CN117677389A - 百日咳疫苗 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及百日咳核酸疫苗、白喉核酸疫苗、破伤风核酸疫苗和组合疫苗，以及使用所述疫苗和包含所述疫苗的组合物的方法。

Description

百日咳疫苗
相关申请
本申请根据35 U.S.C.§119(e)要求于2021年3月26日提交的美国临时申请号63/166,838的权益，所述临时申请通过引用整体并入本文。
经由EFS-WEB作为文本文件提交的序列表
本申请含有序列表，所述序列表以ASCII格式经由EFS-Web提交并且特此通过引用整体并入。所述ASCII拷贝创建于2022年3月23日，命名为M137870114WO00-SEQ-JXV并且大小为418,946字节。
背景技术
百日咳(Pertussis)(一种也称为百日咳(whooping cough)的呼吸道疾病)是由百日咳博德特氏菌引起，百日咳博德特氏菌是一种高度接触传染性的非芽孢形成性革兰氏阴性球杆菌。所述疾病主要通过雾化液滴传播，例如来自感染者的喷嚏、咳嗽或呼吸。受感染的人在咳嗽开始后约两周内最具接触传染性，大约在暴露后5至10天。百日咳的早期症状基本上与普通感冒的症状相同：流鼻涕、低烧和偶尔轻微咳嗽。在疾病进展一周或两周后，出现传统的百日咳症状，包括阵发、呕吐和疲惫。据估计，全世界每年有2000万例感染，造成大约200,000例死亡。
发明内容
本文提供了核糖核酸(RNA)疫苗，所述RNA疫苗是基于以下知识：RNA(例如信使RNA(mRNA))能够安全地指导身体的细胞机制产生几乎任何目标蛋白质，从天然蛋白质到抗体和其他完全新颖的蛋白质构建体，所述蛋白质构建体可在细胞内部和外部具有治疗活性。本公开的RNA(例如mRNA)疫苗可用于诱导针对百日咳博德特氏菌(例如，百日咳(pertussis)、百日咳(whooping cough))、白喉和/或破伤风的平衡免疫反应，包括细胞免疫和体液免疫，而没有例如插入诱变的可能性的风险。
取决于感染的盛行率或未满足的医疗需求的程度或水平，本文公开的疫苗可用于各种环境中。RNA(例如mRNA)疫苗可用于治疗和/或预防各种基因型、菌株和分离株的百日咳、白喉和/或破伤风。
在一些方面，本公开提供了一种组合物，所述组合物包含至少一种信使核糖核酸(mRNA)多核苷酸，所述至少一种mRNA多核苷酸具有至少一个编码百日咳博德特氏菌抗原性多肽的开放阅读框(ORF)，所述百日咳博德特氏菌抗原性多肽选自由以下组成的组：百日咳毒素抗原性多肽、自主转运蛋白枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶(SPHB1)抗原性多肽、气管定殖因子A(TCFA)抗原性多肽、丝状血凝素(FHA)抗原性多肽、百日咳杆菌粘附素(PRN)抗原性多肽、菌毛(FIM)抗原性多肽、腺苷酸环化酶抗原性多肽、博德特氏菌抗杀性(Brk)抗原性多肽和毒力相关基因8(Vag8)抗原性多肽。
在一些实施方案中，所述组合物包含至少两种信使核糖核酸(mRNA)多核苷酸，所述至少两种mRNA多核苷酸各自具有至少一个ORF并且各自编码选自由以下组成的组的百日咳博德特氏菌抗原性多肽：百日咳毒素抗原性多肽、自主转运蛋白枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶(SPHB1)抗原性多肽、气管定殖因子A(TCFA)抗原性多肽、丝状血凝素(FHA)抗原性多肽、百日咳杆菌粘附素(PRN)抗原性多肽、菌毛(FIM)抗原性多肽、腺苷酸环化酶抗原性多肽、博德特氏菌抗杀性(Brk)抗原性多肽和毒力相关基因8(Vag8)抗原性多肽。
在一些实施方案中，所述组合物包含至少三种信使核糖核酸(mRNA)多核苷酸，所述至少三种mRNA多核苷酸各自具有至少一个ORF并且各自编码选自由以下组成的组的百日咳博德特氏菌抗原性多肽：百日咳毒素抗原性多肽、自主转运蛋白枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶(SPHB1)抗原性多肽、气管定殖因子A(TCFA)抗原性多肽、丝状血凝素(FHA)抗原性多肽、百日咳杆菌粘附素(PRN)抗原性多肽、菌毛(FIM)抗原性多肽、腺苷酸环化酶抗原性多肽、博德特氏菌抗杀性(Brk)抗原性多肽和毒力相关基因8(Vag8)抗原性多肽。
在一些实施方案中，所述组合物包含至少四种信使核糖核酸(mRNA)多核苷酸，所述至少四种mRNA多核苷酸各自具有至少一个ORF并且各自编码选自由以下组成的组的百日咳博德特氏菌抗原性多肽：百日咳毒素抗原性多肽、自主转运蛋白枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶(SPHB1)抗原性多肽、气管定殖因子A(TCFA)抗原性多肽、丝状血凝素(FHA)抗原性多肽、百日咳杆菌粘附素(PRN)抗原性多肽、菌毛(FIM)抗原性多肽、腺苷酸环化酶抗原性多肽、博德特氏菌抗杀性(Brk)抗原性多肽和毒力相关基因8(Vag8)抗原性多肽。
在一些实施方案中，所述组合物包含至少五种信使核糖核酸(mRNA)多核苷酸，所述至少五种mRNA多核苷酸各自具有至少一个ORF并且各自编码选自由以下组成的组的百日咳博德特氏菌抗原性多肽：百日咳毒素抗原性多肽、自主转运蛋白枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶(SPHB1)抗原性多肽、气管定殖因子A(TCFA)抗原性多肽、丝状血凝素(FHA)抗原性多肽、百日咳杆菌粘附素(PRN)抗原性多肽、菌毛(FIM)抗原性多肽、腺苷酸环化酶抗原性多肽、博德特氏菌抗杀性(Brk)抗原性多肽和毒力相关基因8(Vag8)抗原性多肽。
在一些实施方案中，所述组合物包含至少六种信使核糖核酸(mRNA)多核苷酸，所述至少六种mRNA多核苷酸各自具有至少一个ORF并且各自编码选自由以下组成的组的百日咳博德特氏菌抗原性多肽：百日咳毒素抗原性多肽、自主转运蛋白枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶(SPHB1)抗原性多肽、气管定殖因子A(TCFA)抗原性多肽、丝状血凝素(FHA)抗原性多肽、百日咳杆菌粘附素(PRN)抗原性多肽、菌毛(FIM)抗原性多肽、腺苷酸环化酶抗原性多肽、博德特氏菌抗杀性(Brk)抗原性多肽和毒力相关基因8(Vag8)抗原性多肽。
在一些实施方案中，所述组合物包含至少七种信使核糖核酸(mRNA)多核苷酸，所述至少七种mRNA多核苷酸各自具有至少一个ORF并且各自编码选自由以下组成的组的百日咳博德特氏菌抗原性多肽：百日咳毒素抗原性多肽、自主转运蛋白枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶(SPHB1)抗原性多肽、气管定殖因子A(TCFA)抗原性多肽、丝状血凝素(FHA)抗原性多肽、百日咳杆菌粘附素(PRN)抗原性多肽、菌毛(FIM)抗原性多肽、腺苷酸环化酶抗原性多肽、博德特氏菌抗杀性(Brk)抗原性多肽和毒力相关基因8(Vag8)抗原性多肽。
在一些实施方案中，所述组合物包含至少八种信使核糖核酸(mRNA)多核苷酸，所述至少八种mRNA多核苷酸各自具有至少一个ORF并且各自编码选自由以下组成的组的百日咳博德特氏菌抗原性多肽：百日咳毒素抗原性多肽、自主转运蛋白枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶(SPHB1)抗原性多肽、气管定殖因子A(TCFA)抗原性多肽、丝状血凝素(FHA)抗原性多肽、百日咳杆菌粘附素(PRN)抗原性多肽、菌毛(FIM)抗原性多肽、腺苷酸环化酶抗原性多肽、博德特氏菌抗杀性(Brk)抗原性多肽和毒力相关基因8(Vag8)抗原性多肽。
在一些实施方案中，所述组合物包含至少九种信使核糖核酸(mRNA)多核苷酸，所述至少九种mRNA多核苷酸各自具有至少一个ORF并且各自编码选自由以下组成的组的百日咳博德特氏菌抗原性多肽：百日咳毒素抗原性多肽、自主转运蛋白枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶(SPHB1)抗原性多肽、气管定殖因子A(TCFA)抗原性多肽、丝状血凝素(FHA)抗原性多肽、百日咳杆菌粘附素(PRN)抗原性多肽、菌毛(FIM)抗原性多肽、腺苷酸环化酶抗原性多肽、博德特氏菌抗杀性(Brk)抗原性多肽和毒力相关基因8(Vag8)抗原性多肽。
在一些实施方案中，百日咳毒素抗原多肽选自由以下组成的组：S1亚基、S2亚基、S3亚基、S4亚基、S5亚基或其变体。在一些实施方案中，S1亚基包含与由SEQ ID NO：8标识的序列至少80％、85％、90％、95％或98％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，S1亚基包含与由SEQ ID NO：8标识的序列同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，编码S1亚基的mRNA包含与由SEQ ID NO：7标识的序列至少95％或98％同一的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码S1亚基的mRNA包含与由SEQ ID NO：7标识的序列同一的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码S1亚基的mRNA包含与由SEQ ID NO：6标识的序列至少95％或98％同一的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码S1亚基的mRNA包含与由SEQ ID NO：6标识的序列同一的核苷酸序列。在一些实施方案中，S1亚基变体包含与由SEQ ID NO：5或11标识的序列至少80％、85％、90％、95％或98％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，S1亚基变体包含与由SEQ ID NO：5或11标识的序列同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，编码S1亚基变体的mRNA包含与由SEQ ID NO：3或10标识的序列至少95％或98％同一的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码S1亚基变体的mRNA包含与由SEQ ID NO：3或10标识的序列同一的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码S1亚基变体的mRNA包含与由SEQ ID NO：1或9标识的序列至少95％或98％同一的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码S1亚基变体的mRNA包含与由SEQ ID NO：1或9标识的序列同一的核苷酸序列。在一些实施方案中，S2亚基变体包含与由SEQ ID NO：14标识的序列至少80％、85％、90％、95％或98％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，S2亚基变体包含与由SEQ ID NO：14标识的序列同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，编码S2亚基变体的mRNA包含与由SEQ ID NO：13标识的序列至少95％或98％同一的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码S2亚基变体的mRNA包含与由SEQ ID NO：13标识的序列同一的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码S2亚基变体的mRNA包含与由SEQ ID NO：12标识的序列至少95％或98％同一的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码S2亚基变体的mRNA包含与由SEQ ID NO：12标识的序列同一的核苷酸序列。在一些实施方案中，S3亚基变体包含与由SEQ ID NO：17标识的序列至少80％、85％、90％、95％或98％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，S3亚基变体包含与由SEQ ID NO：17标识的序列同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，编码S3亚基变体的mRNA包含与由SEQ ID NO：16标识的序列至少95％或98％同一的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码S3亚基变体的mRNA包含与由SEQ ID NO：16标识的序列同一的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码S3亚基变体的mRNA包含与由SEQ ID NO：15标识的序列至少95％或98％同一的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码S3亚基变体的mRNA包含与由SEQID NO：15标识的序列同一的核苷酸序列。在一些实施方案中，S4亚基包含与由SEQ ID NO：20标识的序列至少80％、85％、90％、95％或98％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，S4亚基变体包含与由SEQ ID NO：20标识的序列同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，编码S4亚基的mRNA包含与由SEQ ID NO：19标识的序列至少95％或98％同一的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码S4亚基的mRNA包含与由SEQ ID NO：19标识的序列同一的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码S4亚基的mRNA包含与由SEQ ID NO：18标识的序列至少95％或98％同一的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码S4亚基的mRNA包含与由SEQ ID NO：18标识的序列同一的核苷酸序列。在一些实施方案中，S5亚基变体包含与由SEQ ID NO：23标识的序列至少80％、85％、90％、95％或98％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，S5亚基变体包含与由SEQ ID NO：23标识的序列同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，编码S5亚基变体的mRNA包含与由SEQ ID NO：22标识的序列至少95％或98％同一的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码S5亚基变体的mRNA包含与由SEQ ID NO：22标识的序列同一的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码S5亚基变体的mRNA包含与由SEQ ID NO：21标识的序列至少95％或98％同一的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码S5亚基变体的mRNA包含与由SEQ ID NO：21标识的序列同一的核苷酸序列。
在一些实施方案中，SPHB1抗原性多肽包含与由SEQ ID NO：26标识的序列至少80％、85％、90％、95％或98％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，SPHB1抗原性多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包含由SEQ ID NO：26标识的序列。在一些实施方案中，编码SPHB1抗原性多肽的mRNA包含与由SEQ ID NO：25标识的序列至少95％或98％同一的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码SPHB1抗原性多肽的mRNA包含与由SEQ ID NO：25标识的序列同一的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码SPHB1抗原性多肽的mRNA包含与由SEQ ID NO：24标识的序列至少95％或98％同一的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码SPHB1抗原性多肽的mRNA包含与由SEQ ID NO：24标识的序列同一的核苷酸序列。
在一些实施方案中，TCFA抗原性多肽包含与由SEQ ID NO：29标识的序列至少80％、85％、90％、95％或98％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，TCFA抗原性多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包含由SEQ ID NO：29标识的序列。在一些实施方案中，编码TCFA抗原性多肽的mRNA包含与由SEQ ID NO：28标识的序列至少95％或98％同一的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码TCFA抗原性多肽的mRNA包含与由SEQ ID NO：28标识的序列同一的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码TCFA抗原性多肽的mRNA包含与由SEQ ID NO：27标识的序列至少95％或98％同一的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码TCFA抗原性多肽的mRNA包含与由SEQ ID NO：27标识的序列同一的核苷酸序列。
在一些实施方案中，丝状血凝素抗原性多肽包含FHA1、FHA2或FHA3。在一些实施方案中，FHA3抗原性多肽包含与由SEQ ID NO：35标识的序列至少80％、85％、90％、95％或98％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，FHA3抗原性多肽包含由SEQ ID NO：35标识的序列。在一些实施方案中，编码FHA3抗原性多肽的mRNA包含与由SEQ ID NO：34标识的序列至少95％或98％同一的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码FHA3抗原性多肽的mRNA包含与由SEQ ID NO：34标识的序列同一的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码FHA3抗原性多肽的mRNA包含与由SEQ ID NO：33标识的序列至少95％或98％同一的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码FHA3抗原性多肽的mRNA包含与由SEQ ID NO：33标识的序列同一的核苷酸序列。
在一些实施方案中，PRN抗原性多肽包含与由SEQ ID NO：32标识的序列至少80％、85％、90％、95％或98％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，PRN抗原性多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包含由SEQ ID NO：32标识的序列。在一些实施方案中，编码PRN抗原性多肽的mRNA包含与由SEQ ID NO：31标识的序列至少95％或98％同一的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码PRN抗原性多肽的mRNA包含与由SEQ ID NO：31标识的序列同一的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码PRN抗原性多肽的mRNA包含与由SEQ ID NO：30标识的序列至少95％或98％同一的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码PRN抗原性多肽的mRNA包含与由SEQ ID NO：30标识的序列同一的核苷酸序列。
在一些实施方案中，FIM抗原性多肽选自由以下组成的组：FIM1、FIM2、FIM3以及其结构域交换的构建体。在一些实施方案中，FIM抗原性多肽包含与由SEQ ID NO：38标识的序列至少80％、85％、90％、95％或98％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，FIM抗原性多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包含由SEQ ID NO：38标识的序列。在一些实施方案中，编码FIM抗原性多肽的mRNA包含与由SEQ ID NO：37标识的序列至少95％或98％同一的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码FIM抗原性多肽的mRNA包含与由SEQ ID NO：37标识的序列同一的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码FIM抗原性多肽的mRNA包含与由SEQ ID NO：36标识的序列至少95％或98％同一的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码FIM抗原性多肽的mRNA包含与由SEQ ID NO：36标识的序列同一的核苷酸序列。
在一些实施方案中，腺苷酸环化酶抗原性多肽选自由以下组成的组：ACT188LQ、ACTH63A_K65A_S66G和重复子毒素(RTX)结构域。在一些实施方案中，RTX抗原性多肽包含与由SEQID NO：41标识的序列至少80％、85％、90％、95％或98％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，RTX抗原性多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包含由SEQ ID NO：41标识的序列。在一些实施方案中，编码RTX抗原性多肽的mRNA包含与由SEQ ID NO：40标识的序列至少95％或98％同一的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码RTX抗原性多肽的mRNA包含与由SEQ ID NO：40标识的序列同一的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码RTX抗原性多肽的mRNA包含与由SEQ ID NO：39标识的序列至少95％或98％同一的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码RTX抗原性多肽的mRNA包含与由SEQ ID NO：39标识的序列同一的核苷酸序列。
在一些实施方案中，Brk抗原性多肽包含与由SEQ ID NO：44标识的序列至少80％、85％、90％、95％或98％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，Brk抗原性多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包含由SEQ ID NO：44标识的序列。在一些实施方案中，编码Brk抗原性多肽的mRNA包含与由SEQ ID NO：43标识的序列至少95％或98％同一的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码Brk抗原性多肽的mRNA包含与由SEQ ID NO：43标识的序列同一的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码Brk抗原性多肽的mRNA包含与由SEQ ID NO：42标识的序列至少95％或98％同一的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码Brk抗原性多肽的mRNA包含与由SEQ ID NO：42标识的序列同一的核苷酸序列。
在一些实施方案中，Vag8抗原性多肽包含与由SEQ ID NO：47标识的序列至少80％、85％、90％、95％或98％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，Vag8抗原性多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包含由SEQ ID NO：47标识的序列。在一些实施方案中，编码Vag8抗原性多肽的mRNA包含与由SEQ ID NO：46标识的序列至少95％或98％同一的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码Vag8抗原性多肽的mRNA包含与由SEQ ID NO：46标识的序列同一的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码Vag8抗原性多肽的mRNA包含与由SEQ ID NO：45标识的序列至少95％或98％同一的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码Vag8抗原性多肽的mRNA包含与由SEQ ID NO：45标识的序列同一的核苷酸序列。
在一些实施方案中，本文提供的任何组合物还包含至少一种mRNA多核苷酸，所述至少一种mRNA多核苷酸具有至少一个编码白喉抗原性多肽的ORF。在一些实施方案中，白喉抗原性多肽包含与由SEQ ID NO：50标识的序列至少80％、85％、90％、95％或98％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，白喉抗原性多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包含由SEQ ID NO：50标识的序列。在一些实施方案中，编码白喉抗原性多肽的mRNA包含与由SEQID NO：49标识的序列至少95％或98％同一的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码白喉抗原性多肽的mRNA包含与由SEQ ID NO：49标识的序列同一的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码白喉抗原性多肽的mRNA包含与由SEQ ID NO：48标识的序列至少95％或98％同一的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码白喉抗原性多肽的mRNA包含与由SEQ ID NO：48标识的序列同一的核苷酸序列。
在一些实施方案中，本文提供的任一种组合物还包含至少一种mRNA多核苷酸，所述至少一种mRNA多核苷酸具有至少一个编码破伤风抗原性多肽的ORF。在一些实施方案中，破伤风抗原性多肽包含与由SEQ ID NO：53标识的序列至少80％、85％、90％、95％或98％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，破伤风抗原性多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包含由SEQ ID NO：53标识的序列。在一些实施方案中，编码破伤风抗原性多肽的mRNA包含与由SEQ ID NO：52标识的序列至少95％或98％同一的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码破伤风抗原性多肽的mRNA包含与由SEQ ID NO：52标识的序列同一的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码破伤风抗原性多肽的mRNA包含与由SEQ ID NO：51标识的序列至少95％或98％同一的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码破伤风抗原性多肽的mRNA包含与由SEQID NO：51标识的序列同一的核苷酸序列。
在一些方面，提供了一种组合物，所述组合物包含至少一种信使核糖核酸(mRNA)多核苷酸，所述至少一种mRNA多核苷酸具有至少一个编码白喉抗原性多肽的开放阅读框(ORF)。在一些实施方案中，白喉抗原性多肽包含与由SEQ ID NO：50标识的序列至少80％、85％、90％、95％或98％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，白喉抗原性多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包含由SEQ ID NO：50标识的序列。在一些实施方案中，编码白喉抗原性多肽的mRNA包含与由SEQ ID NO：49标识的序列至少95％或98％同一的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码白喉抗原性多肽的mRNA包含与由SEQ ID NO：49标识的序列同一的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码白喉抗原性多肽的mRNA包含与由SEQ ID NO：48标识的序列至少95％或98％同一的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码白喉抗原性多肽的mRNA包含与由SEQ ID NO：48标识的序列同一的核苷酸序列。
在一些方面，提供了一种组合物，所述组合物包含至少一种信使核糖核酸(mRNA)多核苷酸，所述至少一种mRNA多核苷酸具有至少一个编码破伤风抗原性多肽的开放阅读框(ORF)。在一些实施方案中，破伤风抗原性多肽包含与由SEQ ID NO：53标识的序列至少80％、85％、90％、95％或98％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，破伤风抗原性多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包含由SEQ ID NO：53标识的序列。在一些实施方案中，编码破伤风抗原性多肽的mRNA包含与由SEQ ID NO：52标识的序列至少95％或98％同一的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码破伤风抗原性多肽的mRNA包含与由SEQ ID NO：52标识的序列同一的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码破伤风抗原性多肽的mRNA包含与由SEQID NO：51标识的序列至少95％或98％同一的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码破伤风抗原性多肽的mRNA包含与由SEQ ID NO：51标识的序列同一的核苷酸序列。
在一些实施方案中，本文提供的任一种组合物还包含编码抗原性融合多肽的mRNA，所述抗原性融合多肽选自由以下组成的组：百日咳抗原性融合多肽、破伤风抗原性融合多肽、白喉抗原性融合多肽或其组合。在一些实施方案中，抗原性融合多肽包含与选自SEQ ID NO：56、59、62、65、68、71、74、77、80、83、86、89、92、95和98的序列至少80％、85％、90％、95％或98％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗原性融合多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包含选自SEQ ID NO：56、59、62、65、68、71、74、77、80、83、86、89、92、95和98的序列。在一些实施方案中，编码抗原性融合多肽的mRNA包含与选自SEQ ID NO：55、58、61、64、67、70、73、76、79、82、85、88、91、94和97的序列至少95％或98％同一的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码抗原性融合多肽的mRNA包含与选自SEQ ID NO：55、58、61、64、67、70、73、76、79、82、85、88、91、94和97的序列同一的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码抗原性融合多肽的mRNA包含与选自SEQ ID NO：54、57、60、63、66、69、72、75、78、81、84、87、90、93和96的序列至少95％或98％同一的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码抗原性融合多肽的mRNA包含与选自SEQ ID NO：54、57、60、63、66、69、72、75、78、81、84、87、90、93和96的序列同一的核苷酸序列。
在一些实施方案中，mRNA包含5’非翻译区(UTR)，所述5’非翻译区包含SEQ ID NO：2的核苷酸序列。在一些实施方案中，mRNA包含3’UTR，所述3’UTR包含SEQ ID NO：4的核苷酸序列。在一些实施方案中，mRNA还包含化学修饰。在一些实施方案中，化学修饰是1-甲基假尿苷。
在一些实施方案中，本文所述的任一种组合物还包含脂质纳米颗粒。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含PEG修饰的脂质、非阳离子脂质、固醇、可电离氨基脂质或其任何组合。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含0.5-15mol％PEG修饰的脂质；5-25mol％非阳离子脂质；25-55mol％固醇；和20-60mol％可电离氨基脂质。
在一些实施方案中，PEG修饰的脂质是1，2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油、甲氧基聚乙二醇(PEG2000 DMG)，非阳离子脂质是1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)，固醇是胆固醇，并且可电离氨基脂质具有化合物1的结构：
在一些方面中，本公开提供了一种方法，所述方法包括向受试者施用有效地在所述受试者中诱导针对百日咳博德特氏菌的中和抗体反应的量的如前述权利要求中任一项所述的组合物。
在一些实施方案中，组合物是以有效地在受试者中诱导Th1免疫反应、Th17免疫反应、Th2反应或其组合的量施用。在一些实施方案中，组合物是以有效地减少或消除受试者中的百日咳症状的量施用。在一些实施方案中，组合物是以有效地减少或消除受试者的呼吸道的定殖的量施用。在一些实施方案中，组合物是以有效地降低或消除百日咳博德特氏菌的传播性的量施用。
在一些实施方案中，组合物作为加强进一步第二次施用。在一些实施方案中，加强剂量在第一剂量后28天施用。
本公开的各种实施方案的细节在以下描述中阐述。本公开的其他特征、目的和优点将是从说明书和权利要求书清楚的。
附图说明
附图并不是按比例绘制的。在附图中，在不同图中示出的每个个相同或接近相同的组成部分由类似数字表示。为了清楚起见，在每个附图中可能并非标记了每个组成部分。在附图中：
图1是描绘如实施例1中所述，在注射所指示的mRNA构建体且然后暴露于百日咳博德特氏菌后，小鼠的重量变化百分比(体重减轻)的图。
图2是显示如实施例1中所述，在注射所指示的mRNA构建体且然后暴露于百日咳博德特氏菌后，小鼠的血细胞结构的图。示出了白细胞、嗜中性粒细胞和淋巴细胞计数。
图3是显示如实施例1中所述，在注射所指示的mRNA构建体且然后暴露于百日咳博德特氏菌后，小鼠中IL-6的浓度的图。
图4是显示如实施例1中所述，在注射所指示的mRNA构建体且然后暴露于百日咳博德特氏菌后，小鼠气管和肺中的细菌负荷(如通过CFU所测量)的图。
图5是显示如实施例1中所述，在注射所指示的mRNA构建体且然后暴露于百日咳博德特氏菌后，小鼠鼻灌洗液中的细菌负荷(如通过CFU所测量)的图。
图6A-6B示出针对毒素的抗体滴度。图6A示出施用加强剂量后一周的抗体滴度(抗PT)(实施例1)，并且图6B示出激发后三天的抗RTX抗体滴度(实施例1)。
图7A-7B示出另外的抗体滴度表征。图7A示出使用细胞外百日咳蛋白作为抗原的抗体滴度(100种蛋白质)，图7B示出来自活百日咳博德特氏菌结合测定的结果(全病菌滴度)。
图8是示出激发后三天通过ELISA测定的针对百日咳毒素的血清IgG抗体滴度的图(实施例2)。数据呈现为平均值±SEM，每个时间点每个治疗组n＝5。**与模拟疫苗接种显著不同(p＜0.005)，***与模拟疫苗接种显著不同(p＜0.0005)。黑色虚线指示最低检测限。使用Kruskal-Wallis非参数检验与邓恩(Dunnet)事后检验进行统计分析。
图9是显示激发后三天通过ELISA测定的针对全病菌(UT25)的血清IgG抗体滴度的图(实施例2)。数据呈现为平均值±SEM，每个时间点每个处理组n＝5。*与模拟疫苗接种显著不同(p＜0.05)，**与模拟疫苗接种显著不同(p＜0.005)，***与模拟疫苗接种显著不同(p＜0.0005)。黑色虚线指示最低检测限。使用Kruskal-Wallis非参数检验与邓恩(Dunnet)事后检验进行统计分析。
图10A-10B是显示激发后三天在受试者肺和气管(图10A)以及鼻灌洗液(图10B)中测量的细菌负荷的图(实施例2)。
图11A-11B是显示在加强施用不同剂量的疫苗之前和加强施用不同剂量的疫苗之后小鼠中的抗白喉毒素滴度(图11A)和抗破伤风毒素滴度(图11B)的图(实施例3)。
图12是显示由以10μg剂量施用的三种不同抗原产生的IC50的汇总图(实施例3)。
图13显示百日咳博德特氏菌激发后三天肺和气管样品中的菌落形成单位(CFU)。数据呈现为平均值±SEM(平均值的标准误差)，每个处理组n＝5，NS＝无显著性，*与模拟疫苗接种显著不同(p＜0.0231)，****与模拟疫苗接种显著不同(p＜0.0001)。黑线指示最低检测限。采用单因素ANOVA与杜凯氏(Tukeys’)事后检验进行统计分析。
图14示出来自百日咳博德特氏菌激发后三天的鼻灌洗液样品中的CFU。数据呈现为平均值±SEM，每个处理组n＝5。NS＝无显著性。黑线指示最低检测限。采用单因素ANOVA与杜凯氏事后检验进行统计分析。
图15示出来自百日咳博德特氏菌激发后三天的鼻相关淋巴组织(NALT)中存在的CFU。数据呈现为平均值±SEM，每个处理组n＝5。黑线指示最低检测限。*与模拟疫苗接种显著不同(p＜0.0326)，采用单因素ANOVA与杜凯氏事后检验进行统计分析。
图16示出激发当天与激发后三天之间小鼠重量的变化百分比。在激发当天称重，然后在激发后3天称重。数据呈现为平均重量变化百分比±SEM，每个处理组n＝5。
图17示出百日咳博德特氏菌激发后三天，不同免疫组之间的完全白细胞计数。激发后使用Hemavet测定嗜中性粒细胞计数。数据呈现为平均值±SEM，每个处理组n＝5。NS＝无显著性。采用单因素ANOVA与杜凯氏事后检验进行统计分析。
图18示出百日咳博德特氏菌激发后三天，不同免疫组之间的嗜中性粒细胞计数。激发后使用Hemavet测定嗜中性粒细胞计数。数据呈现为平均值±SEM，每个时间点每个治疗组n＝5。NS＝无显著性。采用单因素ANOVA与杜凯氏事后检验进行统计分析。
图19示出百日咳博德特氏菌激发后三天，不同免疫组之间的淋巴细胞计数。激发后使用Hemavet测定淋巴细胞计数。数据呈现为平均值±SEM，每个时间点每个治疗组n＝5。NS＝无显著性。采用单因素ANOVA与杜凯氏事后检验进行统计分析。
图20示出百日咳博德特氏菌激发后三天，不同免疫组之间的单核细胞计数。激发后使用Hemavet测定单核细胞计数。数据呈现为平均值±SEM，每个时间点每个治疗组n＝5。NS＝无显著性。采用单因素ANOVA与杜凯氏事后检验进行统计分析。
图21示出百日咳博德特氏菌激发后三天，不同免疫组之间的嗜酸性粒细胞计数。激发后使用Hemavet测定嗜酸性粒细胞计数。数据呈现为平均值±SEM，每个时间点每个治疗组n＝5。NS＝无显著性。采用单因素ANOVA与杜凯氏事后检验进行统计分析。
图22示出针对全病菌(百日咳博德特氏菌菌株UT25)的血清抗体(IgG)滴度。数据呈现为平均值±SEM，每个处理组n＝5。*与模拟疫苗接种显著不同(p＜0.0372)，**与模拟疫苗接种显著不同(p＜0.0091)，***与模拟疫苗接种显著不同(p＜0.0007)。黑线指示最低检测限。使用Kruskal-Wallis非参数检验与邓恩(Dunnet)事后检验进行统计分析。
图23示出激发后三天针对百日咳毒素(PT)的血清抗体(IgG)滴度。数据呈现为平均值±SEM，每个处理组n＝5。*与模拟疫苗接种显著不同(p＜0.0313)，****与模拟疫苗接种显著不同(p＜0.0001)。黑线指示最低检测限。使用Kruskal-Wallis非参数检验与邓恩(Dunnet)事后检验进行统计分析。
图24示出激发后三天针对白喉毒素的血清抗体(IgG)滴度。数据呈现为平均值±SEM，每个处理组n＝5。*与模拟疫苗接种显著不同(p＜0.0182)，***与模拟疫苗接种显著不同(p＜0.0009)。黑线指示最低检测限。使用Kruskal-Wallis非参数检验与邓恩(Dunnet)事后检验进行统计分析。
图25示出激发后三天针对破伤风毒素的血清抗体(IgG)滴度。数据呈现为平均值±SEM，每个时间点每个治疗组n＝5。**与模拟疫苗接种显著不同(p＜0.0040)，***与模拟疫苗接种显著不同(p＜0.0009)。黑线指示最低检测限。使用Kruskal-Wallis非参数检验与邓恩(Dunnet)事后检验进行统计分析。
图26示出肺上清液样品中的IL-6水平。数据呈现为平均值±SEM，每个时间点每个治疗组n＝5。****与NVNC显著不同(p＜0.0001)。所有组均与模拟疫苗接种显著不同(p＜0.0001)。灰色实心圆圈指示测量值超出检测范围。采用单因素ANOVA与杜凯氏事后检验进行统计分析。
图27示出血清样品中的IL-6水平。数据呈现为平均值±SEM，每个时间点每个治疗组n＝5。****与NVNC显著不同(p＜0.0005)，所有均与模拟疫苗接种显著不同(p＜0.0001)。灰色实心圆圈指示测量值超出检测范围。采用单因素ANOVA与杜凯氏事后检验进行统计分析。
图28示出在初免疫苗接种剂量后两周，小鼠中的抗百日咳博德特氏菌抗体滴度。
图29A-29C示出来自用百日咳博德特氏菌菌株UT25或D420激发的小鼠在激发后第1天(图29A)、第3天(图29B)和第7天(图29C)的肺和气管样品中的菌落形成单位(CFU)。
图30A-30B示出来自用百日咳博德特氏菌菌株UT25(图30A)或D420(图30B)激发的小鼠的肺和气管样品中CFU的时间过程。
具体实施方式
百日咳博德特氏菌是一种高度接触传染性、需氧、非芽孢形成性革兰氏阴性球杆菌。细菌附着至呼吸道上皮细胞的纤毛并产生毒素，所述毒素对免疫细胞有多种影响。例如，百日咳毒素(PT)抑制驻留气道巨噬细胞的保护性抗菌功能并抑制嗜中性粒细胞流入气道。随着细菌繁殖，炎症和粘液分泌过多发生。百日咳抗原允许细菌逃避宿主防御，因为促进了淋巴细胞增多同时趋化性受损。由百日咳博德特氏菌产生的毒力因子包括与粘连相关并在附着/定殖、持久性和携带中起作用的那些，其包括：丝状血凝素(FHA)、凝集原、百日咳杆菌粘附素和菌毛(FIM)。其他毒力因子是毒素，它们在病理学和持久性中发挥作用。百日咳博德特氏菌毒素包括：百日咳毒素(PT)、腺苷酸环化酶毒素(ACT)、气管细胞毒素、皮肤坏死毒素、耐热毒素和LPS(脂多糖；内毒素)。
已经使用了百日咳疫苗的两种主要方法。在全细胞疫苗(wP)中，疫苗包含热灭活或福尔马林灭活的百日咳博德特氏菌培养物，包括大量的抗原。存在一些副作用，并且疫苗对一些个体是禁忌的。与自然感染相似，wP疫苗触发Th1和Th17免疫反应。保护持续3-5年。wP疫苗在儿童中是反应原性的，并且以各种不同的方式生产，从而产生异源疫苗。相比之下，非细胞疫苗(aP)，其包含通过化学方法去毒的重组/纯化的细菌抗原(例如，PT、FHA、PRN和FIM2/3)。aP疫苗(DTaP，用于儿童；Tdap，用于成人)需要三个剂量来达到大约85％的功效并且保护持续时间未知；然而，两年后功效下降。aP疫苗触发Th2偏向的免疫反应。目前的aP疫苗不包括某些毒力因子，如ACT。此外，aP疫苗通过中和来预防症状性疾病；然而，它们不能预防定殖或传播(例如，接种疫苗的个体可能是无症状携带者)。已经发现，与用wP疫苗初免的儿童相比，用aP疫苗初免的儿童急性感染的风险高2至5倍。此外，儿童是易感的，因为已经服用aP疫苗的成人可能是感染储主。
本文提供了编码百日咳博德特氏菌抗原和任选的白喉和/或破伤风抗原的核酸疫苗，所述核酸疫苗提供持久保护，包括预防定殖和传播。作为mRNA疫苗递送的疫苗抗原的组合是特别有效的。本文所述的疫苗还引发Th1、Th2和/或Th17免疫反应。
抗原
本发明的组合物(例如疫苗组合物)的特征在于设计用于编码目标抗原(例如，源自百日咳博德特氏菌、白喉或破伤风蛋白的抗原)的核酸，特别是mRNA。本发明的组合物(例如疫苗组合物)不包含抗原本身，而是包含一旦递送至细胞、组织或受试者即编码抗原或抗原性序列的核酸，特别是mRNA。核酸(特别是mRNA)的递送是通过将所述核酸配制在适当载体或递送媒介物(例如，脂质纳米颗粒)中来实现，使得在施用至细胞、组织或受试者后，核酸由细胞摄取，所述细胞进而表达由核酸(例如mRNA)编码的蛋白质。
如本文所用的抗原是能够诱导免疫反应(例如，引起免疫系统产生针对抗原的抗体)的蛋白质。本公开的疫苗提供优于传统的基于蛋白质的疫苗接种方法的独特优点，其中蛋白质抗原是在体外纯化或产生的，例如重组蛋白质生产技术。本公开的疫苗的特征在于编码所需抗原的mRNA，当将其引入体内时，即在体内施用至哺乳动物受试者(例如人)，引起身体细胞表达所需抗原。
细菌抗原，诸如本文公开的那些，通常不在哺乳动物细胞中产生。因此，为了产生其中细菌抗原由受试者(例如，由哺乳动物细胞)产生的mRNA疫苗，进行若干修饰。首先，细菌在其外膜蛋白上包含形成β桶的自主转运蛋白结构域，从而允许细菌输出毒力因子(例如毒素)。这个过程有助于蛋白质的正确折叠。哺乳动物细胞不具有自主转运蛋白或β桶，并且当在哺乳动物细胞中产生编码此类结构的mRNA时，所得结构不能适当地适合哺乳动物膜。为了解决这个问题，本文公开的抗原包含分泌信号，使得它们在类似于细菌中的自主转运蛋白输出的过程中从哺乳动物细胞分泌。其次，细菌系统使蛋白质糖基化；然而，糖基化在哺乳动物细胞中确实经常发生。为了防止糖基化，本文所述的mRNA编码抗原，其中倾向于N-连接糖基化的残基(例如，天冬酰胺)已被去除、修饰或取代以防止糖基化。
为了促进将本公开的mRNA递送至身体细胞，将mRNA包封在脂质纳米颗粒(LNP)中。在递送和由身体细胞摄取后，mRNA在胞质溶胶中被翻译，并且蛋白质抗原由宿主细胞机器产生。蛋白质抗原被呈递并引发适应性体液和细胞免疫反应。中和抗体针对所表达的蛋白抗原，并且因此蛋白质抗原被认为是疫苗开发的相关靶抗原。在本文中，除非另有说明，否则术语“抗原”的使用涵盖免疫原性蛋白和免疫原性片段(诱导(或能够诱导)针对百日咳博德特氏菌和任选的白喉和/或破伤风的免疫反应)。应理解，术语“蛋白质”涵盖肽，并且术语“抗原”涵盖抗原性片段。
许多蛋白质具有四级或三维结构，其由一个以上多肽或若干缔合成寡聚分子的多肽链组成。如本文所用，术语“亚基”是指单一蛋白质分子，例如，由加工新生蛋白质分子产生的多肽或多肽链，所述亚基与其他蛋白质分子(例如亚基或链)组装(或“共组装”)形成蛋白质复合体。蛋白质可具有相对小数目的亚基，并且因此阐述为“寡聚的”，或者可由大数目的亚基组成并且因此阐述为“多聚的”。寡聚或多聚蛋白质的亚基可为相同的、同源的或完全不相似的，并且专用于不同的任务。
蛋白质或蛋白质亚基还可包含结构域。如本文所用的术语“结构域”是指蛋白质内不同的功能和/或结构单元。通常，“结构域”负责特定功能或相互作用，从而有助于蛋白质的总体作用。结构域可存在于各种生物环境中。相似结构域(即，共享结构、功能和/或序列同源性的结构域)可存在于单一蛋白质内或者可存在于具有相似或不同功能的不同蛋白质内。蛋白质结构域通常是给定蛋白质三级结构或序列的保守部分，其可独立于蛋白质或其亚基的其余部分起作用和存在。
如本文所用，术语抗原不同于术语“表位”，所述表位是抗原的亚结构，例如多肽(如7-10个氨基酸)或碳水化合物结构，其可由抗原结合位点识别，但不足以诱导免疫反应。本领域阐述了以分离形式递送至受试者或免疫细胞的蛋白抗原，例如分离的蛋白质、多肽或肽抗原，然而，蛋白抗原的设计、测试、验证和产生可为昂贵且耗时的，尤其是当大规模产生蛋白时。相反，mRNA技术可用于快速设计和测试编码各种抗原的mRNA构建体。此外，结合配制在适当递送媒介物(例如，脂质纳米颗粒)中的mRNA的快速产生可快速进行并且可快速大规模产生mRNA疫苗。潜在益处还来自于以下事实：由本发明的mRNA编码的抗原由受试者的细胞表达，例如由人体表达，并且因此，受试者(例如人体)用作“工厂”以产生抗原，其进而引发期望免疫反应。
如本文提供的组合物可包括编码相同或不同百日咳菌株的两种或更多种抗原的RNA或多种RNA。本文还提供了包含编码一种或多种百日咳抗原和不同生物体的一种或多种抗原的RNA的组合疫苗。因此，本公开的疫苗可为靶向相同株/种类的一种或多种抗原或不同株/种类的一种或多种抗原的组合疫苗，例如诱导对在百日咳感染风险高的相同地理区域发现的生物体或个体在暴露于百日咳博德特氏菌时有可能暴露于其的生物体的免疫性的抗原。
所编码的百日咳、白喉和破伤风抗原
本文提供的组合物包含编码至少一种百日咳、白喉或破伤风抗原的mRNA，如下文所述。由mRNA编码的每种抗原例如使用突变进行化学去毒。
百日咳毒素包含五个亚基。A亚基(S1)是毒素。它与G蛋白结合并使其失活，以及抑制细胞因子信号传导。B五聚体(S2-S5)与宿主的膜受体结合。如本文所述，在一些实施方案中，疫苗包含编码可溶性S1的mRNA(例如，S1亚基通过除去其插入B五聚体中的C-末端螺旋而溶解)。在一些实施方案中，可溶性S1用至少一个突变(例如9K_129G)去毒。
百日咳的自主转运蛋白抗原包括百日咳杆菌粘附素、SphB1、TcfA、BrkA和Vag8。每个抗原含有N-末端过客结构域和C-末端β桶输出蛋白(通道)结构域。许多过客结构域在表面被保守的蛋白酶位点切割。在一些实施方案中，本文所述的疫苗包含编码至少一种自主转运蛋白抗原(例如，百日咳杆菌粘附素、SphB1、TcfA、BrkA和Vag8)的mRNA。在一些实施方案中，自主转运蛋白抗原在蛋白酶切割位点处(例如，在天冬酰胺与丙氨酸残基之间)被截短。
丝状血凝素粘附素(FHA)是一种大型丝状蛋白，其作为主要附着因子粘附于呼吸道(例如，呼吸道上皮)的宿主纤毛上皮细胞。所述蛋白质是百日咳博德特氏菌的毒力因子并且其与生物膜形成相关。所述蛋白质包含至少三个结合结构域，其可结合至上皮细胞表面上的不同细胞受体，包括肝素结合结构域(HEP)、碳水化合物结合结构域(FragA)和Mal85短片段。在一些实施方案中，FHA抗原包含FHA截短蛋白，并且选自由以下组成的组：FHA1_HEP430-873、FHA2_FragA1141-1273、FHA3_MAL851655-2111和FHA4_Long430-1279。FHA4_Long430-1279构建体包含肝素结合结构域和碳水化合物结合结构域两者。
在一些实施方案中，组合物包含编码腺苷酸环化酶毒素构建体的mRNA。腺苷酸环化酶毒素是1706个氨基酸残基长的蛋白质，其包含三个结构域：腺苷酸环化酶结构域、疏水结构域和钙结合重复序列。毒素由I型分泌系统分泌，其允许毒素从细胞质直接分泌到细胞外。大多数毒素仍然与细胞内的FHA缔合，但没有活性。聚集也使毒素失活，并且其快速失活突出了分泌型细菌与靶细胞之间的紧密接触的必要性。腺苷酸环化酶毒素通过补体受体3(CD11b/CD18或Mac-1)结合至靶细胞，通常是吞噬细胞(例如嗜中性粒细胞)。毒素的溶血素部分然后结合至靶膜并将其自身插入双层中，导致腺苷酸环化酶(AC)结构域易位至细胞质的细胞质膜中。AC结构域然后结合钙调蛋白并催化从ATP不受调控地产生cAMP。cAMP的过量产生影响许多细胞过程，包括吞噬细胞的杀菌功能。重复子毒素(Repeat-in-toxin)(RTX)也是家族的一部分，并且包含重复的富含天冬氨酸和甘氨酸的九肽。RTX蛋白在细胞膜中形成孔。在一些实施方案中，组合物(例如疫苗)包含编码至少一种腺苷酸环化酶毒素(ACT)构建体的mRNA，所述ACT构建体选自由以下组成的组：ACT188LQ、ACTH63A_K65A_S66G和RTX1006-1600。ACT的催化结构域可通过例如LQ188插入或每个催化残基突变为丙氨酸或甘氨酸(H63A/K65A/S66G)来去毒。
在一些实施方案中，组合物(例如疫苗)包含编码至少一种菌毛(FIM)抗原的mRNA。FIM蛋白是包含数千个菌毛蛋白亚基的长而细的毛发状聚合物。FIM生物发生需要一种细菌蛋白质系统，所述系统包括：外膜B-桶引导蛋白以使亚基易位、在聚合物末端的结合寡糖的尖端粘附蛋白和周质伴侣蛋白以稳定菌毛亚基直到组装。百日咳博德特氏菌中的主要菌毛蛋白是Fim2和Fim3，它们在感染过程中附着至呼吸道上皮细胞。在一些实施方案中，组合物(例如，疫苗)包含编码至少一种FIM蛋白的mRNA，诸如菌毛结构域交换构建体。实例包括FimD_Fim2和Fim2_Fim2_Fim2。
在一些实施方案中，组合物(例如疫苗)包含编码至少一种白喉抗原(例如白喉毒素)的mRNA。白喉是由白喉棒状杆菌细菌引起的感染并且引起喉咙痛和发热，但可导致喉咙中形成灰色或白色斑块，从而阻塞气道并引起犬吠样咳嗽。在严重情况下，白喉是致命的。白喉毒素是单一的60-kDa分子量蛋白质，其包含两条肽链，即通过二硫键连接的片段A和片段B。片段B是使毒素进入宿主细胞的识别亚基，并且片段A通过催化延伸因子EF-2的ADP-核糖基化来抑制受影响细胞中新蛋白质的合成。
在一些实施方案中，组合物(例如疫苗)包含编码至少一种破伤风抗原(例如破伤风毒素)的mRNA。破伤风是一种细菌感染，其特征在于可能致命的肌肉痉挛。破伤风是由感染破伤风梭菌细菌引起的。破伤风毒素，即破伤风痉挛毒素包含重链和轻链。存在三个结构域，每个结构域均有助于毒素的病理生理学。重链包含两个结构域：重链的N-末端侧有助于膜易位，并且C-末端侧有助于毒素定位正确神经元上的特异性受体位点。轻链结构域切割小突触囊泡(SSV)的膜融合所必需的囊泡相关膜蛋白(VAMP)。SSV携带神经递质至细胞膜进行释放，并且抑制这一过程会阻断神经递质释放，从而导致特征性痉挛。
在一些实施方案中，组合物(例如疫苗)包含编码第一百日咳抗原性多肽的第一mRNA，所述第一百日咳抗原性多肽选自由以下组成的组：百日咳毒素抗原性多肽、自主转运蛋白枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶(SPHB1)抗原性多肽、气管定殖因子A(TCFA)抗原性多肽、丝状血凝素(FHA)抗原性多肽、百日咳杆菌粘附素(PRN)抗原性多肽、菌毛(FIM)抗原性多肽、腺苷酸环化酶抗原性多肽和博德特氏菌抗杀性(Brk)抗原性多肽。
在一些实施方案中，组合物(例如疫苗)还包含编码第二百日咳抗原性多肽的第二mRNA，所述第二百日咳抗原性多肽选自由以下组成的组：百日咳毒素抗原性多肽、自主转运蛋白枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶(SPHB1)抗原性多肽、气管定殖因子A(TCFA)抗原性多肽、丝状血凝素(FHA)抗原性多肽、百日咳杆菌粘附素(PRN)抗原性多肽、菌毛(FIM)抗原性多肽、腺苷酸环化酶抗原性多肽和博德特氏菌抗杀性(Brk)抗原性多肽。
在一些实施方案中，组合物(例如疫苗)还包含编码第三百日咳抗原性多肽的第三mRNA，所述第三百日咳抗原性多肽选自由以下组成的组：百日咳毒素抗原性多肽、自主转运蛋白枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶(SPHB1)抗原性多肽、气管定殖因子A(TCFA)抗原性多肽、丝状血凝素(FHA)抗原性多肽、百日咳杆菌粘附素(PRN)抗原性多肽、菌毛(FIM)抗原性多肽、腺苷酸环化酶抗原性多肽和博德特氏菌抗杀性(Brk)抗原性多肽。
在一些实施方案中，组合物(例如疫苗)还包含编码第四百日咳抗原性多肽的第四mRNA，所述第四百日咳抗原性多肽选自由以下组成的组：百日咳毒素抗原性多肽、自主转运蛋白枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶(SPHB1)抗原性多肽、气管定殖因子A(TCFA)抗原性多肽、丝状血凝素(FHA)抗原性多肽、百日咳杆菌粘附素(PRN)抗原性多肽、菌毛(FIM)抗原性多肽、腺苷酸环化酶抗原性多肽和博德特氏菌抗杀性(Brk)抗原性多肽。
在一些实施方案中，组合物(例如疫苗)还包含编码第五百日咳抗原性多肽的第五mRNA，所述第五百日咳抗原性多肽选自由以下组成的组：百日咳毒素抗原性多肽、自主转运蛋白枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶(SPHB1)抗原性多肽、气管定殖因子A(TCFA)抗原性多肽、丝状血凝素(FHA)抗原性多肽、百日咳杆菌粘附素(PRN)抗原性多肽、菌毛(FIM)抗原性多肽、腺苷酸环化酶抗原性多肽和博德特氏菌抗杀性(Brk)抗原性多肽。
在一些实施方案中，组合物(例如疫苗)还包含编码第六百日咳抗原性多肽的第六mRNA，所述第六百日咳抗原性多肽选自由以下组成的组：百日咳毒素抗原性多肽、自主转运蛋白枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶(SPHB1)抗原性多肽、气管定殖因子A(TCFA)抗原性多肽、丝状血凝素(FHA)抗原性多肽、百日咳杆菌粘附素(PRN)抗原性多肽、菌毛(FIM)抗原性多肽、腺苷酸环化酶抗原性多肽和博德特氏菌抗杀性(Brk)抗原性多肽。
在一些实施方案中，组合物(例如疫苗)包含编码第七百日咳抗原性多肽的第七mRNA，所述第七百日咳抗原性多肽选自由以下组成的组：百日咳毒素抗原性多肽、自主转运蛋白枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶(SPHB1)抗原性多肽、气管定殖因子A(TCFA)抗原性多肽、丝状血凝素(FHA)抗原性多肽、百日咳杆菌粘附素(PRN)抗原性多肽、菌毛(FIM)抗原性多肽、腺苷酸环化酶抗原性多肽和博德特氏菌抗杀性(Brk)抗原性多肽。
在一些实施方案中，组合物(例如疫苗)包含编码第八百日咳抗原性多肽的第八mRNA，所述第八百日咳抗原性多肽选自由以下组成的组：百日咳毒素抗原性多肽、自主转运蛋白枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶(SPHB1)抗原性多肽、气管定殖因子A(TCFA)抗原性多肽、丝状血凝素(FHA)抗原性多肽、百日咳杆菌粘附素(PRN)抗原性多肽、菌毛(FIM)抗原性多肽、腺苷酸环化酶抗原性多肽和博德特氏菌抗杀性(Brk)抗原性多肽。
在一些实施方案中，组合物(例如疫苗)包含至少一种mRNA多核苷酸(例如，1、2、3、4、5、6、7或8种mRNA多核苷酸)，所述至少一种mRNA多核苷酸具有至少一个编码选自由以下组成的组的每种百日咳抗原性多肽中的至少一种的ORF：百日咳毒素抗原性多肽、自主转运蛋白枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶(SPHB1)抗原性多肽、气管定殖因子A(TCFA)抗原性多肽、丝状血凝素(FHA)抗原性多肽、百日咳杆菌粘附素(PRN)抗原性多肽、菌毛(FIM)抗原性多肽、腺苷酸环化酶抗原性多肽和博德特氏菌抗杀性(Brk)抗原性多肽。
在一些实施方案中，组合物(例如疫苗)还包含至少一种mRNA多核苷酸，所述至少一种mRNA多核苷酸具有至少一个编码白喉抗原性多肽的ORF。在一些实施方案中，组合物(例如疫苗)还包含至少一种mRNA多核苷酸，所述至少一种mRNA多核苷酸具有至少一个编码破伤风抗原性多肽的ORF。在一些实施方案中，组合物(例如疫苗)还包含至少一种具有至少一个编码白喉抗原性多肽的ORF的mRNA多核苷酸和至少一种具有至少一个编码破伤风抗原性多肽的ORF的mRNA多核苷酸。
在一些实施方案中，组合物(例如疫苗)包含至少一种mRNA多核苷酸，所述至少一种mRNA多核苷酸具有至少一个编码白喉抗原性多肽的ORF。在一些实施方案中，组合物(例如疫苗)包含至少一种mRNA多核苷酸，所述至少一种mRNA多核苷酸具有至少一个编码破伤风抗原性多肽的ORF。
在本发明的每个实施方案或方面中，应理解，特征疫苗包含包封在脂质纳米颗粒(LNP)内的mRNA。虽然有可能将每种独特的mRNA包封在其自身的LNP中，但mRNA疫苗技术具有能够将几种mRNA包封在单一LNP产物中的显著技术优势。在其他实施方案中，疫苗是单独的疫苗，所述疫苗不是共配制的，但可在施用前单独混合或简单地单独施用。
由本公开的mRNA编码的百日咳抗原、白喉抗原和破伤风抗原的示例性序列提供于表1中。在一些实施方案中，mRNA疫苗编码与选自SEQ ID NO：5、8、11、14、17、20、23、26、29、32、35、38、41、44、47、50和53的序列80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或同一的多肽。
核酸
本公开的组合物包含(至少一种)信使RNA(mRNA)，所述mRNA具有编码百日咳抗原、白喉抗原或破伤风抗原的开放阅读框(ORF)。在一些实施方案中，mRNA还包含5’UTR、3’UTR、poly(A)尾和/或5’帽类似物。
还应理解，本公开的组合物(例如疫苗)可包括任何5’非翻译区(UTR)和/或任何3’UTR。示例性UTR序列包括SEQ ID NO：11-14；然而，其他UTR序列可使用或替换本文所述的任何UTR序列。在一些实施方案中，本公开的5’UTR包含选自SEQ ID NO：99(GGGAAAUA AGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACC)和SEQ ID NO：2(GGGAAAUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGACCCCGGCGCCGCCACC)的序列。在一些实施方案中，本公开的3’UTR包含选自SEQ ID NO：100(UGAUAAUAGGCUGGAGCCUCGGUGGCCAUGCUU CUUGCCCCUUGGGCCUCCCCCCAGCCCCUCCUCCCCUUCCUGCACCCGUACCCCCGUGGUCUUUGAAUAAAGUCUGAGUGGGCGGC)和SEQ ID NO：4(UGAUAA UAGGCUGGAGCCUCGGUGGCCUAGCUUCUUGCCCCUUGGGCCUCCCCCCAGCCCCUCCUCCCCUUCCUGCACCCGUACCCCCGUGGUCUUUGAAUAAAGUCUGAGUGGGCGGC)的序列。还可从本文提供的RNA多核苷酸省略UTR。
核酸包含核苷酸(核苷酸单体)的聚合物。因此，核酸也称为多核苷酸。核酸可为或者可包括例如脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、苏糖核酸(TNA)、二醇核酸(GNA)、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA，包括具有β-D-核糖构型的LNA、具有α-L-核糖构型的α-LNA(LNA的非对映异构体)、具有2′-氨基官能化的2′-氨基-LNA和具有2′-氨基官能化的2′-氨基-α-LNA)、乙烯核酸(ENA)、环己烯基核酸(CeNA)和/或其嵌合体和/或组合。
信使RNA(mRNA)是编码(至少一种)蛋白质(天然存在的、非天然存在的或经修饰的氨基酸聚合物)的任何RNA，并且可经翻译以在体外、体内、原位或离体产生编码的蛋白质。本领域技术人员应理解，除非另有说明，否则本申请中所阐释的核酸序列可在代表性DNA序列中列举“T”，但在序列表示mRNA的情况下，“T”将被取代为“U”。因此，所公开和由本文特定序列识别号标识的任何DNA还公开了与DNA互补的相应mRNA序列，其中DNA序列的每个“T”被“U”取代。
开放阅读框(ORF)是一段连续的DNA或RNA，以起始密码子(例如，甲硫氨酸(ATG或AUG))开始并以终止密码子(例如TAA、TAG或TGA，或UAA、UAG或UGA)结束。ORF通常编码蛋白质。应理解，本文公开的序列还可包含额外元件，例如5’和3’UTR，但与ORF不同，那些元件不一定存在于本公开的RNA多核苷酸中。
编码本公开的百日咳抗原、白喉抗原和破伤风抗原的mRNA的示例性序列提供于表1中。在一些实施方案中，mRNA包含开放阅读框(ORF)，所述开放阅读框与选自SEQ ID NO：3、7、10、13、16、19、22、25、28、31、34、37、40、43、46、49和52的序列80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或同一。在一些实施方案中，mRNA包含与选自SEQ ID NO：1、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48和51的序列80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或同一的核苷酸序列。
变体
在一些实施方案中，本公开的组合物包含编码至少一种百日咳抗原变体、白喉抗原变体或破伤风抗原变体的RNA。抗原变体或其他多肽变体是指其氨基酸序列与野生型、天然或参照序列不同的分子。与天然或参照序列相比，抗原/多肽变体可在氨基酸序列内的某些位置处具有取代、缺失和/或插入。通常，变体与野生型、天然或参照序列具有至少50％的同一性。在一些实施方案中，变体与野生型、天然或参照序列共享至少80％或至少90％的同一性。
由本公开的核酸编码的变体抗原/多肽可含有赋予多种期望性质中的任一者的氨基酸变化，例如，在受试者中增强其免疫原性、增强其表达和/或改善其稳定性或PK/PD性质。变体抗原/多肽可使用常规诱变技术制备，并且适当地进行测定以确定其是否具有期望性质。确定表达水平和免疫原性的测定是本领域中熟知的。类似地，可使用本领域公认的技术，例如通过测定抗原在接种的受试者中随时间推移的表达和/或通过观察诱导的免疫反应的耐久性，来测量蛋白质变体的PK/PD性质。由变体核酸编码的蛋白质的稳定性可通过测定热稳定性或尿素变性时的稳定性来测量，或者可使用计算机预测来测量。用于此类实验和计算机测定的方法是本领域中已知的。
在一些实施方案中，组合物包含RNA或RNA ORF，其包含本文提供的序列中的任一者的核苷酸序列，或者包含与本文提供的序列中的任一者的核苷酸序列至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的核苷酸序列。
术语“同一性”是指如通过比较序列确定的两种或更多种多肽(例如抗原)或多核苷酸(核酸)的序列之间的关系。同一性也指如通过两个或更多个氨基酸残基或核酸残基串之间的匹配数确定的序列之间或之中的序列相关性程度。同一性度量由特定数学模型或计算机程序(例如，“算法”)处理的具有空位比对(如果有的话)的两个或更多个序列中的较小者间的同一性匹配百分比。相关抗原或核酸的同一性可容易地通过已知方法计算。“同一性百分比(％)”当应用于多肽或多核苷酸序列时，定义为在比对序列并引入空位(必要时)以实现最大同一性百分比之后，候选氨基酸或核酸序列中与第二序列的氨基酸序列或核酸序列中的残基(氨基酸残基或核酸残基)同一的残基的百分数。用于比对的方法和计算机程序是本领域熟知的。应理解，同一性取决于同一性百分比的计算，但由于计算中引入的空位和罚分，同一性的值可能不同。通常，特定多核苷酸或多肽(例如抗原)的变体与所述特定参照多核苷酸或多肽具有如通过本文所述和本领域技术人员已知的序列比对程序和参数所确定的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％但小于100％的序列同一性。用于比对的此类工具包括BLAST套件的那些工具(Stephen F.Altschul等人(1997)，“Gapped BLAST and PSI-BLAST：a new generation of protein database searchprograms”，Nucleic Acids Res.25：3389-3402)。另一种常用局部比对技术是基于Smith-Waterman算法(Smith，T.F.和Waterman，M.S.(1981)“Identification of commonmolecular subsequences.”J.Mol.Biol.147：195-197)。基于动态程序化的通用全局比对技术是Needleman-Wunsch算法(Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.(1970)“A general methodapplicable to the search for similarities in the amino acid sequences of twoproteins.”J.Mol.Biol.48：443-453)。最近，已开发出一种快速最佳全局序列比对算法(FOGSAA)，据称其比其他最佳全局比对方法(包括Needleman-Wunsch算法)更快地产生核苷酸和蛋白质序列的全局比对。
因此，编码相对于参照序列、特别是本文公开的多肽(例如抗原)序列含有取代、插入和/或添加、缺失和共价修饰的肽或多肽的多核苷酸包括在本公开的范围内。例如，序列标签或氨基酸(例如一个或多个赖氨酸)可添加至肽序列中(例如，在N末端或C末端)。序列标签可用于肽检测、纯化或定位。赖氨酸可用于增加肽溶解度或允许生物素化。或者，位于肽或蛋白质的氨基酸序列的羧基和氨基末端区处的氨基酸残基可任选地被缺失，从而提供截短序列。根据序列的用途，例如作为可溶或连接至固体载体的更大序列的一部分的序列的表达，某些氨基酸(例如，C末端或N末端残基)可替代地缺失。在一些实施方案中，信号序列、终止序列、跨膜结构域、接头、多聚化结构域(例如，折叠子区)等(或编码其)的序列可用实现相同或相似功能的替代序列取代。在一些实施方案中，可例如通过引入更大的氨基酸填充蛋白质核心中的空腔以改善稳定性。在其他实施方案中，可用疏水性残基置换包埋的氢键网络以改进稳定性。在其他实施方案中，可去除糖基化位点并用适当残基置换。本领域技术人员可容易地鉴定此类序列。还应理解，本文提供的一些序列含有可在例如用于制备mRNA疫苗之前缺失的序列标签或末端肽序列(例如，在N末端或C末端)。
如由本领域技术人员认识到，也将蛋白质片段、功能性蛋白质结构域和同源蛋白质视为在目标百日咳抗原、白喉抗原和/或破伤风抗原的范围内。例如，本文提供了参照蛋白质的任何蛋白质片段(意指比参照抗原序列短至少一个氨基酸残基、但在其他方面相同的多肽序列)，条件是所述片段是免疫原性的并赋予针对百日咳、白喉或破伤风的保护性免疫反应。除了与参照蛋白质相同但截短的变体之外，在一些实施方案中，如本文提供或参考的任何序列中所示，抗原包括2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个突变。抗原/抗原性多肽的长度范围可为约4、6或8个氨基酸至全长蛋白质。
稳定化元件
天然存在的真核mRNA分子除了例如5’-帽结构或3’-poly(A)尾的其他结构特征之外，还可含有稳定化元件，包括但不限于在其5’端(5’UTR)和/或在其3’端(3’UTR)的非翻译区(UTR)。5’UTR和3’UTR二者都通常是从基因组DNA转录并且是成熟前mRNA的元件。通常在mRNA加工期间向转录的(成熟前)mRNA中添加成熟mRNA的特征性结构特征(例如5’-帽和3’-poly(A)尾)。
在一些实施方案中，组合物包含具有编码至少一个具有至少一种修饰的抗原性多肽的开放阅读框、至少一个5’末端帽的RNA，并且配制在脂质纳米颗粒内。可使用以下用以生成5′-鸟苷帽结构的化学RNA帽类似物，根据制造商的方案，在体外转录反应期间伴随地完成多核苷酸的5′加帽：3′-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)G[ARCA帽]；G(5’)ppp(5’)A；G(5’)ppp(5’)G；m7G(5’)ppp(5’)A；m7G(5’)ppp(5’)G(New England BioLabs，Ipswich，MA)。可使用用以生成“Cap0”结构：m7G(5’)ppp(5’)G的牛痘病毒加帽酶(New England BioLabs，Ipswich，MA)在转录后完成修饰RNA的5′加帽。可使用牛痘病毒加帽酶和用以生成m7G(5’)ppp(5’)G-2′-O-甲基的2′-O甲基转移酶来生成Cap1结构。可由Cap1结构，之后使用2′-O甲基转移酶将5′倒数第三个核苷酸2′-O甲基化来生成Cap2结构。可由Cap2结构，之后使用2′-O甲基转移酶将5′倒数第四个核苷酸2′-O甲基化来生成Cap3结构。酶可源自重组来源。
3’-poly(A)尾通常是添加至转录的mRNA的3’端的一段腺嘌呤核苷酸。在一些情况下，其可包含高达约400个腺嘌呤核苷酸。在一些实施方案中，3’-poly(A)尾的长度对于个别mRNA的稳定性可为必需的要素。
在一些实施方案中，组合物包括稳定化元件。稳定化元件可包括例如组蛋白茎环。已鉴定茎环结合蛋白(SLBP)，一种32kDa的蛋白质。其与细胞核和细胞质二者中组蛋白信使3’端的组蛋白茎环结合。其表达水平受细胞周期的调控；其在S期达到峰值，此时组蛋白mRNA水平也升高。已显示所述蛋白质对于U7 snRNP对组蛋白前mRNA的有效3’端加工是至关重要的。SLBP在加工后继续与茎环结合，然后刺激成熟组蛋白mRNA在细胞质中翻译成组蛋白。SLBP的RNA结合结构域在后生动物和原生动物中是保守的；其与组蛋白茎环的结合取决于环的结构。最小结合位点包括相对于茎环的5’的至少三个核苷酸和3’的两个核苷酸。
在一些实施方案中，mRNA包括编码区、至少一个组蛋白茎环和任选地多poly(A)序列或聚腺苷酸化信号。所述poly(A)序列或聚腺苷酸化信号通常应增强编码的蛋白质的表达水平。在一些实施方案中，所述编码的蛋白质不为组蛋白、报告基因蛋白(例如荧光素酶、GFP、EGFP、β-半乳糖苷酶、EGFP)或标志物或选择蛋白(例如α-球蛋白、半乳糖激酶和黄嘌呤：鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(GPT))。
在一些实施方案中，mRNA包括poly(A)序列或聚腺苷酸化信号与至少一个组蛋白茎环的组合，即使两者在性质上代表替代机制，但协同地作用以增加蛋白质表达超过用任一个别元件观察到的水平。poly(A)和至少一种组蛋白茎环的组合的协同效应不依赖于元件的顺序或poly(A)序列的长度。
在一些实施方案中，mRNA不包括组蛋白下游元件(HDE)。“组蛋白下游元件”(HDE)包括在天然存在的茎环的3’的大约15至20个核苷酸的富含嘌呤的多核苷酸段，其代表U7snRNA的结合位点，所述U7 snRNA参与组蛋白前mRNA加工成成熟组蛋白mRNA。在一些实施方案中，核酸不包括内含子。
mRNA可含有或可不含有增强子和/或启动子序列，其可经修饰或未经修饰，或者其可经活化或未经活化。在一些实施方案中，组蛋白茎环通常源自组蛋白基因，并且包括由间隔体分开的两个相邻的部分或完全反向互补序列的分子内碱基配对，所述间隔体由形成结构的环的短序列组成。未配对的环区通常不能与茎环元件中的任一者碱基配对。其由于是许多RNA二级结构的关键组分而更经常地出现于RNA中，但也可存在于单链DNA中。茎环结构的稳定性通常取决于长度、错配或膨出部的数目和配对区的碱基组成。在一些实施方案中，可产生摆动碱基配对(非沃森-克里克碱基配对(non-Watson-Crick base pairing))。在一些实施方案中，至少一种组蛋白茎环序列包含15至45个核苷酸的长度。
在一些实施方案中，mRNA已去除一个或多个富含AU的序列。这些序列有时称为AURES，其是在3’UTR中发现的去稳定化序列。AURES可从RNA疫苗去除。或者，AURES可保留在RNA疫苗中。
信号肽
在一些实施方案中，组合物包含具有ORF的mRNA，所述ORF编码与抗原融合的信号肽。包含蛋白质N末端15-60个氨基酸的信号肽通常是分泌途径上跨膜易位所需要的，并且因此，普遍控制真核生物和原核生物中大部分蛋白质进入分泌途径。在真核生物中，新生前体蛋白(前蛋白)的信号肽将核糖体引导至粗内质网(ER)膜，并且起始生长的肽链穿过其转运以进行加工。ER加工产生成熟蛋白质，其中信号肽通常通过宿主细胞的ER驻留信号肽酶从前体蛋白切割，或者其保持未切割并作为膜锚起作用。信号肽也可促进蛋白质靶向细胞膜。
信号肽的长度可为15-60个氨基酸。例如，信号肽的长度可为15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60个氨基酸。在一些实施方案中，信号肽的长度为20-60、25-60、30-60、35-60、40-60、45-60、50-60、55-60、15-55、20-55、25-55、30-55、35-55、40-55、45-55、50-55、15-50、20-50、25-50、30-50、35-50、40-50、45-50、15-45、20-45、25-45、30-45、35-45、40-45、15-40、20-40、25-40、30-40、35-40、15-35、20-35、25-35、30-35、15-30、20-30、25-30、15-25、20-25或15-20个氨基酸。
来自异源基因的信号肽(其调控自然界中除百日咳抗原、白虎抗原和破伤风抗原外的基因的表达)是本领域中已知的，并且可测试其所需性质，然后并入本公开的核酸中。
融合蛋白
在一些实施方案中，本公开的组合物包括编码抗原性融合蛋白的mRNA。因此，所编码的一种或多种抗原可包括在有或无接头的情况下接合在一起的两种或更多种蛋白质(例如，蛋白质和/或蛋白质片段)。或者，与蛋白质抗原融合的蛋白质不促进对其自身的强烈免疫反应，而是促进对百日咳抗原、白喉抗原或破伤风抗原的强烈免疫反应。在一些实施方案中，抗原性融合蛋白保留来自每个原始蛋白质的功能性质。
在一些实施方案中，抗原性融合蛋白包含以下抗原性多肽中的2、3、4、5、6、7、8、9或10种：百日咳毒素抗原性多肽、自主转运蛋白枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶(SPHB1)抗原性多肽、气管定殖因子A(TCFA)抗原性多肽、丝状血凝素(FHA)抗原性多肽、百日咳杆菌粘附素(PRN)抗原性多肽、菌毛(FIM)抗原性多肽、腺苷酸环化酶抗原性多肽、博德特氏菌抗杀性(Brk)抗原性多肽、白喉抗原性多肽和破伤风抗原性多肽。本公开的示例性融合蛋白提供于表1中。例如，在一些实施方案中，本公开的mRNA疫苗编码与选自SEQ ID NO：56、59、62、65、68、71、74、77、80、83、86、89、92、95和98的序列80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或同一的多肽。在一些实施方案中，本公开的mRNA疫苗编码与选自SEQ ID NO：55、58、61、64、67、70、73、76、79、82、85、88、91、94和97的序列80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或同一的ORF。在一些实施方案中，本公开的mRNA疫苗编码与选自SEQ ID NO：54、57、60、63、66、69、72、75、78、81、84、87、90、93和96的序列80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或同一的核苷酸序列。
接头和可切割肽
在一些实施方案中，本公开的mRNA编码多于一种多肽，在本文中称为融合蛋白。在一些实施方案中，mRNA进一步编码位于融合蛋白的至少一个或每个结构域之间的接头。接头可以是例如可切割接头或蛋白酶敏感性接头。在一些实施方案中，接头选自由以下组成的组：F2A接头、P2A接头、T2A接头、E2A接头以及其组合。这种自切割肽接头家族(称为2A肽)已经在本领域中进行了描述(参见例如，Kim，J.H.等人(2011)PLoS ONE 6：e18556)。在一些实施方案中，接头是F2A接头。
在一些实施方案中，接头是GS接头。GS接头是包括甘氨酸和丝氨酸氨基酸重复的多肽接头。其包含柔性和亲水性残基，并且可用于实施蛋白质亚基的融合，而不干扰蛋白质结构域的折叠和功能，并且不形成二级结构。在一些实施方案中，mRNA编码包含3至20个氨基酸长的GS接头的融合蛋白。例如，所述GS接头可具有3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸的长度(或具有至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸的长度)。在一些实施方案中，GS接头是(或至少是)15个氨基酸长(例如，GGSGGSGGSGGSGGG(SEQ ID NO：101))。在一些实施方案中，GS接头是(或至少是)8个氨基酸长(例如，GGGSGGGS(SEQ ID NO：102))。在一些实施方案中，GS接头是(或至少是)7个氨基酸长(例如，GGGSGGG(SEQ ID NO：103))。在一些实施方案中，GS接头是(或至少是)4个氨基酸长(例如，GGGS(SEQ ID NO：104))。在一些实施方案中，GS接头包含(GGGS)n(SEQID NO：105)，其中n为1-5的任何整数。在一些实施方案中，GS接头是(或至少是)4个氨基酸长(例如，GSGG(SEQ ID NO：106))。在一些实施方案中，所述GS接头包含(GSGG)n(SEQ IDNO：107)，其中n为1-5的任何整数。
在一些实施方案中，接头是甘氨酸接头，例如具有3个氨基酸的长度(或至少3个氨基酸的长度)(例如，GGG)。
在一些实施方案中，由mRNA疫苗编码的蛋白质包含一个以上接头，其可彼此相同或不同(例如，在同一S蛋白构建体中的GGGSGGG(SEQ ID NO：103)和GGGS(SEQ ID NO：104))。
本领域中已知的可切割接头可与本公开结合使用。示例性的此类接头包括：F2A接头、T2A接头、P2A接头和E2A接头(参见例如，WO2017127750)。熟练的技术人员将理解，其他本领域公认的接头可适合用于本公开的构建体(例如，由本公开的核酸编码)中。熟练的技术人员同样将理解，其他多顺反子构建体(在同一分子内分别编码多于一种抗原/多肽的mRNA)可适合用于如本文提供的用途。
序列优化
在一些实施方案中，对编码本公开的抗原的ORF进行密码子优化。密码子优化方法是本领域中已知的。例如，本文提供的任何一个或多个序列的ORF可为密码子优化的。在一些实施方案中，密码子优化可用于匹配靶标和宿主生物体中的密码子频率以确保正确折叠；偏向GC含量以增加mRNA稳定性或减少二级结构；最小化可损害基因构建或表达的串联重复密码子或碱基操作；定制转录和翻译控制区；插入或去除蛋白质运输序列；在编码的蛋白质中去除/添加翻译后修饰位点(例如，糖基化位点)；添加、去除或改组蛋白结构域；插入或缺失限制性位点；修饰核糖体结合位点和mRNA降解位点；调整翻译率以允许蛋白质的各种结构域正确折叠；或者减少或消除多核苷酸内的问题二级结构。密码子优化工具、算法和服务是本领域中已知的-非限制性实例包括来自GeneArt(Life Technologies)、DNA2.0(Menlo Park CA)和/或专有方法的服务。在一些实施方案中，使用优化算法优化开放阅读框(ORF)序列。
在一些实施方案中，密码子优化的序列与天然存在或野生型序列ORF(例如，编码百日咳抗原、白喉抗原或破伤风抗原的天然存在或野生型mRNA序列)共享小于95％的序列同一性。在一些实施方案中，密码子优化的序列与天然存在或野生型序列(例如，编码百日咳抗原、白喉抗原或破伤风抗原的天然存在或野生型mRNA序列)共享小于90％的序列同一性。在一些实施方案中，密码子优化的序列与天然存在或野生型序列(例如，编码百日咳抗原、白喉抗原或破伤风抗原的天然存在或野生型mRNA序列)共享小于85％的序列同一性。在一些实施方案中，密码子优化的序列与天然存在或野生型序列(例如，编码百日咳抗原、白喉抗原或破伤风抗原的天然存在或野生型mRNA序列)共享小于80％的序列同一性。在一些实施方案中，密码子优化的序列与天然存在或野生型序列(例如，编码百日咳抗原、白喉抗原或破伤风抗原的天然存在或野生型mRNA序列)共享小于75％的序列同一性。
在一些实施方案中，密码子优化的序列与天然存在或野生型序列(例如，编码百日咳抗原、白喉抗原或破伤风抗原的天然存在或野生型mRNA序列)共享介于65％与85％之间(例如，介于约67％与约85％之间或介于约67％与约80％之间)的序列同一性。在一些实施方案中，密码子优化的序列与天然存在或野生型序列(例如，编码百日咳抗原、白喉抗原或破伤风抗原的天然存在或野生型mRNA序列)共享介于65％与75％或约80％之间的序列同一性。
在一些实施方案中，密码子优化的序列编码与由非密码子优化的序列编码的百日咳抗原、白喉抗原或破伤风抗原的免疫原性一样，或比其免疫原性更高(例如，高至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少100％或至少200％)的抗原。
经修饰的mRNA在转染至哺乳动物宿主细胞中时具有12-18小时之间或大于18小时、例如24小时、36小时、48小时、60小时、72小时或大于72小时的稳定性，并且能够由哺乳动物宿主细胞表达。
在一些实施方案中，密码子优化的RNA可为其中G/C的水平增加的RNA。核酸分子(例如mRNA)的G/C含量可影响RNA的稳定性。具有增加量的鸟嘌呤(G)和/或胞嘧啶(C)残基的RNA可在功能上比含有大量腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)核苷酸的RNA更稳定。举例来说，WO02/098443公开了一种药物组合物，其含有通过翻译区中的序列修饰而稳定化的mRNA。由于遗传密码的简并性，修饰通过用促进更大RNA稳定性而不改变所得氨基酸的那些密码子取代现有密码子来起作用。所述方法限于RNA的编码区。
化学上未经修饰的核苷酸
在一些实施方案中，mRNA未经化学修饰，并且包含由腺苷、鸟苷、胞嘧啶和尿苷组成的标准核糖核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核苷酸和核苷包含标准核苷残基，诸如存在于转录的RNA中的那些核苷残基(例如A、G、C或U)。在一些实施方案中，本公开的核苷酸和核苷包含标准脱氧核糖核苷，诸如存在于DNA中的那些脱氧核糖核苷(例如dA、dG、dC或dT)。
化学修饰
在一些实施方案中，本公开的组合物包含具有编码百日咳抗原、白喉抗原或破伤风抗原的开放阅读框的RNA，其中核酸包含可为标准的(未经修饰的)或如本领域中已知修饰的核苷酸和/或核苷。在一些实施方案中，本公开的核苷酸和核苷包含经修饰的核苷酸或核苷。此类经修饰的核苷酸和核苷可为天然存在的经修饰的核苷酸和核苷或非天然存在的经修饰的核苷酸和核苷。此类修饰可包括如本领域中公认的在核苷酸和/或核苷的糖、主链或核碱基部分的那些修饰。
在一些实施方案中，本公开的天然存在的经修饰的核苷酸或核苷是本领域中通常已知或公认的核苷酸或核苷。此类天然存在的经修饰的核苷酸和核苷的非限制性实例尤其可见于广泛公认的MODOMICS数据库中。
在一些实施方案中，本公开的非天然存在的经修饰的核苷酸或核苷是本领域中通常已知或公认的核苷酸或核苷。此类非天然存在的经修饰的核苷酸和核苷的非限制性实例尤其可见于公开的美国申请号PCT/US2012/058519；PCT/US2013/075177；PCT/US2014/058897；PCT/US2014/058891；PCT/US2014/070413；PCT/US2015/36773；PCT/US2015/36759；PCT/US2015/36771；或PCT/IB2017/051367，所述申请都通过引用并入本文。
因此，本公开的核酸(例如，DNA核酸和RNA核酸，例如mRNA核酸)可包含标准核苷酸和核苷、天然存在的核苷酸和核苷、非天然存在的核苷酸和核苷或其任何组合。
在一些实施方案中，本公开的核酸(例如，DNA核酸和RNA核酸，例如mRNA核酸)包含多种(一种以上)不同类型的标准和/或经修饰的核苷酸和核苷。在一些实施方案中，核酸的特定区含有一种、两种或更多种(任选地不同)类型的标准和/或经修饰的核苷酸和核苷。
在一些实施方案中，相对于包含标准核苷酸和核苷的未经修饰的核酸，引入细胞或生物体的经修饰的RNA核酸(例如，经修饰的mRNA核酸)分别在细胞或生物体中展现降低的降解。
在一些实施方案中，相对于包含标准核苷酸和核苷的未经修饰的核酸，引入细胞或生物体中的经修饰的RNA核酸(例如，经修饰的mRNA核酸)可分别在细胞或生物体中展现降低的免疫原性(例如，降低的先天反应)。
在一些实施方案中，核酸(例如RNA核酸，例如mRNA核酸)包含非天然修饰的核苷酸，其在核酸的合成期间或合成后引入以实现期望功能或性质。修饰可存在于核苷酸间键联、嘌呤或嘧啶碱基或糖上。修饰可用化学合成或用聚合酶在链的末端或链中的任何其他地方引入。核酸的任何区可经化学修饰。
本公开提供了核酸(例如RNA核酸，例如mRNA核酸)的经修饰的核苷和核苷酸。“核苷”是指含有糖分子(例如戊糖或核糖)或其衍生物与有机碱基(例如嘌呤或嘧啶)或其衍生物(在本文中也称为“核碱基”)组合的化合物。“核苷酸”是指包括磷酸基团的核苷。经修饰的核苷酸可通过任何有用的方法，例如化学、酶促或重组方法合成，以包括一个或多个经修饰的或非天然的核苷。核酸可包含连接的核苷的一个或多个区。此类区可具有可变主链键联。键联可为标准磷酸二酯键联，在这种情形下，核酸将包含核苷酸的区。
经修饰的核苷酸碱基配对不仅涵盖标准腺苷-胸腺嘧啶、腺苷-尿嘧啶或鸟苷-胞嘧啶碱基对，而且还包括在核苷酸和/或包含非标准或经修饰的碱基的经修饰的核苷酸之间形成的碱基对，其中氢键供体和氢键受体的排列允许在非标准碱基与标准碱基之间或在两个互补非标准碱基结构之间、例如在具有至少一个化学修饰的那些核酸中的氢键。这种非标准碱基配对的一个实例是修饰核苷酸肌苷与腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶之间的碱基配对。碱基/糖或接头的任何组合可并入本公开的核酸中。
在一些实施方案中，核酸(例如RNA核酸，例如mRNA核酸)中经修饰的核碱基包含1-甲基-假尿苷(m1ψ)、1-乙基-假尿苷(e1ψ)、5-甲氧基-尿苷(mo5U)、5-甲基-胞苷(m5C)和/或假尿苷(ψ)。在一些实施方案中，核酸(例如RNA核酸，例如mRNA核酸)中的经修饰的核碱基包含5-甲氧基甲基尿苷、5-甲硫基尿苷、1-甲氧基甲基假尿苷、5-甲基胞苷和/或5-甲氧基胞苷。在一些实施方案中，多核糖核苷酸包括至少两种(例如，2、3、4种或更多种)任何上文所提及的经修饰的核碱基的组合，包括但不限于化学修饰。
在一些实施方案中，本公开的mRNA包含在核酸的一个或多个或所有尿苷位置的1-甲基-假尿苷(m1ψ)取代。
在一些实施方案中，本公开的mRNA包含在核酸的一个或多个或所有尿苷位置的1-甲基-假尿苷(m1ψ)取代和在核酸的一个或多个或所有胞苷位置的5-甲基胞苷取代。
在一些实施方案中，本公开的mRNA包含在核酸的一个或多个或所有尿苷位置的假尿苷(ψ)取代。
在一些实施方案中，本公开的mRNA包含在核酸的一个或多个或所有尿苷位置的假尿苷(ψ)取代和在核酸的一个或多个或所有胞苷位置的5-甲基胞苷取代。
在一些实施方案中，本公开的mRNA包含在核酸的一个或多个或所有尿苷位置的尿苷。
在一些实施方案中，对于特定修饰，对mRNA进行均匀修饰(例如，完全修饰、贯穿整个序列中修饰)。例如，核酸可用1-甲基-假尿苷均匀修饰，这意味着mRNA序列中的所有尿苷残基都用1-甲基-假尿苷置换。类似地，通过用经修饰的残基(例如上文所阐释的那些残基)置换，可针对序列中存在的任何类型的核苷残基对核酸进行均匀修饰。
本公开的核酸可沿着分子的整个长度经部分或完全修饰。例如，在本公开的核酸中，或在其预定序列区中(例如，在包括或不包括poly(A)尾的mRNA中)，可均匀地修饰一种或多种或所有或给定类型的核苷酸(例如，嘌呤或嘧啶，或任何一种或多种或所有A、G、U、C)。在一些实施方案中，本公开的核酸中(或其序列区中)的所有核苷酸X都是经修饰的核苷酸，其中X可为核苷酸A、G、U、C中的任一者，或组合A+G、A+U、A+C、G+U、G+C、U+C、A+G+U、A+G+C、G+U+C或A+G+C中的任一者。
所述核酸可含有约1％至约100％的经修饰的核苷酸(相对于总核苷酸含量，或相对于一种或多种类型的核苷酸，即A、G、U或C中的任何一者或多者)或任何居间百分比(例如，1％至20％、1％至25％、1％至50％、1％至60％、1％至70％、1％至80％、1％至90％、1％至95％、10％至20％、10％至25％、10％至50％、10％至60％、10％至70％、10％至80％、10％至90％、10％至95％、10％至100％、20％至25％、20％至50％、20％至60％、20％至70％、20％至80％、20％至90％、20％至95％、20％至100％、50％至60％、50％至70％、50％至80％、50％至90％、50％至95％、50％至100％、70％至80％、70％至90％、70％至95％、70％至100％、80％至90％、80％至95％、80％至100％、90％至95％、90％至100％和95％至100％)。应理解，未经修饰的A、G、U或C的存在占任何其余百分数。
mRNA可含有最少1％并且最多100％的经修饰的核苷酸或任何居间百分数，例如至少5％的经修饰的核苷酸、至少10％的经修饰的核苷酸、至少25％的经修饰的核苷酸、至少50％的经修饰的核苷酸、至少80％的经修饰的核苷酸或至少90％的经修饰的核苷酸。例如，所述核酸可含有经修饰的嘧啶，例如经修饰的尿嘧啶或胞嘧啶。在一些实施方案中，所述核酸中至少5％、至少10％、至少25％、至少50％、至少80％、至少90％或100％的尿嘧啶由经修饰的尿嘧啶(例如5-取代的尿嘧啶)置换。经修饰的尿嘧啶可由具有单一独特结构的化合物置换，或者可由具有不同结构(例如，2、3、4种或更多种独特结构)的多种化合物置换。在一些实施方案中，核酸中至少5％、至少10％、至少25％、至少50％、至少80％、至少90％或100％的胞嘧啶由经修饰的胞嘧啶(例如5-取代的胞嘧啶)置换。经修饰的胞嘧啶可由具有单一独特结构的化合物置换，或者可由具有不同结构(例如，2、3、4种或更多种独特结构)的多种化合物置换。
非翻译区(UTR)
本公开的mRNA可包含一个或多个充当或用作非翻译区的区或部分。当mRNA被设计为编码至少一种目标抗原时，核酸可包含这些非翻译区(UTR)中的一者或多者。核酸的野生型非翻译区经转录，而非经翻译。在mRNA中，5’UTR在转录起始位点开始，并继续至起始密码子，但不包括起始密码子；而3’UTR在终止密码子之后立即开始，并继续至转录终止信号。关于就核酸分子和翻译的稳定性而言UTR所起的调控作用存在越来越多的证据。UTR的调控特征可并入本发明的多核苷酸中以尤其增强分子的稳定性。还可并入特定特征以确保在转录物被错误导向不期望器官部位的情形下转录物的受控下调。多种5’UTR和3’UTR序列是本领域中已知和可获得的。
5’UTR是mRNA的在起始密码子(核糖体翻译的mRNA转录物的第一个密码子)正上游(5’)的区。5’UTR不编码蛋白质(是非编码的)。天然5’UTR具有在翻译起始中起作用的特征。它们拥有像Kozak序列的签名序列，所述Kozak序列通常已知在核糖体起始许多基因的翻译的过程中有所涉及。Kozak序列具有共有CCR(A/G)CCAUGG，其中R是起始密码子(AUG)上游三个碱基处的嘌呤(腺嘌呤或鸟嘌呤)，起始密码子(AUG)后接另一个‘G’。还已知5’UTR形成参与延伸因子结合的二级结构。
在本公开的一些实施方案中，5’UTR是异源UTR，即，是在自然界中发现的与不同ORF相关的UTR。在另一个实施方案中，5’UTR是合成UTR，即，在自然界中不出现。合成的UTR包括已经突变以改善其性质的UTR，例如，增加基因表达的UTR，以及完全合成的UTR。示例性5’UTR包括非洲爪蟾属(Xenopus)或人类源a-球蛋白或b-球蛋白(8278063；9012219)、人类细胞色素b-245a多肽和羟基类固醇(17b)脱氢酶和烟草蚀纹病毒(US8278063、9012219)。还可使用CMV立即早期1(IE1)基因(US20140206753、WO2013/185069)、序列GGGAUCCUACC(SEQID NO：108)(WO2014144196)。在另一个实施方案中，TOP基因的5’UTR是缺乏5’TOP基序(寡嘧啶束)的TOP基因的5’UTR(例如，WO/2015101414、WO2015101415、WO/2015/062738、WO2015024667、WO2015024667)；可使用源自核糖体蛋白大32(L32)基因的5’UTR元件(WO/2015101414、WO2015101415、WO/2015/062738)、源自羟基类固醇(17-β)脱氢酶4基因(HSD17B4)的5’UTR的5’UTR元件(WO2015024667)或源自ATP5A1的5’UTR的5’UTR元件(WO2015024667)。在一些实施方案中，使用内部核糖体进入位点(IRES)代替5’UTR。
在一些实施方案中，本公开的5’UTR包含选自SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：99的序列。
3’UTR是mRNA的在终止密码子(mRNA转录物的发出翻译终止信号的密码子)正下游(3’)的区。3’UTR不编码蛋白质(是非编码的)。已知天然或野生型3′UTR具有嵌入其中的腺苷和尿苷的段。这些富含AU的签名序列在具有高更新率的基因中是特别普遍的。基于其序列特征和功能特性，富含AU的元件(ARE)可分成这些类别(Chen等人，1995)：I类ARE在富U区内含有AUUUA基序的若干分散的拷贝。C-Myc和MyoD含有I类ARE。II类ARE具有两个或更多个重叠的UUAUUUA(U/A)(U/A)九聚物。含有这种类型的ARE的分子包括GM-CSF和TNF-a。III类ARE定义不太明确。这些富U区不含AUUUA基序。c-Jun和肌细胞生成素是这种类别的两个充分研究的实例。已知大多数结合至ARE的蛋白质使信使不稳定，而据记载ELAV家族的成员(最著名的是HuR)增加mRNA的稳定性。HuR结合至所有三类的ARE。将HuR特异性结合位点工程化至核酸分子的3′UTR中将导致HuR结合，并因此导致体内信使的稳定化。
3’UTR富AU元件(ARE)的引入、去除或修饰可用于调节本公开的核酸(例如RNA)的稳定性。当工程化特定核酸时，可引入ARE的一个或多个拷贝以使本公开的核酸更不稳定，从而缩减翻译并减少所得蛋白质的产生。同样，ARE可被鉴别和去除或突变以便增加细胞内稳定性并因此增加翻译和所得蛋白质的产生。可在相关细胞系中使用本公开的核酸执行转染实验，并且可在转染后的不同时间点测定蛋白质产生。例如，可用不同ARE工程化分子，并且通过对相关蛋白质使用ELISA试剂盒并测定在转染后6小时、12小时、24小时、48小时和7天产生的蛋白质，来转染细胞。
本领域的普通技术人员将理解，异源或合成的5’UTR可与任何期望的3’UTR序列一起使用。例如，异源5’UTR可与合成3’UTR或异源3’UTR一起使用。
非UTR序列也可用作核酸内的区或亚区。例如，内含子或内含子序列的部分可并入本公开的核酸的区中。内含子序列的并入可增加蛋白质产生以及核酸水平。
特征的组合可包括于侧翼区中并且可包含于其他特征内。例如，ORF可由可包含强Kozak翻译起始信号的5’UTR和/或可包括用于模板化添加聚-A尾的oligo(dT)序列的3’UTR侧接。5’UTR可包含来自相同和/或不同基因的第一多核苷酸片段和第二多核苷酸片段，例如美国专利申请公开号20100293625和PCT/US2014/069155中所述的5’UTR，所述公开通过引用整体并入本文。
应理解，来自任何基因的任何UTR可并入核酸的区中。此外，可使用任何已知基因的多个野生型UTR。提供不为野生型区的变体的人工UTR也在本公开的范围内。这些UTR或其部分可置于与它们所选自的转录物中相同的取向或可在取向或位置上有所改变。因此，5′或3′UTR可反转、缩短、延长、与一个或多个其他5′UTR或3′UTR嵌合。如本文所用，术语“改变的”在其涉及UTR序列时意指所述UTR已相对于参考序列在某些方面改变。例如，3’UTR或5’UTR可通过如上文教导的方向或位置的改变而相对于野生型或天然UTR改变，或者可通过包括额外核苷酸、核苷酸的缺失、核苷酸的交换或转座而改变。产生“改变的”UTR(无论是3′还是5′)的任何这些变化包含变体UTR。
在一些实施方案中，可使用双重、三重或四重UTR，例如5’UTR或3’UTR。如本文所用，“双重”UTR是其中同一UTR的两个拷贝串联或大体上串联编码的一种UTR。例如，可如美国专利公布20100129877中所描述使用双重β-珠蛋白3′UTR，所述专利的内容以引用的方式整体并入本文。
具有模式化UTR也在本公开的范围内。如本文所用，“图案化的UTR”是反映重复或交替图案如重复一次、两次或多于3次的ABABAB或AABBAABBAABB或ABCABCABC或其变体的那些UTR。在这些图案中，每个字母A、B或C表示在核苷酸层次上的不同UTR。
在一些实施方案中，侧翼区选自其蛋白质共享共同功能、结构、特征或性质的转录物家族。例如，目标多肽可属于在特定细胞、组织中或在发育过程中的某一时间表达的蛋白质的家族。来自任何这些基因的UTR可交换相同或不同蛋白质家族的任何其他UTR以便形成新的多核苷酸。如本文所用，“蛋白质家族”在广义上用于指共享至少一种功能、结构、特征、定位、起源或表达模式的两个或更多个目标多肽的群。
非翻译区还可包括翻译增强子元件(TEE)。作为非限制性实例，TEE可包括美国申请号20090226470中所描述的那些和本领域已知的那些，所述申请以引用的方式整体并入本文。
RNA的体外转录
编码本文所述的多核苷酸的cDNA可使用体外转录(IVT)系统转录。RNA的体外转录是本领域中已知的，并且阐述于国际公开WO 2014/152027中，所述公开通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，本公开的RNA是根据WO 2018/053209和WO 2019/036682中阐述的任何一种或多种方法制备，所述文献各自通过引用并入本文。
在一些实施方案中，所述RNA转录物是使用非扩增的线性化DNA模板在体外转录反应中产生，以产生RNA转录物。在一些实施方案中，所述模板DNA是分离的DNA。在一些实施方案中，所述模板DNA是cDNA。在一些实施方案中，所述cDNA通过RNA多核苷酸(例如但不限于百日咳mRNA)的逆转录形成。在一些实施方案中，用质粒DNA模板转染细胞，例如细菌细胞，例如大肠杆菌，例如DH-1细胞。在一些实施方案中，培养转染的细胞以复制质粒DNA，然后分离和纯化所述质粒DNA。在一些实施方案中，所述DNA模板包括RNA聚合酶启动子，例如位于目标基因5’并与其可操作连接的T7启动子。
在一些实施方案中，体外转录模板编码5’非翻译(UTR)区，含有开放阅读框，并编码3’UTR和poly(A)尾。体外转录模板的特定核酸序列组成和长度将取决于模板编码的mRNA。
“5’非翻译区”(UTR)是指不编码多肽的mRNA的位于起始密码子(即，核糖体翻译的mRNA转录物的第一个密码子)正上游(即，5’)的区。当产生RNA转录物时，5’UTR可包含启动子序列。此类启动子序列是本领域中已知的。应理解，此类启动子序列将不存在于本公开的疫苗中。
“3’非翻译区”(UTR)是指不编码多肽的mRNA的位于终止密码子(即，发出翻译终止信号的mRNA转录物的密码子)正下游(即，3’)的区。
“开放阅读框”是以起始密码子(例如，甲硫氨酸(ATG))开始并以终止密码子(例如，TAA、TAG或TGA)结束的DNA的连续段，并且编码多肽。
“poly(A)尾”是mRNA的位于含有多个连续单磷酸腺苷的3’UTR的下游、例如正下游(即，3’)的区。poly(A)尾可含有10至300个单磷酸腺苷。例如，poly(A)尾可含有10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290或300个单磷酸腺苷。在一些实施方案中，poly(A)尾含有50至250个单磷酸腺苷。在相关生物学环境中(例如，在细胞中，在体内)，poly(A)尾用于保护mRNA免于例如在细胞质中的酶促降解，并帮助转录终止，和/或mRNA从细胞核输出和翻译。
在一些实施方案中，核酸包括200至3,000个核苷酸。例如，核酸可包括200至500、200至1000、200至1500、200至3000、500至1000、500至1500、500至2000、500至3000、1000至1500、1000至2000、1000至3000、1500至3000或2000至3000个核苷酸。
体外转录系统通常包含转录缓冲液、核苷酸三磷酸(NTP)、RNA酶抑制剂和聚合酶。
NTP可以自制制造、可选自供应商或可如本文所描述的合成。NTP可选自但不限于本文所描述的那些，包括天然和非天然(修饰的)NTP。
任何数量的RNA聚合酶或变体可用于本公开的方法中。所述聚合酶可选自但不限于噬菌体RNA聚合酶，例如T7 RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶、SP6 RNA聚合酶和/或突变型聚合酶，例如但不限于能够并入经修饰的核酸和/或经修饰的核苷酸(包括化学修饰的核酸和/或核苷酸)的聚合酶。一些实施方案排除使用DNA酶。
在一些实施方案中，RNA转录物通过酶促加帽来加帽。在一些实施方案中，RNA包含5’末端帽，例如7mG(5’)ppp(5’)NlmpNp。
化学合成
固相化学合成。本公开的核酸可使用固相技术全部或部分地制造。核酸的固相化学合成是一种自动化方法，其中分子固定于固体载体上，并且在反应物溶液中逐步合成。固相合成可用于在核酸序列中位点特异性引入化学修饰。
液相化学合成。通过顺序添加单体结构单元来合成本公开的核酸可在液相中实施。
合成方法的组合。上文论述的合成方法各自具有其自身的优点和限制。已经进行尝试来组合这些方法以克服限制。此类方法的组合在本公开的范围内。固相或液相化学合成与酶促连接的组合使用提供了产生不能通过单独化学合成获得的长链核酸的有效方式。
核酸区或亚区的连接
还可使用通过连接酶装配核酸。DNA或RNA连接酶通过形成磷酸二酯键来促进多核苷酸链的5’和3’末端的分子间连接。核酸(例如嵌合多核苷酸和/或环状核酸)可通过一个或多个区或亚区的连接来制备。DNA片段可通过连接酶催化的反应连接以产生具有不同功能的重组DNA。两个寡脱氧核苷酸(一个具有5’磷酰基，且另一个具有游离3’羟基)用作DNA连接酶的底物。
纯化
本文所述的核酸的纯化可包括但不限于核酸净化、质量保证和质量控制。净化可通过本领域已知的方法如但不限于珠粒(Beckman Coulter Genomics，Danvers，MA)、聚-T珠粒、LNATM oligo-T捕获探针(Inc，Vedbaek，Denmark)，或基于HPLC的纯化方法如但不限于强阴离子交换HPLC、弱阴离子交换HPLC、反相HPLC(RP-HPLC)以及疏水相互作用HPLC(HIC-HPLC)来进行。术语“纯化的”当关于核酸使用时，例如“纯化的核酸”，是指与至少一种污染物分离的核酸。“污染物”是使另一种物质不适合、不纯或劣质的任何物质。因此，纯化的核酸(例如，DNA和RNA)以不同于其在自然界中发现的形式或环境存在，或以不同于其在进行处理或纯化方法之前存在的形式或环境存在。
质量保证和/或质量控制检查可使用诸如但不限于凝胶电泳、UV吸光度或分析型HPLC的方法来进行。
在一些实施方案中，核酸可通过包括但不限于逆转录酶-PCR的方法测序。
量化
在一些实施方案中，本公开的核酸可在外泌体中或当衍生自一种或多种体液时定量。体液包括外周血、血清、血浆、腹水、尿液、脑脊髓液(CSF)、痰、唾液、骨髓、滑液、房水、羊水、耳垢、母乳、支气管肺泡灌洗液、精液、前列腺液、考珀液(cowper′s fluid)或预射精液、汗液、粪便物、毛发、泪液、囊肿液、胸膜液和腹膜液、心包液、淋巴、食糜、乳糜、胆汁、间质液、月经、脓液、皮脂、呕吐物、阴道分泌物、粘膜分泌物、粪便水、胰液、窦腔灌洗液、支气管肺抽吸物、囊胚腔液和脐带血。或者，可从选自由以下组成的组的器官撷取外来体：肺、心脏、胰脏、胃、肠、膀胱、肾、卵巢、精巢、皮肤、结肠、乳房、前列腺、脑、食道、肝以及胎盘。
可使用构建体特异性探针、血细胞计数法、qRT-PCR、实时PCR、PCR、流式细胞术、电泳、质谱或其组合来实施测定，而外泌体可使用免疫组织化学方法(例如酶联免疫吸附测定(ELISA))方法来分离。还可通过尺寸排阻色谱法、密度梯度离心、差速离心、纳米膜超滤、免疫吸附剂捕获、亲和纯化、微流体分离或其组合来分离外来体。
这些方法使得研究人员能够实时监测剩余或递送的核酸水平。这是可能的，因为在一些实施方案中，本公开的核酸由于结构或化学修饰而不同于内源形式。
在一些实施方案中，核酸可使用例如但不限于紫外可见光谱(UV/Vis)的方法来定量。UV/Vis光谱仪的非限制性实例是光谱仪(ThermoFisher，Waltham，MA)。可对定量的核酸进行分析，以确定核酸是否可具有适当大小，检查核酸未发生降解。核酸的降解可通过以下方法检查，例如但不限于琼脂糖凝胶电泳；基于HPLC的纯化方法，例如但不限于强阴离子交换HPLC、弱阴离子交换HPLC、反相HPLC(RP-HPLC)和疏水相互作用HPLC(HIC-HPLC)；液相色谱-质谱(LCMS)、毛细管电泳(CE)和毛细管凝胶电泳(CGE)。
脂质纳米粒子(LNP)
在一些实施方案中，本公开的mRNA配制在脂质纳米颗粒(LNP)中。脂质纳米颗粒通常包含可电离氨基脂质、非阳离子脂质、固醇和PEG脂质组分以及目标核酸货物。本公开的脂质纳米颗粒可使用本领域中通常已知的组分、组合物和方法产生，参见例如PCT/US2016/052352；PCT/US2016/068300；PCT/US2017/037551；PCT/US2015/027400；PCT/US2016/047406；PCT/US2016000129；PCT/US2016/014280；PCT/US2016/014280；PCT/US2017/038426；PCT/US2014/027077；PCT/US2014/055394；PCT/US2016/52117；PCT/US2012/069610；PCT/US2017/027492；PCT/US2016/059575和PCT/US2016/069491，所述专利都通过引用整体并入本文。
本公开的疫苗通常配制在脂质纳米颗粒中。在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒包含至少一种可电离氨基脂质、至少一种非阳离子脂质、至少一种固醇和/或至少一种聚乙二醇(PEG)修饰的脂质。
在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒包含20-60mol％可电离氨基脂质。在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒包含20-55mol％可电离氨基脂质。例如，所述脂质纳米颗粒可包含20-50mol％、20-40mol％、20-30mol％、30-60mol％、30-50mol％、30-40mol％、40-60mol％、40-50mol％或50-60mol％可电离氨基脂质。在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒包含20mol％、30mol％、40mol％、50mol％或60mol％可电离氨基脂质。在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒包含40mol％、41mol％、42mol％、43mol％、44mol％、45mol％、46mol％、47mol％、48mol％、49mol％、50mol％或60mol％可电离氨基脂质。
在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒包含5-25mol％非阳离子脂质。例如，所述脂质纳米颗粒可包含5-20mol％、5-15mol％、5-10mol％、10-25mol％、10-20mol％、10-25mol％、15-25mol％、15-20mol％或20-25mol％非阳离子脂质。在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒包含5mol％、10mol％、15mol％、20mol％或25mol％非阳离子脂质。
在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒包含25-55mol％固醇。例如，所述脂质纳米颗粒可包含25-50mol％、25-45mol％、25-40mol％、25-35mol％、25-30mol％、30-55mol％、30-50mol％、30-45mol％、30-40mol％、30-35mol％、35-55mol％、35-50mol％、35-45mol％、35-40mol％、40-55mol％、40-50mol％、40-45mol％、45-55mol％、45-50mol％或50-55mol％固醇。在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒包含25mol％、30mol％、35mol％、40mol％、45mol％、50mol％或55mol％固醇。
在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒包含0.5-15mol％PEG修饰的脂质。例如，所述脂质纳米颗粒可包含0.5-10mol％、0.5-5mol％、1-15mol％、1-10mol％、1-5mol％、2-15mol％、2-10mol％、2-5mol％、5-15mol％、5-10mol％或10-15mol％。在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒包含0.5mol％、1mol％、2mol％、3mol％、4mol％、5mol％、6mol％、7mol％、8mol％、9mol％、10mol％、11mol％、12mol％、13mol％、14mol％或15mol％PEG修饰的脂质。
在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒包含20-60mol％可电离氨基脂质、5-25mol％非阳离子脂质、25-55mol％固醇和0.5-15mol％PEG修饰的脂质。在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒包含40-50mol％可电离氨基脂质、5-15mol％中性脂质、20-40mol％胆固醇和0.5-3mol％PEG修饰的脂质。在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒包含45-50mol％可电离氨基脂质、9-13mol％中性脂质、35-45mol％胆固醇和2-3mol％PEG修饰的脂质。在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒包含48mol％可电离氨基脂质、11mol％中性脂质、68.5mol％胆固醇和2.5mol％PEG修饰的脂质。
在一些实施方案中，本公开的可电离氨基脂质包含式(I)化合物：
或其盐或异构体，其中：
R1选自由C5-30烷基、C5-20烯基、-R*YR″、-YR″和-R″M′R′组成的组；
R2和R3独立地选自由H、C1-14烷基、C2-14烯基、-R*YR″、-YR″和-R*OR″组成的组，或者R2和R3与其所附接的原子一起形成杂环或碳环；
R4选自由C3-6碳环、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR、-CQ(R)2和未被取代的C1-6烷基组成的组，其中Q选自碳环、杂环、-OR、-O(CH2)nN(R)2、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX3、-CX2H、-CXH2、-CN、-N(R)2、-C(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(S)N(R)2、-N(R)R8、-O(CH2)nOR、-N(R)C(＝NR9)N(R)2、-N(R)C(＝CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、-N(OR)C(O)R、-N(OR)S(O)2R、-N(OR)C(O)OR、-N(OR)C(O)N(R)2、-N(OR)C(S)N(R)2、-N(OR)C(＝NR9)N(R)2、-N(OR)C(＝CHR9)N(R)2、-C(＝NR9)N(R)2、-C(＝NR9)R、-C(O)N(R)OR和-C(R)N(R)2C(O)OR，并且每个n独立地选自1、2、3、4和5；
每个R5独立地选自由C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
每个R6独立地选自由C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
M和M′独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR′)O-、-S(O)2-、-S-S-、芳基和杂芳基；
R7选自由C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
R8选自由C3-6碳环和杂环组成的组；
R9选自由H、CN、NO2、C1-6烷基、-OR、-S(O)2R、-S(O)2N(R)2、C2-6烯基、C3-6碳环和杂环组成的组；
每个R独立地选自由C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
每个R’独立地选自由C1-18烷基、C2-18烯基、-R*YR”、-YR”和H组成的组；
每个R”独立地选自由C3-14烷基和C3-14烯基组成的组；
每个R*独立地选自由C1-12烷基和C2-12烯基组成的组；
每个Y独立地是C3-6碳环；
每个X独立地选自由F、Cl、Br和I组成的组；并且
m选自5、6、7、8、9、10、11、12和13。
在一些实施方案中，式(I)化合物的子集包括以下的那些化合物：其中当R4是-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR或-CQ(R)2时，则(i)当n为1、2、3、4或5时，Q不为-N(R)2，或(ii)当n为1或2时，Q不为5元、6元或7元杂环烷基。
在一些实施方案中，式(I)化合物的另一子集包括以下那些，其中
R1选自由C5-30烷基、C5-20烯基、-R*YR″、-YR″和-R″M′R′组成的组；
R2和R3独立地选自由H、C1-14烷基、C2-14烯基、-R*YR″、-YR″和-R*OR″组成的组，或者R2和R3与其所附接的原子一起形成杂环或碳环；
R4选自由C3-6碳环、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR、-CQ(R)2和未被取代的C1-6烷基组成的组，其中Q选自C3-6碳环、具有一个或多个选自N、O和S的杂原子的5至14元杂环、-OR、-O(CH2)nN(R)2、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX3、-CX2H、-CXH2、-CN、-C(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(S)N(R)2、-CRN(R)2C(O)OR、-N(R)R8、-O(CH2)nOR、-N(R)C(＝NR9)N(R)2、-N(R)C(＝CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、-N(OR)C(O)R、-N(OR)S(O)2R、-N(OR)C(O)OR、-N(OR)C(O)N(R)2、-N(OR)C(S)N(R)2、-N(OR)C(＝NR9)N(R)2、-N(OR)C(＝CHR9)N(R)2、-C(＝NR9)N(R)2、-C(＝NR9)R、-C(O)N(R)OR和具有一个或多个选自N、O和S的杂原子的5至14元杂环烷基，其被一个或多个选自以下的取代基取代：氧代基(＝O)、OH、氨基、单烷基氨基或二烷基氨基和C1-3烷基，并且每个n独立地选自1、2、3、4和5；
每个R5独立地选自由C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
每个R6独立地选自由C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
M和M′独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR′)O-、-S(O)2-、-S-S-、芳基和杂芳基；
R7选自由C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
R8选自由C3-6碳环和杂环组成的组；
R9选自由H、CN、NO2、C1-6烷基、-OR、-S(O)2R、-S(O)2N(R)2、C2-6烯基、C3-6碳环和杂环组成的组；
每个R独立地选自由C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
每个R’独立地选自由C1-18烷基、C2-18烯基、-R*YR”、-YR”和H组成的组；
每个R″独立地选自由C3-14烷基和C3-14烯基组成的组；
每个R*独立地选自由C1-12烷基和C2-12烯基组成的组；
每个Y独立地是C3-6碳环；
每个X独立地选自由F、Cl、Br和I组成的组；并且
m选自5、6、7、8、9、10、11、12和13，
或其盐或异构体。
在一些实施方案中，式(I)化合物的另一子集包括以下那些，其中
R1选自由C5-30烷基、C5-20烯基、-R*YR″、-YR″和-R″M′R′组成的组；
R2和R3独立地选自由H、C1-14烷基、C2-14烯基、-R*YR″、-YR″和-R*OR″组成的组，或者R2和R3与其所附接的原子一起形成杂环或碳环；
R4选自由C3-6碳环、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR、-CQ(R)2和未被取代的C1-6烷基组成的组，其中Q选自C3-6碳环、具有一个或多个选自N、O和S的杂原子的5至14元杂环、-OR、-O(CH2)nN(R)2、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX3、-CX2H、-CXH2、-CN、-C(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(S)N(R)2、-CRN(R)2C(O)OR、-N(R)R8、-O(CH2)nOR、-N(R)C(＝NR9)N(R)2、-N(R)C(＝CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、-N(OR)C(O)R、-N(OR)S(O)2R、-N(OR)C(O)OR、-N(OR)C(O)N(R)2、-N(OR)C(S)N(R)2、-N(OR)C(＝NR9)N(R)2、-N(OR)C(＝CHR9)N(R)2、-C(＝NR9)R、-C(O)N(R)OR和-C(＝NR9)N(R)2，并且每个n独立地选自1、2、3、4和5；并且当Q是5至14元杂环并且(i)R4是-(CH2)nQ，其中n为1或2，或(ii)R4是-(CH2)nCHQR，其中n为1，或(iii)R4是-CHQR和-CQ(R)2时，则Q是5至14元杂芳基或8至14元杂环烷基；
每个R5独立地选自由C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
每个R6独立地选自由C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
M和M′独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR′)O-、-S(O)2-、-S-S-、芳基和杂芳基；
R7选自由C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
R8选自由C3-6碳环和杂环组成的组；
R9选自由H、CN、NO2、C1-6烷基、-OR、-S(O)2R、-S(O)2N(R)2、C2-6烯基、C3-6碳环和杂环组成的组；
每个R独立地选自由C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
每个R’独立地选自由C1-18烷基、C2-18烯基、-R*YR”、-YR”和H组成的组；
每个R”独立地选自由C3-14烷基和C3-14烯基组成的组；
每个R*独立地选自由C1-12烷基和C2-12烯基组成的组；
每个Y独立地是C3-6碳环；
每个X独立地选自由F、Cl、Br和I组成的组；并且
m选自5、6、7、8、9、10、11、12和13，
或其盐或异构体。
在一些实施方案中，式(I)化合物的另一子集包括以下那些，其中
R1选自由C5-30烷基、C5-20烯基、-R*YR″、-YR″和-R″M′R′组成的组；
R2和R3独立地选自由H、C1-14烷基、C2-14烯基、-R*YR″、-YR″和-R*OR″组成的组，或者R2和R3与其所附接的原子一起形成杂环或碳环；
R4选自由C3-6碳环、-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR、-CQ(R)2和未被取代的C1-6烷基组成的组，其中Q选自C3-6碳环、具有一个或多个选自N、O和S的杂原子的5至14元杂环、-OR、-O(CH2)nN(R)2、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX3、-CX2H、-CXH2、-CN、-C(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(S)N(R)2、-CRN(R)2C(O)OR、-N(R)R8、-O(CH2)nOR、-N(R)C(＝NR9)N(R)2、-N(R)C(＝CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、-N(OR)C(O)R、-N(OR)S(O)2R、-N(OR)C(O)OR、-N(OR)C(O)N(R)2、-N(OR)C(S)N(R)2、-N(OR)C(＝NR9)N(R)2、-N(OR)C(＝CHR9)N(R)2、-C(＝NR9)R、-C(O)N(R)OR和-C(＝NR9)N(R)2，并且每个n独立地选自1、2、3、4和5；
每个R5独立地选自由C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
每个R6独立地选自由C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
M和M′独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR′)O-、-S(O)2-、-S-S-、芳基和杂芳基；
R7选自由C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
R8选自由C3-6碳环和杂环组成的组；
R9选自由H、CN、NO2、C1-6烷基、-OR、-S(O)2R、-S(O)2N(R)2、C2-6烯基、C3-6碳环和杂环组成的组；
每个R独立地选自由C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
每个R’独立地选自由C1-18烷基、C2-18烯基、-R*YR”、-YR”和H组成的组；
每个R”独立地选自由C3-14烷基和C3-14烯基组成的组；
每个R*独立地选自由C1-12烷基和C2-12烯基组成的组；
每个Y独立地是C3-6碳环；
每个X独立地选自由F、Cl、Br和I组成的组；并且
m选自5、6、7、8、9、10、11、12和13，
或其盐或异构体。
在一些实施方案中，式(I)化合物的另一子集包括以下那些，其中
R1选自由C5-30烷基、C5-20烯基、-R*YR″、-YR″和-R″M′R′组成的组；
R2和R3独立地选自由H、C2-14烷基、C2-14烯基、-R*YR″、-YR″和-R*OR″组成的组，或者R2和R3与其所附接的原子一起形成杂环或碳环；
R4是-(CH2)nQ或-(CH2)nCHQR，其中Q是-N(R)2，并且n选自3、4和5；
每个R5独立地选自由C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
每个R6独立地选自由C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
M和M′独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR′)O-、-S(O)2-、-S-S-、芳基和杂芳基；
R7选自由C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
每个R独立地选自由C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
每个R’独立地选自由C1-18烷基、C2-18烯基、-R*YR”、-YR”和H组成的组；
每个R”独立地选自由C3-14烷基和C3-14烯基组成的组；
每个R*独立地选自由C1-12烷基和C1-12烯基组成的组；
每个Y独立地是C3-6碳环；
每个X独立地选自由F、Cl、Br和I组成的组；并且
m选自5、6、7、8、9、10、11、12和13，
或其盐或异构体。
在一些实施方案中，式(I)化合物的另一子集包括以下那些，其中
R1选自由C5-30烷基、C5-20烯基、-R*YR″、-YR″和-R″M′R′组成的组；
R2和R3独立地选自由C1-14烷基、C2-14烯基、-R*YR″、-YR″和-R*OR″组成的组，或者R2和R3与其所附接的原子一起形成杂环或碳环；
R4选自由-(CH2)nQ、-(CH2)nCHQR、-CHQR和-CQ(R)2组成的组，其中Q是-N(R)2，并且n选自1、2、3、4和5；
每个R5独立地选自由C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
每个R6独立地选自由C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
M和M′独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR′)O-、-S(O)2-、-S-S-、芳基和杂芳基；
R7选自由C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
每个R独立地选自由C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；
每个R’独立地选自由C1-18烷基、C2-18烯基、-R*YR”、-YR”和H组成的组；
每个R″独立地选自由C3-14烷基和C3-14烯基组成的组；
每个R*独立地选自由C1-12烷基和C1-12烯基组成的组；
每个Y独立地是C3-6碳环；
每个X独立地选自由F、Cl、Br和I组成的组；并且
m选自5、6、7、8、9、10、11、12和13，
或其盐或异构体。
在一些实施方案中，式(I)化合物的子集包括式(IA)化合物：
或其盐或异构体，其中1选自1、2、3、4和5；m选自5、6、7、8和9；M1是键或M′；R4是未被取代的C1-3烷基或-(CH2)nQ，其中Q是OH、-NHC(S)N(R)2、-NHC(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)R8、-NHC(＝NR9)N(R)2、-NHC(＝CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、杂芳基或杂环烷基；M和M′独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-P(O)(OR’)O-、-S-S-、芳基以及杂芳基；并且R2和R3独立地选自由H、C1-14烷基和C2-14烯基组成的组。
在一些实施方案中，式(I)化合物的子集包括式(II)化合物：
或其盐或异构体，其中l选自1、2、3、4和5；M1是键或M′；R4是未被取代的C1-3烷基或-(CH2)nQ，其中n是2、3或4，并且Q是OH、-NHC(S)N(R)2、-NHC(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)R8、-NHC(＝NR9)N(R)2、-NHC(＝CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、杂芳基或杂环烷基；M和M′独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R′)-、-P(O)(OR′)O-、-S-S-、芳基和杂芳基；并且R2和R3独立地选自由H、C1-14烷基和C2-14烯基组成的组。
在一些实施方案中，式(I)化合物的子集包括式(IIa)、(IIb)、(IIc)或(IIe)的那些：
或其盐或异构体，其中R4如本文所述。
在一些实施方案中，式(I)化合物的子集包括式(IId)的那些：
或其盐或异构体，其中n是2、3或4；并且m、R’、R”以及R2至R6如本文所述。例如，R2和R3中的每个可独立地选自由C5-14烷基和C5-14烯基组成的组。
在一些实施方案中，本公开的可电离氨基脂质包含具有以下结构的化合物：
在一些实施方案中，本公开的可电离氨基脂质包含具有以下结构的化合物：
在一些实施方案中，本公开的非阳离子脂质包含1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1，2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DLPC)、1，2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-磷酸胆碱(DMPC)、1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、1，2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1，2-二-十一烷酰基-sn-甘油-磷酸胆碱(DUPC)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)、1，2-二-O-十八碳烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18：0二醚PC)、1-油酰基-2胆固醇基半琥珀酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(OChemsPC)、1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(C16 Lyso PC)、1，2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1，2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1，2-二-二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1，2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(ME 16.0PE)、1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1，2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1，2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1，2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1，2-二-二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-外消旋-(1-甘油)钠盐(DOPG)、鞘磷脂和其混合物。
在一些实施方案中，本公开的PEG修饰的脂质包含PEG修饰的磷脂酰乙醇胺、PEG修饰的磷脂酸、PEG修饰的神经酰胺、PEG修饰的二烷基胺、PEG修饰的二酰基甘油、PEG修饰的二烷基甘油和其混合物。在一些实施方案中，PEG修饰的脂质是DMG-PEG、PEG-c-DOMG(也称为PEG-DOMG)、PEG-DSG和/或PEG-DPG。
在一些实施方案中，本公开的固醇包含胆固醇、粪生固醇、谷固醇、麦角固醇、菜油固醇、豆固醇、芸苔固醇、番茄碱、熊果酸、α-生育酚和其混合物。
在一些实施方案中，本公开的LNP包含化合物1的可电离氨基脂质，其中非阳离子脂质是DSPC，结构脂质是胆固醇，并且PEG脂质是DMG-PEG(例如PEG2000-DMG)。
在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒包含45-55摩尔百分比(mol％)的可电离氨基脂质(例如化合物1)。例如，脂质纳米颗粒可包含45-47mol％、45-48mol％、45-49mol％、45-50mol％、45-52mol％、46-48mol％、46-49mol％、46-50mol％、46-52mol％、46-55mol％、47-48mol％、47-49mol％、47-50mol％、47-52mol％、47-55mol％、48-50mol％、48-52mol％、48-55mol％、49-50mol％、49-52mol％、49-55mol％或50-55mol％可电离氨基脂质(例如化合物1)。例如，脂质纳米颗粒可包含45mol％、46mol％、47mol％、48mol％、49mol％、50mol％、51mol％、52mol％、53mol％、54mol％或55mol％可电离氨基脂质。
在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒包含5-15mol％非阳离子(中性)脂质(例如DSPC)。例如，所述脂质纳米颗粒可包含5-6mol％、5-7mol％、5-8mol％、5-9mol％、5-10mol％、5-11mol％、5-12mol％、5-13mol％、5-14mol％、5-15mol％、6-7mol％、6-8mol％、6-9mol％、6-10mol％、6-11mol％、6-12mol％、6-13mol％、6-14mol％、6-15mol％、7-8mol％、7-9mol％、7-10mol％、7-11mol％、7-12mol％、7-13mol％、7-14mol％、7-15mol％、8-9mol％、8-10mol％、8-11mol％、8-12mol％、8-13mol％、8-14mol％、8-15mol％、9-10mol％、9-11mol％、9-12mol％、9-13mol％、9-14mol％、9-15mol％、10-11mol％、10-12mol％、10-13mol％、10-14mol％、10-15mol％、11-12mol％、11-13mol％、11-14mol％、11-15mol％、12-13mol％、12-14mol％、13-14mol％、13-15mol％或14-15mol％非阳离子(中性)脂质(例如DSPC)。例如，所述脂质纳米颗粒可包含5mol％、6mol％、7mol％、8mol％、9mol％、10mol％、11mol％、12mol％、13mol％、14mol％或15mol％DSPC。
在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒包含35-40mol％固醇(例如胆固醇)。例如，所述脂质纳米颗粒可包含35-36mol％、35-37mol％、35-38mol％、35-39mol％、35-40mol％、36-37mol％、36-38mol％、36-39mol％、36-40mol％、37-38mol％、37-39mol％、37-40mol％、38-39mol％、38-40mol％或39-40mol％胆固醇。例如，所述脂质纳米颗粒可包含35mol％、35.5mol％、36mol％、36.5mol％、37mol％、37.5mol％、38mol％、38.5mol％、39mol％、39.5mol％或40mol％胆固醇。
在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒包含1-3mol％DMG-PEG。例如，所述脂质纳米颗粒可包含1-1.5mol％、1-2mol％、1-2.5mol％、1-3mol％、1.5-2mol％、1.5-2.5mol％、1.5-3mol％、2-2.5mol％、2-3mol％或2.5-3.mol％DMG-PEG。例如，所述脂质纳米颗粒可包含1mol％、1.5mol％、2mol％、2.5mol％或3mol％DMG-PEG。
在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒包含50mol％可电离氨基脂质、10mol％DSPC、38.5mol％胆固醇和1.5mol％DMG-PEG。在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒包含48mol％可电离氨基脂质、11mol％DSPC、38.5mol％胆固醇和2.5mol％PEG2000-DMG。
在一些实施方案中，本公开的LNP包含约2∶1至约30∶1的N∶P比。
在一些实施方案中，本公开的LNP包含约6∶1的N∶P比。
在一些实施方案中，本公开的LNP包含约3∶1的N∶P比。
在一些实施方案中，本公开的LNP包含约10∶1至约100∶1的可电离氨基脂质组分与RNA的重量/重量比。
在一些实施方案中，本公开的LNP包含约20∶1的可电离氨基脂质组分与RNA的重量/重量比。
在一些实施方案中，本公开的LNP包含约10∶1的可电离氨基脂质组分与RNA的重量/重量比。
在一些实施方案中，本公开的LNP具有约50nm至约150nm的平均直径。
在一些实施方案中，本公开的LNP具有约70nm至约120nm的平均直径。
多价疫苗
如本文提供的组合物可包括编码相同或不同种类的两种或更多种抗原的RNA或多种RNA。在一些实施方案中，组合物包含编码两种或更多种百日咳抗原、白喉抗原和/或破伤风的RNA或多种RNA。在一些实施方案中，所述RNA可编码1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种或10种或更多种百日咳抗原、白喉抗原和/或破伤风抗原。
在一些实施方案中，可将两种或更多种不同的编码抗原的mRNA配制在相同脂质纳米颗粒中。在其他实施方案中，可将两种或更多种不同的编码抗原的RNA配制在单独脂质纳米颗粒中(每个RNA配制在单一脂质纳米颗粒中)。然后，可将脂质纳米颗粒组合并作为单一疫苗组合物(例如，包含编码多种抗原的多种RNA)施用，或者可单独施用。
药物制剂
本文提供了用于预防或治疗例如人类和其他哺乳动物的百日咳的组合物(例如药物组合物)、方法、药盒和试剂。本文提供的组合物可用作治疗剂或预防剂。其可用于药物中以预防和/或治疗百日咳感染、白喉感染和/或破伤风感染。
在一些实施方案中，可将含有如本文所述的RNA的疫苗施用至受试者(例如哺乳动物受试者，诸如人类受试者)，并且RNA多核苷酸在体内翻译以产生抗原性多肽(抗原)。
组合物(例如，包含RNA)的“有效量”至少部分地基于靶组织、靶细胞类型、施用方式、RNA的物理特征(例如，长度、核苷酸组成和/或修饰的核苷的程度)、疫苗的其他组分和其他决定因素，例如受试者的年龄、体重、身高、性别和一般健康状况。通常，有效量的组合物提供诱导或加强的免疫反应，其随受试者细胞中的抗原产生而变化。在一些实施方案中，有效量的含有具有至少一个化学修饰的RNA多核苷酸的组合物比含有编码相同抗原或肽抗原的相应未经修饰的多核苷酸的组合物更有效。抗原产生增加可通过细胞转染(用RNA疫苗转染的细胞的百分数)增加、从多核苷酸的蛋白质翻译和/或表达增加、核酸降解减少(例如，如通过从经修饰的多核苷酸的蛋白质翻译的持续时间增加)或宿主细胞的抗原特异性免疫反应的改变来证明。
术语“药物组合物”是指活性剂与惰性或活性载体的组合，使得组合物尤其适于体内或离体诊断或治疗用途。“药学上可接受的载体”在施用至受试者后或在施用至受试者时不会引起不期望的生理效应。药物组合物中的载体在其与活性成分相容并且能够稳定活性成分的意义上必须也是“可接受的”。一种或多种增溶剂可用作递送活性剂的药物载体。药学上可接受的载体的实例包括(但不限于)生物相容性媒介物、佐剂、添加剂和稀释剂，以实现可用作剂型的组合物。其他载体的实例包括胶态氧化硅、硬脂酸镁、纤维素和月桂基硫酸钠。额外适宜药物载体和稀释剂以及使用其的药物必需品阐述于Remington′sPharmaceutical Sciences中。
在一些实施方案中，根据本公开的组合物(包含多核苷酸及其编码的多肽)可用于治疗或预防百日咳感染、白喉感染和/或破伤风染。组合物可作为主动免疫方案的一部分预防性或治疗性地施用至健康个体或在潜伏期(incubation phase)期间或在症状发作后的活动性感染期间的感染早期施用。在一些实施方案中，提供给细胞、组织或受试者的RNA的量可为有效用于免疫预防的量。
组合物可与其他预防性或治疗性化合物一起施用。作为一个非限制性实例，预防性或治疗性化合物可为佐剂或加强剂。如本文所用，当提及预防性组合物(例如疫苗)时，术语“加强剂”是指额外施用预防性(疫苗)组合物。可在早期施用预防性组合物后给予加强剂(或加强疫苗)。初始施用预防性组合物与加强剂之间的施用时间可以是但不限于12小时、1天、36小时、2天、3天、4天、5天、6天、1周、10天、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、18个月、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年或更长时间。在示例性实施方案中，初始施用预防性组合物与加强剂之间的施用时间可以是但不限于1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月或6个月。如本文所述，加强剂可包含与早期施用预防性组合物相比相同或不同的mRNA。在一些实施方案中，加强剂是单价的(例如，mRNA编码单一抗原)。在一些实施方案中，加强剂是多价的(例如，mRNA编码一种以上抗原)。
在一些实施方案中，组合物可经肌内、鼻内或真皮内施用，类似于本领域中已知的灭活疫苗的施用。
根据感染的盛行率或未满足的医疗需要的程度或水平，组合物可用于各种环境。作为一个非限制性实例，RNA疫苗可用于治疗和/或预防多种细菌性疾病(例如，百日咳、破伤风、白喉)。RNA疫苗具有优越的性质，这是因为它们比市售疫苗产生大得多的抗体滴度、更好的中和免疫性、产生更耐久的免疫反应和/或更早产生反应。
本文提供了药物组合物，其包括RNA和/或复合体，任选地与一种或多种药学上可接受的赋形剂组合。
所述RNA可单独配制或施用，或与一种或多种其他组分联合配制或施用。例如，免疫组合物可包含其他组分，包括但不限于佐剂。
在一些实施方案中，免疫组合物不包含佐剂(其不含佐剂)。
RNA可与一种或多种药学上可接受的赋形剂组合配制或施用。在一些实施方案中，疫苗组合物包含至少一种额外活性物质，例如治疗活性物质、预防活性物质或两者的组合。疫苗组合物可为无菌的、无热原的，或无菌和无热原的。在医药剂(例如疫苗组合物)的配制和/或制造中的一般考虑因素可见于例如Remington：The Science and Practice ofPharmacy，第21版，Lippincott Williams&Wilkins，2005(其通过引用整体并入本文)。
在一些实施方案中，将免疫组合物施用至人类、人类患者或受试者。出于本公开的目的，短语“活性成分”通常是指RNA疫苗或其中所含的多核苷酸，例如编码抗原的RNA多核苷酸(例如，mRNA多核苷酸)。
本文所述的疫苗组合物的制剂可通过药理学领域中已知或以后开发的任何方法来制备。一般来说，此类制备方法包括使活性成分(例如mRNA多核苷酸)与赋形剂和/或一种或多种其他辅助成分缔合并且然后在必要时和/或需要时将产品分割、成型和/或包装成期望的单剂量或多剂量单元的步骤。
根据本公开的药物组合物中的活性成分、药学上可接受的赋形剂和/或任何另外成分的相对量将取决于所治疗的受试者的身份、尺寸和/或病状并且进一步取决于待施用组合物的途径而改变。举例来说，所述组合物可包含介于0.1％与100％之间、例如介于0.5％与50％之间、介于1％与30％之间、介于5％与80％之间、至少80％(w/w)的活性成分。
在一些实施方案中，使用一种或多种赋形剂配制RNA以：(1)增加稳定性；(2)增加细胞转染；(3)允许持续或延迟释放(例如，来自储积制剂)；(4)改变生物分布(例如，靶向特定组织或细胞类型)；(5)增加编码的蛋白质在体内的翻译；和/或(6)改变编码的蛋白质(抗原)在体内的释放曲线。除了传统赋形剂(例如任何和所有溶剂、分散介质、稀释剂或其他液体媒介物、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂)之外，赋形剂还可包括(但不限于)类脂质、脂质体、脂质纳米颗粒、聚合物、脂质复合体、核-壳纳米颗粒、肽、蛋白质、用RNA转染的细胞(例如，用于移植至受试者中)、玻尿酸酶、纳米颗粒模拟物和其组合。
给药/施用
本文提供了用于预防和/或治疗人类和其他哺乳动物的百日咳感染、白喉感染和/或破伤风感染的免疫组合物(例如，RNA疫苗)、方法、药盒和试剂。免疫组合物可用作治疗剂或预防剂。在一些实施方案中，免疫组合物用于提供针对百日咳感染、白喉感染和/或破伤风感染的预防性保护。在一些实施方案中，免疫组合物用于治疗百日咳感染、白喉感染和/或破伤风感染。在一些实施方案中，免疫组合物用于引发免疫效应细胞，例如离体激活外周血单核细胞(PBMC)，然后将其输注(再输注)至受试者中。
受试者可以是任何哺乳动物，包括非人类灵长类动物和人类受试者。通常，受试者是人类受试者。
在一些实施方案中，将免疫组合物(例如，RNA疫苗)以有效诱导抗原特异性免疫反应的量施用至受试者(例如，哺乳动物受试者，例如人类受试者)。编码百日咳抗原、破伤风抗原和/或白喉抗原的RNA在体内表达和翻译以产生抗原，其然后刺激受试者的免疫反应。
在施用本公开的免疫组合物(例如RNA疫苗)之后，可实现针对百日咳、白喉和/或破伤风的预防性保护。免疫组合物可施用一次、两次、三次、四次或更多次，但有可能施用一次疫苗即为足够的(任选地接着进行单次加强)。尽管不太期望，但可将免疫组合物施用至受感染个体以实现治疗反应。可能需要相应调整给药。
在本公开的方面中，提供了在受试者中引发针对百日咳抗原、白喉抗原和/或破伤风抗原(或多种抗原)的免疫反应的方法。在一些实施方案中，方法包括向受试者施用包含具有编码百日咳抗原、白喉抗原和/或破伤风抗原(或多种抗原)的开放阅读框的mRNA的免疫组合物，从而在受试者中诱导对百日咳抗原、白喉抗原和/或破伤风抗原(或多种抗原)具有特异性的免疫反应，其中相对于用预防有效剂量的针对所述抗原的传统疫苗接种的受试者中的抗抗原抗体滴度，疫苗接种后受试者中的抗抗原抗体滴度增加。“抗抗原抗体”是特异性结合至抗原的血清抗体。
预防有效剂量是在临床上可接受的水平上预防病毒感染的有效剂量。在一些实施方案中，有效剂量是疫苗的包装插页中列出的剂量。如本文所用，传统疫苗是指除本公开的mRNA疫苗之外的疫苗。例如，传统疫苗包括(但不限于)活微生物疫苗、杀灭的微生物疫苗、亚单位疫苗、蛋白质抗原疫苗、DNA疫苗、病毒样颗粒(VLP)疫苗等。在示例性实施方案中，传统疫苗是已经获得监管部门批准和/或在国家药物监管机构(例如美国食品药品管理局(FDA)或欧洲药物管理局(EMA))注册的疫苗。
在一些实施方案中，相对于用预防有效剂量的针对百日咳、破伤风或白喉的传统疫苗接种的受试者或未接种疫苗的受试者中的抗抗原抗体滴度，疫苗接种后的受试者中的抗抗原抗体滴度增加1log至10log。在一些实施方案中，相对于用预防有效剂量的针对百日咳、破伤风或白喉的传统疫苗接种的受试者或未接种疫苗的受试者中的抗抗原抗体滴度，疫苗接种后的受试者中的抗抗原抗体滴度增加1log、2log、3log、4log、5log或10log。
在本公开的其他方面，提供了在受试者中引发针对百日咳、破伤风或白喉的免疫反应的方法。所述方法包括向受试者施用包含含有编码百日咳抗原、破伤风抗原或白喉抗原的开放阅读框的mRNA的组合物，从而在受试者中诱导对百日咳、破伤风或白喉具有特异性的免疫反应，其中受试者中的免疫反应等同于以相对于组合物2倍至100倍剂量水平用针对百日咳、破伤风或白喉的传统疫苗接种的受试者中的免疫反应。
在一些实施方案中，受试者中的免疫反应等同于以相对于本公开的组合物两倍的剂量水平用传统疫苗接种的受试者中的免疫反应。在一些实施方案中，受试者中的免疫反应等同于以相对于本公开的组合物三倍的剂量水平用传统疫苗接种的受试者中的免疫反应。在一些实施方案中，受试者中的免疫反应等同于以相对于本公开的组合物4倍、5倍、10倍、50倍或100倍的剂量水平用传统疫苗接种的受试者中的免疫反应。在一些实施方案中，受试者中的免疫反应等同于以相对于本公开的组合物10倍至1000倍的剂量水平用传统疫苗接种的受试者中的免疫反应。在一些实施方案中，受试者中的免疫反应等同于以相对于本公开的组合物100倍至1000倍的剂量水平用传统疫苗接种的受试者中的免疫反应。
在其他实施方案中，通过测定受试者中的[蛋白]抗体滴度来评价免疫反应。在其他实施方案中，测试来自经免疫受试者的血清或抗体中和病毒摄取或减少人类B淋巴细胞的百日咳、白喉和/或破伤风转化的能力。在其他实施方案中，使用本领域中公认的技术来测量促进稳固T细胞反应的能力。
本公开的其他方面提供了通过向受试者施用包含具有编码百日咳、白喉和/或破伤风抗原的开放阅读框的mRNA的组合物，从而在受试者中诱导对百日咳、白喉和/或破伤风抗原具有特异性的免疫反应，而在受试者中引发针对百日咳、白喉和/或破伤风的免疫反应的方法，其中相对于在用预防有效剂量的针对百日咳、白喉和/或破伤风的传统疫苗接种的受试者中诱导的免疫反应，所述受试者中诱导的免疫反应早2天至10周。在一些实施方案中，在以相对于本公开的组合物2倍至100倍的剂量水平用预防有效剂量的传统疫苗接种的受试者中，诱导所述受试者中的免疫反应。
在一些实施方案中，相对于在用预防有效剂量的传统疫苗接种的受试者中诱导的免疫反应，所述受试者中诱导的免疫反应早2天、3天、1周、2周、3周、5周或10周。
本文还提供了通过向受试者施用具有编码至少一种百日咳抗原、破伤风抗原和/或白喉抗原的开放阅读框的mRNA而在受试者中引发针对百日咳、破伤风或白喉的免疫反应的方法，其中RNA不包括稳定化元件，并且其中佐剂不与疫苗共配制或共施用。
组合物可通过任何产生治疗有效结果的途径施用。这些途径包括(但不限于)真皮内、肌内、鼻内和/或皮下施用。本公开提供了包括向有需要的受试者施用RNA疫苗的方法。所需要的精确量可取决于受试者的种类、年龄和一般状况、疾病的严重性、具体组合物、其施用方式、其作用方式等在受试者与受试者之间不同。RNA通常配制成剂量单位形式以便于施用和剂量的均匀性。然而，应理解，RNA的总日用量可由主治医师在合理的医学判断范围内决定。对于任何特定患者的具体治疗有效、预防有效或适当的成像剂量水平将取决于多种因素，包括所治疗的病症和病症的严重程度；所采用的具体化合物的活性；所采用的具体组合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；施用时间、施用途径和所采用的具体化合物的排泄速率；治疗的持续时间；与所采用的具体化合物组合或同时使用的药物；以及医学领域众所周知的类似因素。
如本文提供的RNA的有效量(例如有效剂量)可低至20μg，例如以单一剂量或两个10μg剂量(例如，第一有效疫苗剂量和第二有效疫苗剂量)施用。在一些实施方案中，第一有效疫苗剂量和第二有效疫苗剂量是相同的量。在一些实施方案中，第一有效疫苗剂量和第二有效疫苗剂量是不同量。在一些实施方案中，有效量是5μg-30μg、5μg-25μg、5μg-20μg、5μg-15μg、5μg-10μg、10μg-30μg、10μg-25μg、10μg-20μg、10μg-15μg、15μg-30μg、15μg-25μg、15μg-20μg、20μg-30μg、25μg-30μg或25μg-300μg的总剂量。在一些实施方案中，有效剂量(例如，有效量)是至少10μg且小于25μg的组合物。在一些实施方案中，有效剂量(例如，有效量)是至少5μg且小于25μg的组合物。例如，有效量可以是5μg、10μg、15μg、20μg、25μg、30μg、35μg、40μg、45μg、50μg、55μg、60μg、65μg、70μg、75μg、80μg、85μg、90μg、95μg、100μg、110μg、120μg、130μg、140μg、150μg、160μg、170μg、180μg、190μg、200μg、250μg或300μg的总剂量。在一些实施方案中，有效量(例如，有效剂量)是10μg的总剂量。在一些实施方案中，有效量是20μg(例如，两个10μg剂量)的总剂量。在一些实施方案中，有效量是25μg的总剂量。在一些实施方案中，有效量是30μg的总剂量。在一些实施方案中，有效量是50μg的总剂量。在一些实施方案中，有效量是60μg(例如，两个30μg剂量)的总剂量。在一些实施方案中，有效量是75μg的总剂量。在一些实施方案中，有效量是100μg的总剂量。在一些实施方案中，有效量是150μg的总剂量。在一些实施方案中，有效量是200μg的总剂量。在一些实施方案中，有效量是250μg的总剂量。在一些实施方案中，有效量是300μg的总剂量。
本文所述的RNA可配制成本文所述的剂型，例如鼻内、气管内或可注射(例如，静脉内、眼内、玻璃体内、肌内、真皮内、心内、腹膜内和皮下)。
疫苗效力
本公开的一些方面提供了组合物(例如，RNA疫苗)的制剂，其中以有效量配制RNA以在受试者中产生抗原特异性免疫反应(例如，产生对百日咳、破伤风或白喉抗原具有特异性的抗体)。“有效量”是有效产生抗原特异性免疫反应的RNA的剂量。本文还提供了在受试者中诱导抗原特异性免疫反应的方法。
如本文所用，对本公开的疫苗或LNP的免疫反应是在受试者中产生对疫苗中存在的(一种或多种)百日咳、白喉和/或破伤风蛋白的体液和/或细胞免疫反应。出于本公开的目的，“体液”免疫反应是指由抗体分子(包括例如分泌性(IgA)或IgG分子)介导的免疫反应，而“细胞”免疫反应是由T淋巴细胞(例如，CD4+辅助细胞和/或CD8+T细胞(例如CTL))和/或其他白细胞介导的免疫反应。细胞免疫的一个重要方面包括由细胞溶解性T细胞(CTL)引起的抗原特异性反应。CTL对与主要组织相容性复合体(MHC)所编码的蛋白质缔合呈递并在细胞表面上表达的肽抗原具有特异性。CTL帮助诱导和促进细胞内微生物的破坏或感染此类微生物的细胞的溶解。细胞免疫的另一个方面包括由辅助T细胞引起的抗原特异性反应。辅助T细胞用于帮助刺激功能并且使非特异性效应细胞的活性集中于在表面上展示与MHC分子缔合的肽抗原的细胞。细胞免疫反应还导致产生细胞因子、趋化因子和由活化T细胞和/或其他白细胞产生的其他此类分子(包括源自CD4+和CD8+T细胞的那些)。体液免疫反应可进一步分为Th1和Th2反应，分别导致产生Th1型细胞因子和Th2型细胞因子。Th1型细胞因子倾向于产生负责杀死细胞内寄生虫和保持自身免疫反应的促炎性反应。主要Th1细胞因子是干扰素γ。在一些实施方案中，过度的促炎性反应(例如基于Th1的反应)可导致不受控制的组织损伤，并且被Th2型细胞因子抵消。Th2型细胞因子包括白介素4、5和13，其与特应性中的IgE和嗜酸性粒细胞反应的促进相关；以及还有白介素-10，其是抗炎性的。过量时，Th2反应将抵消Th1介导的杀微生物作用。因此，在一些实施方案中，本文提供的疫苗引发平衡的Th1和Th2反应。在一些实施方案中，本文提供的疫苗的施用可导致Th17反应。T辅助17细胞(Th17)是由其产生白介素17而定义的促炎性T辅助细胞的亚群。Th17细胞维持粘膜屏障并有助于粘膜表面的病原体清除。Th17型细胞因子靶向先天免疫细胞和上皮细胞以产生G-CSF和Il-8，导致嗜中性粒细胞产生和募集。在一些实施方案中，本公开的组合物(例如疫苗)产生Th1反应。在一些实施方案中，本公开的组合物(例如疫苗)产生Th2反应。在一些实施方案中，本公开的组合物(例如疫苗)产生Th17反应。在一些实施方案中，本公开的组合物(例如疫苗)产生Th1和Th2反应、Th1和Th17反应、Th2和Th17反应或Th1、Th2和Th17反应。
在一些实施方案中，抗原特异性免疫反应通过测量在施用如本文提供的组合物的受试者中产生的抗百日咳抗原抗体滴度来表征。在一些实施方案中，抗原特异性免疫反应通过测量在施用如本文提供的组合物的受试者中产生的抗白喉抗原抗体滴度来表征。在一些实施方案中，抗原特异性免疫反应通过测量在施用如本文提供的组合物的受试者中产生的抗破伤风抗原抗体滴度来表征。抗体滴度是受试者内抗体(例如，对特定抗原或抗原的表位特异性的抗体)的量的测量结果。抗体滴度通常表示为提供阳性结果的最大稀释度的倒数。例如，酶联免疫吸附测定(ELISA)是用于测定抗体滴度的常见测定。
可使用多种血清学测试来测量针对所编码的目标抗原(例如百日咳抗原、白喉抗原或破伤风抗原)的抗体。这些测试包括血球凝集抑制测试、补体结合测试、荧光抗体测试、酶联免疫吸附测定(ELISA)和噬斑减少中和测试(PRNT)。这些测试中的每一者测量不同抗体活性。在示例性实施方案中，噬斑减少中和测试或PRNT(例如PRNT50或PRNT90)用作保护的血清学相关物。PRNT测量体外病毒中和的生物学参数，并且是某些类别的病毒中最具血清学病毒特异性的测试，与病毒感染的保护的血清水平充分相关。PRNT的基本设计允许在试管或微量滴定板中发生病毒-抗体相互作用，并且然后通过将混合物平铺在病毒易感性细胞、优选哺乳动物来源的细胞上来测量抗体对病毒感染性的效应。用限制后代病毒传播的半固体培养基覆盖细胞。引发生产性感染的每个病毒产生局部感染区域(噬斑)，其可以多种方式检测。对噬斑计数并与病毒的起始浓度进行比较以确定总病毒感染性的降低百分比。在PRNT中，通常在与标准量的病毒混合之前，将所测试的血清样品进行连续稀释。病毒的浓度保持恒定，使得当添加至易感细胞中并用半固体培养基覆盖时，可辨别个别噬斑并计数。以这种方式，可在任何选择的病毒活性降低百分比下计算每个血清样品的PRNT终点滴度。
在旨在评价疫苗免疫原性的功能测定中，用于抗体滴定的血清样品稀释系列理想地应在低于“血清保护性”阈值滴度下开始。关于百日咳中和抗体、白喉中和抗体或破伤风中和抗体，在某些实施方案中，1∶10的血清阳性阈值可被认为是血清保护阈值。
PRNT终点滴度表示为显示所需的噬斑计数减少百分比的最后血清稀释度的倒数。PRNT滴度可基于50％或更大的噬斑计数减少来计算(PRNT50)。对于疫苗血清，PRNT50滴度优于使用较高截止值(例如，PRNT90)的滴度，从滴定曲线的线性部分提供更准确的结果。
存在用以计算PRNT滴度的若干方式。计算滴度的最简单和最广泛使用的方式是对噬斑计数，并且将滴度报告为基于输入噬斑的反滴定，显示输入噬斑计数减少＞50％的最后血清稀释度的倒数。使用来自若干血清稀释的曲线拟合方法可允许计算更精确的结果。存在多种计算机分析程序可用于此目的(例如，SPSS或GraphPad Prism)。
在一些实施方案中，抗体滴度用于评价受试者是否已经感染或确定是否需要免疫。在一些实施方案中，抗体滴度用于确定自身免疫反应的强度，确定是否需要加强免疫，确定先前的疫苗是否有效，以及鉴定任何最近或先前的感染。根据本公开，抗体滴度可用于确定由组合物(例如，RNA疫苗)在受试者中诱导的免疫反应的强度。
在一些实施方案中，受试者中产生的抗百日咳抗原抗体滴度、抗白喉抗原抗体滴度或抗破伤风抗原抗体滴度相对于对照增加至少1log。例如，受试者中产生的抗百日咳抗原抗体滴度、抗白喉抗原抗体滴度或抗破伤风抗原抗体滴度相对于对照可增加至少1.5、至少2、至少2.5或至少3log。在一些实施方案中，受试者中产生的抗百日咳抗原抗体滴度、抗白喉抗原抗体滴度或抗破伤风抗原抗体滴度相对于对照增加至少1、1.5、2、2.5或3log。在一些实施方案中，受试者中产生的抗百日咳抗原抗体滴度、抗白喉抗原抗体滴度或抗破伤风抗原抗体滴度相对于对照增加1-3log。例如，受试者中产生的抗百日咳抗原抗体滴度、抗白喉抗原抗体滴度或抗破伤风抗原抗体滴度相对于对照可增加1-1.5、1-2、1-2.5、1-3、1.5-2、1.5-2.5、1.5-3、2-2.5、2-3或2.5-3log。
在一些实施方案中，受试者中产生的抗百日咳抗原抗体滴度、抗白喉抗原抗体滴度或抗破伤风抗原抗体滴度相对于对照增加至少2倍。例如，受试者中产生的抗百日咳抗原抗体滴度、抗白喉抗原抗体滴度或抗破伤风抗原抗体滴度可相对于对照增加至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍或至少10倍。在一些实施方案中，受试者中产生的抗百日咳抗原抗体滴度、抗白喉抗原抗体滴度或抗破伤风抗原抗体滴度相对于对照增加2、3、4、5、6、7、8、9或10倍。在一些实施方案中，受试者中产生的抗百日咳抗原抗体滴度、抗白喉抗原抗体滴度或抗破伤风抗原抗体滴度相对于对照增加2-10倍。例如，受试者中产生的抗百日咳抗原抗体滴度、抗白喉抗原抗体滴度或抗破伤风抗原抗体滴度相对于对照可增加2-10、2-9、2-8、2-7、2-6、2-5、2-4、2-3、3-10、3-9、3-8、3-7、3-6、3-5、3-4、4-10、4-9、4-8、4-7、4-6、4-5、5-10、5-9、5-8、5-7、5-6、6-10、6-9、6-8、6-7、7-10、7-9、7-8、8-10、8-9或9-10倍。
在一些实施方案中，抗原特异性免疫反应测量为百日咳、白喉和/或破伤风的血清中和抗体滴度的几何平均滴度(GMT)的比率，称为几何平均比率(GMR)。几何平均滴度(GMT)是通过将所有值相乘并且取所述数的n次方根来计算的一组受试者的平均抗体滴度，其中n是具有可用数据的受试者的数目。
在一些实施方案中，对照是未施用组合物(例如RNA疫苗)的受试者中产生的抗百日咳抗原抗体滴度、抗白喉抗原抗体滴度或抗破伤风抗原抗体滴度。在一些实施方案中，对照是施用了重组或纯化蛋白疫苗的受试者中产生的抗百日咳抗原抗体滴度、抗白喉抗原抗体滴度或抗破伤风抗原抗体滴度。重组蛋白疫苗通常包括在异源表达系统(例如细菌或酵母)中产生或从大量病原生物体中纯化的蛋白抗原。
在一些实施方案中，在鼠类模型中测量组合物(例如RNA疫苗)有效的能力。例如，可将组合物施用至鼠类模型，并且分析所述鼠类模型的中和抗体滴度的诱导。细菌激发研究还可用于评价本公开的疫苗的功效。例如，可将组合物施用至鼠类模型，用细菌激发鼠类模型，并测定鼠类模型的存活和/或免疫反应(例如中和抗体反应、T细胞反应(例如细胞因子反应))。
在一些实施方案中，组合物(例如，RNA疫苗)的有效量是与重组蛋白疫苗的标准护理剂量相比减少的剂量。如本文所提供的“照护标准”是指医学或心理学治疗指南，并且可为一般性的或特异性的。“照护标准”基于科学证据和参与给定疾患的治疗的医学专业人士之间的合作来指定适当治疗。其是医师/临床医师对于某种类型的患者、疾病或临床情况应遵循的诊断和治疗过程。如本文所提供的“照护标准剂量”是指医师/临床医师或其他医学专业人士在遵循用于治疗或预防百日咳、白喉和/或破伤风感染或相关疾患的照护标准指南的同时，将施用至受试者以治疗或预防百日咳、白喉和/或破伤风感染或相关疾患的重组或纯化蛋白疫苗、或活的减毒或灭活疫苗、或VLP疫苗的剂量。
在一些实施方案中，在施用有效量的组合物的受试者中产生的抗百日咳抗原抗体滴度、抗白喉抗原抗体滴度或抗破伤风抗原抗体滴度等同于在施用照护标准剂量的重组或纯化蛋白疫苗、或活的减毒或灭活疫苗、或VLP疫苗的对照受试者中产生的抗百日咳抗原抗体滴度、抗白喉抗原抗体滴度或抗破伤风抗原抗体滴度。
疫苗功效可使用标准分析来评价(例如，参见Weinberg等人，J Infect Dis.2010年6月1日；201(11)：1607-10)。例如，疫苗功效可通过双盲、随机化、临床对照试验来测量。疫苗功效可表示为未接种疫苗(ARU)和接种疫苗(ARV)的研究同类群组之间疾病罹患率(AR)的成比例降低，并且可使用下式从接种疫苗组中疾病的相对风险(RR)计算：
功效＝(ARU-ARV)/ARU×100；并且
功效＝(1-RR)×100。
同样，疫苗有效性可使用标准分析来评估(例如，参见Weinberg等人，J InfectDis.2010年6月1日；201(11)：1607-10)。疫苗有效性是评价疫苗(其可能已经证明具有高疫苗功效)如何减少群体中的疾病。此量度可评价在自然现场条件下而非在受控临床试验中，疫苗接种程序而不仅仅疫苗本身的益处和不利效应的净平衡。疫苗有效性与疫苗功效(效力)成正比，但也受群体中的目标组的免疫程度以及影响住院治疗、流动就诊或费用的“真实世界”结果的其他非疫苗相关因素影响。例如，可使用回溯性病例对照分析，其中比较一组感染病例和适当对照之间的疫苗接种率。疫苗有效性可表示为比率差异，其中使用针对疫苗接种后仍发生感染的优势比(OR)：
有效性＝(1-OR)×100。
在一些实施方案中，相对于未接种疫苗的对照受试者，组合物(例如，RNA疫苗)的功效为至少60％。例如，相对于未接种疫苗的对照受试者，组合物的功效可为至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少95％、至少98％或100％。
消除性免疫性。消除性免疫性是指防止病原体有效感染至宿主中的独特免疫状态。在一些实施方案中，有效量的本公开的组合物足以在受试者中提供消除性免疫性至少1年。例如，有效量的本公开的组合物足以在受试者中提供消除性免疫持续至少2年、至少3年、至少4年、至少5年、至少6年、至少7年、至少8年、至少9年、至少10年或更长时间。在一些实施方案中，有效量的本公开的组合物足以在受试者中以相对于对照低至少5倍的剂量提供消除性免疫性。例如，有效量可足以在受试者中以相对于对照低至少10倍、15倍或20倍的剂量提供消除性免疫性。
可检测抗原。在一些实施方案中，有效量的本公开的组合物足以产生可检测水平的百日咳、白喉和/或破伤风抗原，如在施用后1-72小时在受试者的血清中所测量。
滴度。抗体滴度是受试者内抗体(例如，对特定抗原(例如，抗百日咳抗原、抗白喉抗原或抗破伤风抗原)具有特异性的抗体)的数量的量度。抗体滴度通常表示为提供阳性结果的最大稀释度的倒数。例如，酶联免疫吸附测定(ELISA)是用于测定抗体滴度的常见测定。
在一些实施方案中，有效量的本公开的组合物足以产生由针对特定抗原的中和抗体产生的1,000-10,000中和抗体滴度，如在施用后1-72小时在受试者的血清中所测量。在一些实施方案中，有效量足以产生由针对特定抗原的中和抗体产生的1,000-5,000中和抗体滴度，如在施用后1-72小时在受试者的血清中所测量。在一些实施方案中，有效量足以产生由针对特定抗原的中和抗体产生的5,000-10,000中和抗体滴度，如在施用后1-72小时在受试者的血清中所测量。
在一些实施方案中，所述中和抗体滴度是至少100NT50。例如，所述中和抗体滴度可为至少200、300、400、500、600、700、800、900或1000NT50。在一些实施方案中，所述中和抗体滴度是至少10,000NT50。
在一些实施方案中，所述中和抗体滴度是至少100个中和单位/毫升(NU/mL)。例如，所述中和抗体滴度可为至少200、300、400、500、600、700、800、900或1000NU/mL。在一些实施方案中，所述中和抗体滴度是至少10,000NU/mL。
在一些实施方案中，受试者中产生的抗百日咳抗原抗体滴度、抗白喉抗原抗体滴度或抗破伤风抗原抗体滴度相对于对照增加至少1log。例如，受试者中产生的抗百日咳抗原抗体滴度、抗白喉抗原抗体滴度或抗破伤风抗原抗体滴度相对于对照可增加至少2、3、4、5、6、7、8、9或10log。
在一些实施方案中，受试者中产生的抗百日咳抗原抗体滴度、抗白喉抗原抗体滴度或抗破伤风抗原抗体滴度相对于对照增加至少2倍。例如，受试者中产生的抗百日咳抗原抗体滴度、抗白喉抗原抗体滴度或抗破伤风抗原抗体滴度相对于对照增加至少3、4、5、6、7、8、9或10倍。
在一些实施方案中，几何平均值，即n个数的乘积的n次方根，通常用于阐述成比例生长。在一些实施方案中，几何平均值用于表征受试者中产生的抗体滴度。
对照可以是例如未接种疫苗的受试者，或施用全细胞细菌疫苗或无细胞疫苗(例如，DTaP或Tdap)的受试者。
实施例
实施例1.mRNA疫苗(单一抗原)的体内研究
为了研究mRNA疫苗的作用，在第0天向小鼠注射阴性对照(无疫苗，无百日咳博德特氏菌)、阳性对照(无疫苗，感染百日咳博德特氏菌)或用脂质纳米颗粒(LNP)配制的mRNA百日咳疫苗(50μL肌内注射)。28天后，不同的组接受了加强剂量。初始疫苗接种后五十六天，用2x 107CFU百日咳博德特氏菌激发小鼠。激发后3天(初始免疫接种后59天)，检查小鼠的细菌负荷、血清学反应和免疫谱。
在每种疫苗中，将mRNA配制在脂质纳米颗粒(LNP)中，所述脂质纳米颗粒包含0.5％-15％PEG修饰的脂质、5％-25％非阳离子脂质、25％-55％固醇和20％-60％可电离阳离子脂质。例如，PEG修饰的脂质是1，2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油、甲氧基聚乙二醇(PEG2000DMG)，非阳离子脂质是1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)，固醇是胆固醇，并且可电离阳离子脂质具有化合物1的结构。
设计并合成了表达单独百日咳毒素(C180、PTX、RTX和ACT-CAT)、不同粘附蛋白(FHA1、FHA2、FHA3、FHA4、PRN和BrkA)的mRNA疫苗。还生成了其他抗原和对照，包括Vag1、TcfA、SphB2、Fim、PT-alum(遗传脱毒，1.25μg)、wP(1/20人剂量)和DTaP(1/20人剂量)。所测量的毒素终点包括：总白细胞、嗜中性粒细胞和淋巴细胞、全身性IL-6(指示炎症)、体重减轻以及PT和ACT中和。还进行了毒素结合ELISA。粘附/表面抗原终点如下：肺和鼻细菌负荷、全身IL-6、毒素结合ELISA和活百日咳博德特氏菌染色(作为OPA替代物)。
结果显示于图1-7B中。图1示出不同组之间的重量变化百分比(体重减轻)。所有毒素mRNA构建体均显示出小于安慰剂的平均体重减轻。如图2所示，毒素mRNA构建体还显示相对于安慰剂减少的细胞计数(白细胞、嗜中性粒细胞和淋巴细胞)。图3，其示出样品中IL-6的浓度，表明毒素mRNA构建体与1/20DTaP剂量相当地预防全身性炎症。测定气管和肺以及鼻灌洗液中的细菌负荷。如图4和5所示，发现TCFA、SPHB1、FHA3和FIM3影响肺/鼻细菌负荷。图6A-6B示出在施用毒素mRNA构建体加强剂后(图6A)和然后在激发后(图6B)的抗体滴度。发现C180和PTX预防毒素介导的病理学(图6A)，RTX及其催化结构域构建体也是如此。此外，检查了针对分泌型抗原(细胞外百日咳蛋白，100种蛋白质)的抗体滴度(图7A)，并且发现相对于对照，大多数mRNA构建体中的抗体滴度增加。当进行活百日咳博德特氏菌结合测定时，mRNA构建体中的抗体滴度相对于对照也增加(图7B)。
小鼠实验证明，表达mRNA的百日咳毒素构建体能够预防毒素介导的病理学(参见例如，C180和PTX)。此外，发现TCFA、SPHB1、FHA3和FIM3影响肺/鼻细菌负荷。
实施例2.mRNA疫苗(抗原组合)的体内研究
为了研究mRNA疫苗的作用，在第0天向小鼠注射阴性对照(无疫苗，无百日咳博德特氏菌)、阳性对照(无疫苗，感染百日咳博德特氏菌)或具有脂质纳米颗粒的mRNA百日咳疫苗(50μL肌内注射)。28天后，不同的组接受了加强剂量。初始疫苗接种后五十六天，用2x107CFU百日咳博德特氏菌激发小鼠。激发后3天(初始免疫接种后59天)，检查小鼠的细菌负荷、血清学反应和免疫谱。
在每种疫苗中，将mRNA配制在脂质纳米颗粒(LNP)中，所述脂质纳米颗粒包含0.5％-15％PEG修饰的脂质、5％-25％非阳离子脂质、25％-55％固醇和20％-60％可电离阳离子脂质。例如，PEG修饰的脂质是1，2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油、甲氧基聚乙二醇(PEG2000DMG)，非阳离子脂质是1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)，固醇是胆固醇，并且可电离阳离子脂质具有化合物1的结构。
设计并合成了表达不同百日咳抗原或不同百日咳抗原的组合的mRNA疫苗。所测试的组和所施用的mRNA的剂量显示于下表中：
组 抗原 剂量(ug)
1 Fim2-3 2
2 Fim2 2
3 RTX 2
4 SPHB1 2
5 TCFA 2
6 FHA3 2
7 C180 2
8 FHA3+FIM2+SPHB1 6
9 FHA3+FIM2+C180 6
10 FHA3+FIM2-3+C180 6
11 FIM2+TCFA+C180 6
12 C180+RTX 4
13 FHA3+FIM2+TCFA+SPHB1 8
14 C180+FHA3+FIM2+RTX 8
15 FHA3+FIM2+SBHB1+TCFA 8
16 C180+FHA3+FIM2+PRN 8
17 C180+FHA3+FIM2+SPHB1+RTX 10
18 C180+FHA3+FIM2+SPHB1 8
19 C180+FHA3+FIM2+SPHB1+RTX+TCFA 12
使用用0.1μg/mL PT包被的板，通过ELISA测量针对百日咳毒素(PT)的血清IgG抗体滴度。数据显示在图8中，并且证明IgG抗体滴度在每个测试的疫苗组中增加，高于全细胞疫苗(wP)和对照组。与模拟疫苗接种组相比，对于C180+FHA3+FIM2+SPHB1(p＜0.005)和C180+FHA3+FIM2+SPHB1+RTX+TCFA(p＜0.005)以及C180+FHA3+FIM2(p＜0.0005)组合疫苗以及无细胞疫苗(aP；p＜0.0005)，抗体滴度的增加是统计学上显著的。进行第二ELISA以检查针对UT25(“全病菌”百日咳)的血清IgG抗体滴度。将板用0.243OD的UT25包被。结果显示在图9中，并且显示IgG抗体滴度在每个组中增加到高于模拟疫苗接种组。特别地，FHA3+FIM2+SPHB1+TCFA(p＜0.05)、C180+FHA3+FIM2+SPHB1(p＜0.005)、无细胞疫苗(aP；p＜0.005)、全细胞疫苗(wP；p＜0.0005)、C180+FHA3+FIM2(p＜0.0005)和C180+FHA3+FIM2+PRN(p＜0.0005)组显示相对于模拟疫苗接种组的统计学上显著的增加。
还测量了测试动物的肺、气管和鼻中的细菌负荷，并且结果显示于图10A(肺和气管)和10B(鼻)中。激发剂量对于有意义的鼻测量值而言太低；然而，如图10A所示，四种组合疫苗具有统计学上显著降低的细菌负荷(肺和气管)：C180+TCFA+FIM2、C180+FHA3+FIM2+PRN、C180+FHA3+FIM2+SPHB1和C180+FHA3+FIM2+SPHB1+RTX+TCFA。
实施例1和2中的研究总结(比较两种不同剂量的单一抗原)如下呈现，其中“X”表示值小于wP/aP对照，“XX”表示值等于或优于wP/aP对照，并且无标记表示无活性。
研究1-10μg剂量
研究2-2μg剂量
抗原组合结果的总结显示于下表中(“X”表示值小于wP/aP对照，“XX”表示值等于或优于wP/aP对照，并且无标记表示无活性)：
研究2-抗原组合
实施例3-小鼠的体内免疫(白喉去毒毒素和破伤风毒素片段C)
为了研究具有脂质纳米颗粒的白喉和破伤风mRNA疫苗的效果，在第-3天对C57BL/6小、鼠(n＝5/组)进行预采血，然后在第0天注射mRNA疫苗(50μL肌内注射；0.5μg、2μg或10μg mRNA浓度)。在第27天，收集血液用于血清分析。初始免疫后28天，不同组接受与初始剂量相同量的加强剂量。初始疫苗接种后五十六天，采集血液。
在每种疫苗中，将mRNA配制在脂质纳米颗粒(LNP)中，所述脂质纳米颗粒包含0.5％-15％PEG修饰的脂质、5％-25％非阳离子脂质、25％-55％固醇和20％-60％可电离阳离子脂质。例如，PEG修饰的脂质是1，2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油、甲氧基聚乙二醇(PEG2000DMG)，非阳离子脂质是1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)，固醇是胆固醇，并且可电离阳离子脂质具有化合物1的结构。
测试了两种不同的白喉去毒毒素(K51E_NGM和CRM197_NGM)，以及破伤风毒素片段C(FragC_NGM)。使用天然白喉毒素(突变的G52 E)蛋白和以1ug/ml包被的破伤风类毒素对收集的血清进行ELISA。如图11A所示，在所有剂量水平下，CRM197去毒白喉毒素引发了比K51E去毒白喉毒素更高的结合滴度。在破伤风中，在所有测试的剂量水平中，FragC引发了相似的滴度(图11B)。比较了10μg剂量下每种疫苗的IC50值(图12)，并示出相同的趋势。
实施例4-mRNA疫苗制剂的免疫原性和功效
在小鼠模型中测试了mRNA疫苗制剂的免疫原性和功效。简言之，在第0天用初免剂量的疫苗免疫4周龄雌性BALB/c小鼠，并在第28天用加强剂量免疫。各组显示在下表中。每次给药以50μL剂量肌内施用至受试者腿部。
在第53天、第58天(组1-5、10、16-19)和第59天(组6-9、11-15)采集血液样品，并在第55天(组1-5、10、16-19)或第56天(组6-9、11-15)用百日咳博德特氏菌(菌株UT25)激发受试者。
数据显示在图13-27中。图13显示百日咳博德特氏菌激发后三天肺和气管样品中的菌落形成单位(CFU)。数据证明，与组合组相比，单一抗原制剂组中的CFU显著增加。图14示出来自百日咳博德特氏菌激发后三天的鼻灌洗液数据。组之间无显著差异。图15示出来自百日咳博德特氏菌激发后三天的鼻相关淋巴组织中存在的CFU。所有组合疫苗显示出比模拟疫苗接种组和全细胞百日咳疫苗组(wP)显著更少的CFU/mL。
图16示出激发当天与激发后三天之间小鼠重量的变化百分比。在wP组中观察到最大体重减轻，而几种组合疫苗和DTaP具有较小体重减轻。
图17示出百日咳博德特氏菌激发后三天，不同免疫组之间的完全白细胞计数。组之间无显著差异。图18示出百日咳博德特氏菌激发后三天，不同免疫组之间的嗜中性粒细胞计数。使用Hemavet来测定嗜中性粒细胞计数。组之间未观察到显著差异。图19示出百日咳博德特氏菌激发后三天，不同免疫组之间的淋巴细胞计数。使用Hemavet来测定淋巴细胞计数。组之间未观察到显著差异。图20示出百日咳博德特氏菌激发后三天，不同免疫组之间的单核细胞计数。使用Hemavet来测定单核细胞计数。组之间未观察到显著差异。图21示出百日咳博德特氏菌激发后三天，不同免疫组之间的嗜酸性粒细胞计数。使用Hemavet来测定嗜酸性粒细胞计数。组之间未观察到显著差异。
图22示出针对全病菌(百日咳博德特氏菌菌株UT25)的血清抗体(IgG)滴度。用0.245OD的UT25包被板，并使用ELISA测定来测定抗体滴度。相对于未疫苗接种的阴性对照(NVNC)和模拟疫苗接种对照，观察到显著差异。图23示出激发后三天针对百日咳毒素(PT)的血清抗体(IgG)滴度。用0.1μg/mL PT(List Biological Laboratories#181)包被板，并使用ELISA测定来测定抗体滴度。除wP疫苗接种组外，在实验组与对照组之间观察到显著差异。图24示出激发后三天针对白喉毒素的血清抗体(IgG)滴度。用0.1μg/mL的白喉毒素(Abcam 188505)包被板，并使用ELISA测定来测定抗体滴度。对于所测试制剂中的两种观察到显著增加。图25示出激发后三天针对破伤风毒素的血清抗体(IgG)滴度。用0.1μg/mL的破伤风毒素(Enzo ALX630108)包被板，并使用ELISA测定来测定抗体滴度。对于所测试的单一制剂观察到显著增加，但对于组合疫苗未观察到显著增加。
在激发后三天测量肺上清液(图26)和血清(图27)中的IL-6水平。单斑点96孔板用于测定样品中的IL-6细胞因子水平。在来自施用了mRNA疫苗的受试者的所有样品中观察到IL-6的减少。
实施例5-包含针对不同临床分离株的10种抗原的mRNA疫苗的免疫原性
包含各自合成的十种不同抗原(八种百日咳相关抗原，以及白喉和破伤风抗原)和单独mRNA分子的mRNA疫苗(“mRNA-DTP-10”)的免疫原性和功效，然后合并至相同脂质纳米颗粒(LNP)制剂中。LNP制剂包含化合物1、DSPC、PEG修饰的脂质和胆固醇。测试了其他疫苗制剂，包括DTaP疫苗、全细胞疫苗(SI WCV)和阳性对照(MCV-UT25和MCV-D420)。
简言之，大约4周龄的雌性BALB/c小鼠在第0天进行疫苗接种，然后在第30天接受加强剂量的疫苗。在第44天，用百日咳博德特氏菌(菌株UT25或D420)激发小鼠。三天后，采集样品进行血清学、全血细胞计数(CBC)分析并且计数菌落形成单位(CFU)。
初始(初免)疫苗接种后两周的抗百日咳博德特氏菌抗体(IgG)滴度显示在图28中。在所有组与对照组(NV)之间观察到统计学显著差异，其中mRNA疫苗具有最高的抗原特异性抗体滴度。
接下来，测量了激发后第1天、第3天和第7天小鼠肺和气管样品(代表下呼吸道)中的CFU。对于所测试的每种菌株(UT25和D420)注意到类似的相对结果：mRNA疫苗制剂在每个时间点和所测试的每种菌株产生显著更低的CFU计数(图29A-29C)。结果的时间过程呈现在图30A(UT25)和图30B(D420)中。
额外序列
应理解，本文所述的任何mRNA序列可包括5’UTR和/或3’UTR。所述UTR序列可选自以下序列，或者可使用其他已知UTR序列。还应理解，本文所述的任何mRNA构建体还可包含poly(A)尾和/或帽(例如，7mG(5’)ppp(5’)NlmpNp)。此外，尽管本文所述的许多mRNA和编码的抗原序列包括信号肽和/或肽标签(例如，C末端His标签)，但应理解，所指示的信号肽和/或肽标签可用不同信号肽和/或肽标签取代，或者可省略信号肽和/或肽标签。
5’UTR：GGGAAAUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACC(SEQ ID NO：99)
5’UTR：GGGAAAUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGACCCCGGCGCCGCCACC(SEQID NO：2)
3’UTR：UGAUAAUAGGCUGGAGCCUCGGUGGCCAUGCUUCUUGCCCCUUGGGCCUCCCCCCAGCCCCUCCUCCCCUUCCUGCACCCGUACCCCCGUGGUCUUUGAAUAAAGUCUGAGUGGGCGGC(SEQ ID NO：100)
3’UTR：UGAUAAUAGGCUGGAGCCUCGGUGGCCUAGCUUCUUGCCCCUUGGGCCUCCCCCCAGCCCCUCCUCCCCUUCCUGCACCCGUACCCCCGUGGUCUUUGAAUAAAGUCUGAGUGGGCGGC(SEQ ID NO：4)
表1.序列表

Claims (147)

1.一种组合物，所述组合物包含：
至少一种信使核糖核酸(mRNA)多核苷酸，所述至少一种mRNA多核苷酸具有至少一个编码百日咳博德特氏菌抗原性多肽的开放阅读框(ORF)，所述百日咳博德特氏菌抗原性多肽选自由以下组成的组：百日咳毒素抗原性多肽、自主转运蛋白枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶(SPHB1)抗原性多肽、气管定殖因子A(TCFA)抗原性多肽、丝状血凝素(FHA)抗原性多肽、百日咳杆菌粘附素(PRN)抗原性多肽、菌毛(FIM)抗原性多肽、腺苷酸环化酶抗原性多肽、博德特氏菌抗杀性(Brk)抗原性多肽和毒力相关基因8(Vag8)抗原性多肽。
2.如权利要求1所述的组合物，所述组合物包含：
至少两种信使核糖核酸(mRNA)多核苷酸，所述至少两种mRNA多核苷酸各自具有至少一个ORF并且各自编码选自由以下组成的组的百日咳博德特氏菌抗原性多肽：百日咳毒素抗原性多肽、自主转运蛋白枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶(SPHB1)抗原性多肽、气管定殖因子A(TCFA)抗原性多肽、丝状血凝素(FHA)抗原性多肽、百日咳杆菌粘附素(PRN)抗原性多肽、菌毛(FIM)抗原性多肽、腺苷酸环化酶抗原性多肽、博德特氏菌抗杀性(Brk)抗原性多肽和毒力相关基因8(Vag8)抗原性多肽。
3.如权利要求1所述的组合物，所述组合物包含：
至少三种信使核糖核酸(mRNA)多核苷酸，所述至少三种mRNA多核苷酸各自具有至少一个ORF并且各自编码选自由以下组成的组的百日咳博德特氏菌抗原性多肽：百日咳毒素抗原性多肽、自主转运蛋白枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶(SPHB1)抗原性多肽、气管定殖因子A(TCFA)抗原性多肽、丝状血凝素(FHA)抗原性多肽、百日咳杆菌粘附素(PRN)抗原性多肽、菌毛(FIM)抗原性多肽、腺苷酸环化酶抗原性多肽、博德特氏菌抗杀性(Brk)抗原性多肽和毒力相关基因8(Vag8)抗原性多肽。
4.如权利要求1所述的组合物，所述组合物包含：
至少四种信使核糖核酸(mRNA)多核苷酸，所述至少四种mRNA多核苷酸各自具有至少一个ORF并且各自编码选自由以下组成的组的百日咳博德特氏菌抗原性多肽：百日咳毒素抗原性多肽、自主转运蛋白枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶(SPHB1)抗原性多肽、气管定殖因子A(TCFA)抗原性多肽、丝状血凝素(FHA)抗原性多肽、百日咳杆菌粘附素(PRN)抗原性多肽、菌毛(FIM)抗原性多肽、腺苷酸环化酶抗原性多肽、博德特氏菌抗杀性(Brk)抗原性多肽和毒力相关基因8(Vag8)抗原性多肽。
5.如权利要求1所述的组合物，所述组合物包含：
至少五种信使核糖核酸(mRNA)多核苷酸，所述至少五种mRNA多核苷酸各自具有至少一个ORF并且编码选自由以下组成的组的百日咳博德特氏菌抗原性多肽：百日咳毒素抗原性多肽、自主转运蛋白枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶(SPHB1)抗原性多肽、气管定殖因子A(TCFA)抗原性多肽、丝状血凝素(FHA)抗原性多肽、百日咳杆菌粘附素(PRN)抗原性多肽、菌毛(FIM)抗原性多肽、腺苷酸环化酶抗原性多肽、博德特氏菌抗杀性(Brk)抗原性多肽和毒力相关基因8(Vag8)抗原性多肽。
6.如权利要求1所述的组合物，所述组合物包含：
至少六种信使核糖核酸(mRNA)多核苷酸，所述至少六种mRNA多核苷酸各自具有至少一个ORF并且各自编码选自由以下组成的组的百日咳博德特氏菌抗原性多肽：百日咳毒素抗原性多肽、自主转运蛋白枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶(SPHB1)抗原性多肽、气管定殖因子A(TCFA)抗原性多肽、丝状血凝素(FHA)抗原性多肽、百日咳杆菌粘附素(PRN)抗原性多肽、菌毛(FIM)抗原性多肽、腺苷酸环化酶抗原性多肽、博德特氏菌抗杀性(Brk)抗原性多肽和毒力相关基因8(Vag8)抗原性多肽。
7.如权利要求1所述的组合物，所述组合物包含：
至少七种信使核糖核酸(mRNA)多核苷酸，所述至少七种mRNA多核苷酸各自具有至少一个ORF并且各自编码选自由以下组成的组的百日咳博德特氏菌抗原性多肽：百日咳毒素抗原性多肽、自主转运蛋白枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶(SPHB1)抗原性多肽、气管定殖因子A(TCFA)抗原性多肽、丝状血凝素(FHA)抗原性多肽、百日咳杆菌粘附素(PRN)抗原性多肽、菌毛(FIM)抗原性多肽、腺苷酸环化酶抗原性多肽、博德特氏菌抗杀性(Brk)抗原性多肽和毒力相关基因8(Vag8)抗原性多肽。
8.如权利要求1所述的组合物，所述组合物包含：
至少八种信使核糖核酸(mRNA)多核苷酸，所述至少八种mRNA多核苷酸各自具有至少一个ORF并且各自编码选自由以下组成的组的百日咳博德特氏菌抗原性多肽：百日咳毒素抗原性多肽、自主转运蛋白枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶(SPHB1)抗原性多肽、气管定殖因子A(TCFA)抗原性多肽、丝状血凝素(FHA)抗原性多肽、百日咳杆菌粘附素(PRN)抗原性多肽、菌毛(FIM)抗原性多肽、腺苷酸环化酶抗原性多肽、博德特氏菌抗杀性(Brk)抗原性多肽和毒力相关基因8(Vag8)抗原性多肽。
9.一种组合物，所述组合物包含：
至少九种信使核糖核酸(mRNA)多核苷酸，所述至少九种mRNA多核苷酸各自具有至少一个ORF并且各自编码选自由以下组成的组的每种百日咳博德特氏菌抗原性多肽中的至少一种：百日咳毒素抗原性多肽、自主转运蛋白枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶(SPHB1)抗原性多肽、气管定殖因子A(TCFA)抗原性多肽、丝状血凝素(FHA)抗原性多肽、百日咳杆菌粘附素(PRN)抗原性多肽、菌毛(FIM)抗原性多肽、腺苷酸环化酶抗原性多肽、博德特氏菌抗杀性(Brk)抗原性多肽和毒力相关基因8(Vag8)抗原性多肽。
10.如权利要求1-9中任一项所述的组合物，其中所述百日咳毒素抗原多肽选自由以下组成的组：S1亚基、S2亚基、S3亚基、S4亚基、S5亚基或其变体。
11.如权利要求10所述的组合物，其中所述S1亚基包含与由SEQ ID NO：8标识的序列至少80％、85％、90％、95％或98％同一的氨基酸序列。
12.如权利要求11所述的组合物，其中所述S1亚基包含与由SEQ ID NO：8标识的序列同一的氨基酸序列。
13.如权利要求10-12中任一项所述的组合物，其中编码所述S 1亚基的mRNA包含与由SEQ ID NO：7标识的序列至少95％或98％同一的核苷酸序列。
14.如权利要求13所述的组合物，其中编码所述S1亚基的所述mRNA包含与由SEQ IDNO：7标识的序列同一的核苷酸序列。
15.如权利要求10-14中任一项所述的组合物，其中编码所述S1亚基的mRNA包含与由SEQ ID NO：6标识的序列至少95％或98％同一的核苷酸序列。
16.如权利要求15所述的组合物，其中编码所述S1亚基的所述mRNA包含与由SEQ IDNO：6标识的序列同一的核苷酸序列。
17.如权利要求10所述的组合物，其中所述S1亚基变体包含与由SEQ ID NO：5或11标识的序列至少80％、85％、90％、95％或98％同一的氨基酸序列。
18.如权利要求17所述的组合物，其中所述S1亚基变体包含与由SEQ ID NO：5或11标识的序列同一的氨基酸序列。
19.如权利要求17或18所述的组合物，其中编码所述S1亚基变体的mRNA包含与由SEQID NO：3或10标识的序列至少95％或98％同一的核苷酸序列。
20.如权利要求19所述的组合物，其中编码所述S1亚基变体的所述mRNA包含与由SEQID NO：3或10标识的序列同一的核苷酸序列。
21.如权利要求17-20中任一项所述的组合物，其中编码所述S1亚基变体的所述mRNA包含与由SEQ ID NO：1或9标识的序列至少95％或98％同一的核苷酸序列。
22.如权利要求21所述的组合物，其中编码所述S1亚基变体的所述mRNA包含与由SEQID NO：1或9标识的序列同一的核苷酸序列。
23.如权利要求10所述的组合物，其中所述S2亚基变体包含与由SEQ ID NO：14标识的序列至少80％、85％、90％、95％或98％同一的氨基酸序列。
24.如权利要求23所述的组合物，其中所述S2亚基变体包含与由SEQ ID NO：14标识的序列同一的氨基酸序列。
25.如权利要求23或24所述的组合物，其中编码所述S2亚基变体的mRNA包含与由SEQID NO：13标识的序列至少95％或98％同一的核苷酸序列。
26.如权利要求25所述的组合物，其中编码所述S2亚基变体的所述mRNA包含与由SEQID NO：13标识的序列同一的核苷酸序列。
27.如权利要求23-26中任一项所述的组合物，其中编码所述S2亚基变体的所述mRNA包含与由SEQ ID NO：12标识的序列至少95％或98％同一的核苷酸序列。
28.如权利要求27所述的组合物，其中编码所述S2亚基变体的所述mRNA包含与由SEQID NO：12标识的序列同一的核苷酸序列。
29.如权利要求10所述的组合物，其中所述S3亚基变体包含与由SEQ ID NO：17标识的序列至少80％、85％、90％、95％或98％同一的氨基酸序列。
30.如权利要求29所述的组合物，其中所述S3亚基变体包含与由SEQ ID NO：17标识的序列同一的氨基酸序列。
31.如权利要求29或30所述的组合物，其中编码所述S3亚基变体的mRNA包含与由SEQID NO：16标识的序列至少95％或98％同一的核苷酸序列。
32.如权利要求31所述的组合物，其中编码所述S3亚基变体的所述mRNA包含与由SEQID NO：16标识的序列同一的核苷酸序列。
33.如权利要求29-32中任一项所述的组合物，其中编码所述S3亚基变体的所述mRNA包含与由SEQ ID NO：15标识的序列至少95％或98％同一的核苷酸序列。
34.如权利要求33所述的组合物，其中编码所述S3亚基变体的所述mRNA包含与由SEQID NO：15标识的序列同一的核苷酸序列。
35.如权利要求10所述的组合物，其中所述S4亚基包含与由SEQ ID NO：20标识的序列至少80％、85％、90％、95％或98％同一的氨基酸序列。
36.如权利要求35所述的组合物，其中所述S4亚基变体包含与由SEQ ID NO：20标识的序列同一的氨基酸序列。
37.如权利要求35或36所述的组合物，其中编码所述S4亚基的mRNA包含与由SEQ IDNO：19标识的序列至少95％或98％同一的核苷酸序列。
38.如权利要求37所述的组合物，其中编码所述S4亚基的所述mRNA包含与由SEQ IDNO：19标识的序列同一的核苷酸序列。
39.如权利要求35-38中任一项所述的组合物，其中编码所述S4亚基的所述mRNA包含与由SEQ ID NO：18标识的序列至少95％或98％同一的核苷酸序列。
40.如权利要求39所述的组合物，其中编码所述S4亚基的所述mRNA包含与由SEQ IDNO：18标识的序列同一的核苷酸序列。
41.如权利要求10所述的组合物，其中所述S5亚基变体包含与由SEQ ID NO：23标识的序列至少80％、85％、90％、95％或98％同一的氨基酸序列。
42.如权利要求41所述的组合物，其中所述S5亚基变体包含与由SEQ ID NO：23标识的序列同一的氨基酸序列。
43.如权利要求41或42所述的组合物，其中编码所述S5亚基变体的mRNA包含与由SEQID NO：22标识的序列至少95％或98％同一的核苷酸序列。
44.如权利要求43所述的组合物，其中编码所述S5亚基变体的所述mRNA包含与由SEQID NO：22标识的序列同一的核苷酸序列。
45.如权利要求41-44中任一项所述的组合物，其中编码所述S5亚基变体的所述mRNA包含与由SEQ ID NO：21标识的序列至少95％或98％同一的核苷酸序列。
46.如权利要求45所述的组合物，其中编码所述S5亚基变体的所述mRNA包含与由SEQID NO：21标识的序列同一的核苷酸序列。
47.如权利要求1-46中任一项所述的组合物，其中所述SPHB1抗原性多肽包含与由SEQID NO：26标识的序列至少80％、85％、90％、95％或98％同一的氨基酸序列。
48.如权利要求47所述的组合物，其中所述SPHB1抗原性多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包含由SEQ ID NO：26标识的序列。
49.如权利要求47或48所述的组合物，其中编码所述SPHB1抗原性多肽的mRNA包含与由SEQ ID NO：25标识的序列至少95％或98％同一的核苷酸序列。
50.如权利要求49所述的组合物，其中编码所述SPHB1抗原性多肽的所述mRNA包含与由SEQ ID NO：25标识的序列同一的核苷酸序列。
51.如权利要求47-50中任一项所述的组合物，其中编码所述SPHB1抗原性多肽的所述mRNA包含与由SEQ ID NO：24标识的序列至少95％或98％同一的核苷酸序列。
52.如权利要求51所述的组合物，其中编码所述SPHB1抗原性多肽的所述mRNA包含与由SEQ ID NO：24标识的序列同一的核苷酸序列。
53.如权利要求1-52中任一项所述的组合物，其中所述TCFA抗原性多肽包含与由SEQID NO：29标识的序列至少80％、85％、90％、95％或98％同一的氨基酸序列。
54.如权利要求53所述的组合物，其中所述TCFA抗原性多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包含由SEQ ID NO：29标识的序列。
55.如权利要求53或54所述的组合物，其中编码所述TCFA抗原性多肽的mRNA包含与由SEQ ID NO：28标识的序列至少95％或98％同一的核苷酸序列。
56.如权利要求55所述的组合物，其中编码所述TCFA抗原性多肽的所述mRNA包含与由SEQ ID NO：28标识的序列同一的核苷酸序列。
57.如权利要求53-56中任一项所述的组合物，其中编码所述TCFA抗原性多肽的所述mRNA包含与由SEQ ID NO：27标识的序列至少95％或98％同一的核苷酸序列。
58.如权利要求57所述的组合物，其中编码所述TCFA抗原性多肽的所述mRNA包含与由SEQ ID NO：27标识的序列同一的核苷酸序列。
59.如权利要求1-58中任一项所述的组合物，其中所述丝状血凝素抗原性多肽包含FHA1、FHA2或FHA3。
60.如权利要求59所述的组合物，其中所述FHA3抗原性多肽包含与由SEQ ID NO：35标识的序列至少80％、85％、90％、95％或98％同一的氨基酸序列。
61.如权利要求60所述的组合物，其中所述FHA3抗原性多肽包含由SEQ ID NO：35标识的序列。
62.如权利要求60或61所述的组合物，其中编码所述FHA3抗原性多肽的mRNA包含与由SEQ ID NO：34标识的序列至少95％或98％同一的核苷酸序列。
63.如权利要求62所述的组合物，其中编码所述FHA3抗原性多肽的所述mRNA包含与由SEQ ID NO：34标识的序列同一的核苷酸序列。
64.如权利要求60-63中任一项所述的组合物，其中编码所述FHA3抗原性多肽的所述mRNA包含与由SEQ ID NO：33标识的序列至少95％或98％同一的核苷酸序列。
65.如权利要求64所述的组合物，其中编码所述FHA3抗原性多肽的所述mRNA包含与由SEQ ID NO：33标识的序列同一的核苷酸序列。
66.如权利要求1-65中任一项所述的组合物，其中所述PRN抗原性多肽包含与由SEQ IDNO：32标识的序列至少80％、85％、90％、95％或98％同一的氨基酸序列。
67.如权利要求66所述的组合物，其中所述PRN抗原性多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包含由SEQ ID NO：32标识的序列。
68.如权利要求66或67所述的组合物，其中编码所述PRN抗原性多肽的mRNA包含与由SEQ ID NO：31标识的序列至少95％或98％同一的核苷酸序列。
69.如权利要求68所述的组合物，其中编码所述PRN抗原性多肽的所述mRNA包含与由SEQ ID NO：31标识的序列同一的核苷酸序列。
70.如权利要求66-69中任一项所述的组合物，其中编码所述PRN抗原性多肽的所述mRNA包含与由SEQ ID NO：30标识的序列至少95％或98％同一的核苷酸序列。
71.如权利要求70所述的组合物，其中编码所述PRN抗原性多肽的所述mRNA包含与由SEQ ID NO：30标识的序列同一的核苷酸序列。
72.如权利要求1-71中任一项所述的组合物，其中所述FIM抗原性多肽选自由以下组成的组：FIM1、FIM2、FIM3以及其结构域交换的构建体。
73.如权利要求72所述的组合物，其中所述FIM抗原性多肽包含与由SEQ ID NO：38标识的序列至少80％、85％、90％、95％或98％同一的氨基酸序列。
74.如权利要求73所述的组合物，其中所述FIM抗原性多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包含由SEQ ID NO：38标识的序列。
75.如权利要求73或74所述的组合物，其中编码所述FIM抗原性多肽的mRNA包含与由SEQ ID NO：37标识的序列至少95％或98％同一的核苷酸序列。
76.如权利要求75所述的组合物，其中编码所述FIM抗原性多肽的所述mRNA包含与由SEQ ID NO：37标识的序列同一的核苷酸序列。
77.如权利要求73-76中任一项所述的组合物，其中编码所述FIM抗原性多肽的所述mRNA包含与由SEQ ID NO：36标识的序列至少95％或98％同一的核苷酸序列。
78.如权利要求77所述的组合物，其中编码所述FIM抗原性多肽的所述mRNA包含与由SEQ ID NO：36标识的序列同一的核苷酸序列。
79.如权利要求1-78中任一项所述的组合物，其中所述腺苷酸环化酶抗原性多肽选自由以下组成的组：ACT188LQ、ACTH63A_K65A_S66G和重复子毒素(RTX)结构域。
80.如权利要求79所述的组合物，其中所述RTX抗原性多肽包含与由SEQ ID NO：41标识的序列至少80％、85％、90％、95％或98％同一的氨基酸序列。
81.如权利要求80所述的组合物，其中所述RTX抗原性多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包含由SEQ ID NO：41标识的序列。
82.如权利要求80或81所述的组合物，其中编码所述RTX抗原性多肽的mRNA包含与由SEQ ID NO：40标识的序列至少95％或98％同一的核苷酸序列。
83.如权利要求82所述的组合物，其中编码所述RTX抗原性多肽的所述mRNA包含与由SEQ ID NO：40标识的序列同一的核苷酸序列。
84.如权利要求80-83中任一项所述的组合物，其中编码所述RTX抗原性多肽的所述mRNA包含与由SEQ ID NO：39标识的序列至少95％或98％同一的核苷酸序列。
85.如权利要求84所述的组合物，其中编码所述RTX抗原性多肽的所述mRNA包含与由SEQ ID NO：39标识的序列同一的核苷酸序列。
86.如权利要求1-85中任一项所述的组合物，其中所述Brk抗原性多肽包含与由SEQ IDNO：44标识的序列至少80％、85％、90％、95％或98％同一的氨基酸序列。
87.如权利要求86所述的组合物，其中所述Brk抗原性多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包含由SEQ ID NO：44标识的序列。
88.如权利要求86或87所述的组合物，其中编码所述Brk抗原性多肽的mRNA包含与由SEQ ID NO：43标识的序列至少95％或98％同一的核苷酸序列。
89.如权利要求88所述的组合物，其中编码所述Brk抗原性多肽的所述mRNA包含与由SEQ ID NO：43标识的序列同一的核苷酸序列。
90.如权利要求86-89中任一项所述的组合物，其中编码所述Brk抗原性多肽的所述mRNA包含与由SEQ ID NO：42标识的序列至少95％或98％同一的核苷酸序列。
91.如权利要求90所述的组合物，其中编码所述Brk抗原性多肽的所述mRNA包含与由SEQ ID NO：42标识的序列同一的核苷酸序列。
92.如权利要求1-91中任一项所述的组合物，其中所述Vag8抗原性多肽包含与由SEQID NO：47标识的序列至少80％、85％、90％、95％或98％同一的氨基酸序列。
93.如权利要求92所述的组合物，其中所述Vag8抗原性多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包含由SEQ ID NO：47标识的序列。
94.如权利要求92或93所述的组合物，其中编码所述Vag8抗原性多肽的mRNA包含与由SEQ ID NO：46标识的序列至少95％或98％同一的核苷酸序列。
95.如权利要求94所述的组合物，其中编码所述Vag8抗原性多肽的所述mRNA包含与由SEQ ID NO：46标识的序列同一的核苷酸序列。
96.如权利要求92-95中任一项所述的组合物，其中编码所述Vag8抗原性多肽的所述mRNA包含与由SEQ ID NO：45标识的序列至少95％或98％同一的核苷酸序列。
97.如权利要求97所述的组合物，其中编码所述Vag8抗原性多肽的所述mRNA包含与由SEQ ID NO：45标识的序列同一的核苷酸序列。
98.如权利要求1-97中任一项所述的组合物，所述组合物还包含至少一种mRNA多核苷酸，所述至少一种mRNA多核苷酸具有至少一个编码白喉抗原性多肽的ORF。
99.如权利要求98所述的组合物，其中所述白喉抗原性多肽包含与由SEQ ID NO：50标识的序列至少80％、85％、90％、95％或98％同一的氨基酸序列。
100.如权利要求99所述的组合物，其中所述白喉抗原性多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包含由SEQ ID NO：50标识的序列。
101.如权利要求99或100所述的组合物，其中编码所述白喉抗原性多肽的mRNA包含与由SEQ ID NO：49标识的序列至少95％或98％同一的核苷酸序列。
102.如权利要求101所述的组合物，其中编码所述白喉抗原性多肽的所述mRNA包含与由SEQ ID NO：49标识的序列同一的核苷酸序列。
103.如权利要求99-102中任一项所述的组合物，其中编码所述白喉抗原性多肽的所述mRNA包含与由SEQ ID NO：48标识的序列至少95％或98％同一的核苷酸序列。
104.如权利要求103所述的组合物，其中编码所述白喉抗原性多肽的所述mRNA包含与由SEQ ID NO：48标识的序列同一的核苷酸序列。
105.如权利要求1-104中任一项所述的组合物，所述组合物还包含至少一种mRNA多核苷酸，所述至少一种mRNA多核苷酸具有至少一个编码破伤风抗原性多肽的ORF。
106.如权利要求105所述的组合物，其中所述破伤风抗原性多肽包含与由SEQ ID NO：53标识的序列至少80％、85％、90％、95％或98％同一的氨基酸序列。
107.如权利要求106所述的组合物，其中所述破伤风抗原性多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包含由SEQ ID NO：53标识的序列。
108.如权利要求106或107所述的组合物，其中编码所述破伤风抗原性多肽的mRNA包含与由SEQ ID NO：52标识的序列至少95％或98％同一的核苷酸序列。
109.如权利要求108所述的组合物，其中编码所述破伤风抗原性多肽的所述mRNA包含与由SEQ ID NO：52标识的序列同一的核苷酸序列。
110.如权利要求106-109中任一项所述的组合物，其中编码所述破伤风抗原性多肽的所述mRNA包含与由SEQ ID NO：51标识的序列至少95％或98％同一的核苷酸序列。
111.如权利要求110所述的组合物，其中编码所述破伤风抗原性多肽的所述mRNA包含与由SEQ ID NO：51标识的序列同一的核苷酸序列。
112.一种组合物，所述组合物包含：
至少一种信使核糖核酸(mRNA)多核苷酸，所述至少一种mRNA多核苷酸具有至少一个编码白喉抗原性多肽的开放阅读框(ORF)。
113.如权利要求112所述的组合物，其中所述白喉抗原性多肽包含与由SEQ ID NO：50标识的序列至少80％、85％、90％、95％或98％同一的氨基酸序列。
114.如权利要求113所述的组合物，其中所述白喉抗原性多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包含由SEQ ID NO：50标识的序列。
115.如权利要求113或114所述的组合物，其中编码所述白喉抗原性多肽的mRNA包含与由SEQ ID NO：49标识的序列至少95％或98％同一的核苷酸序列。
116.如权利要求115所述的组合物，其中编码所述白喉抗原性多肽的所述mRNA包含与由SEQ ID NO：49标识的序列同一的核苷酸序列。
117.如权利要求113-116中任一项所述的组合物，其中编码所述白喉抗原性多肽的所述mRNA包含与由SEQ ID NO：48标识的序列至少95％或98％同一的核苷酸序列。
118.如权利要求117所述的组合物，其中编码所述白喉抗原性多肽的所述mRNA包含与由SEQ ID NO：48标识的序列同一的核苷酸序列。
119.一种组合物，所述组合物包含：
至少一种信使核糖核酸(mRNA)多核苷酸，所述至少一种mRNA多核苷酸具有至少一个编码白喉抗原性多肽的开放阅读框(ORF)。
120.如权利要求119所述的组合物，其中所述破伤风抗原性多肽包含与由SEQ ID NO：53标识的序列至少80％、85％、90％、95％或98％同一的氨基酸序列。
121.如权利要求120所述的组合物，其中所述破伤风抗原性多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包含由SEQ ID NO：53标识的序列。
122.如权利要求120或121所述的组合物，其中编码所述破伤风抗原性多肽的mRNA包含与由SEQ ID NO：52标识的序列至少95％或98％同一的核苷酸序列。
123.如权利要求122所述的组合物，其中编码所述破伤风抗原性多肽的所述mRNA包含与由SEQ ID NO：52标识的序列同一的核苷酸序列。
124.如权利要求120-123中任一项所述的组合物，其中编码所述破伤风抗原性多肽的所述mRNA包含与由SEQ ID NO：51标识的序列至少95％或98％同一的核苷酸序列。
125.如权利要求124所述的组合物，其中编码所述破伤风抗原性多肽的所述mRNA包含与由SEQ ID NO：51标识的序列同一的核苷酸序列。
126.如前述权利要求中任一项所述的组合物，所述组合物还包含编码选自由以下组成的组的抗原性融合多肽的mRNA：百日咳抗原性融合多肽、破伤风抗原性融合多肽、白喉抗原性融合多肽或其组合。
127.如权利要求126所述的组合物，其中所述抗原性融合多肽包含与选自SEQ ID NO：56、59、62、65、68、71、74、77、80、83、86、89、92、95和98的序列至少80％、85％、90％、95％或98％同一的氨基酸序列。
128.如权利要求127所述的组合物，其中所述抗原性融合多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包含选自SEQ ID NO：56、59、62、65、68、71、74、77、80、83、86、89、92、95和98的序列。
129.如权利要求127或128所述的组合物，其中编码所述抗原性融合多肽的所述mRNA包含与选自SEQ ID NO：55、58、61、64、67、70、73、76、79、82、85、88、91、94和97的序列至少95％或98％同一的核苷酸序列。
130.如权利要求129所述的组合物，其中编码所述抗原性融合多肽的所述mRNA包含与选自SEQ ID NO：55、58、61、64、67、70、73、76、79、82、85、88、91、94和97的序列同一的核苷酸序列。
131.如权利要求127-130中任一项所述的组合物，其中编码所述抗原性融合多肽的所述mRNA包含与选自SEQ ID NO：54、57、60、63、66、69、72、75、78、81、84、87、90、93和96的序列至少95％或98％同一的核苷酸序列。
132.如权利要求131所述的组合物，其中编码所述抗原性融合多肽的所述mRNA包含与选自SEQ ID NO：54、57、60、63、66、69、72、75、78、81、84、87、90、93和96的序列同一的核苷酸序列。
133.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述mRNA包含5’非翻译区(UTR)，所述5’非翻译区包含SEQ ID NO：2的核苷酸序列。
134.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述mRNA包含3’UTR，所述3’UTR包含SEQ ID NO：4的核苷酸序列。
135.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述mRNA还包含化学修饰。
136.如权利要求125所述的组合物，其中所述化学修饰是1-甲基假尿苷。
137.如前述权利要求中任一项所述的组合物，所述组合物还包含脂质纳米颗粒。
138.如权利要求137所述的组合物，其中所述脂质纳米颗粒包含PEG修饰的脂质、非阳离子脂质、固醇、可电离氨基脂质或其任何组合。
139.如权利要求137或138所述的组合物，其中所述脂质纳米颗粒包含0.5-15mol％PEG修饰的脂质；5-25mol％非阳离子脂质；25-55mol％固醇；和20-60mol％可电离氨基脂质。
140.如权利要求138或139所述的组合物，其中所述PEG修饰的脂质是1，2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油、甲氧基聚乙二醇(PEG2000 DMG)，所述非阳离子脂质是1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)，所述固醇是胆固醇，并且所述可电离氨基脂质具有化合物1的结构：
141.一种方法，所述方法包括向受试者施用有效地在所述受试者中诱导针对百日咳博德特氏菌的中和抗体反应的量的如前述权利要求中任一项所述的组合物。
142.如权利要求141所述的方法，其中所述组合物是以有效地在所述受试者中诱导Th1免疫反应、Th17免疫反应、Th2反应或其组合的量施用。
143.如权利要求141或142所述的方法，其中所述组合物是以有效地减少或消除所述受试者中的百日咳症状的量施用。
144.如权利要求141-143中任一项所述的方法，其中所述组合物是以有效地减少或消除所述受试者的呼吸道的定殖的量施用。
145.如权利要求141-144中任一项所述的方法，其中所述组合物是以有效地降低或消除百日咳博德特氏菌的传播性的量施用。
146.如权利要求141-145中任一项所述的方法，其中所述组合物作为加强进一步第二次施用。
147.如权利要求146所述的方法，其中所述加强剂量在第一剂量后28天施用。
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