JP2024511179A - 百日咳ワクチン - Google Patents

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Abstract

本開示は、百日咳核酸ワクチン、ジフテリア核酸ワクチン、破傷風核酸ワクチン、及び組み合わせワクチン、ならびにワクチンを使用する方法及びワクチンを含む組成物に関する。

Description

関連出願
本出願は、２０２１年３月２６日に出願された米国特許出願第６３／１６６，８３８号の米国特許法第１１９条（ｅ）下の利益を主張し、その出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ＥＦＳ－ＷＥＢを介してテキストファイルとして提出された配列表
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂ経由でＡＳＣＩＩ形式で提出された配列表を含み、この配列表は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。２０２２年３月２３日に作成された当該ＡＳＣＩＩコピーは、Ｍ１３７８７０１１４ＷＯ００－ＳＥＱ－ＪＸＶと名付けられ、４１８，９４６バイトのサイズである。
百日咳（ｗｈｏｏｐｉｎｇ ｃｏｕｇｈ）とも呼ばれる呼吸器疾患である百日咳（ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）は、伝染性が高く、胞子を形成しないグラム陰性球桿菌であるＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓによって引き起こされる。この疾患は、主に、例えば、感染した人のくしゃみ、咳、または呼気からのエアロゾル化された液滴を介して伝染する。感染した人は、咳が始まってから約２週間後、曝露後約５～１０日間、最も感染性が高い。百日咳の初期症状は、鼻水、微熱、及び軽度の時折の咳など、一般的な風邪の症状と本質的に同じである。疾患の進行から１週間または２週間後、発作、嘔吐、及び疲労を含む従来の百日咳症状が発生する。世界中で、毎年２，０００万人の感染があり、約２０万人が死亡していると推定されている。
リボ核酸（ＲＮＡ）（例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））が身体の細胞機構を安全に指向して、天然タンパク質から抗体、及び細胞の内部及び外部で治療活性を有し得る他の完全に新規なタンパク質構築物まで、目的のほぼ全てのタンパク質を産生することができるという知識の上に構築されるＲＮＡワクチンが、本明細書に提供される。本開示のＲＮＡワクチン（例えば、ｍＲＮＡ）は、例えば、挿入変異誘発の可能性のリスクを伴わずに、細胞及び液性免疫の両方を含む、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ（例えば、百日咳（ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、ｗｈｏｏｐｉｎｇ ｃｏｕｇｈ））、ジフテリア、及び／または破傷風に対するバランスのとれた免疫応答を誘発するために使用され得る。
本明細書に開示されるワクチンは、感染の有病率または満たされていない医療ニーズの程度もしくはレベルに応じて、様々な設定で利用され得る。ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、様々な遺伝子型、株及び分離株の百日咳、ジフテリア、及び／または破傷風を治療及び／または予防するために利用され得る。
本開示は、いくつかの態様では、百日咳毒素抗原ポリペプチド、オートトランスポーターサブチリシン様プロテアーゼ（ＳＰＨＢ１）抗原ポリペプチド、気管コロニー形成因子Ａ（ＴＣＦＡ）抗原ポリペプチド、繊維状赤血球凝集素（ＦＨＡ）抗原ポリペプチド、パータクチン（ＰＲＮ）抗原ポリペプチド、線毛（ＦＩＭ）抗原ポリペプチド、アデニル酸シクラーゼ抗原ポリペプチド、ボルデテラ菌の殺傷抵抗性（Ｂｒｋ）抗原ポリペプチド、及び病原性関連遺伝子８（Ｖａｇ８）抗原ポリペプチドからなる群から選択されるＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ抗原ポリペプチドをコードする少なくとも１つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有する少なくとも１つのメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む、組成物を提供する。
いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも２つのメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドであって、各々が、少なくとも１つのＯＲＦを有し、かつ各々が、百日咳毒素抗原ポリペプチド、オートトランスポーターサブチリシン様プロテアーゼ（ＳＰＨＢ１）抗原ポリペプチド、気管コロニー形成因子Ａ（ＴＣＦＡ）抗原ポリペプチド、繊維状赤血球凝集素（ＦＨＡ）抗原ポリペプチド、パータクチン（ＰＲＮ）抗原ポリペプチド、線毛（ＦＩＭ）抗原ポリペプチド、アデニル酸シクラーゼ抗原ポリペプチド、ボルデテラ菌の殺傷抵抗性（Ｂｒｋ）抗原ポリペプチド、及び病原性関連遺伝子８（Ｖａｇ８）抗原ポリペプチドからなる群から選択されるＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ抗原ポリペプチドをコードする、当該少なくとも２つのメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも３つのメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドであって、各々が、少なくとも１つのＯＲＦを有し、かつ各々が、百日咳毒素抗原ポリペプチド、オートトランスポーターサブチリシン様プロテアーゼ（ＳＰＨＢ１）抗原ポリペプチド、気管コロニー形成因子Ａ（ＴＣＦＡ）抗原ポリペプチド、繊維状赤血球凝集素（ＦＨＡ）抗原ポリペプチド、パータクチン（ＰＲＮ）抗原ポリペプチド、線毛（ＦＩＭ）抗原ポリペプチド、アデニル酸シクラーゼ抗原ポリペプチド、ボルデテラ菌の殺傷抵抗性（Ｂｒｋ）抗原ポリペプチド、及び病原性関連遺伝子８（Ｖａｇ８）抗原ポリペプチドからなる群から選択されるＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ抗原ポリペプチドをコードする、当該少なくとも３つのメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも４つのメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドであって、各々が、少なくとも１つのＯＲＦを有し、かつ各々が、百日咳毒素抗原ポリペプチド、オートトランスポーターサブチリシン様プロテアーゼ（ＳＰＨＢ１）抗原ポリペプチド、気管コロニー形成因子Ａ（ＴＣＦＡ）抗原ポリペプチド、繊維状赤血球凝集素（ＦＨＡ）抗原ポリペプチド、パータクチン（ＰＲＮ）抗原ポリペプチド、線毛（ＦＩＭ）抗原ポリペプチド、アデニル酸シクラーゼ抗原ポリペプチド、ボルデテラ菌の殺傷抵抗性（Ｂｒｋ）抗原ポリペプチド、及び病原性関連遺伝子８（Ｖａｇ８）抗原ポリペプチドからなる群から選択されるＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ抗原ポリペプチドをコードする、当該少なくとも４つのメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも５つのメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドであって、各々が、少なくとも１つのＯＲＦを有し、かつ各々が、百日咳毒素抗原ポリペプチド、オートトランスポーターサブチリシン様プロテアーゼ（ＳＰＨＢ１）抗原ポリペプチド、気管コロニー形成因子Ａ（ＴＣＦＡ）抗原ポリペプチド、繊維状赤血球凝集素（ＦＨＡ）抗原ポリペプチド、パータクチン（ＰＲＮ）抗原ポリペプチド、線毛（ＦＩＭ）抗原ポリペプチド、アデニル酸シクラーゼ抗原ポリペプチド、ボルデテラ菌の殺傷抵抗性（Ｂｒｋ）抗原ポリペプチド、及び病原性関連遺伝子８（Ｖａｇ８）抗原ポリペプチドからなる群から選択されるＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ抗原ポリペプチドをコードする、当該少なくとも５つのメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも６つのメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドであって、各々が、少なくとも１つのＯＲＦを有し、かつ各々が、百日咳毒素抗原ポリペプチド、オートトランスポーターサブチリシン様プロテアーゼ（ＳＰＨＢ１）抗原ポリペプチド、気管コロニー形成因子Ａ（ＴＣＦＡ）抗原ポリペプチド、繊維状赤血球凝集素（ＦＨＡ）抗原ポリペプチド、パータクチン（ＰＲＮ）抗原ポリペプチド、線毛（ＦＩＭ）抗原ポリペプチド、アデニル酸シクラーゼ抗原ポリペプチド、ボルデテラ菌の殺傷抵抗性（Ｂｒｋ）抗原ポリペプチド、及び病原性関連遺伝子８（Ｖａｇ８）抗原ポリペプチドからなる群から選択されるＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ抗原ポリペプチドをコードする、当該少なくとも６つのメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも７つのメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドであって、各々が、少なくとも１つのＯＲＦを有し、かつ各々が、百日咳毒素抗原ポリペプチド、オートトランスポーターサブチリシン様プロテアーゼ（ＳＰＨＢ１）抗原ポリペプチド、気管コロニー形成因子Ａ（ＴＣＦＡ）抗原ポリペプチド、繊維状赤血球凝集素（ＦＨＡ）抗原ポリペプチド、パータクチン（ＰＲＮ）抗原ポリペプチド、線毛（ＦＩＭ）抗原ポリペプチド、アデニル酸シクラーゼ抗原ポリペプチド、ボルデテラ菌の殺傷抵抗性（Ｂｒｋ）抗原ポリペプチド、及び病原性関連遺伝子８（Ｖａｇ８）抗原ポリペプチドからなる群から選択されるＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ抗原ポリペプチドをコードする、当該少なくとも７つのメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも８つのメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドであって、各々が、少なくとも１つのＯＲＦを有し、かつ各々が、百日咳毒素抗原ポリペプチド、オートトランスポーターサブチリシン様プロテアーゼ（ＳＰＨＢ１）抗原ポリペプチド、気管コロニー形成因子Ａ（ＴＣＦＡ）抗原ポリペプチド、繊維状赤血球凝集素（ＦＨＡ）抗原ポリペプチド、パータクチン（ＰＲＮ）抗原ポリペプチド、線毛（ＦＩＭ）抗原ポリペプチド、アデニル酸シクラーゼ抗原ポリペプチド、ボルデテラ菌の殺傷抵抗性（Ｂｒｋ）抗原ポリペプチド、及び病原性関連遺伝子８（Ｖａｇ８）抗原ポリペプチドからなる群から選択されるＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ抗原ポリペプチドをコードする、当該少なくとも８つのメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも９つのメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドであって、各々が、少なくとも１つのＯＲＦを有し、かつ各々が、百日咳毒素抗原ポリペプチド、オートトランスポーターサブチリシン様プロテアーゼ（ＳＰＨＢ１）抗原ポリペプチド、気管コロニー形成因子Ａ（ＴＣＦＡ）抗原ポリペプチド、繊維状赤血球凝集素（ＦＨＡ）抗原ポリペプチド、パータクチン（ＰＲＮ）抗原ポリペプチド、線毛（ＦＩＭ）抗原ポリペプチド、アデニル酸シクラーゼ抗原ポリペプチド、ボルデテラ菌の殺傷抵抗性（Ｂｒｋ）抗原ポリペプチド、及び病原性関連遺伝子８（Ｖａｇ８）抗原ポリペプチドからなる群から選択されるＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ抗原ポリペプチドをコードする、当該少なくとも９つのメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、百日咳毒素抗原ポリペプチドは、Ｓ１サブユニット、Ｓ２サブユニット、Ｓ３サブユニット、Ｓ４サブユニット、Ｓ５サブユニット、またはそのバリアントからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、Ｓ１サブユニットは、配列番号８によって特定される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｓ１サブユニットは、配列番号８によって特定される配列と同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｓ１サブユニットをコードするｍＲＮＡは、配列番号７によって特定される配列と少なくとも９５％または９８％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｓ１サブユニットをコードするｍＲＮＡは、配列番号７によって特定される配列と同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｓ１サブユニットをコードするｍＲＮＡは、配列番号６によって特定される配列と少なくとも９５％または９８％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｓ１サブユニットをコードするｍＲＮＡは、配列番号６によって特定される配列と同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｓ１サブユニットバリアントは、配列番号５または１１によって特定される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｓ１サブユニットバリアントは、配列番号５または１１によって特定される配列と同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｓ１サブユニットバリアントをコードするｍＲＮＡは、配列番号３または１０によって特定される配列と少なくとも９５％または９８％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｓ１サブユニットバリアントをコードするｍＲＮＡは、配列番号３または１０によって特定される配列と同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｓ１サブユニットバリアントをコードするｍＲＮＡは、配列番号１または９によって特定される配列と少なくとも９５％または９８％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｓ１サブユニットバリアントをコードするｍＲＮＡは、配列番号１または９によって特定される配列と同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｓ２サブユニットバリアントは、配列番号１４によって特定される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｓ２サブユニットバリアントは、配列番号１４によって特定される配列と同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｓ２サブユニットバリアントをコードするｍＲＮＡは、配列番号１３によって特定される配列と少なくとも９５％または９８％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｓ２サブユニットバリアントをコードするｍＲＮＡは、配列番号１３によって特定される配列と同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｓ２サブユニットバリアントをコードするｍＲＮＡは、配列番号１２によって特定される配列と少なくとも９５％または９８％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｓ２サブユニットバリアントをコードするｍＲＮＡは、配列番号１２によって特定される配列と同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｓ３サブユニットバリアントは、配列番号１７によって特定される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｓ３サブユニットバリアントは、配列番号１７によって特定される配列と同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｓ３サブユニットバリアントをコードするｍＲＮＡは、配列番号１６によって特定される配列と少なくとも９５％または９８％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｓ３サブユニットバリアントをコードするｍＲＮＡは、配列番号１６によって特定される配列と同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｓ３サブユニットバリアントをコードするｍＲＮＡは、配列番号１５によって特定される配列と少なくとも９５％または９８％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｓ３サブユニットバリアントをコードするｍＲＮＡは、配列番号１５によって特定される配列と同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｓ４サブユニットは、配列番号２０によって特定される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｓ４サブユニットバリアントは、配列番号２０によって特定される配列と同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｓ４サブユニットをコードするｍＲＮＡは、配列番号１９によって特定される配列と少なくとも９５％または９８％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｓ４サブユニットをコードするｍＲＮＡは、配列番号１９によって特定される配列と同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｓ４サブユニットをコードするｍＲＮＡは、配列番号１８によって特定される配列と少なくとも９５％または９８％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｓ４サブユニットをコードするｍＲＮＡは、配列番号１８によって特定される配列と同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｓ５サブユニットバリアントは、配列番号２３によって特定される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｓ５サブユニットバリアントは、配列番号２３によって特定される配列と同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｓ５サブユニットバリアントをコードするｍＲＮＡは、配列番号２２によって特定される配列と少なくとも９５％または９８％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｓ５サブユニットバリアントをコードするｍＲＮＡは、配列番号２２によって特定される配列と同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｓ５サブユニットバリアントをコードするｍＲＮＡは、配列番号２１によって特定される配列と少なくとも９５％または９８％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｓ５サブユニットバリアントをコードするｍＲＮＡは、配列番号２１によって特定される配列と同一であるヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＳＰＨＢ１抗原ポリペプチドは、配列番号２６によって特定される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＳＰＨＢ１抗原ポリペプチドは、配列番号２６によって特定される配列を含むアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＳＰＨＢ１抗原ポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、配列番号２５によって特定される配列と少なくとも９５％または９８％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＳＰＨＢ１抗原ポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、配列番号２５によって特定される配列と同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＳＰＨＢ１抗原ポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、配列番号２４によって特定される配列と少なくとも９５％または９８％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＳＰＨＢ１抗原ポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、配列番号２４によって特定される配列と同一であるヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＴＣＦＡ抗原ポリペプチドは、配列番号２９によって特定される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＴＣＦＡ抗原ポリペプチドは、配列番号２９によって特定される配列を含むアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＴＣＦＡ抗原ポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、配列番号２８によって特定される配列と少なくとも９５％または９８％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＴＣＦＡ抗原ポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、配列番号２８によって特定される配列と同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＴＣＦＡ抗原ポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、配列番号２７によって特定される配列と少なくとも９５％または９８％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＴＣＦＡ抗原ポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、配列番号２７によって特定される配列と同一であるヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、繊維状赤血球凝集素抗原ポリペプチドは、ＦＨＡ１、ＦＨＡ２、またはＦＨＡ３を含む。いくつかの実施形態では、ＦＨＡ３抗原ポリペプチドは、配列番号３５によって特定される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＦＨＡ３抗原ポリペプチドは、配列番号３５によって特定される配列を含む。いくつかの実施形態では、ＦＨＡ３抗原ポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、配列番号３４によって特定される配列と少なくとも９５％または９８％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＦＨＡ３抗原ポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、配列番号３４によって特定される配列と同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＦＨＡ３抗原ポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、配列番号３３によって特定される配列と少なくとも９５％または９８％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＦＨＡ３抗原ポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、配列番号３３によって特定される配列と同一であるヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＰＲＮ抗原ポリペプチドは、配列番号３２によって特定される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＰＲＮ抗原ポリペプチドは、配列番号３２によって特定される配列を含むアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＰＲＮ抗原ポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、配列番号３１によって特定される配列と少なくとも９５％または９８％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＰＲＮ抗原ポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、配列番号３１によって特定される配列と同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＰＲＮ抗原ポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、配列番号３０によって特定される配列と少なくとも９５％または９８％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＰＲＮ抗原ポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、配列番号３０によって特定される配列と同一であるヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＦＩＭ抗原ポリペプチドは、ＦＩＭ１、ＦＩＭ２、ＦＩＭ３、及びそれらのドメインスワップ構築物からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＦＩＭ抗原ポリペプチドは、配列番号３８によって特定される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＦＩＭ抗原ポリペプチドは、配列番号３８によって特定される配列を含むアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＦＩＭ抗原ポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、配列番号３７によって特定される配列と少なくとも９５％または９８％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＦＩＭ抗原ポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、配列番号３７によって特定される配列と同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＦＩＭ抗原ポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、配列番号３６によって特定される配列と少なくとも９５％または９８％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＦＩＭ抗原ポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、配列番号３６によって特定される配列と同一であるヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、アデニル酸シクラーゼ抗原ポリペプチドは、ＡＣＴ１８８ＬＱ、ＡＣＴＨ６３Ａ＿Ｋ６５Ａ＿Ｓ６６Ｇ、及びリピートイントキシン（ＲＴＸ）ドメインからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＲＴＸ抗原ポリペプチドは、配列番号４１によって特定される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＲＴＸ抗原ポリペプチドは、配列番号４１によって特定される配列を含むアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＲＴＸ抗原ポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、配列番号４０によって特定される配列と少なくとも９５％または９８％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＲＴＸ抗原ポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、配列番号４０によって特定される配列と同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＲＴＸ抗原ポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、配列番号３９によって特定される配列と少なくとも９５％または９８％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＲＴＸ抗原ポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、配列番号３９によって特定される配列と同一であるヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｂｒｋ抗原ポリペプチドは、配列番号４４によって特定される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｂｒｋ抗原ポリペプチドは、配列番号４４によって特定される配列を含むアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｂｒｋ抗原ポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、配列番号４３によって特定される配列と少なくとも９５％または９８％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｂｒｋ抗原ポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、配列番号４３によって特定される配列と同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｂｒｋ抗原ポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、配列番号４２によって特定される配列と少なくとも９５％または９８％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｂｒｋ抗原ポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、配列番号４２によって特定される配列と同一であるヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｖａｇ８抗原ポリペプチドは、配列番号４７によって特定される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｖａｇ８抗原ポリペプチドは、配列番号４７によって特定される配列を含むアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｖａｇ８抗原ポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、配列番号４６によって特定される配列と少なくとも９５％または９８％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｖａｇ８抗原ポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、配列番号４６によって特定される配列と同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｖａｇ８抗原ポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、配列番号４５によって特定される配列と少なくとも９５％または９８％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｖａｇ８抗原ポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、配列番号４５によって特定される配列と同一であるヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供する組成物のうちのいずれかは、ジフテリア抗原ポリペプチドをコードする少なくとも１つのＯＲＦを有する少なくとも１つのｍＲＮＡポリヌクレオチドを更に含む。いくつかの実施形態では、ジフテリア抗原ポリペプチドは、配列番号５０によって特定される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ジフテリア抗原ポリペプチドは、配列番号５０によって特定される配列を含むアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ジフテリア抗原ポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、配列番号４９によって特定される配列と少なくとも９５％または９８％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ジフテリア抗原ポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、配列番号４９によって特定される配列と同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ジフテリア抗原ポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、配列番号４８によって特定される配列と少なくとも９５％または９８％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ジフテリア抗原ポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、配列番号４８によって特定される配列と同一であるヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供する組成物のうちのいずれか１つは、破傷風抗原ポリペプチドをコードする少なくとも１つのＯＲＦを有する少なくとも１つのｍＲＮＡポリヌクレオチドを更に含む。いくつかの実施形態では、破傷風抗原ポリペプチドは、配列番号５３によって特定される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、破傷風抗原ポリペプチドは、配列番号５３によって特定される配列を含むアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、破傷風抗原ポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、配列番号５２によって特定される配列と少なくとも９５％または９８％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、破傷風抗原ポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、配列番号５２によって特定される配列と同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、破傷風抗原ポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、配列番号５１によって特定される配列と少なくとも９５％または９８％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、破傷風抗原ポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、配列番号５１によって特定される配列と同一であるヌクレオチド配列を含む。
いくつかの態様では、ジフテリア抗原ポリペプチドをコードする少なくとも１つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有する少なくとも１つのメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む組成物が、提供される。いくつかの実施形態では、ジフテリア抗原ポリペプチドは、配列番号５０によって特定される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ジフテリア抗原ポリペプチドは、配列番号５０によって特定される配列を含むアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ジフテリア抗原ポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、配列番号４９によって特定される配列と少なくとも９５％または９８％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ジフテリア抗原ポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、配列番号４９によって特定される配列と同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ジフテリア抗原ポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、配列番号４８によって特定される配列と少なくとも９５％または９８％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ジフテリア抗原ポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、配列番号４８によって特定される配列と同一であるヌクレオチド配列を含む。
いくつかの態様では、破傷風抗原ポリペプチドをコードする少なくとも１つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有する少なくとも１つのメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む組成物が、提供される。いくつかの実施形態では、破傷風抗原ポリペプチドは、配列番号５３によって特定される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、破傷風抗原ポリペプチドは、配列番号５３によって特定される配列を含むアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、破傷風抗原ポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、配列番号５２によって特定される配列と少なくとも９５％または９８％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、破傷風抗原ポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、配列番号５２によって特定される配列と同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、破傷風抗原ポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、配列番号５１によって特定される配列と少なくとも９５％または９８％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、破傷風抗原ポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、配列番号５１によって特定される配列と同一であるヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物のうちのいずれか１つは、百日咳抗原融合ポリペプチド、破傷風抗原融合ポリペプチド、ジフテリア抗原融合ポリペプチド、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される抗原融合ポリペプチドをコードするｍＲＮＡを更に含む。いくつかの実施形態では、抗原融合ポリペプチドは、配列番号５６、５９、６２、６５、６８、７１、７４、７７、８０、８３、８６、８９、９２、９５、及び９８から選択される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗原融合ポリペプチドは、配列番号５６、５９、６２、６５、６８、７１、７４、７７、８０、８３、８６、８９、９２、９５、及び９８から選択される配列を含むアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗原融合ポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、配列番号５５、５８、６１、６４、６７、７０、７３、７６、７９、８２、８５、８８、９１、９４、及び９７から選択される配列と少なくとも９５％または９８％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、抗原融合ポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、配列番号５５、５８、６１、６４、６７、７０、７３、７６、７９、８２、８５、８８、９１、９４、及び９７から選択される配列と同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、抗原融合ポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、配列番号５４、５７、６０、６３、６６、６９、７２、７５、７８、８１、８４、８７、９０、９３、及び９６から選択される配列と少なくとも９５％または９８％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、抗原融合ポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、配列番号５４、５７、６０、６３、６６、６９、７２、７５、７８、８１、８４、８７、９０、９３、及び９６から選択される配列と同一であるヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号２のヌクレオチド配列を含む５’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号４のヌクレオチド配列を含む３’ＵＴＲを含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、化学修飾を更に含む。いくつかの実施形態では、化学修飾は、１－メチルシュードウリジンである。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物のうちのいずれか１つは、脂質ナノ粒子を更に含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、ＰＥＧ修飾脂質、非カチオン性脂質、ステロール、イオン化可能なアミノ脂質、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、０．５～１５ｍｏｌ％のＰＥＧ修飾脂質、５～２５ｍｏｌ％の非カチオン性脂質、２５～５５ｍｏｌ％のステロール、及び２０～６０ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質を含む。
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質は、１，２ジミリストイル－ｓｎ－グリセロール、メトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ２０００ ＤＭＧ）であり、非カチオン性脂質は、１，２ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）であり、ステロールは、コレステロールであり、イオン化可能なアミノ脂質は、化合物１の構造を有する。
いくつかの態様では、本開示は、対象に、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物を、対象におけるＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓに対する中和抗体応答を誘導するのに有効な量で投与することを含む方法を提供する。
いくつかの実施形態では、組成物は、対象において、Ｔｈ１免疫応答、Ｔｈ１７免疫応答、Ｔｈ２応答、またはそれらの組み合わせを誘導するのに有効な量で投与される。いくつかの実施形態では、組成物は、対象における百日咳の症状を低減または除去するのに有効な量で投与される。いくつかの実施形態では、組成物は、対象の呼吸器のコロニー形成を低減または除去するのに有効な量で投与される。いくつかの実施形態では、組成物は、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓの伝染性を低減または除去するのに有効な量で投与される。
いくつかの実施形態では、組成物は、ブーストとして、２回目を更に投与される。いくつかの実施形態では、ブースト用量は、第１の用量から２８日後に投与される。
本開示の様々な実施形態の詳細が、以下の説明に記載されている。本開示の他の特色、目的、及び利点は、明細書及び特許請求の範囲から明らかになるであろう。
添付の図面は、一定の縮尺で描画されることを意図していない。図面では、様々な図に示されている各同一またはほぼ同一の構成要素は、同様の番号で表されている。わかりやすくするために、全ての構成要素が、各図面において標識されているわけではない場合がある。図面の説明は以下のとおりである。
実施例１に記載されるように、示されるｍＲＮＡ構築物を注射した後、次いでＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓに曝露した後のマウスにおける重量変化（体重減少）の割合を示すグラフである。 実施例１に記載されるように、示されるｍＲＮＡ構築物を注射した後、次いで百日咳ボルデテラへの曝露後のマウスの血液細胞性を示すグラフである。白血球数、好中球数、及びリンパ球数を示す。 実施例１に記載されるように、示されるｍＲＮＡ構築物を注射した後、次いでＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓに曝露した後のマウスにおけるＩＬ－６の濃度を示すグラフである。 実施例１に記載されるように、示されるｍＲＮＡ構築物を注射した後、次いでＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓに曝露した後のマウスの気管及び肺における細菌負荷（ＣＦＵによって測定される）を示すグラフである。 実施例１に記載されるように、示されるｍＲＮＡ構築物を注射した後、次いでＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓに曝露した後のマウスの鼻洗浄における細菌負荷（ＣＦＵによって測定される）を示すグラフである。 毒素に対する抗体力価を示す。Ａは、ブースター投与（実施例１）から１週間後の抗体力価（抗ＰＴ）を示し、Ｂは、チャレンジから３日後の抗ＲＴＸ抗体力価を示す（実施例１）。 追加の抗体力価の特性評価を示す。Ａは、抗原（１００タンパク質）として細胞外百日咳タンパク質を使用した抗体力価を示し、Ｂは、生のＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ結合アッセイ（全バグ力価）からの結果を示す。 チャレンジから３日後のＥＬＩＳＡによる百日咳毒素に対する血清ＩｇＧ抗体力価を示すグラフである（実施例２）。データは、各時点での処置群当たりの平均±標準誤差、ｎ＝５として提示される。＊＊偽ワクチン接種と有意差がある（ｐ＜０．００５）、＊＊＊偽ワクチン接種と有意差がある（ｐ＜０．０００５）。黒い点線は、検出の最低限界を示す。統計分析には、Ｄｕｎｎｅｔの事後検定を用いたＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ非パラメトリック検定を使用した。 チャレンジから３日後のＥＬＩＳＡによる全バグ（ＵＴ２５）に対する血清ＩｇＧ抗体力価を示すグラフである（実施例２）。データは、各時点での処置群当たりの平均±標準誤差、ｎ＝５として提示される。＊ワクチン接種と有意差がある（ｐ＜０．０５）、＊＊偽ワクチン接種と有意差がある（ｐ＜０．００５）、＊＊＊偽ワクチン接種と有意差がある（ｐ＜０．０００５）。黒い点線は、検出の最低限界を示す。統計分析には、Ｄｕｎｎｅｔの事後検定を用いたＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ非パラメトリック検定を使用した。 Ａ及びＢは、対象の肺及び気管（Ａ）ならびに鼻洗浄（Ｂ）におけるチャレンジから３日後に測定された細菌負荷を示すグラフである（実施例２）。 Ａ及びＢは、対象の肺及び気管（Ａ）ならびに鼻洗浄（Ｂ）におけるチャレンジから３日後に測定された細菌負荷を示すグラフである（実施例２）。 Ａ及Ｂは、ブースト投与前及び異なる用量のワクチンのブースト投与後のマウＡスにおける抗ジフテリア毒素力価（Ａ）及び抗破傷風毒素力価（Ｂ）を示すグラフである（実施例３）。 Ａ及びＢは、ブースト投与前及び異なる用量のワクチンのブースト投与後のマウＡスにおける抗ジフテリア毒素力価（Ａ）及び抗破傷風毒素力価（Ｂ）を示すグラフである（実施例３）。 １０μｇ用量で投与された３つの異なる抗原から生じるＩＣ５０を示す要約グラフである（実施例３）。 Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓチャレンジから３日後の肺及び気管試料中のコロニー形成単位（ＣＦＵ）を示す。データは、平均±標準誤差（平均の標準誤差）、処置群当たりｎ＝５として提示される、ＮＳ＝有意差なし、＊偽ワクチン接種と有意差がある（ｐ＜０．０２３１）、＊＊＊＊偽ワクチン接種と有意差がある（ｐ＜０．０００１）。黒い線は、検出の最低限界を示す。統計分析には、Ｔｕｋｅｙｓの事後検定を用いた一元配置分散分析を使用した。 Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓチャレンジから３日後からの鼻洗浄試料中のＣＦＵを示す。データは、平均±標準誤差として提示され、ｎ＝５／処置群である。ＮＳ＝有意差なし。黒い線は、検出の最低限界を示す。統計分析には、Ｔｕｋｅｙｓの事後検定を用いた一元配置分散分析を使用した。 Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓチャレンジから３日後からの鼻関連リンパ組織（ＮＡＬＴ）中に存在するＣＦＵを示す。データは、平均±標準誤差として提示され、ｎ＝５／処置群である。黒い線は、検出の最低限界を示す。＊偽ワクチン接種と有意差がある（ｐ＜０．０３２６）、統計分析には、Ｔｕｋｅｙｓの事後検定を用いた一元配置分散分析を使用した。 チャレンジの日とチャレンジ後３日間との間のマウス体重変化の割合を示す。チャレンジの日、次いでチャレンジから３日後に体重を測定した。データは、平均体重変化率±標準誤差として提示され、ｎ＝５／処置群である。 Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓチャレンジから３日後の異なる免疫群間の完全な白血球数を示す。Ｈｅｍａｖｅｔを使用して、チャレンジ後の好中球数を決定した。データは、平均±標準誤差として提示され、ｎ＝５／処置群である。ＮＳ＝有意差なし。統計分析には、Ｔｕｋｅｙｓの事後検定を用いた一元配置分散分析を使用した。 Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓチャレンジから３日後の異なる免疫群間の好中球数を示す。Ｈｅｍａｖｅｔを使用して、チャレンジ後の好中球数を決定した。データは、平均±標準誤差として提示され、各時点でのｎ＝５／処置群である。ＮＳ＝有意差なし。統計分析には、Ｔｕｋｅｙｓの事後検定を用いた一元配置分散分析を使用した。 Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓチャレンジから３日後の異なる免疫群間のリンパ球数を示す。Ｈｅｍａｖｅｔを使用して、チャレンジ後のリンパ球数を決定した。データは、平均±標準誤差として提示され、各時点でのｎ＝５／処置群である。ＮＳ＝有意差なし。統計分析には、Ｔｕｋｅｙｓの事後検定を用いた一元配置分散分析を使用した。 Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓチャレンジから３日後の異なる免疫群間の単球数を示す。Ｈｅｍａｖｅｔを使用して、チャレンジ後の単球数を決定した。データは、平均±標準誤差として提示され、各時点でのｎ＝５／処置群である。ＮＳ＝有意差なし。統計分析には、Ｔｕｋｅｙｓの事後検定を用いた一元配置分散分析を使用した。 Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓチャレンジから３日後の異なる免疫群間の好酸球数を示す。Ｈｅｍａｖｅｔを使用して、チャレンジ後の好酸球数を決定した。データは、平均±標準誤差として提示され、各時点でのｎ＝５／処置群である。ＮＳ＝有意差なし。統計分析には、Ｔｕｋｅｙｓの事後検定を用いた一元配置分散分析を使用した。 全バグ（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ株ＵＴ２５）に対する血清抗体（ＩｇＧ）力価を示す。データは、平均±標準誤差として提示され、ｎ＝５／処置群である。＊偽ワクチン接種と有意差がある（ｐ＜０．０３７２）、＊＊偽ワクチン接種と有意差がある（ｐ＜０．００９１）、＊＊＊偽ワクチン接種と有意差がある（ｐ＜０．０００７）。黒い線は、検出の最低限界を示す。統計分析には、Ｄｕｎｎｅｔの事後検定を用いたＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ非パラメトリック検定を使用した。 チャレンジから３日後の百日咳毒素（ＰＴ）に対する血清抗体（ＩｇＧ）力価を示す。データは、平均±標準誤差として提示され、ｎ＝５／処置群である。＊偽ワクチン接種と有意差がある（ｐ＜０．０３１３）、＊＊＊＊偽ワクチン接種と有意差がある（ｐ＜０．０００１）。黒い線は、検出の最低限界を示す。統計分析には、Ｄｕｎｎｅｔの事後検定を用いたＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ非パラメトリック検定を使用した。 チャレンジから３日後のジフテリア毒素に対する血清抗体（ＩｇＧ）力価を示す。データは、平均±標準誤差として提示され、ｎ＝５／処置群である。＊偽ワクチン接種と有意差がある（ｐ＜０．０１８２）、＊＊＊偽ワクチン接種と有意差がある（ｐ＜０．０００９）。黒い線は、検出の最低限界を示す。統計分析には、Ｄｕｎｎｅｔの事後検定を用いたＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ非パラメトリック検定を使用した。 チャレンジから３日後の破傷風毒素に対する血清抗体（ＩｇＧ）力価を示す。データは、平均±標準誤差として提示され、各時点でｎ＝５／処置群である。＊＊偽ワクチン接種と有意差がある（ｐ＜０．００４０）、＊＊＊偽ワクチン接種と有意差がある（ｐ＜０．０００９）。黒い線は、検出の最低限界を示す。統計分析には、Ｄｕｎｎｅｔの事後検定を用いたＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ非パラメトリック検定を使用した。 肺上清試料中のＩＬ－６レベルを示す。データは、平均±標準誤差として提示され、各時点でのｎ＝５／処置群である。＊＊＊＊ＮＶＮＣと有意差がある（ｐ＜０．０００１）。全ての群は、偽ワクチン接種と有意差がある（ｐ＜０．０００１）。灰色で塗りつぶされた円は、測定が検出範囲外であることを示す。統計分析には、Ｔｕｋｅｙｓの事後検定を用いた一元配置分散分析を使用した。 血清試料中のＩＬ－６レベルを示す。データは、平均±標準誤差として提示され、各時点でのｎ＝５／処置群である。＊＊＊＊ＮＶＮＣと有意差がある（ｐ＜０．０００５）、全ての群は、偽ワクチン接種と有意差がある（ｐ＜０．０００１）。灰色で塗りつぶされた円は、測定が検出範囲外であることを示す。統計分析には、Ｔｕｋｅｙｓの事後検定を用いた一元配置分散分析を使用した。 プライミングワクチン接種用量から２週間後のマウスにおける抗Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ抗体力価を示す。 Ａ、Ｂ、及びＣは、チャレンジ後１日目（Ａ）、３日目（Ｂ）、及び７日目（Ｃ）に、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ株ＵＴ２５またはＤ４２０にチャレンジしたマウスからの肺及び気管試料中のコロニー形成単位（ＣＦＵ）を示す。 Ａ、Ｂ、及びＣは、チャレンジ後１日目（Ａ）、３日目（Ｂ）、及び７日目（Ｃ）に、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ株ＵＴ２５またはＤ４２０にチャレンジしたマウスからの肺及び気管試料中のコロニー形成単位（ＣＦＵ）を示す。 Ａ、Ｂ、及びＣは、チャレンジ後１日目（Ａ）、３日目（Ｂ）、及び７日目（Ｃ）に、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ株ＵＴ２５またはＤ４２０にチャレンジしたマウスからの肺及び気管試料中のコロニー形成単位（ＣＦＵ）を示す。 Ａ～Ｂは、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ株ＵＴ２５（Ａ）またはＤ４２０（Ｂ）でチャレンジしたマウスからの肺及び気管試料中のＣＦＵの時間経過を示す。
Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓは、高伝染性、好気性、非胞子形成、グラム陰性球桿菌である。細菌は、呼吸上皮細胞の繊毛に付着し、免疫細胞に様々な効果を有する毒素を産生する。例えば、百日咳毒素（ＰＴ）は、常駐気道マクロファージの保護抗菌機能を阻害し、好中球の気道への流入を阻害する。細菌が増殖するにつれて、炎症及び粘液過分泌が起こる。リンパ球増加が促進される一方で、走化性が損なわれるため、百日咳抗原は、細菌が宿主の防御を回避することを可能にする。Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓによって産生される毒性因子には、付着に関連し、付着／コロニー形成、持続性、及び輸送において役割を果たすものが含まれ、これには、繊維状赤血球凝集素（ＦＨＡ）、凝集原、パータクチン、及び線毛（ＦＩＭ）が含まれる。他の毒性因子は、病理学及び持続性において役割を果たす毒素である。Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ毒素としては、百日咳毒素（ＰＴ）、アデニル酸シクラーゼ毒素（ＡＣＴ）、気管細胞毒素、皮膚壊死性毒素、加熱性毒素、及びＬＰＳ（リポ多糖；エンドトキシン）が挙げられる。
百日咳ワクチンに対する２つの主なアプローチが使用されている。全細胞ワクチン（ｗＰ）において、ワクチンは、多数の抗原を含む、熱殺菌またはホルマリン不活性化Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ培養物を含む。多くの副作用があり、ワクチンは一部の個人には禁忌である。自然感染と同様に、ｗＰワクチンは、Ｔｈ１及びＴｈ１７免疫応答を誘発する。保護は、３～５年の間続く。ｗＰワクチンは、小児において反応源性であり、様々な異なる方法で産生され、不均一なワクチンをもたらす。対照的に、無細胞ワクチン（ａＰ）は、化学方法によって解毒された組換え／精製細菌抗原（例えば、ＰＴ、ＦＨＡ、ＰＲＮ、及びＦＩＭ２／３）を含む。ａＰワクチン（ＤＴａＰ、小児用；Ｔｄａｐ、成人用）は、約８５％の有効性を達成するために３回の用量を必要とし、保護の持続時間は不明であるが、２年後の有効性の低下が存在する。ａＰワクチンは、Ｔｈ２バイアス免疫応答を誘発する。現在のａＰワクチンは、ＡＣＴなどのある特定の毒性因子を含まない。加えて、ａＰワクチンは、中和によって症候性疾患を予防するが、コロニー形成または伝播を予防しない（例えば、ワクチン接種された個人は、無症候性キャリアであり得る）。ａＰワクチンでプライミングされた小児は、ｗＰワクチンでプライミングされた小児と比較して、急性感染に罹るリスクが２～５倍高いことが見出されている。更に、ａＰワクチンを投与された成人は、感染源であり得るが、小児は、感染しやすい。
コロニー形成及び伝達の予防を含む永続的な保護を提供する、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ抗原、ならびに任意選択的にジフテリア及び／または破傷風抗原をコードする核酸ワクチンが、本明細書に提供される。ｍＲＮＡワクチンとして送達されるワクチン抗原の組み合わせは、特に有効である。本明細書に記載のワクチンはまた、Ｔｈ１、Ｔｈ２、及び／またはＴｈ１７免疫応答も誘発する。
抗原
本発明の組成物、例えば、ワクチン組成物は、目的の抗原、例えば、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、ジフテリア、または破傷風タンパク質に由来する抗原をコードするように設計された核酸、特に、ｍＲＮＡを特徴とする。本発明の組成物、例えば、ワクチン組成物は、それ自体が抗原を含まず、むしろ、細胞、組織、または対象に一旦送達された抗原または抗原配列をコードする核酸、特にｍＲＮＡ（複数可）を含む。核酸、特にｍＲＮＡ（複数可）の送達は、細胞、組織または対象への投与時に核酸が細胞によって取り込まれ、次に、この細胞が、核酸、例えば、ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質（複数可）を発現するように、適切な担体または送達ビヒクル（例えば、脂質ナノ粒子）中に当該核酸を製剤化することによって達成される。
抗原とは、免疫応答を誘導する（例えば、抗原に対する抗体を免疫系に産生させる）ことが可能なタンパク質である。本開示のワクチンは、タンパク質抗原がインビトロで精製または産生される従来のタンパク質ベースのワクチン接種アプローチ、例えば、組換えタンパク質産生技術に対して独特の利点を提供する。本開示のワクチンは、所望の抗原をコードするｍＲＮＡを特徴とし、これが体内に導入されると、すなわちインビボで哺乳類対象（例えばヒト）に投与されると、身体の細胞に所望の抗原を発現させる。
本明細書に開示されるものなどの細菌抗原は、典型的には、哺乳類細胞において産生されない。したがって、細菌抗原が対象によって（例えば、哺乳類細胞によって）産生されるｍＲＮＡワクチンを生成するために、いくつかの修飾が行われる。第一に、細菌は、ベータバレルを形成するそれらの外膜タンパク質上にオートトランスポータードメインを含み、細菌が毒性因子（例えば、毒素）を輸出することを可能にする。このプロセスは、タンパク質の適切な折り畳みを助ける。哺乳類細胞は、オートトランスポーターまたはベータバレルを有さず、そのような構造をコードするｍＲＮＡが哺乳類細胞内で産生される場合、得られる構造は、哺乳類の膜内に適切に適合しない。これに対処するために、本明細書に開示される抗原は、分泌シグナルを含み、細菌におけるオートトランスポーターの輸出に類似するプロセスで哺乳類細胞から分泌される。第二に、細菌系は、タンパク質をグリコシル化するが、グリコシル化は、哺乳類細胞においていくらか頻繁に生じる。グリコシル化を防ぐために、本明細書に記載のｍＲＮＡは、Ｎ結合グリコシル化（例えば、アスパラギン）を起こしやすい残基が、グリコシル化を防ぐために除去、修飾、または置換されている抗原をコードする。
本開示のｍＲＮＡの身体細胞への送達を促進するために、ｍＲＮＡは脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内にカプセル化される。身体の細胞に送達されて取り込まれると、ｍＲＮＡはサイトゾルで翻訳され、宿主細胞機構によってタンパク質抗原が生成される。タンパク質抗原が提示され、適応的な液性及び細胞性免疫応答が引き起こされる。中和抗体は発現されたタンパク質抗原に対するものであるため、タンパク質抗原はワクチン開発に関連する標的抗原と考えられる。本明細書では、「抗原」という用語の使用は、別段述べない限り、免疫原性タンパク質及び免疫原性断片（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、ならびに任意選択的に、ジフテリア及び／または破傷風に対する免疫応答を誘導する（または誘導することが可能である）免疫原性断片）を包含する。「タンパク質」という用語がペプチドを包含し、「抗原」という用語が抗原フラグメントを包含することを理解されたい。
多くのタンパク質は、オリゴマー分子に会合する複数のポリペプチドまたはいくつかのポリペプチド鎖からなる四次構造または三次元構造を有する。本明細書で使用される場合、「サブユニット」という用語は、単一のタンパク質分子、例えば、発生期のタンパク質分子のプロセシングから生じるポリペプチドまたはポリペプチド鎖を指し、このサブユニットは、他のタンパク質分子（例えば、サブユニットまたは鎖）とアセンブル（または「同時アセンブル」して）タンパク質複合体を形成する。タンパク質は、比較的少数のサブユニットを有し得るので、「オリゴマー」として説明され得るか、または多数のサブユニットからなり、したがって「マルチマー」として記述され得る。オリゴマーまたはマルチマータンパク質のサブユニットは、同一、相同、または完全に異なって、異なるタスク専用である場合もある。
タンパク質またはタンパク質サブユニットは、更にドメインを含み得る。本明細書で使用される場合、「ドメイン」という用語は、タンパク質内の別個の機能及び／または構造単位を指す。通常、「ドメイン」とは特定の機能または相互作用に関与し、タンパク質の全体的な役割に寄与する。ドメインは、様々な生物学的状況で存在し得る。類似のドメイン（すなわち、構造的、機能的及び／または配列相同性を共有するドメイン）は、単一のタンパク質内に存在し得、または類似もしくは異なる機能を有する別個のタンパク質内に存在し得る。タンパク質ドメインは、多くの場合、所定のタンパク質の三次構造または配列の保存された部分であり、残りのタンパク質またはそのサブユニットとは独立して機能し、存在し得る。
本明細書で使用される場合、抗原という用語は、抗原の下部構造、例えば、抗原結合部位によって認識され得るが免疫応答を誘導するには不十分である、７～１０アミノ酸などのポリペプチドまたは炭水化物構造である「エピトープ」という用語とは異なる。当該技術分野は、単離された形態で対象または免疫細胞に送達されるタンパク質抗原、例えば、単離されたタンパク質、ポリペプチドまたはペプチド抗原を記載しているが、タンパク質抗原の設計、試験、検証、及び産生は、特にタンパク質を大規模に生産する場合、費用及び時間がかかる場合がある。対照的に、ｍＲＮＡテクノロジーは、様々な抗原をコードするｍＲＮＡ構築物の迅速な設計及び試験に適している。更に、適切な送達ビヒクル（例えば、脂質ナノ粒子）での製剤と組み合わせたｍＲＮＡの迅速な産生は、迅速に進行し得、大規模でｍＲＮＡワクチンを迅速に産生し得る。本発明のｍＲＮＡによってコードされる抗原が対象の細胞によって発現され、例えば、人体によって発現され、したがって、対象、例えば、人体は、「工場」として機能して、抗原を生成し、それが次に、所望の免疫応答を誘発するという事実からも潜在的な利益が生じる。
本明細書で提供される組成物は、同じまたは異なる百日咳株の２つ以上の抗原をコードするＲＮＡまたは複数のＲＮＡを含み得る。また、１つ以上の百日咳抗原及び異なる生物の１つ以上の抗原（複数可）をコードするＲＮＡを含む併用ワクチンが、本明細書で提供される。したがって、本開示のワクチンは、同じ株／種の１つ以上の抗原、または異なる株／種の１つ以上の抗原、例えば、百日咳感染のリスクが高い同じ地理的領域で見出される生物に対する免疫を誘導する抗原、またはＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓに曝露すると、個体が曝露する可能性が高い生物を標的とする併用ワクチンであり得る。
コードされた百日咳、ジフテリア、及び破傷風抗原
本明細書で提供される組成物は、以下に記載されるように、少なくとも１つの百日咳、ジフテリア、または破傷風抗原をコードするｍＲＮＡを含む。ｍＲＮＡによってコードされる各抗原は、例えば、変異を伴って化学的に解毒される。
百日咳毒素は、５つのサブユニットを含む。Ａサブユニット（Ｓ１）は、毒素である。Ｇタンパク質に結合して不活性化し、サイトカインシグナル伝達を抑制する。Ｂ五量体（Ｓ２～Ｓ５）は、宿主の膜受容体に結合する。本明細書に記載されるように、いくつかの実施形態では、ワクチンは、可溶性Ｓ１をコードするｍＲＮＡを含む（例えば、Ｓ１サブユニットは、Ｂ五量体に挿入するそのＣ末端ヘリックスを除去することによって可溶化される）。いくつかの実施形態では、可溶性Ｓ１は、少なくとも１つの変異（例えば、９Ｋ＿１２９Ｇ）を伴って解毒される。
百日咳のオートトランスポーター抗原としては、パータクチン、ＳｐｈＢ１、ＴｃｆＡ、ＢｒｋＡ、及びＶａｇ８が挙げられる。各抗原は、Ｎ末端パッセンジャードメイン及びＣ末端ベータバレルエクスポーター（チャネル）ドメインを含む。多くのパッセンジャードメインは、保存されたプロテアーゼ部位を有する表面で切断される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のワクチンは、少なくとも１つのオートトランスポーター抗原（例えば、パータクチン、ＳｐｈＢ１、ＴｃｆＡ、ＢｒｋＡ、及びＶａｇ８）をコードするｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、オートトランスポーター抗原は、プロテアーゼ切断部位（例えば、アスパラギン残基とアラニン残基との間）で切断される。
繊維状赤血球凝集素接着剤（ＦＨＡ）は、気道の宿主線毛上皮（例えば、呼吸上皮）への接着のための優位な付着因子として機能する、大型の繊維状タンパク質である。タンパク質は、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓの毒性因子であり、バイオフィルム形成と関連している。タンパク質は、ヘパリン結合ドメイン（ＨＥＰ）、炭水化物結合ドメイン（ＦｒａｇＡ）、及びＭａｌ８５短断片を含む、上皮細胞表面上の異なる細胞受容体に結合することができる少なくとも３つの結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＦＨＡ抗原は、ＦＨＡ切断タンパク質を含み、ＦＨＡ１＿ＨＥＰ４３０－８７３、ＦＨＡ２＿ＦｒａｇＡ１１４１－１２７３、ＦＨＡ３＿ＭＡＬ８５１６５５－２１１１、及びＦＨＡ４＿Ｌｏｎｇ４３０－１２７９からなる群から選択される。ＦＨＡ４＿Ｌｏｎｇ４３０－１２７９構築物は、ヘパリン及び炭水化物結合ドメインの両方を含む。
いくつかの実施形態では、組成物は、アデニル酸シクラーゼ毒素構築物をコードするｍＲＮＡを含む。アデニル酸シクラーゼ毒素は、アデニル酸シクラーゼドメイン、疎水性ドメイン、及びカルシウム結合反復の３つのドメインを含む１７０６アミノ酸残基長タンパク質である。毒素は、Ｉ型分泌系によって分泌され、細胞外の細胞質から直接毒素が分泌されることを可能にする。毒素のほとんどは、細胞内でＦＨＡと関連しているが、不活性である。凝集はまた、毒素を不活性化し、その迅速な不活性化は、分泌細菌と標的細胞との間の密接な接触の必要性を強調する。アデニル化シクラーゼ毒素は、補体受容体３（ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８、またはＭａｃ－１）によって、標的細胞、典型的には食細胞（例えば、好中球）に結合する。次いで、毒素のヘモリシン部分は、標的膜に結合し、それ自体を二層に挿入し、アデニル酸シクラーゼ（ＡＣ）ドメインの細胞質の細胞質膜へのトランスロケーションをもたらす。次いで、ＡＣドメインは、カルモジュリンに結合し、ＡＴＰからのｃＡＭＰの無秩序な産生を触媒する。ｃＡＭＰの過剰産生は、食細胞の殺菌機能を含む多くの細胞プロセスに影響を及ぼす。リピートイントキシン（ＲＴＸ）もファミリーの一部であり、アスパラギン酸及びグリシンリッチノナペプチドを繰り返すことを含む。ＲＴＸタンパク質は、細胞膜に孔を形成する。いくつかの実施形態では、組成物（例えば、ワクチン）は、ＡＣＴ１８８ＬＱ、ＡＣＴＨ６３Ａ＿Ｋ６５Ａ＿Ｓ６６Ｇ、及びＲＴＸ１００６－１６００からなる群から選択される少なくとも１つのアデニル酸シクラーゼ毒素（ＡＣＴ）構築物をコードするｍＲＮＡを含む。ＡＣＴの触媒ドメインは、例えば、ＬＱ１８８挿入、またはアラニンもしくはグリシンのいずれかへの各触媒残基（Ｈ６３Ａ／Ｋ６５Ａ／Ｓ６６Ｇ）の変異によって解毒され得る。
いくつかの実施形態では、組成物（例えば、ワクチン）は、少なくとも１つの線毛（ＦＩＭ）抗原をコードするｍＲＮＡを含む。ＦＩＭタンパク質は、何千ものピリンサブユニットを含む、長くて薄い、毛髪のようなポリマーである。ＦＩＭバイオジェネシスは、サブユニットを転位させるための外膜Ｂ－バレルアシャータンパク質、オリゴ糖に結合するポリマーの末端にある先端接着タンパク質、及び組み立てられるまで線毛サブユニットを安定化させるための周質シャペロンタンパク質を含む細菌タンパク質の系を必要とする。Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓの主なピリンは、Ｆｉｍ２及びＦｉｍ３であり、感染時に呼吸上皮細胞に付着する。いくつかの実施形態では、組成物（例えば、ワクチン）は、線毛ドメインスワップ構築物などの少なくとも１つのＦＩＭタンパク質をコードするｍＲＮＡを含む。例としては、ＦｉｍＤ＿Ｆｉｍ２及びＦｉｍ２＿Ｆｉｍ２＿Ｆｉｍ２が挙げられる。
いくつかの実施形態では、組成物（例えば、ワクチン）は、少なくとも１つのジフテリア抗原（例えば、ジフテリア毒素）をコードするｍＲＮＡを含む。ジフテリアは、細菌Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅによって引き起こされる感染症であり、咽頭痛及び発熱を引き起こすが、喉に灰色または白色の斑点を形成し、気道を遮断し、犬吠咳を引き起こす可能性がある。重症の場合、ジフテリアは、致命的である。ジフテリア毒素は、ジスルフィド結合によって連結された２つのペプチド鎖、断片Ａ及び断片Ｂを含む、単一の６０ｋＤａ分子量タンパク質である。断片Ｂは、宿主細胞への毒素侵入を得る認識サブユニットであり、断片Ａは、伸長因子ＥＦ－２のＡＤＰ－リボシル化を触媒することによって、罹患した細胞における新しいタンパク質の合成を阻害する。
いくつかの実施形態では、組成物（例えば、ワクチン）は、少なくとも１つの破傷風抗原（例えば、破傷風毒素）をコードするｍＲＮＡを含む。破傷風は、致命的であり得る筋肉痙攣を特徴とする細菌感染症である。破傷風は、細菌Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉによる感染によって引き起こされる。破傷風毒素であるテタノスパスミンは、重鎖及び軽鎖を含む。３つのドメインがあり、その各々が毒素の病態生理学に寄与する。重鎖は、ドメインのうちの２つを含み、重鎖のＮ末端側は、膜トランスロケーションを助け、Ｃ末端側は、毒素が正しいニューロン上の特定の受容体部位を見つけるのを助ける。軽鎖ドメインは、小シナプス小胞（ＳＳＶ）の膜融合に必要な小胞関連膜タンパク質（ＶＡＭＰ）を切断する。ＳＳＶは、放出のために神経伝達物質を膜に運び、このプロセスの阻害は、神経伝達物質の放出をブロックし、特徴的な痙攣をもたらす。
いくつかの実施形態では、組成物（例えば、ワクチン）は、百日咳毒素抗原ポリペプチド、オートトランスポーターサブチリシン様プロテアーゼ（ＳＰＨＢ１）抗原ポリペプチド、気管コロニー形成因子Ａ（ＴＣＦＡ）抗原ポリペプチド、繊維状赤血球凝集素（ＦＨＡ）抗原ポリペプチド、パータクチン（ＰＲＮ）抗原ポリペプチド、線毛（ＦＩＭ）抗原ポリペプチド、アデニル酸シクラーゼ抗原ポリペプチド、及びボルデテラ菌の殺傷抵抗性（Ｂｒｋ）抗原ポリペプチドからなる群から選択される第１の百日咳菌抗原ポリペプチドをコードする第１のｍＲＮＡを含む。
いくつかの実施形態では、組成物（例えば、ワクチン）は、百日咳毒素抗原ポリペプチド、オートトランスポーターサブチリシン様プロテアーゼ（ＳＰＨＢ１）抗原ポリペプチド、気管コロニー形成因子Ａ（ＴＣＦＡ）抗原ポリペプチド、繊維状赤血球凝集素（ＦＨＡ）抗原ポリペプチド、パータクチン（ＰＲＮ）抗原ポリペプチド、線毛（ＦＩＭ）抗原ポリペプチド、アデニル酸シクラーゼ抗原ポリペプチド、及びボルデテラ菌の殺傷抵抗性（Ｂｒｋ）抗原ポリペプチドからなる群から選択される第２の百日咳菌抗原ポリペプチドをコードする第２のｍＲＮＡを更に含む。
いくつかの実施形態では、組成物（例えば、ワクチン）は、百日咳毒素抗原ポリペプチド、オートトランスポーターサブチリシン様プロテアーゼ（ＳＰＨＢ１）抗原ポリペプチド、気管コロニー形成因子Ａ（ＴＣＦＡ）抗原ポリペプチド、繊維状赤血球凝集素（ＦＨＡ）抗原ポリペプチド、パータクチン（ＰＲＮ）抗原ポリペプチド、線毛（ＦＩＭ）抗原ポリペプチド、アデニル酸シクラーゼ抗原ポリペプチド、及びボルデテラ菌の殺傷抵抗性（Ｂｒｋ）抗原ポリペプチドからなる群から選択される第３の百日咳菌抗原ポリペプチドをコードする第３のｍＲＮＡを更に含む。
いくつかの実施形態では、組成物（例えば、ワクチン）は、百日咳毒素抗原ポリペプチド、オートトランスポーターサブチリシン様プロテアーゼ（ＳＰＨＢ１）抗原ポリペプチド、気管コロニー形成因子Ａ（ＴＣＦＡ）抗原ポリペプチド、繊維状赤血球凝集素（ＦＨＡ）抗原ポリペプチド、パータクチン（ＰＲＮ）抗原ポリペプチド、線毛（ＦＩＭ）抗原ポリペプチド、アデニル酸シクラーゼ抗原ポリペプチド、及びボルデテラ菌の殺傷抵抗性（Ｂｒｋ）抗原ポリペプチドからなる群から選択される第４の百日咳菌抗原ポリペプチドをコードする第４のｍＲＮＡを更に含む。
いくつかの実施形態では、組成物（例えば、ワクチン）は、百日咳毒素抗原ポリペプチド、オートトランスポーターサブチリシン様プロテアーゼ（ＳＰＨＢ１）抗原ポリペプチド、気管コロニー形成因子Ａ（ＴＣＦＡ）抗原ポリペプチド、繊維状赤血球凝集素（ＦＨＡ）抗原ポリペプチド、パータクチン（ＰＲＮ）抗原ポリペプチド、線毛（ＦＩＭ）抗原ポリペプチド、アデニル酸シクラーゼ抗原ポリペプチド、及びボルデテラ菌の殺傷抵抗性（Ｂｒｋ）抗原ポリペプチドからなる群から選択される第５の百日咳菌抗原ポリペプチドをコードする第５のｍＲＮＡを更に含む。
いくつかの実施形態では、組成物（例えば、ワクチン）は、百日咳毒素抗原ポリペプチド、オートトランスポーターサブチリシン様プロテアーゼ（ＳＰＨＢ１）抗原ポリペプチド、気管コロニー形成因子Ａ（ＴＣＦＡ）抗原ポリペプチド、繊維状赤血球凝集素（ＦＨＡ）抗原ポリペプチド、パータクチン（ＰＲＮ）抗原ポリペプチド、線毛（ＦＩＭ）抗原ポリペプチド、アデニル酸シクラーゼ抗原ポリペプチド、及びボルデテラ菌の殺傷抵抗性（Ｂｒｋ）抗原ポリペプチドからなる群から選択される第６の百日咳菌抗原ポリペプチドをコードする第６のｍＲＮＡを更に含む。
いくつかの実施形態では、組成物（例えば、ワクチン）は、百日咳毒素抗原ポリペプチド、オートトランスポーターサブチリシン様プロテアーゼ（ＳＰＨＢ１）抗原ポリペプチド、気管コロニー形成因子Ａ（ＴＣＦＡ）抗原ポリペプチド、繊維状赤血球凝集素（ＦＨＡ）抗原ポリペプチド、パータクチン（ＰＲＮ）抗原ポリペプチド、線毛（ＦＩＭ）抗原ポリペプチド、アデニル酸シクラーゼ抗原ポリペプチド、及びボルデテラ菌の殺傷抵抗性（Ｂｒｋ）抗原ポリペプチドからなる群から選択される第７の百日咳菌抗原ポリペプチドをコードする第７のｍＲＮＡを含む。
いくつかの実施形態では、組成物（例えば、ワクチン）は、百日咳毒素抗原ポリペプチド、オートトランスポーターサブチリシン様プロテアーゼ（ＳＰＨＢ１）抗原ポリペプチド、気管コロニー形成因子Ａ（ＴＣＦＡ）抗原ポリペプチド、繊維状赤血球凝集素（ＦＨＡ）抗原ポリペプチド、パータクチン（ＰＲＮ）抗原ポリペプチド、線毛（ＦＩＭ）抗原ポリペプチド、アデニル酸シクラーゼ抗原ポリペプチド、及びボルデテラ菌の殺傷抵抗性（Ｂｒｋ）抗原ポリペプチドからなる群から選択される第８の百日咳菌抗原ポリペプチドをコードする第８のｍＲＮＡを含む。
いくつかの実施形態では、組成物（例えば、ワクチン）は、百日咳毒素抗原ポリペプチド、オートトランスポーターサブチリシン様プロテアーゼ（ＳＰＨＢ１）抗原ポリペプチド、気管コロニー形成因子Ａ（ＴＣＦＡ）抗原ポリペプチド、繊維状赤血球凝集素（ＦＨＡ）抗原ポリペプチド、パータクチン（ＰＲＮ）抗原ポリペプチド、線毛（ＦＩＭ）抗原ポリペプチド、アデニル酸シクラーゼ抗原ポリペプチド、及びボルデテラ菌の殺傷抵抗性（Ｂｒｋ）抗原ポリペプチドからなる群から選択される各百日咳抗原ポリペプチドの少なくとも１つをコードする少なくとも１つのＯＲＦを有する、少なくとも１つのｍＲＮＡポリヌクレオチド（例えば、１、２、３、４、５、６、７、または８つのｍＲＮＡポリヌクレオチド）を含む。
いくつかの実施形態では、組成物（例えば、ワクチン）は、ジフテリア抗原ポリペプチドをコードする少なくとも１つのＯＲＦを有する少なくとも１つのｍＲＮＡポリヌクレオチドを更に含む。いくつかの実施形態では、組成物（例えば、ワクチン）は、破傷風抗原ポリペプチドをコードする少なくとも１つのＯＲＦを有する少なくとも１つのｍＲＮＡポリヌクレオチドを更に含む。いくつかの実施形態では、組成物（例えば、ワクチン）は、ジフテリア抗原ポリペプチドをコードする少なくとも１つのＯＲＦを有する少なくとも１つのｍＲＮＡポリヌクレオチド及び破傷風抗原ポリペプチドをコードする少なくとも１つのＯＲＦを有する少なくとも１つのｍＲＮＡポリヌクレオチドを更に含む。
いくつかの実施形態では、組成物（例えば、ワクチン）は、ジフテリア抗原ポリペプチドをコードする少なくとも１つのＯＲＦを有する少なくとも１つのｍＲＮＡポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、組成物（例えば、ワクチン）は、破傷風抗原ポリペプチドをコードする少なくとも１つのＯＲＦを有する少なくとも１つのｍＲＮＡポリヌクレオチドを含む。
本発明の各実施形態または態様では、特徴とされるワクチンは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内にカプセル化されたｍＲＮＡを含むことが理解される。各々の固有のｍＲＮＡを独自のＬＮＰにカプセル化することは可能であるが、ｍＲＮＡワクチン技術では、単一のＬＮＰ生成物に複数のｍＲＮＡをカプセル化できるという大きな技術的利点を享受する。他の実施形態では、ワクチンは、同時製剤化されていないが、投与前に別々に混合されても、または単に別々に投与され得る、別々のワクチンである。
本開示のｍＲＮＡによってコードされる百日咳、ジフテリア、及び破傷風抗原の例示的な配列を、表１に提供する。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号５、８、１１、１４、１７、２０、２３、２６、２９、３２、３５、３８、４１、４４、４７、５０、及び５３から選択される配列に対して８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または同一であるポリペプチドをコードする。
核酸
本開示の組成物は、百日咳抗原、ジフテリア抗原、または破傷風抗原をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有する（少なくとも１つの）メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは更に、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、ポリ（Ａ）テール、及び／または５’キャップアナログを含む。
また、本開示の組成物（例えば、ワクチン）は、任意の５つの非翻訳領域（ＵＴＲ）及び／または任意の３つのＵＴＲを含み得ることが理解されるべきである。例示的なＵＴＲ配列としては、配列番号１１～１４が挙げられるが、しかしながら、他のＵＴＲ配列は、本明細書に記載のＵＴＲ配列のうちのいずれかとして使用または交換され得る。いくつかの実施形態では、本開示の５’ＵＴＲは、配列番号９９（ＧＧＧＡＡＡＵＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ）及び配列番号２（ＧＧＧＡＡＡＵＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＣＣＣＣＧＧＣＧＣＣＧＣＣＡＣＣ）から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示の３’ＵＴＲは、配列番号１００（ＵＧＡＵＡＡＵＡＧＧＣＵＧＧＡＧＣＣＵＣＧＧＵＧＧＣＣＡＵＧＣＵＵＣＵＵＧＣＣＣＣＵＵＧＧＧＣＣＵＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＵＣＣＵＣＣＣＣＵＵＣＣＵＧＣＡＣＣＣＧＵＡＣＣＣＣＣＧＵＧＧＵＣＵＵＵＧＡＡＵＡＡＡＧＵＣＵＧＡＧＵＧＧＧＣＧＧＣ）及び配列番号４（ＵＧＡＵＡＡＵＡＧＧＣＵＧＧＡＧＣＣＵＣＧＧＵＧＧＣＣＵＡＧＣＵＵＣＵＵＧＣＣＣＣＵＵＧＧＧＣＣＵＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＵＣＣＵＣＣＣＣＵＵＣＣＵＧＣＡＣＣＣＧＵＡＣＣＣＣＣＧＵＧＧＵＣＵＵＵＧＡＡＵＡＡＡＧＵＣＵＧＡＧＵＧＧＧＣＧＧＣ）から選択される配列を含む。また、ＵＴＲは、本明細書で提供するＲＮＡポリヌクレオチドから省略され得る。
核酸は、ヌクレオチド（ヌクレオチド単量体）のポリマーを含む。したがって、核酸はポリヌクレオチドとも称される。核酸は、例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡであって、例としては、β－Ｄ－リボ構成を有するＬＮＡ、α－Ｌ－リボ構成を有するα－ＬＮＡ（ＬＮＡのジアステレオマー）、２’－アミノ官能化を有する２’－アミノ－ＬＮＡ、及び２’－アミノ官能化を有する２’－アミノ－α－ＬＮＡ）、エチレン核酸（ＥＮＡ）、シクロヘキセニル核酸（ＣｅＮＡ）、及び／またはこれらのキメラ及び／または組み合わせであり得るか、またはこれらを含み得る。
「メッセンジャーＲＮＡ」（ｍＲＮＡ）は、（少なくとも１つの）タンパク質（天然に存在するか、天然に存在しないか、またはアミノ酸の修飾ポリマー）をコードする任意のＲＮＡを指し、これは、翻訳されて、インビトロで、インビボで、インサイチュで、またはエクスビボでコードされたポリペプチドを産生し得る。別段の記載がある場合を除き、本出願に記載の核酸配列が代表的なＤＮＡ配列内で「Ｔ」を列挙し得るが、配列が、ｍＲＮＡに相当する場合、「Ｔ」が「Ｕ」で置き換えられることを、当業者であれば理解しよう。したがって、本明細書で開示され、特定の配列識別番号によって特定される任意のＤＮＡは、そのＤＮＡに相補的な対応するｍＲＮＡ配列も開示しており、その場合、ＤＮＡ配列の各「Ｔ」は「Ｕ」に置き換えられる。
オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）とは、開始コドン（例えば、メチオニン（ＡＴＧまたはＡＵＧ））で始まり、終止コドン（例えば、ＴＡＡ、ＴＡＧ、もしくはＴＧＡ、またはＵＡＡ、ＵＡＧ、もしくはＵＧＡ）で終わるＤＮＡまたはＲＮＡの連続的なストレッチである。ＯＲＦは、典型的にはタンパク質をコードする。本明細書に開示の配列は、追加のエレメント、例えば、５’及び３’ＵＴＲを更に含み得るが、それらのエレメントは、ＯＲＦとは異なり、本開示のＲＮＡポリヌクレオチドに必ずしも存在する必要はないことが理解されるであろう。
本開示の百日咳、ジフテリア、及び破傷風抗原をコードするｍＲＮＡの例示的な配列を、表１に提供する。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号３、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８、３１、３４、３７、４０、４３、４６、４９、及び５２から選択される配列に対して８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または同一であるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号１、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３、３６、３９、４２、４５、４８、及び５１から選択される配列に対して８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または同一であるヌクレオチド配列を含む。
バリアント
いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、少なくとも１つの百日咳抗原バリアント、ジフテリア抗原バリアント、または破傷風抗原バリアントをコードするＲＮＡを含む。抗原バリアントまたは他のポリペプチドバリアントは、野生型、ネイティブ、または参照配列とはアミノ酸配列が異なる分子を指す。抗原／ポリペプチドバリアントは、ネイティブ配列または参照配列と比較して、アミノ酸配列内の特定の位置に置換、欠失、及び／または挿入を有し得る。通常、バリアントは、野生型、ネイティブ、または参照配列に対し少なくとも５０％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、バリアントは、野生型、ネイティブ、または参照配列と少なくとも８０％または少なくとも９０％の同一性を共有する。
本開示の核酸によってコードされる変異型抗原／ポリペプチドは、多数の望ましい特性、例えば、その免疫原性を強化する、その発現を強化する、及び／または対象におけるその安定性もしくはＰＫ／ＰＤ特性を改善する特性のうちのいずれかを付与するアミノ酸変化を含み得る。バリアント抗原／ポリペプチドは、通例の変異誘発技法を用いて作製し、適宜アッセイして、所望の特性を有するかどうかを評価することができる。発現レベル及び免疫原性を決定するアッセイは、当該技術分野で周知である。同様に、タンパク質バリアントのＰＫ／ＰＤ特性は、当該技術分野で認識されている技法を使用して、例えば、ワクチン接種した対象における抗原の発現を経時的に評価することによって、及び／または誘導された免疫応答の持続性を確認することによって測定することができる。バリアント核酸によってコードされるタンパク質（複数可）の安定性は、熱安定性もしくは尿素変性時の安定性を分析することによって測定することができ、またはｉｎ ｓｉｌｉｃｏ予測を用いて測定することができる。そのような実験及びｉｎ ｓｉｌｉｃｏ評価のための方法は、当該技術分野で既知である。
いくつかの実施形態では、組成物は、本明細書で提供する配列のいずれか１つのヌクレオチド配列を含むＲＮＡもしくはＲＮＡ ＯＲＦを含むか、または本明細書で提供される配列のいずれか１つのヌクレオチド配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列を含む。
「同一性」という用語は、配列を比較することによって決定した、２つ以上のポリペプチド（例えば、抗原）またはポリヌクレオチド（核酸）の配列間の関係を指す。同一性とはまた、配列間または配列同士の配列関連性の程度も指し、２つ以上のアミノ酸残基または核酸残基の鎖間の一致数によって決定される。同一性とは、特定の数学的モデルまたはコンピュータプログラム（例えば、「アルゴリズム」）によって対処される、ギャップアラインメント（もしあれば）を有する２つ以上の配列の小さい方の間の完全な一致の割合を測定する。関連する抗原または核酸の同一性は、公知の方法によって容易に計算され得る。ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列に適用される「同一性パーセント（％）」とは、当該配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入して最大の同一性パーセントを達成した後の第二の配列のアミノ酸配列または核酸配列における残基と同一の、アミノ酸または核酸の候補配列における残基（アミノ酸残基または核酸残基）のパーセンテージと定義される。整列のための方法及びコンピュータプログラムは、当該技術分野で周知である。同一性は、同一性パーセントの計算に依存するが、計算に導入されたギャップ及びペナルティにより価値が異なる場合があることが理解される。概して、特定のポリヌクレオチドまたはポリペプチド（例えば、抗原）のバリアントは、本明細書に記載され、当業者に既知である配列アライメントプログラム及びパラメータによって決定して、特定の参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチドのものに対し少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％であるが、１００％未満の配列同一性を有する。そのようなアライメント用ツールには、ＢＬＡＳＴスイートのツールが含まれる（Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｆ．Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ（１９９７），“Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ ａｎｄ ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ：ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒａｍｓ”，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２）。別のよく知られたローカルアラインメント技術は、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ（Ｓｍｉｔｈ，Ｔ．Ｆ．＆Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ｍ．Ｓ．（１９８１）“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｍｍｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５－１９７を参照されたい）。動的計画法に基づく一般的なグローバルアラインメント技術は、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ．＆Ｗｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．（１９７０）“Ａ ｇｅｎｅｒａｌ ｍｅｔｈｏｄ ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ ｔｏ ｔｈｅ ｓｅａｒｃｈ ｆｏｒ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｗｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３－４５３）である。より最近では、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを含む他の最適なグローバルアラインメント方法よりも速くヌクレオチド及びタンパク質配列のグローバルアラインメントを生成すると言われる高速最適グローバルシーケンスアラインメントアルゴリズム（ＦＯＧＳＡＡ）が開発されている。
したがって、参照配列、特に本明細書に開示のポリペプチド（抗原）配列と比較して、置換、挿入、及び／または付加、欠失、ならびに共有結合修飾を含有するペプチドまたはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、本開示の範囲内に含まれる。例えば、配列タグまたはアミノ酸（例えば、１つ以上のリジン）をペプチド配列に（例えば、そのＮ末端またはＣ末端に）付加することができる。配列タグは、ペプチドの検出、精製または局在のために使用することができる。リジンは、ペプチドの溶解性を増大させるために、またはビオチン化を可能にするために使用され得る。代替的に、ペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列のカルボキシ及びアミノ末端領域に位置するアミノ酸残基を任意選択的に欠失させて、短縮配列をもたらし得る。ある特定のアミノ酸（例えば、Ｃ末端またはＮ末端残基）は、代替的に、配列の用途に応じて欠失され得る（例えば、溶解性である、より大きな配列の一部としてのまたは固体支持体に結合した配列の発現）。いくつかの実施形態では、シグナル配列、終止配列、膜貫通ドメイン、リンカー、多量体化ドメイン（例えば、フォールドオン領域）などのための（またはこれらをコードする）配列は、同じまたは類似の機能を達成する代替的な配列で置き換えられ得る。いくつかの実施形態では、タンパク質のコア内の空洞は、例えば、より大きなアミノ酸を導入することにより、充填して安定性を改善することができる。他の実施形態では、埋もれた水素結合ネットワークを疎水性残基により置き換えて、安定性を改善することができる。また他の実施形態では、グリコシル化部位は、除去され、適切な残基で置き換えられ得る。そのような配列は、当業者には容易に特定可能である。本明細書で提供される配列のうちのいくつかは、例えば、ｍＲＮＡワクチンの調製で使用する前に欠失され得る、配列タグまたは末端ペプチド配列を（例えば、Ｎ末端またはＣ末端に）含有することも理解されるべきである。
当業者に認識されるように、タンパク質断片、機能的タンパク質ドメイン、及び同種タンパク質もまた、目的の百日咳抗原、ジフテリア抗原、及び／または破傷風抗原の範囲内にあるとみなされる。例えば、参照タンパク質の任意のタンパク質断片（参照抗原配列より少なくとも１アミノ酸残基短いがそれ以外は同一であるポリペプチド配列を意味する）であって、免疫原性であり、百日咳、ジフテリア、または破傷風に対する防御免疫応答を付与することを条件とする、任意のタンパク質断片が、本明細書で提供される。参照タンパク質と同一であるが短縮されている変異型に加えて、いくつかの実施形態では、抗原は、本明細書で提供または言及する任意の配列に示されるように２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の変異を含む。抗原／抗原ポリペプチドの長さは、約４、６、または８アミノ酸から全長タンパク質までの範囲をとり得る。
安定化エレメント
天然真核生物ｍＲＮＡ分子は、５’－キャップ構造または３’－ポリ（Ａ）テールなどの他の構造的特徴に加えて、限定されるものではないが、その５’末端（５’ＵＴＲ）及び／または３’末端（３’ＵＴＲ）の非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む、安定化エレメントを含み得る。５’ＵＴＲと３’ＵＴＲは両方とも、典型的にはゲノムＤＮＡから転写され、未成熟ｍＲＮＡのエレメントである。成熟ｍＲＮＡに特有の構造的特徴、例えば、５’－キャップ及び３’－ポリ（Ａ）テールは、通常はｍＲＮＡのプロセシング中、転写された（未成熟）ｍＲＮＡに付加される。
いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも１つの修飾、少なくとも１つの５’末端キャップを有する少なくとも１つの抗原ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有するＲＮＡポリヌクレオチドを含み、脂質ナノ粒子内に製剤化される。ポリヌクレオチドの５’キャッピングは、以下の化学的ＲＮＡキャップ類似体を使用するインビトロ転写反応中に同時に完了して、製造業者のプロトコルに従って５’－グアノシンキャップ構造を生成することができる：３´－Ｏ－Ｍｅ－ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ［ＡＲＣＡキャップ］、Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ、Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）。修飾ＲＮＡの５’キャッピングは、ワクシニアウイルスキャッピング酵素を使用して、転写後に完了されて、「キャップ０」構造：ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇを生成し得る（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）。キャップ１構造は、ワクシニアウイルスキャッピング酵素及び２’－Ｏメチルトランスフェラーゼの両方を用いて生成して、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ－２’－Ｏ－メチルを生成され得る。キャップ２構造は、キャップ１構造から、２’－Ｏメチルトランスフェラーゼを用いて終わりから３番目の５’－ヌクレオチドを２’－Ｏ－メチル化することによって生成され得る。キャップ３構造は、キャップ２構造から、２’－Ｏメチルトランスフェラーゼを用いて終わりから４番目の５’－ヌクレオチドを２’－Ｏ－メチル化することによって生成され得る。酵素は、組換え供給源に由来し得る。
３’－ポリ（Ａ）テールは、典型的には、転写されたｍＲＮＡの３’末端に付加されるアデニンヌクレオチドの連なりである。いくつかの場合において、最長約４００のアデニンヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、３’－ポリ（Ａ）テールの長さは、個々のｍＲＮＡの安定性に関して必須のエレメントであり得る。
いくつかの実施形態では、組成物は安定化エレメントを含む。安定化エレメントは、例えば、ヒストンステムループを含み得る。３２ｋＤａのタンパク質であるステムループ結合タンパク質（ＳＬＢＰ）が特定されている。これは、核及び細胞質の両方におけるヒストンメッセージの３’末端にあるヒストンステムループと関連している。その発現レベルは細胞周期によって調節され、Ｓ期にピークに達し、このときヒストンｍＲＮＡレベルも上昇する。このタンパク質は、Ｕ７ ｓｎＲＮＰによるヒストンプレｍＲＮＡの効率的な３’末端プロセシングに必須であることが示されている。ＳＬＢＰはプロセシング後も引き続きステムループと会合し、次いで、細胞質中での成熟ヒストンｍＲＮＡからヒストンタンパク質への翻訳を促進する。ＳＬＢＰのＲＮＡ結合ドメインは、後生動物及び原生動物の全体にわたり保存されており、ヒストンのステムループとの結合は、ループの構造に依存する。最小結合部位は、ステムループに対して少なくとも３つのヌクレオチド５’及び２つのヌクレオチド３’を含む。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、コード領域、少なくとも１つのヒストンステムループ、及び任意選択的に、ポリ（Ａ）配列またはポリアデニル化シグナルを含む。ポリ（Ａ）配列またはポリアデニル化シグナルは、概して、コードされたタンパク質の発現レベルを向上すべきである。コードされるタンパク質は、いくつかの実施形態では、ヒストンタンパク質、レポータータンパク質（例えば、ルシフェラーゼ、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、β－ガラクトシダーゼ、ＥＧＦＰ）、またはマーカーもしくは選択タンパク質（例えば、アルファ－グロビン、ガラクトキナーゼ及びキサンチン：グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＧＰＴ））ではない。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、ポリ（Ａ）配列またはポリアデニル化シグナルと少なくとも１つのヒストンステムループとの組み合わせであって、いずれも本来は代替的機構に相当するが、相乗的にも作用して、個々のエレメントのいずれかで観察されるレベルを上回ってタンパク質発現を増大させる組み合わせを含む。ポリ（Ａ）と少なくとも１つのヒストンステムループとの組み合わせによる相乗効果は、エレメントの順序にも、ポリ（Ａ）配列の長さにも依存しない。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、ヒストン下流エレメント（ＨＤＥ）を含まない。「ヒストン下流エレメント（ＨＤＥ）」は、天然に存在するステムループの３’にある約１５～２０ヌクレオチドのプリンリッチなポリヌクレオチドのストレッチを含み、これはヒストンプレｍＲＮＡから成熟ヒストンｍＲＮＡへのプロセシングに関与するＵ７ ｓｎＲＮＡの結合部位に相当する。いくつかの実施形態では、この核酸は、イントロンを含まない。
ｍＲＮＡは、エンハンサー及び／またはプロモータ配列を含む場合もしくは含まない場合があり、これらは、修飾もしくは未修飾であり得るか、または活性化もしくは非活性化され得る。いくつかの実施形態では、ヒストンステムループは、概してヒストン遺伝子に由来し、短い配列からなるスペーサーによって隔てられた２つの隣接する部分的または全体的に逆相補的な配列の分子内塩基対を含み、これがこの構造のループを形成する。不対ループ領域は、典型的には、ステムループエレメントのいずれとも塩基対形成することができない。これは、多くのＲＮＡ二次構造の重要な構成要素であるので、ＲＮＡに存在する場合が多いが、一本鎖ＤＮＡにも存在し得る。ステムループ構造の安定性は、概して、長さ、ミスマッチまたはバルジの数、及び対となる領域の塩基組成に依存する。いくつかの実施形態では、ゆらぎ塩基対（非ワトソン・クリック型塩基対）が生じることがある。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのヒストンステムループ配列は、１５～４５ヌクレオチドの長さを含む。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、１つ以上のＡＵリッチの配列が除去されている。これらの配列（ＡＵＲＥＳと称されることがある）は、３’ＵＴＲに見られる不安定化配列である。ＡＵＲＥＳはＲＮＡワクチンから除去され得る。代替的に、ＡＵＲＥＳは、ＲＮＡワクチン中に残存し得る。
シグナルペプチド
いくつかの実施形態では、組成物は、抗原と融合したシグナルペプチドをコードするＯＲＦを有するｍＲＮＡを含む。シグナルペプチドは、タンパク質のＮ末端側の１５～６０アミノ酸を含み、典型的には、分泌経路上の膜を横断したトランスロケーションに必要であるので、真核生物及び原核生物の両方でほとんどのタンパク質が分泌経路に進入するのを普遍的に制御している。真核生物において、新生前駆体タンパク質（プレタンパク質）のシグナルペプチドは、リボソームを粗面小胞体（ＥＲ）膜に誘導し、プロセシングのために、成長ペプチド鎖の膜横断輸送を開始する。ＥＲプロセシングにより成熟タンパク質が生成され、シグナルペプチドは、典型的には、宿主細胞のＥＲ常駐シグナルペプチダーゼにより、前駆体タンパク質から切断されるか、または切断されないまま保たれ、膜アンカーとして機能する。シグナルペプチドはまた、タンパク質の細胞膜への標的化も促進し得る。
シグナルペプチドの長さは、１５～６０アミノ酸であり得る。例えば、シグナルペプチドの長さは、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、または６０アミノ酸であり得る。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドの長さは、２０～６０、２５～６０、３０～６０、３５～６０、４０～６０、４５～６０、５０～６０、５５～６０、１５～５５、２０～５５、２５～５５、３０～５５、３５～５５、４０～５５、４５～５５、５０～５５、１５～５０、２０～５０、２５～５０、３０～５０、３５～５０、４０～５０、４５～５０、１５～４５、２０～４５、２５～４５、３０～４５、３５～４５、４０～４５、１５～４０、２０～４０、２５～４０、３０～４０、３５～４０、１５～３５、２０～３５、２５～３５、３０～３５、１５～３０、２０～３０、２５～３０、１５～２５、２０～２５、または１５～２０アミノ酸長である。
異種遺伝子由来のシグナルペプチド（事実上百日咳、ジフテリア、及び破傷風抗原以外の遺伝子の発現を調節する）が当該技術分野で既知であり、これを所望の特性について試験し、次いで本開示の核酸に組み込むことができる。
融合タンパク質
いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、抗原性融合タンパク質をコードするｍＲＮＡを含む。したがって、コードされた抗原（複数可）は、リンカーが有無で一緒に結合された２つ以上のタンパク質（例えば、タンパク質及び／またはタンパク質フラグメント）を含み得る。代替的に、タンパク質抗原が融合されるタンパク質は、それ自体に対する強力な免疫応答を促進しないが、むしろ、百日咳抗原、ジフテリア抗原、または破傷風抗原に対する強力な免疫応答を促進する。抗原融合タンパク質は、いくつかの実施形態では、各々の起源のタンパク質由来の機能的特性を保持している。
いくつかの実施形態では、抗原融合タンパク質は、抗原ポリペプチド：百日咳毒素抗原ポリペプチド、オートトランスポーターサブチリシン様プロテアーゼ（ＳＰＨＢ１）抗原ポリペプチド、気管コロニー形成因子Ａ（ＴＣＦＡ）抗原ポリペプチド、繊維状赤血球凝集素（ＦＨＡ）抗原ポリペプチド、パータクチン（ＰＲＮ）抗原ポリペプチド、線毛（ＦＩＭ）抗原ポリペプチド、アデニル酸シクラーゼ抗原ポリペプチド、及びボルデテラ菌の殺傷抵抗性（Ｂｒｋ）抗原ポリペプチド、ジフテリア抗原ポリペプチド、及び破傷風抗原ポリペプチドのうちの２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０を含む。本開示の例示的な融合タンパク質を、表１に提供する。例えば、いくつかの実施形態では、本開示のｍＲＮＡワクチンは、配列番号５６、５９、６２、６５、６８、７１、７４、７７、８０、８３、８６、８９、９２、９５、及び９８から選択される配列に対して８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または同一であるポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、本開示のｍＲＮＡワクチンは、配列番号５５、５８、６１、６４、６７、７０、７３、７６、７９、８２、８５、８８、９１、９４、及び９７から選択される配列に対して８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または同一であるＯＲＦを含む。いくつかの実施形態では、本開示のｍＲＮＡワクチンは、配列番号５４、５７、６０、６３、６６、６９、７２、７５、７８、８１、８４、８７、９０、９３、及び９６から選択される配列に対して８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または同一であるヌクレオチド配列を含む。
リンカー及び切断可能なペプチド
いくつかの実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、本明細書では融合タンパク質と称される、２つ以上のポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、融合タンパク質の少なくとも１つまたは各ドメインの間に位置するリンカーを更にコードする。リンカーは、例えば、切断可能なリンカーまたはプロテアーゼ感受性リンカーであり得る。いくつかの実施形態では、リンカーは、Ｆ２Ａリンカー、Ｐ２Ａリンカー、Ｔ２Ａリンカー、Ｅ２Ａリンカー、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。２Ａペプチドと称される自己切断ペプチドリンカーのこのファミリーは、当該技術分野で記載されている（例えば、Ｋｉｍ，Ｊ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．（２０１１）ＰＬｏＳ ＯＮＥ ６：ｅ１８５５６を参照されたい）。いくつかの実施形態では、リンカーは、Ｆ２Ａリンカーである。
いくつかの実施形態では、リンカーは、ＧＳリンカーである。ＧＳリンカーは、グリシン及びセリンのアミノ酸リピートを含むポリペプチドリンカーである。それらは可塑性かつ親水性の残基を含み、タンパク質ドメインの折り畳み及び機能に干渉することもなく、また二次構造を形成することもなく、タンパク質サブユニットの融合を実行するために使用され得る。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、３から２０アミノ酸長であるＧＳリンカーを含む融合タンパク質をコードする。例えば、ＧＳリンカーは、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０アミノ酸の長さを有し得る（または少なくともその長さを有し得る）。いくつかの実施形態では、ＧＳリンカーは、１５アミノ酸長（例えば、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＧ（配列番号１０１））である（または少なくとも１５アミノ酸長である）。いくつかの実施形態では、ＧＳリンカーは、８アミノ酸長（例えば、ＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号１０２））である（または少なくとも８アミノ酸長である）。いくつかの実施形態では、ＧＳリンカーは、７アミノ酸長（例えば、ＧＧＧＳＧＧＧ（配列番号１０３））である（または少なくとも７アミノ酸長である）。いくつかの実施形態では、ＧＳリンカーは、４アミノ酸長（例えば、ＧＧＧＳ（配列番号１０４））である（または少なくとも４アミノ酸長である）。いくつかの実施形態では、ＧＳリンカーは、（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号１０５）を含み、ｎは、１～５の任意の整数である。いくつかの実施形態では、ＧＳリンカーは、４アミノ酸長（例えば、ＧＳＧＧ（配列番号１０６））である（または少なくとも４アミノ酸長である）。いくつかの実施形態では、ＧＳリンカーは、（ＧＳＧＧ）ｎ（配列番号１０７）を含み、ｎは、１～５の任意の整数である。
いくつかの実施形態では、リンカーは、例えば、３アミノ酸（例えば、ＧＧＧ）の長さ（または少なくとも３アミノ酸の長さ）を有するグリシンリンカーである。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡワクチンによってコードされるタンパク質は、１つを超えるリンカーを含み、これらは、互いに同じまたは異なり得る（例えば、同じＳタンパク質構築物中のＧＧＧＳＧＧＧ（配列番号１０３）及びＧＧＧＳ（配列番号１０４））。
本開示に関連して、当該技術分野で既知の切断可能なリンカーが使用され得る。そのような例示的なリンカーとしては、Ｆ２Ａリンカー、Ｔ２Ａリンカー、Ｐ２Ａリンカー、及びＥ２Ａリンカーが挙げられる（例えば、ＷＯ２０１７１２７７５０を参照されたい）。当業者は、他の当該技術分野で認識されているリンカーが、本開示の構築物（例えば、本開示の核酸によってコードされる）での使用に好適である場合があることを理解するであろう。当業者は同様に、他のポリシストロン性構築物（同じ分子内で１つを超える抗原／ポリペプチドを別々にコードするｍＲＮＡ）が、本明細書に提供される使用に好適である場合があることを理解するであろう。
配列最適化
いくつかの実施形態では、本開示の抗原をコードするＯＲＦは、コドン最適化される。コドン最適化方法は、当該技術分野で既知である。例えば、本明細書で提供される配列のうちのいずれか１つ以上のＯＲＦが、コドン最適化され得る。コドン最適化は、いくつかの実施形態では、標的生物及び宿主生物におけるコドン頻度を一致させて、適切な折り畳みを確実にするために；ＧＣ含量をバイアスして、ｍＲＮＡ安定性を増加させるか、または二次構造を低減するために；遺伝子の構築または発現を損なう可能性のあるタンデムリピートコドンまたはベースランを最小化するために；転写及び翻訳制御領域をカスタマイズするために；タンパク質トラフィッキング配列を挿入または除去するために；コードされたタンパク質（例えばグリコシル化部位）中の翻訳後修飾部位を除去／付加するために；タンパク質ドメインの追加、除去またはシャッフルのために；制限サイトを挿入または削除するために；リボソーム結合部位及びｍＲＮＡ分解部位を修飾するために；タンパク質の様々なドメインが適切に折り畳まれることを可能にするように翻訳速度を調節するために；またはポリヌクレオチド内の問題の二次構造を低減もしくは排除するために使用され得る。コドン最適化ツール、アルゴリズム、及びサービスは、当該技術分野で知られており、非限定的な例としては、ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ ＣＡ）からのサービス及び／または専有の方法が挙げられる。いくつかの実施形態では、このオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）配列は、最適化アルゴリズムを用いて最適化される。
いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、天然または野生型の配列ＯＲＦ（例えば、百日咳抗原、ジフテリア抗原、または破傷風抗原をコードする天然または野生型のｍＲＮＡ配列）に対し９５％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、天然または野生型の配列（例えば、百日咳抗原、ジフテリア抗原、または破傷風抗原をコードする天然または野生型のｍＲＮＡ配列）に対して９０％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、天然または野生型の配列（例えば、百日咳抗原、ジフテリア抗原、または破傷風抗原をコードする天然または野生型のｍＲＮＡ配列）に対して８５％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、天然または野生型の配列（例えば、百日咳抗原、ジフテリア抗原、または破傷風抗原をコードする天然または野生型のｍＲＮＡ配列）に対して８０％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、天然または野生型の配列（例えば、百日咳抗原、ジフテリア抗原、または破傷風抗原をコードする天然または野生型のｍＲＮＡ配列）に対して７５％未満の配列同一性を共有する。
いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、天然または野生型の配列（例えば、百日咳抗原、ジフテリア抗原、または破傷風抗原をコードする天然または野生型のｍＲＮＡ配列）に対して６５％～８５％（例えば、約６７％～約８５％または約６７％～約８０％）の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、天然または野生型の配列（例えば、百日咳抗原、ジフテリア抗原、または破傷風抗原をコードする天然または野生型のｍＲＮＡ配列）に対して６５％～７５％または約８０％の配列同一性を共有する。
いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、非コドン最適化配列によってコードされる百日咳抗原、ジフテリア抗原、または破傷風抗原と免疫原性が同じか、またはそれよりも免疫原性が高い（例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも１００％、または少なくとも２００％以上高い）抗原をコードする。
修飾ｍＲＮＡは、哺乳動物宿主細胞にトランスフェクションされた場合、１２～１８時間、または１８時間超、例えば、２４、３６、４８、６０、７２時間、または７２時間超の安定性を有し、哺乳類宿主細胞による発現が可能である。
いくつかの実施形態では、コドン最適化ＲＮＡは、Ｇ／Ｃのレベルが向上されたものであり得る。核酸分子（例えば、ｍＲＮＡ）のＧ／Ｃ含量は、ＲＮＡの安定性に影響を及ぼし得る。グアニン（Ｇ）及び／またはシトシン（Ｃ）残基の量が増加したＲＮＡは、大量のアデニン（Ａ）及びチミン（Ｔ）またはウラシル（Ｕ）ヌクレオチドを含有するＲＮＡより機能的に安定していると考えられる。一例として、ＷＯ０２／０９８４４３は、翻訳領域内の配列修飾によって安定化されたｍＲＮＡを含む薬学的組成物を開示している。遺伝暗号の縮退のため、当該修飾は、得られるアミノ酸を変更することなくＲＮＡの安定性を更に高めるものに既存のコドンを置換することによって機能する。このアプローチは、ＲＮＡのコード領域に限定される。
化学修飾されていないヌクレオチド
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、化学的に修飾されておらず、アデノシン、グアノシン、シトシン、及びウリジンからなる標準的なリボヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本開示のヌクレオチド及びヌクレオシドは、転写ＲＮＡ内に存在するもの（例えば、Ａ、Ｇ、Ｃ、またはＵ）などの標準的なヌクレオシド残基を含む。いくつかの実施形態では、本開示のヌクレオチド及びヌクレオシドは、ＤＮＡ内に存在するもの（例えば、ｄＡ、ｄＧ、ｄＣ、またはｄＴ）などの標準的なデオキシリボヌクレオシドを含む。
化学修飾
本開示の組成物は、いくつかの実施形態では、百日咳抗原、ジフテリア抗原、または破傷風抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するＲＮＡを含み、核酸が、標準（非修飾）であり得るか、または当該技術分野で既知であるように修飾され得るヌクレオチド及び／またはヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、本開示のヌクレオチド及びヌクレオシドは、修飾ヌクレオチドまたはヌクレオシドを含む。このような修飾ヌクレオチド及びヌクレオシドは、天然に存在する修飾ヌクレオチド及びヌクレオシド、または天然には存在しないヌクレオチド及びヌクレオシドであり得る。このような修飾は、当該技術分野で認識されているヌクレオチド及び／またはヌクレオシドの糖、骨格、または核酸塩基部分での修飾が含まれ得る。
いくつかの実施形態では、本開示の天然に存在する修飾ヌクレオチドまたはヌクレオチドは、概して知られているか、または当該技術分野で認識されているものである。そのような天然に存在する修飾ヌクレオチド及びヌクレオチドの非限定的な例は、特に、広く認識されているＭＯＤＯＭＩＣＳデータベースに見出すことができる。
いくつかの実施形態では、本開示の非天然に存在する修飾ヌクレオチドまたはヌクレオシドは、概して知られているか、または当該技術分野で認識されているものである。そのような非天然に存在する修飾ヌクレオチド及びヌクレオシドの非限定的な例は、特に、公開されている米国出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０５８５１９号、同第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７５１７７号、同第ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０５８８９７号、同第ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０５８８９１号、同第ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０７０４１３号、同第ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／３６７７３号、同第ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／３６７５９号、同第ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／３６７７１号、またはＰＣＴ／ＩＢ２０１７／０５１３６７に見出すことができ、これらの全てが参照により本明細書に組み込まれる。
したがって、本開示の核酸（例えば、ＤＮＡ核酸及びｍＲＮＡ核酸などのＲＮＡ核酸）は、標準ヌクレオチド及びヌクレオシド、天然に存在するヌクレオチド及びヌクレオシド、非天然に存在するヌクレオチド及びヌクレオシド、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。
本開示の核酸（例えば、ＤＮＡ核酸及びｍＲＮＡ核酸などのＲＮＡ核酸）は、いくつかの実施形態では、様々な（１つより多くの）異なる種類の標準及び／または修飾ヌクレオチド及びヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、核酸の特定の領域は、１つ、２つ、またはそれ以上の（任意選択的に異なる）タイプの標準的及び／または修飾ヌクレオチド及びヌクレオシドを含む。
いくつかの実施形態では、細胞または生物に導入された修飾ＲＮＡ核酸（例えば、修飾ｍＲＮＡ核酸）は、標準ヌクレオチド及びヌクレオシドを含む非修飾核酸と比較して、それぞれ、細胞または生物における分解の減少を示す。
いくつかの実施形態では、細胞または生物に導入される修飾ＲＮＡ核酸（例えば、修飾ｍＲＮＡ核酸）は、標準的なヌクレオチド及びヌクレオシドを含む非修飾核酸と比較して、それぞれ細胞または生物における低減された免疫原性（例えば、低減された生得的応答）を呈し得る。
いくつかの実施形態では、核酸（例えば、ｍＲＮＡ核酸などのＲＮＡ核酸）は、核酸の合成中または合成後に導入されて、所望の機能または特性を達成する非天然の修飾ヌクレオチドを含む。修飾は、ヌクレオチド間結合、プリンもしくはピリミジン塩基、または糖に存在し得る。修飾は、化学合成を用いて、またはポリメラーゼ酵素を用いて、鎖の末端もしくは鎖中の任意の場所に導入され得る。核酸の領域のうちのいずれのも、化学修飾され得る。
本開示は、核酸の修飾ヌクレオシド及びヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ核酸などのＲＮＡ核酸）を提供する。「ヌクレオシド」は、糖分子（例えば、ペントースもしくはリボース）またはその誘導体を、有機塩基（例えば、プリンもしくはピリミジン）またはその誘導体（本明細書では「核酸塩基」とも称される）と組み合わせて含む化合物を指す。「ヌクレオチド」とは、リン酸基を含むヌクレオシドを指す。修飾ヌクレオチドは、１つ以上の修飾または非天然ヌクレオシドを含めるため、任意の有用な方法で、例えば、化学的に、酵素的に、または組換え的に合成され得る。ポリヌクレオチドは、連結されたヌクレオシドの領域（複数可）を含み得る。かかる領域は、可変骨格結合を有し得る。この結合は、標準的なホスホジエステル結合であり得、その場合、核酸は、ヌクレオチドの領域を含むことになろう。
修飾ヌクレオチドの塩基対合は、標準的なアデノシン－チミン、アデノシン－ウラシル、またはグアノシン－シトシン塩基対だけでなく、非標準または修飾塩基を含むヌクレオチド及び／または修飾ヌクレオチド間で形成される塩基対も包含し、ここで、水素結合供与体及び水素結合受容体の配置により、例えば、少なくとも１つの化学修飾を有するそれらの核酸におけるものなど、非標準塩基及び標準塩基間、または２つの相補的非標準塩基構造間の水素結合が可能になる。かかる非標準塩基対合の一例は、修飾ヌクレオチドイノシンとアデニン、シトシンまたはウラシル間の塩基対合である。塩基／糖またはリンカーの任意の組み合わせを本開示のポリヌクレオチドに組み込むことができる。
いくつかの実施形態では、核酸中の修飾核酸塩基（例えば、ｍＲＮＡ核酸などのＲＮＡ核酸）は、１－メチル－シュードウリジン（ｍ１ψ）、１－エチル－シュードウリジン（ｅ１ψ）、５－メトキシ－ウリジン（ｍｏ５Ｕ）、５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）、及び／またはシュードウリジン（ψ）を含む。いくつかの実施形態では、核酸中の修飾核酸塩基（例えば、ｍＲＮＡ核酸などのＲＮＡ核酸）は、５－メトキシメチルウリジン、５－メチルチオウリジン、１－メトキシメチルシュードウリジン、５－メチルシチジン、及び／または５－メトキシシチジンを含む。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、前述の任意の修飾核酸塩基（限定されるものではないが、化学修飾を含む）のうちの少なくとも２つ（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上）の組み合わせを含む。
いくつかの実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、核酸の１つ以上または全てのウリジン位置に１－メチル－シュードウリジン（ｍ１ψ）置換を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、核酸の１つ以上または全てのウリジン位置に１－メチル－シュードウリジン（ｍ１ψ）置換、及び核酸の１つ以上または全てのシチジン位置に５－メチルシチジン置換を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、核酸の１つ以上または全てのウリジン位置にシュードウリジン（ψ）置換を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、核酸の１つ以上または全てのウリジン位置にシュードウリジン（ψ）置換、及び核酸の１つ以上または全てのシチジン位置に５－メチルシチジン置換を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、核酸の１つ以上または全てのウリジン位置にウリジンを含む。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、特定の修飾について一様に修飾される（例えば、完全に修飾される、配列全体にわたり修飾される）。例えば、核酸は、１－メチル－シュードウリジンで一様に修飾され得、つまり、当該ｍＲＮＡ配列の全てのウリジン残基が１－メチル－シュードウリジンで置き換えられる。同様に、核酸は、配列中に存在する任意の種類のヌクレオシド残基を、上記のものなどの修飾残基で置き換えることによって一様に修飾することができる。
本開示の核酸は、分子の全長に沿って部分的にも完全にも修飾することができる。例えば、１つ以上または全てまたは所与の種類のヌクレオチド（例えば、プリンもしくはピリミジン、またはＡ、Ｇ、Ｕ、Ｃのいずれか１つ以上もしくは全て）は、本開示の核酸、またはその所定の配列領域（例えば、ポリＡテールを含むか、または除外するｍＲＮＡ）において均一に修飾され得る。いくつかの実施形態では、本開示の核酸（またはその配列領域）中の全てのヌクレオチドＸは、修飾ヌクレオチドであり、式中、Ｘは、ヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｕ、Ｃのうちのいずれか１つ、または組み合わせＡ＋Ｇ、Ａ＋Ｕ、Ａ＋Ｃ、Ｇ＋Ｕ、Ｇ＋Ｃ、Ｕ＋Ｃ、Ａ＋Ｇ＋Ｕ、Ａ＋Ｇ＋Ｃ、Ｇ＋Ｕ＋Ｃ、もしくはＡ＋Ｇ＋Ｃのうちのいずれか１つであり得る。
核酸は、約１％～約１００％の修飾ヌクレオチド（全体のヌクレオチド含有量に関して、または１つ以上の種類のヌクレオチド、すなわちＡ、Ｇ、Ｕ、もしくはＣのうちのいずれか１つ以上に関して）あるいは任意の介在するパーセンテージ（例えば、１％～２０％、１％～２５％、１％～５０％、１％～６０％、１％～７０％、１％～８０％、１％～９０％、１％～９５％、１０％～２０％、１０％～２５％、１０％～５０％、１０％～６０％、１０％～７０％、１０％～８０％、１０％～９０％、１０％～９５％、１０％～１００％、２０％～２５％、２０％～５０％、２０％～６０％、２０％～７０％、２０％～８０％、２０％～９０％、２０％～９５％、２０％～１００％、５０％～６０％、５０％～７０％、５０％～８０％、５０％～９０％、５０％～９５％、５０％～１００％、７０％～８０％、７０％～９０％、７０％～９５％、７０％～１００％、８０％～９０％、８０％～９５％、８０％～１００％、９０％～９５％、９０％～１００％、及び９５％～１００％）を含有し得る。任意の残りのパーセンテージが、非修飾Ａ、Ｇ、Ｕ、またはＣの存在により説明されることが理解されるであろう。
ｍＲＮＡは、１％以上１００％までの修飾ヌクレオチド、または任意の範囲のパーセンテージ（例えば、少なくとも５％の修飾ヌクレオチド、少なくとも１０％の修飾ヌクレオチド、少なくとも２５％の修飾ヌクレオチド、少なくとも５０％の修飾ヌクレオチド、少なくとも８０％の修飾ヌクレオチド、もしくは少なくとも９０％の修飾ヌクレオチド）を含有し得る。例えば、核酸は、修飾ウラシルまたはシトシンなどの修飾ピリミジンを含有し得る。いくつかの実施形態では、核酸内のウラシルの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または１００％が、修飾ウラシル（例えば、５－置換ウラシル）で置き換えられる。修飾ウラシルは、単一の固有の構造を有する化合物で置き換えることができるか、または異なる構造（例えば、２つ、３つ、４つ、もしくはそれ以上の固有の構造）を有する複数の化合物で置き換えることができる。いくつかの実施形態では、核酸内のシトシンの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または１００％が、修飾シトシン（例えば、５－置換シトシン）で置き換えられる。修飾シトシンは、単一の固有の構造を有する化合物で置き換えることができるか、または異なる構造（例えば、２つ、３つ、４つ、もしくはそれ以上の固有の構造）を有する複数の化合物で置き換えることができる。
非翻訳領域（ＵＴＲ）
本開示のｍＲＮＡは、非翻訳領域として作用または機能する１つ以上の領域または部分を含み得る。ｍＲＮＡが、少なくとも１つの目的の抗原をコードするように設計される場合、核酸は、これらの非翻訳領域（ＵＴＲ）のうちの１つ以上を含み得る。核酸の野生型非翻訳領域は、転写されるが翻訳はされない。ｍＲＮＡにおいて、５’ＵＴＲは、転写開始部位で開始し、開始コドンまで続くが、開始コドンを含まない一方で、３’ＵＴＲは、終止コドンのすぐ後に始まり、転写終結シグナルまで続く。核酸分子の安定性及び翻訳の観点から、ＵＴＲによって果たされる調節的役割に関する証拠が増えている。ＵＴＲの調節機能は、特に分子の安定性を高めるために、本開示のポリヌクレオチドに組み込むことができる。また、転写産物が望ましくない臓器部位に誤って向けられた場合に備え、転写産物の下方調節の制御を確保するための特定の特徴も組み込むことができる。様々な５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲ配列が当該技術分野において知られており、利用可能である。
５’ＵＴＲとは、開始コドン（リボソームによって翻訳されるｍＲＮＡ転写産物の最初のコドン）からすぐ上流（５’）にあるｍＲＮＡの領域である。５’ＵＴＲはタンパク質をコードしない（非コードである）。天然５’ＵＴＲは、翻訳開始で役割を果たす機能を有する。これらは、Ｋｏｚａｋ配列のようなシグネチャーを保有し、この配列は、多くの遺伝子の翻訳をリボソームが開始するプロセスに関与することが一般的に公知である。コザック配列は、コンセンサスＣＣＲ（Ａ／Ｇ）ＣＣＡＵＧＧを有し、Ｒが、開始コドン（ＡＵＧ）の３塩基上流にあるプリン（アデニンまたはグアニン）であり、それに別の「Ｇ」が続く。５′ＵＴＲはまた、伸長因子結合に関与する二次構造を形成することが知られている。
本開示のいくつかの実施形態では、５’ＵＴＲは、異種ＵＴＲであり、すなわち、異なるＯＲＦに関連する自然界で見出されるＵＴＲである。別の実施形態では、５’ＵＴＲは合成ＵＴＲであり、すなわち、天然には存在しない。合成ＵＴＲとしては、例えば、遺伝子発現を増加させる、その特性を改善するために変異させたＵＴＲ、ならびに完全に合成されたものが挙げられる。例示的な５’ＵＴＲとしては、Ｘｅｎｏｐｕｓまたはヒト由来のａ－グロビンまたはｂ－グロビン（８２７８０６３、９０１２２１９）、ヒトシトクロムｂ－２４５ ａポリペプチド、及びヒドロキシステロイド（１７ｂ）デヒドロゲナーゼ、及びタバコエッチウイルス（ＵＳ８２７８０６３、９０１２２１９）が挙げられる。ＣＭＶ即時早期１（ＩＥ１）遺伝子（ＵＳ２０１４０２０６７５３、ＷＯ２０１３／１８５０６９）、配列ＧＧＧＡＵＣＣＵＡＣＣ（配列番号１０８）（ＷＯ２０１４１４４１９６）も使用され得る。別の実施形態では、ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲは、５’ＴＯＰモチーフ（オリゴピリミジントラクト）が欠如したＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲであり（例えば、ＷＯ／２０１５１０１４１４、ＷＯ２０１５１０１４１５、ＷＯ／２０１５／０６２７３８、ＷＯ２０１５０２４６６７、ＷＯ２０１５０２４６６７；リボソームタンパク質ラージ３２（Ｌ３２）遺伝子に由来する５’ＵＴＲエレメント（ＷＯ／２０１５１０１４１４、ＷＯ２０１５１０１４１５、ＷＯ／２０１５／０６２７３８）、ヒドロキシステロイド（１７－β）デヒドロゲナーゼ４遺伝子（ＨＳＤ１７Ｂ４）の５’ＵＴＲに由来する５’ＵＴＲエレメント（ＷＯ２０１５０２４６６７）、またはＡＴＰ５Ａ１の５’ＵＴＲに由来する５’ＵＴＲエレメント（ＷＯ２０１５０２４６６７）が使用され得る。いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲの代わりに内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を使用する。
いくつかの実施形態では、本開示の５’ＵＴＲは、配列番号２及び配列番号９９から選択される配列を含む。
３’ＵＴＲは、終止コドン（翻訳終了をシグナル伝達するｍＲＮＡ転写産物のコドン）のすぐ下流（３’）にあるｍＲＮＡの領域である。３’ＵＴＲはタンパク質をコードしない（非コードである）。天然または野生型の３′ＵＴＲは、一連のアデノシン及びウリジンが埋め込まれていることが知られている。これらのＡＵリッチシグネチャーは、高い回転率を有する遺伝子内で特に広く見られる。それらの配列特徴及び機能特性に基づいて、ＡＵリッチエレメント（ＡＲＥ）を３つのクラスに分離することができる（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ，１９９５）：クラスＩ ＡＲＥは、Ｕリッチ地域内のＡＵＵＵＡモチーフのいくつかの分散コピーを含有する。Ｃ－Ｍｙｃ及びＭｙｏＤは、クラスＩ ＡＲＥを含む。クラスＩＩ ＡＲＥは２つ以上の重複するＵＵＡＵＵＵＡ（Ｕ／Ａ）（Ｕ／Ａ）九量体を有する。このタイプのＡＲＥを含む分子としては、ＧＭ－ＣＳＦ及びＴＮＦ－ａが挙げられる。クラスＩＩＩのＡＲＥはそれほど十分には定義されていない。これらのＵリッチ領域は、ＡＵＵＵＡモチーフを含有しない。ｃ－Ｊｕｎ及びＭｙｏｇｅｎｉｎは、このクラスの中でも十分に研究された２つの例である。ＡＲＥに結合するほとんどのタンパク質はメッセンジャーを不安定化することが知られているが、ＥＬＡＶファミリーのメンバー、特にＨｕＲは、ｍＲＮＡの安定性を高めることが報告されている。ＨｕＲは、３つ全てのクラスのＡＲＥに結合する。ＨｕＲ特異的結合部位を核酸分子の３’ＵＴＲに組み込むと、ＨｕＲ結合が生じ、インビボでのメッセージが安定する。
３’ＵＴＲ ＡＵリッチエレメント（ＡＲＥ）の導入、除去、または修飾を使用して、本開示の核酸（例えば、ＲＮＡ）の安定性を調節することができる。特定の核酸を操作する場合、ＡＲＥの１つまたは複数のコピーを導入して、本開示の核酸の安定性を低下させ、それによって翻訳を抑制し、得られるタンパク質の産生を減少させることができる。同様に、ＡＲＥを特定し、除去または変異させて、細胞内安定性を増加させ、故に、結果として生じるタンパク質の翻訳及び産生を増加させることができる。トランスフェクション実験は、本開示の核酸を使用して、関連細胞株において実施することができ、タンパク質産生は、トランスフェクション後の様々な時点でアッセイすることができる。例えば、細胞に様々なＡＲＥエンジニアリング分子をトランスフェクトし、ＥＬＩＳＡキットを使用して関連タンパク質にトランスフェクトし、トランスフェクションの６時間後、１２時間後、２４時間後、４８時間後、及び７日後に生成されたタンパク質をアッセイすることができる。
当業者であれば、異種または合成の５’ＵＴＲが、任意の所望の３’ＵＴＲ配列とともに使用され得ることを理解するであろう。例えば、異種５’ＵＴＲを、異種３’ＵＴＲを含む合成３’ＵＴＲと、ともに使用することができる。
非ＵＴＲ配列はまた、核酸内の領域またはサブ領域として使用され得る。例えば、イントロン配列またはイントロン配列の部分は、本開示の核酸の領域に組み込まれ得る。イントロン配列の組み込みは、タンパク質産生ならびに核酸レベルを増加させ得る。
特徴の組み合わせをフランキング領域に含めることも、他の特徴の中に含めることもできる。例えば、ＯＲＦは、強力なコザック翻訳開始シグナルを含有し得る５´ＵＴＲ及び／またはポリＡテールのテンプレート化付加のためのオリゴ（ｄＴ）配列を含み得る３´ＵＴＲによって隣接され得る。５’ＵＴＲは、米国特許出願公開第２０１００２９３６２５号及びその全体が参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０６９１５５に記載の５’ＵＴＲなどの、同じ及び／または異なる遺伝子からの第１のポリヌクレオチド断片及び第２のポリヌクレオチド断片を含み得る。
任意の遺伝子からの任意のＵＴＲが、核酸の領域に組み込まれ得ることが理解されるべきである。更に、任意の既知の遺伝子の複数の野生型ＵＴＲが利用され得る。野生型領域のバリアントではない人工ＵＴＲを提供することも、本開示の範囲内である。これらのＵＴＲまたはその一部分は、それらが選択された転写物と同じ向きに配置され得るか、または向きもしくは位置が改変され得る。したがって、５’または３’ＵＴＲは、１つ以上の他の５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲで逆転、短縮、延長、作製され得る。本明細書で使用される場合、「改変された」という用語は、ＵＴＲ配列に関するものであり、ＵＴＲが参照配列に関して何らかの形で変化したことを意味する。例えば、３’ＵＴＲまたは５’ＵＴＲは、上に教示されるように、配向もしくは位置の変化によって野生型もしくは天然ＵＴＲと比較して、改変され得るか、または追加のヌクレオチドの包含、ヌクレオチドの欠失、ヌクレオチドのスワッピングもしくは転位によって改変され得る。「改変された」ＵＴＲ（３’または５’のいずれか）を産生する任意のこれらの変化はバリアントＵＴＲを含む。
いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲなどの二重、三重、または四重のＵＴＲが使用され得る。本明細書で使用する「二重」ＵＴＲとは、同じＵＴＲの２つのコピーが直列または実質的に直列にコード化されているものである。例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許公開第２０１００１２９８７７号に記載の二重ベータ－グロビン３′ＵＴＲが使用され得る。
パターン化されたＵＴＲを有することも本開示の範囲内である。本明細書で使用される「パターン化ＵＴＲ」とは、ＡＢＡＢＡＢもしくはＡＡＢＢＡＡＢＢＡＡＢＢもしくはＡＢＣＡＢＣＡＢＣまたはそのバリアントが１回、２回、または３回以上反復されるような反復パターンまたは交互パターンを反映するＵＴＲである。これらのパターンでは、各文字Ａ、Ｂ、またはＣは、ヌクレオチドレベルで異なるＵＴＲを表す。
いくつかの実施形態では、隣接領域は、そのタンパク質が共通の機能、構造、特徴、または特性を共有する、転写物のファミリーから選択される。例えば、目的のポリペプチドは、特定の細胞、組織、または発生中のある時点で発現されるタンパク質のファミリーに属している場合がある。これらの遺伝子のいずれかに由来するＵＴＲは、新しいポリヌクレオチドを作製するために、同じまたは異なるファミリーのタンパク質の任意の他のＵＴＲとスワッピングされ得る。本明細書で使用される場合、「タンパク質のファミリー」とは、最も広い意味において使用され、少なくとも１つの機能、構造、特徴、局在、起点または発現パターンを共有する２つ以上の目的のポリペプチドの群を指す。
非翻訳領域は、翻訳エンハンサーエレメント（ＴＥＥ）も含み得る。非限定的な例として、ＴＥＥとしては、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願第２００９０２２６４７０号に記載されているＴＥＥ、及び当該技術分野で既知のＴＥＥを含み得る。
ＲＮＡのインビトロ転写
本明細書に記載のポリヌクレオチドをコードするｃＤＮＡは、インビトロ転写（ＩＶＴ）システムを使用して転写され得る。ＲＮＡのインビトロ転写は、当該技術分野で既知であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２０１４／１５２０２７号に記載されている。いくつかの実施形態では、本開示のＲＮＡは、ＷＯ２０１８／０５３２０９及びＷＯ２０１９／０３６６８２（これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている方法のいずれか１つ以上に従って調製される。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ転写産物は、ＲＮＡ転写産物を生成するためのインビトロ転写反応で、増幅されていない直鎖化されたＤＮＡテンプレートを使用して生成される。いくつかの実施形態では、テンプレートＤＮＡは、単離されたＤＮＡである。いくつかの実施形態では、テンプレートＤＮＡはｃＤＮＡである。いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡは、例えば、限定されないが、百日咳ｍＲＮＡのＲＮＡポリヌクレオチドの逆転写によって形成される。いくつかの実施形態では、細胞、例えば、細菌細胞、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、例えば、ＤＨ－１細胞に、プラスミドＤＮＡテンプレートを用いてトランスフェクションする。いくつかの実施形態では、トランスフェクトされた細胞を、プラスミドＤＮＡを複製するために培養し、次いで単離及び精製する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡテンプレートは、ＲＮＡポリメラーゼプロモータ、例えば、目的の遺伝子の５’側に位置し、目的の遺伝子に作用可能に連結されているＴ７プロモータを含む。
いくつかの実施形態では、インビトロ転写テンプレートは、５′非翻訳（ＵＴＲ）領域をコードし、オープンリーディングフレームを含有し、３′ＵＴＲ及びポリＡテールをコードする。特定の核酸配列組成物及びインビトロ転写テンプレートの長さは、テンプレートによってコードされるｍＲＮＡに依存する。
「５’非翻訳領域」（ＵＴＲ）は、ポリペプチドをコードしていない開始コドン（すなわち、リボソームによって翻訳されたｍＲＮＡ転写物の最初のコドン）から直接上流（すなわち、５’側）にあるｍＲＮＡの領域を指す。ＲＮＡ転写産物が生成されている場合、５’ＵＴＲはプロモータ配列を含み得る。そのようなプロモータ配列が、当該技術分野で既知である。本開示のワクチンには、そのようなプロモータ配列が存在しないことが理解されるべきである。
「３’非翻訳領域」（ＵＴＲ）は、ポリペプチドをコードしていない終止コドン（すなわち、翻訳終結をシグナル伝達するｍＲＮＡ転写物のコドン）から直接下流（すなわち、３’側）にあるｍＲＮＡの領域を指す。
「オープンリーディングフレーム」は、開始コドン（例えば、メチオニン（ＡＴＧ））で始まり、終止コドン（例えば、ＴＡＡ、ＴＡＧまたはＴＧＡ）で終わるＤＮＡの連続ストレッチであり、ポリペプチドをコードする。
「ポリ（Ａ）テール」は、複数の連続したアデノシン一リン酸を含有する３’ＵＴＲの下流、例えば、すぐ下流（すなわち、３’）にある、ｍＲＮＡの領域である。ポリ（Ａ）テールは、１０～３００個のアデノシン一リン酸を含有し得る。例えば、ポリ（Ａ）テールは、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、または３００個のアデノシン一リン酸を含有し得る。いくつかの実施形態では、ポリ（Ａ）テールは、５０～２５０個のアデノシン一リン酸を含有する。関連する生物学的環境（例えば、細胞内、インビボ）において、ポリ（Ａ）テールは、例えば、細胞質での酵素分解からｍＲＮＡを保護するように機能し、転写終結、及び／または核からのｍＲＮＡの輸送及び翻訳で補助する。
いくつかの実施形態では、核酸は、２００～３，０００ヌクレオチドを含む。例えば、核酸は、２００～５００、２００～１０００、２００～１５００、２００～３０００、５００～１０００、５００～１５００、５００～２０００、５００～３０００、１０００～１５００、１０００～２０００、１０００～３０００、１５００～３０００、または２０００～３０００ヌクレオチドを含み得る。
インビトロの転写系は、典型的には、転写緩衝液、ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）、ＲＮａｓｅ阻害剤、及びポリメラーゼを含む。
ＮＴＰは、社内で製造され得るか、供給業者から選択され得るか、または本明細書に記載されるように合成され得る。ＮＴＰは、限定されないが、天然及び非天然（修飾）ＮＴＰを含む本明細書に記載のものから選択され得る。
任意の数のＲＮＡポリメラーゼまたはバリアントが、本開示の方法で使用され得る。ポリメラーゼは、限定されないが、ファージＲＮＡポリメラーゼ、例えば、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ、及び／または限定されないが、化学修飾核酸及び／またはヌクレオチドを含む、修飾核酸及び／または修飾ヌクレオチドを組み込むことが可能なポリメラーゼなどの変異体ポリメラーゼから選択され得る。いくつかの実施形態は、ＤＮａｓｅの使用を除外する。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ転写産物は、酵素キャッピングを介してキャッピングされる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、５’末端キャップ、例えば、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮｐを含む。
化学合成
固相化学合成。本開示の核酸は、固相技術を使用して全体的または部分的に製造され得る。核酸の固相化学合成は、分子を固体支持体上に固定し、反応溶液中で段階的に合成する自動化された方法である。固相合成は、核酸配列への化学修飾の部位特異的導入に役立つ。
液相化学合成。モノマービルディングブロックの連続付加による本開示の核酸の合成は、液相で実行され得る。
合成方法の組み合わせ。上記で考察した合成方法には、各々独自の利点及び制限がある。その制限を克服するために、これらの方法を組み合わせる試みが行われている。そのような方法の組み合わせは、本開示の範囲内である。酵素ライゲーションと組み合わせた、固相または液相化学合成の使用は、化学合成単独では得ることができない長鎖核酸を生成する効率的な方式が提供される。
核酸領域または部分領域のライゲーション
リガーゼによる核酸の組み立ても使用され得る。ＤＮＡまたはＲＮＡリガーゼは、ホスホジエステル結合の形成を介して、ポリヌクレオチド鎖の５’末端と３’末端の分子間ライゲーションを促進する。キメラポリヌクレオチド及び／または環状核酸などの核酸は、１つ以上の領域または部分領域のライゲーションによって調製され得る。ＤＮＡフラグメントをリガーゼ触媒反応によって結合させて、異なる機能を有する組換えＤＮＡを生成することができる。２つのオリゴデオキシヌクレオチド（５’ホスホリル基を含むもの及び遊離３’ヒドロキシル基を含むもの）がＤＮＡリガーゼの基質として機能する。
精製
本明細書に記載の核酸の精製には、核酸のクリーンアップ、品質保証及び品質管理が含まれ得るが、これらに限定されない。クリーンアップは、限定されるものではないが、ＡＧＥＮＣＯＵＲＴ（登録商標）ビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）、ポリＴビーズ、ＬＮＡ（商標）オリゴＴキャプチャープローブ（ＥＸＩＱＯＮ（登録商標）Ｉｎｃ，Ｖｅｄｂａｅｋ，Ｄｅｎｍａｒｋ）、またはＨＰＬＣベースの精製方法、限定されるものではないが、強陰イオン交換ＨＰＬＣ、弱陰イオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）、及び疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ－ＨＰＬＣ）などの当該技術分野で知られている方法によって実施することができる。「精製された」という用語は、「精製された核酸」などの核酸に関して使用される場合、少なくとも１つの夾雑物から分離されたものを指す。「夾雑物」とは、別の不適切なもの、不純なもの、または粗悪なものに変えてしまう任意の物質である。したがって、精製された核酸（例えば、ＤＮＡ及びＲＮＡ）は、それが天然に見出されるものとは異なる形態もしくは設定で、またはそれに処理もしくは精製方法を施す前に存在していたものとは異なる形態もしくは設定で存在する。
品質保証及び／または品質管理のチェックは、限定されるものではないが、ゲル電気泳動、ＵＶ吸光度、または分析的ＨＰＬＣなどの方法を使用して行うことができる。
いくつかの実施形態では、核酸は、限定されるものではないが、逆転写酵素ＰＣＲを含む方法によって配列決定され得る。
定量化
いくつかの実施形態では、本開示の核酸は、エクソソームにおいて、または１つ以上の体液に由来する場合に定量化され得る。体液には、末梢血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液（ＣＳＦ）、痰、唾液、骨髄、滑膜液、痰性体液、羊膜液、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液、前立腺液、カウパー液または尿道球腺液、汗、糞便、髪、涙、嚢胞液、胸膜及び腹水、心膜液、リンパ液、粥状液、乳び、胆汁、間質液、月経、膿汁、皮脂、嘔吐物、膣分泌物、粘膜分泌物、便水、膵液、副鼻腔からの洗浄液、気管支肺吸引液、胚盤葉腔液、及び臍帯血が挙げられる。代替的に、エクソソームは、肺、心臓、膵臓、胃、腸、膀胱、腎臓、卵巣、精巣、皮膚、結腸、乳房、前立腺、脳、食道、肝臓、及び胎盤からなる群から選択される器官から取得され得る。
アッセイは、構築物特異的プローブ、サイトメトリー、ｑＲＴ－ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、ＰＣＲ、フローサイトメトリー、電気泳動、質量分析、またはこれらの組み合わせを使用して実施することができ、エクソソームは、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）などの免疫組織化学を使用して単離することができる。エクソソームはまた、サイズ排除クロマトグラフィー、密度勾配遠心分離、分画遠心分離、ナノ膜限外濾過、免疫吸着捕捉、アフィニティー精製、マイクロ流体分離、またはこれらの組み合わせによって単離することができる。
これらの方法により、研究者は、核酸の残留レベルまたは送達レベルをリアルタイムでモニターすることができる。これは、本開示の核酸が、いくつかの実施形態では、構造的または化学的修飾により内因性形態とは異なることから可能である。
いくつかの実施形態では、核酸は、限定されるものではないが、紫外線可視分光法（ＵＶ／Ｖｉｓ）などの方法を使用して定量化され得る。ＵＶ／Ｖｉｓ分光計の非限定的な例は、ＮＡＮＯＤＲＯＰ（登録商標）分光計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）である。定量化された核酸は、核酸が適切なサイズであり得るかどうか決定し、核酸の分解が生じていないか確認するために分析され得る。核酸の分解は、限定するものではないが、アガロースゲル電気泳動、ＨＰＬＣベースの精製方法、例えば、限定するものではないが、強陰イオン交換ＨＰＬＣ、弱陰イオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）、及び疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ－ＨＰＬＣ）、液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣＭＳ）、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）及びキャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）などの方法によって確認され得る。
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）
いくつかの実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中に製剤化される。脂質ナノ粒子は、典型的には、イオン化可能なアミノ脂質、非カチオン性脂質、ステロール、及びＰＥＧ脂質構成要素を、目的の核酸カーゴとともに含む。本開示の脂質ナノ粒子は、当該技術分野で概して既知である構成要素、組成物、及び方法を使用して生成することができ、例えば、それら全ての全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５２３５２、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６８３００、ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０３７５５１、ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０２７４００、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０４７４０６、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６０００１２９、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０１４２８０、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０１４２８０、ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０３８４２６、ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０２７０７７、ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０５５３９４、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／５２１１７、ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０６９６１０、ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０２７４９２、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５９５７５、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６９４９１を参照されたい。
本開示のワクチンは、典型的には、脂質ナノ粒子内で製剤化される。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのイオン化可能なアミノ脂質、少なくとも１つの非カチオン性脂質、少なくとも１つのステロール、及び／または少なくとも１つのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾脂質を含む。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、２０～６０ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質を含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、２０～５５ｍｏｌ％のイオン化可能なカチオン性脂質を含む。例えば、脂質ナノ粒子は、２０～５０ｍｏｌ％、２０～４０ｍｏｌ％、２０～３０ｍｏｌ％、３０～６０ｍｏｌ％、３０～５０ｍｏｌ％、３０～４０ｍｏｌ％、４０～６０ｍｏｌ％、４０～５０ｍｏｌ％、または５０～６０ｍｏｌ％のイオン化可能アミノ脂質を含み得る。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、２０ｍｏｌ％、３０ｍｏｌ％、４０ｍｏｌ％、５０ｍｏｌ％、または６０ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質を含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、４０ｍｏｌ％、４１ｍｏｌ％、４２ｍｏｌ％、４３ｍｏｌ％、４４ｍｏｌ％ ４５ｍｏｌ％、４６ｍｏｌ％、４７ｍｏｌ％、４８ｍｏｌ％、４９ｍｏｌ％、５０ｍｏｌ％、または６０ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質を含む。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、５～２５ｍｏｌ％の非カチオン性脂質を含む。例えば、脂質ナノ粒子は、５～２０ｍｏｌ％、５～１５ｍｏｌ％、５～１０ｍｏｌ％、１０～２５ｍｏｌ％、１０～２０ｍｏｌ％、１０～２５ｍｏｌ％、１５～２５ｍｏｌ％、１５～２０ｍｏｌ％、または２０～２５ｍｏｌ％の非カチオン性脂質を含み得る。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、５ｍｏｌ％、１０ｍｏｌ％、１５ｍｏｌ％、２０ｍｏｌ％、または２５ｍｏｌ％の非カチオン性脂質を含む。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、２５～５５ｍｏｌ％のステロールを含む。例えば、脂質ナノ粒子は、２５～５０ｍｏｌ％、２５～４５ｍｏｌ％、２５～４０ｍｏｌ％、２５～３５ｍｏｌ％、２５～３０ｍｏｌ％、３０～５５ｍｏｌ％、３０～５０ｍｏｌ％、３０～４５ｍｏｌ％、３０～４０ｍｏｌ％、３０～３５ｍｏｌ％、３５～５５ｍｏｌ％、３５～５０ｍｏｌ％、３５～４５ｍｏｌ％、３５～４０ｍｏｌ％、４０～５５ｍｏｌ％、４０～５０ｍｏｌ％、４０～４５ｍｏｌ％、４５～５５ｍｏｌ％、４５～５０ｍｏｌ％、または５０～５５ｍｏｌ％のステロールを含み得る。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、２５ｍｏｌ％、３０ｍｏｌ％、３５ｍｏｌ％、４０ｍｏｌ％、４５ｍｏｌ％、５０ｍｏｌ％、または５５ｍｏｌ％のステロールを含む。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、０．５～１５ｍｏｌ％のＰＥＧ修飾脂質を含む。例えば、脂質ナノ粒子は、０．５～１０ｍｏｌ％、０．５～５ｍｏｌ％、１～１５ｍｏｌ％、１～１０ｍｏｌ％、１～５ｍｏｌ％、２～１５ｍｏｌ％、２～１０ｍｏｌ％、２～５ｍｏｌ％、５～１５ｍｏｌ％、５～１０ｍｏｌ％、または１０～１５ｍｏｌ％を含み得る。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、０．５ｍｏｌ％、１ｍｏｌ％、２ｍｏｌ％、３ｍｏｌ％、４ｍｏｌ％、５ｍｏｌ％、６ｍｏｌ％、７ｍｏｌ％、８ｍｏｌ％、９ｍｏｌ％、１０ｍｏｌ％、１１ｍｏｌ％、１２ｍｏｌ％、１３ｍｏｌ％、１４ｍｏｌ％、または１５ｍｏｌ％のＰＥＧ修飾脂質を含む。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、２０～６０ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質、５～２５ｍｏｌ％の非カチオン性脂質、２５～５５ｍｏｌ％のステロール、及び約０．５～１５ｍｏｌ％のＰＥＧ修飾脂質を含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、４０～５０ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質、５～１５ｍｏｌ％の中性脂質、２０～４０ｍｏｌ％のコレステロール、及び約０．５～３ｍｏｌ％のＰＥＧ修飾脂質を含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、４５～５０ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質、９～１３％の中性脂質、３５～４５ｍｏｌ％のコレステロール、及び約２～３ｍｏｌ％のＰＥＧ修飾脂質を含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、４８ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質、１１ｍｏｌ％の中性脂質、６８．５ｍｏｌ％のコレステロール、及び約２．５ｍｏｌ％のＰＥＧ修飾脂質を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のイオン化可能なアミノ脂質は、式（Ｉ）の化合物：
またはその塩もしくは異性体を含み、式中：
Ｒ１が、Ｃ５－３０アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３が独立して、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、Ｃ２－１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、またはＲ２及びＲ３が、それらが付着している原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４が、Ｃ３－６炭素環、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、
－ＣＨＱＲ、－ＣＱ（Ｒ）２、及び非置換Ｃ１－６アルキル、からなる群から選択され、式中、Ｑが、炭素環、複素環、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＸ２Ｈ、－ＣＸＨ２、－ＣＮ、－Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｒ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ、及び－Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、各ｎは、独立して、１、２、３、４、及び５から選択され、
各Ｒ５が独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ６が独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｍ及びＭ’が、独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ７が、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｒ８が、Ｃ３－６炭素環及び複素環からなる群から選択され、
Ｒ９が、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１－６アルキル、－ＯＲ、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）２、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ３－６炭素環、及び複素環からなる群から選択され、
各Ｒが独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ’が独立して、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ”が独立して、Ｃ３－１４アルキル及びＣ３－１４アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒ＊が独立して、Ｃ１－１２アルキル及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｙが独立して、Ｃ３－６炭素環であり、
各Ｘが、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から独立して選択され、
ｍが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択される。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットは、Ｒ４が、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、または－ＣＱ（Ｒ）２である場合、（ｉ）Ｑは、ｎが１、２、３、４、もしくは５である場合、－Ｎ（Ｒ）２ではなく、または（ｉｉ）Ｑは、ｎが１もしくは２である場合、５、６、もしくは７員のヘテロシクロアルキルではないものを含む。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットには、
Ｒ１が、Ｃ５－３０アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３が独立して、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、Ｃ２－１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、またはＲ２及びＲ３が、それらが付着している原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４が、Ｃ３－６炭素環、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、－ＣＱ（Ｒ）２、及び非置換のＣ１－６アルキルからなる群から選択され、ここでＱが、Ｃ３－６炭素環、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５～１４員のヘテロアリール、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＸ２Ｈ、－ＣＸＨ２、－ＣＮ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－ＣＲＮ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｒ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ、ならびにＮ、Ｏ、及びＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５～１４員のヘテロシクロアルキルから選択され、これは、オキソ（＝Ｏ）、ＯＨ、アミノ、モノ－またはジ－アルキルアミノ、及びＣ１－３アルキルから選択される１つ以上の置換基で置換されており、各ｎが独立して、１、２、３、４、及び５から選択され、
各Ｒ５が独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ６が独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｍ及びＭ’が、独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ７が、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｒ８が、Ｃ３－６炭素環及び複素環からなる群から選択され、
Ｒ９が、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１－６アルキル、－ＯＲ、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）２、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ３－６炭素環、及び複素環からなる群から選択され、
各Ｒが独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ’が独立して、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ”が独立して、Ｃ３－１４アルキル及びＣ３－１４アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒ＊が独立して、Ｃ１－１２アルキル及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｙが独立して、Ｃ３－６炭素環であり、
各Ｘが独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から選択され、
ｍが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択されるもの、
またはその塩もしくは異性体が含まれる。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットには、
Ｒ１が、Ｃ５－３０アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３が独立して、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、Ｃ２－１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、またはＲ２及びＲ３が、それらが付着している原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４が、Ｃ３－６炭素環、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、－ＣＱ（Ｒ）２、及び非置換のＣ１－６アルキルからなる群から選択され、ここでＱが、Ｃ３－６炭素環、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５～１４員の複素環、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＸ２Ｈ、－ＣＸＨ２、－ＣＮ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－ＣＲＮ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｒ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ、及び－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２から選択され、各ｎが独立して、１、２、３、４、及び５から選択され、かつＱが、５～１４員の複素環であり、かつ（ｉ）Ｒ４が－（ＣＨ２）ｎＱであり、ここでｎは、１もしくは２であるか、または（ｉｉ）Ｒ４が－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲであり、ここでｎは、１であるか、または（ｉｉｉ）Ｒ４が－ＣＨＱＲ及び－ＣＱ（Ｒ）２である場合、Ｑが５～１４員のヘテロアリールまたは８～１４員のヘテロシクロアルキルのいずれかであり、
各Ｒ５が独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ６が独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｍ及びＭ’が、独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ７が、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｒ８が、Ｃ３－６炭素環及び複素環からなる群から選択され、
Ｒ９が、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１－６アルキル、－ＯＲ、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）２、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ３－６炭素環、及び複素環からなる群から選択され、
各Ｒが独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ’が独立して、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ”が独立して、Ｃ３－１４アルキル及びＣ３－１４アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒ＊が独立して、Ｃ１－１２アルキル及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｙが独立して、Ｃ３－６炭素環であり、
各Ｘは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から独立して選択され、
ｍが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択されるもの、
またはその塩もしくは異性体が含まれる。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットには、
Ｒ１が、Ｃ５－３０アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３が独立して、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、Ｃ２－１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、またはＲ２及びＲ３が、それらが付着している原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４が、Ｃ３－６炭素環、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、－ＣＱ（Ｒ）２、及び非置換のＣ１－６アルキルからなる群から選択され、ここでＱが、Ｃ３－６炭素環、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５～１４員のヘテロアリール、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＸ２Ｈ、－ＣＸＨ２、－ＣＮ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－ＣＲＮ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｒ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ、及び－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２から選択され、各ｎが独立して、１、２、３、４、及び５から選択され、
各Ｒ５が独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ６が独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｍ及びＭ’が、独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ７が、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｒ８が、Ｃ３－６炭素環及び複素環からなる群から選択され、
Ｒ９が、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１－６アルキル、－ＯＲ、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）２、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ３－６炭素環、及び複素環からなる群から選択され、
各Ｒが独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ’が独立して、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ”が独立して、Ｃ３－１４アルキル及びＣ３－１４アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒ＊が独立して、Ｃ１－１２アルキル及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｙが独立して、Ｃ３－６炭素環であり、
各Ｘは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から独立して選択され、
ｍが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択されるもの、
またはその塩もしくは異性体が含まれる。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットには、
Ｒ１が、Ｃ５－３０アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３が独立して、Ｈ、Ｃ２－１４アルキル、Ｃ２－１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、またはＲ２及びＲ３が、それらが付着している原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４が－（ＣＨ２）ｎＱまたは－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲであり、ここでＱが－Ｎ（Ｒ）２であり、ｎが、３、４、及び５から選択され、
各Ｒ５が独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ６が独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｍ及びＭ’が、独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ７が、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒが独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ’が独立して、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ”が独立して、Ｃ３－１４アルキル及びＣ３－１４アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒ＊が独立して、Ｃ１－１２アルキル及びＣ１－１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｙが独立して、Ｃ３－６炭素環であり、
各Ｘは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から独立して選択され、
ｍが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択されるもの、
またはその塩もしくは異性体が含まれる。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットには、
Ｒ１が、Ｃ５－３０アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３が独立して、Ｃ１－１４アルキル、Ｃ２－１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、またはＲ２及びＲ３が、それらが付着している原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４が、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、及び－ＣＱ（Ｒ）２からなる群から選択され、ここでＱが、－Ｎ（Ｒ）２であり、かつｎが、１、２、３、４、及び５から選択され、
各Ｒ５が独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ６が独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｍ及びＭ’が、独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ７が、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒが独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ’が独立して、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ”が独立して、Ｃ３－１４アルキル及びＣ３－１４アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒ＊が独立して、Ｃ１－１２アルキル及びＣ１－１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｙが独立して、Ｃ３－６炭素環であり、
各Ｘが、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から独立して選択され、
ｍが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択されるもの、
またはその塩もしくは異性体が含まれる。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットには、式（ＩＡ）の化合物、
またはその塩もしくは異性体を含み、ここでｌが、１、２、３、４、及び５から選択され、ｍが、５、６、７、８、及び９から選択され、Ｍ１が、結合またはＭ’であり、Ｒ４が、非置換のＣ１－３アルキル、または－（ＣＨ２）ｎＱであり、ここでＱが、ＯＨ、－ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－ＮＨＣ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＮＨＣ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ヘテロアリール、またはヘテロシクロアルキルであり、Ｍ及びＭ’が独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、Ｒ２及びＲ３が独立して、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、及びＣ２－１４アルケニルからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットには、式（ＩＩ）の化合物、
またはその塩もしくは異性体を含み、ここでｌが、１、２、３、４、及び５から選択され、Ｍ１が、結合またはＭ’であり、Ｒ４が、非置換のＣ１－３アルキル、または－（ＣＨ２）ｎＱであり、ここでｎが、２、３、または４であり、Ｑが、ＯＨ、－ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－ＮＨＣ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＮＨＣ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ヘテロアリール、またはヘテロシクロアルキルであり、Ｍ及びＭ’が独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、Ｒ２及びＲ３が独立して、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、及びＣ２－１４アルケニルからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットには、式（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、もしくは（ＩＩｅ）の化合物、
またはその塩もしくは異性体が含まれ、式中、Ｒ４は、本明細書に記載のとおりである。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットには、式（ＩＩｄ）の化合物、
またはその塩もしくは異性体が含まれ、式中、ｎは、２、３、または４であり、ｍ、Ｒ’、Ｒ”、及びＲ２～Ｒ６は、本明細書に記載のとおりである。例えば、Ｒ２及びＲ３の各々が独立して、Ｃ５－１４アルキル及びＣ５－１４アルケニルからなる群から選択され得る。
いくつかの実施形態では、本開示のイオン化可能なアミノ脂質は、以下の構造を有する化合物を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のイオン化可能なアミノ脂質は、以下の構造を有する化合物を含む。
いくつかの実施形態では、本開示の非カチオン性脂質は、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＬＰＣ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、ｌ，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２－ジウンデカノイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホコリン（ＤＵＰＣ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：０ジエーテルＰＣ）、１－オレオイル－２－コレステリルヘミスクシノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＯＣｈｅｍｓＰＣ）、１－ヘキサデシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（Ｃ１６ Ｌｙｓｏ ＰＣ）、１，２－ジリノレノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジアラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＭＥ１６．０ＰＥ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジリノレノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジアラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－ｒａｃ－（１－グリセロール）ナトリウム塩（ＤＯＰＧ）、スフィンゴミエリン、及びこれらの混合物を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のＰＥＧ修飾脂質は、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロール、及びこれらの混合物を含む。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質は、ＤＭＧ－ＰＥＧ、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ（ＰＥＧ－ＤＯＭＧとも称される）、ＰＥＧ－ＤＳＧ、及び／またはＰＥＧ－ＤＰＧである。
いくつかの実施形態では、本開示のステロールは、コレステロール、フェコステロール、シトステロール、エルゴステロール、カンペステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール、トマチジン、ウルソール酸、アルファ－トコフェロール、及びそれらの混合物を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰは、化合物１のイオン化可能なアミノ脂質を含み、ここで、非カチオン性脂質はＤＳＰＣであり、構造脂質はコレステロールであり、ＰＥＧ脂質はＤＭＧ－ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ２０００－ＤＭＧ）である。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、４５～５５モルパーセント（ｍｏｌ％）のイオン化可能なアミノ脂質（例えば、化合物１）を含む。例えば、脂質ナノ粒子は、４５～４７、４５～４８、４５～４９、４５～５０、４５～５２、４６～４８、４６～４９、４６～５０、４６～５２、４６～５５、４７～４８、４７～４９、４７～５０、４７～５２、４７～５５、４８～５０、４８～５２、４８～５５、４９～５０、４９～５２、４９～５５、または５０～５５ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質（例えば、化合物１）を含み得る。例えば、脂質ナノ粒子は、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、または５５ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質を含み得る。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、５～１５ｍｏｌ％の非カチオン性（中性）脂質（例えば、ＤＳＰＣ）を含む。例えば、脂質ナノ粒子は、５～６、５～７、５～８、５～９、５～１０、５～１１、５～１２、５～１３、５～１４、５～１５、６～７、６～８、６～９、６～１０、６～１１、６～１２、６～１３、６～１４、６～１５、７～８、７～９、７～１０、７～１１、７～１２、７～１３、７～１４、７～１５、８～９、８～１０、８～１１、８～１２、８～１３、８～１４、８～１５、９～１０、９～１１、９～１２、９～１３、９～１４、９～１５、１０～１１、１０～１２、１０～１３、１０～１４、１０～１５、１１～１２、１１～１３、１１～１４、１１～１５、１２～１３、１２～１４、１３～１４、１３～１５、または１４～１５ｍｏｌ％の非カチオン性（中性）脂質（例えば、ＤＳＰＣ）を含み得る。例えば、脂質ナノ粒子は、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５ｍｏｌ％のＤＳＰＣを含み得る。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、３５～４０ｍｏｌ％のステロール（例えば、コレステロール）を含む。例えば、脂質ナノ粒子は、３５～３６、３５～３７、３５～３８、３５～３９、３５～４０、３６～３７、３６～３８、３６～３９、３６～４０、３７～３８、３７～３９、３７～４０、３８～３９、３８～４０、または３９～４０ｍｏｌ％のコレステロールを含み得る。例えば、脂質ナノ粒子は、３５、３５．５、３６、３６．５、３７、３７．５、３８、３８．５、３９、３９．５または４０ｍｏｌ％のコレステロールを含み得る。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、１～３ｍｏｌ％のＤＭＧ－ＰＥＧを含む。例えば、脂質ナノ粒子は、１～１．５、１～２、１～２．５、１～３、１．５～２，１．５～２．５、１．５～３、２～２．５、２～３、または２．５～３．ｍｏｌ％のＤＭＧ－ＰＥＧを含み得る。例えば、脂質ナノ粒子は、１、１．５、２、２．５、または３ｍｏｌ％のＤＭＧ－ＰＥＧを含み得る。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、５０ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質と、１０ｍｏｌ％のＤＳＰＣと、３８．５ｍｏｌ％のコレステロールと、１．５ｍｏｌ％のＤＭＧ－ＰＥＧとを含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、４８ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質と、１１ｍｏｌ％のＤＳＰＣと、３８．５ｍｏｌ％のコレステロールと、２．５ｍｏｌ％のＰＥＧ２０００－ＤＭＧとを含む。
いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰは、約２：１～約３０：１のＮ：Ｐ比を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰは、約６：１のＮ：Ｐ比を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰは、約３：１のＮ：Ｐ比を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰは、約１０：１～約１００：１というｗｔ／ｗｔ比のイオン化可能なアミノ脂質構成要素対ＲＮＡを含む。
いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰは、約２０：１というｗｔ／ｗｔ比のイオン化可能なアミノ脂質構成要素対ＲＮＡを含む。
いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰは、約１０：１というｗｔ／ｗｔ比のイオン化可能なアミノ脂質構成要素対ＲＮＡを含む。
いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰの平均直径は約５０ｎｍ～約１５０ｎｍである。
いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰの平均直径は約７０ｎｍ～約１２０ｎｍである。
多価ワクチン
本明細書で提供する組成物は、同じまたは異なる種の２つ以上の抗原をコードするＲＮＡまたは複数のＲＮＡを含み得る。いくつかの実施形態では、組成物は、２つ以上の百日咳抗原、ジフテリア抗原、及び／または破傷風をコードするＲＮＡまたは複数のＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個、またはそれ以上の百日咳抗原、ジフテリア抗原、及び／または破傷風抗原をコードし得る。
いくつかの実施形態では、抗原をコードする２つ以上の異なるｍＲＮＡを、同じ脂質ナノ粒子内に製剤化され得る。他の実施形態では、抗原をコードする２つ以上の異なるＲＮＡが、別々の脂質ナノ粒子内に製剤化され得る（各ＲＮＡが単一の脂質ナノ粒子内に製剤化される）。脂質ナノ粒子は、次に、組み合わされて単一のワクチン組成物（例えば、複数の抗原をコードする複数のＲＮＡを含むワクチン組成物）として投与され得るか、または別々に投与され得る。
薬学的製剤
本明細書で提供されるのは、例えば、ヒト及び他の哺乳類における百日咳の予防または治療のための組成物（例えば、薬学的組成物）、方法、キット、及び試薬である。本明細書で提供される組成物は、治療剤または予防剤として使用され得る。それらは、百日咳感染症、ジフテリア感染症、及び／または破傷風感染症を予防及び／または治療するために医学において使用され得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡを含有するワクチンは、対象（例えば、ヒト対象などの哺乳類対象）に投与され得、ＲＮＡポリヌクレオチドは、インビボで翻訳されて、抗原ポリペプチド（抗原）を産生する。
組成物（例えば、ＲＮＡを含む）の「有効量」は、少なくとも部分的には、標的組織、標的細胞タイプ、投与手段、ＲＮＡの物理的特性（例えば、長さ、ヌクレオチド組成、及び／または修飾ヌクレオシドの程度）、ワクチンの他の構成要素、ならびに他の決定因子、例えば、対象の年齢、体重、身長、性別、及び全体的健康状態に基づく。典型的には、組成物の有効量は、対象の細胞内での抗原産生の関数として、誘導または追加免疫された免疫応答を提供する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの化学修飾を有するＲＮＡポリヌクレオチドを含有する組成物の有効量は、同じ抗原またはペプチド抗原をコードする対応する非修飾ポリヌクレオチドを含有する組成物よりも効率的である。抗原産生の増大は、細胞トランスフェクションの増大（ＲＮＡワクチンでトランスフェクトされた細胞のパーセンテージ）、ポリヌクレオチドからのタンパク質翻訳及び／または発現の増大、核酸分解の減少（例えば、修飾ポリヌクレオチドからのタンパク質翻訳の持続時間の増大によって示される）、または宿主細胞の抗原特異的免疫応答の変化によって実証され得る。
「薬学的組成物」という用語は、活性薬剤と、組成物をインビボまたはエクスビボでの診断的または療法的使用に特に好適なものにする不活性または活性の担体との組み合わせを指す。「薬学的に許容される担体」とは、対象への投与後または投与時に、望ましくない生理学的作用を引き起こさないものである。薬学的組成物中の担体は、有効成分に適合性であり、それを安定化させることが可能であるという意味においても「許容」されなければならない。１つ以上の可溶化剤を活性薬剤の送達のための薬学的担体として利用することができる。薬学的に許容される担体の例としては、限定されるものではないが、剤形として使用可能な組成物を達成するための生体適合性のビヒクル、アジュバント、添加剤、及び希釈剤が挙げられる。他の担体の例としては、コロイド状酸化ケイ素、ステアリン酸マグネシウム、セルロース、及びラウリル硫酸ナトリウムが挙げられる。追加の好適な薬学的担体及び希釈剤、ならびにそれらを使用するための医薬的必需品は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓに記載されている。
いくつかの実施形態では、本開示に従う組成物（ポリヌクレオチド及びそのコードされたポリペプチドを含む）は、百日咳感染症、ジフテリア感染症、及び／または破傷風感染症の治療または予防のために使用され得る。ある組成物は、健康な個体または潜伏期間中の感染初期または症状発現後の活動性感染中に、積極的な免疫化スキームの一環として予防的または治療的に投与され得る。いくつかの実施形態では、細胞、組織、または対象に提供されるＲＮＡの量は、免疫予防に有効な量であり得る。
組成物は、他の予防または治療化合物とともに投与され得る。非限定的な例として、予防または治療化合物は、アジュバントまたはブースターであり得る。本明細書で使用する場合、「ブースター」という用語は、ワクチンなどの予防組成物に関する場合、予防（ワクチン）組成物の追加投与を指す。ブースター（またはブースターワクチン）は、予防組成物の早期投与後に投与され得る。予防組成物の初回投与とブースターとの間の投与時間は、１２時間、１日、３６時間、２日、３日、４日、５日、６日、１週間、１０日、２週間、３週間、１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、６カ月、７カ月、８カ月、９カ月、１０カ月、１１カ月、１年、１８カ月、２年、３年、４年、５年、６年、７年、８年、９年、１０年、またはそれ以上であり得るが、これらに限定されない。例示的な実施形態では、予防的組成物の最初の投与とブースターとの間の投与時間は、限定されないが、１週間、２週間、３週間、１カ月、２カ月、３カ月、または６カ月であり得る。本明細書に記載されるように、ブースターは、初期投与の予防組成物と比較して、同じまたは異なるｍＲＮＡを含み得る。ブースターは、いくつかの実施形態では、一価である（例えば、ｍＲＮＡは、単一の抗原をコードする）。いくつかの実施形態では、ブースターは、多価である（例えば、ｍＲＮＡは、１つを超える抗原をコードする）。
いくつかの実施形態では、組成物は、当該技術分野で公知の不活化ワクチンの投与と同様に、筋肉内、経鼻、または皮内に投与され得る。
組成物は、感染の有病率または満たされていない医療ニーズの程度もしくはレベルに応じて、様々な設定で利用され得る。非限定的な例として、ＲＮＡワクチンは、様々な感染性疾患（例えば、百日咳、破傷風、ジフテリア）を治療及び／または予防するために利用され得る。ＲＮＡワクチンは、市販のワクチンよりもはるかに大きな抗体力価、より良好な中和免疫をもたらし、より持続性のある免疫応答を生じるか、及び／またはより早期の応答をもたらすという点において優れた特性を有する。
本明細書で提供されるのは、ＲＮＡ及び／または任意選択的に、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤と組み合わせた複合体を含む薬学的組成物である。
ＲＮＡは、単独で、または１つ以上の他の構成要素と組み合わせて、製剤化または投与され得る。例えば、免疫化組成物は、限定するものではないが、アジュバントを含む他の構成要素を含み得る。
いくつかの実施形態では、免疫化組成物はアジュバントを含まない（アジュバントフリーである）。
ＲＮＡは、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤と組み合わせて製剤化されてもまたは投与され得る。いくつかの実施形態では、ワクチン組成物は、例えば、治療活性物質、予防活性物質、または両方の組み合わせなどの少なくとも１つの追加の活性物質を含む。ワクチン組成物は、無菌、パイロジェンフリーであっても、または無菌かつパイロジェンフリーの両方であり得る。ワクチン組成物などの医薬品の製剤化及び／または製造における一般的な考慮事項は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ２１ｓｔ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００５（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に見出すことができる。
いくつかの実施形態では、免疫化組成物は、ヒト、ヒトの患者または対象に投与される。本開示の目的において、「有効成分」という表現は、概して、ＲＮＡワクチンまたはそれに含まれるポリヌクレオチド、例えば、抗原をコードするＲＮＡポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド）を指す。
本明細書に記載のワクチン組成物の製剤は、薬理学の分野で知られているまたは今後開発される任意の方法によって、調製され得る。概して、このような調製方法は、活性成分（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド）を、賦形剤及び／または１つ以上の補助成分と会合させるステップと、次に必要に応じて及び／または所望により、生成物を所望の単回または多回用量単位に分割、成形、及び／またはパッケージングするステップとを含む。
本開示に従う薬学的組成物中の活性成分、薬学的に許容される賦形剤、及び／または任意の更なる成分の相対量は、治療される対象の固有性、サイズ、及び／または状態に応じて、また更にはその組成物が投与される経路に応じて変動する。例として、組成物は、０．１％～１００％、例えば、０．５～５０％、１～３０％、５～８０％、少なくとも８０％（ｗ／ｗ）の活性成分を含み得る。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、１つ以上の賦形剤を使用して製剤化されて、（１）安定性を増加する、（２）細胞トランスフェクションを増加する、（３）持続放出もしくは遅延放出（例えば、デポー製剤から）を可能にする、（４）生体内分布を改変する（例えば、特定の組織または細胞型を標的とする）、（５）コードされたタンパク質の翻訳をインビボで増加する、及び／または（６）コードされたタンパク質（抗原）の放出プロファイルをインビボで改変することができる。ありとあらゆる溶媒、分散媒体、希釈剤、または他の液体ビヒクルなどの従来の賦形剤に加えて、分散剤または懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤または乳化剤、保存剤、賦形剤としては、限定されないが、リピドイド、リポソーム、脂質ナノ粒子、ポリマー、リポプレックス、コアシェルナノ粒子、ペプチド、タンパク質、ＲＮＡでトランスフェクトされた細胞（例えば、対象への移植用）、ヒアルロニダーゼ、ナノ粒子模倣物、及びそれらの組み合わせが挙げられ得る。
投与量／投与
ヒト及び他の哺乳類における百日咳感染症、ジフテリア感染症、及び／または破傷風感染症の予防及び／または治療のための免疫化組成物（例えば、ＲＮＡワクチン）、方法、キット、及び試薬が、本明細書で提供される。免疫化組成物は、治療剤または予防薬剤として使用され得る。いくつかの実施形態では、免疫化組成物は、百日咳感染症、ジフテリア感染症、及び／または破傷風感染症からの予防的保護を提供するために使用される。いくつかの実施形態では、免疫化組成物は、百日咳感染症、ジフテリア感染症、及び／または破傷風感染症を治療するために使用される。いくつかの実施形態では、実施形態、免疫化組成物は、例えばエクスビボで末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を活性化する、免疫エフェクター細胞の初回刺激に使用され、次いで対象に注入（再注入）される。
対象は、任意の哺乳類（非ヒト霊長類及びヒト対象を含む）であり得る。典型的には、対象とはヒト対象である。
いくつかの実施形態では、免疫化組成物（例えば、ＲＮＡワクチン）は、抗原特異的免疫応答を誘導するのに有効な量で対象（例えば、ヒト対象などの哺乳類対象）に投与される。百日咳抗原、破傷風抗原、及び／またはジフテリア抗原をコードするＲＮＡは、発現され、インビボで翻訳されて、抗原が産生され、次いで、対象における免疫応答が刺激される。
百日咳、ジフテリア、及び／または破傷風からの予防的保護は、本開示の免疫化組成物（例えば、ＲＮＡワクチン）の投与後に達成され得る。免疫化成物は１回、２回、３回、４回、またはそれ以上投与され得るが、ワクチンを１回投与するだけで十分な場合がある（任意選択的に１回のブースターが続く）。望ましいものではないが、感染した個体にある免疫化組成物を投与して治療応答を達成することも可能である。用量設定を適宜調整する必要がある場合がある。
百日咳抗原、ジフテリア抗原、及び／または破傷風抗原に対する対象における免疫応答を誘発する方法を、本開示の態様で提供する。いくつかの実施形態では、方法は、対象に、百日咳抗原、ジフテリア抗原、及び／または破傷風抗原（または複数の抗原）をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡを含む免疫化組成物を投与し、それによって対象において百日咳抗原、ジフテリア抗原、及び／または破傷風抗原（または複数の抗原）に特異的な免疫応答を誘導することを伴い、対象における抗－抗原抗体力価が、抗原に対する予防有効用量の従来のワクチンをワクチン接種した対象における抗抗原抗体力価と比較して、ワクチン接種後に増加する。「抗抗原抗体」とは、抗原に特異的に結合する血清抗体である。
予防有効用量とは、臨床的に許容されるレベルでウイルス感染を予防する有効用量である。いくつかの実施形態では、有効用量とは、ワクチンの添付文書に列記されている用量である。本明細書で使用する場合、従来のワクチンとは、本開示のｍＲＮＡワクチン以外のワクチンを指す。例えば、従来のワクチンとしては、生存微生物ワクチン、死菌微生物ワクチン、サブユニットワクチン、タンパク質抗原ワクチン、ＤＮＡワクチン、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）ワクチンなどが挙げられるが、これらに限定されない。例示的な実施形態では、従来のワクチンとは、規制認可を得ているか、及び／または国の医薬品規制機関、例えば、米国の食品医薬品局（ＦＤＡ）または欧州医薬品庁（ＥＭＡ）によって登録されているワクチンである。
いくつかの実施形態では、対象における抗抗原抗体力価は、ワクチン接種後、百日咳、破傷風、またはジフテリアに対する予防有効用量の従来のワクチンをワクチン接種した対象またはワクチン未接種の対象における抗－抗原抗体力価よりも、１ｌｏｇ～１０ｌｏｇ増大している。いくつかの実施形態では、対象における抗－抗原抗体力価は、ワクチン接種後、百日咳、破傷風、またはジフテリアに対する予防有効用量の従来のワクチンをワクチン接種した対象またはワクチン未接種の対象における抗－抗原抗体力価と比較して１ｌｏｇ、２ｌｏｇ、３ｌｏｇ、４ｌｏｇ、５ｌｏｇ、または１０ｌｏｇ増大している。
対象における百日咳、破傷風、及び／またはジフテリアウイルスに対する免疫応答を誘発する方法は、本開示の他の態様で提供される。本方法は、百日咳抗原、破傷風抗原、またはジフテリア抗原をコードするオープンリーディングフレームを含むｍＲＮＡを含む組成物を対象に投与することを含み、それによって、対象において百日咳、破傷風、またはジフテリアに特異的な免疫応答を誘導し、この対象での免疫応答は、この組成物に対し２倍～１００倍の投薬量レベルで、百日咳、破傷風、またはジフテリアに対する従来のワクチンを接種した対象での免疫応答と同等である。
いくつかの実施形態では、対象における免疫応答は、本開示の組成物に対し２倍の投薬量レベルで従来のワクチンを接種した対象における免疫応答と同等である。いくつかの実施形態では、対象における免疫応答は、本開示の組成物に対し３倍の投薬量レベルで従来のワクチンを接種した対象における免疫応答と同等である。いくつかの実施形態では、対象における免疫応答は、本開示の組成物に対し４倍、５倍、１０倍、５０倍、または１００倍の投薬量レベルで従来のワクチンを接種した対象における免疫応答と同等である。いくつかの実施形態では、対象における免疫応答は、本開示の組成物に対し１０倍～１０００倍の投薬量レベルで従来のワクチンを接種した対象における免疫応答と同等である。いくつかの実施形態では、対象における免疫応答は、本開示の組成物に対し１００倍～１０００倍の投薬量レベルで従来のワクチンを接種した対象における免疫応答と同等である。
他の実施形態では、免疫応答は、対象における［タンパク質］抗体力価を決定することによって評価される。他の実施形態では、免疫化された対象由来の血清または抗体の能力を、ウイルス取込みを中和する能力またはヒトＢリンパ球の百日咳、ジフテリア、及び／または破傷風形質転換を低減する能力に対して試験する。他の実施形態では、強力なＴ細胞応答（複数可）を促進する能力は、当該技術分野で認識されている技法を使用して測定される。
本開示の他の態様は、百日咳、ジフテリア、及び／または破傷風抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡを含む組成物を対象に投与して、それによって、対象において百日咳、ジフテリア、及び／または破傷風抗原に特異的な免疫応答を誘導することによって、対象において百日咳、ジフテリア、及び／または破傷風に対する免疫応答を誘発する方法を提供し、この対象における免疫応答は、予防有効用量の百日咳、ジフテリア、及び／または破傷風に対する従来のワクチンをワクチン接種した対象において誘導される免疫応答と比較して２日～１０週間早く誘導される。いくつかの実施形態では、対象における免疫応答は、本開示の組成物に対し２倍～１００倍の投薬量レベルで予防有効用量の従来のワクチンを接種した対象において誘導される。
いくつかの実施形態では、対象内の免疫応答は、予防有効用量の従来のワクチンでワクチン接種した対象内で誘導される免疫応答よりも２日、３日、１週間、２週間、３週間、５週間、または１０週間早く誘導される。
また、少なくとも１つの百日咳抗原、ジフテリア抗原、及び／または破傷風抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡを対象に投与することによって、百日咳、破傷風、またはジフテリアに対する対象における免疫応答を誘発する方法であって、ＲＮＡが安定化エレメントを含まず、アジュバントがワクチンと同時製剤化もされず、または同時投与もされない、方法が、本明細書でも提供される。
組成物は、治療的に有効な転帰をもたらす任意の経路で投与され得る。このような経路としては、限定されるものではないが、皮内、筋肉内、鼻腔内、及び／または皮下の投与が挙げられる。本開示は、ＲＮＡワクチンを投与することをそれを必要とする対象に行うことを含む方法を提供する。必要とされる正確な量は、対象の人種、年齢、及び全身状態、疾患の重症度、特定の組成物、その投与様式、その活性様式などに応じて対象ごとに異なる。ＲＮＡは、典型的には、投与しやすさ及び投薬量の均一性のために、単位剤形で製剤化される。ただし、ＲＮＡの１日合計使用量は妥当な医学的判断の範囲内で主治医によって決定され得ることが理解されよう。任意の特定の患者に対する具体的な治療有効用量レベル、予防有効用量レベル、または適切なイメージング用量レベルは、治療する障害及び障害の重症度；用いる具体的化合物の活性；用いる具体的組成物；患者の年齢、体重、全体の健康状態、性別、及び食事；用いる具体的化合物の投与時間、投与経路、及び排泄率；治療の期間；用いる具体的化合物と組み合わせでまたは同時に使用する薬物；ならびに医学分野で周知されている類似の因子を含めた様々な因子に依存する。
本明細書で示す場合、ＲＮＡの有効量（例えば、有効用量）は、例えば、単回投与または２回の１０μｇ投与として２０μｇ程度の低さで投与され得る（例えば、１回目の有効ワクチン用量及び２回目の有効ワクチン用量）。いくつかの実施形態では、１回目の有効ワクチン用量と２回目の有効ワクチン用量は同じ量である。いくつかの実施形態では、１回目の有効ワクチン用量と２回目の有効ワクチン用量は異なる量である。いくつかの実施形態では、有効量は、５μｇ～３０μｇ、５μｇ～２５μｇ、５μｇ～２０μｇ、５μｇ～１５μｇ、５μｇ～１０μｇ、１０μｇ～３０μｇ、１０μｇ～２５μｇ、１０μｇ～２０μｇ、１０μｇ～１５μｇ、１５μｇ～３０μｇ、１５μｇ～２５μｇ、１５μｇ～２０μｇ、２０μｇ～３０μｇ、２５μｇ～３０μｇ、または２５μｇ～３００μｇの総用量である。いくつかの実施形態では、有効用量（例えば、有効量）は、少なくとも１０μｇかつ２５μｇ未満の組成物である。いくつかの実施形態では、有効用量（例えば、有効量）は、少なくとも５μｇかつ２５μｇ未満の組成物である。例えば、有効量は、５μｇ、１０μｇ、１５μｇ、２０μｇ、２５μｇ、３０μｇ、３５μｇ、４０μｇ、４５μｇ、５０μｇ、５５μｇ、６０μｇ、６５μｇ、７０μｇ、７５μｇ、８０μｇ、８５μｇ、９０μｇ、９５μｇ、１００μｇ、１１０μｇ、１２０μｇ、１３０μｇ、１４０μｇ、１５０μｇ、１６０μｇ、１７０μｇ、１８０μｇ、１９０μｇ、２００μｇ、２５０μｇ、または３００μｇの総用量であり得る。いくつかの実施形態では、有効量（例えば、有効用量）は、１０μｇの総用量である。いくつかの実施形態では、有効量は、２０μｇの総用量（例えば、２回の１０μｇ用量）である。いくつかの実施形態では、有効量は、２５μｇの総用量である。いくつかの実施形態では、有効量は、３０μｇの総用量である。いくつかの実施形態では、有効量は、５０μｇの総用量である。いくつかの実施形態では、有効量は、６０μｇの総用量（例えば、２回の３０μｇ用量）である。いくつかの実施形態では、有効量は、７５μｇの総用量である。いくつかの実施形態では、有効量は、１００μｇの総用量である。いくつかの実施形態では、有効量は、１５０μｇの総用量である。いくつかの実施形態では、有効量は、２００μｇの総用量である。いくつかの実施形態では、有効量は、２５０μｇの総用量である。いくつかの実施形態では、有効量は、３００μｇの総用量である。
本明細書に記載のＲＮＡは、本明細書に記載の剤形、例えば、鼻腔内、気管内、または注射用（例えば、静脈内、眼内、硝子体内、筋肉内、皮内、心臓内、腹腔内、及び皮下）の剤形で製剤化され得る。
ワクチン効果
本開示のいくつかの態様は、組成物（例えば、ＲＮＡワクチン）の製剤であって、ＲＮＡが、対象において抗原特異的免疫応答（例えば、百日咳、破傷風、またはジフテリア抗原に特異的な抗体の産生）をもたらすのに有効な量で製剤化される、製剤を提供する。「有効量」とは、抗原特異的免疫応答をもたらすのに有効なＲＮＡの用量である。また、本明細書では、対象内の抗原特異的免疫応答を誘導する方法も提供する。
本明細書で使用される場合、本開示のワクチンまたはＬＮＰに対する免疫応答とは、ワクチン中に存在する（１つ以上の）百日咳、ジフテリア、及び／または破傷風タンパク質（複数可）に対する対象における液性及び／または細胞性免疫応答の発生である。本開示の目的において、「液性」免疫応答とは、抗体分子（例えば、分泌（ＩｇＡ）またはＩｇＧ分子を含む）によって媒介される免疫応答を指し、一方、「細胞性」免疫応答とは、Ｔリンパ球（例えば、ＣＤ４＋ヘルパー及び／またはＣＤ８＋Ｔ細胞（例えば、ＣＴＬ）及び／または他の白血球）によって媒介される免疫応答を指す。細胞性免疫における１つの重要な態様は、細胞溶解性Ｔ細胞（ＣＴＬ）による抗原特異的応答を含む。ＣＴＬは、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）によってコードされたタンパク質とともに提示され細胞表面に発現するペプチド抗原に対し特異性を有する。ＣＴＬは、細胞内微生物の破壊またはこのような微生物に感染した細胞の溶解を誘導及び促進する一助となる。細胞性免疫の別の態様は、ヘルパーＴ細胞による抗原特異的応答に関与する。ヘルパーＴ細胞は、ペプチド抗原をＭＨＣ分子とともにその表面に提示する細胞に対する非特異的エフェクター細胞の機能を刺激し、その活性に焦点を合わせる一助となるように作用する。細胞性免疫応答はまた、活性化Ｔ細胞及び／または他の白血球（ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞由来のものを含む）によって産生されるサイトカイン、ケモカイン、及び他のこのような分子の産生も引き起こす。液性免疫応答は、Ｔｈ１及びＴｈ２応答に更に分割され得、それぞれ、Ｔｈ１型サイトカイン及びＴｈ２型サイトカインの産生をもたらす。Ｔｈ１型サイトカインは、細胞内寄生虫の殺傷及び自己免疫応答の永続化に関与する炎症誘発応答を生成する傾向がある。主なＴｈ１サイトカインは、インターフェロンガンマである。過度の炎症誘発応答（例えば、Ｔｈ１に基づく応答）は、いくつかの実施形態では、制御不能な組織損傷をもたらし得、Ｔｈ２型サイトカインによって相殺される。Ｔｈ２型サイトカインには、アトピーにおけるＩｇＥ及び好酸球応答の促進に関連するインターロイキン４、５、及び１３、ならびに抗炎症性であるインターロイキン－１０も含まれる。過剰には、Ｔｈ２応答は、Ｔｈ１媒介性の殺菌作用を相殺する。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるワクチンは、バランスのとれたＴｈ１及びＴｈ２応答を誘発する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるワクチンの投与は、Ｔｈ１７応答をもたらし得る。Ｔヘルパー１７細胞（Ｔｈ１７）は、インターロイキン１７の産生によって定義される炎症誘発性Ｔヘルパー細胞のサブセットである。Ｔｈ１７細胞は、粘膜バリアを維持し、粘膜表面での病原体クリアランスに寄与する。Ｔｈ１７型サイトカインは、先天性免疫細胞及び上皮細胞を標的とし、Ｇ－ＣＳＦ及びＩｌ－８を産生し、好中球産生及び動員をもたらす。いくつかの実施形態では、本開示の組成物（例えば、ワクチン）は、Ｔｈ１応答を生じる。いくつかの実施形態では、本開示の組成物（例えば、ワクチン）は、Ｔｈ２応答を生じる。いくつかの実施形態では、本開示の組成物（例えば、ワクチン）は、Ｔｈ１７応答を生じる。いくつかの実施形態では、本開示の組成物（例えば、ワクチン）は、Ｔｈ１及びＴｈ２応答、Ｔｈ１及びＴｈ１７応答、Ｔｈ２及びＴｈ１７応答、またはＴｈ１、Ｔｈ２、及びＴｈ１７応答を生成する。
いくつかの実施形態では、抗原特異的免疫応答は、本明細書で提供される組成物を投与された対象において産生された抗百日咳抗原抗体力価を測定することによって特徴付けられる。いくつかの実施形態では、抗原特異的免疫応答は、本明細書で提供される組成物を投与された対象において産生された抗ジフテリア抗原抗体力価を測定することによって特徴付けられる。いくつかの実施形態では、抗原特異的免疫応答は、本明細書で提供される組成物を投与された対象において産生された抗破傷風抗原抗体力価を測定することによって特徴付けられる。抗体力価とは、対象内にある抗体、例えば、特定の抗原または抗原のエピトープに特異的な抗体の量の測定値である。抗体力価は、典型的には、陽性結果をもたらす最大希釈度の逆数として表される。例えば、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）とは、例えば、抗体力価を定量するための一般的なアッセイである。
目的のコードされた抗原、例えば、百日咳抗原、ジフテリア抗原、または破傷風抗原に対する抗体を測定するために、様々な血清学的試験が使用され得る。これらの試験には、赤血球凝集阻害試験、補体結合試験、蛍光抗体試験、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、及びプラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）が含まれる。これらの各試験は、様々な抗体活性を測定する。例示的な実施形態では、プラーク減少中和試験、またはＰＲＮＴ（例えば、ＰＲＮＴ５０またはＰＲＮＴ９０）は、防御の血清学的相関物として使用される。ＰＲＮＴは、インビトロウイルス中和の生物学的パラメータを測定し、特定のクラスのウイルスの中で最も血清学的にウイルス特異的な試験であり、ウイルス感染からの保護の血清レベルとよく相関する。ＰＲＮＴの基本設計では、試験管またはマイクロタイタープレートでウイルスと抗体の相互作用を行うことを可能にし、これによってウイルス感受性細胞、好ましくは哺乳類由来の細胞に混合物をプレーティングすることで、ウイルス感染性に対する抗体の影響を測定する。細胞は、子孫ウイルスの伝播を制限する半固体培地で覆われている。生産的な感染を開始する各ウイルスは、様々な方法で検出され得る局所的な感染領域（プラーク）を生成する。プラークを数え、ウイルスの開始濃度に戻って比較して、ウイルスの総感染力の低下率を決定する。ＰＲＮＴでは、通常、試験される血清試料は、標準化された量のウイルスと混合する前に段階希釈される。ウイルスの濃度は一定に保たれているため、感受性の高い細胞に添加して半固形培地をかぶせると、個々のプラークを識別して数えることができる。このようにして、ＰＲＮＴエンドポイント力価は、ウイルス活性の任意の選択されたパーセント減少で各血清試料に対して計算され得る。
ワクチンの免疫原性を評価することを目的とした機能アッセイでは、抗体滴定の血清試料希釈系列は、理想的には「血清防御」閾値力価未満で開始する必要がある。百日咳中和抗体、ジフテリア中和抗体、または破傷風中和抗体に関して、ある特定の実施形態では、１：１０という血清陽性の閾値は、血清保護閾値とみなすことができる。
ＰＲＮＴエンドポイント力価は、プラーク数の望ましい減少率を示す最後の血清希釈の逆数として表される。ＰＲＮＴ力価は、プラーク数の５０％以上の減少（ＰＲＮＴ５０）に基づいて計算することができる。ＰＲＮＴ５０力価は、ワクチン血清に対してより高いカットオフ（例えば、ＰＲＮＴ９０）を使用する力価よりも優先され、滴定曲線の線形部分からより正確な結果を提供する。
ＰＲＮＴ力価を計算する方法にはいくつかある。力価を計算するための最も簡単で最も広く使用されている方法は、プラークを数え、最後の血清希釈の逆数として力価を報告して、入力プラークの逆滴定に基づく入力プラーク数の５０％超の減少を示すことである。いくつかの血清希釈からのカーブフィッティング法を使用すると、より正確な結果を計算できる場合がある。これに利用可能な様々なコンピュータ分析プログラムがある（例えば、ＳＰＳＳまたはＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ）。
いくつかの実施形態では、抗体力価は、対象が感染症に罹ったか否かを評価するため、または免疫化が必要か否かを判断するために使用される。いくつかの実施形態では、抗体力価は、自己免疫応答の強さを定量するため、ブースター免疫が必要か否かを判断するため、以前のワクチンが有効だった否かを判断するため、及び最近または過去の感染を確認するために使用される。本開示によれば、抗体力価は、組成物（例えば、ＲＮＡワクチン）によって対象において誘導された免疫応答の強さを定量するために使用され得る。
いくつかの実施形態では、対象において産生される抗百日咳抗原抗体力価、抗ジフテリア抗原抗体力価、または抗破傷風抗原抗体力価は、対照と比較して少なくとも１ｌｏｇ増大される。例えば、対象において産生される抗百日咳抗原抗体力価、抗ジフテリア抗原抗体力価、または抗破傷風抗原抗体力価は、対照と比較して少なくとも１．５、少なくとも２、少なくとも２．５、または少なくとも３ｌｏｇ増大され得る。いくつかの実施形態では、対象において産生される抗百日咳抗原抗体力価、抗ジフテリア抗原抗体力価、または抗破傷風抗原抗体力価は、対照と比較して少なくとも１、１．５、２、２．５、または３ｌｏｇ増大される。いくつかの実施形態では、対象において産生される抗百日咳抗原抗体力価、抗ジフテリア抗原抗体力価、または抗破傷風抗原抗体力価は、対照と比較して１～３ｌｏｇ増大される。例えば、対象に産生される抗百日咳抗原抗体力価、抗ジフテリア抗原抗体力価、または抗破傷風抗原抗体力価は、対照と比較して１～１．５、１～２、１～２．５、１～３、１．５～２、１．５～２．５、１．５～３、２～２．５、２～３、または２．５～３ｌｏｇ増大され得る。
いくつかの実施形態では、対象において産生される抗百日咳抗原抗体力価、抗ジフテリア抗原抗体力価、または抗破傷風抗原抗体力価は、対照と比較して少なくとも２倍増大される。例えば、対象において産生される抗百日咳抗原抗体力価、抗ジフテリア抗原抗体力価、または抗破傷風抗原抗体力価は、対照と比較して、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、または少なくとも１０倍増大され得る。いくつかの実施形態では、対象において産生される抗百日咳抗原抗体力価、抗ジフテリア抗原抗体力価、または抗破傷風抗原抗体力価は、対照と比較して２、３、４、５、６、７、８、９、または１０倍増大される。いくつかの実施形態では、対象において産生される抗百日咳抗原抗体力価、抗ジフテリア抗原抗体力価、または抗破傷風抗原抗体力価は、対照と比較して２～１０倍増大される。例えば、対象において産生される抗百日咳抗原抗体力価、抗ジフテリア抗原抗体力価、または抗破傷風抗原抗体力価は、対照と比較して２～１０、２～９、２～８、２～７、２～６、２～５、２～４、２～３、３～１０、３～９、３～８、３～７、３～６、３～５、３～４、４～１０、４～９、４～８、４～７、４～６、４～５、５～１０、５～９、５～８、５～７、５～６、６～１０、６～９、６～８、６～７、７～１０、７～９、７～８、８～１０、８～９、または９～１０倍増大され得る。
いくつかの実施形態では、抗原特異的免疫応答は、百日咳、ジフテリア、及び／または破傷風に対する血清中和抗体力価の幾何平均力価（ＧＭＴ）の比（幾何平均比（ＧＭＲ）と称される）として測定される。幾何平均力価（ＧＭＴ）は、全ての値を掛け合わせ、その数値のｎ乗根（ｎは利用可能なデータを有する対象数である）をとることによって算出される、対象の群における平均抗体力価である。
対照は、いくつかの実施形態では、組成物（例えば、ＲＮＡワクチン）を投与されていない対象において産生される抗百日咳抗原抗体力価、抗ジフテリア抗原抗体力価、または抗破傷風抗原抗体力価である。いくつかの実施形態では、対照は、組換えまたは精製されたタンパク質ワクチンを投与された対象において産生される抗百日咳抗原抗体力価、抗ジフテリア抗原抗体力価、または抗破傷風抗原抗体力価である。組換えタンパク質ワクチンは、通常、異種発現系（例えば、細菌または酵母）で産生されたか、または大量の病原性生物から精製されたタンパク質抗原を含む。
いくつかの実施形態では、組成物（例えば、ＲＮＡワクチン）が有効となる能力は、マウスモデルで測定される。例えば、組成物は、マウスモデルに投与され得、マウスモデルを中和抗体力価の誘導について評価される。また、細菌チャレンジ研究も、本開示のワクチンの有効性を評価するために使用され得る。例えば、組成物は、マウスモデルに投与され得、そのマウスモデルを細菌でチャレンジし、そのマウスモデルを生存及び／または免疫応答（例えば、中和抗体応答、Ｔ細胞応答（例えば、サイトカイン応答））について評価される。
いくつかの実施形態では、組成物（例えば、ＲＮＡワクチン）の有効量は、組換えタンパク質ワクチンの標準治療用量と比較して低減された用量である。本明細書で使用する「標準治療」とは、医学的または心理学的な治療ガイドラインを指し、一般的または具体的であり得る。「標準治療」は、科学的根拠及び所与の状態の治療に携わる医療従事者間の協力に基づいた適切な治療を指す。それは、医師／臨床医がある特定のタイプの患者、病気、または臨床状況に対し従うべき診断及び治療のプロセスである。本明細書で使用する「標準治療用量」とは、医師／臨床医または他の医療専門家が、百日咳、ジフテリア、及び／または破傷風感染症、または関連する状態を治療または予防するための標準治療ガイドラインに従いながら、百日咳、ジフテリア、及び／または破傷風感染症、または関連する状態を治療または予防するために対象に投与する、組換えもしくは精製タンパク質ワクチン、または生弱毒化もしくは不活化ワクチン、またはＶＬＰワクチンの用量を指す。
いくつかの実施形態では、有効量の組成物を投与された対象において産生される抗百日咳抗原抗体力価、抗ジフテリア抗原抗体力価、または抗破傷風抗原抗体力価は、組換えもしくは精製されたタンパク質ワクチン、または生弱毒化もしくは不活性化ワクチン、またはＶＬＰワクチンの標準的なケア用量を投与された対照対象において産生される抗百日咳抗原抗体力価、抗ジフテリア抗原抗体力価、または抗破傷風抗原抗体力価と同等である。
ワクチン有効性は、標準的な分析を使用して評価され得る（例えば、Ｗｅｉｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ．２０１０ Ｊｕｎ１；２０１（１１）：１６０７－１０を参照されたい）。例えば、ワクチン効果は、二重盲検ランダム化対照臨床試験で測定され得る。ワクチン効果は、ワクチン非接種試験コホートの罹患率（ＡＲＵ）とワクチン接種試験コホートの罹患率（ＡＲＶ）との間の疾患罹患率（ＡＲ）の比例的減少として表され得、以下の式を用いてワクチン接種群の疾患の相対リスク（ＲＲ）から算出し得る。
有効性＝（ＡＲＵ－ＡＲＶ）／ＡＲＵ×１００、及び
効果＝（１－ＲＲ）×１００。
同様に、ワクチン有効性は、標準的な分析を使用して評価することができる（例えば、Ｗｅｉｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ．２０１０ Ｊｕｎ１；２０１（１１）：１６０７－１０を参照されたい）。ワクチンの有効性とは、ワクチン（高いワクチン効果を有することが既に判明している場合もある）が集団の中でどのように疾患を低減するかを評価するものである。この尺度は、対照臨床試験ではなく、自然現場条件下で、ワクチン自体だけでなく、ワクチン接種プログラムの利益と副作用との正味のバランスを評価することができる。ワクチン有効性は、ワクチン有効性（効力）に比例するがまた、集団内の標的群の免疫化の程度、ならびに入院、外来訪問、または費用の「現実世界」の結果に影響を与える他の非ワクチン関連因子によって影響を受ける。例えば、後ろ向きケースコントロール解析が使用され得、ここでは、感染症例のセット及び適切な対照におけるワクチン接種率が比較される。ワクチン有効性は、ワクチン接種したにもかかわらず感染症を発症したオッズ比（ＯＲ）の使用により、割合の差として表され得る。
有効性＝（１－ＯＲ）×１００
いくつかの実施形態では、組成物（例えば、ＲＮＡワクチン）の有効性は、ワクチン未接種対照の対象に対し少なくとも６０％である。例えば、組成物の有効性は、ワクチン未接種対照の対象に対し少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％であり得る。
殺菌免疫。殺菌免疫とは、宿主への有効な病原体感染を防止する固有の免疫状態を指す。いくつかの実施形態では、本開示の組成物の有効量は、少なくとも１年間、対象における殺菌免疫をもたらすのに十分である。例えば、本開示の組成物の有効量は、少なくとも２年間、少なくとも３年間、少なくとも４年間、少なくとも５年間、少なくとも６年間、少なくとも７年間、少なくとも８年間、少なくとも９年間、少なくとも１０年間、対象内の殺菌免疫をもたらすのに十分である。いくつかの実施形態では、本開示の組成物の有効量は、対照よりも少なくとも５倍低い用量で対象内の殺菌免疫をもたらすのに十分である。例えば、有効量は、対照よりも少なくとも１０倍、１５倍、または２０倍低い用量でも対象における殺菌免疫をもたらすのに十分であり得る。
検出可能な抗原。いくつかの実施形態では、本開示の組成物の有効量は、投与の１～７２時間後の対象の血清において測定して、検出可能なレベルの百日咳、ジフテリア、及び／または、破傷風抗原を産生するのに十分である。
力価。抗体力価とは、対象内の抗体、例えば、特定の抗原（例えば、抗百日咳抗原、抗ジフテリア抗原、または抗破傷風抗原）に特異的である抗体の数の測定値である。抗体力価は、典型的には、陽性結果をもたらす最大希釈度の逆数として表される。例えば、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）とは、例えば、抗体力価を定量するための一般的なアッセイである。
いくつかの実施形態では、本開示の組成物の有効量は、投与してから１～７２時間後の対象の血清中の測定において、特異抗原に対する中和抗体によって産生される１，０００～１０，０００の中和抗体力価を産生するのに十分である。いくつかの実施形態では、有効量は、投与してから１～７２時間後の対象の血清中の測定において、特異抗原に対する中和抗体によって産生される１，０００～５，０００の中和抗体力価を産生するのに十分である。いくつかの実施形態では、有効量は、投与してから１～７２時間後の対象の血清中の測定において、特異抗原に対する中和抗体によって産生される５，０００～１０，０００の中和抗体力価を産生するのに十分である。
いくつかの実施形態では、中和抗体力価は、少なくとも１００ＮＴ５０である。例えば、中和抗体力価は、少なくとも２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００ＮＴ５０であり得る。いくつかの実施形態では、中和抗体力価は、少なくとも１０，０００ＮＴ５０である。
いくつかの実施形態では、中和抗体力価は、少なくとも１００中和単位／ミリリットル（ＮＵ／ｍＬ）である。例えば、中和抗体力価は、少なくとも２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００ＮＵ／ｍＬであり得る。いくつかの実施形態では、中和抗体力価は、少なくとも１０，０００ＮＵ／ｍＬである。
いくつかの実施形態では、対象において産生される抗百日咳抗原抗体力価、抗ジフテリア抗原抗体力価、または抗破傷風抗原抗体力価は、対照と比較して、少なくとも１ｌｏｇ増大される。例えば、対象において産生される抗百日咳抗原抗体力価、抗ジフテリア抗原抗体力価、または抗破傷風抗原抗体力価は、対照と比較して少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０ｌｏｇ増大され得る。
いくつかの実施形態では、対象において産生される抗百日咳抗原抗体力価、抗ジフテリア抗原抗体力価、または抗破傷風抗原抗体力価は、対照と比較して、少なくとも２倍増大される。例えば、対象において産生される抗百日咳抗原抗体力価、抗ジフテリア抗原抗体力価、または抗破傷風抗原抗体力価は、対照と比較して少なくとも３、４、５、６、７、８、９、または１０倍増大される。
いくつかの実施形態では、ｎ個の数の積のｎ乗根である幾何平均を、比例増殖を説明するために一般的に使用する。幾何平均は、いくつかの実施形態では、対象において産生される抗体力価を特性評価するために使用される。
対照は、例えば、ワクチン未接種の対象、または全細胞細菌ワクチンもしくは非細胞ワクチン（例えば、ＤＴａＰまたはＴｄａｐ）を投与された対象であり得る。
実施例１．ｍＲＮＡワクチン（単一抗原）のインビボ研究
ｍＲＮＡワクチンの効果を研究するために、マウスに、陰性対照（ワクチンなし、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓなし）、陽性対照（ワクチンなし、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓに感染）、または脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）で製剤化されたｍＲＮＡ百日咳ワクチン（５０μＬの筋肉内注射）を０日目に注射した。２８日後、異なる群は、ブースター用量を受けた。最初のワクチン接種から５６日後、マウスに、２×１０７ＣＦＵのＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓをチャレンジした。チャレンジから３日後（初回ワクチン接種から５９日後）、マウスの細菌負荷、血清学的応答、及び免疫プロファイルを調べた。
各ワクチンでは、０．５～１５％のＰＥＧ修飾脂質、５～２５％の非カチオン性脂質、２５～５５％のステロール、及び２０～６０％のイオン化可能なカチオン性脂質を含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中にｍＲＮＡを製剤化する。ＰＥＧ修飾脂質は、例えば、１，２ジミリストイル－ｓｎ－グリセロール、メトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ２０００ ＤＭＧ）であり、非カチオン性脂質は、１，２ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）であり、ステロールは、コレステロールであり、イオン化可能なカチオン性脂質は、化合物１の構造を有する。
個々の百日咳毒素（Ｃ１８０、ＰＴＸ、ＲＴＸ、及びＡＣＴ－ＣＡＴ）、異なる接着タンパク質（ＦＨＡ１、ＦＨＡ２、ＦＨＡ３、ＦＨＡ４、ＰＲＮ、及びＢｒｋＡ）を発現するｍＲＮＡワクチンを設計し、合成した。Ｖａｇ１、ＴｃｆＡ、ＳｐｈＢ２、Ｆｉｍ、ＰＴ－ａｌｕｍ（遺伝的に解毒、１．２５μｇ）、ｗＰ（１／２０ヒト用量）、及びＤＴａＰ（１／２０ヒト用量）を含む他の抗原及び対照も生成した。測定した毒素エンドポイントには、総白血球、好中球、及びリンパ球、全身ＩＬ－６（炎症を示す）、体重減少、ならびにＰＴ及びＡＣＴ中和が含まれた。毒素結合ＥＬＩＳＡもまた、実施した。接着／表面抗原エンドポイントは、肺及び鼻の細菌負荷、全身ＩＬ－６、毒素結合ＥＬＩＳＡ、及び生のＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ染色（ＯＰＡサロゲートとして）のとおりであった。
結果を、図１～７Ｂに示す。図１は、異なる群間の体重変化率（体重減少）を示す。全ての毒素ｍＲＮＡ構築物は、プラセボの平均体重減少よりも少ない平均体重減少を示した。図２に示されるように、毒素ｍＲＮＡ構築物はまた、プラセボと比較して減少した細胞数（白血球、好中球、及びリンパ球）を示した。試料中のＩＬ－６の濃度を示す図３は、毒素ｍＲＮＡ構築物が、１／２０のＤＴａＰ用量のものと同等の全身性炎症を予防することを示す。気管、肺、及び鼻洗浄中の細菌負荷を決定した。図４及び５に示されるように、ＴＣＦＡ、ＳＰＨＢ１、ＦＨＡ３、及びＦＩＭ３は、肺／鼻細菌負荷に影響を及ぼすことが見出された。図６Ａ～６Ｂは、毒素ｍＲＮＡ構築物ブースターの投与後（図６Ａ）、次いでチャレンジ後（図６Ｂ）の抗体力価を示す。Ｃ１８０及びＰＴＸは、ＲＴＸ及びその触媒ドメイン構築物と同様に、毒素媒介性病理を予防することが見出された（図６Ａ）。更に、分泌された抗原（細胞外百日咳タンパク質、１００タンパク質）に対する抗体力価を調べ（図７Ａ）、抗体力価が、対照と比較して、ほとんどのｍＲＮＡ構築物において増加したことが見出された。生のボルデテラ百日咳結合アッセイを行ったとき、ｍＲＮＡ構築物中の抗体力価も、対照と比較して増加した（図７Ｂ）。
マウス実験は、ｍＲＮＡ発現の百日咳毒素構築物が、毒素媒介性病理を予防することができることを示した（例えば、Ｃ１８０及びＰＴＸを参照されたい）。更に、ＴＣＦＡ、ＳＰＨＢ１、ＦＨＡ３、及びＦＩＭ３は、肺／鼻細菌負荷に影響を及ぼすことが見出された。
実施例２．ｍＲＮＡワクチンのインビボ研究（抗原の組み合わせ）
ｍＲＮＡワクチンの効果を研究するために、マウスに、陰性対照（ワクチンなし、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓなし）、陽性対照（ワクチンなし、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓに感染）、または脂質ナノ粒子を含むｍＲＮＡ百日咳ワクチン（５０μＬの筋肉内注射）を０日目に注射した。２８日後、異なる群は、ブースター用量を受けた。最初のワクチン接種から５６日後、マウスに、２×１０７ＣＦＵのＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓをチャレンジした。チャレンジから３日後（初回ワクチン接種から５９日後）、マウスの細菌負荷、血清学的応答、及び免疫プロファイルを調べた。
各ワクチンでは、０．５～１５％のＰＥＧ修飾脂質、５～２５％の非カチオン性脂質、２５～５５％のステロール、及び２０～６０％のイオン化可能なカチオン性脂質を含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中にｍＲＮＡを製剤化する。ＰＥＧ修飾脂質は、例えば、１，２ジミリストイル－ｓｎ－グリセロール、メトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ２０００ ＤＭＧ）であり、非カチオン性脂質は、１，２ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）であり、ステロールは、コレステロールであり、イオン化可能なカチオン性脂質は、化合物１の構造を有する。
異なる百日咳抗原または異なる百日咳抗原の組み合わせを発現するｍＲＮＡワクチンを設計し、合成した。試験した群及び投与したｍＲＮＡの用量を、以下の表に示す。
百日咳毒素（ＰＴ）に対する血清ＩｇＧ抗体力価を、０．１μｇ／ｍＬのＰＴでコーティングしたプレートを使用して、ＥＬＩＳＡによって測定した。データを図８に示し、全細胞ワクチン（ｗＰ）及び対照のＩｇＧ抗体力価を上回って試験した全てのワクチン群においてＩｇＧ抗体力価が増加したことを示す。抗体力価の増加は、偽ワクチン接種群と比較して、Ｃ１８０＋ＦＨＡ３＋ＦＩＭ２＋ＳＰＨＢ１（ｐ＜０．００５）及びＣ１８０＋ＦＨＡ３＋ＦＩＭ２＋ＳＰＨＢ１＋ＲＴＸ＋ＴＣＦＡ（ｐ＜０．００５）ならびにＣ１８０＋ＦＨＡ３＋ＦＩＭ２（ｐ＜０．０００５）組み合わせワクチン、ならびに無細胞ワクチン（ａＰ；ｐ＜０．０００５）において統計的に有意であった。第２のＥＬＩＳＡを実施して、ＵＴ２５（「全バグ」百日咳）に対する血清ＩｇＧ抗体力価を調べた。０．２４３ＯＤでＵＴ２５でプレートをコーティングした。結果を図９に示し、偽ワクチン接種群のＩｇＧ抗体力価を上回る各群においてＩｇＧ抗体力価が上昇したことを示す。特に、ＦＨＡ３＋ＦＩＭ２＋ＳＰＨＢ１＋ＴＣＦＡ（ｐ＜０．０５）、Ｃ１８０＋ＦＨＡ３＋ＦＩＭ２＋ＳＰＨＢ１（ｐ＜０．００５）、無細胞ワクチン（ａＰ；ｐ＜０．００５）、全細胞ワクチン（ｗＰ；ｐ＜０．０００５）、Ｃ１８０＋ＦＨＡ３＋ＦＩＭ２（ｐ＜０．０００５）、及びＣ１８０＋ＦＨＡ３＋ＦＩＭ２＋ＰＲＮ（ｐ＜０．０００５）群は、偽ワクチン接種群と比較して統計的に有意な増加を示した。
試験動物の肺、気管、及び鼻の細菌負荷も測定し、結果を図１０Ａ（肺及び気管）及び図１０Ｂ（鼻）に示す。チャレンジ用量は、有意義な鼻の測定には低すぎたが、図１０Ａに示されるように、組み合わせワクチンのうちの４つ：Ｃ１８０＋ＴＣＦＡ＋ＦＩＭ２、Ｃ１８０＋ＦＨＡ３＋ＦＩＭ２＋ＰＲＮ、Ｃ１８０＋ＦＨＡ３＋ＦＩＭ２＋ＳＰＨＢ１、及びＣ１８０＋ＦＨＡ３＋ＦＩＭ２＋ＳＰＨＢ１＋ＲＴＸ＋ＴＣＦＡは、統計的に有意に減少した細菌負荷（肺及び気管）を有した。
実施例１及び２の研究の要約（２つの異なる投与量で単一の抗原を比較する）を以下に提示し、ここで、「Ｘ」は、値がｗＰ／ａＰ対照よりも低かったことを表し、「ＸＸ」は、値がｗＰ／ａＰ対照と同等またはより良好であったことを表し、無印は、活性がなかったことを示す。
抗原組み合わせ結果の要約を以下の表に示す（Ｘ」は、値がｗＰ／ａＰ対照よりも低かったことを表し、「ＸＸ」は、値がｗＰ／ａＰ対照と同等またはより良好であったことを表し、無印は、活性がなかったことを示す）。
実施例３－マウスのインビボ免疫化（ジフテリア解毒毒素及び破傷風毒素断片Ｃ）
脂質ナノ粒子を用いたジフテリア及び破傷風ｍＲＮＡワクチンの効果を研究するために、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝５／群）を－３日目に予めブレンドし、次いで０日目にｍＲＮＡワクチン（５０μＬの筋肉内注射；０．５μｇ、２μｇ、または１０μｇのｍＲＮＡ濃度）を注射した。２７日目に、血清分析のために血液を採取した。初回免疫から２８日後、異なる群は、初回用量と同じ量のブースター用量を受けた。初回ワクチン接種から５６日後、血液を採取した。
各ワクチンでは、０．５～１５％のＰＥＧ修飾脂質、５～２５％の非カチオン性脂質、２５～５５％のステロール、及び２０～６０％のイオン化可能なカチオン性脂質を含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中にｍＲＮＡを製剤化する。ＰＥＧ修飾脂質は、例えば、１，２ジミリストイル－ｓｎ－グリセロール、メトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ２０００ ＤＭＧ）であり、非カチオン性脂質は、１，２ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）であり、ステロールは、コレステロールであり、イオン化可能なカチオン性脂質は、化合物１の構造を有する。
破傷風毒素断片Ｃ（ＦｒａｇＣ＿ＮＧＭ）と同様に、２つの異なるジフテリア解毒毒素（Ｋ５１Ｅ＿ＮＧＭ及びＣＲＭ１９７＿ＮＧＭ）を試験した。天然ジフテリア毒素（変異Ｇ５２Ｅ）タンパク質及び１ｕｇ／ｍｌでコーティングした破傷風トキソイドを使用して、採取した血清上でＥＬＩＳＡを行った。図１１Ａに示されるように、ＣＲＭ１９７解毒ジフテリア毒素は、全ての用量レベルにわたって、Ｋ５１Ｅ解毒ジフテリア毒素よりも高い結合力価を誘発した。破傷風において、ＦｒａｇＣは、試験された全ての用量レベルにわたって同様の力価を誘発した（図１１Ｂ）。１０μｇの用量での各ワクチンにおけるＩＣ５０値を比較し（図１２）、同じ傾向を示した。
実施例４－ｍＲＮＡワクチン製剤の免疫原性及び有効性
マウスモデルにおいて、ｍＲＮＡワクチン製剤の免疫原性及び有効性を試験した。簡潔には、４週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃマウスを、０日目にプライミング用量のワクチン、及び２８日目にブースト用量で免疫化した。群を、以下の表に示す。各用量を、５０μＬの用量として、対象の脚に筋肉注射で投与した。
５３日目、５８日目（群１～５、１０、１６～１９）及び５９日目（群６～９、１１～１５）に血液試料を採取し、対象を５５日目（群１～５、１０、１６～１９）または５６日目（群６～９、１１～１５）にＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ（株ＵＴ２５）でチャレンジした。
データを、図１３～図２７に示す。図１３は、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓチャレンジから３日後の肺及び気管試料中のコロニー形成単位（ＣＦＵ）を示す。データは、ＣＦＵが、併用群と比較して、単一の抗原製剤群で有意に増加したことを示す。図１４は、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓチャレンジから３日後からの鼻洗浄データを示す。群間で有意差はなかった。図１５は、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓチャレンジから３日後からの鼻関連リンパ組織に存在するＣＦＵを示す。全ての併用ワクチンは、偽ワクチン接種群及び全細胞百日咳ワクチン群（ｗＰ）よりも有意に少ないＣＦＵ／ｍＬを示した。
図１６は、チャレンジの日とチャレンジ後３日間との間のマウス体重変化の割合を示す。最大の体重減少は、ｗＰ群で観察されたが、併用ワクチン及びＤＴａＰのいくつかは、より少ない体重減少を有した。
図１７は、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓチャレンジから３日後の異なる免疫群間の完全な白血球数を示す。群間で有意差はなかった。図１８は、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓチャレンジから３日後の異なる免疫群間の好中球数を示す。Ｈｅｍａｖｅｔを使用して、好中球数を決定した。群間に有意差は認められなかった。図１９は、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓチャレンジから３日後の異なる免疫群間のリンパ球数を示す。Ｈｅｍａｖｅｔを使用して、リンパ球数を決定した。群間に有意差は認められなかった。図２０は、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓチャレンジから３日後の異なる免疫群間の単球数を示す。Ｈｅｍａｖｅｔを使用して、ｍｏｎｃｙｔｅ数を決定した。群間に有意差は認められなかった。図２１は、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓチャレンジから３日後の異なる免疫群間の好酸球数を示す。Ｈｅｍａｖｅｔを使用して、好酸球数を決定した。群間に有意差は認められなかった。
図２２は、全バグ（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ株ＵＴ２５）に対する血清抗体（ＩｇＧ）力価を示す。０．２４５ＯＤでＵＴ２５でプレートをコーティングし、ＥＬＩＳＡアッセイを使用して抗体力価を決定した。非ワクチン接種陰性対照（ＮＶＮＣ）及び偽ワクチン接種対照に対して有意差が観察された。図２３は、チャレンジから３日後の百日咳毒素（ＰＴ）に対する血清抗体（ＩｇＧ）力価を示す。０．１μｇ／ｍＬのＰＴ（Ｌｉｓｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ＃１８１）でプレートをコーティングし、ＥＬＩＳＡアッセイを使用して抗体力価を決定した。ｗＰワクチン接種群を除き、実験群と対照群との間に有意差が認められた。図２４は、チャレンジから３日後のジフテリア毒素に対する血清抗体（ＩｇＧ）力価を示す。０．１μｇ／ｍＬのジフテリア毒素（Ａｂｃａｍ １８８５０５）でプレートをコーティングし、ＥＬＩＳＡアッセイを使用して抗体力価を決定した。試験した製剤のうちの２つについて、有意な増加が観察された。図２５は、チャレンジから３日後の破傷風毒素に対する血清抗体（ＩｇＧ）力価を示す。０．１μｇ／ｍＬの破傷風毒素（ＥＮＺＯ ＡＬＸ６３０１０８）でプレートをコーティングし、ＥＬＩＳＡアッセイを使用して抗体力価を決定した。試験した単一製剤について、有意な増加が観察されたが、併用ワクチンについては観察されなかった。
チャレンジから３日後に、肺上清（図２６）及び血清（図２７）中のＩＬ－６レベルを測定した。単一スポット９６ウェルプレートを用いて、試料中のＩＬ－６サイトカインレベルを決定した。ｍＲＮＡワクチンを投与した対象からの全ての試料において、ＩＬ－６の減少が観察された。
実施例５－異なる臨床的分離株に対する１０個の抗原を含むｍＲＮＡワクチンの免疫原性
１０個の異なる抗原（８個の百日咳関連抗原、ならびにジフテリア抗原及び破傷風抗原）を含み、各々が、個々のｍＲＮＡ分子を合成し、次いで、同じ脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤に組み合わされる、ｍＲＮＡワクチン（「ｍＲＮＡ－ＤＴＰ－１０」）の免疫原性及び有効性。ＬＮＰ製剤は、化合物１、ＤＳＰＣ、ＰＥＧ修飾脂質、及びコレステロールを含む。ＤＴａＰワクチン、全細胞ワクチン（ＳＩ ＷＣＶ）、及び陽性対照（ＭＣＶ－ＵＴ２５及びＭＣＶ－Ｄ４２０）を含む他のワクチン製剤を試験した。
簡潔には、約４週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃマウスを、０日目にワクチン接種し、次いで３０日目にブースト用量のワクチンを受けた。４４日目に、マウスをＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ（株ＵＴ２５またはＤ４２０）でチャレンジした。３日後、血清学、全血球計算（ＣＢＣ）分析、及びコロニー形成単位（ＣＦＵ）を計数するために試料を採取した。
最初の（プライミング）ワクチン接種から２週間後の抗Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ抗体（ＩｇＧ）力価を、図２８に示す。全ての群と対照（ＮＶ）との間に統計的に有意な差が観察され、ｍＲＮＡワクチンは最高の抗原特異的抗体力価を有した。
次に、チャレンジ後１、３、及び７日目のマウス肺及び気管試料（下気道を表す）中のＣＦＵを測定した。同様の相対結果が、試験した株（ＵＴ２５及びＤ４２０）の各々について注目された：ｍＲＮＡワクチン製剤は、各時点において、及び試験した各株を用いて有意に低いＣＦＵ数を得た（図２９Ａ～２９Ｃ）。結果の時間経過を、図３０Ａ（ＵＴ２５）及び図３０Ｂ（Ｄ４２０）に示す。
追加の配列
本明細書に記載のｍＲＮＡ配列のうちのいずれかが５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲを含み得ることが理解されるべきである。ＵＴＲ配列は、以下の配列から選択され得るか、または他の既知のＵＴＲ配列が使用され得る。また、本明細書に記載のｍＲＮＡ構築物のうちのいずれかは、ポリ（Ａ）テール及び／またはキャップ（例えば、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮｐ）を更に含み得ることが理解されるべきである。更に、本明細書に記載のｍＲＮＡ及びコードされた抗原配列のうちの多くが、シグナルペプチド及び／またはペプチドタグ（例えば、Ｃ末端Ｈｉｓタグ）を含むが、示されたシグナルペプチド及び／またはペプチドタグが、異なるシグナルペプチド及び／またはペプチドタグに置換されても、シグナルペプチド及び／またはペプチドタグが省略され得ることが理解されるべきである。
５’ＵＴＲ：ＧＧＧＡＡＡＵＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ（配列番号９９）
５’ＵＴＲ：ＧＧＧＡＡＡＵＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＣＣＣＣＧＧＣＧＣＣＧＣＣＡＣＣ（配列番号２）
３’ＵＴＲ：ＵＧＡＵＡＡＵＡＧＧＣＵＧＧＡＧＣＣＵＣＧＧＵＧＧＣＣＡＵＧＣＵＵＣＵＵＧＣＣＣＣＵＵＧＧＧＣＣＵＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＵＣＣＵＣＣＣＣＵＵＣＣＵＧＣＡＣＣＣＧＵＡＣＣＣＣＣＧＵＧＧＵＣＵＵＵＧＡＡＵＡＡＡＧＵＣＵＧＡＧＵＧＧＧＣＧＧＣ（配列番号１００）
３’ＵＴＲ：ＵＧＡＵＡＡＵＡＧＧＣＵＧＧＡＧＣＣＵＣＧＧＵＧＧＣＣＵＡＧＣＵＵＣＵＵＧＣＣＣＣＵＵＧＧＧＣＣＵＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＵＣＣＵＣＣＣＣＵＵＣＣＵＧＣＡＣＣＣＧＵＡＣＣＣＣＣＧＵＧＧＵＣＵＵＵＧＡＡＵＡＡＡＧＵＣＵＧＡＧＵＧＧＧＣＧＧＣ（配列番号４）

Claims (147)

  1. 組成物であって、
    百日咳毒素抗原ポリペプチド、オートトランスポーターサブチリシン様プロテアーゼ（ＳＰＨＢ１）抗原ポリペプチド、気管コロニー形成因子Ａ（ＴＣＦＡ）抗原ポリペプチド、繊維状赤血球凝集素（ＦＨＡ）抗原ポリペプチド、パータクチン（ＰＲＮ）抗原ポリペプチド、線毛（ＦＩＭ）抗原ポリペプチド、アデニル酸シクラーゼ抗原ポリペプチド、ボルデテラ菌の殺傷抵抗性（Ｂｒｋ）抗原ポリペプチド、及び病原性関連遺伝子８（Ｖａｇ８）抗原ポリペプチドからなる群から選択されるＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ抗原ポリペプチドをコードする少なくとも１つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有する少なくとも１つのメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む、前記組成物。
  2. 少なくとも２つのメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドであって、各々が、少なくとも１つのＯＲＦを有し、かつ各々が、百日咳毒素抗原ポリペプチド、オートトランスポーターサブチリシン様プロテアーゼ（ＳＰＨＢ１）抗原ポリペプチド、気管コロニー形成因子Ａ（ＴＣＦＡ）抗原ポリペプチド、繊維状赤血球凝集素（ＦＨＡ）抗原ポリペプチド、パータクチン（ＰＲＮ）抗原ポリペプチド、線毛（ＦＩＭ）抗原ポリペプチド、アデニル酸シクラーゼ抗原ポリペプチド、ボルデテラ菌の殺傷抵抗性（Ｂｒｋ）抗原ポリペプチド、及び病原性関連遺伝子８（Ｖａｇ８）抗原ポリペプチドからなる群から選択されるＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ抗原ポリペプチドをコードする、前記少なくとも２つのメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む、請求項１に記載の組成物。
  3. 少なくとも３つのメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドであって、各々が、少なくとも１つのＯＲＦを有し、かつ各々が、百日咳毒素抗原ポリペプチド、オートトランスポーターサブチリシン様プロテアーゼ（ＳＰＨＢ１）抗原ポリペプチド、気管コロニー形成因子Ａ（ＴＣＦＡ）抗原ポリペプチド、繊維状赤血球凝集素（ＦＨＡ）抗原ポリペプチド、パータクチン（ＰＲＮ）抗原ポリペプチド、線毛（ＦＩＭ）抗原ポリペプチド、アデニル酸シクラーゼ抗原ポリペプチド、ボルデテラ菌の殺傷抵抗性（Ｂｒｋ）抗原ポリペプチド、及び病原性関連遺伝子８（Ｖａｇ８）抗原ポリペプチドからなる群から選択されるＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ抗原ポリペプチドをコードする、前記少なくとも３つのメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む、請求項１に記載の組成物。
  4. 少なくとも４つのメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドであって、各々が、少なくとも１つのＯＲＦを有し、かつ各々が、百日咳毒素抗原ポリペプチド、オートトランスポーターサブチリシン様プロテアーゼ（ＳＰＨＢ１）抗原ポリペプチド、気管コロニー形成因子Ａ（ＴＣＦＡ）抗原ポリペプチド、繊維状赤血球凝集素（ＦＨＡ）抗原ポリペプチド、パータクチン（ＰＲＮ）抗原ポリペプチド、線毛（ＦＩＭ）抗原ポリペプチド、アデニル酸シクラーゼ抗原ポリペプチド、ボルデテラ菌の殺傷抵抗性（Ｂｒｋ）抗原ポリペプチド、及び病原性関連遺伝子８（Ｖａｇ８）抗原ポリペプチドからなる群から選択されるＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ抗原ポリペプチドをコードする、前記少なくとも４つのメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む、請求項１に記載の組成物。
  5. 少なくとも５つのメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドであって、各々が、少なくとも１つのＯＲＦを有し、百日咳毒素抗原ポリペプチド、オートトランスポーターサブチリシン様プロテアーゼ（ＳＰＨＢ１）抗原ポリペプチド、気管コロニー形成因子Ａ（ＴＣＦＡ）抗原ポリペプチド、繊維状赤血球凝集素（ＦＨＡ）抗原ポリペプチド、パータクチン（ＰＲＮ）抗原ポリペプチド、線毛（ＦＩＭ）抗原ポリペプチド、アデニル酸シクラーゼ抗原ポリペプチド、ボルデテラ菌の殺傷抵抗性（Ｂｒｋ）抗原ポリペプチド、及び病原性関連遺伝子８（Ｖａｇ８）抗原ポリペプチドからなる群から選択されるＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ抗原ポリペプチドをコードする、前記少なくとも５つのメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む、請求項１に記載の組成物。
  6. 少なくとも６つのメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドであって、各々が、少なくとも１つのＯＲＦを有し、かつ各々が、百日咳毒素抗原ポリペプチド、オートトランスポーターサブチリシン様プロテアーゼ（ＳＰＨＢ１）抗原ポリペプチド、気管コロニー形成因子Ａ（ＴＣＦＡ）抗原ポリペプチド、繊維状赤血球凝集素（ＦＨＡ）抗原ポリペプチド、パータクチン（ＰＲＮ）抗原ポリペプチド、線毛（ＦＩＭ）抗原ポリペプチド、アデニル酸シクラーゼ抗原ポリペプチド、ボルデテラ菌の殺傷抵抗性（Ｂｒｋ）抗原ポリペプチド、及び病原性関連遺伝子８（Ｖａｇ８）抗原ポリペプチドからなる群から選択されるＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ抗原ポリペプチドをコードする、前記少なくとも６つのメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む、請求項１に記載の組成物。
  7. 少なくとも７つのメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドであって、各々が、少なくとも１つのＯＲＦを有し、かつ各々が、百日咳毒素抗原ポリペプチド、オートトランスポーターサブチリシン様プロテアーゼ（ＳＰＨＢ１）抗原ポリペプチド、気管コロニー形成因子Ａ（ＴＣＦＡ）抗原ポリペプチド、繊維状赤血球凝集素（ＦＨＡ）抗原ポリペプチド、パータクチン（ＰＲＮ）抗原ポリペプチド、線毛（ＦＩＭ）抗原ポリペプチド、アデニル酸シクラーゼ抗原ポリペプチド、ボルデテラ菌の殺傷抵抗性（Ｂｒｋ）抗原ポリペプチド、及び病原性関連遺伝子８（Ｖａｇ８）抗原ポリペプチドからなる群から選択されるＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ抗原ポリペプチドをコードする、前記少なくとも７つのメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む、請求項１に記載の組成物。
  8. 少なくとも８つのメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドであって、各々が、少なくとも１つのＯＲＦを有し、かつ各々が、百日咳毒素抗原ポリペプチド、オートトランスポーターサブチリシン様プロテアーゼ（ＳＰＨＢ１）抗原ポリペプチド、気管コロニー形成因子Ａ（ＴＣＦＡ）抗原ポリペプチド、繊維状赤血球凝集素（ＦＨＡ）抗原ポリペプチド、パータクチン（ＰＲＮ）抗原ポリペプチド、線毛（ＦＩＭ）抗原ポリペプチド、アデニル酸シクラーゼ抗原ポリペプチド、ボルデテラ菌の殺傷抵抗性（Ｂｒｋ）抗原ポリペプチド、及び病原性関連遺伝子８（Ｖａｇ８）抗原ポリペプチドからなる群から選択されるＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ抗原ポリペプチドをコードする、前記少なくとも８つのメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む、請求項１に記載の組成物。
  9. 組成物であって、
    少なくとも９つのメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドであって、各々が、少なくとも１つのＯＲＦを有し、かつ各々が、百日咳毒素抗原ポリペプチド、オートトランスポーターサブチリシン様プロテアーゼ（ＳＰＨＢ１）抗原ポリペプチド、気管コロニー形成因子Ａ（ＴＣＦＡ）抗原ポリペプチド、繊維状赤血球凝集素（ＦＨＡ）抗原ポリペプチド、パータクチン（ＰＲＮ）抗原ポリペプチド、線毛（ＦＩＭ）抗原ポリペプチド、アデニル酸シクラーゼ抗原ポリペプチド、ボルデテラ菌の殺傷抵抗性（Ｂｒｋ）抗原ポリペプチド、及び病原性関連遺伝子８（Ｖａｇ８）抗原ポリペプチドからなる群から選択される各々のＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ抗原ポリペプチドのうちの少なくとも１つをコードする、前記少なくとも９つのメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む、前記組成物。
  10. 前記百日咳毒素抗原ポリペプチドが、Ｓ１サブユニット、Ｓ２サブユニット、Ｓ３サブユニット、Ｓ４サブユニット、Ｓ５サブユニット、またはそのバリアントからなる群から選択される、請求項１～９のいずれか１項に記載の組成物。
  11. 前記Ｓ１サブユニットが、配列番号８によって特定される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の組成物。
  12. 前記Ｓ１サブユニットが、配列番号８によって特定される配列と同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載の組成物。
  13. 前記Ｓ１サブユニットをコードする前記ｍＲＮＡが、配列番号７によって特定される配列と少なくとも９５％または９８％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項１０～１２のいずれか１項に記載の組成物。
  14. 前記Ｓ１サブユニットをコードする前記ｍＲＮＡが、配列番号７によって特定される配列と同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項１３に記載の組成物。
  15. 前記Ｓ１サブユニットをコードする前記ｍＲＮＡが、配列番号６によって特定される配列と少なくとも９５％または９８％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項１０～１４のいずれか１項に記載の組成物。
  16. 前記Ｓ１サブユニットをコードする前記ｍＲＮＡが、配列番号６によって特定される配列と同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項１５に記載の組成物。
  17. Ｓ１サブユニットバリアントが、配列番号５または１１によって特定される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の組成物。
  18. 前記Ｓ１サブユニットバリアントが、配列番号５または１１によって特定される配列と同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載の組成物。
  19. 前記Ｓ１サブユニットバリアントをコードする前記ｍＲＮＡが、配列番号３または１０によって特定される配列と少なくとも９５％または９８％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項１７または１８に記載の組成物。
  20. 前記Ｓ１サブユニットバリアントをコードする前記ｍＲＮＡが、配列番号３または１０によって特定される配列と同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項１９に記載の組成物。
  21. 前記Ｓ１サブユニットバリアントをコードする前記ｍＲＮＡが、配列番号１または９によって特定される配列と少なくとも９５％または９８％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項１７～２０のいずれか１項に記載の組成物。
  22. 前記Ｓ１サブユニットバリアントをコードする前記ｍＲＮＡが、配列番号１または９によって特定される配列と同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項２１に記載の組成物。
  23. Ｓ２サブユニットバリアントが、配列番号１４によって特定される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の組成物。
  24. 前記Ｓ２サブユニットバリアントが、配列番号１４によって特定される配列と同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２３に記載の組成物。
  25. 前記Ｓ２サブユニットバリアントをコードする前記ｍＲＮＡが、配列番号１３によって特定される配列と少なくとも９５％または９８％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項２３または２４に記載の組成物。
  26. 前記Ｓ２サブユニットバリアントをコードする前記ｍＲＮＡが、配列番号１３によって特定される配列と同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項２５に記載の組成物。
  27. 前記Ｓ２サブユニットバリアントをコードする前記ｍＲＮＡが、配列番号１２によって特定される配列と少なくとも９５％または９８％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項２３～２６のいずれか１項に記載の組成物。
  28. 前記Ｓ２サブユニットバリアントをコードする前記ｍＲＮＡが、配列番号１２によって特定される配列と同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項２７に記載の組成物。
  29. Ｓ３サブユニットバリアントが、配列番号１７によって特定される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の組成物。
  30. 前記Ｓ３サブユニットバリアントが、配列番号１７によって特定される配列と同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２９に記載の組成物。
  31. 前記Ｓ３サブユニットバリアントをコードする前記ｍＲＮＡが、配列番号１６によって特定される配列と少なくとも９５％または９８％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項２９または３０に記載の組成物。
  32. 前記Ｓ３サブユニットバリアントをコードする前記ｍＲＮＡが、配列番号１６によって特定される配列と同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項３１に記載の組成物。
  33. 前記Ｓ３サブユニットバリアントをコードする前記ｍＲＮＡが、配列番号１５によって特定される配列と少なくとも９５％または９８％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項２９～３２のいずれか１項に記載の組成物。
  34. 前記Ｓ３サブユニットバリアントをコードする前記ｍＲＮＡが、配列番号１５によって特定される配列と同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項３３に記載の組成物。
  35. 前記Ｓ４サブユニットが、配列番号２０によって特定される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の組成物。
  36. Ｓ４サブユニットバリアントが、配列番号２０によって特定される配列と同一であるアミノ酸配列を含む、請求項３５に記載の組成物。
  37. 前記Ｓ４サブユニットをコードする前記ｍＲＮＡが、配列番号１９によって特定される配列と少なくとも９５％または９８％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項３５または３６に記載の組成物。
  38. 前記Ｓ４サブユニットをコードする前記ｍＲＮＡが、配列番号１９によって特定される配列と同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項３７に記載の組成物。
  39. 前記Ｓ４サブユニットをコードする前記ｍＲＮＡが、配列番号１８によって特定される配列と少なくとも９５％または９８％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項３５～３８のいずれか１項に記載の組成物。
  40. 前記Ｓ４サブユニットをコードする前記ｍＲＮＡが、配列番号１８によって特定される配列と同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項３９に記載の組成物。
  41. Ｓ５サブユニットバリアントが、配列番号２３によって特定される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の組成物。
  42. 前記Ｓ５サブユニットバリアントが、配列番号２３によって特定される配列と同一であるアミノ酸配列を含む、請求項４１に記載の組成物。
  43. 前記Ｓ５サブユニットバリアントをコードする前記ｍＲＮＡが、配列番号２２によって特定される配列と少なくとも９５％または９８％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項４１または４２に記載の組成物。
  44. 前記Ｓ５サブユニットバリアントをコードする前記ｍＲＮＡが、配列番号２２によって特定される配列と同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項４３に記載の組成物。
  45. 前記Ｓ５サブユニットバリアントをコードする前記ｍＲＮＡが、配列番号２１によって特定される配列と少なくとも９５％または９８％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項４１～４４のいずれか１項に記載の組成物。
  46. 前記Ｓ５サブユニットバリアントをコードする前記ｍＲＮＡが、配列番号２１によって特定される配列と同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項４５に記載の組成物。
  47. 前記ＳＰＨＢ１抗原ポリペプチドが、配列番号２６によって特定される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１～４６のいずれか１項に記載の組成物。
  48. 前記ＳＰＨＢ１抗原ポリペプチドが、配列番号２６によって特定される配列を含むアミノ酸配列を含む、請求項４７に記載の組成物。
  49. 前記ＳＰＨＢ１抗原ポリペプチドをコードする前記ｍＲＮＡが、配列番号２５によって特定される配列と少なくとも９５％または９８％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項４７または４８に記載の組成物。
  50. 前記ＳＰＨＢ１抗原ポリペプチドをコードする前記ｍＲＮＡが、配列番号２５によって特定される配列と同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項４９に記載の組成物。
  51. 前記ＳＰＨＢ１抗原ポリペプチドをコードする前記ｍＲＮＡが、配列番号２４によって特定される配列と少なくとも９５％または９８％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項４７～５０のいずれか１項に記載の組成物。
  52. 前記ＳＰＨＢ１抗原ポリペプチドをコードする前記ｍＲＮＡが、配列番号２４によって特定される配列と同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項５１に記載の組成物。
  53. 前記ＴＣＦＡ抗原ポリペプチドが、配列番号２９によって特定される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１～５２のいずれか１項に記載の組成物。
  54. 前記ＴＣＦＡ抗原ポリペプチドが、配列番号２９によって特定される配列を含むアミノ酸配列を含む、請求項５３に記載の組成物。
  55. 前記ＴＣＦＡ抗原ポリペプチドをコードする前記ｍＲＮＡが、配列番号２８によって特定される配列と少なくとも９５％または９８％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項５３または５４に記載の組成物。
  56. 前記ＴＣＦＡ抗原ポリペプチドをコードする前記ｍＲＮＡが、配列番号２８によって特定される配列と同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項５５に記載の組成物。
  57. 前記ＴＣＦＡ抗原ポリペプチドをコードする前記ｍＲＮＡが、配列番号２７によって特定される配列と少なくとも９５％または９８％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項５３～５６のいずれか１項に記載の組成物。
  58. 前記ＴＣＦＡ抗原ポリペプチドをコードする前記ｍＲＮＡが、配列番号２７によって特定される配列と同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項５７に記載の組成物。
  59. 前記繊維状赤血球凝集素抗原ポリペプチドが、ＦＨＡ１、ＦＨＡ２、またはＦＨＡ３を含む、請求項１～５８のいずれか１項に記載の組成物。
  60. ＦＨＡ３抗原ポリペプチドが、配列番号３５によって特定される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項５９に記載の組成物。
  61. 前記ＦＨＡ３抗原ポリペプチドが、配列番号３５によって特定される配列を含む、請求項６０に記載の組成物。
  62. 前記ＦＨＡ３抗原ポリペプチドをコードする前記ｍＲＮＡが、配列番号３４によって特定される配列と少なくとも９５％または９８％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項６０または６１に記載の組成物。
  63. 前記ＦＨＡ３抗原ポリペプチドをコードする前記ｍＲＮＡが、配列番号３４によって特定される配列と同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項６２に記載の組成物。
  64. 前記ＦＨＡ３抗原ポリペプチドをコードする前記ｍＲＮＡが、配列番号３３によって特定される配列と少なくとも９５％または９８％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項６０～６３のいずれか１項に記載の組成物。
  65. 前記ＦＨＡ３抗原ポリペプチドをコードする前記ｍＲＮＡが、配列番号３３によって特定される配列と同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項６４に記載の組成物。
  66. 前記ＰＲＮ抗原ポリペプチドが、配列番号３２によって特定される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１～６５のいずれか１項に記載の組成物。
  67. 前記ＰＲＮ抗原ポリペプチドが、配列番号３２によって特定される配列を含むアミノ酸配列を含む、請求項６６に記載の組成物。
  68. 前記ＰＲＮ抗原ポリペプチドをコードする前記ｍＲＮＡが、配列番号３１によって特定される配列と少なくとも９５％または９８％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項６６または６７に記載の組成物。
  69. 前記ＰＲＮ抗原ポリペプチドをコードする前記ｍＲＮＡが、配列番号３１によって特定される配列と同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項６８に記載の組成物。
  70. 前記ＰＲＮ抗原ポリペプチドをコードする前記ｍＲＮＡが、配列番号３０によって特定される配列と少なくとも９５％または９８％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項６６～６９のいずれか１項に記載の組成物。
  71. 前記ＰＲＮ抗原ポリペプチドをコードする前記ｍＲＮＡが、配列番号３０によって特定される配列と同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項７０に記載の組成物。
  72. 前記ＦＩＭ抗原ポリペプチドが、ＦＩＭ１、ＦＩＭ２、ＦＩＭ３、及びそれらのドメインスワップ構築物からなる群から選択される、請求項１～７１のいずれか１項に記載の組成物。
  73. 前記ＦＩＭ抗原ポリペプチドが、配列番号３８によって特定される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項７２に記載の組成物。
  74. 前記ＦＩＭ抗原ポリペプチドが、配列番号３８によって特定される配列を含むアミノ酸配列を含む、請求項７３に記載の組成物。
  75. 前記ＦＩＭ抗原ポリペプチドをコードする前記ｍＲＮＡが、配列番号３７によって特定される配列と少なくとも９５％または９８％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項７３または７４に記載の組成物。
  76. 前記ＦＩＭ抗原ポリペプチドをコードする前記ｍＲＮＡが、配列番号３７によって特定される配列と同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項７５に記載の組成物。
  77. 前記ＦＩＭ抗原ポリペプチドをコードする前記ｍＲＮＡが、配列番号３６によって特定される配列と少なくとも９５％または９８％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項７３～７６のいずれか１項に記載の組成物。
  78. 前記ＦＩＭ抗原ポリペプチドをコードする前記ｍＲＮＡが、配列番号３６によって特定される配列と同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項７７に記載の組成物。
  79. 前記アデニル酸シクラーゼ抗原ポリペプチドが、ＡＣＴ１８８ＬＱ、ＡＣＴＨ６３Ａ＿Ｋ６５Ａ＿Ｓ６６Ｇ、及びリピートイントキシン（ＲＴＸ）ドメインからなる群から選択される、請求項１～７８のいずれか１項に記載の組成物。
  80. ＲＴＸ抗原ポリペプチドが、配列番号４１によって特定される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項７９に記載の組成物。
  81. 前記ＲＴＸ抗原ポリペプチドが、配列番号４１によって特定される配列を含むアミノ酸配列を含む、請求項８０に記載の組成物。
  82. 前記ＲＴＸ抗原ポリペプチドをコードする前記ｍＲＮＡが、配列番号４０によって特定される配列と少なくとも９５％または９８％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項８０または８１に記載の組成物。
  83. 前記ＲＴＸ抗原ポリペプチドをコードする前記ｍＲＮＡが、配列番号４０によって特定される配列と同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項８２に記載の組成物。
  84. 前記ＲＴＸ抗原ポリペプチドをコードする前記ｍＲＮＡが、配列番号３９によって特定される配列と少なくとも９５％または９８％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項８０～８３のいずれか１項に記載の組成物。
  85. 前記ＲＴＸ抗原ポリペプチドをコードする前記ｍＲＮＡが、配列番号３９によって特定される配列と同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項８４に記載の組成物。
  86. 前記Ｂｒｋ抗原ポリペプチドが、配列番号４４によって特定される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１～８５のいずれか１項に記載の組成物。
  87. 前記Ｂｒｋ抗原ポリペプチドが、配列番号４４によって特定される配列を含むアミノ酸配列を含む、請求項８６に記載の組成物。
  88. 前記Ｂｒｋ抗原ポリペプチドをコードする前記ｍＲＮＡが、配列番号４３によって特定される配列と少なくとも９５％または９８％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項８６または８７に記載の組成物。
  89. 前記Ｂｒｋ抗原ポリペプチドをコードする前記ｍＲＮＡが、配列番号４３によって特定される配列と同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項８８に記載の組成物。
  90. 前記Ｂｒｋ抗原ポリペプチドをコードする前記ｍＲＮＡが、配列番号４２によって特定される配列と少なくとも９５％または９８％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項８６～８９のいずれか１項に記載の組成物。
  91. 前記Ｂｒｋ抗原ポリペプチドをコードする前記ｍＲＮＡが、配列番号４２によって特定される配列と同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項９０に記載の組成物。
  92. 前記Ｖａｇ８抗原ポリペプチドが、配列番号４７によって特定される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１～９１のいずれか１項に記載の組成物。
  93. 前記Ｖａｇ８抗原ポリペプチドが、配列番号４７によって特定される配列を含むアミノ酸配列を含む、請求項９２に記載の組成物。
  94. 前記Ｖａｇ８抗原ポリペプチドをコードする前記ｍＲＮＡが、配列番号４６によって特定される配列と少なくとも９５％または９８％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項９２または９３に記載の組成物。
  95. 前記Ｖａｇ８抗原ポリペプチドをコードする前記ｍＲＮＡが、配列番号４６によって特定される配列と同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項９４に記載の組成物。
  96. 前記Ｖａｇ８抗原ポリペプチドをコードする前記ｍＲＮＡが、配列番号４５によって特定される配列と少なくとも９５％または９８％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項９２～９５のいずれか１項に記載の組成物。
  97. 前記Ｖａｇ８抗原ポリペプチドをコードする前記ｍＲＮＡが、配列番号４５によって特定される配列と同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項９７に記載の組成物。
  98. ジフテリア抗原ポリペプチドをコードする少なくとも１つのＯＲＦを有する少なくとも１つのｍＲＮＡポリヌクレオチドを更に含む、請求項１～９７のいずれか１項に記載の組成物。
  99. 前記ジフテリア抗原ポリペプチドが、配列番号５０によって特定される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項９８に記載の組成物。
  100. 前記ジフテリア抗原ポリペプチドが、配列番号５０によって特定される配列を含むアミノ酸配列を含む、請求項９９に記載の組成物。
  101. 前記ジフテリア抗原ポリペプチドをコードする前記ｍＲＮＡが、配列番号４９によって特定される配列と少なくとも９５％または９８％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項９９または１００に記載の組成物。
  102. 前記ジフテリア抗原ポリペプチドをコードする前記ｍＲＮＡが、配列番号４９によって特定される配列と同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項１０１に記載の組成物。
  103. 前記ジフテリア抗原ポリペプチドをコードする前記ｍＲＮＡが、配列番号４８によって特定される配列と少なくとも９５％または９８％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項９９～１０２のいずれか１項に記載の組成物。
  104. 前記ジフテリア抗原ポリペプチドをコードする前記ｍＲＮＡが、配列番号４８によって特定される配列と同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項１０３に記載の組成物。
  105. 破傷風抗原ポリペプチドをコードする少なくとも１つのＯＲＦを有する少なくとも１つのｍＲＮＡポリヌクレオチドを更に含む、請求項１～１０４のいずれか１項に記載の組成物。
  106. 前記破傷風抗原ポリペプチドが、配列番号５３によって特定される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１０５に記載の組成物。
  107. 前記破傷風抗原ポリペプチドが、配列番号５３によって特定される配列を含むアミノ酸配列を含む、請求項１０６に記載の組成物。
  108. 前記破傷風抗原ポリペプチドをコードする前記ｍＲＮＡが、配列番号５２によって特定される配列と少なくとも９５％または９８％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項１０６または１０７に記載の組成物。
  109. 前記破傷風抗原ポリペプチドをコードする前記ｍＲＮＡが、配列番号５２によって特定される配列と同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項１０８に記載の組成物。
  110. 前記破傷風抗原ポリペプチドをコードする前記ｍＲＮＡが、配列番号５１によって特定される配列と少なくとも９５％または９８％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項１０６～１０９のいずれか１項に記載の組成物。
  111. 前記破傷風抗原ポリペプチドをコードする前記ｍＲＮＡが、配列番号５１によって特定される配列と同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項１１０に記載の組成物。
  112. 組成物であって、
    ジフテリア抗原ポリペプチドをコードする少なくとも１つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有する少なくとも１つのメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む、前記組成物。
  113. 前記ジフテリア抗原ポリペプチドが、配列番号５０によって特定される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１１２に記載の組成物。
  114. 前記ジフテリア抗原ポリペプチドが、配列番号５０によって特定される配列を含むアミノ酸配列を含む、請求項１１３に記載の組成物。
  115. 前記ジフテリア抗原ポリペプチドをコードする前記ｍＲＮＡが、配列番号４９によって特定される配列と少なくとも９５％または９８％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項１１３または１１４に記載の組成物。
  116. 前記ジフテリア抗原ポリペプチドをコードする前記ｍＲＮＡが、配列番号４９によって特定される配列と同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項１１５に記載の組成物。
  117. 前記ジフテリア抗原ポリペプチドをコードする前記ｍＲＮＡが、配列番号４８によって特定される配列と少なくとも９５％または９８％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項１１３～１１６のいずれか１項に記載の組成物。
  118. 前記ジフテリア抗原ポリペプチドをコードする前記ｍＲＮＡが、配列番号４８によって特定される配列と同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項１１７に記載の組成物。
  119. 組成物であって、
    破傷風抗原ポリペプチドをコードする少なくとも１つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有する少なくとも１つのメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む、前記組成物。
  120. 前記破傷風抗原ポリペプチドが、配列番号５３によって特定される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１１９に記載の組成物。
  121. 前記破傷風抗原ポリペプチドが、配列番号５３によって特定される配列を含むアミノ酸配列を含む、請求項１２０に記載の組成物。
  122. 前記破傷風抗原ポリペプチドをコードする前記ｍＲＮＡが、配列番号５２によって特定される配列と少なくとも９５％または９８％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項１２０または１２１に記載の組成物。
  123. 前記破傷風抗原ポリペプチドをコードする前記ｍＲＮＡが、配列番号５２によって特定される配列と同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項１２２に記載の組成物。
  124. 前記破傷風抗原ポリペプチドをコードする前記ｍＲＮＡが、配列番号５１によって特定される配列と少なくとも９５％または９８％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項１２０～１２３のいずれか１項に記載の組成物。
  125. 前記破傷風抗原ポリペプチドをコードする前記ｍＲＮＡが、配列番号５１によって特定される配列と同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項１２４に記載の組成物。
  126. 百日咳抗原融合ポリペプチド、破傷風抗原融合ポリペプチド、ジフテリア抗原融合ポリペプチド、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される抗原融合ポリペプチドをコードするｍＲＮＡを更に含む、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  127. 前記抗原融合ポリペプチドが、配列番号５６、５９、６２、６５、６８、７１、７４、７７、８０、８３、８６、８９、９２、９５、及び９８から選択される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１２６に記載の組成物。
  128. 前記抗原融合ポリペプチドが、配列番号５６、５９、６２、６５、６８、７１、７４、７７、８０、８３、８６、８９、９２、９５、及び９８から選択される配列を含むアミノ酸配列を含む、請求項１２７に記載の組成物。
  129. 前記抗原融合ポリペプチドをコードする前記ｍＲＮＡが、配列番号５５、５８、６１、６４、６７、７０、７３、７６、７９、８２、８５、８８、９１、９４、及び９７から選択される配列と少なくとも９５％または９８％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項１２７または１２８に記載の組成物。
  130. 前記抗原融合ポリペプチドをコードする前記ｍＲＮＡが、配列番号５５、５８、６１、６４、６７、７０、７３、７６、７９、８２、８５、８８、９１、９４、及び９７から選択される配列と同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項１２９に記載の組成物。
  131. 前記抗原融合ポリペプチドをコードする前記ｍＲＮＡが、配列番号５４、５７、６０、６３、６６、６９、７２、７５、７８、８１、８４、８７、９０、９３、及び９６から選択される配列と少なくとも９５％または９８％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項１２７～１３０のいずれか１項に記載の組成物。
  132. 前記抗原融合ポリペプチドをコードする前記ｍＲＮＡが、配列番号５４、５７、６０、６３、６６、６９、７２、７５、７８、８１、８４、８７、９０、９３、及び９６から選択される配列と同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項１３１に記載の組成物。
  133. 前記ｍＲＮＡが、配列番号２のヌクレオチド配列を含む５’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  134. 前記ｍＲＮＡが、配列番号４のヌクレオチド配列を含む３’ＵＴＲを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  135. 前記ｍＲＮＡが、化学修飾を更に含む、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  136. 前記化学修飾が、１－メチルシュードウリジンである、請求項１２５に記載の組成物。
  137. 脂質ナノ粒子を更に含む、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  138. 前記脂質ナノ粒子が、ＰＥＧ修飾脂質、非カチオン性脂質、ステロール、イオン化可能なアミノ脂質、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１３７に記載の組成物。
  139. 前記脂質ナノ粒子が、０．５～１５ｍｏｌ％のＰＥＧ修飾脂質、５～２５ｍｏｌ％の非カチオン性脂質、２５～５５ｍｏｌ％のステロール、及び２０～６０ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質を含む、請求項１３７または１３８に記載の組成物。
  140. 前記ＰＥＧ修飾脂質が、１，２ジミリストイル－ｓｎ－グリセロール、メトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ２０００ ＤＭＧ）であり、前記非カチオン性脂質が、１，２ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）であり、前記ステロールが、コレステロールであり、前記イオン化可能なアミノ脂質が、化合物１の構造を有する、請求項１３８または１３９に記載の組成物。
  141. 方法であって、対象に、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物を前記対象におけるＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓに対する中和抗体応答を誘導するのに有効な量で投与することを含む、前記方法。
  142. 前記組成物が、前記対象において、Ｔｈ１免疫応答、Ｔｈ１７免疫応答、Ｔｈ２応答、またはそれらの組み合わせを誘導するのに有効な量で投与される、請求項１４１に記載の方法。
  143. 前記組成物が、前記対象における百日咳の症状を低減または除去するのに有効な量で投与される、請求項１４１または１４２に記載の方法。
  144. 前記組成物が、前記対象の気道のコロニー形成を低減または除去するのに有効な量で投与される、請求項１４１～１４３のいずれか１項に記載の方法。
  145. 前記組成物が、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓの伝染性を低減または除去するのに有効な量で投与される、請求項１４１～１４４のいずれか１項に記載の方法。
  146. 前記組成物が、ブーストとして、２回目を更に投与される、請求項１４１～１４５のいずれか１項に記載の方法。
  147. ブースト用量が、第１の用量から２８日後に投与される、請求項１４６に記載の方法。
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