヌクレオシドに関する、その位置、パターン、パーセントまたは集団の1つまたは複数における修飾を指す。一般に、本明細書では、こうした用語は、mRNAの5’末端に天然に生じるキャップ部分におけるリボヌクレオチド修飾を指すことは意図されない。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、同じヌクレオシド型のすべてもしくはいずれかの一様な化学修飾、または同じヌクレオシド型のすべてもしくはいずれかにおける同じ出発修飾の単純な下方滴定によって産生される修飾の集団、またはランダム組み込みを有する同じヌクレオシド型のすべての任意の化学修飾(すべてのウリジンがウリジン類似体、例えば、シュードウリジンまたは5-メトキシウリジンによって置き換えられる場合など)の測定パーセントを有し得る。別の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド全体を通して2つ、3つ、または4つの同じヌクレオシド型が一様な化学修飾を有し得る(例えば、すべてのウリジン及びすべてのシトシンなどが同じように修飾される)。
修飾ヌクレオチド塩基対形成は、標準的なアデノシン-チミン、アデノシン-ウラシル、またはグアノシン-シトシンという塩基対だけでなく、非標準塩基または修飾塩基を含むヌクレオチド及び/または修飾ヌクレオチドの間に形成される塩基対も包含し、水素結合ドナーと水素結合アクセプターとの配置によって、非標準塩基と標準塩基との間での水素結合、または例えば少なくとも1つの化学修飾を有するポリヌクレオチドなどにおける2つの相補的非標準塩基構造の間での水素結合が可能になる。非標準塩基のそのような対形成の例の1つは、修飾ヌクレオチドであるイノシンと、アデニン、シトシン、またはウラシルとの間の塩基対形成である。塩基/糖またはリンカーの任意の組み合わせを本開示のポリヌクレオチドに組み込んでよい。
当業者であれば、特に記載しない限り、本出願に記載のポリヌクレオチド配列は、代表的なDNA配列において「T」を列挙しているが、その配列がRNAを表す場合には、「T」は、「U」に置き換えられることを認識するであろう。
本開示の組成物、方法、及び合成プロセスにおいて有用な、限定はされないが、化学修飾を含む、ポリヌクレオチド(例えば、mRNAポリヌクレオチドなどのRNAポリヌクレオチド)の修飾には、限定はされないが、下記のものが含まれる:一様なヌクレオチド、ヌクレオシド、及び核酸塩基:2-メチルチオ-N6-(シス-ヒドロキシイソペンテニル)アデノシン、2-メチルチオ-N6-メチルアデノシン、2-メチルチオ-N6-スレオニルカルバモイルアデノシン、N6-グリシニルカルバモイルアデノシン、N6-イソペンテニルアデノシン、N6-メチルアデノシン、N6-スレオニルカルバモイルアデノシン、1,2’-O-ジメチルアデノシン、1-メチルアデノシン、2’-O-メチルアデノシン、2’-O-リボシルアデノシン(ホスフェート)、2-メチルアデノシン、2-メチルチオ-N6イソペンテニルアデノシン、2-メチルチオ-N6-ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン、2’-O-メチルアデノシン、2’-O-リボシルアデノシン(ホスフェート)、イソペンテニルアデノシン、N6-(シス-ヒドロキシイソペンテニル)アデノシン、N6,2’-O-ジメチルアデノシン、N6,2’-O-ジメチルアデノシン、N6,N6,2’-O-トリメチルアデノシン、N6,N6-ジメチルアデノシン、N6-アセチルアデノシン、N6-ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン、N6-メチル-N6-スレオニルカルバモイルアデノシン、2-メチルアデノシン、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデノシン、7-デアザ-アデノシン、N1-メチル-アデノシン、N6,N6(ジメチル)アデニン、N6-シス-ヒドロキシ-イソペンテニル-アデノシン、α-チオ-アデノシン、2(アミノ)アデニン、2(アミノプロピル)アデニン、2(メチルチオ)N6(イソペンテニル)アデニン、2-(アルキル)アデニン、2-(アミノアルキル)アデニン、2-(アミノプロピル)アデニン、2-(ハロ)アデニン、2-(ハロ)アデニン、2-(プロピル)アデニン、2’-アミノ-2’-デオキシ-ATP、2’-アジド-2’-デオキシ-ATP、2’-デオキシ-2’-a-アミノアデノシンTP、2’-デオキシ-2’-a-アジドアデノシンTP、6(アルキル)アデニン、6(メチル)アデニン、6-(アルキル)アデニン、6-(メチル)アデニン、7(デアザ)アデニン、8(アルケニル)アデニン、8(アルキニル)アデニン、8(アミノ)アデニン、8(チオアルキル)アデニン、8-(アルケニル)アデニン、8-(アルキル)アデニン、8-(アルキニル)アデニン、8-(アミノ)アデニン、8-(ハロ)アデニン、8-(ヒドロキシル)アデニン、8-(チオアルキル)アデニン、8-(チオール)アデニン、8-アジド-アデノシン、アザアデニン、デアザアデニン、N6(メチル)アデニン、N6-(イソペンチル)アデニン、7-デアザ-8-アザ-アデノシン、7-メチルアデニン、1-デアザアデノシンTP、2’フルオロ-N6-Bz-デオキシアデノシンTP、2’-OMe-2-アミノ-ATP、2’O-メチル-N6-Bz-デオキシアデノシンTP、2’-a-エチニルアデノシンTP、2-アミノアデニン、2-アミノアデノシンTP、2-アミノ-ATP、2’-a-トリフルオロメチルアデノシンTP、2-アジドアデノシンTP、2’-b-エチニルアデノシンTP、2-ブロモアデノシンTP、2’-b-トリフルオロメチルアデノシンTP、2-クロロアデノシンTP、2’-デオキシ-2’,2’-ジフルオロアデノシンTP、2’-デオキシ-2’-a-メルカプトアデノシンTP、2’-デオキシ-2’-a-チオメトキシアデノシンTP、2’-デオキシ-2’-b-アミノアデノシンTP、2’-デオキシ-2’-b-アジドアデノシンTP、2’-デオキシ-2’-b-ブロモアデノシンTP、2’-デオキシ-2’-b-クロロアデノシンTP、2’-デオキシ-2’-b-フルオロアデノシンTP、2’-デオキシ-2’-b-ヨードアデノシンTP、2’-デオキシ-2’-b-メルカプトアデノシンTP、2’-デオキシ-2’-b-チオメトキシアデノシンTP、2-フルオロアデノシンTP、2-ヨードアデノシンTP、2-メルカプトアデノシンTP、2-メトキシ-アデニン、2-メチルチオ-アデニン、2-トリフルオロメチルアデノシンTP、3-デアザ-3-ブロモアデノシンTP、3-デアザ-3-クロロアデノシンTP、3-デアザ-3-フルオロアデノシンTP、3-デアザ-3-ヨードアデノシンTP、3-デアザアデノシンTP、4’-アジドアデノシンTP、4’-炭素環式アデノシンTP、4’-エチニルアデノシンTP、5’-ホモ-アデノシンTP、8-アザ-ATP、8-ブロモ-アデノシンTP、8-トリフルオロメチルアデノシンTP、9-デアザアデノシンTP、2-アミノプリン、7-デアザ-2,6-ジアミノプリン、7-デアザ-8-アザ-2,6-ジアミノプリン、7-デアザ-8-アザ-2-アミノプリン、2,6-ジアミノプリン、7-デアザ-8-アザ-アデニン,7-デアザ-2-アミノプリン、2-チオシチジン、3-メチルシチジン、5-ホルミルシチジン、5-ヒドロキシメチルシチジン、5-メチルシチジン、N4-アセチルシチジン、2’-O-メチルシチジン、2’-O-メチルシチジン、5,2’-O-ジメチルシチジン、5-ホルミル-2’-O-メチルシチジン、ライシジン、N4,2’-O-ジメチルシチジン、N4-アセチル-2’-O-メチルシチジン、N4-メチルシチジン、N4,N4-ジメチル-2’-OMe-シチジンTP、4-メチルシチジン、5-アザ-シチジン、シュード-イソ-シチジン、ピロロ-シチジン、α-チオ-シチジン、2-(チオ)シトシン、2’-アミノ-2’-デオキシ-CTP、2’-アジド-2’-デオキシ-CTP、2’-デオキシ-2’-a-アミノシチジンTP、2’-デオキシ-2’-a-アジドシチジンTP、3(デアザ)5(アザ)シトシン、3(メチル)シトシン、3-(アルキル)シトシン、3-(デアザ)5(アザ)シトシン、3-(メチル)シチジン、4,2’-O-ジメチルシチジン、5(ハロ)シトシン、5(メチル)シトシン、5(プロピニル)シトシン、5(トリフルオロメチル)シトシン、5-(アルキル)シトシン、5-(アルキニル)シトシン、5-(ハロ)シトシン、5-(プロピニル)シトシン、5-(トリフルオロメチル)シトシン、5-ブロモ-シチジン、5-ヨード-シチジン、5-プロピニルシトシン、6-(アゾ)シトシン、6-アザ-シチジン、アザシトシン、デアザシトシン、N4(アセチル)シトシン、1-メチル-1-デアザ-シュードイソシチジン、1-メチル-シュードイソシチジン、2-メトキシ-5-メチル-シチジン、2-メトキシ-シチジン、2-チオ-5-メチル-シチジン、4-メトキシ-1-メチル-シュードイソシチジン、4-メトキシ-シュードイソシチジン、4-チオ-1-メチル-1-デアザ-シュードイソシチジン、4-チオ-1-メチル-シュードイソシチジン、4-チオ-シュードイソシチジン、5-アザ-ゼブラリン、5-メチル-ゼブラリン、ピロロ-シュードイソシチジン、ゼブラリン、(E)-5-(2-ブロモ-ビニル)シチジンTP、2,2’-アンヒドロ-シチジンTP塩酸塩、2’フルオロ-N4-Bz-シチジンTP、2’フルオロ-N4-アセチル-シチジンTP、2’-O-メチル-N4-アセチル-シチジンTP、2’O-メチル-N4-Bz-シチジンTP、2’-a-エチニルシチジンTP、2’-a-トリフルオロメチルシチジンTP、2’-b-エチニルシチジンTP、2’-b-トリフルオロメチルシチジンTP、2’-デオキシ-2’,2’-ジフルオロシチジンTP、2’-デオキシ-2’-a-メルカプトシチジンTP、2’-デオキシ-2’-a-チオメトキシシチジンTP、2’-デオキシ-2’-b-アミノシチジンTP、2’-デオキシ-2’-b-アジドシチジンTP、2’-デオキシ-2’-b-ブロモシチジンTP、2’-デオキシ-2’-b-クロロシチジンTP、2’-デオキシ-2’-b-フルオロシチジンTP、2’-デオキシ-2’-b-ヨードシチジンTP、2’-デオキシ-2’-b-メルカプトシチジンTP、2’-デオキシ-2’-b-チオメトキシシチジンTP、2’-O-メチル-5-(1-プロピニル)シチジンTP、3’-エチニルシチジンTP、4’-アジドシチジンTP、4’-炭素環式シチジンTP、4’-エチニルシチジンTP、5-(1-プロピニル)アラ-シチジンTP、5-(2-クロロ-フェニル)-2-チオシチジンTP、5-(4-アミノ-フェニル)-2-チオシチジンTP、5-アミノアリル-CTP、5-シアノシチジンTP、5-エチニルアラ(Ethynylara)-シチジンTP、5-エチニルシチジンTP、5’-ホモ-シチジンTP、5-メトキシシチジンTP、5-トリフルオロメチル-シチジンTP、N4-アミノ-シチジンTP、N4-ベンゾイル-シチジンTP、シュードイソシチジン、7-メチルグアノシン、N2,2’-O-ジメチルグアノシン、N2-メチルグアノシン、ワイオシン、1,2’-O-ジメチルグアノシン、1-メチルグアノシン、2’-O-メチルグアノシン、2’-O-リボシルグアノシン(ホスフェート)、2’-O-メチルグアノシン、2’-O-リボシルグアノシン(ホスフェート)、7-アミノメチル-7-デアザグアノシン、7-シアノ-7-デアザグアノシン、アルカエオシン、メチルワイオシン、N2,7-ジメチルグアノシン、N2,N2,2’-O-トリメチルグアノシン、N2,N2,7-トリメチルグアノシン、N2,N2-ジメチルグアノシン、N2,7,2’-O-トリメチルグアノシン、6-チオ-グアノシン、7-デアザ-グアノシン、8-オキソ-グアノシン、N1-メチル-グアノシン、α-チオ-グアノシン、2(プロピル)グアニン、2-(アルキル)グアニン、2’-アミノ-2’-デオキシ-GTP、2’-アジド-2’-デオキシ-GTP、2’-デオキシ-2’-a-アミノグアノシンTP、2’-デオキシ-2’-a-アジドグアノシンTP、6(メチル)グアニン、6-(アルキル)グアニン、6-(メチル)グアニン、6-メチル-グアノシン、7(アルキル)グアニン、7(デアザ)グアニン、7(メチル)グアニン、7-(アルキル)グアニン、7-(デアザ)グアニン、7-(メチル)グアニン、8(アルキル)グアニン、8(アルキニル)グアニン、8(ハロ)グアニン、8(チオアルキル)グアニン、8-(アルケニル)グアニン、8-(アルキル)グアニン、8-(アルキニル)グアニン、8-(アミノ)グアニン、8-(ハロ)グアニン、8-(ヒドロキシル)グアニン、8-(チオアルキル)グアニン、8-(チオール)グアニン、アザグアニン、デアザグアニン、N(メチル)グアニン、N-(メチル)グアニン、1-メチル-6-チオ-グアノシン、6-メトキシ-グアノシン、6-チオ-7-デアザ-8-アザ-グアノシン、6-チオ-7-デアザ-グアノシン、6-チオ-7-メチル-グアノシン、7-デアザ-8-アザ-グアノシン、7-メチル-8-オキソ-グアノシン、N2,N2-ジメチル-6-チオ-グアノシン、N2-メチル-6-チオ-グアノシン、1-Me-GTP、2’フルオロ-N2-イソブチル-グアノシンTP、2’O-メチル-N2-イソブチル-グアノシンTP、2’-a-エチニルグアノシンTP、2’-a-トリフルオロメチルグアノシンTP、2’-b-エチニルグアノシンTP、2’-b-トリフルオロメチルグアノシンTP、2’-デオキシ-2’,2’-ジフルオログアノシンTP、2’-デオキシ-2’-a-メルカプトグアノシンTP、2’-デオキシ-2’-a-チオメトキシグアノシンTP、2’-デオキシ-2’-b-アミノグアノシンTP、2’-デオキシ-2’-b-アジドグアノシンTP、2’-デオキシ-2’-b-ブロモグアノシンTP、2’-デオキシ-2’-b-クロログアノシンTP、2’-デオキシ-2’-b-フルオログアノシンTP、2’-デオキシ-2’
-b-ヨードグアノシンTP、2’-デオキシ-2’-b-メルカプトグアノシンTP、2’-デオキシ-2’-b-チオメトキシグアノシンTP、4’-アジドグアノシンTP、4’-炭素環式グアノシンTP、4’-エチニルグアノシンTP、5’-ホモ-グアノシンTP、8-ブロモ-グアノシンTP、9-デアザグアノシンTP、N2-イソブチル-グアノシンTP、1-メチルイノシン、イノシン、1,2’-O-ジメチルイノシン、2’-O-メチルイノシン、7-メチルイノシン、2’-O-メチルイノシン、エポキシキューオシン、ガラクトシル-キューオシン、マンノシルキューオシン、キューオシン、アリアミノ(allyアミノ)-チミジン、アザチミジン、デアザチミジン、デオキシ-チミジン、2’-O-メチルウリジン、2-チオウリジン、3-メチルウリジン、5-カルボキシメチルウリジン、5-ヒドロキシウリジン、5-メチルウリジン、5-タウリノメチル-2-チオウリジン、5-タウリノメチルウリジン、ジヒドロウリジン、シュードウリジン、(3-(3-アミノ-3-カルボキシプロピル)ウリジン、1-メチル-3-(3-アミノ-5-カルボキシプロピル)シュードウリジン、1-メチルシュードウリジン、1-エチル-シュードウリジン、2’-O-メチルウリジン、2’-O-メチルシュードウリジン、2’-O-メチルウリジン、2-チオ-2’-O-メチルウリジン、3-(3-アミノ-3-カルボキシプロピル)ウリジン、3,2’-O-ジメチルウリジン、3-メチル-シュード-ウリジンTP、4-チオウリジン、5-(カルボキシヒドロキシメチル)ウリジン、5-(カルボキシヒドロキシメチル)ウリジンメチルエステル、5,2’-O-ジメチルウリジン、5,6-ジヒドロ-ウリジン、5-アミノメチル-2-チオウリジン、5-カルバモイルメチル-2’-O-メチルウリジン、5-カルバモイルメチルウリジン、5-カルボキシヒドロキシメチルウリジン、5-カルボキシヒドロキシメチルウリジンメチルエステル、5-カルボキシメチルアミノメチル-2’-O-メチルウリジン、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン、5-カルボキシメチルアミノメチルウリジン、5-カルボキシメチルアミノメチルウリジン、5-カルバモイルメチルウリジンTP、5-メトキシカルボニルメチル-2’-O-メチルウリジン、5-メトキシカルボニルメチル-2-チオウリジン、5-メトキシカルボニルメチルウリジン、5-メチルウリジン、)、5-メトキシウリジン、5-メチル-2-チオウリジン、5-メチルアミノメチル-2-セレノウリジン、5-メチルアミノメチル-2-チオウリジン、5-メチルアミノメチルウリジン、5-メチルジヒドロウリジン、5-オキシ酢酸-ウリジンTP、5-オキシ酢酸-メチルエステル-ウリジンTP、N1-メチル-シュード-ウラシル、N1-エチル-シュード-ウラシル、ウリジン5-オキシ酢酸、ウリジン5-オキシ酢酸メチルエステル、3-(3-アミノ-3-カルボキシプロピル)-ウリジンTP、5-(イソ-ペンテニルアミノメチル)-2-チオウリジンTP、5-(イソ-ペンテニルアミノメチル)-2’-O-メチルウリジンTP、5-(イソ-ペンテニルアミノメチル)ウリジンTP、5-プロピニルウラシル、α-チオ-ウリジン、1(アミノアルキルアミノ-カルボニルエチレニル)-2(チオ)-シュードウラシル、1(アミノアルキルアミノカルボニルエチレニル)-2,4-(ジチオ)シュードウラシル、1(アミノアルキルアミノカルボニルエチレニル)-4(チオ)シュードウラシル、1(アミノアルキルアミノカルボニルエチレニル)-シュードウラシル、1(アミノカルボニルエチレニル)-2(チオ)-シュードウラシル、1(アミノカルボニルエチレニル)-2,4-(ジチオ)シュードウラシル、1(アミノカルボニルエチレニル)-4(チオ)シュードウラシル、1(アミノカルボニルエチレニル)-シュードウラシル、1置換2(チオ)-シュードウラシル、1置換2,4-(ジチオ)シュードウラシル、1置換4(チオ)シュードウラシル、1置換シュードウラシル、1-(アミノアルキルアミノ-カルボニルエチレニル)-2-(チオ)-シュードウラシル、1-メチル-3-(3-アミノ-3-カルボキシプロピル)シュードウリジンTP、1-メチル-3-(3-アミノ-3-カルボキシプロピル)シュード-UTP、1-メチル-シュード-UTP、1-エチル-シュード-UTP、2(チオ)シュードウラシル、2’デオキシウリジン、2’フルオロウリジン、2-(チオ)ウラシル、2,4-(ジチオ)シュードウラシル、2’メチル、2’アミノ、2’アジド、2’フルロ-グアノシン、2’-アミノ-2’-デオキシ-UTP、2’-アジド-2’-デオキシ-UTP、2’-アジド-デオキシウリジンTP、2’-O-メチルシュードウリジン、2’デオキシウリジン、2’フルオロウリジン、2’-デオキシ-2’-a-アミノウリジンTP、2’-デオキシ-2’-a-アジドウリジンTP、2-メチルシュードウリジン、3(3アミノ-3カルボキシプロピル)ウラシル、4(チオ)シュードウラシル、4-(チオ)シュードウラシル、4-(チオ)ウラシル、4-チオウラシル、5(1,3-ジアゾール-1-アルキル)ウラシル、5(2-アミノプロピル)ウラシル、5(アミノアルキル)ウラシル、5(ジメチルアミノアルキル)ウラシル、5(グアニジニウムアルキル)ウラシル、5(メトキシカルボニルメチル)-2-(チオ)ウラシル、5(メトキシカルボニル-メチル)ウラシル、5(メチル)2(チオ)ウラシル、5(メチル)2,4(ジチオ)ウラシル、5(メチル)4(チオ)ウラシル、5(メチルアミノメチル)-2(チオ)ウラシル、5(メチルアミノメチル)-2,4(ジチオ)ウラシル、5(メチルアミノメチル)-4(チオ)ウラシル、5(プロピニル)ウラシル、5(トリフルオロメチル)ウラシル、5-(2-アミノプロピル)ウラシル、5-(アルキル)-2-(チオ)シュードウラシル、5-(アルキル)-2,4(ジチオ)シュードウラシル、5-(アルキル)-4(チオ)シュードウラシル、5-(アルキル)シュードウラシル、5-(アルキル)ウラシル、5-(アルキニル)ウラシル、5-(アリルアミノ)ウラシル、5-(シアノアルキル)ウラシル、5-(ジアルキルアミノアルキル)ウラシル、5-(ジメチルアミノアルキル)ウラシル、5-(グアニジニウムアルキル)ウラシル、5-(ハロ)ウラシル、5-(1,3-ジアゾール-1-アルキル)ウラシル、5-(メトキシ)ウラシル、5-(メトキシカルボニルメチル)-2-(チオ)ウラシル、5-(メトキシカルボニル-メチル)ウラシル、5-(メチル)2(チオ)ウラシル、5-(メチル)2,4(ジチオ)ウラシル、5-(メチル)4(チオ)ウラシル、5-(メチル)-2-(チオ)シュードウラシル、5-(メチル)-2,4(ジチオ)シュードウラシル、5-(メチル)-4(チオ)シュードウラシル、5-(メチル)シュードウラシル、5-(メチルアミノメチル)-2(チオ)ウラシル、5-(メチルアミノメチル)-2,4(ジチオ)ウラシル、5-(メチルアミノメチル)-4-(チオ)ウラシル、5-(プロピニル)ウラシル、5-(トリフルオロメチル)ウラシル、5-アミノアリル-ウリジン、5-ブロモ-ウリジン、5-ヨード-ウリジン、5-ウラシル、6(アゾ)ウラシル、6-(アゾ)ウラシル、6-アザ-ウリジン、アリアミノ(allyアミノ)-ウラシル、アザウラシル、デアザウラシル、N3(メチル)ウラシル、シュード-UTP-1-2-エタン酸、シュードウラシル、4-チオ-シュード-UTP、1-カルボキシメチル-シュードウリジン、1-メチル-1-デアザ-シュードウリジン、1-プロピニル-ウリジン、1-タウリノメチル-1-メチル-ウリジン、1-タウリノメチル-4-チオ-ウリジン、1-タウリノメチル-シュードウリジン、2-メトキシ-4-チオ-シュードウリジン、2-チオ-1-メチル-1-デアザ-シュードウリジン、2-チオ-1-メチル-シュードウリジン、2-チオ-5-アザ-ウリジン、2-チオ-ジヒドロシュードウリジン、2-チオ-ジヒドロウリジン、2-チオ-シュードウリジン、4-メトキシ-2-チオ-シュードウリジン、4-メトキシ-シュードウリジン、4-チオ-1-メチル-シュードウリジン、4-チオ-シュードウリジン、5-アザ-ウリジン、ジヒドロシュードウリジン、(±)1-(2-ヒドロキシプロピル)シュードウリジンTP、(2R)-1-(2-ヒドロキシプロピル)シュードウリジンTP、(2S)-1-(2-ヒドロキシプロピル)シュードウリジンTP、(E)-5-(2-ブロモ-ビニル)アラ-ウリジンTP、(E)-5-(2-ブロモ-ビニル)ウリジンTP、(Z)-5-(2-ブロモ-ビニル)アラ-ウリジンTP、(Z)-5-(2-ブロモ-ビニル)ウリジンTP、1-(2,2,2-トリフルオロエチル)-シュード-UTP、1-(2,2,3,3,3-ペンタフルオロプロピル)シュードウリジンTP、1-(2,2-ジエトキシエチル)シュードウリジンTP、1-(2,4,6-トリメチルベンジル)シュードウリジンTP、1-(2,4,6-トリメチル-ベンジル)シュード-UTP、1-(2,4,6-トリメチル-フェニル)シュード-UTP、1-(2-アミノ-2-カルボキシエチル)シュード-UTP、1-(2-アミノ-エチル)シュード-UTP、1-(2-ヒドロキシエチル)シュードウリジンTP、1-(2-メトキシエチル)シュードウリジンTP、1-(3,4-ビス-トリフルオロメトキシベンジル)シュードウリジンTP、1-(3,4-ジメトキシベンジル)シュードウリジンTP、1-(3-アミノ-3-カルボキシプロピル)シュード-UTP、1-(3-アミノ-プロピル)シュード-UTP、1-(3-シクロプロピル-プロパ-2-イニル)シュードウリジンTP、1-(4-アミノ-4-カルボキシブチル)シュード-UTP、1-(4-アミノ-ベンジル)シュード-UTP、1-(4-アミノ-ブチル)シュード-UTP、1-(4-アミノ-フェニル)シュード-UTP、1-(4-アジドベンジル)シュードウリジンTP、1-(4-ブロモベンジル)シュードウリジンTP、1-(4-クロロベンジル)シュードウリジンTP、1-(4-フルオロベンジル)シュードウリジンTP、1-(4-ヨードベンジル)シュードウリジンTP、1-(4-メタンスルホニルベンジル)シュードウリジンTP、1-(4-メトキシベンジル)シュードウリジンTP、1-(4-メトキシ-ベンジル)シュード-UTP、1-(4-メトキシ-フェニル)シュード-UTP、1-(4-メチルベンジル)シュードウリジンTP、1-(4-メチル-ベンジル)シュード-UTP、1-(4-ニトロベンジル)シュードウリジンTP、1-(4-ニトロ-ベンジル)シュード-UTP、1(4-ニトロ-フェニル)シュード-UTP、1-(4-チオメトキシベンジル)シュードウリジンTP、1-(4-トリフルオロメトキシベンジル)シュードウリジンTP、1-(4-トリフルオロメチルベンジル)シュードウリジンTP、1-(5-アミノ-ペンチル)シュード-UTP、1-(6-アミノ-ヘキシル)シュード-UTP、1,6-ジメチル-シュード-UTP、1-[3-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-プロピオニル]シュードウリジンTP、1-{3-[2-(2-アミノエトキシ)-エトキシ]-プロピオニル}シュードウリジンTP、1-アセチルシュードウリジンTP、1-アルキル-6-(1-プロピニル)-シュード-UTP、1-アルキル-6-(2-プロピニル)-シュード-UTP、1-アルキル-6-アリル-シュード-UTP、1-アルキル-6-エチニル-シュード-UTP、1-アルキル-6-ホモアリル-シュード-UTP、1-アルキル-6-ビニル-シュード-UTP、1-アリルシュードウリジンTP、1-アミノメチル-シュード-UTP、1-ベン
ゾイルシュードウリジンTP、1-ベンジルオキシメチルシュードウリジンTP、1-ベンジル-シュード-UTP、1-ビオチニル-PEG2-シュードウリジンTP、1-ビオチニルシュードウリジンTP、1-ブチル-シュード-UTP、1-シアノメチルシュードウリジンTP、1-シクロブチルメチル-シュード-UTP、1-シクロブチル-シュード-UTP、1-シクロヘプチルメチル-シュード-UTP、1-シクロヘプチル-シュード-UTP、1-シクロヘキシルメチル-シュード-UTP、1-シクロヘキシル-シュード-UTP、1-シクロオクチルメチル-シュード-UTP、1-シクロオクチル-シュード-UTP、1-シクロペンチルメチル-シュード-UTP、1-シクロペンチル-シュード-UTP、1-シクロプロピルメチル-シュード-UTP、1-シクロプロピル-シュード-UTP、1-エチル-シュード-UTP、1-ヘキシル-シュード-UTP、1-ホモアリルシュードウリジンTP、1-ヒドロキシメチルシュードウリジンTP、1-イソ-プロピル-シュード-UTP、1-Me-2-チオ-シュード-UTP、1-Me-4-チオ-シュード-UTP、1-Me-アルファ-チオ-シュード-UTP、1-メタンスルホニルメチルシュードウリジンTP、1-メトキシメチルシュードウリジンTP、1-メチル-6-(2,2,2-トリフルオロエチル)シュード-UTP、1-メチル-6-(4-モルホリノ)-シュード-UTP、1-メチル-6-(4-チオモルホリノ)-シュード-UTP、1-メチル-6-(置換フェニル)シュード-UTP、1-メチル-6-アミノ-シュード-UTP、1-メチル-6-アジド-シュード-UTP、1-メチル-6-ブロモ-シュード-UTP、1-メチル-6-ブチル-シュード-UTP、1-メチル-6-クロロ-シュード-UTP、1-メチル-6-シアノ-シュード-UTP、1-メチル-6-ジメチルアミノ-シュード-UTP、1-メチル-6-エトキシ-シュード-UTP、1-メチル-6-エチルカルボキシレート-シュード-UTP、1-メチル-6-エチル-シュード-UTP、1-メチル-6-フルオロ-シュード-UTP、1-メチル-6-ホルミル-シュード-UTP、1-メチル-6-ヒドロキシアミノ-シュード-UTP、1-メチル-6-ヒドロキシ-シュード-UTP、1-メチル-6-ヨード-シュード-UTP、1-メチル-6-イソ-プロピル-シュード-UTP、1-メチル-6-メトキシ-シュード-UTP、1-メチル-6-メチルアミノ-シュード-UTP、1-メチル-6-フェニル-シュード-UTP、1-メチル-6-プロピル-シュード-UTP、1-メチル-6-tert-ブチル-シュード-UTP、1-メチル-6-トリフルオロメトキシ-シュード-UTP、1-メチル-6-トリフルオロメチル-シュード-UTP、1-モルホリノメチルシュードウリジンTP、1-ペンチル-シュード-UTP、1-フェニル-シュード-UTP、1-ピバロイルシュードウリジンTP、1-プロパルギルシュードウリジンTP、1-プロピル-シュード-UTP、1-プロピニル-シュードウリジン、1-p-トリル-シュード-UTP、1-tert-ブチル-シュード-UTP、1-チオメトキシメチルシュードウリジンTP、1-チオモルホリノメチルシュードウリジンTP、1-トリフルオロアセチルシュードウリジンTP、1-トリフルオロメチル-シュード-UTP、1-ビニルシュードウリジンTP、2,2’-アンヒドロ-ウリジンTP、2’-ブロモ-デオキシウリジンTP、2’-F-5-メチル-2’-デオキシ-UTP、2’-OMe-5-Me-UTP、2’-OMe-シュード-UTP、2’-a-エチニルウリジンTP、2’-a-トリフルオロメチルウリジンTP、2’-b-エチニルウリジンTP、2’-b-トリフルオロメチルウリジンTP、2’-デオキシ-2’,2’-ジフルオロウリジンTP、2’-デオキシ-2’-a-メルカプトウリジンTP、2’-デオキシ-2’-a-チオメトキシウリジンTP、2’-デオキシ-2’-b-アミノウリジンTP、2’-デオキシ-2’-b-アジドウリジンTP、2’-デオキシ-2’-b-ブロモウリジンTP、2’-デオキシ-2’-b-クロロウリジンTP、2’-デオキシ-2’-b-フルオロウリジンTP、2’-デオキシ-2’-b-ヨードウリジンTP、2’-デオキシ-2’-b-メルカプトウリジンTP、2’-デオキシ-2’-b-チオメトキシウリジンTP、2-メトキシ-4-チオ-ウリジン、2-メトキシウリジン、2’-O-メチル-5-(1-プロピニル)ウリジンTP、3-アルキル-シュード-UTP、4’-アジドウリジンTP、4’-炭素環式ウリジンTP、4’-エチニルウリジンTP、5-(1-プロピニル)アラ-ウリジンTP、5-(2-フラニル)ウリジンTP、5-シアノウリジンTP、5-ジメチルアミノウリジンTP、5’-ホモ-ウリジンTP、5-ヨード-2’-フルオロ-デオキシウリジンTP、5-フェニルエチニルウリジンTP、5-トリジュウテロメチル-6-ジュウテロウリジンTP、5-トリフルオロメチル-ウリジンTP、5-ビニルアラウリジンTP、6-(2,2,2-トリフルオロエチル)-シュード-UTP、6-(4-モルホリノ)-シュード-UTP、6-(4-チオモルホリノ)-シュード-UTP、6-(置換-フェニル)-シュード-UTP、6-アミノ-シュード-UTP、6-アジド-シュード-UTP、6-ブロモ-シュード-UTP、6-ブチル-シュード-UTP、6-クロロ-シュード-UTP、6-シアノ-シュード-UTP、6-ジメチルアミノ-シュード-UTP、6-エトキシ-シュード-UTP、6-エチルカルボキシレート-シュード-UTP、6-エチル-シュード-UTP、6-フルオロ-シュード-UTP、6-ホルミル-シュード-UTP、6-ヒドロキシアミノ-シュード-UTP、6-ヒドロキシ-シュード-UTP、6-ヨード-シュード-UTP、6-イソ-プロピル-シュード-UTP、6-メトキシ-シュード-UTP、6-メチルアミノ-シュード-UTP、6-メチル-シュード-UTP、6-フェニル-シュード-UTP、6-フェニル-シュード-UTP、6-プロピル-シュード-UTP、6-tert-ブチル-シュード-UTP、6-トリフルオロメトキシ-シュード-UTP、6-トリフルオロメチル-シュード-UTP、アルファ-チオ-シュード-UTP、シュードウリジン1-(4-メチルベンゼンスルホン酸)TP、シュードウリジン1-(4-メチル安息香酸)TP、シュードウリジンTP1-[3-(2-エトキシ)]プロピオン酸、シュードウリジンTP1-[3-{2-(2-[2-(2-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ)-エトキシ}]プロピオン酸、シュードウリジンTP1-[3-{2-(2-[2-{2(2-エトキシ)-エトキシ}-エトキシ]-エトキシ)-エトキシ}]プロピオン酸、シュードウリジンTP1-[3-{2-(2-[2-エトキシ]-エトキシ)-エトキシ}]プロピオン酸、シュードウリジンTP1-[3-{2-(2-エトキシ)-エトキシ}]プロピオン酸、シュードウリジンTP1-メチルホスホン酸、シュードウリジンTP1-メチルホスホン酸ジエチルエステル、シュード-UTP-N1-3-プロピオン酸、シュード-UTP-N1-4-ブタン酸、シュード-UTP-N1-5-ペンタン酸、シュード-UTP-N1-6-ヘキサン酸、シュード-UTP-N1-7-ヘプタン酸、シュード-UTP-N1-メチル-p-安息香酸、シュード-UTP-N1-p-安息香酸、ワイブトシン、ヒドロキシワイブトシン、イソワイオシン、ペルオキシワイブトシン、中間体ヒドロキシワイブトシン、4-デメチルワイオシン、2,6-(ジアミノ)プリン、1-(アザ)-2-(チオ)-3-(アザ)-フェノキサジン-1-イル:1,3-(ジアザ)-2-(オキソ)-フェンチアジン(phenthiazin)-1-イル、1,3-(ジアザ)-2-(オキソ)-フェノキサジン-1-イル、1,3,5-(トリアザ)-2,6-(ジオキサ)-ナフタレン、2(アミノ)プリン、2,4,5-(トリメチル)フェニル、2’メチル、2’アミノ、2’アジド、2’フルロ-シチジン、2’メチル、2’アミノ、2’アジド、2’フルロ-アデニン、2’メチル、2’アミノ、2’アジド、2’フルロ-ウリジン、2’-アミノ-2’-デオキシリボース、2-アミノ-6-クロロ-プリン、2-アザ-イノシニル、2’-アジド-2’-デオキシリボース、2’フルオロ-2’-デオキシリボース、2’-フルオロ-修飾塩基、2’-O-メチル-リボース、2-オキソ-7-アミノピリドピリミジン-3-イル、2-オキソ-ピリドピリミジン-3-イル、2-ピリジノン、3ニトロピロール、3-(メチル)-7-(プロピニル)イソカルボスチリル、3-(メチル)イソカルボスチリル、4-(フルオロ)-6-(メチル)ベンゾイミダゾール、4-(メチル)ベンゾイミダゾール、4-(メチル)インドリル、4,6-(ジメチル)インドリル、5ニトロインドール、5置換ピリミジン、5-(メチル)イソカルボスチリル、5-ニトロインドール、6-(アザ)ピリミジン、6-(アゾ)チミン、6-(メチル)-7-(アザ)インドリル、6-クロロ-プリン、6-フェニル-ピロロ-ピリミジン-2-オン-3-イル、7-(アミノアルキルヒドロキシ)-1-(アザ)-2-(チオ)-3-(アザ)-フェンチアジン(phenthiazin)-1-イル、7-(アミノアルキルヒドロキシ)-1-(アザ)-2-(チオ)-3-(アザ)-フェノキサジン-1-イル、7-(アミノアルキルヒドロキシ)-1,3-(ジアザ)-2-(オキソ)-フェノキサジン-1-イル、7-(アミノアルキルヒドロキシ)-1,3-(ジアザ)-2-(オキソ)-フェンチアジン(phenthiazin)-1-イル、7-(アミノアルキルヒドロキシ)-1,3-(ジアザ)-2-(オキソ)-フェノキサジン-1-イル、7-(アザ)インドリル、7-(グアニジニウムアルキルヒドロキシ)-1-(アザ)-2-(チオ)-3-(アザ)-フェノキサジニル(phenoxazinl)-イル、7-(グアニジニウムアルキルヒドロキシ)-1-(アザ)-2-(チオ)-3-(アザ)-フェンチアジン(phenthiazin)-1-イル、7-(グアニジニウムアルキルヒドロキシ)-1-(アザ)-2-(チオ)-3-(アザ)-フェノキサジン-1-イル、7-(グアニジニウムアルキルヒドロキシ)-1,3-(ジアザ)-2-(オキソ)-フェノキサジン-1-イル、7-(グアニジニウムアルキル-ヒドロキシ)-1,3-(ジアザ)-2-(オキソ)-フェンチアジン(phenthiazin)-1-イル、7-(グアニジニウムアルキルヒドロキシ)-1,3-(ジアザ)-2-(オキソ)-フェノキサジン-1-イル、7-(プロピニル)イソカルボスチリル、7-(プロピニル)イソカルボスチリル、プロピニル-7-(アザ)インドリル、7-デアザ-イノシニル、7-置換1-(アザ)-2-(チオ)-3-(アザ)-フェノキサジン-1-イル、7-置換1,3-(ジアザ)-2-(オキソ)-フェノキサジン-1-イル、9-(メチル)-イミジゾピリジニル、アミノインドリル、アントラセニル、ビス-オルト-(アミノアルキルヒドロキシ)-6-フェニル-ピロロ-ピリミジン-2-オン-3-イル、ビス-オルト-置換-6-フェニル-ピロロ-ピリミジン-2-オン-3-イル、ジフルオロトリル、ヒポキサンチン、イミジゾピリジニル、イノシニル、イソカルボスチリル、イソグアニシン(Isoguanisine)、N2-置換プリン、N6-メチル-2-アミノ-プリン、N6-置換プリン、N-アルキル化誘導体、ナフタレニル、ニトロベンゾイミダゾリル、ニトロイミダゾリル、ニトロインダゾリル、ニトロピラゾリル、ヌブラリン(Nubularine)、O6-置換プリン、O-アルキル化誘導体、オルト-(アミノアルキルヒドロキシ)-6-フェニル-ピロロ-ピリミジン-2-
オン-3-イル、オルト-置換-6-フェニル-ピロロ-ピリミジン-2-オン-3-イル、オキソホルマイシンTP、パラ-(アミノアルキルヒドロキシ)-6-フェニル-ピロロ-ピリミジン-2-オン-3-イル、パラ-置換-6-フェニル-ピロロ-ピリミジン-2-オン-3-イル、ペンタセニル、フェナントラセニル(Phenanthracenyl)、フェニル、プロピニル-7-(アザ)インドリル、ピレニル、ピリドピリミジン-3-イル、ピリドピリミジン-3-イル、2-オキソ-7-アミノ-ピリドピリミジン-3-イル、ピロロ-ピリミジン-2-オン-3-イル、ピロロピリミジニル、ピロロピリジニル、スチルベンジル(Stilbenzyl)、置換1,2,4-トリアゾール、テトラセニル、ツベルシジン(Tubercidine)、キサンチン、キサントシン-5’-TP、2-チオ-ゼブラリン、5-アザ-2-チオ-ゼブラリン、7-デアザ-2-アミノ-プリン、ピリジン-4-オンリボヌクレオシド、2-アミノ-リボシド-TP、ホルマイシンA TP、ホルマイシンB TP、ピロロシン(Pyrrolosine)TP、2’-OH-アラ-アデノシンTP、2’-OH-アラ-シチジンTP、2’-OH-アラ-ウリジンTP、2’-OH-アラ-グアノシンTP、5-(2-カルボメトキシビニル)ウリジンTP、及びN6-(19-アミノ-ペンタオキサノナデシル)アデノシンTP。
-b-ヨードグアノシンTP、2’-デオキシ-2’-b-メルカプトグアノシンTP、2’-デオキシ-2’-b-チオメトキシグアノシンTP、4’-アジドグアノシンTP、4’-炭素環式グアノシンTP、4’-エチニルグアノシンTP、5’-ホモ-グアノシンTP、8-ブロモ-グアノシンTP、9-デアザグアノシンTP、N2-イソブチル-グアノシンTP、1-メチルイノシン、イノシン、1,2’-O-ジメチルイノシン、2’-O-メチルイノシン、7-メチルイノシン、2’-O-メチルイノシン、エポキシキューオシン、ガラクトシル-キューオシン、マンノシルキューオシン、キューオシン、アリアミノ(allyアミノ)-チミジン、アザチミジン、デアザチミジン、デオキシ-チミジン、2’-O-メチルウリジン、2-チオウリジン、3-メチルウリジン、5-カルボキシメチルウリジン、5-ヒドロキシウリジン、5-メチルウリジン、5-タウリノメチル-2-チオウリジン、5-タウリノメチルウリジン、ジヒドロウリジン、シュードウリジン、(3-(3-アミノ-3-カルボキシプロピル)ウリジン、1-メチル-3-(3-アミノ-5-カルボキシプロピル)シュードウリジン、1-メチルシュードウリジン、1-エチル-シュードウリジン、2’-O-メチルウリジン、2’-O-メチルシュードウリジン、2’-O-メチルウリジン、2-チオ-2’-O-メチルウリジン、3-(3-アミノ-3-カルボキシプロピル)ウリジン、3,2’-O-ジメチルウリジン、3-メチル-シュード-ウリジンTP、4-チオウリジン、5-(カルボキシヒドロキシメチル)ウリジン、5-(カルボキシヒドロキシメチル)ウリジンメチルエステル、5,2’-O-ジメチルウリジン、5,6-ジヒドロ-ウリジン、5-アミノメチル-2-チオウリジン、5-カルバモイルメチル-2’-O-メチルウリジン、5-カルバモイルメチルウリジン、5-カルボキシヒドロキシメチルウリジン、5-カルボキシヒドロキシメチルウリジンメチルエステル、5-カルボキシメチルアミノメチル-2’-O-メチルウリジン、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン、5-カルボキシメチルアミノメチルウリジン、5-カルボキシメチルアミノメチルウリジン、5-カルバモイルメチルウリジンTP、5-メトキシカルボニルメチル-2’-O-メチルウリジン、5-メトキシカルボニルメチル-2-チオウリジン、5-メトキシカルボニルメチルウリジン、5-メチルウリジン、)、5-メトキシウリジン、5-メチル-2-チオウリジン、5-メチルアミノメチル-2-セレノウリジン、5-メチルアミノメチル-2-チオウリジン、5-メチルアミノメチルウリジン、5-メチルジヒドロウリジン、5-オキシ酢酸-ウリジンTP、5-オキシ酢酸-メチルエステル-ウリジンTP、N1-メチル-シュード-ウラシル、N1-エチル-シュード-ウラシル、ウリジン5-オキシ酢酸、ウリジン5-オキシ酢酸メチルエステル、3-(3-アミノ-3-カルボキシプロピル)-ウリジンTP、5-(イソ-ペンテニルアミノメチル)-2-チオウリジンTP、5-(イソ-ペンテニルアミノメチル)-2’-O-メチルウリジンTP、5-(イソ-ペンテニルアミノメチル)ウリジンTP、5-プロピニルウラシル、α-チオ-ウリジン、1(アミノアルキルアミノ-カルボニルエチレニル)-2(チオ)-シュードウラシル、1(アミノアルキルアミノカルボニルエチレニル)-2,4-(ジチオ)シュードウラシル、1(アミノアルキルアミノカルボニルエチレニル)-4(チオ)シュードウラシル、1(アミノアルキルアミノカルボニルエチレニル)-シュードウラシル、1(アミノカルボニルエチレニル)-2(チオ)-シュードウラシル、1(アミノカルボニルエチレニル)-2,4-(ジチオ)シュードウラシル、1(アミノカルボニルエチレニル)-4(チオ)シュードウラシル、1(アミノカルボニルエチレニル)-シュードウラシル、1置換2(チオ)-シュードウラシル、1置換2,4-(ジチオ)シュードウラシル、1置換4(チオ)シュードウラシル、1置換シュードウラシル、1-(アミノアルキルアミノ-カルボニルエチレニル)-2-(チオ)-シュードウラシル、1-メチル-3-(3-アミノ-3-カルボキシプロピル)シュードウリジンTP、1-メチル-3-(3-アミノ-3-カルボキシプロピル)シュード-UTP、1-メチル-シュード-UTP、1-エチル-シュード-UTP、2(チオ)シュードウラシル、2’デオキシウリジン、2’フルオロウリジン、2-(チオ)ウラシル、2,4-(ジチオ)シュードウラシル、2’メチル、2’アミノ、2’アジド、2’フルロ-グアノシン、2’-アミノ-2’-デオキシ-UTP、2’-アジド-2’-デオキシ-UTP、2’-アジド-デオキシウリジンTP、2’-O-メチルシュードウリジン、2’デオキシウリジン、2’フルオロウリジン、2’-デオキシ-2’-a-アミノウリジンTP、2’-デオキシ-2’-a-アジドウリジンTP、2-メチルシュードウリジン、3(3アミノ-3カルボキシプロピル)ウラシル、4(チオ)シュードウラシル、4-(チオ)シュードウラシル、4-(チオ)ウラシル、4-チオウラシル、5(1,3-ジアゾール-1-アルキル)ウラシル、5(2-アミノプロピル)ウラシル、5(アミノアルキル)ウラシル、5(ジメチルアミノアルキル)ウラシル、5(グアニジニウムアルキル)ウラシル、5(メトキシカルボニルメチル)-2-(チオ)ウラシル、5(メトキシカルボニル-メチル)ウラシル、5(メチル)2(チオ)ウラシル、5(メチル)2,4(ジチオ)ウラシル、5(メチル)4(チオ)ウラシル、5(メチルアミノメチル)-2(チオ)ウラシル、5(メチルアミノメチル)-2,4(ジチオ)ウラシル、5(メチルアミノメチル)-4(チオ)ウラシル、5(プロピニル)ウラシル、5(トリフルオロメチル)ウラシル、5-(2-アミノプロピル)ウラシル、5-(アルキル)-2-(チオ)シュードウラシル、5-(アルキル)-2,4(ジチオ)シュードウラシル、5-(アルキル)-4(チオ)シュードウラシル、5-(アルキル)シュードウラシル、5-(アルキル)ウラシル、5-(アルキニル)ウラシル、5-(アリルアミノ)ウラシル、5-(シアノアルキル)ウラシル、5-(ジアルキルアミノアルキル)ウラシル、5-(ジメチルアミノアルキル)ウラシル、5-(グアニジニウムアルキル)ウラシル、5-(ハロ)ウラシル、5-(1,3-ジアゾール-1-アルキル)ウラシル、5-(メトキシ)ウラシル、5-(メトキシカルボニルメチル)-2-(チオ)ウラシル、5-(メトキシカルボニル-メチル)ウラシル、5-(メチル)2(チオ)ウラシル、5-(メチル)2,4(ジチオ)ウラシル、5-(メチル)4(チオ)ウラシル、5-(メチル)-2-(チオ)シュードウラシル、5-(メチル)-2,4(ジチオ)シュードウラシル、5-(メチル)-4(チオ)シュードウラシル、5-(メチル)シュードウラシル、5-(メチルアミノメチル)-2(チオ)ウラシル、5-(メチルアミノメチル)-2,4(ジチオ)ウラシル、5-(メチルアミノメチル)-4-(チオ)ウラシル、5-(プロピニル)ウラシル、5-(トリフルオロメチル)ウラシル、5-アミノアリル-ウリジン、5-ブロモ-ウリジン、5-ヨード-ウリジン、5-ウラシル、6(アゾ)ウラシル、6-(アゾ)ウラシル、6-アザ-ウリジン、アリアミノ(allyアミノ)-ウラシル、アザウラシル、デアザウラシル、N3(メチル)ウラシル、シュード-UTP-1-2-エタン酸、シュードウラシル、4-チオ-シュード-UTP、1-カルボキシメチル-シュードウリジン、1-メチル-1-デアザ-シュードウリジン、1-プロピニル-ウリジン、1-タウリノメチル-1-メチル-ウリジン、1-タウリノメチル-4-チオ-ウリジン、1-タウリノメチル-シュードウリジン、2-メトキシ-4-チオ-シュードウリジン、2-チオ-1-メチル-1-デアザ-シュードウリジン、2-チオ-1-メチル-シュードウリジン、2-チオ-5-アザ-ウリジン、2-チオ-ジヒドロシュードウリジン、2-チオ-ジヒドロウリジン、2-チオ-シュードウリジン、4-メトキシ-2-チオ-シュードウリジン、4-メトキシ-シュードウリジン、4-チオ-1-メチル-シュードウリジン、4-チオ-シュードウリジン、5-アザ-ウリジン、ジヒドロシュードウリジン、(±)1-(2-ヒドロキシプロピル)シュードウリジンTP、(2R)-1-(2-ヒドロキシプロピル)シュードウリジンTP、(2S)-1-(2-ヒドロキシプロピル)シュードウリジンTP、(E)-5-(2-ブロモ-ビニル)アラ-ウリジンTP、(E)-5-(2-ブロモ-ビニル)ウリジンTP、(Z)-5-(2-ブロモ-ビニル)アラ-ウリジンTP、(Z)-5-(2-ブロモ-ビニル)ウリジンTP、1-(2,2,2-トリフルオロエチル)-シュード-UTP、1-(2,2,3,3,3-ペンタフルオロプロピル)シュードウリジンTP、1-(2,2-ジエトキシエチル)シュードウリジンTP、1-(2,4,6-トリメチルベンジル)シュードウリジンTP、1-(2,4,6-トリメチル-ベンジル)シュード-UTP、1-(2,4,6-トリメチル-フェニル)シュード-UTP、1-(2-アミノ-2-カルボキシエチル)シュード-UTP、1-(2-アミノ-エチル)シュード-UTP、1-(2-ヒドロキシエチル)シュードウリジンTP、1-(2-メトキシエチル)シュードウリジンTP、1-(3,4-ビス-トリフルオロメトキシベンジル)シュードウリジンTP、1-(3,4-ジメトキシベンジル)シュードウリジンTP、1-(3-アミノ-3-カルボキシプロピル)シュード-UTP、1-(3-アミノ-プロピル)シュード-UTP、1-(3-シクロプロピル-プロパ-2-イニル)シュードウリジンTP、1-(4-アミノ-4-カルボキシブチル)シュード-UTP、1-(4-アミノ-ベンジル)シュード-UTP、1-(4-アミノ-ブチル)シュード-UTP、1-(4-アミノ-フェニル)シュード-UTP、1-(4-アジドベンジル)シュードウリジンTP、1-(4-ブロモベンジル)シュードウリジンTP、1-(4-クロロベンジル)シュードウリジンTP、1-(4-フルオロベンジル)シュードウリジンTP、1-(4-ヨードベンジル)シュードウリジンTP、1-(4-メタンスルホニルベンジル)シュードウリジンTP、1-(4-メトキシベンジル)シュードウリジンTP、1-(4-メトキシ-ベンジル)シュード-UTP、1-(4-メトキシ-フェニル)シュード-UTP、1-(4-メチルベンジル)シュードウリジンTP、1-(4-メチル-ベンジル)シュード-UTP、1-(4-ニトロベンジル)シュードウリジンTP、1-(4-ニトロ-ベンジル)シュード-UTP、1(4-ニトロ-フェニル)シュード-UTP、1-(4-チオメトキシベンジル)シュードウリジンTP、1-(4-トリフルオロメトキシベンジル)シュードウリジンTP、1-(4-トリフルオロメチルベンジル)シュードウリジンTP、1-(5-アミノ-ペンチル)シュード-UTP、1-(6-アミノ-ヘキシル)シュード-UTP、1,6-ジメチル-シュード-UTP、1-[3-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-プロピオニル]シュードウリジンTP、1-{3-[2-(2-アミノエトキシ)-エトキシ]-プロピオニル}シュードウリジンTP、1-アセチルシュードウリジンTP、1-アルキル-6-(1-プロピニル)-シュード-UTP、1-アルキル-6-(2-プロピニル)-シュード-UTP、1-アルキル-6-アリル-シュード-UTP、1-アルキル-6-エチニル-シュード-UTP、1-アルキル-6-ホモアリル-シュード-UTP、1-アルキル-6-ビニル-シュード-UTP、1-アリルシュードウリジンTP、1-アミノメチル-シュード-UTP、1-ベン
ゾイルシュードウリジンTP、1-ベンジルオキシメチルシュードウリジンTP、1-ベンジル-シュード-UTP、1-ビオチニル-PEG2-シュードウリジンTP、1-ビオチニルシュードウリジンTP、1-ブチル-シュード-UTP、1-シアノメチルシュードウリジンTP、1-シクロブチルメチル-シュード-UTP、1-シクロブチル-シュード-UTP、1-シクロヘプチルメチル-シュード-UTP、1-シクロヘプチル-シュード-UTP、1-シクロヘキシルメチル-シュード-UTP、1-シクロヘキシル-シュード-UTP、1-シクロオクチルメチル-シュード-UTP、1-シクロオクチル-シュード-UTP、1-シクロペンチルメチル-シュード-UTP、1-シクロペンチル-シュード-UTP、1-シクロプロピルメチル-シュード-UTP、1-シクロプロピル-シュード-UTP、1-エチル-シュード-UTP、1-ヘキシル-シュード-UTP、1-ホモアリルシュードウリジンTP、1-ヒドロキシメチルシュードウリジンTP、1-イソ-プロピル-シュード-UTP、1-Me-2-チオ-シュード-UTP、1-Me-4-チオ-シュード-UTP、1-Me-アルファ-チオ-シュード-UTP、1-メタンスルホニルメチルシュードウリジンTP、1-メトキシメチルシュードウリジンTP、1-メチル-6-(2,2,2-トリフルオロエチル)シュード-UTP、1-メチル-6-(4-モルホリノ)-シュード-UTP、1-メチル-6-(4-チオモルホリノ)-シュード-UTP、1-メチル-6-(置換フェニル)シュード-UTP、1-メチル-6-アミノ-シュード-UTP、1-メチル-6-アジド-シュード-UTP、1-メチル-6-ブロモ-シュード-UTP、1-メチル-6-ブチル-シュード-UTP、1-メチル-6-クロロ-シュード-UTP、1-メチル-6-シアノ-シュード-UTP、1-メチル-6-ジメチルアミノ-シュード-UTP、1-メチル-6-エトキシ-シュード-UTP、1-メチル-6-エチルカルボキシレート-シュード-UTP、1-メチル-6-エチル-シュード-UTP、1-メチル-6-フルオロ-シュード-UTP、1-メチル-6-ホルミル-シュード-UTP、1-メチル-6-ヒドロキシアミノ-シュード-UTP、1-メチル-6-ヒドロキシ-シュード-UTP、1-メチル-6-ヨード-シュード-UTP、1-メチル-6-イソ-プロピル-シュード-UTP、1-メチル-6-メトキシ-シュード-UTP、1-メチル-6-メチルアミノ-シュード-UTP、1-メチル-6-フェニル-シュード-UTP、1-メチル-6-プロピル-シュード-UTP、1-メチル-6-tert-ブチル-シュード-UTP、1-メチル-6-トリフルオロメトキシ-シュード-UTP、1-メチル-6-トリフルオロメチル-シュード-UTP、1-モルホリノメチルシュードウリジンTP、1-ペンチル-シュード-UTP、1-フェニル-シュード-UTP、1-ピバロイルシュードウリジンTP、1-プロパルギルシュードウリジンTP、1-プロピル-シュード-UTP、1-プロピニル-シュードウリジン、1-p-トリル-シュード-UTP、1-tert-ブチル-シュード-UTP、1-チオメトキシメチルシュードウリジンTP、1-チオモルホリノメチルシュードウリジンTP、1-トリフルオロアセチルシュードウリジンTP、1-トリフルオロメチル-シュード-UTP、1-ビニルシュードウリジンTP、2,2’-アンヒドロ-ウリジンTP、2’-ブロモ-デオキシウリジンTP、2’-F-5-メチル-2’-デオキシ-UTP、2’-OMe-5-Me-UTP、2’-OMe-シュード-UTP、2’-a-エチニルウリジンTP、2’-a-トリフルオロメチルウリジンTP、2’-b-エチニルウリジンTP、2’-b-トリフルオロメチルウリジンTP、2’-デオキシ-2’,2’-ジフルオロウリジンTP、2’-デオキシ-2’-a-メルカプトウリジンTP、2’-デオキシ-2’-a-チオメトキシウリジンTP、2’-デオキシ-2’-b-アミノウリジンTP、2’-デオキシ-2’-b-アジドウリジンTP、2’-デオキシ-2’-b-ブロモウリジンTP、2’-デオキシ-2’-b-クロロウリジンTP、2’-デオキシ-2’-b-フルオロウリジンTP、2’-デオキシ-2’-b-ヨードウリジンTP、2’-デオキシ-2’-b-メルカプトウリジンTP、2’-デオキシ-2’-b-チオメトキシウリジンTP、2-メトキシ-4-チオ-ウリジン、2-メトキシウリジン、2’-O-メチル-5-(1-プロピニル)ウリジンTP、3-アルキル-シュード-UTP、4’-アジドウリジンTP、4’-炭素環式ウリジンTP、4’-エチニルウリジンTP、5-(1-プロピニル)アラ-ウリジンTP、5-(2-フラニル)ウリジンTP、5-シアノウリジンTP、5-ジメチルアミノウリジンTP、5’-ホモ-ウリジンTP、5-ヨード-2’-フルオロ-デオキシウリジンTP、5-フェニルエチニルウリジンTP、5-トリジュウテロメチル-6-ジュウテロウリジンTP、5-トリフルオロメチル-ウリジンTP、5-ビニルアラウリジンTP、6-(2,2,2-トリフルオロエチル)-シュード-UTP、6-(4-モルホリノ)-シュード-UTP、6-(4-チオモルホリノ)-シュード-UTP、6-(置換-フェニル)-シュード-UTP、6-アミノ-シュード-UTP、6-アジド-シュード-UTP、6-ブロモ-シュード-UTP、6-ブチル-シュード-UTP、6-クロロ-シュード-UTP、6-シアノ-シュード-UTP、6-ジメチルアミノ-シュード-UTP、6-エトキシ-シュード-UTP、6-エチルカルボキシレート-シュード-UTP、6-エチル-シュード-UTP、6-フルオロ-シュード-UTP、6-ホルミル-シュード-UTP、6-ヒドロキシアミノ-シュード-UTP、6-ヒドロキシ-シュード-UTP、6-ヨード-シュード-UTP、6-イソ-プロピル-シュード-UTP、6-メトキシ-シュード-UTP、6-メチルアミノ-シュード-UTP、6-メチル-シュード-UTP、6-フェニル-シュード-UTP、6-フェニル-シュード-UTP、6-プロピル-シュード-UTP、6-tert-ブチル-シュード-UTP、6-トリフルオロメトキシ-シュード-UTP、6-トリフルオロメチル-シュード-UTP、アルファ-チオ-シュード-UTP、シュードウリジン1-(4-メチルベンゼンスルホン酸)TP、シュードウリジン1-(4-メチル安息香酸)TP、シュードウリジンTP1-[3-(2-エトキシ)]プロピオン酸、シュードウリジンTP1-[3-{2-(2-[2-(2-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ)-エトキシ}]プロピオン酸、シュードウリジンTP1-[3-{2-(2-[2-{2(2-エトキシ)-エトキシ}-エトキシ]-エトキシ)-エトキシ}]プロピオン酸、シュードウリジンTP1-[3-{2-(2-[2-エトキシ]-エトキシ)-エトキシ}]プロピオン酸、シュードウリジンTP1-[3-{2-(2-エトキシ)-エトキシ}]プロピオン酸、シュードウリジンTP1-メチルホスホン酸、シュードウリジンTP1-メチルホスホン酸ジエチルエステル、シュード-UTP-N1-3-プロピオン酸、シュード-UTP-N1-4-ブタン酸、シュード-UTP-N1-5-ペンタン酸、シュード-UTP-N1-6-ヘキサン酸、シュード-UTP-N1-7-ヘプタン酸、シュード-UTP-N1-メチル-p-安息香酸、シュード-UTP-N1-p-安息香酸、ワイブトシン、ヒドロキシワイブトシン、イソワイオシン、ペルオキシワイブトシン、中間体ヒドロキシワイブトシン、4-デメチルワイオシン、2,6-(ジアミノ)プリン、1-(アザ)-2-(チオ)-3-(アザ)-フェノキサジン-1-イル:1,3-(ジアザ)-2-(オキソ)-フェンチアジン(phenthiazin)-1-イル、1,3-(ジアザ)-2-(オキソ)-フェノキサジン-1-イル、1,3,5-(トリアザ)-2,6-(ジオキサ)-ナフタレン、2(アミノ)プリン、2,4,5-(トリメチル)フェニル、2’メチル、2’アミノ、2’アジド、2’フルロ-シチジン、2’メチル、2’アミノ、2’アジド、2’フルロ-アデニン、2’メチル、2’アミノ、2’アジド、2’フルロ-ウリジン、2’-アミノ-2’-デオキシリボース、2-アミノ-6-クロロ-プリン、2-アザ-イノシニル、2’-アジド-2’-デオキシリボース、2’フルオロ-2’-デオキシリボース、2’-フルオロ-修飾塩基、2’-O-メチル-リボース、2-オキソ-7-アミノピリドピリミジン-3-イル、2-オキソ-ピリドピリミジン-3-イル、2-ピリジノン、3ニトロピロール、3-(メチル)-7-(プロピニル)イソカルボスチリル、3-(メチル)イソカルボスチリル、4-(フルオロ)-6-(メチル)ベンゾイミダゾール、4-(メチル)ベンゾイミダゾール、4-(メチル)インドリル、4,6-(ジメチル)インドリル、5ニトロインドール、5置換ピリミジン、5-(メチル)イソカルボスチリル、5-ニトロインドール、6-(アザ)ピリミジン、6-(アゾ)チミン、6-(メチル)-7-(アザ)インドリル、6-クロロ-プリン、6-フェニル-ピロロ-ピリミジン-2-オン-3-イル、7-(アミノアルキルヒドロキシ)-1-(アザ)-2-(チオ)-3-(アザ)-フェンチアジン(phenthiazin)-1-イル、7-(アミノアルキルヒドロキシ)-1-(アザ)-2-(チオ)-3-(アザ)-フェノキサジン-1-イル、7-(アミノアルキルヒドロキシ)-1,3-(ジアザ)-2-(オキソ)-フェノキサジン-1-イル、7-(アミノアルキルヒドロキシ)-1,3-(ジアザ)-2-(オキソ)-フェンチアジン(phenthiazin)-1-イル、7-(アミノアルキルヒドロキシ)-1,3-(ジアザ)-2-(オキソ)-フェノキサジン-1-イル、7-(アザ)インドリル、7-(グアニジニウムアルキルヒドロキシ)-1-(アザ)-2-(チオ)-3-(アザ)-フェノキサジニル(phenoxazinl)-イル、7-(グアニジニウムアルキルヒドロキシ)-1-(アザ)-2-(チオ)-3-(アザ)-フェンチアジン(phenthiazin)-1-イル、7-(グアニジニウムアルキルヒドロキシ)-1-(アザ)-2-(チオ)-3-(アザ)-フェノキサジン-1-イル、7-(グアニジニウムアルキルヒドロキシ)-1,3-(ジアザ)-2-(オキソ)-フェノキサジン-1-イル、7-(グアニジニウムアルキル-ヒドロキシ)-1,3-(ジアザ)-2-(オキソ)-フェンチアジン(phenthiazin)-1-イル、7-(グアニジニウムアルキルヒドロキシ)-1,3-(ジアザ)-2-(オキソ)-フェノキサジン-1-イル、7-(プロピニル)イソカルボスチリル、7-(プロピニル)イソカルボスチリル、プロピニル-7-(アザ)インドリル、7-デアザ-イノシニル、7-置換1-(アザ)-2-(チオ)-3-(アザ)-フェノキサジン-1-イル、7-置換1,3-(ジアザ)-2-(オキソ)-フェノキサジン-1-イル、9-(メチル)-イミジゾピリジニル、アミノインドリル、アントラセニル、ビス-オルト-(アミノアルキルヒドロキシ)-6-フェニル-ピロロ-ピリミジン-2-オン-3-イル、ビス-オルト-置換-6-フェニル-ピロロ-ピリミジン-2-オン-3-イル、ジフルオロトリル、ヒポキサンチン、イミジゾピリジニル、イノシニル、イソカルボスチリル、イソグアニシン(Isoguanisine)、N2-置換プリン、N6-メチル-2-アミノ-プリン、N6-置換プリン、N-アルキル化誘導体、ナフタレニル、ニトロベンゾイミダゾリル、ニトロイミダゾリル、ニトロインダゾリル、ニトロピラゾリル、ヌブラリン(Nubularine)、O6-置換プリン、O-アルキル化誘導体、オルト-(アミノアルキルヒドロキシ)-6-フェニル-ピロロ-ピリミジン-2-
オン-3-イル、オルト-置換-6-フェニル-ピロロ-ピリミジン-2-オン-3-イル、オキソホルマイシンTP、パラ-(アミノアルキルヒドロキシ)-6-フェニル-ピロロ-ピリミジン-2-オン-3-イル、パラ-置換-6-フェニル-ピロロ-ピリミジン-2-オン-3-イル、ペンタセニル、フェナントラセニル(Phenanthracenyl)、フェニル、プロピニル-7-(アザ)インドリル、ピレニル、ピリドピリミジン-3-イル、ピリドピリミジン-3-イル、2-オキソ-7-アミノ-ピリドピリミジン-3-イル、ピロロ-ピリミジン-2-オン-3-イル、ピロロピリミジニル、ピロロピリジニル、スチルベンジル(Stilbenzyl)、置換1,2,4-トリアゾール、テトラセニル、ツベルシジン(Tubercidine)、キサンチン、キサントシン-5’-TP、2-チオ-ゼブラリン、5-アザ-2-チオ-ゼブラリン、7-デアザ-2-アミノ-プリン、ピリジン-4-オンリボヌクレオシド、2-アミノ-リボシド-TP、ホルマイシンA TP、ホルマイシンB TP、ピロロシン(Pyrrolosine)TP、2’-OH-アラ-アデノシンTP、2’-OH-アラ-シチジンTP、2’-OH-アラ-ウリジンTP、2’-OH-アラ-グアノシンTP、5-(2-カルボメトキシビニル)ウリジンTP、及びN6-(19-アミノ-ペンタオキサノナデシル)アデノシンTP。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド(例えば、mRNAポリヌクレオチドなどのRNAポリヌクレオチド)は、前述の修飾核酸塩基の少なくとも2つ(例えば、2つ、3つ、4つ、またはそれを超える数)の組み合わせを含む。
いくつかの実施形態では、mRNAは、少なくとも1つの化学修飾ヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも1つの化学修飾ヌクレオシドは、シュ-ドウリジン(ψ)、2-チオウリジン(s2U)、4’-チオウリジン、5-メチルシトシン、2-チオ-1-メチル-1-デアザ-シュ-ドウリジン、2-チオ-1-メチル-シュ-ドウリジン、2-チオ-5-アザ-ウリジン、2-チオ-ジヒドロシュ-ドウリジン、2-チオ-ジヒドロウリジン、2-チオ-シュ-ドウリジン、4-メトキシ-2-チオ-シュ-ドウリジン、4-メトキシ-シュ-ドウリジン、4-チオ-1-メチル-シュ-ドウリジン、4-チオ-シュ-ドウリジン、5-アザ-ウリジン、ジヒドロシュ-ドウリジン、5-メチルウリジン、5-メトキシウリジン、2’-O-メチルウリジン、1-メチル-シュ-ドウリジン(m1ψ)、1-エチル-シュ-ドウリジン(e1ψ)、5-メトキシ-ウリジン(mo5U)、5-メチル-シチジン(m5C)、α-チオ-グアノシン、α-チオ-アデノシン、5-シアノウリジン、4’-チオウリジン7-デアザ-アデニン、1-メチル-アデノシン(m1A)、2-メチル-アデニン(m2A)、N6-メチル-アデノシン(m6A)、及び2,6-ジアミノプリン,(I)、1-メチル-イノシン(m1I)、ワイオシン(imG)、メチルワイオシン(mimG)、7-デアザ-グアノシン、7-シアノ-7-デアザ-グアノシン(preQ0)、7-アミノメチル-7-デアザ-グアノシン(preQ1)、7-メチル-グアノシン(m7G)、1-メチル-グアノシン(m1G)、8-オキソ-グアノシン、7-メチル-8-オキソ-グアノシン、2,8-ジメチルアデノシン、2-ゲラニルチオウリジン、2-ライシジン、2-セレノウリジン、3-(3-アミノ-3-カルボキシプロピル)-5,6-ジヒドロウリジン、3-(3-アミノ-3-カルボキシプロピル)シュ-ドウリジン、3-メチルシュ-ドウリジン、5-(カルボキシヒドロキシメチル)-2’-O-メチルウリジンメチルエステル、5-アミノメチル-2-ゲラニルチオウリジン、5-アミノメチル-2-セレノウリジン、5-アミノメチルウリジン、5-カルバモイルヒドロキシメチルウリジン、5-カルバモイルメチル-2-チオウリジン、5-カルボキシメチル-2-チオウリジン、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-ゲラニルチオウリジン、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-セレノウリジン、5-シアノメチルウリジン、5-ヒドロキシシチジン、5-メチルアミノメチル-2-ゲラニルチオウリジン、7-アミノカルボキシプロピル-デメチルワイオシン、7-アミノカルボキシプロピルワイオシン、7-アミノカルボキシプロピルワイオシンメチルエステル、8-メチルアデノシン、N4,N4-ジメチルシチジン、N6-ホルミルアデノシン、N6-ヒドロキシメチルアデノシン、アグマチジン、環式N6-スレオニルカルバモイルアデノシン、グルタミル-キュ-オシン、メチル化中間体ヒドロキシワイブトシン、N4,N4,2’-O-トリメチルシチジン、ゲラニル化5-メチルアミノメチル-2-チオウリジン、ゲラニル化5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン、Q塩基、preQ0塩基、preQ1塩基、ならびにそれらの2つ以上の組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、少なくとも1つの化学的に修飾されたヌクレオシドは、シュードウリジン、1-メチル-シュードウリジン、1-エチル-シュードウリジン、5-メチルシトシン、5-メトキシウリジン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド(例えば、mRNAポリヌクレオチドなどのRNAポリヌクレオチド)は、前述の修飾核酸塩基の少なくとも2つ(例えば、2つ、3つ、4つ、またはそれを超える数)の組み合わせを含む。
いくつかの実施形態では、mRNAは、1つまたは複数の癌エピトープポリペプチドをコードするORFを含むウラシル修飾配列であり、ここで、mRNAは、化学的に修飾された核酸塩基、例えば、5-メトキシウラシルを含む。本発明のある特定の態様では、ポリヌクレオチドの場合と同様に、5-メトキシウラシル塩基がリボース糖に接続されている場合、結果として得られる修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドは、5-メトキシウリジンと称される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド中のウラシルは、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または約100%が5-メトキシウラシルである。1つの実施形態では、ポリヌクレオチド中のウラシルは、少なくとも95%が5-メトキシウラシルである。別の実施形態では、ポリヌクレオチド中のウラシルは、100%が5-メトキシウラシルである。
ポリヌクレオチド中のウラシルの少なくとも95%が5-メトキシウラシルである実施形態では、全体的なウラシル含量は、mRNAが好適なタンパク質発現レベルを提供しつつも、免疫応答をほとんどまたは全く誘発しないように調節することができる。いくつかの実施形態では、ORFのウラシル含量は、対応する野生型ORF中の理論的最小ウラシル含量(%Utm)の約105%~約145%、約105%~約140%、約110%~約140%、約110%~約145%、約115%~約135%、約105%~約135%、約110%~約135%、約115%~約145%、または約115%~約140%である。他の実施形態では、ORFのウラシル含量は、%UTMの約117%~約134%または118%~132%である。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の癌エピトープポリペプチドをコードするORFのウラシル含量は、%Utmの約115%、約120%、約125%、約130%、約135%、約140%、約145%、または約150%である。この文脈において、「ウラシル」という用語は、5-メトキシウラシル及び/または天然ウラシルを指し得る。
いくつかの実施形態では、本発明の1つまたは複数の癌エピトープポリペプチドをコードするmRNAのORF中のウラシル含量は、ORF中の総核酸塩基含量の約50%未満、約40%未満、約30%未満、約20%未満、約15%未満、または約12%未満である。いくつかの実施形態では、ORF中のウラシル含量は、ORFの総核酸塩基含量の約12%~約25%である。他の実施形態では、ORF中のウラシル含量は、ORFの総核酸塩基含量の約15%~約17%である。1つの実施形態では、1つまたは複数の癌エピトープポリペプチドをコードするmRNAのORF中のウラシル含量は、オープンリーディングフレーム中の総核酸塩基含量の約20%未満である。この文脈において、「ウラシル」という用語は、5-メトキシウラシル及び/または天然ウラシルを指し得る。
さらなる実施形態では、本発明の1つまたは複数の癌エピトープポリペプチドをコードするmRNAのORFは、5-メトキシウラシルを含み、1つまたは複数の癌エピトープポリペプチドをコードする対応する野生型ヌクレオチド配列よりもウラシルペア(UU)及び/またはウラシルトリプレット(UUU)及び/またはウラシルクワドラプレット(UUUU)を少ない量で含有する調節されたウラシル含量を有する。いくつかの実施形態では、本発明の1つまたは複数の癌エピトープポリペプチドをコードするmRNAのORFは、ウラシルペア及び/またはウラシルトリプレット及び/またはウラシルクワドラプレットを全く含有しない。いくつかの実施形態では、ウラシルペア及び/またはウラシルトリプレット及び/またはウラシルクワドラプレットは、ある特定の閾値未満、例えば、1つまたは複数の癌エピトープポリペプチドをコードするmRNAのORF中における出現数が、1以下、2以下、3以下、4以下、5以下、6以下、7以下、8以下、9以下、10以下、11以下、12以下、13以下、14以下、15以下、16以下、17以下、18以下、19以下、または20以下に低減される。具体的な実施形態では、本発明の1つまたは複数の癌エピトープポリペプチドをコードするmRNAのORFは、20未満、19未満、18未満、17未満、16未満、15未満、14未満、13未満、12未満、11未満、10未満、9未満、8未満、7未満、6未満、5未満、4未満、3未満、2未満もしくは1未満の非フェニルアラニンウラシルペア及び/またはトリプレットを含有する。別の実施形態では、1つまたは複数の癌エピトープポリペプチドをコードするmRNAのORFは、非フェニルアラニンウラシルペア及び/またはトリプレットを全く含有しない。
さらなる実施形態では、本発明の1つまたは複数の癌エピトープポリペプチドをコードするmRNAのORFは、5-メトキシウラシルを含み、1つまたは複数の癌エピトープポリペプチドをコードする対応する野生型ヌクレオチド配列よりもウラシルリッチクラスタを少ない量で含有する調節されたウラシル含量を有する。いくつかの実施形態では、本発明の1つまたは複数の癌エピトープポリペプチドをコードするmRNAのORFは、1つまたは複数の癌エピトープポリペプチドをコードする対応する野生型ヌクレオチド配列中の対応するウラシルリッチクラスタの長さよりも短いウラシルリッチクラスタを含有する。
さらなる実施形態では、低頻度の代替コドンが用いられる。1つまたは複数の癌エピトープポリペプチドをコードする5-メトキシウラシルを含むmRNAのORF中のコドンの少なくとも約5%、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約99%、または100%は、同義コドンセット中の置換コドンのコドン頻度よりもコドン頻度が低い代替コドンでそれぞれ置換される。ORFはまた、上記のとおり、ウラシル含量が調節されている。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の癌エピトープポリペプチドをコードするmRNAのORF中の少なくとも1つのコドンは、同義コドンセット中の置換コドンのコドン頻度よりもコドン頻度が低い代替コドンで置換される。
いくつかの実施形態では、1つまたは複数の癌エピトープポリペプチドをコードする5-メトキシウラシルを含むmRNAのORFのウラシル含量を調節すると、哺乳類細胞に投与された場合における、1つまたは複数の癌エピトープポリペプチドの発現レベルが、対応する野生型mRNAに由来する1つまたは複数の癌エピトープポリペプチドの発現レベルよりも高くなる。他の実施形態では、哺乳類細胞に投与された場合における、1つまたは複数の癌エピトープポリペプチドの発現レベルは、5-メトキシウラシルを少なくとも95%含有し、かつウラシル含量が理論的最小値の約160%、約170%、約180%、約190%、または約200%である対応するmRNAと比較して増加する。さらに他の実施形態では、哺乳類細胞に投与された場合における、1つまたは複数の癌エピトープポリペプチドの発現レベルは、対応するmRNAと比較して増加し、ここで、ウラシルの少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、または約100%が1-メチルシュードウラシルまたはシュードウラシルである。いくつかの実施形態では、哺乳類細胞は、マウス細胞、ラット細胞、またはウサギ細胞である。他の実施形態では、哺乳類細胞は、サル細胞またはヒト細胞である。いくつかの実施形態では、ヒト細胞は、HeLa細胞、BJ線維芽細胞、または末梢血単核球細胞(PBMC)である。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の癌エピトープポリペプチドは、mRNAがインビボで哺乳類細胞に投与された場合、発現する。いくつかの実施形態では、mRNAは、マウス、ウサギ、ラット、サル、またはヒトに投与される。1つの実施形態では、マウスは、ヌルマウスである。いくつかの実施形態では、mRNAは、約0.01mg/kg、約0.05mg/kg、約0.1mg/kg、または約0.15mg/kgの量でマウスに投与される。いくつかの実施形態では、mRNAは、静脈内投与または筋肉内投与される。他の実施形態では、1つまたは複数の癌エピトープポリペプチドは、mRNAがインビトロで哺乳類細胞に投与された場合、発現する。いくつかの実施形態では、発現は、少なくとも約2倍、少なくとも約5倍、少なくとも約10倍、少なくとも約50倍、少なくとも約500倍、少なくとも約1500倍、または少なくとも約3000倍増加する。他の実施形態では、発現は、少なくとも約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、60%、約70%、約80%、約90%、または約100%増加する。
いくつかの実施形態では、1つまたは複数の癌エピトープポリペプチドをコードする5-メトキシウラシルを含むmRNAのORFは、ウラシル含量を調節すると、安定性の増加を示す。いくつかの実施形態では、mRNAは、同じ条件下における対応する野生型mRNAの安定性と比べて、細胞内の安定性の増加を示す。いくつかの実施形態では、mRNAは、ヌクレアーゼ耐性、熱安定性、及び/または二次構造の安定化の向上を含む、安定性の増加を示す。いくつかの実施形態では、mRNAが示す安定性の増加は、mRNAの半減期(例えば、血漿、細胞、または組織試料中)を決定すること及び/またはmRNAによる経時的なタンパク質発現の曲線下面積(AUC)(例えば、インビトロまたはインビボ)を決定することによって測定される。mRNAは、その半減期及び/またはAUCが、同じ条件下における対応する野生型mRNAの半減期及び/またはAUCを超える場合、安定性が増加したと特定される。
いくつかの実施形態では、本発明のmRNAは、同じ条件下における対応する野生型mRNAによって誘導される免疫応答と比較して、検出可能に低い免疫応答(例えば、自然免疫または獲得免疫)を誘導する。他の実施形態では、本開示のmRNAは、1つもしくは複数の癌エピトープポリペプチドをコードするが、5-メトキシウラシルを含まないmRNAによって同じ条件下で誘導される免疫応答と比較して、または1つもしくは複数の癌エピトープポリペプチドをコードし、5-メトキシウラシルを含むが、ウラシル含量が調節されていないmRNAによって同じ条件下で誘導される免疫応答と比較して、検出可能に低い免疫応答(例えば、自然免疫または獲得免疫)を誘導する。自然免疫応答は、炎症促進性サイトカインの発現増加、細胞内PRR(RIG-I、MDA5など)の活性化、細胞死、及び/またはタンパク質翻訳の停止もしくは減少によって顕在化され得る。いくつかの実施形態では、自然免疫応答の低下は、本発明のmRNAを細胞に1回以上投与した後における、1型インターフェロン(例えば、IFN-α、IFN-β、IFN-κ、IFN-δ、IFN-ε、IFN-τ、IFN-ω、及びIFN-ζ)の発現もしくは活性レベル、またはtoll様受容体(例えば、TLR7及びTLR8)などのインターフェロン調節遺伝子の発現によって、及び/または細胞死の減少によって、測定することができる。
いくつかの実施形態では、本開示のmRNAに応答した哺乳類細胞による1型インターフェロンの発現は、対応する野生型mRNA、1つもしくは複数の癌エピトープポリペプチドをコードするが、5-メトキシウラシルを含まないmRNA、または1つもしくは複数の癌エピトープポリペプチドをコードし、5-メトキシウラシルを含むが、ウラシル含量が調節されていないmRNAと比較して、少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%、99.9%、または99.9%を超えて低下する。いくつかの実施形態では、インターフェロンは、IFN-βである。いくつかの実施形態では、本開示のmRNAの哺乳類細胞への投与によってもたらされる細胞死の頻度は、対応する野生型mRNA、1つもしくは複数の癌エピトープポリペプチドをコードするが、5-メトキシウラシルを含まないmRNA、または1つもしくは複数の癌エピトープポリペプチドをコードし、5-メトキシウラシルを含むが、ウラシル含量が調節されていないmRNAで観察される細胞死の頻度よりも10%、25%、50%、75%、85%、90%、95%、または95%を超えて少ない。いくつかの実施形態では、哺乳類細胞は、BJ線維芽細胞である。他の実施形態では、哺乳類細胞は、脾細胞である。いくつかの実施形態では、哺乳類細胞は、マウスまたはラットの細胞である。他の実施形態では、哺乳類細胞は、ヒトの細胞である。1つの実施形態では、本開示のmRNAは、mRNAが導入される哺乳類細胞の自然免疫応答を実質的に誘導しない。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、1つまたは複数の癌エピトープポリペプチドをコードするORFを含むmRNAであり、ここで、mRNA中のウラシルは、少なくとも約95%が5-メトキシウラシルであり、ORFのウラシル含量は、対応する野生型ORF中の理論的最小ウラシル含量の約115%~約135%であり、1つまたは複数の癌エピトープポリペプチドをコードするORF中のウラシル含量は、ORF中の総核酸塩基含量の約23%未満である。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の癌エピトープポリペプチドをコードするORFは、対応する野生型ORFと比較して、ORFのG/C含量(絶対量または相対量)が少なくとも約40%減少するようにさらに修飾される。さらに他の実施形態では、1つまたは複数の癌エピトープポリペプチドをコードするORFは、20未満の非フェニルアラニンウラシルペア及び/またはトリプレットを含有する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の癌エピトープポリペプチドをコードするmRNAのORF中の少なくとも1つのコドンは、同義コドンセット中の置換コドンのコドン頻度よりもコドン頻度が低い代替コドンでさらに置換される。いくつかの実施形態では、mRNA中のウラシルの少なくとも約95%が5-メトキシウラシルであり、ORFのウラシル含量が対応する野生型ORF中の理論的最小ウラシル含量の約115%~約135%である、ORFを含むmRNAによってコードされる1つまたは複数の癌エピトープポリペプチドの発現は、対応する野生型mRNA由来の1つまたは複数の癌エピトープポリペプチドの発現と比較したとき、少なくとも約10倍増加する。いくつかの実施形態では、mRNAは、オープンORFを含み、ここで、mRNA中のウラシルは、少なくとも約95%が5-メトキシウラシルであり、ORFのウラシル含量は、対応する野生型ORF中の理論的最小ウラシル含量の約115%~約135%であり、mRNAは、mRNAが導入される哺乳類細胞の自然免疫応答を実質的に誘導しない。
ある特定の実施形態では、化学修飾は、ポリヌクレオチド(例えば、mRNAポリヌクレオチドなどのRNAポリヌクレオチド)中の核酸塩基に存在する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド(例えば、mRNAポリヌクレオチドなどのRNAポリヌクレオチド)中の修飾核酸塩基は、1-メチル-シュードウリジン(m1ψ)、1-エチル-シュードウリジン(e1ψ)、5-メトキシ-ウリジン(mo5U)、5-メチル-シチジン(m5C)、シュードウリジン(ψ)、α-チオ-グアノシン及びα-チオ-アデノシンからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、前述の修飾核酸塩基の少なくとも2つ(例えば、2つ、3つ、4つ、またはそれを超える数)の組み合わせを含む。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド(例えば、mRNAポリヌクレオチドなどのRNAポリヌクレオチド)は、シュードウリジン(ψ)及び5-メチル-シチジン(m5C)を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド(例えば、mRNAポリヌクレオチドなどのRNAポリヌクレオチド)は、1-メチル-シュードウリジン(m1ψ)を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド(例えば、mRNAポリヌクレオチドなどのRNAポリヌクレオチド)は、1-エチル-シュードウリジン(e1ψ)を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド(例えば、mRNAポリヌクレオチドなどのRNAポリヌクレオチド)は、1-メチル-シュードウリジン(m1ψ)及び5-メチル-シチジン(m5C)を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド(例えば、mRNAポリヌクレオチドなどのRNAポリヌクレオチド)は、1-エチル-シュードウリジン(e1ψ)及び5-メチル-シチジン(m5C)を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド(例えば、mRNAポリヌクレオチドなどのRNAポリヌクレオチド)は、2-チオウリジン(s2U)を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド(例えば、mRNAポリヌクレオチドなどのRNAポリヌクレオチド)は、2-チオウリジン及び5-メチル-シチジン(m5C)を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド(例えば、mRNAポリヌクレオチドなどのRNAポリヌクレオチド)は、メトキシ-ウリジン(mo5U)を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド(例えば、mRNAポリヌクレオチドなどのRNAポリヌクレオチド)は、5-メトキシ-ウリジン(mo5U)及び5-メチル-シチジン(m5C)を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド(例えば、mRNAポリヌクレオチドなどのRNAポリヌクレオチド)は、2’-O-メチルウリジンを含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド(例えば、mRNAポリヌクレオチドなどのRNAポリヌクレオチド)は、2’-O-メチルウリジン及び5-メチル-シチジン(m5C)を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド(例えば、mRNAポリヌクレオチドなどのRNAポリヌクレオチド)は、N6-メチル-アデノシン(m6A)を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド(例えば、mRNAポリヌクレオチドなどのRNAポリヌクレオチド)は、N6-メチル-アデノシン(m6A)及び5-メチル-シチジン(m5C)を含む。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド(例えば、mRNAポリヌクレオチドなどのRNAポリヌクレオチド)は、特定の修飾を得るように、一様に修飾される(例えば、完全に修飾される、配列全体を通して修飾される)。例えば、ポリヌクレオチドは、5-メチル-シチジン(m5C)で一様に修飾することができ、このことは、mRNA配列におけるシトシン残基のすべてが、5-メチル-シチジン(m5C)と交換されることを意味する。別の例として、ポリヌクレオチドは、1-メチル-シュードウリジンで一様に修飾することができ、このことは、mRNA配列におけるウリジン残基のすべてが、1-メチル-シュードウリジンと交換されることを意味する。同様に、ポリヌクレオチドは、上記のもののいずれかなどの修飾残基を用いた交換によって任意の型のヌクレオシド残基が配列に存在するように一様に修飾することができる。
いくつかの実施形態では、オープンリーディングフレーム中の化学修飾ヌクレオシドは、ウリジン、アデニン、シトシン、グアニン、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基は、修飾シトシンである。修飾シトシンを有する核酸塩基及びヌクレオシドの例には、N4-アセチル-シチジン(ac4C)、5-メチル-シチジン(m5C)、5-ハロ-シチジン(例えば、5-ヨード-シチジン)、5-ヒドロキシメチル-シチジン(hm5C)、1-メチル-シュードイソシチジン、2-チオ-シチジン(s2C)、及び2-チオ-5-メチル-シチジンが含まれる。
いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基は、修飾ウリジンである。修飾ウリジンを有する核酸塩基及びヌクレオシドの例には、1-メチル-シュードウリジン(m1ψ)、1-エチル-シュードウリジン(e1ψ)、5-メトキシウリジン、2-チオウリジン、5-シアノウリジン、2’-O-メチルウリジン、及び4’-チオウリジンが含まれる。
いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基は、修飾アデニンである。修飾アデニンを有する核酸塩基及びヌクレオシドの例には、7-デアザ-アデニン、1-メチル-アデノシン(m1A)、2-メチル-アデニン(m2A)、N6-メチル-アデノシン(m6A)及び2,6-ジアミノプリンが含まれる。
いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基は、修飾グアニンである。修飾グアニンを有する核酸塩基及びヌクレオシドの例には、イノシン(I)、1-メチル-イノシン(m1I)、ワイオシン(imG)、メチルワイオシン(mimG)、7-デアザ-グアノシン、7-シアノ-7-デアザ-グアノシン(preQ0)、7-アミノメチル-7-デアザ-グアノシン(preQ1)、7-メチル-グアノシン(m7G)、1-メチル-グアノシン(m1G)、8-オキソ-グアノシン、7-メチル-8-オキソ-グアノシンが含まれる。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド(例えば、mRNAポリヌクレオチドなどのRNAポリヌクレオチド)中の核酸塩基修飾ヌクレオチドは、5-メトキシウリジンである。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド(例えば、mRNAポリヌクレオチドなどのRNAポリヌクレオチド)は、修飾核酸塩基の少なくとも2つ(例えば、2つ、3つ、4つ、またはそれを超える数)の組み合わせを含む。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド(例えば、mRNAポリヌクレオチドなどのRNAポリヌクレオチド)は、5-メトキシウリジン(5mo5U)及び5-メチル-シチジン(m5C)を含む。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド(例えば、mRNAポリヌクレオチドなどのRNAポリヌクレオチド)は、特定の修飾を得るように、一様に修飾される(例えば、完全に修飾される、配列全体を通して修飾される)。例えば、ポリヌクレオチドは、5-メトキシウリジンで一様に修飾することができ、このことは、mRNA配列におけるウリジン残基の実質的にすべてが、5-メトキシウリジンと交換されることを意味する。同様に、ポリヌクレオチドは、上記のもののいずれかなどの修飾残基を用いた交換によって任意の型のヌクレオシド残基が配列に存在するように一様に修飾することができる。
いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基は、修飾シトシンである。
いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基は、修飾ウラシルである。修飾ウラシルを有する核酸塩基及びヌクレオシドの例は、5-メトキシウラシルが挙げられる。
いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基は、修飾アデニンである。
いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基は、修飾グアニンである。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ヌクレオシド間に任意の有用なリンカーを含むことができる。骨格修飾を含む、本開示の組成物に有用であるそのようなリンカーには、次のもの:3’-アルキレンホスホネート、3’-アミノホスホロアミデート、アルケン含有骨格、アミノアルキルホスホロアミデート、アミノアルキルホスホトリエステル、ボラノホスフェート、-CH2-O-N(CH3)-CH2-、-CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2-、-CH2-NH-CH2-、キラルホスホネート、キラルホスホロチオエート、ホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格、メチレン(メチルイミノ)、メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格、メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ骨格、モルホリノ結合、-N(CH3)-CH2-CH2-、ヘテロ原子含有オリゴヌクレオシドヌクレオシド間結合、ホスフィネート、ホスホロアミデート、ホスホロジチオエート、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、PNA、シロキサン骨格、スルファメート骨格、スルフィドスルホキシド及びスルホン骨格、スルホネート及びスルホンアミド骨格、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、ならびにチオノホスホロアミデートが含まれるが、これらに限定されない。
ポリヌクレオチド(例えば、本明細書に記載のRNAまたはmRNA)に組み込むことができる、修飾されたヌクレオシド及びヌクレオチド(例えば、構成要素分子)は、リボ核酸の糖上で修飾され得る。例えば、2’ヒドロキシル基(OH)は、多数の異なる置換基で修飾または交換され得る。2’位での置換の例には、H、ハロ、任意選択で置換されたC1-6アルキル;任意選択で置換されたC1-6アルコキシ;任意選択で置換されたC6-10アリールオキシ;任意選択で置換されたC3-8シクロアルキル;任意選択で置換されたC3-8シクロアルコキシ;任意選択で置換されたC6-10アリールオキシ;任意選択で置換されたC6-10アリール-C1-6アルコキシ、任意選択で置換されたC1-12(ヘテロシクリル)オキシ;糖(例えば、リボース、ペントース、または本明細書に記載のいずれか);ポリエチレングリコール(PEG)、-O(CH2CH2O)nCH2CH2OR(式中、Rは、Hまたは任意選択で置換されたアルキルであり、nは、0~20の整数(例えば、0~4、0~8、0~10、0~16、1~4、1~8、1~10、1~16、1~20、2~4、2~8、2~10、2~16、2~20、4~8、4~10、4~16、及び4~20)である);2’-ヒドロキシルがC1-6アルキレン架橋またはC1-6ヘテロアルキレン架橋によって同じリボース糖の4’-炭素に接続されている「ロックド」核酸(LNA)(架橋の例には、メチレン、プロピレン、エーテル、またはアミノ架橋が挙げられる);本明細書に定義されるアミノアルキル;本明細書に定義されるアミノアルコキシ;本明細書に定義されるアミノ;及び本明細書に定義されるアミノ酸が挙げられるが、これらに限定されない。
一般に、RNAは、酸素を有する5員環である糖基のリボースを含む。非限定的な修飾ヌクレオチドの例には、リボース中の酸素の置換(例えば、S、Se、またはメチレンもしくはエチレンなどのアルキレンによる置換);二重結合の付加(例えば、シクロペンテニルまたはシクロヘキセニルでリボースを置換する);リボースの環縮小(例えば、4員環のシクロブタンまたはオキセタンを形成する);リボースの環拡大(例えば、アンヒドロヘキシトール、アルトリトール、マンニトール、シクロヘキサニル、シクロヘキセニル、及びモルホリノなどの追加の炭素またはヘテロ原子を有し、またホスホロアミデート骨格を有する6員環または7員環を形成する);多環式形態(例えば、トリシクロ;及び「アンロックド」形態、例えば、グリコール核酸(GNA)(例えば、リボースがホスホジエステル結合に結合したグリコール単位によって置換されている、R-GNAまたはS-GNA)、トレオース核酸(リボースがα-L-トレオフラノシル-(3’→2’)で置換されている、TNA)、及びペプチド核酸(2-アミノ-エチル-グリシン結合でリボース及びホスホジエステル骨格が置き換えられるPNA)が挙げられる。糖基はまた、リボース中の対応する炭素の立体化学配置とは反対の立体化学配置を有する1つまたは複数の炭素を含有し得る。したがって、ポリヌクレオチド分子は、例えば、アラビノースを含有するヌクレオチドを糖として含み得る。そのような糖修飾は、国際特許公開第WO2013052523号及び同第WO2014093924号に教示されており、これらの文献のそれぞれの内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
本発明のポリヌクレオチド(例えば、1つもしくは複数の癌エピトープポリペプチドまたはその機能性断片もしくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)は、糖、核酸塩基、及び/またはヌクレオシド間結合に対する修飾の組み合わせを含み得る。それらの組み合わせは、本明細書に記載のいずれか1つまたは複数の修飾を含み得る。
本開示のポリヌクレオチドは、部分的に修飾するか、または分子の全長にわたって完全に修飾してよい。例えば、1つもしくは複数もしくはすべてまたは所与の型のヌクレオチド(例えば、プリンもしくはピリミジン、またはA、G、U、Cのいずれか1つもしくは複数もしくはすべて)を、本発明のポリヌクレオチドまたはその所与の所定配列領域(例えば、ポリA尾部を含むmRNAまたはポリA尾部を除外したmRNA)において一様に修飾してよい。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチド(またはその所与の配列領域)におけるヌクレオチドXはすべて、修飾ヌクレオチドであり、Xは、ヌクレオチドA、ヌクレオチドG、ヌクレオチドU、ヌクレオチドCのいずれか1つ、またはA+G、A+U、A+C、G+U、G+C、U+C、A+G+U、A+G+C、G+U+C、もしくはA+G+Cという組み合わせのいずれか1つであり得る。
ポリヌクレオチドは、(全ヌクレオチド含量に関するか、または1つもしくは複数の型のヌクレオチド、すなわちA、G、U、もしくはCのいずれか1つもしくは複数に関して)修飾ヌクレオチドを、約1%~約100%または介在する任意の割合(例えば、1%~20%、1%~25%、1%~50%、1%~60%、1%~70%、1%~80%、1%~90%、1%~95%、10%~20%、10%~25%、10%~50%、10%~60%、10%~70%、10%~80%、10%~90%、10%~95%、10%~100%、20%~25%、20%~50%、20%~60%、20%~70%、20%~80%、20%~90%、20%~95%、20%~100%、50%~60%、50%~70%、50%~80%、50%~90%、50%~95%、50%~100%、70%~80%、70%~90%、70%~95%、70%~100%、80%~90%、80%~95%、80%~100%、90%~95%、90%~100%、及び95%~100%)で含み得る。任意の残りの割合は、非修飾のA、G、U、またはCの存在に相当することを理解されたい。
ポリヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドを最小1%~最大100%含むか、または修飾ヌクレオチドを少なくとも5%、修飾ヌクレオチドを少なくとも10%、修飾ヌクレオチドを少なくとも25%、修飾ヌクレオチドを少なくとも50%、修飾ヌクレオチドを少なくとも80%、もしくは修飾ヌクレオチドを少なくとも90%含むなど、介在する任意の割合で修飾ヌクレオチドを含み得る。例えば、ポリヌクレオチドは、修飾ウラシルまたは修飾シトシンなどの修飾ピリミジンを含み得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドにおけるウラシルの少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも25%、少なくとも50%、少なくとも80%、少なくとも90%、または100%が、修飾ウラシル(例えば、5-置換ウラシル)と交換される。修飾ウラシルは、単一の特有構造を有する化合物によって交換することができるか、または異なる構造(例えば、2つ、3つ、4つ、もしくはそれを超える数の特有構造)を有する複数の化合物によって交換することができる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドにおけるシトシンの少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも25%、少なくとも50%、少なくとも80%、少なくとも90%、または100%が修飾シトシン(例えば、5-置換シトシン)と交換される。修飾シトシンは、単一の特有構造を有する化合物によって交換することができるか、または異なる構造(例えば、2つ、3つ、4つ、もしくはそれを超える数の特有構造)を有する複数の化合物によって交換することができる。
したがって、いくつかの実施形態では、RNAワクチンは、5’UTR要素、任意選択でコドン最適化オープンリーディングフレーム、及び3’UTR要素、ポリ(A)配列及び/またはポリアデニル化シグナルを含み、RNAは、化学的に修飾されない。
いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基は、修飾ウラシルである。修飾ウラシルを有する核酸塩基及びヌクレオシドの例には、シュードウリジン(ψ)、ピリジン-4-オンリボヌクレオシド、5-アザ-ウリジン、6-アザ-ウリジン、2-チオ-5-アザ-ウリジン、2-チオ-ウリジン(s2U)、4-チオ-ウリジン(s4U)、4-チオ-シュードウリジン、2-チオ-シュードウリジン、5-ヒドロキシ-ウリジン(ho5U)、5-アミノアリル-ウリジン、5-ハロ-ウリジン(例えば、5-ヨード-ウリジンまたは5-ブロモ-ウリジン)、3-メチル-ウリジン(m3U)、5-メトキシ-ウリジン(mo5U)、ウリジン5-オキシ酢酸(cmo5U)、ウリジン5-オキシ酢酸メチルエステル(mcmo5U)、5-カルボキシメチル-ウリジン(cm5U)、1-カルボキシメチル-シュードウリジン、5-カルボキシヒドロキシメチル-ウリジン(chm5U)、5-カルボキシヒドロキシメチル-ウリジンメチルエステル(mchm5U)、5-メトキシカルボニルメチル-ウリジン(mcm5U)、5-メトキシカルボニルメチル-2-チオ-ウリジン(mcm5s2U)、5-アミノメチル-2-チオ-ウリジン(nm5s2U)、5-メチルアミノメチル-ウリジン(mnm5U)、5-メチルアミノメチル-2-チオ-ウリジン(mnm5s2U)、5-メチルアミノメチル-2-セレノ-ウリジン(mnm5se2U)、5-カルバモイルメチル-ウリジン(ncm5U)、5-カルボキシメチルアミノメチル-ウリジン(cmnm5U)、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオ-ウリジン(cmnm5s2U)、5-プロピニル-ウリジン、1-プロピニル-シュードウリジン、5-タウリノメチル-ウリジン(τm5U)、1-タウリノメチル-シュードウリジン、5-タウリノメチル-2-チオ-ウリジン(τm5s2U)、1-タウリノメチル-4-チオ-シュードウリジン、5-メチル-ウリジン(m5U、すなわち、核酸塩基であるデオキシチミンを有する)、1-メチル-シュードウリジン(m1ψ)、1-エチル-シュードウリジン(e1ψ)、5-メチル-2-チオ-ウリジン(m5s2U)、1-メチル-4-チオ-シュードウリジン(m1s4ψ)、4-チオ-1-メチル-シュードウリジン、3-メチル-シュードウリジン(m3ψ)、2-チオ-1-メチル-シュードウリジン、1-メチル-1-デアザ-シュードウリジン、2-チオ-1-メチル-1-デアザ-シュードウリジン、ジヒドロウリジン(D)、ジヒドロシュードウリジン、5,6-ジヒドロウリジン、5-メチル-ジヒドロウリジン(m5D)、2-チオ-ジヒドロウリジン、2-チオ-ジヒドロシュードウリジン、2-メトキシ-ウリジン、2-メトキシ-4-チオ-ウリジン、4-メトキシ-シュードウリジン、4-メトキシ-2-チオ-シュードウリジン、N1-メチル-シュードウリジン、3-(3-アミノ-3-カルボキシプロピル)ウリジン(acp3U)、1-メチル-3-(3-アミノ-3-カルボキシプロピル)シュードウリジン(acp3ψ)、5-(イソペンテニルアミノメチル)ウリジン(inm5U)、5-(イソペンテニルアミノメチル)-2-チオ-ウリジン(inm5s2U)、α-チオ-ウリジン、2’-O-メチル-ウリジン(Um)、5、2’-O-ジメチル-ウリジン(m5Um)、2’-O-メチル-シュードウリジン(ψm)、2-チオ-2’-O-メチル-ウリジン(s2Um)、5-メトキシカルボニルメチル-2’-O-メチル-ウリジン(mcm5Um)、5-カルバモイルメチル-2’-O-メチル-ウリジン(ncm5Um)、5-カルボキシメチルアミノメチル-2’-O-メチル-ウリジン(cmnm5Um)、3、2’-O-ジメチル-ウリジン(m3Um)、及び5-(イソペンテニルアミノメチル)-2’-O-メチル-ウリジン(inm5Um)、1-チオ-ウリジン、デオキシチミジン、2’-F-アラ-ウリジン、2’-F-ウリジン、2’-OH-アラ-ウリジン、5-(2-カルボメトキシビニル)ウリジン、ならびに5-[3-(1-E-プロペニルアミノ)]ウリジンが含まれる。
いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基は、修飾シトシンである。修飾シトシンを有する核酸塩基及びヌクレオシドの例には、5-アザ-シチジン、6-アザ-シチジン、シュードイソシチジン、3-メチル-シチジン(m3C)、N4-アセチル-シチジン(ac4C)、5-ホルミル-シチジン(f5C)、N4-メチル-シチジン(m4C)、5-メチル-シチジン(m5C)、5-ハロ-シチジン(例えば、5-ヨード-シチジン)、5-ヒドロキシメチル-シチジン(hm5C)、1-メチル-シュードイソシチジン、ピロロ-シチジン、ピロロ-シュードイソシチジン、2-チオ-シチジン(s2C)、2-チオ-5-メチル-シチジン、4-チオ-シュードイソシチジン、4-チオ-1-メチル-シュードイソシチジン、4-チオ-1-メチル-1-デアザ-シュードイソシチジン、1-メチル-1-デアザ-シュードイソシチジン、ゼブラリン、5-アザ-ゼブラリン、5-メチル-ゼブラリン、5-アザ-2-チオ-ゼブラリン、2-チオ-ゼブラリン、2-メトキシ-シチジン、2-メトキシ-5-メチル-シチジン、4-メトキシ-シュードイソシチジン、4-メトキシ-1-メチル-シュードイソシチジン、ライシジン(k2C)、α-チオ-シチジン、2’-O-メチル-シチジン(Cm)、5、2’-O-ジメチル-シチジン(m5Cm)、N4-アセチル-2’-O-メチル-シチジン(ac4Cm)、N4、2’-O-ジメチル-シチジン(m4Cm)、5-ホルミル-2’-O-メチル-シチジン(f5Cm)、N4,N4,2’-O-トリメチル-シチジン(m4
2Cm)、1-チオ-シチジン、2’-F-アラ-シチジン、2’-F-シチジン、及び2’-OH-アラ-シチジンが含まれる。
いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基は、修飾アデニンである。修飾アデニンを有する核酸塩基及びヌクレオシドの例には、2-アミノ-プリン、2,6-ジアミノプリン、2-アミノ-6-ハロ-プリン(例えば、2-アミノ-6-クロロ-プリン)、6-ハロ-プリン(例えば、6-クロロ-プリン)、2-アミノ-6-メチル-プリン、8-アジド-アデノシン、7-デアザ-アデニン、7-デアザ-8-アザ-アデニン、7-デアザ-2-アミノ-プリン、7-デアザ-8-アザ-2-アミノ-プリン、7-デアザ-2,6-ジアミノプリン、7-デアザ-8-アザ-2,6-ジアミノプリン、1-メチル-アデノシン(m1A)、2-メチル-アデニン(m2A)、N6-メチル-アデノシン(m6A)、2-メチルチオ-N6-メチル-アデノシン(ms2m6A)、N6-イソペンテニル-アデノシン(i6A)、2-メチルチオ-N6-イソペンテニル-アデノシン(ms2i6A)、N6-(シス-ヒドロキシイソペンテニル)アデノシン(io6A)、2-メチルチオ-N6-(シス-ヒドロキシイソペンテニル)アデノシン(ms2io6A)、N6-グリシニルカルバモイル-アデノシン(g6A)、N6-スレオニルカルバモイル-アデノシン(t6A)、N6-メチル-N6-スレオニルカルバモイル-アデノシン(m6t6A)、2-メチルチオ-N6-スレオニルカルバモイル-アデノシン(ms2g6A)、N6,N6-ジメチル-アデノシン(m6
2A)、N6-ヒドロキシノルバリルカルバモイル-アデノシン(hn6A)、2-メチルチオ-N6-ヒドロキシノルバリルカルバモイル-アデノシン(ms2hn6A)、N6-アセチル-アデノシン(ac6A)、7-メチル-アデニン、2-メチルチオ-アデニン、2-メトキシ-アデニン、α-チオ-アデノシン、2’-O-メチル-アデノシン(Am)、N6,2’-O-ジメチル-アデノシン(m6Am)、N6,N6,2’-O-トリメチル-アデノシン(m6
2Am)、1,2’-O-ジメチル-アデノシン(m1Am)、2’-O-リボシルアデノシン(ホスフェート)(Ar(p))、2-アミノ-N6-メチル-プリン、1-チオ-アデノシン、8-アジド-アデノシン、2’-F-アラ-アデノシン、2’-F-アデノシン、2’-OH-アラ-アデノシン、及びN6-(19-アミノ-ペンタオキサノナデシル)-アデノシンが含まれる。
いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基は、修飾グアニンである。修飾グアニンを有する核酸塩基及びヌクレオシドの例には、イノシン(I)、1-メチル-イノシン(m1I)、ワイオシン(imG)、メチルワイオシン(mimG)、4-デメチル-ワイオシン(imG-14)、イソワイオシン(imG2)、ワイブトシン(yW)、ペルオキシワイブトシン(o2yW)、ヒドロキシワイブトシン(OhyW)、中間体ヒドロキシワイブトシン(OhyW*)、7-デアザ-グアノシン、キューオシン(Q)、エポキシキューオシン(oQ)、ガラクトシル-キューオシン(galQ)、マンノシル-キューオシン(manQ)、7-シアノ-7-デアザ-グアノシン(preQ0)、7-アミノメチル-7-デアザ-グアノシン(preQ1)、アルカエオシン(G+)、7-デアザ-8-アザ-グアノシン、6-チオ-グアノシン、6-チオ-7-デアザ-グアノシン、6-チオ-7-デアザ-8-アザ-グアノシン、7-メチル-グアノシン(m7G)、6-チオ-7-メチル-グアノシン、7-メチル-イノシン、6-メトキシ-グアノシン、1-メチル-グアノシン(m1G)、N2-メチル-グアノシン(m2G)、N2,N2-ジメチル-グアノシン(m2
2G)、N2,7-ジメチル-グアノシン(m2,7G)、N2,N2,7-ジメチル-グアノシン(m2,2,7G)、8-オキソ-グアノシン、7-メチル-8-オキソ-グアノシン、1-メチル-6-チオ-グアノシン、N2-メチル-6-チオ-グアノシン、N2,N2-ジメチル-6-チオ-グアノシン、α-チオ-グアノシン、2’-O-メチル-グアノシン(Gm)、N2-メチル-2’-O-メチル-グアノシン(m2Gm)、N2,N2-ジメチル-2’-O-メチル-グアノシン(m2
2Gm)、1-メチル-2’-O-メチル-グアノシン(m1Gm)、N2,7-ジメチル-2’-O-メチル-グアノシン(m2,7Gm)、2’-O-メチル-イノシン(Im)、1,2’-O-ジメチル-イノシン(m1Im)、2’-O-リボシルグアノシン(ホスフェート)(Gr(p))、1-チオ-グアノシン、O6-メチル-グアノシン、2’-F-アラ-グアノシン、及び2’-F-グアノシンが含まれる。
RNA(例えば、mRNA)のインビトロでの転写
本開示の癌ワクチンは、mRNA(例えば、修飾mRNA)などのRNAポリヌクレオチドを少なくとも1つ含む。mRNAは、例えば、鋳型DNAからインビトロで転写され、こうした鋳型DNAは、「インビトロの転写鋳型」と称される。いくつかの実施形態では、インビトロの転写鋳型は、5’非翻訳(UTR)領域をコードし、オープンリーディングフレームを含み、3’UTR及びポリA尾部をコードする。インビトロの転写鋳型の特定の核酸配列組成及び長さは、鋳型によってコードされるmRNAに依存することになる。
本開示の癌ワクチンは、mRNA(例えば、修飾mRNA)などのRNAポリヌクレオチドを少なくとも1つ含む。mRNAは、例えば、鋳型DNAからインビトロで転写され、こうした鋳型DNAは、「インビトロの転写鋳型」と称される。いくつかの実施形態では、インビトロの転写鋳型は、5’非翻訳(UTR)領域をコードし、オープンリーディングフレームを含み、3’UTR及びポリA尾部をコードする。インビトロの転写鋳型の特定の核酸配列組成及び長さは、鋳型によってコードされるmRNAに依存することになる。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、200~3,000ヌクレオチドを含む。例えば、ポリヌクレオチドは、200~500、200~1000、200~1500、200~3000、500~1000、500~1500、500~2000、500~3000、1000~1500、1000~2000、1000~3000、1500~3000、または2000~3000ヌクレオチドを含み得る。
他の態様では、本発明は、IVT法によるmRNA癌ワクチンの調製方法に関する。インビトロ転写(IVT)法では、ほとんど任意の配列のRNA分子の鋳型誘導型の合成が可能になる。IVT法を使用して合成することができるRNA分子のサイズ範囲は、短いオリゴヌクレオチドから数千塩基という長い核酸ポリマーにまで及ぶ。IVT法では、大量(例えば、マイクログラム量~ミリグラム量)のRNA転写物の合成が可能になる(Beckert et al.,Synthesis of RNA by in vitro transcription,Methods Mol Biol.703:29-41(2011)、Rio et al.RNA:A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor:Cold Spring Harbor Laboratory Press,2011,205-220.、Cooper,Geoffery M.The Cell:A Molecular Approach.4th ed.Washington D.C.:ASM Press,2007.262-299)。一般に、IVTでは、目的とする配列の上流に位置するプロモーター配列を特徴とするDNA鋳型が利用される。プロモーター配列は、バクテリオファージ起源のもの(例えば、T7、T3、またはSP6のプロモーター配列)が最も一般的であるが、デノボ設計されたものを含む多くの他のプロモーター配列も許容可能である。典型的には、特定のバクテリオファージプロモーター配列に対応するRNAポリメラーゼを使用することによってDNA鋳型の転写を達成することが最良である。RNAポリメラーゼの例には、限定はされないが、数ある中でも特に、T7RNAポリメラーゼ、T3RNAポリメラーゼ、またはSP6RNAポリメラーゼが含まれる。IVTは、一般に、二本鎖DNAにおいて開始されるが、一本鎖ででも進行可能である。
癌抗原、または例えば、活性化癌遺伝子変異ペプチドをコードする、例えば、mRNAなどの、本開示のmRNAワクチンは、任意の適切な合成方法を使用して調製してよいことを理解されたい。例えば、いくつかの実施形態では、本開示のmRNAワクチンは、鋳型としての一本鎖のボトム鎖DNA、及びプロモーターとして働く相補的オリゴヌクレオチドからIVTを使用して調製される。一本鎖のボトム鎖DNAは、RNAをインビトロで転写するためのDNA鋳型として働き得るものであり、例えば、プラスミド、PCR産物、または化学合成から得てよい。いくつかの実施形態では、一本鎖のボトム鎖DNAは、環状の鋳型から直鎖化される。一本鎖のボトム鎖DNA鋳型は、一般に、IVTが容易になるように、例えば、バクテリオファージのプロモーター配列などのプロモーター配列を含む。一本鎖のボトム鎖DNAと、プロモーター相補的オリゴヌクレオチドであるトップ鎖と、を使用するRNAの調製方法は、当該技術分野において知られている。例示の方法では、限定はされないが、鋳型であるDNAボトム鎖と、プロモーター相補的オリゴヌクレオチドであるトップ鎖(例えば、T7プロモーター相補的オリゴヌクレオチド、T3プロモーター相補的オリゴヌクレオチド、またはSP6プロモーター相補的オリゴヌクレオチド)と、のアニーリングが実施された後、例えば、T7RNAポリメラーゼ、T3RNAポリメラーゼ、またはSP6RNAポリメラーゼなどの、プロモーター配列に対応するRNAポリメラーゼを使用するIVTが実施される。
IVT法は、二本鎖のDNA鋳型を使用しても実施することができる。例えば、いくつかの実施形態では、二本鎖のDNA鋳型は、当該技術分野において利用可能な鎖伸長技術を使用し、相補的オリゴヌクレオチドを伸長させて相補的DNA鎖を生成することによって調製される。いくつかの実施形態では、プロモーター配列、及び目的とするエピトープを1つまたは複数コードする配列を含む一本鎖のボトム鎖DNA鋳型が、プロモーター相補的オリゴヌクレオチドであるトップ鎖へとアニーリングされ、PCR様プロセスに供されることでトップ鎖が伸長して二本鎖のDNA鋳型が生成する。あるいは、またはさらに、ボトム鎖プロモーター配列に相補的であり、かつ目的とするエピトープを1つまたは複数コードする配列に相補的な配列を含むトップ鎖DNAが、ボトム鎖プロモーターオリゴヌクレオチドへとアニーリングされ、PCR様プロセスに供されることでボトム鎖が伸長して二本鎖のDNA鋳型が生成する。いくつかの実施形態では、PCR様サイクルの回数範囲は、1~20サイクルであり、例えば、3~10サイクルである。いくつかの実施形態では、二本鎖のDNA鋳型は、完全または部分的に化学合成法によって合成される。二本鎖のDNA鋳型は、本明細書に記載のインビトロでの転写に供すことができる。
別の態様では、例えば、癌抗原またはエピトープをコードするmRNAなどの、本開示のmRNAワクチンは、それらの配列が重なり合う部分全体が相補的な2つのDNA鎖を使用して調製し、相補部分がアニーリングしたときに一本鎖のオーバーハング(すなわち、粘着末端)を残してよい。こうした一本鎖オーバーハングは、もう一方の鎖を鋳型として使用して伸長し、それによって二本鎖DNAを生成することによって二本鎖にすることができる。場合によっては、このプライマー伸長法では、例えば、トップ鎖DNA合成法によって得られる鋳型DNA配列に組み込まれるサイズと比較して、鋳型DNA配列に組み込まれることになるORFを長鎖化することが可能である。プライマー伸長法では、第1の鎖(5”から3’の方向)の3’末端の一部が、第2の鎖(3’から5’の方向)3’末端の一部に相補的である。そのような実施形態のいくつかでは、一本鎖の第1鎖DNAは、プロモーター(例えば、T7、T3、またはSP6)の配列、任意選択で5’-UTR、及びORFの一部またはすべて(例えば、ORFの5’末端の一部)を含み得る。いくつかの実施形態では、一本鎖の第2鎖DNAは、ORFの一部またはすべてに相補的な配列(例えば、ORFの3’末端に相補的な部分)、及び任意選択で3’-UTR、終始配列、及び/またはポリ(A)尾部を含み得る。2つの合成DNA鎖を使用するRNAの調製方法では、重なり合う相補部分を有する2つの鎖のアニーリングが実施された後、1回または複数回のPCR様サイクルを使用することで鎖が伸長して二本鎖のDNA鋳型が生成するプライマー伸長が実施され得る。いくつかの実施形態では、PCR様サイクルの回数範囲は、1~20サイクルであり、例えば、3~10サイクルである。そのような二本鎖DNAは、本明細書に記載のインビトロでの転写に供すことができる。
別の態様では、例えば、癌抗原またはエピトープをコードするmRNAなどの、本開示のmRNAワクチンは、gBlocks(登録商標)(Integrated DNA Technologies,Coralville,Iowa)などの合成の二本鎖直鎖DNA分子を二本鎖のDNA鋳型として使用して調製してよい。そのような合成二本鎖直鎖DNA分子の利点は、そうしたものによって、mRNAがそこから生成するための、より長い鋳型が与えられることである。例えば、gBlocks(登録商標)のサイズ範囲は、45~1000(例えば、125~750ヌクレオチド)であり得る。いくつかの実施形態では、合成の二本鎖直鎖DNA鋳型は、全長の5’-UTR、全長の3’-UTR、または両方を含む。全長の5’-UTRは、最大で100ヌクレオチド長であり得、例えば、約40~60ヌクレオチド長である。全長の3’-UTRは、最大で300ヌクレオチド長であり得、例えば、約100~150ヌクレオチド長である。
より長い構築物の生成を容易にするために、3’側の鎖に重複配列を有するように設計された2つ以上の二本鎖直鎖DNA分子及び/または遺伝子断片を、当該技術分野において知られる方法を使用して共に会合させてよい。例えば、こうした二本鎖DNA断片の5’末端から塩基を切断する中温性エキソヌクレアーゼを使用した後、新たに形成された相補的な一本鎖3’末端をアニーリングさせてから、ポリメラーゼ依存性の伸長によって任意の一本鎖ギャップを埋め、最終的に、DNAリガーゼによってDNAセグメントを共有結合で連結してGibson Assembly(商標)法(Synthetic Genomics,Inc.,La Jolla,CA)を実施してよい。
別の態様では、例えば、癌抗原またはエピトープをコードするmRNAなどの、本開示のmRNAワクチンは、RNAの化学合成を使用して調製してよい。方法は、ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む第1のポリヌクレオチド、及び5’-UTRを含む第2のポリヌクレオチドの、固形担体に複合化した相補的ポリヌクレオチドへのアニーリングを含む。その後、第1のポリヌクレオチドの5’末端に対して、第2のポリヌクレオチドの3’末端が適切な条件下でライゲーションされる。適切な条件には、DNAリガーゼの使用が含まれる。ライゲーション反応によって第1のライゲーション産物が生成する。その後、第1のライゲーション産物の3’末端に対して、3’-UTRを含む第3のポリヌクレオチドの5’末端が適切な条件下でライゲーションされる。第2のライゲーション反応に適切な条件には、RNAリガーゼが含まれる。第2のライゲーション反応では、第2のライゲーション産物が生成する。第2のライゲーション産物を固形担体から遊離させることで、目的とするポリペプチドをコードするmRNAが生成する。いくつかの実施形態では、mRNAは、30~1000ヌクレオチドである。
目的とするポリペプチドをコードするmRNAは、ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む第1のポリヌクレオチド、及び3’-UTRを含む第2のポリヌクレオチドを、固形担体に複合化した相補的ポリヌクレオチドに結合することによって調製してもよい。第1のポリヌクレオチドの3’末端に対して、第2のポリヌクレオチドの5’末端が適切な条件下でライゲーションされる。適切な条件には、DNAリガーゼが含まれる。方法によって、第1のライゲーション産物が生成する。第1のライゲーション産物に対して、5’-UTRを含む第3のポリヌクレオチドが適切な条件でライゲーションされることで第2のライゲーション産物が生成する。適切な条件には、T4RNAなどのRNAリガーゼが含まれる。第2のライゲーション産物を固形担体から遊離させることで、目的とするポリペプチドをコードするmRNAが生成する。
いくつかの実施形態では、第1のポリヌクレオチドは、5’-トリホスフェート及び3’-OHを特徴とする。他の実施形態では、第2のポリヌクレオチドは、3’-OHを含む。さらに他の実施形態では、第3のポリヌクレオチドは、5’-トリホスフェート及び3’-OHを含む。第2のポリヌクレオチドは、5’-キャップ構造も含み得る。方法は、第3のポリヌクレオチドの3’末端に対する、ポリ-A領域を含む第4のポリヌクレオチドのライゲーション段階もさらに含み得る。第4のポリヌクレオチドは、5’-トリホスフェートを含み得る。
方法は、逆相精製を含んでも含まなくてもよい。方法は、洗浄段階も含み得、固形担体は、未反応のポリヌクレオチドを除去するために洗浄される。固形担体は、例えば、捕捉樹脂であり得る。いくつかの実施形態では、方法は、dTによる精製を含む。
本開示によれば、本開示のmRNAワクチンをコードする鋳型DNAは、1つまたは複数の癌エピトープをコードするオープンリーディングフレーム(ORF)を含む。いくつかの実施形態では、鋳型DNAは、最大で1000ヌクレオチドのORFを含み、例えば、約10~350ヌクレオチド、約30~300ヌクレオチド、または約50~250ヌクレオチドのORFを含む。いくつかの実施形態では、鋳型DNAは、約150ヌクレオチドのORFを含む。いくつかの実施形態では、鋳型DNAは、約200ヌクレオチドのORFを含む。
いくつかの実施形態では、IVT転写物は、反応が生じた後のIVT反応混合物の構成成分から精製される。例えば、未精製のIVT混合物は、元の鋳型を消化するために、RNAseを含まないDNaseで処理してよい。mRNAは、当該技術分野において知られる方法を使用して精製することができ、こうした方法には、限定はされないが、有機溶媒を使用する沈殿、またはカラムに基づく精製方法が含まれる。RNAを精製するためには、例えば、MEGACLEAR(商標)キット(Ambion,Austin,TX)などの市販のキットが利用可能である。mRNAは、当該技術分野において知られる方法を使用して定量化することができ、こうした方法には、限定はされないが、例えば、NanoDropなどの市販の機器を用いるものが含まれる。精製されたmRNAは、例えば、RNAのサイズが正しいかの確認、及び/またはRNAに分解が生じていないかの確認を行うためにアガロースゲル電気泳動によって分析することができる。
非翻訳領域(UTR)
非翻訳領域(UTR)は、開始コドン(5’UTR)の前と終止コドン(3’UTR)の後の翻訳されないポリヌクレオチドの核酸領域である。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の癌抗原またはエピトープをコードするオープンリーディングフレーム(ORF)を含む本発明のポリヌクレオチド(例えば、リボ核酸(RNA)、例えば、メッセンジャーRNA(mRNA))は、UTR(例えば、5’UTRもしくはその機能性断片、3’UTRもしくはその機能性断片、またはそれらの組み合わせ)をさらに含む。
非翻訳領域(UTR)は、開始コドン(5’UTR)の前と終止コドン(3’UTR)の後の翻訳されないポリヌクレオチドの核酸領域である。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の癌抗原またはエピトープをコードするオープンリーディングフレーム(ORF)を含む本発明のポリヌクレオチド(例えば、リボ核酸(RNA)、例えば、メッセンジャーRNA(mRNA))は、UTR(例えば、5’UTRもしくはその機能性断片、3’UTRもしくはその機能性断片、またはそれらの組み合わせ)をさらに含む。
UTRは、ポリヌクレオチド中のコーディング領域に対して相同または異種であってよい。いくつかの実施形態では、UTRは、1つまたは複数の癌エピトープポリペプチドをコードするORFに対して相同である。いくつかの実施形態では、UTRは、1つまたは複数の癌エピトープポリペプチドをコードするORFに対して異種である。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、2つ以上の5’UTRまたはその機能性断片を含み、そのそれぞれは、同じまたは異なるヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、2つ以上の3’UTRまたはその機能性断片を含み、そのそれぞれは、同じまたは異なるヌクレオチド配列を有する。
いくつかの実施形態では、5’UTRもしくはその機能性断片、3’UTRもしくはその機能性断片、またはこれらの任意の組み合わせは、配列最適化される。
いくつかの実施形態では、5’UTRもしくはその機能性断片、3’UTRもしくはその機能性断片、またはこれらの任意の組み合わせは、少なくとも1つの化学的に修飾された核酸塩基、例えば、5-メトキシウラシルを含む。
UTRは、調節的役割、例えば、安定性、局在化及び/または翻訳効率の向上または低下をもたらす特徴を有し得る。UTRを含むポリヌクレオチドは、細胞、組織、または器官に投与することができ、1つまたは複数の調節的特徴は、常法を使用して測定することができる。いくつかの実施形態では、5’UTRまたは3’UTRの機能性断片は、全長5’UTRまたは3’UTRの1つまたは複数の調節的特徴をそれぞれ含む。
天然5’UTRは、翻訳開始に関与するという特徴を持つ。天然5’UTRは、リボソームによって多くの遺伝子の翻訳が開始されるプロセスに関与することが一般的に知られているコザック配列のような特徴を保持する。コザック配列は、コンセンサスCCR(A/G)CCAUGG(配列番号246)(配列中、Rは、後ろに「G」がもう1つ続く開始コドン(AUG)の3塩基上流にあるプリン(アデニンまたはグアニン)である)を有する。5’UTRはまた、伸長因子の結合に関与する二次構造を形成することが知られている。
特定の標的器官に豊富に発現される遺伝子に典型的に見出される特徴を操作することによって、ポリヌクレオチドの安定性及びタンパク質の産生を増強することができる。例えば、アルブミン、血清アミロイドA、アポリポタンパク質A/B/E、トランスフェリン、αフェトプロテイン、エリスロポエチン、または第VIII因子などの、肝臓に発現されるmRNAの5’UTRを導入すると、肝細胞株または肝臓でのポリヌクレオチドの発現を増強することができる。同様に、筋肉(例えば、MyoD、ミオシン、ミオグロビン、ミオゲニン、ヘルクリン)、内皮細胞(例えば、Tie-1、CD36)、骨髄細胞(例えば、C/EBP、AML1、G-CSF、GM-CSF、CD11b、MSR、Fr-1、i-NOS)、白血球(例えば、CD45、CD18)、脂肪組織(例えば、CD36、GLUT4、ACRP30、アディポネクチン)及び肺上皮細胞(例えば、SP-A/B/C/D)に対しては、その組織における発現を改善するために、他の組織特異的mRNAに由来する5’UTRを使用することができる。
いくつかの実施形態では、UTRは、転写物のファミリーであって、そのタンパク質が共通の機能、構造、特徴または特性を有する転写物のファミリーから選択される。例えば、コードされたポリペプチドは、特定の細胞内、組織内または発達中のある時期に発現するタンパク質のファミリー(すなわち、少なくとも1つの機能、構造、特徴、局在化、起点、または発現パターンを共有するファミリー)に属し得る。遺伝子またはmRNAのいずれかに由来するUTRを、同じまたは異なるタンパク質ファミリーの任意の他のUTRと交換することによって、新しいポリヌクレオチドを作ることができる。
いくつかの実施形態では、5’UTR及び3’UTRは、異種であり得る。いくつかの実施形態では、5’UTRは、3’UTRとは異なる種に由来し得る。いくつかの実施形態では、3’UTRは、5’UTRとは異なる種に由来し得る。
共同所有の国際特許出願第PCT/US2014/021522号(国際公開第WO/2014/164253号、当該文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる)は、ORFに対する隣接領域として本発明のポリヌクレオチドに利用することができるUTRの例の一覧を提供する。
本出願のUTRの例には、限定するものではないが、次の核酸配列に由来する1つまたは複数の5’UTR及び/または3’UTRが挙げられる:α-グロビンまたはβ-グロビンなどのグロビン(例えば、Xenopus、マウス、ウサギ、またはヒトグロビン);強力なコザック翻訳開始シグナル;CYBA(例えば、ヒトシトクロムb-245αポリペプチド);アルブミン(例えば、ヒトアルブミン7);HSD17B4(ヒドロキシステロイド(17-β)デヒドロゲナーゼ);ウイルス(例えば、タバコエッチウイルス(TEV)、ベネズエラウマ脳炎ウイルス(VEEV)、デング熱ウイルス、サイトメガロウイルス(CMV)(例えば、CMV前初期1(IE1))、肝炎ウイルス(例えば、B型肺炎ウイルス)、シンドビスウイルス、またはPAVオオムギ黄萎ウイルス);熱ショックタンパク質(例えば、hsp70);翻訳開始因子(例えば、elF4G);グルコース輸送体(例えば、hGLUT1(ヒトグルコース輸送体1));アクチン(例えば、ヒトαアクチンまたはβアクチン);GAPDH;チューブリン;ヒストン;クエン酸回路酵素;トポイソメラーゼ(例えば、5’TOPモチーフ(オリゴピリミジントラクト)を欠くTOP遺伝子の5’UTR);リボソームタンパク質大型32(L32);リボソームタンパク質(例えば、ヒトまたはマウスリボソームタンパク質、例えば、rps9など);ATPシンターゼ(例えば、ATP5A1またはミトコンドリアH+-ATPシンターゼのβサブユニット);成長ホルモン(例えば、ウシ(bGH)またはヒト(hGH));伸長因子(例えば、伸長因子1 α1(EEF1A1));マンガンスーパーオキシドジスムターゼ(MnSOD);筋細胞エンハンサー因子2A(MEF2A);β-F1-ATPase、クレアチンキナーゼ、ミオグロビン、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF);コラーゲン(例えば、I型コラーゲンα2(Col1A2)、I型コラーゲンα1(Col1A1)、VI型コラーゲンα2(Col6A2)、VI型コラーゲンα1(Col6A1));リボフォリン(例えば、リボフォリンI(RPNI));低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質(例えば、LRP1);カルジオトロフィン様サイトカイン因子(例えば、Nnt1);カルレティキュリン(Calr);プロコラーゲン-リジン,2-オキソグルタル酸5-ジオキシゲナーゼ1(Plod1);及びヌクレオバインディン(例えば、Nucb1)。
5’UTR及び3’UTRの他の例には、Kariko et al.,Mol.Ther.2008 16(11):1833-1840;Kariko et al.,Mol.Ther.2012 20(5):948-953;Kariko et al.,Nucleic Acids Res.2011 39(21):e142;Strong et al.,Gene Therapy 1997 4:624-627;Hansson et al.,J.Biol.Chem.2015 290(9):5661-5672;Yu et al.,Vaccine 2007 25(10):1701-1711;Cafri et al.,Mol.Ther.2015 23(8):1391-1400;Andries et al.,Mol.Pharm.2012 9(8):2136-2145;Crowley et al.,Gene Ther.2015 Jun 30,doi:10.1038/gt.2015.68;Ramunas et al.,FASEB J.2015 29(5):1930-1939;Wang et al.,Curr.Gene Ther.2015 15(4):428-435;Holtkamp et al.,Blood 2006 108(13):4009-4017;Kormann et al.,Nat.Biotechnol.2011 29(2):154-157;Poleganov et al.,Hum.Gen.Ther.2015 26(11):751-766;Warren et al.,Cell Stem Cell 2010 7(5):618-630;Mandal and Rossi,Nat.Protoc.2013 8(3):568-582;Holcik and Liebhaber,PNAS 1997 94(6):2410-2414;Ferizi et al.,Lab Chip.2015 15(17):3561-3571;Thess et al.,Mol.Ther.2015 23(9):1456-1464;Boros et al.,PLoS One 2015 10(6):e0131141;Boros et al.,J.Photochem.Photobiol.B.2013 129:93-99;Andries et al.,J.Control.Release 2015 217:337-344;Zinckgraf et al.,Vaccine 2003 21(15):1640-9;Garneau et al.,J.Virol.2008 82(2):880-892;Holden and Harris,Virology 2004 329(1):119-133;Chiu et al.,J.Virol.2005 79(13):8303-8315;Wang et al.,EMBO J.1997 16(13):4107-4116;Al-Zoghaibi et al.,Gene 2007 391(1-2):130-9;Vivinus et al.,Eur.J.Biochem.2001 268(7):1908-1917;Gan and Rhoads,J.Biol.Chem.1996 271(2):623-626;Boado et al.,J.Neurochem.1996 67(4):1335-1343;Knirsch and Clerch,Biochem.Biophys.Res.Commun.2000 272(1):164-168;Chung et al.,Biochemistry 1998 37(46):16298-16306;Izquierdo and Cuevza,Biochem.J.2000 346 Pt 3:849-855;Dwyer et al.,J.Neurochem.1996 66(2):449-458;Black et al.,Mol.Cell.Biol.1997 17(5):2756-2763;Izquierdo and Cuevza,Mol.Cell.Biol.1997 17(9):5255-5268;US8278036;US8748089;US8835108;US9012219;US2010/0129877;US2011/0065103;US2011/0086904;US2012/0195936;US2014/020675;US2013/0195967;US2014/029490;US2014/0206753;WO2007/036366;WO2011/015347;WO2012/072096;WO2013/143555;WO2014/071963;WO2013/185067;WO2013/182623;WO2014/089486;WO2013/185069;WO2014/144196;WO2014/152659;2014/152673;WO2014/152940;WO2014/152774;WO2014/153052;WO2014/152966、WO2014/152513;WO2015/101414;WO2015/101415;WO2015/062738;及びWO2015/024667に記載のものが挙げられるが、これらに限定されない。これらの文献のそれぞれの内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、5’UTRは、β-グロビンの5’UTR;強力なコザック翻訳開始シグナルを含有する5’UTR;シトクロムb-245 αポリペプチド(CYBA)の5’UTR;ヒドロキシステロイド(17-β)デヒドロゲナーゼ(HSD17B4)の5’UTR;タバコエッチウイルス(TEV)の5’UTR;ベネズエラウマ脳炎ウイルス(TEEV)の5’UTR;非構造タンパク質をコードする風疹ウイルス(RV)RNAの5側オープンリーディングフレーム;デング熱ウイルス(DEN)の5’UTR;熱ショックタンパク質70(Hsp70)の5’UTR;eIF4Gの5’UTR;GLUT1の5’UTR;その機能性断片及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、3’UTRは、β-グロビンの3’UTR;CYBAの3’UTR;アルブミンの3’UTR;成長ホルモン(GH)の3’UTR;VEEVの3’UTR;B型肝炎ウイルス(HBV)の3’UTR;α-グロビンの3’UTR;DENの3’UTR;PAVオオムギ黄萎ウイルス(BYDV-PAV)の3’UTR;伸長因子1 α1(EEF1A1)の3’UTR;マンガンスーパーオキシドジスムターゼ(MnSOD)の3’UTR;ミトコンドリアH(+)-ATPシンターゼのβサブユニット(β-mRNA)の3’UTR;GLUT1の3’UTR;MEF2Aの3’UTR;β-F1-ATPaseの3’UTR;その機能性断片及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
UTRの他の例には、WO2014/164253に開示されているUTRの1つまたは複数(UTRの任意の組み合わせを含む)が挙げられるが、これらに限定されない。当該文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。米国特許仮出願第61/775,509号の表21及び米国特許仮出願第61/829,372号の表22には、5’UTR及び3’UTRの開始部位及び終了部位の一覧が示されおり、これらの文献のそれぞれの内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。表21には、それぞれの5’UTR(5’-UTR-005~5’-UTR68511)が、その天然または野生型(相同)転写物に対して、その開始部位及び終了部位で特定されている(ENST;ENSEMBLデータベースで使用されている識別子)。
任意の遺伝子またはmRNAに由来する野生型UTRを本発明のポリヌクレオチドに組み込むことができる。いくつかの実施形態では、UTRは、野生型または天然UTRに対して変更を加え、バリアントUTRを生成することができ、例えば、UTRの配向もしくは位置をORFに対して変えることによって、または追加のヌクレオチドの組み込み、ヌクレオチドの欠失、ヌクレオチドの入れ替えもしくは転移によって行われる。いくつかの実施形態では、5’または3’UTRのバリアントには、例えば、野生型UTRの変異体、または1つもしくは複数のヌクレオチドがUTRの末端に付加されているか、UTRの末端から除去されているバリアントを利用することができる。
加えて、1つまたは複数の合成UTRを1つまたは複数の非合成UTRと組み合わせて使用することもできる。例えば、Mandal and Rossi,Nat.Protoc.2013 8(3):568-82及びwww.addgene.org/Derrick_Rossi/から入手可能な配列を参照のこと。これらのそれぞれの内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。UTRまたはその部分は、その選択元の転写物と同じ配向に配置してもよいし、配向または位置を変更してもよい。したがって、5’UTR及び/または3’UTRは、反転、短縮、延長されてもよいし、1つまたは複数の他の5’UTRまたは3’UTRと組み合わせてもよい。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、複数のUTR、例えば、ダブル、トリプルまたはクアドルプルで5’UTRまたは3’UTRを含む。例えば、ダブルUTRは、同じUTRの2つのコピーを直列または実質的に直列のいずれかで含む。例えば、ダブルβ-グロビンの3’UTRを使用することができる(US2010/0129877を参照のこと。当該文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる)。
ある特定の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に開示のUTRのいずれかから選択される5’UTR及び/または3’UTRを含む。いくつかの実施形態では、5’UTR及び/または3’UTRは、以下を含む。
ある特定の実施形態では、本発明の5’UTR及び/または3’UTR配列は、配列番号247~271のいずれかを含む5’UTR配列及び/または配列番号272~302のいずれかを含む3’UTR配列ならびにこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される配列に対して、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、または約100%同一であるヌクレオチド配列を含む。
本発明のポリヌクレオチドは、特徴の組み合わせを含み得る。例えば、ORFは、強力なコザック翻訳開始シグナルを含む5’UTR及び/またはポリAテールの鋳型付加のためのオリゴ(dT)配列を含む3’UTRに隣接し得る。5’UTRは、同じ及び/または異なるUTRに由来する第1のポリヌクレオチド断片及び第2のポリヌクレオチド断片を含む(例えば、US2010/0293625を参照のこと。当該文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる)。
また、パターン化されたUTRを有することも本発明の範囲内である。本明細書で使用されるとき、「パターン化されたUTR」は、ABABABもしくはAABBAABBAABBもしくはABCABCABCまたはその変形などの、1回、2回、または3回以上反復する繰り返しまたは交互のパターンを含む。これらのパターンにおいて、それぞれの文字A、B、またはCは、異なるUTR核酸配列を表す。
本発明のポリヌクレオチド内の領域またはサブ領域として、他の非UTR配列を使用することができる。例えば、イントロンまたはイントロン配列の部分を本発明のポリヌクレオチドに組み込むことができる。イントロン配列を組み込むと、タンパク質産生及びポリヌクレオチド発現レベルを増やすことができる。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、UTRの代わりに、またはUTRに加えて、配列内リボソーム進入部位(IRES)を含む(例えば、Yakubov et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.2010 394(1):189-193を参照のこと。当該文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる)。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、非構造タンパク質をコードする風疹ウイルス(RV)RNAの5’側オープンリーディングフレームを含む、風疹ウイルス(RV)ゲノムRNAの5’末端及び/または3’末端にそれぞれ関連する5’配列及び/または3’配列、またはその欠失誘導体を含む(例えば、Pogue et al.,J.Virol.67(12):7106-7117を参照のこと。当該文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる)。翻訳エンハンサーとして、ウイルスカプシド配列、例えば、カプシド配列の5’部分を使用することもできる(例えば、Sjoberg et al.,Biotechnology(NY)1994 12(11):1127-1131及びFrolov and Schlesinger J.Virol.1996 70(2):1182-1190に記載のセムリキ森林ウイルス及びシンドビスウイルスのカプシドRNA。これらの文献のそれぞれの内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる)。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、5’UTR配列の代わりにIRESを含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ORF及びウイルスカプシド配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、合成5’UTRを非合成3’UTRと組み合わせて含む。
いくつかの実施形態では、UTRはまた、少なくとも1つの翻訳エンハンサーポリヌクレオチド、翻訳エンハンサー要素、または翻訳のエンハンサー要素(「TEE」と総称される、ポリヌクレオチドから生成されるポリペプチドまたはタンパク質の量を増加させる核酸配列)も含み得る。非限定的な例として、TEEは、US2009/0226470に記載のものが挙げられ、当該文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれ、他は当該技術分野において知られている。非限定的な例として、TEEは、転写プロモーターと開始コドンとの間に位置し得る。いくつかの実施形態では、5’UTRは、TEEを含む。
一態様では、TEEは、限定するものではないが、キャップ依存的翻訳またはキャップ非依存的翻訳などの核酸の翻訳活性を促進することができるUTR中の保存要素である。これらの配列の保存は、ヒトを含む14種で判明している。例えば、Panek et al.,“An evolutionary conserved pattern of 18S rRNA sequence complementarity to mRNA 5’UTRs and its implications for eukaryotic gene translation regulation,” Nucleic Acids Research 2013,doi:10.1093/nar/gkt548を参照のこと。当該文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
1つの非限定的な例では、TEEは、Gtxホメオドメインタンパク質の5’-リーダー中のTEE配列を含む。Chappell et al.,PNAS 2004 101:9590-9594を参照のこと。当該文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
別の非限定的な例では、TEEは、US2009/0226470、US2013/0177581、及びWO2009/075886の配列番号1~35;WO2012/009644の配列番号1~5及び7~645;ならびにWO1999/024595、US6310197、及びUS6849405の配列番号1の配列のうちの1つまたは複数を有するTEEを含み、これらの文献のそれぞれの内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、TEEは、配列内リボソーム進入部位(IRES)、HCV-IRES、またはIRES要素、例えば、限定するものではないが、US7468275、US2007/0048776、US2011/0124100、WO2007/025008、及びWO2001/055369に記載のものなどであり、これらの文献のそれぞれの内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。IRES要素は、Chappell et al.,PNAS 2004 101:9590-9594、Zhou et al.,PNAS 2005 102:6273-6278、US2007/0048776、US2011/0124100及びWO2007/025008に記載のGtx配列(例えば、Gtx9-nt、Gtx8-nt、Gtx7-nt)を含み得るが、これらに限定されず、これらの文献のそれぞれの内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
「翻訳エンハンサーポリヌクレオチド」または「翻訳エンハンサーポリヌクレオチド配列」は、本明細書で提供されるTEE及び/または当該技術分野において知られているTEE(例えば、US6310197、US6849405、US7456273、US7183395、US2009/0226470、US2007/0048776、US2011/0124100、US2009/0093049、US2013/0177581、WO2009/075886、WO2007/025008、WO2012/009644、WO2001/055371、WO1999/024595、EP2610341A1、及びEP2610340A1を参照のこと;これらの文献のそれぞれの内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる)のうちの1つまたは複数を含む、ポリヌクレオチド、またはそのバリアント、ホモログ、もしくは機能性誘導体を指す。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、TEEの1つまたは複数のコピーを含む。翻訳エンハンサーポリヌクレオチド中のTEEは、1つまたは複数の配列セグメント中に編成することができる。配列セグメントは、本明細書で提供されるTEEのうちの1つまたは複数を保持することができ、それぞれのTEEは、1つまたは複数のコピーで存在する。複数の配列セグメントが翻訳エンハンサーポリヌクレオチド中に存在する場合、当該配列セグメントは、均一であっても不均一であってもよい。したがって、翻訳エンハンサーポリヌクレオチド中の複数の配列セグメントは、同一もしくは異なるタイプの本明細書で提供されるTEE、同一もしくは異なる数のTEEのそれぞれのコピー、及び/または各配列セグメント内の同一もしくは異なるTEEの編成を保持し得る。1つの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、翻訳エンハンサーポリヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドの5’UTR及び/または3’UTRは、WO1999/024595、WO2012/009644、WO2009/075886、WO2007/025008、WO1999/024595、WO2001/055371、EP2610341A1、EP2610340A1、US6310197、US6849405、US7456273、US7183395、US2009/0226470、US2011/0124100、US2007/0048776、US2009/0093049、またはUS2013/0177581に開示されている少なくとも1つのTEEまたはその部分を含み、これらの文献のそれぞれの内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドの5’UTR及び/または3’UTRは、US2009/0226470、US2007/0048776、US2013/0177581、US2011/0124100、WO1999/024595、WO2012/009644、WO2009/075886、WO2007/025008、EP2610341A1、EP2610340A1、US6310197、US6849405、US7456273、US7183395、Chappell et al.,PNAS 2004 101:9590-9594、Zhouet al.,PNAS 2005 102:6273-6278及びWellensiek et al.,“Genome-wide profiling of human cap-independent translation-enhancing elements,” Nature Methods 2013、DOI:10.1038/NMETH.2522(付録表1及び付録表2)に開示されているTEEに対して、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%同一であるTEEを含み、これらの文献のそれぞれの内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドの5’UTR及び/または3’UTRは、US2009/0226470、US2007/0048776、US2013/0177581、US2011/0124100、WO1999/024595、WO2012/009644、WO2009/075886、WO2007/025008、EP2610341A1、EP2610340A1、US6310197、US6849405、US7456273、US7183395、Chappell et al.,PNAS 2004 101:9590-9594、Zhou et al.,PNAS 2005 102:6273-6278及びWellensiek et al.,“Genome-wide profiling of human cap-independent translation-enhancing elements,” Nature Methods 2013,DOI:10.1038/NMETH.2522(付録表1及び付録表2)に開示されているTEE配列の5~30ヌクレオチド断片、5~25ヌクレオチド断片、5~20ヌクレオチド断片、5~15ヌクレオチド断片、または5~10ヌクレオチド断片(5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30ヌクレオチドの断片を含む)から選択されるTEEを含む。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドの5’UTR及び/または3’UTRは、US7456273、US7183395、US2009/0093049、及びWO2001/055371のいずれかに記載の転写調節エレメントであるTEEを含み、これらの文献のそれぞれの内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。転写調節エレメントは、限定するものではないが、US7456273、US7183395、US2009/0093049、及びWO2001/055371に記載の方法などの当該技術分野において知られている方法によって特定することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の少なくとも1つのTEEを含む5’UTR及び/または3’UTRは、限定するものではないが、ベクター系または核酸ベクターなどのモノシストロニック配列中に組み込むことができる。非限定的な例として、ベクター系及び核酸ベクターには、US7456273、US7183395、US2007/0048776、US2009/0093049、US2011/0124100、WO2007/025008、及びWO2001/055371に記載のものを挙げることができる。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドの5’UTR及び/または3’UTRは、本明細書に記載のTEEまたはその部分を含む。いくつかの実施形態では、3’UTR中のTEEは、5’UTRに位置するTEEと同じであり得、及び/または異なり得る。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドの5’UTR及び/または3’UTRは、少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも22、少なくとも23、少なくとも24、少なくとも25、少なくとも30、少なくとも35、少なくとも40、少なくとも45、少なくとも50、少なくとも55または60個を超えるTEE配列を含み得る。1つの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドの5’UTRは、1~60、1~55、1~50、1~45、1~40、1~35、1~30、1~25、1~20、1~15、1~10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1個のTEE配列を含み得る。本発明のポリヌクレオチドの5’UTR中のTEE配列は、同じTEE配列であっても、異なるTEE配列であってもよい。本発明のポリヌクレオチドの5’UTR中の異なるTEE配列の組み合わせは、異なるTEE配列のいずれかの2つ以上のコピーが組み込まれる組み合わせを含み得る。TEE配列は、ABABABもしくはAABBAABBAABBもしくはABCABCABCまたはその変形などの、1回、2回、3回、または3回を超えて反復するパターンであり得る。これらのパターンにおいて、それぞれの文字A、B、またはCは、異なるTEEヌクレオチド配列を表す。
いくつかの実施形態では、5’UTR及び/または3’UTRは、2つのTEE配列を分離するスペーサーを含む。非限定的な例として、スペーサーは、15ヌクレオチドスペーサー及び/または当該技術分野において知られている他のスペーサーであり得る。別の非限定的な例として、5’UTR及び/または3’UTRは、5’UTR及び/または3’UTRでそれぞれ少なくとも1回、少なくとも2回、少なくとも3回、少なくとも4回、少なくとも5回、少なくとも6回、少なくとも7回、少なくとも8回、少なくとも9回、少なくとも10回、または10回を超えて反復するTEE配列-スペーサーモジュールを含む。いくつかの実施形態では、5’UTR及び/または3’UTRは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10回反復するTEE配列-スペーサーモジュールを含む。
いくつかの実施形態では、2つのTEE配列を分離するスペーサーは、本発明のポリヌクレオチド、例えば、本明細書に記載のmiR配列(例えば、miR結合部位及びmiRシード)の翻訳を制御することができる、当該技術分野において知られている他の配列を含み得る。非限定的な例として、2つのTEE配列を分離するために使用される各スペーサーは、異なるmiR配列またはmiR配列の構成要素(例えば、miRシード配列)を含み得る。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、miR及び/またはTEE配列を含む。いくつかの実施形態では、miR配列及び/またはTEE配列を本発明のポリヌクレオチドに組み込むことで、ステムループ領域の形状を変化させ、翻訳を増加及び/または減少させることができる。例えば、Kedde et al.,Nature Cell Biology 2010 12(10):1014-20を参照のこと。当該文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
マイクロRNA(miRNA)結合部位
本発明のポリヌクレオチドは、調節エレメント、例えば、マイクロRNA(miRNA)結合部位、転写因子結合部位、構造化mRNA配列及び/またはモチーフ、内因性核酸結合分子に対する偽受容体として機能するように操作された人工結合部位、ならびにそれらの組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態では、そのような調節エレメントを含むポリヌクレオチドは、「センサー配列」を含むものと称される。センサー配列の非限定的な例は、米国特許公開第2014/0200261号に記載されており、当該文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
本発明のポリヌクレオチドは、調節エレメント、例えば、マイクロRNA(miRNA)結合部位、転写因子結合部位、構造化mRNA配列及び/またはモチーフ、内因性核酸結合分子に対する偽受容体として機能するように操作された人工結合部位、ならびにそれらの組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態では、そのような調節エレメントを含むポリヌクレオチドは、「センサー配列」を含むものと称される。センサー配列の非限定的な例は、米国特許公開第2014/0200261号に記載されており、当該文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド(例えば、リボ核酸(RNA)、例えば、メッセンジャーRNA(mRNA))は、目的のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム(ORF)を含み、1つまたは複数のmiRNA結合部位(複数可)をさらに含む。miRNA結合部位(複数可)の包含または組み込みにより、天然miRNAの組織特異的発現及び/または細胞型特異的発現に基づき、本発明のポリヌクレオチドの制御がなされ、その結果、ポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドの制御がなされる。
miRNA、例えば、天然miRNAは、ポリヌクレオチドに結合し、ポリヌクレオチドの安定性を低下させることまたはポリヌクレオチドの翻訳を阻害することのいずれかによって遺伝子発現を下方制御する、19~25ヌクレオチド長のノンコーティングRNAである。miRNA配列は、「シード」領域、すなわち、成熟miRNAの位置2~8の領域の配列を含む。miRNAシードは、成熟miRNAの位置2~8または2~7を含み得る。いくつかの実施形態では、miRNAシードは、7ヌクレオチド(例えば、成熟miRNAのヌクレオチド2~8)を含み得、対応するmiRNA結合部位中のシード相補部位には、miRNAの位置1に対向するアデノシン(A)が隣接する。いくつかの実施形態では、miRNAシードは、6ヌクレオチド(例えば、成熟miRNAのヌクレオチド2~7)を含み得、対応するmiRNA結合部位中のシード相補部位には、miRNAの位置1に対向するアデノシン(A)が隣接する。例えば、Grimson A,Farh KK,Johnston WK,Garrett-Engele P,Lim LP,Bartel DP;Mol Cell.2007 Jul 6;27(1):91-105を参照のこと。標的細胞または組織のmiRNAプロファイリングを実施して、その細胞または組織中にmiRNAが存在するか存在しないかを決定することができる。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド(例えば、リボ核酸(RNA)、例えば、メッセンジャーRNA(mRNA))は、1つまたは複数のマイクロRNA結合部位、マイクロRNA標的配列、マイクロRNA相補配列、またはマイクロRNAシード相補配列を含む。そのような配列は、米国特許公開第US2005/0261218号及び米国特許公開第US2005/0059005号に教示されているものなどの任意の既知のマイクロRNAに対応し、例えば、当該マイクロRNAに対して相補性を有し得る。これらの文献のそれぞれの内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用されるとき、「マイクロRNA(miRNAまたはmiR)結合部位」という用語は、miRNAのすべてまたは一領域に対して、miRNAと相互作用、会合、または結合するのに十分な相補性を有する、5’UTR及び/または3’UTR中に含まれるポリヌクレオチド内の配列、例えば、DNA内の配列またはRNA転写物内の配列を指す。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、目的のポリペプチドをコードするORFを含み、1つまたは複数のmiRNA結合部位(複数可)をさらに含む。例示の実施形態では、ポリヌクレオチド(例えば、リボ核酸(RNA)、例えば、メッセンジャーRNA(mRNA))の5’UTR及び/または3’UTRは、1つまたは複数のmiRNA結合部位(複数可)を含む。
miRNA結合部位がmiRNAに対して十分な相補性を有するとは、ポリヌクレオチドのmiRNA媒介性制御、例えば、ポリヌクレオチドのmiRNA媒介性翻訳抑制または分解を促進するのに、相補性の程度が十分であることを指す。本発明の例示的な態様では、miRNA結合部位がmiRNAに対して十分な相補性を有するとは、ポリヌクレオチドのmiRNA媒介性分解、例えば、miRNAガイド付きRNA誘導型サイレンシング複合体(RISC)によるmRNAの切断を促進するのに、相補性の程度が十分であることを指す。miRNA結合部位は、例えば、19~25ヌクレオチドのmiRNA配列、19~23ヌクレオチドのmiRNA配列、または22ヌクレオチドのmiRNA配列に対して相補性を有し得る。miRNA結合部位は、miRNAの一部分のみ、例えば、全長天然miRNA配列のうちの1、2、3、または4ヌクレオチド少ない部分に対して相補的であり得る。所望の制御がmRNA分解である場合、十分な相補性または完全な相補性(例えば、天然miRNAの長さ全体または有意な部分にわたる十分な相補性または完全な相補性)が好ましい。
いくつかの実施形態では、miRNA結合部位は、miRNAシード配列と相補性(例えば、部分的または完全な相補性)を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、miRNA結合部位は、miRNAシード配列と完全な相補性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、miRNA結合部位は、miRNA配列と相補性(例えば、部分的または完全な相補性)を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、miRNA結合部位は、miRNA配列と完全な相補性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、miRNA結合部位は、1、2、または3ヌクレオチドの置換、末端付加、及び/または末端切断を除いて、miRNA配列と完全な相補性を有する。
いくつかの実施形態では、miRNA結合部位は、対応するmiRNAと同じ長さである。他の実施形態では、miRNA結合部位は、5’末端、3’末端、またはその両方で、対応するmiRNAよりも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11または12ヌクレオチド短い。さらに他の実施形態では、マイクロRNA結合部位は、5’末端、3’末端、またはその両方で、対応するマイクロRNAよりも2ヌクレオチド短い。対応するmiRNAよりも短いmiRNA結合部位は、依然として、miRNA結合部位の1つもしくは複数を組み込んだmRNAを分解させることができ、またはmRNAの翻訳を妨げることができる。
いくつかの実施形態では、miRNA結合部位は、ダイサーを含有する活性型RISCの一部である対応する成熟miRNAに結合する。別の実施形態では、miRNA結合部位がRISC中の対応するmiRNAに結合すると、miRNA結合部位を含有するmRNAが分解されるか、またはmRNAの翻訳が妨げられる。いくつかの実施形態では、miRNA結合部位は、miRNAに対し、miRNAを含むRISC複合体が、miRNA結合部位を含むポリヌクレオチドを切断するのに十分な相補性を有する。他の実施形態では、miRNA結合部位は、不完全な相補性を有し、それにより、miRNAを含むRISC複合体が、miRNA結合部位を含むポリヌクレオチドに不安定性を誘導する。別の実施形態では、miRNA結合部位は、不完全な相補性を有し、それにより、miRNAを含むRISC複合体は、miRNA結合部位を含むポリヌクレオチドの翻訳を抑制する。
いくつかの実施形態では、miRNA結合部位は、対応するmiRNAに対して、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11または12のミスマッチを有する。
いくつかの実施形態では、miRNA結合部位は、対応するmiRNAの少なくとも約10、少なくとも約11、少なくとも約12、少なくとも約13、少なくとも約14、少なくとも約15、少なくとも約16、少なくとも約17、少なくとも約18、少なくとも約19、少なくとも約20、または少なくとも約21の連続ヌクレオチドに対して相補的である、それぞれ少なくとも約10、少なくとも約11、少なくとも約12、少なくとも約13、少なくとも約14、少なくとも約15、少なくとも約16、少なくとも約17、少なくとも約18、少なくとも約19、少なくとも約20、または少なくとも約21の連続ヌクレオチドを有する。
1つまたは複数のmiRNA結合部位を本発明のポリヌクレオチドに操作することによって、対象のmiRNAが利用可能であれば、当該ポリヌクレオチドを分解または翻訳減少の標的にすることができる。これにより、ポリヌクレオチドの送達時におけるオフターゲット効果を減らすことができる。例えば、本発明のポリヌクレオチドがある組織または細胞に送達されることを意図しないものの、当該組織または細胞に行き着いてしまう場合、その組織または細胞に豊富に存在するmiRNAの1つまたは複数の結合部位をポリヌクレオチドの5’UTR及び/または3’UTRに操作すれば、そのmiRNAが目的遺伝子の発現を阻害し得る。
逆に、特定の組織におけるタンパク質発現を上昇させるために、miRNA結合部位を天然起源のポリヌクレオチド配列から除去することができる。例えば、特定のmiRNAに対する結合部位をポリヌクレオチドから除去することで、当該miRNAを含有する組織または細胞におけるタンパク質発現を改善することができる。
1つの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、限定するものではないが、正常細胞及び/または癌性細胞などの特定の細胞に対する細胞傷害性または細胞保護性mRNA治療剤を制御するために、5’UTR及び/または3’UTR中に、少なくとも1つのmiRNA結合部位を含み得る。別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、限定するものではないが、正常細胞及び/または癌性細胞などの特定の細胞に対する細胞傷害性または細胞保護性mRNA治療剤を制御するために、5’-UTR及び/または3’-UTR中に、2、3、4、5、6、7、8、9、10、またはそれより多くのmiRNA結合部位を含み得る。
複数の組織における発現の制御は、1つまたは複数のmiRNA結合部位、例えば、1つまたは複数の別個のmiRNA結合部位の導入または除去により達成することができる。miRNA結合部位を除去するか、または挿入するかどうかの決定は、発症及び/または疾患状態の組織及び/または細胞におけるmiRNA発現パターン及び/またはそのプロファイリングに基づいて行うことができる。miRNA、miRNA結合部位、ならびにその発現パターン及び生物学的役割の特定は、報告されている(例えば、Bonauer et al.,Curr Drug Targets 2010 11:943-949;Anand and Cheresh Curr Opin Hematol 2011 18:171-176;Contreras and Rao Leukemia 2012 26:404-413(2011 Dec 20.doi:10.1038/leu.2011.356);Bartel Cell 2009 136:215-233;Landgraf et al,Cell,2007 129:1401-1414;Gentner and Naldini,Tissue Antigens.2012 80:393-403及び当該文献中の全参考文献;これらの文献のそれぞれは、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる)。
miRNA及びmiRNA結合部位は、米国特許公開第2014/0200261号、同第2005/0261218号、及び同第2005/0059005号に記載の非限定的な例を含む、任意の既知の配列に対応し得、これらの文献のそれぞれは、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
miRNAがmRNAを制御し、それにより、タンパク質発現を制御することが知られている組織の例には、肝臓(miR-122)、筋肉(miR-133、miR-206、miR-208)、内皮細胞(miR-17-92、miR-126)、骨髄細胞(miR-142-3p、miR-142-5p、miR-16、miR-21、miR-223、miR-24、miR-27)、脂肪組織(let-7、miR-30c)、心臓(miR-1d、miR-149)、腎臓(miR-192、miR-194、miR-204)、及び肺上皮細胞(let-7、miR-133、miR-126)が挙げられるが、これらに限定されない。
具体的に、miRNAは、抗原組織提示細胞(APC)(例えば、樹状細胞及びマクロファージ)、マクロファージ、単球、Bリンパ球、Tリンパ球、顆粒球、ナチュラルキラー細胞などの免疫細胞(造血細胞とも呼ばれる)において差次的に発現することが知られている。免疫細胞特異的miRNAは、免疫原性、自己免疫、感染に対する免疫応答、炎症、ならびに遺伝子治療及び組織/臓器移植後の望ましくない免疫応答に関与する。免疫細胞特異的miRNAはまた、造血細胞(免疫細胞)の発生、増殖、分化及びアポトーシスの多くの局面を制御する。例えば、miR-142及びmiR-146は、免疫細胞内で排他的に発現し、特に、骨髄性樹状細胞で豊富である。ポリヌクレオチドの3’-UTRにmiR-142結合部位を付加することによって、ポリヌクレオチドに対する免疫応答を遮断することができ、それにより、組織及び細胞内での安定した遺伝子導入が可能になることが示されている。miR-142は、抗原提示細胞において外因性ポリヌクレオチドを効率的に分解することから、形質導入細胞の細胞傷害性排除を抑制する(例えば、Annoni A et al.,blood,2009,114,5152-5161;Brown BD,et al.,Nat med.2006,12(5),585-591;Brown BD,et al.,blood,2007,110(13):4144-4152,これらの文献のそれぞれは、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる)。
抗原媒介性免疫応答は、生物に侵入すると、抗原提示細胞によって処理され、抗原提示細胞の表面上に提示される外来抗原によって惹起される免疫応答を指し得る。T細胞は、提示された抗原を認識し、抗原を発現する細胞の細胞傷害性排除を誘導することができる。
本発明のポリヌクレオチドの5’UTR及び/または3’UTRにmiR-142結合部位を導入することで、抗原提示細胞における遺伝子発現をmiR-142媒介性分解を介して選択的に抑制して、抗原提示細胞(例えば、樹状細胞)の抗原提示を制限することにより、ポリヌクレオチド送達後の抗原媒介性免疫応答を防ぐことができる。それにより、ポリヌクレオチドは、細胞傷害性排除を惹起することなく、標的の組織または細胞内で安定的に発現する。
1つの実施形態では、免疫細胞、特に、抗原提示細胞で発現することが知られているmiRNAに対する結合部位を本発明のポリヌクレオチド中に操作することで、抗原提示細胞におけるポリヌクレオチドの発現をmiRNA媒介性RNA分解を介して抑制し、抗原媒介性免疫応答を軽減することができる。ポリヌクレオチドの発現は、免疫細胞特異的miRNAが発現しない非免疫細胞では、維持される。例えば、いくつかの実施形態では、肝臓特異的タンパク質に対する免疫原性応答を防ぐために、任意のmiR-122結合部位を除去することができ、miR-142(及び/またはmirR-146)結合部位を本発明のポリヌクレオチドの5’UTR及び/または3’UTR中に操作することができる。
1つの実施形態では、肝臓細胞で発現することが知られているmiRNAに対する結合部位を本発明のポリヌクレオチド中に操作して、肝臓におけるポリヌクレオチドの発現を抑制することができる。例えば、いくつかの実施形態では、肝臓における抗原の発現を防ぐために、任意の肝臓特異的miR結合部位を本発明のポリヌクレオチドの5’UTR及び/または3’UTR中に操作することができる。
APC及びマクロファージにおける選択的分解及び抑制をさらに誘導するために、本発明のポリヌクレオチドは、5’UTR及び/または3’UTR中に、単独で、あるいはmiR-142及び/またはmiR-146結合部位との組み合わせのいずれかで、さらなる負の制御要素を含み得る。非限定的な例として、さらなる負の制御要素は、構造的崩壊要素(CDE)である。
免疫細胞特異的miRNAには、hsa-let-7a-2-3p、hsa-let-7a-3p、hsa-7a-5p、hsa-let-7c、hsa-let-7e-3p、hsa-let-7e-5p、hsa-let-7g-3p、hsa-let-7g-5p、hsa-let-7i-3p、hsa-let-7i-5p、miR-10a-3p、miR-10a-5p、miR-1184、hsa-let-7f-1--3p、hsa-let-7f-2--5p、hsa-let-7f-5p、miR-125b-1-3p、miR-125b-2-3p、miR-125b-5p、miR-1279、miR-130a-3p、miR-130a-5p、miR-132-3p、miR-132-5p、miR-142-3p、miR-142-5p、miR-143-3p、miR-143-5p、miR-146a-3p、miR-146a-5p、miR-146b-3p、miR-146b-5p、miR-147a、miR-147b、miR-148a-5p、miR-148a-3p、miR-150-3p、miR-150-5p、miR-151b、miR-155-3p、miR-155-5p、miR-15a-3p、miR-15a-5p、miR-15b-5p、miR-15b-3p、miR-16-1-3p、miR-16-2-3p、miR-16-5p、miR-17-5p、miR-181a-3p、miR-181a-5p、miR-181a-2-3p、miR-182-3p、miR-182-5p、miR-197-3p、miR-197-5p、miR-21-5p、miR-21-3p、miR-214-3p、miR-214-5p、miR-223-3p、miR-223-5p、miR-221-3p、miR-221-5p、miR-23b-3p、miR-23b-5p、miR-24-1-5p、miR-24-2-5p、miR-24-3p、miR-26a-1-3p、miR-26a-2-3p、miR-26a-5p、miR-26b-3p、miR-26b-5p、miR-27a-3p、miR-27a-5p、miR-27b-3p、miR-27b-5p、miR-28-3p、miR-28-5p、miR-2909、miR-29a-3p、miR-29a-5p、miR-29b-1-5p、miR-29b-2-5p、miR-29c-3p、miR-29c-5p、miR-30e-3p、miR-30e-5p、miR-331-5p、miR-339-3p、miR-339-5p、miR-345-3p、miR-345-5p、miR-346、miR-34a-3p、miR-34a-5p、、miR-363-3p、miR-363-5p、miR-372、miR-377-3p、miR-377-5p、miR-493-3p、miR-493-5p、miR-542、miR-548b-5p、miR548c-5p、miR-548i、miR-548j、miR-548n、miR-574-3p、miR-598、miR-718、miR-935、miR-99a-3p、miR-99a-5p、miR-99b-3p、及びmiR-99b-5pが含まれるが、これらに限定されない。さらに、マイクロアレイハイブリダイゼーション及びミクロトーム解析により、免疫細胞中の新規miRNAを特定することができる(例えば、Jima DD et al,Blood,2010,116:e118-e127;Vaz C et al.,BMC Genomics,2010,11,288;これらの文献のそれぞれの内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる)。
肝臓で発現することが知られているmiRNAには、miR-107、miR-122-3p、miR-122-5p、miR-1228-3p、miR-1228-5p、miR-1249、miR-129-5p、miR-1303、miR-151a-3p、miR-151a-5p、miR-152、miR-194-3p、miR-194-5p、miR-199a-3p、miR-199a-5p、miR-199b-3p、miR-199b-5p、miR-296-5p、miR-557、miR-581、miR-939-3p、及びmiR-939-5pが含まれるが、これらに限定されない。任意の肝臓特異的miRNAに由来するmiRNA結合部位を本発明のポリヌクレオチドに導入するか、または除去することで、肝臓におけるポリヌクレオチドの発現を制御することができる。肝臓特異的miRNA結合部位は、単独で操作されてもよいし、本発明のポリヌクレオチド中の免疫細胞(例えば、APC)miRNA結合部位とさらに組み合わせて操作されてもよい。
肺で発現することが知られているmiRNAには、let-7a-2-3p、let-7a-3p、let-7a-5p、miR-126-3p、miR-126-5p、miR-127-3p、miR-127-5p、miR-130a-3p、miR-130a-5p、miR-130b-3p、miR-130b-5p、miR-133a、miR-133b、miR-134、miR-18a-3p、miR-18a-5p、miR-18b-3p、miR-18b-5p、miR-24-1-5p、miR-24-2-5p、miR-24-3p、miR-296-3p、miR-296-5p、miR-32-3p、miR-337-3p、miR-337-5p、miR-381-3p、及びmiR-381-5pが含まれるが、これらに限定されない。任意の肺特異的miRNAに由来するmiRNA結合部位を本発明のポリヌクレオチドに導入するか、または除去することで、肺におけるポリヌクレオチドの発現を制御することができる。肺特異的miRNA結合部位は、単独で操作されてもよいし、本発明のポリヌクレオチド中の免疫細胞(例えば、APC)miRNA結合部位とさらに組み合わせて操作されてもよい。
心臓で発現することが知られているmiRNAには、miR-1、miR-133a、miR-133b、miR-149-3p、miR-149-5p、miR-186-3p、miR-186-5p、miR-208a、miR-208b、miR-210、miR-296-3p、miR-320、miR-451a、miR-451b、miR-499a-3p、miR-499a-5p、miR-499b-3p、miR-499b-5p、miR-744-3p、miR-744-5p、miR-92b-3p、及びmiR-92b-5pが含まれるが、これらに限定されない。任意の心臓特異的マイクロRNAに由来するmmiRNA結合部位を本発明のポリヌクレオチドに導入するか、または除去することで、心臓におけるポリヌクレオチドの発現を制御することができる。心臓特異的miRNA結合部位は、単独で操作されてもよいし、本発明のポリヌクレオチド中の免疫細胞(例えば、APC)miRNA結合部位とさらに組み合わせて操作されてもよい。
神経系で発現することが知られているmiRNAには、miR-124-5p、miR-125a-3p、miR-125a-5p、miR-125b-1-3p、miR-125b-2-3p、miR-125b-5p、miR-1271-3p、miR-1271-5p、miR-128、miR-132-5p、miR-135a-3p、miR-135a-5p、miR-135b-3p、miR-135b-5p、miR-137、miR-139-5p、miR-139-3p、miR-149-3p、miR-149-5p、miR-153、miR-181c-3p、miR-181c-5p、miR-183-3p、miR-183-5p、miR-190a、miR-190b、miR-212-3p、miR-212-5p、miR-219-1-3p、miR-219-2-3p、miR-23a-3p、miR-23a-5p、miR-30a-5p、miR-30b-3p、miR-30b-5p、miR-30c-1-3p、miR-30c-2-3p、miR-30c-5p、miR-30d-3p、miR-30d-5p、miR-329、miR-342-3p、miR-3665、miR-3666、miR-380-3p、miR-380-5p、miR-383、miR-410、miR-425-3p、miR-425-5p、miR-454-3p、miR-454-5p、miR-483、miR-510、miR-516a-3p、miR-548b-5p、miR-548c-5p、miR-571、miR-7-1-3p、miR-7-2-3p、miR-7-5p、miR-802、miR-922、miR-9-3p、及びmiR-9-5pが含まれるが、これらに限定されない。神経系内に豊富なmiRNAには、限定するものではないが、miR-132-3p、miR-132-3p、miR-148b-3p、miR-148b-5p、miR-151a-3p、miR-151a-5p、miR-212-3p、miR-212-5p、miR-320b、miR-320e、miR-323a-3p、miR-323a-5p、miR-324-5p、miR-325、miR-326、miR-328、miR-922を含む、ニューロンに特異的に発現するもの、ならびにmiR-1250、miR-219-1-3p、miR-219-2-3p、miR-219-5p、miR-23a-3p、miR-23a-5p、miR-3065-3p、miR-3065-5p、miR-30e-3p、miR-30e-5p、miR-32-5p、miR-338-5p、及びmiR-657を含む、グリア細胞に特異的に発現するものがさらに含まれる。任意のCNS特異的miRNAに由来するmiRNA結合部位を本発明のポリヌクレオチドに導入するか、または除去することで、神経系におけるポリヌクレオチドの発現を制御することができる。神経系特異的miRNA結合部位は、単独で操作されてもよいし、本発明のポリヌクレオチド中の免疫細胞(例えば、APC)miRNA結合部位とさらに組み合わせて操作されてもよい。
膵臓で発現することが知られているmiRNAには、miR-105-3p、miR-105-5p、miR-184、miR-195-3p、miR-195-5p、miR-196a-3p、miR-196a-5p、miR-214-3p、miR-214-5p、miR-216a-3p、miR-216a-5p、miR-30a-3p、miR-33a-3p、miR-33a-5p、miR-375、miR-7-1-3p、miR-7-2-3p、miR-493-3p、miR-493-5p、及びmiR-944が含まれるが、これらに限定されない。任意の膵臓特異的miRNAに由来するmiRNA結合部位を本発明のポリヌクレオチドに導入するか、または除去することで、膵臓におけるポリヌクレオチドの発現を制御することができる。膵臓特異的miRNA結合部位は、単独で操作されてもよいし、本発明のポリヌクレオチド中の免疫細胞(例えば、APC)miRNA結合部位とさらに組み合わせて操作されてもよい。
腎臓で発現することが知られているmiRNAには、miR-122-3p、miR-145-5p、miR-17-5p、miR-192-3p、miR-192-5p、miR-194-3p、miR-194-5p、miR-20a-3p、miR-20a-5p、miR-204-3p、miR-204-5p、miR-210、miR-216a-3p、miR-216a-5p、miR-296-3p、miR-30a-3p、miR-30a-5p、miR-30b-3p、miR-30b-5p、miR-30c-1-3p、miR-30c-2-3p、miR30c-5p、miR-324-3p、miR-335-3p、miR-335-5p、miR-363-3p、miR-363-5p、及びmiR-562が含まれるが、これらに限定されない。任意の腎臓特異的miRNAに由来するmiRNA結合部位を本発明のポリヌクレオチドに導入するか、または除去することで、腎臓におけるポリヌクレオチドの発現を制御することができる。腎臓特異的miRNA結合部位は、単独で操作されてもよいし、本発明のポリヌクレオチド中の免疫細胞(例えば、APC)miRNA結合部位とさらに組み合わせて操作されてもよい。
筋肉で発現することが知られているmiRNAには、let-7g-3p、let-7g-5p、miR-1、miR-1286、miR-133a、miR-133b、miR-140-3p、miR-143-3p、miR-143-5p、miR-145-3p、miR-145-5p、miR-188-3p、miR-188-5p、miR-206、miR-208a、miR-208b、miR-25-3p、及びmiR-25-5pが含まれるが、これらに限定されない。任意の筋肉特異的miRNAに由来するmiRNA結合部位を本発明のポリヌクレオチドに導入するか、または除去することで、筋肉におけるポリヌクレオチドの発現を制御することができる。筋肉特異的miRNA結合部位は、単独で操作されてもよいし、本発明のポリヌクレオチド中の免疫細胞(例えば、APC)miRNA結合部位とさらに組み合わせて操作されてもよい。
miRNAはまた、限定するものではないが、内皮細胞、上皮細胞、及び脂肪細胞などの異なる細胞種で差次的に発現される。
内皮細胞で発現することが知られているmiRNAには、let-7b-3p、let-7b-5p、miR-100-3p、miR-100-5p、miR-101-3p、miR-101-5p、miR-126-3p、miR-126-5p、miR-1236-3p、miR-1236-5p、miR-130a-3p、miR-130a-5p、miR-17-5p、miR-17-3p、miR-18a-3p、miR-18a-5p、miR-19a-3p、miR-19a-5p、miR-19b-1-5p、miR-19b-2-5p、miR-19b-3p、miR-20a-3p、miR-20a-5p、miR-217、miR-210、miR-21-3p、miR-21-5p、miR-221-3p、miR-221-5p、miR-222-3p、miR-222-5p、miR-23a-3p、miR-23a-5p、miR-296-5p、miR-361-3p、miR-361-5p、miR-421、miR-424-3p、miR-424-5p、miR-513a-5p、miR-92a-1-5p、miR-92a-2-5p、miR-92a-3p、miR-92b-3p、及びmiR-92b-5pが含まれるが、これらに限定されない。新規miRNAは、ディープシークエンシング解析より、内皮細胞で多く発見されている(例えば、Voellenkle C et al.,RNA,2012,18,472-484;当該文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる)。任意の内皮細胞特異的miRNAに由来するmiRNA結合部位を本発明のポリヌクレオチドに導入するか、または除去することで、内皮細胞におけるポリヌクレオチドの発現を制御することができる。
上皮細胞で発現することが知られているmiRNAには、呼吸繊毛上皮細胞に特異的なlet-7b-3p、let-7b-5p、miR-1246、miR-200a-3p、miR-200a-5p、miR-200b-3p、miR-200b-5p、miR-200c-3p、miR-200c-5p、miR-338-3p、miR-429、miR-451a、miR-451b、miR-494、miR-802及びmiR-34a、miR-34b-5p、miR-34c-5p、miR-449a、miR-449b-3p、miR-449b-5p、肺上皮細胞に特異的なlet-7ファミリー、miR-133a、miR-133b、miR-126、腎臓上皮細胞に特異的なmiR-382-3p、miR-382-5p、ならびに角膜上皮細胞に特異的なmiR-762が含まれるが、これらに限定されない。任意の上皮細胞特異的miRNAに由来するmiRNA結合部位を本発明のポリヌクレオチドに導入するか、または除去することで、上皮細胞におけるポリヌクレオチドの発現を制御することができる。
加えて、大きなmiRNA群が胚幹細胞内に多く存在し、幹細胞の自己再生を制御するとともに、神経細胞、心細胞、造血細胞、皮膚細胞、骨形成原細胞及び筋肉細胞などのさまざまな細胞系統の発生及び/または分化を制御している(例えば、Kuppusamy KT et al.,Curr.Mol Med,2013,13(5),757-764;Vidigal JA and Ventura A,Semin Cancer Biol.2012,22(5-6),428-436;Goff LA et al.,PLoS One,2009,4:e7192;Morin RD et al.,Genome Res,2008,18,610-621;Yoo JK et al.,Stem Cells Dev.2012,21(11),2049-2057;これらの文献のそれぞれは、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる)。胚幹細胞に豊富に存在するmiRNAには、let-7a-2-3p、let-a-3p、let-7a-5p、let7d-3p、let-7d-5p、miR-103a-2-3p、miR-103a-5p、miR-106b-3p、miR-106b-5p、miR-1246、miR-1275、miR-138-1-3p、miR-138-2-3p、miR-138-5p、miR-154-3p、miR-154-5p、miR-200c-3p、miR-200c-5p、miR-290、miR-301a-3p、miR-301a-5p、miR-302a-3p、miR-302a-5p、miR-302b-3p、miR-302b-5p、miR-302c-3p、miR-302c-5p、miR-302d-3p、miR-302d-5p、miR-302e、miR-367-3p、miR-367-5p、miR-369-3p、miR-369-5p、miR-370、miR-371、miR-373、miR-380-5p、miR-423-3p、miR-423-5p、miR-486-5p、miR-520c-3p、miR-548e、miR-548f、miR-548g-3p、miR-548g-5p、miR-548i、miR-548k、miR-548l、miR-548m、miR-548n、miR-548o-3p、miR-548o-5p、miR-548p、miR-664a-3p、miR-664a-5p、miR-664b-3p、miR-664b-5p、miR-766-3p、miR-766-5p、miR-885-3p、miR-885-5p、miR-93-3p、miR-93-5p、miR-941、miR-96-3p、miR-96-5p、miR-99b-3p及びmiR-99b-5pが含まれるが、これらに限定されない。ヒト胚幹細胞のディープシークエンシングにより、新規予測miRNAが多く発見されている(例えば、Morin RD et al.,Genome Res,2008,18,610-621;Goff LA et al.,PLoS One,2009,4:e7192;Bar M et al.,Stem cells,2008,26,2496-2505;これらの文献のそれぞれの内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる)。
多くのmiRNA発現研究は、さまざまな癌細胞/癌組織及び他の疾患におけるmiRNAの発現差をプロファイリングするために実施される。いくつかのmiRNAは、ある特定の癌細胞で異常に過剰発現し、他の細胞では発現が少ない。例えば、miRNAは、癌細胞(WO2008/154098、US2013/0059015、US2013/0042333、WO2011/157294);癌幹細胞(US2012/0053224);膵癌及び膵疾患(US2009/0131348、US2011/0171646、US2010/0286232、US8389210);喘息及び炎症(US8415096);前立腺癌(US2013/0053264);肝細胞癌(WO2012/151212、US2012/0329672、WO2008/054828、US8252538);肺癌細胞(WO2011/076143、WO2013/033640、WO2009/070653、US2010/0323357);皮膚T細胞リンパ腫(WO2013/011378);結腸直腸癌細胞(WO2011/0281756、WO2011/076142);癌陽性リンパ節(WO2009/100430、US2009/0263803);鼻咽腔癌(EP2112235);慢性閉塞性肺疾患(US2012/0264626、US2013/0053263);甲状腺癌(WO2013/066678);卵巣癌細胞(US2012/0309645、WO2011/095623);乳癌細胞(WO2008/154098、WO2007/081740、US2012/0214699)、白血病及びリンパ腫(WO2008/073915、US2009/0092974、US2012/0316081、US2012/0283310、WO2010/018563、これらの文献のそれぞれの内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる)で差次的に発現する。
非限定的な例として、ある特定の癌細胞及び/または腫瘍細胞で過剰発現しているmiRNAに対するmiRNA結合部位を本発明のポリヌクレオチドの3’UTRから除去し、癌細胞で過剰発現しているmiRNAによって抑制された発現を回復させ、それにより、対応する生物学的機能、例えば、転写の刺激及び/または抑制、細胞周期停止、アポトーシスならびに細胞死を改善することができる。miRNA発現が上方制御されていない正常な細胞及び組織は、影響を受けない。
miRNAは、血管新生などの複雑な生物学的過程を制御することもできる(例えば、miR-132)(Anand and Cheresh Curr Opin Hematol 2011 18:171-176)。本発明のポリヌクレオチドにおいて、そのような過程に関与するmiRNA結合部位を除去または導入して、当該ポリヌクレオチドの発現を、生物学的に関連する細胞型または関連する生物学的過程に合うように調整することができる。この文脈において、本発明のポリヌクレオチドは、栄養要求性ポリヌクレオチドと定義される。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、miRNA結合部位を含み、当該miRNA結合部位は、表1から選択されるか、または本明細書に別途記載される1つまたは複数のヌクレオチド配列を含み、miRNA結合部位配列のうちのいずれか1つまたは複数の1つまたは複数のコピーを含む。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、表1から選択されるか、または本明細書に別途記載される、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、またはそれより多くの同じまたは異なるmiRNA結合部位(これらの任意の組み合わせを含む)をさらに含む。いくつかの実施形態では、miRNA結合部位は、miR-142に結合するか、またはmiR-142に対して相補的である。いくつかの実施形態では、miR-142は、配列番号303を含む。いくつかの実施形態では、miRNA結合部位は、miR-142-3pまたはmiR-142-5pに結合する。いくつかの実施形態では、miR-142-3p結合部位は、配列番号305を含む。いくつかの実施形態では、miR-142-5p結合部位は、配列番号307を含む。いくつかの実施形態では、miRNA結合部位は、配列番号305または307に対して、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または100%同一であるヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、miRNA結合部位は、ポリヌクレオチドの任意の位置(例えば、5’UTR及び/または3’UTR)で、本発明のポリヌクレオチド中に挿入される。いくつかの実施形態では、5’UTRは、miRNA結合部位を含む。いくつかの実施形態では、3’UTRは、miRNA結合部位を含む。いくつかの実施形態では、5’UTR及び3’UTRは、miRNA結合部位を含む。ポリヌクレオチドへの挿入部位は、ポリヌクレオチドへのmiRNA結合部位の挿入が、対応するmiRNAの非存在下で機能性ポリペプチドの翻訳に干渉せず、またmiRNAの存在下では、ポリヌクレオチドへのmiRNA結合部位の挿入及びmiRNA結合部位の対応するmiRNAへの結合により、ポリヌクレオチドを分解することができ、またはポリヌクレオチドの翻訳を妨げることができる限り、ポリヌクレオチド内のどこの位置であってもよい。
いくつかの実施形態では、miRNA結合部位は、ORFを含む本発明のポリヌクレオチド中のORFの終止コドンから少なくとも約30ヌクレオチド下流に挿入される。いくつかの実施形態では、miRNA結合部位は、本発明のポリヌクレオチド中のORFの終止コドンから少なくとも約10ヌクレオチド、少なくとも約15ヌクレオチド、少なくとも約20ヌクレオチド、少なくとも約25ヌクレオチド、少なくとも約30ヌクレオチド、少なくとも約35ヌクレオチド、少なくとも約40ヌクレオチド、少なくとも約45ヌクレオチド、少なくとも約50ヌクレオチド、少なくとも約55ヌクレオチド、少なくとも約60ヌクレオチド、少なくとも約65ヌクレオチド、少なくとも約70ヌクレオチド、少なくとも約75ヌクレオチド、少なくとも約80ヌクレオチド、少なくとも約85ヌクレオチド、少なくとも約90ヌクレオチド、少なくとも約95ヌクレオチド、または少なくとも約100ヌクレオチド下流に挿入される。いくつかの実施形態では、miRNA結合部位は、本発明のポリヌクレオチド中のORFの終止コドンから約10ヌクレオチド~約100ヌクレオチド、約20ヌクレオチド~約90ヌクレオチド、約30ヌクレオチド~約80ヌクレオチド、約40ヌクレオチド~約70ヌクレオチド、約50ヌクレオチド~約60ヌクレオチド、約45ヌクレオチド~約65ヌクレオチド下流に挿入される。
miRNA遺伝子制御は、限定するものではないが、周辺配列の種、配列のタイプ(例えば、異種、相同、外因性、内因性、または人工)、周辺配列内の制御要素及び/または周辺配列内の構造要素などの、miRNAの周辺にある配列から影響を受け得る。miRNAは、5’UTR及び/または3’UTRによる影響を受け得る。非限定的な例として、非ヒト3’UTRは、同じ配列タイプのヒト3’UTRと比較して、目的のポリペプチドの発現に対する当該miRNA配列の制御的作用を増加させることができる。
1つの実施形態では、5’UTRの他の制御要素及び/または構造要素は、miRNA媒介性遺伝子制御に影響を与え得る。制御要素及び/または構造要素の一例は、5’UTR中の構造化IRES(配列内リボソーム進入部位)であり、これは、タンパク質翻訳を開始するための翻訳伸長因子の結合に必要である。5’-UTR中のこの二次構造化要素へのEIF4A2の結合は、miRNA媒介性遺伝子発現に必要である(Meijer HA et al.,Science,2013,340,82-85、当該文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる)。本発明のポリヌクレオチドは、マイクロRNA媒介性遺伝子制御を高めるために、この構造化5’UTRをさらに含み得る。
少なくとも1つのmiRNA結合部位が本発明のポリヌクレオチドの3’UTR中に操作され得る。この文脈において、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、またはそれより多くのRNA結合部位が本発明のポリヌクレオチドの3’UTR中に操作され得る。例えば、1~10、1~9、1~8、1~7、1~6、1~5、1~4、1~3、2、または1つのmiRNA結合部位が本発明のポリヌクレオチドの3’UTR中に操作され得る。1つの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドに組み込まれるmiRNA結合部位は、同じmiRNA部位であってもよいし、異なるmiRNA部位であってもよい。本発明のポリヌクレオチドに組み込まれる異なるmiRNA結合部位の組み合わせは、異なるmiRNA部位のいずれかの2つ以上のコピーが組み込まれる組み合わせを含み得る。別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドに組み込まれるmiRNA結合部位は、体内の同じ組織または異なる組織を標的にすることができる。非限定的な例として、本発明のポリヌクレオチドの3’-UTRに組織特異的、細胞種特異的、または疾患特異的miRNA結合部位を導入することにより、特定の細胞種(例えば、肝細胞、骨髄細胞、内皮細胞、癌細胞など)における発現の程度を低下させることができる。
1つの実施形態では、miRNA結合部位は、本発明のポリヌクレオチドの3’UTRの5’末端近傍、3’UTRの5’末端と3’末端の約半分のところ、及び/または3’UTRの3’末端近傍に操作され得る。非限定的な例として、miRNA結合部位は、3’UTRの5’末端近傍、及び3’UTRの5’末端と3’末端の約半分のところに操作され得る。別の非限定的な例として、miRNA結合部位は、3’UTRの3’末端近傍、及び3’UTRの5’末端と3’末端の約半分のところに操作され得る。さらに別の非限定的な例として、miRNA結合部位は、3’UTRの5’末端近傍及び3’UTRの3’末端近傍に操作され得る。
別の実施形態では、3’UTRは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個のmiRNA結合部位を含み得る。miRNA結合部位は、miRNA、miRNAシード配列、及び/またはシード配列に隣接するmiRNA配列に対して相補的であり得る。
1つの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、対象の異なる組織または異なる細胞種において発現するmiRNA部位を2つ以上含むように操作することができる。非限定的な例として、本発明のポリヌクレオチドは、対象の肝臓及び腎臓におけるポリヌクレオチドの発現を制御するために、miR-192及びmiR-122を含むように操作することができる。別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、同じ組織に対するmiRNA部位を2つ以上含むように操作することができる。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドに関係する治療濃度域及びまたは発現差を、miRNA結合部位により変更することができる。例えば、癌細胞のmiRNAの特徴により、死亡シグナルをもたらすポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが癌細胞でより高度に発現されるように設計することができる。癌細胞が特定のmiRNAを低レベルで発現する場合、当該miRNA(または複数のmiRNA)に対する結合部位をコードするポリヌクレオチドは、より高度に発現される。したがって、死亡シグナルをもたらすポリペプチドは、癌細胞の細胞死を惹起または誘導する。同じmiRNAを高度に発現する、隣接する非癌細胞は、そのmiRNAが3’UTRにコードされる結合部位または「センサー」に結合する作用により当該ポリヌクレオチドが低レベルで発現されるので、コードされた死亡シグナルによる影響を受けにくい。逆に、あるmiRNAが癌細胞で高度に発現する場合には、細胞生存シグナルまたは細胞保護性シグナルを癌含有組織及び非癌性細胞に送達することができ、その結果、癌細胞に対する生存シグナルが低くなり、正常細胞に対する生存シグナルが大きくなる。本明細書に記載のmiRNA結合部位の使用に基づいて、異なるシグナルを有する複数のポリヌクレオチドを設計及び投与することができる。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドの発現は、少なくとも1つのmiR結合部位またはセンサー配列をポリヌクレオチドに組み込み、投与用にポリヌクレオチドを製剤化することによって、制御することができる。非限定的な例として、本発明のポリヌクレオチドは、miRNA結合部位を組み込み、本明細書に記載の脂質のいずれかを含むイオン化可能な脂質(例えば、カチオン性脂質)を含む脂質ナノ粒子中にポリヌクレオチドを製剤化することによって、組織または細胞に標的化することができる。
本発明のポリヌクレオチドは、異なる組織、細胞種、または生物学的条件におけるmiRNAの発現パターンに基づいて、特定の組織、細胞種、または生物学的条件においてより標的化された発現がなされるように操作することができる。組織特異的miRNA結合部位を導入することで、本発明のポリヌクレオチドは、組織もしくは細胞において、または生物学的条件の点で、最適のタンパク質発現を得るように設計することができる。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、既知のmiRNAシード配列に対して100%の同一性またはmiRNAシード配列に対して100%未満の同一性のいずれかを有するmiRNA結合部位が組み込まれるように設計することができる。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、既知のmiRNAシード配列に対して、少なくとも:60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するmiRNA結合部位が組み込まれるように設計することができる。miRNAシード配列は、miRNA結合親和性を低下させるように部分的に変異させてもよく、それにより、ポリヌクレオチドの下方調節が減少する。本質的に、miRNA結合部位とmiRNAシードとの間の一致または不一致の程度は、タンパク質発現を調節するmiRNAの能力をより細かく調整するレオスタットとして機能し得る。加えて、miRNA結合部位の非シード領域内の変異も、タンパク質発現を調節するmiRNAの能力に影響を与え得る。
1つの実施形態では、miRNA配列は、ステムループのループ内に組み込むことができる。
別の実施形態では、miRNAシード配列は、ステムループのループ内に組み込むことができ、miRNA結合部位は、ステムループの5’ステム内または3’ステム内に組み込むことができる。。
1つの実施形態では、翻訳エンハンサー要素(TEE)は、ステムループのステムの5’末端に組み込むことができ、miRNAシードは、ステムループのステム内に組み込むことができる。別の実施形態では、TEEは、ステムループのステムの5’末端に組み込むことができ、miRNAシードは、ステムループのステム内に組み込むことができ、miRNA結合部位は、ステムループのステムの3’末端またはステムループ後の配列内に組み込むことができる。miRNAシード及びmiRNA結合部位は、同じ及び/または異なるmiRNA配列に対するものであってよい。
1つの実施形態では、miRNA配列及び/またはTEE配列を組み込むことにより、ステムループ領域の形状を変化させ、翻訳を増加及び/または減少させることができる(例えば、Kedde et al.,“A Pumilio-induced RNA structure switch in p27-3’UTR controls miR-221 and miR-22 accessibility.” Nature Cell Biology.2010を参照のこと。当該文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる)。
1つの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドの5’-UTRは、少なくとも1つのmiRNA配列を含み得る。miRNA配列は、限定するものではないが、19または22ヌクレオチド配列及び/またはシードを含まないmiRNA配列であり得る。
1つの実施形態では、5’UTR中のmiRNA配列は、本明細書に記載の本発明のポリヌクレオチドを安定化するために使用することができる。
別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドの5’UTR中のmiRNA配列は、限定するものではないが、開始コドンなどの翻訳開始部位へのアクセス可能性を低下させるために使用することができる。例えば、最初の開始コドン(AUG)へのアクセス可能性を低下させるために、開始コドン(-4~+37、ここでAUGコドンのAが+1)の周りにアンチセンスロックド核酸(LNA)オリゴヌクレオチド及びエクソンジャンクション複合体(EJC)を使用した、Matsuda et al.,PLoS One.2010 11(5):e15057を参照のこと。当該文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。Matsudaにより、LNAまたはEJCを用いて開始コドン周辺の配列を変えることは、ポリヌクレオチドの効率、長さ及び構造安定性に影響することが示された。本発明のポリヌクレオチドは、翻訳開始部位へのアクセス可能性を低下させるために、Matsudaらによって記載されたLNA配列またはEJC配列の代わりに、翻訳開始部位近傍にmiRNA配列を含み得る。翻訳開始部位は、miRNA配列の前、配列の後、または配列内にあってよい。非限定的な例として、翻訳開始部位は、シード配列または結合部位などのmiRNA配列内に位置し得る。別の非限定的な例として、翻訳開始部位は、シード配列またはmir-122結合部位などのmiR-122配列内に位置し得る。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、抗原提示細胞による抗原提示を減らすために、少なくとも1つのmiRNAを含み得る。miRNAは、完全なmiRNA配列、miRNAシード配列、シードを含まないmiRNA配列、またはそれらの組み合わせであり得る。非限定的な例として、本発明のポリヌクレオチドを組み込んだmiRNAは、造血系に特異的であり得る。別の非限定的な例として、抗原提示を減らすために本発明のポリヌクレオチドに組み込まれるmiRNAは、miR-142-3pである。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、目的の組織または細胞におけるコードされたポリペプチドの発現を減らすために、少なくとも1つのmiRNAを含み得る。非限定的な例として、本発明のポリヌクレオチドは、肝臓におけるコードされた目的ポリペプチドの発現を減らすために、少なくとも1つのmiR-122結合部位を含み得る。別の非限定的な例として、本発明のポリヌクレオチドは、少なくとも1つのmiR-142-3p結合部位、miR-142-3pシード配列、シードを含まないmiR-142-3p結合部位、miR-142-5p結合部位、miR-142-5pシード配列、シードを含まないmiR-142-5p結合部位、miR-146結合部位、miR-146シード配列及び/またはシード配列を含まないmiR-146結合部位を含み得る。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、免疫細胞においてmRNA治療剤を選択的に分解し、治療剤の送達によって引き起こされる望ましくない免疫原性応答を抑制するために、3’UTR中に少なくとも1つのmiRNA結合部位を含み得る。非限定的な例として、miRNA結合部位は、抗原提示細胞において、本発明のポリヌクレオチドをより不安定にすることができる。これらのmiRNAの非限定的な例には、mir-142-5p、mir-142-3p、mir-146a-5p、及びmir-146-3pが挙げられる。
1つの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、RNA結合タンパク質と相互作用することができるポリヌクレオチドの領域内に少なくとも1つのmiRNA配列を含む。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、(i)1つまたは複数の野生型エピトープ抗原をコードする配列最適化されたヌクレオチド配列(例えば、ORF)と、(ii)miRNA結合部位(例えば、miR-142に結合するmiRNA結合部位)と、を含む。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に開示の1つまたは複数の癌エピトープポリペプチドをコードするウラシル修飾配列と、本明細書に開示のmiRNA結合部位、例えば、miR-142に結合するmiRNA結合部位と、を含む。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の癌エピトープポリペプチドをコードするウラシル修飾配列は、少なくとも1つの化学的に修飾された核酸塩基、例えば、5-メトキシウラシルを含む。いくつかの実施形態では、本発明の1つまたは複数の癌エピトープポリペプチドをコードするウラシル修飾配列中の核酸塩基の一種(例えば、ウラシル)の少なくとも95%は、修飾された核酸塩基である。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の癌エピトープポリペプチドをコードするウラシル修飾配列中のウラシルの少なくとも95%は、5-メトキシウリジンである。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の1つまたは複数の癌エピトープポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、miRNA結合部位と、を含む、ポリヌクレオチドは、送達剤、例えば、式(I)、(IA)、(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)または(IIe)、例えば、化合物1~232のいずれかを有する脂質を含む、LNPを用いて製剤化される。
3’UTR及びAUリッチ要素
ある特定の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド(例えば、本発明の癌抗原エピトープをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)は、3’UTRをさらに含む。ある特定の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド(例えば、本発明の活性化癌遺伝子変異ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)は、3’UTRをさらに含む。
ある特定の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド(例えば、本発明の癌抗原エピトープをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)は、3’UTRをさらに含む。ある特定の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド(例えば、本発明の活性化癌遺伝子変異ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)は、3’UTRをさらに含む。
3’-UTRは、翻訳終止コドンのすぐ後に続くmRNAのセクションであり、多くの場合、転写後の遺伝子発現に影響を与える制御領域を含有する。3’-UTR内の制御領域は、mRNAのポリアデニル化、翻訳効率、局在化、及び安定性に影響し得る。1つの実施形態では、本発明に有用な3’-UTRは、制御タンパク質またはマイクロRNAに対する結合部位を含む。いくつかの実施形態では、3’-UTRは、リプレッサータンパク質に結合し、mRNAの発現を阻害する、サイレンサー領域を有する。他の実施形態では、3’-UTRは、AUリッチ要素を含む。タンパク質は、AREに結合し、局所的に転写物の安定性もしくは崩壊率に影響を与えるか、または翻訳開始に影響を与える。他の実施形態では、3’-UTRは、mRNA転写物の末端にポリ(A)テールと呼ばれる数百のアデニン残基の付加を導く、配列AAUAAAを含む。
天然または野生型3’UTRは、アデノシン及びウリジンのストレッチが埋め込まれていることが知られている。これらのAUが豊富という特徴は、特に、代謝率の高い遺伝子に一般にみられる。この配列の特徴及び機能特性に基づいて、AUリッチ要素(ARE)は、次の3つのクラスに分類することができる(Chen et al,1995):クラスIのAREは、Uリッチ領域内にAUUUAモチーフの分散コピーをいくつか含有する。C-Myc及びMyoDは、クラスIのAREを含有する。クラスIIのAREは、2つ以上の重複するUUAUUUA(U/A)(U/A)九量体を保有する。このタイプのAREを含有する分子には、GM-CSF及びTNF-aが含まれる。クラスIIIのAREは、あまり明確にされていない。これらのUリッチ領域は、AUUUAモチーフを含有しない。よく研究されているこのクラスの例には、c-Junとミオゲニンの2つがある。AREに結合するタンパク質のほとんどは、メッセンジャーを不安定にすることが知られているが、ELAVファミリーのメンバー、特にHuRは、mRNAの安定性を高めることが実証されている。HuRは、AREのすべての3つのクラスに結合する。核酸分子の3’UTR中にHuR特異的結合部位を操作すると、HuR結合が生じ、それにより、インビボにおけるメッセージの安定化につながる。
3’UTR AUリッチ要素(ARE)の導入、除去または修飾は、本発明のポリヌクレオチドの安定性を調節するために使用することができる。特定のポリヌクレオチドを操作する場合、AREの1つまたは複数のコピーは、本発明のポリヌクレオチドの安定性が低下するように導入され得、それにより、翻訳を抑制し、結果として生じるタンパク質の産生を減少させる。同様に、細胞内安定性を高めるAREを特定し、除去または変異させることで、翻訳及び結果として生じるタンパク質の産生を増加させる。本発明のポリヌクレオチドを使用したトランスフェクション実験を関連細胞株で実施することができ、タンパク質産生を、トランスフェクション後のさまざまな時点でアッセイすることができる。例えば、異なるARE操作分子を細胞にトランスフェクトすることができ、関連タンパク質に対するELISAキットを使用し、トランスフェクションから6時間後、12時間後、24時間後、48時間後、及び7日後に産生されたタンパク質をアッセイすることができる。
5’キャップを有する領域
本発明はまた、5’キャップと、本発明のポリヌクレオチド(例えば、活性化癌遺伝子変異ペプチドなどの癌抗原エピトープをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)の両方を含む、ポリヌクレオチドを含む。
本発明はまた、5’キャップと、本発明のポリヌクレオチド(例えば、活性化癌遺伝子変異ペプチドなどの癌抗原エピトープをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)の両方を含む、ポリヌクレオチドを含む。
天然mRNAの5’キャップ構造は、mRNA安定性を高める核輸送に関与し、mRNAキャップ結合タンパク質(CBP)に結合する。これは、CBPとポリ(A)結合タンパク質との会合を介して、細胞におけるmRNA安定性及び翻訳能力に関与し、成熟した環状mRNA種を形成する。キャップは、さらに、mRNAスプライシング中の5’側イントロンの除去も補助する。
内因性mRNA分子は、5’-末端がキャップされ得、それにより、mRNA分子の末端のグアノシンキャップ残基と5’-末端転写センスヌクレオチドとの間に5’-ppp-5’-トリホスフェート結合が生じる。次いで、この5’-グアニル酸キャップがメチル化されて、N7-メチル-グアニル酸残基が生じ得る。mRNAの5’末端の末端及び/または末端前の転写ヌクレオチドのリボース糖も、任意選択で2’-O-メチル化され得る。グアニル酸キャップ構造の加水分解及び切断による5’-脱キャップは、mRNA分子などの核酸分子を分解の標的にし得る。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド(例えば、癌抗原エピトープをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)には、キャップ部分を組み込む。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド(例えば、活性化癌遺伝子変異ペプチドなどの癌抗原エピトープをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)は、非加水分解型キャップ構造を含み、それにより、脱キャップが防止され、mRNA半減期が長くなる。キャップ構造の加水分解は、5’-ppp-5’ホスホロジエステル結合の切断を必要とするので、キャッピング反応中に修飾ヌクレオチドを使用することができる。例えば、New England Biolabs(Ipswich,MA)のワクシニアキャッピング酵素をα-チオ-グアノシンヌクレオチドとともに製造元の説明書に従って使用して、5’-ppp-5’キャップ中にホスホロチオエート結合を作ることができる。α-メチル-ホスホネート及びセレノ-ホスフェートヌクレオチドなどの追加の修飾グアノシンヌクレオチドを使用することもできる。
追加の修飾には、糖環の2’-ヒドロキシル基上における、ポリヌクレオチド(上記のもの)の5’-末端及び/または5’-末端前のヌクレオチドのリボース糖の2’-O-メチル化が含まれるが、これらに限定されない。複数の異なる5’-キャップ構造を使用して、mRNA分子として機能するポリヌクレオチドなどの核酸分子の5’-キャップを生成してもよい。キャップ類似体は、本明細書において、合成キャップ類似体、化学的キャップ、化学的キャップ類似体、または構造的もしくは機能的キャップ類似体とも呼ばれ、その化学構造は、天然(すなわち、内因性、野生型または生理学的)5’-キャップとは異なるが、キャップ機能は保持している。キャップ類似体は、化学的(すなわち、非酵素的)にまたは酵素的に合成し、及び/または本発明のポリヌクレオチドに連結することができる。
例えば、抗リバースキャップ類似体(ARCA)のキャップは、5’-5’-トリホスフェート基によって連結された2つのグアニンを含有し、1つのグアニンは、N7メチル基及び3’-O-メチル基を含有する(すなわち、N7,3’-O-ジメチル-グアノシン-5’-トリホスフェート-5’-グアノシン(m7G-3’mppp-G;これは、等価的に3’O-Me-m7G(5’)ppp(5’)Gとも記述され得る)。他方の修飾されていないグアニンの3’-O原子は、キャップされたポリヌクレオチドの5’-末端ヌクレオチドに連結される。N7-及び3’-O-メチル化グアニンは、キャップされたポリヌクレオチドの末端部分を提供する。
別のキャップの例は、mCAPである。これは、ARCAに類似しているが、グアノシンに2’-O-メチル基を有する(すなわち、N7,2’-O-ジメチル-グアノシン-5’-トリホスフェート-5’-グアノシン、m7Gm-ppp-G)。
いくつかの実施形態では、キャップは、ジヌクレオチドキャップ類似体である。非限定的な例として、ジヌクレオチドキャップ類似体は、米国特許第US8,519,110号に記載のジヌクレオチドキャップ類似体のように、異なるホスフェート位置をボラノホスフェート基またはホスホロセレノエート基で修飾することができ、当該文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
別の実施形態では、キャップは、キャップ類似体であり、当該技術分野において知られている及び/または本明細書に記載のN7-(4-クロロフェノキシエチル)置換ジヌクレオチド形態のキャップ類似体である。N7-(4-クロロフェノキシエチル)置換ジヌクレオチド形態のキャップ類似体の非限定的な例には、N7-(4-クロロフェノキシエチル)-G(5’)ppp(5’)Gキャップ類似体及びN7-(4-クロロフェノキシエチル)-m3’-OG(5’)ppp(5’)Gキャップ類似体が挙げられる(例えば、Kore et al.Bioorganic & Medicinal Chemistry 2013 21:4570-4574に記載されているさまざまなキャップ類似体及びキャップ類似体の合成方法を参照のこと;当該文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる)。別の実施形態では、本発明のキャップ類似体は、4-クロロ/ブロモフェノキシエチル類似体である。
キャップ類似体により、ポリヌクレオチドまたはその領域の付随するキャップ付加が可能になるのに対し、インビトロ転写反応では、転写物の最大20%がキャップされないまま残り得る。これは、内因性細胞転写機構によって産生される核酸の内因性5’-キャップ構造とキャップ類似体との構造的相違に加え、翻訳能力の低下及び細胞安定性の低下をもたらし得る。
本発明のポリヌクレオチド(例えば、癌抗原エピトープをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)はまた、より真正な5’-キャップ構造を生成するために、製造後に酵素を使用してキャップ付加することができる(IVTまたは化学合成を問わない)。本明細書で使用されるとき、「より真正な」という語句は、構造的または機能的に内因性または野生型の特徴を厳密に反映または模倣する特徴を指す。すなわち、「より真正な」特徴は、先行技術の合成的な特徴または類似体などと比較して、内因性、野生型、天然または生理学的な細胞機能及び/または構造をよりよく表すものであるか、あるいは、1つまたは複数の点で対応する内因性、野生型、天然または生理学的な特徴よりも優れているものである。本発明のより真正な5’キャップ構造の非限定的な例は、とりわけ、当該技術分野において知られている合成5’キャップ構造(または野生型、天然もしくは生理学的な5’キャップ構造)と比較して、キャップ結合タンパク質の結合の増強、半減期の延長、5’エンドヌクレアーゼに対する感受性の低下及び/または5’脱キャップの低下がなされているものである。例えば、組み換えワクシニアウイルスキャッピング酵素及び組み換え2’-O-メチルトランスフェラーゼ酵素は、ポリヌクレオチドの5’-末端ヌクレオチドとグアニンキャップヌクレオチドとの間に標準型5’-5’-トリホスフェート結合を生成することができる。ここで、キャップグアニンは、N7メチル化を含有し、mRNAの5’-末端ヌクレオチドは、2’-O-メチルを含有する。そのような構造は、キャップ1構造と呼ばれる。このキャップは、例えば、当該技術分野において知られている他の5’キャップ類似体構造と比較して、翻訳能力及び細胞安定性の向上、ならびに細胞炎症促進性サイトカインの活性化の低下をもたらす。キャップ構造には、7mG(5’)ppp(5’)N,pN2p(キャップ0)、7mG(5’)ppp(5’)NlmpNp(キャップ1)、及び7mG(5’)-ppp(5’)NlmpN2mp(キャップ2)が含まれるが、これらに限定されない。
非限定的な例として、製造後のキメラポリヌクレオチドのキャップ付加は、キメラポリヌクレオチドのほぼ100%をキャップ付加できるため、より効率的であり得る。これは、キャップ類似体がインビトロ転写反応の過程でキメラポリヌクレオチドに結合する場合の約80%とは対照的である。
本発明によれば、5’末端キャップは、内因性キャップまたはキャップ類似体を含み得る。本発明によれば、5’末端キャップは、グアニン類似体を含み得る。有用なグアニン類似体には、イノシン、N1-メチル-グアノシン、2’フルオロ-グアノシン、7-デアザ-グアノシン、8-オキソ-グアノシン、2-アミノ-グアノシン、LNA-グアノシン、及び2-アジド-グアノシンが含まれるが、これらに限定されない。
ポリAテール
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチド(例えば、活性化癌遺伝子変異ペプチドなどの癌抗原エピトープをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)は、ポリAテールをさらに含む。さらなる実施形態では、安定化のために、ポリAテールの末端基を組み込むことができる。他の実施形態では、ポリAテールは、des-3’ヒドロキシルテールを含む。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチド(例えば、活性化癌遺伝子変異ペプチドなどの癌抗原エピトープをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)は、ポリAテールをさらに含む。さらなる実施形態では、安定化のために、ポリAテールの末端基を組み込むことができる。他の実施形態では、ポリAテールは、des-3’ヒドロキシルテールを含む。
RNAプロセシング中には、安定性を高めるために、長鎖アデニンヌクレオチド(ポリAテール)がmRNA分子などのポリヌクレオチドに付加され得る。転写直後に、転写物の3’末端が切断され、3’ヒドロキシルを遊離させることができる。次いで、ポリAポリメラーゼがアデニンヌクレオチド鎖をRNAに付加する。ポリアデニル化と呼ばれるこのプロセスは、例えば、およそ80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240または250残基長を含む、およそ80~およそ250残基長であり得るポリAテールを付加する。
ポリAテールはまた、構築物が核から輸出された後に付加され得る。
本発明によれば、ポリAテールの末端基は、安定化のために組み込むことができる。本発明のポリヌクレオチドは、des-3’ヒドロキシルテールを含み得る。本発明のポリヌクレオチドはまた、Junjie Li,et al.(Current Biology,Vol.15,1501-1507,August 23,2005;当該文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる)によって教示される構造部分または2’-Oメチル修飾を含み得る。
本発明のポリヌクレオチドは、ヒストンmRNAを含む代替ポリAテール構造を持つ転写物をコードするように設計され得る。Norburyによれば、「末端ウリジル化は、ヒト複製依存性ヒストンmRNAでも検出されている。これらのmRNAの代謝は、染色体DNA複製の完了または阻害後に、潜在的に有毒なヒストンが蓄積するのを防ぐのに重要だと考えられている。これらのmRNAは、3’ポリ(A)テールの欠如により区別され、その機能は、安定なステムループ構造及びその同族のステムループ結合タンパク質(SLBP)が代わりに担い、後者は、ポリアデニル化mRNAに対するPABPの機能と同じ機能を果たす」(Norbury,“Cytoplasmic RNA:a case of the tail wagging the dog,” Nature Reviews Molecular Cell Biology;AOP,published online 29 August 2013;doi:10.1038/nrm3645)当該文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
特有のポリAテール長は、本発明のポリヌクレオチドにある特定の利点を与える。一般に、ポリAテールの長さは、存在する場合、30ヌクレオチド長を超える。別の実施形態では、ポリAテールは、35ヌクレオチド長を超える(例えば、少なくとも約35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1,000、1,100、1,200、1,300、1,400、1,500、1,600、1,700、1,800、1,900、2,000、2,500、及び3,000ヌクレオチド、またはそれを超える)。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドまたはその領域は、約30~約3,000ヌクレオチド(例えば、30~50、30~100、30~250、30~500、30~750、30~1,000、30~1,500、30~2,000、30~2,500、50~100、50~250、50~500、50~750、50~1,000、50~1,500、50~2,000、50~2,500、50~3,000、100~500、100~750、100~1,000、100~1,500、100~2,000、100~2,500、100~3,000、500~750、500~1,000、500~1,500、500~2,000、500~2,500、500~3,000、1,000~1,500、1,000~2,000、1,000~2,500、1,000~3,000、1,500~2,000、1,500~2,500、1,500~3,000、2,000~3,000、2,000~2,500、及び2,500~3,000)を含む。
いくつかの実施形態では、ポリAテールは、ポリヌクレオチド全体の長さまたはのポリヌクレオチドの特定の領域の長さに関連して設計される。この設計は、コーディング領域の長さ、特定の特徴もしくは領域の長さに基づいてもよいし、またはポリヌクレオチドから発現される最終産物の長さに基づいてもよい。
これに関し、ポリAテールは、長さが、ポリヌクレオチドまたはその特徴よりも10、20、30、40、50、60、70、80、90、または100%長くてもよい。ポリAテールはまた、そのポリAテールが属するポリヌクレオチドの一部として設計することができる。これに関し、ポリAテールは、構築物の全長、構築物領域または構築物の全長からポリAテールを差し引いた長さに対して、10、20、30、40、50、60、70、80、もしくは90%またはそれより長くてもよい。さらに、結合部位の操作及びポリヌクレオチドのポリA結合タンパク質への結合は、発現を増強し得る。
加えて、複数の異なるポリヌクレオチドが、PABP(ポリA結合タンパク質)を介して、ポリAテールの3’末端にある修飾ヌクレオチドを使用して、3’-末端で一緒に連結され得る。関連細胞株でトランスフェクション実験を実施することができ、タンパク質産生を、トランスフェクションから12時間後、24時間後、48時間後、72時間後及び7日後にELISAによってアッセイすることができる。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ポリA-Gカルテット領域を含むように設計される。Gカルテットは、DNA及びRNAの両方でGリッチ配列によって形成され得る、4つのグアニンヌクレオチドの環状水素結合アレイである。本実施形態では、Gカルテットは、ポリAテールの末端に組み込まれる。結果として得られるポリヌクレオチドは、さまざまな時点における、安定性、タンパク質産生及び半減期を含む他のパラメータについて、アッセイすることができる。ポリA-Gカルテットによって生じるmRNAからのタンパク質産生は、120ヌクレオチドのみのポリAテールを使用したときにみられるタンパク質産生の少なくとも75%に相当することが発見されている。
開始コドン領域
本発明はまた、開始コドン領域と、本明細書に記載のポリヌクレオチド(例えば、活性化癌遺伝子変異ペプチドなどの癌抗原エピトープをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)の両方を含む、ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、開始コドン領域に類似する領域または開始コドン領域と同様に機能する領域を有し得る。
本発明はまた、開始コドン領域と、本明細書に記載のポリヌクレオチド(例えば、活性化癌遺伝子変異ペプチドなどの癌抗原エピトープをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)の両方を含む、ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、開始コドン領域に類似する領域または開始コドン領域と同様に機能する領域を有し得る。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの翻訳は、開始コドンAUGではないコドンから開始され得る。ポリヌクレオチドの翻訳は、限定するものではないが、ACG、AGG、AAG、CTG/CUG、GTG/GUG、ATA/AUA、ATT/AUU、TTG/UUGなどの代替開始コドンから開始され得る(Touriol et al.Biology of the Cell 95(2003)169-178及びMatsuda and Mauro PLoS ONE,2010 5:11を参照のこと;これらの文献のそれぞれの内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる)。
非限定的な例として、ポリヌクレオチドの翻訳は、代替開始コドンACGから開始する。別の非限定的な例として、ポリヌクレオチド翻訳は、代替開始コドンCTGまたはCUGから開始する。さらなる別の非限定的な例として、ポリヌクレオチドの翻訳は、代替開始コドンGTGまたはGUGから開始する。
翻訳を開始するコドン、例えば、限定するものではないが、開始コドンまたは代替開始コドンに隣接するヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの翻訳効率、長さ及び/または構造に影響を与えることが知られている(例えば、Matsuda and Mauro PLoS ONE,2010 5:11を参照のこと;当該文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる)。翻訳を開始するコドンに隣接するヌクレオチドのいずれかをマスキングすることを利用して、ポリヌクレオチドの翻訳開始位置、翻訳効率、長さ及び/または構造を変更することができる。
いくつかの実施形態では、開始コドンまたは代替開始コドンの近傍でマスキング剤を使用して当該コドンをマスキングまたは遮蔽し、マスキングされた開始コドンまたは代替開始コドンで翻訳が開始される確率を低下させることができる。マスキング剤の非限定的な例には、アンチセンスロックド核酸(LNA)ポリヌクレオチド及びエクソンジャンクション複合体(EJC)が挙げられる(例えば、マスキング剤であるLNAポリヌクレオチド及びEJCについて記載するMatsuda and Mauro(PLoS ONE,20105:11)を参照のこと;当該文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる)。
別の実施形態では、ポリヌクレオチドの開始コドンをマスキング剤を使用してマスキングし、代替開始コドンで翻訳が開始される可能性を高めることができる。いくつかの実施形態では、第1の開始コドンまたは代替開始コドンをマスキング剤を使用してマスキングし、マスキングされた開始コドンまたは代替開始コドンの下流にある開始コドンまたは代替開始コドンで翻訳が開始される可能性を高めることができる。
いくつかの実施形態では、開始コドンまたは代替開始コドンは、miR結合部位に対する完全な相補体内に位置し得る。miR結合部位の完全な相補体は、マスキング剤と同様に、ポリヌクレオチドの翻訳、長さ及び/または構造を制御する助けとなり得る。非限定的な例として、開始コドンまたは代替開始コドンは、miRNA結合部位に対する完全な相補体の中央に位置し得る。開始コドンまたは代替開始コドンは、第1ヌクレオチド、第2ヌクレオチド、第3ヌクレオチド、第4ヌクレオチド、第5ヌクレオチド、第6ヌクレオチド、第7ヌクレオチド、第8ヌクレオチド、第9ヌクレオチド、第10ヌクレオチド、第11ヌクレオチド、第12ヌクレオチド、第13ヌクレオチド、第14ヌクレオチド、第15ヌクレオチド、第16ヌクレオチド、第17ヌクレオチド、第18ヌクレオチド、第19ヌクレオチド、第20ヌクレオチドまたは第21ヌクレオチドの後に位置し得る。
別の実施形態では、ポリヌクレオチドの翻訳を開始コドンではないコドンから開始させるために、ポリヌクレオチドの開始コドンをポリヌクレオチド配列から除去してもよい。ポリヌクレオチドの翻訳は、除去された開始コドンの後にあるコドンまたは下流の開始コドンもしくは代替開始コドンで開始され得る。非限定的な例では、翻訳を下流の開始コドンまたは代替開始コドンから開始させるために、ポリヌクレオチド配列の最初の3ヌクレオチドである開始コドンATGまたはAUGが除去される。開始コドンが除去されたポリヌクレオチド配列は、翻訳の開始、ポリヌクレオチドの長さ及び/またはポリヌクレオチドの構造を制御または制御を試みるために、下流の開始コドン及び/または代替開始コドンに対する少なくとも1つのマスキング剤をさらに含み得る。
終止コドン領域
本発明はまた、終止コドン領域と、本明細書に記載のポリヌクレオチド(例えば、活性化癌遺伝子変異ペプチドなどの癌抗原エピトープをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)の両方を含む、ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、3’非翻訳領域(UTR)の前に少なくとも2つの終止コドンを含み得る。終止コドンは、DNAの場合はTGA、TAA及びTAGから、またはRNAの場合はUGA、UAA及びUAGから選択することができる。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、DNAの場合は終止コドンTGA、またはRNAの場合は終止コドンUGAと、1つの追加の終止コドンと、を含む。さらなる実施形態では、追加の終止コドンは、TAAまたはUAAであり得る。別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、3つの連続する終止コドン、4つの終止コドン、またはそれより多くの終止コドンを含む。
本発明はまた、終止コドン領域と、本明細書に記載のポリヌクレオチド(例えば、活性化癌遺伝子変異ペプチドなどの癌抗原エピトープをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)の両方を含む、ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、3’非翻訳領域(UTR)の前に少なくとも2つの終止コドンを含み得る。終止コドンは、DNAの場合はTGA、TAA及びTAGから、またはRNAの場合はUGA、UAA及びUAGから選択することができる。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、DNAの場合は終止コドンTGA、またはRNAの場合は終止コドンUGAと、1つの追加の終止コドンと、を含む。さらなる実施形態では、追加の終止コドンは、TAAまたはUAAであり得る。別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、3つの連続する終止コドン、4つの終止コドン、またはそれより多くの終止コドンを含む。
挿入及び置換
本発明はまた、挿入及び/または置換をさらに含む、本開示のポリヌクレオチドを含む。
本発明はまた、挿入及び/または置換をさらに含む、本開示のポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの5’UTRは、同一塩基のヌクレオシドの少なくとも1つの領域及び/またはストリングの挿入によって置換され得る。ヌクレオチドの領域及び/またはストリングは、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7または少なくとも8ヌクレオチドを含み得るが、これらに限定されず、ヌクレオチドは、天然及び/または非天然であってよい。非限定的な例として、ヌクレオチド基は、5~8個のアデニン、シトシン、チミン、本明細書に開示の他のヌクレオチドのいずれかのストリング及び/またはその組み合わせを含み得る。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの5’UTRは、限定するものではないが、アデニン、シトシン、チミン、本明細書に開示の他のヌクレオチドのいずれか及び/またはそれらの組み合わせなどの2つの異なる塩基のヌクレオチドの少なくとも2つの領域及び/またはストリングの挿入によって置換され得る。例えば、5’UTRは、5~8個のアデニン塩基を挿入し、それに続いて5~8個のシトシン塩基を挿入することによって置換され得る。別の例では、5’UTRは、5~8個のシトシン塩基を挿入し、それに続いて5~8個のアデニン塩基を挿入することによって置換され得る。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、RNAポリメラーゼによって認識され得る転写開始部位の下流に、少なくとも1つの置換及び/または挿入を含み得る。非限定的な例として、少なくとも1つの置換及び/または挿入は、転写開始部位の下流に存在し得、これは、転写開始部位のすぐ下流の領域内(限定するものではないが、+1~+6など)の少なくとも1つの核酸が置換されることによる。転写開始部位のすぐ下流にあるヌクレオチド領域を変化させることは、開始速度に影響を与え、見かけのヌクレオチドトリホスフェート(NTP)反応定数値を大きくし、初期転写をキュアリングする転写複合体からの短い転写物の解離を増加させ得る(Brieba et al,Biochemistry(2002)41:5144-5149;当該文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる)。少なくとも1つのヌクレオシドの修飾、置換及び/または挿入は、配列のサイレント変異をもたらし得るか、またはアミノ酸配列の変異をもたらし得る。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、転写開始部位の下流に、少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12または少なくとも13個のグアニン塩基の置換を含み得る。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、転写開始部位のすぐ下流の領域内に、少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5または少なくとも6個のグアニン塩基の置換を含み得る。非限定的な例として、領域内のヌクレオチドがGGGAGAである場合、グアニン塩基は、少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3または少なくとも4個のアデニンヌクレオチドで置換され得る。別の非限定的な例では、領域内のヌクレオチドがGGGAGAである場合、グアニン塩基は、少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3または少なくとも4個のシトシン塩基で置換され得る。別の非限定的な例では、領域内のヌクレオチドがGGGAGAである場合、グアニン塩基は、少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3もしくは少なくとも4個のチミン、及び/または本明細書に記載のヌクレオチドのいずれかで置換され得る。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、開始コドンの上流に少なくとも1つの置換及び/または挿入を含み得る。明確さを期すために記すが、当業者であれば、開始コドンは、タンパク質コーディング領域の最初のコドンであり、転写開始部位は、転写が開始される部位であることを理解するであろう。ポリヌクレオチドは、ヌクレオチド塩基の少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ、少なくとも7つまたは少なくとも8つの置換及び/または挿入を含み得るが、これらに限定されない。ヌクレオチド塩基は、開始コドンの上流の1つ、少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つまたは少なくとも5つの位置に挿入または置換され得る。挿入及び/または置換されるヌクレオチドは、同じ塩基(例えば、すべてAまたはすべてCまたはすべてTまたはすべてG)、2つの異なる塩基(例えば、A及びC、A及びT、またはC及びT)、3つの異なる塩基(例えば、A、C及びTまたはA、C及びT)または少なくとも4つの異なる塩基であってよい。
非限定的な例として、ポリヌクレオチド内のコーディング領域の上流にあるグアニン塩基は、アデニン、シトシン、チミン、または本明細書に記載のヌクレオチドのいずれかで置換され得る。別の非限定的な例では、ポリヌクレオチド内のグアニン塩基の置換は、グアニン塩基が、転写開始部位の下流かつ開始コドンの前にある領域内に1つ残るように設計され得る(Esvelt et al.Nature(2011)472(7344):499-503を参照のこと;当該文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる)。非限定的な例として、転写開始部位の下流であるが、開始コドンの上流である1つの位置に少なくとも5個のヌクレオチドが挿入され得、少なくとも5個のヌクレオチドは、同じ塩基型であってよい。
本開示に従って、例えばトリホスフェートケミストリーを使用し、キメラポリヌクレオチドの2つの領域または部分を連結またはライゲーションしてよい。いくつかの実施形態では、100以下のヌクレオチドの第1の領域または部分は、化学的に合成され、5’はモノホスフェートとなり、末端の3’-OHは除去または遮断される。領域が80ヌクレオチドより長いのであれば、後にライゲーションによって化学的に連結されることになる2つ以上の鎖として合成してよい。第1の領域または部分が、IVTを使用して、非位置的に修飾された領域または部分として合成されるのであれば、その後に、5’-モノホスフェートへと変換し、続けて3’末端のキャッピングを実施してよい。モノホスフェート保護基は、当該技術分野で知られるもののいずれから選択してもよい。キメラポリヌクレオチドの第2の領域または部分は、例えば本明細書に記載の、化学合成法またはIVT法のいずれを使用して合成してもよい。IVT法は、修飾されたキャップを有するプライマーを利用することができるRNAポリメラーゼの使用を含み得る。あるいは、キャップは、化学的に合成し、IVTの領域または部分にカップリングさせてよい。
ライゲーション方法については、DNA T4リガーゼでのライゲーションの後に、(DNA T4リガーゼの活性に必要になるDNAスプリントを除去するために)DNAseで処理することで、望ましくない連結産物形成が容易に阻止されるであろうことに留意されたい。
キメラポリヌクレオチド全体がホスフェート-糖骨格で製造される必要はない。領域または部分の1つがポリペプチドをコードするのであれば、そのような領域または部分は、ホスフェート-糖骨格を含むことが好ましい。
ライゲーションは、酵素的ライゲーション、クリックケミストリー、オルトクリックケミストリー、ソルリンク(solulink)、または当業者に知られる他の生体複合化ケミストリーなどの、任意の適切な技術を使用して実施してよい。いくつかの実施形態では、ライゲーションは、相補的オリゴヌクレオチドスプリントによって誘導される。いくつかの実施形態では、ライゲーションは、相補的オリゴヌクレオチドスプリントなしで実施される。
他の態様では、本発明は、IVT法によるmRNA癌ワクチンの調製を目的とするキットに関する。個別化癌ワクチンでは、患者特異的変異を同定し、1つまたは複数のネオエピトープで患者にワクチン接種を施すことが重要である。そのようなワクチンでは、mRNAのORFによってコードされる抗原(複数可)は、患者特異的ということになる。抗原(複数可)をコードするRNAの5’末端及び3’末端は、多くのRNAに共通する非翻訳領域及び安定化領域を含むため、より広く適用可能であり得る。数ある中でも特に、本開示は、RNAの1つまたは複数の5’領域及び/3’領域などの、キメラポリヌクレオチドの1つまたは複数の部分を含むキットを提供し、こうした1つまたは複数の部分は、患者特異的エピトープをコードするORFと組み合わせてよい。例えば、キットは、5’-ORF、3’-ORF、及びポリ(A)尾部の1つまたは複数を含むポリヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、それぞれのポリヌクレオチド構成要素は、個々の容器に存在する。他の実施形態では、複数のポリヌクレオチド構成要素が単一の容器に共に存在する。いくつかの実施形態では、キットは、リガーゼ酵素を含む。いくつかの実施形態では、提供されるキットは、使用のための説明を含む。いくつかの実施形態では、説明は、ORFをコードするエピトープと、例えば、5’-ORF、3’-ORF、及び/またはポリ(A)尾部などの、キットに含まれる1つまたは複数の他の構成要素と、のライゲーションについての説明を含む。
本発明による個別化癌ワクチンの生成方法は、組織試料に対して本明細書に記載の核酸またはタンパク質のディープシークエンシング法などの技術を使用する変異の同定を含む。いくつかの実施形態では、患者のトランスクリプトームにおける変異の最初の同定が実施される。患者のトランスクリプトームに由来するデータは、患者特異的かつ腫瘍特異的な発現変異を同定するために、患者のエクソームに由来する配列情報と比較される。比較によって推定ネオエピトープのデータセットが得られ、このデータセットは、ミュータノームと称される。ミュータノームは、患者当たり約100~10,000の候補変異を含み得る。ミュータノームは、ネオ抗原ワクチンの生成を目的とする最適変異セットを同定するために、問い合わせまたはアルゴリズムのセットを使用するデータ探索解析に供される。いくつかの実施形態では、mRNAネオ抗原ワクチンが設計され、製造される。その後、患者はそのワクチンで治療される。
ネオ抗原ワクチンは、複数のネオエピトープ、または1つもしくは複数の単一のRNAワクチン、またはそれらの組み合わせを含むポリシストロニックワクチンであり得る。
いくつかの実施形態では、変異同定プロセスを開始してから、患者の治療を開始するまでの全方法は、2ヶ月未満で達成される。他の実施形態では、全プロセスは、7週間以内、6週間以内、5週間以内、4週間以内、3週間以内、2週間以内、または1週間未満で達成される。いくつかの実施形態では、全方法は、30日未満で実施される。
変異同定プロセスは、トランスクリプトーム解析とエクソーム解析との両方、またはトランスクリプトーム解析のみ、もしくはエクソーム解析のみを含み得る。いくつかの実施形態では、トランスクリプトーム解析が最初に実施され、エクソーム解析は2番目に実施される。解析は、生体試料または組織試料に対して実施される。いくつかの実施形態では、生体試料または組織試料は、血液試料または血清試料である。他の実施形態では、試料は、組織バンクの試料であるか、またはEBVで形質転換したB細胞である。
癌関連変異のある特定の特性を解析することによって、mRNAワクチンに含めるために最適なネオエピトープを評価及び/または選択し得るということが認識及び理解されてきた。例えば、所与の時点で、ワクチンに含めるためのネオエピトープのセットを選択されるために、いくつかの特性の1つまたは複数を評価または重み付けしてよい。1つのネオエピトープまたはネオエピトープのセットの特性には、例えば、患者のRNAシークエンシングもしくは他の核酸分析における遺伝子もしくは転写物レベルの発現評価、利用可能なデータベースにおける組織特異的発現、既知の癌遺伝子/腫瘍抑制因子、バリアントコール(variant call)信頼スコア、RNAシークエンシングに基づく対立遺伝子特異的発現、保存的アミノ酸置換と非保存的アミノ酸置換との比較、点変異の位置(TCRの関与増加についての中心スコア(Centering Score))、点変異の位置(HLAとの結合の差異についての固定スコア(Anchoring Score))、独自性(Selfness):患者のWESデータとのコアエピトープ相同性(<100%)、8マー~11マーについてはHLA-A及びHLA-Bに対するIC50、15マー~20マーについてはHLA-DRB1に対するIC50、広範結合スコア(promiscuity Score)(すなわち、結合すると予測される患者HLAの数)、8マー~11マーについてはHLA-Cに対するIC50、15マー~20マーについてはHLA-DRB3~5に対するIC50、15マー~20マーについてはHLA-DQB1/A1に対するIC50、15マー~20マーについてはHLA-DPB1/A1に対するIC50、クラスIとクラスIIとの比率比較、患者においてカバーされるHLA-Aアロタイプ、HLA-Bアロタイプ、及びHLA-DRB1アロタイプの多様性、点変異と複合エピトープ(例えば、フレームシフト)との比率比較、及び/または偽エピトープHLA結合スコアが含まれ得る。
いくつかの実施形態では、最適なオエピトープの同定に使用される癌関連変異癌の特性は、変異の型、患者試料における変異の存在量、免疫原性、自己反応性の欠如、ペプチド組成の性質と関連する特性である。
変異の型が決定され、推定エピトープをワクチンに含めるべきかどうかの決定要素として考慮されるべきである。変異の型は、変わり得るものである。いくつかの実例では、単一のワクチンに異なる型の変異を複数含めることが望ましくあり得る。他の実例では、単一の型の変異がより望ましくあり得る。特定の変異に対する値を重み付け及び計算することができる。いくつかの実施形態では、特定の変異は、一塩基多型(SNP)である。いくつかの実施形態では、特定の変異は、複合変異体であり、例えば、イントロンの保持、複合的なスプライシング事象、または配列のリーディングフレームを変化させる挿入/欠失変異から生じるペプチド配列である。
患者試料における変異の存在量もスコア化し、推定エピトープをワクチンに含めるべきかどうかの決定要素としてよい。大量に存在する変異は、より強固な免疫応答を促進し得る。
免疫原性の考慮は、ワクチンに含めるための最適なネオエピトープの選択における重要な要素である。免疫原性は、例えば、ネオエピトープのMHC結合能力、HLA広範結合度、変異位置、T細胞の予測される反応性、T細胞の実際の反応性、特定の立体構造及び結果的な溶媒への露出につながる構造、ならびに特定のアミノ酸の表現状態(representation)を解析することによって評価してよい。NetMHC予測アルゴリズムなどの既知のアルゴリズムを使用することで、一般的なHLA-A対立遺伝子及びHLA-B対立遺伝子にペプチドが結合する能力を予測することができる。インシリコの3次元解析及び/またはタンパク質ドッキングプログラムによってMHCと結合したペプチドの構造評価を実施してもよい。エピトープがMHC分子に結合したときにエピトープのアミノ酸残基が溶媒に露出する度合いを評価するために、Rosettaアルゴリズムから得たものなどの、MHC分子への結合時の予測エピトープ構造を使用してよい。T細胞反応性は、エピトープ及びT細胞をインビトロで用いて実験的に評価してよい。あるいは、T細胞反応性は、T細胞応答/配列データセットを使用して評価してよい。
ワクチンに含まれるネオエピトープに重要な要素は、自己反応性が存在しないことである。推定ネオエピトープは、そのエピトープが、例えば、悪性細胞内で遺伝子変化の結果として生じ、腫瘍組織に限ったものであることを確認するためにスクリーニングしてよい。理想的には、エピトープは、患者の正常組織には存在するべきではなく、したがって、自己に類似したエピトープは、データセットから除外される。自己反応性が存在しないことを決定するために、ネオ抗原候補の比較のための参照として個別化コードゲノムを使用してよい。いくつかの実施形態では、個別化コードゲノムは、個別化されたトランスクリプトーム及び/またはエクソームから生成される。
エピトープの設計においてペプチド組成の性質を考慮してもよい。例えば、エピトープに見られる保存アミノ酸と非保存アミノ酸とを比較した値に対するスコアをそれぞれの推定エピトープに与えることができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のツールによって実施される解析は、異なる時間、すなわち、治療行為の前及び後に患者から得られる異なる特性セット、異なる組織試料から得られる異なる特性セット、同様の腫瘍を有する異なる患者から得られる異なる特性セットなどの比較を含み得る。いくつかの実施形態では、あるセットの特性に由来するピーク値の平均を別のセットの特性に由来するピーク値の平均と比較してよい。例えば、2つの異なるセットの分布の間でHLA結合の平均値を比較してよい。2つのセットの分布は、例えば、日数、月数、または年数によって区切られた期間について決定してよい。
さらに、発明者らは、本明細書に記載のアルゴリズムを使用することで、癌変異の特性に対するそのようなデータを収集し、解析し得ることを認識及び理解している。データは、個別化癌ワクチンを開発するためのネオエピトープ及びネオエピトープのセットの同定に有用である。
いくつかの実施形態では、腫瘍変異ペプチドの注解された転写物はすべて、本発明に従ってワクチンに含められる。いくつかの実施形態では、RNAシークエンシングにおいて同定されたRNAの翻訳物が、本発明に従ってワクチンに含められる。
例えば、2つ以上のネオ抗原などの、2つ以上のペプチドのコンカテマーによって、ペプチドの境界に、意図されない新たなエピトープ(偽エピトープ)が創出され得ることを理解されたい。そのような偽エピトープを阻止または除外するために、クラスI対立遺伝子がヒットするかを、コンカテマーにおけるペプチド境界にわたってスクリーニングしてよい。いくつかの実施形態では、偽エピトープの形成を低減または除外するために、コンカテマー内のペプチドの順序がシャッフルされる。いくつかの実施形態では、偽エピトープの形成を低減または除外するために、ペプチド間にリンカーを使用してよく、こうしたリンカーは、例えば、グリシンなどの単一アミノ酸のリンカーである。いくつかの実施形態では、偽エピトープの形成を低減または除外することになる他のアミノ酸でアンカーアミノ酸を交換することができる。いくつかの実施形態では、偽エピトープの形成を低減または除外するために、コンカテマー内のペプチド境界でペプチドが切り詰められる。
いくつかの実施形態では、複数のペプチドエピトープ抗原は、偽エピトープが最小化するように配置及び順序決定される。他の実施形態では、複数のペプチドエピトープ抗原は、偽エピトープを含まないポリペプチドである。癌抗原エピトープが、コンカテマー構造においてヘッドトゥーテール編成で配置されると、それぞれの癌抗原エピトープの間にジャンクションが形成される。このジャンクションは、ペプチドのN末端に存在するエピトープに由来するいくつかのアミノ酸、すなわち1~10のアミノ酸と、直接連結される隣接エピトープのC末端のいくつかのアミノ酸、すなわち1~10のアミノ酸と、を含む。ジャンクションは、免疫応答を生成し得る免疫原性ペプチドではないことが重要である。いくつかの実施形態では、ジャンクションは、個別化癌ワクチンの設計対象である対象のHLAタンパク質に対して、約50nMを超えるIC50で結合するペプチド配列を形成する。他の実施形態では、ジャンクションのペプチド配列は、対象のHLAタンパク質に対して、約10nM、約150nM、約200nM、約250nM、約300nM、約350nM、約400nM、約450nm、または約500nMを超えるIC50で結合する。
本明細書に記載の技術に従ってネオエピトープを特徴付けるシステムは、任意の適切な形態をとり得るものであり、この点に関して実施形態は限定されない。いくつかの実施形態と関連させて使用してよいコンピューターシステム900の実施態様の例は、図5に示される。上記の機能性のいずれを実施するためにも、コンピューターシステム900などの、1つまたは複数のコンピューターシステムを使用してよい。コンピューターシステム900は、1つまたは複数のプロセッサ910と、例えば、揮発性記憶装置920及び1つまたは複数の不揮発性記憶媒体930などの1つまたは複数のコンピューター可読記憶媒体(すなわち、有形かつ非一過性のコンピューター可読媒体)と、を含み得、こうした記憶媒体は、任意の適切なデータ記憶媒体から形成し得る。プロセッサ910は、任意の適切な様式で揮発性記憶装置920及び不揮発性記憶装置機器930からのデータ書き込み及びデータ読み込みを制御し得、この点に関して実施形態は限定されない。本明細書に記載の機能性のいずれを実施するためにも、プロセッサ910は、1つまたは複数のコンピューター可読記憶媒体(例えば、揮発性記憶装置920及び/または不揮発性記憶装置930)に記憶される1つまたは複数の命令を実行し得、こうした記憶媒体は、プロセッサ910によって実行するための命令を記憶する有形かつ非一過性のコンピューター可読媒体として働き得る。
上記の実施形態は、多くの様式のいずれで実施することもできる。例えば、実施形態は、ハードウェア、ソフトウェア、またはそれらの組み合わせを使用して実施してよい。ソフトウェアにおいて実施されるとき、任意の適切なプロセッサまたはプロセッサの集合体でソフトウェアコードを実行することができ、こうしたプロセッサが、単一のコンピューターにおいて提供されるか、または複数のコンピューター間に分散しているかは問われない。上記の機能を実施する任意の要素または要素の集合体が、一般に、上で議論される機能を制御する1つまたは複数の制御装置であると考え得ることを理解されるべきである。1つまたは複数の制御装置は、専用のハードウェア、または上記の機能を実施するためのマイクロコードもしくはソフトウェアを使用してプログラム化された汎用ハードウェア(例えば、1つもしくは複数のプロセッサ)などを用いてさまざまな様式で実施することができる。
この点に関して、1つの実施態様は、少なくとも1つのコンピューター可読記憶媒体(すなわち、少なくとも1つの有形かつ非一過性のコンピューター可読媒体)を含むと理解されるべきであり、こうしたコンピューター可読記憶媒体は、1つまたは複数のプロセッサで実行されると、上で議論される機能を実施するコンピュータープログラム(すなわち、複数の命令)がコードされるコンピューターメモリー(例えば、ハードドライブ、フラッシュメモリー、プロセッサワーキングメモリーなど)、フロッピーディスク、光ディスク、磁気テープ、または他の有形かつ非一過性のコンピューター可読媒体などである。コンピューター可読記憶媒体は持ち運び可能であり、その結果、そこに記憶されるプログラムは、本明細書で議論される技術を実施するために任意のコンピューターリソースに読み込ませることができる。さらに、実行されると上で議論される機能を実施するコンピュータープログラムに対する参照は、ホストコンピューターで動くアプリケーションプログラムに限定されないことを理解されるべきである。むしろ、本明細書では、「コンピュータープログラム」という用語は、上記の技術を実施する1つまたは複数のプロセッサをプログラムするために用いることができる任意の型のコンピューターコード(例えば、ソフトウェアまたはマイクロコード)を参照するために一般的な意味において使用される。
GCリッチドメイン
定義
GCリッチ:本明細書で使用されるとき、「GCリッチ」という用語は、グアニン(G)及び/またはシトシン(C)核酸塩基、またはその誘導体もしくは類似体を含み、GC含量が約50%を超える、ポリヌクレオチド(例えば、mRNA)、またはその任意の部分(例えば、RNA要素)の核酸塩基の組成を指す。「GCリッチ」という用語は、約50%のGC含量を含む、ポリヌクレオチドのすべて、またはその部分、限定するものではないが、遺伝子、非コーディング領域、5’UTR、3’UTR、オープンリーディングフレーム、RNA要素、配列モチーフ、またはその任意の個々の配列、断片、もしくはセグメントなどを指す。本開示のいくつかの実施形態では、GCリッチポリヌクレオチド、またはその任意の部分は、排他的に、グアニン(G)及び/またはシトシン(C)核酸塩基から構成されるる。
定義
GCリッチ:本明細書で使用されるとき、「GCリッチ」という用語は、グアニン(G)及び/またはシトシン(C)核酸塩基、またはその誘導体もしくは類似体を含み、GC含量が約50%を超える、ポリヌクレオチド(例えば、mRNA)、またはその任意の部分(例えば、RNA要素)の核酸塩基の組成を指す。「GCリッチ」という用語は、約50%のGC含量を含む、ポリヌクレオチドのすべて、またはその部分、限定するものではないが、遺伝子、非コーディング領域、5’UTR、3’UTR、オープンリーディングフレーム、RNA要素、配列モチーフ、またはその任意の個々の配列、断片、もしくはセグメントなどを指す。本開示のいくつかの実施形態では、GCリッチポリヌクレオチド、またはその任意の部分は、排他的に、グアニン(G)及び/またはシトシン(C)核酸塩基から構成されるる。
GC含量:本明細書で使用されるとき、「GC含量」という用語は、ポリヌクレオチド(例えば、mRNA)、またはその部分(例えば、RNA要素)における、グアニン(G)及びシトシン(C)核酸塩基のいずれか、またはその誘導体もしくは類似体である核酸塩基のパーセンテージ(DNA及びRNA中のアデニン(A)及びチミン(T)またはウラシル(U)ならびにその誘導体または類似体を含む可能性のある核酸塩基の総数からのパーセンテージ)を指す。「GC含量」という用語は、ポリヌクレオチドのすべて、またはその部分、限定するものではないが、遺伝子、非コーディング領域、5’UTR、3’UTR、オープンリーディングフレーム、RNA要素、配列モチーフ、またはその任意の個々の配列、断片、もしくはセグメントなどを指す。
開始コドン:本明細書で使用されるとき、「開始コドン(start codon)」という用語と互換的に使用される「開始コドン(initiation codon)」という用語は、リボソームによって翻訳され、連結したアデニン-ウラシル-グアニン核酸塩基のトリプレットから構成される、オープンリーディングフレームの最初のコドンを指す。開始コドンは、アデニン(A)、ウラシル(U)、及びグアニン(G)の最初の文字コードによって記述され、多くの場合、単純に「AUG」と記載される。天然mRNAは、本明細書において「代替開始コドン」と称されるAUG以外のコドンを開始コドンに使用することもあるが、本明細書に記載のポリヌクレオチドの開始コドンは、AUGコドンを使用する。翻訳開始のプロセス中に、開始コドンを含む配列は、リボソームが結合する開始tRNA(Met-tRNAi
Met)のアンチコドンとの相補的な塩基対合を介して認識される。オープンリーディングフレームは、2つ以上のAUG開始コドンを含有してもよく、これは、本明細書において「代替開始コドン」と称される。
開始コドンは、翻訳開始に重要な役割を果たす。開始コドンは、リボソームによって翻訳されるオープンリーディングフレームの最初のコドンである。典型的には、開始コドンは、AUGのヌクレオチドトリプレットを含むが、いくつかの場合、異なるヌクレオチドから構成される他のコドンで翻訳開始が生じることもある。真核生物における翻訳の開始は、多段階の生化学的プロセスであり、メッセンジャーRNA分子(mRNA)、40Sリボソームサブユニット、翻訳機構の他の構成要素(例えば、真核生物の開始因子;eIF)の間の多数のタンパク質-タンパク質、タンパク質-RNA、及びRNA-RNA相互作用を伴う。mRNA翻訳開始の現行モデルでは、開始前複合体(あるいは「43S開始前複合体」;「PIC」と略される)が、特定の翻訳促進ヌクレオチド環境(コザック配列)(Kozak(1989)J Cell Biol 108:229-241)内に存在する最初のAUGコドンに遭遇するまで5’~3’方向にヌクレオチドをスキャニングすることで、mRNA上の動員部位(典型的には、5’キャップ)から開始コドンまで移動すると仮定されている。PICによるスキャニングは、Met-tRNAi
Metの開始転移RNAのアンチコドンを含むヌクレオチドと、mRNAの開始コドンを含むヌクレオチドとの間の相補的な塩基対合で終了する。AUGコドンとMet-tRNAi
Metアンチコドンとの間の生産的な塩基対合により、一連の構造的及び生化学的イベントが誘発され、最終的に60Sリボソーム大サブユニットのPICへの結合が生じ、翻訳伸長を行う活性リボソームが形成される。
コザック配列:「コザック配列」(「コザックコンセンサス配列」とも称される)という用語は、遺伝子またはオープンリーディングフレームの発現を強める翻訳開始エンハンサー要素を指し、真核生物では5’UTR内に位置する。コザックコンセンサス配列は、当初、プレプロインスリン遺伝子の翻訳に対する、開始コドン(AUG)を囲む単一変異の作用を解析した結果、配列GCCRCC(配列中、R=プリン)と定義された(Kozak(1986)Cell 44:283-292)。本明細書に開示のポリヌクレオチドは、コザックコンセンサス配列、またはその誘導体もしくは修飾を含む。(翻訳エンハンサー組成物及びその使用方法の例は、全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第5,807,707号(Andrews et al.);全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第5,723,332号(Chernajovsky);全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第5,891,665号(Wilson)を参照のこと。)
スキャニング漏れ:「スキャニング漏れ」として知られる現象は、PICが開始コドンを読み飛ばし、代わりに下流へのスキャニングを代わりの開始コドンまたは代替開始コドンを認識するまで継続することによって生じ得る。その発生頻度によっては、PICによる開始コドンの読み飛ばしにより、翻訳効率が低下することがある。さらに、この下流のAUGコドンからの翻訳が生じ得、それにより、所望の治療応答を誘発することができない可能性のある望ましくない異常な翻訳産物が生成される。いくつかの場合では、異常な翻訳産物は、事実、有害な応答を引き起こすこともある(Kracht et al.,(2017)Nat Med 23(4):501-507)。
修飾された:本明細書で使用されるとき、「修飾された」または「修飾」は、ポリヌクレオチド(例えば、mRNA)の組成または構造が変化した状態またはその変化を指す。ポリヌクレオチドは、化学的、構造的、及び/または機能的を含む、さまざまな様式で修飾され得る。例えば、ポリヌクレオチドは、1つまたは複数のRNA要素を組む混むことによって、構造的に修飾され得る。ここで、このRNA要素は、1つまたは複数の機能(例えば、翻訳制御活性)を提供する配列及び/またはRNA二次構造(複数可)を含む。したがって、本開示のポリヌクレオチドは、1つまたは複数の修飾から構成され得る(例えば、1つまたは複数の化学的、構造的、または機能的修飾(これらの任意の組み合わせを含む)を含み得る)。
核酸塩基:本明細書で使用されるとき、「核酸塩基」(あるいは「ヌクレオチド塩基」または「窒素塩基」)という用語は、核酸中に認められるプリンまたはピリミジン複素環式化合物を指し、核酸またはその部分もしくはセグメントに改善された特性(例えば、結合親和性、ヌクレアーゼ耐性、化学安定性)を付与する天然プリン及び天然ピリミジンのあらゆる誘導体または類似体を含む。アデニン、シトシン、グアニン、チミン、及びウラシルが天然核酸中に主に認められる核酸塩基である。当該技術分野において知られている及び/または本明細書に記載の他の天然、非天然及び/または合成核酸塩基が核酸に組み込まれてもよい。
ヌクレオシド/ヌクレオチド:本明細書で使用されるとき、「ヌクレオシド」という用語は、核酸塩基(例えば、プリンまたはピリミジン)、またはその誘導体もしくは類似体(本明細書では「核酸塩基」とも称される)に共有結合しているが、ヌクレオシド間連結基(例えば、リン酸基)を欠く、糖分子(例えば、RNAではリボースまたはDNAではデオキシリボース)、またはその誘導体もしくは類似体を含有する化合物を指す。本明細書で使用されるとき、「ヌクレオチド」という用語は、ヌクレオシド間連結基(例えば、リン酸基)に共有結合したヌクレオシド、または核酸もしくはその部分もしくはセグメントに改善された化学的及び/または機能的特性(例えば、結合親和性、ヌクレアーゼ耐性、化学安定性)を付与するそのあらゆる誘導体、類似体もしくは修飾体を指す。
核酸:本明細書で使用されるとき、「核酸」という用語は、その最も広い意味で使用され、ヌクレオチドのポリマー、またはその誘導体もしくは類似体を含む任意の化合物及び/または物質を包含する。こうしたポリマーは、多くの場合、「ポリヌクレオチド」と称される。したがって、本明細書で使用されるとき、「核酸」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、同等であり、互換的に使用される。本開示の核酸またはポリヌクレオチドの例には、リボ核酸(RNA)、デオキシリボ核酸(DNA)、DNA-RNAハイブリッド、RNAi誘導剤、RNAi剤、siRNA、shRNA、mRNA、修飾mRNA、miRNA、アンチセンスRNA、リボザイム、触媒DNA、三重らせん形成を誘導するRNA、トレオース核酸(TNA)、グリコール核酸(GNA)、ペプチド核酸(PNA)、ロックド核酸(β-D-リボ配置を有するLNA、α-L-リボ配置を有するα-LNA(LNAのジアステレオマー)を含むLNA、2’-アミノ官能化された2’-アミノ-LNA、及び2’-アミノ官能化された2’-アミノ-α-LNA)またはそのハイブリッドが挙げられるが、これらに限定されない。
核酸構造:本明細書で使用されるとき、「核酸構造」(「ポリヌクレオチド構造」と互換可能に使用される)という用語は、核酸(例えば、mRNA)に含まれる、原子、化学成分、要素、モチーフ、及び/または連結ヌクレオチドまたはその誘導体もしくは類似体の配列の配置または編成を指す。この用語は、核酸の二次元または三次元の状態も指す。したがって、「RNA構造」という用語は、RNA分子(例えば、mRNA)に含まれる、原子、化学成分、要素、モチーフ、及び/または連結ヌクレオチドまたはその誘導体もしくは類似体の配列の配置または編成を指し、及び/またはRNA分子の二次元及び/または三次元の状態を指す。核酸構造は、編成上の複雑さの増大に基づいて、本明細書で「分子構造」、「一次構造」、「二次構造」、及び「三次構造」と称される4つの編成分類にさらに分類され得る。
オープンリーディングフレーム:本明細書で使用されるとき、「オープンリーディングフレーム」という用語は、「ORF」と略され、ポリペプチドをコードするmRNA分子のセグメントまたは領域を指す。ORFは、開始コドンから始まり、終止コドンで終わる、重複しないインフレームのコドンの連続ストレッチを含み、リボソームによって翻訳される。
開始前複合体(PIC):本明細書で使用されるとき、「開始前複合体」(あるいは「43S開始前複合体」;「PIC」と略される)という用語は、40Sリボソームサブユニット、真核生物の開始因子(eIF1、eIF1A、eIF3、eIF5)、及びeIF2-GTP-Met-tRNAi
Metの3つから構成される複合体を含み、mRNA分子の5’キャップに本質的に結合し、結合後に、5’UTRのリボソームスキャニングを実施することができる、リボ核タンパク質複合体を指す。
RNA要素:本明細書で使用されるとき、「RNA要素」という用語は、生物学的機能を与え、及び/または生物学的活性(例えば、翻訳制御活性)を有する、RNA分子の部分、断片、またはセグメントを指す。本明細書に記載のものなどの1つまたは複数のRNA要素を組み込むことによるポリヌクレオチドの修飾は、修飾ポリヌクレオチドに1つまたは複数の所望の機能的特性を提供する。本明細書に記載のRNA要素は、天然のもの、非天然のもの、合成のもの、操作されたもの、またはこれらの任意の組み合わせであってよい。例えば、制御活性を提供する天然RNA要素には、ウイルス、原核生物及び真核生物(例えば、ヒト)のトランスクリプトーム全体に認められる要素が含まれる。RNA要素、特に真核生物のmRNA及び翻訳されたウイルスRNAは、細胞内で多くの機能の媒介に関与することが示されている。天然RNA要素の例には、翻訳開始要素(例えば、配列内リボソーム進入部位(IRES)、Kieft et al.,(2001)RNA 7(2):194-206を参照のこと)、翻訳エンハンサー要素(例えば、APP mRNA翻訳エンハンサー要素、Rogers et al.,(1999)J Biol Chem 274(10):6421-6431を参照のこと)、mRNA安定性要素(例えば、AUリッチ要素(ARE)、Garneau et al.,(2007)Nat Rev Mol Cell Biol 8(2):113-126を参照のこと)、翻訳抑制要素(例えば、Blumer et al.,(2002)Mech Dev 110(1-2):97-112を参照のこと)、タンパク質結合RNA要素(例えば、鉄応答性要素、Selezneva et al.,(2013)J Mol Biol 425(18):3301-3310を参照のこと)、細胞質ポリアデニル化要素(Villalba et al.,(2011)Curr Opin Genet Dev 21(4):452-457)、及び触媒RNA要素(例えば、リボザイム、Scott et al.,(2009)Biochim Biophys Acta 1789(9-10):634-641を参照のこと)が挙げられるが、これらに限定されない。
滞留時間:本明細書で使用されるとき、「滞留時間」という用語は、開始前複合体(PIC)またはリボソームによるmRNA分子に沿った別々の位置または場所の占有時間を指す。
翻訳制御活性:本明細書で使用されるとき、「翻訳制御活性」(「翻訳制御機能」と互換的に使用される)という用語は、PIC及び/またはリボソームの活性を含む、翻訳装置の活性を調節する(例えば、制御する、影響を与える、調整する、変化をもたらす)生物学的な機能、機序、またはプロセスを指す。いくつかの態様では、所望の翻訳制御活性は、mRNA翻訳の翻訳忠実度を上昇及び/または向上させる。いくつかの態様では、所望の翻訳制御活性は、スキャニング漏れを減少及び/または抑制する。
ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含むポリヌクレオチドの翻訳は、さまざまなシス作用性核酸構造によってもたらされるさまざまな機序によって調整及び制御され得る。例えば、ヘアピンまたは他の高次(例えば、シュードノット)分子内mRNA二次構造を形成する天然シス作用性RNA要素は、ポリヌクレオチドに翻訳制御活性を提供することができ、ここで、特にRNA要素が5’-キャップ構造に近い5’UTRに位置する場合、RNA要素は、ポリヌクレオチドの翻訳開始に影響するか、またはこれを調節する(Pelletier and Sonenberg(1985)Cell 40(3):515-526;Kozak(1986)Proc Natl Acad Sci 83:2850-2854)。シス作用性RNA要素はまた、翻訳伸長に影響し得、多数のフレームシフトイベントに関与する(Namy et al.,(2004)Mol Cell 13(2):157-168)。配列内リボソーム進入部位(IRES)は、別のタイプのシス作用性RNA要素であり、典型的には、5’UTR内に位置するが、天然mRNAのコーディング領域内に認められることも報告されている(Holcik et al.(2000)Trends Genet 16(10):469-473)。細胞mRNAでは、IRESは、多くの場合、5’-キャップ構造とともに存在し、キャップ依存性翻訳が損なわれた条件下で翻訳される、機能的能力をmRNAに提供する(Gebauer et al.,(2012)Cold Spring Harb Perspect Biol 4(7):a012245)。別のタイプの天然シス作用性RNA要素には、上流オープンリーディングフレーム(uORF)が含まれる。天然uORFは、多数のmRNAの5’UTR内に単独または複数で存在し、主要な下流ORFの翻訳に対して、通常は負の影響を与える(酵母のGCN4 mRNA及び哺乳類のATF4 mRNAの顕著な例外を除く。ここで、uORFは、eIF2リン酸化が増加した条件下で、主要な下流ORFの翻訳を促進する働きをする(Hinnebusch(2005)Annu Rev Microbiol 59:407-450))。ポリヌクレオチド(例えば、mRNA)に含まれる構成成分、構造、要素、モチーフ、及び/または特定配列によって提供されるさらなる翻訳制御活性の例には、mRNAの安定化または不安定化(Baker & Parker(2004)Curr Opin Cell Biol 16(3):293-299)、翻訳活性化(Villalba et al.,(2011)Curr Opin Genet Dev 21(4):452-457)、及び翻訳抑制(Blumer et al.,(2002)Mech Dev 110(1-2):97-112)が挙げられるが、これらに限定されない。研究により、天然シス作用性RNA要素は、当該要素を使用して、組み込みにより異種ポリヌクレオチドを修飾する場合、それぞれの機能を付与することができることが示されている(Goldberg-Cohen et al.,(2002)J Biol Chem 277(16):13635-13640)。
機能性RNA要素を含む修飾ポリヌクレオチド
本開示は、修飾(例えば、RNA要素)を含む合成ポリヌクレオチドを提供し、ここで、修飾は、所望の翻訳制御活性を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、5’非翻訳領域(UTR)、開始コドン、ポリペプチドをコードする完全なオープンリーディングフレーム、3’UTR、及び少なくとも1つの修飾を含むポリヌクレオチドであって、少なくとも1つの修飾は、所望の翻訳制御活性を提供し、例えば、mRNA翻訳の翻訳忠実度を上昇及び/または向上させる修飾である、ポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、所望の翻訳制御活性は、シス作用性制御活性である。いくつかの実施形態では、所望の翻訳制御活性は、開始コドンまたは開示コドン近傍における、43S開始前複合体(PIC)またはリボソームの滞留時間の増加である。いくつかの実施形態では、所望の翻訳制御活性は、開始コドンでの、または開始コドンからのポリペプチド合成の開始の増加である。いくつかの実施形態では、所望の翻訳制御活性は、完全なオープンリーディングフレームから翻訳されるポリペプチドの量の増加である。いくつかの実施形態では、所望の翻訳制御活性は、PICまたはリボソームによる開始コドン解読の忠実度の向上である。いくつかの実施形態では、所望の翻訳制御活性は、PICまたはリボソームによるスキャニング漏れの抑制または減少である。いくつかの実施形態では、所望の翻訳制御活性は、PICまたはリボソームによる開始コドン解読速度の低下である。いくつかの実施形態では、所望の翻訳制御活性は、mRNA内の開始コドン以外の任意のコドンでのポリペプチド合成の開始の阻害または低減である。いくつかの実施形態では、所望の翻訳制御活性は、mRNA内の完全なオープンリーディングフレーム以外の任意のオープンリーディングフレームから翻訳されるポリペプチドの量の阻害または低減である。いくつかの実施形態では、所望の翻訳制御活性は、異常な翻訳産物の生産の阻害または低減である。いくつかの実施形態では、所望の翻訳制御活性は、前述の翻訳制御活性のうちの1つまたは複数の組み合わせである。
本開示は、修飾(例えば、RNA要素)を含む合成ポリヌクレオチドを提供し、ここで、修飾は、所望の翻訳制御活性を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、5’非翻訳領域(UTR)、開始コドン、ポリペプチドをコードする完全なオープンリーディングフレーム、3’UTR、及び少なくとも1つの修飾を含むポリヌクレオチドであって、少なくとも1つの修飾は、所望の翻訳制御活性を提供し、例えば、mRNA翻訳の翻訳忠実度を上昇及び/または向上させる修飾である、ポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、所望の翻訳制御活性は、シス作用性制御活性である。いくつかの実施形態では、所望の翻訳制御活性は、開始コドンまたは開示コドン近傍における、43S開始前複合体(PIC)またはリボソームの滞留時間の増加である。いくつかの実施形態では、所望の翻訳制御活性は、開始コドンでの、または開始コドンからのポリペプチド合成の開始の増加である。いくつかの実施形態では、所望の翻訳制御活性は、完全なオープンリーディングフレームから翻訳されるポリペプチドの量の増加である。いくつかの実施形態では、所望の翻訳制御活性は、PICまたはリボソームによる開始コドン解読の忠実度の向上である。いくつかの実施形態では、所望の翻訳制御活性は、PICまたはリボソームによるスキャニング漏れの抑制または減少である。いくつかの実施形態では、所望の翻訳制御活性は、PICまたはリボソームによる開始コドン解読速度の低下である。いくつかの実施形態では、所望の翻訳制御活性は、mRNA内の開始コドン以外の任意のコドンでのポリペプチド合成の開始の阻害または低減である。いくつかの実施形態では、所望の翻訳制御活性は、mRNA内の完全なオープンリーディングフレーム以外の任意のオープンリーディングフレームから翻訳されるポリペプチドの量の阻害または低減である。いくつかの実施形態では、所望の翻訳制御活性は、異常な翻訳産物の生産の阻害または低減である。いくつかの実施形態では、所望の翻訳制御活性は、前述の翻訳制御活性のうちの1つまたは複数の組み合わせである。
したがって、本開示は、本明細書に記載の所望の翻訳制御活性を提供する配列及び/またはRNA二次構造(複数可)を含むRNA要素を含む、ポリヌクレオチド、例えば、mRNAを提供する。いくつかの態様では、mRNAは、mRNA翻訳の翻訳忠実度を上昇及び/または向上させる配列及び/またはRNA二次構造(複数可)を含む、RNA要素を含む。いくつかの態様では、mRNAは、スキャニング漏れの抑制及び/または減少などの所望の翻訳制御活性を提供する配列及び/またはRNA二次構造(複数可)を含む、RNA要素を含む。いくつかの態様では、本開示は、スキャニング漏れを抑制し、及び/または減少させ、それにより、mRNAの翻訳忠実度を上昇させる配列及び/またはRNA二次構造(複数可)を含むRNA要素を含む、mRNAを提供する。
いくつかの実施形態では、RNA要素は、天然ヌクレオチド及び/または修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、RNA要素は、本明細書に記載の所望の翻訳制御活性を提供する連結ヌクレオチド、またはその誘導体もしくは類似体の配列から構成される。いくつかの実施形態では、RNA要素は、安定なRNA二次構造を形成するか、または安定なRNA二次構造に折りたたまれる、連結ヌクレオチド、またはその誘導体もしくは類似体の配列を含み、ここで、RNA二次構造は、本明細書に記載の所望の翻訳制御活性を提供する。RNA要素は、当該要素の一次配列(例えば、GCリッチ要素)に基づいて、当該要素によって形成されるRNA二次構造(例えば、ステムループ)、当該要素のRNA分子内の位置(例えば、mRNAの5’UTR内に位置する)、当該要素の生物学的機能及び/または活性(例えば、「翻訳エンハンサー要素」)、ならびにこれらの任意の組み合わせによって、同定及び/または特徴付けされ得る。
いくつかの態様では、本開示は、スキャニング漏れを抑制し、及び/またはmRNA翻訳の翻訳忠実度を向上させる1つまたは複数の構造的修飾を有するmRNAであって、構造的修飾のうちの少なくとも1つは、GCリッチRNA要素である、mRNAを提供する。いくつかの態様では、本開示は、少なくとも1つの修飾を含む修飾mRNAであって、少なくとも1つの修飾は、mRNAの5’UTR中のコザックコンセンサス配列に先行する、連結ヌクレオチド、またはその誘導体もしくは類似体の配列を含むGCリッチRNA要素である、修飾mRNAを提供する。1つの実施形態では、GCリッチRNA要素は、mRNAの5’UTR中のコザックコンセンサス配列の約30、約25、約20、約15、約10、約5、約4、約3、約2、または約1ヌクレオチド上流に位置する。別の実施形態では、GCリッチRNA要素は、コザックコンセンサス配列の15~30、15~20、15~25、10~15、または5~10ヌクレオチド上流に位置する。別の実施形態では、GCリッチRNA要素は、mRNAの5’UTR中のコザックコンセンサス配列のすぐ隣に位置する。
前述の態様または関連する態様のいずれかにおいて、本開示は、任意の順序で連結された3~30、5~25、10~20、15~20、約20、約15、約12、約10、約7、約6もしくは約3ヌクレオチド、その誘導体または類似体の配列を含む、GCリッチRNA要素であって、配列組成が、70~80%シトシン、60~70%シトシン、50%~60%シトシン、40~50%シトシン、30~40%シトシン塩基である、GCリッチRNA要素を提供する。前述の態様または関連する態様のいずれかにおいて、本開示は、任意の順序で連結された3~30、5~25、10~20、15~20、約20、約15、約12、約10、約7、約6もしくは約3ヌクレオチド、その誘導体または類似体の配列を含む、GCリッチRNA要素であって、配列組成が、約80%シトシン、約70%シトシン、約60%シトシン、約50%シトシン、約40%シトシン、または約30%シトシンである、GCリッチRNA要素を提供する。
前述の態様または関連する態様のいずれかにおいて、本開示は、任意の順序で連結された20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、もしくは3ヌクレオチド、またはその誘導体もしくは類似体の配列を含む、GCリッチRNA要素であって、配列組成が、70~80%シトシン、60~70%シトシン、50%~60%シトシン、40~50%シトシン、または30~40%シトシンである、GCリッチRNA要素を提供する。前述の態様または関連する態様のいずれかにおいて、本開示は、任意の順序で連結された20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、もしくは3ヌクレオチド、またはその誘導体もしくは類似体の配列を含む、GCリッチRNA要素であって、配列組成が、約80%シトシン、約70%シトシン、約60%シトシン、約50%シトシン、約40%シトシン、または約30%シトシンである、GCリッチRNA要素を提供する。
いくつかの態様では、本開示は、少なくとも1つの修飾を含む修飾mRNAであって、少なくとも1つの修飾は、mRNAの5’UTR中のコザックコンセンサス配列に先行する、連結ヌクレオチド、またはその誘導体もしくは類似体の配列を含むGCリッチRNA要素であり、GCリッチRNA要素は、mRNAの5’UTR中のコザックコンセンサス配列の約30、約25、約20、約15、約10、約5、約4、約3、約2、または約1ヌクレオチド上流に位置し、GCリッチRNA要素は、任意の順序で連結された3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、もしくは20ヌクレオチド、またはその誘導体もしくは類似体の配列を含み、配列組成は、>50%シトシンである、修飾mRNAを提供する。いくつかの実施形態では、配列組成は、>55%シトシン、>60%シトシン、>65%シトシン、>70%シトシン、>75%シトシン、>80%シトシン、>85%シトシン、または>90%シトシンである。
他の態様では、本開示は、少なくとも1つの修飾を含む修飾mRNAであって、少なくとも1つの修飾は、mRNAの5’UTR中のコザックコンセンサス配列に先行する、連結ヌクレオチド、またはその誘導体もしくは類似体の配列を含むGCリッチRNA要素であり、GCリッチRNA要素は、mRNAの5’UTR中のコザックコンセンサス配列の約30、約25、約20、約15、約10、約5、約4、約3、約2、または約1ヌクレオチド上流に位置し、GCリッチRNA要素は、約3~30、5~25、10~20、15~20または約20、約15、約12、約10、約6もしくは約3ヌクレオチド、またはその誘導体もしくは類似体の配列を含み、配列は、反復GCモチーフを含み、反復GCモチーフは、[CCG]n(配列中、n=1~10、n=2~8、n=3~6、またはn=4~5)である、修飾mRNAを提供する。いくつかの実施形態では、配列は、反復GCモチーフ[CCG]n(配列中、n=1、2、3、4または5)を含む。いくつかの実施形態では、配列は、反復GCモチーフ[CCG]n(配列中、n=1、2、または3)を含む。いくつかの実施形態では、配列は、反復GCモチーフ[CCG]n(配列中、n=1)を含む。いくつかの実施形態では、配列は、反復GCモチーフ[CCG]n(配列中、n=2)を含む。いくつかの実施形態では、配列は、反復GCモチーフ[CCG]n(配列中、n=3)を含む。いくつかの実施形態では、配列は、反復GCモチーフ[CCG]n(配列中、n=4)(配列番号308)を含む。いくつかの実施形態では、配列は、反復GCモチーフ[CCG]n(配列中、n=5)(配列番号309)を含む。
別の態様では、本開示は、少なくとも1つの修飾を含む修飾mRNAであって、少なくとも1つの修飾は、mRNAの5’UTR中のコザックコンセンサス配列に先行する、連結ヌクレオチド、またはその誘導体もしくは類似体の配列を含むGCリッチRNA要素であり、GCリッチRNA要素は、表2に記載の配列のいずれか1つを含む、修飾mRNAを提供する。1つの実施形態では、GCリッチRNA要素は、mRNAの5’UTR中のコザックコンセンサス配列の約30、約25、約20、約15、約10、約5、約4、約3、約2、または約1ヌクレオチド上流に位置する。別の実施形態では、GCリッチRNA要素は、コザックコンセンサス配列の約15~30、15~20、15~25、10~15、または5~10ヌクレオチド上流に位置する。別の実施形態では、GCリッチRNA要素は、mRNAの5’UTR中のコザックコンセンサス配列のすぐ隣に位置する。
他の態様では、本開示は、少なくとも1つの修飾を含む修飾mRNAであって、少なくとも1つの修飾は、mRNAの5’UTR中のコザックコンセンサス配列に先行する、表2に記載の配列V1[CCCCGGCGCC](配列番号310)、またはその誘導体もしくは類似体を含むGCリッチRNA要素である、修飾mRNAを提供する。いくつかの実施形態では、GCリッチ要素は、表2に記載の配列V1を含み、mRNAの5’UTR中のコザックコンセンサス配列の上流のすぐ隣に位置する。いくつかの実施形態では、GCリッチ要素は、表2に記載の配列V1を含み、mRNAの5’UTR中のコザックコンセンサス配列の1、2、3、4、5、6、7、8、9または10塩基上流に位置する。他の実施形態では、GCリッチ要素は、表2に記載の配列V1を含み、mRNAの5’UTR中のコザックコンセンサス配列の1~3、3~5、5~7、7~9、9~12、または12~15塩基上流に位置する。
他の態様では、本開示は、少なくとも1つの修飾を含む修飾mRNAであって、少なくとも1つの修飾は、mRNAの5’UTR中のコザックコンセンサス配列に先行する、表2に記載の配列V2[CCCCGGC]、またはその誘導体もしくは類似体を含むGCリッチRNA要素である、修飾mRNAを提供する。いくつかの実施形態では、GCリッチ要素は、表2に記載の配列V2を含み、mRNAの5’UTR中のコザックコンセンサス配列の上流のすぐ隣に位置する。いくつかの実施形態では、GCリッチ要素は、表2に記載の配列V2を含み、mRNAの5’UTR中のコザックコンセンサス配列の1、2、3、4、5、6、7、8、9または10塩基上流に位置する。他の実施形態では、GCリッチ要素は、表2に記載の配列V2を含み、mRNAの5’UTR中のコザックコンセンサス配列の1~3、3~5、5~7、7~9、9~12、または12~15塩基上流に位置する。
他の態様では、本開示は、少なくとも1つの修飾を含む修飾mRNAであって、少なくとも1つの修飾は、mRNAの5’UTR中のコザックコンセンサス配列に先行する、表2に記載の配列EK[GCCGCC]、またはその誘導体もしくは類似体を含むGCリッチRNA要素である、修飾mRNAを提供する。いくつかの実施形態では、GCリッチ要素は、表2に記載の配列EKを含み、mRNAの5’UTR中のコザックコンセンサス配列の上流のすぐ隣に位置する。いくつかの実施形態では、GCリッチ要素は、表2に記載の配列EKを含み、mRNAの5’UTR中のコザックコンセンサス配列の1、2、3、4、5、6、7、8、9または10塩基上流に位置する。他の実施形態では、GCリッチ要素は、表2に記載の配列EKを含み、mRNAの5’UTR中のコザックコンセンサス配列の1~3、3~5、5~7、7~9、9~12、または12~15塩基上流に位置する。
さらなる他の態様では、本開示は、少なくとも1つの修飾を含む修飾mRNAであって、少なくとも1つの修飾は、mRNAの5’UTR中のコザックコンセンサス配列に先行する、表2に記載の配列V1[CCCCGGCGCC](配列番号310)、またはその誘導体もしくは類似体を含むGCリッチRNA要素であり、5’UTRは、表2に記載の次の配列:
GGGAAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGA(配列番号311)を含む、修飾mRNAを提供する。
GGGAAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGA(配列番号311)を含む、修飾mRNAを提供する。
いくつかの実施形態では、GCリッチ要素は、表2に記載の配列V1を含み、表2に示す5’UTR配列中のコザックコンセンサス配列の上流のすぐ隣に位置する。いくつかの実施形態では、GCリッチ要素は、表2に記載の配列V1を含み、mRNAの5’UTR中のコザックコンセンサス配列の1、2、3、4、5、6、7、8、9または10塩基上流に位置し、5’UTRは、表2に記載の次の配列:
GGGAAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGA(配列番号312)を含む。
GGGAAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGA(配列番号312)を含む。
他の実施形態では、GCリッチ要素は、表1に記載の配列V1を含み、mRNAの5’UTR中のコザックコンセンサス配列の1~3、3~5、5~7、7~9、9~12、または12~15塩基上流に位置し、5’UTRは、表2に記載の次の配列:
GGGAAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGA(配列番号312)を含む。
GGGAAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGA(配列番号312)を含む。
いくつかの実施形態では、5’UTRは、表2に記載の次の配列:
GGGAAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGACCCCGGCGCCGCCACC(配列番号313)を含む。
GGGAAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGACCCCGGCGCCGCCACC(配列番号313)を含む。
別の態様では、本開示は、少なくとも1つの修飾を含む修飾mRNAであって、少なくとも1つの修飾は、ヘアピンまたはステムループを形成する順序で連結したヌクレオチド、またはその誘導体もしくは類似体の配列を含む安定なRNA二次構造を含む、GCリッチRNA要素である、修飾mRNAを提供する。1つの実施形態では、安定したRNA二次構造は、コザックコンセンサス配列の上流にある。別の実施形態では、安定したRNA二次構造は、コザックコンセンサス配列の約30、約25、約20、約15、約10、または約5ヌクレオチド上流に位置する。別の実施形態では、安定したRNA二次構造は、コザックコンセンサス配列の約20、約15、約10または約5ヌクレオチド上流に位置する。別の実施形態では、安定したRNA二次構造は、コザックコンセンサス配列の約5、約4、約3、約2、約1ヌクレオチド上流に位置する。別の実施形態では、安定したRNA二次構造は、コザックコンセンサス配列の約15~30、約15~20、約15~25、約10~15、または約5~10ヌクレオチド上流に位置する。別の実施形態では、安定したRNA二次構造は、コザックコンセンサス配列の12~15ヌクレオチド上流に位置する。別の実施形態では、安定したRNA二次構造は、約-30kcal/mol、約-20~-30kcal/mol、約-20kcal/mol、約-10~-20kcal/mol、約-10kcal/mol、約-5~-10kcal/molのΔGを有する。
別の実施形態では、修飾は、ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームに作動可能に連結され、ここで、修飾及びオープンリーディングフレームは、異種である。
別の実施形態では、GCリッチRNA要素の配列は、排他的に、グアニン(G)及びシトシン(C)核酸塩基から構成される。
本明細書に記載の所望の翻訳制御活性を提供するRNA要素は、リボソームプロファイリングなどの既知の技術を使用して、同定及び特徴付けを行うことができる。リボソームプロファイリングは、PIC及び/またはリボソームがmRNAに結合する位置を決定することができる技術である(例えば、Ingolia et al.,(2009)Science 324(5924):218-23を参照のこと;当該文献は、参照によって本明細書に組み込まれる)。この技術は、PIC及び/またはリボソームによって、mRNAの領域またはセグメントがヌクレアーゼ消化から保護されることに基づく。保護することで、「フットプリント」と呼ばれる30bpのRNA断片が生成される。RNAフットプリントの配列及び頻度を当該技術分野において知られている方法(例えば、RNAシークエンシング)によって解析することができる。フットプリントは、リボソームのA部位のほぼ中央にある。PICまたはリボソームがmRNAに沿った特定の位置または場所に留まる場合、これらの位置で生成されるフットプリントは、比較的よく生じるものである。研究では、PIC及び/またはリボソームの処理能力が低くなる位置では、より多くのフットプリントが生成され、PIC及び/またはリボソームの処理能力が上がる位置では、フットプリントが少なくなることが示された(Gardin et al.,(2014)eLife 3:e03735)。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のRNA要素のうちのいずれか1つまたは複数を含むポリヌクレオチドに沿った別々の位置または場所におけるPICまたはリボソームの滞留時間または占有時間は、リボソームプロファイリングによって決定される。
治療方法
ヒト及び他の哺乳類における癌の予防及び/または治療を目的とする組成物(例えば、医薬組成物)、方法、キット、及び試薬が本明細書で提供される。癌RNAワクチンは、治療剤または予防剤として使用することができる。癌RNAワクチンは、癌を予防及び/または治療するための医療において使用してよい。例示の態様では、本開示の癌RNAワクチンは、癌からの予防的保護を与えるために使用される。癌からの予防的保護は、本開示の癌RNAワクチンの投与後に達成することができる。ワクチンは、1回、2回、3回、4回、またはそれより多い回数投与することができるが、1回のワクチン投与(続いて任意選択でブースターの単回投与)で十分である可能性を有している。治療応答を達成するために、癌を有する個体にワクチンを投与することがより望ましい。投薬は、状況に応じて調節する必要があり得る。
ヒト及び他の哺乳類における癌の予防及び/または治療を目的とする組成物(例えば、医薬組成物)、方法、キット、及び試薬が本明細書で提供される。癌RNAワクチンは、治療剤または予防剤として使用することができる。癌RNAワクチンは、癌を予防及び/または治療するための医療において使用してよい。例示の態様では、本開示の癌RNAワクチンは、癌からの予防的保護を与えるために使用される。癌からの予防的保護は、本開示の癌RNAワクチンの投与後に達成することができる。ワクチンは、1回、2回、3回、4回、またはそれより多い回数投与することができるが、1回のワクチン投与(続いて任意選択でブースターの単回投与)で十分である可能性を有している。治療応答を達成するために、癌を有する個体にワクチンを投与することがより望ましい。投薬は、状況に応じて調節する必要があり得る。
mRNAワクチンが合成されると、患者に投与される。いくつかの実施形態では、ワクチンは、最大2ヶ月、最大3ヶ月、最大4ヶ月、最大5ヶ月、最大6ヶ月、最大7ヶ月、最大8ヶ月、最大9ヶ月、最大10ヶ月、最大11ヶ月、最大1年、最大1年半、最大2年、最大3年、または最大4年のスケジュールで投与される。スケジュールは、同一であるか、または変更され得る。いくつかの実施形態では、スケジュールは、最初の3ヶ月は1週間に1回であり、その後は1ヶ月に1回となる。ワクチンは、任意の経路によって投与してよい。いくつかの実施形態では、ワクチンは、筋肉内または静脈内の経路によって投与される。
ワクチンは、任意の経路によって投与してよい。いくつかの実施形態では、ワクチンは、筋肉内または静脈内の経路によって投与される。
ワクチンにおける変異が依然として適切であるかどうかを決定するために、治療の任意の時点で患者を調べてよい。その分析に基づいてワクチンを調節または再形成することで、1つもしくは複数の異なる変異を含めるか、または1つもしくは複数の変異を除去してよい。
治療組成物及び予防組成物
例えば、ヒトまたは哺乳類における癌の予防、治療、または診断を目的とする組成物(例えば、医薬組成物)、方法、キット、及び試薬が本明細書で提供される。癌RNAワクチンは、治療剤または予防剤として使用することができる。癌RNAワクチンは、癌を予防及び/または治療するための医療において使用してよい。いくつかの実施形態では、本発明の癌ワクチンは、例えば、末梢血単核球(PBMC)をエクスビボで活性化するための、免疫エフェクター細胞のプライミングにおける使用を想定することができ、当該末梢血単核球(PBMC)は、その後、対象へと注入(再注入)される。
例えば、ヒトまたは哺乳類における癌の予防、治療、または診断を目的とする組成物(例えば、医薬組成物)、方法、キット、及び試薬が本明細書で提供される。癌RNAワクチンは、治療剤または予防剤として使用することができる。癌RNAワクチンは、癌を予防及び/または治療するための医療において使用してよい。いくつかの実施形態では、本発明の癌ワクチンは、例えば、末梢血単核球(PBMC)をエクスビボで活性化するための、免疫エフェクター細胞のプライミングにおける使用を想定することができ、当該末梢血単核球(PBMC)は、その後、対象へと注入(再注入)される。
例示の実施形態では、本明細書に記載のRNAポリヌクレオチドを含む癌ワクチンは、対象(例えば、ヒト対象などの哺乳類対象)に投与することができ、RNAポリヌクレオチドは、インビボで翻訳されることで抗原ポリペプチドを生成する。
癌RNAワクチンは、細胞、組織、または生物においてポリペプチド(例えば、抗原または免疫原)の翻訳を誘導し得る。例示の実施形態では、そのような翻訳はインビボで生じるが、そのような翻訳がエクスビボ、培養物中、またはインビトロで生じる実施形態を想定することができる。例示の実施形態では、細胞、組織、または生物は、抗原ポリペプチドをコードする少なくとも1つの翻訳可能領域を有するポリヌクレオチドを含む癌RNAワクチンを含む有効量の組成物と接触する。
「有効量」の癌RNAワクチンは、ポリヌクレオチドの標的組織、標的細胞型、投与手段、物理的特徴(例えば、ヌクレオシドのサイズ及び修飾度)、ならびに癌RNAワクチンの他の成分、ならびに他の決定要素に少なくとも部分的に基づいて提供される。一般に、有効量の癌RNAワクチン組成物は、細胞における抗原産生に応じて免疫応答を誘導または強化し、こうした抗原産生は、好ましくは、同一の抗原またはペプチド抗原をコードする対応する非修飾ポリヌクレオチドを含む組成物と比較してより効率的である。抗原産生の増加は、細胞トランスフェクション(RNAワクチンが細胞にトランスフェクトされる割合)の増加、ポリヌクレオチドからのタンパク質の翻訳の増加、核酸分解の減少(例えば、修飾ポリヌクレオチドからのタンパク質の翻訳持続期間の増加によって示される)、または宿主細胞の抗原特異的免疫応答の変化によって示され得る。
いくつかの実施形態では、本開示によるRNAワクチン(ポリヌクレオチド及びそれがコードするポリペプチドを含む)は、癌の治療に使用してよい。
癌RNAワクチンは、健康な個体または早期癌もしくは症状発症後の活性期の癌を有する個体に対する活性免疫化スケジュールの一部として予防的または治療的に投与してよい。いくつかの実施形態では、本開示のRNAワクチンが細胞、組織、または対象に提供される量は、免疫予防に有効な量であり得る。
癌RNAワクチンは、他の予防化合物または治療化合物と共に投与してよい。非限定的な例として、予防化合物または治療化合物は、免疫増強剤、アジュバントまたはブースターであり得る。ワクチンなどの組成物を指すとき、本明細書で使用される「ブースター」という用語は、予防(ワクチン)組成物の追加投与を指す。ブースター(またはブースターワクチン)は、予防組成物が先に投与された後に与えてよい。予防組成物の初回投与とブースターとの投与時間間隔は、限定はされないが、1分、2分、3分、4分、5分、6分、7分、8分、9分、10分、15分、20分、35分、40分、45分、50分、55分、1時間、2時間、3時間、4時間、5時間、6時間、7時間、8時間、9時間、10時間、11時間、12時間、13時間、14時間、15時間、16時間、17時間、18時間、19時間、20時間、21時間、22時間、23時間、1日、36時間、2日、3日、4日、5日、6日、1週間、10日、2週間、3週間、1ヶ月、2ヶ月、3ヶ月、4ヶ月、5ヶ月、6ヶ月、7ヶ月、8ヶ月、9ヶ月、10ヶ月、11ヶ月、1年、18ヶ月、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年、11年、12年、13年、14年、15年、16年、17年、18年、19年、20年、25年、30年、35年、40年、45年、50年、55年、60年、65年、70年、75年、80年、85年、90年、95年、または99年超であり得る。例示の実施形態では、予防組成物の初回投与とブースターとの投与時間間隔は、限定はされないが、1週間、2週間、3週間、1ヶ月、2ヶ月、3ヶ月、6ヶ月、または1年であり得る。
1つの実施形態では、ポリヌクレオチドは、当該技術分野において知られるワクチンの投与と同様に筋肉内または皮内に投与してよい。
mRNA癌ワクチンは、癌の重症度またはアンメットメディカルニーズの程度もしくはレベルに応じてさまざまな状況において利用してよい。非限定例として、mRNA癌ワクチンは、任意のステージの癌の治療に利用してよい。mRNA癌ワクチンは、市販の抗癌ワクチンと比較して、生成抗体価がはるかに高く、T細胞応答を生成し、応答生成が早いという点において優れた特性を有する。理論に束縛されるものではないが、mRNA癌ワクチンは天然の細胞機構を取り入れているため、mRNAであるmRNA癌ワクチンは、翻訳時に適切なタンパク質の立体構造を生成するように良好に設計されると発明者らは仮定する。エクスビボで製造され、望ましくない細胞応答を誘発する可能性のある従来型ワクチンとは異なり、mRNA癌ワクチンは、より自然な方法で細胞系に提示される。
mRNA癌ワクチンが治療し得る癌のリストが以下に示されるが、そのリストに限定はされない。ペプチドエピトープまたは抗原は、こうした癌または腫瘍の任意の抗原に由来し得る。そのようなエピトープは、癌抗原または腫瘍抗原と称される。癌細胞は、腫瘍進行の異なるフェーズの間に細胞表面分子を異なって発現し得る。例えば、癌細胞は、良性状態では細胞表面抗原を発現し得るが、転位時にその特定の細胞表面抗原を下方制御し得る。したがって、腫瘍抗原または癌抗原は、癌の進行の任意のステージの間に産生する抗原を包含し得ると想定される。本発明の方法は、こうした変化に適合するように調整してよい。例えば、特定の患者向けに異なるmRNAワクチンをいくつか生成してよい。例えば、治療の開始時点で最初のワクチンを使用してよい。その後のある時点で、新たなmRNAワクチンを生成し、患者に投与することで、発現中の異なる抗原を網羅してよい。
いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、下記の抗原のうちの1つである:CD2、CD19、CD20、CD22、CD27、CD33、CD37、CD38、CD40、CD44、CD47、CD52、CD56、CD70、CD79、CD137、4-IBB、5T4、AGS-5、AGS-16、アンジオポエチン2、B7.1、B7.2、B7DC、B7H1、B7H2、B7H3、BT-062、BTLA、CAIX、癌胎児抗原、CTLA4、クリプト(Cripto)、ED-B、ErbBl、ErbB2、ErbB3、ErbB4、EGFL7、EpCAM、EphA2、EphA3、EphB2、FAP、フィブロネクチン、葉酸受容体、ガングリオシドGM3、GD2、グルココルチコイド誘導性腫瘍壊死因子受容体(GITR)、gplOO、gpA33、GPNMB、ICOS、IGF1R、インテグリンav、インテグリンανβ、LAG-3、ルイスY、メソテリン、c-MET、MN炭酸脱水酵素IX、MUC1、MUC16、ネクチン-4、NKGD2、NOTCH、OX40、OX40L、PD-1、PDL1、PSCA、PSMA、RANKL、ROR1、ROR2、SLC44A4、シンデカン-1、TACI、TAG-72、テネイシン、TIM3、TRAILRl、TRAILR2、VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、及びそれらの変異体。
癌または腫瘍には、限定はされないが、新生物、悪性腫瘍、転移癌、または無制御の細胞増殖によって特徴付けられ、結果的に癌性であると想定される任意の疾患もしくは障害が含まれる。癌は、原発性または転移性の癌であり得る。本発明に従って治療することができる特定の癌には、限定はされないが、下記のものが含まれる(そのような障害の概説については、Fishman et al.,1985,Medicine,2d Ed.,J.B.Lippincott Co.,Philadelphiaを参照のこと)。癌には、限定はされないが、胆道癌、膀胱癌、神経膠芽腫及び髄芽腫を含む脳癌、乳癌、子宮頸癌、絨毛癌、結腸癌、子宮内膜癌、食道癌、胃癌、急性リンパ性白血病及び急性骨髄性白血病を含む血液新生物、多発性骨髄腫、AIDS関連白血病及び成人T細胞白血病リンパ腫、ボーエン病及びパジェット病を含む上皮内新生物、肝癌、肺癌、ホジキン病及びリンパ球性リンパ腫を含むリンパ腫、神経芽細胞腫、扁平上皮癌を含む口腔癌、上皮細胞、間質細胞、生殖細胞、及び間葉系細胞から生じるものを含む卵巣癌、膵癌、前立腺癌、直腸癌、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫、線維肉腫、及び骨肉腫を含む肉腫、メラノーマ、カポジ肉腫、基底細胞癌、及び扁平上皮癌を含む皮膚癌、セミノーマ、非セミノーマ、奇形腫、絨毛癌などの胚腫瘍を含む精巣癌、間質性腫瘍及び生殖細胞腫瘍、甲状腺の腺癌及び髄様癌を含む甲状腺癌、ならびに腺癌及びウィルムス腫瘍を含む腎癌が含まれる。一般に経験する癌には、乳癌、前立腺癌、肺癌、卵巣癌、結腸直腸癌、及び脳癌が含まれる。
いくつかの実施形態では、癌は、非小細胞肺癌(NSCLC)、小細胞肺癌、メラノーマ、膀胱尿路上皮癌、HPV陰性頭頸部扁平上皮癌(HNSCC)、及び高頻度マイクロサテライト(MSI H)/ミスマッチ修復(MMR)欠損である固形悪性腫瘍からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、NSCLCは、EGFR感受性変異及び/またはALK転座がない。いくつかの実施形態では、高頻度マイクロサテライト(MSI H)/ミスマッチ修復(MMR)欠損である固形悪性腫瘍は、結腸直腸癌、胃腺癌、食道腺癌、及び子宮内膜癌からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、癌は、膵臓、腹膜、大腸、小腸、胆道、肺、子宮内膜、卵巣、生殖管、胃腸管、子宮頸部、胃、尿路、結腸、直腸、ならびに造血系及びリンパ系組織の癌から選択される。いくつかの実施形態では、癌は、結腸直腸癌である。
癌RNAワクチン及びRNAワクチン組成物及び/または複合物を、1つもしくは複数の薬学的に許容される賦形剤と任意選択で組み合わせて含む医薬組成物が本明細書で提供される。
癌RNAワクチンは、単独で製剤化もしくは投与するか、または1つもしくは複数の他の成分と組み合わせて製剤化もしくは投与してよい。例えば、癌RNAワクチン(ワクチン組成物)は、限定するものではないが、免疫増強剤(例えば、アジュバント)を含む他の成分を含み得る。いくつかの実施形態では、癌RNAワクチンは、免疫増強剤またはアジュバントを含まない(すなわち、免疫増強剤不含またはアジュバント不含である)。
他の実施形態では、本明細書に記載のmRNA癌ワクチンは、患者の治療に有用な任意の他の治療と組み合わせてよい。例えば、患者は、mRNA癌ワクチン及び抗癌剤で治療してよい。したがって、1つの実施形態では、本発明の方法は、1つまたは複数の癌治療と組み合わせて使用することができ、例えば、抗癌剤、従来型癌ワクチン、化学療法、放射線療法などと(例えば、同時に、または全治療手順の一部として)組み合わせて使用することができる。変動し得る癌治療のパラメーターには、限定はされないが、用量、投与タイミング、または期間もしくは治療が含まれ、癌治療は、用量、タイミング、または期間で変わり得る。癌の別の治療は手術であり、手術は、単独または前述の治療方法のいずれかと組み合わせて利用することができる。有用であることが知られているか、または癌の予防もしくは治療に使用されたことがあるか、もしくは現在使用されている任意の薬剤または治療(例えば、従来型癌ワクチン、化学療法、放射線療法、手術、ホルモン療法及び/または生物学的治療/免疫療法)を本発明の組成物と共に、本明細書に記載の発明に従って組み合わせて使用することができる。医療分野の当業者であれば、対象に適した治療を決定することができる。
そのような薬剤(すなわち、抗癌剤)の例には、限定はされないが、DNA相互作用性の薬剤(限定はされないが、アルキル化剤(例えば、ナイトロジェンマスタード(例えば、クロラムブシル、シクロホスファミド、イソファミド(Isofamide)、メクロレタミン、メルファラン、ウラシルマスタード);チオテパなどのアジリジン;ブスルファンなどのメタンスルホン酸エステル;カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシンなどのニトロソウレア;シスプラチン、カルボプラチンなどの白金錯体;マイトマイシン、及びプロカルバジン、ダカルバジン及びアルトレタミンなどの生体内還元性アルキル化剤);例えばブレオマイシンなどのDNA鎖切断剤;例えばアムサクリン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、イダルビシン、ミトキサントロンなどのインターカレーターなどの挿入性のトポイソメラーゼII阻害剤、ならびにエトポシド及びテニポシドなどの非インターカレーター;例えばエトポシド及びテニポシド(Teniposde)などの非挿入性のトポイソメラーゼII阻害剤;ならびに例えばプリカマイジン(Plicamydin)などのDNA副溝結合剤を含む);代謝拮抗剤(限定はされないが、メトトレキサート及びトリメトレキサートなどの葉酸アンタゴニスト;フルオロウラシル、フルオロデオキシウリジン、CB3717、アザシチジン、及びフロクスウリジンなどのピリミジンアンタゴニスト;メルカプトプリン、6-チオグアニン、ペントスタチンなどのプリンアンタゴニスト;シタラビン及びフルダラビンなどの糖修飾類似体;ならびにヒドロキシウレアなどのリボヌクレオチド還元酵素阻害剤を含む);チューブリン相互作用性の薬剤(限定はされないが、コルビチン(colcbicine)、ビンクリスチン及びビンブラスチン、両方のアルカロイド、ならびにパクリタキセル及びシトキサン(cytoxan)を含む);ホルモン剤(限定はされないが、エストロゲン、複合化エストロゲン及びエチニルエストラジオール及びジエチルスチルベステロール(Diethylstilbesterol)、クロロトリアニセン(Chlortrianisen)及びイデンエストロール(Idenestrol);カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、メドロキシプロゲステロン、及びメゲストロールなどのプロゲスチン;ならびにテストステロン、プロピオン酸テストステロンなどのアンドロゲン;フルオキシメステロン、メチルテストステロン;例えば、プレドニゾン、デキサメタゾン、メチルプレドニゾロン、及びプレドニゾロンなどの副腎皮質ステロイド;例えば、酢酸ロイプロリド及び酢酸ゴセレリンなどの黄体化ホルモン放出ホルモン剤または性腺刺激ホルモン放出ホルモンアンタゴニストを含む);抗ホルモン抗原(antihormonal antigen)(限定はされないが、タモキシフェンなどの抗エストロゲン剤、フルタミドなどの抗アンドロゲン剤;ならびにミトタン及びアミノグルテチミドなどの抗副腎剤を含む);サイトカイン(限定はされないが、IL-1.アルファ.、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-18、TGF-β、GM-CSF、M-CSF、G-CSF、TNF-α、TNF-β、LAF、TCGF、BCGF、TRF、BAF、BDG、MP、LIF、OSM、TMF、PDGF、IFN-α、IFN-β、IFN-.γ、及びウテログロビン(米国特許第5,696、092号)を含む);抗血管新生剤(限定はされないが、VEGFを阻害する薬剤(例えば、他の中和抗体)、可溶性受容体構築物、チロシンキナーゼ阻害剤、アンチセンス戦略、VEGFまたはVEGF受容体に対するRNAアプタマー及びリボザイム、免疫毒素及びコアグリガンド(coaguligand)、腫瘍ワクチン、ならびに抗体を含む)が含まれる。
本発明の方法に従って使用することができる抗癌剤の特定の例には、限定はされないが、アシビシン、アクラルビシン、アコダゾール塩酸塩、アクロニン、アドゼレシン、アルデスロイキン、アルトレタミン、アンボマイシン、酢酸アメタントロン、アミノグルテチミド、アムサクリン、アナストロゾール、アントラマイシン、アスパラギナーゼ、アスペルリン、アザシチジン、アゼテパ、アゾトマイシン、バチマスタット、ベンゾデパ、ビカルタミド、ビサントレン塩酸塩、メシル酸ビスナフィド、ビセレシン、ブレオマイシン硫酸塩、ブレキナルナトリウム、ブロピリミン、ブスルファン、カクチノマイシン、カルステロン、カラセミド、カルベチマー、カルボプラチン、カルムスチン、カルビシン塩酸塩、カルゼレシン、セデフィンゴール、クロラムブシル、シロレマイシン、シスプラチン、クラドリビン、メシル酸クリスナトール、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン塩酸塩、デシタビン、デキソルマプラチン、デザグアニン、メシル酸デザグアニン、ジアジコン、ドセタキセル、ドキソルビシン、ドキソルビシン塩酸塩、ドロロキシフェン、ドロロキシフェンクエン酸塩、プロピオン酸ドロモスタノロン、デュアゾマイシン、エダトレキサート、エフロミチン塩酸塩(eflomithine hydrochloride)、エルサミトルシン、エンロプラチン、エンプロマート、エピプロピジン、エピルビシン塩酸塩、エルブロゾール、エソルビシン塩酸塩、エストラムスチン、エストラムスチンホスフェートナトリウム、エタニダゾール、エトポシド、エトポシドホスフェート、エトプリン、ファドロゾール塩酸塩、ファザラビン、フェンレチニド、フロクスウリジン、フルダラビンホスフェート、フルオロウラシル、フルロシタビン、ホスキドン、ホストリエシンナトリウム、ゲムシタビン、ゲムシタビン塩酸塩、ヒドロキシウレア、イダルビシン塩酸塩、イホスファミド、イルモホシン、インターロイキンII(組換えインターイエキン(interieukin)IIまたはrIL2を含む)、インターフェロンアルファ-2a、インターフェロンアルファ-2b、インターフェロンアルファ-n1、インターフェロンアルファ-n3、インターフェロンベータ-Ia、インターフェロンガンマ-Ib、イプロプラチン、イリノテカン塩酸塩、酢酸ランレオチド、レトロゾール、酢酸リュープロリド、リアロゾール塩酸塩、ロメトレキソールナトリウム、ロムスチン、ロソキサントロン塩酸塩、マソプロコール、マイタンシン、メクロレタミン塩酸塩、酢酸メゲストロール、酢酸メレンゲストロール、メルファラン、メノガリル、メルカプトプリン、メトトレキサート、メトトレキサートナトリウム、メトプリン、メツレデパ、ミチンドミド、ミトカルシン、ミトクロミン、ミトギリン、ミトマルシン、マイトマイシン、ミトスペル、ミトタン、ミトキサントロン塩酸塩、ミコフェノール酸、ノコダゾール、ノガラマイシン、オルマプラチン、オキシスラン、パクリタキセル、ペグアスパルガーゼ、ペリオマイシン、ペンタムスチン、硫酸ペプロマイシン、ペルホスファミド、ピポブロマン、ピポスルファン、ピロキサントロン塩酸塩、プリカマイシン、プロメスタン、ポルフィマーナトリウム、ポルフィロマイシン、プレドニムスチン、プロカルバジン塩酸塩、ピューロマイシン、ピューロマイシン塩酸塩、ピラゾフリン、リボプリン、ログレチミド、サフィンゴール、サフィンゴール塩酸塩、セムスチン、シムトラゼン、スパルフォセートナトリウム、スパルソマイシン、スピロゲルマニウム塩酸塩、スピロムスチン、スピロプラチン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、スロフェヌル、タリソマイシン、テコガランナトリウム、テガフール、テロキサントロン塩酸塩、テモポルフィン、テニポシド、テロキシロン、テストラクトン、チアミプリン、チオグアニン、チオテパ、チアゾフリン、チラパザミン、クエン酸トレミフェン、酢酸トレストロン、リン酸トリシリビン、トリメトレキサート、グルクロン酸トリメトレキサート、トリプトレリン、ツブロゾール塩酸塩、ウラシルマスタード、ウレデパ、バプレオチド、ベルテポルフィン、硫酸ビンブラスチン、硫酸ビンクリスチン、ビンデシン、硫酸ビンデシン、硫酸ビネピジン、硫酸ビングリシナート、硫酸ビンロイロシン、ビノレルビン酒石酸塩、硫酸ビンロシジン、硫酸ビンゾリジン、ボロゾール、ゼニプラチン、ジノスタチン、及びゾルビシン塩酸塩が含まれる。
他の抗癌剤には、限定はされないが、20-エピ-1,25ジヒドロキシビタミンD3、5-エチニルウラシル、血管新生阻害剤、抗背側化形態形成タンパク質―1(anti-dorsalizing morphogenetic protein-1)、アラ-CDP-DL-PTBA、BCR/ABLアンタゴニスト、CaRestM3、CARN700、カゼインキナーゼ阻害剤(ICOS)、クロトリマゾール、コリスマイシンA、コリスマイシンB、コンブレタスタチンA4、クランベシジン816、クリプトフィシン8、クラシンA、デヒドロジデムニンB、ジデムニンB、ジヒドロ-5-アザシチジン、ジヒドロタキソール,デュオカルマイシンSA、カハラリドF、ラメラリン-Nトリアセテート、リュープロリド+エストロゲン+プロゲステロン、リッソクリナミド7、モノホスホリルリピドA+マイオバクテリウム(myobacterium)細胞壁sk、N-アセチルジナリン、N-置換ベンズアミド、O6-ベンジルグアニン、プラセチンA、プラセチンB、白金錯体、白金化合物、白金-トリアミン複合体、レニウムRe186エチドロネート、RIIレチンアミド、ルビギノンB1、SarCNU、サルコフィトールA、サルグラモスチム、老化由来阻害剤1(senescence derived inhibitor1)、スピカマイシンD、タリムスチン、5-フルオロウラシル、トロンボポエチン、チモトリナン、甲状腺刺激ホルモン、バリオリンB、サリドマイド、ベラレソール、ベラミン(veramine)、ベルジン(verdin)、ベルテポルフィン、ビノレルビン、ビンキサルチン(vinxaltine)、ビタキシン(vitaxin)、ザノテロン、ゼニプラチン、及びジラスコルブが含まれる。
本発明は、癌細胞を破壊するためのX線、ガンマ線、及び他の線源の使用を含む放射線療法と組み合わせた、mRNA癌ワクチンを含む組成物の投与も包含する。好ましい実施形態では、放射線治療は、外照射または遠隔療法として実施され、放射線は、遠隔の線源から向けられる。他の好ましい実施形態では、放射線治療は、内療法または密封小線源療法として実施され、放射能源は、癌細胞または腫瘤に近接して体内に設置される。
特定の実施形態では、癌の型に応じて適切な抗原レジメンが選択される。例えば、卵巣癌を有する患者には、卵巣癌治療に有用な1つまたは複数の他の薬剤を予防的または治療的に有効な量で組み合わせて、mRNA癌ワクチンを含む予防的または治療的に有効な量の組成物を投与してよく、卵巣癌治療に有用なこうした他の薬剤には、限定はされないが、P32療法などの腹腔内放射線療法、複部及び骨盤全体の放射線療法、シスプラチン、パクリタキセル(タキソール)もしくはドセタキセル(タキソテール)とシスプラチンもしくはカルボプラチンとの組み合わせ、シクロホスファミドとシスプラチンとの組み合わせ、シクロホスファミドとカルボプラチンとの組み合わせ、5-FUとロイコボリンとの組み合わせ、エトポシド、リポソームドキソルビシン、ゲムシタビン、またはトポテカンが含まれる。癌治療及びその用量、投与経路、ならびに推奨用法は、当該技術分野において知られており、Physician’s Desk Reference(56th ed.,2002)などの文献に記載されている。
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、mRNA癌ワクチンは、免疫チェックポイント調節因子などのT細胞活性化因子と共に投与される。免疫チェックポイント調節因子には、刺激性チェックポイント分子と阻害性チェックポイント分子(すなわち、抗CTLA4抗体及び抗PD1抗体)との両方が含まれる。
刺激性チェックポイント阻害剤は、チェックポイントプロセスを促進することによって機能する。いくつかの刺激性チェックポイント分子は、腫瘍壊死因子(TNF)受容体スーパーファミリーのメンバー(CD27、CD40、OX40、GITR、及びCD137)であり、他のものは、B7-CD28スーパーファミリーに属する(CD28及びICOS)。OX40(CD134)は、エフェクターT細胞及びメモリーT細胞の増殖に関与する。抗OX40モノクローナル抗体は、進行癌の治療に有効であることが示されている。MEDI0562は、ヒト化OX40アゴニストである。GITRは、グルココルチコイド誘導性TNFRファミリー関連遺伝子であり、T細胞の増殖に関与する。GITRに対するいくつかの抗体は、抗癌応答を促進することが示されている。ICOSは、誘導性のT細胞共刺激因子であり、T細胞のエフェクター機能において重要である。CD27は、ナイーブT細胞の抗原特定的な増殖を支持し、T細胞及びB細胞のメモリー生成に関与する。アゴニストである抗CD27抗体がいくつか開発中である。CD122は、インターロイキン-2受容体ベータサブユニットである。NKTR-214は、CD122偏向結合性免疫賦活性サイトカインである。
阻害性チェックポイント分子には、限定はされないが、PD-1、TIM-3、VISTA、A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、CTLA-4、IDO、KIR、及びLAG3が含まれる。CTLA-4、PD-1、及びそのリガンドは、T細胞機能及び他の細胞機能のすべての段階を通して重要な役割を担う共刺激分子のCD28-B7ファミリーのメンバーである。CTLA-4は、細胞傷害性Tリンパ球関連タンパク質4(CD152)であり、T細胞の増殖制御に関与する。
PD-1受容体は、活性化したT細胞(及びB細胞)の表面に発現し、通常の状況下では、樹状細胞またはマクロファージなどの抗原提示細胞の表面に発現するそのリガンド(PD-L1及びPD-L2)に結合する。この相互作用は、T細胞にシグナルを送り込み、T細胞を阻害する。癌細胞は、その表面に高レベルのPD-L1発現を誘導することによって、このシステムを悪用する。これによって、癌細胞によるPD-1経路の支配が可能になり、腫瘍微小環境に侵入し得るPD-1発現T細胞のスイッチが切れることによって抗癌免疫応答が抑制される。ペンブロリズマブ(以前の名称はMK-3475及びランブロリズマブであり、商品名はKeytrudaである)は、癌免疫療法において使用されるヒト抗体である。この抗体は、PD-1受容体を標的とする。
IDO(インドールアミン-2,3-ジオキシゲナーゼ)は、T細胞及びNK細胞を抑制するトリプトファン分解酵素であり、Treg及び骨髄系由来サプレッサー細胞を生成及び活性化すると共に、腫瘍の血管新生を促進する。TIM-3(T細胞免疫グロブリンドメイン及びムチンドメイン3)は、そのリガンドであるガレクチン-9と相互作用すると細胞死を引き起こすことによってTh1/Tc1機能の負の制御因子として働く。VISTAは、T細胞活性化のV-ドメインIgサプレッサーである。
チェックポイント阻害剤は、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、融合タンパク質もしくはそれらの組み合わせ、または小分子などの分子である。例えば、チェックポイント阻害剤は、チェックポイントタンパク質を阻害するものであり、こうしたチェックポイントタンパク質は、CTLA-4、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR、2B4、CD160、CGEN-15049、CHK1、CHK2、A2aR、B-7ファミリーのリガンド、またはそれらの組み合わせであり得る。チェックポイントタンパク質のリガンドには、限定はされないが、CTLA-4、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR、2B4、CD160、CGEN-15049、CHK1、CHK2、A2aR、及びB-7ファミリーのリガンドが含まれる。いくつかの実施形態では、抗PD-1抗体は、BMS-936558(ニボルマブ)である。他の実施形態では、抗CTLA-4抗体は、イピリムマブ(商品名はYervoyであり、以前はMDX-010及びMDX-101として知られる)である。
いくつかの好ましい実施形態では、チェックポイント調節因子を含む癌治療剤は、例えば、抗PD1、サイトカイン、ケモカイン、または刺激性受容体/リガンド(例えば、OX40)などの癌治療剤をコードするmRNAの形態で送達される。
いくつかの実施形態では、癌治療剤は、標的治療である。標的治療は、ベムラフェニブ(PLX4032)またはダブラフェニブなどのBRAF阻害剤であり得る。BRAF阻害剤は、PLX4032、PLX4720、PLX4734、GDC-0879、PLX4032、PLX-4720、PLX4734、及びトシル酸ソラフェニブであり得る。BRAFは、B-Rafと呼ばれるタンパク質をつくるヒト遺伝子であり、癌原遺伝子B-Raf及びv-Rafマウス肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログB1とも称される。B-Rafタンパク質は、細胞増殖の誘導に関与する細胞内でのシグナル送達に関与する。ベムラフェニブは、BRAF阻害剤であり、後期のメラノーマの治療を対象としてFDAによって認可された。
他の実施形態では、T細胞治療剤は、OX40Lである。OX40は、腫瘍壊死因子/神経成長因子受容体(TNFR/NGFR)ファミリーのメンバーである。OX40は、T細胞活性化ならびに正常及び悪性のリンパ球系細胞の分化、増殖、またはアポトーシスの制御において一定の役割を担い得る。
一態様では、本発明の方法は、PD-1アンタゴニストを対象に投与することをさらに含む。いくつかの態様では、PD-1アンタゴニストは、PD-1に特異的に結合する抗体またはその抗原結合部分である。具体的な態様では、PD-1アンタゴニストは、モノクローナル抗体である。いくつかの態様では、PD-1アンタゴニストは、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、ピジリズマブ、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
別の態様では、本発明の方法は、PDL-1アンタゴニストを対象に投与することをさらに含む。いくつかの態様では、PD-L1アンタゴニストは、PD-L1に特異的に結合する抗体またはその抗原結合部分である。具体的な態様では、PD-L1アンタゴニストは、モノクローナル抗体である。いくつかの態様では、PD-L1アンタゴニストは、デュルバルマブ、アベルマブ、MEDI473、BMS-936559、アテゾリズマブ、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
別の態様では、本発明の方法は、CTLA-4アンタゴニストを対象に投与することをさらに含む。いくつかの態様では、CTLA-4アンタゴニストは、CTLA-4に特異的に結合する抗体またはその抗原結合部分である。具体的な態様では、CTLA-4アンタゴニストは、モノクローナル抗体である。いくつかの態様では、CTLA-4アンタゴニストは、イピリムマブ、トレメリムマブ、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
本発明のある特定の実施形態は、癌の治療を必要とする対象の癌の治療方法であって、ポリヌクレオチド、特に、KRASワクチンペプチドをコードするmRNAを、1つまたは複数の抗癌剤とともに対象に投与することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の抗癌剤は、1つまたは複数のチェックポイント阻害剤抗体である。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の抗癌剤は、1つまたは複数のチェックポイント阻害剤抗体をコードするmRNAである。
一態様では、対象は、本開示のポリヌクレオチドの前に、PD-1アンタゴニストで先に治療されている。別の態様では、対象は、本開示のポリヌクレオチドの前に、PD-1に結合するモノクローナル抗体で治療されている。別の態様では、対象は、本方法のポリヌクレオチドの前に、抗PD-1モノクローナル抗体療法で治療されている。他の態様では、抗PD-1モノクローナル抗体療法は、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、ピジリズマブ、またはこれらの任意の組み合わせを含む。
別の態様では、対象は、本開示のポリヌクレオチドの前に、PDL-1に結合するモノクローナル抗体で治療されている。別の態様では、対象は、本方法のポリヌクレオチドの前に、抗PDL-1モノクローナル抗体療法で治療されている。他の態様では、抗PDL-1モノクローナル抗体療法は、デュルバルマブ、アベルマブ、MEDI473、BMS-936559、アテゾリズマブ、またはこれらの任意の組み合わせを含む。
いくつかの態様では、対象は、本開示のポリヌクレオチドの前に、CTLA-4アンタゴニストで治療されている。別の態様では、対象は、本開示のポリヌクレオチドの前に、CTLA-4に結合するモノクローナル抗体で先に治療されている。別の態様では、対象は、本発明のポリヌクレオチドの前に、抗CTLA-4モノクローナル抗体で治療されている。他の態様では、抗CTLA-4抗体療法は、イピリムマブまたはトレメリムマブを含む。
1つの実施形態では、本開示に有用な抗PD-1抗体(またはその抗原結合部分)は、ペンブロリズマブである。ペンブロリズマブ(「KEYTRUDA(登録商標)」、ランブロリズマブ、及びMK-3475としても知られる)は、ヒト細胞表面受容体PD-1(プログラム死1またはプログラム細胞死1)に対するヒト化モノクローナルIgG4抗体である。ペンブロリズマブは、例えば、米国特許第8,900,587号に記載されており、http://www.cancer.gov/drugdictionary?cdrid=695789(最終アクセス:2014年12月14日)も参照のこと。ペンブロリズマブは、再発または難治性メラノーマ及び進行性NSCLCの治療に対し、FDAの承認を受けている。
別の実施形態では、本開示に有用な抗PD-1抗体は、ニボルマブである。ニボルマブ(「OPDIVO(登録商標)」としても知られ、以前の名称は5C4、BMS-936558、MDX-1106、またはONO-4538である)は、PD-1リガンド(PD-L1及びPD-L2)との相互作用を選択的に阻害することにより、抗腫瘍T細胞機能の下方制御を妨げる、完全ヒトIgG4(S228P)PD-1免疫チェックポイント阻害剤抗体である(米国特許第8,008,449号;Wang et al.,2014 Cancer Immunol Res.2(9):846-56)。ニボルマブは、腎細胞癌(腎腺癌、または副腎腫)、メラノーマ、及び非小細胞肺癌(NSCLC)を含む、さまざまな進行性固形腫瘍に活性を示している(Topalian et al.,2012a;Topalian et al.,2014;Drake et al.,2013;WO 2013/173223。
他の実施形態では、抗PD-1抗体は、PD-1受容体に対するモノクローナル抗体であるMEDI0680(以前の名称はAMP-514である)である。MEDI0680は、例えば、米国特許第8,609,089B2号またはhttp://www.cancer.gov/drugdictionary?cdrid=756047(2014年12月14日に最終アクセス)に記載されている。
ある特定の実施形態では、抗PD-1抗体は、ヒト化モノクローナル抗体であるBGB-A317である。BGB-A317は、米国特許公開第2015/0079109号に記載されている。
ある特定の実施形態では、PD-1アンタゴニストは、B7-DC Fc融合タンパク質であるAMP-224である。AMP-224は、米国特許公開第2013/0017199号またはhttp://www.cancer.gov/publications/dictionaries/cancer-drug?cdrid=700595(2015年7月8日に最終アクセス)に考察されている。
ある特定の実施形態では、本開示に有用な抗PD-L1抗体は、MSB0010718C(アベルマブとも呼ばれる;US2014/0341917を参照のこと)またはBMS-936559(以前の名称は12A4またはMDX-1105である)(例えば、米国特許第7,943,743号;WO2013/173223を参照のこと)である。他の実施形態では、抗PD-L1抗体は、MPDL3280A(RG7446としても知られる)(例えば、Herbst et al.(2013)J Clin Oncol 31(suppl):3000.Abstract;米国特許第8,217,149号を参照のこと)、MEDI4736(デュルバルマブとしても知られる;Khleif(2013)In:Proceedings from the European Cancer Congress 2013;September 27-October 1,2013;Amsterdam,The Netherlandsである。
臨床的な抗CTLA-4抗体の例は、米国特許第6,984,720号に開示されているヒトmAb 10D1(現在はイピリムマブとして知られ、YERVOY(登録商標)として上市されている)である。本方法に有用な別の抗CTLA-4抗体は、トレメリムマブ(CP-675,206としても知られる)である。トレメリムマブは、ヒトIgG2モノクローナル抗CTLA-4抗体である。トレメリムマブは、WO/2012/122444、米国特許公開第2012/263677号、または国際公開第WO2007/113648A2号に記載されている。
以下の表(表10)は、特定の腫瘍の種類、ならびに使用中及び試験中の治療法の種類におけるKRAS変異の例を提供する。本発明の組成物は、これらの治療法のいずれかとの組み合わせにおいて有用である。
他の実施形態では、癌治療剤は、サイトカインである。さらに他の実施形態では、癌治療剤は、集団ベースの腫瘍特異的抗原を含むワクチンである。
他の実施形態では、癌治療剤は、癌-生殖系列遺伝子が発現する1つまたは複数の従来型抗原(複数の患者に見られる腫瘍に共通する抗原であり、「共通癌抗原」とも称される)を含むワクチンである。いくつかの実施形態では、従来型抗原は、癌もしくは腫瘍に一般に見られることが知られるものであるか、または特定の型の癌もしくは腫瘍において見られることが知られるものである。いくつかの実施形態では、従来型癌抗原は、変異していない腫瘍抗原である。いくつかの実施形態では、従来型癌抗原は、変異した腫瘍抗原である。
p53遺伝子(正式記号TP53)は、ヒトの癌において他のどの遺伝子よりも高い頻度で変異する。p53に生じる変異のほとんどで、そのゲノム位置は1人または少数の患者のみに特有であるため、こうした変異は、特定の患者集団向けに設計される治療ワクチンのための反復ネオ抗原として使用できないことが大規模コホート研究によって示された。しかしながら、p53遺伝子座の小サブセットは実に「ホットスポット」のパターンを示しており、そこでは、遺伝子のいくつかの位置が相対的に高い頻度で変異するのである。際だったことに、反復して変異するこうした領域の大部分が、エクソンとイントロンとの境界付近に存在し、mRNAのスプライシング機構によって認識される標準のヌクレオチド配列モチーフを破壊する。
スプライシングモチーフが変異すると、局所的なアミノ酸配列には変化が生じない(すなわち、同義変異またはイントロン変異)と予測されるとしても、最終的なmRNA配列には変化が生じ得る。それ故に、こうした変異によって予測不可能な様式でmRNAのスプライシングに変化が生じ得、翻訳されるタンパク質が著しい機能的影響を受け得るにもかかわらず、こうした変異は、一般的なアノテーションツールによって「ノンコーディング」として注解されてしまい、さらに解析されることなく無視されることが多い。代替的にスプライシングを受けたアイソフォームにインフレームの配列変化が生じる(すなわち、中途終始コドン(pretermination codon)(PTC)が生じない)のであれば、こうしたアイソフォームはナンセンス変異依存mRNA分解機構(NMD)による排除を免れることができ、速やかに発現し、プロセシングを受けてHLA系によって細胞表面に提示される。さらに、変異に由来する代替的なスプライシングは、通常、「潜在性」であって、すなわち、正常組織では発現しないものであり、それ故に、T細胞によって非自己のネオ抗原として認識され得る。
いくつかの実例では、癌治療剤は、癌治療剤は、反復多型(「ホットスポット変異」)であるネオ抗原を1つまたは複数含むワクチンである。例えば、数ある中でも特に、本発明は、p53におけるある特定の反復体細胞癌変異から得られるネオ抗原ペプチド配列を提供する。ネオ抗原ペプチド及びHLA拘束性エピトープが生じる変異及びmRNAのスプライシング事象の例には、限定はされないが、下記のものが含まれる:
(1)コドン位置T125に隣接する標準5’スプライス部位における変異であって、エピトープAVSPCISFVW(配列番号233)(HLA-B*57:01、HLA-B*58:01)、エピトープHPLASCQCFF(配列番号234)(HLA-B*35:01、HLA-B*53:01)、エピトープFVWNFGIPL(配列番号235)(HLA-A*02:01、HLA-A*02:06、HLA-B*35:01)を含むペプチド配列TAKSVTCTVSCPEGLASMRLQCLAVSPCISFVWNFGIPLHPLASCQCFFIVYPLNV(配列番号232)を有する保持型イントロンを誘導する変異;
(2)コドン位置331に隣接する標準5’スプライス部位における変異であって、エピトープLQVLSLGTSY(配列番号237)(HLA-B*15:01)、エピトープFQSNTQNAVF(配列番号238)(HLA-B*15:01)を含むペプチド配列EYFTLQVLSLGTSYQVESFQSNTQNAVFFLTVLPAIGAFAIRGQ(配列番号236)を有する保持型イントロンを誘導する変異;
(3)コドン位置126に隣接する標準3’スプライス部位における変異であって、エピトープCTMFCQLAK(配列番号240)(HLA-A*11:01)、エピトープKSVTCTMF(配列番号241)(HLA-B*58:01)を含む新規のスパニングペプチド配列AKSVTCTMFCQLAK(配列番号239)を生成する潜在性の代替エクソン3’スプライス部位を誘導する変異;及び/または
(4)コドン位置224に隣接する標準5’スプライス部位における変異であって、エピトープVPYEPPEVW(配列番号243)(HLA-B*53:01、HLA-B*51:01)、エピトープLTVPPSTAW(配列番号244)(HLA-B*58:01、HLA-B*57:01)を含む新規のスパニングペプチド配列VPYEPPEVWLALTVPPSTAWAA(配列番号242)を生成する潜在性の代替イントロン5’スプライス部位を誘導する変異
(転写コドン位置は、Ensemblのv83のヒトゲノムアノテーションに由来する標準の全長p53転写物であるENST00000269305(配列番号245)を参照したものである)。
(1)コドン位置T125に隣接する標準5’スプライス部位における変異であって、エピトープAVSPCISFVW(配列番号233)(HLA-B*57:01、HLA-B*58:01)、エピトープHPLASCQCFF(配列番号234)(HLA-B*35:01、HLA-B*53:01)、エピトープFVWNFGIPL(配列番号235)(HLA-A*02:01、HLA-A*02:06、HLA-B*35:01)を含むペプチド配列TAKSVTCTVSCPEGLASMRLQCLAVSPCISFVWNFGIPLHPLASCQCFFIVYPLNV(配列番号232)を有する保持型イントロンを誘導する変異;
(2)コドン位置331に隣接する標準5’スプライス部位における変異であって、エピトープLQVLSLGTSY(配列番号237)(HLA-B*15:01)、エピトープFQSNTQNAVF(配列番号238)(HLA-B*15:01)を含むペプチド配列EYFTLQVLSLGTSYQVESFQSNTQNAVFFLTVLPAIGAFAIRGQ(配列番号236)を有する保持型イントロンを誘導する変異;
(3)コドン位置126に隣接する標準3’スプライス部位における変異であって、エピトープCTMFCQLAK(配列番号240)(HLA-A*11:01)、エピトープKSVTCTMF(配列番号241)(HLA-B*58:01)を含む新規のスパニングペプチド配列AKSVTCTMFCQLAK(配列番号239)を生成する潜在性の代替エクソン3’スプライス部位を誘導する変異;及び/または
(4)コドン位置224に隣接する標準5’スプライス部位における変異であって、エピトープVPYEPPEVW(配列番号243)(HLA-B*53:01、HLA-B*51:01)、エピトープLTVPPSTAW(配列番号244)(HLA-B*58:01、HLA-B*57:01)を含む新規のスパニングペプチド配列VPYEPPEVWLALTVPPSTAWAA(配列番号242)を生成する潜在性の代替イントロン5’スプライス部位を誘導する変異
(転写コドン位置は、Ensemblのv83のヒトゲノムアノテーションに由来する標準の全長p53転写物であるENST00000269305(配列番号245)を参照したものである)。
1つの実施形態では、本発明は、ネオ抗原ペプチド(1)~(4)の1つまたは複数をコードするオープンリーディングフレーム(ORF)をコードするmRNAを含む癌治療ワクチンを提供する。1つの実施形態では、本発明は、患者の腫瘍が上記の変異のいずれを含むかということに基づく、ペプチド(1)~(4)の1つまたは複数を含むか、またはコードするワクチンの選択投与を提供する。1つの実施形態では、本発明は、対象の腫瘍が上記の変異のいずれを含むか、及び対象の正常なHLA型が、得られるネオ抗原に結合すると予測される対応HLA対立遺伝子を含むかという二重の判断基準に基づく、ワクチンの選択投与を提供する。
いくつかの実施形態では、癌治療ワクチンは、1つまたは複数の反復多型をコードする1つまたは複数のmRNAを含む。いくつかの実施形態では、癌治療ワクチンは、1つまたは複数の患者特異的ネオ抗原をコードする1つまたは複数のmRNAを含む。いくつかの実施形態では、癌治療ワクチンは、免疫チェックポイント調節因子をコードする1つまたは複数のmRNAを含む。1つもしくは複数の反復多型、1つもしくは複数の患者特異的ネオ抗原、及び/または1つもしくは複数の免疫チェックポイント調節因子は、任意の様式で組み合わせることができる。例えば、1つまたは複数のコンカテマー構築物が1つもしくは複数の反復多型、1つもしくは複数の患者特異的ネオ抗原、及び/または1つもしくは複数の免疫チェックポイント調節因子をコードすることが望ましくあり得る。他の実例では、1つもしくは複数の反復多型、1つもしくは複数の患者特異的ネオ抗原、及び/または1つもしくは複数の免疫チェックポイント調節因子は、別々のmRNA構築物によってコードされることが望ましくあり得る。1つもしくは複数の反復多型、1つもしくは複数の患者特異的ネオ抗原、及び/または1つもしくは複数の免疫チェックポイント調節因子は、同時に投与するか、または連続的に投与することができることを理解されたい。
mRNA癌ワクチン及び抗癌治療剤は、免疫治療応答をさらに増進するために組み合わせることができる。mRNA癌ワクチン及び他の治療剤は、同時または連続的に投与してよい。他の治療剤が同時に投与されるとき、それを同一の製剤または別々の製剤において投与することができるが、投与は同時に実施される。他の治療剤及びmRNA癌ワクチンの投与が時間的に別々であるとき、他の治療剤は、互いに連続的に投与され、かつmRNA癌ワクチンと連続的に投与される。こうした化合物の投与の時間間隔は、数分程度であり得るか、または例えば、数時間、数日、数週間、数ヶ月などの、より長い時間であり得る。例えば、いくつかの実施形態では、こうした化合物の投与の時間間隔は、1時間、2時間、3時間、4時間、5時間、6時間、8時間、12時間、24時間、またはそれより長い時間である。いくつかの実施形態では、こうした化合物の投与の時間間隔は、2日、3日、4日、5日、6日、または7日以上である。いくつかの実施形態では、mRNA癌ワクチンは、抗癌治療剤の前に投与される。いくつかの実施形態では、mRNA癌ワクチンは、抗癌治療剤の後に投与される。
他の治療剤には、限定はされないが、抗癌治療剤、アジュバント、サイトカイン、抗体、抗原などが含まれる。
いくつかの態様では、提供される方法は、mRNA癌ワクチンを、免疫チェックポイント調節因子と組み合わせて投与することを含む。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント調節因子、例えば、抗PD-1抗体などのチェックポイント阻害剤は、100~300mgを送達するために十分な用量レベルで対象に投与される。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント調節因子、例えば、抗PD-1抗体などのチェックポイント阻害剤は、200mgを送達するために十分な用量レベルで対象に投与される。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント調節因子、例えば、抗PD-1抗体などのチェックポイント阻害剤は、静脈内注入によって投与される。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント調節因子は、2回、3回、4回またはそれより多い回数で対象に投与される。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント調節因子は、mRNAワクチン投与と同じ日に対象に投与される。
RNAワクチンは、1つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤と組み合わせて製剤化または投与してよい。いくつかの実施形態では、ワクチン組成物は、例えば、治療的に活性な物質、予防的に活性な物質、または両方の組み合わせなどの追加の活性物質を少なくとも1つ含む。ワクチン組成物は、無菌、発熱物質非含有、または無菌かつ発熱物質非含有であり得る。ワクチン組成物などの医薬剤の製剤化及び/または製造における一般的な考慮事項は、例えば、Remington:The Science and Practice of Pharmacy 21st ed.,Lippincott Williams & Wilkins,2005(その全体が参照によって本明細書に組み込まれる)において見つけてよい。
いくつかの実施形態では、癌RNAワクチンは、ヒト、ヒト患者、または対象に投与される。本開示の目的では、「活性成分」という語句は、一般に、例えば、抗原ポリペプチドをコードするRNAポリヌクレオチド(例えば、mRNAポリヌクレオチド)などの、そこに含まれるRNAワクチンまたはポリヌクレオチドを指す。
本明細書に記載のワクチン組成物の製剤は、既に知られている任意の方法、または薬理学の分野において今後開発される任意の方法によって調製してよい。一般に、そのような調製方法は、活性成分(例えば、mRNAポリヌクレオチド)を賦形剤及び/または1つもしくは複数の他の付属成分と結びつける段階と、必要及び/または望ましいのであれば、その後に実施される、所望の単一用量単位または複数用量単位への製造物の分割段階、成形段階、及び/または充填段階と、を含む。
癌RNAワクチンは、下記のことを達成するために、1つまたは複数の賦形剤を使用して製剤化することができる:(1)安定性の向上、(2)細胞へのトランスフェクションの増加、(3)(例えば、デポ製剤からの)持続放出もしくは遅延放出の実現(4)生体内分布(例えば、特定の組織もしくは細胞型への標的指向化)の改変、(5)コードタンパク質のインビボでの翻訳の増加、及び/または(6)コードタンパク質(抗原)のインビボでの放出プロファイルの改変。任意及びすべての溶媒、分散媒体、希釈剤、または他の液体媒体、分散助剤または懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤または乳化剤、保存剤などの従来型賦形剤に加えて、賦形剤には、限定はされないが、リピドイド(lipidoid)、リポソーム、脂質ナノ粒子、ポリマー、リポプレックス、コアシェルナノ粒子、ペプチド、タンパク質、癌RNAワクチンをトランスフェクトした細胞(例えば、対象への移植向け)、ヒアルロニダーゼ、ナノ粒子模倣体、及びそれらの組み合わせが含まれ得る。
急速血中クリアランス
本発明は、反復投与される生物学的に活性な剤などの活性剤に対するABC作用を低下させるための化合物、組成物及びその使用方法を提供する。容易に明らかとなるように、投与される活性剤に対するABCの作用を全体的に低下させ、または排除することで、活性剤の半減期及び有効性が効果的に向上する。
本発明は、反復投与される生物学的に活性な剤などの活性剤に対するABC作用を低下させるための化合物、組成物及びその使用方法を提供する。容易に明らかとなるように、投与される活性剤に対するABCの作用を全体的に低下させ、または排除することで、活性剤の半減期及び有効性が効果的に向上する。
いくつかの実施形態では、ABCの低下という用語は、MC3 LNPなどの、陽性参照対照であるABC誘導LNPと比較したABCの任意の低下を指す。ABC誘導LNPは、所与の時間枠内での2回目またはそれ以後の投与時に、活性剤の循環レベルの低下をもたらす。したがって、ABCの低下は、剤の2回目またはそれ以後の投与時に、循環する剤のクリアランスが標準LNPに対して低いことを指す。低下は、例えば、少なくとも10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、または100%であり得る。いくつかの実施形態では、低下は、10~100%、10~50%、20~100%、20~50%、30~100%、30~50%、40%~100%、40~80%、50~90%、または50~100%である。あるいは、ABCの低下は、2回目もしくはそれ以降に、循環する剤が少なくとも検出可能なレベルであること、または標準LNPの投与後における循環する剤に対して、循環する剤が少なくとも2倍、3倍、4倍、5倍増加することを特徴とし得る。いくつかの実施形態では、低下は、2~100倍、2~50倍、3~100倍、3~50倍、3~20倍、4~100倍、4~50倍、4~40倍、4~30倍、4~25倍、4~20倍、4~15倍、4~10倍、4~5倍、5~100倍、5~50倍、5~40倍、5~30倍、5~25倍、5~20倍、5~15倍、5~10倍、6~100倍、6~50倍、6~40倍、6~30倍、6~25倍、6~20倍、6~15倍、6~10倍、8~100倍、8~50倍、8~40倍、8~30倍、8~25倍、8~20倍、8~15倍、8~10倍、10~100倍、10~50倍、10~40倍、10~30倍、10~25倍、10~20倍、10~15倍、20~100倍、20~50倍、20~40倍、20~30倍、または20~25倍である。
本開示は、クリアランスの影響を受けにくく、したがって、インビボでより長い半減期を有する、脂質含有化合物及び組成物を提供する。これは、特に、組成物が、長期投与を含む反復投与を意図している場合であり、さらにより詳細には、そのような反復投与が数日以内または数週間以内に生じる場合である。
重大なことには、これらの組成物は、急速血中クリアランス(ABC)の影響をうけにくく、または観察される当該現象を完全に回避する。ABCは、ある特定の外因的に投与された剤が2回目以降の投与で血液から急速に排除される現象である。この現象は、部分的には、限定するものではないが、脂質化剤、リポソームまたは他の脂質ベースの送達ビヒクル、及び脂質封入剤を含む、さまざまな脂質含有組成物で観察されている。従来、ABCの原理は、あまり理解されておらず、いくつかの場合、体液性免疫応答に起因し得、したがって、インビボ、特に臨床状況において、その影響を制限する戦略は、いまだ得られていない。
本開示は、ABCの影響を受けたとしても、その影響が小さい化合物及び組成物を提供する。いくつかの重要な態様では、そのような化合物及び組成物は、脂質含有化合物または組成物である。驚くべきことに、本開示の脂質含有化合物または組成物は、インビボにおいて、2回目以降の投与時にABCを経験しない。ABCに対するこの耐性により、これらの化合物及び組成物は、数日または1~2週間を含む短期間内の反復使用を含む、インビボでの反復使用に特に適したものになる。この安定性及び/または半減期の向上は、部分的には、これらの組成物が、B1a細胞及び/またはB1b細胞及び/または通常型B細胞、pDC及び/または血小板を活性化することがないことに起因する。
したがって、本開示は、急速血中クリアランス(ABC)の根底にある機序の解明を提供する。本開示及び本明細書で提供される本発明によれば、ABC現象は、少なくとも脂質及び脂質ナノ粒子に関する限り、少なくとも部分的にはB1a細胞及び/またはB1b細胞、pDC及び/または血小板が関与する自然免疫応答に媒介されることが見出された。B1a細胞は、通常、循環IgMの形態の天然抗体の分泌に関与する。このIgMは、多反応性であり、これは、各抗原に対する親和性は比較的低いものの、さまざまな抗原に結合することができることを意味する。
本発明によれば、インビボで投与される脂質ナノ粒子などのいくつかの脂質化剤または脂質含有製剤は、ABCを誘発し、ABCの影響を受けることが判明した。本発明によれば、LNPの初回用量の投与時に、自然免疫応答の発生に関与する1つまたは複数の細胞(本明細書ではセンサーと称される)がかかる剤に結合し、活性化され、次いで、ABC及び毒性を促進する免疫因子(本明細書ではエフェクターと称される)のカスケードを開始することがわかった。例えば、B1a細胞及びB1b細胞は、LNPに結合し、活性化され(単独で、あるいはpDCなどの他のセンサー及び/またはIL6などのエフェクターの存在下で)、LNPに結合する天然IgMを分泌し得る。対象内の既存の天然IgMもまた、LNPを認識して結合し、それにより、補体結合を誘発し得る。初回用量の投与後、天然IgMの産生は、LNPの投与の1~2時間内に開始する。典型的には、天然IgMは、約2~3週間までに、IgMの自然半減期に起因して、系から排除される。天然IgGは、LNPの投与から最初の約96時間後に産生される。剤は、ナイーブ環境で投与された場合、B1a細胞もしくはB1b細胞の活性化後に産生される天然IgMまたは天然IgGによって比較的妨げられない生物学的作用を発揮することができる。天然IgM及び天然IgGは、非特異的であるため、抗PEG IgM及び抗PEG IgGとは異なる。
出願人は機序に拘束されるものではないが、LNPが、次の機序により、ABC及び/または毒性を誘発することが提案される。LNPは、対象に投与されると、血液を通して脾臓に迅速に輸送されると考えられる。LNPは、血液及び/または脾臓中で免疫細胞に遭遇し得る。血液及び/または脾臓内のLNPの存在に応答して、迅速な自然免疫応答が誘発される。出願人は、LNPの投与から数時間以内に、いくつかの免疫センサーがLNPの存在に反応することを本明細書で示している。これらのセンサーには、免疫応答の発生に関与するB細胞、pDC、及び血小板などの免疫細胞が含まれるが、これらに限定されない。センサーは、脾臓辺縁帯などの脾臓中及び/または血液中に存在し得る。LNPは、他のセンサーと相互作用し得る1つまたは複数のセンサーと物理的に相互作用し得る。そのような場合、LNPは、センサーと直接的または間接的に相互作用する。センサーは、LNPの認識に応答して、互いに直接相互作用し得る。例えば、多くのセンサーは、脾臓中に位置しており、互いに容易に相互作用することができる。あるいは、センサーのうちの1つまたは複数は、血中のLNPと相互作用し、活性化され得る。次に、活性化されたセンサーは、他のセンサーと直接的に相互作用するか、または間接的に(例えば、メッセンジャー、例えば、IL6などのサイトカインの刺激または産生を介して)相互作用し得る。
いくつかの実施形態では、LNPは、次のセンサー:pDC、B1a細胞、B1b細胞、及び血小板のそれぞれと直接相互作用し、これを活性化し得る。次いで、これらの細胞は、互いに直接的または間接的に相互作用して、最終的にLNPの反復投与に伴うABC及び/または毒性につながるエフェクターの産生を開始し得る。例えば、出願人は、LNP投与が、pDCの活性化、血小板の凝集及び活性化ならびにB細胞の活性化をもたらすことを示した。LNPに応答して、血小板も凝集し、活性化され、B細胞と凝集し、pDC細胞が活性化される。LNPは、比較的迅速に血小板及びB細胞の表面と相互作用することがわかった。これらのセンサーのいずれか1つまたは組み合わせのLNPに応答した活性化を遮断することは、通常生じる免疫応答を軽減させるのに有用である。免疫応答のこの軽減は、ABC及び/または毒性の回避をもたらす。
センサーは、一旦活性化されると、エフェクターを産生する。本明細書で使用されるエフェクターは、B細胞などの免疫細胞によって産生される免疫分子である。エフェクターには、天然IgM及び天然IgGなどの免疫グロブリンならびにIL6などのサイトカインが含まれるが、これらに限定されない。B1a細胞及びB1b細胞は、LNPの投与後2~6時間以内に、天然IgMの産生を刺激する。天然IgGは、96時間以内に検出され得る。IL6レベルは、数時間以内に上昇する。天然IgM及び天然IgGは、体内を数日~数週間循環する。この時間中、循環するエフェクターは、新しく投与されたLNPと相互作用して、これらのLNPの身体によるクリアランスが誘発され得る。例えば、エフェクターは、LNPを認識して、これに結合し得る。エフェクターのFc領域は、マクロファージによって認識され、装飾されたLNPの取り込みを誘発する。次いで、マクロファージが脾臓に輸送される。免疫センサーによるエフェクターの産生は、ABCについて観察されるタイミングと相関する一過性の応答である。
投与回が2回目またはそれ以降の投与回である場合、かつかかる2回目またはそれ以降の投与量が、先に誘導された天然IgM及び/または天然IgGが系から排除される前(例えば、2~3ウィンドウ期間前)に投与される場合、かかる2回目またはそれ以降の投与が、循環する天然IgM及び/または天然IgGまたはFcの標的にされ、補体副経路の活性化を誘発し、それ自体が迅速に排除される。エフェクターが体内からクリアランスされた後、またはその数が減少した後に、LNPが投与される時、ABCは、観察されない。
したがって,本発明の態様によれば、LNPと1つもしくは複数のセンサーとの間の相互作用を阻害すること、LNPによる1つもしくは複数のセンサーの活性化を阻害すること(直接的または間接的に)、1つもしくは複数のエフェクターの産生を阻害すること、及び/または1つもしくは複数のエフェクターの活性を阻害することが有用である。いくつかの実施形態では、LNPは、LNPとセンサーとの相互作用を制限または遮断するように設計される。例えば、LNPは、センサーとの相互作用を防ぐために、変更されたPC及び/またはPEGを有し得る。代替的または追加的に、LNPによって誘導される免疫応答を阻害する剤を使用して、これらの作用のうちのいずれか1つまたは複数を達成してもよい。
また、通常型B細胞もABCに関与していることが判明した。具体的には、剤の初回投与時に、本明細書でCD19(+)と称される通常型B細胞が剤に結合し、これに応答する。B1a細胞及びB1b細胞とは異なるが、通常型B細胞は、最初にIgM応答を開始することができ(LNP投与の約96時間後に開始する)、続いて、記憶応答に付随するIgG応答が生じる(LNP投与の約14日後に開始する)。したがって、通常型B細胞は、投与された剤に応答し、ABCを媒介するIgM(及び最終的にはIgG)に寄与する。IgM及びIgGは、典型的には、抗PEG IgM及び抗PEG IgGである。
いくつかの場合では、ABC応答の大部分が、B1a細胞及びB1a媒介性免疫応答を介して媒介されることが企図される。いくつかの場合では、通常型B細胞とB1a細胞の両方がそのような作用を媒介しながら、IgMとIgGの両方によってABC応答が媒介されることがさらに企図される。またさらに他の場合では、ABC応答は、天然IgM分子によって媒介され、これらの一部は、活性化されたB1a細胞によって産生され得る天然IgMに結合することができる。天然IgMは、LNPの1つまたは複数の構成要素に結合し得る(例えば、LNPのリン脂質構成要素への結合(リン脂質のPC部分への結合など)及び/またはLNPのPEG脂質構成要素への結合(PEG-DMGへの結合、特に、PEG-DMGのPEG部分への結合など))。B1aは、ホスファチジルコリンのリガンドであるCD36を発現するので、CD36受容体は、B1a細胞の活性化及び天然IgMの産生を媒介し得ることが企図される。またさらに他の場合では、ABC応答は、主に、通常型B細胞によって媒介される。
本発明によれば、ABC現象は、少なくとも部分的には、B1a細胞を活性化しない化合物及び組成物(剤、送達ビヒクル、及び製剤など)の使用を介して、減少または無効化できることが判明した。B1a細胞を活性化しない化合物及び組成物は、本明細書では、B1a不活性化合物及び組成物と称され得る。本発明によれば、ABC現象は、少なくとも部分的には、通常型B細胞を活性化しない化合物及び組成物の使用を介して、減少または無効化できることが判明した。いくつかの実施形態では、通常型B細胞を活性化しない化合物及び組成物は、本明細書では、CD19不活性化合物及び組成物と称され得る。したがって、本明細書で提供されるいくつかの実施形態では、化合物及び組成物は、B1a細胞を活性化せず、従来型B細胞を活性化しない。いくつかの実施形態では、B1a細胞も通常型B細胞も活性化しない化合物及び組成物は、本明細書では、B1a/CD19不活性化合物及び組成物と称され得る。
これらの根底にある機序は、これまでに理解されておらず、当該現象におけるB1a細胞及びB1b細胞の役割ならびに通常型B細胞との相互作用も認識されていなかった。
したがって、本開示は、ABCを促進しない化合物及び組成物を提供する。また、これらは、B1a細胞及び/またはB1b細胞、血小板及び/またはpDC、ならびに任意選択で通常型B細胞を活性化することがないことをさらに特徴とし得る。これらの化合物(例えば、予防剤、治療剤及び診断剤などの生物学的に活性な剤を含む剤、リポソーム、脂質ナノ粒子及び他の脂質ベース封入構造を含む送達ビヒクルなど)及び組成物(例えば、製剤など)は、反復投与、特に短期間内(例えば、1~2週間内)で行われる反復投与を要する用途に特に望ましい。これは、例えば、剤が規則的で狭い間隔で対象に提供される核酸ベースの治療剤である場合である。本明細書で提供される知見は、同様に投与される及び/またはABCを受けるこれらの剤及び他の薬に該当し得る。
特に関心が高いものは、ABCの影響を受けやすいことが知られている脂質含有化合物、脂質含有粒子、及び脂質含有組成物である。そのような脂質含有化合物粒子及び組成物は、生物学的に活性な剤としてまたはそのような剤の送達ビヒクルとして広範囲に使用されている。したがって、そのような剤の有効性を向上させる能力は、剤自体またはその送達ビヒクルに対するABCの作用を低下させるかどうかに関わらず、多種多様な活性剤にとって有益である。
本明細書では、1つまたは複数の生物学的に活性な剤の反復投与と関係する急性期応答(ARP)を刺激または増強しない組成物もまた提供される。
組成物は、いくつかの場合では、限定するものではないが、天然IgMを含むIgMに結合し得ない。
組成物は、いくつかの場合では、限定されないが、C反応性タンパク質などの急性期タンパク質に結合し得ない。
組成物は、いくつかの場合では、CD5(+)媒介免疫応答を誘発し得ない。本明細書で使用されるとき、CD5(+)媒介性免疫応答は、B1a細胞及び/またはB1b細胞によって媒介される免疫応答である。そのような応答には、ABC応答、急性期応答、天然IgM及び/または天然IgGの誘導などが含まれ得る。
組成物は、いくつかの場合では、CD19(+)媒介免疫応答を誘発し得ない。本明細書で使用されるとき、CD19(+)媒介性免疫応答は、通常型CD19(+),CD5(-)B細胞によって媒介される免疫応答である。そのような応答には、IgMの誘導、IgGの誘導、メモリーB細胞の誘導、ABC応答、抗タンパク質応答を含む抗薬物抗体(ADA)応答(ここで、タンパク質は、LNP内に封入され得る)などが含まれ得る。
B1a細胞は、自然免疫に関与するB細胞のサブセットである。これらの細胞は、天然抗体または天然血清抗体と呼ばれる循環IgMの供給源である。天然IgM抗体は、多数の抗原に対して親和性が弱いことを特徴とし、したがって、「多特異性」または「多反応性」と称される。これは、2つ以上の抗原に結合する能力を示す。B1a細胞は、IgGを産生することができない。さらに、B1a細胞は、メモリー細胞に発達しないことから、適応免疫応答に寄与しない。しかしながら、B1a細胞は、活性化時に、IgMを分泌することができる。分泌されたIgMは、典型的には、約2~3週間以内に排除され、この時点で、免疫系は、それまでに投与された抗原に対して比較的ナイーブになる。この期間後(例えば、最初の曝露から約3週間後)に同じ抗原が提示された場合であれば、当該抗原は、急速に排除されない。しかしながら、重大なことに、この期間内(例えば、1週間以内または数日以内を含む2週間以内)に抗原が提示される場合、当該抗原は、急速に排除される。この連続投与間の遅延により、ある特定の脂質含有治療剤または診断剤は、使用に適さなくなる。
ヒトでは、B1a細胞は、CD19(+)、CD20(+)、CD27(+)、CD43(+)、CD70(-)及びCD5(+)である。マウスでは、B1a細胞は、CD19(+)、CD5(+)、及びCD45B細胞アイソフォームB220(+)である。B1a細胞と他の通常型B細胞とを区別するのは、典型的には、CD5の発現である。B1a細胞は、CD5を高レベルで発現し得、これに基づき、B1a細胞は、CD5を低レベルまたは検出不可能なレベルで発現するB-1b細胞などの他のB-1細胞と区別され得る。CD5は、汎T細胞表面糖タンパク質である。B1a細胞はまた、脂肪酸トランスロカーゼとしても知られているCD36を発現する。CD36は、クラスBスカベンジャー受容体ファミリーのメンバーである。CD36は、酸化した低密度リポタンパク質、天然リポタンパク質、酸化リン脂質、及び長鎖脂肪酸を含む、多くのリガンドに結合することができる。
B1b細胞は、自然免疫に関与するB細胞の別のサブセットである。これらの細胞は、循環天然IgMの別の供給源である。PSを含むいくつかの抗原は、B1b活性化を介してT細胞非依存の免疫を誘導することができる。CD27は、典型的には、抗原活性化に応答して、B1b細胞で上方制御される。B1a細胞と同様に、B1b細胞は、典型的には、脾臓及び腹膜腔などの身体の特定の場所に存在し、血液中の存在量は非常に少ない。B1bから分泌された天然IgMは、典型的には、約2~3週間以内に排除され、この時点で、免疫系は、それまでに投与された抗原に対して比較的ナイーブになる。この期間後(例えば、最初の曝露から約3週間後)に同じ抗原が提示された場合であれば、当該抗原は、急速に排除されない。しかしながら、重大なことに、この期間内(例えば、1週間以内または数日以内を含む2週間以内)に抗原が提示される場合、当該抗原は、急速に排除される。この連続投与間の遅延により、ある特定の脂質含有治療剤または診断剤は、使用に適さなくなる。
いくつかの実施形態では、B1a細胞及び/またはB1b細胞の活性化を遮断することが望ましい。B1a細胞及び/またはB1b細胞の活性化を遮断する1つの戦略は、脂質ナノ粒子のどの構成要素がB細胞の活性化を促進するかを決定し、それらの構成要素を中和することを伴う。少なくともPEG及びホスファチジルコリン(PC)が、B1a及びB1b細胞と他の細胞との相互作用及び/または活性化に寄与することが本発明で発見された。PEGは、B1細胞と血小板との間の凝集を促進する役割を果たし得、それにより、活性化に至り得る。PC(LNP中のヘルパー脂質)はまた、おそらくB細胞表面上のCD36受容体との相互作用を介して、B1細胞の活性化に関与する。多数の粒子は、PEG脂質代替物を有し、PEGレス、及び/またはPC置換脂質(例えば、オレイン酸またはその類似体)が設計され試験されている。出願人は、反復投与時にABCをいずれにせよ促進するLNP内のこれらの構成要素のうちの1つまたは複数を置換することが、天然IgMの産生及び/またはB細胞活性化を低下させることにより、ABCを防ぐのに有用であることを確立した。したがって、本発明は、B細胞トリガーの包含を排除する設計の結果として、ABCを低下させたLNPを包含する。
B1a細胞及び/またはB1b細胞の活性化を遮断する別の戦略は、LNPによって誘導される免疫応答を阻害する剤を使用することを伴う。これらのタイプの剤は、以下でより詳細に考察される。いくつかの実施形態では、これらの剤は、B1a/B1b細胞とLNPまたは血小板またはpDCとの間の相互作用を遮断する。例えば、剤は、抗体であってもよいし、または相互作用を物理的に遮断する他の結合剤であってよい。この一例は、CD36またはCD6に結合する抗体である。剤は、B1a/B1b細胞が一旦活性化されるか、または活性化される前に、シグナル伝達することを阻止または無効にする化合物であってもよい。例えば、B細胞とLNPまたは他の免疫細胞との相互作用の結果として生じるB1a/B1bシグナル伝達カスケード中の1つまたは複数の構成要素を遮断することが可能である。さらに他の実施形態では、剤は、活性化後のB1a/B1b細胞によって産生される1つまたは複数のエフェクターに作用し得る。これらのエフェクターには、例えば、天然IgM及びサイトカインが含まれる。
本発明の態様によれば、pDC細胞の活性化が遮断された場合、LNPに応答したB細胞の活性化が減少することが示された。したがって、ABC及び/または毒性を回避するために、pDCの活性化を阻止することが望ましいことがある。上で考察した戦略と同様に、pDC細胞の活性化は、pDCとLNP及び/またはB細胞/血小板との間の相互作用を妨害する剤によって遮断され得る。あるいは、pDCに作用してその活性化能力を遮断するか、またはそのエフェクターに作用する剤をLNPとともに使用してABCを回避することができる。
血小板もまた、ABC及び毒性に重要な役割を果たし得る。血小板は、LNPの初回用量が対象に投与された後、極めて迅速に、LNPと会合し、凝集し、活性化される。いくつかの実施形態では、血小板の凝集及び/または活性化を遮断することが望ましい。血小板の凝集及び/または活性化を遮断する1つの戦略は、脂質ナノ粒子のどの構成要素が血小板の凝集を促進するかを決定し、それらの構成要素を中和することを伴う。少なくともPEGが、血小板の凝集、活性化、及び/または他の細胞との相互作用に寄与することが本発明で発見された。多数の粒子は、PEG脂質代替物を有し、PEGレスが設計され試験されている。出願人は、反復投与時にABCをいずれにせよ促進するLNP内のこれらの構成要素のうちの1つまたは複数を置換することが、天然IgMの産生及び/または血小板の凝集を低下させることにより、ABCを防ぐのに有用であることを確立した。したがって、本発明は、血小板トリガーの包含を排除する設計の結果として、ABCを低下させたLNPを包含する。あるいは、血小板に作用して、一旦活性化したその能力を遮断するか、またはそのエフェクターに作用する剤をLNPとともに使用してABCを回避することができる。
ABC活性及び関連活性の測定
本明細書で提供されるLNPを含むさまざまな化合物及び組成物は、インビボ投与時にABC活性を促進しない。これらのLNPは、多数のアッセイのいずれか、限定するものではないが、以下に記載されるものなどにより、特徴付け及び/または同定がなされ得る。
本明細書で提供されるLNPを含むさまざまな化合物及び組成物は、インビボ投与時にABC活性を促進しない。これらのLNPは、多数のアッセイのいずれか、限定するものではないが、以下に記載されるものなどにより、特徴付け及び/または同定がなされ得る。
いくつかの実施形態では、方法は、ABCを促進する免疫応答を生ずることなく、LNPを投与することを伴う。ABCを促進する免疫応答は、B1細胞、pDC、または血小板などの1つまたは複数のセンサー、及び天然IgM、天然IgGまたはIL6などのサイトカインなどの1つまたは複数のエフェクターの活性化を伴う。したがって、ABCを促進する免疫応答を生ずることのないLNPの投与は、1つまたは複数のセンサーの有意な活性化及び1つまたは複数のエフェクターの有意な産生のないLNPの投与を最低限伴う。本文脈中で使用される有意とは、ABC誘発LNPの2回目の投与について予想される血中クリアランスのレベルに対して、2回目の投与のすべてまたは一部の急速血中クリアランスという生理学的結果をもたらす量を指す。例えば、免疫応答は、2回目の投与後に観察されるABCが、ABC誘発LNPについて予想されるABCよりも低くなるように減少されるものである。
B1aまたはB1b活性化アッセイ
本開示で提供される特定の組成物は、B1a細胞またはB1b細胞(CD19+CD5+)及び/または通常型B細胞(CD19+CD5-)などのB細胞を活性化しない。B1a細胞、B1b細胞、または通常型B細胞の活性化は、多くの方法で決定することができ、そのいくつかを以下に提供する。B細胞集団は、B細胞集団分画または脾細胞もしくは末梢血単核細胞(PBMC)の未分画集団として提供され得る。後者の場合、細胞集団は、最適なLNPと一定の期間インキュベートされ、次いで、さらなる分析のために採取され得る。あるいは、上清が採取及び分析され得る。
本開示で提供される特定の組成物は、B1a細胞またはB1b細胞(CD19+CD5+)及び/または通常型B細胞(CD19+CD5-)などのB細胞を活性化しない。B1a細胞、B1b細胞、または通常型B細胞の活性化は、多くの方法で決定することができ、そのいくつかを以下に提供する。B細胞集団は、B細胞集団分画または脾細胞もしくは末梢血単核細胞(PBMC)の未分画集団として提供され得る。後者の場合、細胞集団は、最適なLNPと一定の期間インキュベートされ、次いで、さらなる分析のために採取され得る。あるいは、上清が採取及び分析され得る。
活性化マーカーの細胞表面発現の上方制御
B1a細胞、B1b細胞、または通常型B細胞の活性化は、CD86などの後期活性化マーカーを含むB細胞活性化マーカーの発現上昇として決定され得る。例示的な非限定的なアッセイでは、未分画B細胞は、脾細胞集団またはPBMC集団として提供され、最適なLNPとともに特定の期間インキュベートされ、ついで、CD19などの標準B細胞マーカー及びCD86などの活性化マーカーについて染色され、例えば、フローサイトメトリーを使用して分析される。好適な陰性対照は、同じ集団を培地とともにインキュベートし、次いで、同じ染色及び可視化のステップを実施することを伴う。陰性対照と比較した試験集団におけるCD86発現の上昇は、B細胞の活性化を示す。
B1a細胞、B1b細胞、または通常型B細胞の活性化は、CD86などの後期活性化マーカーを含むB細胞活性化マーカーの発現上昇として決定され得る。例示的な非限定的なアッセイでは、未分画B細胞は、脾細胞集団またはPBMC集団として提供され、最適なLNPとともに特定の期間インキュベートされ、ついで、CD19などの標準B細胞マーカー及びCD86などの活性化マーカーについて染色され、例えば、フローサイトメトリーを使用して分析される。好適な陰性対照は、同じ集団を培地とともにインキュベートし、次いで、同じ染色及び可視化のステップを実施することを伴う。陰性対照と比較した試験集団におけるCD86発現の上昇は、B細胞の活性化を示す。
炎症促進性サイトカイン放出
B細胞の活性化は、サイトカイン放出アッセイによっても評価することができる。例えば、活性化は、目的のLNPとともに曝露された際のIL-6及び/またはTNF-αなどのサイトカインの産生及び/または分泌を介して評価され得る。
B細胞の活性化は、サイトカイン放出アッセイによっても評価することができる。例えば、活性化は、目的のLNPとともに曝露された際のIL-6及び/またはTNF-αなどのサイトカインの産生及び/または分泌を介して評価され得る。
そのようなアッセイは、当該技術分野においてよく知られている常法のサイトカイン分泌アッセイを使用して実施することができる。サイトカイン分泌の増加は、B細胞活性化を示す。
B細胞へのLNPの結合/会合及び/またはB細胞による取り込み
LNPのB細胞への会合または結合は、目的のLNPの評価及び当該LNPのさらなる特徴付けのためにも使用することができる。会合/結合及び/または取り込み/内在化は、蛍光標識されたLNPなどの検出可能に標識されたLNPを使用し、さまざまなインキュベーション期間後における当該LNPのB細胞内またはB細胞上の場所を追跡することで評価され得る。
LNPのB細胞への会合または結合は、目的のLNPの評価及び当該LNPのさらなる特徴付けのためにも使用することができる。会合/結合及び/または取り込み/内在化は、蛍光標識されたLNPなどの検出可能に標識されたLNPを使用し、さまざまなインキュベーション期間後における当該LNPのB細胞内またはB細胞上の場所を追跡することで評価され得る。
本発明は、本明細書で提供される組成物が認識または検出を回避することができ、任意選択で、循環IgMなどのABCの下流のメディエーター及び/または急性期タンパク質(例えば、C反応性タンパク質(CRP)などの急性期応答メディエーターによる結合を回避することができることをさらに企図する。
ABCを低下させるための使用方法
本明細書ではまた、治療剤などの剤を封入し得るLNPを、ABCを促進することなく対象に送達するための方法も提供される。
本明細書ではまた、治療剤などの剤を封入し得るLNPを、ABCを促進することなく対象に送達するための方法も提供される。
いくつかの実施形態では、方法は、ABCを促進しない本明細書に記載のLNPのいずれか、例えば、LNPに結合する天然IgMの産生を誘導しないもの、B1a及び/またはB1b細胞を活性化しないものを投与することを含む。本明細書で使用されるとき、「ABCを促進しない」LNPとは、実質的なABCをもたらす免疫応答を誘導しないか、または実質的なABCをもたらすには不十分な実質的に低いレベルの免疫応答を誘導するLNPを指す。LNPに結合する天然IgMの産生を誘導しないLNPとは、LNPに結合する天然IgMを誘導しないか、または実質的なABCをもたらすには不十分な実質的に低いレベルの天然IgM分子を誘導するLNPを指す。B1a細胞及び/またはB1b細胞を活性化しないLNPとは、LNPに結合する天然IgMを産生するB1a細胞及び/またはB1b細胞の応答を誘導しないか、または実質的なABCをもたらすには不十分な実施的に低いレベルのB1a及び/またはB1b応答を誘導するLNPを指す。
いくつかの実施形態では、産生を活性化しない及び誘導しないという用語は、参照値または参照条件に対する相対的な低下である。いくつかの実施形態では、参照値または参照条件は、MC3 LNPなどの標準LNPによる、IgMなどの分子の産生の活性化または誘導の量である。いくつかの実施形態では、相対的な低下は、少なくとも30%、例えば、少なくとも30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の低下である。他の実施形態では、B細胞などの細胞を活性化しないという用語、及びIgMなどのタンパクの産生を誘導しないという用語は、活性細胞または特定のタンパク質の量が検出不可能であることを指し得る。
血小板作用及び毒性
本発明はさらに、LNP投与に関連する用量制限毒性の根底にある機序の解明を一部前提とする。そのような毒性は、凝固障害、急性もしくは慢性かどうかに関わらず、播種性血管内凝固(DIC、消費性凝固障害とも称される)及び/または血管血栓症を含み得る。いくつかの場合では、LNPに関連する用量制限毒性は、急性期応答(APR)または補体活性化関連偽アレルギー反応(CARPA)である。
本発明はさらに、LNP投与に関連する用量制限毒性の根底にある機序の解明を一部前提とする。そのような毒性は、凝固障害、急性もしくは慢性かどうかに関わらず、播種性血管内凝固(DIC、消費性凝固障害とも称される)及び/または血管血栓症を含み得る。いくつかの場合では、LNPに関連する用量制限毒性は、急性期応答(APR)または補体活性化関連偽アレルギー反応(CARPA)である。
本明細書で使用されるとき、凝固障害は、インビボでの凝固(血液凝固)の増加を指す。本開示で報告された知見は、そのような凝固の増加と一致し、根底にある機序についての洞察を多く提供する。凝固は、多数の異なる因子及び細胞型が関係するプロセスであり、この点に関して、LNPと血小板との間の関係及び相互作用はこれまで理解されていない。本開示は、そのような相互作用の証拠を提供するものであり、また、血小板会合の減少、血小板凝集の減少、及び/または血小板凝集の減少を含む、血小板の作用が低くなるように改変された化合物及び組成物を提供する。そのような血小板作用を調節する能力、好ましくは、下方調節する能力により、LNP投与後の凝固障害の発生率及び/または重症度を低減することができる。これは、次に、そのようなLNPに関連する毒性を低減させ、それにより、より高い用量のLNPが可能になり、また、重要なことに、それらのカーゴを、それを必要とする患者に投与することが可能になる。
CARPAは、ナノ医薬品及び生物製剤によって誘発されることがある、過敏反応(HSR)で現れる急性免疫毒性のクラスである。アレルギー反応とは異なり、CARPAは、典型的には、IgEを伴わないが、病原体を排除する身体能力を高める自然免疫系の一部である補体系の活性化の結果として生じる。次の経路:古典補体経路(CP)、副経路(AP)、及びレクチン経路(LP)の1つまたは複数がCARPAに関与し得る。Szebeni,Molecular Immunology,61:163-173(2014)。
古典経路は、C1q、C1r、C1s、またはC1qr2s2を含有するC1複合体の活性化によって誘発される。C1複合体の活性化は、抗原と複合化したIgMもしくはIgGにC1qが結合する場合、またはC1qが病原体の表面に直接結合する場合に生じる。そのような結合は、次いで、C1q分子の高次構造に変化をもたらし、それにより、C1sを切断するC1rの活性化が生じる。ここで、C1r2s2構成要素は、C4、次にC2を分解し、C4a、C4b、C2a、及びC2bを生じる。C4b及びC2bが結合して古典経路C3転換酵素(C4b2b複合体)を形成し、これがC3のC3a及びC3bへの開裂を促進する。次いで、C3bは、C3転換酵素に結合してC5転換酵素(C4b2b3b複合体)を形成する。副経路は、自発的なC3加水分解の結果として連続的に活性化される。因子P(プロペルジン)は、副経路の正の制御因子である。プロペルジンのオリゴマー化により、C3転換酵素が安定化し、次いで、より多くのC3が切断され得る。C3分子は、表面に結合し、より多くのB、D、及びP活性をリクルートして、補体活性化の増幅が生じ得る。
急性期反応(APR)は、感染の防止及び潜在的な病原体の排除を行う複雑な全身性の自然免疫応答である。多数のタンパク質がAPRに関与しており、十分に特徴付けがなされているタンパク質は、C反応性タンパク質である。
本発明によれば、ある特定のLNPは、インビボ投与のほぼ直後に、血小板と物理的に会合することができるが、他のLNPは、血小板と全く会合しないか、またはバックグラウンドレベルでしか会合しないことが見出された。重大なことに、血小板と会合するLNPは、その後形成される血小板凝集も安定させるようである。血小板とある特定のLNPの物理的接触は、当該血小板が凝集した状態を維持する能力、または当該血小板が投与後の長期間にわたり凝集体を継続的に形成する能力と相関する。そのような凝集体は、活性化した血小板を含み、さらに、マクロファージ及びB細胞などの自然免疫細胞も含む。
脂質ナノ粒子(LNP)
実施形態の1つのセットでは、脂質ナノ粒子(LNP)が提供される。1つの実施形態では、脂質ナノ粒子は、イオン化可能な脂質、構造脂質、リン脂質を含む脂質と、mRNAと、を含む。本明細書に記載のLNPのそれぞれは、本明細書に記載のmRNAの製剤として使用され得る。1つの実施形態では、脂質ナノ粒子は、イオン化可能な脂質、構造脂質、リン脂質、及びmRNAを含む。いくつかの実施形態では、LNPは、イオン化可能な脂質、PEG修飾脂質、リン脂質及び構造脂質を含む。いくつかの実施形態では、LNPは、約20~60%のイオン化可能な脂質:約5~25%のリン脂質:約25~55%の構造脂質;約0.5~15%のPEG修飾脂質のモル比を有する。いくつかの実施形態では、LNPは、約50%のイオン化可能な脂質、約1.5%のPEG修飾脂質、約38.5%の構造脂質及び約10%のリン脂質のモル比を含む。いくつかの実施形態では、LNPは、約55%のイオン化可能な脂質、約2.5%のPEG脂質、約32.5%の構造脂質及び約10%のリン脂質のモル比を含む。いくつかの実施形態では、イオン化可能な脂質は、イオン化可能なアミノ脂質またはカチオン性脂質であり、リン脂質は、中性脂質であり、構造脂質は、コレステロールである。いくつかの実施形態では、LNPは、イオン化可能な脂質:コレステロール:DSPC:PEG2000-DMGが50:38.5:10:1.5であるモル比を有する。
実施形態の1つのセットでは、脂質ナノ粒子(LNP)が提供される。1つの実施形態では、脂質ナノ粒子は、イオン化可能な脂質、構造脂質、リン脂質を含む脂質と、mRNAと、を含む。本明細書に記載のLNPのそれぞれは、本明細書に記載のmRNAの製剤として使用され得る。1つの実施形態では、脂質ナノ粒子は、イオン化可能な脂質、構造脂質、リン脂質、及びmRNAを含む。いくつかの実施形態では、LNPは、イオン化可能な脂質、PEG修飾脂質、リン脂質及び構造脂質を含む。いくつかの実施形態では、LNPは、約20~60%のイオン化可能な脂質:約5~25%のリン脂質:約25~55%の構造脂質;約0.5~15%のPEG修飾脂質のモル比を有する。いくつかの実施形態では、LNPは、約50%のイオン化可能な脂質、約1.5%のPEG修飾脂質、約38.5%の構造脂質及び約10%のリン脂質のモル比を含む。いくつかの実施形態では、LNPは、約55%のイオン化可能な脂質、約2.5%のPEG脂質、約32.5%の構造脂質及び約10%のリン脂質のモル比を含む。いくつかの実施形態では、イオン化可能な脂質は、イオン化可能なアミノ脂質またはカチオン性脂質であり、リン脂質は、中性脂質であり、構造脂質は、コレステロールである。いくつかの実施形態では、LNPは、イオン化可能な脂質:コレステロール:DSPC:PEG2000-DMGが50:38.5:10:1.5であるモル比を有する。
イオン化可能なアミノ脂質
本開示は、有利な性質を持つ医薬組成物を提供する。例えば、本明細書に記載の脂質(例えば、式(I)、(IA)、(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)、(IIe)、(III)、(IV)、(V)、または(VI)のいずれかを有する脂質は、哺乳類の細胞または器官に治療剤及び/または予防剤を送達するための脂質ナノ粒子組成物に有利に使用することができる。例えば、本明細書に記載の脂質は、免疫原性がほとんどないか、まったくない。例えば、本明細書に開示の脂質化合物は、参照脂質(例えば、MC3、KC2、またはDLinDMA)と比較して、より低い免疫原性を有する。例えば、本明細書に開示の脂質及び治療剤または予防剤を含む製剤は、参照脂質(例えば、MC3、KC2、またはDLinDMA)及び同じ治療剤または予防剤を含む対応する製剤と比較して、治療指数が上昇する。特に、本出願は、
(a)1つまたは複数の癌エピトープポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチドと、
(b)送達剤と、を含む、医薬組成物を提供する。
本開示は、有利な性質を持つ医薬組成物を提供する。例えば、本明細書に記載の脂質(例えば、式(I)、(IA)、(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)、(IIe)、(III)、(IV)、(V)、または(VI)のいずれかを有する脂質は、哺乳類の細胞または器官に治療剤及び/または予防剤を送達するための脂質ナノ粒子組成物に有利に使用することができる。例えば、本明細書に記載の脂質は、免疫原性がほとんどないか、まったくない。例えば、本明細書に開示の脂質化合物は、参照脂質(例えば、MC3、KC2、またはDLinDMA)と比較して、より低い免疫原性を有する。例えば、本明細書に開示の脂質及び治療剤または予防剤を含む製剤は、参照脂質(例えば、MC3、KC2、またはDLinDMA)及び同じ治療剤または予防剤を含む対応する製剤と比較して、治療指数が上昇する。特に、本出願は、
(a)1つまたは複数の癌エピトープポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチドと、
(b)送達剤と、を含む、医薬組成物を提供する。
いくつかの実施形態では、送達剤は、式(I)を有する脂質化合物
(式中、
R1は、C5-30アルキル、C5-20アルケニル、-R*YR”、-YR”、及び-R”M’R’からなる群から選択され、
R2及びR3は、H、C1-14アルキル、C2-14アルケニル、-R*YR”、-YR”、及び-R*OR”からなる群から独立して選択されるか、またはR2及びR3は、それらが結合している原子と一緒になってヘテロ環もしくは炭素環を形成し、
R4は、C3-6炭素環、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR、-CQ(R)2、及び非置換C1-6アルキルからなる群から選択され、Qは、炭素環、ヘテロ環、-OR、-O(CH2)nN(R)2、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX3、-CX2H、-CXH2、-CN、-N(R)2、-C(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(S)N(R)2、-N(R)R8、-O(CH2)nOR、-N(R)C(=NR9)N(R)2、-N(R)C(=CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、-N(OR)C(O)R、-N(OR)S(O)2R、-N(OR)C(O)OR、-N(OR)C(O)N(R)2、-N(OR)C(S)N(R)2、-N(OR)C(=NR9)N(R)2、-N(OR)C(=CHR9)N(R)2、-C(=NR9)N(R)2、-C(=NR9)R、-C(O)N(R)OR、及び-C(R)N(R)2C(O)ORから選択され、nはそれぞれ、1、2、3、4、及び5から独立して選択され、
R5はそれぞれ、C1-3アルキル、C2-3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
R6はそれぞれ、C1-3アルキル、C2-3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
M及びM’は、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、-S-S-、アリ-ル基、及びヘテロアリ-ル基から独立して選択され、
R7は、C1-3アルキル、C2-3アルケニル、及びHからなる群から選択され、
R8は、C3-6炭素環及びヘテロ環からなる群から選択され、
R9は、H、CN、NO2、C1-6アルキル、-OR、-S(O)2R、-S(O)2N(R)2、C2-6アルケニル、C3-6炭素環及びヘテロ環からなる群から選択され、
Rはそれぞれ、C1-3アルキル、C2-3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
R’はそれぞれ、C1-18アルキル、C2-18アルケニル、-R*YR”、-YR”、及びHからなる群から独立して選択され、
R”はそれぞれ、C3-14アルキル及びC3-14アルケニルからなる群から独立して選択され、
R*はそれぞれ、C1-12アルキル及びC2-12アルケニルからなる群から独立して選択され、
Yはそれぞれ、独立してC3-6炭素環であり、
Xはそれぞれ、F、Cl、Br、及びIからなる群から独立して選択され、mは、5、6、7、8、9、10、11、12、及び13から選択される)
またはその塩もしくは立体異性体を含む。
R1は、C5-30アルキル、C5-20アルケニル、-R*YR”、-YR”、及び-R”M’R’からなる群から選択され、
R2及びR3は、H、C1-14アルキル、C2-14アルケニル、-R*YR”、-YR”、及び-R*OR”からなる群から独立して選択されるか、またはR2及びR3は、それらが結合している原子と一緒になってヘテロ環もしくは炭素環を形成し、
R4は、C3-6炭素環、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR、-CQ(R)2、及び非置換C1-6アルキルからなる群から選択され、Qは、炭素環、ヘテロ環、-OR、-O(CH2)nN(R)2、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX3、-CX2H、-CXH2、-CN、-N(R)2、-C(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(S)N(R)2、-N(R)R8、-O(CH2)nOR、-N(R)C(=NR9)N(R)2、-N(R)C(=CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、-N(OR)C(O)R、-N(OR)S(O)2R、-N(OR)C(O)OR、-N(OR)C(O)N(R)2、-N(OR)C(S)N(R)2、-N(OR)C(=NR9)N(R)2、-N(OR)C(=CHR9)N(R)2、-C(=NR9)N(R)2、-C(=NR9)R、-C(O)N(R)OR、及び-C(R)N(R)2C(O)ORから選択され、nはそれぞれ、1、2、3、4、及び5から独立して選択され、
R5はそれぞれ、C1-3アルキル、C2-3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
R6はそれぞれ、C1-3アルキル、C2-3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
M及びM’は、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、-S-S-、アリ-ル基、及びヘテロアリ-ル基から独立して選択され、
R7は、C1-3アルキル、C2-3アルケニル、及びHからなる群から選択され、
R8は、C3-6炭素環及びヘテロ環からなる群から選択され、
R9は、H、CN、NO2、C1-6アルキル、-OR、-S(O)2R、-S(O)2N(R)2、C2-6アルケニル、C3-6炭素環及びヘテロ環からなる群から選択され、
Rはそれぞれ、C1-3アルキル、C2-3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
R’はそれぞれ、C1-18アルキル、C2-18アルケニル、-R*YR”、-YR”、及びHからなる群から独立して選択され、
R”はそれぞれ、C3-14アルキル及びC3-14アルケニルからなる群から独立して選択され、
R*はそれぞれ、C1-12アルキル及びC2-12アルケニルからなる群から独立して選択され、
Yはそれぞれ、独立してC3-6炭素環であり、
Xはそれぞれ、F、Cl、Br、及びIからなる群から独立して選択され、mは、5、6、7、8、9、10、11、12、及び13から選択される)
またはその塩もしくは立体異性体を含む。
いくつかの実施形態では、式(I)の化合物のサブセットは、
R1が、C5-20アルキル、C5-20アルケニル、-R*YR”、-YR”、及び-R”M’R’からなる群から選択され、
R2及びR3が、H、C1-14アルキル、C2-14アルケニル、-R*YR”、-YR”、及び-R*OR”からなる群から独立して選択されるか、またはR2及びR3が、それらが結合している原子と一緒になってヘテロ環もしくは炭素環を形成し、
R4が、C3-6炭素環、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR、-CQ(R)2、及び非置換C1-6アルキルからなる群から選択され、Qが、炭素環、ヘテロ環、-OR、-O(CH2)nN(R)2、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX3、-CX2H、-CXH2、-CN、-N(R)2、-C(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(S)N(R)2、及び-C(R)N(R)2C(O)ORから選択され、nのそれぞれが、1、2、3、4、及び5から独立して選択され、
R5がそれぞれ、C1-3アルキル、C2-3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
R6がそれぞれ、C1-3アルキル、C2-3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
M及びM’が、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、アリ-ル基、及びヘテロアリ-ル基から独立して選択され、
R7が、C1-3アルキル、C2-3アルケニル、及びHからなる群から選択され、
Rがそれぞれ、C1-3アルキル、C2-3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
R’がそれぞれ、C1-18アルキル、C2-18アルケニル、-R*YR”、-YR”、及びHからなる群から独立して選択され、
R”がそれぞれ、C3-14アルキル及びC3-14アルケニルからなる群から独立して選択され、
R*がそれぞれ、C1-12アルキル及びC2-12アルケニルからなる群から独立して選択され、
Yがそれぞれ、独立してC3-6炭素環であり、
Xがそれぞれ、F、Cl、Br、及びIからなる群から独立して選択され、mが、5、6、7、8、9、10、11、12、及び13から選択される、化合物
またはその塩もしくは立体異性体を含み、ここで、アルキル基及びアルケニル基は、直鎖または分岐鎖であってよい。
R1が、C5-20アルキル、C5-20アルケニル、-R*YR”、-YR”、及び-R”M’R’からなる群から選択され、
R2及びR3が、H、C1-14アルキル、C2-14アルケニル、-R*YR”、-YR”、及び-R*OR”からなる群から独立して選択されるか、またはR2及びR3が、それらが結合している原子と一緒になってヘテロ環もしくは炭素環を形成し、
R4が、C3-6炭素環、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR、-CQ(R)2、及び非置換C1-6アルキルからなる群から選択され、Qが、炭素環、ヘテロ環、-OR、-O(CH2)nN(R)2、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX3、-CX2H、-CXH2、-CN、-N(R)2、-C(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(S)N(R)2、及び-C(R)N(R)2C(O)ORから選択され、nのそれぞれが、1、2、3、4、及び5から独立して選択され、
R5がそれぞれ、C1-3アルキル、C2-3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
R6がそれぞれ、C1-3アルキル、C2-3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
M及びM’が、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、アリ-ル基、及びヘテロアリ-ル基から独立して選択され、
R7が、C1-3アルキル、C2-3アルケニル、及びHからなる群から選択され、
Rがそれぞれ、C1-3アルキル、C2-3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
R’がそれぞれ、C1-18アルキル、C2-18アルケニル、-R*YR”、-YR”、及びHからなる群から独立して選択され、
R”がそれぞれ、C3-14アルキル及びC3-14アルケニルからなる群から独立して選択され、
R*がそれぞれ、C1-12アルキル及びC2-12アルケニルからなる群から独立して選択され、
Yがそれぞれ、独立してC3-6炭素環であり、
Xがそれぞれ、F、Cl、Br、及びIからなる群から独立して選択され、mが、5、6、7、8、9、10、11、12、及び13から選択される、化合物
またはその塩もしくは立体異性体を含み、ここで、アルキル基及びアルケニル基は、直鎖または分岐鎖であってよい。
いくつかの実施形態では、式(I)の化合物のサブセットは、R4が、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR、または-CQ(R)2であるとき、(i)nが、1、2、3、4、もしくは5であるとき、Qが、-N(R)2ではない化合物、または(ii)nが、1もしくは2であるとき、Qが、5員、6員、もしくは7員のヘテロシクロアルキルではない化合物を含む。
いくつかの実施形態では、式(I)の化合物の別のサブセットは、
R1が、C5-30アルキル、C5-20アルケニル、-R*YR”、-YR”、及び-R”M’R’からなる群から選択され、
R2及びR3が、H、C1-14アルキル、C2-14アルケニル、-R*YR”、-YR”、及び-R*OR”からなる群から独立して選択されるか、またはR2及びR3が、それらが結合している原子と一緒になってヘテロ環もしくは炭素環を形成し、
R4が、C3-6炭素環、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR、-CQ(R)2、及び非置換C1-6アルキルからなる群から選択され、Qが、C3-6炭素環、N、O、及びSから選択される1つまたは複数のヘテロ原子を有する5~14員のヘテロアリ-ル、-OR、-O(CH2)nN(R)2、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX3、-CX2H、-CXH2、-CN、-C(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(S)N(R)2、-CRN(R)2C(O)OR、-N(R)R8、-O(CH2)nOR、-N(R)C(=NR9)N(R)2、-N(R)C(=CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、-N(OR)C(O)R、-N(OR)S(O)2R、-N(OR)C(O)OR、-N(OR)C(O)N(R)2、-N(OR)C(S)N(R)2、-N(OR)C(=NR9)N(R)2、-N(OR)C(=CHR9)N(R)2、-C(=NR9)N(R)2、-C(=NR9)R、-C(O)N(R)OR、ならびにオキソ(=O)、OH、アミノ、及びC1-3アルキルから選択される1つまたは複数の置換基で置換されており、N、O、及びSから選択される1つまたは複数のヘテロ原子を有する5~14員のヘテロシクロアルキルから選択され、nがそれぞれ、1、2、3、4、及び5から独立して選択され、
R5がそれぞれ、C1-3アルキル、C2-3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
R6がそれぞれ、C1-3アルキル、C2-3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
M及びM’は、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、-S-S-、アリ-ル基、及びヘテロアリ-ル基から独立して選択され、
R7が、C1-3アルキル、C2-3アルケニル、及びHからなる群から選択され、
R8が、C3-6炭素環及びヘテロ環からなる群から選択され、
R9が、H、CN、NO2、C1-6アルキル、-OR、-S(O)2R、-S(O)2N(R)2、C2-6アルケニル、C3-6炭素環及びヘテロ環からなる群から選択され、
Rがそれぞれ、C1-3アルキル、C2-3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
R’がそれぞれ、C1-18アルキル、C2-18アルケニル、-R*YR”、-YR”、及びHからなる群から独立して選択され、
R”がそれぞれ、C3-14アルキル及びC3-14アルケニルからなる群から独立して選択され、
R*がそれぞれ、C1-12アルキル及びC2-12アルケニルからなる群から独立して選択され、
Yがそれぞれ、独立してC3-6炭素環であり、
Xがそれぞれ、F、Cl、Br、及びIからなる群から独立して選択され、
mが、5、6、7、8、9、10、11、12、及び13から選択される、化合物
またはその塩もしくは立体異性体を含む。
R1が、C5-30アルキル、C5-20アルケニル、-R*YR”、-YR”、及び-R”M’R’からなる群から選択され、
R2及びR3が、H、C1-14アルキル、C2-14アルケニル、-R*YR”、-YR”、及び-R*OR”からなる群から独立して選択されるか、またはR2及びR3が、それらが結合している原子と一緒になってヘテロ環もしくは炭素環を形成し、
R4が、C3-6炭素環、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR、-CQ(R)2、及び非置換C1-6アルキルからなる群から選択され、Qが、C3-6炭素環、N、O、及びSから選択される1つまたは複数のヘテロ原子を有する5~14員のヘテロアリ-ル、-OR、-O(CH2)nN(R)2、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX3、-CX2H、-CXH2、-CN、-C(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(S)N(R)2、-CRN(R)2C(O)OR、-N(R)R8、-O(CH2)nOR、-N(R)C(=NR9)N(R)2、-N(R)C(=CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、-N(OR)C(O)R、-N(OR)S(O)2R、-N(OR)C(O)OR、-N(OR)C(O)N(R)2、-N(OR)C(S)N(R)2、-N(OR)C(=NR9)N(R)2、-N(OR)C(=CHR9)N(R)2、-C(=NR9)N(R)2、-C(=NR9)R、-C(O)N(R)OR、ならびにオキソ(=O)、OH、アミノ、及びC1-3アルキルから選択される1つまたは複数の置換基で置換されており、N、O、及びSから選択される1つまたは複数のヘテロ原子を有する5~14員のヘテロシクロアルキルから選択され、nがそれぞれ、1、2、3、4、及び5から独立して選択され、
R5がそれぞれ、C1-3アルキル、C2-3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
R6がそれぞれ、C1-3アルキル、C2-3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
M及びM’は、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、-S-S-、アリ-ル基、及びヘテロアリ-ル基から独立して選択され、
R7が、C1-3アルキル、C2-3アルケニル、及びHからなる群から選択され、
R8が、C3-6炭素環及びヘテロ環からなる群から選択され、
R9が、H、CN、NO2、C1-6アルキル、-OR、-S(O)2R、-S(O)2N(R)2、C2-6アルケニル、C3-6炭素環及びヘテロ環からなる群から選択され、
Rがそれぞれ、C1-3アルキル、C2-3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
R’がそれぞれ、C1-18アルキル、C2-18アルケニル、-R*YR”、-YR”、及びHからなる群から独立して選択され、
R”がそれぞれ、C3-14アルキル及びC3-14アルケニルからなる群から独立して選択され、
R*がそれぞれ、C1-12アルキル及びC2-12アルケニルからなる群から独立して選択され、
Yがそれぞれ、独立してC3-6炭素環であり、
Xがそれぞれ、F、Cl、Br、及びIからなる群から独立して選択され、
mが、5、6、7、8、9、10、11、12、及び13から選択される、化合物
またはその塩もしくは立体異性体を含む。
いくつかの実施形態では、式(I)の化合物の別のサブセットは、
R1が、C5-30アルキル、C5-20アルケニル、-R*YR”、-YR”、及び-R”M’R’からなる群から選択され、
R2及びR3が、H、C1-14アルキル、C2-14アルケニル、-R*YR”、-YR”、及び-R*OR”からなる群から独立して選択されるか、またはR2及びR3は、それらが結合している原子と一緒になってヘテロ環もしくは炭素環を形成し、
R4が、C3-6炭素環、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR、-CQ(R)2、及び非置換C1-6アルキルからなる群から選択され、Qが、C3-6炭素環、N、O、及びSから選択される1つまたは複数のヘテロ原子を有する5~14員のヘテロ環、-OR、-O(CH2)nN(R)2、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX3、-CX2H、-CXH2、-CN、-C(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(S)N(R)2、-CRN(R)2C(O)OR、-N(R)R8、-O(CH2)nOR、-N(R)C(=NR9)N(R)2、-N(R)C(=CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、-N(OR)C(O)R、-N(OR)S(O)2R、-N(OR)C(O)OR、-N(OR)C(O)N(R)2、-N(OR)C(S)N(R)2、-N(OR)C(=NR9)N(R)2、-N(OR)C(=CHR9)N(R)2、-C(=NR9)R、-C(O)N(R)OR、及び-C(=NR9)N(R)2から選択され、nがそれぞれ、1、2、3、4、及び5から独立して選択され、Qが、5~14員のヘテロ環であり、かつ(i)R4が、-(CH2)nQ(nは、1もしくは2である)であるか、または(ii)R4が、-(CH2)nCHQR(nは、1である)であるか、または(iii)R4が、-CHQR、及び-CQ(R)2であるとき、Qが、5~14員のヘテロアリ-ル、もしくは8~14員のヘテロシクロアルキルのいずれかであり、
R5がそれぞれ、C1-3アルキル、C2-3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
R6がそれぞれ、C1-3アルキル、C2-3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
M及びM’が、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、-S-S-、アリ-ル基、及びヘテロアリ-ル基から独立して選択され、
R7が、C1-3アルキル、C2-3アルケニル、及びHからなる群から選択され、
R8が、C3-6炭素環及びヘテロ環からなる群から選択され、
R9が、H、CN、NO2、C1-6アルキル、-OR、-S(O)2R、-S(O)2N(R)2、C2-6アルケニル、C3-6炭素環及びヘテロ環からなる群から選択され、
Rがそれぞれ、C1-3アルキル、C2-3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
R’がそれぞれ、C1-18アルキル、C2-18アルケニル、-R*YR”、-YR”、及びHからなる群から独立して選択され、
R”がそれぞれ、C3-14アルキル及びC3-14アルケニルからなる群から独立して選択され、
R*がそれぞれ、C1-12アルキル及びC2-12アルケニルからなる群から独立して選択され、
Yがそれぞれ、独立してC3-6炭素環であり、
Xがそれぞれ、F、Cl、Br、及びIからなる群から独立して選択され、
mが、5、6、7、8、9、10、11、12、及び13から選択される、化合物
またはその塩もしくは異性体を含む。
R1が、C5-30アルキル、C5-20アルケニル、-R*YR”、-YR”、及び-R”M’R’からなる群から選択され、
R2及びR3が、H、C1-14アルキル、C2-14アルケニル、-R*YR”、-YR”、及び-R*OR”からなる群から独立して選択されるか、またはR2及びR3は、それらが結合している原子と一緒になってヘテロ環もしくは炭素環を形成し、
R4が、C3-6炭素環、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR、-CQ(R)2、及び非置換C1-6アルキルからなる群から選択され、Qが、C3-6炭素環、N、O、及びSから選択される1つまたは複数のヘテロ原子を有する5~14員のヘテロ環、-OR、-O(CH2)nN(R)2、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX3、-CX2H、-CXH2、-CN、-C(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(S)N(R)2、-CRN(R)2C(O)OR、-N(R)R8、-O(CH2)nOR、-N(R)C(=NR9)N(R)2、-N(R)C(=CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、-N(OR)C(O)R、-N(OR)S(O)2R、-N(OR)C(O)OR、-N(OR)C(O)N(R)2、-N(OR)C(S)N(R)2、-N(OR)C(=NR9)N(R)2、-N(OR)C(=CHR9)N(R)2、-C(=NR9)R、-C(O)N(R)OR、及び-C(=NR9)N(R)2から選択され、nがそれぞれ、1、2、3、4、及び5から独立して選択され、Qが、5~14員のヘテロ環であり、かつ(i)R4が、-(CH2)nQ(nは、1もしくは2である)であるか、または(ii)R4が、-(CH2)nCHQR(nは、1である)であるか、または(iii)R4が、-CHQR、及び-CQ(R)2であるとき、Qが、5~14員のヘテロアリ-ル、もしくは8~14員のヘテロシクロアルキルのいずれかであり、
R5がそれぞれ、C1-3アルキル、C2-3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
R6がそれぞれ、C1-3アルキル、C2-3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
M及びM’が、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、-S-S-、アリ-ル基、及びヘテロアリ-ル基から独立して選択され、
R7が、C1-3アルキル、C2-3アルケニル、及びHからなる群から選択され、
R8が、C3-6炭素環及びヘテロ環からなる群から選択され、
R9が、H、CN、NO2、C1-6アルキル、-OR、-S(O)2R、-S(O)2N(R)2、C2-6アルケニル、C3-6炭素環及びヘテロ環からなる群から選択され、
Rがそれぞれ、C1-3アルキル、C2-3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
R’がそれぞれ、C1-18アルキル、C2-18アルケニル、-R*YR”、-YR”、及びHからなる群から独立して選択され、
R”がそれぞれ、C3-14アルキル及びC3-14アルケニルからなる群から独立して選択され、
R*がそれぞれ、C1-12アルキル及びC2-12アルケニルからなる群から独立して選択され、
Yがそれぞれ、独立してC3-6炭素環であり、
Xがそれぞれ、F、Cl、Br、及びIからなる群から独立して選択され、
mが、5、6、7、8、9、10、11、12、及び13から選択される、化合物
またはその塩もしくは異性体を含む。
いくつかの実施形態では、式(I)の化合物の別のサブセットは、
R1が、C5-30アルキル、C5-20アルケニル、-R*YR”、-YR”、及び-R”M’R’からなる群から選択され、
R2及びR3が、H、C1-14アルキル、C2-14アルケニル、-R*YR”、-YR”、及び-R*OR”からなる群から独立して選択されるか、またはR2及びR3が、それらが結合している原子と一緒になってヘテロ環もしくは炭素環を形成し、
R4が、C3-6炭素環、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR、-CQ(R)2、及び非置換C1-6アルキルからなる群から選択され、Qが、C3-6炭素環、N、O、及びSから選択される1つまたは複数のヘテロ原子を有する5~14員のヘテロアリ-ル、-OR、-O(CH2)nN(R)2、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX3、-CX2H、-CXH2、-CN、-C(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(S)N(R)2、-CRN(R)2C(O)OR、-N(R)R8、-O(CH2)nOR、-N(R)C(=NR9)N(R)2、-N(R)C(=CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、-N(OR)C(O)R、-N(OR)S(O)2R、-N(OR)C(O)OR、-N(OR)C(O)N(R)2、-N(OR)C(S)N(R)2、-N(OR)C(=NR9)N(R)2、-N(OR)C(=CHR9)N(R)2、-C(=NR9)R、-C(O)N(R)OR、ならびに-C(=NR9)N(R)2、ならびにオキソ(=O)、OH、アミノ、及びC1-3アルキルから選択される1つまたは複数の置換基で置換されており、N、O、及びSから選択される1つまたは複数のヘテロ原子を有する5~14員のヘテロシクロアルキルから選択され、nがそれぞれ、1、2、3、4、及び5から独立して選択され、
R5がそれぞれ、C1-3アルキル、C2-3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
R6がそれぞれ、C1-3アルキル、C2-3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
M及びM’が、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、アリ-ル基、及びヘテロアリ-ル基から独立して選択され、
R7が、C1-3アルキル、C2-3アルケニル、及びHからなる群から選択され、
R8が、C3-6炭素環及びヘテロ環からなる群から選択され、
R9が、H、CN、NO2、C1-6アルキル、-OR、-S(O)2R、-S(O)2N(R)2、C2-6アルケニル、C3-6炭素環及びヘテロ環からなる群から選択され、
Rがそれぞれ、C1-3アルキル、C2-3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
R’がそれぞれ、C1-18アルキル、C2-18アルケニル、-R*YR”、-YR”、及びHからなる群から独立して選択され、
R”がそれぞれ、C3-14アルキル及びC3-14アルケニルからなる群から独立して選択され、
R*がそれぞれ、C1-12アルキル及びC2-12アルケニルからなる群から独立して選択され、
Yがそれぞれ、独立してC3-6炭素環であり、
Xがそれぞれ、F、Cl、Br、及びIからなる群から独立して選択され、
mが、5、6、7、8、9、10、11、12、及び13から選択される、化合物
またはその塩もしくは異性体を含む。
R1が、C5-30アルキル、C5-20アルケニル、-R*YR”、-YR”、及び-R”M’R’からなる群から選択され、
R2及びR3が、H、C1-14アルキル、C2-14アルケニル、-R*YR”、-YR”、及び-R*OR”からなる群から独立して選択されるか、またはR2及びR3が、それらが結合している原子と一緒になってヘテロ環もしくは炭素環を形成し、
R4が、C3-6炭素環、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR、-CQ(R)2、及び非置換C1-6アルキルからなる群から選択され、Qが、C3-6炭素環、N、O、及びSから選択される1つまたは複数のヘテロ原子を有する5~14員のヘテロアリ-ル、-OR、-O(CH2)nN(R)2、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX3、-CX2H、-CXH2、-CN、-C(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(S)N(R)2、-CRN(R)2C(O)OR、-N(R)R8、-O(CH2)nOR、-N(R)C(=NR9)N(R)2、-N(R)C(=CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、-N(OR)C(O)R、-N(OR)S(O)2R、-N(OR)C(O)OR、-N(OR)C(O)N(R)2、-N(OR)C(S)N(R)2、-N(OR)C(=NR9)N(R)2、-N(OR)C(=CHR9)N(R)2、-C(=NR9)R、-C(O)N(R)OR、ならびに-C(=NR9)N(R)2、ならびにオキソ(=O)、OH、アミノ、及びC1-3アルキルから選択される1つまたは複数の置換基で置換されており、N、O、及びSから選択される1つまたは複数のヘテロ原子を有する5~14員のヘテロシクロアルキルから選択され、nがそれぞれ、1、2、3、4、及び5から独立して選択され、
R5がそれぞれ、C1-3アルキル、C2-3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
R6がそれぞれ、C1-3アルキル、C2-3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
M及びM’が、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、アリ-ル基、及びヘテロアリ-ル基から独立して選択され、
R7が、C1-3アルキル、C2-3アルケニル、及びHからなる群から選択され、
R8が、C3-6炭素環及びヘテロ環からなる群から選択され、
R9が、H、CN、NO2、C1-6アルキル、-OR、-S(O)2R、-S(O)2N(R)2、C2-6アルケニル、C3-6炭素環及びヘテロ環からなる群から選択され、
Rがそれぞれ、C1-3アルキル、C2-3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
R’がそれぞれ、C1-18アルキル、C2-18アルケニル、-R*YR”、-YR”、及びHからなる群から独立して選択され、
R”がそれぞれ、C3-14アルキル及びC3-14アルケニルからなる群から独立して選択され、
R*がそれぞれ、C1-12アルキル及びC2-12アルケニルからなる群から独立して選択され、
Yがそれぞれ、独立してC3-6炭素環であり、
Xがそれぞれ、F、Cl、Br、及びIからなる群から独立して選択され、
mが、5、6、7、8、9、10、11、12、及び13から選択される、化合物
またはその塩もしくは異性体を含む。
いくつかの実施形態では、式(I)の化合物の別のサブセットは、
R1が、C5-20アルキル、C5-20アルケニル、-R*YR”、-YR”、及び-R”M’R’からなる群から選択され、
R2及びR3が、H、C1-14アルキル、C2-14アルケニル、-R*YR”、-YR”、及び-R*OR”からなる群から独立して選択されるか、またはR2及びR3が、それらが結合している原子と一緒になってヘテロ環もしくは炭素環を形成し、
R4が、C3-6炭素環、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR、-CQ(R)2、及び非置換C1-6アルキルからなる群から選択され、Qが、C3-6炭素環、N、O、及びSから選択される1つまたは複数のヘテロ原子を有する5~14員のヘテロ環、-OR、-O(CH2)nN(R)2、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX3、-CX2H、-CXH2、-CN、-C(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(S)N(R)2、-CRN(R)2C(O)OR、-N(R)R8、-O(CH2)nOR、-N(R)C(=NR9)N(R)2、-N(R)C(=CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、-N(OR)C(O)R、-N(OR)S(O)2R、-N(OR)C(O)OR、-N(OR)C(O)N(R)2、-N(OR)C(S)N(R)2、-N(OR)C(=NR9)N(R)2、-N(OR)C(=CHR9)N(R)2、-C(=NR9)R、-C(O)N(R)OR、-N(R)2及び-C(=NR9)N(R)2から選択され、nがそれぞれ、1、2、3、4、及び5から独立して選択され、Qが、5~14員のヘテロ環であり、かつ(i)R4が、-(CH2)nQ(nは、1もしくは2である)であるか、または(ii)R4が、-(CH2)nCHQR(nは、1である)であるか、または(iii)R4が、-CHQR、及び-CQ(R)2であるとき、Qが、5~14員のヘテロアリ-ル、もしくは8~14員のヘテロシクロアルキルのいずれかであり、
R5がそれぞれ、C1-3アルキル、C2-3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
R6がそれぞれ、C1-3アルキル、C2-3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
M及びM’は、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、-S-S-、アリ-ル基、及びヘテロアリ-ル基から独立して選択され、
R7が、C1-3アルキル、C2-3アルケニル、及びHからなる群から選択され、
R8が、C3-6炭素環及びヘテロ環からなる群から選択され、
R9が、H、CN、NO2、C1-6アルキル、-OR、-S(O)2R、-S(O)2N(R)2、C2-6アルケニル、C3-6炭素環及びヘテロ環からなる群から選択され、
Rがそれぞれ、C1-3アルキル、C2-3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
R’がそれぞれ、C1-18アルキル、C2-18アルケニル、-R*YR”、-YR、-YR”、及びHからなる群から独立して選択され、
R”がそれぞれ、C3-14アルキル及びC3-14アルケニルからなる群から独立して選択され、
R*がそれぞれ、C1-12アルキル、C1-12アルケニル、及びC2-12アルケニルからなる群から独立して選択され、
Yがそれぞれ、独立してC3-6炭素環であり、
Xがそれぞれ、F、Cl、Br、及びIからなる群から独立して選択され、
mが、5、6、7、8、9、10、11、12、及び13から選択される、化合物
またはその塩もしくは立体異性体を含む。
R1が、C5-20アルキル、C5-20アルケニル、-R*YR”、-YR”、及び-R”M’R’からなる群から選択され、
R2及びR3が、H、C1-14アルキル、C2-14アルケニル、-R*YR”、-YR”、及び-R*OR”からなる群から独立して選択されるか、またはR2及びR3が、それらが結合している原子と一緒になってヘテロ環もしくは炭素環を形成し、
R4が、C3-6炭素環、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR、-CQ(R)2、及び非置換C1-6アルキルからなる群から選択され、Qが、C3-6炭素環、N、O、及びSから選択される1つまたは複数のヘテロ原子を有する5~14員のヘテロ環、-OR、-O(CH2)nN(R)2、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX3、-CX2H、-CXH2、-CN、-C(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(S)N(R)2、-CRN(R)2C(O)OR、-N(R)R8、-O(CH2)nOR、-N(R)C(=NR9)N(R)2、-N(R)C(=CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、-N(OR)C(O)R、-N(OR)S(O)2R、-N(OR)C(O)OR、-N(OR)C(O)N(R)2、-N(OR)C(S)N(R)2、-N(OR)C(=NR9)N(R)2、-N(OR)C(=CHR9)N(R)2、-C(=NR9)R、-C(O)N(R)OR、-N(R)2及び-C(=NR9)N(R)2から選択され、nがそれぞれ、1、2、3、4、及び5から独立して選択され、Qが、5~14員のヘテロ環であり、かつ(i)R4が、-(CH2)nQ(nは、1もしくは2である)であるか、または(ii)R4が、-(CH2)nCHQR(nは、1である)であるか、または(iii)R4が、-CHQR、及び-CQ(R)2であるとき、Qが、5~14員のヘテロアリ-ル、もしくは8~14員のヘテロシクロアルキルのいずれかであり、
R5がそれぞれ、C1-3アルキル、C2-3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
R6がそれぞれ、C1-3アルキル、C2-3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
M及びM’は、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、-S-S-、アリ-ル基、及びヘテロアリ-ル基から独立して選択され、
R7が、C1-3アルキル、C2-3アルケニル、及びHからなる群から選択され、
R8が、C3-6炭素環及びヘテロ環からなる群から選択され、
R9が、H、CN、NO2、C1-6アルキル、-OR、-S(O)2R、-S(O)2N(R)2、C2-6アルケニル、C3-6炭素環及びヘテロ環からなる群から選択され、
Rがそれぞれ、C1-3アルキル、C2-3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
R’がそれぞれ、C1-18アルキル、C2-18アルケニル、-R*YR”、-YR、-YR”、及びHからなる群から独立して選択され、
R”がそれぞれ、C3-14アルキル及びC3-14アルケニルからなる群から独立して選択され、
R*がそれぞれ、C1-12アルキル、C1-12アルケニル、及びC2-12アルケニルからなる群から独立して選択され、
Yがそれぞれ、独立してC3-6炭素環であり、
Xがそれぞれ、F、Cl、Br、及びIからなる群から独立して選択され、
mが、5、6、7、8、9、10、11、12、及び13から選択される、化合物
またはその塩もしくは立体異性体を含む。
さらにいくつかの実施形態では、式(I)の化合物の別のサブセットは、
R1が、C5-20アルキル、C5-20アルケニル、-R*YR”、-YR”、及び-R”M’R’からなる群から選択され、
R2及びR3が、H、C1-14アルキル、C2-14アルケニル、-R*YR”、-YR”、及び-R*OR”からなる群から独立して選択されるか、またはR2及びR3が、それらが結合している原子と一緒になってヘテロ環もしくは炭素環を形成し、
R4が、C3-6炭素環、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR、-CQ(R)2、及び非置換C1-6アルキルからなる群から選択され、Qが、-N(R)2、C3-6炭素環、N、O、及びSから選択される1つまたは複数のヘテロ原子を有する5~14員のヘテロ環、-OR、-O(CH2)nN(R)2、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX3、-CX2H、-CXH2、-CN、-C(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(S)N(R)2、-CRN(R)2C(O)ORから選択され、nがそれぞれ、1、2、3、4、及び5から独立して選択され、Qが、5~14員のヘテロ環であり、かつ(i)R4が、-(CH2)nQ(nは、1もしくは2である)であるか、または(ii)R4が、-(CH2)nCHQR(nは、1である)であるか、または(iii)R4が、-CHQR、及び-CQ(R)2であるとき、Qが、5~14員のヘテロアリール、もしくは8~14員のヘテロシクロアルキルのいずれかであり、
R5がそれぞれ、C1-3アルキル、C2-3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
R6がそれぞれ、C1-3アルキル、C2-3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
M及びM’が、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、アリ-ル基、及びヘテロアリ-ル基から独立して選択され、
R7が、C1-3アルキル、C2-3アルケニル、及びHからなる群から選択され、
Rがそれぞれ、C1-3アルキル、C2-3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
R’がそれぞれ、C1-18アルキル、C2-18アルケニル、-R*YR”、-YR”、及びHからなる群から独立して選択され、
R”がそれぞれ、C3-14アルキル及びC3-14アルケニルからなる群から独立して選択され、
R*がそれぞれ、C1-12アルキル及びC2-12アルケニルからなる群から独立して選択され、
Yがそれぞれ、独立してC3-6炭素環であり、
Xがそれぞれ、F、Cl、Br、及びIからなる群から独立して選択され、
mが、5、6、7、8、9、10、11、12、及び13から選択される、化合物
またはその塩もしくは立体異性体を含む。
R1が、C5-20アルキル、C5-20アルケニル、-R*YR”、-YR”、及び-R”M’R’からなる群から選択され、
R2及びR3が、H、C1-14アルキル、C2-14アルケニル、-R*YR”、-YR”、及び-R*OR”からなる群から独立して選択されるか、またはR2及びR3が、それらが結合している原子と一緒になってヘテロ環もしくは炭素環を形成し、
R4が、C3-6炭素環、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR、-CQ(R)2、及び非置換C1-6アルキルからなる群から選択され、Qが、-N(R)2、C3-6炭素環、N、O、及びSから選択される1つまたは複数のヘテロ原子を有する5~14員のヘテロ環、-OR、-O(CH2)nN(R)2、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX3、-CX2H、-CXH2、-CN、-C(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(S)N(R)2、-CRN(R)2C(O)ORから選択され、nがそれぞれ、1、2、3、4、及び5から独立して選択され、Qが、5~14員のヘテロ環であり、かつ(i)R4が、-(CH2)nQ(nは、1もしくは2である)であるか、または(ii)R4が、-(CH2)nCHQR(nは、1である)であるか、または(iii)R4が、-CHQR、及び-CQ(R)2であるとき、Qが、5~14員のヘテロアリール、もしくは8~14員のヘテロシクロアルキルのいずれかであり、
R5がそれぞれ、C1-3アルキル、C2-3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
R6がそれぞれ、C1-3アルキル、C2-3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
M及びM’が、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、アリ-ル基、及びヘテロアリ-ル基から独立して選択され、
R7が、C1-3アルキル、C2-3アルケニル、及びHからなる群から選択され、
Rがそれぞれ、C1-3アルキル、C2-3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
R’がそれぞれ、C1-18アルキル、C2-18アルケニル、-R*YR”、-YR”、及びHからなる群から独立して選択され、
R”がそれぞれ、C3-14アルキル及びC3-14アルケニルからなる群から独立して選択され、
R*がそれぞれ、C1-12アルキル及びC2-12アルケニルからなる群から独立して選択され、
Yがそれぞれ、独立してC3-6炭素環であり、
Xがそれぞれ、F、Cl、Br、及びIからなる群から独立して選択され、
mが、5、6、7、8、9、10、11、12、及び13から選択される、化合物
またはその塩もしくは立体異性体を含む。
さらにいくつかの実施形態では、式(I)の化合物の別のサブセットは、
R1が、C5-30アルキル、C5-20アルケニル、-R*YR”、-YR”、及び-R”M’R’からなる群から選択され、
R2及びR3が、H、C1-14アルキル、C2-14アルケニル、-R*YR”、-YR”、及び-R*OR”からなる群から独立して選択されるか、またはR2及びR3が、それらが結合している原子と一緒になってヘテロ環もしくは炭素環を形成し、
R4が、C3-6炭素環、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR、-CQ(R)2、及び非置換C1-6アルキルからなる群から選択され、Qが、C3-6炭素環、N、O、及びSから選択される1つまたは複数のヘテロ原子を有する5~14員のヘテロアリ-ル、-OR、-O(CH2)nN(R)2、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX3、-CX2H、-CXH2、-CN、-C(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(S)N(R)2、-CRN(R)2C(O)OR、-N(R)R8、-O(CH2)nOR、-N(R)C(=NR9)N(R)2、-N(R)C(=CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、-N(OR)C(O)R、-N(OR)S(O)2R、-N(OR)C(O)OR、-N(OR)C(O)N(R)2、-N(OR)C(S)N(R)2、-N(OR)C(=NR9)N(R)2、-N(OR)C(=CHR9)N(R)2、-C(=NR9)R、-C(O)N(R)OR、及び-C(=NR9)N(R)2から選択され、nがそれぞれ、1、2、3、4、及び5から独立して選択され、
R5がそれぞれ、C1-3アルキル、C2-3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
R6がそれぞれ、C1-3アルキル、C2-3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
M及びM’が、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、-S-S-、アリ-ル基、及びヘテロアリ-ル基から独立して選択され、
R7が、C1-3アルキル、C2-3アルケニル、及びHからなる群から選択され、
R8が、C3-6炭素環及びヘテロ環からなる群から選択され、
R9が、H、CN、NO2、C1-6アルキル、-OR、-S(O)2R、-S(O)2N(R)2、C2-6アルケニル、C3-6炭素環及びヘテロ環からなる群から選択され、
Rがそれぞれ、C1-3アルキル、C2-3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
R’がそれぞれ、C1-18アルキル、C2-18アルケニル、-R*YR”、-YR”、及びHからなる群から独立して選択され、
R”がそれぞれ、C3-14アルキル及びC3-14アルケニルからなる群から独立して選択され、
R*がそれぞれ、C1-12アルキル及びC2-12アルケニルからなる群から独立して選択され、
Yがそれぞれ、独立してC3-6炭素環であり、
Xがそれぞれ、F、Cl、Br、及びIからなる群から独立して選択され、
mが、5、6、7、8、9、10、11、12、及び13から選択される、化合物
またはその塩もしくは立体異性体を含む。
R1が、C5-30アルキル、C5-20アルケニル、-R*YR”、-YR”、及び-R”M’R’からなる群から選択され、
R2及びR3が、H、C1-14アルキル、C2-14アルケニル、-R*YR”、-YR”、及び-R*OR”からなる群から独立して選択されるか、またはR2及びR3が、それらが結合している原子と一緒になってヘテロ環もしくは炭素環を形成し、
R4が、C3-6炭素環、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR、-CQ(R)2、及び非置換C1-6アルキルからなる群から選択され、Qが、C3-6炭素環、N、O、及びSから選択される1つまたは複数のヘテロ原子を有する5~14員のヘテロアリ-ル、-OR、-O(CH2)nN(R)2、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX3、-CX2H、-CXH2、-CN、-C(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(S)N(R)2、-CRN(R)2C(O)OR、-N(R)R8、-O(CH2)nOR、-N(R)C(=NR9)N(R)2、-N(R)C(=CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、-N(OR)C(O)R、-N(OR)S(O)2R、-N(OR)C(O)OR、-N(OR)C(O)N(R)2、-N(OR)C(S)N(R)2、-N(OR)C(=NR9)N(R)2、-N(OR)C(=CHR9)N(R)2、-C(=NR9)R、-C(O)N(R)OR、及び-C(=NR9)N(R)2から選択され、nがそれぞれ、1、2、3、4、及び5から独立して選択され、
R5がそれぞれ、C1-3アルキル、C2-3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
R6がそれぞれ、C1-3アルキル、C2-3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
M及びM’が、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、-S-S-、アリ-ル基、及びヘテロアリ-ル基から独立して選択され、
R7が、C1-3アルキル、C2-3アルケニル、及びHからなる群から選択され、
R8が、C3-6炭素環及びヘテロ環からなる群から選択され、
R9が、H、CN、NO2、C1-6アルキル、-OR、-S(O)2R、-S(O)2N(R)2、C2-6アルケニル、C3-6炭素環及びヘテロ環からなる群から選択され、
Rがそれぞれ、C1-3アルキル、C2-3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
R’がそれぞれ、C1-18アルキル、C2-18アルケニル、-R*YR”、-YR”、及びHからなる群から独立して選択され、
R”がそれぞれ、C3-14アルキル及びC3-14アルケニルからなる群から独立して選択され、
R*がそれぞれ、C1-12アルキル及びC2-12アルケニルからなる群から独立して選択され、
Yがそれぞれ、独立してC3-6炭素環であり、
Xがそれぞれ、F、Cl、Br、及びIからなる群から独立して選択され、
mが、5、6、7、8、9、10、11、12、及び13から選択される、化合物
またはその塩もしくは立体異性体を含む。
いくつかの実施形態では、式(I)の化合物の別のサブセットは、
R1が、C5-20アルキル、C5-20アルケニル、-R*YR”、-YR”、及び-R”M’R’からなる群から選択され、
R2及びR3が、H、C1-14アルキル、C2-14アルケニル、-R*YR”、-YR”、及び-R*OR”からなる群から独立して選択されるか、またはR2及びR3が、それらが結合している原子と一緒になってヘテロ環もしくは炭素環を形成し、
R4が、C3-6炭素環、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR、-CQ(R)2、及び非置換C1-6アルキルからなる群から選択され、Qが、C3-6炭素環、N、O、及びSから選択される1つまたは複数のヘテロ原子を有する5~14員のヘテロアリ-ル、-OR、-O(CH2)nN(R)2、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX3、-CX2H、-CXH2、-CN、-C(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(S)N(R)2、-CRN(R)2C(O)ORから選択され、nがそれぞれ、1、2、3、4、及び5から独立して選択され、
R5がそれぞれ、C1-3アルキル、C2-3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
R6がそれぞれ、C1-3アルキル、C2-3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
M及びM’が、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、アリ-ル基、及びヘテロアリ-ル基から独立して選択され、
R7が、C1-3アルキル、C2-3アルケニル、及びHからなる群から選択され、
Rがそれぞれ、C1-3アルキル、C2-3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
R’がそれぞれ、C1-18アルキル、C2-18アルケニル、-R*YR”、-YR”、及びHからなる群から独立して選択され、
R”がそれぞれ、C3-14アルキル及びC3-14アルケニルからなる群から独立して選択され、
R*がそれぞれ、C1-12アルキル及びC2-12アルケニルからなる群から独立して選択され、
Yがそれぞれ、独立してC3-6炭素環であり、
Xがそれぞれ、F、Cl、Br、及びIからなる群から独立して選択され、
mが、5、6、7、8、9、10、11、12、及び13から選択される、化合物
またはその塩もしくは立体異性体を含む。
R1が、C5-20アルキル、C5-20アルケニル、-R*YR”、-YR”、及び-R”M’R’からなる群から選択され、
R2及びR3が、H、C1-14アルキル、C2-14アルケニル、-R*YR”、-YR”、及び-R*OR”からなる群から独立して選択されるか、またはR2及びR3が、それらが結合している原子と一緒になってヘテロ環もしくは炭素環を形成し、
R4が、C3-6炭素環、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR、-CQ(R)2、及び非置換C1-6アルキルからなる群から選択され、Qが、C3-6炭素環、N、O、及びSから選択される1つまたは複数のヘテロ原子を有する5~14員のヘテロアリ-ル、-OR、-O(CH2)nN(R)2、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX3、-CX2H、-CXH2、-CN、-C(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(S)N(R)2、-CRN(R)2C(O)ORから選択され、nがそれぞれ、1、2、3、4、及び5から独立して選択され、
R5がそれぞれ、C1-3アルキル、C2-3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
R6がそれぞれ、C1-3アルキル、C2-3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
M及びM’が、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、アリ-ル基、及びヘテロアリ-ル基から独立して選択され、
R7が、C1-3アルキル、C2-3アルケニル、及びHからなる群から選択され、
Rがそれぞれ、C1-3アルキル、C2-3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
R’がそれぞれ、C1-18アルキル、C2-18アルケニル、-R*YR”、-YR”、及びHからなる群から独立して選択され、
R”がそれぞれ、C3-14アルキル及びC3-14アルケニルからなる群から独立して選択され、
R*がそれぞれ、C1-12アルキル及びC2-12アルケニルからなる群から独立して選択され、
Yがそれぞれ、独立してC3-6炭素環であり、
Xがそれぞれ、F、Cl、Br、及びIからなる群から独立して選択され、
mが、5、6、7、8、9、10、11、12、及び13から選択される、化合物
またはその塩もしくは立体異性体を含む。
さらにいくつかの実施形態では、式(I)の化合物の別のサブセットは、
R1が、C5-30アルキル、C5-20アルケニル、-R*YR”、-YR”、及び-R”M’R’からなる群から選択され、
R2及びR3が、H、C2-14アルキル、C2-14アルケニル、-R*YR”、-YR”、及び-R*OR”からなる群から独立して選択されるか、またはR2及びR3が、それらが結合している原子と一緒になってヘテロ環もしくは炭素環を形成し、
R4が、-(CH2)nQまたは-(CH2)nCHQRであり、Qが、-N(R)2であり、nが、3、4、及び5から選択され、
R5がそれぞれ、C1-3アルキル、C2-3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
R6がそれぞれ、C1-3アルキル、C2-3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
M及びM’が、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、-S-S-、アリ-ル基、及びヘテロアリ-ル基から独立して選択され、
R7が、C1-3アルキル、C2-3アルケニル、及びHからなる群から選択され、
Rがそれぞれ、C1-3アルキル、C2-3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
R’がそれぞれ、C1-18アルキル、C2-18アルケニル、-R*YR”、-YR”、及びHからなる群から独立して選択され、
R”がそれぞれ、C3-14アルキル及びC3-14アルケニルからなる群から独立して選択され、
R*がそれぞれ、C1-12アルキル及びC1-12アルケニルからなる群から独立して選択され、
Yがそれぞれ、独立してC3-6炭素環であり、
Xがそれぞれ、F、Cl、Br、及びIからなる群から独立して選択され、
mが、5、6、7、8、9、10、11、12、及び13から選択される、化合物
またはその塩もしくは立体異性体を含む。
R1が、C5-30アルキル、C5-20アルケニル、-R*YR”、-YR”、及び-R”M’R’からなる群から選択され、
R2及びR3が、H、C2-14アルキル、C2-14アルケニル、-R*YR”、-YR”、及び-R*OR”からなる群から独立して選択されるか、またはR2及びR3が、それらが結合している原子と一緒になってヘテロ環もしくは炭素環を形成し、
R4が、-(CH2)nQまたは-(CH2)nCHQRであり、Qが、-N(R)2であり、nが、3、4、及び5から選択され、
R5がそれぞれ、C1-3アルキル、C2-3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
R6がそれぞれ、C1-3アルキル、C2-3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
M及びM’が、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、-S-S-、アリ-ル基、及びヘテロアリ-ル基から独立して選択され、
R7が、C1-3アルキル、C2-3アルケニル、及びHからなる群から選択され、
Rがそれぞれ、C1-3アルキル、C2-3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
R’がそれぞれ、C1-18アルキル、C2-18アルケニル、-R*YR”、-YR”、及びHからなる群から独立して選択され、
R”がそれぞれ、C3-14アルキル及びC3-14アルケニルからなる群から独立して選択され、
R*がそれぞれ、C1-12アルキル及びC1-12アルケニルからなる群から独立して選択され、
Yがそれぞれ、独立してC3-6炭素環であり、
Xがそれぞれ、F、Cl、Br、及びIからなる群から独立して選択され、
mが、5、6、7、8、9、10、11、12、及び13から選択される、化合物
またはその塩もしくは立体異性体を含む。
さらにいくつかの実施形態では、式(I)の化合物の別のサブセットは、
R1が、C5-20アルキル、C5-20アルケニル、-R*YR”、-YR”、及び-R”M’R’からなる群から選択され、
R2及びR3が、H、C2-14アルキル、C2-14アルケニル、-R*YR”、-YR”、及び-R*OR”からなる群から独立して選択されるか、またはR2及びR3が、それらが結合している原子と一緒になってヘテロ環もしくは炭素環を形成し、
R4が、-(CH2)nQまたは-(CH2)nCHQRであり、Qが、-N(R)2であり、nが、3、4、及び5から選択され、
R5がそれぞれ、C1-3アルキル、C2-3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
R6がそれぞれ、C1-3アルキル、C2-3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
M及びM’が、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、アリ-ル基、及びヘテロアリ-ル基から独立して選択され、
R7が、C1-3アルキル、C2-3アルケニル、及びHからなる群から選択され、
Rがそれぞれ、C1-3アルキル、C2-3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
R’がそれぞれ、C1-18アルキル、C2-18アルケニル、-R*YR”、-YR”、及びHからなる群から独立して選択され、
R”がそれぞれ、C3-14アルキル及びC3-14アルケニルからなる群から独立して選択され、
R*がそれぞれ、C1-12アルキル及びC1-12アルケニルからなる群から独立して選択され、
Yがそれぞれ、独立してC3-6炭素環であり、
Xがそれぞれ、F、Cl、Br、及びIからなる群から独立して選択され、
mが、5、6、7、8、9、10、11、12、及び13から選択される、化合物
またはその塩もしくは立体異性体を含む。
R1が、C5-20アルキル、C5-20アルケニル、-R*YR”、-YR”、及び-R”M’R’からなる群から選択され、
R2及びR3が、H、C2-14アルキル、C2-14アルケニル、-R*YR”、-YR”、及び-R*OR”からなる群から独立して選択されるか、またはR2及びR3が、それらが結合している原子と一緒になってヘテロ環もしくは炭素環を形成し、
R4が、-(CH2)nQまたは-(CH2)nCHQRであり、Qが、-N(R)2であり、nが、3、4、及び5から選択され、
R5がそれぞれ、C1-3アルキル、C2-3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
R6がそれぞれ、C1-3アルキル、C2-3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
M及びM’が、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、アリ-ル基、及びヘテロアリ-ル基から独立して選択され、
R7が、C1-3アルキル、C2-3アルケニル、及びHからなる群から選択され、
Rがそれぞれ、C1-3アルキル、C2-3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
R’がそれぞれ、C1-18アルキル、C2-18アルケニル、-R*YR”、-YR”、及びHからなる群から独立して選択され、
R”がそれぞれ、C3-14アルキル及びC3-14アルケニルからなる群から独立して選択され、
R*がそれぞれ、C1-12アルキル及びC1-12アルケニルからなる群から独立して選択され、
Yがそれぞれ、独立してC3-6炭素環であり、
Xがそれぞれ、F、Cl、Br、及びIからなる群から独立して選択され、
mが、5、6、7、8、9、10、11、12、及び13から選択される、化合物
またはその塩もしくは立体異性体を含む。
さらに他の実施形態では、式(I)の化合物の別のサブセットは、
R1が、C5-30アルキル、C5-20アルケニル、-R*YR”、-YR”、及び-R”M’R’からなる群から選択され、
R2及びR3が、C1-14アルキル、C2-14アルケニル、-R*YR”、-YR”、及び-R*OR”からなる群から独立して選択されるか、またはR2及びR3が、それらが結合している原子と一緒になってヘテロ環もしくは炭素環を形成し、
R4が、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR、及び-CQ(R)2からなる群から選択され、Qが、-N(R)2であり、nが、1、2、3、4、及び5から選択され、
R5がそれぞれ、C1-3アルキル、C2-3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
R6がそれぞれ、C1-3アルキル、C2-3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
M及びM’が、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、-S-S-、アリ-ル基、及びヘテロアリ-ル基から独立して選択され、
R7が、C1-3アルキル、C2-3アルケニル、及びHからなる群から選択され、
Rがそれぞれ、C1-3アルキル、C2-3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
R’がそれぞれ、C1-18アルキル、C2-18アルケニル、-R*YR”、-YR”、及びHからなる群から独立して選択され、
R”がそれぞれ、C3-14アルキル及びC3-14アルケニルからなる群から独立して選択され、
R*がそれぞれ、C1-12アルキル及びC1-12アルケニルからなる群から独立して選択され、
Yがそれぞれ、独立してC3-6炭素環であり、
Xがそれぞれ、F、Cl、Br、及びIからなる群から独立して選択され、
mが、5、6、7、8、9、10、11、12、及び13から選択される、化合物
またはその塩もしくは立体異性体を含む。
R1が、C5-30アルキル、C5-20アルケニル、-R*YR”、-YR”、及び-R”M’R’からなる群から選択され、
R2及びR3が、C1-14アルキル、C2-14アルケニル、-R*YR”、-YR”、及び-R*OR”からなる群から独立して選択されるか、またはR2及びR3が、それらが結合している原子と一緒になってヘテロ環もしくは炭素環を形成し、
R4が、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR、及び-CQ(R)2からなる群から選択され、Qが、-N(R)2であり、nが、1、2、3、4、及び5から選択され、
R5がそれぞれ、C1-3アルキル、C2-3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
R6がそれぞれ、C1-3アルキル、C2-3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
M及びM’が、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、-S-S-、アリ-ル基、及びヘテロアリ-ル基から独立して選択され、
R7が、C1-3アルキル、C2-3アルケニル、及びHからなる群から選択され、
Rがそれぞれ、C1-3アルキル、C2-3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
R’がそれぞれ、C1-18アルキル、C2-18アルケニル、-R*YR”、-YR”、及びHからなる群から独立して選択され、
R”がそれぞれ、C3-14アルキル及びC3-14アルケニルからなる群から独立して選択され、
R*がそれぞれ、C1-12アルキル及びC1-12アルケニルからなる群から独立して選択され、
Yがそれぞれ、独立してC3-6炭素環であり、
Xがそれぞれ、F、Cl、Br、及びIからなる群から独立して選択され、
mが、5、6、7、8、9、10、11、12、及び13から選択される、化合物
またはその塩もしくは立体異性体を含む。
さらに他の実施形態では、式(I)の化合物の別のサブセットは、
R1が、C5-20アルキル、C5-20アルケニル、-R*YR”、-YR”、及び-R”M’R’からなる群から選択され、
R2及びR3が、C1-14アルキル、C2-14アルケニル、-R*YR”、-YR”、及び-R*OR”からなる群から独立して選択されるか、またはR2及びR3が、それらが結合している原子と一緒になってヘテロ環もしくは炭素環を形成し、
R4が、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR、及び-CQ(R)2からなる群から選択され、Qが、-N(R)2であり、nが、1、2、3、4、及び5から選択され、
R5がそれぞれ、C1-3アルキル、C2-3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
R6がそれぞれ、C1-3アルキル、C2-3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
M及びM’が、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、アリ-ル基、及びヘテロアリ-ル基から独立して選択され、
R7が、C1-3アルキル、C2-3アルケニル、及びHからなる群から選択され、
Rがそれぞれ、C1-3アルキル、C2-3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
R’がそれぞれ、C1-18アルキル、C2-18アルケニル、-R*YR”、-YR”、及びHからなる群から独立して選択され、
R”がそれぞれ、C3-14アルキル及びC3-14アルケニルからなる群から独立して選択され、
R*がそれぞれ、C1-12アルキル及びC1-12アルケニルからなる群から独立して選択され、
Yがそれぞれ、独立してC3-6炭素環であり、
Xがそれぞれ、F、Cl、Br、及びIからなる群から独立して選択され、
mが、5、6、7、8、9、10、11、12、及び13から選択される、化合物
またはその塩もしくは立体異性体を含む。
R1が、C5-20アルキル、C5-20アルケニル、-R*YR”、-YR”、及び-R”M’R’からなる群から選択され、
R2及びR3が、C1-14アルキル、C2-14アルケニル、-R*YR”、-YR”、及び-R*OR”からなる群から独立して選択されるか、またはR2及びR3が、それらが結合している原子と一緒になってヘテロ環もしくは炭素環を形成し、
R4が、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR、及び-CQ(R)2からなる群から選択され、Qが、-N(R)2であり、nが、1、2、3、4、及び5から選択され、
R5がそれぞれ、C1-3アルキル、C2-3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
R6がそれぞれ、C1-3アルキル、C2-3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
M及びM’が、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、アリ-ル基、及びヘテロアリ-ル基から独立して選択され、
R7が、C1-3アルキル、C2-3アルケニル、及びHからなる群から選択され、
Rがそれぞれ、C1-3アルキル、C2-3アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
R’がそれぞれ、C1-18アルキル、C2-18アルケニル、-R*YR”、-YR”、及びHからなる群から独立して選択され、
R”がそれぞれ、C3-14アルキル及びC3-14アルケニルからなる群から独立して選択され、
R*がそれぞれ、C1-12アルキル及びC1-12アルケニルからなる群から独立して選択され、
Yがそれぞれ、独立してC3-6炭素環であり、
Xがそれぞれ、F、Cl、Br、及びIからなる群から独立して選択され、
mが、5、6、7、8、9、10、11、12、及び13から選択される、化合物
またはその塩もしくは立体異性体を含む。
ある特定の実施形態では、式(I)の化合物のサブセットは、式(IA)の化合物:
(式中、lは、1、2、3、4、及び5から選択され、mは、5、6、7、8、及び9から選択され、M1は、単結合またはM’であり、R4は、非置換C1-3アルキル、または-(CH2)nQであり、Qは、OH、-NHC(S)N(R)2、-NHC(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)R8、-NHC(=NR9)N(R)2、-NHC(=CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、ヘテロアリ-ル、またはヘテロシクロアルキルであり、M及びM’は、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-P(O)(OR’)O-、-S-S-、アリ-ル基、及びヘテロアリ-ル基から独立して選択され、
R2及びR3は、H、C1-14アルキル、及びC2-14アルケニルからなる群から独立して選択される)またはその塩もしくは立体異性体を含む。
R2及びR3は、H、C1-14アルキル、及びC2-14アルケニルからなる群から独立して選択される)またはその塩もしくは立体異性体を含む。
いくつかの実施形態では、式(I)の化合物のサブセットは、式(IA)、式(II)の化合物、またはその塩もしくは立体異性体
(式中、
lは、1、2、3、4、及び5から選択され、mは、5、6、7、8、及び9から選択され、
M1は、単結合またはM’であり、
R4は、非置換C1-3アルキル、または-(CH2)nQであり、Qは、OH、-NHC(S)N(R)2、または-NHC(O)N(R)2であり、
M及びM’は、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-P(O)(OR’)O-、アリ-ル基、及びヘテロアリ-ル基から独立して選択され、
R2及びR3は、H、C1-14アルキル、及びC2-14アルケニルからなる群から独立して選択される)を含む。
(式中、
lは、1、2、3、4、及び5から選択され、mは、5、6、7、8、及び9から選択され、
M1は、単結合またはM’であり、
R4は、非置換C1-3アルキル、または-(CH2)nQであり、Qは、OH、-NHC(S)N(R)2、または-NHC(O)N(R)2であり、
M及びM’は、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-P(O)(OR’)O-、アリ-ル基、及びヘテロアリ-ル基から独立して選択され、
R2及びR3は、H、C1-14アルキル、及びC2-14アルケニルからなる群から独立して選択される)を含む。
ある特定の実施形態では、式(I)の化合物のサブセットは、式(II)の化合物:
またはその塩もしくは立体異性体(式中、lは、1、2、3、4、及び5から選択され、M1は、単結合またはM’であり、R4は、非置換C1-3アルキル、または-(CH2)nQであり、nは、2、3、または4であり、Qは、OH、-NHC(S)N(R)2、-NHC(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)R8、-NHC(=NR9)N(R)2、-NHC(=CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、ヘテロアリ-ル、またはヘテロシクロアルキルであり、M及びM’は、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-P(O)(OR’)O-、-S-S-、アリ-ル基、及びヘテロアリ-ル基から独立して選択され、
R2及びR3は、H、C1-14アルキル、及びC2-14アルケニルからなる群から独立して選択される)を含む。
R2及びR3は、H、C1-14アルキル、及びC2-14アルケニルからなる群から独立して選択される)を含む。
いくつかの実施形態では、式(I)の化合物のサブセットは、式(II)の化合物、またはその塩もしくは立体異性体(式中、
lは、1、2、3、4、及び5から選択され、
M1は、単結合またはM’であり、
R4は、非置換C1-3アルキル、または-(CH2)nQであり、nは、2、3、または4であり、Qは、OH、-NHC(S)N(R)2、または-NHC(O)N(R)2であり、
M及びM’は、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-P(O)(OR’)O-、アリ-ル基、及びヘテロアリ-ル基から独立して選択され、
R2及びR3は、H、C1-14アルキル、及びC2-14アルケニルからなる群から独立して選択される)を含む。
lは、1、2、3、4、及び5から選択され、
M1は、単結合またはM’であり、
R4は、非置換C1-3アルキル、または-(CH2)nQであり、nは、2、3、または4であり、Qは、OH、-NHC(S)N(R)2、または-NHC(O)N(R)2であり、
M及びM’は、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-P(O)(OR’)O-、アリ-ル基、及びヘテロアリ-ル基から独立して選択され、
R2及びR3は、H、C1-14アルキル、及びC2-14アルケニルからなる群から独立して選択される)を含む。
いくつかの実施形態では、式(I)の化合物は、式(IIa)、
またはその塩(式中、R4は、上記のとおりである)のものである。
いくつかの実施形態では、式(I)の化合物は、式(IIb)の化合物
またはその塩(式中、R4は、上記のとおりである)のものである。
いくつかの実施形態では、式(I)の化合物は、式(IIc)の化合物
またはその塩(式中、R4は、上記のとおりである)のものである。
いくつかの実施形態では、式(I)の化合物は、式(IIe)の化合物:
またはその塩(式中、R4は、上記のとおりである)のものである。
いくつかの実施形態では、式(IIa)、(IIb)、(IIc)、または(IIe)の化合物は、(CH2)nQ及び(CH2)nCHQRから選択されるR4を含み、Q、R及びnは、上に定義するとおりである。
いくつかの実施形態では、Qは、-OR、-OH、-O(CH2)nN(R)2、-OC(O)R、-CX3、-CN、-N(R)C(O)R、-N(H)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(H)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(H)C(O)N(R)2、-N(H)C(O)N(H)(R)、-N(R)C(S)N(R)2、-N(H)C(S)N(R)2、-N(H)C(S)N(H)(R)、及びヘテロ環からなる群から選択され、Rは、上に定義するとおりである。いくつかの態様では、nは、1または2である。いくつかの実施形態では、Qは、OH、-NHC(S)N(R)2、または-NHC(O)N(R)2である。
いくつかの実施形態では、式(I)の化合物は、式(IId)の化合物
またはその塩もしくは異性体(式中、nは、2、3、または4であり、m、R’、R”、及びR2~R6は、上に定義するとおりである)である。例えば、R2及びR3のそれぞれは、C5-14アルキル及びC5-14アルケニルからなる群から独立して選択され得、nは、2、3、及び4から選択され、R’、R”、R5、R6及びmは、上に定義するとおりである。
式(IId)の化合物のいくつかの態様では、R2は、C8アルキルである。式(IId)の化合物のいくつかの態様では、R3は、C5-C9アルキルである。式(IId)の化合物のいくつかの態様では、mは、5、7、または9である。式(IId)の化合物のいくつかの態様では、R5はそれぞれ、Hである。式(IId)の化合物のいくつかの態様では、R6はそれぞれ、Hである。
別の態様では、本出願は、(1)式(I)を有する化合物と、(2)任意選択でヘルパー脂質(例えば、リン脂質)と、(3)任意選択で構造脂質(例えば、ステロール)と、(4)任意選択で脂質複合体(例えば、PEG脂質)と、を含む、脂質組成物(例えば、脂質ナノ粒子(LNP))を提供する。例示の実施形態では、脂質組成物(例えば、LNP)は、1つまたは複数の癌エピトープポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、例えば、脂質組成物に封入されたポリヌクレオチドをさらに含む。
本明細書で使用されるとき、「アルキル」または「アルキル基」という用語は、1個または複数の炭素原子(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個またはそれより多い炭素原子)を含む、直鎖または分岐鎖の飽和炭化水素を意味する。
「C1-14アルキル」という表記は、1~14個の炭素原子を含む、直鎖または分岐鎖の飽和炭化水素を意味する。アルキル基は、任意選択で置換されてもよい。
本明細書で使用されるとき、「アルケニル」または「アルケニル基」という用語は、2個またはそれ以上の炭素原子(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個またはそれより多い炭素原子)及び少なくとも1つの二重結合を含む、直鎖または分岐鎖の炭化水素を意味する。
「C2-14アルケニル」という表記は、2~14個の炭素原子及び少なくとも1つの二重結合を含む、直鎖または分岐鎖の炭化水素を意味する。アルケニル基は、1、2、3、4またはそれ以上の二重結合を含み得る。例えば、C18アルケニルは、1つまたは複数の二重結合を含み得る。2つの二重結合を含むC18アルケニル基は、リノレイル基であり得る。アルケニル基は、任意選択で置換されてもよい。
本明細書で使用されるとき、「炭素環」または「炭素環式基」という用語は、炭素原子の1つまたは複数の環を含む、単環系または多環系を意味する。環は、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、または15員環であり得る。
「C3-6炭素環」という表記は、3~6個の炭素原子を有する単環を含む、炭素環を意味する。炭素環は、1つまたは複数の二重結合を含み得、芳香族であり得る(例えば、アリール基)。炭素環の例には、シクロプロピル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、フェニル基、ナフチル基及び1,2-ジヒドロナフチル基が挙げられる。炭素環は、任意選択で置換されてもよい。
本明細書で使用されるとき、「ヘテロ環」または「複素環基」という用語は、1つまたは複数の環を含み、少なくとも1つの環は、少なくとも1つのヘテロ原子を含む、単環系または多環系を意味する。ヘテロ原子は、例えば、窒素、酸素または硫黄原子であり得る。環は、3、4、5、6、7、8、9、10、11、または12員環であり得る。ヘテロ環は、1つまたは複数の二重結合を含み得、芳香族であり得る(例えば、ヘテロアリール基)。ヘテロ環の例には、イミダゾリル、イミダゾリジニル、オキサゾリル、オキサゾリジニル、チアゾリル、チアゾリジニル、ピラゾリジニル、ピラゾリル、イソオキサゾリジニル、イソオキサゾリル、イソチアゾリジニル、イソチアゾリル、モルホリニル、ピロリル、ピロリジニル、フリル、テトラヒドロフリル、チオフェニル、ピリジニル、ピペリジニル、キノリル、及びイソキノリル基が挙げられる。ヘテロ環は、任意選択で置換されてもよい。
本明細書で使用されるとき、「生分解性基」は、対象において脂質のより速い代謝を促進することができる基である。生分解性基は、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、アリール基、及びヘテロアリール基であり得るが、これらに限定されない。
本明細書で使用されるとき、「アリール基」は、1つまたは複数の芳香環を含む、炭素環式基である。アリール基の例には、フェニル基及びナフチル基が挙げられる。
本明細書で使用されるとき、「ヘテロアリール基」は、1つまたは複数の芳香環を含む、ヘテロ環基である。ヘテロアリール基の例には、ピロリル、フリル、チオフェニル、イミダゾリル、オキサゾリル、及びチアゾリルが挙げられる。アリール基及びヘテロアリール基はいずれも任意選択で置換されてもよい。例えば、M及びM’は、任意選択で置換されたフェニル、オキサゾール、及びチアゾールからなる非限定的な群から選択することができる。本明細書の式において、M及びM’は、上記の生分解性基の一覧から独立して選択することができる。
アルキル基、アルケニル基、及びシクリル基(例えば、カルボシクリル及びヘテロシクリル)は、特に指定されない限り、任意選択で置換されてもよい。任意の置換基は、限定するものではないが、ハロゲン原子(例えば、塩素、臭素、フッ素、またはヨウ素の基)、カルボン酸(例えば、-C(O)OH)、アルコール(例えば、ヒドロキシル、-OH)、エステル(例えば、-C(O)ORまたは-OC(O)R)、アルデヒド(例えば、-C(O)H)、カルボニル(例えば、-C(O)R、あるいはC=Oと表される)、酸ハロゲン化物(例えば、-C(O)X、式中、Xは、臭素、フッ素、塩素、及びヨウ素から選択されるハライド)、炭酸塩(例えば、-OC(O)OR)、アルコキシ(例えば、-OR)、アセタール(例えば、-C(OR)2R””、式中、ORはそれぞれ同じであっても異なってもよいアルコキシ基であり、R””は、アルキル基またはアルケニル基である)、リン酸塩(例えば、P(O)4
3-)、チオール(例えば、-SH)、スルホキシド(例えば、-S(O)R)、スルフィン酸(例えば、-S(O)OH)、スルホン酸(例えば、-S(O)2OH)、チアール(例えば、-C(S)H)、硫酸塩(例えば、S(O)4
2-)、スルホニル(例えば、-S(O)2-)、アミド(例えば、-C(O)NR2、または-N(R)C(O)R)、アジド(例えば、-N3)、ニトロ(例えば、-NO2)、シアノ(例えば、-CN)、イソシアノ(例えば、-NC)、アシルオキシ(例えば、-OC(O)R)、アミノ(例えば、-NR2、-NRH、または-NH2)、カルバモイル(例えば、-OC(O)NR2、-OC(O)NRH、または-OC(O)NH2)、スルホンアミド(例えば、-S(O)2NR2、-S(O)2NRH、-S(O)2NH2、-N(R)S(O)2R、-N(H)S(O)2R、-N(R)S(O)2H、または-N(H)S(O)2H)、アルキル基、アルケニル基、及びシクリル(例えば、カルボシクリルまたはヘテロシクリル)基からなる群から選択することができる。
前述のいずれにおいても、Rは、本明細書に定義される、アルキル基またはアルケニル基である。いくつかの実施形態では、置換基自体も、例えば、本明細書で定義される1、2、3、4、5、または6つの置換基でさらに置換されてもよい。例えば、C1-6アルキル基は、本明細書で定義される1、2、3、4、5、または6つの置換基でさらに置換されてもよい。
式(I)、(IA)、(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)、及び(IIe)のいずれか1つの化合物は、該当する場合、以下の特徴のうちの1つまたは複数を含む。
いくつかの実施形態では、R4は、C3-6炭素環、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR、及び-CQ(R)2からなる群から選択され、Qは、C3-6炭素環、N、O、S、及びPから選択される1つまたは複数のヘテロ原子を有する5~14員の芳香族または非芳香族ヘテロ環、-OR、-O(CH2)nN(R)2、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX3、-CX2H、-CXH2、-CN、-N(R)2、-C(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(S)N(R)2、及び-C(R)N(R)2C(O)ORから選択され、nはそれぞれ、1、2、3、4、及び5から独立して選択される。
別の実施形態では、R4は、C3-6炭素環、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR、及び-CQ(R)2からなる群から選択され、Qが、C3-6炭素環、N、O、及びSから選択される1つまたは複数のヘテロ原子を有する5~14員のヘテロアリ-ル、-OR、-O(CH2)nN(R)2、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX3、-CX2H、-CXH2、-CN、-C(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(S)N(R)2、-C(R)N(R)2C(O)OR、ならびにオキソ(=O)、OH、アミノ、及びC1-3アルキルから選択される1つまたは複数の置換基で置換されており、N、O、及びSから選択される1つまたは複数のヘテロ原子を有する5~14員のヘテロシクロアルキルから選択され、nはそれぞれ、1、2、3、4、及び5から独立して選択される。
別の実施形態では、R4は、C3-6炭素環、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR、及び-CQ(R)2からなる群から選択され、Qは、C3-6炭素環、N、O、及びSから選択される1つまたは複数のヘテロ原子を有する5~14員のヘテロ環、-OR、-O(CH2)nN(R)2、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX3、-CX2H、-CXH2、-CN、-C(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(S)N(R)2、-C(R)N(R)2C(O)ORから選択され、nはそれぞれ、1、2、3、4、及び5から独立して選択され、Qが、5~14員のヘテロ環であり、かつ(i)R4が、-(CH2)nQ(nは、1もしくは2である)であるか、または(ii)R4が、-(CH2)nCHQR(nは、1である)であるか、または(iii)R4が、-CHQR、及び-CQ(R)2であるとき、Qが、5~14員のヘテロアリール、もしくは8~14員のヘテロシクロアルキルのいずれかである。
別の実施形態では、R4は、C3-6炭素環、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR、及び-CQ(R)2からなる群から選択され、Qは、C3-6炭素環、N、O、及びSから選択される1つまたは複数のヘテロ原子を有する5~14員のヘテロアリール、-OR、-O(CH2)nN(R)2、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX3、-CX2H、-CXH2、-CN、-C(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(S)N(R)2、-C(R)N(R)2C(O)ORから選択され、nはそれぞれ、1、2、3、4、及び5から独立して選択される。
別の実施形態では、R4は、非置換C1-4アルキル、例えば、非置換メチルである。
ある特定の実施形態では、本開示は、式(I)を有する化合物(式中、R4は、-(CH2)nQまたは-(CH2)nCHQRであり、Qは、-N(R)2であり、nは、3、4、及び5から選択される)を提供する。
ある特定の実施形態では、本開示は、式(I)を有する化合物(式中、R4は、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR、及び-CQ(R)2からなる群から選択され、Qは、-N(R)2であり、nは、1、2、3、4、及び5から選択される)を提供する。
ある特定の実施形態では、本開示は、式(I)を有する化合物(式中、R2及びR3は、C2-14アルキル、C2-14アルケニル、-R*YR”、-YR”、及び-R*OR”からなる群から独立して選択されるか、またはR2及びR3が、それらが結合している原子と一緒になってヘテロ環もしくは炭素環を形成し、R4は、-(CH2)nQまたは-(CH2)nCHQRであり、Qは、-N(R)2であり、nは、3、4、及び5から選択される)を提供する。
ある特定の実施形態では、R2及びR3は、C2-14アルキル、C2-14アルケニル、-R*YR”、-YR”、及び-R*OR”からなる群から独立して選択されるか、またはR2及びR3が、それらが結合している原子と一緒になってヘテロ環もしくは炭素環を形成する。
いくつかの実施形態では、R1は、C5-20アルキル及びC5-20アルケニルからなる群から選択される。
他の実施形態では、R1は、-R*YR”、-YR”、及び-R”M’R’からなる群から選択される。
ある特定の実施形態では、R1は、-R*YR”及び-YR”から選択される。いくつかの実施形態では、Yは、シクロプロピル基である。いくつかの実施形態では、R*は、C8アルキルまたはC8アルケニルである。ある特定の実施形態では、R”は、C3-12アルキルである。例えば、R”は、C3アルキルであり得る。例えば、R”は、C4-8アルキル(例えば、C4、C5、C6、C7、またはC8アルキル)であり得る。
いくつかの実施形態では、R1は、C5-20アルキルである。いくつかの実施形態では、R1は、C6アルキルである。いくつかの実施形態では、R1は、C8アルキルである。他の実施形態では、R1は、C9アルキルである。ある特定の実施形態では、R1は、C14アルキルである。他の実施形態では、R1は、C18アルキルである。
いくつかの実施形態では、R1は、C5-20アルケニルである。ある特定の実施形態では、R1は、C18アルケニルである。いくつかの実施形態では、R1は、リノレイルである。
ある特定の実施形態では、R1は、分枝鎖である(例えば、デカン-2-イル、ウンデカン-3-イル、ドデカン-4-イル、トリデカン-5-イル、テトラデカン-6-イル、2-メチルウンデカン-3-イル、2-メチルデカン-2-イル、3-メチルウンデカン-3-イル、4-メチルドデカン-4-イル、またはヘプタデカン-9-イル)。ある特定の実施形態では、R1は、
である。
ある特定の実施形態では、R1は、非置換C5-20アルキルまたはC5-20アルケニルである。ある特定の実施形態では、R’は、置換されたC5-20アルキルまたはC5-20アルケニル(例えば、1-シクロプロピルノニルなどの、C3-6炭素環での置換)である。
他の実施形態では、R1は、-R”M’R’である。
いくつかの実施形態では、R’は、-R*YR”及び-YR”から選択される。いくつかの実施形態では、Yは、C3-8シクロアルキルである。いくつかの実施形態では、Yは、C6-10アリ-ルである。いくつかの実施形態では、Yは、シクロプロピル基である。いくつかの実施形態では、Yは、シクロヘキシル基である。ある特定の実施形態では、R*は、C1アルキルである。
いくつかの実施形態では、R”は、C3-12アルキル及びC3-12アルケニルからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、Yに隣接するR”は、C1アルキルである。いくつかの実施形態では、Yに隣接するR”は、C4-9アルキル(例えば、C4、C5、C6、C7またはC8またはC9アルキル)である。
いくつかの実施形態では、R’は、C4アルキル及びC4アルケニルから選択される。ある特定の実施形態では、R’は、C5アルキル及びC5アルケニルから選択される。いくつかの実施形態では、R’は、C6アルキル及びC6アルケニルから選択される。いくつかの実施形態では、R’は、C7アルキル及びC7アルケニルから選択される。いくつかの実施形態では、R’は、C9アルキル及びC9アルケニルから選択される。
他の実施形態では、R’は、C11アルキル及びC11アルケニルから選択される。他の実施形態では、R’は、C12アルキル、C12アルケニル、C13アルキル、C13アルケニル、C14アルキル、C14アルケニル、C15アルキル、C15アルケニル、C16アルキル、C16アルケニル、C17アルキル、C17アルケニル、C18アルキル、及びC18アルケニルから選択される。ある特定の実施形態では、R’は、分枝鎖である(例えば、デカン-2-イル、ウンデカン-3-イル、ドデカン-4-イル、トリデカン-5-イル、テトラデカン-6-イル、2-メチルウンデカン-3-イル、2-メチルデカン-2-イル、3-メチルウンデカン-3-イル、4-メチルドデカン-4-イル、またはヘプタデカン-9-イル)。ある特定の実施形態では、R’は、
である。
ある特定の実施形態では、R’は、非置換C1-18アルキルである。ある特定の実施形態では、R’は、置換されたC1-18アルキル(例えば、1-シクロプロピルノニルなどの、C3-6炭素環で置換されたC1-15アルキル)である。
いくつかの実施形態では、R”は、C3-14アルキル及びC3-14アルケニルからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、R”は、C3アルキル、C4アルキル、C5アルキル、C6アルキル、C7アルキル、またはC8アルキルである。いくつかの実施形態では、R”は、C9アルキル、C10アルキル、C11アルキル、C12アルキル、C13アルキル、またはC14アルキルである。
いくつかの実施形態では、M’は、-C(O)O-である。いくつかの実施形態では、M’は、-OC(O)-である。
他の実施形態では、M’は、アリール基またはヘテロアリール基である。例えば、M’は、フェニル、オキサゾール、及びチアゾールからなる群から選択することができる。
いくつかの実施形態では、Mは、-C(O)O-である。いくつかの実施形態では、Mは、-OC(O)-である。いくつかの実施形態では、Mは、-C(O)N(R’)-である。いくつかの実施形態では、Mは、-P(O)(OR’)O-である。
他の実施形態では、Mは、アリール基またはヘテロアリール基である。例えば、Mは、フェニル、オキサゾール、及びチアゾールからなる群から選択することができる。
いくつかの実施形態では、Mは、M’と同じである。他の実施形態では、Mは、M’とは異なる。
いくつかの実施形態では、R5はそれぞれHである。ある特定のこのような実施形態では、R6もそれぞれHである。
いくつかの実施形態では、R7は、Hである。他の実施形態では、R7は、C1-3アルキル(例えば、メチル、エチル、プロピル、またはi-プロピル)である。
いくつかの実施形態では、R2及びR3は、独立してC5-14アルキルまたはC5-14アルケニルである。
いくつかの実施形態では、R2及びR3は、同じである。いくつかの実施形態では、R2及びR3は、C8アルキルである。ある特定の実施形態では、R2及びR3は、C2アルキルである。他の実施形態では、R2及びR3は、C3アルキルである。いくつかの実施形態では、R2及びR3は、C4アルキルである。ある特定の実施形態では、R2及びR3は、C5アルキルである。他の実施形態では、R2及びR3は、C6アルキルである。いくつかの実施形態では、R2及びR3は、C7アルキルである。
他の実施形態では、R2及びR3は、異なる。ある特定の実施形態では、R2は、C8アルキルである。いくつかの実施形態では、R3は、C1-7(例えば、C1、C2、C3、C4、C5、C6、またはC7アルキル)またはC9アルキルである。
いくつかの実施形態では、R7及びR3は、Hである。
ある特定の実施形態では、R2は、Hである。
いくつかの実施形態では、mは、5、7、または9である。
いくつかの実施形態では、R4は、-(CH2)nQ及び-(CH2)nCHQRから選択される。
いくつかの実施形態では、Qは、-OR、-OH、-O(CH2)nN(R)2、-OC(O)R、-CX3、-CN、-N(R)C(O)R、-N(H)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(H)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(H)C(O)N(R)2、-N(H)C(O)N(H)(R)、-N(R)C(S)N(R)2、-N(H)C(S)N(R)2、-N(H)C(S)N(H)(R)、-C(R)N(R)2C(O)OR、炭素環、及びヘテロ環からなる群から選択される。
ある特定の実施形態では、Qは、-OHである。
ある特定の実施形態では、Qは、置換または非置換の5~10員ヘテロアリールであり、例えば、Qは、イミダゾール、ピリミジン、プリン、2-アミノ-1,9-ジヒドロ-6H-プリン-6-オン-9-イル(もしくはグアニン-9-イル)、アデニン-9-イル、シトシン-1-イル、またはウラシル-1-イルである。ある特定の実施形態では、Qは、例えば、オキソ(=O)、OH、アミノ、及びC1-3アルキルから選択される1つまたは複数の置換基で置換された、置換5~14員ヘテロシクロアルキルである。例えば、Qは、4-メチルピペラジニル、4-(4-メトキシベンジル)ピペラジニル、またはイソインドリン-2-イル-1,3-ジオンである。
ある特定の実施形態では、Qは、非置換または置換のC6-10アリール(フェニルなど)またはC3-6シクロアルキルである。
いくつかの実施形態では、nは、1である。他の実施形態では、nは、2である。さらなる実施形態では、nは、3である。ある特定の他の実施形態では、nは、4である。例えば、R4は、-(CH2)2OHであり得る。例えば、R4は、-(CH2)3OHであり得る。例えば、R4は、-(CH2)4OHであり得る。例えば、R4は、ベンジルであり得る。例えば、R4は、4-メトキシベンジルであり得る。
いくつかの実施形態では、R4は、C3-6炭素環である。いくつかの実施形態では、R4は、C3-6シクロアルキルである。例えば、R4は、例えば、OH、ハロ、C1-6アルキルなどで任意選択で置換されたシクロヘキシルであり得る。例えば、R4は、2-ヒドロキシシクロヘキシルであり得る。
いくつかの実施形態では、Rは、Hである。
いくつかの実施形態では、Rは、非置換C1-3アルキルまたは非置換C2-3アルケニルである。例えば、R4は、-CH2CH(OH)CH3または-CH2CH(OH)CH2CH3であり得る。
いくつかの実施形態では、Rは、置換されたC1-3アルキル、例えば、CH2OHである。例えば、R4は、-CH2CH(OH)CH2OHであり得る。
いくつかの実施形態では、R2及びR3は、それらが結合している原子と一緒になってヘテロ環または炭素環を形成する。いくつかの実施形態では、R2及びR3は、それらが結合している原子と一緒になって、N、O、S、及びPから選択される1つまたは複数のヘテロ原子を有する5~14員の芳香族または非芳香族ヘテロ環を形成する。いくつかの実施形態では、R2及びR3は、それらが結合している原子と一緒になって、芳香族または非芳香族のいずれかである、任意選択で置換されたC3-20炭素環(例えば、C3-18炭素環、C3-15炭素環、C3-12炭素環、またはC3-10炭素環)を形成する。いくつかの実施形態では、R2及びR3は、それらが結合している原子と一緒になってC3-6炭素環を形成する。他の実施形態では、R2及びR3は、それらが結合している原子と一緒になって、シクロヘキシル基またはフェニル基などのC6炭素環を形成する。ある特定の実施形態では、ヘテロ環またはC3-6炭素環は、1つまたは複数のアルキル基で置換される(例えば、同じ環原子または隣接環原子もしくは非隣接環原子において)。例えば、R2及びR3は、それらが結合している原子と一緒になって、1つまたは複数のC5アルキル置換を有するシクロヘキシル基またはフェニル基を形成し得る。ある特定の実施形態では、R2及びR3によって形成されるヘテロ環またはC3-6炭素環は、炭素環基で置換される。例えば、R2及びR3は、それらが結合している原子と一緒になって、シクロヘキシルで置換されたシクロヘキシル基またはフェニル基を形成し得る。いくつかの実施形態では、R2及びR3は、それらが結合している原子と一緒になって、シクロヘプチル基、シクロペンタデカニル基、またはナフチル基などのC7-15炭素環を形成する。
いくつかの実施形態では、R4は、-(CH2)nQ及び-(CH2)nCHQRから選択される。いくつかの実施形態では、Qは、-OR、-OH、-O(CH2)nN(R)2、-OC(O)R、-CX3、-CN、-N(R)C(O)R、-N(H)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(H)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(H)C(O)N(R)2、-N(H)C(O)N(H)(R)、-N(R)C(S)N(R)2、-N(H)C(S)N(R)2、-N(H)C(S)N(H)(R)、及びヘテロ環からなる群から選択される。他の実施形態では、Qは、イミダゾール、ピリミジン、及びプリンからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、R2及びR3は、それらが結合している原子と一緒になってヘテロ環または炭素環を形成する。いくつかの実施形態では、R2及びR3は、それらが結合している原子と一緒になって、フェニル基などのC3-6炭素環を形成する。ある特定の実施形態では、ヘテロ環またはC3-6炭素環は、1つまたは複数のアルキル基で置換される(例えば、同じ環原子または隣接環原子もしくは非隣接環原子において)。例えば、R2及びR3は、それらが結合している原子と一緒になって、1つまたは複数のC5アルキル置換を有するフェニル基を形成し得る。
いくつかの実施形態では、式(I)の化合物のサブセットは、式(IIa)、(IIb)、(IIc)、もしくは(IIe)の化合物:
またはその塩もしくは異性体(式中、R4は、上記のとおりである)を含む。
いくつかの実施形態では、式(I)の化合物のサブセットは、式(IId)の化合物:
またはその塩もしくは異性体(式中、nは、2、3、または4であり、m、R’、R”、及びR2~R6は、上に定義するとおりである)を含む。例えば、R2及びR3のそれぞれは、C5-14アルキル及びC5-14アルケニルからなる群から独立して選択され得る。
いくつかの実施形態では、式(I)の化合物の本開示の医薬組成物は、
及びその塩または立体異性体からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、次の化合物:
またはその塩もしくは立体異性体を含む。
他の実施形態では、式(I)の化合物は、化合物1~化合物147、またはその塩もしくは立体異性体からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、中央のピペラジン部分を含むイオン化可能な脂質が提供される。本明細書に記載の脂質は、哺乳類の細胞または器官に治療剤及び/または予防剤を送達するための脂質ナノ粒子組成物に有利に使用することができる。例えば、本明細書に記載の脂質は、免疫原性がほとんどないか、まったくない。例えば、本明細書に開示の脂質化合物は、参照脂質(例えば、MC3、KC2、またはDLinDMA)と比較して、より低い免疫原性を有する。例えば、本明細書に開示の脂質及び治療剤または予防剤を含む製剤は、参照脂質(例えば、MC3、KC2、またはDLinDMA)及び同じ治療剤または予防剤を含む対応する製剤と比較して、治療指数が上昇する。
いくつかの実施形態では、送達剤は、式(III)を有する脂質化合物
またはその塩もしくは立体異性体(式中、
環Aは、
であり、
tは、1または2であり、
A1及びA2は、CHまたはNからそれぞれ独立して選択され、
Zは、CH2または非存在であり、ZがCH2であるとき、破線(1)及び(2)はそれぞれ単結合を表し、Zが非存在であるとき、破線(1)及び(2)は両方とも非存在であり、
R1、R2、R3、R4、及びR5は、C5-20アルキル、C5-20アルケニル、-R”MR’、-R*YR”、-YR”、及び-R*OR”からなる群から独立して選択され、
Mはそれぞれ、-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)O-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、アリール基、及びヘテロアリール基からなる群から独立して選択され、
X1、X2、及びX3は、単結合、-CH2-、-(CH2)2-、-CHR-、-CHY-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)-CH2-、-CH2-C(O)-、-C(O)O-CH2-、-OC(O)-CH2-、-CH2-C(O)O-、-CH2-OC(O)-、-CH(OH)-、-C(S)-、及び-CH(SH)-からなる群から独立して選択され、
Yはそれぞれ、独立してC3-6炭素環であり、
R*はそれぞれ、C1-12アルキル及びC2-12アルケニルからなる群から独立して選択され、
Rはそれぞれ、C1-3アルキル及びC3-6炭素環からなる群から独立して選択され、
R’はそれぞれ、C1-12アルキル、C2-12アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
R”はそれぞれ、C3-12アルキル及びC3-12アルケニルからなる群から独立して選択され、
環Aが
であるとき、
i)X1、X2、及びX3のうちの少なくとも1つは、-CH2-ではなく、及び/または
ii)R1、R2、R3、R4、及びR5のうちの少なくとも1つは、-R”MR’である)を含む。
環Aは、
tは、1または2であり、
A1及びA2は、CHまたはNからそれぞれ独立して選択され、
Zは、CH2または非存在であり、ZがCH2であるとき、破線(1)及び(2)はそれぞれ単結合を表し、Zが非存在であるとき、破線(1)及び(2)は両方とも非存在であり、
R1、R2、R3、R4、及びR5は、C5-20アルキル、C5-20アルケニル、-R”MR’、-R*YR”、-YR”、及び-R*OR”からなる群から独立して選択され、
Mはそれぞれ、-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)O-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、アリール基、及びヘテロアリール基からなる群から独立して選択され、
X1、X2、及びX3は、単結合、-CH2-、-(CH2)2-、-CHR-、-CHY-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)-CH2-、-CH2-C(O)-、-C(O)O-CH2-、-OC(O)-CH2-、-CH2-C(O)O-、-CH2-OC(O)-、-CH(OH)-、-C(S)-、及び-CH(SH)-からなる群から独立して選択され、
Yはそれぞれ、独立してC3-6炭素環であり、
R*はそれぞれ、C1-12アルキル及びC2-12アルケニルからなる群から独立して選択され、
Rはそれぞれ、C1-3アルキル及びC3-6炭素環からなる群から独立して選択され、
R’はそれぞれ、C1-12アルキル、C2-12アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
R”はそれぞれ、C3-12アルキル及びC3-12アルケニルからなる群から独立して選択され、
環Aが
i)X1、X2、及びX3のうちの少なくとも1つは、-CH2-ではなく、及び/または
ii)R1、R2、R3、R4、及びR5のうちの少なくとも1つは、-R”MR’である)を含む。
いくつかの実施形態では、化合物は、式(IIIa1)~(IIIa6):
のいずれかのものである。
式(III)または(IIIa1)~(IIIa6)のいずれかの化合物は、該当する場合、以下の特徴のうちの1つまたは複数を含む。
いくつかの実施形態では、環Aは、
である。
いくつかの実施形態では、環Aは、
である。
いくつかの実施形態では、環Aは、
である。
いくつかの実施形態では、環Aは、
である。
いくつかの実施形態では、環Aは、
である。
いくつかの実施形態では、環Aは、
であり、環中のN原子は、X2に接続している。
いくつかの実施形態では、Zは、CH2である。
いくつかの実施形態では、Zは、非存在である。
いくつかの実施形態では、A1及びA2のうちの少なくとも1つは、Nである。
いくつかの実施形態では、A1及びA2のそれぞれは、Nである。
いくつかの実施形態では、A1及びA2のそれぞれは、CHである。
いくつかの実施形態では、A1はNであり、A2はCHである。
いくつかの実施形態では、A1はCHであり、A2はNである。
いくつかの実施形態では、X1、X2、及びX3のうちの少なくとも1つは、-CH2-ではない。例えば、ある特定の実施形態では、X1は、-CH2-ではない。いくつかの実施形態では、X1、X2、及びX3のうちの少なくとも1つは、-C(O)-である。
いくつかの実施形態では、X2は、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)-CH2-、-CH2-C(O)-、-C(O)O-CH2-、-OC(O)-CH2-、-CH2-C(O)O-、または-CH2-OC(O)-である。
いくつかの実施形態では、X3は、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)-CH2-、-CH2-C(O)-、-C(O)O-CH2-、-OC(O)-CH2-、-CH2-C(O)O-、または-CH2-OC(O)-である。他の実施形態では、X3は、-CH2-である。
いくつかの実施形態では、X3は、単結合または-(CH2)2-である。
いくつかの実施形態では、R1及びR2は、同じである。ある特定の実施形態では、R1、R2、及びR3は、同じである。いくつかの実施形態では、R4及びR5は、同じである。ある特定の実施形態では、R1、R2、R3、R4、及びR5は、同じである。
いくつかの実施形態では、R1、R2、R3、R4、及びR5のうちの少なくとも1つは、-R”MR’である。いくつかの実施形態では、R1、R2、R3、R4、及びR5のうちの多くても1つが、-R”MR’である。例えば、R1、R2、及びR3のうちの少なくとも1つは、-R”MR’であり得、及び/またはR4及びR5のうち少なくとも1つは、-R”MR’である。ある特定の実施形態では、少なくとも1つのMは、-C(O)O-である。いくつかの実施形態では、Mはそれぞれ-C(O)O-である。いくつかの実施形態では、少なくとも1つのMは、-OC(O)-である。いくつかの実施形態では、Mはそれぞれ-OC(O)-である。いくつかの実施形態では、少なくとも1つのMは、-OC(O)O-である。いくつかの実施形態では、Mはそれぞれ-OC(O)O-である。いくつかの実施形態では、少なくとも1つのR”は、C3アルキルである。ある特定の実施形態では、R”はそれぞれC3アルキルである。いくつかの実施形態では、少なくとも1つのR”は、C5アルキルである。ある特定の実施形態では、R”はそれぞれC5アルキルである。いくつかの実施形態では、少なくとも1つのR”は、C6アルキルである。ある特定の実施形態では、R”はそれぞれC6アルキルである。いくつかの実施形態では、少なくとも1つのR”は、C7アルキルである。ある特定の実施形態では、R”はそれぞれC7アルキルである。いくつかの実施形態では、少なくとも1つのR’は、C5アルキルである。ある特定の実施形態では、R’はそれぞれC5アルキルである。他の実施形態では、少なくとも1つのR’は、C1アルキルである。ある特定の実施形態では、R’はそれぞれC1アルキルである。いくつかの実施形態では、少なくとも1つのR’は、C2アルキルである。ある特定の実施形態では、R’はそれぞれC2アルキルである。
いくつかの実施形態では、R1、R2、R3、R4、及びR5のうちの少なくとも1つは、C12アルキルである。ある特定の実施形態では、R1、R2、R3、R4、及びR5のそれぞれは、C12アルキルである。
ある特定の実施形態では、化合物は、
からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、送達剤は、化合物236を含む。
いくつかの実施形態では、送達剤は、式(IV)を有する化合物
またはその塩もしくは立体異性体(式中、
A1及びA2は、CHまたはNからそれぞれ独立して選択され、A1及びA2のうちの少なくとも1つは、Nであり、
Zは、CH2または非存在であり、ZがCH2であるとき、破線(1)及び(2)はそれぞれ単結合を表し、Zが非存在であるとき、破線(1)及び(2)は両方とも非存在であり、
R1、R2、R3、R4、及びR5は、C6-20アルキル及びC6-20アルケニルからなる群から独立して選択され、
環Aが
であるとき、
i)R1、R2、R3、R4、及びR5は、同じであり、ここで、R1は、C12アルキル、C18アルキル、もしくはC18アルケニルではなく、
ii)R1、R2、R3、R4、及びR5のうちの1つのみがC6-20アルケニルから選択され、
iii)R1、R2、R3、R4、及びR5のうちの少なくとも1つは、R1、R2、R3、R4、及びR5のうちの他の少なくとも1つとは異なる数の炭素原子を有し、
iv)R1、R2、及びR3は、C6-20アルケニルから選択され、R4及びR5は、C6-20アルキルから選択され、または、
v)R1、R2、及びR3は、C6-20アルキルから選択され、R4及びR5は、C6-20アルケニルから選択される)を含む。
A1及びA2は、CHまたはNからそれぞれ独立して選択され、A1及びA2のうちの少なくとも1つは、Nであり、
Zは、CH2または非存在であり、ZがCH2であるとき、破線(1)及び(2)はそれぞれ単結合を表し、Zが非存在であるとき、破線(1)及び(2)は両方とも非存在であり、
R1、R2、R3、R4、及びR5は、C6-20アルキル及びC6-20アルケニルからなる群から独立して選択され、
環Aが
i)R1、R2、R3、R4、及びR5は、同じであり、ここで、R1は、C12アルキル、C18アルキル、もしくはC18アルケニルではなく、
ii)R1、R2、R3、R4、及びR5のうちの1つのみがC6-20アルケニルから選択され、
iii)R1、R2、R3、R4、及びR5のうちの少なくとも1つは、R1、R2、R3、R4、及びR5のうちの他の少なくとも1つとは異なる数の炭素原子を有し、
iv)R1、R2、及びR3は、C6-20アルケニルから選択され、R4及びR5は、C6-20アルキルから選択され、または、
v)R1、R2、及びR3は、C6-20アルキルから選択され、R4及びR5は、C6-20アルケニルから選択される)を含む。
いくつかの実施形態では、化合物は、式(IVa)の化合物:
のものである。
式(IV)または(IVa)の化合物は、該当する場合、以下の特徴のうちの1つまたは複数を含む。
いくつかの実施形態では、Zは、CH2である。
いくつかの実施形態では、Zは、非存在である。
いくつかの実施形態では、A1及びA2のうちの少なくとも1つは、Nである。
いくつかの実施形態では、A1及びA2のそれぞれは、Nである。
いくつかの実施形態では、A1及びA2のそれぞれは、CHである。
いくつかの実施形態では、A1はNであり、A2はCHである。
いくつかの実施形態では、A1はCHであり、A2はNである。
いくつかの実施形態では、R1、R2、R3、R4、及びR5は、同じであり、C12アルキル、C18アルキル、またはC18アルケニルではない。いくつかの実施形態では、R1、R2、R3、R4、及びR5は、同じであり、C9アルキルまたはC14アルキルである。
いくつかの実施形態では、R1、R2、R3、R4、及びR5のうちの1つのみがC6-20アルケニルから選択される。ある特定のそのような実施形態では、R1、R2、R3、R4、及びR5は、同じ数の炭素原子を有する。いくつかの実施形態では、R4は、C5-20アルケニルから選択される。例えば、R4は、C12アルケニルまたはC18アルケニルであり得る。
いくつかの実施形態では、R1、R2、R3、R4、及びR5のうちの少なくとも1つは、R1、R2、R3、R4、及びR5のうちの他の少なくとも1つとは異なる数の炭素原子を有する。
ある特定の実施形態では、R1、R2、及びR3は、C6-20アルケニルから選択され、R4及びR5は、C6-20アルキルから選択される。他の実施形態では、R1、R2、及びR3は、C6-20アルキルから選択され、R4及びR5は、C6-20アルケニルから選択される。いくつかの実施形態では、R1、R2、及びR3は、同じ数の炭素原子を有し、及び/またはR4及びR5は、同じ数の炭素原子を有する。例えば、R1、R2、及びR3、またはR4及びR5は、6、8、9、12、14、または18個の炭素原子を有し得る。いくつかの実施形態では、R1、R2、及びR3、またはR4及びR5は、C18アルケニル(例えば、リノレイル)である。いくつかの実施形態では、R1、R2、及びR3、またはR4及びR5は、6、8、9、12、または14個の炭素原子を含むアルキル基である。
いくつかの実施形態では、R1は、R2、R3、R4、及びR5とは異なる数の炭素原子を有する。他の実施形態では、R3は、R1、R2、R4、及びR5とは異なる数の炭素原子を有する。さらなる実施形態では、R4は、R1、R2、R3、及びR5とは異なる数の炭素原子を有する。
いくつかの実施形態では、化合物は、
からなる群から選択される。
他の実施形態では、送達剤は、式(V)を有する化合物:
またはその塩もしくは立体異性体(式中、
A3は、CHまたはNであり、
A4は、CH2またはNHであり、A3及びA4のうちの少なくとも1つは、NまたはNHであり、
Zは、CH2または非存在であり、ZがCH2であるとき、破線(1)及び(2)はそれぞれ単結合を表し、Zが非存在であるとき、破線(1)及び(2)は両方とも非存在であり、
R1、R2、及びR3は、C5-20アルキル、C5-20アルケニル、-R”MR’、-R*YR”、-YR”、及び-R*OR”からなる群から独立して選択され、
Mはそれぞれ、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、アリ-ル基、及びヘテロアリ-ル基から独立して選択され、
X1及びX2は、-CH2-、-(CH2)2-、-CHR-、-CHY-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)-CH2-、-CH2-C(O)-、-C(O)O-CH2-、-OC(O)-CH2-、-CH2-C(O)O-、-CH2-OC(O)-、-CH(OH)-、-C(S)-、及び-CH(SH)-からなる群から独立して選択され、
Yはそれぞれ、独立してC3-6炭素環であり、
R*はそれぞれ、C1-12アルキル及びC2-12アルケニルからなる群から独立して選択され、
Rはそれぞれ、C1-3アルキル及びC3-6炭素環からなる群から独立して選択され、
R’はそれぞれ、C1-12アルキル、C2-12アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
R”はそれぞれ、C3-12アルキル及びC3-12アルケニルからなる群から独立して選択される)を含む。
A3は、CHまたはNであり、
A4は、CH2またはNHであり、A3及びA4のうちの少なくとも1つは、NまたはNHであり、
Zは、CH2または非存在であり、ZがCH2であるとき、破線(1)及び(2)はそれぞれ単結合を表し、Zが非存在であるとき、破線(1)及び(2)は両方とも非存在であり、
R1、R2、及びR3は、C5-20アルキル、C5-20アルケニル、-R”MR’、-R*YR”、-YR”、及び-R*OR”からなる群から独立して選択され、
Mはそれぞれ、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、アリ-ル基、及びヘテロアリ-ル基から独立して選択され、
X1及びX2は、-CH2-、-(CH2)2-、-CHR-、-CHY-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)-CH2-、-CH2-C(O)-、-C(O)O-CH2-、-OC(O)-CH2-、-CH2-C(O)O-、-CH2-OC(O)-、-CH(OH)-、-C(S)-、及び-CH(SH)-からなる群から独立して選択され、
Yはそれぞれ、独立してC3-6炭素環であり、
R*はそれぞれ、C1-12アルキル及びC2-12アルケニルからなる群から独立して選択され、
Rはそれぞれ、C1-3アルキル及びC3-6炭素環からなる群から独立して選択され、
R’はそれぞれ、C1-12アルキル、C2-12アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
R”はそれぞれ、C3-12アルキル及びC3-12アルケニルからなる群から独立して選択される)を含む。
いくつかの実施形態では、化合物は、式(Va)の化合物:
のものである。
式(V)または(Va)の化合物は、該当する場合、以下の特徴のうちの1つまたは複数を含む。
いくつかの実施形態では、Zは、CH2である。
いくつかの実施形態では、Zは、非存在である。
いくつかの実施形態では、A3及びA4のうちの少なくとも1つは、NまたはNHである。
いくつかの実施形態では、A3はNであり、A4はNHである。
いくつかの実施形態では、A3はNであり、A4はCH2である。
いくつかの実施形態では、A3はCHであり、A4はNHである。
いくつかの実施形態では、X1及びX2のうちの少なくとも1つは、-CH2-ではない。例えば、ある特定の実施形態では、X1は、-CH2-ではない。いくつかの実施形態では、X1及びX2のうちの少なくとも1つは、-C(O)-である。
いくつかの実施形態では、X2は、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)-CH2-、-CH2-C(O)-、-C(O)O-CH2-、-OC(O)-CH2-、-CH2-C(O)O-、または-CH2-OC(O)-である。
いくつかの実施形態では、R1、R2、及びR3は、C5-20アルキル及びC5-20アルケニルからなる群から独立して選択される。いくつかの実施形態では、R1、R2、及びR3は、同じである。ある特定の実施形態では、R1、R2、及びR3は、C6、C9、C12、またはC14アルキルである。他の実施形態では、R1、R2、及びR3は、C18アルケニルである。例えば、R1、R2、及びR3は、リノレイルであってよい。
いくつかの実施形態では、化合物は、
からなる群から選択される。
他の実施形態では、送達剤は、式(VI)を有する化合物:
またはその塩もしくは立体異性体(式中、
A6及びA7は、CHまたはNからそれぞれ独立して選択され、ここで、A6及びA7のうちの少なくとも1つはNであり、
Zは、CH2または非存在であり、ZがCH2であるとき、破線(1)及び(2)はそれぞれ単結合を表し、Zが非存在であるとき、破線(1)及び(2)は両方とも非存在であり、
X4及びX5は、-CH2-、-CH2)2-、-CHR-、-CHY-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)-CH2-、-CH2-C(O)-、-C(O)O-CH2-、-OC(O)-CH2-、-CH2-C(O)O-、-CH2-OC(O)-、-CH(OH)-、-C(S)-、及び-CH(SH)-からなる群から独立して選択され、
R1、R2、R3、R4、及びR5はそれぞれ、C5-20アルキル、C5-20アルケニル、-R”MR’、-R*YR”、-YR”、及び-R*OR”からなる群から独立して選択され、
Mはそれぞれ、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、アリ-ル基、及びヘテロアリ-ル基からなる群から独立して選択され、
Yはそれぞれ、独立してC3-6炭素環であり、
R*はそれぞれ、C1-12アルキル及びC2-12アルケニルからなる群から独立して選択され、
Rはそれぞれ、C1-3アルキル及びC3-6炭素環からなる群から独立して選択され、
R’はそれぞれ、C1-12アルキル、C2-12アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
R”はそれぞれ、C3-12アルキル及びC3-12アルケニルからなる群から独立して選択される)を含む。
A6及びA7は、CHまたはNからそれぞれ独立して選択され、ここで、A6及びA7のうちの少なくとも1つはNであり、
Zは、CH2または非存在であり、ZがCH2であるとき、破線(1)及び(2)はそれぞれ単結合を表し、Zが非存在であるとき、破線(1)及び(2)は両方とも非存在であり、
X4及びX5は、-CH2-、-CH2)2-、-CHR-、-CHY-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)-CH2-、-CH2-C(O)-、-C(O)O-CH2-、-OC(O)-CH2-、-CH2-C(O)O-、-CH2-OC(O)-、-CH(OH)-、-C(S)-、及び-CH(SH)-からなる群から独立して選択され、
R1、R2、R3、R4、及びR5はそれぞれ、C5-20アルキル、C5-20アルケニル、-R”MR’、-R*YR”、-YR”、及び-R*OR”からなる群から独立して選択され、
Mはそれぞれ、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O)2-、アリ-ル基、及びヘテロアリ-ル基からなる群から独立して選択され、
Yはそれぞれ、独立してC3-6炭素環であり、
R*はそれぞれ、C1-12アルキル及びC2-12アルケニルからなる群から独立して選択され、
Rはそれぞれ、C1-3アルキル及びC3-6炭素環からなる群から独立して選択され、
R’はそれぞれ、C1-12アルキル、C2-12アルケニル、及びHからなる群から独立して選択され、
R”はそれぞれ、C3-12アルキル及びC3-12アルケニルからなる群から独立して選択される)を含む。
いくつかの実施形態では、R1、R2、R3、R4、及びR5はそれぞれ、C6-20アルキル及びC6-20アルケニルからなる群から独立して選択される。
いくつかの実施形態では、R1及びR2は、同じである。ある特定の実施形態では、R1、R2、及びR3は、同じである。いくつかの実施形態では、R4及びR5は、同じである。ある特定の実施形態では、R1、R2、R3、R4、及びR5は、同じである。
いくつかの実施形態では、R1、R2、R3、R4、及びR5のうちの少なくとも1つは、C9-12アルキルである。ある特定の実施形態では、R1、R2、R3、R4、及びR5のそれぞれは、独立して、C9、C12またはC14アルキルである。ある特定の実施形態では、R1、R2、R3、R4、及びR5のそれぞれは、C9アルキルである。
いくつかの実施形態では、A6はNであり、A7はNである。いくつかの実施形態では、A6はCHであり、A7はNである。
いくつかの実施形態では、X4は-CH2-であり、X5は-C(O)-である。いくつかの実施形態では、X4及びX5は、-C(O)-である。
いくつかの実施形態では、A6がNであり、A7がNであるとき、X4及びX5のうちの少なくとも1つは、-CH2-ではなく、例えば、X4及びX5のうちの少なくとも1つは、-C(O)-である。いくつかの実施形態では、A6がNであり、A7がNであるとき、R1、R2、R3、R4、及びR5のうちの少なくとも1つは、-R”MR’である。
いくつかの実施形態では、R1、R2、R3、R4、及びR5のうちの少なくとも1つは、-R”MR’ではない。
いくつかの実施形態では、化合物は、
である。
他の実施形態では、送達剤は、次式を有する化合物:
を含む。
本明細書に開示の脂質化合物のアミン部分は、ある特定の条件下でプロトン化することができる。例えば、式(I)による脂質の中央のアミン部分は、典型的に、アミノ部分のpKaを下回るpHでプロトン化し(すなわち、正電荷を有し)、pKaを上回るpHでは実質的に帯電しない。そのような脂質は、イオン化可能なアミノ脂質と称され得る。
具体的な1つの実施形態では、イオン化可能なアミノ脂質は、化合物18である。別の実施形態では、イオン化可能なアミノ脂質は、化合物236である。
いくつかの実施形態では、イオン化可能なアミノ脂質、例えば、式(I)の化合物の量は、脂質組成物中、約1モル%~99モル%の範囲である。
1つの実施形態では、イオン化可能なアミノ脂質、例えば、式(I)の化合物の量は、脂質組成物中、少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、または99モル%である。
1つの実施形態では、イオン化可能なアミノ脂質、例えば、式(I)の化合物の量は、脂質組成物中、約30モル%~約70モル%、約35モル%~約65モル%、約40モル%~約60モル%、及び約45モル%~約55モル%の範囲である。
具体的な1つの実施形態では、イオン化可能なアミノ脂質、例えば、式(I)の化合物の量は、脂質組成物中、約50モル%である。
本明細書に開示のイオン化可能なアミノ脂質、例えば、式(I)の化合物に加えて、本明細書に開示の医薬組成物の脂質組成物は、リン脂質、構造脂質、PEG脂質、及びこれらの任意の組み合わせなどの追加成分を含み得る。
リン脂質
本明細書に開示の医薬組成物の脂質組成物は、1つまたは複数のリン脂質、例えば、1つまたは複数の飽和もしくは(ポリ)不飽和リン脂質またはそれらの組み合わせを含み得る。一般に、リン脂質は、1つのリン脂質部分及び1つまたは複数の脂肪酸部分を含む。
本明細書に開示の医薬組成物の脂質組成物は、1つまたは複数のリン脂質、例えば、1つまたは複数の飽和もしくは(ポリ)不飽和リン脂質またはそれらの組み合わせを含み得る。一般に、リン脂質は、1つのリン脂質部分及び1つまたは複数の脂肪酸部分を含む。
リン脂質部分は、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、2-リゾホスファチジルコリン、及びスフィンゴミエリンからなる非限定的な群から選択することができる。
脂肪酸部分は、例えば、ラウリン酸、ミリスチン酸、ミリストレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、α-リノレン酸、エルカ酸、フィタン酸、アラキジン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ベヘン酸、ドコサペンタエン酸、及びドコサヘキサエン酸からなる非限定的な群から選択することができる。
特定のリン脂質は、膜への融合を促進することができる。例えば、カチオン性リン脂質は、膜(例えば、細胞膜または細胞内膜)の1つまたは複数の負電荷を帯びたリン脂質と相互作用することができる。リン脂質の膜への融合は、脂質含有組成物(例えば、LNP)の1つまたは複数の要素(例えば、治療剤)が膜を通過するのを可能にし、例えば、1つまたは複数の要素の標的組織への送達を可能にする。
分岐、酸化、環化、及びアルキンを含む修飾及び置換を有する天然種を含む、非天然リン脂質種もまた企図される。例えば、リン脂質は、1つまたは複数のアルキン(例えば、1つまたは複数の二重結合が三重結合によって置き換えられているアルケニル基)で官能化されてもよいし、1つまたは複数のアルキンに架橋されてもよい。アルキン基は、適切な反応条件下で、アジドに曝されると、銅触媒による付加環化を受け得る。そのような反応は、ナノ粒子組成物の脂質二重層を官能化して膜透過もしくは細胞認識を促進すること、またはナノ粒子組成物を標的化部分もしくはイメージング部分(例えば、色素)などの有用な成分に結合させることに有用であり得る。
リン脂質には、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジグリセロール、及びホスファチジン酸などのグリセロリン脂質が含まれるが、これらに限定されない。リン脂質はまた、スフィンゴミエリンなどのスフィンゴリン脂質も含み得る。
リン脂質の例には、次のものが挙げられるが、これらに限定されない。
ある特定の実施形態では、本発明に有用なまたは潜在的に有用であるリン脂質は、DSPCの類似体またはバリアントである。ある特定の実施形態では、本発明に有用なまたは潜在的に有用であるリン脂質は、式(IX)の化合物:
またはその塩(式中、
R1はそれぞれ、独立して、任意選択で置換されたアルキルであり、または任意選択で2つのR1は、介在する原子と一緒になって、任意選択で置換された単環式カルボシクリルもしくは任意選択で置換された単環式ヘテロシクリルを形成し、または任意選択で3つのR1は、介在する原子と一緒になって、任意選択で置換された二環式カルボシクリルもしくは任意選択で置換された二環式ヘテロシクリルを形成し、
nは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10であり、
mは、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10であり、
Aは、式:
からなり、
L2はぞれぞれの場合において、独立して、単結合または任意選択で置換されたC1-6アルキレンであり、ここで、任意選択で置換されたC1-6アルキレンの1つのメチレン単位は、任意選択で-O-、-N(RN)-、-S-、-C(O)-、-C(O)N(RN)-、-NRNC(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)O-、-OC(O)N(RN)-、-NRNC(O)O-、または-NRNC(O)N(RN)-で置き換えられ、
R2はぞれぞれの場合において、独立して、任意選択で置換されたC1-30アルキル、任意選択で置換されたC1-30アルケニル、または任意選択で置換されたC1-30アルキニルであり、ここで、任意選択で、R2の1つまたは複数のメチレン単位は、任意選択で置換されたカルボシクリレン、任意選択で置換されたヘテロシクリレン、任意選択で置換されたアリーレン、任意選択で置換されたヘテロアリーレン、-N(RN)-、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)N(RN)-、-NRNC(O)-、-NRNC(O)N(RN)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)O-、-OC(O)N(RN)-、-NRNC(O)O-、-C(O)S-、-SC(O)-、-C(=NRN)-、-C(=NRN)N(RN)-、-NRNC(=NRN)-、-NRNC(=NRN)N(RN)-、-C(S)-、-C(S)N(RN)-、-NRNC(S)-、-NRNC(S)N(RN)-、-S(O)-、-OS(O)-、-S(O)O-、-OS(O)O-、-OS(O)2-、-S(O)2O-、-OS(O)2O-、-N(RN)S(O)-、-S(O)N(RN)-、-N(RN)S(O)N(RN)-、-OS(O)N(RN)-、-N(RN)S(O)O-、-S(O)2-、-N(RN)S(O)2-、-S(O)2N(RN)-、-N(RN)S(O)2N(RN)-、-OS(O)2N(RN)-、または-N(RN)S(O)2O-で独立して置き換えられ、
RNはぞれぞれの場合において、独立して、水素、任意選択で置換されたアルキル、または窒素保護基であり、
環Bは、任意選択で置換されたカルボシクリル、任意選択で置換されたヘテロシクリル、任意選択で置換されたアリール、または任意選択で置換されたヘテロアリールであり、
pは、1または2であり、
ただし、化合物は、次式:
のものではなく、
ここで、R2はぞれぞれの場合において、独立して、非置換アルキル、非置換アルケニル、または非置換アルキニルである)である。
R1はそれぞれ、独立して、任意選択で置換されたアルキルであり、または任意選択で2つのR1は、介在する原子と一緒になって、任意選択で置換された単環式カルボシクリルもしくは任意選択で置換された単環式ヘテロシクリルを形成し、または任意選択で3つのR1は、介在する原子と一緒になって、任意選択で置換された二環式カルボシクリルもしくは任意選択で置換された二環式ヘテロシクリルを形成し、
nは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10であり、
mは、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10であり、
Aは、式:
L2はぞれぞれの場合において、独立して、単結合または任意選択で置換されたC1-6アルキレンであり、ここで、任意選択で置換されたC1-6アルキレンの1つのメチレン単位は、任意選択で-O-、-N(RN)-、-S-、-C(O)-、-C(O)N(RN)-、-NRNC(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)O-、-OC(O)N(RN)-、-NRNC(O)O-、または-NRNC(O)N(RN)-で置き換えられ、
R2はぞれぞれの場合において、独立して、任意選択で置換されたC1-30アルキル、任意選択で置換されたC1-30アルケニル、または任意選択で置換されたC1-30アルキニルであり、ここで、任意選択で、R2の1つまたは複数のメチレン単位は、任意選択で置換されたカルボシクリレン、任意選択で置換されたヘテロシクリレン、任意選択で置換されたアリーレン、任意選択で置換されたヘテロアリーレン、-N(RN)-、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)N(RN)-、-NRNC(O)-、-NRNC(O)N(RN)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)O-、-OC(O)N(RN)-、-NRNC(O)O-、-C(O)S-、-SC(O)-、-C(=NRN)-、-C(=NRN)N(RN)-、-NRNC(=NRN)-、-NRNC(=NRN)N(RN)-、-C(S)-、-C(S)N(RN)-、-NRNC(S)-、-NRNC(S)N(RN)-、-S(O)-、-OS(O)-、-S(O)O-、-OS(O)O-、-OS(O)2-、-S(O)2O-、-OS(O)2O-、-N(RN)S(O)-、-S(O)N(RN)-、-N(RN)S(O)N(RN)-、-OS(O)N(RN)-、-N(RN)S(O)O-、-S(O)2-、-N(RN)S(O)2-、-S(O)2N(RN)-、-N(RN)S(O)2N(RN)-、-OS(O)2N(RN)-、または-N(RN)S(O)2O-で独立して置き換えられ、
RNはぞれぞれの場合において、独立して、水素、任意選択で置換されたアルキル、または窒素保護基であり、
環Bは、任意選択で置換されたカルボシクリル、任意選択で置換されたヘテロシクリル、任意選択で置換されたアリール、または任意選択で置換されたヘテロアリールであり、
pは、1または2であり、
ただし、化合物は、次式:
ここで、R2はぞれぞれの場合において、独立して、非置換アルキル、非置換アルケニル、または非置換アルキニルである)である。
i)リン脂質頭部の修飾
ある特定の実施形態では、本発明に有用なまたは潜在的に有用であるリン脂質は、修飾されたリン脂質頭部(例えば、修飾されたコリン基)を含む。ある特定の実施形態では、修飾された頭部を有するリン脂質は、修飾された四級アミンを有するDSPC、またはその類似体である。例えば、式(IX)の実施形態では、R1のうちの少なくとも1つは、メチルではない。ある特定の実施形態では、R1のうちの少なくとも1つは、水素でもメチルでもない。ある特定の実施形態では、式(IX)の化合物は、次式:
またはその塩(式中、
tはそれぞれ、独立して、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10であり、
uはそれぞれ、独立して、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10であり、
vはそれぞれ、独立して、1、2、または3である)のうちの1つのものである。
ある特定の実施形態では、本発明に有用なまたは潜在的に有用であるリン脂質は、修飾されたリン脂質頭部(例えば、修飾されたコリン基)を含む。ある特定の実施形態では、修飾された頭部を有するリン脂質は、修飾された四級アミンを有するDSPC、またはその類似体である。例えば、式(IX)の実施形態では、R1のうちの少なくとも1つは、メチルではない。ある特定の実施形態では、R1のうちの少なくとも1つは、水素でもメチルでもない。ある特定の実施形態では、式(IX)の化合物は、次式:
tはそれぞれ、独立して、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10であり、
uはそれぞれ、独立して、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10であり、
vはそれぞれ、独立して、1、2、または3である)のうちの1つのものである。
ある特定の実施形態では、式(IX)の化合物は、次式:
またはその塩のうちの1つのものである。
ある特定の実施形態では、式(IX)の化合物は、次のうちの1つである。
またはその塩のうちの1つである。
ある特定の実施形態では、式(IX)の化合物は、式(IX-a):
またはその塩のものである。
ある特定の実施形態では、本発明に有用なまたは潜在的に有用であるリン脂質は、修飾されたコアを含む。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の修飾されたコアを有するリン脂質は、修飾されたコア構造を有するDSPC、またはその類似体である。例えば、式(IX-a)のある特定の実施形態では、基Aは、次式:
のものではない。
ある特定の実施形態では、式(IX-a)の化合物は、次式:
またはその塩のうちの1つのものである。
ある特定の実施形態では、式(IX)の化合物は、次式:
またはその塩のうちの1つである。
ある特定の実施形態では、本発明に有用なまたは潜在的に有用であるリン脂質は、グリセリド部分の代わりに環式部分を含む。ある特定の実施形態では、本発明に有用なリン脂質は、グリセリド部分の代わりに環式部分を有するDSPC、またはその類似体である。ある特定の実施形態では、式(IX)の化合物は、式(IX-b):
またはその塩のものである。
ある特定の実施形態では、式(IX-b)の化合物は、式(IX-b-1):
またはその塩(式中、
wは、0、1、2または3である)のものである。
wは、0、1、2または3である)のものである。
ある特定の実施形態では、式(IX-b)の化合物は、式(IX-b-2):
またはその塩のものである。
ある特定の実施形態では、式(IX-b)の化合物は、式(IX-b-3):
またはその塩のものであるからなる。
ある特定の実施形態では、式(IX-b)の化合物は、式(IX-b-4):
またはその塩のものであるからなる。
ある特定の実施形態では、式(IX-b)の化合物は、次式:
またはその塩のうちの1つである。
(ii)リン脂質尾部の修飾
ある特定の実施形態では、本発明に有用なまたは潜在的に有用であるリン脂質は、修飾された尾部を含む。ある特定の実施形態では、本発明に有用なまたは潜在的に有用であるリン脂質は、修飾された尾部を有するDSPC、またはその類似体である。本明細書に記載されるように、「修飾された尾部」は、短いもしくは長い脂肪族鎖、分岐が導入された脂肪族鎖、置換基が導入された脂肪族鎖、1つもしくは複数のメチレンが環式基もしくはヘテロ原子基によって置き換えられている脂肪族鎖、またはこれらの任意の組み合わせを有する尾部であってよい。例えば、ある特定の実施形態では、(IX)の化合物は、式(IX-a)、またはその塩(式中、R2の少なくとも1つの場合において、R2はそれぞれの場合において、任意選択で置換されたC1-30アルキルであり、ここで、R2の1つまたは複数のメチレン単位は、任意選択で置換されたカルボシクリレン、任意選択で置換されたヘテロシクリレン、任意選択で置換されたアリーレン、任意選択で置換されたヘテロアリーレン、-N(RN)-、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)N(RN)-、-NRNC(O)-、-NRNC(O)N(RN)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)O-、-OC(O)N(RN)-、-NRNC(O)O-、-C(O)S-、-SC(O)-、-C(=NRN)-、-C(=NRN)N(RN)-、-NRNC(=NRN)-、-NRNC(=NRN)N(RN)-、-C(S)-、-C(S)N(RN)-、-NRNC(S)-、-NRNC(S)N(RN)-、-S(O)-、-OS(O)-、-S(O)O-、-OS(O)O-、-OS(O)2-、-S(O)2O-、-OS(O)2O-、-N(RN)S(O)-、-S(O)N(RN)-、-N(RN)S(O)N(RN)-、-OS(O)N(RN)-、-N(RN)S(O)O-、-S(O)2-、-N(RN)S(O)2-、-S(O)2N(RN)-、-N(RN)S(O)2N(RN)-、-OS(O)2N(RN)-、または-N(RN)S(O)2O-で独立して置き換えられる)のものである。
ある特定の実施形態では、本発明に有用なまたは潜在的に有用であるリン脂質は、修飾された尾部を含む。ある特定の実施形態では、本発明に有用なまたは潜在的に有用であるリン脂質は、修飾された尾部を有するDSPC、またはその類似体である。本明細書に記載されるように、「修飾された尾部」は、短いもしくは長い脂肪族鎖、分岐が導入された脂肪族鎖、置換基が導入された脂肪族鎖、1つもしくは複数のメチレンが環式基もしくはヘテロ原子基によって置き換えられている脂肪族鎖、またはこれらの任意の組み合わせを有する尾部であってよい。例えば、ある特定の実施形態では、(IX)の化合物は、式(IX-a)、またはその塩(式中、R2の少なくとも1つの場合において、R2はそれぞれの場合において、任意選択で置換されたC1-30アルキルであり、ここで、R2の1つまたは複数のメチレン単位は、任意選択で置換されたカルボシクリレン、任意選択で置換されたヘテロシクリレン、任意選択で置換されたアリーレン、任意選択で置換されたヘテロアリーレン、-N(RN)-、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)N(RN)-、-NRNC(O)-、-NRNC(O)N(RN)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)O-、-OC(O)N(RN)-、-NRNC(O)O-、-C(O)S-、-SC(O)-、-C(=NRN)-、-C(=NRN)N(RN)-、-NRNC(=NRN)-、-NRNC(=NRN)N(RN)-、-C(S)-、-C(S)N(RN)-、-NRNC(S)-、-NRNC(S)N(RN)-、-S(O)-、-OS(O)-、-S(O)O-、-OS(O)O-、-OS(O)2-、-S(O)2O-、-OS(O)2O-、-N(RN)S(O)-、-S(O)N(RN)-、-N(RN)S(O)N(RN)-、-OS(O)N(RN)-、-N(RN)S(O)O-、-S(O)2-、-N(RN)S(O)2-、-S(O)2N(RN)-、-N(RN)S(O)2N(RN)-、-OS(O)2N(RN)-、または-N(RN)S(O)2O-で独立して置き換えられる)のものである。
ある特定の実施形態では、式(IX)の化合物は、式(IX-c):
またはその塩(式中、
xはそれぞれ、独立して、0以上30以下の整数であり、
ここで、それぞれの場合において、Gは、任意選択で置換されたカルボシクリレン、任意選択で置換されたヘテロシクリレン、任意選択で置換されたアリーレン、任意選択で置換されたヘテロアリーレン、-N(RN)-、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)N(RN)-、-NRNC(O)-、-NRNC(O)N(RN)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)O-、-OC(O)N(RN)-、-NRNC(O)O-、-C(O)S-、-SC(O)-、-C(=NRN)-、-C(=NRN)N(RN)-、-NRNC(=NRN)-、-NRNC(=NRN)N(RN)-、-C(S)-、-C(S)N(RN)-、-NRNC(S)-、-NRNC(S)N(RN)-、-S(O)-、-OS(O)-、-S(O)O-、-OS(O)O-、-OS(O)2-、-S(O)2O-、-OS(O)2O-、-N(RN)S(O)-、-S(O)N(RN)-、-N(RN)S(O)N(RN)-、-OS(O)N(RN)-、-N(RN)S(O)O-、-S(O)2-、-N(RN)S(O)2-、-S(O)2N(RN)-、-N(RN)S(O)2N(RN)-、-OS(O)2N(RN)-、または-N(RN)S(O)2O-からなる群から独立して選択される)のものである。それぞれの可能性が本発明の別個の実施形態を表す。
xはそれぞれ、独立して、0以上30以下の整数であり、
ここで、それぞれの場合において、Gは、任意選択で置換されたカルボシクリレン、任意選択で置換されたヘテロシクリレン、任意選択で置換されたアリーレン、任意選択で置換されたヘテロアリーレン、-N(RN)-、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)N(RN)-、-NRNC(O)-、-NRNC(O)N(RN)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)O-、-OC(O)N(RN)-、-NRNC(O)O-、-C(O)S-、-SC(O)-、-C(=NRN)-、-C(=NRN)N(RN)-、-NRNC(=NRN)-、-NRNC(=NRN)N(RN)-、-C(S)-、-C(S)N(RN)-、-NRNC(S)-、-NRNC(S)N(RN)-、-S(O)-、-OS(O)-、-S(O)O-、-OS(O)O-、-OS(O)2-、-S(O)2O-、-OS(O)2O-、-N(RN)S(O)-、-S(O)N(RN)-、-N(RN)S(O)N(RN)-、-OS(O)N(RN)-、-N(RN)S(O)O-、-S(O)2-、-N(RN)S(O)2-、-S(O)2N(RN)-、-N(RN)S(O)2N(RN)-、-OS(O)2N(RN)-、または-N(RN)S(O)2O-からなる群から独立して選択される)のものである。それぞれの可能性が本発明の別個の実施形態を表す。
ある特定の実施形態では、式(IX-c)の化合物は、式(IX-c-1):
またはその塩(式中、
vはぞれぞれの場合において、独立して、1、2、または3である)のものである。
vはぞれぞれの場合において、独立して、1、2、または3である)のものである。
ある特定の実施形態では、式(IX-c)の化合物は、式(IX-c-2):
またはその塩のものである。
ある特定の実施形態では、式(IX-c)の化合物は、次式:
またはその塩のものである。
ある特定の実施形態では、式(IX-c)の化合物は、次式:
またはその塩である。
ある特定の実施形態では、式(IX-c)の化合物は、式(IX-c-3):
またはその塩のものである。
ある特定の実施形態では、式(IX-c)の化合物は、次式:
またはその塩のものである。
ある特定の実施形態では、式(IX-c)の化合物は、次式:
またはその塩である。
ある特定の実施形態では、本発明に有用なまたは潜在的に有用であるリン脂質は、修飾されたホスホコリン部分を含み、ここで、四級アミンをホスホリル基に連結するアルキル鎖は、エチレンではない(例えば、nは、2ではない)。したがって、ある特定の実施形態では、本発明に有用なまたは潜在的に有用であるリン脂質は、式(IX)の化合物(式中、nは、1、3、4、5、6、7、8、9、または10である)である。例えば、ある特定の実施形態では、式(IX)の化合物は、次式:
またはその塩のうちの1つのものである。
ある特定の実施形態では、式(IX)の化合物は、次式:
またはその塩のうちの1つである。
代替的な脂質
ある特定の実施形態では、本発明のリン脂質の代わりに、代替的な脂質が使用される。そのような代替的な脂質の非限定的な例には、次のものが挙げられる。
ある特定の実施形態では、本発明のリン脂質の代わりに、代替的な脂質が使用される。そのような代替的な脂質の非限定的な例には、次のものが挙げられる。
構造脂質
本明細書に開示の医薬組成物の脂質組成物は、1つまたは複数の構造脂質を含み得る。本明細書で使用されるとき、「構造脂質」という用語は、ステロールを指し、また脂質含有ステロール部分も指す。
本明細書に開示の医薬組成物の脂質組成物は、1つまたは複数の構造脂質を含み得る。本明細書で使用されるとき、「構造脂質」という用語は、ステロールを指し、また脂質含有ステロール部分も指す。
脂質ナノ粒子に構造脂質を組み込むことは、粒子内における他の脂質の凝集を緩和するのに役立ち得る。構造脂質は、コレステロール、フェコステロール、シトステロール、エルゴステロール、カンペステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール、トマチジン、トマチン、ウルソル酸、α-トコフェロール、ホパノイド、フィトステロール、ステロイド、及びこれらの混合物を含むが、これらに限定されない群から選択することができる。いくつかの実施形態では、構造脂質は、ステロールである。本明細書で定義するように、「ステロール」は、ステロイドアルコールからなるステロイドのサブグループである。ある特定の実施形態では、構造脂質は、ステロイドである。ある特定の実施形態では、構造脂質は、コレステロールである。ある特定の実施形態では、構造脂質は、コレステロールの類似体である。ある特定の実施形態では、構造脂質は、α-トコフェロールである。構造脂質の例には、次のものが挙げられるが、これらに限定されない:
1つの実施形態では、本明細書に開示の医薬組成物の脂質組成物中の構造脂質(例えば、コレステロールなどのステロール)の量は、約20モル%~約60モル%、約25モル%~約55モル%、約30モル%~約50モル%、または約35モル%~約45モル%の範囲である。
1つの実施形態では、本明細書に開示の脂質組成物中の構造脂質(例えば、コレステロールなどのステロール)の量は、約25モル%~約30モル%、約30モル%~約35モル%、または約35モル%~約40モル%の範囲である。
1つの実施形態では、本明細書に開示の脂質組成物中の構造脂質(例えば、コレステロールなどのステロール)の量は、約24モル%、約29モル%、約34モル%、または約39モル%である。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示の脂質組成物中の構造脂質(例えば、コレステロールなどのステロール)の量は、少なくとも約20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、または60モル%である。
ポリエチレングリコール(PEG)脂質
本明細書に開示の医薬組成物の脂質組成物は、1つまたは複数のポリエチレングリコール(PEG)脂質を含み得る。
本明細書に開示の医薬組成物の脂質組成物は、1つまたは複数のポリエチレングリコール(PEG)脂質を含み得る。
本明細書で使用されるとき、「PEG脂質」という用語は、ポリエチレングリコール(PEG)で修飾された脂質を指す。PEG脂質の非限定的な例には、PEG修飾されたホスファチジルエタノールアミン及びホスファチジン酸、PEG-セラミド複合体(例えば、PEG-CerC14またはPEG-CerC20)、PEG修飾されたジアルキルアミン及びPEG修飾された1,2-ジアシルオキシプロパン-3-アミンが挙げられる。そのような脂質は、PEG化脂質とも呼ばれる。例えば、PEG脂質は、PEG-c-DOMG、PEG-DMG、PEG-DLPE、PEG-DMPE、PEG-DPPC、またはPEG-DSPE脂質であってよい。
いくつかの実施形態では、PEG脂質は、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロールメトキシポリエチレングリコール(PEG-DMG)、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[アミノ(ポリエチレングリコール)](PEG-DSPE)、PEG-ジステリルグリセロール(PEG-DSG)、PEG-ジパルメトレイル、PEG-ジオレイル、PEG-ジステアリル、PEG-ジアシルグリカミド(PEG-DAG)、PEG-ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン(PEG-DPPE)、またはPEG-1,2-ジミリスチルオキシルプロピル-3-アミン(PEG-c-DMA)を含むが、これらに限定されない。
1つの実施形態では、PEG脂質は、PEG修飾ホスファチジルエタノールアミン、PEG修飾ホスファチジン酸、PEG修飾セラミド、PEG修飾ジアルキルアミン、PEG修飾ジアシルグリセロール、PEG修飾ジアルキルグリセロール、及びこれらの混合物からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、PEG脂質の脂質部分は、約C14~約C22、好ましくは、約C14~約C16の長さを有する部分を含む。いくつかの実施形態では、PEG部分、例えば、mPEG-NH2は、約1000、2000、5000、10,000、15,000または20,000ダルトンのサイズを有する。1つの実施形態では、PEG脂質は、PEG2k-DMGである。
1つの実施形態では、本明細書に記載の脂質ナノ粒子は、非拡散性PEGであるPEG脂質を含み得る。非拡散性PEGの非限定的な例には、PEG-DSG及びPEG-DSPEが挙げられる。
PEG脂質は、当該技術分野において知られており、米国特許第8158601号及び国際公開第WO2015/130584A2号に記載のものなどがあり、これらの文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
一般に、本明細書に記載のさまざまな式の他の脂質成分(例えば、PEG脂質)のいくつかは、2016年12月10日出願の「Compositions and Methods for Delivery of Therapeutic Agents」と題する国際特許出願第PCT/US2016/000129号に記載のとおりに合成され得、当該文献は、その全体が参照によって組み込まれる。
脂質ナノ粒子組成物の脂質成分は、PEGまたはPEG修飾脂質などの、ポリエチレングリコールを含む1つまたは複数の分子を含み得る。そのような種は、代替的に、PEG化脂質とも呼ばれ得る。PEG脂質は、ポリエチレングリコールで修飾された脂質である。PEG脂質は、PEG修飾ホスファチジルエタノールアミン、PEG修飾ホスファチジン酸、PEG修飾セラミド、PEG修飾ジアルキルアミン、PEG修飾ジアシルグリセロール、PEG修飾ジアルキルグリセロール、及びこれらの混合物を含む非限定的な群から選択され得る。例えば、PEG脂質は、PEG-c-DOMG、PEG-DMG、PEG-DLPE、PEG-DMPE、PEG-DPPC、またはPEG-DSPE脂質であり得る。
いくつかの実施形態では、PEG修飾脂質は、PEG DMGの修飾形態である。PEG-DMGは、次の構造を有する。
1つの実施形態では、本発明に有用なPEG脂質は、国際公開第WO2012099755号に記載のPEG化脂質であってよく、当該文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。本明細書に記載のこれらの例示的なPEG脂質はいずれも、PEG鎖上にヒドロキシル基を含むように修飾されてもよい。ある特定の実施形態では、PEG脂質は、PEG-OH脂質である。本明細書で概して定義するように、「PEG-OH脂質」(本明細書において「ヒドロキシ-PEG化脂質」とも称される)は、脂質上に1つまたは複数のヒドロキシル(-OH)基を有するPEG化脂質である。ある特定の実施形態では、PEG-OH脂質は、PEG鎖上に1つまたは複数のヒドロキシル基を含む。ある特定の実施形態では、PEG-OHまたはヒドロキシ-PEG化脂質は、PEG鎖の末端に-OH基を含む。それぞれの可能性が本発明の別個の実施形態を表す。
ある特定の実施形態では、本発明に有用なPEG脂質は、式(VII)の化合物である。本明細書で提供されるのは、式(VII)の化合物:
またはその塩(式中、
R3は、-OROであり、
ROは、水素、任意選択で置換されたアルキル、または酸素保護基であり、
rは、1以上100以下の整数であり、
L1は、任意選択で置換されたC1-10アルキレンであり、ここで、任意選択で置換されたC1-10アルキレンのうちの少なくとも1つのメチレンは、任意選択で置換されたカルボシクリレン、任意選択で置換されたヘテロシクリレン、任意選択で置換されたアリーレン、任意選択で置換されたヘテロアリーレン、O、N(RN)、S、C(O)、C(O)N(RN)、NRNC(O)、C(O)O、-OC(O)、OC(O)O、OC(O)N(RN)、NRNC(O)O、またはNRNC(O)N(RN)で独立して置き換えられ、
Dは、クリックケミストリーによって得られる部分または生理学的条件下で切断可能な部分であり、
mは、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10であり、
Aは、式:
からなり、
L2はぞれぞれの場合において、独立して、単結合または任意選択で置換されたC1-6アルキレンであり、ここで、任意選択で置換されたC1-6アルキレンの1つのメチレン単位は、O、N(RN)、S、C(O)、C(O)N(RN)、NRNC(O)、C(O)O、OC(O)、OC(O)O、OC(O)N(RN)、-NRNC(O)O、またはNRNC(O)N(RN)で任意選択で置き換えられ、
R2はぞれぞれの場合において、独立して、任意選択で置換されたC1-30アルキル、任意選択で置換されたC1-30アルケニル、または任意選択で置換されたC1-30アルキニルであり、ここで、任意選択で、R2の1つまたは複数のメチレン単位は、任意選択で置換されたカルボシクリレン、任意選択で置換されたヘテロシクリレン、任意選択で置換されたアリーレン、任意選択で置換されたヘテロアリーレン、N(RN)、O、S、C(O)、C(O)N(RN)、NRNC(O)、-NRNC(O)N(RN)、C(O)O、OC(O)、OC(O)O、OC(O)N(RN)、NRNC(O)O、C(O)S、SC(O)、-C(=NRN)、C(=NRN)N(RN)、NRNC(=NRN)、NRNC(=NRN)N(RN)、C(S)、C(S)N(RN)、NRNC(S)、NRNC(S)N(RN)、S(O)、OS(O)、S(O)O、OS(O)O、OS(O)2、S(O)2O、OS(O)2O、N(RN)S(O)、-S(O)N(RN)、N(RN)S(O)N(RN)、OS(O)N(RN)、N(RN)S(O)O、S(O)2、N(RN)S(O)2、S(O)2N(RN)、N(RN)S(O)2N(RN)、OS(O)2N(RN)、またはN(RN)S(O)2Oで独立して置き換えられ、
RNはぞれぞれの場合において、独立して、水素、任意選択で置換されたアルキル、または窒素保護基であり、
環Bは、任意選択で置換されたカルボシクリル、任意選択で置換されたヘテロシクリル、任意選択で置換されたアリール、または任意選択で置換されたヘテロアリールであり、
pは、1または2である)である。
R3は、-OROであり、
ROは、水素、任意選択で置換されたアルキル、または酸素保護基であり、
rは、1以上100以下の整数であり、
L1は、任意選択で置換されたC1-10アルキレンであり、ここで、任意選択で置換されたC1-10アルキレンのうちの少なくとも1つのメチレンは、任意選択で置換されたカルボシクリレン、任意選択で置換されたヘテロシクリレン、任意選択で置換されたアリーレン、任意選択で置換されたヘテロアリーレン、O、N(RN)、S、C(O)、C(O)N(RN)、NRNC(O)、C(O)O、-OC(O)、OC(O)O、OC(O)N(RN)、NRNC(O)O、またはNRNC(O)N(RN)で独立して置き換えられ、
Dは、クリックケミストリーによって得られる部分または生理学的条件下で切断可能な部分であり、
mは、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10であり、
Aは、式:
L2はぞれぞれの場合において、独立して、単結合または任意選択で置換されたC1-6アルキレンであり、ここで、任意選択で置換されたC1-6アルキレンの1つのメチレン単位は、O、N(RN)、S、C(O)、C(O)N(RN)、NRNC(O)、C(O)O、OC(O)、OC(O)O、OC(O)N(RN)、-NRNC(O)O、またはNRNC(O)N(RN)で任意選択で置き換えられ、
R2はぞれぞれの場合において、独立して、任意選択で置換されたC1-30アルキル、任意選択で置換されたC1-30アルケニル、または任意選択で置換されたC1-30アルキニルであり、ここで、任意選択で、R2の1つまたは複数のメチレン単位は、任意選択で置換されたカルボシクリレン、任意選択で置換されたヘテロシクリレン、任意選択で置換されたアリーレン、任意選択で置換されたヘテロアリーレン、N(RN)、O、S、C(O)、C(O)N(RN)、NRNC(O)、-NRNC(O)N(RN)、C(O)O、OC(O)、OC(O)O、OC(O)N(RN)、NRNC(O)O、C(O)S、SC(O)、-C(=NRN)、C(=NRN)N(RN)、NRNC(=NRN)、NRNC(=NRN)N(RN)、C(S)、C(S)N(RN)、NRNC(S)、NRNC(S)N(RN)、S(O)、OS(O)、S(O)O、OS(O)O、OS(O)2、S(O)2O、OS(O)2O、N(RN)S(O)、-S(O)N(RN)、N(RN)S(O)N(RN)、OS(O)N(RN)、N(RN)S(O)O、S(O)2、N(RN)S(O)2、S(O)2N(RN)、N(RN)S(O)2N(RN)、OS(O)2N(RN)、またはN(RN)S(O)2Oで独立して置き換えられ、
RNはぞれぞれの場合において、独立して、水素、任意選択で置換されたアルキル、または窒素保護基であり、
環Bは、任意選択で置換されたカルボシクリル、任意選択で置換されたヘテロシクリル、任意選択で置換されたアリール、または任意選択で置換されたヘテロアリールであり、
pは、1または2である)である。
ある特定の実施形態では、式(VII)の化合物は、PEG-OH脂質である(すなわち、R3は、-OROであり、ROは、水素である)。ある特定の実施形態では、式(VII)の化合物は、式(VII-OH):
またはその塩のものである。
ある特定の実施形態では、Dは、クリックケミストリーによって得られる部分である(例えば、トリアゾール)。ある特定の実施形態では、式(VII)の化合物は、式(VII-a-1)または(VII-a-2):
またはその塩のものである。
ある特定の実施形態では、式(VII)の化合物は、次式:
またはその塩(式中、
sは、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10である)のうちの1つのものである。
sは、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10である)のうちの1つのものである。
ある特定の実施形態では、式(VII)の化合物は、次式:
またはその塩のうちの1つのものである。
ある特定の実施形態では、式(VII)の化合物は、次式:
またはその塩のうちの1つのものである。
ある特定の実施形態では、式(VII)の化合物は、次式:
またはその塩のうちの1つのものである。
ある特定の実施形態では、Dは、生理学的条件下で切断可能な部分である(例えば、エステル、アミド、カーボネート、カルバメート、ウレア)。ある特定の実施形態では、式(VII)の化合物は、式(VII-b-1)または(VII-b-2):
またはその塩のものである。
ある特定の実施形態では、式(VII)の化合物は、式(VII-b-1-OH)または(VII-b-2-OH):
またはその塩のものである。
ある特定の実施形態では、式(VII)の化合物は、次式:
またはその塩のうちの1つのものである。
ある特定の実施形態では、式(VII)の化合物は、次式:
またはその塩のうちの1つのものである。
ある特定の実施形態では、式(VII)の化合物は、次式
またはその塩のうちの1つのものである。
ある特定の実施形態では、式(VII)の化合物は、次式:
またはその塩のうちの1つのものである。
ある特定の実施形態では、本発明に有用なPEG脂質は、PEG化脂肪酸である。ある特定の実施形態では、本発明に有用なPEG脂質は、式(VIII)の化合物である。本明細書で提供されるのは、式(VIII)の化合物:
またはその塩(式中、
R3は、-OROであり、
ROは、水素、任意選択で置換されたアルキル、または酸素保護基であり、
rは、1以上100以下の整数であり、
R5は、任意選択で置換されたC10-40アルキル、任意選択で置換されたC10-40アルケニル、または任意選択で置換されたC10-40アルキニルであり、任意選択で、R5の1つまたは複数のメチレン基は、任意選択で置換されたカルボシクリレン、任意選択で置換されたヘテロシクリレン、任意選択で置換されたアリーレン、任意選択で置換されたヘテロアリーレン、N(RN)、O、S、C(O)、-C(O)N(RN)、NRNC(O)、NRNC(O)N(RN)、C(O)O、OC(O)、OC(O)O、OC(O)N(RN)、-NRNC(O)O、C(O)S、SC(O)、C(=NRN)、C(=NRN)N(RN)、NRNC(=NRN)、NRNC(=NRN)N(RN)、-C(S)、C(S)N(RN)、NRNC(S)、NRNC(S)N(RN)、S(O)、OS(O)、S(O)O、OS(O)O、OS(O)2、-S(O)2O、OS(O)2O、N(RN)S(O)、S(O)N(RN)、N(RN)S(O)N(RN)、OS(O)N(RN)、N(RN)S(O)O、-S(O)2、N(RN)S(O)2、S(O)2N(RN)、N(RN)S(O)2N(RN)、OS(O)2N(RN)、またはN(RN)S(O)2Oで置き換えられ、
RNはぞれぞれの場合において、独立して、水素、任意選択で置換されたアルキル、または窒素保護基である)である。
R3は、-OROであり、
ROは、水素、任意選択で置換されたアルキル、または酸素保護基であり、
rは、1以上100以下の整数であり、
R5は、任意選択で置換されたC10-40アルキル、任意選択で置換されたC10-40アルケニル、または任意選択で置換されたC10-40アルキニルであり、任意選択で、R5の1つまたは複数のメチレン基は、任意選択で置換されたカルボシクリレン、任意選択で置換されたヘテロシクリレン、任意選択で置換されたアリーレン、任意選択で置換されたヘテロアリーレン、N(RN)、O、S、C(O)、-C(O)N(RN)、NRNC(O)、NRNC(O)N(RN)、C(O)O、OC(O)、OC(O)O、OC(O)N(RN)、-NRNC(O)O、C(O)S、SC(O)、C(=NRN)、C(=NRN)N(RN)、NRNC(=NRN)、NRNC(=NRN)N(RN)、-C(S)、C(S)N(RN)、NRNC(S)、NRNC(S)N(RN)、S(O)、OS(O)、S(O)O、OS(O)O、OS(O)2、-S(O)2O、OS(O)2O、N(RN)S(O)、S(O)N(RN)、N(RN)S(O)N(RN)、OS(O)N(RN)、N(RN)S(O)O、-S(O)2、N(RN)S(O)2、S(O)2N(RN)、N(RN)S(O)2N(RN)、OS(O)2N(RN)、またはN(RN)S(O)2Oで置き換えられ、
RNはぞれぞれの場合において、独立して、水素、任意選択で置換されたアルキル、または窒素保護基である)である。
ある特定の実施形態では、式(VIII)の化合物は、式(VIII-OH):
またはその塩のものである。いくつかの実施形態では、rは、45である。さらに他の実施形態では、rは、1である。
ある特定の実施形態では、式(VIII)の化合物は、次式:
またはその塩のうちの1つのものである。いくつかの実施形態では、rは、45である。
さらに他の実施形態では、式(VIII)の化合物は、
またはその塩である。
1つの実施形態では、式(VIII)の化合物は、
である。
1つの実施形態では、本明細書に開示の医薬組成物の脂質組成物中のPEG脂質の量は、約0.1モル%~約5モル%、約0.5モル%~約5モル%、約1モル%~約5モル%、約1.5モル%~約5モル%、約2モル%~約5モル%モル%、約0.1モル%~約4モル%、約0.5モル%~約4モル%、約1モル%~約4モル%、約1.5モル%~約4モル%、約2モル%~約4モル%、約0.1モル%~約3モル%、約0.5モル%~約3モル%、約1モル%~約3モル%、約1.5モル%~約3モル%、約2モル%~約3モル%、約0.1モル%~約2モル%、約0.5モル%~約2モル%、約1モル%~約2モル%、約1.5モル%~約2モル%、約0.1モル%~約1.5モル%、約0.5モル%~約1.5モル%、または約1モル%~約1.5モル%の範囲である。
1つの実施形態では、本明細書に開示の脂質組成物中のPEG脂質の量は、約2モル%である。1つの実施形態では、本明細書に開示の脂質組成物中のPEG脂質の量は、約1.5モル%である。
1つの実施形態では、本明細書に開示の脂質組成物中のPEG脂質の量は、少なくとも約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、または5モル%である。
いくつかの態様では、本明細書に開示の医薬組成物の脂質組成物は、PEG脂質を含まない。
他のイオン化可能なアミノ脂質
本明細書に開示の医薬組成物の脂質組成物は、式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、または(VI)に従う脂質に加えて、またはこれに代えて、1つまたは複数のイオン化可能なアミノ脂質を含み得る。
本明細書に開示の医薬組成物の脂質組成物は、式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、または(VI)に従う脂質に加えて、またはこれに代えて、1つまたは複数のイオン化可能なアミノ脂質を含み得る。
イオン化可能な脂質は、3-(ジドデシルアミノ)-N1,N1,4-トリドデシル-1-ピペラジンエタンアミン(KL10)、N1-[2-(ジドデシルアミノ)エチル]-N1,N4,N4-トリドデシル-1,4-ピペラジンジエタンアミン(KL22)、14,25-ジトリデシル-15,18,21,24-テトラアザ-オクタトリアコンタン(KL25)、1,2-ジリノレイルオキシ-N,N-ジメチルアミノプロパン(DLin-DMA)、2,2-ジリノレイル-4-ジメチルアミノメチル-[1,3]-ジオキソラン(DLin-K-DMA)、ヘプタトリアコンタ-6,9,28,31-テトラエン-19-イル4-(ジメチルアミノ)ブタノエート(DLin-MC3-DMA)、2,2-ジリノレイル-4-(2-ジメチルアミノエチル)-[1,3]-ジオキソラン(DLin-KC2-DMA)、1,2-ジオレイルオキシ-N,N-ジメチルアミノプロパン(DODMA)、(13Z,165Z)-N,N-ジメチル-3-ノニドコサ-13-16-ジエン-1-アミン(L608)、2-({8-[(3β)-コレスト-5-エン-3-イルオキシ]オクチル}オキシ)-N,N-ジメチル-3-[(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イルオキシ]プロパン-1-アミン(オクチル-CLinDMA)、(2R)-2-({8-[(3β)-コレスト-5-エン-3-イルオキシ]オクチル}オキシ)-N,N-ジメチル-3-[(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イルオキシ]プロパン-1-アミン(オクチル-CLinDMA(2R))、及び(2S)-2-({8-[(3β)-コレスト-5-エン-3-イルオキシ]オクチル}オキシ)-N,N-ジメチル-3-[(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イルオキシ]プロパン-1-アミン(オクチル-CLinDMA(2S))からなる非限定的な群から選択することができる。これらに加えて、イオン化可能なアミノ脂質は、環式アミン基を含む脂質であってもよい。
イオン化可能な脂質はまた、国際公開第WO2017/075531A1号に開示の化合物であり得、当該文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。例えば、イオン化可能なアミノ脂質は、限定するものではないが、
及びこれらの任意の組み合わせを含む。
イオン化可能な脂質はまた、国際公開第WO2015/199952A1号に開示の化合物であり得、当該文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。例えば、イオン化可能なアミノ脂質は、限定するものではないが、
及びこれらの任意の組み合わせを含む。
ナノ粒子組成物
本明細書に開示の医薬組成物の脂質組成物は、上記のものに加えて、1つまたは複数の成分を含み得る。例えば、脂質組成物は、1つまたは複数の透過性エンハンサー分子、炭水化物、ポリマー、表面改質剤(例えば、界面活性剤)、または他の成分を含み得る。例えば、透過性エンハンサー分子は、米国特許出願公開第2005/0222064号に記載されている分子であってよい。炭水化物は、単糖(例えば、グルコース)及び多糖(例えば、グリコーゲンならびにその誘導体及び類似体)を含み得る。
本明細書に開示の医薬組成物の脂質組成物は、上記のものに加えて、1つまたは複数の成分を含み得る。例えば、脂質組成物は、1つまたは複数の透過性エンハンサー分子、炭水化物、ポリマー、表面改質剤(例えば、界面活性剤)、または他の成分を含み得る。例えば、透過性エンハンサー分子は、米国特許出願公開第2005/0222064号に記載されている分子であってよい。炭水化物は、単糖(例えば、グルコース)及び多糖(例えば、グリコーゲンならびにその誘導体及び類似体)を含み得る。
本明細書に開示の医薬組成物を封入または部分的に封入するために、ポリマーを含めること及び/または使用することができる(例えば、脂質ナノ粒子形態の医薬組成物)。ポリマーは、生分解性及び/または生体適合性であり得る。ポリマーは、ポリアミン、ポリエーテル、ポリアミド、ポリエステル、ポリカーバメート、ポリ尿素、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリイミド、ポリスルホン、ポリウレタン、ポリアセチレン、ポリエチレン、ポリエチレンイミン、ポリイソシアネート、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリアクリロニトリル、及びポリアリレートから選択することができるが、これらに限定されない。
脂質組成物とポリヌクレオチドの比の範囲は、約10:1~約60:1(wt/wt)であり得る。
いくつかの実施形態では、脂質組成物とポリヌクレオチドの比は、約10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1、26:1、27:1、28:1、29:1、30:1、31:1、32:1、33:1、34:1、35:1、36:1、37:1、38:1、39:1、40:1、41:1、42:1、43:1、44:1、45:1、46:1、47:1、48:1、49:1、50:1、51:1、52:1、53:1、54:1、55:1、56:1、57:1、58:1、59:1または60:1(wt/wt)であり得る。いくつかの実施形態では、脂質組成物と治療剤をコードするポリヌクレオチドとの重量/重量比は、約20:1または約15:1である。
1つの実施形態では、本明細書に記載の脂質ナノ粒子は、5:1、10:1、15:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1、45:1、50:1、55:1、60:1もしくは70:1の脂質:ポリヌクレオチド重量比、または限定するものではないが、5:1~約10:1、約5:1~約15:1、約5:1~約20:1、約5:1~約25:1、約5:1~約30:1、約5:1~約35:1、約5:1~約40:1、約5:1~約45:1、約5:1~約50:1、約5:1~約55:1、約5:1~約60:1、約5:1~約70:1、約10:1~約15:1、約10:1~約20:1、約10:1~約25:1、約10:1~約30:1、約10:1~約35:1、約10:1~約40:1、約10:1~約45:1、約10:1~約50:1、約10:1~約55:1、約10:1~約60:1、約10:1~約70:1、約15:1~約20:1、約15:1~約25:1,約15:1~約30:1、約15:1~約35:1、約15:1~約40:1、約15:1~約45:1、約15:1~約50:1、約15:1~約55:1、約15:1~約60:1もしくは約15:1~約70:1などの範囲もしくはこれらの比のいずれかで、ポリヌクレオチド(例えば、mRNA)を含み得る。
1つの実施形態では、本明細書に記載の脂質ナノ粒子は、およそ0.1mg/ml~2mg/ml、例えば、限定するものではないが、0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml、0.6mg/ml、0.7mg/ml、0.8mg/ml、0.9mg/ml、1.0mg/ml、1.1mg/ml、1.2mg/ml、1.3mg/ml、1.4mg/ml、1.5mg/ml、1.6mg/ml、1.7mg/ml、1.8mg/ml、1.9mg/ml、2.0mg/mlまたは2.0mg/mlを超える濃度で、ポリヌクレオチドを含むことができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示の医薬組成物は、脂質ナノ粒子(LNP)として製剤化される。したがって、本開示はまた、(i)本明細書に記載の式(I)または(III)の化合物などの送達剤を含む脂質組成物と、(ii)1つまたは複数の癌エピトープポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、を含む、ナノ粒子組成物を提供する。そのようなナノ粒子組成物において、本明細書に開示の脂質組成物は、1つまたは複数の癌エピトープポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを封入することができる。
ナノ粒子組成物は、典型的に、マイクロメートルまたはそれより小さいサイズであり、脂質二重層を含み得る。ナノ粒子組成物は、脂質ナノ粒子(LNP)、リポソーム(例えば、脂質ベシクル)、及びリポプレックスを包含する。例えば、ナノ粒子組成物は、直径が500nm以下の脂質二重層を有するリポソームであり得る。
ナノ粒子組成物は、例えば、脂質ナノ粒子(LNP)、リポソーム、及びリポプレックスを含む。いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は、1つまたは複数の脂質二重層を含むベシクルである。ある特定の実施形態では、ナノ粒子組成物は、水性コンパートメントによって分離された2つ以上の同心円状二重層を含む。脂質二重層は、官能化されてもよいし、及び/または互いに架橋されてもよい。脂質二重層は、1つまたは複数のリガンド、タンパク質、またはチャネルを含み得る。
いくつかの実施形態では、本開示のナノ粒子組成物は、式(I)、(III)、(IV)、(V)、または(VI)に従う少なくとも1つの化合物を含む。例えば、ナノ粒子組成物は、化合物1~147のうちの1つもしくは複数、または化合物1~342のうちの1つもしくは複数を含み得る。ナノ粒子組成物はまた、さまざまな他の成分も含むことができる。例えば、ナノ粒子組成物は、式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、または(VI)に従う脂質に加えて、(i)少なくとも1つのリン脂質、(ii)少なくとも1つの構造脂質、(iii)少なくとも1つのPEG脂質、または(iv)これらの任意の組み合わせなどの1つまたは複数の他の脂質を含み得る。構造脂質の組み込みは、例えば、式IIIに従う脂質が本発明の脂質ナノ粒子組成物に使用される場合、任意選択であってよい。
いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は、式(I)の化合物(例えば、化合物18、25、26または48)を含む。いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は、式(I)の化合物(例えば、化合物18、25、26または48)と、リン脂質(例えば、DSPC)と、を含む。
いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は、式(III)の化合物(例えば、化合物236)を含む。いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は、式(III)の化合物(例えば、化合物236)と、リン脂質(例えば、DOPEまたはDSPC)と、を含む。
いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は、式(I)の化合物(例えば、化合物18、25、26または48)からなるか、または本質的になる脂質組成物を含む。いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は、式(I)の化合物(例えば、化合物18、25、26または48)からなるか、または本質的になる脂質組成物と、リン脂質(例えば、DSPC)と、を含む。
いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は、式(III)の化合物(例えば、化合物236)からなるか、または本質的になる脂質組成物を含む。いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は、式(III)の化合物(例えば、化合物236)からなるか、または本質的になる脂質組成物と、リン脂質(例えば、DOPEまたはDSPC)と、を含む。
1つの実施形態では、脂質ナノ粒子は、イオン化可能な脂質、構造脂質、リン脂質、及びmRNAを含む。いくつかの実施形態では、LNPは、イオン化可能な脂質、PEG修飾脂質、リン脂質及び構造脂質を含む。いくつかの実施形態では、LNPは、約20~60%のイオン化可能な脂質:約5~25%のリン脂質:約25~55%の構造脂質;約0.5~15%のPEG修飾脂質のモル比を有する。いくつかの実施形態では、LNPは、約50%のイオン化可能な脂質、約1.5%のPEG修飾脂質、約38.5%の構造脂質及び約10%リン脂質のモル比を含む。いくつかの実施形態では、LNPは、約55%のイオン化可能な脂質、約2.5%のPEG脂質、約32.5%の構造脂質及び約10%のリン脂質のモル比を含む。いくつかの実施形態では、イオン化可能な脂質は、イオン化可能なアミノ脂質であり、リン脂質は、中性脂質であり、構造脂質は、コレステロールである。いくつかの実施形態では、LNPは、イオン化可能な脂質:コレステロール:DSPC:PEG脂質が50:38.5:10:1.5であるモル比を有する。いくつかの実施形態では、イオン化可能な脂質は、化合物18または化合物236であり、PEG脂質は、化合物428である。
いくつかの実施形態では、LNPは、化合物18:コレステロール:リン脂質:化合物428が50:38.5:10:1.5であるモル比を有する。いくつかの実施形態では、LNPは、化合物18:コレステロール:DSPC:化合物428が50:38.5:10:1.5であるモル比を有する。
いくつかの実施形態では、LNPは、化合物236:コレステロール:リン脂質:化合物428が50:38.5:10:1.5であるモル比を有する。いくつかの実施形態では、LNPは、化合物236:コレステロール:DSPC:化合物428が50:38.5:10:1.5であるモル比を有する。
いくつかの実施形態では、LNPは、0.4未満の多分散値を有する。いくつかの実施形態では、LNPは、中性のpHで正味の中性電荷を有する。いくつかの実施形態では、LNPは、50~150nmの平均直径を有する。いくつかの実施形態では、LNPは、80~100nmの平均直径を有する。
本明細書で概して定義するように、「脂質」という用語は、疎水性または両親媒性の性質を有する小分子を指す。脂質は、天然であっても合成であってもよい。脂質の種類の例には、脂肪、ろう、ステロール含有代謝産物、ビタミン、脂肪酸、グリセロ脂質、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、糖脂質、及びポリケチド、及びプレノール脂質が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの場合では、いくつかの脂質は、その両親媒性の性質により、水性媒体中でリポソーム、ベシクル、または膜を形成する。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子(LNP)は、イオン化可能な脂質を含み得る。本明細書で使用されるとき、「イオン化可能な脂質」という用語は、当該技術分野における通常の意味を有し、1つまたは複数の荷電性部分を含む脂質を指し得る。いくつかの実施形態では、イオン化可能な脂質は、正電荷を有してもよいし、負電荷を有してもよい。イオン化可能な脂質は、正電荷を有し得、その場合、「カチオン性脂質」と称され得る。ある特定の実施形態では、イオン化可能な脂質分子は、アミン基を含み得、イオン化可能なアミノ脂質と称され得る。本明細書で使用されるとき、「荷電性部分」は、形式電荷、例えば、一価(+1、または-1)、二価(+2、または-2)、三価(+3、または-3)などを所有する化学部分である。荷電性部分は、アニオン性(すなわち、負荷電性)またはカチオン性(すなわち、正荷電性)であり得る。正荷電性部分の例には、アミン基(例えば、一級、二級、及び/または三級アミン)、アンモニウム基、ピリジニウム基、グアニジン基、及びイミジゾリウム基が挙げられる。具体的な実施形態では、荷電性部分は、アミン基を含む。負荷電性基またはその前駆体の例には、カルボキシレート基、スルホネート基、サルフェート基、ホスホネ-ト基、ホスフェート基、ヒドロキシル基などが挙げられる。荷電性部分の電荷は、場合により、環境条件で変化し得、例えば、pHの変化により当該部分の電荷が変わり、及び/または当該部分が帯電したり、非帯電になったりする。一般に、分子の電荷密度は、一般に、分子の電荷密度は、所望のとおりに選択することができる。
「帯電した」または「荷電性部分」という用語は、分子上の「部分的な負電荷」または「部分的な正電荷」を指さないことを理解されたい。「部分的な負電荷」及び「部分的な正電荷」という用語は、当該技術分野におけるその通常の意味が与えられる。「部分的な負電荷」は、電子密度が結合の1つの原子に向かって引き抜かれるように分極し、原子上に部分的な負電荷を生成する結合を官能基が有する場合に生じ得る。当業者であれば、一般に、このように分極し得る結合を認識するであろう。
いくつかの実施形態では、イオン化可能な脂質は、イオン化可能なアミノ脂質であり、当該技術分野において「イオン化可能なカチオン性脂質」と称されることもある。1つの実施形態では、イオン化可能なアミノ脂質は、正電荷を有する親水性頭部と、リンカー構造を介して連結された疎水性尾部とを有し得る。
これらに加えて、イオン化可能な脂質は、環式アミン基を含む脂質であってもよい。
1つの実施形態では、イオン化可能な脂質は、限定するものではないが、国際公開第WO2013086354号及び同第WO2013116126号に記載のイオン化可能な脂質から選択され得、これらの文献のそれぞれの内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
さらに別の実施形態では、イオン化可能な脂質は、限定するものではないが、米国特許第7,404,969号の式CLI-CLXXXXIIから選択され得、当該文献のそれぞれは、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
1つの実施形態では、脂質は、国際公開第WO2012/170889号に記載のものなどの切断可能な脂質であり得、当該文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。1つの実施形態では、脂質は、当該技術分野において知られている方法及び/または国際公開第WO2013/086354号に記載の方法によって合成され得、当該文献のそれぞれの内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
ナノ粒子組成物は、さまざまな方法によって特徴付けることができる。例えば、顕微鏡検査法(例えば、透過型電子顕微鏡検査法または走査型電子顕微鏡検査法)を使用して、ナノ粒子組成物のモルホロジー及び粒径分布を調べることができる。動的光散乱法または電位差測定法(例えば、電位差滴定法)を使用して、ゼータ電位を測定することができる。動的光散乱法はまた、粒径を決定するために利用することもできる。また、Zetasizer Nano ZS(Malvern Instruments Ltd(Malvern,Worcestershire,UK))などの機器を使用して、粒径、多分散指数、及びゼータ電位などの、ナノ粒子組成物の複数の特徴を測定することができる。
いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は、式(I)の化合物(例えば、化合物18、25、26または48)からなるか、または本質的になる脂質組成物を含む。いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は、式(I)の化合物(例えば、化合物18、25、26または48)からなるか、または本質的になる脂質組成物と、リン脂質(例えば、DSPCまたはMSPC)と、を含む。
ナノ粒子組成物は、さまざまな方法によって特徴付けることができる。例えば、顕微鏡検査法(例えば、透過型電子顕微鏡検査法または走査型電子顕微鏡検査法)を使用して、ナノ粒子組成物のモルホロジー及び粒径分布を調べることができる。動的光散乱法または電位差測定法(例えば、電位差滴定法)を使用して、ゼータ電位を測定することができる。動的光散乱法はまた、粒径を決定するために利用することもできる。また、Zetasizer Nano ZS(Malvern Instruments Ltd(Malvern,Worcestershire,UK))などの機器を使用して、粒径、多分散指数、及びゼータ電位などの、ナノ粒子組成物の複数の特徴を測定することができる。
ナノ粒子のサイズは、限定するものではないが、炎症などの生物学的応答を阻止するのに役立ち得、またはポリヌクレオチドの生物学的作用を高め得る。
本明細書で使用されるとき、ナノ粒子組成物との関係における「(粒)径」または「平均(粒)径」は、ナノ粒子組成物の平均直径を指す。
1つの実施形態では、1つまたは複数の癌エピトープポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、限定するものではないが、約10~約20nm、約10~約30nm、約10~約40nm、約10~約50nm、約10~約60nm、約10~約70nm、約10~約80nm、約10~約90nm、約20~約30nm、約20~約40nm、約20~約50nm、約20~約60nm、約20~約70nm、約20~約80nm、約20~約90nm、約20~約100nm、約30~約40nm、約30~約50nm、約30~約60nm、約30~約70nm、約30~約80nm、約30~約90nm、約30~約100nm、約40~約50nm、約40~約60nm、約40~約70nm、約40~約80nm、約40~約90nm、約40~約100nm、約50~約60nm、約50~約70nm、約50~約80nm、約50~約90nm、約50~約100nm、約60~約70nm、約60~約80nm、約60~約90nm、約60~約100nm、約70~約80nm、約70~約90nm、約70~約100nm、約80~約90nm、約80~約100nm及び/または約90~約100nmなどの約10~約100nmの直径を有する脂質ナノ粒子に製剤化される。
1つの実施形態では、ナノ粒子は、約10~500nmの直径を有する。1つの実施形態では、ナノ粒子は、100nm超、150nm超、200nm超、250nm超、300nm超、350nm超、400nm超、450nm超、500nm超、550nm超、600nm超、650nm超、700nm超、750nm超、800nm超、850nm超、900nm超、950nm超または1000nm超の直径を有する。
いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物の最大寸法は、1μmまたはそれより小さい(例えば、1μm、900nm、800nm、700nm、600nm、500nm、400nm、300nm、200nm、175nm、150nm、125nm、100nm、75nm、50nmまたはそれより小さい)。
ナノ粒子組成物は、比較的均一であり得る。多分散指数を使用して、ナノ粒子組成物の均一性、例えば、ナノ粒子組成物の粒径分布を示すことができる。小さい(例えば、0.3未満の)多分散指数は、一般に、狭い粒径分布を示す。ナノ粒子組成物は、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.20、0.21、0.22、0.23、0.24、または0.25などの約0~約0.25の多分散指数を有し得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示のナノ粒子組成物の多分散指数は、約0.10~約0.20であり得る。
ナノ粒子組成物のゼータ電位を使用して、組成物の界面動電位を示すことができる。例えば、ゼータ電位は、ナノ粒子組成物の表面電荷を記述することができる。電荷の高い種は、細胞、組織、及び体内の他の要素と望ましくない相互作用を起こすことがあるので、比較的に小さい正または負の電荷を有するナノ粒子組成物が一般に望ましい。いくつかの実施形態では、本明細書に開示のナノ粒子組成物のゼータ電位は、約-10mV~約+20mV、約-10mV~約+15mV、約10mV~約+10mV、約-10mV~約+5mV、約-10mV~約0mV、約-10mV~約-5mV、約-5mV~約+20mV、約-5mV~約+15mV、約-5mV~約+10mV、約-5mV~約+5mV、約-5mV~約0mV、約0mV~約+20mV、約0mV~約+15mV、約0mV~約+10mV、約0mV~約+5mV、約+5mV~約+20mV、約+5mV~約+15mV、または約+5mV~約+10mVであり得る。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子のゼータ電位は、約0mV~約100mV、約0mV~約90mV、約0mV~約80mV、約0mV~約70mV、約0mV~約60mV、約0mV~約50mV、約0mV~約40mV、約0mV~約30mV、約0mV~約20mV、約0mV~約10mV、約10mV~約100mV、約10mV~約90mV、約10mV~約80mV、約10mV~約70mV、約10mV~約60mV、約10mV~約50mV、約10mV~約40mV、約10mV~約30mV、約10mV~約20mV、約20mV~約100mV、約20mV~約90mV、約20mV~約80mV、約20mV~約70mV、約20mV~約60mV、約20mV~約50mV、約20mV~約40mV、約20mV~約30mV、約30mV~約100mV、約30mV~約90mV、約30mV~約80mV、約30mV~約70mV、約30mV~約60mV、約30mV~約50mV、約30mV~約40mV、約40mV~約100mV、約40mV~約90mV、約40mV~約80mV、約40mV~約70mV、約40mV~約60mV、及び約40mV~約50mVであり得る。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子のゼータ電位は、約10mV~約50mV、約15mV~約45mV、約20mV~約40mV、及び約25mV~約35mVであり得る。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子のゼータ電位は、約10mV、約20mV、約30mV、約40mV、約50mV、約60mV、約70mV、約80mV、約90mV、及び約100mVであり得る。
ポリヌクレオチドに関する「封入効率」という用語は、調製後における、提供された初期量と比較した、ナノ粒子組成物によって封入されたまたは別様に会合しているポリヌクレオチドの量を記述するものである。本明細書で使用されるとき、「封入」は、完全な、実質的なまたは部分的な囲い込み、閉じ込め、取り囲み、または包み込みを指し得る。
封入効率は、望ましくは高い(例えば、100%に近い)。封入効率は、例えば、ナノ粒子組成物を含む溶液中のポリヌクレオチドの量を、1つまたは複数の有機溶媒または界面活性剤によって当該ナノ粒子組成物を破壊する前と後で比較することによって、測定することができる。
蛍光を使用して、溶液中の遊離ポリヌクレオチドの量を測定することができる。本明細書に記載のナノ粒子組成物について、ポリヌクレオチドの封入効率は、少なくとも50%、例えば、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%であり得る。いくつかの実施形態では、封入効率は、少なくとも80%であり得る。ある特定の実施形態では、封入効率は、少なくとも90%であり得る。
本明細書に開示の医薬組成物中に存在するポリヌクレオチドの量は、ポリヌクレオチドのサイズ、所望の標的及び/または用途、またはナノ粒子組成物の他の性質ならびにポリヌクレオチドの性質に依存し得る。
例えば、ナノ粒子組成物に有用なmRNAの量は、mRNAのサイズ(長さ、または分子量として表される)、配列、及び他の特徴に依存し得る。ナノ粒子組成物中のポリヌクレオチドの相対量も変動し得る。
本開示の脂質ナノ粒子組成物中に存在する脂質組成物とポリヌクレオチドの相対量は、有効性及び忍容性の考察に従って最適化することができる。ポリヌクレオチドとしてmRNAを含む組成物の場合、N:P比が有用な指標として役立ち得る。
ナノ粒子組成物のN:P比は、発現と忍容性の両方を制御するので、N:P比が低く、発現が強いナノ粒子組成物が望ましい。N:P比は、ナノ粒子組成物中の脂質とRNAの比によって変動する。
一般に、より小さいN:P比が好ましい。1つまたは複数のRNA、脂質、及びその量は、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、12:1、14:1、16:1、18:1、20:1、22:1、24:1、26:1、28:1、または30:1などの約2:1~約30:1のN:P比を提供するように選択することができる。ある特定の実施形態では、N:P比は、約2:1~約8:1であり得る。他の実施形態では、N:P比は、約5:1~約8:1である。ある特定の実施形態では、N:P比は、5:1~6:1である。具体的な1つの態様では、N:P比は、約5.67:1である。
ナノ粒子組成物を提供することに加えて、本開示はまた、ポリヌクレオチドを封入することを含む、脂質ナノ粒子の作製方法も提供する。当該方法は、本明細書に開示の医薬組成物のいずれかを使用することと、当該技術分野において知られている脂質ナノ粒子の作製方法に従って脂質ナノ粒子を作製することと、を含む。例えば、Wang et al.(2015)“Delivery of oligonucleotides with lipid nanoparticles” Adv.Drug Deliv.Rev.87:68-80;Silva et al.(2015)“Delivery Systems for Biopharmaceuticals.Part I:Nanoparticles and Microparticles” Curr.Pharm.Technol.16:940-954;Naseri et al.(2015)“Solid Lipid Nanoparticles and Nanostructured Lipid Carriers:Structure,Preparation and Application” Adv.Pharm.Bull.5:305-13;Silva et al.(2015)“Lipid nanoparticles for the delivery of biopharmaceuticals” Curr.Pharm.Biotechnol.16:291-302及び当該文献で引用されている参考文献を参照のこと。
キット製剤
本発明の他の態様では、こうした方法の達成を目的とするキットも提供される。キットは、脂質ナノ粒子製剤を収容する容器と、ワクチン製剤を収容する容器と、対象への投与までの24時間以内に、個別化mRNA癌ワクチンをワクチン製剤に添加して個別化mRNA癌ワクチン製剤を生成し、個別化mRNA癌ワクチン製剤と脂質ナノ粒子製剤とを混合することについての説明と、を含む。いくつかの実施形態では、キットは、2~100の癌抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するmRNAを含む。
本発明の他の態様では、こうした方法の達成を目的とするキットも提供される。キットは、脂質ナノ粒子製剤を収容する容器と、ワクチン製剤を収容する容器と、対象への投与までの24時間以内に、個別化mRNA癌ワクチンをワクチン製剤に添加して個別化mRNA癌ワクチン製剤を生成し、個別化mRNA癌ワクチン製剤と脂質ナノ粒子製剤とを混合することについての説明と、を含む。いくつかの実施形態では、キットは、2~100の癌抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するmRNAを含む。
物品は、1つまたは複数の容器に医薬グレードまたは診断グレードの本発明の化合物を含む。物品は、本発明の化合物の使用を促進または記載する説明またはラベルを含み得る。
本明細書に記載の「促進」は、教育、病院的及び他の臨床的説明、医薬販売を含む医薬業界活動、ならびに任意の形態の文書的、口頭的、及び電子的なコミュニケーションを含む任意の宣伝活動または他の販売促進活動を行う方法を含む、癌の治療に関して本発明の組成物と関連してビジネスを実施するすべての方法を含む。
「説明」は、販売促進の構成要素であると定義することができ、典型的には、本発明の組成物の梱包に対する文書的説明またはそれと関連する文書的説明を含む。説明は、任意の様式で提供される任意の口頭的または電子的な説明も含み得る。
したがって、いくつかの実施形態では、治療的、診断的、または研究的な用途におけるその使用を促進するための、医薬的または診断的または研究的なキットを、本明細書に記載の薬剤から構築してよい。キットは、本発明の構成要素及び使用説明を収容する1つまたは複数の容器を含み得る。具体的には、そのようなキットは、意図される治療用途及びこうした薬剤の適切な投与について記載する説明と共に、本明細書に記載の薬剤を1つまたは複数含み得る。ある特定の実施形態では、キットにおける薬剤は、特定の用途及び薬剤の投与方法に適した医薬製剤及び用量であり得る。
キットは、医師による本明細書に記載の方法の使用が容易になるように設計してよく、多くの形態をとることができる。キットの組成物はそれぞれ、適用可能な場合、液体形態(例えば、溶液)または固体形態(例えば、乾燥粉末)で提供してよい。ある特定の場合では、組成物のいくつかは、(例えば、活性形態にするために)例えば、適切な溶媒もしくは他の種類のもの(例えば、水もしくは細胞培養培地)を添加することによって構成可能であるか、または別の形で処理可能であり得、こうした溶媒または他の種類のものは、キットに付属して提供されてもされなくてもよい。本明細書で使用される「説明」は、説明及び/または販売促進の構成要素であると定義することができ、典型的には、本発明の梱包に対する文書的説明またはそれと関連する文書的説明を含む。説明は、任意の様式で提供される任意の口頭的または電子的な説明も含み得、その結果、使用者は、例えば、視聴覚的なもの(例えば、ビデオテープ、DVDなど)、インターネット、及び/またはウェブに基づくコミュニケーションなどを通して、説明がキットと関連することになると明確に認識することになる。文書的説明は、医薬物または生物学的産物の製造、使用、または販売を規制する政府機関によって規定された形態であり得、当該説明は、ヒトへの投与を目的とする製造、使用、または販売の機関による承認を反映したものでもあり得る。
キットは、本明細書に記載の要素のいずれか1つまたは複数を1つまたは複数の容器に含み得る。例として、1つの実施形態では、キットは、キットの1つまたは複数の構成要素の混合、及び/または試料の単離及び混合、ならびに対象への適用のための説明を含み得る。キットは、本明細書に記載の薬剤を収容する容器を含み得る。薬剤は、無菌的に調製し、シリンジに充填し、冷蔵配送してよい。あるいは、バイアルまたは他の貯蔵用容器に薬剤を収容してもよい。無菌的に調製された他の薬剤を第2の容器に収容してよい。あるいは、シリンジ、バイアル、チューブ、または他の容器において配送される事前混合済の活性剤をキットに含めてもよい。
キットは、ブリスターパウチ、収縮包装パウチ、真空密封可能なパウチ、密封可能な熱形成トレイ、または同様のパウチ形態もしくはトレイ形態などのさまざまな形態を有し得、パウチ、1つまたは複数のチューブ、容器、箱、またはバッグの中に緩く梱包された付属物を共に含む。キットは、付属物を追加した後に無菌化してよく、それによって容器内の個々の付属品を通常なら未包装となる状態にしておくことが可能になる。キットは、放射線滅菌法、加熱滅菌法、または当該技術分野において知られる他の滅菌法などの、任意の適切な滅菌技術を使用して無菌化することができる。キットは、特定の用途に応じて他の構成要素も含み得、こうした構成要素は、例えば、容器、細胞培地、塩、緩衝剤、試薬、シリンジ、針、消毒剤の適用または除去のためのガーゼなどの布、使い捨ての手袋、投与前の薬剤支持体などである。
キットの組成物は、例えば、液体溶液または乾燥粉末などの任意の適切な形態として提供してよい。提供される組成物が乾燥粉末であるとき、粉末は、併せて提供され得る適切な溶媒を添加することによって再構成してよい。液体形態の組成物が使用される実施形態では、液体形態は、濃縮するか、またはすぐ使用可能な状態にしてよい。溶媒は、使用または投与される化合物及び様式に依存することになる。薬物組成物に適した溶媒はよく知られており、文献から情報を入手することが可能である。溶媒は、使用または投与される化合物及び様式に依存することになる。
実施形態の1つのセットでは、キットは、バイアル、チューブ、及び同様のものなどの1つまたは複数の容器手段を密閉受容する区分けされた運搬手段を含み得、容器手段はそれぞれ、方法において使用されることになる別々の要素のうちの1つを含む。例えば、容器の1つは、アッセイに対する正の対照を含み得る。さらに、キットは、例えば、アッセイにおいて有用な緩衝液などの他の構成要素のための容器を含み得る。
本発明は、梱包及びラベル添付が終了した医薬製品も包含する。この製造物品は、ガラスバイアルまたは密閉される他の容器などの適切なベッセルまたは容器に、適切な単位用量形態を含む。非経口投与に適した用量形態の場合、活性成分は無菌であり、微粒子を含有しない溶液としての投与に適している。言い換えれば、本発明は、非経口溶液と凍結乾燥粉末との両方を包含し、これらはそれぞれ無菌であり、後者は注射前の再構成に適するものである。あるいは、単位用量形態は、経口送達、経皮送達、局所送達、または経粘膜送達に適した固体であり得る。
好ましい実施形態では、単位用量形態は、静脈内送達、筋肉内送達、または皮下送達に適する。したがって、本発明は、溶液を包含し、こうした溶液は、好ましくは、無菌でありそれぞれの送達経路に適したものである。
別の好ましい実施形態では、本発明の組成物は、生体適合性界面活性剤または他のタンパク質と共に容器に貯蔵され、こうした界面活性剤には、限定はされないが、レシチン、タウロコール酸、及びコレステロールが含まれ、こうした他のタンパク質には、限定はされないが、ガンマグロブリン及び血清アルブミンが含まれる。より好ましくは、本発明の組成物は、ヒトにおける使用目的ではヒト血清アルブミンと共に貯蔵され、獣医学的な使用目的ではウシ血清アルブミンと共に貯蔵される。
任意の医薬製品と同様に、梱包材料及び容器は、貯蔵及び発送の間に製品の安定性が保護されるように設計される。さらに、本発明の製品は、使用説明、または問題の疾患もしくは障害をどのように適切に予防もしくは治療するかについて医師、専門技師、もしくは患者に通知する他の情報材料を含む。言い換えれば、製造物品は、投薬レジメンを指示または提案する説明手段を含み、こうした投薬レジメンには、限定はされないが、実際用量、監視手順(平均絶対リンパ球数、腫瘍細胞数、及び腫瘍サイズの監視方法など)ならびに他の監視情報が含まれる。
より具体的には、本発明は、箱、ボトル、チューブ、バイアル、容器、噴霧器、吸入器、静注輸液(静注)バッグ、エンベロープ、及び同様のものなどの梱包材料と、当該梱包材料内に含まれる少なくとも1つの単位用量形態の医薬剤と、を含む製造物品を提供する。本発明は、箱、ボトル、チューブ、バイアル、容器、噴霧器、吸入器、静注輸液(静注)バッグ、エンベロープ、及び同様のものなどの梱包材料と、当該梱包材料内に含まれる少なくとも1つの単位用量形態のそれぞれの医薬剤と、を含む製造物品も提供する。本発明は、箱、ボトル、チューブ、バイアル、容器、噴霧器、吸入器、静注輸液(静注)バッグ、エンベロープ、及び同様のものなどの梱包材料と、当該梱包材料内に含まれる少なくとも1つの単位用量形態のそれぞれの医薬剤と、を含む製造物品をさらに提供する。本発明は、製剤の注射を目的とする針もしくはシリンジ(好ましくは、無菌形態で梱包される)、及び/または梱包されたアルコールパッドを含む製造物品をさらに提供する。
ワクチン組成物における活性成分、薬学的に許容される賦形剤、及び/または任意の追加成分の相対量は、治療中の対象の独自性、サイズ、及び/または病状、さらにこれらに加えて、組成物が投与されることになる経路に応じて変わり得るものである。例えば、組成物は、活性成分を0.1%~99%(w/w)含み得る。例として、組成物は、活性成分を0.1%~100%(w/w)含み得、例えば、.5~50%(w/w)、1~30%(w/w)、5~80%(w/w)、少なくとも80%(w/w)含む。
いくつかの実施形態では、医薬製品を含むパッケージは、0.1mg~1mgのmRNAを含有する。いくつかの実施形態では、医薬製品を含むパッケージは、0.35mgのmRNAを含有する。いくつかの実施形態では、mRNAの濃度は、1mg/mLである。
いくつかの実施形態では、医薬製品を含むパッケージは、5~15mgの総脂質を含有する。いくつかの実施形態では、医薬製品を含むパッケージは、7mgの総脂質を含有する。いくつかの実施形態では、総脂質の濃度は、20mg/mLである。
いくつかの実施形態では、所望の治療効果、診断効果、予防効果、または造影効果を得るために、対象の体重当たりとして1日当たり0.0001mg/kg~100mg/kg、0.001mg/kg~0.05mg/kg、0.005mg/kg~0.05mg/kg、0.001mg/kg~0.005mg/kg、0.05mg/kg~0.5mg/kg、0.01mg/kg~50mg/kg、0.1mg/kg~40mg/kg、0.5mg/kg~30mg/kg、0.01mg/kg~10mg/kg、0.1mg/kg~10mg/kg、または1mg/kg~25mg/kgを送達するために十分な用量レベルでRNA(例えば、mRNA)ワクチン組成物を、1日当たり、1週間当たり、1ヶ月当たりなどに1回または複数回投与してよい(例えば、国際公開第WO2013/078199号に記載の単位用量の範囲を参照のこと。当該文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる)。いくつかの実施形態では、RNA(例えば、mRNA)ワクチンは、0.0100mg、0.025mg、0.050mg、0.075mg、0.100mg、0.125mg、0.150mg、0.175mg、0.200mg、0.225mg、0.250mg、0.275mg、0.300mg、0.325mg、0.350mg、0.375mg、0.400mg、0.425mg、0.450mg、0.475mg、0.500mg、0.525mg、0.550mg、0.575mg、0.600mg、0.625mg、0.650mg、0.675mg、0.700mg、0.725mg、0.750mg、0.775mg、0.800mg、0.825mg、0.850mg、0.875mg、0.900mg、0.925mg、0.950mg、0.975mg、または1.0mgを送達するために十分な用量レベルで投与される。いくつかの実施形態では、RNA(例えば、mRNA)ワクチンは、10μg~400μgのmRNAワクチンを送達するために十分な用量レベルで対象に投与される。いくつかの実施形態では、RNA(例えば、mRNA)ワクチンは、0.033mg、0.1mg、0.2mg、または0.4mgを送達するために十分な用量レベルで対象に投与される。
所望の用量は、1日に3回、1日に2回、1日に1回、2日ごとに1回、3日ごとに1回、1週間ごとに1回、2週間ごとに1回、3週間ごとに1回、4週間ごとに1回、2ヶ月ごとに1回、3ヶ月ごとに1回、6ヶ月ごとに1回などの頻度で送達してよい。ある特定の実施形態では、所望の用量は、複数回の投与(例えば、2回、3回、4回、5回、6回、7回、8回、9回、10回、11回、12回、13回、14回、またはそれを超える回数の投与)を使用して送達してよい。複数回投与が用いられるときは、本明細書に記載のものなどの分割投薬レジメンを使用してよい。いくつかの実施形態では、RNAワクチン組成物は、0.0005mg/kg~0.01mg/kgを送達するために十分な用量レベルで投与してよく、例えば、約0.0005mg/kg~約0.0075mg/kg、例えば、約0.0005mg/kg、約0.001mg/kg、約0.002mg/kg、約0.003mg/kg、約0.004mg/kg、または約0.005mg/kgを送達するために十分な用量レベルで投与してよい。いくつかの実施形態では、RNAワクチン組成物は、0.025mg/kg~0.250mg/kg、0.025mg/kg~0.500mg/kg、0.025mg/kg~0.750mg/kg、または0.025mg/kg~1.0mg/kgを送達するために十分な用量レベルで1回または2回(またはそれを超える回数)投与してよい。
いくつかの実施形態では、RNAワクチン組成物は、0.0100mg、0.025mg、0.050mg、0.075mg、0.100mg、0.125mg、0.150mg、0.175mg、0.200mg、0.225mg、0.250mg、0.275mg、0.300mg、0.325mg、0.350mg、0.375mg、0.400mg、0.425mg、0.450mg、0.475mg、0.500mg、0.525mg、0.550mg、0.575mg、0.600mg、0.625mg、0.650mg、0.675mg、0.700mg、0.725mg、0.750mg、0.775mg、0.800mg、0.825mg、0.850mg、0.875mg、0.900mg、0.925mg、0.950mg、0.975mg、または1.0mgの総用量またはその総用量を送達するために十分な用量レベルで、2回(例えば、0日目と7日目、0日目と14日目、0日目と21日目、0日目と28日目、0日目と60日目、0日目と90日目、0日目と120日目、0日目と150日目、0日目と180日目、0日目と3ヶ月後、0日目と6ヶ月後、0日目と9ヶ月後、0日目と12ヶ月後、0日目と18ヶ月後、0日目と2年後、0日目と5年後、または0日目と10年後)投与してよい。本開示は、投与用量を上げたもの及び下げたもの、ならびに投与頻度を上げたもの及び下げたものを包含する。例えば、RNAワクチン組成物は、3回もしくは4回またはそれより多い回数投与してよい。いくつかの実施形態では、mRNAワクチン組成物は、3週間ごとに1日1回投与される。
いくつかの実施形態では、RNAワクチン組成物は、0.010mg、0.025mg、0.100mg、または0.400mgの総用量またはその総用量を送達するために十分な用量レベルで、2回(例えば、0日目と7日目、0日目と14日目、0日目と21日目、0日目と28日目、0日目と60日目、0日目と90日目、0日目と120日目、0日目と150日目、0日目と180日目、0日目と3ヶ月後、0日目と6ヶ月後、0日目と9ヶ月後、0日目と12ヶ月後、0日目と18ヶ月後、0日目と2年後、0日目と5年後、または0日目と10年後)投与してよい。
いくつかの実施形態では、対象のワクチン接種方法における使用を目的とするRNAワクチンでは、対象のワクチン接種に有効な量で、10μg/kg~400μg/kgの単回用量の核酸ワクチンが対象に投与される。いくつかの実施形態では、対象のワクチン接種方法における使用を目的とするRNAワクチンでは、対象のワクチン接種に有効な量で、10μg~400μgの単回用量の核酸ワクチンが対象に投与される。
いくつかの実施形態では、RNAワクチン組成物は、MC3、コレステロール、DSPC、及びPEG2000-DMGを含む脂質ナノ粒子において製剤化された本明細書に記載のポリヌクレオチド、クエン酸三ナトリウム緩衝剤、スクロース、ならびに注射用水を含み得る。非限定例として、組成物は、2.0mg/mLの薬物物質(例えば、癌抗原をコードするポリヌクレオチド)、21.8mg/mLのMC3、10.1mg/mLのコレステロール、5.4mg/mLのDSPC、2.7mg/mLのPEG2000-DMG、5.16mg/mLのクエン酸三ナトリウム、71mg/mLのスクロース、及び1.0mLの注射用水を含む。
いくつかの実施形態では、ナノ粒子(例えば、脂質ナノ粒子)は、10~500nm、20~400nm、30~300nm、40~200nmの平均直径を有する。いくつかの実施形態では、ナノ粒子(例えば、脂質ナノ粒子)は、50~150nm、50~200nm、80~100nm、または80~200nmの平均直径を有する。
いくつかの実施形態では、RNAワクチンは、5~15mgの総脂質、例えば、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14または15mgの総脂質を含む。いくつかの実施形態では、RNAワクチンは、7mgの総脂質を含む。いくつかの実施形態では、ワクチン製剤中の総脂質の濃度は、10~30mg/mL、例えば、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30mg/mLである。
フラゲリンは、約500のアミノ酸の単量体タンパク質であり、このタンパク質が重合することで、細菌の動きと関連する鞭毛が形成される。さまざまな鞭毛細菌(例えば、Salmonella typhimurium)ならびに非鞭毛細菌(Escherichia coliなど)がフラゲリンを発現する。自然免疫系の細胞(樹状細胞、マクロファージなど)によるフラゲリンの感知は、Toll様受容体5(TLR5)ならびにNod様受容体(NLR)であるIpaf及びNaip5によって媒介される。TLR及びNLRは、自然免疫応答及び適応免疫応答の活性化において一定の役割を担うことが同定されている。したがって、フラゲリンは、ワクチンにおいてアジュバント効果を発揮する。
既知のフラゲリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、NCBIのGenBankデータベースにおいて公的に利用可能である。フラゲリン配列としては、数ある中でも特に、S.Typhimurium、H.Pylori、V.Cholera、S.marcesens、S.flexneri、T.pallidum、L.pneumophila、B.burgdorferei、C.difficile、R.meliloti、A.tumefaciens、R.lupini、B.clarridgeiae、P.Mirabilis、B.subtilus、L.monocytogenes、P.aeruginosa、及びE.coliに由来するものが知られている。
本明細書で使用されるフラゲリンポリペプチドは、全長フラゲリンタンパク質、その免疫原性断片、及びフラゲリンタンパク質またはその免疫原性断片に対して少なくとも50%の配列同一性を有するペプチドを指す。フラゲリンタンパク質の例には、Salmonella typhi(UniPro登録番号:Q56086)、Salmonella typhimurium(A0A0C9DG09)、Salmonella enteritidis(A0A0C9BAB7)、及びSalmonella choleraesuis(Q6V2X8)に由来するフラゲリンが含まれる。いくつかの実施形態では、フラゲリンポリペプチドは、フラゲリンタンパク質またはその免疫原性断片に対して、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列同一性を有する。
いくつかの実施形態では、フラゲリンポリペプチドは、免疫原性断片である。免疫原性断片は、免疫応答を誘発するフラゲリンタンパク質の一部分である。いくつかの実施形態では、免疫応答は、TLR5を介する免疫応答である。免疫原性断片の例は、ヒンジ領域のすべてまたは一部が、欠失または他のアミノ酸と交換されたフラゲリンタンパク質である。例えば、抗原ポリペプチドをヒンジ領域に挿入してよい。ヒンジ領域は、フラゲリンの超可変領域である。フラゲリンのヒンジ領域は、「D3ドメインまたはD3領域」、「プロペラドメインまたはプロペラ領域」、「超可変ドメインまたは超可変領域」、及び「可変ドメインまたは可変領域」とも称される。本明細書で使用される「ヒンジ領域の少なくとも一部」は、フラゲリンのヒンジ領域の任意の部分、またはヒンジ領域全体を指す。他の実施形態では、フラゲリンの免疫原性断片は、20、25、30、35、または40のアミノ酸のフラゲリンC末端断片である。
フラゲリン単量体は、ドメインD0~D3によって形成される。D0及びD1は、ステムを形成するものであり、タンデム型の長いアルファヘリックスから構成され、異なる細菌の間で高度に保存されている。D1ドメインは、TLR5の活性化に有用なアミノ酸ストレッチをいくつか含む。D1ドメイン全体またはドメイン内の活性領域の1つもしくは複数が、フラゲリンの免疫原性断片である。D1ドメイン内の免疫原性領域の例には、Salmonella typhimuriumのフラゲリンであるFliCにおける残基88~114及び残基411~431が含まれる。88~100の領域における13のアミノ酸の中では、Salmonellaのフラゲリン及び他のフラゲリンの間で少なくとも6つの置換が許容され、こうした置換が存在してもTLR5の活性化は依然として保存される。したがって、フラゲリンの免疫原性断片には、TLR5を活性化すると共に、FliCの88~100のSalmonella配列(LQRVRELAVQSAN(配列番号356))に対する同一性が53%以上である13のアミノ酸のモチーフを含むフラゲリン様配列が含まれる。
いくつかの実施形態では、RNA(例えば、mRNA)ワクチンは、フラゲリンと1つまたは複数の抗原ポリペプチドとの融合タンパク質をコードするRNAを含む。本明細書で使用される「融合タンパク質」は、構築物の2つの構成要素が連結されたものを指す。いくつかの実施形態では、抗原ポリペプチドのカルボキシ末端は、フラゲリンポリペプチドのアミノ末端に融合または連結される。他の実施形態では、抗原ポリペプチドのアミノ末端は、フラゲリンポリペプチドのカルボキシ末端に融合または連結される。融合タンパク質には、例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、またはそれを超える数のフラゲリンポリペプチドと、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、またはそれを超える数の抗原ポリペプチドと、が連結されたものが含まれ得る。2つ以上のフラゲリンポリペプチド及び/または2つ以上の抗原ポリペプチドが連結されると、そのような構築物は、「多量体」と称され得る。
融合タンパク質の構成要素はそれぞれ、互いに直接連結するか、またはリンカーを介して連結してよい。例えば、リンカーは、アミノ酸リンカーであり得る。融合タンパク質の構成要素を連結するためにRNA(例えば、mRNA)ワクチンによってコードされるアミノ酸リンカーには、例えば、リジン残基、グルタミン酸残基、セリン残基、及びアルギニン残基からなる群から選択される少なくとも1つのメンバーが含まれ得る。いくつかの実施形態では、リンカーは、1~30、1~25、1~25、5~10、5、15、または5~20のアミノ酸長である。
ワクチンの投与様式
癌RNAワクチンは、治療的に有効な結果をもたらす任意の経路によって投与してよい。こうしたものには、限定はされないが、皮内投与、筋肉内投与、及び/または皮下投与が含まれる。本開示は、RNAワクチンを必要とする対象へのその投与を含む方法を提供する。正確な必要量は、対象の種、年齢、及び全身状態、疾患の重症度、特定の組成物、その投与様式、その活性様式、ならびに同様のものに応じて対象ごとに変わることになる。癌RNAワクチン組成物は、典型的には、投与を容易化し、用量を均一にするための単位剤形において製剤化される。しかしながら、癌RNAワクチン組成物の全体的な日々の用法は、健全な医学的判断の範囲内で主治医によって決定され得ることを理解されたい。任意の特定の患者を対象とする治療的に有効、予防的に有効、または適切な造影の特定用量レベルは、さまざまな因子に依存することになり、こうした因子には、治療中の障害及び障害の重症度、用いられる特定の化合物の活性、用いられる特定の組成物、年齢、体重、総体的な健康、患者の性別及び食事、投与時間、投与経路、及び用いられる特定の化合物の排出速度、治療の期間、用いられる特定の化合物と組み合わせられるか、または同時発生的に使用される薬物、ならびに医学分野においてよく知られる同様の因子が含まれる。
癌RNAワクチンは、治療的に有効な結果をもたらす任意の経路によって投与してよい。こうしたものには、限定はされないが、皮内投与、筋肉内投与、及び/または皮下投与が含まれる。本開示は、RNAワクチンを必要とする対象へのその投与を含む方法を提供する。正確な必要量は、対象の種、年齢、及び全身状態、疾患の重症度、特定の組成物、その投与様式、その活性様式、ならびに同様のものに応じて対象ごとに変わることになる。癌RNAワクチン組成物は、典型的には、投与を容易化し、用量を均一にするための単位剤形において製剤化される。しかしながら、癌RNAワクチン組成物の全体的な日々の用法は、健全な医学的判断の範囲内で主治医によって決定され得ることを理解されたい。任意の特定の患者を対象とする治療的に有効、予防的に有効、または適切な造影の特定用量レベルは、さまざまな因子に依存することになり、こうした因子には、治療中の障害及び障害の重症度、用いられる特定の化合物の活性、用いられる特定の組成物、年齢、体重、総体的な健康、患者の性別及び食事、投与時間、投与経路、及び用いられる特定の化合物の排出速度、治療の期間、用いられる特定の化合物と組み合わせられるか、または同時発生的に使用される薬物、ならびに医学分野においてよく知られる同様の因子が含まれる。
いくつかの実施形態では、所望の治療効果、診断効果、予防効果、または造影効果を得るために、対象の体重当たりとして1日当たり0.0001mg/kg~100mg/kg、0.001mg/kg~0.05mg/kg、0.005mg/kg~0.05mg/kg、0.001mg/kg~0.005mg/kg、0.05mg/kg~0.5mg/kg、0.01mg/kg~50mg/kg、0.1mg/kg~40mg/kg、0.5mg/kg~30mg/kg、0.01mg/kg~10mg/kg、0.1mg/kg~10mg/kg、または1mg/kg~25mg/kgを送達するために十分な用量レベルで癌RNAワクチン組成物を、1日当たり、1週間当たり、1ヶ月当たりなどに1回または複数回投与してよい(例えば、国際公開第WO2013/078199号に記載の単位用量の範囲を参照のこと。当該文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる)。所望の用量は、1日に3回、1日に2回、1日に1回、2日ごとに1回、3日ごとに1回、1週間ごとに1回、2週間ごとに1回、3週間ごとに1回、4週間ごとに1回、2ヶ月ごとに1回、3ヶ月ごとに1回、6ヶ月ごとに1回などの頻度で送達してよい。ある特定の実施形態では、所望の用量は、複数回の投与(例えば、2回、3回、4回、5回、6回、7回、8回、9回、10回、11回、12回、13回、14回、またはそれを超える回数の投与)を使用して送達してよい。複数回投与が用いられるときは、本明細書に記載のものなどの分割投薬レジメンを使用してよい。例示の実施形態では、癌RNAワクチン組成物は、0.0005mg/kg~0.01mg/kgを送達するために十分な用量レベルで投与してよく、例えば、約0.0005mg/kg~約0.0075mg/kg、例えば、約0.0005mg/kg、約0.001mg/kg、約0.002mg/kg、約0.003mg/kg、約0.004mg/kg、または約0.005mg/kgを送達するために十分な用量レベルで投与してよい。
本明細書に記載のRNAワクチン医薬組成物は、鼻腔内へのもの、気管内へのもの、または注射用のもの(例えば、静脈内、眼内、硝子体内、筋肉内、皮内、心臓内、腹腔内、及び皮下へのもの)などの、本明細書に記載の剤形へと製剤化することができる。
本発明は、下記の説明に示されるか、または図面に例示される構成の詳細及び構成要素の配置にその用途が限定されることはない。本発明は、他の実施形態が可能であり、さまざまな様式において実施または実行することが可能である。また、本明細書で使用される用語表現及び専門用語は、説明を目的とするものであり、限定であると見なされるべきではない。「including(含む)」、「comprising(含む)」、または「having(有する)」、「containing(含む)」、「involving(含む)」、及びその変形形態の本明細書での使用は、その後に列挙される項目及びその同等形態ならびに追加の項目を包含することが意図される。
実施例1.ポリヌクレオチドの製造
本開示によれば、ポリヌクレオチド及びまたはその一部もしくは領域の製造は、「RNA転写物の生成を目的とする製造方法」と題する国際出願WO2014/152027に教示される方法を利用して達成してよく、当該文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
本開示によれば、ポリヌクレオチド及びまたはその一部もしくは領域の製造は、「RNA転写物の生成を目的とする製造方法」と題する国際出願WO2014/152027に教示される方法を利用して達成してよく、当該文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
精製方法には、国際出願WO2014/152030及びWO2014/152031に教示されるものが含まれ得、これらの文献はそれぞれ、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
ポリヌクレオチドの検出方法及び特徴付け方法は、WO2014/144039に教示されるように実施してよく、当該文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
本開示のポリヌクレオチドの特徴付けは、ポリヌクレオチドマッピング、逆転写酵素によるシークエンシング、電荷分布解析、及びRNA不純物の検出からなる群から選択される手順を使用して達成してよく、特徴付けは、RNA転写物の配列決定、RNA転写物の純度決定、またはRNA転写物の電荷不均一性の決定を含む。そのような方法は、例えば、WO2014/144711及びWO2014/144767に教示されており、これらの文献のそれぞれの内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
実施例2 キメラポリヌクレオチドの合成
序論
本開示によれば、トリホスフェートケミストリーを使用し、キメラポリヌクレオチドの2つの領域または部分を連結またはライゲーションしてよい。
序論
本開示によれば、トリホスフェートケミストリーを使用し、キメラポリヌクレオチドの2つの領域または部分を連結またはライゲーションしてよい。
この方法によれば、100以下のヌクレオチドの第1の領域または部分は、化学的に合成され、5’はモノホスフェートとなり、末端の3’OHは除去または遮断される。領域が80ヌクレオチドより長いのであれば、ライゲーションするための2つの鎖として合成してよい。
第1の領域または部分が、インビトロ転写(IVT)を使用して、非位置的に修飾された領域または部分として合成されるのであれば、その後に、5’モノホスフェートへの変換、続いて3’末端のキャッピングを実施してよい。
モノホスフェート保護基は、当該技術分野で知られるもののいずれから選択してもよい。
キメラポリヌクレオチドの第2の領域または部分は、化学合成法またはIVT法のいずれを使用して合成してもよい。IVT法は、修飾されたキャップを有するプライマーを利用することができるRNAポリメラーゼの使用を含み得る。あるいは、130までのヌクレオチドのキャップは、化学的に合成し、IVTの領域または部分にカップリングさせてよい。
キメラポリヌクレオチド全体がホスフェート-糖骨格で製造される必要はない。領域または部分の1つがポリペプチドをコードするのであれば、そのような領域または部分は、ホスフェート-糖骨格を含むことが好ましい。
その後、ライゲーションは、任意の既知のクリックケミストリー、オルトクリックケミストリー、ソルリンク(solulink)、または当業者に知られる他の生体複合化ケミストリーを使用して実施される。
合成経路
キメラポリヌクレオチドは、一連の出発セグメントを使用して調製される。そのようなセグメントは、
(a)通常の3’OHを含み、5’がキャップされて保護されたセグメント(セグメント1)
(b)ポリペプチドのコード領域を含み得、通常の3’OHを含み、5’にトリホスフェートを有するセグメント(セグメント2)
(c)キメラポリヌクレオチドの3’末端(例えば、尾部)向けに5’にモノホスフェートを有し、コーディセピンを含むか、または3’OHを含まないセグメント(セグメント3)
合成(化学的またはIVT)の後、セグメント3(セグメント3)は、コーディセピンで処理され、その後、ピロホスファターゼで処理されることで5’モノホスフェートが創出される。
キメラポリヌクレオチドは、一連の出発セグメントを使用して調製される。そのようなセグメントは、
(a)通常の3’OHを含み、5’がキャップされて保護されたセグメント(セグメント1)
(b)ポリペプチドのコード領域を含み得、通常の3’OHを含み、5’にトリホスフェートを有するセグメント(セグメント2)
(c)キメラポリヌクレオチドの3’末端(例えば、尾部)向けに5’にモノホスフェートを有し、コーディセピンを含むか、または3’OHを含まないセグメント(セグメント3)
合成(化学的またはIVT)の後、セグメント3(セグメント3)は、コーディセピンで処理され、その後、ピロホスファターゼで処理されることで5’モノホスフェートが創出される。
その後、セグメント2(セグメント2)は、RNAリガーゼを使用してセグメント3にライゲーションされる。その後、ライゲーションされたポリヌクレオチドは、精製され、ピロホスファターゼで処理されることでジホスフェートが切断される。その後、処理されたセグメント2-セグメント3構築物は精製され、その5’末端にセグメント1がライゲーションされる。キメラポリヌクレオチドの精製段階をさらに実施してよい。
それぞれの段階の収率は、90~95%にもなり得る。
実施例3:cDNAの生成を目的とするPCR
cDNAを調製するためのPCR手順は、Kapa Biosystems(Woburn,MA)による2xのKAPA HIFI(商標)HotStart ReadyMixを使用して実施される。このシステムは、2xのKAPA ReadyMixを12.5μl、フォワードプライマー(10μM)を0.75μl、リバースプライマー(10μM)を0.75μl、鋳型cDNAを~100ng、及び25.0μlに希釈したdH20を含む。反応条件は、95℃で5分間保持した後、98℃20秒、続いて58℃15秒、続いて72℃45秒というサイクルを25回実施した後、72℃で5分間保持し、その後終了まで4℃で保持するというものである。
cDNAを調製するためのPCR手順は、Kapa Biosystems(Woburn,MA)による2xのKAPA HIFI(商標)HotStart ReadyMixを使用して実施される。このシステムは、2xのKAPA ReadyMixを12.5μl、フォワードプライマー(10μM)を0.75μl、リバースプライマー(10μM)を0.75μl、鋳型cDNAを~100ng、及び25.0μlに希釈したdH20を含む。反応条件は、95℃で5分間保持した後、98℃20秒、続いて58℃15秒、続いて72℃45秒というサイクルを25回実施した後、72℃で5分間保持し、その後終了まで4℃で保持するというものである。
InvitrogenのPURELINK(商標)PCRマイクロキット(Carlsbad,CA)を製造者の説明に記載の量(最大5μg)ごとに使用して、反応に対する浄化処理が実施される。反応のスケールが大きくなればなるほど、より大きな能力を有する製品を使用して浄化処理を実施する必要が生じることになる。浄化処理の後、NANODROP(商標)を使用してcDNAが定量化され、cDNAが予想サイズであることがアガロースゲル電気泳動による分析によって確認される。その後、cDNAは、インビトロでの転写反応を行う前にシークエンシング解析に供される。
実施例4.インビトロ転写(IVT)
インビトロでの転写反応では、一様に修飾されたポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドが生成する。そのような一様に修飾されたポリヌクレオチドは、本開示のポリヌクレオチドの領域または一部を含み得る。投入用のヌクレオチドトリホスフェート(NTP)混合物は、天然のNTP及び非天然のNTPを使用して社内で調製される。
インビトロでの転写反応では、一様に修飾されたポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドが生成する。そのような一様に修飾されたポリヌクレオチドは、本開示のポリヌクレオチドの領域または一部を含み得る。投入用のヌクレオチドトリホスフェート(NTP)混合物は、天然のNTP及び非天然のNTPを使用して社内で調製される。
インビトロでの典型的な転写反応は、下記のものを含む:
1 鋳型cDNA 1.0μg
2 10x転写緩衝液(400mMのTris-HCl(pH8.0)、190mMのMgCl2、50mMのDTT、10mMのスペルミジン) 2.0μl
3 カスタムNTP(それぞれ25mM) 7.2μl
4 RNAse阻害剤 20U
5 T7RNAポリメラーゼ 3000U
6 dH20 最大20.0μl、及び
7 3時間~5時間の37℃でのインキュベート。
1 鋳型cDNA 1.0μg
2 10x転写緩衝液(400mMのTris-HCl(pH8.0)、190mMのMgCl2、50mMのDTT、10mMのスペルミジン) 2.0μl
3 カスタムNTP(それぞれ25mM) 7.2μl
4 RNAse阻害剤 20U
5 T7RNAポリメラーゼ 3000U
6 dH20 最大20.0μl、及び
7 3時間~5時間の37℃でのインキュベート。
未精製のIVT混合物は、翌日の浄化処理に向けて4℃で一晩貯蔵してよい。その後、RNAseを含まないDNaseを1U使用することで元の鋳型が消化される。mRNAは、37℃で15分間インキュベートした後、AmbionのMEGACLEAR(商標)キット(Austin,TX)を製造者の説明に従って使用して精製される。このキットによって最大500μgのRNAを精製することができる。浄化処理の後、NanoDropを使用してRNAが定量化され、RNAのサイズが適切であり、RNAに分解が生じていないことがアガロースゲル電気泳動による分析によって確認される。
実施例5.STING研究
本実施例では、構造的に活性なSTINGなどの免疫増強剤がコンカテマーワクチンに対するT細胞応答を増強することができるかどうかを調べた。RNA31コンカテマーをコードするmRNA構築物(クラスI及びクラスIIエピトープをコードする)をワクチンとして使用し、クラスI及びクラスIIエピトープに対するT細胞応答へのSTINGの作用を調べた。RNA31及びSTING mRNAは、共製剤化して同時に送達するか、または共製剤化せずにSTING mRNAを遅らせて送達した。動物に1日目に初回用量を投与し、15日目に追加免疫を与えた。脾細胞を22日目に回収した。
本実施例では、構造的に活性なSTINGなどの免疫増強剤がコンカテマーワクチンに対するT細胞応答を増強することができるかどうかを調べた。RNA31コンカテマーをコードするmRNA構築物(クラスI及びクラスIIエピトープをコードする)をワクチンとして使用し、クラスI及びクラスIIエピトープに対するT細胞応答へのSTINGの作用を調べた。RNA31及びSTING mRNAは、共製剤化して同時に送達するか、または共製剤化せずにSTING mRNAを遅らせて送達した。動物に1日目に初回用量を投与し、15日目に追加免疫を与えた。脾細胞を22日目に回収した。
異なる材料を試験して、STINGをさまざまな比率でコンカテマーワクチンに加えた場合の免疫原性を決定し、STINGをトップランクの市販のアジュバントと比較し、免疫原性がSTING投与のタイミングに依存するかどうかを決定し、STINGとともに投与した場合の非製剤化mRNAの免疫原性を調べた。以下の材料/条件で試験した:RNA31(3μg)、ポリI:C(10μg)含有RNA31(3μg)、MPLA(5μg)含有RNA31(3μg)、STING(1μg)/RNA31(3μg)、STING(0.6μg)/RNA31(3μg)、STING(0.6μg)/RNA54(3μg)、STING(0.6μg)/RNA31(3μg)(24時間後)、STING(0.6μg)/RNA31(3μg)(48時間後)、STING(0.6μg)/RNA31(3μg)(非製剤化)、及びSTING(6μg)/RNA31(30μg)(非製剤化)。CA-54は、5つのクラスIIエピトープのコンカテマーである(そのすべてがRNA31内に含まれる)。
結果を図12~13に示す。抗原特異的IFNγ応答をクラスIIエピトープで調べた場合、STINGは、mRNAによってコードされたMHCクラスIIエピトープに対する免疫応答を高めることがわかった。STINGは、市販のアジュバントと同等の挙動を示した(5~10倍の用量差)。試験した両方の比で作用したが、STING:抗原比が1:5のほうが1:3での組み合わせよりも良好に機能した(図12)。上記のクラスIエピトープを使用すると同様の結果が得られた。これを図13に示す。同様に、クラスIエピトープの場合、STING:抗原比が1:5のほうが1:3での組み合わせよりも良好に機能することがわかった。
さらに、後の時点(24時間)でのSTING投与も共送達と同様の免疫原性を有することがわかった(図14)。
さらなる実験では、STINGと抗原の異なる比の作用を52のマウスエピトープを使用して試験した(追加エピトープ_4a_DX_RX_perm)。マウスに1日目に初回用量を投与し、8日目に追加用量を投与し、脾細胞を15日目に回収した。再刺激に対するT細胞応答をELISpot及びFACSの使用により評価した。再刺激は、コンカテマーをコードするエピトープに対応するペプチド配列を用いて行った。2つのクラスIIエピトープ(RNA2、RNA3)及び4つのクラスIエピトープ(RNA7、RNA10、RNA13、RNA22)に対するT細胞応答を試験した。
極めて驚くべきことに、試験した比の大部分で、STINGを加えることにより、抗原単独と比較してT細胞応答が向上し、抗原単独よりも機能が悪くなることはないことがわかった。応答性の幅は、予想外であった。試験した6つの抗原(エピトープ)のうちの4つについて、抗原に総用量10~30ugでSTINGを加えると、用量50ugの抗原単独の場合よりも高いT細胞応答が一貫してもたらされた。したがって、免疫原性の向上には、STING:抗原の比に大きなベルカーブがある。
試験グループを次の表に示した。
クラスIIエピトープのうち、RNA2(図6に示される結果)及びRNA3(図7に示される結果)は、STINGを加えると、抗原のみの群(最大50μg用量の抗原単独を含む)と比較して、1:1(STING:抗原)未満の比で、T細胞応答が増大することを示した。図7の左パネルは、STINGを加えると、抗原のみの群と比較して、すべての比で、T細胞応答が増大することを示している。
同様の結果がクラスIエピトープでもみられた。RNA7(図8に示される結果)、RNA13(図9に示される結果)、RNA22(図10に示される結果)、及びRNA10(図11に示される結果)はすべて、STING:抗原の比が、総mRNA用量と比較した場合、抗原のみの群と比較して、より高いT細胞応答をもたらすことを示した。
実施例6.コンカテマー研究
長い構築物の完全な読み取りが可能かどうかを調べ、20及び52エピトープ構築物を含有するエピトープに対する免疫原性を比較するための研究を実施した。実験では、5つの異なる製剤グループを、化合物257を含有するLNPで試験した。
長い構築物の完全な読み取りが可能かどうかを調べ、20及び52エピトープ構築物を含有するエピトープに対する免疫原性を比較するための研究を実施した。実験では、5つの異なる製剤グループを、化合物257を含有するLNPで試験した。
投与量は等ピコモルであり、これは、構築物の長さにかかわらず、すべての群が個々のエピトープをそれぞれ同じ濃度で投与されたことを意味する。動物に0日目に1回目の用量(初回用量)を投与し、6日目に2回目の用量(追加用量)を投与し、次に、脾細胞を12日目に回収し、試料に対するIFNγ ELISpotを実施した。
52のエピトープを含有するワクチンの免疫原性を調べた。RNA1/SIINFEKL(配列番号231)が、試験した4つの構築物のそれぞれの最終エピトープであった。RNA1/SIINFEKL(配列番号231)で再刺激を実施した場合に、すべての試験群からINFγ応答が観察されたように、52のエピトープ構築物におけるSIINFEKL(配列番号231)T細胞応答は、コンカテマーの完全な読み通しを確認するものである(図1)。予想した通り、RNA31コンカテマーでは、当該コンカテマーがRNA1/SIINFEKL(配列番号231)エピトープを有しないため、RNA1は認められなかった。
52マー構築物と20マー構築物との間の免疫原性は、類似していた。例えば、クラスIエピトープで再刺激した場合には、2つとも同様の挙動を示す(図2)。クラスIIエピトープの長さを削ると免疫原性が向上し得るが、クラスIエピトープを21アミノ酸から15アミノ酸に削った場合は免疫原性に影響はなかった。さらに、追加のエピトープに対する免疫原性が52エピトープ構築物で検出された(図3)。クラスIIエピトープで再刺激した場合、52マー構築物と20マー構築物の両方が同様の挙動を示した(図4)。
実施例7.活性化癌遺伝子KRAS変異
KRASは、ヒト癌において最も高頻度の変異型癌遺伝子である(約15%)。KRAS変異は、ほとんどの場合、単一の「ホットスポット」に保存されており、癌遺伝子を活性化させる。以前の研究では、発癌性変異に特異的なT細胞を生産する能力には制限があることが示された。しかしながら、この研究のほとんどは、最も一般的なHLA対立遺伝子の環境(白色人種の約50%で生じるA2)で実施された。より最近では、(a)あまり一般的でないHLA対立遺伝子の環境(A11,C8)で、特定のT細胞が点変異に対して生成され得ること、ならびに(b)これらの細胞のエクスビボでの成長及び当該細胞の患者への再導入が、肺癌患者において、劇的な腫瘍応答を媒介することが実証されている。(N Engl J Med 2016;375:2255-2262December 8,2016DOI:10.1056/NEJMoa1609279)。
KRASは、ヒト癌において最も高頻度の変異型癌遺伝子である(約15%)。KRAS変異は、ほとんどの場合、単一の「ホットスポット」に保存されており、癌遺伝子を活性化させる。以前の研究では、発癌性変異に特異的なT細胞を生産する能力には制限があることが示された。しかしながら、この研究のほとんどは、最も一般的なHLA対立遺伝子の環境(白色人種の約50%で生じるA2)で実施された。より最近では、(a)あまり一般的でないHLA対立遺伝子の環境(A11,C8)で、特定のT細胞が点変異に対して生成され得ること、ならびに(b)これらの細胞のエクスビボでの成長及び当該細胞の患者への再導入が、肺癌患者において、劇的な腫瘍応答を媒介することが実証されている。(N Engl J Med 2016;375:2255-2262December 8,2016DOI:10.1056/NEJMoa1609279)。
以下の表4に示すように、CRC(結腸直腸癌)では、3つの変異のみ(G12V、G12D、及びG13D)が症例の96%を占めている。さらに、標準治療として、すべてのCRC患者のKRAS変異タイプを得た。
別のCOSMICデータセットでも、結腸直腸癌におけるKRAS変異の73.68%が、これらの3つの変異(G12V、G12D、及びG13D)で占められている(図15及び表5)。
図16、17、及び18は、HRAS、KRAS、及びNRASのアイソフォームに特異的な点変異の特異性をそれぞれ示す。各点変異を有する腫瘍の総数を表すデータは、COSMIC v52リリースから照合した。それぞれのアミノ酸置換を生じさせる単一の塩基変異を示す。各癌種の各アイソフォームの最も高頻度の変異を灰色の網掛けで強調表示する。H/L:造血細胞/リンパ組織。(Prior et al.Cancer Res.2012 May 15;72(10):2457-2467)。
加えて、EGFR遮断耐性患者では、二次KRAS変異が同定されている。RASは、EGFRの下流にあり、EGFR遮断療法に対する耐性の機序を構成することがわかっている。EGFR遮断耐性KRAS変異腫瘍は、本明細書に開示の組成物及び方法を使用して、標的化することができる。少数の症例では、同じ患者で2つ以上のKRAS変異が同定された(最大4つの異なる変異が同時に発生)。この変異範囲は、結腸直腸癌の一次腫瘍ミスセンス変異体とは少なくともいくらか異なるようである(Diaz et al.The molecular evolution of acquired resistance to targeted EGFR blockade in colorectal cancers,Nature 486:537(2012);Misale et al.Emergence of KRAS muations and acquired resistance to anti-EGFR therapy in colorectal cancer,Nature 486:532(2012))。図19は、EGFR遮断耐性を獲得した後の二次KRAS変異を示す(Diaz et al.The molecular evolution of acquired resistance to targeted EGFR blockade in colorectal cancers,Nature 486:537(2012))。図20は、EGFR遮断後の二次KRAS変異を示す(Misale et al.Emergence of KRAS muations and acquired resistance to anti-EGFR therapy in colorectal cancer,Nature 486:532(2012))。
図21に示すように、NRASも結腸直腸癌で変異するが、KRASよりも頻度が低い。
本実施例では、少なくとも1つの活性化癌遺伝子変異ペプチド、例えば、少なくとも1つの活性化KRAS変異をコードするmRNAを含む、RNA癌ワクチンを動物に投与する。HLA*A*11:01 Tgマウス(Taconic、系統9660F、n=4)またはHLA-A*2:01 Tgマウス(Taconic、系統9659F、n=4)に変異型KRASをコードするmRNAを次のとおり投与する。1日目に変異型KRASをコードするmRNAを投与し、8日目に採血し、15日目に変異型KRASをコードするmRNAを投与し、22日目に動物を屠殺した。試験群を以下の表6に示す。
mRNAは、0.5mg/kg(動物20g当たり10ug)の用量で動物に投与する。エクスビボでの再刺激(ペプチド当たり1ug/ml)を、GolgiPlug(ブレフェルジンA)の存在下、摂氏37度で4時間、試験する。細胞内サイトカイン染色(ICS)を、KRAS G12D、KRAS G12V、KRAS G13D、KRAS G12WT、KRAS G13WT、及びペプチドなしについて試験する。
KRAS変異をコードするmRNAがT細胞を生成する能力を試験する。KRAS変異をコードするmRNAの有効性を、例えば、ペプチド接種と比較する。
KRAS変異ペプチド配列及びmRNA構築物の例を表7~9に示す。
化学的性質:修飾ウリジンN1-メチルシュードウリジン(m1Ψ)
キャップ:C1
テール:T100
5’UTR配列(標準5’フランク(FP産生+T7部位+5’UTRを含む)):TCAAGCTTTTGGACCCTCGTACAGAAGCTAATACGACTCACTATAGGGAAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGAGCCACC(配列番号353)
5’UTR配列(プロモーターなし):GGGAAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGAGCCACC(配列番号354)
3’UTR配列(ヒト3’UTR XbaIなし):TGATAATAGGCTGGAGCCTCGGTGGCCATGCTTCTTGCCCCTTGGGCCTCCCCCCAGCCCCTCCTCCCCTTCCTGCACCCGTACCCCCGTGGTCTTTGAATAAAGTCTGAGTGGGCGGC(配列番号355)
キャップ:C1
テール:T100
5’UTR配列(標準5’フランク(FP産生+T7部位+5’UTRを含む)):TCAAGCTTTTGGACCCTCGTACAGAAGCTAATACGACTCACTATAGGGAAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGAGCCACC(配列番号353)
5’UTR配列(プロモーターなし):GGGAAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGAGCCACC(配列番号354)
3’UTR配列(ヒト3’UTR XbaIなし):TGATAATAGGCTGGAGCCTCGGTGGCCATGCTTCTTGCCCCTTGGGCCTCCCCCCAGCCCCTCCTCCCCTTCCTGCACCCGTACCCCCGTGGTCTTTGAATAAAGTCTGAGTGGGCGGC(配列番号355)
実施例8.p53においてスプライス部位の変異及びサイレント変異が反復して生じる「ホットスポット」
P53遺伝子(正式記号TP53)は、ヒトの癌においてほかのどの遺伝子よりも高い頻度で変異する。p53に生じる変異のほとんどで、そのゲノム位置は1人または少数の患者のみに特有であるため、こうした変異は、特定の患者集団向けに設計される治療ワクチンのための反復ネオ抗原として使用できないことが大規模コホート研究によって示された。しかしながら、p53遺伝子座の小サブセットは実に「ホットスポット」のパターンを示しており、そこでは、遺伝子のいくつかの位置が相対的に高い頻度で変異するのである。際だったことに、反復して変異するこうした領域の大部分が、エクソンとイントロンとの境界付近に存在し、mRNAのスプライシング機構によって認識される標準のヌクレオチド配列モチーフを破壊する。スプライシングモチーフが変異すると、局所的なアミノ酸配列には変化が生じない(すなわち、同義変異またはイントロン変異)と予測されるとしても、最終的なmRNA配列には変化が生じ得る。それ故に、こうした変異によって予測不可能な様式でmRNAのスプライシングに変化が生じ得、翻訳されるタンパク質が著しい機能的影響を受け得るにもかかわらず、こうした変異は、一般的なアノテーションツールによって「ノンコーディング」として注解されてしまい、さらに解析されることなく無視されることが多い。代替的にスプライシングを受けたアイソフォームにインフレームの配列変化が生じる(すなわち、PTCが生じない)のであれば、こうしたアイソフォームはNMDによる排除を免れることができ、速やかに発現し、プロセシングを受けてHLA系によって細胞表面に提示される。さらに、変異に由来する代替的なスプライシングは、通常、「潜在性」であって、すなわち、正常組織では発現しないものであり、それ故に、T細胞によって非自己のネオ抗原として認識され得る。
P53遺伝子(正式記号TP53)は、ヒトの癌においてほかのどの遺伝子よりも高い頻度で変異する。p53に生じる変異のほとんどで、そのゲノム位置は1人または少数の患者のみに特有であるため、こうした変異は、特定の患者集団向けに設計される治療ワクチンのための反復ネオ抗原として使用できないことが大規模コホート研究によって示された。しかしながら、p53遺伝子座の小サブセットは実に「ホットスポット」のパターンを示しており、そこでは、遺伝子のいくつかの位置が相対的に高い頻度で変異するのである。際だったことに、反復して変異するこうした領域の大部分が、エクソンとイントロンとの境界付近に存在し、mRNAのスプライシング機構によって認識される標準のヌクレオチド配列モチーフを破壊する。スプライシングモチーフが変異すると、局所的なアミノ酸配列には変化が生じない(すなわち、同義変異またはイントロン変異)と予測されるとしても、最終的なmRNA配列には変化が生じ得る。それ故に、こうした変異によって予測不可能な様式でmRNAのスプライシングに変化が生じ得、翻訳されるタンパク質が著しい機能的影響を受け得るにもかかわらず、こうした変異は、一般的なアノテーションツールによって「ノンコーディング」として注解されてしまい、さらに解析されることなく無視されることが多い。代替的にスプライシングを受けたアイソフォームにインフレームの配列変化が生じる(すなわち、PTCが生じない)のであれば、こうしたアイソフォームはNMDによる排除を免れることができ、速やかに発現し、プロセシングを受けてHLA系によって細胞表面に提示される。さらに、変異に由来する代替的なスプライシングは、通常、「潜在性」であって、すなわち、正常組織では発現しないものであり、それ故に、T細胞によって非自己のネオ抗原として認識され得る。
いくつかの変異部位が保持型イントロンまたは潜在性スプライシングを生成することがRNAシークエンシングによって確認された。変異によって得られた2つの代表的なペプチドは、コードゲノムの他の箇所とは一致しないHLA-A2結合エピトープを複数有していた。
p53において同定した反復変異は、
(1)コドン位置T125に隣接する標準5’スプライス部位における変異であって、エピトープAVSPCISFVW(配列番号233)(HLA-B*57:01、HLA-B*58:01)、エピトープHPLASCQCFF(配列番号234)(HLA-B*35:01、HLA-B*53:01)、エピトープFVWNFGIPL(配列番号235)(HLA-A*02:01、HLA-A*02:06、HLA-B*35:01)を含むペプチド配列TAKSVTCTVSCPEGLASMRLQCLAVSPCISFVWNFGIPLHPLASCQCFFIVYPLNV(配列番号232)を有する保持型イントロンを誘導する変異;
(2)コドン位置331に隣接する標準5’スプライス部位における変異であって、エピトープLQVLSLGTSY(配列番号237)(HLA-B*15:01)、エピトープFQSNTQNAVF(配列番号238)(HLA-B*15:01)を含むペプチド配列EYFTLQVLSLGTSYQVESFQSNTQNAVFFLTVLPAIGAFAIRGQ(配列番号236)を有する保持型イントロンを誘導する変異;
(3)コドン位置126に隣接する標準3’スプライス部位における変異であって、エピトープCTMFCQLAK(配列番号240)(HLA-A*11:01)、エピトープKSVTCTMF(配列番号241)(HLA-B*58:01)を含む新規のスパニングペプチド配列AKSVTCTMFCQLAK(配列番号239)を生成する潜在性の代替エクソン3’スプライス部位を誘導する変異;及び(4)コドン位置224に隣接する標準5’スプライス部位における変異であって、エピトープVPYEPPEVW(配列番号243)(HLA-B*53:01、HLA-B*51:01)、エピトープLTVPPSTAW(配列番号244)(HLA-B*58:01、HLA-B*57:01)を含む新規のスパニングペプチド配列VPYEPPEVWLALTVPPSTAWAA(配列番号242)を生成する潜在性の代替イントロン5’スプライス部位を誘導する変異(転写コドン位置は、Ensemblのv83のヒトゲノムアノテーションに由来する標準の全長p53転写物であるENST00000269305(配列番号245)を参照したものである)。
(1)コドン位置T125に隣接する標準5’スプライス部位における変異であって、エピトープAVSPCISFVW(配列番号233)(HLA-B*57:01、HLA-B*58:01)、エピトープHPLASCQCFF(配列番号234)(HLA-B*35:01、HLA-B*53:01)、エピトープFVWNFGIPL(配列番号235)(HLA-A*02:01、HLA-A*02:06、HLA-B*35:01)を含むペプチド配列TAKSVTCTVSCPEGLASMRLQCLAVSPCISFVWNFGIPLHPLASCQCFFIVYPLNV(配列番号232)を有する保持型イントロンを誘導する変異;
(2)コドン位置331に隣接する標準5’スプライス部位における変異であって、エピトープLQVLSLGTSY(配列番号237)(HLA-B*15:01)、エピトープFQSNTQNAVF(配列番号238)(HLA-B*15:01)を含むペプチド配列EYFTLQVLSLGTSYQVESFQSNTQNAVFFLTVLPAIGAFAIRGQ(配列番号236)を有する保持型イントロンを誘導する変異;
(3)コドン位置126に隣接する標準3’スプライス部位における変異であって、エピトープCTMFCQLAK(配列番号240)(HLA-A*11:01)、エピトープKSVTCTMF(配列番号241)(HLA-B*58:01)を含む新規のスパニングペプチド配列AKSVTCTMFCQLAK(配列番号239)を生成する潜在性の代替エクソン3’スプライス部位を誘導する変異;及び(4)コドン位置224に隣接する標準5’スプライス部位における変異であって、エピトープVPYEPPEVW(配列番号243)(HLA-B*53:01、HLA-B*51:01)、エピトープLTVPPSTAW(配列番号244)(HLA-B*58:01、HLA-B*57:01)を含む新規のスパニングペプチド配列VPYEPPEVWLALTVPPSTAWAA(配列番号242)を生成する潜在性の代替イントロン5’スプライス部位を誘導する変異(転写コドン位置は、Ensemblのv83のヒトゲノムアノテーションに由来する標準の全長p53転写物であるENST00000269305(配列番号245)を参照したものである)。
同等形態
当業者であれば、日常的な実験法を使用するだけで、本明細書に記載の開示の特定の実施形態に対する多くの同等形態を認識するか、または確認することができるであろう。そのような同等形態は、下記の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。
当業者であれば、日常的な実験法を使用するだけで、本明細書に記載の開示の特定の実施形態に対する多くの同等形態を認識するか、または確認することができるであろう。そのような同等形態は、下記の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。
「およそ」または「約」という用語は、1つまたは複数の目的の値に適用されるとき、指定された参照値と同様の値を指す。ある特定の実施形態では、「およそ」または「約」という用語は、特に明記しない限り、または文脈から明らかでない限り、指定された参照値のいずれかの方向(より大きいまたはより小さい)の25%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%以下の範囲内に含まれる値の範囲を指す(当該数が可能な値の100%を超える場合を除く)。
本明細書に開示される、特許文書を含む参考文献はすべて、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
Claims (130)
- mRNA癌ワクチンであって、
次のうちの1つまたは複数:
(a)個別化癌抗原である1~500のペプチドエピトープと、ユニバーサルタイプIIのT細胞エピトープとをコードする1つもしくは複数のオープンリーディングフレームをそれぞれ有する1つもしくは複数のmRNA、
(b)活性化癌遺伝子変異ペプチドをコードするオープンリーディングフレームをそれぞれ有する1つもしくは複数のmRNAであって、任意選択で、前記mRNAは、ユニバーサルタイプIIのT細胞エピトープをさらに含む、前記mRNA、
(c)癌抗原ペプチドエピトープをコードするオープンリーディングフレームをそれぞれ有する1つもしくは複数のmRNAであって、前記mRNAワクチンは、5~100のペプチドエピトープをコードし、前記ペプチドエピトープのうちの少なくとも2つは、個別化癌抗原であり、任意選択で、前記mRNAは、ユニバーサルタイプIIのT細胞エピトープをさらに含む、前記mRNA、及び/または
(d)癌抗原ペプチドエピトープをコードするオープンリーディングフレームをそれぞれ有する1つもしくは複数のmRNAであって、前記mRNAワクチンは、5~100のペプチドエピトープをコードし、前記ペプチドエピトープのうちの少なくとも3つは、複合バリアントであり、前記ペプチドエピトープのうちの少なくとも2つは、点変異であり、任意選択で、前記mRNAは、ユニバーサルタイプIIのT細胞エピトープをさらに含む、前記mRNA
を含む、脂質ナノ粒子を含む、前記mRNA癌ワクチン。 - 前記mRNA癌ワクチンが、1~20のユニバーサルタイプIIのT細胞エピトープをコードする、請求項1に記載のmRNA癌ワクチン。
- 前記ユニバーサルタイプIIのT細胞エピトープが、ILMQYIKANSKFIGI(テタヌス毒素;配列番号226)、FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE(テタヌス毒素;配列番号227)、QYIKANSKFIGITE(テタヌス毒素;配列番号228)QSIALSSLMVAQAIP(ジフテリア毒素;配列番号229)、及びAKFVAAWTLKAAA(汎DRエピトープ;配列番号230)からなる群から選択される、請求項2に記載のmRNA癌ワクチン。
- 前記ユニバーサルタイプIIのT細胞エピトープが、前記mRNA全体にわたって同じユニバーサルタイプIIのT細胞エピトープである、請求項1~3のいずれか1項に記載のmRNA癌ワクチン。
- 前記ユニバーサルタイプIIのT細胞エピトープが、前記mRNA中1~20回繰り返される、請求項1~3のいずれか1項に記載のmRNA癌ワクチン。
- 前記ユニバーサルタイプIIのT細胞エピトープが、前記mRNA全体にわたって互いに異なる、請求項1~3のいずれか1項に記載のmRNA癌ワクチン。
- 前記ユニバーサルタイプIIのT細胞エピトープが、すべての癌抗原ペプチドエピトープの間に位置する、請求項1~3のいずれか1項に記載のmRNA癌ワクチン。
- 前記ユニバーサルタイプIIのT細胞エピトープが、癌抗原ペプチドエピトープの間に1つおきに位置する、請求項1~3のいずれか1項に記載のmRNA癌ワクチン。
- 前記ユニバーサルタイプIIのT細胞エピトープが、癌抗原ペプチドエピトープの間に2つおきに位置する、請求項1~3のいずれか1項に記載のmRNA癌ワクチン。
- 次の条件のうちの1つまたは複数:
(i)前記活性化癌遺伝子変異が、KRAS変異であること、
(ii)前記KRAS変異が、G12変異であり、任意選択で、前記G12 KRAS変異は、G12D、G12V、G12S、G12C、G12A、及びG12R KRAS変異から選択されること、
(iii)前記KRAS変異が、G13変異であり、任意選択で、前記G13 KRAS変異は、G13D KRAS変異であること、及び/または
(iv)前記活性化癌遺伝子変異が、H-RASもしくはN-RAS変異であること
を満たす、請求項1~9のいずれか1項に記載のmRNA癌ワクチン。 - 次の条件のうちの1つまたは複数:
(A)前記mRNAが、2つ以上の活性化癌遺伝子変異ペプチドのコンカテマーをコードするオープンリーディングフレームを有すること、
(B)前記ペプチドエピトープのうちの少なくとも2つが、1つのグリシンによって互いに分離されており、任意選択で、前記ペプチドエピトープのすべてが、1つのグリシンによって互いに分離されていること、
(C)前記コンカテマーが、3~10の活性化癌遺伝子変異ペプチドを含むこと、及び/または
(D)前記ペプチドエピトープのうちの少なくとも2つが、リンカーなしで互いに直接連結されていること
を満たす、請求項1~10のいずれか1項に記載のmRNA癌ワクチン。 - 次の条件のうちの1つまたは複数:
(i)前記ペプチドエピトープのうちの少なくとも1つは、従来型癌抗原であること、
(ii)前記ペプチドエピトープのうちの少なくとも1つは、反復多型であること、
(iii)前記反復多型は、p53における反復体細胞癌変異を含むこと、
(iv)前記p53における反復体細胞癌変異は、
(A)コドン位置T125に隣接する標準5’スプライス部位における変異であって、エピトープAVSPCISFVW(配列番号233)(HLA-B*57:01、HLA-B*58:01)、エピトープHPLASCQCFF(配列番号234)(HLA-B*35:01、HLA-B*53:01)、エピトープFVWNFGIPL(配列番号235)(HLA-A*02:01、HLA-A*02:06、HLA-B*35:01)を含むペプチド配列TAKSVTCTVSCPEGLASMRLQCLAVSPCISFVWNFGIPLHPLASCQCFFIVYPLNV(配列番号232)を有する保持型イントロンを誘導する前記変異;
(B)コドン位置331に隣接する標準5’スプライス部位における変異であって、エピトープLQVLSLGTSY(配列番号237)(HLA-B*15:01)、エピトープFQSNTQNAVF(配列番号238)(HLA-B*15:01)を含むペプチド配列EYFTLQVLSLGTSYQVESFQSNTQNAVFFLTVLPAIGAFAIRGQ(配列番号236)を有する保持型イントロンを誘導する前記変異;
(C)コドン位置126に隣接する標準3’スプライス部位における変異であって、エピトープCTMFCQLAK(配列番号240)(HLA-A*11:01)、エピトープKSVTCTMF(配列番号241)(HLA-B*58:01)を含む新規のスパニングペプチド配列AKSVTCTMFCQLAK(配列番号239)を生成する潜在性の代替エクソン3’スプライス部位を誘導する前記変異;及び/または
(D)コドン位置224に隣接する標準5’スプライス部位における変異であって、エピトープVPYEPPEVW(配列番号243)(HLA-B*53:01、HLA-B*51:01)、エピトープLTVPPSTAW(配列番号244)(HLA-B*58:01、HLA-B*57:01)を含む新規のスパニングペプチド配列VPYEPPEVWLALTVPPSTAWAA(配列番号242)を生成する潜在性の代替イントロン5’スプライス部位を誘導する前記変異
(転写コドン位置は、Ensemblのv83のヒトゲノムアノテーションに由来する標準の全長p53転写物であるENST00000269305(配列番号245)を参照したものである)からなる群から選択されること、
及び/または
(v)前記mRNA癌ワクチンが、安定剤を含まないこと
を満たす、請求項1~11のいずれか1項に記載のmRNA癌ワクチン。 - 前記1つまたは複数のmRNAが、免疫増強剤をコードするオープンリーディングフレームをさらに含む、請求項1~3のいずれか1項に記載のmRNA癌ワクチン。
- 前記免疫増強剤が、前記脂質ナノ粒子に製剤化される、請求項13に記載のmRNA癌ワクチン。
- 前記免疫増強剤が、別個の脂質ナノ粒子に製剤化される、請求項13に記載のmRNA癌ワクチン。
- 前記免疫増強剤が、構造的に活性なヒトSTINGポリペプチドである、請求項13に記載のmRNA癌ワクチン。
- 前記構造的に活性なヒトSTINGポリペプチドが、配列番号1に示されるアミノ酸配列を含む、請求項13に記載のmRNA癌ワクチン。
- 前記構造的に活性なヒトSTINGポリペプチドをコードする前記mRNAが、配列番号170に示されるヌクレオチド配列を含む、請求項13に記載のmRNA癌ワクチン。
- 前記構造的に活性なヒトSTINGポリペプチドをコードする前記mRNAが、miR-122マイクロRNA結合部位を有する3’UTRを含む、請求項13に記載のmRNA癌ワクチン。
- 前記miR-122マイクロRNA結合部位が、配列番号175に示されるヌクレオチド配列を含む、請求項19に記載のmRNA癌ワクチン。
- 前記1つまたは複数のmRNAがそれぞれ、配列番号176に示すヌクレオチド配列を含む5’UTRを含む、請求項1~20のいずれか1項に記載のmRNA癌ワクチン。
- 前記1つまたは複数のmRNAがそれぞれ、ポリAテールを含む、請求項1~21のいずれか1項に記載のmRNA癌ワクチン。
- 前記ポリAテールが、約100ヌクレオチドを含む、請求項22に記載のmRNA癌ワクチン。
- 前記1つまたは複数のmRNAがそれぞれ、5’キャップ1構造を含む、請求項1~23のいずれか1項に記載のmRNA癌ワクチン。
- 前記1つまたは複数のmRNAが、少なくとも1つの化学修飾を含む、請求項1~24のいずれか1項に記載のmRNA癌ワクチン。
- 前記化学修飾が、N1-メチルシュードウリジンである、請求項25に記載のmRNA癌ワクチン。
- 前記1つまたは複数のmRNAが、N1-メチルシュードウリジンで完全に修飾されている、請求項26に記載のmRNA癌ワクチン。
- 前記1つまたは複数のmRNAが、45~55の個別化癌抗原をコードする、請求項1~27のいずれか1項に記載のmRNA癌ワクチン。
- 前記1つまたは複数のmRNAが、52の個別化癌抗原をコードする、請求項1~27のいずれか1項に記載のmRNA癌ワクチン。
- 前記個別化癌抗原のそれぞれが、別個のオープンリーディングフレームによってコードされる、請求項1~27のいずれか1項に記載のmRNA癌ワクチン。
- 前記ペプチドエピトープが、2~100のペプチドエピトープから構成されるコンカテマー癌抗原の形態であり、任意選択で、前記コンカテマー癌抗原は、5~100のペプチドエピトープから構成される、請求項1~27のいずれか1項に記載のmRNA癌ワクチン。
- 前記コンカテマー癌抗原は、
a)前記2~100のペプチドエピトープもしくは任意選択で5~100のペプチドエピトープが、切断感受性部位が間に入ることによって散在していること、
b)それぞれのペプチドエピトープをコードする前記mRNAが、リンカーなしで互いに直接連結されていること、
c)それぞれのペプチドエピトープをコードする前記mRNAが、単一のヌクレオチドリンカーで互いに連結されていること、
d)それぞれのペプチドエピトープが、25~35アミノ酸を含み、かつ中央に位置するSNP変異を含むこと、
e)前記ペプチドエピトープの少なくとも30%が、対象に由来するクラスIのMHC分子に対して最も高い親和性を有すること、
f)前記ペプチドエピトープの少なくとも30%が、対象に由来するクラスIIのMHC分子に対して最も高い親和性を有すること、
g)前記ペプチドエピトープの少なくとも50%が、HLA-A、HLA-B、及び/またはDRB1に対してIC>500nMの予測結合親和性を有すること、
h)前記mRNAが、45~55のペプチドエピトープをコードすること、
i)前記mRNAが、52のペプチドエピトープをコードすること、
j)前記ペプチドエピトープの50%が、クラスIのMHCに対して結合親和性を有し、かつペプチドエピトープの50%が、クラスIIのMHCに対して結合親和性を有すること、
k)前記ペプチドエピトープをコードする前記mRNAが、前記ペプチドエピトープの順序が偽エピトープを最小化する順序になるように配置されること、
l)前記ペプチドエピトープの少なくとも30%が、15アミノ酸長のMHCクラスI結合ペプチドであること、及び/または
m)前記ペプチドエピトープの少なくとも30%が、21アミノ酸長のMHCクラスII結合ペプチドであること
のうちの1つまたは複数を含む、請求項31に記載のmRNA癌ワクチン。 - mRNA癌ワクチンであって、
脂質ナノ粒子に製剤化された、個別化癌抗原である45~55のペプチドエピトープをコードする1つまたは複数のオープンリーディングフレームをそれぞれ有する1つまたは複数のmRNAを含み、任意選択で、前記ペプチドエピトープのうちの少なくとも1つは、活性化癌遺伝子変異ペプチドまたは従来型癌抗原であり、任意選択で、前記ペプチドエピトープのうちの少なくとも3つは、複合バリアントであり、前記ペプチドエピトープのうちの少なくとも2つは、点変異である、前記mRNA癌ワクチン。 - 前記1つまたは複数のmRNAが、48~54の個別化癌抗原をコードする、請求項33に記載のmRNA癌ワクチン。
- 前記1つまたは複数のmRNAが、52の個別化癌抗原をコードする、請求項33~34のいずれか1項に記載のmRNA癌ワクチン。
- 前記個別化癌抗原のそれぞれは、別個のオープンリーディングフレームによってコードされる、請求項33~35のいずれか1項に記載のmRNA癌ワクチン。
- 前記ペプチドエピトープが、2~100のペプチドエピトープから構成されるコンカテマー癌抗原の形態であり、任意選択で、前記コンカテマー癌抗原は、5~100のペプチドエピトープから構成される、請求項33~35のいずれか1項に記載のmRNA癌ワクチン。
- 前記コンカテマー癌抗原は、
a)前記2~100のペプチドエピトープもしくは任意選択で5~100のペプチドエピトープが、切断感受性部位が間に入ることによって散在していること、
b)それぞれのペプチドエピトープをコードする前記mRNAが、リンカーなしで互いに直接連結されていること、
c)それぞれのペプチドエピトープをコードする前記mRNAが、単一のヌクレオチドリンカーで互いに連結されていること、
d)それぞれのペプチドエピトープが、25~35アミノ酸を含み、かつ中央に位置するSNP変異を含むこと、
e)前記ペプチドエピトープの少なくとも30%が、対象に由来するクラスIのMHC分子に対して最も高い親和性を有すること、
f)前記ペプチドエピトープの少なくとも30%が、対象に由来するクラスIIのMHC分子に対して最も高い親和性を有すること、
g)前記ペプチドエピトープの少なくとも50%が、HLA-A、HLA-B、及び/またはDRB1に対してIC>500nMの予測結合親和性を有すること、
h)前記mRNAが、45~55のペプチドエピトープをコードすること、
i)前記mRNAが、52のペプチドエピトープをコードすること、
j)前記ペプチドエピトープの50%が、クラスIのMHCに対して結合親和性を有し、かつペプチドエピトープの50%が、クラスIIのMHCに対して結合親和性を有すること、
k)前記ペプチドエピトープをコードする前記mRNAが、前記ペプチドエピトープの順序が偽エピトープを最小化する順序になるように配置されること、
l)前記ペプチドエピトープの少なくとも30%が、15アミノ酸長のMHCクラスI結合ペプチドであること、及び/または
m)前記ペプチドエピトープの少なくとも30%が、21アミノ酸長のMHCクラスII結合ペプチドであること
のうちの1つまたは複数を含む、請求項37に記載のmRNA癌ワクチン。 - 前記ペプチドエピトープのうちの少なくとも2つが、ユニバーサルタイプIIのT細胞エピトープによって互いに分離されている、請求項33~38のいずれか1項に記載のmRNA癌ワクチン。
- 前記ペプチドエピトープのすべてが、ユニバーサルタイプIIのT細胞エピトープによって互いに分離されている、請求項33~38のいずれか1項に記載のmRNA癌ワクチン。
- 前記mRNA癌ワクチンが、1~20のユニバーサルタイプIIのT細胞エピトープをコードする、請求項33~38のいずれか1項に記載のmRNA癌ワクチン。
- 前記ユニバーサルタイプIIのT細胞エピトープが、ILMQYIKANSKFIGI(テタヌス毒素;配列番号226)、FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE(テタヌス毒素;配列番号227)、QYIKANSKFIGITE(テタヌス毒素;配列番号228)QSIALSSLMVAQAIP(ジフテリア毒素;配列番号229)、及びAKFVAAWTLKAAA(汎DRエピトープ;配列番号230)からなる群から選択される、請求項41に記載のmRNA癌ワクチン。
- 前記ユニバーサルタイプIIのT細胞エピトープが、前記mRNA全体にわたって同じユニバーサルタイプIIのT細胞エピトープである、請求項39~42のいずれか1項に記載のmRNA癌ワクチン。
- 前記ユニバーサルタイプIIのT細胞エピトープが、前記mRNA中1~20回繰り返される、請求項39~42のいずれか1項に記載のmRNA癌ワクチン。
- 前記ユニバーサルタイプIIのT細胞エピトープが、前記mRNA全体にわたって互いに異なる、請求項39~42のいずれか1項に記載のmRNA癌ワクチン。
- 前記ユニバーサルタイプIIのT細胞エピトープが、すべてのペプチドエピトープの間に位置する、請求項39~42のいずれか1項に記載のmRNA癌ワクチン。
- 前記ユニバーサルタイプIIのT細胞エピトープが、すべてのペプチドエピトープの間に1つおきに位置する、請求項39~42のいずれか1項に記載のmRNA癌ワクチン。
- 前記ユニバーサルタイプIIのT細胞エピトープが、すべてのペプチドエピトープの間に2つおきに位置する、請求項39~42のいずれか1項に記載のmRNA癌ワクチン。
- 前記1つまたは複数のmRNAが、免疫増強剤をコードするオープンリーディングフレームをさらに含む、請求項33~48のいずれか1項に記載のmRNA癌ワクチン。
- 前記免疫増強剤が、前記脂質ナノ粒子に製剤化される、請求項38に記載のmRNA癌ワクチン。
- 前記免疫増強剤が、別個の脂質ナノ粒子に製剤化される、請求項38に記載のmRNA癌ワクチン。
- 前記免疫増強剤が、構造的に活性なヒトSTINGポリペプチドである、請求項38に記載のmRNA癌ワクチン。
- 前記構造的に活性なヒトSTINGポリペプチドが、配列番号1に示されるアミノ酸配列を含む、請求項52に記載のmRNA癌ワクチン。
- 前記構造的に活性なヒトSTINGポリペプチドをコードする前記mRNAが、配列番号170に示されるヌクレオチド配列を含む、請求項52に記載のmRNA癌ワクチン。
- 次の条件のうちの1つまたは複数:
(i)前記活性化癌遺伝子変異が、KRAS変異であること、
(ii)前記KRAS変異が、G12変異であり、任意選択で、前記G12 KRAS変異は、G12D、G12V、G12S、G12C、G12A、及びG12R KRAS変異から選択されること、
(iii)前記KRAS変異が、G13変異であり、任意選択で、前記G13 KRAS変異は、G13D KRAS変異であること、及び/または
(iv)前記活性化癌遺伝子変異が、H-RASもしくはN-RAS変異であること
を満たす、請求項33~54のいずれか1項に記載のmRNA癌ワクチン。 - 次の条件のうちの1つまたは複数:
(A)前記mRNAが、2つ以上の活性化癌遺伝子変異ペプチドのコンカテマーをコードするオープンリーディングフレームを有すること、
(B)前記ペプチドエピトープのうちの少なくとも2つが、1つのグリシンによって互いに分離されており、任意選択で、前記ペプチドエピトープのすべてが、1つのグリシンによって互いに分離されていること、
(C)前記コンカテマーが、3~10の活性化癌遺伝子変異ペプチドを含むこと、及び/または
(D)前記ペプチドエピトープのうちの少なくとも2つが、リンカーなしで互いに直接連結されていること
を満たす、請求項33~55のいずれか1項に記載のmRNA癌ワクチン。 - 次の条件のうちの1つまたは複数:
(i)前記ペプチドエピトープのうちの少なくとも1つは、従来型癌抗原であること、
(ii)前記ペプチドエピトープのうちの少なくとも1つは、反復多型であること、
(iii)前記反復多型は、p53における反復体細胞癌変異を含むこと、
(iv)前記p53における反復体細胞癌変異は、
(A)コドン位置T125に隣接する標準5’スプライス部位における変異であって、エピトープAVSPCISFVW(配列番号233)(HLA-B*57:01、HLA-B*58:01)、エピトープHPLASCQCFF(配列番号234)(HLA-B*35:01、HLA-B*53:01)、エピトープFVWNFGIPL(配列番号235)(HLA-A*02:01、HLA-A*02:06、HLA-B*35:01)を含むペプチド配列TAKSVTCTVSCPEGLASMRLQCLAVSPCISFVWNFGIPLHPLASCQCFFIVYPLNV(配列番号232)を有する保持型イントロンを誘導する前記変異;
(B)コドン位置331に隣接する標準5’スプライス部位における変異であって、エピトープLQVLSLGTSY(配列番号237)(HLA-B*15:01)、エピトープFQSNTQNAVF(配列番号238)(HLA-B*15:01)を含むペプチド配列EYFTLQVLSLGTSYQVESFQSNTQNAVFFLTVLPAIGAFAIRGQ(配列番号236)を有する保持型イントロンを誘導する前記変異;
(C)コドン位置126に隣接する標準3’スプライス部位における変異であって、エピトープCTMFCQLAK(配列番号240)(HLA-A*11:01)、エピトープKSVTCTMF(配列番号241)(HLA-B*58:01)を含む新規のスパニングペプチド配列AKSVTCTMFCQLAK(配列番号239)を生成する潜在性の代替エクソン3’スプライス部位を誘導する前記変異;及び/または
(D)コドン位置224に隣接する標準5’スプライス部位における変異であって、エピトープVPYEPPEVW(配列番号243)(HLA-B*53:01、HLA-B*51:01)、エピトープLTVPPSTAW(配列番号244)(HLA-B*58:01、HLA-B*57:01)を含む新規のスパニングペプチド配列VPYEPPEVWLALTVPPSTAWAA(配列番号242)を生成する潜在性の代替イントロン5’スプライス部位を誘導する前記変異
(転写コドン位置は、Ensemblのv83のヒトゲノムアノテーションに由来する標準の全長p53転写物であるENST00000269305(配列番号245)を参照したものである)からなる群から選択されること、及び/または
(v)前記mRNA癌ワクチンが、安定剤を含まないことを満たす、請求項33~56のいずれか1項に記載のmRNA癌ワクチン。 - mRNA癌ワクチンであって、
(i)個別化癌抗原である1~500ペプチドエピトープをコードする1つまたは複数のオープンリーディングフレームをそれぞれ有する1つまたは複数のmRNAと、
(ii)前記個別化癌抗原に対する免疫応答を高めるポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有するmRNAと、を含む、脂質ナノ粒子を含み、
任意選択で、(i)及び(ii)は、およそ5:1の質量比で存在し、任意選択で、前記ペプチドエピトープのうちの少なくとも1つは、活性化癌遺伝子変異ペプチドまたは従来型癌抗原であり、任意選択で、前記ペプチドエピトープのうちの少なくとも3つは、複合バリアントであり、前記ペプチドエピトープのうちの少なくとも2つは、点変異である、前記mRNA癌ワクチン。 - 前記免疫応答が、
(i)I型インターフェロン経路のシグナル伝達を刺激すること、
(ii)NFkB経路のシグナル伝達を刺激すること、
(iii)炎症反応を刺激すること、
(iv)サイトカイン産生を刺激すること、または
(v)樹状細胞の発生、活性もしくは動員を刺激すること、及び
(vi)(i)~(vi)のいずれかの組み合わせを特徴とする細胞性または体液性免疫応答を含む、請求項58に記載のmRNA癌ワクチン。 - 前記ペプチドエピトープと、前記個別化癌抗原に対する免疫応答を高める前記ポリペプチドとの両方をコードする単一のmRNA構築物を含む、請求項58に記載のmRNA癌ワクチン。
- 前記ペプチドエピトープが、2~100のペプチドエピトープから構成されるコンカテマー癌抗原の形態であり、任意選択で、前記コンカテマー癌抗原は、5~100のペプチドエピトープから構成される、請求項58または59に記載のmRNA癌ワクチン。
- 前記コンカテマー癌抗原は、
a)前記2~100のペプチドエピトープもしくは任意選択で5~100のペプチドエピトープが、切断感受性部位が間に入ることによって散在していること、
b)それぞれのペプチドエピトープをコードする前記mRNAが、リンカーなしで互いに直接連結されていること、
c)それぞれのペプチドエピトープをコードする前記mRNAが、単一のヌクレオチドリンカーで互いに連結されていること、
d)それぞれのペプチドエピトープが、25~35アミノ酸を含み、かつ中央に位置するSNP変異を含むこと、
e)前記ペプチドエピトープの少なくとも30%が、対象に由来するクラスIのMHC分子に対して最も高い親和性を有すること、
f)前記ペプチドエピトープの少なくとも30%が、対象に由来するクラスIIのMHC分子に対して最も高い親和性を有すること、
g)前記ペプチドエピトープの少なくとも50%が、HLA-A、HLA-B、及び/またはDRB1に対してIC>500nMの予測結合親和性を有すること、
h)前記mRNAが、45~55のペプチドエピトープをコードすること、
i)前記mRNAが、52のペプチドエピトープをコードすること、
j)前記ペプチドエピトープの50%が、クラスIのMHCに対して結合親和性を有し、かつペプチドエピトープの50%が、クラスIIのMHCに対して結合親和性を有すること、
k)前記ペプチドエピトープをコードする前記mRNAが、前記ペプチドエピトープの順序が偽エピトープを最小化する順序になるように配置されること、
l)前記ペプチドエピトープの少なくとも30%が、15アミノ酸長のMHCクラスI結合ペプチドであること、及び/または
m)前記ペプチドエピトープの少なくとも30%が、21アミノ酸長のMHCクラスII結合ペプチドであること
のうちの1つまたは複数を含む、請求項61に記載のmRNA癌ワクチン。 - それぞれのペプチドエピトープが、中央に位置するSNP変異を含み、前記SNP変異の両側には7~15の隣接アミノ酸が存在する、請求項62に記載のmRNA癌ワクチン。
- 対象において少なくとも1つの個別化癌抗原に対する免疫応答を高める前記ポリペプチドが、構造的に活性なヒトSTINGポリペプチドである、請求項58~63のいずれか1項に記載のmRNA癌ワクチン。
- 前記構造的に活性なヒトSTINGポリペプチドが、V147L、N154S、V155M、R284M、R284K、R284T、E315Q、R375A、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される1つまたは複数の変異を含む、請求項64に記載のmRNA癌ワクチン。
- 前記構造的に活性なヒトSTINGポリペプチドが、V155M変異を含む、請求項65に記載のmRNA癌ワクチン。
- 前記構造的に活性なヒトSTINGポリペプチドが、変異R284M/V147L/N154S/V155Mを含む、請求項65に記載のmRNA癌ワクチン。
- それぞれのmRNAが、同じまたは異なる脂質ナノ粒子に製剤化される、請求項58~67のいずれか1項に記載のmRNA癌ワクチン。
- 癌個別化癌抗原をコードするそれぞれのmRNAが、同じまたは異なる脂質ナノ粒子に製剤化される、請求項68に記載のmRNA癌ワクチン。
- 前記個別化癌抗原に対する免疫応答を高めるポリペプチドをコードするそれぞれのmRNAが、同じまたは異なる脂質ナノ粒子に製剤化される、請求項69に記載のmRNA癌ワクチン。
- 個別化癌抗原をコードするそれぞれのmRNAが、同じ脂質ナノ粒子に製剤化され、前記個別化癌抗原に対する免疫応答を高めるポリペプチドをコードするそれぞれのmRNAが、異なる脂質ナノ粒子に製剤化される、請求項68~70のいずれか1項に記載のmRNA癌ワクチン。
- 個別化癌抗原をコードするそれぞれのmRNAが、同じ脂質ナノ粒子に製剤化され、前記個別化癌抗原に対する免疫応答を高めるポリペプチドをコードするそれぞれのmRNAが、個別化癌抗原をコードするそれぞれのmRNAと同じ脂質ナノ粒子に製剤化される、請求項68~70のいずれか1項に記載のmRNA癌ワクチン。
- 個別化癌抗原をコードするそれぞれのmRNAが、異なる脂質ナノ粒子に製剤化され、前記個別化癌抗原に対する免疫応答を高めるポリペプチドをコードするそれぞれのmRNAが、それぞれの個別化癌抗原をコードするそれぞれのmRNAと同じ脂質ナノ粒子に製剤化される、請求項68~70のいずれか1項に記載のmRNA癌ワクチン。
- 前記ペプチドエピトープが、T細胞エピトープ及び/またはB細胞エピトープである、請求項1~73のいずれか1項に記載のmRNA癌ワクチン。
- 前記ペプチドエピトープが、T細胞エピトープとB細胞エピトープの組み合わせを含む、請求項1~73のいずれか1項に記載のmRNA癌ワクチン。
- 前記ペプチドエピトープのうちの少なくとも1つが、T細胞エピトープである、請求項1~73のいずれか1項に記載のmRNA癌ワクチン。
- 前記ペプチドエピトープのうちの少なくとも1つが、B細胞エピトープである、請求項1~73のいずれか1項に記載のmRNA癌ワクチン。
- 前記ペプチドエピトープが、前記対象のMHCに対する結合強度について最適化されている、請求項1~73のいずれか1項に記載のmRNA癌ワクチン。
- それぞれのエピトープのTCR面が、内因性タンパク質に対する類似性が低い、請求項78に記載のmRNA癌ワクチン。
- リコール抗原をさらに含む、請求項1~73のいずれか1項に記載のmRNA癌ワクチン。
- 前記リコール抗原が、感染性疾患抗原である、請求項80に記載のmRNA癌ワクチン。
- 1つまたは複数の従来型癌抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するmRNAをさらに含む、請求項1~73のいずれか1項に記載のmRNA癌ワクチン。
- 次の条件のうちの1つまたは複数:
(i)前記活性化癌遺伝子変異が、KRAS変異であること、
(ii)前記KRAS変異が、G12変異であり、任意選択で、前記G12 KRAS変異は、G12D、G12V、G12S、G12C、G12A、及びG12R KRAS変異から選択されること、
(iii)前記KRAS変異が、G13変異であり、任意選択で、前記G13 KRAS変異は、G13D KRAS変異であること、及び/または
(iv)前記活性化癌遺伝子変異が、H-RASもしくはN-RAS変異であること
を満たす、請求項58~82のいずれか1項に記載のmRNA癌ワクチン。 - 次の条件のうちの1つまたは複数:
(A)前記mRNAが、2つ以上の活性化癌遺伝子変異ペプチドのコンカテマーをコードするオープンリーディングフレームを有すること、
(B)前記ペプチドエピトープのうちの少なくとも2つが、1つのグリシンによって互いに分離されており、任意選択で、前記ペプチドエピトープのすべてが、1つのグリシンによって互いに分離されていること、
(C)前記コンカテマーが、3~10の活性化癌遺伝子変異ペプチドを含むこと、及び/または
(D)前記ペプチドエピトープのうちの少なくとも2つが、リンカーなしで互いに直接連結されていること
を満たす、請求項58~83のいずれか1項に記載のmRNA癌ワクチン。 - 次の条件のうちの1つまたは複数:
(i)前記ペプチドエピトープのうちの少なくとも1つは、従来型癌抗原であること、
(ii)前記ペプチドエピトープのうちの少なくとも1つは、反復多型であること、
(iii)前記反復多型は、p53における反復体細胞癌変異を含むこと、
(iv)前記p53における反復体細胞癌変異は、
(A)コドン位置T125に隣接する標準5’スプライス部位における変異であって、エピトープAVSPCISFVW(配列番号233)(HLA-B*57:01、HLA-B*58:01)、エピトープHPLASCQCFF(配列番号234)(HLA-B*35:01、HLA-B*53:01)、エピトープFVWNFGIPL(配列番号235)(HLA-A*02:01、HLA-A*02:06、HLA-B*35:01)を含むペプチド配列TAKSVTCTVSCPEGLASMRLQCLAVSPCISFVWNFGIPLHPLASCQCFFIVYPLNV(配列番号232)を有する保持型イントロンを誘導する前記変異;
(B)コドン位置331に隣接する標準5’スプライス部位における変異であって、エピトープLQVLSLGTSY(配列番号237)(HLA-B*15:01)、エピトープFQSNTQNAVF(配列番号238)(HLA-B*15:01)を含むペプチド配列EYFTLQVLSLGTSYQVESFQSNTQNAVFFLTVLPAIGAFAIRGQ(配列番号236)を有する保持型イントロンを誘導する前記変異;
(C)コドン位置126に隣接する標準3’スプライス部位における変異であって、エピトープCTMFCQLAK(配列番号240)(HLA-A*11:01)、エピトープKSVTCTMF(配列番号241)(HLA-B*58:01)を含む新規のスパニングペプチド配列AKSVTCTMFCQLAK(配列番号239)を生成する潜在性の代替エクソン3’スプライス部位を誘導する前記変異;及び/または
(D)コドン位置224に隣接する標準5’スプライス部位における変異であって、エピトープVPYEPPEVW(配列番号243)(HLA-B*53:01、HLA-B*51:01)、エピトープLTVPPSTAW(配列番号244)(HLA-B*58:01、HLA-B*57:01)を含む新規のスパニングペプチド配列VPYEPPEVWLALTVPPSTAWAA(配列番号242)を生成する潜在性の代替イントロン5’スプライス部位を誘導する前記変異
(転写コドン位置は、Ensemblのv83のヒトゲノムアノテーションに由来する標準の全長p53転写物であるENST00000269305(配列番号245)を参照したものである)からなる群から選択されること、
及び/または
(v)前記mRNA癌ワクチンが、安定剤を含まないこと
を満たす、請求項58~84のいずれか1項に記載のmRNA癌ワクチン。 - 前記脂質ナノ粒子が、約20~60%のイオン化可能なアミノ脂質:5~25%の中性脂質:25~55%のステロール;0.5~15%のPEG修飾脂質のモル比を含み、任意選択で、前記イオン化可能なアミノ脂質は、カチオン性脂質である、請求項1~85のいずれか1項に記載のmRNA癌ワクチン。
- 前記脂質ナノ粒子が、約50%の化合物25:約10%のDSPC:約38.5%のコレステロール;約1.5%のPEG-DMGのモル比を含む、請求項86に記載のmRNA癌ワクチン。
- 前記イオン化可能なアミノ脂質が、例えば、2,2-ジリノレイル-4-ジメチルアミノエチル-[1,3]-ジオキソラン(DLin-KC2-DMA)、ジリノレイル-メチル-4-ジメチルアミノブチレート(DLin-MC3-DMA)、及びジ((Z)-ノナ-2-エン-1-イル)9-((4-(ジメチルアミノ)ブタノイル)オキシ)ヘプタデカンジオエート(L319)からなる群から選択される、請求項86に記載のmRNA癌ワクチン。
- 前記脂質ナノ粒子が、式(I)の化合物を含む、請求項1~85のいずれか1項に記載のmRNA癌ワクチン。
- 式(I)の化合物が、化合物25である、請求項89に記載のmRNA癌ワクチン。
- 前記脂質ナノ粒子が、0.4未満の多分散値を有する、請求項1~85のいずれか1項に記載のmRNA癌ワクチン。
- 前記脂質ナノ粒子が、中性のpH値で正味の中性電荷を有する、請求項1~85のいずれか1項に記載のmRNA癌ワクチン。
- それぞれのエピトープのTCR面が、内因性タンパク質に対する類似性が低い、請求項1~92のいずれか1項に記載のmRNA癌ワクチン。
- 前記mRNAが、免疫チェックポイント調節因子をコードするオープンリーディングフレームをさらに含む、請求項1~93のいずれか1項に記載のmRNA癌ワクチン。
- 追加の癌治療剤をさらに含み、任意選択で、前記追加の癌治療剤は、免疫チェックポイント調節因子である、請求項1~93のいずれか1項に記載のmRNA癌ワクチン。
- 前記免疫チェックポイント調節因子が、阻害性チェックポイントポリペプチドである、請求項93または94に記載のmRNA癌ワクチン。
- 前記阻害性チェックポイントポリペプチドが、PD1、PD-L1、CTLA4、TIM-3、VISTA、A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、IDO、KIR、LAG3、またはそれらの組み合わせを阻害する、請求項96に記載のmRNA癌ワクチン。
- 前記チェックポイント阻害剤ポリペプチドが、抗体である、請求項97に記載のmRNA癌ワクチン。
- 前記阻害性チェックポイントポリペプチドが、CTLA4に特異的に結合する抗CTLA4抗体またはその抗原結合断片、PD1に特異的に結合する抗PD1抗体またはその抗原結合断片、PD-L1に特異的に結合する抗PD-L1抗体またはその抗原結合断片、及びそれらの組み合わせから選択される抗体である、請求項98に記載のmRNA癌ワクチン。
- 前記チェックポイント阻害剤ポリペプチドが、アテゾリズマブ、アベルマブ、またはデュルバルマブから選択される抗PD-L1抗体である、請求項99に記載のmRNA癌ワクチン。
- 前記チェックポイント阻害剤ポリペプチドが、トレメリムマブまたはイピリムマブから選択される抗CTLA-4抗体である、請求項99に記載のmRNA癌ワクチン。
- 前記チェックポイント阻害剤ポリペプチドが、ニボルマブまたはペンブロリズマブから選択される抗PD1抗体である、請求項99に記載のmRNA癌ワクチン。
- 前記化学修飾が、シュードウリジン、N1-メチルシュードウリジン、2-チオウリジン、4’-チオウリジン、5-メチルシトシン、2-チオ-1-メチル-1-デアザ-シュードウリジン、2-チオ-1-メチル-シュードウリジン、2-チオ-5-アザ-ウリジン、2-チオ-ジヒドロシュードウリジン、2-チオ-ジヒドロウリジン、2-チオ-シュードウリジン、4-メトキシ-2-チオ-シュードウリジン、4-メトキシ-シュードウリジン、4-チオ-1-メチル-シュードウリジン、4-チオ-シュードウリジン、5-アザ-ウリジン、ジヒドロシュードウリジン、5-メチルウリジン、5-メチルウリジン、5-メトキシウリジン、及び2’-O-メチルウリジンからなる群から選択される、請求項25~102のいずれか1項に記載のmRNA癌ワクチン。
- 癌を有する対象に、請求項1~103のいずれか1項に記載のmRNA癌ワクチンを投与することを含む、対象のワクチン接種方法。
- 前記mRNAワクチンが、10μg~400μgの前記mRNAワクチンを送達するために十分な用量レベルで前記対象に投与される、請求項104に記載の方法。
- 前記mRNAワクチンが、0.033mg、0.1mg、0.2mg、または0.4mgを送達するために十分な用量レベルで前記対象に投与される、請求項105に記載の方法。
- 前記mRNAワクチンが、2回、3回、4回またはそれより多い回数で前記対象に投与される、請求項104または105に記載の方法。
- 前記mRNAワクチンが、3週間ごとに1日1回投与される、請求項107に記載の方法。
- 前記mRNAワクチンが、皮内、筋肉内、及び/または皮下投与によって投与される、請求項104~108のいずれか1項に記載の方法。
- 前記mRNAワクチンが、筋肉内投与によって投与される、請求項109に記載の方法。
- 追加の癌治療剤を投与することをさらに含み、任意選択で、前記追加の癌治療剤は、前記対象に対する免疫チェックポイント調節因子である、請求項104~110のいずれか1項に記載の方法。
- 前記免疫チェックポイント調節因子が、阻害性チェックポイントポリペプチドである、請求項111に記載の方法。
- 前記阻害性チェックポイントポリペプチドが、PD1、PD-L1、CTLA4、TIM-3、VISTA、A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、IDO、KIR、LAG3、またはそれらの組み合わせを阻害する、請求項112に記載の方法。
- 前記チェックポイント阻害剤ポリペプチドが、抗体である、請求項112に記載の方法。
- 前記阻害性チェックポイントポリペプチドが、CTLA4に特異的に結合する抗CTLA4抗体またはその抗原結合断片、PD1に特異的に結合する抗PD1抗体またはその抗原結合断片、PD-L1に特異的に結合する抗PD-L1抗体またはその抗原結合断片、及びそれらの組み合わせから選択される抗体である、請求項114に記載の方法。
- 前記チェックポイント阻害剤ポリペプチドが、アテゾリズマブ、アベルマブ、またはデュルバルマブから選択される抗PD-L1抗体である、請求項115に記載の方法。
- 前記チェックポイント阻害剤ポリペプチドが、トレメリムマブまたはイピリムマブから選択される抗CTLA-4抗体である、請求項115に記載の方法。
- 前記チェックポイント阻害剤ポリペプチドが、ニボルマブまたはペンブロリズマブから選択される抗PD1抗体である、請求項115に記載の方法。
- 前記免疫チェックポイント調節因子が、100~300mgを送達するために十分な用量レベルで前記対象に投与される、請求項111~118のいずれか1項に記載の方法。
- 前記免疫チェックポイント調節因子が、200mgを送達するために十分な用量レベルで前記対象に投与される、請求項119に記載の方法。
- 前記免疫チェックポイント調節因子が、静脈内注入によって投与される、請求項111~120のいずれか1項に記載の方法。
- 前記免疫チェックポイント調節因子が、2回、3回、4回またはそれより多い回数で前記対象に投与される、請求項111~121のいずれか1項に記載の方法。
- 前記免疫チェックポイント調節因子が、前記mRNAワクチン投与と同じ日に前記対象に投与される、請求項111~122のいずれか1項に記載の方法。
- 前記癌が、
(i)非小細胞肺癌(NSCLC)、小細胞肺癌、メラノーマ、膀胱尿路上皮癌、HPV陰性頭頸部扁平上皮癌(HNSCC)、及び高頻度マイクロサテライト(MSI H)/ミスマッチ修復(MMR)欠損である固形悪性腫瘍からなる群;及び/または
(ii)膵臓、腹膜、大腸、小腸、胆道、肺、子宮内膜、卵巣、生殖管、胃腸管、子宮頸部、胃、尿路、結腸、直腸、ならびに造血系及びリンパ系組織の癌から選択される、請求項104~123のいずれか1項に記載の方法。 - 前記NSCLCが、EGFR感受性変異及び/またはALK転座がない、請求項124に記載の方法。
- 高頻度マイクロサテライト(MSI H)/ミスマッチ修復(MMR)欠損である前記固形悪性腫瘍が、結腸直腸癌、胃腺癌、食道腺癌、及び子宮内膜癌からなる群から選択される、請求項125に記載の方法。
- 1000~3000ヌクレオチドを含むコンカテマー癌抗原をコードするmRNAの生成方法であって、
(a)請求項1~103のいずれか1項に記載の癌抗原をコードするオープンリーディングフレームを含む第1のポリヌクレオチド及び5’-UTRを含む第2のポリヌクレオチドの、固形担体に複合化したポリヌクレオチドへの結合と、
(b)前記第2のポリヌクレオチドの3’末端の、前記第1のポリヌクレオチドの5’末端への適切な条件下でのライゲーションであって、前記適切な条件がDNAリガーゼを含み、それによって、第1のライゲーション産物が生成する前記ライゲーションと、
(c)3’-UTRを含む第3のポリヌクレオチドの5’末端の、前記第1のライゲーション産物の3’末端への、適切な条件下でのライゲーションであって、前記適切な条件がRNAリガーゼを含み、それによって、第2のライゲーション産物が生成する前記ライゲーションと、
(d)前記固形担体からの前記第2のライゲーション産物の遊離と、
を含み、それによって、前記1000~3000ヌクレオチドを含むコンカテマー癌抗原をコードするmRNAが生成する、前記方法。 - 個別化mRNA癌ワクチンでの対象の治療方法であって、患者特異的なミュータノームを生成するためのネオエピトープのセットの同定と、MHCとの結合強度、MHCとの結合多様性、免疫原性の予測度合い、自己反応性の低さ、及び/またはT細胞反応性に基づく、前記ワクチン向けネオエピトープのセットの前記ミュータノームからの選択と、前記ネオエピトープのセットをコードする前記mRNAワクチンの調製と、前記対象からの試料の単離の2ヶ月以内に実施される、前記mRNAワクチンの前記対象への投与と、を含む、前記方法。
- ネオエピトープのセットをコードする1つまたは複数のポリヌクレオチドを有する個別化mRNA癌ワクチンにおける使用を目的とする、前記ネオエピトープのセットの同定方法であって、
(a)患者のトランスクリプトーム及び患者のエクソームの解析による患者特異的なミュータノームの同定と、
(b)患者のRNAシークエンシングにおける遺伝子もしくは転写物レベルの発現評価;バリアントコ-ル(variant call)信頼スコア;RNAシークエンシングに基づく対立遺伝子特異的発現;保存的アミノ酸置換と非保存的アミノ酸置換との比較;点変異の位置(TCRの関与増加についての中心スコア(Centering Score));点変異の位置(HLAとの結合の差異についての固定スコア(Anchoring Score));独自性(Selfness):患者のWESデータとのコアエピトープ相同性(<100%);8マー~11マーについてはHLA-A及びHLA-Bに対するIC50;15マー~20マーについてはHLA-DRB1に対するIC50;広範結合スコア(promiscuity Score);8マー~11マーについてはHLA-Cに対するIC50;15マー~20マーについてはHLA-DRB3~5に対するIC50;15マー~20マーについてはHLA-DQB1/A1に対するIC50;15マー~20マーについてはHLA-DPB1/A1に対するIC50;クラスIとクラスIIとの比率比較;患者においてカバーされるHLA-Aアロタイプ、HLA-Bアロタイプ、及びHLA-DRB1アロタイプの多様性;点変異と複合エピトープとの比率比較;偽エピトープHLA結合スコア;RNAシークエンシングリードの存在及び/または存在量のうちの少なくとも3つに基づく、前記ネオエピトープに対する加重値を使用する、前記ミュータノームからの15~500のネオエピトープのサブセットの選択と、
(c)最高加重値に基づく、前記サブセットからの、個別化mRNA癌ワクチンにおける使用を目的とする前記ネオエピトープのセットの選択であって、前記ネオエピトープのセットが15~40のネオエピトープを含む前記選択と、を含む、前記方法。 - ネオエピトープのセットをコードする1つまたは複数のポリヌクレオチドを有する個別化mRNA癌ワクチンにおける使用を目的とする、前記ネオエピトープのセットの同定方法であって、
(a)患者の腫瘍からRNAシークエンシング試料を生成して、RNAシークエンシングリードのセットを生成することと、
(b)すべてのRNAシークエンシングリードからヌクレオチド配列の総数をコンパイルすることと、
(c)前記腫瘍試料と、同じ組織種の正常組織の対応するデータベースとの間で配列情報を比較することと、
(d)最高加重値に基づく、前記サブセットからの、個別化mRNA癌ワクチンにおける使用を目的とするネオエピトープのセットの選択であって、前記ネオエピトープのセットが15~40のネオエピトープを含む前記選択と、を含む、前記方法。
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