KR20210116512A - 원핵생물 세포 용해물에서의 생체접합체 백신 합성 - Google Patents
원핵생물 세포 용해물에서의 생체접합체 백신 합성 Download PDFInfo
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Abstract
항-박테리아 백신을 비롯한 백신에서 이용될 수 있는 글리코실화 단백질의 무세포 합성을 위한 방법, 시스템, 성분 및 조성물이 개시된다. 글리코실화 단백질은 담체에 접합된 박테리아 다당류를 포함할 수 있으며, 이는 담체에 접합된 다당류에 대해 면역화된 숙주에서 면역 반응을 생성하기 위해 사용될 수 있다. 적합한 담체에는 헤모필루스 인플루엔자에 단백질 D (PD), 네이세리아 메닌기티디스 포린 단백질 (PorA), 코리네박테리움 디프테리아에 독소 (CRM197), 클로스트리디움 테타니 독소 (TT), 및 에스케리키아 콜라이 말토스 결합 단백질, 및 그의 변이체가 포함될 수 있으나 이로 제한되지 않는다.
Description
정부 지원된 연구 또는 개발에 대한 성명
본 발명은 국립 과학 재단에 의해 수여된 MCB1413563에 따라 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 대한 특정 권리를 갖는다.
관련 특허 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 35 U.S.C. § 119(e)하에 2019년 1월 11일에 출원한 미국 가특허 출원 번호 62/791,425를 우선권으로 주장하며, 그의 전체 내용이 본원에 참고로 포함된다.
본 발명의 분야는 원핵생물 세포 용해물에서의 N-글리코실화 단백질의 시험관 내 합성에 관한 것이다. 특히, 본 발명의 분야는 박테리아와 같은 병원체에 대한 백신 접합체로서 원핵생물 세포 용해물에서 시험관 내 합성된 N-글리코실화 단백질의 용도에 관한 것이다.
접합체 백신은 생명을 위협하는 박테리아 감염의 예방을 위한 가장 안전하고 가장 효과적인 방법 중 하나이다. 생체접합체 백신은 단백질 글리칸 커플링 기술 (PGCT)을 통해 생성되는 유형의 접합체 백신이며, 다당류 항원은 살아있는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 세포에서 박테리아 올리고사카릴트랜스퍼라제 (OST)를 사용하여 N-글리코실화를 통해 재조합 담체 단백질에 접합된다. 생체접합체 백신은 항박테리아 백신을 생성하는데 필요한 시간 및 비용을 크게 감소시키는 잠재성을 갖는다. 그러나, PGCT는 i) 생체 내 공정 개발 일정의 길이; 및 ii) FDA-승인된 담체 단백질, 예컨대 클로스트리디움 테타니(Clostridium tetani) 및 코리네박테리움 디프테리아에(Corynebacterium diptheriae)로부터의 독소가 살아있는 이. 콜라이에서 N-연결된 글리코실화와 상용성인 것으로 아직 입증되지 않았다는 사실에 의해 제한된다. 여기서, 본 발명자들은 20 시간 동안 지속되는 반응에서 에스케리키아 콜라이 및 프란시셀라 툴라렌시스(Franscicella tularensis)의 병원성 균주에 대한 생체접합체 백신의 신속한 시험관 내 생성을 가능하게 하기 위해 무세포 당단백질 합성 (CFGpS) 기술을 적용하였다. CFGpS 시스템의 모듈식 성질로 인해, 이 무세포 전략은 표면 항원 유전자 클러스터가 공지되어 있는 병원성 박테리아에 대한 FDA-승인된 담체 단백질 또는 추가의 백신을 사용하여 생체접합체를 생성하기 위해 용이하게 적용될 수 있다. 본 발명자들은 이 시스템이 동결건조될 수 있고, 생체접합체 합성 능력을 보유할 수 있음을 추가로 보여주며, 이는 자원이 부족한 환경에서 주문식 백신 생성 및 개발에 대한 잠재성을 입증한다. 이 작업은 이. 콜라이 용해물에서의 생체접합체 백신 생성의 첫번째 입증을 나타내며, 항박테리아 백신 후보에 대한 이동식 프로토타이핑 또는 생성 플랫폼으로서 유망하게 적용된다.
글리코실화 단백질의 무세포 합성을 위한 방법, 시스템, 성분 및 조성물이 개시된다. 글리코실화 단백질은 항-박테리아 백신을 비롯한 백신에서 사용될 수 있다. 글리코실화 단백질은 담체에 접합된 박테리아 다당류를 포함할 수 있고, 이는 담체에 접합된 다당류에 대해 면역화된 숙주에서 면역 반응을 생성하는데 사용될 수 있다. 적합한 담체에는 헤모필루스 인플루엔자에(Haemophilus influenzae) 단백질 D (PD), 네이세리아 메닌기티디스(Neisseria meningitidis) 포린 단백질 (PorA), 코리네박테리움 디프테리아에(Corynebacterium diphtheriae) 독소 (CRM197), 클로스트리디움 테타니 독소 (TT), 및 에스케리키아 콜라이 말토스 결합 단백질, 또는 그의 변이체가 포함될 수 있으나 이로 제한되지 않는다. 글리코실화 단백질은 당단백질 합성을 위한 성분, 예컨대 올리고사카릴트랜스퍼라제 (OST) 및 지질-연결된 올리고당류 (LLO), 예컨대 박테리아 O-항원의 합성과 연관된 OST 및 LLO가 풍부화된 원핵생물 세포 용해물을 사용하여 무세포 당단백질 합성 (CFGpS) 시스템에서 합성될 수 있다. 따라서, 원핵생물 세포 용해물은 이종성 OST를 발현하도록 조작되고/거나 LLO의 생성을 위한 이종성 글리칸 합성 경로를 발현하도록 조작된 재조합 원핵생물로부터 제조될 수 있다. 개시된 용해물은 모듈식으로 기재될 수 있고, 개시된 CFGpS 시스템에서 글리코실화 단백질을 제조하기 위해 조합될 수 있다.
도 1. [Guarino C., and DeLisa M.P., Glycobiology, 2012 May 22(5):596-601] (그의 전체 내용은 본원에 참고로 포함됨)로부터 적합화된 바와 같은 이. 콜라이에서 발현된 씨. 제주니 N-연결된 글리코실화 경로의 기능을 도시하는 개략도.
도 2. [Ihssen et al., Microb. Cell. Fact. 2010 9:61, pages 1-13] (그의 전체 내용은 본원에 참고로 포함됨)으로부터 적합화된 바와 같은 접합체 및 생체접합체 백신의 생성을 위한 전략. 개략도는 프란시셀라 툴라렌시스에 대한 예시적인 백신의 생성을 도시한다.
도 3. 생체접합체 백신의 시험관 내 생성을 위한 CFGpS 기술의 적용. 항-에프. 툴라렌시스 생체접합체의 생성을 위한 생체 내 및 시험관 내 작업 흐름의 예. 시험관 내에서 생체접합체를 생성하는 능력은 신규한 백신 후보의 신속한 프로토타이핑을 가능하게 할 것이다.
도 4. 혼합된 용해물 CFGpS에서 다양한 박테리아 O-항원을 보유하는 당단백질의 신속한 합성. S30 용해물은 씨. 제주니 OST (CjOST 용해물), 프란시셀라 툴라렌시스 O-항원 (FtO-PS) 생합성 경로 (FtLLO 용해물), 또는 에스케리키아 콜라이 O78 항원 (EcO78-PS) 생합성 경로 (EcO78LLO 용해물)를 발현하는 CLM24 세포로부터 제조되었다. (A) FtLLO 용해물을 sfGFP21-DQNAT-6xHis 또는 MBP-4xDQNAT-6xHis에 대한 DNA 주형을 함유하는 CFGpS 반응에서 CjOST 용해물과 혼합하였다. CcOST 및 FtLLO 용해물 둘 다 CFGpS 반응에 존재할 때 FtO-PS는 R4-DQNAT 및 MBP-4xDQNAT에 공유 부착되고, 이는 웨스턴 블롯 검정에서 관찰된 래더-유사 패턴에 의해 나타난다 (레인 2, 4). (B) EcO78LLO 용해물을 sfGFP21-DQNAT-6xHis 또는 MBP-4xDQNAT-6xHis에 대한 DNA 주형을 함유하는 CFGpS 반응에서 CjOST 용해물과 혼합하였다. CjOST 및 EcO78LLO 용해물 둘 다 CFGpS 반응에 존재할 때 EcO78-PS는 sfGFP-21-DQNAT 및 MBP-4xDQNAT에 공유 부착되고, 이는 웨스턴 블롯 검정에서 관찰된 래더-유사 패턴에 의해 나타난다 (레인 2, 4). 생체접합체는 또한 이. 콜라이 O78 균주에 대한 상업적인 항혈청과 교차-반응성이었다 (데이터는 도시되지 않음). 이들 결과는 혼합된 용해물 CFGpS에서 LLO의 모듈성 및 항박테리아 백신의 신속한 합성에 대한 CFGpS 기술의 잠재성을 입증한다. 약어: CLM24 pSF CjOST; FtLLO 용해물: CLM24 pGAB2; α-FtO 항원: 에프. 툴라렌시스 O-항원 글리칸에 대한 FB11 mAb.
도 5. 사용 시점 백신 제조를 위한 냉동-건조된 CFGpS 반응물. (A) 자원이 제한된 환경에서 이동식 생체접합체 생성 및 분배를 위한 계획. (B) 동결건조된 CFGpS 반응물은 생체접합체 합성 활성을 보유한다. CjOST 용해물 또는 FtLLO 용해물 단독, 또는 CjOST 및 FtLLO 용해물 둘 다의 혼합물을 함유하는 CFGpS 반응물을 준비하였다. 이어서, 이들 반응물을 동결건조시키고, 15 μL 뉴클레아제-무함유 물로 재구성하였다. 사전 혼합된 반응물 (레인 1, 2, 5, 6)은 재구성 직후에 작동시킨 반면에, CjOST 용해물 또는 FtLLO 용해물 단독을 함유하는 반응물은 재구성 후에 혼합하였다 (레인 3, 4, 7). DQNAT 시퀀(sequon)이 합성되고 CjOST 용해물 또는 FtLLO 용해물 둘 다 반응에 존재할 때 FtO-PS는 표적 단백질에 부착된다 (레인 2, 4, 6, 7). 생체접합체 합성 능력은 동결건조 후에 보존되며, 이는 자원이 부족한 지역에서 이동식 생체접합체 생성 및 분배를 위한 CFGpS의 잠재성을 입증한다. 약어: CjOST 용해물: CLM24 pSF CjOST; FtLLO 용해물: CLM24 pGAB2; α-FtO 항원: 에프. 툴라렌시스 O-항원 글리칸에 대해 특이적인 FB11 mAb. 적색 (예를 들어, 레인 1, 3 및 5): αHis.
도 6. 선택적으로 풍부화된 S30 용해물에서 생성된 O-항원의 구조. (A) 에프. 툴라렌시스 Schu S4 O-항원의 구조. (B) 장독소생성 이. 콜라이 O78 항원의 구조.
도 7. 이. 콜라이 용해물의 혼합은 상이한 OST 효소의 신속한 프로토타이핑을 가능하게 한다. (a) 용해물 혼합 전략을 이용하여 수행된 무세포 당단백질 합성 반응의 이뮤노블롯 분석이며, 이에 의해 글리칸 생합성 경로를 발현하는 세포로부터 유래된 CjLLO 용해물을 CjPglB를 발현하는 세포로부터 유래된 CjPglB 용해물과 혼합하고, 생성된 용해물 혼합물을 scFv13-R4DQNAT 또는 sfGFP217-DQNAT를 코딩하는 플라스미드 DNA로 프라이밍하였다. (b) 하기 OST: CjPglB, CcPglB, DdPglB, DgPglB, 또는 DvPglB 중 하나를 발현하는 세포로부터 유래된 추출물과 혼합된 CjLLO 용해물을 사용하여 수행된 반응의 이뮤노블롯 분석. 혼합된 용해물을 sfGFP217-DQNAT (D) 또는 sfGFP217-AQNAT (A)를 코딩하는 플라스미드 DNA로 프라이밍하였다. 블롯을 수용자 단백질을 검출하기 위한 항-His 항체 (상단 패널) 및 씨. 제주니 글리칸에 대한 hR6 혈청 (하단 패널)으로 프로빙하였다. 화살표는 수용자 단백질의 비글리코실화 (g0) 및 단일 글리코실화 (g1) 형태를 나타낸다. 분자량 (MW) 마커는 좌측에 표시된다. 결과는 적어도 3개의 생물학적 복제물을 대표한다. doi.org/10.1038/s41467-018-05110-x로부터 입수한 도면.
도 8. 이. 콜라이 용해물의 혼합을 이용하여 접합체 백신을 합성할 수 있다. 용해물 혼합 전략을 이용하여 수행된 무세포 반응이며, 이에 의해 이. 콜라이 O78 다당류 항원 (EcO78-PS) 생합성 경로를 발현하는 세포로부터 유래된 LLO 용해물을 씨. 제주니 또는 씨. 콜라이로부터의 PglB를 발현하는 세포로부터 유래된 OST 용해물과 혼합하였다. 생성된 용해물 혼합물을 sfGFP217-DQNAT를 코딩하는 플라스미드 DNA로 프라이밍하였다. 블롯을 수용자 단백질을 검출하기 위한 항-His 항체 (좌측) 및 항-EcO78-PS 항혈청 (우측)으로 프로빙하였다. 본 발명자들은 CjPglB 또는 CcPglB가 EcO78-PS를 sfGFP217-DQNAT에 성공적으로 접합시켰음을 관찰하였다. 분자량 (MW) 마커는 좌측에 표시하였다. 별표 (*)는 EcO78-PS 항혈청의 비특이적인 결합을 나타낸다. 결과는 적어도 3개의 생물학적 복제물을 대표한다.
도 9. 상이한 올리고당류 구조를 갖는 무세포 글리코실화의 확장. 정제된 scFv13-R4DQNAT 수용자 단백질, 정제된 CjPglB, 및 하기 글리칸의 생합성 경로를 발현하는 세포로부터 유기 용매-추출된 LLO에 의해 생성된 시험관 내 글리코실화 반응 생성물의 이뮤노블롯 분석: a. 고유의 씨. 라리 육당류 N-글리칸; b. 조작된 씨. 라리 육당류 N-글리칸; c. 고유의 더블유. 숙시노게네스(W. succinogenes) 육당류 N-글리칸; d. 이. 콜라이 O9 '프라이머-어댑터' Man3GlcNAc 구조; e. 에프. 툴라렌시스 O-PS Qui4NFm-(GalNAcAN)2-QuiNAc 구조; 및 f. 진핵생물 Man3GlcNAc2 N-글리칸 구조. 블롯을 수용자 단백질을 검출하기 위한 항-His 항체 및 하기 중 하나로 프로빙하였다: 고유의 및 조작된 씨. 라리 글리칸과 교차-반응하는 hR6 혈청, 또는 Man3GlcNAc 및 Man3GlcNAc2 글리칸에서 내부 및 비-환원 말단 α-만노실 기와 결합하는 ConA 렉틴. Ft-OPS 구조와 특이적으로 반응하는 FB11 항체. 더블유. 숙시노게네스 N-글리칸의 구조 결정이 현재 불완전하기 때문에, 그리고 이용가능한 항체가 없기 때문에, 이 N-글리칸을 보유하는 단백질 생성물은 항-His 항체로만 프로빙되었다. 화살표는 scFv13-R4DQNAT 단백질의 비글리코실화 (g0) 및 단일 글리코실화 (g1) 형태를 나타낸다. 분자량 (MW) 마커는 좌측에 표시된다. 결과는 적어도 3개의 생물학적 복제물을 대표한다. doi.org/10.1038/s41467-018-05110-x로부터 입수한 도면.
도 10. 무세포 당단백질 합성 플랫폼은 모듈식이며, 다양한 박테리아 O-다당류를 사용하여 생체접합체를 합성하는데 사용될 수 있다. 이. 콜라이 용해물을 CjPglB 및 (A) 에프. 툴라렌시스 SchuS4 O 항원, (B) 이. 콜라이 O78 항원, 또는 (C) 이. 콜라이 O7 항원에 대한 생합성 경로를 발현하는 세포로부터 제조하였고, sfGFP217-DQNAT 생체접합체를 합성하는데 사용하였다. (A)에서, 항-His 신호는 적색으로 도시되고, 항-에프. 툴라렌시스 O 항원 신호는 녹색으로 도시된다. (B) 및 (C), 블롯 영상은 항-His이다. 영상은 적어도 3개의 생물학적 복제물을 대표한다. 점선은 샘플이 동일한 노출을 갖는 동일한 블롯으로부터의 것임을 나타낸다.
도 11. OST 및 LLO가 선택적으로 풍부화된 추출물을 사용하는 1-포트 무세포 단백질 합성. (a) CjPglB 및 CjLLO가 선택적으로 풍부화된 무세포 글리코실화 용해물에 의해 생성된 scFv13-R4DQNAT 또는 sfGFP217-DQNAT의 웨스턴 블롯 분석. (b) 상단 - 각각 적색 및 녹색으로 채색된 α-나선 및 가요성 루프를 갖는 인간 에리트로포이에틴 (PDB 코드 1BUY)의 리본 표현. N24 (22-AENIT-26), N38 (36-NENIT-40) 또는 N83 (81-LVNSS-85)에서 고유의 시퀀을 DQNAT로 돌연변이시킴으로써 모델링된 글리코실화 부위이며, 각각의 시퀀에서 아스파라긴 잔기는 청색으로 채색되었다. N24 (22-AENIT-26), N38 (36-NENIT-40) 또는 N83 (81-LVNSS-85)에서 고유의 시퀀이 최적의 박테리아 시퀀, DQNAT (청색으로 도시됨)로 개별적으로 돌연변이된 당조작된 hEPO 변이체. 하단 - 무세포 글리코실화 용해물에 의해 생성된 hEPO 당변이체의 웨스턴 블롯 분석. 반응을 표시된 바와 같이 플라스미드 pJL1-hEPO22-DQNAT-26 (N24), pJL1-hEPO36-DQNAT-40 (N38), 또는 pJL1-hEPO81-DQNAT-85 (N83)로 프라이밍하였다. 모든 대조군 반응 (각각의 패널에서 레인 1)을 CjPglB가 결여된 CjLLO-풍부화된 용해물을 사용하여 수행하였다. 블롯을 수용자 단백질을 검출하기 위한 항-헥사-히스티딘 항체 (항-His), 또는 N-글리칸을 검출하기 위한 hR6 혈청 (항-글리칸)으로 프라이밍하였다. 화살표는 단백질 표적의 비글리코실화 (g0) 및 단일 글리코실화 (g1) 형태를 나타낸다. 별표는 비-특이적인 혈청 항체 결합에 상응하는 밴드를 나타낸다. 분자량 (MW) 마커는 좌측에 표시된다. [Jaroentomeechai et al., Nat. Comm., July 12, 2018, doi.org/10.1038/s41467-018-05110-x]로부터 입수한 도면이며, 그의 전체 내용이 본원에 참고로 포함된다.
도 12. 무세포 당단백질 합성 용해물을 사용하여 에프. 툴라렌시스에 대한 생체접합체의 주문식 및 재현가능한 생성. (a) CjPglB, FtO-PS, 및 바람직한 시퀀이 반응에 존재할 때에만 FtO-PS에 의한 sfGFP217-DQNAT의 글리코실화가 관찰되었다 (레인 3). 플라스미드 DNA가 생략된 경우에는, sfGFP217-DQNAT 합성이 관찰되지 않았다. (b) 허가된 백신에서 사용되는 담체를 비롯한 면역자극성 담체에 의한 생체접합체 백신의 주문식 합성. 30℃에서 ~1 시간 동안 지속되는 1 mL 무세포 당단백질 합성 반응으로부터 Ni-NTA 아가로스를 사용하여 생체접합체를 정제하였다. 점선은 샘플이 동일한 노출을 갖는 동일한 블롯으로부터의 것임을 나타낸다. 분자량 래더는 각각의 영상의 좌측에 도시된다. [Stark et al., bioRxiv, Jun. 24, 2019, doi.org/10.1101/681841]로부터 적합화된 도면이며, 그의 전체 내용이 본원에 참고로 포함된다.
도 13. 다양한 이. 콜라이 균주로부터 제조된 조질 용해물은 시험관 내 단백질 글리코실화로 처리할 수 있다. r이. 콜라이 705, BL21(DE3) 및 CLM24를 비롯한 몇몇 샤시 균주로부터 제조된 용해물을 정제된 CjPglB, 유기 용매-추출된 CjLLO로 보충된 반응에서 사용하고, 플라스미드 pJL1-scFv13-R4DQNAT로 프라이밍하였다. 효율적인 글리코실화는 16 시간 동안 지속되는 반응에서 관찰되었다. 블롯을 수용자 단백질을 검출하기 위한 항-헥사-히스티딘 항체 (항-His), 또는 N-글리칸을 검출하기 위한 hR6 혈청 (항-글리칸)으로 프로빙하였다. 화살표는 scFv13-R4DQNAT의 비글리코실화 (g0) 및 단일 글리코실화 (g1) 형태를 나타낸다. 분자량 (MW) 마커는 좌측에 표시된다.
도 14. 해독된 무세포 반응은 생체접합체를 생성한다. 지질 A 리모델링은 무세포 당단백질 합성 반응에서 글리코실화 활성에 영향을 미치지 않는다. 용해물은 CjPglB 및 FtO-PS를 또한 발현하는 FtLpxE 세포를 발현하는 야생형 CLM24, CLM24 ΔlpxM, 또는 CLM24 ΔlpxM으로부터 제조되었다. 거의 동일한 글리코실화 활성이 조작된 균주로부터 유래된 용해물 각각에 대해 관찰되었다. 영상은 적어도 3개의 생물학적 복제물을 대표한다. [Stark et al., bioRxiv, Jun. 24, 2019, doi.org/10.1101/681841]로부터 적합화된 도면이며, 그의 전체 내용이 본원에 참고로 포함된다.
도 15. 항박테리아 백신의 주문식 및 이동식 생성을 가능하게 하는 iVAX 플랫폼의 실시양태를 도시하는 개략도. 시험관 내 생체접합체 백신 발현 (iVAX, i n vitro bioconjugate vaccine expression) 플랫폼은 박테리아 병원체에 대한 백신을 개발하고 분배시키는 신속한 수단을 제공한다. 해독된 지질 A를 갖는 조작된 비병원체 이. 콜라이에서 병원체-특이적인 다당류 (예를 들어, CPS, O-PS) 및 박테리아 올리고사카릴트랜스퍼라제 효소의 발현은 생체접합체 백신의 합성을 위해 필요한 모든 기구를 함유하는 저-내독소 용해물을 생성한다. iVAX 용해물에 의해 촉매되는 반응을 이용하여, 허가된 담체 단백질을 함유하는 생체접합체를 생성할 수 있고, 무냉장 수송 및 보관을 위해 활성의 손실없이 냉동-건조될 수 있다. 냉동-건조된 반응은 간단한 재수화를 통해 현장 의료시에 활성화될 수 있고, 이를 사용하여 ~1 시간 내에 면역학적으로 활성인 생체접합체를 재현가능하게 합성할 수 있다.
도 16. 허가된 접합체 백신 담체 단백질의 시험관 내 합성. (a) FDA-승인된 접합체 백신에서 사용된 4가지 모든 담체 단백질은 14C-류신 혼입을 통해 측정되는 바와 같이 시험관 내에서 가용성으로 합성되었다. 이들에는 에이치. 인플루엔자에 단백질 D (PD), 엔. 메닌기티디스 포린 단백질 (PorA), 및 씨. 디프테리아에 독소 (CRM197) 및 씨. 테타니 독소 (TT)의 유전적으로 해독된 변이체가 포함된다. 이. 콜라이 말토스 결합 단백질 (MBP), 및 TT의 단편 C (TTc) 및 경쇄 (TTlight) 도메인을 비롯한 추가의 면역자극성 담체 또한 가용성으로 합성되었다. 값은 평균을 나타내고, 오차 막대는 생물학적 복제물의 표준 편차를 나타낸다 (n = 3). (b) 전장 생성물은 웨스턴 블롯을 통해 시험한 모든 단백질에 대해 관찰되었다. 상이한 노출은 실선으로 표시된다. 분자량 래더는 좌측에 도시된다. 도 21 또한 참고한다.
도 17. iVAX 용해물에서 FtO-PS에 의한 단백질의 재현가능한 글리코실화. (a) iVAX 용해물은 CjPglB, 및 FtO-PS를 코딩하는 생합성 경로를 발현하는 세포로부터 제조되었다. (b) CjPglB, FtO-PS, 및 바람직한 시퀀이 반응에 존재할 때에만 FtO-PS에 의한 sfGFP217-DQNAT의 글리코실화가 관찰되었다 (레인 3). 플라스미드 DNA가 생략된 경우에는, sfGFP217-DQNAT 합성이 관찰되지 않았다. (c) iVAX 용해물의 동일한 로트 (좌측) 또는 상이한 로트 (우측)를 사용하여 sfGFP217-DQNAT를 생성하는 iVAX 반응의 생물학적 복제물은 반응 및 용해물 제조의 재현가능성을 입증하였다. 상단 패널은 담체 단백질을 검출하기 위한 항-헥사-히스티딘 항체 (αHis)로의 프로빙으로부터의 신호를 도시하고, 중간 패널은 상업적인 항-FtO-PS 항체 (αFtO-PS)로의 프로빙으로부터의 신호를 도시하고, 하단 패널은 병합된 αHis 및 αFtO-PS 신호를 도시한다. 복제물이 명확하게 도시되지 않는다면, 영상은 적어도 3개의 생물학적 복제물을 대표한다. 점선은 샘플이 동일한 노출을 갖는 동일한 블롯으로부터의 것임을 나타낸다. 분자량 래더는 각각의 영상의 좌측에 도시된다. 도 22 또한 참고한다.
도 18. iVAX를 사용하여 에프. 툴라렌시스에 대한 생체접합체의 주문식 생성. (a) iVAX 반응물을 CjPglB 및 FtO-PS를 함유하는 용해물로부터 준비하고, 허가된 백신에서 사용되는 것들을 비롯하여 면역자극성 담체를 코딩하는 플라스미드로 프라이밍하였다. (b) 시험한 모든 담체 단백질에 대해 항-에프. 툴라렌시스 생체접합체 백신의 주문식 합성이 관찰되었다. ~1 시간 동안 지속되는 1 mL iVAX 반응물로부터 Ni-NTA 아가로스를 사용하여 생체접합체를 정제하였다. 상단 패널은 담체 단백질을 검출하기 위한 항-헥사-히스티딘 항체 (αHis)로의 프로빙으로부터의 신호를 도시하고, 중간 패널은 상업적인 항-FtO-PS 항체 (αFtO-PS)로의 프로빙으로부터의 신호를 도시하고, 하단 패널은 병합된 αHis 및 αFtO-PS 신호를 도시한다. 영상은 적어도 3개의 생물학적 복제물을 대표한다. 점선은 샘플이 동일한 노출을 갖는 동일한 블롯으로부터의 것임을 나타낸다. 분자량 래더는 각각의 영상의 좌측에 도시된다. 도 23 및 24 또한 참고한다.
도 19. 해독되고 동결건조된 iVAX 반응물은 생체접합체를 생성한다. (a) iVAX 용해물은 용해물 생성을 위한 공급원 균주에서 lpxM의 결실 및 에프. 툴라렌시스 LpxE의 발현을 통해 해독되었다. (b) 생성된 용해물은 유의하게 감소된 내독소 활성을 나타내었다. *p = 0.019 및 **p = 0.003, 양측 t-검정에 의해 결정. (c) sfGFP217-DQNAT를 생성하는 iVAX 반응물을 즉시 또는 동결건조 및 재수화 후에 작동시켰다. (d) 글리코실화 활성은 동결건조 후에 보존되었고, 이는 생체접합체 백신의 이동식 생합성을 위한 iVAX 반응의 잠재성을 입증한다. 상단 패널은 담체 단백질을 검출하기 위한 항-헥사-히스티딘 항체 (αHis)로의 프로빙으로부터의 신호를 도시하고, 중간 패널은 상업적인 항-FtO-PS 항체 (αFtO-PS)로의 프로빙으로부터의 신호를 도시하고, 하단 패널은 병합된 αHis 및 αFtO-PS 신호를 도시한다. 영상은 적어도 3개의 생물학적 복제물을 대표한다. 분자량 래더는 각각의 영상의 좌측에 도시된다. 도 25 또한 참고한다.
도 20. iVAX-유래된 생체접합체는 마우스에서 FtLPS-특이적인 항체를 유도한다. (a) 해독된 용해물을 사용하여 조립된 냉동-건조된 iVAX 반응물을 이용하여 면역화 연구를 위한 항-에프. 툴라렌시스 생체접합체를 합성하였다. (b) 6개 그룹의 BALB/c 마우스를 PBS 또는 7.5 μg의 정제되고 무세포 합성된 비글리코실화 MBP4xDQNAT, FtO-PS-접합된 MBP4xDQNAT, 비글리코실화 PD4xDQNAT, 또는 FtO-PS-접합된 PD4xDQNAT로 피하로 면역화시켰다. PCGT를 이용하여 살아있는 이. 콜라이 세포에서 제조된 FtO-PS-접합된 MBP4xDQNAT는 양성 대조군으로 사용되었다. 5 마리의 마우스로 구성된 PBS 대조군 그룹을 제외하고, 각각의 그룹은 6 마리의 마우스로 구성되었다. 21 및 42 일째에 동일한 용량의 항원으로 마우스를 부스팅시켰다. FtLPS-특이적인 IgG 역가는 항원으로서 고정된 에프. 툴라렌시스 LPS를 갖는 개별 마우스의 종점 (70 일) 혈청 (검은 점)에서 ELISA에 의해 측정하였다. 각각의 그룹의 평균 역가 또한 도시된다 (적색 선). iVAX-유래된 생체접합체는 모든 다른 그룹과 비교하여 유의하게 더 높은 수준의 FtLPS-특이적인 IgG를 유도하였다 (**p < 0.01, 터키-크래머(Tukey-Kramer) HSD). (c) 종점 혈청으로부터 ELISA에 의해 측정된 IgG1 및 IgG2a 아형 역가는 iVAX-유래된 생체접합체가 시험한 모든 다른 그룹과 비교하여 FtO-PS-특이적인 IgG1의 생성을 부스팅하였음을 나타내었다 (**p < 0.01, 터키-크래머 HSD). 이들 결과는 iVAX 생체접합체가 대부분의 접합체 백신에서 전형적인 Th2-편향된 면역 반응을 유도하였음을 나타낸다. 값은 평균을 나타내고, 오차 막대는 ELISA에 의해 검출된 FtLPS-특이적인 IgG의 표준 오차를 나타낸다. 도 26 또한 참고한다.
도 21. 허가된 접합체 백신 담체 단백질의 시험관 내 합성은 소정 범위의 온도에 걸쳐 가능하고, 용이하게 최적화될 수 있다. 도 16 또한 참고한다. (a) CRM197을 제외하고, 모든 담체는 14C-류신 혼입에 의해 측정되는 바와 같이 25℃, 30℃ 및 37℃에서 유사한 가용성 수율로 발현하였다. 값은 평균을 나타내고, 오차 막대는 생물학적 복제물의 표준 편차를 나타낸다 (n = 3). (b) PorA의 가용성 발현은 반응에 지질 나노디스크의 첨가를 통해 개선되었다. (c) 전장 TT의 발현은 (i) 디술피드-결합된 중쇄 및 경쇄에서 전장 TT로의 조립을 개선시키기 위해 산화 조건에서 시험관 내 단백질 합성을 수행하고, (ii) 프로테아제 분해를 최소화하기 위해 단지 2 시간 동안만 반응을 작동시킴으로써 증강될 수 있다. CFPS 반응에서 생성된 (d) CRM197 및 (e) TT는 각각 α-DT 및 α-TT 항체에 의해 검출되며, 상업적으로 입수가능한 정제된 DT 및 TT 단백질 표준 (50 ng 표준 로딩)과 크기에서 비슷하다. 영상은 적어도 3개의 생물학적 복제물을 대표한다. 점선은 샘플이 동일한 노출을 갖는 동일한 블롯으로부터의 것임을 나타낸다. 분자량 래더는 각각의 영상의 좌측에 도시된다.
도 22. iVAX 반응에서 글리코실화는 소정 범위의 온도에 걸쳐 1 시간 내에 발생한다. 도 17 또한 참고한다. 30℃ (좌측), 37℃, 25℃ 및 실온 (~21℃) (우측)에서 FtO-PS 글리코실화의 동력학은 비슷하며, 단백질 합성 및 글리코실화가 iVAX 반응의 첫번째 시간 내에 발생함을 나타낸다. 이들 결과는 iVAX 플랫폼이 허용가능한 범위의 온도에 걸쳐 생체접합체를 합성할 수 있음을 입증한다. 상단 패널은 담체 단백질을 검출하기 위한 항-헥사-히스티딘 항체 (αHis)로의 프로빙으로부터의 신호를 도시하고, 중간 패널은 상업적인 항-FtO-PS 항체 (αFtO-PS)로의 프로빙으로부터의 신호를 도시하고, 하단 패널은 병합된 αHis 및 αFtO-PS 신호를 도시한다. 영상은 적어도 3개의 생물학적 복제물을 대표한다. 분자량 래더는 각각의 영상의 좌측에 도시된다.
도 23. 살아있는 이. 콜라이에서 PGCT를 이용하여 에프. 툴라렌시스에 대한 생체접합체의 생성. 도 18 또한 참고한다. (a) 생체접합체는 CjPglB, FtO-PS에 대한 생합성 경로, 및 허가된 백신에서 사용되는 것들을 비롯한 면역자극성 담체의 패널을 발현하는 CLM24 세포에서 PGCT를 통해 생성되었다. (b) 본 발명자들은 iVAX-유래된 샘플과 비교하여 모든 담체에서 막 단백질인 PorA의 낮은 발현, 뿐만 아니라 감소된 글리칸 로딩 및 고분자량 FtO-PS 종의 접합을 관찰하였다. 상단 패널은 담체 단백질을 검출하기 위한 항-헥사-히스티딘 항체 (αHis)로의 프로빙으로부터의 신호를 나타내고, 중간 패널은 상업적인 항-FtO-PS 항체 (αFtO-PS)로의 프로빙으로부터의 신호를 나타내고, 하단 패널은 병합된 αHis 및 αFtO-PS 신호를 도시한다. 영상은 적어도 3개의 생물학적 복제물을 대표한다. 분자량 래더는 각각의 영상의 좌측에 도시된다.
도 24. iVAX 플랫폼은 모듈식이며, 이를 이용하여 임상적으로 관련된 수율로 다양한 생체접합체를 합성할 수 있다. 도 18 또한 참고한다. (a) FtO-PS에 의한 단백질 합성 및 글리코실화는 MBP4xDQNAT 및 PD4xDQNAT를 생성하는 iVAX 반응에서 측정되었다. ~1 시간 후에, 반응은 14C-류신 혼입을 통해 측정되는 바와 같이 ~40 μg mL-1 단백질을 생성하였고, 이 중에서 ~20 μg mL-1는 밀도계측에 의해 결정되는 바와 같이 FtO-PS에 의해 글리코실화되었다. 값은 평균을 나타내고, 오차 막대는 생물학적 복제물의 표준 오차를 나타낸다 (n = 2). 모듈성을 입증하기 위해, iVAX 용해물을 CjPglB 및 (b) 이. 콜라이 O78 항원 또는 (c) 이. 콜라이 O7 항원에 대한 생합성 경로를 발현하는 세포로부터 제조하였고, 이를 사용하여 PD4xDQNAT (좌측) 또는 sfGFP217-DQNAT (우측) 생체접합체를 합성하였다. 각각의 항원에 대한 반복 단량체 단위의 구조 및 조성이 도시된다. 다당류 항원 둘 다 조성적으로 및 O7 항원의 경우에는 구조적으로 에프. 툴라렌시스 O 항원과 구별된다. 블롯은 담체 단백질을 검출하기 위한 항-헥사-히스티딘 항체 (αHis)로의 프로빙으로부터의 신호를 도시한다. 상업적인 항-O-PS 혈청 또는 항체가 이용가능한 경우에는, 이를 사용하여 접합된 O 항원 (α-EcO78 블롯, 패널 b)의 동일성을 확인하였다. 별표는 비-특이적인 혈청 항체 결합으로부터 생성된 밴드를 나타낸다. 영상은 적어도 3개의 생물학적 복제물을 대표한다. 점선은 샘플이 동일한 노출을 갖는 동일한 블롯으로부터의 것임을 나타낸다. 분자량 래더는 각각의 영상의 좌측에 도시된다.
도 25. 해독된 iVAX 용해물은 생체접합체를 합성하고, 용해물 생성 및 냉동-건조된 반응 규모 둘 다 재현가능하게 합성한다. 도 19 또한 참고한다. (a) CjPglB 및 FtO-PS를 함유하는 iVAX 용해물은 FtLpxE를 발현하는 야생형 CLM24, CLM24 ΔlpxM 또는 CLM24 ΔlpxM 세포로부터 제조하였다. 거의 동일한 sfGFP217-DQNAT 글리코실화는 조작된 균주로부터 유래된 각각의 용해물에 대해 관찰되었다. (b) 면역화를 위한 물질을 생성하기 위해, 내독소-편집된 iVAX 용해물을 생성하기 위한 발효를 0.5 L에서 10 L로 증대시켰다. 본 발명자들은 0.5 L 및 10 L 배양물로부터 유래된 용해물에 대해 및 10 L 발효로부터 생성된 용해물의 상이한 배치에 걸쳐 유사한 수준의 sfGFP217-DQNAT 글리코실화를 관찰하였다. (c) 면역화를 위해, 본 발명자들은 5 mL 냉동-건조된 iVAX 반응물로부터 FtO-PS-접합된 MBP4xDQNAT 및 PD4xDQNAT의 2가지 로트를 제조하였다. 본 발명자들은 담체 및 물질 로트 둘 다에 대해 유사한 수준의 정제된 단백질 (~200 μg) 및 FtO-PS 변형 (>50%, 밀도계측에 의해 측정)을 관찰하였다. 상단 패널은 담체 단백질을 검출하기 위한 항-헥사-히스티딘 항체 (αHis)로의 프로빙으로부터의 신호를 나타내고, 중간 패널은 상업적인 항-FtO-PS 항체 (αFtO-PS)로의 프로빙으로부터의 신호를 나타내고, 하단 패널은 병합된 αHis 및 αFtO-PS 신호를 도시한다. 영상은 적어도 3개의 생물학적 복제물을 대표한다. 분자량 래더는 좌측에 도시된다.
도 26. 백신접종된 마우스에서 시간에 따른 FtLPS-특이적인 항체 역가. 도 20 또한 참고한다. BALB/c 마우스의 6개 그룹을 PBS 또는 7.5 μg의 정제되고 무세포 합성된 비글리코실화 MBP4xDQNAT, FtO-PS-접합된 MBP4xDQNAT, 비글리코실화 PD4xDQNAT, 또는 FtO-PS-접합된 PD4xDQNAT에 의해 피하로 면역화시켰다. PCGT를 이용하여 살아있는 이. 콜라이 세포에서 제조된 FtO-PS-접합된 MBP4xDQNAT는 양성 대조군으로 사용되었다. 5 마리의 마우스로 구성된 PBS 대조군 그룹을 제외하고, 각각의 그룹은 6 마리의 마우스로 구성되었다. 21 및 42 일째에 동일한 용량의 항원으로 마우스를 부스팅시켰다. FtLPS-특이적인 IgG 역가는 초기 면역화 후 -1, 35, 49, 63 및 70 일째에 수집된 혈청에서 ELISA에 의해 측정되었다. iVAX-유래된 생체접합체는 연구 35, 49 및 70 일째에 수집된 혈청에서 PBS 대조군 그룹과 비교하여 유의하게 더 높은 수준의 FtLPS-특이적인 IgG를 유도하였다 (**p < 0.01, 터키-크래머 HSD). 값은 평균을 나타내고, 오차 막대는 ELISA에 의해 검출된 FtLPS-특이적인 IgG의 표준 오차를 나타낸다.
도 27. 표 1은 iVAX 반응에 대한 비용 분석을 도시한다. 1 mL iVAX 반응물은 2개의 10 μg 백신 용량을 생성하고, $11.75에 대해 조립될 수 있다. 표 1에서, 아미노산 비용은 시그마(Sigma)로부터 개별적으로 구입한 2 mM의 20 가지 각각의 표준 아미노산에 대한 것이다. 용해물 비용은 연간 30개의 용해물 배치 및 5 년 장비 수명을 가정하여 10 L 발효로부터 50 mL 용해물을 제조하는 단일 직원을 기준으로 한다. 공급자로부터 직접적으로 구입가능한 경우에는 성분 공급처 또한 표에 포함된다. 자가제의 성분은 직접적으로 구입될 수 없으며, 방법 섹션에 기재된 절차에 따라 제조되어야 한다.
도 28. 표 2는 CLM24 ΔlpxM 균주를 구축하고 검증하기 위해 사용된 프라이머를 도시한다. KO 프라이머는 lpxM에 대해 상동성을 갖는 pKD4로부터 칸나마이신 내성 카세트의 증폭을 위해 사용하였다. Seq 프라이머는 콜로니 PCR 및 녹아웃 균주의 시퀀싱 확인을 위해 사용되었다.
도 29. 표 3은 실시예에서 사용된 플라스미드를 나열한다.
도 30. 표 4는 실시예에서 사용된 항체 및 항혈청을 나열한다.
도 31. iVAX-유래된 백신은 치명적인 에프. 툴라렌시스 공격으로부터 보호한다. (a) 5 마리 BALB/c 마우스의 그룹을 PBS 또는 7.5 μg의 정제되고 무세포 합성된 비글리코실화 MBP4xDQNAT, PD4xDQNAT 또는 EPADNNNS-DQNRT, 또는 FtO-PS-접합된 MBP4xDQNAT, PD4xDQNAT 또는 EPADNNNS-DQNRT에 의해 복강내로 면역화시켰다. PCGT를 이용하여 살아있는 이. 콜라이 세포에서 제조된 FtO-PS-접합된 MBP4xDQNAT, PD4xDQNAT 및 EPADNNNS-DQNRT는 양성 대조군으로 사용되었다. 21 및 42 일째에 동일한 용량의 항원으로 마우스를 부스팅시켰다. 66 일째에 마우스에게 6000 cfu (비내 LD50의 50배) 에프. 툴라렌시스 아종 홀라르크티카(holarctica) 생 백신 균주 록키 마운틴 래버러토리즈(Rocky Mountain Laboratories)로 비내로 시도하였고, 추가 25 일 동안 생존에 대해 모니터링하였다. 담체 단백질로서 (b) MBP4xDQNAT (c) PD4xDQNAT 및 (d) EPADNNNS-DQNRT에 의한 면역화에 대한 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 곡선이 도시된다. 이들 결과는 iVAX-유래된 백신이 최신식 PGCT 접근법을 이용하여 합성된 백신만큼 효과적으로 치명적인 병원체 공격으로부터 마우스를 보호한다는 것을 나타낸다. (*p = 0.0476; **p = 0.0079, 피셔(Fisher) 정확 검정; ns: 유의하지 않음).
도 2. [Ihssen et al., Microb. Cell. Fact. 2010 9:61, pages 1-13] (그의 전체 내용은 본원에 참고로 포함됨)으로부터 적합화된 바와 같은 접합체 및 생체접합체 백신의 생성을 위한 전략. 개략도는 프란시셀라 툴라렌시스에 대한 예시적인 백신의 생성을 도시한다.
도 3. 생체접합체 백신의 시험관 내 생성을 위한 CFGpS 기술의 적용. 항-에프. 툴라렌시스 생체접합체의 생성을 위한 생체 내 및 시험관 내 작업 흐름의 예. 시험관 내에서 생체접합체를 생성하는 능력은 신규한 백신 후보의 신속한 프로토타이핑을 가능하게 할 것이다.
도 4. 혼합된 용해물 CFGpS에서 다양한 박테리아 O-항원을 보유하는 당단백질의 신속한 합성. S30 용해물은 씨. 제주니 OST (CjOST 용해물), 프란시셀라 툴라렌시스 O-항원 (FtO-PS) 생합성 경로 (FtLLO 용해물), 또는 에스케리키아 콜라이 O78 항원 (EcO78-PS) 생합성 경로 (EcO78LLO 용해물)를 발현하는 CLM24 세포로부터 제조되었다. (A) FtLLO 용해물을 sfGFP21-DQNAT-6xHis 또는 MBP-4xDQNAT-6xHis에 대한 DNA 주형을 함유하는 CFGpS 반응에서 CjOST 용해물과 혼합하였다. CcOST 및 FtLLO 용해물 둘 다 CFGpS 반응에 존재할 때 FtO-PS는 R4-DQNAT 및 MBP-4xDQNAT에 공유 부착되고, 이는 웨스턴 블롯 검정에서 관찰된 래더-유사 패턴에 의해 나타난다 (레인 2, 4). (B) EcO78LLO 용해물을 sfGFP21-DQNAT-6xHis 또는 MBP-4xDQNAT-6xHis에 대한 DNA 주형을 함유하는 CFGpS 반응에서 CjOST 용해물과 혼합하였다. CjOST 및 EcO78LLO 용해물 둘 다 CFGpS 반응에 존재할 때 EcO78-PS는 sfGFP-21-DQNAT 및 MBP-4xDQNAT에 공유 부착되고, 이는 웨스턴 블롯 검정에서 관찰된 래더-유사 패턴에 의해 나타난다 (레인 2, 4). 생체접합체는 또한 이. 콜라이 O78 균주에 대한 상업적인 항혈청과 교차-반응성이었다 (데이터는 도시되지 않음). 이들 결과는 혼합된 용해물 CFGpS에서 LLO의 모듈성 및 항박테리아 백신의 신속한 합성에 대한 CFGpS 기술의 잠재성을 입증한다. 약어: CLM24 pSF CjOST; FtLLO 용해물: CLM24 pGAB2; α-FtO 항원: 에프. 툴라렌시스 O-항원 글리칸에 대한 FB11 mAb.
도 5. 사용 시점 백신 제조를 위한 냉동-건조된 CFGpS 반응물. (A) 자원이 제한된 환경에서 이동식 생체접합체 생성 및 분배를 위한 계획. (B) 동결건조된 CFGpS 반응물은 생체접합체 합성 활성을 보유한다. CjOST 용해물 또는 FtLLO 용해물 단독, 또는 CjOST 및 FtLLO 용해물 둘 다의 혼합물을 함유하는 CFGpS 반응물을 준비하였다. 이어서, 이들 반응물을 동결건조시키고, 15 μL 뉴클레아제-무함유 물로 재구성하였다. 사전 혼합된 반응물 (레인 1, 2, 5, 6)은 재구성 직후에 작동시킨 반면에, CjOST 용해물 또는 FtLLO 용해물 단독을 함유하는 반응물은 재구성 후에 혼합하였다 (레인 3, 4, 7). DQNAT 시퀀(sequon)이 합성되고 CjOST 용해물 또는 FtLLO 용해물 둘 다 반응에 존재할 때 FtO-PS는 표적 단백질에 부착된다 (레인 2, 4, 6, 7). 생체접합체 합성 능력은 동결건조 후에 보존되며, 이는 자원이 부족한 지역에서 이동식 생체접합체 생성 및 분배를 위한 CFGpS의 잠재성을 입증한다. 약어: CjOST 용해물: CLM24 pSF CjOST; FtLLO 용해물: CLM24 pGAB2; α-FtO 항원: 에프. 툴라렌시스 O-항원 글리칸에 대해 특이적인 FB11 mAb. 적색 (예를 들어, 레인 1, 3 및 5): αHis.
도 6. 선택적으로 풍부화된 S30 용해물에서 생성된 O-항원의 구조. (A) 에프. 툴라렌시스 Schu S4 O-항원의 구조. (B) 장독소생성 이. 콜라이 O78 항원의 구조.
도 7. 이. 콜라이 용해물의 혼합은 상이한 OST 효소의 신속한 프로토타이핑을 가능하게 한다. (a) 용해물 혼합 전략을 이용하여 수행된 무세포 당단백질 합성 반응의 이뮤노블롯 분석이며, 이에 의해 글리칸 생합성 경로를 발현하는 세포로부터 유래된 CjLLO 용해물을 CjPglB를 발현하는 세포로부터 유래된 CjPglB 용해물과 혼합하고, 생성된 용해물 혼합물을 scFv13-R4DQNAT 또는 sfGFP217-DQNAT를 코딩하는 플라스미드 DNA로 프라이밍하였다. (b) 하기 OST: CjPglB, CcPglB, DdPglB, DgPglB, 또는 DvPglB 중 하나를 발현하는 세포로부터 유래된 추출물과 혼합된 CjLLO 용해물을 사용하여 수행된 반응의 이뮤노블롯 분석. 혼합된 용해물을 sfGFP217-DQNAT (D) 또는 sfGFP217-AQNAT (A)를 코딩하는 플라스미드 DNA로 프라이밍하였다. 블롯을 수용자 단백질을 검출하기 위한 항-His 항체 (상단 패널) 및 씨. 제주니 글리칸에 대한 hR6 혈청 (하단 패널)으로 프로빙하였다. 화살표는 수용자 단백질의 비글리코실화 (g0) 및 단일 글리코실화 (g1) 형태를 나타낸다. 분자량 (MW) 마커는 좌측에 표시된다. 결과는 적어도 3개의 생물학적 복제물을 대표한다. doi.org/10.1038/s41467-018-05110-x로부터 입수한 도면.
도 8. 이. 콜라이 용해물의 혼합을 이용하여 접합체 백신을 합성할 수 있다. 용해물 혼합 전략을 이용하여 수행된 무세포 반응이며, 이에 의해 이. 콜라이 O78 다당류 항원 (EcO78-PS) 생합성 경로를 발현하는 세포로부터 유래된 LLO 용해물을 씨. 제주니 또는 씨. 콜라이로부터의 PglB를 발현하는 세포로부터 유래된 OST 용해물과 혼합하였다. 생성된 용해물 혼합물을 sfGFP217-DQNAT를 코딩하는 플라스미드 DNA로 프라이밍하였다. 블롯을 수용자 단백질을 검출하기 위한 항-His 항체 (좌측) 및 항-EcO78-PS 항혈청 (우측)으로 프로빙하였다. 본 발명자들은 CjPglB 또는 CcPglB가 EcO78-PS를 sfGFP217-DQNAT에 성공적으로 접합시켰음을 관찰하였다. 분자량 (MW) 마커는 좌측에 표시하였다. 별표 (*)는 EcO78-PS 항혈청의 비특이적인 결합을 나타낸다. 결과는 적어도 3개의 생물학적 복제물을 대표한다.
도 9. 상이한 올리고당류 구조를 갖는 무세포 글리코실화의 확장. 정제된 scFv13-R4DQNAT 수용자 단백질, 정제된 CjPglB, 및 하기 글리칸의 생합성 경로를 발현하는 세포로부터 유기 용매-추출된 LLO에 의해 생성된 시험관 내 글리코실화 반응 생성물의 이뮤노블롯 분석: a. 고유의 씨. 라리 육당류 N-글리칸; b. 조작된 씨. 라리 육당류 N-글리칸; c. 고유의 더블유. 숙시노게네스(W. succinogenes) 육당류 N-글리칸; d. 이. 콜라이 O9 '프라이머-어댑터' Man3GlcNAc 구조; e. 에프. 툴라렌시스 O-PS Qui4NFm-(GalNAcAN)2-QuiNAc 구조; 및 f. 진핵생물 Man3GlcNAc2 N-글리칸 구조. 블롯을 수용자 단백질을 검출하기 위한 항-His 항체 및 하기 중 하나로 프로빙하였다: 고유의 및 조작된 씨. 라리 글리칸과 교차-반응하는 hR6 혈청, 또는 Man3GlcNAc 및 Man3GlcNAc2 글리칸에서 내부 및 비-환원 말단 α-만노실 기와 결합하는 ConA 렉틴. Ft-OPS 구조와 특이적으로 반응하는 FB11 항체. 더블유. 숙시노게네스 N-글리칸의 구조 결정이 현재 불완전하기 때문에, 그리고 이용가능한 항체가 없기 때문에, 이 N-글리칸을 보유하는 단백질 생성물은 항-His 항체로만 프로빙되었다. 화살표는 scFv13-R4DQNAT 단백질의 비글리코실화 (g0) 및 단일 글리코실화 (g1) 형태를 나타낸다. 분자량 (MW) 마커는 좌측에 표시된다. 결과는 적어도 3개의 생물학적 복제물을 대표한다. doi.org/10.1038/s41467-018-05110-x로부터 입수한 도면.
도 10. 무세포 당단백질 합성 플랫폼은 모듈식이며, 다양한 박테리아 O-다당류를 사용하여 생체접합체를 합성하는데 사용될 수 있다. 이. 콜라이 용해물을 CjPglB 및 (A) 에프. 툴라렌시스 SchuS4 O 항원, (B) 이. 콜라이 O78 항원, 또는 (C) 이. 콜라이 O7 항원에 대한 생합성 경로를 발현하는 세포로부터 제조하였고, sfGFP217-DQNAT 생체접합체를 합성하는데 사용하였다. (A)에서, 항-His 신호는 적색으로 도시되고, 항-에프. 툴라렌시스 O 항원 신호는 녹색으로 도시된다. (B) 및 (C), 블롯 영상은 항-His이다. 영상은 적어도 3개의 생물학적 복제물을 대표한다. 점선은 샘플이 동일한 노출을 갖는 동일한 블롯으로부터의 것임을 나타낸다.
도 11. OST 및 LLO가 선택적으로 풍부화된 추출물을 사용하는 1-포트 무세포 단백질 합성. (a) CjPglB 및 CjLLO가 선택적으로 풍부화된 무세포 글리코실화 용해물에 의해 생성된 scFv13-R4DQNAT 또는 sfGFP217-DQNAT의 웨스턴 블롯 분석. (b) 상단 - 각각 적색 및 녹색으로 채색된 α-나선 및 가요성 루프를 갖는 인간 에리트로포이에틴 (PDB 코드 1BUY)의 리본 표현. N24 (22-AENIT-26), N38 (36-NENIT-40) 또는 N83 (81-LVNSS-85)에서 고유의 시퀀을 DQNAT로 돌연변이시킴으로써 모델링된 글리코실화 부위이며, 각각의 시퀀에서 아스파라긴 잔기는 청색으로 채색되었다. N24 (22-AENIT-26), N38 (36-NENIT-40) 또는 N83 (81-LVNSS-85)에서 고유의 시퀀이 최적의 박테리아 시퀀, DQNAT (청색으로 도시됨)로 개별적으로 돌연변이된 당조작된 hEPO 변이체. 하단 - 무세포 글리코실화 용해물에 의해 생성된 hEPO 당변이체의 웨스턴 블롯 분석. 반응을 표시된 바와 같이 플라스미드 pJL1-hEPO22-DQNAT-26 (N24), pJL1-hEPO36-DQNAT-40 (N38), 또는 pJL1-hEPO81-DQNAT-85 (N83)로 프라이밍하였다. 모든 대조군 반응 (각각의 패널에서 레인 1)을 CjPglB가 결여된 CjLLO-풍부화된 용해물을 사용하여 수행하였다. 블롯을 수용자 단백질을 검출하기 위한 항-헥사-히스티딘 항체 (항-His), 또는 N-글리칸을 검출하기 위한 hR6 혈청 (항-글리칸)으로 프라이밍하였다. 화살표는 단백질 표적의 비글리코실화 (g0) 및 단일 글리코실화 (g1) 형태를 나타낸다. 별표는 비-특이적인 혈청 항체 결합에 상응하는 밴드를 나타낸다. 분자량 (MW) 마커는 좌측에 표시된다. [Jaroentomeechai et al., Nat. Comm., July 12, 2018, doi.org/10.1038/s41467-018-05110-x]로부터 입수한 도면이며, 그의 전체 내용이 본원에 참고로 포함된다.
도 12. 무세포 당단백질 합성 용해물을 사용하여 에프. 툴라렌시스에 대한 생체접합체의 주문식 및 재현가능한 생성. (a) CjPglB, FtO-PS, 및 바람직한 시퀀이 반응에 존재할 때에만 FtO-PS에 의한 sfGFP217-DQNAT의 글리코실화가 관찰되었다 (레인 3). 플라스미드 DNA가 생략된 경우에는, sfGFP217-DQNAT 합성이 관찰되지 않았다. (b) 허가된 백신에서 사용되는 담체를 비롯한 면역자극성 담체에 의한 생체접합체 백신의 주문식 합성. 30℃에서 ~1 시간 동안 지속되는 1 mL 무세포 당단백질 합성 반응으로부터 Ni-NTA 아가로스를 사용하여 생체접합체를 정제하였다. 점선은 샘플이 동일한 노출을 갖는 동일한 블롯으로부터의 것임을 나타낸다. 분자량 래더는 각각의 영상의 좌측에 도시된다. [Stark et al., bioRxiv, Jun. 24, 2019, doi.org/10.1101/681841]로부터 적합화된 도면이며, 그의 전체 내용이 본원에 참고로 포함된다.
도 13. 다양한 이. 콜라이 균주로부터 제조된 조질 용해물은 시험관 내 단백질 글리코실화로 처리할 수 있다. r이. 콜라이 705, BL21(DE3) 및 CLM24를 비롯한 몇몇 샤시 균주로부터 제조된 용해물을 정제된 CjPglB, 유기 용매-추출된 CjLLO로 보충된 반응에서 사용하고, 플라스미드 pJL1-scFv13-R4DQNAT로 프라이밍하였다. 효율적인 글리코실화는 16 시간 동안 지속되는 반응에서 관찰되었다. 블롯을 수용자 단백질을 검출하기 위한 항-헥사-히스티딘 항체 (항-His), 또는 N-글리칸을 검출하기 위한 hR6 혈청 (항-글리칸)으로 프로빙하였다. 화살표는 scFv13-R4DQNAT의 비글리코실화 (g0) 및 단일 글리코실화 (g1) 형태를 나타낸다. 분자량 (MW) 마커는 좌측에 표시된다.
도 14. 해독된 무세포 반응은 생체접합체를 생성한다. 지질 A 리모델링은 무세포 당단백질 합성 반응에서 글리코실화 활성에 영향을 미치지 않는다. 용해물은 CjPglB 및 FtO-PS를 또한 발현하는 FtLpxE 세포를 발현하는 야생형 CLM24, CLM24 ΔlpxM, 또는 CLM24 ΔlpxM으로부터 제조되었다. 거의 동일한 글리코실화 활성이 조작된 균주로부터 유래된 용해물 각각에 대해 관찰되었다. 영상은 적어도 3개의 생물학적 복제물을 대표한다. [Stark et al., bioRxiv, Jun. 24, 2019, doi.org/10.1101/681841]로부터 적합화된 도면이며, 그의 전체 내용이 본원에 참고로 포함된다.
도 15. 항박테리아 백신의 주문식 및 이동식 생성을 가능하게 하는 iVAX 플랫폼의 실시양태를 도시하는 개략도. 시험관 내 생체접합체 백신 발현 (iVAX, i n vitro bioconjugate vaccine expression) 플랫폼은 박테리아 병원체에 대한 백신을 개발하고 분배시키는 신속한 수단을 제공한다. 해독된 지질 A를 갖는 조작된 비병원체 이. 콜라이에서 병원체-특이적인 다당류 (예를 들어, CPS, O-PS) 및 박테리아 올리고사카릴트랜스퍼라제 효소의 발현은 생체접합체 백신의 합성을 위해 필요한 모든 기구를 함유하는 저-내독소 용해물을 생성한다. iVAX 용해물에 의해 촉매되는 반응을 이용하여, 허가된 담체 단백질을 함유하는 생체접합체를 생성할 수 있고, 무냉장 수송 및 보관을 위해 활성의 손실없이 냉동-건조될 수 있다. 냉동-건조된 반응은 간단한 재수화를 통해 현장 의료시에 활성화될 수 있고, 이를 사용하여 ~1 시간 내에 면역학적으로 활성인 생체접합체를 재현가능하게 합성할 수 있다.
도 16. 허가된 접합체 백신 담체 단백질의 시험관 내 합성. (a) FDA-승인된 접합체 백신에서 사용된 4가지 모든 담체 단백질은 14C-류신 혼입을 통해 측정되는 바와 같이 시험관 내에서 가용성으로 합성되었다. 이들에는 에이치. 인플루엔자에 단백질 D (PD), 엔. 메닌기티디스 포린 단백질 (PorA), 및 씨. 디프테리아에 독소 (CRM197) 및 씨. 테타니 독소 (TT)의 유전적으로 해독된 변이체가 포함된다. 이. 콜라이 말토스 결합 단백질 (MBP), 및 TT의 단편 C (TTc) 및 경쇄 (TTlight) 도메인을 비롯한 추가의 면역자극성 담체 또한 가용성으로 합성되었다. 값은 평균을 나타내고, 오차 막대는 생물학적 복제물의 표준 편차를 나타낸다 (n = 3). (b) 전장 생성물은 웨스턴 블롯을 통해 시험한 모든 단백질에 대해 관찰되었다. 상이한 노출은 실선으로 표시된다. 분자량 래더는 좌측에 도시된다. 도 21 또한 참고한다.
도 17. iVAX 용해물에서 FtO-PS에 의한 단백질의 재현가능한 글리코실화. (a) iVAX 용해물은 CjPglB, 및 FtO-PS를 코딩하는 생합성 경로를 발현하는 세포로부터 제조되었다. (b) CjPglB, FtO-PS, 및 바람직한 시퀀이 반응에 존재할 때에만 FtO-PS에 의한 sfGFP217-DQNAT의 글리코실화가 관찰되었다 (레인 3). 플라스미드 DNA가 생략된 경우에는, sfGFP217-DQNAT 합성이 관찰되지 않았다. (c) iVAX 용해물의 동일한 로트 (좌측) 또는 상이한 로트 (우측)를 사용하여 sfGFP217-DQNAT를 생성하는 iVAX 반응의 생물학적 복제물은 반응 및 용해물 제조의 재현가능성을 입증하였다. 상단 패널은 담체 단백질을 검출하기 위한 항-헥사-히스티딘 항체 (αHis)로의 프로빙으로부터의 신호를 도시하고, 중간 패널은 상업적인 항-FtO-PS 항체 (αFtO-PS)로의 프로빙으로부터의 신호를 도시하고, 하단 패널은 병합된 αHis 및 αFtO-PS 신호를 도시한다. 복제물이 명확하게 도시되지 않는다면, 영상은 적어도 3개의 생물학적 복제물을 대표한다. 점선은 샘플이 동일한 노출을 갖는 동일한 블롯으로부터의 것임을 나타낸다. 분자량 래더는 각각의 영상의 좌측에 도시된다. 도 22 또한 참고한다.
도 18. iVAX를 사용하여 에프. 툴라렌시스에 대한 생체접합체의 주문식 생성. (a) iVAX 반응물을 CjPglB 및 FtO-PS를 함유하는 용해물로부터 준비하고, 허가된 백신에서 사용되는 것들을 비롯하여 면역자극성 담체를 코딩하는 플라스미드로 프라이밍하였다. (b) 시험한 모든 담체 단백질에 대해 항-에프. 툴라렌시스 생체접합체 백신의 주문식 합성이 관찰되었다. ~1 시간 동안 지속되는 1 mL iVAX 반응물로부터 Ni-NTA 아가로스를 사용하여 생체접합체를 정제하였다. 상단 패널은 담체 단백질을 검출하기 위한 항-헥사-히스티딘 항체 (αHis)로의 프로빙으로부터의 신호를 도시하고, 중간 패널은 상업적인 항-FtO-PS 항체 (αFtO-PS)로의 프로빙으로부터의 신호를 도시하고, 하단 패널은 병합된 αHis 및 αFtO-PS 신호를 도시한다. 영상은 적어도 3개의 생물학적 복제물을 대표한다. 점선은 샘플이 동일한 노출을 갖는 동일한 블롯으로부터의 것임을 나타낸다. 분자량 래더는 각각의 영상의 좌측에 도시된다. 도 23 및 24 또한 참고한다.
도 19. 해독되고 동결건조된 iVAX 반응물은 생체접합체를 생성한다. (a) iVAX 용해물은 용해물 생성을 위한 공급원 균주에서 lpxM의 결실 및 에프. 툴라렌시스 LpxE의 발현을 통해 해독되었다. (b) 생성된 용해물은 유의하게 감소된 내독소 활성을 나타내었다. *p = 0.019 및 **p = 0.003, 양측 t-검정에 의해 결정. (c) sfGFP217-DQNAT를 생성하는 iVAX 반응물을 즉시 또는 동결건조 및 재수화 후에 작동시켰다. (d) 글리코실화 활성은 동결건조 후에 보존되었고, 이는 생체접합체 백신의 이동식 생합성을 위한 iVAX 반응의 잠재성을 입증한다. 상단 패널은 담체 단백질을 검출하기 위한 항-헥사-히스티딘 항체 (αHis)로의 프로빙으로부터의 신호를 도시하고, 중간 패널은 상업적인 항-FtO-PS 항체 (αFtO-PS)로의 프로빙으로부터의 신호를 도시하고, 하단 패널은 병합된 αHis 및 αFtO-PS 신호를 도시한다. 영상은 적어도 3개의 생물학적 복제물을 대표한다. 분자량 래더는 각각의 영상의 좌측에 도시된다. 도 25 또한 참고한다.
도 20. iVAX-유래된 생체접합체는 마우스에서 FtLPS-특이적인 항체를 유도한다. (a) 해독된 용해물을 사용하여 조립된 냉동-건조된 iVAX 반응물을 이용하여 면역화 연구를 위한 항-에프. 툴라렌시스 생체접합체를 합성하였다. (b) 6개 그룹의 BALB/c 마우스를 PBS 또는 7.5 μg의 정제되고 무세포 합성된 비글리코실화 MBP4xDQNAT, FtO-PS-접합된 MBP4xDQNAT, 비글리코실화 PD4xDQNAT, 또는 FtO-PS-접합된 PD4xDQNAT로 피하로 면역화시켰다. PCGT를 이용하여 살아있는 이. 콜라이 세포에서 제조된 FtO-PS-접합된 MBP4xDQNAT는 양성 대조군으로 사용되었다. 5 마리의 마우스로 구성된 PBS 대조군 그룹을 제외하고, 각각의 그룹은 6 마리의 마우스로 구성되었다. 21 및 42 일째에 동일한 용량의 항원으로 마우스를 부스팅시켰다. FtLPS-특이적인 IgG 역가는 항원으로서 고정된 에프. 툴라렌시스 LPS를 갖는 개별 마우스의 종점 (70 일) 혈청 (검은 점)에서 ELISA에 의해 측정하였다. 각각의 그룹의 평균 역가 또한 도시된다 (적색 선). iVAX-유래된 생체접합체는 모든 다른 그룹과 비교하여 유의하게 더 높은 수준의 FtLPS-특이적인 IgG를 유도하였다 (**p < 0.01, 터키-크래머(Tukey-Kramer) HSD). (c) 종점 혈청으로부터 ELISA에 의해 측정된 IgG1 및 IgG2a 아형 역가는 iVAX-유래된 생체접합체가 시험한 모든 다른 그룹과 비교하여 FtO-PS-특이적인 IgG1의 생성을 부스팅하였음을 나타내었다 (**p < 0.01, 터키-크래머 HSD). 이들 결과는 iVAX 생체접합체가 대부분의 접합체 백신에서 전형적인 Th2-편향된 면역 반응을 유도하였음을 나타낸다. 값은 평균을 나타내고, 오차 막대는 ELISA에 의해 검출된 FtLPS-특이적인 IgG의 표준 오차를 나타낸다. 도 26 또한 참고한다.
도 21. 허가된 접합체 백신 담체 단백질의 시험관 내 합성은 소정 범위의 온도에 걸쳐 가능하고, 용이하게 최적화될 수 있다. 도 16 또한 참고한다. (a) CRM197을 제외하고, 모든 담체는 14C-류신 혼입에 의해 측정되는 바와 같이 25℃, 30℃ 및 37℃에서 유사한 가용성 수율로 발현하였다. 값은 평균을 나타내고, 오차 막대는 생물학적 복제물의 표준 편차를 나타낸다 (n = 3). (b) PorA의 가용성 발현은 반응에 지질 나노디스크의 첨가를 통해 개선되었다. (c) 전장 TT의 발현은 (i) 디술피드-결합된 중쇄 및 경쇄에서 전장 TT로의 조립을 개선시키기 위해 산화 조건에서 시험관 내 단백질 합성을 수행하고, (ii) 프로테아제 분해를 최소화하기 위해 단지 2 시간 동안만 반응을 작동시킴으로써 증강될 수 있다. CFPS 반응에서 생성된 (d) CRM197 및 (e) TT는 각각 α-DT 및 α-TT 항체에 의해 검출되며, 상업적으로 입수가능한 정제된 DT 및 TT 단백질 표준 (50 ng 표준 로딩)과 크기에서 비슷하다. 영상은 적어도 3개의 생물학적 복제물을 대표한다. 점선은 샘플이 동일한 노출을 갖는 동일한 블롯으로부터의 것임을 나타낸다. 분자량 래더는 각각의 영상의 좌측에 도시된다.
도 22. iVAX 반응에서 글리코실화는 소정 범위의 온도에 걸쳐 1 시간 내에 발생한다. 도 17 또한 참고한다. 30℃ (좌측), 37℃, 25℃ 및 실온 (~21℃) (우측)에서 FtO-PS 글리코실화의 동력학은 비슷하며, 단백질 합성 및 글리코실화가 iVAX 반응의 첫번째 시간 내에 발생함을 나타낸다. 이들 결과는 iVAX 플랫폼이 허용가능한 범위의 온도에 걸쳐 생체접합체를 합성할 수 있음을 입증한다. 상단 패널은 담체 단백질을 검출하기 위한 항-헥사-히스티딘 항체 (αHis)로의 프로빙으로부터의 신호를 도시하고, 중간 패널은 상업적인 항-FtO-PS 항체 (αFtO-PS)로의 프로빙으로부터의 신호를 도시하고, 하단 패널은 병합된 αHis 및 αFtO-PS 신호를 도시한다. 영상은 적어도 3개의 생물학적 복제물을 대표한다. 분자량 래더는 각각의 영상의 좌측에 도시된다.
도 23. 살아있는 이. 콜라이에서 PGCT를 이용하여 에프. 툴라렌시스에 대한 생체접합체의 생성. 도 18 또한 참고한다. (a) 생체접합체는 CjPglB, FtO-PS에 대한 생합성 경로, 및 허가된 백신에서 사용되는 것들을 비롯한 면역자극성 담체의 패널을 발현하는 CLM24 세포에서 PGCT를 통해 생성되었다. (b) 본 발명자들은 iVAX-유래된 샘플과 비교하여 모든 담체에서 막 단백질인 PorA의 낮은 발현, 뿐만 아니라 감소된 글리칸 로딩 및 고분자량 FtO-PS 종의 접합을 관찰하였다. 상단 패널은 담체 단백질을 검출하기 위한 항-헥사-히스티딘 항체 (αHis)로의 프로빙으로부터의 신호를 나타내고, 중간 패널은 상업적인 항-FtO-PS 항체 (αFtO-PS)로의 프로빙으로부터의 신호를 나타내고, 하단 패널은 병합된 αHis 및 αFtO-PS 신호를 도시한다. 영상은 적어도 3개의 생물학적 복제물을 대표한다. 분자량 래더는 각각의 영상의 좌측에 도시된다.
도 24. iVAX 플랫폼은 모듈식이며, 이를 이용하여 임상적으로 관련된 수율로 다양한 생체접합체를 합성할 수 있다. 도 18 또한 참고한다. (a) FtO-PS에 의한 단백질 합성 및 글리코실화는 MBP4xDQNAT 및 PD4xDQNAT를 생성하는 iVAX 반응에서 측정되었다. ~1 시간 후에, 반응은 14C-류신 혼입을 통해 측정되는 바와 같이 ~40 μg mL-1 단백질을 생성하였고, 이 중에서 ~20 μg mL-1는 밀도계측에 의해 결정되는 바와 같이 FtO-PS에 의해 글리코실화되었다. 값은 평균을 나타내고, 오차 막대는 생물학적 복제물의 표준 오차를 나타낸다 (n = 2). 모듈성을 입증하기 위해, iVAX 용해물을 CjPglB 및 (b) 이. 콜라이 O78 항원 또는 (c) 이. 콜라이 O7 항원에 대한 생합성 경로를 발현하는 세포로부터 제조하였고, 이를 사용하여 PD4xDQNAT (좌측) 또는 sfGFP217-DQNAT (우측) 생체접합체를 합성하였다. 각각의 항원에 대한 반복 단량체 단위의 구조 및 조성이 도시된다. 다당류 항원 둘 다 조성적으로 및 O7 항원의 경우에는 구조적으로 에프. 툴라렌시스 O 항원과 구별된다. 블롯은 담체 단백질을 검출하기 위한 항-헥사-히스티딘 항체 (αHis)로의 프로빙으로부터의 신호를 도시한다. 상업적인 항-O-PS 혈청 또는 항체가 이용가능한 경우에는, 이를 사용하여 접합된 O 항원 (α-EcO78 블롯, 패널 b)의 동일성을 확인하였다. 별표는 비-특이적인 혈청 항체 결합으로부터 생성된 밴드를 나타낸다. 영상은 적어도 3개의 생물학적 복제물을 대표한다. 점선은 샘플이 동일한 노출을 갖는 동일한 블롯으로부터의 것임을 나타낸다. 분자량 래더는 각각의 영상의 좌측에 도시된다.
도 25. 해독된 iVAX 용해물은 생체접합체를 합성하고, 용해물 생성 및 냉동-건조된 반응 규모 둘 다 재현가능하게 합성한다. 도 19 또한 참고한다. (a) CjPglB 및 FtO-PS를 함유하는 iVAX 용해물은 FtLpxE를 발현하는 야생형 CLM24, CLM24 ΔlpxM 또는 CLM24 ΔlpxM 세포로부터 제조하였다. 거의 동일한 sfGFP217-DQNAT 글리코실화는 조작된 균주로부터 유래된 각각의 용해물에 대해 관찰되었다. (b) 면역화를 위한 물질을 생성하기 위해, 내독소-편집된 iVAX 용해물을 생성하기 위한 발효를 0.5 L에서 10 L로 증대시켰다. 본 발명자들은 0.5 L 및 10 L 배양물로부터 유래된 용해물에 대해 및 10 L 발효로부터 생성된 용해물의 상이한 배치에 걸쳐 유사한 수준의 sfGFP217-DQNAT 글리코실화를 관찰하였다. (c) 면역화를 위해, 본 발명자들은 5 mL 냉동-건조된 iVAX 반응물로부터 FtO-PS-접합된 MBP4xDQNAT 및 PD4xDQNAT의 2가지 로트를 제조하였다. 본 발명자들은 담체 및 물질 로트 둘 다에 대해 유사한 수준의 정제된 단백질 (~200 μg) 및 FtO-PS 변형 (>50%, 밀도계측에 의해 측정)을 관찰하였다. 상단 패널은 담체 단백질을 검출하기 위한 항-헥사-히스티딘 항체 (αHis)로의 프로빙으로부터의 신호를 나타내고, 중간 패널은 상업적인 항-FtO-PS 항체 (αFtO-PS)로의 프로빙으로부터의 신호를 나타내고, 하단 패널은 병합된 αHis 및 αFtO-PS 신호를 도시한다. 영상은 적어도 3개의 생물학적 복제물을 대표한다. 분자량 래더는 좌측에 도시된다.
도 26. 백신접종된 마우스에서 시간에 따른 FtLPS-특이적인 항체 역가. 도 20 또한 참고한다. BALB/c 마우스의 6개 그룹을 PBS 또는 7.5 μg의 정제되고 무세포 합성된 비글리코실화 MBP4xDQNAT, FtO-PS-접합된 MBP4xDQNAT, 비글리코실화 PD4xDQNAT, 또는 FtO-PS-접합된 PD4xDQNAT에 의해 피하로 면역화시켰다. PCGT를 이용하여 살아있는 이. 콜라이 세포에서 제조된 FtO-PS-접합된 MBP4xDQNAT는 양성 대조군으로 사용되었다. 5 마리의 마우스로 구성된 PBS 대조군 그룹을 제외하고, 각각의 그룹은 6 마리의 마우스로 구성되었다. 21 및 42 일째에 동일한 용량의 항원으로 마우스를 부스팅시켰다. FtLPS-특이적인 IgG 역가는 초기 면역화 후 -1, 35, 49, 63 및 70 일째에 수집된 혈청에서 ELISA에 의해 측정되었다. iVAX-유래된 생체접합체는 연구 35, 49 및 70 일째에 수집된 혈청에서 PBS 대조군 그룹과 비교하여 유의하게 더 높은 수준의 FtLPS-특이적인 IgG를 유도하였다 (**p < 0.01, 터키-크래머 HSD). 값은 평균을 나타내고, 오차 막대는 ELISA에 의해 검출된 FtLPS-특이적인 IgG의 표준 오차를 나타낸다.
도 27. 표 1은 iVAX 반응에 대한 비용 분석을 도시한다. 1 mL iVAX 반응물은 2개의 10 μg 백신 용량을 생성하고, $11.75에 대해 조립될 수 있다. 표 1에서, 아미노산 비용은 시그마(Sigma)로부터 개별적으로 구입한 2 mM의 20 가지 각각의 표준 아미노산에 대한 것이다. 용해물 비용은 연간 30개의 용해물 배치 및 5 년 장비 수명을 가정하여 10 L 발효로부터 50 mL 용해물을 제조하는 단일 직원을 기준으로 한다. 공급자로부터 직접적으로 구입가능한 경우에는 성분 공급처 또한 표에 포함된다. 자가제의 성분은 직접적으로 구입될 수 없으며, 방법 섹션에 기재된 절차에 따라 제조되어야 한다.
도 28. 표 2는 CLM24 ΔlpxM 균주를 구축하고 검증하기 위해 사용된 프라이머를 도시한다. KO 프라이머는 lpxM에 대해 상동성을 갖는 pKD4로부터 칸나마이신 내성 카세트의 증폭을 위해 사용하였다. Seq 프라이머는 콜로니 PCR 및 녹아웃 균주의 시퀀싱 확인을 위해 사용되었다.
도 29. 표 3은 실시예에서 사용된 플라스미드를 나열한다.
도 30. 표 4는 실시예에서 사용된 항체 및 항혈청을 나열한다.
도 31. iVAX-유래된 백신은 치명적인 에프. 툴라렌시스 공격으로부터 보호한다. (a) 5 마리 BALB/c 마우스의 그룹을 PBS 또는 7.5 μg의 정제되고 무세포 합성된 비글리코실화 MBP4xDQNAT, PD4xDQNAT 또는 EPADNNNS-DQNRT, 또는 FtO-PS-접합된 MBP4xDQNAT, PD4xDQNAT 또는 EPADNNNS-DQNRT에 의해 복강내로 면역화시켰다. PCGT를 이용하여 살아있는 이. 콜라이 세포에서 제조된 FtO-PS-접합된 MBP4xDQNAT, PD4xDQNAT 및 EPADNNNS-DQNRT는 양성 대조군으로 사용되었다. 21 및 42 일째에 동일한 용량의 항원으로 마우스를 부스팅시켰다. 66 일째에 마우스에게 6000 cfu (비내 LD50의 50배) 에프. 툴라렌시스 아종 홀라르크티카(holarctica) 생 백신 균주 록키 마운틴 래버러토리즈(Rocky Mountain Laboratories)로 비내로 시도하였고, 추가 25 일 동안 생존에 대해 모니터링하였다. 담체 단백질로서 (b) MBP4xDQNAT (c) PD4xDQNAT 및 (d) EPADNNNS-DQNRT에 의한 면역화에 대한 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 곡선이 도시된다. 이들 결과는 iVAX-유래된 백신이 최신식 PGCT 접근법을 이용하여 합성된 백신만큼 효과적으로 치명적인 병원체 공격으로부터 마우스를 보호한다는 것을 나타낸다. (*p = 0.0476; **p = 0.0079, 피셔(Fisher) 정확 검정; ns: 유의하지 않음).
본 발명은 하기에서 및 출원 전반에 걸쳐 설명된 바와 같이 몇몇 정의를 이용하여 본원에 기재된다.
정의
개시된 주제는 하기와 같은 정의 및 용어를 이용하여 추가로 기재될 수 있다. 본원에서 사용된 정의 및 용어는 단지 특정 실시양태를 기재하기 위한 목적이며, 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
본 명세서 및 청구항에서 사용된 바와 같이, 문맥상 달리 명확하게 지시되지 않는다면 단수 형태는 복수 형태를 포함한다. 예를 들어, 용어 "유전자" 또는 "올리고당류"는 문맥상 달리 명확하게 지시되지 않는다면 각각 "1개 이상의 유전자" 및 "1개 이상의 올리고당류"를 의미하는 것으로 해석되어야 한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "복수개"는 "2개 이상"을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "약", "대략", "실질적으로" 및 "유의하게"는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해될 것이고, 이들이 사용되는 문맥에서 어느 정도 달라질 것이다. 그가 사용되는 문맥에 따라 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명확하지 않은 용어의 사용이 있는 경우에는, "약" 및 "대략"이 특정 용어의 + 또는 - 10% 이하를 의미할 것이고, "실질적으로" 및 "유의하게"는 특정 용어의 + 또는 - 10% 초과를 의미할 것이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "포함한다(include)" 및 "포함하는"은 용어 "포함한다(comprise)" 및 "포함하는"과 동일한 의미를 갖는다. 용어 "포함하다" 및 "포함하는"은 청구항에 인용된 이들 성분에 대해 추가의 성분을 추가로 포함하는 것을 허용하는 "개방형" 접속 용어인 것으로 해석되어야 한다. 용어 "이루어진다" 및 "이루어지는"은 청구항에 인용된 성분 외에 추가의 성분을 포함하는 것을 허용하지 않는 "폐쇄형" 접속 용어인 것으로 해석되어야 한다. 용어 "본질적으로 이루어지는"은 부분적으로 폐쇄형이며, 청구된 주제의 성질을 근본적으로 변경시키지 않는 추가의 성분만을 포함하는 것을 허용하는 것으로 해석되어야 한다.
문구 "예컨대"는 "예를 들어, 비롯하여"로 해석되어야 한다. 더욱이 "예컨대"를 비롯하여 이로 제한되지 않는 임의의 모든 예시적인 언어의 사용은 단지 본 발명을 더 잘 설명하기 위해 의도되고, 달리 청구되지 않는다면 본 발명의 범위를 제한하지 않는다.
추가로, "A, B 및 C 등 중 적어도 하나"와 유사한 관례가 사용되는 이들 예에서, 일반적으로 이러한 구성은 관련 기술분야의 통상의 기술자의 관점에서 상기 관례를 이해할 것이라고 의도된다 (예를 들어, "A, B 및 C 중 적어도 하나를 갖는 시스템"에는 A 단독, B 단독, C 단독, A 및 B를 함께, A 및 C를 함께, B 및 C를 함께, 및/또는 A, B 및 C를 함께 갖는 시스템이 포함되나 이로 제한되지 않는다.). 명세서 또는 도면에서 2개 이상의 대안적인 용어를 제시하는 사실상 임의의 이접 단어 및/또는 문구가 용어 중 하나, 어느 하나의 용어, 또는 두 용어 모두를 포함할 가능성을 고려하는 것으로 이해되어야 한다는 것이 관련 기술분야 내의 기술자에 의해 추가로 이해될 것이다. 예를 들어, 문구 "A 또는 B"는 "A" 또는 "B" 또는 "A 및 B"의 가능성을 포함하는 것으로 이해될 것이다.
"까지", "적어도", "초과", "미만" 등과 같은 모든 언어는 인용된 숫자를 포함하고, 후속적으로 범위들 및 하위 범위로 분류될 수 있는 범위를 지칭한다. 범위는 각각의 개별 구성원을 포함한다. 따라서, 예를 들어, 1-3개의 구성원을 갖는 그룹은 1, 2 또는 3개의 구성원을 갖는 그룹을 지칭한다. 유사하게, 6개의 구성원을 갖는 그룹은 1, 2, 3, 4 또는 6개의 구성원을 갖는 그룹 등을 지칭한다.
법조동사 "할 수 있다(may)"는 기재된 몇몇 실시양태 또는 그에 포함된 특징 중에서 하나 이상의 옵션 또는 선택의 바람직한 사용 또는 선택을 지칭한다. 옵션 또는 선택이 특정 실시양태 또는 그에 포함된 특징과 관련하여 개시되지 않는 경우, 법조동사 "할 수 있다"는 기재된 실시양태 또는 그에 포함된 특징의 제조 또는 사용 방법 및 그의 측면에 대한 긍정적인 행위, 또는 기재된 실시양태 또는 그에 포함된 특징에 대한 구체적인 기술의 사용에 대한 최종 결정을 지칭한다. 후자의 맥락에서, 법조동사 "할 수 있다"는 조동사 "할 수 있다(can)"와 동일한 의미 및 함축을 갖는다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "결합한다", "결합", "상호작용한다", "상호작용하는", "점유한다" 및 "점유하는"은 공유 상호작용, 비공유 상호작용 및 입체적인 상호작용을 지칭한다. 공유 상호작용은 한 쌍의 전자 (단일 결합), 두 쌍의 전자 (이중 결합) 또는 세 쌍의 전자 (삼중 결합)를 공유하여 형성된 두 원자 또는 라디칼 사이의 화학적 결합이다. 공유 상호작용은 관련 기술분야에서 전자 쌍 상호작용 또는 전자 쌍 결합으로도 공지되어 있다. 비공유 결합에는 반 데르 발스 상호작용, 수소 결합, 약한 화학 결합 (근거리 비공유 힘을 통해), 소수성 상호작용, 이온 결합 등이 포함되나 이로 제한되지 않는다. 비공유 상호작용에 대한 검토는 [Alberts et al., in Molecular Biology of the Cell, 3d edition, Garland Publishing, 1994]에서 확인할 수 있다. 입체적인 상호작용은 일반적으로 화합물과 부위 사이의 임의의 인력과는 대조적으로 화합물의 구조가 화합물이 그의 3차원 구조에 의해 부위를 점유할 수 있도록 하는 것을 포함하는 것으로 이해된다.
폴리뉴클레오티드 및 합성 방법
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "핵산" 및 "올리고뉴클레오티드"는 폴리데옥시리보뉴클레오티드 (2-데옥시-D-리보스 함유), 폴리리보뉴클레오티드 (D-리보스 함유), 및 퓨린 또는 피리미딘 염기의 N 글리코시드인 임의의 다른 유형의 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 용어 "핵산", "올리고뉴클레오티드" 및 "폴리뉴클레오티드" 사이에는 길이에 대해 의도된 구분은 없으며, 이들 용어는 상호교환적으로 사용될 것이다. 이들 용어는 분자의 일차 구조만을 지칭한다. 따라서, 이들 용어는 이중- 및 단일-가닥 DNA, 뿐만 아니라 이중- 및 단일-가닥 RNA를 포함한다. 본 발명의 방법에서 사용하기 위해, 올리고뉴클레오티드는 염기, 당, 또는 포스페이트 백본 뿐만 아니라 비-퓨린 또는 비-피리미딘 뉴클레오티드 유사체가 변형된 것인 뉴클레오티드 유사체 또한 포함할 수 있다.
올리고뉴클레오티드는 [Narang et al., 1979, Meth. Enzymol. 68:90-99]의 포스포트리에스테르 방법; [Brown et al., 1979, Meth. Enzymol. 68:109-151]의 포스포디에스테르 방법; [Beaucage et al., 1981, Tetrahedron Letters 22:1859-1862]의 디에틸포스포르아미다이트 방법; 및 미국 특허 번호 4,458,066의 고체 지지체 방법 (각각은 본원에 참고로 포함됨)과 같은 방법에 의한 직접적인 화학적 합성을 비롯하여 임의의 적합한 방법에 의해 제조될 수 있다. 올리고뉴클레오티드 및 변형된 뉴클레오티드의 접합체의 합성 방법에 대한 검토는 [Goodchild, 1990, Bioconjugate Chemistry 1(3): 165-187] (본원에 참고로 포함됨)에 제공된다.
용어 "증폭 반응"은 주형 핵산 서열의 카피를 증가시키거나 또는 주형 핵산을 전사시키는, 효소적 반응을 비롯한 임의의 화학적 반응을 지칭한다. 증폭 반응에는 역전사, 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR), 예컨대 실시간 PCR (미국 특허 번호 4,683,195 및 4,683,202 ; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis et al., eds, 1990) 참고), 및 리가제 연쇄 반응 (LCR) (Barany 등의 미국 특허 번호 5,494,810 참고)이 포함된다. 예시적인 "증폭 반응 조건" 또는 "증폭 조건"은 전형적으로 2 또는 3 단계 사이클을 포함한다. 2-단계 사이클은 고온 변성 단계 이후에 혼성화/신장 (또는 라이게이션) 단계를 갖는다. 3 단계 사이클은 변성 단계 이후에 혼성화 단계 이후에 별도의 신장 단계를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "표적", "표적 서열", "표적 영역" 및 "표적 핵산"은 동의어이며, 증폭, 시퀀싱 또는 검출되어야 하는 핵산의 영역 또는 서열을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "혼성화"는 상보성 염기 쌍 형성으로 인해 2개의 단일-가닥 핵산에 의한 듀플렉스 구조의 형성을 지칭한다. 혼성화는 완전히 상보성인 핵산 가닥 사이에서 또는 미스매치의 작은 영역을 함유하는 "실질적으로 상보성인" 핵산 가닥 사이에서 발생할 수 있다. 완전히 상보성인 핵산 가닥의 혼성화가 강력하게 바람직한 조건은 "엄격한 혼성화 조건" 또는 "서열-특이적인 혼성화 조건"으로 지칭된다. 실질적으로 상보성인 서열의 안정한 듀플렉스는 덜 엄격한 혼성화 조건하에 달성될 수 있고; 허용되는 미스매치 정도는 혼성화 조건의 적합한 조정에 의해 제어될 수 있다. 핵산 기술분야의 기술자는 예를 들어 관련 기술분야에 의해 제공된 지침에 따라 올리고뉴클레오티드의 길이 및 염기 쌍 조성, 이온 강도, 및 미스매치된 염기 쌍의 발생을 비롯한 수많은 변수를 고려하여 듀플렉스 안정성을 경험적으로 결정할 수 있다 (예를 들어, Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York; Wetmur, 1991, Critical Review in Biochem. and Mol. Biol. 26(3/4):227-259; 및 Owczarzy et al., 2008, Biochemistry, 47: 5336-5353 참고, 이들은 본원에 참고로 포함됨).
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "프라이머"는 적합한 조건하에 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 지칭한다. 이러한 조건에는 핵산 가닥에 대해 상보성인 프라이머 연장 생성물의 합성이 적절한 완충제 중에서 및 적합한 온도에서 4가지 상이한 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 연장을 위한 시약 (예를 들어, DNA 폴리머라제 또는 역전사 효소)의 존재하에 유도되는 것들이 포함된다.
프라이머는 바람직하게는 단일-가닥 DNA이다. 프라이머의 적절한 길이는 프라이머의 의도된 용도에 따라 좌우되지만, 전형적으로 약 6 내지 약 225개 뉴클레오티드 범위 (중간 범위 포함), 예컨대 15 내지 35개 뉴클레오티드, 18 내지 75개 뉴클레오티드 및 25 내지 150개 뉴클레오티드이다. 짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형과의 충분히 안정한 혼성체 복합체를 형성하기 위해 더 낮은 온도를 필요로 한다. 프라이머가 주형 핵산의 정확한 서열을 반영할 필요는 없지만, 주형과 혼성화하기에 충분히 상보성이어야 한다. 주어진 표적 서열의 증폭에 적합한 프라이머의 설계는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 본원에 인용된 문헌에 기재되어 있다.
프라이머는 프라이머의 검출 또는 고정화를 가능하게 하지만, DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변경시키지 않는 추가의 특징을 포함할 수 있다. 예를 들어, 프라이머는 표적 핵산과 혼성화하지 않지만 증폭된 생성물의 클로닝 또는 검출을 용이하게 하거나, 또는 RNA의 전사 (예를 들어, 프로모터를 포함시킴으로써) 또는 단백질의 번역 (예를 들어, 5'-UTR, 예컨대 내부 리보솜 진입 부위 (IRES) 또는 3'-UTR 요소, 예컨대 폴리(A)n 서열 (여기서, n 은 약 20 내지 약 200의 범위임)을 포함시킴으로써)을 가능하게 하는 추가의 핵산 서열을 5' 말단에 함유할 수 있다. 혼성화할 주형에 대해 충분히 상보성인 프라이머의 영역은 본원에서 혼성화 영역으로 지칭된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 충분히 엄격한 조건하에 증폭 반응에서 사용될 때, 프라이머가 주로 표적 핵산과 혼성화하는 경우, 프라이머는 표적 서열에 대해 "특이적"이다. 전형적으로, 프라이머-표적 듀플렉스 안정성이 프라이머와 샘플에서 발견되는 임의의 다른 서열 사이에 형성된 듀플렉스 안정성에 비해 더 큰 경우, 프라이머는 표적 서열에 대해 특이적이다. 관련 기술분야의 기술자는 염 조건 뿐만 아니라 프라이머의 염기 조성 및 미스매치의 위치와 같은 다양한 인자가 프라이머의 특이성에 영향을 미칠 것이고, 프라이머 특이성의 일상적인 실험 확인이 여러 경우에 필요할 것임을 인식할 것이다. 프라이머가 표적 서열과만 안정한 듀플렉스를 형성할 수 있는 혼성화 조건이 선택될 수 있다. 따라서, 적합하게 엄격한 증폭 조건하에 표적-특이적인 프라이머의 사용은 표적 프라이머 결합 부위를 함유하는 이들 표적 서열의 선택적인 증폭을 가능하게 한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "폴리머라제"는 뉴클레오티드의 중합을 촉매하는 효소를 지칭한다. "DNA 폴리머라제"는 데옥시리보뉴클레오티드의 중합을 촉매할 수 있다. 공지된 DNA 폴리머라제에는 그 중에서도 예를 들어 피로코쿠스 푸리오수스(Pyrococcus furiosus) (Pfu) DNA 폴리머라제, 이. 콜라이 DNA 폴리머라제 I, T7 DNA 폴리머라제 및 써무스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus) (Taq) DNA 폴리머라제가 포함된다. "RNA 폴리머라제"는 리보뉴클레오티드의 중합을 촉매한다. DNA 폴리머라제의 상기 예는 DNA-의존성 DNA 폴리머라제로도 공지되어 있다. RNA-의존성 DNA 폴리머라제는 또한 DNA 폴리머라제의 범위 내에 속한다. 레트로바이러스에 의해 코딩되는 바이러스 폴리머라제를 포함하는 역전사 효소는 RNA-의존성 DNA 폴리머라제의 예이다. RNA 폴리머라제 ("RNAP")의 공지된 예에는 그 중에서도 예를 들어 T3 RNA 폴리머라제, T7 RNA 폴리머라제, SP6 RNA 폴리머라제 및 이. 콜라이 RNA 폴리머라제가 포함된다. RNA 폴리머라제의 상기 예는 DNA-의존성 RNA 폴리머라제로도 공지되어 있다. 상기 임의의 효소의 폴리머라제 활성은 관련 기술분야에 널리 공지된 수단에 의해 결정될 수 있다.
용어 "프로모터"는 RNA 폴리머라제를 지시하기 위한 시스-작용 DNA 서열 및 시스-작용 DNA 서열을 포함하는 DNA 주형으로부터 RNA 전사를 개시하기 위한 다른 트랜스-작용 전사 인자를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "서열 정의된 생체중합체"는 특이적인 일차 서열을 갖는 생체중합체를 지칭한다. 서열 정의된 생체중합체는 유전자가 특이적인 일차 서열을 갖는 생체중합체를 코딩하는 경우에 유전적으로 코딩된 정의된 생체중합체와 등가물일 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "발현 주형"은 서열 정의된 생체중합체 (예를 들어, 폴리펩티드 또는 단백질)로 번역될 수 있는, 적어도 하나의 RNA를 전사하기 위한 기질로서 작용하는 핵산을 지칭한다. 발현 주형은 DNA 또는 RNA로 구성된 핵산을 포함한다. 발현 주형을 위해 핵산을 사용하기 위한 DNA의 적합한 공급원에는 cDNA로 전환될 수 있는 게놈 DNA, cDNA 및 RNA가 포함된다. 게놈 DNA, cDNA 및 RNA는 임의의 생물학적 공급원, 예컨대 그 중에서도 조직 샘플, 생검, 면봉, 타액, 혈액 샘플, 대변 샘플, 소변 샘플, 스크레이핑으로부터의 것일 수 있다. 게놈 DNA, cDNA 및 RNA는 숙주 세포 또는 바이러스 기원으로부터 및 임의의 종으로부터, 예컨대 현존하는 및 멸종된 유기체로부터의 것일 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "발현 주형" 및 "전사 주형"은 동일한 의미를 갖고, 상호교환적으로 사용된다.
특정한 예시적인 실시양태에서, 예를 들어 본원에 기재된 하나 이상의 rRNA 또는 리포터 폴리펩티드 및/또는 단백질을 코딩하는 핵산을 함유하는 발현 벡터와 같은 벡터가 제공된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "벡터"는 그가 연결된 또 다른 핵산에 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 벡터의 한 유형은 "플라스미드"이며, 이는 추가의 DNA 세그먼트가 라이게이션될 수 있는 원형 이중 가닥 DNA 루프를 지칭한다. 이러한 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로 지칭된다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에서 사용되는 발현 벡터는 종종 플라스미드의 형태이다. 본 명세서에서, "플라스미드" 및 "벡터"는 상호교환적으로 사용될 수 있다. 그러나, 개시된 방법 및 조성물은 이러한 다른 형태의 발현 벡터, 예컨대 동등한 기능을 제공하는 바이러스 벡터 (예를 들어, 복제 결손 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-연관된 바이러스)를 포함하는 것으로 의도된다.
특정한 예시적인 실시양태에서, 재조합 발현 벡터는 본원에 기재된 하나 이상의 방법에서 핵산 서열의 발현에 적합한 형태로 핵산 서열 (예를 들어, 본원에 기재된 하나 이상의 rRNA 또는 리포터 폴리펩티드 및/또는 단백질을 코딩하는 핵산 서열)을 포함하며, 이는 재조합 발현 벡터가 발현될 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 조절 서열을 포함한다는 것을 의미한다. 재조합 발현 벡터 내에서, "작동가능하게 연결된"은 본원에 기재된 하나 이상의 rRNA 또는 리포터 폴리펩티드 및/또는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 (예를 들어, 시험관 내 전사 및/또는 번역 시스템에서) 뉴클레오티드 서열의 발현을 가능하게 하는 방식으로 조절 서열(들)에 연결된 것을 의미하는 것으로 의도된다. 용어 "조절 서열"은 프로모터, 인핸서 및 다른 발현 제어 요소 (예를 들어, 폴리아데닐화 신호)를 포함하는 것으로 의도된다. 이러한 조절 서열은 예를 들어 [Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)]에 기재되어 있다.
올리고뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드는 임의적으로 1개 이상의 비-표준 뉴클레오티드(들), 뉴클레오티드 유사체(들) 및/또는 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 변형된 뉴클레오티드의 예에는 디아미노퓨린, S2T, 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-클로로우라실, 5-아이오도우라실, 히포크산틴, 크산틴, 4-아세틸시토신, 5-(카르복시히드록실메틸)우라실, 5-카르복시메틸아미노메틸-2-티오우리딘, 5-카르복시메틸아미노메틸우라실, 디히드로우라실, 베타-D-갈락토실쿠에오신, 이노신, N6-이소펜테닐아데닌, 1-메틸구아닌, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸시토신, 5-메틸시토신, N6-아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우라실, 베타-D-만노실퀘오신, 5'-메톡시카르복시메틸우라실, 5-메톡시우라실, 2-메틸티오-D46-이소펜테닐아데닌, 우라실-5-옥시아세트산 (v), 와이부톡소신, 수도우라실, 퀘오신, 2-티오시토신, 5-메틸-2-티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, 우라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 우라실-5-옥시아세트산 (v), 5-메틸-2-티오우라실, 3-(3-아미노-3-N-2-카르복시프로필) 우라실, (acp3)w, 2,6-디아미노퓨린 등이 포함되나 이로 제한되지 않는다. 핵산 분자는 또한 염기 모이어티 (예를 들어, 전형적으로 상보성 뉴클레오티드와 수소 결합을 형성하도록 이용가능한 1개 이상의 원자에서 및/또는 전형적으로 상보성 뉴클레오티드와 수소 결합을 형성할 수 없는 1개 이상의 원자에서), 당 모이어티 또는 포스페이트 백본에서 변형될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "결실"은 고유의 폴리뉴클레오티드 서열에 비해 1개 이상의 뉴클레오티드의 제거를 의미한다. 본원에 개시된 조작된 균주는 1개 이상의 유전자에서 결실 (예를 들어, gmd에서 결실 및/또는 waaL에서 결실)을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 결실은 비기능성 유전자 생성물을 생성한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "삽입"은 고유의 폴리뉴클레오티드 서열에 1개 이상의 뉴클레오티드의 부가를 의미한다. 본원에 개시된 조작된 균주는 1개 이상의 유전자에서 삽입 (예를 들어, gmd에서 삽입 및/또는 waaL에서 삽입)을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 결실은 비기능성 유전자 생성물을 생성한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "치환"은 고유의 폴리뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드를 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 고유하지 않은 뉴클레오티드로 대체하는 것을 의미한다. 본원에 개시된 조작된 균주는 1개 이상의 유전자에서 치환 (예를 들어, gmd에서 치환 및/또는 waaL에서 치환)을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 치환은 비기능성 유전자 생성물을 생성하며, 예를 들어 치환은 유전자 생성물의 코딩 서열에서 미성숙 정지 코돈 (예를 들어, TAA, TAG, 또는 TGA)을 도입시킨다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 조작된 균주는 2개 이상의 치환을 포함할 수 있고, 치환은 다수개의 미성숙 정지 코돈 (예를 들어, TAATAA, TAGTAG, 또는 TGATGA)을 도입시킨다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 조작된 균주는 1개 이상의 이종성 유전자를 포함하고 발현하도록 조작될 수 있다. 관련 기술분야에서 이해되는 바와 같이, 이종성 유전자는 균주가 천연 발생함에 따라 조작된 균주에서 천연적으로 존재하지 않는 유전자이다. 이. 콜라이에 대해 이종성인 유전자는 이. 콜라이에서 발생하지 않는 유전자이며, 또 다른 미생물에서 천연 발생하는 유전자 (예를 들어 씨. 제주니로부터의 유전자) 또는 임의의 다른 공지된 미생물에서 천연 발생하지 않는 유전자 (즉, 인공 유전자)일 수 있다.
펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 및 합성 방법
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "펩티드", "폴리펩티드" 및 "단백질"은 아미드 연결에 의해 결합된 아미노산 잔기의 중합체 쇄를 포함하는 분자를 지칭한다. 용어 "아미노산 잔기"에는 알라닌 (Ala 또는 A), 시스테인 (Cys 또는 C), 아스파르트산 (Asp 또는 D), 글루탐산 (Glu 또는 E), 페닐알라닌 (Phe 또는 F), 글리신 (Gly 또는 G), 히스티딘 (His 또는 H), 이소류신 (Ile 또는 I), 리신 (Lys 또는 K), 류신 (Leu 또는 L), 메티오닌 (Met 또는 M), 아스파라긴 (Asn 또는 N), 프롤린 (Pro 또는 P), 글루타민 (Gln 또는 Q), 아르기닌 (Arg 또는 R), 세린 (Ser 또는 S), 트레오닌 (Thr 또는 T), 발린 (Val 또는 V), 트립토판 (Trp 또는 W), 및 티로신 (Tyr 또는 Y) 잔기로 이루어진 군에 함유된 아미노산 잔기가 포함되나 이로 제한되지 않는다. 용어 "아미노산 잔기"에는 비표준 또는 비천연 아미노산 또한 포함될 수 있다. 용어 "아미노산 잔기"에는 알파-, 베타-, 감마- 및 델타-아미노산이 포함될 수 있다.
일부 실시양태에서, 용어 "아미노산 잔기"에는 호모시스테인, 2-아미노아디프산, N-에틸아스파라긴, 3-아미노아디프산, 히드록시리신, β-알라닌, β-아미노-프로피온산, 알로-히드록시리신산, 2-아미노부티르산, 3-히드록시프롤린, 4-아미노부티르산, 4-히드록시프롤린, 피페리딘산, 6-아미노카프로산, 이소데스모신, 2-아미노헵탄산, 알로-이소류신, 2-아미노이소부티르산, N-메틸글리신, 사르코신, 3-아미노이소부티르산, N-메틸이소류신, 2-아미노피멜산, 6-N-메틸리신, 2,4-디아미노부티르산, N-메틸발린, 데스모신, 노르발린, 2,2'-디아미노피멜산, 노르류신, 2,3-디아미노프로피온산, 오르니틴, 및 N-에틸글리신으로 이루어진 군에 함유된 비표준 또는 비천연 아미노산 잔기가 포함될 수 있다. 용어 "아미노산 잔기"에는 상기 언급된 임의의 아미노산의 L 이성질체 또는 D 이성질체가 포함될 수 있다.
비표준 또는 비천연 아미노산의 다른 예에는 p-아세틸-L-페닐알라닌, p-아이오도-L-페닐알라닌, O-메틸-L-티로신, p-프로파르길옥시페닐알라닌, p-프로파르길-페닐알라닌, L-3-(2-나프틸)알라닌, 3-메틸-페닐알라닌, O-4-알릴-L-티로신, 4-프로필-L-티로신, 트리-O-아세틸-GlcNAcpβ-세린, L-Dopa, 플루오린화 페닐알라닌, 이소프로필-L-페닐알라닌, p-아지도-L-페닐알라닌, p-아실-L-페닐알라닌, p-벤조일-L-페닐알라닌, L-포스포세린, 포스포노세린, 포스포노티로신, p-브로모페닐알라닌, p-아미노-L-페닐알라닌, 이소프로필-L-페닐알라닌, 티로신 아미노산의 비천연 유사체; 글루타민 아미노산의 비천연 유사체; 페닐알라닌 아미노산의 비천연 유사체; 세린 아미노산의 비천연 유사체; 트레오닌 아미노산의 비천연 유사체; 메티오닌 아미노산의 비천연 유사체; 류신 아미노산의 비천연 유사체; 이소류신 아미노산의 비천연 유사체; 알킬, 아릴, 아실, 아지도, 시아노, 할로, 히드라진, 히드라지드, 히드록실, 알케닐, 알키닐, 에테르, 티올, 술포닐, 셀레노, 에스테르, 티오산, 보레이트, 보로네이트, 포스포노, 포스핀, 헤테로시클릭, 에논, 이민, 알데히드, 히드록실아민, 케토, 또는 아미노 치환된 아미노산, 또는 이들의 조합물; 광활성화 가능한 가교제를 갖는 아미노산; 스핀-표지된 아미노산; 형광 아미노산; 금속 결합 아미노산; 금속-함유 아미노산; 방사성 아미노산; 포토케이징된 및/또는 광이성질체화 가능한 아미노산; 비오틴 또는 비오틴-유사체 함유 아미노산; 케토 함유 아미노산; 폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에테르를 포함하는 아미노산; 중원자 치환된 아미노산; 화학적으로 절단 가능한 또는 광절단 가능한 아미노산; 연장된 측쇄를 갖는 아미노산; 독성 기를 함유하는 아미노산; 당 치환된 아미노산; 탄소-연결된 당-함유 아미노산; 산화환원-활성 아미노산; α-히드록시 함유 산; 아미노 티오 산; α,α 이치환된 아미노산; β-아미노산; γ-아미노산, 프롤린 또는 히스티딘 이외의 시클릭 아미노산, 및 페닐알라닌, 티로신 또는 트립토판 이외의 방향족 아미노산이 포함되나 이로 제한되지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, "펩티드"는 전형적으로 20개 이하의 아미노산 길이, 및 더욱 전형적으로 12개 이하의 아미노산 길이인 아미노산의 짧은 중합체로 정의된다 (Garrett & Grisham, Biochemistry, 2nd edition, 1999, Brooks/Cole, 110). 일부 실시양태에서, 본원에서 고려되는 펩티드는 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개 이하의 아미노산을 포함할 수 있다. 단백질로도 지칭되는 폴리펩티드는 전형적으로 ≥ 100개 아미노산 길이이다 (Garrett & Grisham, Biochemistry, 2nd edition, 1999, Brooks/Cole, 110). 본원에서 고려되는 폴리펩티드는 100, 101, 102, 103, 104, 105, 약 110, 약 120, 약 130, 약 140, 약 150, 약 160, 약 170, 약 180, 약 190, 약 200, 약 210, 약 220, 약 230, 약 240, 약 250, 약 275, 약 300, 약 325, 약 350, 약 375, 약 400, 약 425, 약 450, 약 475, 약 500, 약 525, 약 550, 약 575, 약 600, 약 625, 약 650, 약 675, 약 700, 약 725, 약 750, 약 775, 약 800, 약 825, 약 850, 약 875, 약 900, 약 925, 약 950, 약 975, 약 1000, 약 1100, 약 1200, 약 1300, 약 1400, 약 1500, 약 1750, 약 2000, 약 2250, 약 2500개 또는 그 초과의 아미노산 잔기를 포함할 수 있지만 이로 제한되지 않는다.
본원에서 고려되는 펩티드는 비-아미노산 모이어티를 포함하도록 추가로 변형될 수 있다. 변형에는 아실화 (예를 들어, O-아실화 (에스테르), N-아실화 (아미드), S-아실화 (티오에스테르)), 아세틸화 (예를 들어, 단백질의 N-말단에서 또는 리신 잔기에서 아세틸 기의 부가), 포르밀화 지방화 (예를 들어, 리포에이트의 부착, C8 관능기), 미리스토일화 (예를 들어, 미리스테이트의 부착, C14 포화된 산), 팔미토일화 (예를 들어, 팔미테이트의 부착, C16 포화된 산), 알킬화 (예를 들어, 리신 또는 아르기닌 잔기에서 알킬 기, 예컨대 메틸의 부가), 이소프레닐화 또는 프레닐화 (예를 들어, 이소프레노이드 기, 예컨대 파르네솔 또는 게라닐게라니올의 부가), C-말단에서 아미드화, 글리코실화 (예를 들어, 아스파라긴, 히드록시리신, 세린, 또는 트레오닌에 글리코실 기를 부가하여, 당단백질 생성)가 포함될 수 있으나 이로 제한되지 않는다. 당의 비효소적 부착으로 간주되는 당화와는 달리, 폴리시알릴화 (예를 들어, 폴리시알산의 부가), 글리피에이션 (예를 들어, 글리코실포스파티딜이노시톨 (GPI) 앵커 형성, 히드록실화, 아이오딘화 (예를 들어, 갑상선 호르몬), 및 인산화 (예를 들어, 일반적으로 세린, 티로신, 트레오닌 또는 히스티딘에 포스페이트 기의 부가). 변형에는 글리코실화 태그 (예를 들어, 임의적으로 C-말단에서 4xDQNAT) 및/또는 히스티딘 태그 (예를 들어, 6xHis)의 부가가 포함될 수 있다.
본원에서 펩티드, 폴리펩티드, 단백질 및 그의 변이체에 대한 기준이 만들어질 수 있다. 기준 아미노산 서열에는 임의의 서열식별번호(SEQ ID NO):1-10의 아미노산 서열이 포함될 수 있으나 이로 제한되지 않는다. 본원에서 고려되는 변이체는 기준 아미노산 서열에 비해 보존적 아미노산 치환을 포함하는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 예를 들어, 본원에서 고려되는 변이체 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질은 기준 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질에 비해 보존적 아미노산 치환 및/또는 비-보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있다. "보존적 아미노산 치환"은 기준 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질의 성질을 최소한으로 방해하는 것으로 예상되는 이들 치환이고, "비-보존적 아미노산 치환"은 기준 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질의 성질을 최대한으로 방해하는 것으로 예상되는 이들 치환이다. 달리 말하면, 보존적 아미노산 치환은 기준 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질의 구조 및 기능을 실질적으로 보존한다. 하기 표는 예시적인 보존적 아미노산 치환의 목록을 제공한다.
표 1
보존적 아미노산 치환은 일반적으로 하기를 유지한다: (a) 치환 영역에서 예를 들어 베타 시트 또는 알파 나선 형태로서 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 백본의 구조, (b) 치환 부위에서 분자의 전하 또는 소수성, 및/또는 (c) 측쇄의 벌크. 비-보존적 아미노산 치환은 일반적으로 하기를 방해한다: (a) 치환 영역에서 예를 들어 베타 시트 또는 알파 나선 형태로서 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 백본의 구조, (b) 치환 부위에서 분자의 전하 또는 소수성, 및/또는 (c) 측쇄의 벌크.
펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질의 기준 아미노산 서열에 비해 결실을 포함하는 변이체가 본원에서 고려된다. "결실"은 기준 서열에 비해 1개 이상의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 부재를 일으키는 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열에서의 변화를 지칭한다. 결실은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 50, 100 또는 200개 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드를 제거한다. 결실은 내부 결실 또는 말단 결실 (예를 들어, 기준 폴리펩티드의 N-말단 말단절단 또는 C-말단 말단절단 또는 기준 폴리뉴클레오티드의 5'-말단 또는 3'-말단 말단절단)을 포함할 수 있다.
펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질의 기준 아미노산 서열의 단편을 포함하는 변이체가 본원에서 고려된다. "단편"은 서열에서 동일하지만 기준 서열에 비해 길이가 더 짧은 아미노산 서열의 일부분을 지칭한다. 단편은 기준 서열의 전체 길이에서 적어도 1개의 아미노산 잔기가 적은 것까지 포함할 수 있다. 예를 들어, 단편은 각각 기준 폴리펩티드의 5 내지 1000개의 연속한 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 단편은 기준 폴리펩티드의 적어도 5, 10, 15, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 250 또는 500개의 연속한 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 단편은 분자의 특정한 영역으로부터 우세하게 선택될 수 있다. 용어 "적어도 단편"은 전장 폴리펩티드를 포함한다.
펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질의 기준 아미노산 서열에 비해 삽입 또는 부가를 포함하는 변이체가 본원에서 고려된다. 단어 "삽입" 및 "부가"는 1개 이상의 아미노산 잔기의 부가를 일으키는 아미노산 또는 서열에서의 변화를 지칭한다. 삽입 또는 부가는 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 또는 200개의 아미노산 잔기를 지칭할 수 있다.
융합 단백질 또한 본원에서 고려된다. "융합 단백질"은 본원에 개시된 적어도 1개의 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 또는 그의 변이체와 적어도 1개의 이종성 단백질 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 (또는 그의 단편 또는 변이체)의 융합에 의해 형성된 단백질을 지칭한다. 이종성 단백질(들)은 펩티드 또는 그의 변이체의 N-말단, C-말단, 또는 두 말단 모두에서 융합될 수 있다.
"상동성"은 2개 이상의 폴리펩티드 서열 사이의 서열 유사성 또는 상호교환적으로 서열 동일성을 지칭한다. 상동성, 서열 유사성, 및 퍼센트 서열 동일성은 관련 기술분야에 있으며 본원에 기재된 방법을 이용하여 결정될 수 있다.
폴리펩티드 서열에 적용되는 문구 "퍼센트 동일성" 및 "% 동일성"은 표준화된 알고리즘을 이용하여 정렬된 적어도 2개의 폴리펩티드 서열 사이의 잔기 매치의 퍼센트를 지칭한다. 폴리펩티드 서열 정렬 방법은 널리 공지되어 있다. 일부 정렬 방법은 보존적 아미노산 치환을 고려한다. 상기에서 더욱 상세하게 설명된 이러한 보존적 치환은 일반적으로 치환 부위에서 전하 및 소수성을 보존하고, 이에 의해 폴리펩티드의 구조 (및 따라서 기능)를 보존한다. 아미노산 서열에 대한 퍼센트 동일성은 관련 기술분야에서 이해되는 바와 같이 결정될 수 있다. (예를 들어, 미국 특허 번호 7,396,664 참고, 이는 그의 전문이 본원에 참고로 포함됨). 일반적으로 사용되고 자유롭게 입수가능한 서열 비교 알고리즘의 제품군은 국립 생물 정보 센터 (NCBI) 기본 국소 정렬 검색 도구 (BLAST)에 의해 제공되며 (Altschul, S. F. et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403 410), 이는 NCBI (메릴랜드주 베데스다)를 비롯한 몇몇 공급처로부터 그의 웹사이트에서 입수가능하다. BLAST 소프트웨어 제품군은 공지된 아미노산 서열을 다양한 데이터베이스로부터의 다른 아미노산 서열에 대해 정렬하기 위해 이용되는 "blastp"를 비롯한 다양한 서열 분석 프로그램을 포함한다.
퍼센트 동일성은 예를 들어 특정한 서열식별번호 (예를 들어, 임의의 서열식별번호:1-10)에 의해 정의되는 바와 같이 전체 정의된 폴리펩티드 서열의 길이에 걸쳐 측정될 수 있거나, 또는 더 짧은 길이에 걸쳐, 예를 들어 더 긴 정의된 폴리펩티드 서열로부터 취한 단편, 예를 들어 적어도 15, 적어도 20, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 70 또는 적어도 150개의 연속한 잔기의 단편의 길이에 걸쳐 측정될 수 있다. 이러한 길이는 단지 예시적이며, 표, 도면 또는 서열 목록에서 본원에 제시된 서열에 의해 뒷받침되는 임의의 단편 길이를 이용하여, 퍼센트 동일성이 측정될 수 있는 길이를 설명할 수 있음이 이해된다.
특정한 폴리펩티드 서열의 "변이체"는 국립 생물 정보 센터의 웹사이트에서 입수가능한 "BLAST 2 서열" 도구와 함께 blastp를 사용하여 폴리펩티드 서열 중 하나의 특정한 길이에 걸쳐 특정한 폴리펩티드 서열에 대해 적어도 50% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열로서 정의될 수 있다. (Tatiana A. Tatusova, Thomas L. Madden (1999), "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol Lett. 174:247-250 참고). 이러한 한 쌍의 폴리펩티드는 폴리펩티드 중 하나의 특정한 정의된 길이에 걸쳐 예를 들어 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 또는 그 초과의 서열 동일성을 나타낼 수 있다. "변이체"는 기준 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 기능적 활성 (예를 들어, 글리코실라제 활성 또는 다른 활성)을 가질 수 있다. "실질적으로 단리된 또는 정제된" 아미노산 서열이 본원에서 고려된다. 용어 "실질적으로 단리된 또는 정제된"은 그들의 천연 환경으로부터 제거되고, 천연적으로 연관된 다른 성분이 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 75%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 95% 없는 것인 아미노산 서열을 지칭한다. 본원에서 고려되는 변이체 폴리펩티드는 임의의 서열식별번호:1-10)의 변이체 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "번역 주형"은 폴리펩티드 또는 단백질을 합성하기 위해 리보솜에 의해 사용될 수 있는 발현 주형으로부터의 전사의 RNA 생성물을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "반응 혼합물"은 주어진 반응을 수행하기 위해 필요한 시약을 함유하는 용액을 지칭한다. 반응 혼합물이 반응을 수행하기 위해 필요한 모든 시약을 함유하는 경우, 이는 완전한 것으로 지칭된다. 반응 혼합물을 위한 성분은 별도의 컨테이너에서 별도로 보관될 수 있고, 각각의 컨테이너는 전체 성분 중 하나 이상을 함유한다. 성분은 상업화를 위해 별도로 포장될 수 있고, 유용한 상업적인 키트는 반응 혼합물을 위한 반응 성분 중 하나 이상을 함유할 수 있다.
본원에 기재된 방법의 단계는 본원에서 달리 나타내지 않거나 또는 문맥상 명백히 모순되지 않는다면 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 단계는 본원에서 달리 나타내지 않거나 또는 문맥상 명백히 모순되지 않는다면 원하는 목적을 달성하기 위해 임의의 횟수로 반복되거나 또는 되풀이될 수 있다.
본 발명을 수행하기 위해 발명자들에게 공지된 최상의 방식을 비롯하여 본 발명의 바람직한 측면이 본원에 기재된다. 이들 바람직한 측면의 변형은 상기 설명을 읽은 후에 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 자명할 것이다. 본 발명자들은 관련 기술분야의 통상의 기술자가 이러한 변형을 적절하게 이용할 것으로 예상하며, 본 발명자들은 본 발명이 본원에 구체적으로 기재된 것과 다르게 실시되기를 의도한다. 따라서, 본 발명은 적용가능한 법에 의해 허용되는 한 본원에 첨부된 청구항에 인용된 주제의 모든 변형 및 등가물을 포함한다. 더욱이, 본원에서 달리 나타내지 않거나 또는 문맥상 명백히 모순되지 않는다면 모든 가능한 변형의 상기 기재된 성분들의 임의의 조합이 본 발명에 포함된다.
무세포 단백질 합성 (CFPS)
본원에 개시된 균주 및 시스템은 관련 기술분야에 공지된 바와 같이 무세포 단백질 합성 방법에 적용될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 4,496,538; 4,727,136; 5,478,730; 5,556,769; 5,623,057; 5,665,563; 5,679,352; 6,168,931; 6,248,334; 6,531,131; 6,869,774; 6,994,986; 7,118,883; 7,189,528; 7,338,789; 7,387,884; 7,399,610; 8,703,471; 및 8,999,668을 참고한다. 미국 공개 출원 번호 2015-0259757, 2014-0295492, 2014-0255987, 2014-0045267, 2012-0171720, 2008-0138857, 2007-0154983, 2005-0054044, 및 2004-0209321 또한 참고한다. 미국 공개 출원 번호 2005-0170452; 2006-0211085; 2006-0234345; 2006-0252672; 2006-0257399; 2006-0286637; 2007-0026485; 2007-0178551 또한 참고한다. 공개 PCT 국제 출원 번호 2003/056914; 2004/013151; 2004/035605; 2006/102652; 2006/119987; 및 2007/120932 또한 참고한다. [Jewett, M.C., Hong, S.H., Kwon, Y.C., Martin, R.W., and Des Soye, B.J. 2014, "Methods for improved in vitro protein synthesis with proteins containing non standard amino acids," 미국 특허 출원 일련 번호: 62/044,221; Jewett, M.C., Hodgman, C.E., and Gan, R. 2013, "Methods for yeast cell-free protein synthesis," 미국 특허 출원 일련 번호: 61/792,290; Jewett, M.C., J.A. Schoborg, and C.E. Hodgman. 2014, "Substrate Replenishment and Byproduct Removal Improve Yeast Cell-Free Protein Synthesis," 미국 특허 출원 일련 번호: 61/953,275; 및 Jewett, M.C., Anderson, M.J., Stark, J.C., Hodgman, C.E. 2015, "Methods for activating natural energy metabolism for improved yeast cell-free protein synthesis," 미국 특허 출원 일련 번호: 62/098,578] 또한 참고한다. [Guarino, C., & DeLisa, M. P. (2012). A prokaryote-based cell-free translation system that efficiently synthesizes glycoproteins. Glycobiology, 22(5), 596-601] 또한 참고한다. 이들 모든 문헌의 내용은 그들의 전문이 본 출원에 참고로 포함된다.
특정한 예시적인 실시양태에서, 본원에 기재된 하나 이상의 방법은 용기, 예를 들어 단일 용기에서 수행된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "용기"는 (예를 들어, 하나 이상의 전사, 번역 및/또는 글리코실화 단계에서 사용하기 위해) 본원에 기재된 반응물 중 하나 이상을 담기에 적합한 임의의 컨테이너를 지칭한다. 용기의 예에는 미량역가 플레이트, 시험 튜브, 원심분리 튜브, 비커, 플라스크, 다중-웰 플레이트, 큐벳, 유동 시스템, 극세사, 현미경 슬라이드 등이 포함되나 이로 제한되지 않는다.
특정한 예시적인 실시양태에서, 생리학적으로 상용성인 (그러나 반드시 천연은 아닌) 이온 및 완충제, 예를 들어 칼륨 글루타메이트, 염화암모늄 등이 전사, 번역 및/또는 글리코실화를 위해 사용된다. 생리학적 세포질 염 조건은 관련 기술분야의 기술자에게 널리 공지되어 있다.
본원에 개시된 균주 및 시스템은 글리코실화 거대분자 (예를 들어, 글리코실화 펩티드, 글리코실화 단백질, 및 글리코실화 지질)를 제조하기 위해 무세포 단백질 방법에 적용될 수 있다. 개시된 균주 및 시스템을 사용하여 제조될 수 있는 글리코실화 단백질에는 N-연결된 글리코실화 (즉, 아스파라긴 및/또는 아르기닌 측쇄의 질소에 부착된 글리칸) 및/또는 O-연결된 글리코실화 (즉, 세린, 트레오닌, 티로신, 히드록시리신, 및/또는 히드록시프롤린의 히드록실 산소에 부착된 글리칸)를 갖는 단백질이 포함될 수 있다. 글리코실화 지질은 산소 원자를 통해 O-연결된 글리칸, 예컨대 세라미드를 포함할 수 있다.
본원에 개시된 글리코실화 거대분자는 관련 기술분야에 공지된 바와 같이 단량체로 구성된 비분지형 및/또는 분지형 당 쇄, 예컨대 비제한적으로, 글루코스 (예를 들어, β-D-글루코스), 갈락토스 (예를 들어, β-D-갈락토스), 만노스 (예를 들어, β-D-만노스), 푸코스 (예를 들어, α-L-푸코스), N-아세틸-글루코사민 (GlcNAc), N-아세틸-갈락토사민 (GalNAc), 뉴라민산, N-아세틸뉴라민산 (즉, 시알산), 및 크실로스를 포함할 수 있으며, 이들은 각각의 글리코실트랜스퍼라제 (예를 들어, 올리고사카릴트랜스퍼라제, GlcNAc 트랜스퍼라제, GalNAc 트랜스퍼라제, 갈락토실트랜스퍼라제, 및 시알릴트랜스퍼라제)를 통해 글리코실화 거대분자, 성장하는 글리칸 쇄, 또는 공여자 분자 (예를 들어, 공여자 지질 및/또는 공여자 뉴클레오티드)에 부착될 수 있다. 본원에 개시된 글리코실화 거대분자는 관련 기술분야에 공지된 바와 같이 글리칸을 포함할 수 있다.
개시된 무세포 단백질 합성 시스템은 조질의 및/또는 적어도 부분적으로 단리되고/거나 정제된 성분을 이용할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "조질"은 세포를 파괴하고 용해시키고, 기껏해야 파괴되고 용해된 세포로부터 조질 성분을 최소한으로 정제함으로써, 예를 들어 파괴되고 용해된 세포를 원심분리하고, 원심분리 후에 상청액 및/또는 펠렛으로부터 조질 성분을 수집함으로써 수득된 성분을 의미할 수 있다. 용어 "단리된 또는 정제된"은 그들의 천연 환경으로부터 제거되고, 천연적으로 연관된 다른 성분이 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 75%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 95% 없는 것인 성분을 지칭한다.
글리코실화를 위한 성분이 풍부화된 원핵생물 세포 용해물에서 무세포 당단백질 합성 (CFGpS)
무세포 당단백질 합성 (CFGpS)을 수행하는 조성물 및 방법이 개시된다. 일부 실시양태에서, 조성물 및 방법은 글리코실화를 위한 성분이 풍부화되고 원핵생물의 유전적으로 변형된 균주로부터 제조된 원핵생물 세포 용해물을 포함하거나 또는 이용한다.
일부 실시양태에서, 유전적으로 변형된 원핵생물은 CFGpS를 위한 용해물을 제조하는데 적합한 에스케리키아 콜라이 또는 임의의 다른 원핵생물의 유전적으로 변형된 균주이다. 임의적으로, 에스케리키아 콜라이의 변형된 균주는 rEc.C321로부터 유래된다. 바람직하게는, 변형된 균주는 바람직하게는 고수율의 무세포 단백질 합성을 가능하게 하는 용해물을 생성하는 게놈 변형 (예를 들어, 유전자가 작동 불가능하게 만드는 유전자 결실)을 포함한다. 또한, 바람직하게는, 변형된 균주는 바람직하게는 (예를 들어, 게놈 변형을 갖지 않는 균주와 비교하여) 비교적 높은 농도에서 글리코실화를 위한 당 전구체를 포함하는 용해물을 생성하는 게놈 변형 (예를 들어, 유전자가 작동 불가능하게 만드는 유전자 결실)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 균주로부터 제조된 용해물은 변형되지 않은 균주로부터 제조된 용해물에 비해 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200% 또는 그 초과로 더 높은 농도로 당 전구체를 포함한다. 예를 들어, 그러나 비제한적으로, 본 발명의 방법, 키트 및 시스템에서 유용한 박테리아 공급원 균주에는 이. 콜라이의 재조합 균주, 예컨대 prfA, endA, gor, rne 및 lpxM으로부터 선택된 하나 이상의 유전자 생성물이 결핍된 이. 콜라이의 재조합 균주가 포함된다. 개시된 방법, 키트 및 시스템에 적합한 재조합 균주에는 r이. 콜라이 ΔprfA ΔendA Δgor Δrne (705), 이. 콜라이 BL21(DE3), 이. 콜라이 CLM24, 이. 콜라이 CLM24 ΔlpxM, 이. 콜라이 CLM24 ΔlpxM CH-IpxE, 이. 콜라이 CLM24 ΔlpxM CH-IpxE TT-IpxE, 이. 콜라이 CLM24 ΔlpxM CH-IpxE TT-IpxE KL-IpxE, 및 이. 콜라이 CLM24 ΔlpxM CH-IpxE TT-IpxE KL-IpxE KO-IpxE가 포함되나 이로 제한되지 않는다.
일부 실시양태에서, 변형된 균주는 글리코실화에 사용되는 단당류 (예를 들어, 글루코스, 만노스, N-아세틸-글루코사민 (GlcNAc), N-아세틸-갈락토사민 (GalNAc), 갈락토스, 시알산, 뉴라민산, 푸코스)의 농도를 증가시키는 변형을 포함한다. 따라서, 변형은 글리코실화에 사용되는 단당류 또는 다당류를 대사하는 효소를 불활성화시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형은 (예를 들어, 효소를 코딩하는 유전자의 적어도 일부분의 결실을 통해) 데히드라타제 또는 탄소-산소 리아제 효소 (EC 4.2)를 불활성화시킨다. 특히, 변형은 GDP-만노스 4,6-데히드라타제 (EC 4.2.1.47)를 불활성화시킬 수 있다. 변형된 균주가 이. 콜라이인 경우, 변형은 (예를 들어, gmd 유전자의 적어도 일부분의 결실을 통해) gmd 유전자에서 불활성화 변형을 포함할 수 있다. 이. 콜라이 gmd 유전자의 서열은 서열식별번호:1로서 본원에 제공되고, 이. 콜라이 GDP-만노스 4,6-데히드라타제의 아미노산 서열은 서열식별번호:2로서 본원에 제공된다.
일부 실시양태에서, 변형된 균주는 글리코실트랜스퍼라제 경로에서 사용되는 효소를 불활성화시키는 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형은 (예를 들어, 효소를 코딩하는 유전자의 적어도 일부분의 결실을 통해) 올리고당류 리가제 효소를 불활성화시킨다. 특히, 변형은 임의적으로 O-항원을 지질 A 코어 올리고당류에 접합시키는 O-항원 리가제를 불활성화시킬 수 있다. 변형은 (예를 들어, waaL 유전자의 적어도 일부분의 결실을 통해) waaL 유전자에서 불활성화 변형을 포함할 수 있다. 이. 콜라이 waaL 유전자의 서열은 서열식별번호:3으로서 본원에 제공되고, 이. 콜라이 O-항원 리가제의 아미노산 서열은 서열식별번호:4로서 제공된다.
일부 실시양태에서, 변형된 균주는 (예를 들어, 효소를 코딩하는 유전자의 적어도 일부분의 결실을 통해) 데히드라타제 또는 탄소-산소 리아제 효소를 불활성화시키는 변형을 포함하고, 또한 변형된 균주는 (예를 들어, 효소를 코딩하는 유전자의 적어도 일부분의 결실을 통해) 올리고당류 리가제 효소를 불활성화시키는 변형을 포함한다. 변형된 균주는 gmd 및 waaL 둘 다의 불활성화 또는 결실을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 변형된 균주는 하나 이상의 직교(orthogonal) 또는 이종성 유전자를 발현하도록 변형될 수 있다. 특히, 변형된 균주는 당단백질 합성과 관련된 직교 또는 이종성 유전자, 예컨대 지질-연결된 올리고당류 (LLO) 경로에서 수반되는 글리코실트랜스퍼라제 (GT)를 발현하도록 유전적으로 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형된 균주는 직교 또는 이종성 올리고사카릴트랜스퍼라제 (EC 2.4.1.119) (OST)를 발현하도록 변형될 수 있다. 올리고사카릴트랜스퍼라제 또는 OST는 올리고당류를 지질에서 단백질로 전달하는 효소이다.
특히, 변형된 균주는 글리코실화 시스템 (예를 들어, N-연결된 글리코실화 시스템 및/또는 O-연결된 글리코실화 시스템)에서 직교 또는 이종성 유전자를 발현하도록 유전적으로 변형될 수 있다. 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni)의 N-연결된 글리코실화 시스템이 이. 콜라이로 전달되었다. (Wacker et al., "N-linked glycosylation in Campylobacter jejuni and its functional transfer into E. coli," Science 2002, Nov 29; 298(5599):1790-3 참고, 그의 전체 내용이 본원에 참고로 포함됨). 특히, 변형된 균주는 씨. 제주니의 pgl 유전자좌의 1개 이상의 유전자 또는 상동성 pgl 유전자좌의 1개 이상의 유전자를 발현하도록 변형될 수 있다. pgl 유전자좌의 유전자에는 pglG, pglF, pglE, wlaJ, pglD, pglC, pglA, pglB, pglJ, pglI, pglH, pglK, 및 gne가 포함되고, 이를 이용하여 지질-연결된 올리고당류 (LLO)를 합성하고, 올리고사카릴트랜스퍼라제를 통해 LLO의 올리고당류 모이어티를 단백질에 전달한다.
유전적으로 변형된 균주에서 발현될 수 있는 적합한 직교 또는 이종성 올리고사카릴트랜스퍼라제 (OST)에는 캄필로박터 제주니 올리고사카릴트랜스퍼라제 PglB가 포함될 수 있다. 씨. 제주니 OST에 대한 유전자는 pglB로 지칭되고, 그의 서열은 서열식별번호:5로서 제공되고, 씨. 제주니 PglB의 아미노산 서열은 서열식별번호:6으로서 제공된다. PglB는 단백질 상에 존재하는 D/E-Y-N-X-S/T 모티프 (Y, X ≠ P)로 올리고당류의 전달을 촉매한다. 본원에 개시된 방법, 키트 및 시스템에서 유용한 OST 효소의 추가의 비제한적인 예에는 캄필로박터 콜라이(Campylobacter coli) PglB, 캄필로박터 라리(Campylobacter lari) PglB, 데술포비브리오 데술푸리칸스(Desulfovibrio desulfuricans) PglB, 데술포비브리오 기가스(Desulfovibrio gigas) PglB, 및 데술포비브리오 불가리스(Desulfovibrio vulgaris) PglB가 포함될 수 있으나 이로 제한되지 않는다.
조질 세포 용해물은 본원에 개시된 변형된 균주로부터 제조될 수 있다. 조질 세포 용해물은 본원에 개시된 상이한 변형된 균주로부터 제조될 수 있고, 조질 세포 용해물은 조합되어 혼합된 조질 세포 용해물을 제조할 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 조질 세포 용해물은 바람직하게는 (예를 들어, 게놈 변형을 갖지 않는 균주와 비교하여) 비교적 높은 농도에서 글리코실화를 위한 당 전구체를 포함하는 용해물을 생성하는 게놈 변형 (예를 들어, 유전자가 작동 불가능하게 만드는 유전자 결실)을 포함하는 하나 이상의 변형된 균주로부터 제조될 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 조질 세포 용해물은 당단백질 합성과 연관된 하나 이상의 직교 또는 이종성 유전자 또는 유전자 클러스터를 발현하도록 변형된 하나 이상의 변형된 균주로부터 제조될 수 있다. 바람직하게는, 조질 세포 용해물 또는 혼합된 조질 세포 용해물은 글리코실화 성분, 예컨대 지질-연결된 올리고당류 (LLO), 글리코실트랜스퍼라제 (GT), 올리고사카릴트랜스퍼라제 (OST), 또는 이들의 임의의 조합물이 풍부화되어 있다. 더욱 바람직하게는, 조질 세포 용해물 또는 혼합된 조질 세포 용해물은 코어 진핵생물 글리칸을 나타내는 Man3GlcNAc2 LLO 및/또는 완전히 시알릴화된 인간 글리칸을 나타내는 Man3GlcNAc4Gal2Neu5Ac2 LLO가 풍부화되어 있다. 예를 들어, 비제한적인 예로, 개시된 방법, 키트 및 시스템에 유용한 글리칸 구조에는 프란시셀라 툴라렌시스 SchuS4 O-다당류, 에스케리키아 콜라이 O78 O-다당류, 에스케리키아 콜라이 O-7 O-다당류, 에스케리키아 콜라이 O-9 O-다당류 프라이머, 캄필로박터 제주니 칠당류 N-글리칸, 캄필로박터 라리 PglB 육당류 N-글리칸, 조작된 캄필로박터 라리 PglB 육당류 N-글리칸, 월리넬라 숙시노게네스(Wolinella succinogenes) 육당류 N-글리칸, 및 진핵생물 Man3GlcNac2 N-글리칸 구조가 포함될 수 있으나 이로 제한되지 않는다.
개시된 조질 세포 용해물은 다양한 당단백질을 합성하기 위해 무세포 당단백질 합성 (CFGpS) 시스템에서 사용될 수 있다. CFGpS 시스템에서 합성된 당단백질에는 원핵생물 당단백질 및 진핵생물 단백질, 인간 단백질이 포함될 수 있다. CFGpS 시스템은 본원에 개시된 조질 세포 용해물 또는 조질 세포 용해물의 혼합물을 사용하는 하기 단계를 수행함으로써 시험관 내에서 당단백질을 합성하는 방법에서 이용될 수 있다: (a) 표적 당단백질을 위한 유전자의 무세포 전사를 수행하는 단계; (b) 무세포 번역을 수행하는 단계; 및 (c) 무세포 글리코실화를 수행하는 단계. 상기 방법은 단일 용기 또는 다중 용기에서 수행될 수 있다. 바람직하게는, 합성 방법의 단계는 단일 반응 용기를 사용하여 수행될 수 있다. 개시된 방법을 이용하여 다양한 당단백질, 예컨대 원핵생물 당단백질 및 진핵생물 당단백질을 합성할 수 있다.
생체접합체 백신 생성
단백질-글리칸 커플링 기술 (PGCT)이 간단하고 비용 효율적인 생체접합체 백신 생성 전략을 나타내지만, 3 가지 주요 한계가 있다. 첫째, 공정 개발 일정, 글리코실화 경로 설계-구축-시험 (DBT) 사이클, 및 생체접합체 생성은 모두 세포 성장에 의해 제한된다. 둘째, FDA-승인된 담체 단백질, 예컨대 클로스트리디움 테타니 및 코리네박테리움 디프테리아에의 독소가 살아있는 이. 콜라이에서 N-연결된 글리코실화와 상용성인 것으로 아직 입증된 적이 없는지 여부가 아직 확인되지 않았다. 셋째, 선택된 비-고유의 글리칸이 씨. 제주니 올리고사카릴트랜스퍼라제 (OST), PglB에 의해 낮은 효율성으로 전달되는 것으로 공지되어 있다.
생체접합체의 생성을 위한 모듈식의 시험관 내 플랫폼은 이들 모든 한계를 해결하는 잠재성을 갖는다. 여기서, 본 발명자들은 프란시셀라 투알렌시스 및 에스케리키아 콜라이의 병원성 균주에 대한 생체접합체가 단지 20 시간 동안 지속되는 무세포 당단백질 합성 (CFGpS) 반응에서 조정된 시험관 내 전사, 번역 및 N-글리코실화를 통해 생성될 수 있음을 입증한다. 이 시스템은 신규한 항박테리아 백신에 대한 공정 개발 및 분배 일정을 수주에서 수일로 감소시키는 잠재성을 갖는다. 추가로, CFGpS 플랫폼의 모듈식 성질, 및 무세포 시스템이 살아있는 세포와 비교하여 막 단백질의 생성에 대한 이점을 입증하였다는 사실 때문에, 이 방법은 FDA-승인된 담체 단백질, 예컨대 막에 국소화된 클로스트리디움 테타니 및 코리네박테리움 디프테리아에 독소를 사용하여 생체접합체를 생성하기 위해 용이하게 적용될 수 있다. 이는 간단히 이들 담체 단백질을 코딩하는 플라스미드를 CFGpS 반응에 공급함으로써 달성될 수 있다. 추가로, CFGpS의 모듈식 성질 때문에, 시험관 내 접근법을 이용하여, 원형적인 씨. 제주니 OST의 다른 천연 또는 조작된 동족체를 프로토타이핑하여, 관심 O-항원 LLO의 전달을 위해 개선된 효율성을 갖는 후보 OST를 확인할 수 있다. 본 발명자들이 이전에 기재한 바와 같이, 이는 용해물을 관심 OST를 풍부화시키고, 혼합된 용해물 CFGpS 반응에서 이들을 LLO 용해물과 혼합함으로써 달성될 수 있다. (WO 2017/117539 참고, 그의 전체 내용이 본원에 참고로 포함됨). 최종적으로, 본 발명자들은 무세포 생체접합체 합성 반응물이 동결건조될 수 있고, 생체접합체 합성 능력을 유지할 수 있음을 입증하며, 이는 신규한 백신을 위한 주문식, 이동식 및 저비용 생성 또는 개발 노력에 대한 CFGpS 시스템의 잠재성을 입증한다. 시험관 내 생체접합체 백신 생성을 위한 이러한 신규한 방법은 기존 방법과 비교하여 신속한, 모듈식 및 이동식 백신 프로토타이핑 및 생성에 대한 이점을 입증하였다. 본 발명자들의 기술은 치료 개발 또는 기초 연구를 위해 사용자-지정된 박테리아 표적에 대한 생체접합체 백신의 신속한 생성을 가능하게 한다.
본 발명자들은 당단백질 또는 생체접합체 백신을 생성하는 능력을 갖는 임의의 원핵생물 무세포 시스템을 알지 못한다. 무세포 당단백질 생성을 위한 상업적인 진핵생물 세포 용해물 시스템 (프로메가(Promega), 써모피셔(ThermoFisher))이 있지만, 이들 시스템은 직교 글리코실화 기구의 과발현을 수반하지 않고, 본 발명자들의 시스템이 할 수 있는 방식으로 모듈식의 사용자-지정된 글리코실화를 가능하게 하지 않는다. 이러한 이유로, 본 발명자들은 본 발명에 대해 상당한 상업적 가능성이 있다고 생각한다.
본원에 개시된 시험관 내 생체접합체 백신 생성 방법은 기존 방법과 비교하여 신속한, 모듈식 및 이동식 백신 프로토타이핑 및 생성에 대한 이점을 입증하였다. 이 시스템은 기존 생성 접근법의 한계를 해결하여, 항박테리아 백신 생성에 대해 매력적인 대안적 또는 상호보완적 전략이 되게 한다. 항생제-내성 박테리아 감염에 의해 초래되는 의료 문제의 증가에 비추어 볼 때, 이 방법은 다양한 병원성 박테리아 균주에 대한 신규한 백신의 개발, 생성 및 분배에 매우 가치있을 잠재성을 갖는다. 개시된 방법의 이점에는 하기가 포함된다: 생체접합체 백신의 주문식 발현; 신규한 생체접합체 백신 후보의 프로토타이핑; 신규한 생체접합체 백신 생성 경로의 프로토타이핑; 자원이 부족한 환경에 생체접합체 백신의 분배.
요약하면, 본 발명자들은 당단백질 백신의 조정된 무세포 전사, 번역 및 글리코실화를 가능하게 하는 첫번째 원핵생물 무세포 시스템을 개시한다. 개시된 시스템은 20 시간 내에 생체접합체 백신의 생성을 가능하게 한다. 시스템의 모듈성은 다양한 담체 단백질에 의해 신규한 글리코실화 경로 및 백신 후보의 신속한 프로토타이핑을 가능하게 한다. 적합한 담체에는 헤모필루스 인플루엔자에 단백질 D (PD) (서열식별번호: 7), 네이세리아 메닌기티디스 포린 단백질 (PorA) (서열식별번호: 8), 코리네박테리움 디프테리아에 독소 (CRM197) (서열식별번호: 9), 클로스트리디움 테타니 독소 (TT) (서열식별번호: 10), TT의 단편 C (TTc), TT의 경쇄 도메인 (TTlight), 에스케리키아 콜라이 말토스 결합 단백질, MBP와 융합된 인간 글루카곤 펩티드, 슈퍼폴더 녹색 형광 단백질 (GFP), 단일-쇄 가변 항체 단편 (scFv), 인간 에리트로포이에틴 변이체, 캄필로박터 제주니 AcrA, 및 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 외독소 A (EPA), 또는 그의 변이체가 포함될 수 있으나 이로 제한되지 않는다. 시스템의 성분 및 생성물은 동결건조될 수 있고, 이는 백신 생성 기술의 광범위하고 신속한 분배에 대한 잠재성을 가능하게 한다. 개시된 시스템은 원핵생물 세포 용해물에서 생체접합체를 생성하는데 필요한 시간을 수주에서 수일로 감소시키며, 이는 기술의 상업화에서 경쟁 우위를 제공할 수 있다.
개시된 생체접합체는 임의적으로 면역 반응을 유도하고/거나 강화시키기 위한 추가의 작용제, 예컨대 아주반트를 포함할 수 있는 백신으로서 제형화될 수 있다. 용어 "아주반트"는 면역 반응을 증강시키는 화합물 또는 혼합물을 지칭한다. 아주반트는 항원을 천천히 방출시키는 조직 데포로서 및 면역 반응을 비특이적으로 증강시키는 림프계 활성화제로서 작용할 수 있다. 개시된 조성물에서 사용될 수 있는 아주반트의 예에는 공중합체 아주반트 (예를 들어, 플루로닉(Pluronic) L121® 상표 폴록사머 401, CRL1005, 또는 저분자량 공중합체 아주반트, 예컨대 폴리겐(Polygen)® 아주반트), 폴리 (I:C), R-848 (Th1-유사 아주반트), 레스퀴모드, 이미퀴모드, PAM3CYS, 인산알루미늄 (예를 들어, AlPO4), 록소리빈, 잠재적으로 유용한 인간 아주반트, 예컨대 BCG (바실리 칼메트-게랑(Bacille Calmette-Guerin)) 및 코리네박테리움 파르붐(Corynebacterium parvum), CpG 올리고데옥시뉴클레오티드 (ODN), 콜레라 독소 유래된 항원 (예를 들어, CTA1-DD), 지다당류 아주반트, 완전 프로인트(Freund) 아주반트, 불완전 프로인트 아주반트, 사포닌 (예를 들어, Quil-A), 미네랄 겔, 예컨대 수산화알루미늄, 표면 활성 물질, 예컨대 리소렉시틴, 플루로닉 폴리올, 다가 음이온, 펩티드, 물 중 오일 또는 탄화수소 에멀젼 (예를 들어, 노바티스 백신(Novartis Vaccines) 또는 몬타니드(Montanide) ISA 720으로부터 입수가능한 MF59), 키홀 림펫 헤모시아닌, 및 디니트로페놀이 포함되나 이로 제한되지 않는다.
예시적인 실시양태
하기 실시양태는 예시적이며, 청구된 주제의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
실시양태 1. 재조합 단백질 담체의 조정된 전사, 번역 및 N-글리코실화를 수행하여, 생체접합체 면역원 또는 백신으로서 사용될 수 있는 N-글리코실화 재조합 단백질 담체를 제공하는 것을 포함하는, 임의적으로 생체접합체 면역원 또는 백신으로서 사용될 수 있는 N-글리코실화 재조합 단백질 담체를 합성하는 방법이며, 여기서 N-글리코실화 재조합 단백질 담체는 (i) 컨센서스 서열 (임의적으로 단백질 담체에 삽입됨), N - X - S/T (여기서 X는 프롤린을 제외한 임의의 천연 또는 비천연 아미노산일 수 있음); 및 (ii) 재조합 단백질 담체에 N-연결된 적어도 하나의 박테리아로부터 적어도 하나의 항원성 다당류 (적어도 1종의 항원성 다당류는 임의적으로 이. 콜라이 또는 프란시셀라 툴라렌시스 중 하나 이상의 균주로부터 임의적으로 적어도 1종의 박테리아 O-항원을 함유함)를 포함하고; 생체접합체 백신은 임의적으로 아주반트를 포함할 수 있는 것인 방법.
실시양태 2. 실시양태 1에 있어서, 담체 단백질이 이. 콜라이 말토스 결합 단백질 (MBP)의 조작된 변이체인 방법.
실시양태 3. 실시양태 1에 있어서, 담체 단백질이 클로스트리디움 테타니로부터의 독소의 해독된 변이체 및 코리네박테리움 디프테리아에로부터의 독소의 해독된 변이체로부터 선택되는 것인 방법.
실시양태 4. 실시양태 1에 있어서, 담체 단백질이 헤모필루스 인플루엔자에 단백질 D (PD) 및 네이세리아 메닌기티디스 포린 단백질 (PorA), 및 그의 변이체로부터 선택되는 것인 방법.
실시양태 5. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 씨. 제주니 PglB의 천연 발생 박테리아 동족체인 올리고사카릴트랜스퍼라제 (OST)를 사용하는 방법.
실시양태 6. 실시양태 1-4 중 어느 하나에 있어서, 씨. 제주니 PglB의 조작된 변이체인 OST를 사용하는 방법.
실시양태 7. 실시양태 1-4 중 어느 하나에 있어서, 천연 발생 고세균 OST인 OST를 사용하는 방법.
실시양태 8. 실시양태 1-4 중 어느 하나에 있어서, 천연 발생 단일-하위단위 진핵생물 OST인 OST, 예컨대 트리파노소마 브루세이이(Trypanosoma bruceii)에서 발견되는 것들을 사용하는 방법.
실시양태 9. 직교 유전자 또는 유전자 클러스터가 조질 세포 용해물에 대한 공급원 균주에서 발현되는 것인 조질 세포 용해물 제조 방법이며, 이는 글리코실화 성분 (지질-연결된 올리고당류 (LLO), 올리고사카릴트랜스퍼라제 (OST), 및/또는 LLO 및 OST 둘 다)이 풍부화된 용해물을 생성하고, 임의적으로 LLO (예를 들어, O-항원과 연관된 LLO)가 풍부화된 별도의 용해물 및 OST (예를 들어, LLO가 기질임)가 풍부화된 별도의 용해물을 생성하고, 임의적으로 별도의 용해물을 조합하여 OST 효소 활성을 통해 LLO의 글리칸 성분으로 글리코실화된 담체 단백질의 무세포 단백질 합성을 수행하고, 추가로 임의적으로 글리코실화 담체 단백질을 정제하고, 임의적으로 면역원으로서 글리코실화 담체 단백질을 투여하는 것인 방법.
실시양태 10. 실시양태 9에 있어서, 공급원 균주가 올리고사카릴트랜스퍼라제 (OST)를 코딩하는 유전자를 과발현하는 것인 방법.
실시양태 11. 실시양태 9 또는 10에 있어서, 공급원 균주가 합성 글리코실트랜스퍼라제 경로를 과발현하여, O-항원, 임의적으로 에프. 툴라렌시스 Schu S4 지질-연결된 올리고당류 (FtLLO)로부터의 O-항원을 생성하는 것인 방법.
실시양태 12. 실시양태 9 또는 10에 있어서, 공급원 균주가 합성 글리코실트랜스퍼라제 경로를 과발현하여, O-항원, 임의적으로 장독소생성 이. 콜라이 O78 지질-연결된 올리고당류 (EcO78LLO)로부터의 O-항원을 생성하는 것인 방법.
실시양태 13. 실시양태 9-12 중 어느 하나에 있어서, 공급원 균주가 글리코실트랜스퍼라제 경로 및 OST를 과발현하여, LLO 및 OST를 생성하는 것인 방법.
실시양태 14. 실시양태 9 또는 10에 있어서, 공급원 균주가 병원성 박테리아 균주로부터 O-항원 글리코실트랜스퍼라제 경로를 과발현하여, O-항원 지질-연결된 올리고당류 (LLO)를 생성하는 것인 방법.
실시양태 15. 하나 이상의 단계로서 조질 세포 용해물 (예를 들어, 실시양태 9-14의 임의의 조질 세포 용해물)을 혼합하는 것을 수반하는 생체접합체 면역원 또는 백신의 무세포 생성 방법.
실시양태 16. 실시양태 15에 있어서, 생체접합체 면역원 또는 백신이 단백질 또는 펩티드인 면역원성 담체를 포함하는 것인 방법.
실시양태 17. 실시양태 15에 있어서, 생체접합체 면역원 또는 백신이 헤모필루스 인플루엔자에 단백질 D (PD), 네이세리아 메닌기티디스 포린 단백질 (PorA), 코리네박테리움 디프테리아에 독소 (CRM197), 클로스트리디움 테타니 독소 (TT), 및 에스케리키아 콜라이 말토스 결합 단백질, 및 그의 변이체로부터 선택된 단백질 또는 그의 펩티드를 포함하는 단백질 또는 펩티드인 면역원성 담체를 포함하는 것인 방법.
실시양태 18. 실시양태 1-17 중 어느 하나에 있어서, 방법의 성분이 동결건조될 수 있고, 재수화시 생체접합체 합성 능력을 보유하는 것인 방법.
실시양태 19. 실시양태 15-18 중 어느 하나에 있어서, 목적이 주문식 백신 생성인 방법.
실시양태 20. 실시양태 15-19 중 어느 하나에 있어서, 목적이 자원이 제한된 환경에서 백신 생성인 방법.
실시양태 21. 하기 성분 중 하나 이상을 포함하는, 시험관 내에서 N-글리코실화 담체 단백질을 합성하기 위한 키트: (i) 직교 올리고사카릴트랜스퍼라제 (OST)를 포함하는 세포 용해물을 포함하는 제1 성분; (ii) O-항원을 포함하는 세포 용해물을 포함하는 제2 성분 (예를 들어, O-항원을 포함하는 지질-연결된 올리고당류 (LLO)); (iii) 담체 단백질을 코딩하는 전사 주형으로부터 mRNA를 합성하기 위해 전사 주형 및 임의적으로 폴리머라제를 포함하는 제3 성분 - 여기서, 담체 단백질은 삽입된 및/또는 천연 발생 컨센서스 서열, N - X - S/T를 포함하고, X는 프롤린을 제외한 임의의 천연 또는 비천연 아미노산일 수 있다.
실시양태 22. 실시양태 21에 있어서, 제1 성분, 제2 성분 및 제3 성분 중 하나 이상이 동결건조되고, 재수화시 생물학적 활성을 보유하는 것인 키트.
실시양태 23. 실시양태 21 또는 22에 있어서, 제1 성분 세포 용해물이 직교 OST를 코딩하는 유전자 (예를 들어 씨. 제주니 PglB)를 과발현하는 공급원 균주 (예를 들어, 이. 콜라이)로부터 생성되는 것인 키트.
실시양태 24. 실시양태 21-23 중 어느 하나에 있어서, 제2 성분 세포 용해물이 합성 글리코실트랜스퍼라제 경로를 과발현하는 공급원 균주 (예를 들어, 프란시셀라 툴라렌시스 Schu S4 O-항원 (FtLLO 용해물)을 생성하기 위한 생합성 기구 또는 장독소생성 이. 콜라이 O78 지질-연결된 올리고당류 (EcO78LLO 용해물)를 생성하기 위한 생합성 기구)로부터 생성되는 것인 키트.
실시양태 25. (a) 직교 올리고사카릴트랜스퍼라제 (OST)를 포함하는 제1 세포 용해물 및 O-항원을 포함하는 제2 세포 용해물 (예를 들어, 지질-연결된 올리고당류 (LLO)로서)을 혼합하여, 무세포 단백질 합성 반응을 준비하고; (b) 무세포 단백질 합성 반응에서 담체 단백질을 전사 및 번역하고 (예를 들어, 임의적으로 담체 단백질을 위한 전사 주형 및/또는 폴리머라제를 무세포 단백질 합성 반응에 첨가함으로써); (c) 무세포 단백질 합성 반응에서 담체 단백질을 박테리아 O-항원에 의해 글리코실화시키는 것을 포함하는, 임의적으로 생체접합체 면역원 또는 백신으로서 사용하기에 적합한 생체접합체일 수 있는 당단백질의 무세포 생성 방법이며, 여기서 담체 단백질은 삽입된 및/또는 천연 발생 컨센서스 서열, N - X - S/T를 포함하고, X는 프롤린을 제외한 임의의 천연 또는 비천연 아미노산일 수 있는 것인 방법.
실시양태 25. 실시양태 24에 있어서, 제2 세포 용해물이 지질-연결된 올리고당류 (LLO)의 일부로서 O-항원을 포함하는 것인 방법.
실시양태 26. 실시양태 24 또는 25에 있어서, 임의적으로 아주반트를 포함하는 백신 조성물로서 당단백질을 제형화하는 것을 추가로 포함하는 방법.
실시양태 27. 상기 임의의 방법 및/또는 키트에 의해 제조되는 생체접합체 면역원 또는 백신.
실시양태 28. 실시양태 27의 백신을 그를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 백신접종 방법.
실시예
하기 실시예는 예시적이며, 청구된 주제의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
실시예 1 - 원핵생물 세포 용해물에서 N-글리코실화 단백질의 재조합 생성을 통해 생체접합체 백신의 신속한 시험관 내 합성 방법
초록
접합체 백신은 생명을 위협하는 박테리아 감염의 예방을 위한 가장 안전하고 가장 효과적인 방법 중 하나이다 [1-10]. 생체접합체 백신은 단백질 글리칸 커플링 기술 (PGCT)을 통해 생성되는 유형의 접합체 백신이며, 다당류 항원은 살아있는 에스케리키아 콜라이 세포에서 박테리아 올리고사카릴트랜스퍼라제 (OST)를 사용하여 N-글리코실화를 통해 재조합 담체 단백질에 접합된다 [11]. 생체접합체 백신은 항박테리아 백신을 생성하는데 필요한 시간 및 비용을 크게 감소시키는 잠재성을 갖는다. 그러나, PGCT는 i) 생체 내 공정 개발 일정의 길이; 및 ii) FDA-승인된 담체 단백질, 예컨대 클로스트리디움 테타니 및 코리네박테리움 디프테리아에로부터의 독소가 살아있는 이. 콜라이에서 N-연결된 글리코실화와 상용성인 것으로 아직 입증되지 않았다는 사실에 의해 제한된다. 여기서, 본 발명자들은 20 시간 동안 지속되는 반응에서 에스케리키아 콜라이 및 프란시셀라 툴라렌시스의 병원성 균주에 대한 생체접합체 백신의 신속한 시험관 내 생성을 가능하게 하기 위해 무세포 당단백질 합성 (CFGpS) 기술을 적용하였다. CFGpS 시스템의 모듈식 성질로 인해, 이 무세포 전략은 표면 항원 유전자 클러스터가 공지되어 있는 병원성 박테리아에 대한 FDA-승인된 담체 단백질 또는 추가의 백신을 사용하여 생체접합체를 생성하기 위해 용이하게 적용될 수 있다 [11] [9] [7, 10] [3, 5, 6, 8]. 본 발명자들은 이 시스템이 동결건조될 수 있고, 생체접합체 합성 능력을 보유할 수 있음을 추가로 보여주며, 이는 자원이 부족한 환경에서 주문식 백신 생성 및 개발에 대한 잠재성을 입증한다. 이 작업은 이. 콜라이 용해물에서 생체접합체 백신 생성의 첫번째 입증을 나타내며, 항박테리아 백신 후보에 대한 이동식 프로토타이핑 또는 생성 플랫폼으로서 유망한 적용을 갖는다.
배경 및 의의
글리코실화, 또는 단백질에의 글리칸 (당)의 부착은 천연에서 가장 풍부한 번역후 변형이며, 단백질 폴딩 및 활성에서 중추적인 역할을 한다 [1-4]. 1930 년대에 처음 발견되었을 때 [12], 글리코실화는 진핵생물에만 있는 것으로 생각되었다. 그러나, 당단백질은 1970 년대에 고세균에서 [13, 14], 1990 년대 후반 및 2000 년대 초반에 박테리아에서도 [15, 16] 발견되었고, 이는 생애 모든 영역에서 중심적인 번역후 변형으로서 글리코실화를 확립하였다. 선형 및 고분지형 다당류 쇄 둘 다를 비롯하여 다양한 글리칸 구조가 기재되었고 [17], 이는 다른 폴리펩티드 변형과 비교하여 기하급수적으로 증가된 정보량을 발생시켰다 [18].
단백질 구조 및 정보 저장에서 그의 역할의 결과로서, 글리코실화는 다양한 생물학적 과정에 관여한다. 진핵생물에서, 당단백질은 면역 인식 및 반응, 세포내 수송, 및 세포간 신호전달에 관여한다 [19-22]. 추가로, 글리코실화에서의 변화는 암 [23-25], 염증 [26-29], 및 알츠하이머(Alzheimer) 질환 [30]을 비롯한 질환 상태와 상관관계가 있는 것으로 나타났다. 원핵생물에서, 글리코실화는 병독성 및 숙주 침입에서 중요한 역할을 하는 것으로 공지되어 있다 [31-33]. 수많은 생물학적 과정에서 글리코실화의 중요한 역할을 기반으로 하여, 생물학의 중심 신조가 중심 성분으로서 글리칸을 포함하도록 조정되어야 한다고 제안되었다 [34].
가장 통상적인 형태의 글리코실화는 아스파라긴 연결된 (N-연결된) 및 세린 (Ser) 또는 트레오닌 (Thr) 연결된 (O-연결된) 것이다 [35]. N-연결된 글리코실화는 컨센서스 서열 Asn-X-Ser/Thr (여기서, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임)을 인식하는 올리고사카릴트랜스퍼라제 (OST)에 의한 아스파라긴 (Asn) 잔기의 측쇄 질소에의 글리칸 모이어티의 부가를 특징으로 한다 [36, 37]. 이 과정은 소포체에서 발생하고, 단백질 폴딩, 품질 제어, 및 수송에 도움이 된다 [38]. O-연결된 글리코실화는 N-글리칸의 부착 후에 골지체에서 발생한다. N-연결된 글리코실화와는 달리, O-연결된 글리코실화에 대해 공지된 컨센서스 서열이 없다 [39, 40]. 생물학에서 글리칸의 중요성에도 불구하고, 당과학은 연구되지 않은 분야로서 최근에 확인되었다. 2012 미국 국립 아카데미의 국립 연구 위원회 (2012 National Research Council of the U.S. National Academies) 보고는 당과학에서 변혁적 진보에 대한 중요한 요구를 강조하였다 [41]. 박테리아에서 글리코실화 경로의 발견은 이러한 중요한 번역후 변형에 대한 새로운 발견을 가능하게 하지만 [42, 43], 해당 분야를 진보시키기 위해서는 새로운 합성 및 분석 도구가 필요하다.
박테리아 글리코실화의 최근의 발견 이래로, N- 및 O-연결된 글리칸을 함유하는 단백질이 수많은 박테리아에서 발견되었다 [44, 45]. 가장 잘 연구된 박테리아 글리코실화 시스템은 캄필로박터 제주니로부터의 pgl 경로이며, 이는 에스케리키아 콜라이에서 기능적으로 발현하는 것으로 나타났다 (도 1) [46]. 씨. 제주니에서, 단백질은 1.406 kDa GlcGalNAc5Bac 칠당류 (Glc: 글루코스, GalNAc: N-아세틸갈락토사민, Bac: 바실로사민)에 의해 N-글리코실화된다. GT는 지질 앵커 운데카프레놀 피로포스페이트 (Und-PP) 상으로 칠당류를 조립하고, 이어서 이는 N-연결된 글리코실화를 위해 OST (PglB)에 대한 기질로서 사용된다 [47-49]. 이 경로는 진핵생물 글리코실화 경로에 비해 훨씬 간단하며, N-연결된 글리코실화의 메카니즘의 본 발명자들의 이해를 높이는데 활용되었다 [42, 43].
모든 박테리아가 당단백질을 합성하는 것은 아니지만, 글리코실화는 종종 박테리아 세포 벽의 합성에 관여한다. 지다당류 (LPS) 분자는 여러 그람-음성 박테리아의 외막의 주요 성분이며, 지질 앵커, 올리고당류 코어, 및 O-항원으로 공지된 가변 다당류 영역으로 구성된다 [32]. 캡슐형 다당류 (CPS)는 이 경우에 다당류 영역이 지질 A 또는 포스포지질 앵커에 직접적으로 연결되어 있다는 점을 제외하고는 LPS와 구조가 유사한 또 다른 유형의 표면 다당류이다 [31]. LPS O-항원 (O-PS) 및 CPS는 적대적인 숙주 환경에서 및 숙주 침입에 대해 생존을 위해 박테리아 병원체에서 사용되는 주요 도구 중 하나이다 [50-53]. 결과적으로, CPS 및 O-PS 생합성 메카니즘의 해명은 항생제 및 항박테리아 백신 개발을 위해 관심이 있다.
항생제-내성 박테리아 균주의 증가는 생명을 위협하는 박테리아 감염의 치료 및 예방을 위한 신규한 전략의 개발을 필요로 한다. 2013 년도에, 질병 통제 예방 센터(Center for Disease Control and Prevention)는 미국의 가장 심각한 건강 위협 중 하나로 항생제 내성을 인용하는 보고를 발표하였다. 담체 단백질에 공유 연결된 CPS 또는 O-PS 항원으로 이루어진 접합체 백신은 박테리아 감염에 대한 가장 안전하고 가장 효과적인 예방책 중 하나이며, 스트렙토코쿠스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae), 네이세리아 메닌기티데스(Neisseria meningitides), 및 헤모필루스 인플루엔자 감염의 발병률을 감소시키기 위해 사용되었다 [1-10]. 다당류 항원이 나이브(naive) T 세포를 직접적으로 활성화시킬 수 없기 때문에, 이들은 장기 지속 면역학적 기억을 유도하기 위해 담체 단백질에 접합되어야 한다 [54]. 그러나, 접합체 백신을 생성하기 위한 기존 기술은 복잡하며, 여러 가공 및 정제 단계를 수반하고, 생성된 생성물은 불분명하다 (도 2, 상단) [2]. 추가로, 이들 공정은 시간 소모적이고, 병원성 박테리아의 대규모 발효를 필요로 할 수 있어서, 개발도상국에서는 접합체 백신이 백신접종 캠페인에서 엄청나게 고가이게 만든다.
살아있는 이. 콜라이 세포에서 재조합 O 항원-단백질 접합체의 생성은 박테리아 N-글리코실화 기구를 사용하여 최근에 달성되었다 (도 2, 하단) [11]. 이들 소위 생체접합체 백신은 항박테리아 백신 생성에 필요한 비용 및 시간을 감소시키는 잠재성을 갖는다. 생체접합체는 프란시셀라 툴라렌시스 [4], 슈도모나스 아에루기노사 [11], 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica) [9], 쉬겔라 딘센테리아에(Shigella dynsenteriae) [7, 10], 쉬겔라 플렉스네리(Shigella flexneri) [8], 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) [5], 브루셀라 아보르투스(Brucella abortus) [3], 및 부르크홀데리아 슈도말레이(Burkholderia pseudomallei) [6]를 비롯한 몇몇 박테리아 표적에 대해 개발되었다. 시험관 내 생체접합체 생성 방법은 신규한 항박테리아 백신에 대한 공정 개발 일정을 수개월에서 수주로 단축시킬 수 있었다 [55].
무세포 단백질 합성 (CFPS)은 조질 세포 용해물에서 단백질의 생성을 가능하게 하는 새로운 분야이다 [55, 56]. CFPS 기술은 50 여년 전에 유전자 코드를 판독하기 위해 니렌버그(Nirenberg) 및 마테이(Matthaei)에 의해 처음으로 사용되었다 [57]. 1960 년대 후반 및 1970 년대 초반에, CFPS를 사용하여 이. 콜라이 락토스 [58] 및 트립토판 [59] 오페론의 조절 메카니즘을 해명하는데 도움이 되었다. 지난 20 년 동안, CFPS 플랫폼은 재조합 단백질 발현 기술에 대한 증가하는 요구를 충족시키기 위해 개발이 급증하였다 [55].
CFPS는 재조합 단백질 발현에 대해 몇몇 이점을 제공한다. 특히, 개방된 반응 환경은 단백질 합성을 위한 기질의 추가 및 제거, 뿐만 아니라 정확한 온라인 반응 모니터링을 가능하게 한다. 추가로, CFPS 반응 환경은 관심 단백질 생성물의 생성을 위해 전적으로 지향되고 최적화될 수 있다. CFPS는 공학자의 목표 (단백질 과발현 및 간단한 생성물 정제)로부터 세포의 목적 (성장 및 번식)을 효과적으로 분리시키며, 이는 막 단백질 [60-63], 이중특이적인 항체 [64], 항체-약물 접합체 [65], 및 바이러스-유사 입자 백신 [66-68]을 비롯하여 복잡한 단백질 및 단백질 어셈블리의 생성에 유리한 것으로 입증되었다. 전반적으로, CFPS 기술은 단백질 합성 일정을 단축시키고, 생체 내 접근법과 비교하여 기질의 추가 또는 제거에 대한 융통성을 증가시킨다. 이. 콜라이 CFPS 시스템은 특히 i) 그의 높은 배치 수율 (2.3 g/L 이하의 녹색 형광 단백질 (GFP)이 보고됨 [69]), ii) 저렴한 필수 기질 [70-72], 및 iii) 106 L가 넘는 반응 부피로 선형 확장하는 능력 [73] 때문에 널리 채택되었다.
글리코실화는 ICE, CHO 추출물, 및 인간 백혈병 세포주 추출물을 비롯한 일부 진핵생물 CFPS 시스템에서 가능하다 [74-77]. 그러나, 이들 플랫폼은 글리코실화를 수행하기 위해 내인성 기구를 이용하며, 이는 i) 가능한 글리칸 구조가 숙주 세포에 의해 천연적으로 합성되는 것들로 제한되고, ii) 글리코실화 과정이 "블랙 박스"에서 수행되어, 조작하거나 또는 제어하기가 어렵다는 것을 의미한다. 고도로 활성인 이. 콜라이 CFPS 플랫폼의 개발은 직교 글리코실화 성분의 첨가를 통해 이. 콜라이 용해물에서 당단백질 생성을 가능하게 하기 위한 최근의 노력을 촉진시켰다. 한 연구에서, 과리노(Guarino) 및 델리사(DeLisa)는 정제된 지질-연결된 올리고당류 (LLO) 및 씨. 제주니 OST를 CFPS 반응에 첨가함으로써 이. 콜라이 CFPS에서 당단백질을 생성하는 능력을 입증하였다. 50-100 μg/mL의 AcrA, 씨. 제주니 당단백질의 수율이 달성되었다 [78]. 이들 최근의 진보에도 불구하고, 박테리아 무세포 글리코실화 시스템은 효율적인 단백질 합성 및 글리코실화를 공동 활성화시킬 수 없기 때문에 제한되었다. 본 발명자들은 최근에 글리코실화 효소가 선택적으로 풍부화된 이. 콜라이 용해물에서 단백질의 모듈식의 조정된 전사, 번역 및 N-글리코실화를 가능하게 함으로써 이러한 한계를 해결하는 무세포 당단백질 합성 (CFGpS) 시스템을 개발하였다 (WO 2017/117539 참고, 그의 전체 내용이 본원에 참고로 포함됨). 여기서, 본 발명자들은 이 기술 플랫폼을 생체접합체 백신의 생성에 적용하여 생체접합체의 신속한 모듈식 시험관 내 발현을 위한 방법론을 수득하였다.
결과 및 논의
생체접합체 백신 생성을 위한 무세포 당단백질 합성 (CFGpS). 단백질-글리칸 커플링 기술 (PGCT)이 생체접합체 백신 생성을 위한 간단하고 비용 효율적인 전략을 나타내지만, 3 가지 주요 한계가 있다. 첫째, 공정 개발 일정, 글리코실화 경로 설계-구축-시험 (DBT) 사이클, 및 생체접합체 생성은 모두 세포 성장에 의해 제한된다. 둘째, FDA-승인된 담체 단백질, 예컨대 클로스트리디움 테타니 및 코리네박테리움 디프테리아에의 독소가 살아있는 이. 콜라이에서 N-연결된 글리코실화와 상용성인 것으로 아직 입증된 적이 없는지 여부가 아직 확인되지 않았다. 셋째, 선택된 비-고유의 글리칸이 씨. 제주니 OST, PglB에 의해 낮은 효율성으로 전달되는 것으로 공지되어 있다 [9].
생체접합체의 생성을 위한 모듈식의 시험관 내 플랫폼은 이들 모든 한계를 해결하는 잠재성을 갖는다. 여기서, 본 발명자들은 프란시셀라 투알렌시스 및 에스케리키아 콜라이의 병원성 균주에 대한 생체접합체가 단지 20 시간 동안 지속되는 무세포 당단백질 합성 (CFGpS) 반응에서 조정된 시험관 내 전사, 번역 및 N-글리코실화를 통해 생성될 수 있음을 입증한다. 이 시스템은 신규한 항박테리아 백신에 대한 공정 개발 및 분배 일정을 수주에서 수일로 감소시키는 잠재성을 갖는다. 추가로, CFGpS 플랫폼의 모듈식 성질, 및 무세포 시스템이 살아있는 세포와 비교하여 막 단백질의 생성에 대한 이점을 입증하였다는 사실 때문에 [60-63], 이 방법은 FDA-승인된 담체 단백질, 예컨대 막에 국소화된 클로스트리디움 테타니 및 코리네박테리움 디프테리아에 독소를 사용하여 생체접합체를 생성하기 위해 용이하게 적용될 수 있다. 이는 간단히 이들 담체 단백질을 코딩하는 플라스미드를 CFGpS 반응에 공급함으로써 달성될 수 있다. 추가로, CFGpS의 모듈식 성질 때문에, 시험관 내 접근법을 이용하여, 최근에 기재된 것들과 같이 원형적인 씨. 제주니 OST의 다른 천연 또는 조작된 동족체를 프로토타이핑하여 [9, 79, 80], 관심 O-항원 LLO의 전달을 위해 개선된 효율성으로 후보 OST를 확인할 수 있다. 본 발명자들이 이전에 기재한 바와 같이, 이는 용해물을 관심 OST를 풍부화시키고, 혼합된 용해물 CFGpS 반응에서 이들을 LLO 용해물과 혼합함으로써 달성될 수 있다 (쥬엣 랩(Jewett lab), 비공개 데이터; 미국 가특허 출원 62273124). 최종적으로, 본 발명자들은 무세포 생체접합체 합성 반응물이 동결건조될 수 있고, 생체접합체 합성 능력을 유지할 수 있음을 입증하고, 이는 신규한 백신을 위한 주문식, 이동식 및 저비용 생성 또는 개발 노력에 대한 CFGpS 시스템의 잠재성을 입증한다. 시험관 내 생체접합체 백신 생성을 위한 이러한 신규한 방법은 기존 방법과 비교하여 신속한, 모듈식 및 이동식 백신 프로토타이핑 및 생성에 대한 이점을 입정하였다.
에프. 툴라렌시스에 대한 생체접합체 백신을 CFGpS를 통해 시험관 내에서 합성할 수 있다. 프란시셀라 툴라렌시스는 야토병을 일으키는 그람-음성 박테리아이다. 에프. 툴라렌시스는 인간에게 공지된 가장 감염성이 높은 박테리아 중 하나로 고려되고: 단일 흡입 바실루스는 개체의 40-50%에서 감염을 일으키고, 사망률이 30%까지이다 [81]. O-항원 생합성을 위한 유전자 유전자좌는 최근에 특징분석되었고 [82], 살아있는 이. 콜라이 세포에서 생체접합체 백신을 생성하기 위해 사용되었다 [4]. 본 발명자들은 CFGpS를 이용하여 항-에프. 툴라렌시스 생체접합체 백신을 생성하기 위해 이 경로를 이용하기로 결정하였다. 본 발명자들은 항-에프. 툴라렌시스 생체접합체 백신이 시험관 내에서 CFGpS 기술을 이용하여 합성될 수 있다고 가정하였다 (도 3).
본 발명자들은 Und-PP-연결된 다당류 항원이 WaaL O-항원 리가제가 결여된 이. 콜라이 CFGpS 샤시 균주에서 직교 글리코실화 기구의 과발현을 통해 S30 용해물에서 풍부화될 수 있다고 가정하였다. 이 가설을 시험하기 위해, 본 발명자들은 씨. 제주니 OST, PglB (CjOST 용해물) 및 프란시셀라 툴라렌시스 Schu S4 O 항원을 생성하기 위한 생합성 기구 (FtLLO 용해물)를 과발현하는 CLM24 세포로부터 용해물을 생성하였다. 에프. 툴라렌시스 Schu S4로부터의 이 17 kb 유전자 클러스터는 15개의 예측된 오픈 리딩 프레임 (ORF)을 함유하고, 반복 단위 GalNAcAN2QuiNAcQui4NFm (GalNAcAN: 2-아세트아미도-2-데옥시-D-갈락투론아미드, QuiNAc: 2-아세트아미도-2,6-디데옥시-D-글루코스, Qui4NFm: 4,6-디데옥시-4-포름아미도-D-글루코스)로 구성된 올리고당류를 생성한다 (도 6A) [82]. 용해물을 고압 균질화를 통해 제조하여, 막-결합된 성분, 예컨대 FtLLO 및 CjOST를 조질 용해물로 운반하는 가용성의 역전된 막 소포의 형성을 촉진시킨다.
본 발명자들은 항-에프. 툴라렌시스 생체접합체 백신이 시험관 내에서 CFGpS 기술을 이용하여 합성될 수 있다고 가정하였다. 에프. 툴라렌시스 O 다당류 (FtO-PS)를 보유하는 생체접합체를 생성하기 위해, 30℃에서 20 시간 동안 지속되는 CFGpS 반응에서 CjPglB 용해물을 FtLLO 용해물과 혼합하였다. 이들 반응은 i) 잔기 T216에서 삽입된 가요성 링커에서 DQNAT 시퀀 및 C-말단 His 태그를 포함하도록 조작된 슈퍼-폴더 녹색 형광 단백질 (sfGFP-21-DQNAT-6xHis) 또는 ii) DQNAT 시퀀의 4개의 C-말단 반복부 및 C-말단 His 태그를 갖는 조작된 말토스 결합 단백질 구축물 (MBP-4xDQNAT-6xHis)을 코딩하는 플라스미드를 함유하였다. MBP-4xDQNAT-6xHis에 접합된 이. 콜라이 O-항원으로 구성된 생체접합체는 마우스에서 체액성 및 세포성 면역을 유도하는 것으로 최근에 확인되었다 [83]. CFGpS 반응의 처음 1 시간 내에, 반응 혼합물이 25mM MnCl2, 0.1% w/v DDM의 최종 농도에서 염화망가니즈 (MnCl2) 및 n-도데실-β-D-말토피라노시드 (DDM) 세제에 의해 스파이킹되어 CjPglB 활성을 최적화하였다 (쥬엣 랩, 비공개 데이터). CFGpS 반응을 30℃에서 총 20 시간 동안 진행시킨 후에, 글리코실화 활성을 항-His 항체 및 FtO-PS에 대해 특이적인 상업적인 모노클로날 항체로 이뮤노블롯팅하여 검정하였다. FtLLO 및 CjPglB 용해물을 혼합할 때 관찰된 래더-유사 패턴은 FtLLO 부착의 지표이며, Wzy 폴리머라제의 작용을 통해 O-PS 쇄 길이 가변성으로 인한 것이다 (도 4A) [4, 11]. 이들 결과는 조정된 무세포 담체 단백질 합성 및 O-항원 부착의 통합을 최초로 입증한다. 추가로, 본 발명자들은 무세포 생체접합체 합성이 단지 20 시간 내에 발생하여, 이러한 무세포 플랫폼이 생체접합체 백신 후보의 신속한 생성 및 프로토타이핑에 대한 매력적인 옵션이 되게 한다는 것을 보여준다.
이. 콜라이 O78 및 다른 병원성 균주에 대한 생체접합체 백신은 CFGpS 플랫폼의 모듈식 성질로 인해 용이하게 합성될 수 있다. 생체접합체 생성을 위한 CFGpS 접근법의 일반성 및 모듈성을 입증하기 위해, 본 발명자들은 추가의 병원성 박테리아에 대한 생체접합체를 생성하고자 하였다. 본 발명자들은 장독소생성 이. 콜라이 균주 O78에 대한 생체접합체를 합성하기로 결정하였으며, 이는 그의 생합성 경로가 이전에 기재되었고 [84], 이 균주에 대해 특이적인 상업적인 항혈청이 존재하기 때문이다. 이. 콜라이 O78 유전자 클러스터를 클로닝하였고, 플라스미드 pMW07-O78에 코딩한다. 이. 콜라이 O78 유전자 클러스터의 발현은 반복 단위 GlcNAc2Man2 (GlcNAC: N-아세틸글루코사민; Man: 만노스)를 갖는 O-항원을 생성시켰다 (도 6B).
본 발명자들은 상기 기재된 동일한 방법을 이용하여 pMW07-O78을 발현하는 CLM24 세포로부터 이. 콜라이 O78 항원 LLO가 풍부화된 용해물 (EcO78LLO 용해물)을 제조하였다. 이어서, 본 발명자들은 sfGFP21-DQNAT-6xHis 또는 MBP-4xDQNAT-6xHis를 코딩하는 플라스미드를 함유하는 CFGpS 반응에서 EcO78LLO 용해물을 CjOST 용해물과 혼합하였다. CFGpS 반응을 상기 기재된 바와 같이 작동시켰다. 글리코실화 활성을 항-His 항체 및 이. 콜라이 O78 균주에 대한 상업적인 항혈청에 의해 이뮤노블롯팅을 통해 검정하였다. 다시, EcO78LLO 용해물 및 CjOST 용해물 둘 다 반응에 존재할 때 래더-유사 패턴이 관찰되었고, 이는 EcO78-PS의 성공적인 접합을 나타낸다 (도 4B). 생체접합체는 또한 항-EcO78 혈청과 교차 반응하였다 (데이터는 도시되지 않음). 이들 결과는 시험관 내 접근법의 모듈식 성질을 입증하고, CFGpS 플랫폼을 이용하여 여러 상이한 병원성 박테리아 균주를 표적화하는 생체접합체 백신을 생성할 수 있다는 증거를 제공한다. 매력적인 후보에는 표면 항원 유전자 클러스터가 공지된 병원성 박테리아, 예컨대 슈도모나스 아에루기노사 [11], 살모넬라 엔테리카 [9], 쉬겔라 딘센테리아에 [7, 10], 쉬겔라 플렉스네리 [8], 스타필로코쿠스 아우레우스 [5], 브루셀라 아보르투스 [3], 및 부르크홀데리아 슈도말레이 [6]가 포함된다. 이들 결과는 다양한 병원성 박테리아에 대한 백신 후보의 신속한 생성 또는 프로토타이핑을 위한 시험관 내 시스템의 잠재성을 입증한다. 더욱이, 합성이 상이한 O-PS 항원에 의해 단지 20 시간 내에 달성될 수 있기 때문에, 이 무세포 플랫폼은 신규한 생체접합체 백신 후보의 신속한 생성 및 프로토타이핑을 위한 매력적인 옵션을 나타낸다.
동결건조된 CFGpS 반응물은 생체접합체 합성 능력을 보유한다. 전통적인 접합체 백신의 주요 한계는 그들의 시간 소모적인 생성 공정으로 인한 그들의 고비용이다. 비교하면, 생체접합체 백신은 생성 비용이 덜 비싸지만, 생성 시간은 살아있는 세포로부터 단백질을 발효하고 정제하기 위해 필요한 시간에 의해 결정된다. 본 발명자들은 생체 내 접근법과 비교하여 더 빠른 생성 및 광범위한 백신접종 캠페인 및 개발 노력을 가능하게 하기 위해 본 발명자들의 CFGpS 반응물이 잠재적인 실온 보관 및 분배를 위해 냉동-건조될 수 있는지 여부를 시험하고 싶었다. 이것이 가능한지 여부를 시험하기 위해, CjOST 용해물 또는 FtLLO 용해물 단독, 또는 CjOST 및 FtLLO 용해물 둘 다의 혼합물을 함유하는 CFGpS 반응을 준비하였다. 이어서, 이들 반응물을 동결건조시켰고, 15 μL 뉴클레아제-무함유 물로 재구성하였다. 반응물은 C-말단 DQNAT 시퀀에 이어서 His 태그를 갖는 단쇄 항체 단편 (scFv13-R4-DQNAT-6xHis) 또는 MBP-4xDQNAT-6xHis를 코딩하는 플라스미드를 함유하였다. 사전 혼합된 반응물 (레인 1, 2, 5, 6)은 재구성 직후에 작동시킨 반면에, CjOST 용해물 또는 FtLLO 용해물 단독을 함유하는 반응물은 재구성 후에 혼합하였다 (레인 3, 4, 7). DQNAT 시퀀이 합성되고 CjOST 용해물 또는 FtLLO 용해물 둘 다 반응에 존재할 때 FtO-PS가 표적 단백질에 부착된다 (레인 2, 4, 6, 7). 이들 결과는 CFGpS 반응 혼합물이 생체접합체 합성 능력의 손실없이 동결건조될 수 있음을 확인시켜 주며, 이동식 주문식 백신 생성 및 장기간 무냉장 보관을 위한 본 발명자들의 기술의 잠재성을 강조한다.
결론
본 발명자들은 조정된 시험관 내 전사, 번역, 및 담체 단백질로의 백신 항원의 접합을 위한 신규한 방법을 본원에 기재한다. 이 시험관 내 접근법은 독특하게 (i) 글리코실화 활성으로부터 세포 생존력을 분리시키고, 글리코실화 성분의 시험관 내 재구성을 통해 세포 대사 부담의 감소를 가능하게 하고, (ii) 개별 글리코실화 성분에 대한 설계-구축-시험 (DBT) 반복을 허용하고, (iii) 세포에서 불가능한 화학적 및 물리적 조작을 비롯하여 잘 정의된 실험 조건 내에서 글리코실화 경로의 조립을 허용한다. 추가로, 상기 시스템은 FDA-승인된 담체 단백질, 예컨대 클로스트리디움 테타니 및 코리네박테리움 디프테리아에로부터의 독소를 사용하여 생체접합체를 생성하는데 명백하고 상업적으로 매력적으로 적용된다. 이 신규한 시험관 내 생체접합체 백신 생성 방법은 기존 방법과 비교하여 신속한, 모듈식 및 이동식 백신 프로토타이핑 및 생성에 대한 이점을 입증하였다.
실시예 1에 대한 참고 문헌
실시예 2 - 무세포 당단백질 합성 플랫폼의 광범위 적용성
박테리아 당공학의 새로운 분야는 백신 및 치료제로서 사용하기 위해 설계자 글리칸 및 당접합체를 생성하는 것을 가능하게 하였다. 본원에서, 본 발명자들은 단백질 생합성을 아스파라긴-연결된 단백질 글리코실화와 균일하게 통합시키는 신규한 무세포 당단백질 합성 기술을 기재한다. 이 기술은 올리고사카릴트랜스퍼라제 (OST) 및 지질-연결된 올리고당류 (LLO)를 비롯한 글리코실화 성분이 선택적으로 풍부화된 세포 용해물을 공급하기 위해 몇몇 에스케리키아 콜라이 균주를 활용한다. 생성된 추출물은 표적 단백질의 효율적이고 부위-특이적인 글리코실화를 위해 1-포트 반응 계획을 가능하게 한다. 플랫폼은 고도로 모듈식이며, 이는 몇몇 박테리아 O-다당류를 비롯한 구조적으로 다양한 글리칸을 여러 당단백질 치료제 및 당접합체 백신 담체 상에 장식하기 위해 다수개의 구별되는 OST의 사용을 가능하게 한다. 하기 표는 독특한 글리코실화 성분, 즉, 이. 콜라이 공급원 균주, OST 및 LLO, 뿐만 아니라 개시된 무세포 당단백질 합성 시스템에서 특징분석된 당단백질 수용자를 요약한다.
요약 표: OST 효소, 글리칸 구조, 수용자 단백질, 및 박테리아 공급원 균주와 관련하여 무세포 당단백질 합성 플랫폼의 일반성.
다수개의 구별되는 올리고사카릴트랜스퍼라제 (OST)는 무세포 단백질 글리코실화를 활성화시키기 위해 이. 콜라이 용해물 내에서 풍부화될 수 있다. 본 발명자들의 무세포 당단백질 합성 기술의 초기 개발을 위해, 본 발명자들은 본 발명자들의 모델 글리코실화 시스템으로서 그람-음성 박테리아 캄필로박터 제주니로부터의 잘 연구된 박테리아 단백질 글리코실화 유전자좌 (pgl)를 선택하였다 [1]. 이 유전자 클러스터는, 지질 담체 운데카프레닐 피로포스페이트 (Und-PP)로부터 사전 조립된 GlcGalNAc5Bac 칠당류 (여기서 Bac는 바실로사민임)를 수용자 단백질 내의 보존된 모티프 (D/E-X-1-N-X+1-S/T, 여기서 X-1 및 X+1은 프롤린을 제외한 임의의 잔기임)에서 아스파라긴 잔기 상에 일괄적으로 전달하는 것을 촉매하는 단일-하위단위 OST, CjPglB를 수반하는 [3], 진핵생물 및 고세균과 기능적으로 유사한 아스파라긴-연결된 (N-연결된) 글리코실화 경로 [2]를 코딩한다.
무세포 시스템의 개방된 성질을 고려할 때, 대안적인 생화학적 반응 성분을 기능적으로 상호교환하고 프로토타이핑하는 것이 가능하다. 이를 달성할 수 있는 한 가지 간단한 방법은 각각 주어진 효소가 선택적으로 풍부화된 별도로 제조된 용해물을 조합하는 것이다 [4, 5]. 이 개념에 대한 증거로서, 별도로 제조된 CjLLO 및 CjPglB 용해물을 혼합한 다음, C-말단에서 단일 DQNAT 모티프로 변형된 항-β-갈락토시다제 (β-gal) 단일-쇄 가변 단편 (scFv) 항체인 scFv13-R4DQNAT [6] 수용자를 코딩하는 DNA로 프라이밍하였다. 생성된 혼합물은 항-His 항체, 및 씨. 제주니 글리칸을 검출하는 hR6 혈청으로 프로빙된 이뮤노블롯에서 관찰되는 바와 같이 scFv13-R4DQNAT의 효율적인 글리코실화를 촉진시켰다 (도 7a). scFv13-R4DQNAT 외에도, 본 발명자들은 또한 최적화된 DQNAT 글리코실화 부위로 추가로 변형된 씨. 제주니 당단백질 AcrA로부터의 21-아미노산 서열을 슈퍼폴더 GFP (sfGFP217-DQNAT)의 가요성 루프에 그라프팅시킴으로써 생성된 상이한 모델 수용자 단백질을 발현시켰다. 혼합된 용해물 반응 방식은 sfGFP217-DQNAT 수용자 단백질을 100% 전환율로 글리코실화시킬 수 있었다 (도 7a).
다음으로, 본 발명자들은 혼합된 용해물 접근법이 4가지 추가의 박테리아 OST의 활성을 신속하게 프로토타이핑하기 위해 사용될 수 있음을 입증하고자 하였다. 조질 용해물을 하기 박테리아 OST 중 하나를 이종성으로 과발현하는 이. 콜라이 CLM24 공급원 균주로부터 별도로 제조하였다: 캄필로박터 콜라이 PglB (CcPglB), 데술포비브리오 데술푸리칸스 PglB (DdPglB), 데술포비브리오 기가스 PglB (DgPglB), 또는 데술포비브리오 불가리스 PglB (DvPglB). 각각의 OST 용해물을 CjLLO-풍부화된 용해물과 혼합한 다음, sfGFP217-DQNAT 또는 이 표적 단백질의 변형된 버전 sfGFP217-AQNAT를 코딩하는 플라스미드 DNA로 보충하였다. 무세포 당단백질 합성 반응의 완료시, 두 sfGFP 모두의 발현 및 글리코실화 상태는 이뮤노블롯 분석에 따르고, 이는 이들 상동성 효소에 대한 시퀀 선호도에 대한 정보를 나타내었다. 예를 들어, CcPglB를 함유하는 혼합된 용해물은 sfGFP217-AQNAT가 아니라 sfGFP217-DQNAT를 효율적으로 글리코실화시키는 것으로 관찰되었다 (도 7b). CcPglB에 대한 이 활성 프로파일은 CjPglB에 대해 관찰된 것과 동일하였고, 이는 CjPglB에 대한 그의 높은 서열 유사성 (~81%)을 기반으로 할 때 놀라운 것은 아니다 [7]. 대조적으로, CjPglB에 대해 낮은 서열 동일성 (~15-20%)을 갖는 데술포비브리오 종으로부터의 OST를 함유하는 용해물 혼합물은 더욱 완화된 시퀀 선호도를 나타내었다 (도 7b). 구체적으로, DgPglB-풍부화된 추출물 혼합물은 거의 동등한 효율성으로 (D/A)QNAT 모티프 둘 다를 변형시킨 반면에, DdOST 및 DvOST를 함유하는 혼합된 용해물은 AQNAT 시퀀을 우세하게 글리코실화시켰다. 종합하면, 이들 결과는 다양한 올리고사카릴트랜스퍼라제 효소 (OST)가 표적화된 당단백질을 생성하기 위해 본 발명자들의 무세포 용해물에서 기능적으로 강화될 수 있음을 시사한다. 본 발명자들은 본 발명자들의 무세포 시스템에서 사용된 OST의 범위가 원생동물, 효모 및 포유류와 같은 유기체로부터 유래한 것들을 포함하도록 확장될 수 있다고 가정한다.
최종적으로, 본 발명자들은 임상적으로 관련된 백신 항원을 나타내는 O-항원 다당류가 다중 OST 효소에 의한 본 발명자들의 용해물 혼합 접근법을 이용하여 단백질로 전달될 수 있음을 보여주었다. 여기서, O78 균주가 개발도상국에서 여행자 설사의 주요 원인이기 때문에, 본 발명자들은 항박테리아 백신의 개발을 알리기 위해 이. 콜라이 O78 다당류 항원 (EcO78-PS)의 접합에 중점을 두었다. 상기 기재된 CjPglB 또는 CcPglB가 풍부화된 조질 용해물을 EcO78-PS의 합성을 위한 생합성 경로를 발현하는 세포로부터 제조된 LLO 용해물과 혼합하였다. 이어서, 이들 용해물 혼합물을 sfGFP217-DQNAT를 코딩하는 플라스미드 DNA로 보충하였다. 이뮤노블롯 분석은 CjPglB 및 CcPglB 둘 다 EcO78-PS를 단백질에 전달할 수 있음을 나타내었다 (도 8). 이들 데이터는 다양한 올리고사카릴트랜스퍼라제 효소 (OST)가 본 발명자들의 무세포 플랫폼에서 접합체 백신 후보를 합성하기 위해 사용될 수 있음을 나타낸다. 본 발명자들은 하기 기재된 접합체 백신의 주문식 및 분산적 생성을 가능하게 하도록 이 플랫폼을 추가로 개발하였다.
지금까지, 씨. 제주니 글리코실화 경로만이 시험관 내에서 재구성되었고 [8, 9], 본 발명자들의 시스템이 상이한 LLO로 변경될 수 있는지 여부는 미해결 문제로 남아있다. 따라서, 글리칸 구조의 범위를 씨. 제주니 칠당류를 넘어서 확장시키기 위해, 본 발명자들은 대안적인 글리칸 생합성 경로를 보유하는 이. 콜라이 세포로부터 추출된 지질-연결된 올리고당류 공여자를 사용하여 시험관 내 글리코실화 반응을 수행하였다. 이들은 하기 글리칸 구조를 보유하는 LLO를 포함하였다: (i) 고유의 씨. 라리 육당류 N-글리칸 [10]; (ii) 씨. 라리 육당류 N-글리칸을 기반으로 하는 조작된 GalNAc5GlcNAc [11]; (iii) 고유의 월리넬라 숙시노게네스 육당류 N-글리칸 [12]; (iv) 조작된 이. 콜라이 O9 프라이머-어댑터 O-PS 글리칸, Man3GlcNAc; (v) 에프. 툴라렌시스 O-PS, Qui4NFm-(GalNAcAN)2-QuiNAc 구조 [13] 및 (vi) 진핵생물 트리만노실 코어 N-글리칸, Man3GlcNAc2 [6]. 이들 각각의 상이한 글리칸에 의한 scFv13-R4DQNAT의 글리코실화는 CjPglB의 존재하에서만 발생하는 것으로 관찰되었다 (도 9). 종합하면, 이들 결과는 진핵생물 구조 및 O-항원 다당류와 닯은 것들을 비롯하여 구조적으로 다양한 글리칸이 무세포 글리코실화 반응에서 모듈식으로 상호교환될 수 있음을 입증한다.
무세포 당단백질 합성 플랫폼에 몇몇 글리칸 구조를 성공적으로 도입시킴으로써, 본 발명자들은 본 발명자들의 관심을 특정한 그룹의 글리칸, 박테리아 O-다당류로 돌렸다. 항박테리아 내성이 전세계적으로 증가하는 문제이기 때문에, 새로운 항생제 및 백신의 생성을 가속화시키는 전략이 필요하다. 특히, 면역원성 담체 단백질에 접합된 박테리아 O-다당류 항원으로 구성된 접합체 백신은 극히 드물게 내성이 있는 박테리아 감염을 예방하는데 90% 넘게 효과적이다. 본 발명자들은 본 발명자들이 병원체-특이적인 다당류의 맥락에서 생체접합체 백신 후보를 제조하기 위해 본 발명자들의 무세포 당단백질 합성 기술을 이용할 수 있는 것으로 가정하였다. 개념 증명으로서, 본 발명자들은 그람-음성 병원체 프란시셀라 툴라렌시스 아종 툴라렌시스 (유형 A) 균주 Schu S4, 통성 코코바실루스 및 야토병 원인 인자로부터의 O-PS 구조를 발현하여 그에 의해 sfGFP-DQNAT를 부위-특이적으로 글리코실화하는 것을 시도하였다. 글리코실화 활성을 항-His 항체 및 FtO-PS에 대한 특이적인 모노클로날 항체에 의한 이뮤노블롯팅을 통해 검정하였다 (도 10A). FtLLO 및 CjPglB 용해물이 혼합될 때 관찰된 래더-유사 패턴은 FtLLO 부착의 지표이며, Wzy 폴리머라제의 작용을 통해 O-PS 쇄 길이 가변성으로 인한 것이다.
다양한 접합체 백신의 생성을 위한 본 발명자들의 무세포 접근법의 일반성 및 모듈성을 입증하기 위해, 본 발명자들은 2가지 이. 콜라이 병원성 균주, 즉, 장독소생성 이. 콜라이 균주 O7 및 O78에 대한 백신을 생성하고자 하였다. 이. 콜라이 균주 O7은 요로 감염의 주요 원인이고, 균주 O78은 저소득 국가에서 여행자 설사의 주요 원인 및 설사 질환의 주요 원인이다. 1-포트 용해물을 CjPglB 및 이. 콜라이 O78 항원 또는 O7 항원에 대한 생합성 경로를 발현하는 세포로부터 제조하였다. 이들 용해물을 함유하는 무세포 반응은 항-His 항체 (도 10B, C) 및 이. 콜라이 O78 및 O7 항원에 대한 항혈청 (데이터는 도시되지 않음)에 의한 이뮤노블롯팅에 의해 본 발명자들의 sfGFP 변이체의 래더-유사 글리코실화를 일으켰다. 중요하게는, 이들 결과는 조정된 담체 단백질 합성 및 병원체-특이적인 O 항원 부착을 위한 본 발명자들의 통합된 기술의 잠재성을 입증한다. 더욱이, 본 발명자들의 무세포 플랫폼은 박테리아 O-다당류의 다양한 구조로부터 신규한 접합체 백신 후보의 신속한 생성 및 프로토타이핑에 대한 매력적인 옵션을 나타낸다.
본 발명자들의 완전히 통합된 무세포 당단백질 합성 플랫폼은 다양한 N-당단백질의 1-포트 합성을 허용하는 것으로 입증되었다. 이 시스템을 이용하여, scFv13-R4DQNAT 또는 sfGFP217-DQNAT를 코딩하는 플라스미드 DNA로 프라이밍된 반응은 100% 단백질 글리코실화로 표적화된 단백질을 생성하였다 (도 11a). 중요하게는, 시험관 내에서 합성된 scFv13-R4DQNAT 및 sfGFP217-DQNAT 단백질은 scFv에 대한 ELISA 포맷에서 항원 기질에 결합하는 능력에 의해 및 N-글리칸 부가에 의해 영향을 받지 않는 sfGFP에 대한 형광 신호에 의해 측정되는 생물학적 활성을 보유하였다 (데이터는 도시되지 않음). 더욱 중요하게는, 잔기 N24 (22-AENIT-26), N38 (36-NENIT-40) 또는 N83 (81-LVNSS-85)에서 고유의 시퀀을 갖는 것들을 비롯하여 몇몇 인간 에리트로포이에틴 (hEPO) 당변이체를 코딩하는 플라스미드 DNA에 의해 프라이밍된 반응에서 유사하게 수행된 본 발명자들의 1-포트 무세포 글리코실화 시스템은 최적의 박테리아 시퀀, DQNAT로 개별적으로 돌연변이되었다 (도 11b). 웨스턴 블롯 분석은 N24 및 N38 부위의 경우 100% 글리코실화 생성물 및 N83 부위의 경우 ~30-40%로 각각의 hEPO 당변이체의 명백히 검출가능한 글리코실화를 나타내었다 (도 11b). 3가지 모든 글리코실화 hEPO 변이체는 상응하는 비글리코실화 대응물에 대해 측정된 활성과 구별되지 않는 생물학적 활성을 보유하였다 (데이터는 도시되지 않음). 종합적으로, 이들 발견은 1-포트 용해물이 인간 기원인 것을 비롯하여 효율적으로 글리코실화된 단백질을 수득하는 방식으로 단백질 합성 및 N-글리코실화를 공동 활성화시킬 수 있음을 확립한다.
다음으로, 본 발명자들은 본 발명자들의 무세포 시스템의 능력을 sfGFP 또는 소형 사이토킨 당단백질, 예컨대 hEPO와 같은 모델-표적을 넘어서 진정한 당단백질 수용자를 합성하기 위해 확장시키고자 하였다. 구체적으로, 본 발명자들은 당접합체 백신 담체의 발현에 본 발명자들의 노력을 기울였다. 이. 콜라이에서 생체 내 접합체 백신 발현은 접합체 백신의 맥락에서 단백질 아주반트로 사용하기 위해 FDA에 의해 아직 승인되지 않은 담체 단백질의 사용에 의해 제한되었다. FDA-승인된 담체 단백질, 예컨대 파상풍 또는 디프테리아 독소 단백질은 살아있는 이. 콜라이 세포의 주변 세포질에서 N-연결된 글리코실화와 상용성인 것으로 아직 입증되지 않았다. 실제로, 이들 FDA-승인된 담체는 이. 콜라이에서 생체 내 발현하기 어려운 것으로 입증되었고, 종종 봉입체로부터 불용성 생성물의 정제 및 재폴딩, 가용성 발현을 증가시키기 위해 발현 파트너의 융합, 또는 전장 단백질에 유리한 단백질 단편의 발현을 필요로 한다. 대조적으로, 무세포 단백질 합성 접근법은 최근에 발현하기 어려운 단백질에 대한 가능성을 나타내었다 [14]. 본원에서 본 발명자들이 중점을 둔 담체 단백질에는 비아실화된 에이치. 인플루엔자에 단백질 D (PD), 엔. 메닌기티디스 포린 단백질 (PorA), 및 코리네박테리움 디프테리아에 독소 (CRM197) 및 클로스트리디움 테타니 독소 (TT)의 유전적으로 해독된 변이체가 포함되었다. 본 발명자들은 또한 단편 C (TTc) 및 TT의 경쇄 (TTlight) 도메인 뿐만 아니라 이. 콜라이 MBP의 발현을 시험하였다. 글리코실화가 가능하도록, 모든 담체를 그들의 C-말단에서 최적의 박테리아 글리코실화 모티프, DQNAT의 4개의 직렬 반복부로 변형시켰다 [15]. 내부 DQNAT 글리코실화 부위를 함유하는 슈퍼폴더 녹색 형광 단백질의 변이체 (sfGFP217-DQNAT) [16]를 시스템 개발을 용이하게 하기 위한 모델 단백질로서 사용하였다. 8가지 모든 담체를 14C-류신 혼입에 의해 결정되는 바와 같이 ~50-650 μg mL-1의 가용성 수율로 시험관 내에서 합성하였다 (데이터는 도시되지 않음).
다음으로, 본 발명자들은 그들의 시험관 내 발현을 1-포트의 무세포 글리코실화와 병합시킴으로써 이들 담체 단백질의 접합된 버전을 합성하고자 하였다. 백신 표적의 경우, 본 발명자들은 고도로 병독성인 프란시셀라 툴라렌시스 균주 Schu S4에 중점을 두었다. 단백질을 FtO-PS로 글리코실화시키기 위해, 본 발명자들은 FtO-PS 생합성 경로 및 CjPglB 효소를 발현하는 당조작된 이. 콜라이 세포로부터 1-포트 용해물을 생성하였다. 지질-연결된 FtO-PS 및 촉매 활성인 CjPglB를 함유하는 이 용해물을 이용하여, sfGFP217-DQNAT를 코딩하는 플라스미드 DNA로 프라이밍된 반응을 촉매하였다. FtO-PS로 장식된 글리코실화 sfGFP217-DQNAT의 효율적인 합성이 항-His 항체 또는 FtO-PS에 대해 특이적인 모노클로날 항체에 의한 이뮤노블롯팅을 통해 관찰되었다 (도 12a). sfGFP217-DQNAT의 글리코실화는 완전한 글리코실화 경로 및 바람직한 DQNAT 글리코실화 서열을 함유하는 반응에서만 관찰되었다 (도 12a).
다음으로, 본 발명자들은 FDA-승인된 담체가 본 발명자들의 무세포 반응에서 FtO-PS와 유사하게 접합될 수 있는지 여부를 조사하였다. MBP4xDQNAT, PD4xDQNAT, PorA4xDQNAT, TTc4xDQNAT, TTlight4xDQNAT, 및 CRM1974xDQNAT를 코딩하는 플라스미드 DNA를 부가한 후에, 지질-연결된 FtO-PS 및 CjPglB가 풍부화된 반응의 경우 FtO-PS에 의한 각각의 글리코실화가 관찰되었지만, CjPglB가 결여된 대조군 반응에서는 관찰되지 않았다 (도 12b). 본 발명자들은 시험한 모든 단백질 담체에 대한 고분자량 FtO-PS 종 (~10-20 kDa 정도)의 접합을 관찰하였고, 이는 더 긴 글리칸 쇄 길이가 에프. 툴라렌시스에 대한 접합체 백신의 효능을 증가시킨 것으로 나타났기 때문에 중요하다 [17]. 종합적으로, 이들 데이터는 무세포 당단백질 합성 플랫폼이 FDA-승인된 것들을 비롯한 다양한 당단백질 치료제 및 당접합체 담체를 효율적으로 합성하고 N-글리코실화시킬 수 있음을 나타낸다.
원핵생물 무세포 단백질 합성은 재조합 단백질 생성을 위한 유망한 도구로서 등장하였다 [18, 19]. 그 중에서도, 에스케리키아 콜라이-기반 용해물, 소위 S30 용해물이 가장 일반적으로 사용되고 잘 연구된 용해물 중 하나이다 [20]. 그러나, 지금까지, 단지 제한된 수의 이. 콜라이 균주만이 효율적인 무세포 단백질 합성을 수행할 수 있는 것으로 나타났으며, 훨씬 적은 수가 단백질 번역후 변형과 커플링된 무세포 단백질 합성의 맥락에서 연구되었다 [8, 21]. i) r이. 콜라이 705, ii) BL21(DE3), 및 iii) CLM24를 비롯한 다양한 일반적인 실험실 이. 콜라이 균주가 본 발명자들의 통합된 무세포 단백질 합성 및 글리코실화를 뒷받침하기 위한 샤시 균주로서 사용될 수 있는지 여부를 결정하기 위해, 본 발명자들은 먼저 초음파 처리를 기반으로 하는 견고한 절차를 이용하여 이들 균주로부터 조질 S30 용해물을 제조하였다 [22]. 이어서, 변형된 PANOx-SP 시스템 [23] 및 글리코실화 반응 [9]을 이용하는 소규모 배치-모드의 순차적인 무세포 단백질 합성이 하기로 보충된 이들 용해물을 사용하여 수행되었다: (i) 정제된 CjPglB 촉매; (ii) 올리고당류 공여자 CjLLO [24]; 및 (iii) 모델 수용자 단백질 scFv13-R4DQNAT를 코딩하는 플라스미드 DNA [6]. 밤새 반응시킨 후, 항-His 이뮤노블롯에서 전적으로 모노-글리코실화 (g1) 형태로 표적화된 단백질의 이동성 변화, 및 hR6 혈청에 의해 scFv13-R4DQNAT에 부착된 씨. 제주니 글리칸의 검출에 의해 입증되는 바와 같이 모든 반응에서 고도로 효율적인 글리코실화가 달성되었다 (도 13).
이. 콜라이 기반 생물치료제 생성 시스템을 이용하는데 있어서 1가지 주요 문제는 지질 A 또는 내독소 오염에 대한 우려이다. 지질 A 독소는 톨-유사 수용체 4 (TLR4)에 의해 인식되어, 감염과 싸우기 위해 필요한 염증전 사이토킨, 예컨대 종양 괴사 인자 알파 및 인터류킨-1 베타를 생성하지만 [25], 높은 수준에서는 치명적인 패혈성 쇼크를 유발할 수 있다 [26]. 무세포 당단백질 합성 반응이 OST 및 LLO를 비롯한 지질-연관된 성분에 의존하기 때문에, 지질 A의 제거를 수반하는 표준 해독 접근법 [27]은 본 발명자들의 글리코실화 성분의 활성 또는 농도를 손상시킬 수 있다. 이 문제를 해결하기 위해, 본 발명자들은 균주 조작을 통해 지질 A 분자를 해독하는 전략을 채택하였다 [28, 29]. 특히, 이. 콜라이에서 아실트랜스퍼라제 유전자 lpxM의 결실 및 에프. 툴라렌시스 포스파타제 LpxE의 과발현은 독성이 유의하게 감소되었지만 아주반트로서의 활성을 보유하면서 거의 균질한 펜타아실화된 모노포스포릴화 지질 A를 생성하는 것으로 나타났다 [28]. iVAX의 맥락에서 해독된 지질 A 구조를 생성하기 위해, 본 발명자들은 FtLpxE 및 FtO-PS 글리코실화 경로를 공동 발현하는 CLM24의 ΔlpxM 유도체로부터 용해물을 생성하였다. 이 균주로부터 유래된 용해물은 HEK-블루 hTLR4 리포터 세포에서 인간 TLR4 활성화에 의해 측정되는 바와 같이 [29], CjPglB 및 FtO-PS를 발현하는 야생형 CLM24 용해물과 비교하여 유의하게 감소된 독성 수준을 나타내었다 (데이터는 도시되지 않음). 공급원 균주에 대한 게놈 재코딩이 단백질 합성 및 글리코실화 효율성에 부정적인 영향을 미치는지 여부를 확립하기 위해, 본 발명자들은 이들 변형된 균주로부터 제조된 S30 용해물을 사용하여 FtO-PS로 변형된 글리코실화 sfGFPDQNAT를 생성하였다. 모든 반응에서 효율적인 단백질 합성 및 N-글리코실화가 관찰되었다. 이들 데이터는 공급원 균주에 대한 게놈 조작, 구체적으로 지질 A의 구조적 편집이 본 발명자들의 무세포 글리코실화 반응에서 막-결합된 CjPglB 및 FtO-PS 성분의 활성에 영향을 미치지 않음을 나타낸다 (도 14). 전반적으로, 여기서 결과는 몇몇 일반적인 실험실 이. 콜라이 및 게놈-조작된 이. 콜라이 균주를 비롯한 다양한 원핵생물 용해물이 본 발명자들의 무세포 시스템에서 단백질 합성 및 N-글리코실화를 기능적으로 재구성하는데 이용될 수 있음을 확립한다.
실시예 2에 대한 참고 문헌
실시예 3 - 현장 의료시에 접합체 백신의 주문식 무세포 바이오제조
개요
접합체 백신은 박테리아 감염을 예방하기 위한 가장 효과적인 방법 중 하나이며, 약물-내성 병원체에 대한 유망한 전략을 나타낸다. 그러나, 앞서 언급한 바와 같이, 기존 제조 접근법은 중앙 집중식 생성 및 저온 유통 분배 요건으로 인해 접합체 백신에 대한 접근을 제한하였다. 이들 한계를 해결하기 위해, 시험관 내 생체접합체 백신 발현 (iVAX)을 위한 모듈식 기술이 하기에 기재된다. iVAX는 해독된 비병원체 에스케리키아 콜라이로부터 이동식 냉동-건조된 용해물을 포함한다. 재수화시, iVAX 반응은 1 시간 내에 다양한 박테리아 병원체에 대한 임상적으로 관련된 용량의 생체접합체 백신을 합성한다. 이 실시예는 놀랍게도 그리고 예상치 못하게도 고도로 병독성인 병원체 프란시셀라 툴라렌시스 아종 툴라렌시스 (유형 A) 균주 Schu S4에 대한 iVAX 합성된 백신이 조작된 박테리아를 사용하여 생성된 백신과 비교하여 유의하게 더 높은 수준으로 마우스에서 병원체-특이적인 항체를 유도하였음을 나타낸다. iVAX 플랫폼은 냉장-비의존성 분배 및 현장 의료 생성을 통해 접근성이 증가된 새로운 생체접합체 백신의 개발을 가속화시킬 것을 약속한다.
서론
약물-내성 박테리아는 2050년까지 연간 최대 천만명의 생명을 위협할 것으로 예측되며 (The Review on Antimicrobial Resistance, 2014), 항생제 및 백신을 개발하고 분배하기 위한 새로운 전략이 필요하하다. 전형적으로 면역자극성 단백질 담체에 연결된 병원체-특이적인 캡슐형 (CPS) 또는 O-항원 다당류 (O-PS)로 구성된 접합체 백신은 생명을 위협하는 박테리아 감염을 예방하기 위한 가장 안전하고 가장 효과적인 방법 중 하나이다 (Jin et al., 2017; Trotter et al., 2008; Weintraub, 2003). 특히, 수막구균성 및 폐렴구균성 접합체 백신의 구현은, 표적화된 균주에서 항생제 내성을 감소시키는 것 외에도 (Roush et al., 2008), 전세계적으로 박테리아성 수막염 및 폐렴의 발생을 유의하게 감소시켰다 (Novak et al., 2012; Poehling et al., 2006). 그러나, 그들의 증명된 안전성 및 효능에도 불구하고, 접합체 백신에 대한 전세계 아동 백신접종률은 ~30%로 여전히 낮으며, 접근성 부족 및 낮은 면역화 범위는 남아있는 질환 부담의 대다수를 차지한다 (Wahl et al., 2018). 또한, 장티푸스 열을 예방하기 위한 타입바(Typhbar)-TCV®의 2018 WHO 사전심사는 거의 10 년만에 최초의 접합체 백신 승인을 나타내었다. 새로운 약물-내성 병원체를 해결하기 위해, 접합체 백신의 개발 및 전세계 분배를 가속화시키기 위한 새로운 기술이 필요하다.
접합체 백신 개발 및 분배의 느린 속도에 기여하는 것은 이들 분자가 특히 제조하기 어렵고 비싸다는 사실이다. 접합체 백신을 생성하기 위한 통상적인 공정은 병원성 박테리아의 대규모 배양물로부터 정제된 다당류 항원과 담체 단백질의 화학적 접합을 수반한다. 병원체의 대규모 발효는 연관된 생물학적 안전성 위험 및 공정 개발 문제로 인해 높은 제조 비용을 일으킨다. 또한, 화학적 접합은 다당류의 구조를 변경시킬 수 있으며, 이는 보호성 에피토프의 손실을 일으킨다 (Bhushan et al., 1998). 이들 문제를 해결하기 위해, 최근에 다당류-단백질 "생체접합체"가 단백질-글리칸 커플링 기술 (PGCT)을 이용하여 에스케리키아 콜라이에서 제조될 수 있음이 입증되었다 (Feldman et al., 2005). 이 접근법에서, 조작된 이. 콜라이 세포는 캄필로박터 제주니 올리고사카릴트랜스퍼라제 효소 PglB (CjPglB)에 의해 촉매된 아스파라긴-연결된 글리코실화 반응을 통해 이종성으로 발현된 CPS 또는 O-PS 항원을 담체 단백질에 공유 부착시킨다 (Cuccui et al., 2013; Garcia-Quintanilla et al., 2014; Ihssen et al., 2010; Ma et al., 2014; Marshall et al., 2018; Wacker et al., 2014; Wetter et al., 2013). 이러한 진보에도 불구하고, 화학적 접합 및 PGCT 접근법 둘 다 살아있는 박테리아 세포에 의존하며, 이는 백신이 냉장 공급 유통을 통해 분배되는 중앙 집중식 생성 설비를 필요로 한다. 냉장은 가열 및 냉동 둘 다에서 병원체-특이적인 다당류의 침전 및 유의한 손실로 인한 접합체 백신 부패를 피하는데 중요하다 (Frasch, 2009; WHO, 2014). 1가지 접합체 백신, 멘아프리백(MenAfriVac)TM만이 최대 4 일 동안 저온 유통 외부에서 활성으로 유지되는 것으로 알려졌고, 이는 사하라 사막 이남 아프리카의 수막염 벨트에서 백신접종 동안에 백신 범위를 증가시키고 비용을 50% 감소시키는 것으로 추정된다 (Lydon et al., 2014). 그러나, 이는 열안정한 백신의 개발 및 검증에서 상당한 투자를 필요로 한다. 광범위하게, 저온 유통 냉장의 필요성은 백신접종 캠페인의 범위를 제한하고, 특히 개발도상국에서 질환 근절에 대한 장벽을 제시하는 경제적 및 수송적 문제를 일으킨다 (Ashok et al., 2017; Wahl et al., 2018).
무세포 단백질 합성 (CFPS)은 시험관 내에서 단백질을 합성하기 위해 살아있는 세포가 아니라 세포 용해물을 사용함으로써 백신 개발을 가속화시키며 또한 분산적이고 저온 유통-비의존성인 바이오제조를 가능하게 하는 기회를 제공한다 (Carlson et al., 2012). 중요하게는, CFPS 플랫폼은 (i) 적절한 양의 단백질이 단지 수시간 내에 시험관 내에서 합성될 수 있기 때문에 현장 의료 단백질 생성을 가능하게 하고, (ii) 주위 온도에서 분배를 위해 냉동-건조될 수 있고, 단지 물을 첨가함으로써 재구성될 수 있으며 (Adiga et al., 2018; Pardee et al., 2016), (iii) 제어된 실험실 환경 외에서 살아있는 세포의 사용과 연관된 생물학적 안전성 우려를 피하게 한다. CFPS는 비글리코실화 단백질 백신의 주문식 및 이동식 생성을 가능하게 하기 위해 최근에 이용되었다 (Adiga et al., 2018; Pardee et al., 2016). 더욱이, 본 발명자들은 최근에 인간 당단백질 및 진핵생물 글리칸을 비롯한 글리코실화 단백질의 1-포트 생성을 가능하게 하는 무세포 당단백질 합성 기술을 기재하였다 (Jaroentomeechai et al., 2018). 이들 진보에도 불구하고, 무세포 시스템 및 심지어 분산적 제조 시스템은 관련 역가에서 글리코실화 단백질을 합성할 수 없고, 다양한 글리칸 구조, 예컨대 생체접합체 백신 생성을 위해 필요한 다당류 항원을 보유하여 역사적으로 제한되었다 (Perez et al., 2016).
이들 한계를 해결하기 위해, 무세포 반응에서 접합체 백신의 신속한 개발 및 저온 유통-비의존성 생합성을 가능하게 하는 iVAX (시험관 내 생체접합체 백신 발현) 플랫폼이 하기에 기재된다 (도 15). iVAX는 하기 특징을 갖도록 설계되었다. 첫째, iVAX는 신속하며, 1 시간 내에 다중 개별 용량의 생체접합체를 생성하는 능력을 갖는다. 둘째, iVAX는 견고하며, 작동 온도 범위에 걸쳐 동등한 양의 생체접합체를 생성한다. 셋째, iVAX는 모듈식이며, 허가된 접합체 백신에서 사용되는 것들을 비롯한 담체 단백질, 뿐만 아니라 접합된 다당류 항원을 신속하게 상호교환하는 능력을 제공한다. 이 실시예에서 기재된 바와 같이, 이러한 모듈성은 고도로 병독성인 프란시셀라 툴라렌시스 아종 툴라렌시스 (유형 A) 균주 Schu S4, 장독소생성 (ETEC) 이. 콜라이 O78, 및 요로 병원성 (UPEC) 이. 콜라이 O7을 비롯한 다양한 박테리아 병원체에 대해 표적화된 다수의 백신 후보를 생성하도록 활용되었다. 넷째, iVAX는 상온에서 안정하며, 물만 첨가하는 전략으로 작동하는 냉동-건조된 무세포 반응으로부터 유래된다. 다섯째, iVAX는 안전하며, 비-조작된 이. 콜라이 제조 플랫폼에 존재하는 높은 수준의 내독소를 효과적으로 피하는 지질 A 리모델링을 활용한다. 이들 결과는 냉동-건조된 저-내독소 iVAX 반응으로부터 유래된 항-에프. 툴라렌시스 생체접합체가 마우스에서 병원체-특이적인 항체 반응을 유도하고, 살아있는 세포에서 확립된 PGCT 접근법을 이용하여 생성된 생체접합체보다 성능이 뛰어남을 입증한다. 전반적으로, iVAX 플랫폼은 선진국 및 개발도상국 둘 다에 중요한 부류의 항박테리아 백신의 보호적 이점을 전달하기 위한 새로운 방식을 제공한다.
결과
허가된 백신 담체 단백질의 시험관 내 합성
무세포 생체접합체 백신 생성에 대한 원리 증명을 입증하기 위해, FDA-승인된 접합체 백신에서 현재 사용되는 담체 단백질의 세트를 시험관 내에서 발현시켰다. 시험관 내에서 가용성 형태로 이들 담체 단백질의 생성은 중요한 벤치마크를 나타내며, 이는 살아있는 이. 콜라이에서 그들의 발현이 어려운 것으로 입증되었고, 종종 봉입체로부터 불용성 생성물의 정제 및 재폴딩 (Haghi et al., 2011; Stefan et al., 2011), 가용성 발현을 증가시키기 위해 발현 파트너, 예컨대 말토스-결합 단백질 (MBP)의 융합 (Figueiredo et al., 1995; Stefan et al., 2011), 또는 전장 단백질에 유리한 말단절단된 단백질 변이체의 발현 (Figueiredo et al., 1995)을 필요로 하기 때문이다. 대조적으로, 무세포 단백질 합성 접근법은 최근에 발현하기 어려운 단백질에 대한 가능성을 나타내었다 (Perez et al., 2016). 본원에 기재된 시험관 내 시스템에서 발현된 담체 단백질에는 비아실화된 에이치. 인플루엔자에 단백질 D (PD), 엔. 메닌기티디스 포린 단백질 (PorA), 및 코리네박테리움 디프테리아에 독소 (CRM197) 및 클로스트리디움 테타니 독소 (TT)의 유전적으로 해독된 변이체가 포함되었다. 또한, 단편 C (TTc) 및 TT의 경쇄 (TTlight) 도메인 뿐만 아니라 이. 콜라이 MBP의 발현을 시험하였다. MBP가 허가된 담체는 아니지만, 이는 면역자극성 성질을 입증하였고 (Fernandez et al., 2007), O-PS에 연결될 때 마우스에서 다당류-특이적인 체액성 및 세포성 면역 반응을 유도하는 것으로 확인되었다 (Ma et al., 2014). 유사하게, TT 도메인, TTlight 및 TTc는 허가된 백신에서 사용되지 않았지만, 면역자극성이고, 마우스에서 씨. 테타니 공격에 대한 보호에 개별적으로 충분하다 (Figueiredo et al., 1995). 글리코실화를 가능하게 하기 위해, 모든 담체를 그들의 C-말단에서 최적의 박테리아 글리코실화 모티프, DQNAT의 4개의 직렬 반복부로 변형시켰다 (Chen et al., 2007). C-말단 6xHis 태그 또한 포함시켜서 웨스턴 블롯 분석을 통한 정제 및 검출을 가능하게 하였다. 내부 DQNAT 글리코실화 부위를 함유한 슈퍼폴더 녹색 형광 단백질의 변이체 (sfGFP217-DQNAT) (Jaroentomeechai et al., 2018)는 시스템 개발을 용이하게 하기 위한 모델 단백질로서 사용되었다.
8가지 모든 담체를 14C-류신 혼입에 의해 결정되는 바와 같이 ~50-650 μg mL-1의 가용성 수율로 시험관 내에서 합성하였다 (도 16a). 특히, MBP4xDQNAT 및 PD4xDQNAT 변이체는 거의 100% 가용성이었고, 각각 500 μg mL-1 및 200 μg mL-1의 수율을 가지며, 웨스턴 블롯 분석에 따라 전적으로 전장 생성물로서 발현되었다 (도 16b). 열에 민감한 것으로 공지된 CRM1974xDQNAT를 제외하고는 유사한 가용성 수율이 모든 담체에 대해 25℃, 30℃ 및 37℃에서 관찰되었다 (도 21a) (WHO, 2014). 이들 결과는 무세포 담체 생합성의 기재된 방법이 13℃ 범위의 온도에 걸쳐 견고하고, 정확한 온도 제어가 실현 불가능한 환경에서 사용될 수 있음을 나타낸다.
이들 무세포 반응의 개방된 반응 환경은 화학적 및 반응 환경의 용이한 조작을 가능하게 하여, 더욱 복잡한 담체의 생성을 개선시켰다. 예를 들어, 막 단백질 PorA4xDQNAT의 경우, 지질 나노디스크를 첨가하여 가용성 발현을 증가시켰다 (도 21b). 나노디스크는 세포막 모방체를 제공하여, 막 단백질의 소수성 영역을 공동 번역에 의해 안정화시킨다 (Bayburt and Sligar, 2010). 분자내 디술피드 결합을 함유하는 TT의 발현을 위해, 발현을 산화 조건에서 2 시간 동안 수행하였고 (Knapp et al., 2007), 이는 전장 생성물로 중쇄 및 경쇄의 조립을 개선시켰고, 전장 TT의 프로테아제 분해를 최소화하였다 (도 21c). 시험관 내에서 합성된 CRM1974xDQNAT 및 TT4xDQNAT는 상업적으로 입수가능한 정제된 디프테리아 독소 (DT) 및 TT 단백질 표준과 크기가 비슷하였고, 각각 α-DT 및 α-TT 항체와 반응성이며 (도 21d, e), 이는 둘 다 면역학적으로 관련된 형태로 생성되었음을 나타낸다. 이는 CRM197 및 TT가 각각 디프테리아 및 파상풍에 대해 FDA-승인된 백신 항원이기 때문에, 이들이 접합된 다당류없이 투여될 때 주목할만 하다. 함께, 이들 결과는 소정 범위의 온도에 걸쳐 가용성 형태로 허가된 접합체 백신 담체 단백질을 발현하는 CFPS의 능력을 강조한다.
생체접합체 백신의 주문식 합성
다음으로, 이들 담체 단백질의 다당류-접합된 버전은 그들의 시험관 내 발현과 1-포트의 무세포 글리코실화를 병합시킴으로써 합성되었다. 모델 백신 표적으로서, 고도로 병독성인 프란시셀라 툴라렌시스 아종 툴라렌시스 (유형 A) 균주 Schu S4, 그람-음성의 통성 코코바실루스 및 야토병 원인 인자를 사용하였다. 이 박테리아는 그의 높은 치사율, 낮은 감염 용량, 및 에어로졸화 가능성으로 인해 부류 A 생물학 테러로 분류된다 (Oyston et al., 2004). 현재 에프. 툴라렌시스에 대해 허가된 백신이 없지만, 몇몇 연구는 Schu S4 균주에 대한 보호를 제공하는데 있어서 에프. 툴라렌시스 LPS, 구체적으로 O-PS 반복 단위에 대한 항체의 중요한 역할을 독립적으로 확인하였다 (Fulop et al., 2001; Lu et al., 2012). 더욱 최근에, PGCT를 이용하여 생성된 슈도모나스 아에루기노사 외독소 A (EPADNNNS-DQNRT) 담체 단백질에 접합된 에프. 툴라렌시스 Schu S4 O-PS (FtO-PS)를 포함하는 생체접합체 백신 (Cuccui et al., 2013; Marshall et al., 2018)은 야토병의 래트 흡입 모델에서 Schu S4 균주에 의한 공격에 대해 보호성인 것으로 나타났다 (Marshall et al., 2018). 이들 초기 발견에 비추어 볼 때, iVAX 플랫폼이 시험관 내에서 FtO-PS 구조를 다양한 담체 단백질에 접합시킴으로써 주문식으로 항-에프. 툴라렌시스 생체접합체 백신 후보를 생성하는 능력을 시험하였다.
FtO-PS는 826-Da 반복 사당류 단위 Qui4NFm-(GalNAcAN)2-QuiNAc (Qui4NFm: 4,6-디데옥시-4-포름아미도-D-글루코스; GalNAcAN: 2-아세트아미도-2-데옥시-D-갈락투론아미드; QuiNAc: 2-아세트아미도-2,6-디데옥시-D-글루코스)로 구성된다 (Prior et al., 2003). FtO-PS에 의해 단백질을 글리코실화하기 위해, FtO-PS 생합성 경로 및 올리고사카릴트랜스퍼라제 효소 CjPglB를 발현하는 당조작된 이. 콜라이 세포로부터 iVAX 용해물 (도 17a)을 생성하였다. 지질-연결된 FtO-PS 및 활성 CjPglB를 함유하는 이 용해물을 이용하여, sfGFP217-DQNAT를 코딩하는 플라스미드 DNA에 의해 프라이밍된 iVAX 반응을 촉매하였다. FtO-PS의 부착이 예상되지 않은 대조군 반응은 FtO-PS 경로 또는 CjPglB 효소가 결여된 세포로부터의 용해물에 의해 수행하였다. 표적 단백질 sfGFP217-DQNAT를 코딩하는 플라스미드가 결여되거나, 또는 CjPglB에 의해 변형되지 않은 돌연변이된 글리코실화 부위 (AQNAT)를 함유하는 sfGFP217-AQNAT를 코딩하는 플라스미드로 프라이밍된 반응 (Kowarik et al., 2006) 또한 시험하였다. iVAX 용해물을 함유하고 sfGFP217-DQNAT를 코딩하는 플라스미드로 프라이밍된 반응에서, 항-His 항체 또는 상업적인 FtO-PS에 대해 특이적인 모노클로날 항체에 의한 이뮤노블롯팅은 래더-유사 밴딩 패턴을 나타내었다 (도 17b). 이 래더는 FtO-PS 부착의 특징이며, Wzy 폴리머라제의 작용을 통한 O-PS 쇄 길이 가변성으로 인한 것이다 (Cuccui et al., 2013; Feldman et al., 2005; Prior et al., 2003). sfGFP217-DQNAT의 글리코실화는 완전한 글리코실화 경로 및 바람직한 DQNAT 글리코실화 서열을 함유하는 반응에서만 관찰되었다 (도 17b). 이 글리코실화 프로파일은 동일한 로트의 용해물로부터 (도 17c, 좌측) 및 상이한 로트의 용해물을 사용하여 (도 17c, 우측) 생물학적 복제물에 걸쳐 재현가능하였다. 시험관 내 단백질 합성 및 글리코실화는 1 시간 후에 관찰되었고, 접합된 다당류의 양은 0.75 내지 1.25 시간에 최대에 도달하였다 (도 22). 유사한 글리코실화 반응 동력학이 37℃, 30℃, 25℃ 및 실온 (~21℃)에서 관찰되었고, 이는 iVAX 반응이 소정 범위의 온도에 걸쳐 견고함을 나타낸다 (도 22).
다음으로, FDA-승인된 담체가 iVAX 반응에서 FtO-PS와 유사하게 접합될 수 있는지 여부를 결정하였다. MBP4xDQNAT, PD4xDQNAT, PorA4xDQNAT, TTc4xDQNAT, TTlight4xDQNAT, 및 CRM1974xDQNAT를 코딩하는 플라스미드 DNA를 부가한 후에, 지질-연결된 FtO-PS 및 CjPglB가 풍부화된 iVAX 반응의 경우 FtO-PS에 의한 각각의 글리코실화가 관찰되었지만, CjPglB가 결여된 대조군 반응에서는 관찰되지 않았다 (도 18). 시험한 모든 단백질 담체에 대한 고분자량 FtO-PS 종 (~10-20 kDa 정도)의 접합이 관찰되었고, 이는 더 긴 글리칸 쇄 길이가 에프. 툴라렌시스에 대한 접합체 백신의 효능을 증가시킨 것으로 나타났기 때문에 중요하다 (Stefanetti et al., 2019). 주목할만 하게는, 살아있는 이. 콜라이에서 확립된 PGCT 접근법을 이용하여 생체접합체의 동일한 패널을 합성하고자 하는 시도는 덜 유망한 결과를 나타내었다. 구체적으로, 그들의 iVAX-유래된 대응물과 비교하여 모든 PGCT-유래된 생체접합체에 대해 낮은 수준의 FtO-PS 글리코실화 및 저분자량 접합된 FtO-PS 종이 관찰되었다 (도 23). 동일한 경향이 가장 일반적인 PGCT 담체 단백질, EPADNNNS-DQNRT를 수반하는 PGCT- 대 iVAX-유래된 생체접합체에 대해 관찰되었다 (Cuccui et al., 2013; Ihssen et al., 2010; Marshall et al., 2018; Wacker et al., 2014; Wetter et al., 2013) (도 18; 도 23). 또한, PorA 막 단백질의 제한된 발현만이 생체 내에서 달성되었다 (도 23). 종합적으로, 이들 데이터는 iVAX가 다양하고 잠재적으로 막-결합된 담체 단백질에 효율적으로 접합된 고분자량 O-PS 항원에 의한 생체접합체 백신 후보의 생성을 위해 PGCT에 비해 이점을 제공함을 나타낸다.
다음으로, iVAX를 이용하여 생성된 생체접합체의 수율이 관련 백신 용량의 생성에 충분한지 여부를 결정하였다. 최근의 임상 데이터는 1-10 μg 용량의 생체접합체 백신 후보가 내약성이 우수하고 항박테리아 IgG의 생성을 자극하는데 효과적임을 나타낸다 (Hatz et al., 2015; Huttner et al., 2017; Riddle et al., 2016). 발현 역가의 평가 및 추가의 실험을 위해, MBP4xDQNAT 및 PD4xDQNAT를 텍스트화하였으며, 이는 이들 담체가 시험관 내에서 높은 가용성 역가로 말단절단 생성물이 없이 발현되기 때문이다 (도 16). 14C-류신 혼입 및 밀도계측 분석에 의해 결정되는 바와 같이 ~1 시간 동안 지속되는 반응이 ~20 μg mL-1의 글리코실화 MBP4xDQNAT 및 PD4xDQNAT를 생성한 것으로 확인되었다 (도 24a). 낭비를 최소화하기 위해, 백신이 1-20 용량의 백신을 함유하는 바이알로 현재 분배된다는 것을 주목해야 한다 (Humphreys, 2011). 따라서, 이러한 수율은 mL당 다중 용량이 iVAX 플랫폼을 이용하여 1 시간 내에 합성될 수 있음을 시사한다
생체접합체 생성을 위한 iVAX 접근법의 모듈성을 입증하기 위해, ETEC 이. 콜라이 균주 O78 및 UPEC 이. 콜라이 균주 O7을 비롯한 추가의 병원체로부터의 O-PS 항원을 보유하는 생체접합체를 생성하였다. 이. 콜라이 O78은 개발도상국에서, 특히 어린이에게서 설사 질환의 주요 원인 및 여행자의 설사의 주요 원인인 반면에 (Qadri et al., 2005), O7 균주는 요로 감염의 일반적인 원인이다 (Johnson, 1991). FtO-PS와 마찬가지로, EcO78-PS 및 EcO7-PS에 대한 생합성 경로가 이전에 기재되었고, 각각 반복 단위 GlcNAc2Man2 (Jansson et al., 1987) 및 Qui4NAcMan(Rha)GalGlcNAc (L'vov et al., 1984) (GlcNAc: N-아세틸글루코사민; Man: 만노스; Qui4NAc: 4-아세트아미도-4,6-디데옥시-D-글루코피라노스; Rha: 람노스; Gal: 갈락토스)를 갖는 O-PS 항원을 생성하는 것으로 확인되었다. PD4xDQNAT 또는 sfGFP217-DQNAT 플라스미드로 프라이밍된 반응에서 CjPglB 및 EcO78-PS 및 EcO7-PS 경로를 발현하는 세포로부터의 iVAX 용해물을 사용하여, 지질-연결된 O-PS 및 CjPglB 둘 다 반응에 존재할 때에만 담체 글리코실화가 관찰되었다 (도 24b, c). 이들 결과는 다중 박테리아 병원체에 대한 생체접합체의 모듈식 생성을 입증하며, 이는 시험관 내 담체 단백질 합성 및 글리코실화와 다중 이종성 O-PS 경로의 상용성에 의해 가능하였다.
내독소 편집 및 냉동-건조는 안전하고 이동식인 iVAX 반응을 생성한다
생물약제 생성을 위해 임의의 이. 콜라이-기반 시스템을 이용하는데 내재된 주요 문제는 단백질 생성물을 오염시키는 것으로 공지되며 높은 수준에서는 치명적인 패혈성 쇼크를 유발할 수 있는 지질 A 또는 내독소의 존재이다 (Russell, 2006). 결과적으로, 제형화된 생물약제에서 내독소의 양은 미국 약전 (USP), 미국 식품의약국 (FDA), 및 유럽 의약품청 (EMEA) (Brito and Singh, 2011)에 의해 규제된다. iVAX 반응이 지질-연관된 성분, 예컨대 CjPglB 및 FtO-PS에 의존하기 때문에, 지질 A의 제거를 수반하는 표준 해독 접근법 (Petsch and Anspach, 2000)은 비용 및 공정 복잡성을 증가시킬 뿐만 아니라 글리코실화 성분의 활성 또는 농도를 손상시킬 수 있다.
이 문제를 해결하기 위해, 균주 조작을 통해 지질 A 분자를 해독시키는 이전에 보고된 전략 (Chen et al., 2016; Needham et al., 2013)을 시험하였다. 특히, 이. 콜라이에서 아실트랜스퍼라제 유전자 lpxM의 결실 및 에프. 툴라렌시스 포스파타제 LpxE의 과발현은 거의 균질한 펜타아실화된 모노포스포릴화 지질 A를 유의하게 감소된 독성으로 생성하지만, 아주반트로서의 활성은 보유하는 것으로 나타났다 (Chen et al., 2016). 이러한 펜타아실화된 모노포스포릴화 지질 A는 모노포스포릴화 지질의 혼합물로 구성된 승인된 아주반트인 살모넬라 미네소타(Salmonella minnesota) R595로부터의 모노포스포릴 지질 A (MPL)의 주요 성분과 구조적으로 동일하였다 (Casella and Mitchell, 2008). iVAX의 맥락에서 해독된 지질 A 구조를 생성하기 위해, FtLpxE 및 FtO-PS 글리코실화 경로를 공동 발현하는 CLM24의 ΔlpxM 유도체로부터의 용해물을 생성하였다 (도 19a). HEK-블루 hTLR4 리포터 세포에서 인간 TLR4 활성화에 의해 측정되는 바와 같이 (Needham et al., 2013), 이 균주로부터 유래된 용해물은 CjPglB 및 FtO-PS를 발현하는 야생형 CLM24 용해물과 비교하여 유의하게 감소된 독성 수준을 나타내었다 (도 19b). 중요하게는, 지질 A의 구조적 리모델링은 iVAX 반응에서 막-결합된 CjPglB 및 FtO-PS 성분의 활성에 영향을 미치지 않았다 (도 25a). 용해물 생성을 위해 샤시 균주를 조작함으로써, 상업적인 단백질-기반 백신 생성물에 대해 보고된 값의 범위 내에서 내독소 수준 <1,000 EU mL-1을 갖는 iVAX 용해물을 생성하였다 (0.288-180,000 EU mL-1) (Brito and Singh, 2011).
전통적인 접합체 백신의 주요 한계는 이들이 냉장되어야 한다는 것이며 (WHO, 2014), 이는 이들 백신을 멀리 있거나 또는 자원이 제한된 환경으로 분배시키기 어렵게 만든다. iVAX 반응물을 주위 온도 보관 및 분배를 위해 냉동-건조시키는 능력은 기존 백신에 대해 필요한 냉장 공급 유통과 연관된 수송 문제를 완화시킬 수 있다. 이러한 가능성을 연구하기 위해, 해독된 iVAX 용해물을 이용하여 2가지 상이한 방식으로: sfGFP217-DQNAT 표적 단백질을 코딩하는 플라스미드에 의해 프라이밍시킨 직후에 반응을 작동시킴으로써 또는 동일한 반응 혼합물을 동결건조시키고 재수화시킨 후에 작동시킴으로써 FtO-PS 생체접합체을 생성할 수 있다 (도 19c). 두 경우 모두, CjPglB가 존재할 때 sfGFP217-DQNAT에 대한 FtO-PS의 접합이 거의 동일한 변형 수준에서 관찰되었다 (도 19d). 또한, 해독되고 냉동-건조된 iVAX 반응을 로트마다 재현가능하고 냉동-건조하지 않은 생성과 구별되지 않는 방식으로 FtO-PS-접합된 MBP4xDQNAT 및 PD4xDQNAT의 생성을 위해 5 mL로 증대시켰다 (도 25b, c). iVAX 반응물을 동결건조시키고 특수 장비없이 생체접합체를 생성하는 능력은 이동식 주문식 백신 생성에 대한 잠재성을 강조한다.
시험관 내에서 합성된 생체접합체는 마우스에서 병원체-특이적인 항체를 유도한다
iVAX 플랫폼을 이용하여 생성된 생체접합체의 효능을 검증하기 위해, iVAX-유래된 생체접합체가 마우스에서 항-FtLPS 항체를 유도하는 능력을 시험하였다 (도 20a). iVAX-유래된 FtO-PS-접합된 MBP4xDQNAT 또는 PD4xDQNAT를 제공받은 BALB/c 마우스가 높은 역가의 FtLPS-특이적인 IgG 항체를 생성하는 것으로 확인되었고, 이는 각각의 담체 단백질의 PBS 또는 비글리코실화 버전을 제공받은 대조군 마우스의 혈청에서 측정된 역가와 비교하여 유의하게 상승되었다 (도 20b, 도 26). PGCT로부터 유래된 글리코실화 MBP4xDQNAT를 제공받은 마우스로부터의 혈청에서 측정된 IgG 역가는 대조군 그룹에서 관찰된 역가와 유사하였고 (도 20b, 도 26), 이는 그의 iVAX-유래된 대응물에 비해 그의 후보의 현저히 약한 글리코실화와 일치한다 (도 23). iVAX를 이용하여 생성된 MBP4xDQNAT 및 PD4xDQNAT 생체접합체 둘 다 유사한 수준의 IgG 생성을 유도하였고, 어느 것도 마우스에서 관찰가능한 부작용을 일으키지 않았으며, 이는 생체접합체 백신 후보의 생성을 위한 기술의 모듈성 및 안전성을 확인시켜 준다.
IgG 역가는 IgG1 및 IgG2a 아형의 분석에 의해 특징화되었고, iVAX-유래된 FtO-PS-접합된 MBP4xDQNAT 및 PD4xDQNAT 둘 다 모든 대조군 그룹 뿐만 아니라 PGCT로부터 유래된 글리코실화 MBP4xDQNAT에 비해 >2 자릿수만큼 IgG1 항체의 생성을 부스팅시킨 것으로 확인되었다 (도 20c). 이 분석은 또한 iVAX-유래된 생체접합체 둘 다 대부분의 접합체 백신의 특징인 강력하게 Th2-편향된 (IgG1 >> IgG2a) 반응을 유도하였음을 나타내었다 (Bogaert et al., 2004). 종합하면, 이들 결과는 iVAX 플랫폼이 강력하고 병원체-특이적인 체액성 면역 반응을 유도할 수 있고 허가된 접합체 백신의 특징인 Th2 편향을 재현하는 백신 후보를 공급한다는 증거를 제공한다.
논의
이 실시예에서, iVAX가 생체접합체 백신의 이동식 주문식 생성을 위한 무세포 플랫폼임이 확립되었다. iVAX 반응물이 생체접합체 백신 생성물의 안전성을 보장하도록 해독되고, 저온 유통-비의존성 분배를 위해 냉동-건조되고, 고수율 생체접합체 생성을 위해 간단히 물을 첨가함으로써 재활성화될 수 있는 것으로 나타났다. 모델 백신 후보로서, 냉동-건조되고 내독소-편집된 iVAX 반응으로부터 유래된 항-에프. 툴라렌시스 생체접합체가 허가된 접합체 백신의 Th2-편향된 면역 반응 특징의 일부로서 마우스에서 병원체-특이적인 IgG 항체를 유도한 것으로 나타났다.
iVAX 플랫폼은 몇몇 신규한 특징을 포함한다. 첫째, iVAX는 모듈식이며, 이는 (i) 허가된 접합체 백신에서 사용되는 것들을 비롯한 담체 단백질, 및 (ii) 에프. 툴라렌시스 아종 툴라렌시스 (유형 A) Schu S4, ETEC 이. 콜라이 O78, 및 UPEC 이. 콜라이 O7로부터의 박테리아 O-PS 항원의 상호교환성을 통해 본원에서 입증되었다. 이는 아마도 살아있는 이. 콜라이에서 허가된 담체의 발현과 연관된 역사적 문제로 인해 진정한 FDA-승인된 담체 단백질에 대한 올리고사카릴트랜스퍼라제-매개된 O-PS 접합의 첫번째 입증을 나타낸다 (Figueiredo et al., 1995; Haghi et al., 2011; Stefan et al., 2011). 병원성 박테리아의 게놈에서 다당류 생합성 유전자의 일반적으로 관찰되는 클러스터화를 고려할 때 iVAX에서 이용되는 O-PS 경로의 추가의 확장이 가능해야 한다 (Raetz and Whitfield, 2002). 이 특징은 질환 발병에 대한 반응으로 또는 새로운 약물-내성 박테리아에 대해 iVAX가 생체접합체 백신 후보의 신속한 데노보 개발에 대한 매력적인 옵션이 되게 할 수 있다.
둘째, iVAX 반응은 ~$12 mL-1의 비용으로 저렴하며 (도 27, 표 1), 1 시간 내에 ~20 μg 생체접합체 mL-1를 합성하는 능력을 갖는다 (도 24a). 10 μg의 용량 크기를 가정할 때, iVAX 반응은 ~$6에 대한 백신 용량을 생성할 수 있다. 비교를 위해, 접합체 백신의 경우 용량당 CDC 비용은 에이치. 인플루엔자에 백신 ActHIB®의 경우 ~$9.50에서 각각 수막구균성 백신 메낙트라(Menactra)® 및 폐렴구균성 백신 프레브나르(Prevnar) 13®의 경우 ~$75 및 ~$118까지의 범위이다 (CDC, 2019).
셋째, iVAX-유래된 생체접합체가 PGCT를 이용하여 살아있는 이. 콜라이 세포로부터 유래된 생체접합체에 비해 FtLPS-특이적인 IgG를 유도하는데 유의하게 더 효과적인 것으로 나타났다 (도 20). 이론에 구애되기를 바라지 않지만, 이러한 증가된 효과에 대한 하나의 가능한 설명은 그들의 PGCT-유래된 대응물과 비교하여 시험관 내에서 발현된 생체접합체에 대해 관찰되는 더욱 광범위한 글리코실화, 더 많은 탄수화물 로딩 및 더 높은 분자량 FtO-PS 종에 의한 장식이다. PGCT를 이용하여 생성된 생체접합체에 대해 관찰되는 고분자량 O-PS 종 존재의 감소는 생체 내에서 O-항원 폴리머라제 Wzy와 PglB 사이의 경쟁으로 인한 것일 수 있다. 대조적으로, 본 개시내용의 시험관 내 접근법은 용해물 생성 전에 생체 내에서 발생하는 O-PS 합성을 iVAX 반응의 일부로서 시험관 내에서 발생하는 글리코실화로부터 분리시킨다. 이들 결과는, 야토병의 래트 흡입 모델에서 생체접합체에서 접합된 FtO-PS 대 단백질의 비의 증가가 에프. 툴라렌시스 Schu S4에 대한 보호를 증강시킴을 나타내는, PGCT-유래된 항-에프. 툴라렌시스 생체접합체에 대한 이전의 보고와 일치한다 (Marshall et al., 2018). 또한, 최근의 연구는 TT와 커플링된 고분자량 (80 kDa) FtO-PS에 의해 제조된 접합체 백신이 저분자량 (25 kDa) 다당류에 의해 제조된 접합체와 비교하여 에프. 툴라렌시스 생 백신 균주에 의한 비내 공격에 대해 더 양호한 보호를 부여하였음을 나타내었다 (Stefanetti et al., 2019).
생체접합체 백신의 이동식 생성을 가능하게 함으로써, iVAX는 무세포 및 분산적 바이오제조 기술 둘 다에서 주요 격차를 해결한다. 글리코실화 생성물의 생성은 세포-기반 분산적 바이오제조 플랫폼 (Crowell et al., 2018; Perez-Pinera et al., 2016) 및 당단백질을 합성하는 능력이 결여된 이. 콜라이 용해물을 사용하는 기존 무세포 플랫폼 (Boles et al., 2017; Murphy et al., 2019; Pardee et al., 2016; Salehi et al., 2016)에서는 아직 입증되지 않았다. 글리코실화된 인간 에리트로포이에틴이 냉동-건조된 중국 햄스터 난소 세포 용해물을 기반으로 하는 무세포 바이오제조 플랫폼에서 생성되었지만 (Adiga et al., 2018), 이것과 대부분의 다른 진핵생물 무세포 및 세포-기반 시스템은 내인성 단백질 글리코실화 기구에 의존한다. 결과적으로, 이들 발현 플랫폼은 생성된 글리칸 구조 또는 근본적인 글리코실화 반응에 대한 제어를 거의 제공하지 않으며, 허용가능한 글리코실화 프로파일을 달성하기 위해 유의한 최적화가 종종 필요하다 (Adiga et al., 2018). 대조적으로, iVAX 플랫폼은 내인성 단백질 글리코실화 경로가 결여된 이. 콜라이로부터 유래된 용해물에 의해 가능해 지며, 이는 원하는 글리코실화 활성의 상향식 조작을 허용한다 (Jaroentomeechai et al., 2018). iVAX에서 원하는 글리코실화 활성을 조작하는 능력은 현장 의료시에 중요한 부류의 항박테리아 백신의 생성을 유일하게 가능하게 한다.
iVAX는 생체접합체 백신의 신속한 개발 및 이동식 주문식 바이오제조를 위한 새로운 접근법을 제공한다. iVAX 플랫폼은 저온 유통 요건을 완화시키고, 이는 기반 시설이 제한된 지역으로 의약을 전달을 개선시킬 수 있고, 부패로 인한 백신 손실을 최소화시킬 수 있다. 또한, 백신 후보를 시험관 내에서 신속하게 생성하는 능력은 병원체 발병 및 긴급한 위협에 대해 신속하게 반응하는 독특한 수단을 제공한다.
실험 모델 및 주제 세부사항
박테리아
이. 콜라이 균주는 하기 방법 세부사항 섹션에서 명시되는 바와 같이 진탕 인큐베이터에서 30-37℃에서 루리아 베르타니(Luria Bertani) (LB), LB-레녹스(Lennox), 또는 2xYTP 배지에서 성장시켰다. 이. 콜라이 NEB 5-알파 (NEB)는 플라스미드 클로닝 및 정제를 위해 사용되었다. 이. 콜라이 CLM24 또는 CLM24 ΔlpxM 균주는 무세포 용해물 제조를 위해 사용되었다. 이. 콜라이 CLM24는 PGCT를 이용하여 생체 내에서 생체접합체를 발현하기 위한 샤시로서 사용되었다. CLM24는 WaaL 리가제를 코딩하는 유전자에서 결실을 갖는 W3110의 당-최적화된 유도체이며, 이는 운데카프레닐 디포스페이트 상에 사전 조립된 글리칸의 축적을 용이하게 한다 (Feldman et al., 2005). CLM24 ΔlpxM은 내인성 아실트랜스퍼라제 결실을 가지며, 해독된 무세포 용해물의 생성을 위한 샤시 균주로서 작용한다.
인간 세포 배양물
HEK-블루 hTLR4 세포 (인비보젠(Invivogen))를 제조자의 사양에 따라 37℃에서 5% CO2를 갖는 습윤 인큐베이터에서 10% 태아 소 혈청, 50 U mL-1 페니실린, 50 mg mL-1 스트렙토마이신, 및 100 μg mL-1 노르마신(Normacin)TM으로 보충된 DMEM 배지 고 글루코스/L-글루타민에서 배양하였다.
마우스
할란 스프라구 돌리(Harlan Sprague Dawley)로부터 입수한 6 주령의 암컷 BALB/c 마우스를 실험 그룹에 무작위로 배정하였다. 마우스를 3 내지 5 마리의 동물 그룹으로 하우징하고, 케이지를 매주 교체하였다. 모든 동물을 손상의 시각적 징후 및 비정상적인 털손질 습관과 같은 거동적 및 신체적 건강에 대해 매일 관찰하였다. 마우스를 각각의 주사 24 및 48 시간 후에 또한 관찰하였고, 비정상적인 반응이 보고되지 않았다. 이 연구는 국제 실험 동물 관리의 평가 및 인증에 대한 협회(Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International)에 의해 인증을 받은 시설에서 코넬(Cornell) 대학에서 수행되었다. 모든 절차는 동물 복지법, 인간 관리 및 실험 동물 사용에 대한 공중 보건 서비스 정책(Animal Welfare Act, Public Health Service Policy on Humane Care and Use of Laboratory Animals, New York State Health Law Article 5, Section 504) 및 코넬 대학 정책 1.4를 비롯하여 관련 대학, 주 및 연방 규제하에 코넬 대학 동물 관리 및 사용 위원회(Cornell University Institutional Animal Care and Use Committee)에 의해 승인된 프로토콜 2012-0132에 따라 수행되었다.
방법 세부사항
CLM24 ΔlpxM 균주의 구축
이. 콜라이 CLM24 ΔlpxM은 다첸코-워너(Datsenko-Wanner) 유전자 녹아웃 방법 (Datsenko and Wanner, 2000)을 이용하여 생성하였다. 간략히, CLM24 세포를 λ 레드 시스템을 코딩하는 pKD46 플라스미드로 형질전환시켰다. 형질전환체는 30℃에서 50 μg mL-1 카르베니실린을 갖는 25 mL LB-레녹스 배지 (10 g L-1 트립톤, 5 g L-1 효모 추출물 및 5 g L-1 NaCl)에서 0.5-0.7의 OD600으로 성장시키고, 수확하고, 25 mL 빙온 10% 글리세롤로 3회 세척하여 이들을 전기적격성으로 만들고, 100 μL 10% 글리세롤의 최종 부피로 재현탁시켰다. 병행하여, lpxM에 대해 상동성인 정방향 및 역방향 프라이머에 의해 pKD4로부터 칸나마이신 내성 카세트를 PCR 증폭시킴으로써 lpxM 녹아웃 카세트를 생성하였다. 전기적격성 세포를 400 ng의 lpxM 녹아웃 카세트로 형질전환시키고, 내성 콜로니의 선택을 위해 30 μg mL-1 칸나마이신을 갖는 LB 한천 상에 플레이팅하였다. 플레이트를 37℃에서 성장시켜, pKD46 플라스미드의 세포를 경화시켰다. 칸나마이신 상에서 성장한 콜로니는 콜로니 PCR 및 DNA 시퀀싱을 통해 녹아웃 카세트를 획득한 것으로 확인되었다. 이어서, 이들 확인된 콜로니를 pCP20으로 형질전환시켜, Flp-FRT 재조합을 통해 칸나마이신 내성 유전자를 제거하였다. 형질전환체를 50 μg mL-1 카르베니실린을 갖는 LB 한천 상에 플레이팅하였다. 선택 후, 콜로니를 42℃의 액체 배양물에서 성장시켜, pCP20 플라스미드의 세포를 경화시켰다. 콜로니는 콜로니 PCR 및 DNA 시퀀싱을 통해 lpxM 및 녹아웃 카세트 둘 다를 상실한 것으로 확인되었고, 50 μg mL-1 카르베니실린 또는 칸나마이신을 갖는 LB 한천 플레이트 상에 복제 플레이팅을 통해 칸나마이신 및 카르베니실린 내성 둘 다를 상실한 것으로 확인되었다. 이 균주의 구축 및 검증을 위해 사용된 모든 프라이머는 도 28, 표 2에 나열된다.
이 연구에서 사용된 모든 플라스미드는 도 29, 표 3에 나열된다. 플라스미드 pJL1-MBP4xDQNAT, pJL1-PD4xDQNAT, pJL1-PorA4xDQNAT, pJL1-TTc4xDQNAT, pJL1-TTlight4xDQNAT, pJL1-CRM1974xDQNAT, 및 pJL1-TT4xDQNAT는 pJL1 벡터에서 NdeI 및 SalI 제한 부위 사이에 C-말단 4xDQNAT-6xHis 태그 (Fisher et al., 2011)를 갖는 IDT로부터 구입한 코돈 최적화된 유전자 구축물의 PCR 증폭 및 후속적인 깁슨 어셈블리(Gibson Assembly)를 통해 생성되었다. C-말단 4xDQNAT-6xHis 태그를 부가하지 않은 것을 제외하고는 플라스미드 pJL1-EPADNNNS-DQNRT를 동일한 접근법을 이용하여 구축하였다. 플라스미드 pTrc99s-ssDsbA-MBP4xDQNAT, pTrc99s-ssDsbA-PD4xDQNAT, pTrc99s-ssDsbA-PorA4xDQNAT, pTrc99s-ssDsbA-TTc4xDQNAT, pTrc99s-ssDsbA-TTlight4xDQNAT, 및 pTrc99s-ssDsbA-EPADNNNS-DQNRT는 각각의 담체 단백질 유전자의 PCR 증폭, 및 깁슨 어셈블리를 통해 NcoI 및 HindIII 제한 부위 사이에서 pTrc99s 벡터로의 삽입에 의해 생성되었다. 플라스미드 pSF-CjPglB-LpxE는 유사한 접근법을 이용하여 구축되었지만, pSF 벡터에서 NdeI 및 NsiI 제한 부위 사이에 pE로부터의 lpxE 유전자를 삽입하였다 (Needham et al., 2013). 엔이빌더(NEBuilder)® 조립 도구 (nebuilder.neb.com)를 사용하여 설계되고 IDT로부터 구입한 정방향 및 역방향 프라이머와 퓨전(Phusion)® 고충실도 DNA 폴리머라제 (NEB)를 사용하여 PCR을 통해 삽입체를 증폭시켰다. 제한 효소 NdeI 및 SalI-HF® (NEB)를 사용하여 pJL1 벡터 (애드진(Addgene) 69496)를 소화시켰다. 제한 효소 NdeI 및 NotI (NEB)를 사용하여 pSF 벡터를 소화시켰다. EZNA 겔 추출 키트 (오메가 바이오-텍(Omega Bio-Tek))를 사용하여 PCR 생성물을 겔 추출하고, 깁슨 어셈블리 시약과 혼합하고, 50℃에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 깁슨 어셈블리 반응으로부터의 플라스미드 DNA를 이. 콜라이 NEB 5-알파 세포로 형질전환시키고, 50 μg ml-1의 칸나마이신 (시그마)을 사용하여 원형화된 구축물을 선택하였다. CFPS 및 iVAX 반응에서 사용하기 위해 EZNA 플라스미드 미디 키트 (오메가 바이오-텍)를 사용하여 서열-검증된 클론을 정제하였다.
무세포 용해물 제조
이. 콜라이 CLM24 공급원 균주를 37℃에서 진탕 플라스크 (1 L 규모) 또는 사르토리우스 스테딤 바이오스타트 씨플러스(Sartorius Stedim BIOSTAT Cplus) 생물반응기 (10 L 규모)에서 2xYTP 배지 (10 g/L 효모 추출물, 16 g/L 트립톤, 5 g/L NaCl, 7 g/L K2HPO4, 3 g/L KH2PO4, pH 7.2)에서 성장시켰다. 단백질 합성 수율 및 글리코실화 활성은 소규모 및 대규모 둘 다에서 용해물의 상이한 배치에 걸쳐 재현가능하였다. CjPglB-풍부화된 용해물을 생성하기 위해, 플라스미드 pSF-CjPglB를 보유하는 CLM24 세포 (Ollis et al., 2015)는 공급원 균주로서 사용되었다. FtO-PS-풍부화된 용해물을 생성하기 위해, 플라스미드 pGAB2를 보유하는 CLM24 (Cuccui et al., 2013)는 공급원 균주로서 사용되었다. CjPglB 및 FtO-PS 둘 다, EcO78-PS, 또는 EcO7-PS를 함유하는 1-포트 용해물을 생성하기 위해, pSF-CjPglB, 및 하기 박테리아 O-PS 생합성 경로 플라스미드 중 하나를 보유하는 CLM24는 공급원 균주로서 사용되었다: pGAB2 (FtO-PS), pMW07-O78 (EcO78-PS), 및 pJHCV32 (EcO7-PS). CjPglB 발현은 0.02% (w/v) L-아라비노스에 의해 0.8-1.0의 OD600로 유도하였고, 배양물을 30℃로 옮겼다. 세포를 ~3.0의 최종 OD600로 성장시켰고, 이 시점에서 5,000xg에서 4℃에서 15 분 동안 원심분리함으로써 세포를 펠렛화하였다. 이어서, 세포 펠렛을 저온 S30 완충제 (10 mM Tris-아세테이트 pH 8.2, 14 mM 아세트산마그네슘, 60 mM 아세트산칼륨)로 3회 세척하고, 5000xg에서 4℃에서 10 분 동안 펠렛화하였다. 최종 세척 후에, 7000xg에서 4℃에서 10 분 동안 세포를 펠렛화하고, 칭량하고, 액체 질소에서 급속 냉동시키고, -80℃에서 보관하였다. 세포 용해물을 제조하기 위해, 세포 펠렛을 1 g의 습윤 세포 덩어리당 1 mL의 S30 완충제에서 균질하게 재현탁시켰다. 20,000-25,000 psi에서 아베스틴 에멀지플렉스(Avestin EmulsiFlex)-B15 (1 L 규모) 또는 에멀지플렉스-C3 (10 L 규모) 고압 균질화기를 거쳐 단일 계대를 통해 세포를 파괴하였다. 이어서, 용해물을 30,000xg에서 30 분 동안 2회 원심분리하여, 세포 파편을 제거하였다. 상청액을 깨끗한 미세원심분리 튜브로 옮기고, 250 rpm에서 60 분 동안 진탕시키면서 37℃ 인큐베이션하였다. 4℃에서 15분 동안 원심분리 (15,000xg) 후에, 상청액을 수집하고, 분취하고, 액체 질소에서 급속 냉동시키고, -80℃에서 보관하였다. S30 용해물은 약 3회 냉동-해동 사이클 동안에 활성이었고, 브래드포드(Bradford) 검정에 의해 측정되는 바와 같이 총 ~40 g/L의 단백질을 함유하였다.
무세포 단백질 합성
CFPS 반응은 변형된 PANOx-SP 시스템에 의해 1.5 mL 미세원심분리 튜브 (15 μL 규모), 15 mL 원뿔형 튜브 (1 mL 규모), 또는 50 mL 원뿔형 튜브 (5 mL 규모)에서 수행하였다 (Jewett and Swartz, 2004). CFPS 반응 혼합물은 하기 성분으로 구성된다: 1.2 mM ATP; 0.85 mM 각각의 GTP, UTP 및 CTP; 34.0 μg mL-1 L-5-포르밀-5, 6, 7, 8-테트라히드로폴산 (폴린산); 170.0 μg mL-1의 이. 콜라이 tRNA 혼합물; 130 mM 칼륨 글루타메이트; 10 mM 암모늄 글루타메이트; 12 mM 마그네슘 글루타메이트; 2 mM 각각의 20가지 아미노산; 0.4 mM 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 (NAD); 0.27 mM 조효소-A (CoA); 1.5 mM 스페르미딘; 1 mM 푸트레신; 4 mM 옥살산나트륨; 33 mM 포스포에놀피루베이트 (PEP); 57 mM HEPES; 13.3 μg mL-1 플라스미드; 및 27% v/v의 세포 용해물. ≥1 mL의 반응 부피를 위해, 플라스미드를 6.67 μg mL-1로 첨가하였으며, 이러한 낮은 플라스미드 농도는 단백질 합성 수율 또는 동력학에 영향을 미치지 않고 시약을 보존하였다. PorA의 발현을 위해, 반응물을 이전에 기재된 바와 같이 제조되거나 (Schoborg et al., 2017) 또는 구입한 (큐브 바이오텍(Cube Biotech) 1 μg mL-1에서 나노디스크로 보충하였다. CRM1974xDQNAT의 발현을 위해, 달리 언급하지 않는다면 CFPS를 25℃에서 20 시간 동안 수행하였다. 모든 다른 담체 단백질의 경우, 달리 언급하지 않는다면 CFPS를 30℃에서 20 시간 동안 작동시켰다.
분자간 디술피드 결합을 함유하는 TT4xDQNAT의 발현을 위해, CFPS를 산화 조건하에 수행하였다. 산화 조건을 위해, 용해물을 실온에서 30 분 동안 750 μM 아이오도아세트아미드에 의해 사전 조건화하여, 유리 술프히드릴 (-SH)에 공유 결합시키고, 반응 혼합물을 4:1 비의 산화 및 환원 형태의 200 mM 글루타티온 및 10 μM 재조합 이. 콜라이 DsbC로 보충하였다 (Knapp et al., 2007).
시험관 내 생체접합체 백신 발현 (iVAX)
조질 용해물에서 담체 단백질의 시험관 내 발현 및 글리코실화를 위해, 2 단계 계획을 실시하였다. 첫번째 단계에서는, 상기 기재된 바와 같이 CFPS를 25-30℃에서 15 분 동안 수행하였다. 두번째 단계에서는, MnCl2 및 DDM을 각각 25 mM 및 0.1% (w/v)의 최종 농도에서 첨가함으로써 단백질 글리코실화를 개시하고, 1 시간의 총 반응 시간 동안 30℃에서 진행시켰다. 단백질 합성 수율 및 글리코실화 활성은 소규모 및 대규모 둘 다에서 iVAX 반응의 생물학적 복제에 걸쳐 재현가능하였다. 이어서, 반응물을 20,000xg에서 10 분 동안 원심분리하여, 불용성 또는 응집된 단백질 생성물을 제거하고, 상청액을 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯팅에 의해 분석하였다.
iVAX 반응물로부터 비글리코실화 및 글리코실화 담체의 정제는 제조자의 프로토콜에 따라 Ni-NTA 아가로스 (퀴아젠(Qiagen))를 사용하여 수행하였다. 간략히, 1 mL 무세포 반응 혼합물당 0.5 mL Ni-NTA 아가로스를 10 mM 이미다졸과 함께 완충제 1 (300 mM NaCl 50 mM NaH2PO4)에서 평형화시켰다. iVAX 반응물로부터의 가용성 분획을 Ni-NTA 아가로스 상에 로딩하고, 4℃에서 2-4 시간 동안 인큐베이션하여, 6xHis-태그 부착된 단백질에 결합시켰다. 인큐베이션 후, 무세포 반응물/아가로스 혼합물을 폴리프로필렌 컬럼 (바이오라드(BioRad)) 상에 로딩하고, 20 mM 이미다졸과 함께 6 컬럼 부피의 완충제 1로 2회 세척하였다. 단백질을 4 분획으로 용리시켰고, 각각은 무세포 반응 혼합물 mL당 300 mM 이미다졸과 함께 0.3 mL 완충제 1을 가졌다. 모든 완충제를 사용하였고, 4℃에서 보관하였다. 단백질을 4℃에서 멸균 1xPBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, pH 7.4)에서 1-2 mg mL-1의 최종 농도에서 보관하였다.
단백질 글리칸 커플링 기술 (PGCT)을 이용하여 생체 내에서 생체접합체의 발현
주변 세포질로의 전위를 위해 DsbA 리더 서열이 선행되는 생체접합체 담체 단백질 유전자를 코딩하는 플라스미드를 pGAB2 및 pSF-CjPglB를 보유하는 CLM24 세포로 형질전환시켰다. pGAB2만을 보유하는 CLM24는 음성 대조군으로 사용되었다. 형질전환된 세포를 5 mL LB 배지 (10 g L-1 효모 추출물, 5 g L-1 트립톤, 5 g L-1 NaCl)에서 밤새 37℃에서 성장시켰다. 다음 날, 세포를 100 mL LB로 계대 배양하고, 37℃에서 6 시간 동안 성장시킨 후에, 배양물을 0.2% 아라비노스 및 0.5 mM IPTG로 보충하여, 각각 CjPglB 및 생체접합체 담체 단백질의 발현을 유도하였다. 이어서, 단백질 발현을 30℃에서 16 시간 동안 수행하였고, 이 시점에서 세포를 수확하였다. 세포 펠렛을 1 mL 멸균 PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, pH 7.4)에서 재현탁시키고, 총 5 분 동안 10 초 온/10 초 오프의 사이클로 40% 진폭에서 Q125 초음파 분쇄기 (큐소니카(Qsonica), 코네티컷주 뉴턴)를 사용하여 용해시켰다. 15,000 rpm에서 4℃에서 30 분 동안 원심분리한 후에 가용성 분획을 단리하였다. 제조자의 프로토콜에 따라 Ni-NTA 스핀 컬럼 (퀴아젠)을 사용하여 단백질을 가용성 분획으로부터 정제하였다.
웨스턴 블롯 분석
샘플을 4-12% Bis-Tris SDS-PAGE 겔 (인비트로젠(Invitrogen)) 상에서 작동시켰다. 전기영동 분리 후에, 제조자의 프로토콜에 따라 단백질을 겔로부터 임모빌론-P 폴리비닐리덴 디플루오리드 (PVDF) 막 (0.45 μm) 상에 전달하였다. 막을 PBS (80 g L-1 NaCl, 0.2 g L-1 KCl, 1.44 g L-1 Na2HPO4, 0.24 g L-1 KH2PO4, pH 7.4)로 세척한 후, 오디세이(Odyssey)® 차단 완충제 (LI-COR)에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 차단 후, 막을 PBST (80 g L-1 NaCl, 0.2 g L-1 KCl, 1.44 g L-1 Na2HPO4, 0.24 g L-1 KH2PO4, 1 mL L-1 Tween-20, pH 7.4)로 6회 세척하였고, 각각의 세척 사이에 5 분 인큐베이션하였다. iVAX 샘플의 경우, 막을 항-6xHis 태그 항체 및 항-O-PS 항체 또는 관심 O 항원에 대해 특이적인 항혈청 (상업적으로 입수가능한 경우) 둘 다로 프로빙하였다. 막의 프로빙은 실온에서 진탕시키면서 적어도 1 시간 동안 수행하였고, 그 후에 상기 기재된 것과 동일한 방식으로 막을 PBST로 세척하고, 형광 표지된 이차 항체로 프로빙하였다. 오디세이® Fc 영상화 시스템 (LI-COR)을 이용하여 막을 영상화하였다. CRM197 및 TT 생성을 상업적인 DT 및 TT 표준 (시그마)과 비교하였고, 디프테리아 또는 파상풍 독소를 각각 인식하는 동일한 SDS-PAGE 절차에 이어서 폴리클로날 항체에 의한 웨스턴 블롯 분석에 의해 직교식으로 검출하였다. 사용된 모든 항체 및 희석은 도 30, 표 4에 나열된다.
TLR4 활성화 검정
HEK-블루 hTLR4 세포 (인비보젠)를 5% CO2를 함유하는 습윤 인큐베이터에서 37℃에서 10% 태아 소 혈청, 50 U mL-1 페니실린, 50 mg mL-1 스트렙토마이신, 및 100 μg mL-1 노르마신TM으로 보충된 DMEM 배지, 고 글루코스/L-글루타민에서 유지시켰다. ~50-80% 전면생장에 도달한 후에, 세포를 HEK-블루 검출 배지 (인비보젠)에서 1.4 x 105 세포/mL의 밀도로 96-웰 플레이트에 플레이팅하였다. 항원은 하기 농도로 첨가되었다: 용해물 중 100 ng μL-1 정제된 단백질; 및 100 ng μL-1 총 단백질. 정제된 이. 콜라이 O55:B5 LPS (시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)) 및 해독된 이. 콜라이 O55:B5 (시그마-알드리치)는 1.0 ng mL-1로 첨가되었고, 각각 양성 및 음성 대조군으로 작용하였다. 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 10-16 시간 동안 인큐베이션한 후에, 620 nm에서 흡광도를 측정하였다. 통계적 유의성은 대응표본 t-검정를 이용하여 결정하였다.
마우스 면역화
6 주령 암컷 BALB/c 마우스 (할란 스프라구 돌리)의 6개 그룹에게 이전에 기재된 바와 같이 단독이거나 또는 정제된 비글리코실화 MBP, FtO-PS-접합된 MBP, 비글리코실화 PD, 또는 FtO-PS-접합된 PD를 함유하는 100 μL PBS (pH 7.4)를 피하 주사하였다 (Chen et al., 2010). 5 마리의 마우스로 구성된 PBS 대조군 그룹을 제외하고, 그룹은 6 마리의 마우스로 구성되었다. 각각의 제제에서 항원의 양은 7.5 μg에 대해 정규화되어, 각각의 경우에 동등한 양의 비글리코실화 단백질 또는 생체접합체가 투여되는 것을 보장하였다. 주사하기 전에, PBS에서 제형화된 정제된 단백질 그룹을 동일한 부피의 불완전 프로인트 아주반트 (시그마-알드리치)와 혼합하였다. 면역화 전에, 각각의 그룹에 대한 물질 (5 μL)을 LB 한천 플레이트 상에 도말하고, 37℃에서 밤새 성장시켜, TLR4 활성화 검정에 의해 측정되는 멸균성 및 내독소 활성을 확인하였다. 초기 면역화 21 일 및 42 일 후에 각각의 그룹의 마우스를 동일한 용량의 항원으로 부스팅시켰다. -1, 21, 35, 49 및 63 일째에 하악하 수집을 통해 그리고 70 일째 연구 종료시에 심장 천자를 통해 혈액을 수득하였다. 각각의 주사 24 및 48 시간 후에 거동적 및 신체적 건강에서의 변화에 대해 마우스를 관찰하였고, 비정상적인 반응이 보고되지 않았다. 이 연구 및 모든 절차는 코넬 대학 연구 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인된 프로토콜 2012-0132에 따라 수행되었다.
효소-연결된 면역흡착 검정
면역화된 마우스에 의해 유도된 에프. 툴라렌시스 LPS-특이적인 항체를 이전에 기재된 프로토콜의 변형을 이용하여 간접적인 ELISA를 통해 측정하였다 (Chen et al., 2010). 간략히, 5000xg에서 10 분 동안 원심분리한 후에 수집한 혈액으로부터 혈청을 단리하고, -20℃에서 보관하였고; 96-웰 플레이트 (맥시소르프(Maxisorp); 눈크 날젠(Nunc Nalgene))를 PBS에서 5 μg mL-1의 농도로 에프. 툴라렌시스 LPS (비이아이 리소시즈(BEI resources))로 코팅하고, 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 다음 날, 플레이트를 PBST (PBS, 0.05% Tween-20, 0.3% BSA)로 3회 세척하고, 4℃에서 밤새 PBS 중 5% 무지방 우유 (카네이션(Carnation))로 차단시켰다. 샘플을 차단 완충제 중에서 1:100 내지 1:12,800,000에서 삼중으로 2배 계열 희석하고, 37℃에서 2 시간 동안 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 PBST로 3회 세척하고, 하기 HRP-접합된 항체 (모두 아브캄(Abcam)으로부터, 1:25,000 희석으로 사용됨) 중 하나의 존재하에 37℃에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다: 염소 항-마우스 IgG, 항-마우스 IgG1, 및 항-마우스 IgG2a. PBST로 3회 추가로 세척한 후에, 3,3'-5,5'-테트라메틸벤지딘 기질 (1-단계 울트라(Ultra) TMB-ELISA; 써모-피셔)을 첨가하고, 플레이트를 어두운 곳에서 30 분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 반응을 2 M H2SO4에 의해 중단시키고, 450 nm의 파장에서 마이크로플레이트 분광광도계 (테칸(Tecan))를 통해 흡광도를 정량화하였다. 무혈청 백그라운드 대조군을 초과하는 신호 3 SD를 생성하는 최저 희석을 측정함으로써 혈청 항체 역가를 결정하였다. 통계적 유의성은 RStudio 1.1.463에서 일원 ANOVA 및 터키-크래머 사후 정당한 유의차 검사를 이용하여 결정하였다.
정량화 및 통계적 분석
무세포 단백질 합성 수율의 정량화
iVAX 반응에서 합성된 단백질의 양을 정량화하기 위해, 2가지 접근법을 이용하였다. sfGFP의 형광 단위를 이전에 보고된 표준 곡선을 이용하여 농도로 전환시켰다 (Hong et al., 2014). 모든 다른 단백질의 수율은 CFPS 혼합물에 10 μM L-14C-류신 (11.1 GBq mmol-1, 퍼킨엘머(PerkinElmer))을 첨가하여, 이전에 기재된 바와 같이 액체 섬광 계수기를 이용하여 측정된 트리클로로아세트산-침전가능한 방사성을 수득함으로써 평가하였다 (Kim and Swartz, 2001).
통계적 분석
n의 정의 및 값, p-값, 표준 편차, 및 표준 오차를 비롯한 통계적 파라미터는 도면 및 상응하는 도면 범례에서 보고된다. 분석 기술은 상응하는 방법 세부사항 섹션에 기재되어 있다.
데이터 및 소프트웨어 이용가능성
완전한 DNA 서열을 비롯하여 이 연구에서 사용된 모든 플라스미드 구축물은 애드진에 수탁되었다 (구축물 128389-128404).
실시예 3에 대한 참고 문헌
실시예 3 - iVAX-유래된 백신은 치명적인 에프. 툴라렌시스 공격에 대해 보호한다
5 마리 BALB/c 마우스의 그룹을 PBS 또는 7.5 μg의 정제되고 무세포 합성된 비글리코실화 MBP4xDQNAT, PD4xDQNAT, 또는 EPADNNNS-DQNRT, 또는 FtO-PS-접합된 MBP4xDQNAT, PD4xDQNAT, 또는 EPADNNNS-DQNRT에 의해 복강내로 면역화시켰다. PCGT를 이용하여 살아있는 이. 콜라이 세포에서 제조된 FtO-PS-접합된 MBP4xDQNAT, PD4xDQNAT, 및 EPADNNNS-DQNRT는 양성 대조군으로 사용되었다. 21 및 42 일째에 마우스를 동일한 용량의 항원으로 부스팅시켰다. 66 일째에 마우스에게 6000 cfu (비내 LD50의 50배) 에프. 툴라렌시스 아종 홀라르크티카 생 백신 균주 록키 마운틴 래버러토리즈로 비내로 시도하였고, 추가 25 일 동안 생존에 대해 모니터링하였다. (도 31a). 담체 단백질로서 (도 31 b) MBP4xDQNAT (도 31 c) PD4xDQNAT 및 (도 31 d) EPADNNNS-DQNRT에 의한 면역화에 대한 카플란-마이어 곡선이 도시된다. 이들 결과는 iVAX-유래된 백신이 최신식 PGCT 접근법을 이용하여 합성된 백신만큼 효과적으로 치명적인 병원체 공격으로부터 마우스를 보호한다는 것을 나타낸다. (*p = 0.0476; **p = 0.0079, 피셔 정확 검정; ns: 유의하지 않음).
상기 설명에서, 다양한 치환 및 변형이 본 발명의 범위 및 개념을 벗어나지 않고 본원에 개시된 본 발명에 대해 이루어질 수 있음이 관련 기술분야의 기술자에게 용이하게 명백할 것이다. 본원에 예시적으로 기재된 본 발명은 적합하게는 본원에 구체적으로 개시되지 않은 임의의 요소 또는 요소들, 제한 또는 제한들의 부재하에 실시될 수 있다. 사용된 용어 및 표현은 설명의 측면에서 사용되었고, 제한하는 것이 아니며, 이러한 용어 및 표현의 사용이 도시되고 기재된 특징 또는 그의 일부의 임의의 등가물을 제외하는 것으로 의도되지 않으며, 다양한 변형이 본 발명의 범위 내에서 가능하다는 것을 인식한다. 따라서, 본 발명이 구체적인 실시양태 및 선택적인 특징에 의해 설명되었지만, 본원에 개시된 개념의 변형 및/또는 변화가 관련 기술분야의 기술자에 의해 의지될 수 있으며, 이러한 변형 및 변화가 본 발명의 범위 내에서 고려된다는 것을 이해해야 한다.
수많은 특허 및 비특허 참고문헌에 대한 인용이 본원에서 이루어진다. 인용된 참고문헌은 그들의 전문이 본원에 참고로 포함된다. 인용된 참고문헌에서 용어 정의와 비교하여 명세서에서 용어 정의에 불일치가 있는 경우에는, 용어는 본 명세서의 정의를 기반으로 하여 해석되어야 한다.
SEQUENCE LISTING
<110> Northwestern University
Jewett, Michael Christopher
Stark, Jessica Carol
DeLisa, Matthew P.
Jaroentomeechai, Thapakorn
<120> METHOD FOR RAPID IN VITRO SYNTHESIS OF BIOCONJUGATE VACCINES VIA
RECOMBINANT PRODUCTION OF N-GLYCOSYLATED PROTEINS IN PROKARYOTIC
CELL LYSATES
<130> 5369-00392
<150> US 62/362,327
<151> 2016-07-14
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1122
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 1
atgtcaaaag tcgctctcat caccggtgta accggacaag acggttctta cctggcagag 60
tttctgctgg aaaaaggtta cgaggtgcat ggtattaagc gtcgcgcatc gtcattcaac 120
accgagcgcg tggatcacat ttatcaggat ccgcacacct gcaacccgaa attccatctg 180
cattatggcg acctgagtga tacctctaac ctgacgcgca ttttgcgtga agtacagccg 240
gatgaagtgt acaacctggg cgcaatgagc cacgttgcgg tctcttttga gtcaccagaa 300
tataccgctg acgtcgacgc gatgggtacg ctgcgcctgc tggaggcgat ccgcttcctc 360
ggtctggaaa agaaaactcg tttctatcag gcttccacct ctgaactgta tggtctggtg 420
caggaaattc cgcagaaaga gaccacgccg ttctacccgc gatctccgta tgcggtcgcc 480
aaactgtacg cctactggat caccgttaac taccgtgaat cctacggcat gtacgcctgt 540
aacggaattc tcttcaacca tgaatccccg cgccgcggcg aaaccttcgt tacccgcaaa 600
atcacccgcg caatcgccaa catcgcccag gggctggagt cgtgcctgta cctcggcaat 660
atggattccc tgcgtgactg gggccacgcc aaagactacg taaaaatgca gtggatgatg 720
ctgcagcagg aacagccgga agatttcgtt atcgcgaccg gcgttcagta ctccgtgcgt 780
cagttcgtgg aaatggcggc agcacagctg ggcatcaaac tgcgctttga aggcacgggc 840
gttgaagaga agggcattgt ggtttccgtc accgggcatg acgcgccggg cgttaaaccg 900
ggtgatgtga ttatcgctgt tgacccgcgt tacttccgtc cggctgaagt tgaaacgctg 960
ctcggcgacc cgaccaaagc gcacgaaaaa ctgggctgga aaccggaaat caccctcaga 1020
gagatggtgt ctgaaatggt ggctaatgac ctcgaagcgg cgaaaaaaca ctctctgctg 1080
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<211> 373
<212> PRT
<213> Escherichia coli
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Met Ser Lys Val Ala Leu Ile Thr Gly Val Thr Gly Gln Asp Gly Ser
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Tyr Leu Ala Glu Phe Leu Leu Glu Lys Gly Tyr Glu Val His Gly Ile
20 25 30
Lys Arg Arg Ala Ser Ser Phe Asn Thr Glu Arg Val Asp His Ile Tyr
35 40 45
Gln Asp Pro His Thr Cys Asn Pro Lys Phe His Leu His Tyr Gly Asp
50 55 60
Leu Ser Asp Thr Ser Asn Leu Thr Arg Ile Leu Arg Glu Val Gln Pro
65 70 75 80
Asp Glu Val Tyr Asn Leu Gly Ala Met Ser His Val Ala Val Ser Phe
85 90 95
Glu Ser Pro Glu Tyr Thr Ala Asp Val Asp Ala Met Gly Thr Leu Arg
100 105 110
Leu Leu Glu Ala Ile Arg Phe Leu Gly Leu Glu Lys Lys Thr Arg Phe
115 120 125
Tyr Gln Ala Ser Thr Ser Glu Leu Tyr Gly Leu Val Gln Glu Ile Pro
130 135 140
Gln Lys Glu Thr Thr Pro Phe Tyr Pro Arg Ser Pro Tyr Ala Val Ala
145 150 155 160
Lys Leu Tyr Ala Tyr Trp Ile Thr Val Asn Tyr Arg Glu Ser Tyr Gly
165 170 175
Met Tyr Ala Cys Asn Gly Ile Leu Phe Asn His Glu Ser Pro Arg Arg
180 185 190
Gly Glu Thr Phe Val Thr Arg Lys Ile Thr Arg Ala Ile Ala Asn Ile
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Arg Asp Trp Gly His Ala Lys Asp Tyr Val Lys Met Gln Trp Met Met
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Leu Gln Gln Glu Gln Pro Glu Asp Phe Val Ile Ala Thr Gly Val Gln
245 250 255
Tyr Ser Val Arg Gln Phe Val Glu Met Ala Ala Ala Gln Leu Gly Ile
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Lys Leu Arg Phe Glu Gly Thr Gly Val Glu Glu Lys Gly Ile Val Val
275 280 285
Ser Val Thr Gly His Asp Ala Pro Gly Val Lys Pro Gly Asp Val Ile
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Ile Ala Val Asp Pro Arg Tyr Phe Arg Pro Ala Glu Val Glu Thr Leu
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Leu Gly Asp Pro Thr Lys Ala His Glu Lys Leu Gly Trp Lys Pro Glu
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Ile Thr Leu Arg Glu Met Val Ser Glu Met Val Ala Asn Asp Leu Glu
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370
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<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 3
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ttagagataa taacttatat attatgtttt ttttcaatga taattgcatt cgtcgataat 120
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cgtggcagac aagaaaatta taatataaaa aaccttattc ttcccctttc tatattttta 240
ataggcttgc ttgatttaat ttggtattct gcgtttaaag tagataattc gccatttcgt 300
gctacttacc atagttattt aaatactgcc aaaatattta tatttggttc ttttattgtt 360
ttcttgacac taactagcca gctaaaatca aaaaaagaga gtgtattata cactttgtat 420
tctctgtcat ttctaattgc tggatatgca atgtatatta atagcattca tgaaaatgac 480
cgcatttctt ttggtgtagg aacggcaaca ggagcagcat attcaacaat gctaataggg 540
atagttagtg gcgttgcgat tctttatact aagaaaaatc atcctttttt atttttatta 600
aatagttgcg cggtacttta tgttctggcg ctaacacaaa ccagagcaac cctactcctg 660
ttccctataa tttgtgttgc tgcattaata gcttattata ataaatcacc caagaaattc 720
acttcctcta ttgttctact aattgctata ttagctagca ttgttattat atttaataaa 780
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<213> Escherichia coli
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Met Leu Ile Gly Ile Val Ser Gly Val Ala Ile Leu Tyr Thr Lys Lys
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Thr Ser Ser Ile Val Leu Leu Ile Ala Ile Leu Ala Ser Ile Val Ile
245 250 255
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Leu Asn Ser Tyr Thr Asn Ala Asn Ser Val Thr Ser Leu Gly Ala Arg
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<213> Campylobacter jejuni
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Gly Gly Leu Arg Phe Thr Ile Tyr Ser Val Pro Val Met Ala Leu Gly
370 375 380
Phe Gly Phe Leu Leu Ser Glu Phe Lys Ala Ile Leu Val Lys Lys Tyr
385 390 395 400
Ser Gln Leu Thr Ser Asn Val Cys Ile Val Phe Ala Thr Ile Leu Thr
405 410 415
Leu Ala Pro Val Phe Ile His Ile Tyr Asn Tyr Lys Ala Pro Thr Val
420 425 430
Phe Ser Gln Asn Glu Ala Ser Leu Leu Asn Gln Leu Lys Asn Ile Ala
435 440 445
Asn Arg Glu Asp Tyr Val Val Thr Trp Trp Asp Tyr Gly Tyr Pro Val
450 455 460
Arg Tyr Tyr Ser Asp Val Lys Thr Leu Val Asp Gly Gly Lys His Leu
465 470 475 480
Gly Lys Asp Asn Phe Phe Pro Ser Phe Ser Leu Ser Lys Asp Glu Gln
485 490 495
Ala Ala Ala Asn Met Ala Arg Leu Ser Val Glu Tyr Thr Glu Lys Ser
500 505 510
Phe Tyr Ala Pro Gln Asn Asp Ile Leu Lys Ser Asp Ile Leu Gln Ala
515 520 525
Met Met Lys Asp Tyr Asn Gln Ser Asn Val Asp Leu Phe Leu Ala Ser
530 535 540
Leu Ser Lys Pro Asp Phe Lys Ile Asp Thr Pro Lys Thr Arg Asp Ile
545 550 555 560
Tyr Leu Tyr Met Pro Ala Arg Met Ser Leu Ile Phe Ser Thr Val Ala
565 570 575
Ser Phe Ser Phe Ile Asn Leu Asp Thr Gly Val Leu Asp Lys Pro Phe
580 585 590
Thr Phe Ser Thr Ala Tyr Pro Leu Asp Val Lys Asn Gly Glu Ile Tyr
595 600 605
Leu Ser Asn Gly Val Val Leu Ser Asp Asp Phe Arg Ser Phe Lys Ile
610 615 620
Gly Asp Asn Val Val Ser Val Asn Ser Ile Val Glu Ile Asn Ser Ile
625 630 635 640
Lys Gln Gly Glu Tyr Lys Ile Thr Pro Ile Asp Asp Lys Ala Gln Phe
645 650 655
Tyr Ile Phe Tyr Leu Lys Asp Ser Ala Ile Pro Tyr Ala Gln Phe Ile
660 665 670
Leu Met Asp Lys Thr Met Phe Asn Ser Ala Tyr Val Gln Met Phe Phe
675 680 685
Leu Gly Asn Tyr Asp Lys Asn Leu Phe Asp Leu Val Ile Asn Ser Arg
690 695 700
Asp Ala Lys Val Phe Lys Leu Lys Ile
705 710
<210> 7
<211> 364
<212> PRT
<213> Haemophilus influenzae
<400> 7
Met Lys Leu Lys Thr Leu Ala Leu Ser Leu Leu Ala Ala Gly Val Leu
1 5 10 15
Ala Gly Cys Ser Ser His Ser Ser Asn Met Ala Asn Thr Gln Met Lys
20 25 30
Ser Asp Lys Ile Ile Ile Ala His Arg Gly Ala Ser Gly Tyr Leu Pro
35 40 45
Glu His Thr Leu Glu Ser Lys Ala Leu Ala Phe Ala Gln Gln Ala Asp
50 55 60
Tyr Leu Glu Gln Asp Leu Ala Met Thr Lys Asp Gly Arg Leu Val Val
65 70 75 80
Ile His Asp His Phe Leu Asp Gly Leu Thr Asp Val Ala Lys Lys Phe
85 90 95
Pro His Arg His Arg Lys Asp Gly Arg Tyr Tyr Val Ile Asp Phe Thr
100 105 110
Leu Lys Glu Ile Gln Ser Leu Glu Met Thr Glu Asn Phe Glu Thr Lys
115 120 125
Asp Gly Lys Gln Ala Gln Val Tyr Pro Asn Arg Phe Pro Leu Trp Lys
130 135 140
Ser His Phe Arg Ile His Thr Phe Glu Asp Glu Ile Glu Phe Ile Gln
145 150 155 160
Gly Leu Glu Lys Ser Thr Gly Lys Lys Val Gly Ile Tyr Pro Glu Ile
165 170 175
Lys Ala Pro Trp Phe His His Gln Asn Gly Lys Asp Ile Ala Ala Glu
180 185 190
Thr Leu Lys Val Leu Lys Lys Tyr Gly Tyr Asp Lys Lys Thr Asp Met
195 200 205
Val Tyr Leu Gln Thr Phe Asp Phe Asn Glu Leu Lys Arg Ile Lys Thr
210 215 220
Glu Leu Leu Pro Gln Met Gly Met Asp Leu Lys Leu Val Gln Leu Ile
225 230 235 240
Ala Tyr Thr Asp Trp Lys Glu Thr Gln Glu Lys Asp Pro Lys Gly Tyr
245 250 255
Trp Val Asn Tyr Asn Tyr Asp Trp Met Phe Lys Pro Gly Ala Met Ala
260 265 270
Glu Val Val Lys Tyr Ala Asp Gly Val Gly Pro Gly Trp Tyr Met Leu
275 280 285
Val Asn Lys Glu Glu Ser Lys Pro Asp Asn Ile Val Tyr Thr Pro Leu
290 295 300
Val Lys Glu Leu Ala Gln Tyr Asn Val Glu Val His Pro Tyr Thr Val
305 310 315 320
Arg Lys Asp Ala Leu Pro Ala Phe Phe Thr Asp Val Asn Gln Met Tyr
325 330 335
Asp Val Leu Leu Asn Lys Ser Gly Ala Thr Gly Val Phe Thr Asp Phe
340 345 350
Pro Asp Thr Gly Val Glu Phe Leu Lys Gly Ile Lys
355 360
<210> 8
<211> 386
<212> PRT
<213> Neisseria meningitidis
<400> 8
Met Arg Lys Lys Leu Thr Ala Leu Val Leu Ser Ala Leu Pro Leu Ala
1 5 10 15
Ala Val Ala Asp Val Ser Leu Tyr Gly Glu Ile Lys Ala Gly Val Glu
20 25 30
Gly Arg Asn Ile Gln Leu Gln Leu Thr Glu Gln Pro Ser Lys Ala Gln
35 40 45
Gly Gln Thr Asn Asn Gln Val Lys Val Thr Lys Ala Lys Ser Arg Ile
50 55 60
Arg Thr Lys Ile Ser Asp Phe Gly Ser Phe Ile Gly Phe Lys Gly Ser
65 70 75 80
Glu Asp Leu Gly Glu Gly Leu Lys Ala Val Trp Gln Leu Glu Gln Asp
85 90 95
Val Ser Val Ala Gly Gly Gly Ala Thr Gln Trp Gly Asn Arg Glu Ser
100 105 110
Phe Ile Gly Leu Ala Gly Glu Phe Gly Thr Leu Arg Ala Gly Arg Val
115 120 125
Ala Asn Gln Phe Asp Asp Ala Ser Gln Ala Ile Asp Pro Trp Asp Ser
130 135 140
Asn Asn Asp Val Ala Ser Gln Leu Gly Ile Phe Lys Arg His Asp Asp
145 150 155 160
Met Pro Val Ser Val Arg Tyr Asp Ser Pro Asp Phe Ser Gly Phe Ser
165 170 175
Gly Ser Val Gln Phe Val Pro Ala Gln Asn Ser Lys Ser Ala Tyr Thr
180 185 190
Pro Ala Tyr Val Asp Glu Lys Gln Val Ser His Ala Ala Val Val Gly
195 200 205
Lys Pro Gly Ser Asp Val Tyr Tyr Ala Gly Leu Asn Tyr Lys Asn Gly
210 215 220
Gly Phe Ala Gly Ser Tyr Ala Phe Lys Tyr Ala Lys His Ala Asn Glu
225 230 235 240
Gly Arg Asp Ala Phe Phe Leu Phe Leu Leu Gly Ser Gly Ser Asp Glu
245 250 255
Ala Lys Gly Thr Asp Pro Leu Lys Asn His Gln Val His Arg Leu Thr
260 265 270
Gly Gly Tyr Glu Glu Gly Gly Leu Asn Leu Ala Leu Ala Ala Gln Leu
275 280 285
Asp Leu Ser Glu Asn Ala Asp Lys Thr Lys Asn Ser Thr Thr Glu Ile
290 295 300
Ala Ala Thr Ala Ser Tyr Arg Phe Gly Asn Ala Val Pro Arg Ile Ser
305 310 315 320
Tyr Ala His Gly Phe Asp Phe Ile Glu Arg Gly Lys Lys Gly Glu Asn
325 330 335
Thr Ser Tyr Asp Gln Ile Ile Ala Gly Val Asp Tyr Asp Phe Ser Lys
340 345 350
Arg Thr Ser Ala Ile Val Ser Gly Ala Trp Leu Lys Arg Asn Thr Gly
355 360 365
Ile Gly Asn Tyr Thr Gln Ile Asn Ala Ala Ser Val Gly Leu Arg His
370 375 380
Lys Phe
385
<210> 9
<211> 560
<212> PRT
<213> Corynebacterium diphtheriae
<400> 9
Met Ser Arg Lys Leu Phe Ala Ser Ile Leu Ile Gly Ala Leu Leu Gly
1 5 10 15
Ile Gly Ala Pro Pro Ser Ala His Ala Gly Ala Asp Asp Val Val Asp
20 25 30
Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr
35 40 45
Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys
50 55 60
Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp Asp Trp Lys Gly Phe Tyr Ser
65 70 75 80
Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn
85 90 95
Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly
100 105 110
Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys
115 120 125
Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu Pro Leu Met Glu Gln Val Gly
130 135 140
Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly Asp Gly Ala Ser Arg Val Val
145 150 155 160
Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn
165 170 175
Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe
180 185 190
Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala
195 200 205
Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu
210 215 220
Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp Val Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr
225 230 235 240
Lys Ile Glu Ser Leu Lys Glu His Gly Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser
245 250 255
Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser Glu Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu
260 265 270
Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu Glu His Pro Glu Leu Ser Glu Leu
275 280 285
Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro Val Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala
290 295 300
Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln Val Ile Asp Ser Glu Thr Ala Asp
305 310 315 320
Asn Leu Glu Lys Thr Thr Ala Ala Leu Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly
325 330 335
Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly Ala Val His His Asn Thr Glu Glu
340 345 350
Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu Ser Ser Leu Met Val Ala Gln Ala
355 360 365
Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val Asp Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn
370 375 380
Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu Phe Gln Val Val His Asn Ser Tyr
385 390 395 400
Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly His Lys Thr Gln Pro Phe Leu His
405 410 415
Asp Gly Tyr Ala Val Ser Trp Asn Thr Val Glu Asp Ser Ile Ile Arg
420 425 430
Thr Gly Phe Gln Gly Glu Ser Gly His Asp Ile Lys Ile Thr Ala Glu
435 440 445
Asn Thr Pro Leu Pro Ile Ala Gly Val Leu Leu Pro Thr Ile Pro Gly
450 455 460
Lys Leu Asp Val Asn Lys Ser Lys Thr His Ile Ser Val Asn Gly Arg
465 470 475 480
Lys Ile Arg Met Arg Cys Arg Ala Ile Asp Gly Asp Val Thr Phe Cys
485 490 495
Arg Pro Lys Ser Pro Val Tyr Val Gly Asn Gly Val His Ala Asn Leu
500 505 510
His Val Ala Phe His Arg Ser Ser Ser Glu Lys Ile His Ser Asn Glu
515 520 525
Ile Ser Ser Asp Ser Ile Gly Val Leu Gly Tyr Gln Lys Thr Val Asp
530 535 540
His Thr Lys Val Asn Ser Lys Leu Ser Leu Phe Phe Glu Ile Lys Ser
545 550 555 560
<210> 10
<211> 451
<212> PRT
<213> Clostridium tetani
<400> 10
Lys Asn Leu Asp Cys Trp Val Asp Asn Glu Glu Asp Ile Asp Val Ile
1 5 10 15
Leu Lys Lys Ser Thr Ile Leu Asn Leu Asp Ile Asn Asn Asp Ile Ile
20 25 30
Ser Asp Ile Ser Gly Phe Asn Ser Ser Val Ile Thr Tyr Pro Asp Ala
35 40 45
Gln Leu Val Pro Gly Ile Asn Gly Lys Ala Ile His Leu Val Asn Asn
50 55 60
Glu Ser Ser Glu Val Ile Val His Lys Ala Met Asp Ile Glu Tyr Asn
65 70 75 80
Asp Met Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys
85 90 95
Val Ser Ala Ser His Leu Glu Gln Tyr Gly Thr Asn Glu Tyr Ser Ile
100 105 110
Ile Ser Ser Met Lys Lys His Ser Leu Ser Ile Gly Ser Gly Trp Ser
115 120 125
Val Ser Leu Lys Gly Asn Asn Leu Ile Trp Thr Leu Lys Asp Ser Ala
130 135 140
Gly Glu Val Arg Gln Ile Thr Phe Arg Asp Leu Pro Asp Lys Phe Asn
145 150 155 160
Ala Tyr Leu Ala Asn Lys Trp Val Phe Ile Thr Ile Thr Asn Asp Arg
165 170 175
Leu Ser Ser Ala Asn Leu Tyr Ile Asn Gly Val Leu Met Gly Ser Ala
180 185 190
Glu Ile Thr Gly Leu Gly Ala Ile Arg Glu Asp Asn Asn Ile Thr Leu
195 200 205
Lys Leu Asp Arg Cys Asn Asn Asn Asn Gln Tyr Val Ser Ile Asp Lys
210 215 220
Phe Arg Ile Phe Cys Lys Ala Leu Asn Pro Lys Glu Ile Glu Lys Leu
225 230 235 240
Tyr Thr Ser Tyr Leu Ser Ile Thr Phe Leu Arg Asp Phe Trp Gly Asn
245 250 255
Pro Leu Arg Tyr Asp Thr Glu Tyr Tyr Leu Ile Pro Val Ala Ser Ser
260 265 270
Ser Lys Asp Val Gln Leu Lys Asn Ile Thr Asp Tyr Met Tyr Leu Thr
275 280 285
Asn Ala Pro Ser Tyr Thr Asn Gly Lys Leu Asn Ile Tyr Tyr Arg Arg
290 295 300
Leu Tyr Asn Gly Leu Lys Phe Ile Ile Lys Arg Tyr Thr Pro Asn Asn
305 310 315 320
Glu Ile Asp Ser Phe Val Lys Ser Gly Asp Phe Ile Lys Leu Tyr Val
325 330 335
Ser Tyr Asn Asn Asn Glu His Ile Val Gly Tyr Pro Lys Asp Gly Asn
340 345 350
Ala Phe Asn Asn Leu Asp Arg Ile Leu Arg Val Gly Tyr Asn Ala Pro
355 360 365
Gly Ile Pro Leu Tyr Lys Lys Met Glu Ala Val Lys Leu Arg Asp Leu
370 375 380
Lys Thr Tyr Ser Val Gln Leu Lys Leu Tyr Asp Asp Lys Asn Ala Ser
385 390 395 400
Leu Gly Leu Val Gly Thr His Asn Gly Gln Ile Gly Asn Asp Pro Asn
405 410 415
Arg Asp Ile Leu Ile Ala Ser Asn Trp Tyr Phe Asn His Leu Lys Asp
420 425 430
Lys Ile Leu Gly Cys Asp Trp Tyr Phe Val Pro Thr Asp Glu Gly Trp
435 440 445
Thr Asn Asp
450
Claims (24)
- (i) 무세포 단백질 합성 반응에서 담체 단백질을 전사 및 번역하고;
(ii) 무세포 단백질 합성 반응에서 담체 단백질을 적어도 1종의 다당류에 의해 글리코실화시키는 것을 포함하는, 시험관 내에서 조정된 전사, 번역 및 N-글리코실화를 통해 다당류를 위한 N-글리코실화 담체 단백질을 합성하는 방법이며,
여기서 담체 단백질은 삽입된 컨센서스 서열, N - X - S/T를 포함하고, X는 프롤린을 제외한 임의의 천연 또는 비천연 아미노산일 수 있고, 적어도 1종의 다당류는 적어도 1종의 박테리아 O-항원인 방법. - 제1항에 있어서, 담체 단백질이 헤모필루스 인플루엔자에(Haemophilus influenzae) 단백질 D (PD), 네이세리아 메닌기티디스(Neisseria meningitidis) 포린 단백질 (PorA), 및 그의 변이체로부터 선택되는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 박테리아 O-항원이 이. 콜라이로부터의 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 박테리아 O-항원이 프란시셀라 툴라렌시스로부터의 것인 방법.
- 제1항에 있어서, N-글리코실화 담체 단백질을 포함하는 백신 조성물로서 N-글리코실화 담체 단백질을 제형화하는 것을 추가로 포함하는 방법.
- 제1항에 있어서, 백신 조성물이 아주반트를 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 글리코실화 단계가 천연 발생 또는 조작된 박테리아 올리고사카릴트랜스퍼라제 (OST)인 OST를 사용하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 글리코실화 단계가 천연 발생 또는 조작된 고세균 올리고사카릴트랜스퍼라제 (OST)인 OST를 사용하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 글리코실화 단계가 씨. 제주니 PglB의 천연 발생 박테리아 동족체인 올리고사카릴트랜스퍼라제 (OST)를 사용하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 글리코실화 단계가 씨. 제주니 PglB의 조작된 변이체인 OST를 사용하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 글리코실화 단계가 천연 발생 단일-하위단위 진핵생물 OST인 OST를 사용하는 것인 방법.
- 제5항에 있어서, 백신 조성물을 그를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
- (i) 직교 올리고사카릴트랜스퍼라제 (OST)를 포함하는 세포 용해물을 포함하는 제1 성분;
(ii) O-항원을 포함하는 세포 용해물을 포함하는 제2 성분;
(iii) 담체 단백질을 코딩하는 전사 주형으로부터 mRNA를 합성하기 위한 전사 주형 및 폴리머라제를 포함하는 제3 성분
을 포함하며, 여기서 담체 단백질은 삽입된 컨센서스 서열, N - X - S/T를 포함하고, X는 프롤린을 제외한 임의의 천연 또는 비천연 아미노산일 수 있는 것인,
시험관 내에서 N-글리코실화 담체 단백질을 합성하기 위한 키트. - (i) 직교 올리고사카릴트랜스퍼라제 (OST) 및 O-항원을 포함하는 세포 용해물을 포함하는 제1 성분;
(ii) 담체 단백질을 코딩하는 전사 주형으로부터 mRNA를 합성하기 위한 전사 주형 및 폴리머라제를 포함하는 제2 성분
을 포함하며, 여기서 담체 단백질은 삽입된 컨센서스 서열, N - X - S/T를 포함하고, X는 프롤린을 제외한 임의의 천연 또는 비천연 아미노산일 수 있는 것인,
시험관 내에서 N-글리코실화 담체 단백질을 합성하기 위한 키트. - 제13항 또는 제14항에 있어서, 제1 성분, 제2 성분, 및 존재하는 경우 제3 성분 중 하나 이상이 동결건조된 것인 키트.
- 제13항에 있어서, 제1 성분 세포 용해물이 직교 OST를 코딩하는 유전자를 과발현하는 공급원 균주로부터 생성되는 것인 키트.
- 제13항에 있어서, 제2 성분 세포 용해물이 합성 글리코실트랜스퍼라제 경로를 과발현하는 공급원 균주로부터 생성되는 것인 키트.
- 제14항에 있어서, 제1 성분 세포 용해물이 (a) 직교 OST를 코딩하는 유전자, 및 (b) 합성 글리코실트랜스퍼라제 경로 중 하나 또는 둘 다를 과발현하는 공급원 균주로부터 생성되는 것인 키트.
- 제13항 또는 제14항에 있어서, 제2 성분 세포 용해물 또는 제1 성분 세포 용해물이 에프. 툴라렌시스(F. tularensis) Schu S4 지질-연결된 올리고당류 (FtLLO)로부터의 O-항원 또는 장독소생성 이. 콜라이(E. coli) O78 지질-연결된 올리고당류 (EcO78LLO)로부터의 O-항원을 포함하는 것인 키트.
- (a) 직교 올리고사카릴트랜스퍼라제 (OST)를 포함하는 제1 세포 용해물 및 O-항원을 포함하는 제2 세포 용해물을 혼합하여, 무세포 단백질 합성 반응을 준비하고; (b) 무세포 단백질 합성 반응에서 헤모필루스 인플루엔자에 단백질 D (PD), 네이세리아 메닌기티디스 포린 단백질 (PorA), 및 그의 변이체로부터 선택된 담체 단백질을 전사 및 번역하고; (c) 무세포 단백질 합성 반응에서 담체 단백질을 박테리아 O-항원에 의해 글리코실화시키는 것을 포함하는, 당단백질의 무세포 생성 방법이며, 여기서 담체 단백질은 삽입된 컨센서스 서열, N - X - S/T를 포함하고, X는 프롤린을 제외한 임의의 천연 또는 비천연 아미노산일 수 있는 것인 방법.
- (a) 직교 올리고사카릴트랜스퍼라제 (OST) 및 O-항원을 포함하는 제1 세포 용해물을 혼합하여, 무세포 단백질 합성 반응을 준비하고; (b) 무세포 단백질 합성 반응에서 헤모필루스 인플루엔자에 단백질 D (PD), 네이세리아 메닌기티디스 포린 단백질 (PorA), 및 그의 변이체로부터 선택된 담체 단백질을 전사 및 번역하고; (c) 무세포 단백질 합성 반응에서 담체 단백질을 박테리아 O-항원에 의해 글리코실화시키는 것을 포함하는, 당단백질의 무세포 생성 방법이며, 여기서 담체 단백질은 삽입된 컨센서스 서열, N - X - S/T를 포함하고, X는 프롤린을 제외한 임의의 천연 또는 비천연 아미노산일 수 있는 것인 방법.
- 제20항 또는 제21항에 있어서, 제2 세포 용해물 또는 제1 세포 용해물이 지질-연결된 올리고당류 (LLO)의 일부로서 O-항원을 포함하는 것인 방법.
- 제20항 또는 제21항에 있어서, 백신 조성물로서 당단백질을 제형화하는 것을 추가로 포함하는 방법.
- 제22항에 있어서, 백신 조성물을 그를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
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2020
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