JP7000343B2 - 一本鎖ｒｎａを提供する方法 - Google Patents

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Description

本発明は、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）を提供する方法に関する。さらに、本発明は、本発明の方法によって得ることができるｓｓＲＮＡ、及び治療におけるこのようなｓｓＲＮＡの使用に関する。
Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いたインビトロ転写（ＩＶＴ）によるｍＲＮＡの合成中に（Yin等、Cell 116 (2004)、393-404参照）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を含む有意な量の異常産物が、酵素の従来的でない活性のために生成される（Triana-Alonso等、JBC 270 (1995)、6298-6307；Cazenave等、PNAS USA 91(1994)、6972-6976; Gong等、JBC 281 (2006)、23533-23544参照）。ｄｓＲＮＡは、タンパク質合成阻害をもたらす炎症性サイトカインを誘導し、エフェクター酵素を活性化するため（Kariko等、Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 10 (2007)、523-532参照）、治療薬として使用されるＩＶＴ ｍＲＮＡからｄｓＲＮＡを除去することが重要である。
今日まで、ＩＶＴ ｍＲＮＡからｄｓＲＮＡを除去するための２つの異なる方法が記載されている。１つの方法は、非多孔性（Weissman等、Methods Mol. Biol. 969 (2013)、43-54参照）又は多孔性（米国特許第８３８３３４０Ｂ２号）Ｃ－１８ポリスチレン－ジビニルベンゼン（ＰＳ－ＤＶＢ）マトリックスを用いたイオン対逆相ＨＰＬＣによるＩＶＴ ｍＲＮＡの精製である。しかしながら、ＲＮＡを精製するためにＨＰＬＣを使用する方法は、いくつかの欠点を有し、例えば、複雑な装置；アセトニトリルのような毒性溶媒の使用；長い持続時間の標準的な精製操作；スケールアップの困難性；コスト；せん断のために長いＲＮＡの分解が挙げられる。
あるいは、酵素ベースの方法は、ｓｓＲＮＡではなく、ｄｓＲＮＡを特異的に加水分解する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＲＮａｓｅＩＩＩを用いて確立されており、それによってＩＶＴ ｍＲＮＡ調製物からｄｓＲＮＡ混入物を除去する（国際公開第２０１３／１０２２０３Ａ１号参照）。しかしながら、ＲＮａｓｅＩＩＩがＲＮＡで治療される患者において、望ましくない反応（望ましくない免疫反応など）を誘導する可能性がある。したがって、ＲＮＡを患者に投与する前に、酵素を除去することが必要であり、それにより、この方法の複雑さ及びコストが増大する。さらに、ＲＮａｓｅＩＩＩの使用は、しばしば、インキュベーション中にｓｓＲＮＡ、特に長いｓｓＲＮＡの部分的な分解をもたらす。これは、ｓｓＲＮＡに含有される二本鎖の二次構造のＲＮａｓｅＩＩＩ触媒による加水分解によって引き起こされる可能性が高い。
１９６６年に、非イオン性相互作用が、ＥｔＯＨの存在下で非修飾セルロース粉末ＣＦ－１１とＲＮＡとの間で記述され、クロマトグラフィーによるリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）からｓＲＮＡ（「可溶性ＲＮＡ」）を分離するために使用された（Barber, R. Biochim. Biophys. Acta 114 (1966), 422-424）。ｓＲＮＡはカラムから３５％ＥｔＯＨを用いて溶出されたが、ｒＲＮＡは、クロマトグラフィー緩衝液のＥｔＯＨ濃度を１５％に低下させることによって選択的に溶出させることができた。
Ｆｒａｎｋｌｉｎ等（PNAS USA 55 (1966)、1504-1511）は、大腸菌の全ＲＮＡからＲＮＡバクテリオファージＲ１７の複製中間体（ＲＩ）ＲＮＡを単離するために同じ分離原理を使用した。ここで、ＲＮアーゼＡ耐性ｄｓＲＮＡとして同定されたセルロース結合ＲＩ ＲＮＡは、ＥｔＯＨを含まない緩衝液中でのみ効率的に溶出された。この技術は、栗の木の寄生性真菌であるクリ胴枯病菌（Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ ｐａｒａｓｉｔｉｃａ）（Day等、Phytopathology 67 (1977)、1393）からｄｓＲＮＡを単離するために適用された。
Ｍｏｒｒｉｓ及びＤｏｄｄｓ（Phytopathology 69 (1977), 854-858）は、１５％（ｖ／ｖ）ＥｔＯＨの存在下で、植物及び真菌のＲＮＡ分離株からウイルスｄｓＲＮＡを選択的にプルダウンすることによって、上記のセルロースベースの手法を単純化した。この手法は、ｄｓＲＮＡを単離するために数十年にわたって使用されており、例えば、ＣＦ－１１セルロースを充填した市販のミニカラムを用いて、わずかな修飾のみを経て、プロセスを高速化し、サンプル処理量を増加させている（Castillo等、Virol. J. 8 (2011)、38; Okada等、Arch. Virol. 159 (2014)、807-809参照）。
本発明の目的は、上記の一又は複数の課題に対処する手段を提供することである。特に、本発明の目的は、ＨＰＬＣに基づく方法よりも費用対効果が高く、簡便であり、時間消費が少ないｓｓＲＮＡを提供するための代替の方法を提供することであり、これは、有害物質を避け、簡単にスケールアップすることができ、ＨＰＬＣを用いて得られたｓｓＲＮＡに匹敵する収率及び純度でｓｓＲＮＡを提供し、長いＲＮＡに影響せず、及び／又はＲＮＡを分解しない。本発明の根底にあるこのような目的は、本明細書のどこにでも、例えば添付の特許請求の範囲の主題によって、開示又は定義されるような主題によって解決される。
第１の態様では、本発明は、ｓｓＲＮＡを提供する方法であって、（ｉ）インビトロ転写によって生成されたｓｓＲＮＡを含むＲＮＡ調製物を提供すること；（ｉｉ）ＲＮＡ調製物を、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）のセルロース材料への結合を可能にする条件下で、セルロース材料と接触させること；及び（ｉｉｉ）ｄｓＲＮＡのセルロース材料への結合を可能にする条件下で、セルロース材料からｓｓＲＮＡを分離することを含む、方法を提供する。
第１の態様の一実施態様では、本方法は、インビトロ転写によってｓｓＲＮＡを含むＲＮＡ調製物を生成する工程をさらに含む。
第１の態様の第１の主要な実施態様では、工程（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）は、ｄｓＲＮＡのセルロース材料への結合を可能にし、ｓｓＲＮＡのセルロース材料への結合を可能にしない条件下で実施される（第１の態様のこの主要な実施態様は、時として、本明細書において「陰性」精製手法と呼ばれ、これは、ｄｓＲＮＡのセルロース材料への選択的結合を可能にし、一方、ｓｓＲＮＡは結合しないままであるためである）。
陰性精製手法の一実施態様では、工程（ｉｉ）は、ｓｓＲＮＡを含むＲＮＡ調製物を、振盪及び／又は撹拌下で、好ましくは少なくとも５分間、より好ましくは少なくとも１０分間、セルロース材料と混合することを含む。
陰性精製手法の一実施態様では、工程（ｉｉ）において、ＲＮＡ調製物は、ｓｓＲＮＡを含む液体として提供され、第１の緩衝液及び／又はセルロース材料は、第１の緩衝液中の懸濁液として提供され、第１の緩衝液は、ｄｓＲＮＡのセルロース材料への結合を可能にし、ｓｓＲＮＡのセルロース材料への結合を可能にしない濃度で、水、エタノール及び塩、好ましくは塩化ナトリウムを含む。一実施態様では、第１の緩衝液中のエタノールの濃度は、１４－２０％（ｖ／ｖ）、好ましくは１４－１６％（ｖ／ｖ）である。一実施態様では、第１の緩衝液中の塩の濃度は、１５－７０ｍＭ、好ましくは２０－６０ｍＭである。一実施態様では、第１の緩衝液は、緩衝物質、好ましくはトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）、及び／又はキレート剤、好ましくはＥＤＴＡをさらに含む。
陰性精製手法の一実施態様では、工程（ｉｉ）及び／又は工程（ｉｉｉ）において、ＲＮＡ調製物、セルロース材料、及び第１の緩衝液の混合物はチューブに入れられ、工程（ｉｉｉ）は、（１）液相及び固相が分離されるようにチューブに重力又は遠心力を適用すること；並びに（２）ｓｓＲＮＡを含む上清を回収するか又はセルロース材料を除去することを含む。代替の実施態様では、工程（ｉｉ）及び／又は工程（ｉｉｉ）において、ＲＮＡ調製物、セルロース材料、及び第１の緩衝液の混合物はスピンカラム又はフィルターデバイスに入れられ、工程（ｉｉｉ）は、（１’）液相及び固相が分離されるようにスピンカラム又はフィルターデバイスに重力、遠心力、圧力、又は真空を適用すること；並びに（２’）ｓｓＲＮＡを含むフロースルーを回収することを含む。
陰性精製手法の一実施態様において、工程（ｉｉ）及び工程（ｉｉｉ）は、１回又は２回以上、反復され、工程（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の１サイクルのうち工程（ｉｉｉ）の後に得られたｓｓＲＮＡ調製物は、次サイクルの工程（ｉｉ）においてＲＮＡ調製物として使用され、工程（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）工程の各サイクルの工程（ｉｉ）において、新鮮なセルロース材料が使用される。
第１の態様の第２の主要な実施態様では、工程（ｉｉ）は、ｄｓＲＮＡ及びｓｓＲＮＡのセルロース材料への結合を可能にする条件下で実施され；及び工程（ｉｉｉ）は、ｄｓＲＮＡのセルロース材料への結合を可能にし、ｓｓＲＮＡのセルロース材料への結合を可能にしない条件下で実施される（第１の態様のこの第２の主要な実施態様は、時として、本明細書において「陽性」精製手法と呼ばれ、これは、最初のｄｓＲＮＡ及びｓｓＲＮＡがセルロース材料に結合し、次にｓｓＲＮＡがセルロース材料から選択的に放出され、一方、ｄｓＲＮＡは結合したままであるためである）。
陽性精製手法の一実施態様では、工程（ｉｉ）は、（１）ｓｓＲＮＡを含むＲＮＡ調製物を、振盪及び／又は撹拌下で、好ましくは少なくとも５分間、より好ましくは少なくとも１０分間、セルロース材料と混合すること；並びに（２）ｄｓＲＮＡ及びｓｓＲＮＡが結合しているセルロース材料を残部から分離することを含む。
陽性精製手法の一実施態様では、工程（ｉｉ）において、ＲＮＡ調製物は、ｓｓＲＮＡ及び第２の緩衝液を含む液体として提供され、及び／又はセルロース材料は、第２の緩衝液中の懸濁液として提供され、第２の緩衝液は、ｄｓＲＮＡ及びｓｓＲＮＡのセルロース材料への結合を可能にする濃度で、水、エタノール及び塩、好ましくは塩化ナトリウムを含む。一実施態様では、第２の緩衝液中のエタノールの濃度は、少なくとも３５％（ｖ／ｖ）、好ましくは３８－４２％（ｖ／ｖ）である。一実施態様では、第２の緩衝液中の塩の濃度は、１５－７０ｍＭ、好ましくは２０－６０ｍＭである。一実施態様では、第２の緩衝液は、緩衝物質、好ましくはトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）、及び／又はキレート剤、好ましくはＥＤＴＡをさらに含む。
陽性精製手法の一実施態様では、工程（ｉｉ）（１）及び／又は（ｉｉ）（２）において、工程（ｉｉ）（１）で得られたＲＮＡ調製物とセルロース材料の混合物は、チューブに入れられ、工程（ｉｉ）（２）は、（２ａ）液相及び固相が分離されるように、チューブに重力又は遠心力をチューブに適用すること；並びに（２ｂ）上清を除去するか又はｄｓＲＮＡ及びｓｓＲＮＡが結合しているセルロース材料を回収することを含む。代替の実施態様では、工程（ｉｉ）（１）及び／又は（ｉｉ）（２）において、工程（ｉｉ）（１）で得られたＲＮＡ調製物とセルロース材料の混合物は、スピンカラム又はフィルターデバイスに入れられ、工程（ｉｉ）（２）は、（２ａ’）液相及び固相が分離されるように、スピンカラム又はフィルターデバイスに重力、遠心力、圧力、又は真空を適用すること；並びに（２ｂ’）フロースルーを廃棄することを含む。
陽性精製手法の一実施態様では、工程（ｉｉ）は、（３）ｄｓＲＮＡ及びｓｓＲＮＡが結合しているセルロース材料に第２の緩衝液のアリコートを添加すること；（４）得られた混合物を、振盪及び／又は撹拌下で、好ましくは少なくとも５分間、より好ましくは少なくとも１０分間、インキュベートすること；（５）ｄｓＲＮＡ及びｓｓＲＮＡが結合しているセルロース材料を液相から分離すること；並びに、任意選択的に（６）工程（３）から（５）を１回又は２回以上、反復することをさらに含む。
陽性精製手法の一実施態様では、工程（ｉｉｉ）は、（１）ｄｓＲＮＡ及びｓｓＲＮＡが結合しているセルロース材料を、振盪及び／又は撹拌下で、好ましくは少なくとも５分間、より好ましくは１０分間、第１の緩衝液と混合することであって、第１の緩衝液は、ｄｓＲＮＡのセルロース材料への結合を可能にし、ｓｓＲＮＡのセルロース材料への結合を可能にしない濃度で、水、エタノール及び塩、好ましくは塩化ナトリウムを含む、混合すること；並びに（２）ｓｓＲＮＡを含む液相をセルロース材料から分離することを含む。一実施態様では、第１の緩衝液中のエタノールの濃度は、１４－２０％（ｖ／ｖ）、好ましくは１４－１６％（ｖ／ｖ）である。一実施態様では、第１の緩衝液中の塩の濃度は、１５－７０ｍＭ、好ましくは２０－６０ｍＭである。一実施態様では、第１の緩衝液は緩衝物質、好ましくはトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）、及び／又はキレート剤、好ましくはＥＤＴＡをさらに含む。
陽性精製手法の一実施態様では、工程（ｉｉｉ）において、セルロース材料及び第１の緩衝液の混合物をチューブに入れ、工程（ｉｉｉ）（２）は、（２ａ）液相及び固相が分離されるようにチューブに重力又は遠心力を適用すること；並びに（２ｂ）ｓｓＲＮＡを含む上清を回収するか又はセルロース材料を除去することを含む。代替の実施態様では、工程（ｉｉｉ）において、セルロース材料及び第１の緩衝液の混合物は、スピンカラム又はフィルターデバイスに入れられ、工程（ｉｉｉ）（２）は、（２ａ’）スピンカラム又はフィルターデバイスに重力、遠心力、圧力、又は真空を適用すること；及び（２ｂ’）ｓｓＲＮＡを含むフロースルーを回収することを含む。
陽性精製手法の一実施態様では、工程（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）は、１回又は２回以上、反復され、工程（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の１サイクルのうち工程（ｉｉｉ）の後に得られたｓｓＲＮＡ調製物は、次サイクルの工程（ｉｉ）においてＲＮＡ調製物として使用され、工程（ｉｉ）及び工程（ｉｉｉ）の各サイクルの工程（ｉｉ）において、新鮮なセルロース材料が使用される。
陽性精製手法の一実施態様では、工程（ｉｉ）において、セルロース材料がカラムに入れられ、工程（ｉｉ）がｄｓＲＮＡ及びｓｓＲＮＡのセルロース材料への結合を可能にする条件下でカラム上にＲＮＡ調製物をロードすることを含み、工程（ｉｉｉ）は、ｄｓＲＮＡのセルロース材料への結合を可能にし、ｓｓＲＮＡのセルロース材料への結合を可能にしない条件下でセルロース材料からｓｓＲＮＡを溶出することを含む。一実施態様では、工程（ｉｉ）において、ＲＮＡ調製物が提供され、ｓｓＲＮＡ及び第２の緩衝液を含む液体としてカラムにロードされ、第２の緩衝液は、ｄｓＲＮＡ及びｓｓＲＮＡのセルロース材料への結合を可能にする濃度で、水、エタノール及び塩、好ましくは塩化ナトリウムを含む。一実施態様では、第２の緩衝液中のエタノールの濃度は、少なくとも３５％（ｖ／ｖ）、好ましくは３８－４２％（ｖ／ｖ）である。一実施態様では、第２の緩衝液中の塩の濃度は、１５－７０ｍＭ、好ましくは２０－６０ｍＭである。一実施態様では、第２の緩衝液は、緩衝物質、好ましくはトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）、及び／又はキレート剤、好ましくはＥＤＴＡをさらに含む。一実施態様では、工程（ｉｉｉ）は、溶離液として第１の緩衝液を用いて実施され、第１の緩衝液は、ｄｓＲＮＡのセルロース材料への結合を可能にし、ｓｓＲＮＡのセルロース材料への結合を可能にしない濃度で、水、エタノール及び塩、好ましくは塩化ナトリウムを含む。一実施態様では、第１の緩衝液中のエタノールの濃度は、１４－２０％（ｖ／ｖ）、好ましくは１４－１６％（ｖ／ｖ）である。一実施態様では、第１の緩衝液中の塩の濃度は、１５－７０ｍＭ、好ましくは２０－６０ｍＭである。一実施態様では、第１の緩衝液は緩衝物質、好ましくはトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）、及び／又はキレート剤、好ましくはＥＤＴＡをさらに含む。
第１の態様の１つの実施態様では、ＲＮＡ調製物は、Ｔ３、Ｔ７及びＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼからなる群から選択されるＲＮＡポリメラーゼを使用することによって生成される。
第１の態様の一実施態様では、工程（ｉｉ）の前に、ＲＮＡ調製物は、少なくとも１つの予備精製処理に供される。一実施態様では、少なくとも１つの予備精製処理は、一又は複数の以下：核酸の沈殿、好ましくは塩化リチウムの使用；磁気ビーズへの核酸の結合；限外ろ過；及び好ましくは二重鎖特異的ヌクレアーゼ（ＤＳＮ）の使用する、ＤＮＡの分解を含む。
第１の態様の１つの実施態様では、ｓｓＲＮＡは、ｍＲＮＡ又は阻害性ＲＮＡ（アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、又はｍｉＲＮＡなど）である。
第１の態様の一実施態様では、ｓｓＲＮＡは、長さが少なくとも２，７００ｎｔ、好ましくは少なくとも２，８００ｎｔ、少なくとも２，９００ｎｔ、少なくとも３，０００ｎｔ、少なくとも３，１００ｎｔ、少なくとも３，２００ｎｔ、少なくとも３，３００ｎｔ、少なくとも３，４００ｎｔ、例えば、少なくとも３，５００ｎｔ、少なくとも３，６００ｎｔ、少なくとも３，７００ｎｔ、少なくとも３，８００ｎｔ、少なくとも３，９００ｎｔ、少なくとも４，０００ｎｔ、少なくとも４，１００ｎｔ、少なくとも４，２００ｎｔ、少なくとも４，３００、少なくとも４，４００ｎｔ、又は少なくとも４５００ｎｔである。
第１の態様の一実施態様では、セルロース材料は、セルロース繊維、好ましくは分配クロマトグラフィー試薬としての使用に適したグレードのセルロース繊維を含む。一実施態様では、工程（ｉｉ）におけるＲＮＡ調製物と接触させる前に、セルロース材料は、洗浄セルロース材料として提供される。一実施態様では、セルロース材料の洗浄は、（Ｉ）セルロース材料を、振盪及び／又は撹拌下で、好ましくは少なくとも５分間、より好ましくは少なくとも１０分間、洗浄溶液と混合すること；並びに（ＩＩ）液体を除去するか又はセルロース材料を回収すること；並びに、任意選択的に（ＩＩＩ）工程（Ｉ）及び（ＩＩ）を１回又は２回以上、反復することを含む。一実施態様では、洗浄溶液は、（Ａ）工程（ｉｉ）が、ｄｓＲＮＡの洗浄セルロース材料への結合を可能にし、ｓｓＲＮＡの洗浄セルロース材料への結合を可能にしない条件下で実施される場合、上記又は下記で定義される第１の緩衝液（すなわち、「陰性」精製手法の実施態様における）、又は（Ｂ）工程（ｉｉ）が、ｄｓＲＮＡ及びｓｓＲＮＡの洗浄セルロース材料への結合を可能にする条件下で工程（ｉｉ）が行われる場合、上記又は下記で定義される第２の緩衝液（すなわち、「陽性」精製手法の実施態様において）の組成物を含む。
第２の態様では、本発明は、第１の態様の何れかの方法によって得ることができるｓｓＲＮＡを提供する。第２の態様の一実施態様では、ｓｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡを実質的に含まず、及び／又はＤＮＡを実質的に含まず、好ましくはｄｓＲＮＡ及びＤＮＡを実質的に含まない。
第３の態様では、本発明は、治療における使用のための第２の態様のｓｓＲＮＡを提供する。
本発明のさらなる態様並びに利点及び新規な特徴は、任意選択的に添付の図面と併せて、以下の詳細な説明から明らかになる。
セルロースによるＩＶＴ ＲＮＡからのｄｓＲＮＡのプルダウンを示す図である。１６％（ｖ／ｖ）ＥｔＯＨを含有する１×ＳＴＥ緩衝液の存在下でセルロース材料とともにインキュベートした後、５０μｇの２５００ｎｔ長のｍ１Ψ修飾されたＩＶＴ ＲＮＡの未結合及び結合画分は、ｄｓＲＮＡ特異的Ｊ２抗体を用いたドットブロッティングによって、ｄｓＲＮＡ混入物について分析された。比較のために、未精製ＲＮＡ（インプット）を並行して分析した。対応するＲＮＡの１８０ｎｇ、９００ｎｇ及び１，８００ｎｇ ＲＮＡをドットブロット分析のためにロードした。ＲＮＡ完全性を制御するために、８０ｎｇのＲＮＡを１．４％（ｗ／ｖ）アガロースゲル上にロードし、電気泳動により分離した。 セルロースによるＩＶＴ ＲＮＡからのｄｓＲＮＡ除去効率における様々な濃度のＥｔＯＨの影響を示す図である。１６％（ｖ／ｖ）、１８％（ｖ／ｖ）又は２０％（ｖ／ｖ）ＥｔＯＨを含有する１×ＳＴＥ緩衝液の存在下でセルロース材料とともにインキュベートした後、５０μｇの１，５００ｎｔ長のｍ１Ψ修飾され、Ｄ２キャップされたＩＶＴ ＲＮＡの未結合及び結合画分は、ｄｓＲＮＡ特異的Ｊ２抗体又はＲＮＡ－ＤＮＡハイブリッド特異的Ｓ９．６抗体をそれぞれ用いたドットブロッティングにより、ｄｓＲＮＡ及びＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド混入物について、分析された。比較のために、未精製ＲＮＡ（インプット）を並行して分析した。対応するＲＮＡの４０ｎｇ、２００ｎｇ、及び１，０００ｎｇ ＲＮＡを、ドットブロット分析において示された抗体とそれぞれハイブリダイズした２つの別々の膜上にロードした。 ＲＮａｓｅＩＩＩ処理及びＨＰＬＣ精製に対するＩＶＴ ＲＮＡのセルロース精製の比較を示す図である。１００μｇの２，５００ｎｔ長のｍ１Ψ修飾されたＩＶＴ ＲＮＡは、マイクロ遠心分離スピンカラム及び１６％（ｖ／ｖ）ＥｔＯＨを含有する１×ＳＴＥ緩衝液を用いて、セルロースによって１倍、２倍又は３倍精製された。２００ｎｇ、１，０００ｎｇ及び３，０００ｎｇのセルロース精製ＲＮＡは、ｄｓＲＮＡ特異的Ｊ２抗体を用いたドットブロッティングにより、ｄｓＲＮＡ混入物について分析された。比較のために、同量の未精製ＲＮＡ並びにＲＮａｓｅＩＩＩ処理ＲＮＡ及びＨＰＬＣ精製ＲＮＡをドットブロット膜にロードした。ハイブリダイゼーションシグナルはデンシトメトリーによって定量化され、値は、未精製ＲＮＡから除去されたｄｓＲＮＡのパーセンテージとして表された。ＲＮＡ完全性を制御するために、８０ｎｇのＲＮＡを１．４％（ｗ／ｖ）アガロースゲル上にロードし、電気泳動により分離した。 ＩＶＴ ＲＮＡからｄｓＲＮＡを除去する際の様々なタイプのセルロースの性能の比較を示す図である。様々なセルロース（Ｓｉｇｍａ、Ｃ６２８８；Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ、ＭＮ １００及びＭＮ２１００）、マイクロ遠心分離スピンカラム及び１６％（ｖ／ｖ）ＥｔＯを含有する１×ＳＴＥ緩衝液を用いた１サイクルの精製後、１００μｇの１，５００ｎｔ長のｍ１Ψ修飾されたＩＶＴ ＲＮＡの未結合及び結合画分をドットブロッティングにより分析した。８０ｎｇ、４００ｎｇ及び２，０００ｎｇのＲＮＡサンプルは、ｄｓＲＮＡ特異的Ｊ２抗体を用いて、ｄｓＲＮＡ混入物について分析された。比較のために、同量の未精製ＲＮＡ（インプットＲＮＡ）をドットブロット膜にロードした。ハイブリダイゼーションシグナルをデンシトメトリーによって定量化し、値は、未精製ＲＮＡから除去したｄｓＲＮＡのパーセンテージとして表された。ＲＮＡの完全性をモニターするために、８０ｎｇのＲＮＡを１．４％（ｗ／ｖ）アガロースゲルにロードし、電気泳動により分離した。 セルロース精製法は拡張性であることを示す図である。５ｍｇの１，９００ｎｔ長のＤ１キャップされたＩＶＴ ＲＮＡは、真空駆動フィルターデバイス及び１６％（ｖ／ｖ）ＥｔＯＨを含有する１×ＳＴＥ緩衝液を用いてセルロースにより１倍又は２倍精製された。４０ｎｇ、２００ｎｇ及び１，０００ｎｇのセルロース精製ＲＮＡは、ｄｓＲＮＡ特異的Ｊ２抗体を用いたドットブロッティングにより、ｄｓＲＮＡ混入物について分析された。比較のために、同量の未精製ＲＮＡ（インプットＲＮＡ）をドットブロット膜にロードした。ハイブリダイゼーションシグナルをデンシトメトリーによって定量化し、値は、未精製ＲＮＡから除去されたｄｓＲＮＡのパーセンテージとして表された。ＲＮＡの完全性を制御するために、８０ｎｇのＲＮＡを１．４％（ｗ／ｖ）アガロースゲル上にロードし、電気泳動により分離した。両方のサンプルのＲＮＡ回収率を示す。 「陽性」精製手法を用いて様々な長さを有するＩＶＴ ＲＮＡの精製を示す図である。４００μｇの＞１０，０００ｎｔ長のＤ１キャップされたＩＶＴ ＲＮＡ、１，３００ｎｔ長のＤ２キャップされたＩＶＴ ＲＮＡ（Ａ）及び２，５００ｎｔ長のＩＶＴ ＲＮＡ（キャップされていない）（Ｂ）をセルロース精製の２サイクルのために使用した。何れのＲＮＡもヌクレオシド修飾を含有しなかった。最初のサイクル中に、ＲＮＡを、４０％（ｖ／ｖ）のＥｔＯＨを含有する１×ＳＴＥを用いてセルロースに完全に結合させ、その後、１６％（ｖ／ｖ）含有緩衝液により溶出し、セルロース材料を含有する第２のマイクロ遠心分離カラムに移した（「陽性」精製）。指示された量の精製ＲＮＡは、ｄｓＲＮＡ特異的Ｊ２抗体を用いたドットブロッティングによってｄｓＲＮＡ混入物について分析された。比較のために、同量の未精製ＲＮＡをドットブロット膜にロードした。ＲＮＡの完全性をモニターするために、８０ｎｇのＲＮＡを１．４％（ｗ／ｖ）アガロースゲルにロードし、電気泳動により分離した。 様々なイオン強度を有する緩衝液を用いたＩＶＴ ＲＮＡの精製を示す図である。２５０μｇ（Ａ）又は１６０μｇ（Ｂ）の１，３００ｎｔ長のｍ１Ψ修飾されたＩＶＴ ＲＮＡは、２５－１５０ｍＭのＮａＣｌ（Ａ）又は０－５０ｍＭのＮａＣｌ（Ｂ）を含有する１×ＳＴＥ緩衝液を使用してセルロース精製された。１６％（ｖ／ｖ）ＥｔＯＨを含有する対応する緩衝液による溶出、続く、０％（ｖ／ｖ）ＥｔＯＨ緩衝液による溶出前に、ＲＮＡを、４０％（ｖ／ｖ）ＥｔＯＨの存在下でセルロースに完全に結合させた。４０ｎｇ、２００ｎｇ、１，０００ｎｇ及び３０００ｎｇの溶出されたＲＮＡは、ｄｓＲＮＡ特異的Ｊ２抗体を用いたドットブロッティングにより、ｄｓＲＮＡ混入物について分析された。回収率が低いため、０％（ｖ／ｖ）ＥｔＯＨで溶出された４０ｎｇ、２００ｎｇ及び１，０００ｎｇのＲＮＡのみが（Ｂ）のドットブロット分析のためにロードされた。比較のために、同量の未精製ＲＮＡ（インプットＲＮＡ）をドットブロット膜にロードした。ハイブリダイゼーションシグナルをデンシトメトリーによって定量化し、値は、未精製ＲＮＡから除去したｄｓＲＮＡのパーセンテージとして表された。ＲＮＡの完全性をモニターするために、８０ｎｇのＲＮＡを１．４％（ｗ／ｖ）アガロースゲルにロードし、電気泳動により分離した。 ＦＰＬＣによるＩＶＴ ＲＮＡのセルロース精製を示す図である。（Ａ）５００μｇの１，３００ｎｔ長のｍ１Ψ修飾されたＩＶＴ ＲＮＡのＦＰＬＣクロマトグラムを示し、ＲＮＡは４ｇのセルロース材料で充填されたＸＫ １６／２０カラムにロードされた。結合は、４０％（ｖ／ｖ）ＥｔＯＨを含有する１×ＳＴＥを用いて行われた。ｓｓＲＮＡ及びｄｓＲＮＡ混入物は、泳動緩衝液のＥｔＯＨ濃度をそれぞれ１６％（ｖ／ｖ）及び０％（ｖ／ｖ）に減少させることにより溶出された。クロマトグラムの灰色の枠で指示され画分を回収した（Ｆ１：１６％ＥｔＯＨ溶出液、Ｆ２：０％ＥｔＯＨ溶出液）。（Ｂ）画分Ｆ１及びＦ２から回収された４０ｎｇ、２００ｎｇ、１，０００ｎｇ及び３，００００ｎｇのＲＮＡは、ｄｓＲＮＡ特異的Ｊ２抗体を用いたドットブロッティングによりｄｓＲＮＡ混入物について分析された。比較のために、同量の未精製ＲＮＡ（インプットＲＮＡ）をドットブロット膜にロードした。ハイブリダイゼーションシグナルをデンシトメトリーによって定量化し、値は、未精製ＲＮＡから除去したｄｓＲＮＡのパーセンテージとして表された。ＲＮＡの完全性をモニターするために、８０ｎｇのＲＮＡを１．４％（ｗ／ｖ）アガロースゲルにロードし、電気泳動により分離した。 ｓｓＲＮＡ溶出のための様々なＥｔＯＨ濃度を用いたＩＶＴ ＲＮＡの精製を示す図である。２００μｇの１，５００ｎｔ長のＤ１キャップされたＩＶＴ ＲＮＡは、ｓｓＲＮＡ溶出を溶出するために、６％、１０％、１２％、１４％、１６％、１８％、２０％又は２４％（ｖ／ｖ）のＥｔＯＨを含有する１×ＳＴＥ緩衝液を用いてセルロース精製された。溶出前に、ＲＮＡを、４０％（ｖ／ｖ）ＥｔＯＨの存在下でセルロースに完全に結合させた。２００ｎｇ、１，０００ｎｇ及び３，０００ｎｇの溶出されたｓｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡ特異的Ｊ２抗体を用いたドットブロッティングにより、ｄｓＲＮＡ混入物について分析された（Ａ）。比較のために、同量の未精製ＲＮＡ（インプットＲＮＡ）をドットブロット膜にロードした。ＲＮＡの完全性をモニターするために、８０ｎｇのＲＮＡを１．４％（ｗ／ｖ）アガロースゲルにロードし、電気泳動により分離した。（Ｂ）ハイブリダイゼーションシグナルをデンシトメトリーで定量化し、値（未精製ＲＮＡから除去されたｄｓＲＮＡのパーセンテージとして表される）は、溶出に使用されたＥｔＯＨ濃度に対してプロットされ（実線）、個々の溶出液から回収されたＲＮＡの比率と比較された（破線）。 セルロースのＲＮＡ結合能の決定を示す図である。０．１ｇのセルロース（Ｓｉｇｍａ、Ｃ６２８８）は、マイクロ遠心分離カラムにおいて４０％（ｖ／ｖ）ＥｔＯＨを含有する５００μｌの１×ＳＴＥ中で、２５μｇ、５０μｇ、１００μｇ、２５０μｇ、５００μｇ、７５０μｇ、１，０００μｇ又は１，５００μｇの１，５００ｎｔ長のＤ１キャップされたＩＶＴ ＲＮＡとともにインキュベートされた。遠心分離による未結合ＲＮＡの分離後、セルロース結合ＲＮＡは、最初に１６％（ｖ／ｖ）ＥｔＯＨを含有する１×ＳＴＥを用いて、最後にＨ２Ｏ（０％（ｖ／ｖ）ＥｔＯＨ）を用いて段階的に溶出された。沈殿後、フロースルー（Ａ、Ｂ；４０％（ｖ／ｖ）ＥｔＯＨ、実線）、１６％（ｖ／ｖ）ＥｔＯＨ溶出液（Ａ、Ｂ；破線）及び０％（ｖ／ｖ）ＥｔＯＨ溶出液（Ａ、Ｂ；点線）から回収されたＲＮＡの量は、分光光度法によって決定され、精製に使用されたＲＮＡの総量に対してプロットされた。値は、使用されたＲＮＡの総量に対する回収率（Ａ）として、又は回収されたＲＮＡの総収量（Ｂ）として示される。１６％（ｖ／ｖ）溶出液から回収された２００ｎｇ、１，０００ｎｇ及び３，０００ｎｇのＲＮＡは、ｄｓＲＮＡ特異的Ｊ２抗体を用いたドットブロッティングにより、ｄｓＲＮＡ混入物について分析された（Ｃ）。比較のために、同量の未精製ＲＮＡ（インプットＲＮＡ）をドットブロット膜にロードした。ＲＮＡの完全性をモニターするために、これらのＲＮＡの８０ｎｇを１．４％（ｗ／ｖ）アガロースゲルにロードし、電気泳動により分離した。ハイブリダイゼーションシグナルをデンシトメトリーにより定量化し、値（未精製ＲＮＡから除去されたｄｓＲＮＡのパーセンテージとして表される）は、精製に使用されたＲＮＡの総量に対して値をプロットされ（Ｄ；実線）、個々の１６％（ｖ／ｖ）ＥｔｏＨ溶出液から回収されＲＮＡの割合と比較された（Ｄ；破線）。 その翻訳能力及び免疫原性におけるＩＶＴ ＲＮＡのセルロース精製の影響を示す図である。マウスエリスロポエチン（ＥＰＯ）をコードするＤ１キャップされたＩＶＴ ＲＮＡ（２００μｇ）を未精製のままとしたか又はそれぞれセルロース材料で満たした２つのスピンカラムを用いた２工程手法によって精製した。第１のカラム：ＩＶＴ ＲＮＡの陽性精製（すなわち、４０％（ｖ／ｖ）ＥｔＯＨを含有する１×ＳＴＥ緩衝液を用いたｄｓＲＮＡ及びｓｓＲＮＡの結合；１６％（ｖ／ｖ）ＥｔＯＨを含有する１×ＳＴＥ緩衝液を用いたｓｓＲＮＡの溶出）；第２のカラム：第１のカラムからの溶出液の陰性精製（すなわち、ｓｓＲＮＡを含有する溶出液であり、１６％ＥｔＯＨを含有する１×ＳＴＥ緩衝液を用いて第１カラムから得られる）。第２のカラムから得られたフロースルーをイソプロパノール／酢酸ナトリウムで沈殿させ、Ｈ２Ｏに再溶解させた。ＴｒａｎｓＩＴ（Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ）を用いた製剤化後、ＩＶＴ ＲＮＡを３μｇＲＮＡ／動物の用量でマウス（ｎ＝４匹）に腹腔内注射した。血液を注射の２、６、及び２４時間後に採取し、血漿サンプルを回収した。コントロールマウスにはＴｒａｎｓＩＴのみが注射された。マウスインターフェロンアルファ（Ａ）及びマウスＥＰＯ（Ｂ）のレベルは、特異的ＥＬＩＳＡアッセイ（マウスインターフェロンアルファ特異的ＥＬＩＳＡ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）；マウスＥＰＯ特異的ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡ発色キット（Ｒ＆Ｄ））を用いて測定された。
本発明は以下にさらに詳細に記載されるが、本発明は、これらが変更され得るため、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコール及び試薬に限定されないことを理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特定の実施態様のみを説明するためのものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図しないことを理解するべきである。他に定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語及び科学用語は、当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
以下では、本発明の要素をより詳細に説明する。これらの要素は、特定の実施態様とともに列挙されているが、追加の実施態様を作製するために任意の方法及び任意の数で組み合わせられることを理解するべきである。様々に記載された実施例及び好ましい実施態様は、本発明を明示的に記載された実施態様のみに限定するものとして解釈されるべきではない。この説明は、明示的に記載された実施態様を、任意の数の開示された及び／又は好ましい要素と組み合わせる実施態様を支持及び包含するものと理解されるべきである。さらに、本出願において、記載されているすべての要素の任意の順列及び組合せは、文脈からそうでないことが示されていない限り、本出願の記載によって開示されるものとして考慮されるべきである。例えば、好ましい実施態様では、ｓｓＲＮＡが１２０ヌクレオチドからなるポリ（Ａ）尾部を含み、別の好ましい実施態様では、ｓｓＲＮＡ分子が５’キャップ類似体を含む場合、好ましい実施態様では、ｓｓＲＮＡは１２０ヌクレオチドからなるポリ（Ａ）尾部及び５’キャップ類似体を含む。同様に、好ましい実施態様では、第１の緩衝液中のＥｔＯＨ濃度が１４－１６％（ｖ／ｖ）であり、別の好ましい実施態様では、第１の緩衝液中のキレート剤濃度が１５－４０ｍＭである場合、次に、好ましい実施態様では、第１の緩衝液は、濃度が１４－１６％（ｖ／ｖ）のＥｔＯＨ及び濃度が１５から４０ｍＭのキレート剤を含む。
好ましくは、本明細書で使用される用語は、「Ａ ｍｕｌｔｉｌｉｎｇｕａｌ ｇｌｏｓｓａｒｙ ｏｆ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｅｒｍｓ：（ＩＵＰＡＣ Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ）」，Ｈ．Ｇ．Ｗ．Ｌｅｕｅｎｂｅｒｇｅｒ、Ｂ．Ｎａｇｅｌ、及びＨ．Ｋｏｌｂｌ編、Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ、ＣＨ－４０１０ Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ、（１９９５）に記載されるように定義される。
本発明の実施は、他に指示がなければ、当該技術分野の文献で説明されている化学、生化学、及び組換えＤＮＡ技術の従来の方法を用いる（例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第2版、J. Sambrook等 編、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor 1989参照）。
本明細書及び以下の特許請求の範囲を通じて、文脈が他を必要としない限り、語句「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、記述されたメンバー、整数若しくは工程、又はメンバー、整数若しくは工程の群の包含を意味すると理解されるが、任意の他のメンバー、整数もしく工程、及びメンバー、整数若しくは工程の群を排除するものではない。用語「本質的に～からなる」とは、任意の本質的な意味を有する他のメンバー、整数又は工程を排除することを意味する。用語「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「本質的に～からなる」という用語を包含し、これは用語「からなる」を包含する。したがって、本出願における各場合において、用語「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「本質的に～からなる」又は「～からなる」という用語で置き換えることができる。同様に、本出願における各場合において、用語「本質的に～からなる」は、用語「からなる」で置き換えることができる。
本発明を説明する文脈において（特に特許請求の範囲において）使用される用語「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」並びに類似の関連語は、本明細書において他に指示がない限り、又は文脈によって明らかに矛盾していない限り、単数形と複数形の両方を包含すると解釈されるべきである。本明細書における値の範囲の列挙は、その範囲内のそれぞれ別個の値を個々に参照する略式の方法として役立つことを単に意図するものである。本明細書において他に示されない限り、それぞれ各値は、本明細書において個別に列挙されているかのように本明細書に援用される。本明細書において記載されているすべての方法は、本明細書において他に指示されない限り、又は文脈と明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施することができる。本明細書において提供される、あらゆる例、又は例示的な言葉（例えば、「など」）の使用は、単に本発明をよりよく説明するためのものであり、他のかたちで請求される本発明の範囲を限定するものではない。本明細書においていかなる言葉も、本発明の実施に不可欠な任意の請求されていない要素を示すものとして解釈されるべきではない。
本明細書の本文を通していくつかの文献が引用されている。本明細書において引用された各文献（すべての特許、特許出願、科学刊行物、製造者の仕様書、指示書などを含む）は、上記又は下記の何れかにかかわらず、出典明示によりそれらの全体が本明細書に援用される。本明細書中のいかなるものも、本発明が、先行する発明によるこのような開示よりも先行する資格がないと認めるものとして解釈されるべきではない。
本明細書で使用される「ｄｓＲＮＡのセルロース材料への結合を可能にする条件」という表現は、ｄｓＲＮＡのセルロース材料への結合（好ましくは非共有結合又は吸着）を促進（例えば、増強）し、セルロース材料から、セルロース材料に結合しているｄｓＲＮＡの放出を阻害し、及び／又は遊離ｄｓＲＮＡ（すなわち、セルロース材料に結合していないｄｓＲＮＡ）の量を低減させる条件を意味する。これらの条件は、ｄｓＲＮＡ（例えば、ｓｓＲＮＡ）以外のＲＮＡのセルロース材料への結合を可能にするか又は可能にしない条件であり得る。したがって、一実施態様では、「ｄｓＲＮＡのセルロース材料への結合を可能にする条件」という表現は、「ｄｓＲＮＡのセルロース材料への結合を可能にし、ｓｓＲＮＡのセルロース材料への結合を可能にしない条件」である。この実施態様では、条件は、（ｉ）ｄｓＲＮＡのセルロース材料への結合（好ましくは非共有結合又は吸着）を促進（例えば、増強）し、セルロース材料から、セルロース材料に結合しているｄｓＲＮＡの放出を阻害し、及び／又は遊離ｄｓＲＮＡの量（すなわち、セルロース材料に結合していないｄｓＲＮＡの量）を低減させ、並びに（ｉｉ）ｓｓＲＮＡの非結合状態（すなわち、セルロース材料に結合していないか又は吸着されていないｓｓＲＮＡの状態）を促進（例えば、増強）し、セルロース材料へ結合した（好ましくは、非共有結合又は吸着した）ｓｓＲＮＡの量を低減させ、及び／又はｓｓＲＮＡのセルロース材料への結合（好ましくは、非共有結合又は吸着）を阻害する。代替の実施態様では、「ｄｓＲＮＡのセルロース材料への結合を可能にする条件」という表現は、「ｄｓＲＮＡ及びｓｓＲＮＡのセルロース材料への結合を可能にする条件」である。この代替の実施態様では、条件は、ｄｓＲＮＡ及びｓｓＲＮＡのセルロース材料への結合（好ましくは非共有結合又は吸着）を促進（例えば、増強）し、セルロース材料から、セルロース材料に結合しているｄｓＲＮＡ及びｓｓＲＮＡの放出を阻害し、並びに／又は遊離ｄｓＲＮＡ及びｓｓＲＮＡの量（すなわち、セルロース材料に結合していないｄｓＲＮＡ及びｓｓＲＮＡの量）を低減させる。
ｄｓＲＮＡ／ｓｓＲＮＡのセルロース材料への結合を可能にするか又は可能にしない上記の条件は、ｄｓＲＮＡ／ｓｓＲＮＡを含むＲＮＡ調製物が溶解されるか又はセルロース材料に添加される培地の組成（緩衝液の組成など）によって制御することができる。この点において、「組成」は、培地中（例えば、緩衝液中）に含有する成分の種類及び量を意味する。
したがって、一実施態様では、「ｄｓＲＮＡのセルロース材料への結合を可能にし、ｓｓＲＮＡのセルロース材料への結合を可能にしない条件」は、水、エタノール、及びｄｓＲＮＡのセルロース材料への結合を可能にし、ｓｓＲＮＡのセルロース材料への結合を可能にしない濃度の塩を含む第１の培地（例えば、第１の緩衝液）によって達成され得る。したがって、これらの条件を満たすために、工程（ｉｉ）において、ＲＮＡ調製物は、ｓｓＲＮＡ及び第１の培地（例えば、第１の緩衝液）を含む液体として提供され得；セルロース材料は、第１の培地（例えば、第１の緩衝液）中の懸濁液として（例えば、第１の培地（例えば、第１の緩衝液）が洗浄液として使用されている洗浄セルロース材料として）提供され得；ＲＮＡ調製物は、ｓｓＲＮＡ及び第１の培地（例えば、第１の緩衝液）を含む液体として提供され得、セルロース材料は、第１の培地（例えば、第１の緩衝液）中の懸濁液として提供され得；又はＲＮＡ調製物は、ｓｓＲＮＡ及び第１の培地（例えば第１の緩衝液）を含む液体として提供され得、セルロース材料は、洗浄セルロース材料（第１の培地（例えば第１の緩衝液）が洗浄溶液として使用されている）として、乾燥形態で若しくは第１の培地（例えば、第１の緩衝液）中の懸濁液の何れかで提供され得る。
「ｄｓＲＮＡのセルロース材料への結合を可能にし、ｓｓＲＮＡのセルロース材料への結合を可能にしない濃度において」という表現は、第１の培地（例えば、第１の緩衝液）中の成分（特に水、エタノール及び塩）の濃度が、（ｉ）ｄｓＲＮＡのセルロース材料への結合（好ましくは非共有結合又は吸着）を促進（例えば、増強）し、第１の培地（例えば、第１の緩衝液中に）中に、セルロース材料から、セルロース材料に結合しているｄｓＲＮＡの放出を阻害し、及び／又は第１の培地（例えば、第１の緩衝液）中の遊離ｄｓＲＮＡの量（すなわち、セルロース材料に結合していないｄｓＲＮＡの量）を低減させ、並びに（ｉｉ）ｓｓＲＮＡの非結合状態（すなわち、セルロース材料に結合していないか又は吸着されていないｓｓＲＮＡの状態）を促進（例えば、増強）し、セルロース材料に結合した（好ましくは、非共有結合又は吸着した）ｓｓＲＮＡの量を低減させ、及び／又はｓｓＲＮＡのセルロース材料への結合（好ましくは、非共有結合又は吸着）を阻害するのに十分であることを意味する。
さらに、一実施態様では、「ｄｓＲＮＡ及びｓｓＲＮＡのセルロース材料への結合を可能にする条件」は、水、エタノール、並びにｄｓＲＮＡ及びｓｓＲＮＡのセルロース材料への結合を可能にする濃度の塩を含む第２の培地（例えば、第２の緩衝液）によって達成することができる。したがって、これらの条件を満たすために、工程（ｉｉ）において、ＲＮＡ調製物は、ｓｓＲＮＡ及び第２の培地（例えば、第２の緩衝液）を含む液体として提供され得；セルロース材料は、第２の培地（例えば、第２の緩衝液）中の懸濁液として（例えば、第２の培地（例えば、第２の緩衝液）が洗浄液として使用されている洗浄セルロース材料として）提供され得；ＲＮＡ調製物は、ｓｓＲＮＡ及び第２の培地（例えば、第２の緩衝液）を含む液体として提供され得、セルロース材料は、第２の培地（例えば、第２の緩衝液）中に懸濁液として提供され得；又はＲＮＡ調製物は、ｓｓＲＮＡ及び第２の培地（例えば第２の緩衝液）を含む液体として提供され得、セルロース材料は、洗浄セルロース材料（第２の培地（例えば第２の緩衝液）が洗浄溶液として使用されている）として、乾燥形態で若しくは第２の培地（例えば、第２の緩衝液）中の懸濁液の何れかで提供され得る。
「ｄｓＲＮＡ及びｓｓＲＮＡのセルロース材料への結合を可能にする濃度において」という表現は、第２の培地（例えば、第２の緩衝液）中の成分（特に水、エタノール及び塩）の濃度が、ｄｓＲＮＡ及びｓｓＲＮＡのセルロース材料への結合（好ましくは非共有結合又は吸着）を促進（例えば、増強）し、第２の培地（例えば、第２の緩衝液）中に、セルロース材料からのセルロース材料に結合しているｄｓＲＮＡ及びｓｓＲＮＡの放出を阻害し、並びに／又は第２の培地（例えば、第２の緩衝液）中の遊離ｄｓＲＮＡ及びｓｓＲＮＡの量（すなわち、セルロース材料に結合していないｄｓＲＮＡ及びｓｓＲＮＡの量）を低減させるのに十分であることを意味する。
驚くべきことに、本発明者らは、ｓｓＲＮＡではなくｄｓＲＮＡは、濃度が１４－２０％（ｖ／ｖ）のエタノールの存在下でセルロース材料に選択的に結合することを見出した。したがって、一実施態様では、「ｄｓＲＮＡのセルロース材料への結合を可能にし、ｓｓＲＮＡのセルロース材料への結合を可能にしない条件」は、濃度が１４－２０％（ｖ／ｖ）、好ましくは１４－１９％（ｖ／ｖ）、より好ましくは１４－１８％（ｖ／ｖ）、例えば、１４－１７％（ｖ／ｖ）、１４－１６％（ｖ／ｖ）、１５－１９％（ｖ／ｖ）、１５－１８％（ｖ／ｖ）、１５－１７％（ｖ／ｖ）、１６－１９％（ｖ／ｖ）、又は１６－１８％（ｖ／ｖ）であるエタノールを含有する上記で特定される第１の培地（例えば、第１の緩衝液）によって達成され得る。一実施態様では、第１の培地（例えば、第１の緩衝液）は、上記で開示された範囲のエタノールに加えて、濃度が１５－７０ｍＭ、好ましくは２０－６０ｍＭ、例えば、２５－５０ｍＭ又は３０－５０ｍＭである塩を含む。第１の培地（例えば、第１の緩衝液）中の塩は、好ましくは塩化ナトリウムである。しかしながら、本出願で提供される情報及びデータに基づいて、当業者は、本発明の方法に使用される第１の培地（例えば、第１の緩衝液）に適した他の塩及びそれらの濃度を容易に決定することができる。第１の培地（例えば、第１の緩衝液）のさらなる任意選択的な成分は、緩衝物質（好ましくはＴＲＩＳ又はＨＥＰＥＳ、より好ましくはＴＲＩＳ）、及び／又はキレート剤（好ましくはＥＤＴＡ又はニトリロ三酢酸、より好ましくはＥＤＴＡ）を含む。一実施態様では、第１の培地（例えば、第１の緩衝液）中の緩衝物質の濃度は、５－４０ｍＭ、好ましくは６－３０ｍＭ、例えば、８－２０ｍＭ又は１０－１５ｍＭである。一実施態様では、第１の培地（例えば、第１の緩衝液）のｐＨは、６．５－８．０、好ましくは６．７－７．８、例えば、６．８－７．２（例えば、ＴＲＩＳが緩衝物質である場合）又は７．３－７．７（ＨＥＰＥＳが緩衝物質である場合）である。一実施態様では、第１の培地（例えば、第１の緩衝液）中のキレート剤の濃度は、１０－５０ｍＭ、好ましくは１５－４０ｍＭ、例えば、２０－３０ｍＭである。
一実施態様では、第１の培地（例えば、第１の緩衝液）は、水、エタノール、ＴＲＩＳ及びＥＤＴＡ（例えば、水、エタノール、塩（好ましくは塩化ナトリウム）、ＴＲＩＳ及びＥＤＴＡ）を、好ましくは第１の培地（例えば、第１の緩衝液）に対して上記で特定される濃度で含む。しかしながら、本出願で提供される情報及びデータに基づいて、当業者は、本発明の方法に使用される第１の培地（例えば、第１の緩衝液）に適した、ＴＲＩＳ以外の緩衝物質及び／又はＥＤＴＡ以外のキレート剤及び／又は塩化ナトリウム以外の塩並びにそれらの濃度を容易に決定することができる。例えば、一実施態様では、第１の培地（例えば、第１の緩衝液）は、上記で開示された範囲（すなわち、１４－２０％（ｖ／ｖ）など）のエタノールに加えて、５－４０ｍＭの量のＴＲＩＳ、及び１５－７０ｍＭの量の塩（好ましくは塩化ナトリウム）を含む。別の実施態様では、第１の培地（例えば、第１の緩衝液）は、上記で開示された範囲（すなわち、１４－２０％（ｖ／ｖ）など）のエタノールに加えて、５－４０ｍＭの量のＨＥＰＥＳ及び１００－１５０ｍＭ（例えば、１１０－１４０ｍＭ又は１２０－１３０ｍＭ）の量の塩（好ましくは塩化ナトリウム）を含む。
一実施態様では、「ｄｓＲＮＡ及びｓｓＲＮＡのセルロース材料への結合を可能にする条件」は、少なくとも３５％（ｖ／ｖ）、好ましくは少なくとも３６％（ｖ／ｖ）、少なくとも３７％（ｖ／ｖ）、少なくとも３８％（ｖ／ｖ）、少なくとも３９％（ｖ／ｖ）、少なくとも４０％（ｖ／ｖ）、例えば、３５－４５％（ｖ／ｖ）、３６－４５％（ｖ／ｖ）、３７－４５％（ｖ／ｖ）、３８－４５％（ｖ／ｖ）、３８－４２％（ｖ／ｖ）、又は３９－４１％（ｖ／ｖ）の濃度のエタノールを含有する上記で特定される第２の培地（例えば、第２の緩衝液）によって達成され得る。一実施態様では、第２の培地（例えば、第２の緩衝液）は、上記の開示された範囲内のエタノール（すなわち、少なくとも３５％（ｖ／ｖ）、少なくとも３６％（ｖ／ｖ）、３７％（ｖ／ｖ）、少なくとも３８％（ｖ／ｖ）など）に加えて、濃度が１５－７０ｍＭ、好ましくは２０－６０ｍＭ、例えば、２５－５０ｍＭ又は３０－５０ｍＭである塩を含む。第２の培地（例えば、第２の緩衝液）中の塩は、好ましくは塩化ナトリウムである。しかしながら、本出願で提供される情報及びデータに基づいて、当業者は、本発明の方法に使用される第２の培地（例えば、第２の緩衝液）に適した他の塩及びそれらの濃度を容易に決定することができる。第２の培地（例えば、第２の緩衝液）のさらなる任意選択的な成分は、緩衝物質（好ましくはＴＲＩＳ又はＨＥＰＥＳ、より好ましくはＴＲＩＳ）、及び／又はキレート剤（好ましくはＥＤＴＡ又はニトリロ三酢酸、より好ましくはＥＤＴＡ）を含む。一実施態様では、第２の培地（例えば、第２の緩衝液）中の緩衝物質の濃度は、５－４０ｍＭ、好ましくは６－３０ｍＭ、例えば、８－２０ｍＭ又は１０－１５ｍＭである。一実施態様では、第２の培地（例えば、第２の緩衝液）のｐＨは、６．５－８．０、好ましくは６．７－７．８、例えば、６．８－７．２（例えば、ＴＲＩＳが緩衝物質である場合）又は７．３－７．７（例えば、ＨＥＰＥＳが緩衝物質である場合）である。一実施態様では、第２の培地（例えば、第２の緩衝液）中のキレート剤の濃度は、１０－５０ｍＭ、好ましくは１５－４０ｍＭ、例えば、２０－３０ｍＭである。
一実施態様では、第２の培地（例えば、第２の緩衝液）は、水、エタノール、ＴＲＩＳ及びＥＤＴＡ（例えば、水、エタノール、塩（好ましくは塩化ナトリウム）、ＴＲＩＳ及びＥＤＴＡ）を、好ましくは第２の培地（例えば、第２の緩衝液）について上記で特定される濃度で含む。しかしながら、本出願で提供される情報及びデータに基づいて、当業者は、ＴＲＩＳ以外の緩衝物質及び／又はＥＤＴＡ以外のキレート剤及び／又は塩化ナトリウム以外の塩、並びに本発明の方法において使用される第２の培地（例えば、第２の緩衝液）に適したそれらの濃度を容易に決定することができる。一実施態様では、第２の培地（例えば、第２の緩衝液）は、上記の開示された範囲（すなわち、少なくとも３５％（ｖ／ｖ）、少なくとも３６％（ｖ／ｖ）、少なくとも３７％（ｖ／ｖ）、少なくとも３８％（ｖ／ｖ）など）のエタノールに加えて、５－４０ｍＭの量のＴＲＩＳ、及び１５－７０ｍＭの量の塩（好ましくは塩化ナトリウム）を含む。別の実施態様では、第２の培地（例えば、第２の緩衝液）は、上記の開示された範囲（すなわち、少なくとも３５％（ｖ／ｖ）、少なくとも３６％（ｖ／ｖ）、少なくとも３７％（ｖ／ｖ）、少なくとも３８％（ｖ／ｖ）など）のエタノールに加えて、５－４０ｍの量のＭＨＥＰＥＳ、及び１００－１５０ｍＭ（例えば、１１０－１４０ｍＭ又は１２０－１３０ｍＭ）の量の塩（好ましくは塩化ナトリウム）を含む。
一実施態様では、第１及び第２の培地（すなわち、第１及び第２の緩衝液）は、エタノールの濃度だけでなく、一若しくは複数の他の成分（塩、任意選択的な緩衝物質、及び／又は任意選択的なキレート剤など）の種類及び／又は濃度が異なる。好ましい一実施態様では、第１及び第２の培地（すなわち、第１及び第２の緩衝液）は、エタノールの濃度を除いて、同じ組成（すなわち、水以外の成分、例えば塩、任意選択的な緩衝物質及び任意選択的なキレート剤の種類及び濃度に関して）を有する。
本明細書で使用される「ｄｓＲＮＡのセルロース材料への結合を可能にする条件下でｓｓＲＮＡをセルロース材料から分離すること」という表現は、ｓｓＲＮＡを含む相（前記相は好ましくは液体である）が、ｄｓＲＮＡが結合しているセルロース材料から単離されることを意味する。このような単離／分離は、当業者に公知であるいくつかの方法で、例えば、ｄｓＲＮＡが結合しているセルロース材料のみを選択的に除去することによって（例えば、セルロース材料として、磁気ビーズに共有結合しているセルロースを使用し、磁石を使用することによって）又はｓｓＲＮＡを含む相のみを（例えば、ピペットを用いることによって）回収することによって達成され得る。
例えば、一実施態様では、ＲＮＡ調製物、セルロース材料、及び第１の緩衝液の混合物がチューブ内に入れられる（この実施態様では、（α）ＲＮＡ調製物は、ｓｓＲＮＡ及び第１の緩衝液を含む液体として提供され、及び／又は（β）セルロース材料は、洗浄セルロース材料（第１の緩衝液が洗浄溶液として使用されている）として、乾燥形態で若しくは第１の培地（例えば、第１の緩衝液）中の懸濁液の何れかで提供され、並びに／又は（γ）ＲＮＡ調製物、セルロース材料、及び第１の緩衝液は、振盪及び／若しくは撹拌しながら（好ましくは少なくとも５分間、より好ましくは少なくとも１０分間、例えば５－３０分間又は１０－２０分間）、混合され；最も好ましくは、（α）ＲＮＡ調製物は、ｓｓＲＮＡ及び第１の緩衝液を含む液体として提供され、（β）セルロース材料は、洗浄セルロース材料（第１の緩衝液が洗浄溶液として使用されている）として、乾燥形態で若しくは第１の培地（例えば、第１の緩衝液）中の懸濁液の何れかで提供され、並びに（γ）ＲＮＡ調製物、セルロース材料、及び第１の緩衝液は、振盪及び／若しくは撹拌下で、例えば５－３０分若しくは１０－２０分間混合される）。この実施態様では、好ましくは、工程（ｉｉｉ）は、（１）液相及び固相が分離される（好ましくは完全に分離される）ように、チューブに重力又は遠心力（例えば、１０，０００×ｇ－１５，０００×ｇで１－５分間）を適用すること；並びに（２）ｓｓＲＮＡを含む上清を（例えば、ピペットを用いることによって）回収すること、又はセルロース材料を（例えば、セルロース材料として、磁気ビーズに共有結合したセルロースを使用し、磁石を使用することによって）除去することを含む。工程（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）は、１回又は２回以上（例えば、１回、２回又は３回）反復され得る。工程（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）を反復する場合、１サイクルの工程（ｉｉｉ）の後に得られたｓｓＲＮＡ調製物は、次の（すなわち直後の）サイクルの工程（ｉｉ）においてＲＮＡ調製物として使用され、各サイクルにおいて、新鮮なセルロース材料（好ましくは新鮮な洗浄セルロース材料）が使用される。
代替の実施態様では、ＲＮＡ調製物、セルロース材料、及び第１の緩衝液の混合物は、スピンカラム又はフィルターデバイスに入れられる（この実施態様では、好ましくは（α）ＲＮＡ調製物は、ｓｓＲＮＡ及び第１の緩衝液を含む液体として提供され、及び／又は（β）セルロース材料は、乾燥形態で又は第１の培地（例えば、第１の緩衝液）中の懸濁液として、洗浄セルロース材料（第１の緩衝液は洗浄溶液として使用されている）として提供され、並びに／又は（γ）ＲＮＡ調製物、セルロース材料、及び第１の緩衝液は、（好ましくは少なくとも５分間、より好ましくは少なくとも１０分間、例えば、５－３０分間又は１０－２０分間）振盪及び／若しくは撹拌しながら混合され；最も好ましくは（α）ＲＮＡ調製物は、ｓｓＲＮＡ及び第１の緩衝液を含む液体として提供され、（β）セルロース材料は、乾燥形態で若しくは第１の培地（例えば、第１の緩衝液）中の懸濁液として、洗浄セルロース材料（第１の緩衝液は洗浄溶液として使用されている）として提供され、並びに（γ）ＲＮＡ調製物、セルロース材料、及び第１の緩衝液は、例えば、５－３０分間又は１０－２０分間、振盪及び／又は撹拌しながら混合される）。この実施態様では、好ましくは、工程（ｉｉｉ）は、（１’）液相及び固相が分離される（好ましくは完全に分離される）ように、スピンカラム又はフィルターデバイスに重力、遠心力（例えば、１０，０００×ｇ－１５，０００×ｇで１－５分間）、圧力（例えば、１０００ｈＰａ－３０００ｈＰａ）、又は真空（例えば、１００ｈＰａ－９００ｈＰａ、例えば２００ｈＰａ－８００ｈＰａ）を適用すること；並びに（２’）ｓｓＲＮＡを含むフロースルーを回収することを含む。工程（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）は、１回又は２回以上（例えば、１回、２回又は３回）反復され得る。工程（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）を反復する場合、１サイクルの工程（ｉｉｉ）の後に得られたｓｓＲＮＡ調製物は、次の（すなわち直後の）サイクルの工程（ｉｉ）においてＲＮＡ調製物として使用され、各サイクルにおいて、新鮮なセルロース材料（好ましくは新鮮な洗浄セルロース材料）が使用される。
本明細書で使用される「ｄｓＲＮＡ及びｓｓＲＮＡが結合しているセルロース材料を残部から分離すること」という表現は、ｄｓＲＮＡ及びｓｓＲＮＡが結合している（好ましくは非共有結合又は吸着している）固相（すなわち、セルロース材料）が、他の相（好ましくは前記他の相は液体である）から単離することを意味する。このような単離／分離は、当業者に公知であるいくつかの方法で、例えば、ｄｓＲＮＡ及びｓｓＲＮＡが結合しているセルロース材料のみを選択的に回収することによって（例えば、セルロース材料として、磁気ビーズに共有結合しているセルロースを使用し、磁石を使用することによって）又は他の相のみを（例えば、ピペットを用いることによって）選択的に除去することによって達成され得る。
例えば、一実施態様では、ＲＮＡ調製物、セルロース材料、及び第２の緩衝液の混合物は、チューブに入れられる（この実施態様では、好ましくは（α’）ＲＮＡ調製物は、ｓｓＲＮＡ及び第２の緩衝液を含む液体として提供され、並びに／又は（β’）セルロース材料は、乾燥形態で若しくは第２の培地（例えば、第２の緩衝液）中の懸濁液として、洗浄セルロース材料（第２の緩衝液は洗浄溶液として使用されている）として提供され、並びに／又は（γ’）ＲＮＡ調製物、セルロース材料、及び第２の緩衝液は、（好ましくは少なくとも５分間、より好ましくは少なくとも１０分間、例えば、５－３０分間又は１０－２０分間）振盪及び／若しくは撹拌しながら混合され；最も好ましくは（α’）ＲＮＡ調製物は、ｓｓＲＮＡ及び第２の緩衝液を含む液体として提供され、（β’）セルロース材料は、乾燥形態で又は第２の培地（例えば、第２の緩衝液）中の懸濁液として、洗浄セルロース材料（第２の緩衝液は洗浄溶液として使用されている）として提供され、並びに（γ’）ＲＮＡ調製物、セルロース材料、及び第２の緩衝液は、例えば、５ました。３０分間又は１０－２０分間、振盪及び／又は撹拌しながら混合される）。この実施態様では、好ましくは、工程（ｉｉ）（２）（すなわち、「ｄｓＲＮＡ及びｓｓＲＮＡが結合しているセルロース材料を残部から分離すること）は、（２ａ）液相及び固相が分離される（好ましくは完全に分離される）ように、チューブに重力又は遠心力（例えば、１０，０００×ｇ－１５，０００×ｇで１－５分間）を適用すること；並びに（２ｂ）上清を除去すること（例えば、ピペットを用いることによって）、又はｄｓＲＮＡ及びｓｓＲＮＡが結合しているセルロース材料を回収すること（例えば、セルロース材料として、磁性ビーズに共有結合したセルロースを使用し、磁石を使用することによって）を含む。工程（ｉｉ）は、さらに、（３）第２の緩衝液のアリコート（好ましくは、アリコートはセルロース材料の体積の０．５－３倍（例えば、１から２倍））をｄｓＲＮＡ及びｓｓＲＮＡが結合しているセルロース材料に添加すること；（４）得られた混合物を振盪及び／又は撹拌しながら（好ましくは５－２０分間又は１０－１５分間）インキュベートすること；並びに（５）ｄｓＲＮＡ及びｓｓＲＮＡが結合しているセルロース材料を液相から分離する（好ましくは、分離は上記（２ａ）及び（２ｂ）において定義されるのと同様の様式で行われる）こと；並びに、任意選択的に（６）工程（３）から（５）を１回又は２回以上（例えば、１回、２回又は３回）反復することを含む。工程（ｉｉｉ）は、（１）ｄｓＲＮＡ及びｓｓＲＮＡが結合しているセルロース材料を、（好ましくは少なくとも５分間、より好ましくは少なくとも１０分間、例えば、５－３０分間又は１０－２０分間）振盪及び／又は撹拌しながら、上記で特定される第１の緩衝液（例えば、ＥｔＯＨ濃度は１４－２０％（ｖ／ｖ）、好ましくは１４－１６％（ｖ／ｖ）である）と混合すること；並びに（２）ｓｓＲＮＡを含む液相をセルロース材料から分離すること（好ましくは、ｓｓＲＮＡを含む液相をセルロース材料から分離する工程は、上記で特定されるように、例えば、重力又は遠心力（例えば、１０，０００×ｇ－１５，０００×ｇで１－５分間）を、液相及び固相が分離される（好ましくは完全に分離される）ようにチューブに適用することによって行われる）；（２）ｓｓＲＮＡを含む上清を（例えば、ピペットを用いることによって）回収するか、又はセルロース材料を（例えば、セルロース材料として、磁気ビーズに共有結合したセルロースを使用して、磁石を使用することによって）除去することを含み得る。工程（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）は、１回又は２回以上（例えば、１回、２回又は３回）反復されてもよい。工程（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）を反復する場合、１サイクルの工程（ｉｉｉ）の後に得られたｓｓＲＮＡ調製物は、次の（すなわち直後の）サイクルの工程（ｉｉ）においてＲＮＡ調製物として使用され、各サイクルにおいて新鮮なセルロース材料（好ましくは、新鮮な洗浄セルロース材料）が使用される。
代替の実施態様では、ＲＮＡ調製物、セルロース材料、及び第２の緩衝液の混合物は、スピンカラム又はフィルターデバイスに入れられる（この実施態様では、好ましくは（α’）ＲＮＡ調製物が、ｓｓＲＮＡ及び第２の緩衝液を含む液体として提供される、並びに／又は（β’）セルロース材料は、洗浄セルロース材料（第２の緩衝液は洗浄液として使用されている）として、乾燥形態で若しくは第２の培地（例えば、第２の緩衝液）中の懸濁液の何れかとして提供され、並びに／又は（γ’）ＲＮＡ調製物、セルロース材料、及び第２の緩衝液は、振盪及び／若しくは撹拌しながら（好ましくは少なくとも５分間、より好ましくは少なくとも１０分間、例えば、５－３０分間又は１０－２０分間）混合される；最も好ましくは（α’）ＲＮＡ調製物は、ｓｓＲＮＡ及び第２の緩衝液を含む液体として提供され、（β’）セルロース材料は、洗浄セルロース材料（第２の緩衝液は洗浄液として使用されている）として、乾燥形態で又は第２の培地（例えば、第２の緩衝液）中の懸濁液の何れかとして提供され、並びに（γ’）ＲＮＡ調製物、セルロース材料、及び第２の緩衝液は、振盪及び／又は撹拌しながら、例えば、５－３０分間又は１０－２０分間）混合される。この実施態様では、好ましくは、工程（ｉｉ）（２）（すなわち、「ｄｓＲＮＡ及びｓｓＲＮＡが結合しているセルロース材料を残部から分離すること」）は、（２ａ’）液相及び固相が分離される（好ましくは完全に分離される）ように、スピンカラム又はフィルターデバイスに重力、遠心力（例えば、１０，０００×ｇ－１５，０００×ｇで１－５分間）、圧力（例えば、１０００ｈＰａ－３０００ｈＰａ）、又は真空（例えば、１００ｈＰａ－９００ｈＰａ、例えば２００ｈＰａ－８００ｈＰａ）を適用すること；並びに（２ｂ’）フロースルーを廃棄することを含む。工程（ｉｉ）は、（３）第２の緩衝液のアリコート（好ましくはアリコートを０．５－３倍（例えば、１－２倍）のセルロース材料の体積）を、ｄｓＲＮＡ及びｓｓＲＮＡが結合しているセルロース材料に添加すること；（４）得られた混合物を振盪及び／又は撹拌しながら（好ましくは５－２０分間又は１０－１５分間）インキュベートすること；並びに（５）ｄｓＲＮＡ及びｓｓＲＮＡが結合しているセルロース材料を、液相から分離すること（好ましくは分離は上記の工程（２ａ’）及び（２ｂ’）において定義したのと同様の様式で実施する；並びに、任意選択的に（６）（３）から（５）の工程を１回又は２回以上（例えば、１回、２回又は３回）反復することを含む。工程（ｉｉｉ）は、（１）ｄｓＲＮＡ及びｓｓＲＮＡが結合しているセルロース材料を、（好ましくは少なくとも５分間、より好ましくは少なくとも１０分間、例えば、５－３０分間又は１０－２０分間）振盪及び／又は撹拌しながら、上記で特定される第１の緩衝液（例えば、ＥｔＯＨ濃度が１４－２０％（ｖ／ｖ）、好ましくは１４－１６％（ｖ／ｖ）である）と混合すること；並びに（２）ｓｓＲＮＡを含む液相をセルロース材料から分離すること（好ましくは、ｓｓＲＮＡを含む液相をセルロース材料から分離することは、上記で特定されるように、例えば、液相及び固相を分離する（好ましくは完全に分離する）ように、重力、遠心力（例えば、１０，０００×ｇ－１５，０００×ｇで１－５分間）、圧力（例えば、１０００ｈＰａ－３０００ｈＰａ）、又は真空（例えば、１００ｈＰａ－９００ｈＰａ、例えば、２００ｈＰａ－８００ｈＰａ）をスピンカラム又はフィルターデバイスに適用することによって実施される）；及びｓｓＲＮＡを含むフロースルーを回収することを含み得る。工程（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）は、１回又は２回以上（例えば、１回、２回又は３回）反復され得る。工程（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）を反復する場合、１サイクルの工程（ｉｉｉ）の後に得られたｓｓＲＮＡ調製物は、次の（すなわち直後の）サイクルの工程（ｉｉ）においてＲＮＡ調製物として使用され、各サイクルにおいて新鮮なセルロース材料（好ましくは新鮮な洗浄セルロース材料）が使用される。
陽性精製手法の一実施態様では、セルロース材料はカラムに入れられる（この実施態様では、セルロース材料は洗浄セルロース材料として提供されることが好ましく、上記で特定される第２の緩衝液（すなわち、少なくとも３５％（ｖ／ｖ）、少なくとも３６％（ｖ／ｖ）、少なくとも３７％（ｖ／ｖ）、少なくとも３８％（ｖ／ｖ）などのＥｔＯＨ濃度を有する）は、洗浄溶液として使用されている）。この実施態様では、ＲＮＡ調製物は工程（ｉｉ）のカラムにロードされる前に、セルロース材料を含むカラムが、上記で特定される第２の緩衝液（例えば、前記第２の緩衝液のアリコートを用いて）を用いて平衡化（洗浄）されることが好ましい。その後、ＲＮＡ調製物（好ましくは、ｓｓＲＮＡ及び前記第２の緩衝液を含む液体として提供される）をカラムに（好ましくは注射によって）ロードし、好ましくはカラムを前記第２の緩衝液（例えば、前記第２の緩衝液のさらなるアリコート、好ましくはカラムの中に含有されるセルロース材料の体積の０．５から２倍）を用いて洗浄される。この洗浄工程が好ましく、それは、ＲＮＡ以外の混入物を洗い流すことができるためである（このような混入物には、特に、ＩＶＴ ＲＮＡ（任意選択的に修飾されている）を生成するために使用される出発材料及びそれらの分解産物、例えば、ＤＮＡ鋳型；ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７、Ｔ３又はＳＰ６など）；修飾されていない形態のモノリボヌクレオチド（例えば、ｒＡＴＰ、ｒＧＴＰ、ｒＣＴＰ、ｒＵＴＰ、及び１つ又は２つのリン酸基のみを有するそれらの類似体）又は修飾形態（例えば、ｒ（１ｍΨ）ＴＰ又はｒΨＴＰ）及び１つ又は２つだけのリン酸基を有するそれらの類似体）；ピロリン酸；キャップ試薬（すなわち、５’－キャップ又は５’－キャップ類似体を導入するための試薬）；及びＩＶＴ ＲＮＡを生成するために使用される添加物（例えば、緩衝剤、塩、抗酸化剤、ポリアミン（例えば、スペルミジンなど）が含まれる）。工程（ｉｉｉ）は、好ましくは、上記で特定される第１の緩衝液（すなわち、ＥｔＯＨ濃度が１４－２０％（ｖ／ｖ）、好ましくは１４－１６％（ｖ／ｖ）である）を溶離液として使用することによって実施され、それにより、セルロース材料からｓｓＲＮＡを放出させる。カラムから溶出又は洗浄される化合物（特に、ｓｓＲＮＡ、任意選択的にさらにはｄｓＲＮＡ）は、従来の手段（例えば、ダイオードアレイ検出器などのＵＶ／ＶＩＳ検出器）を使用することによって、例えば、２６０ｎｍ（核酸の検出用）及び／又は２１５ｎｍ（ペプチド／タンパク質の検出用）及び／又は２８０ｎｍ（芳香族アミノ酸を含有するペプチド／タンパク質の検出用）で検出及び／又はモニターすることができる。
本発明の方法の何れかによって得られるｓｓＲＮＡ（特に、「陰性」又は「陽性」精製手法が使用されたかどうかにかかわらず）は、沈殿及び／又は修飾などのさらなる処理に供され得る。例えば、本発明の方法によって得られるｓｓＲＮＡは、従来の方法を用いて（例えば、「酢酸ナトリウム／イソプロパノール」沈殿法又は「ＬｉＣｌ」沈殿法を用いて）沈殿させて、乾燥形態のｓｓＲＮＡ調製物を得ることができる。乾燥したｓｓＲＮＡは、保存（例えば、－７０℃で）することができ、又は適切な溶媒（例えば、水又はＴＥ緩衝液（１０ｍＭ ＴＲＩＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ））に溶解し、次に保存（例えば、－７０℃で）し、若しくは使用（例えば、薬学的組成物の調製のために）することができる。代替的に又は付加的に、ｓｓＲＮＡは、例えば、キャップされていない５’－三リン酸を除去することによって、及び／又はキャップ構造を添加することによってさらに修飾することができ、その後、保存（例えば、－７０℃で）か又は使用（例えば、薬学的組成物の調製のために）される。
本出願の実施例に実証されるように、本発明の方法は、一又は複数の以下のものなどのいくつかの利点を提供する。例えば、本発明の方法は、単純な遠心分離工程、マイクロ遠心分離スピンカラム、真空駆動フィルターシステム、及びＦＰＬＣを含む広範囲の異なる精製技術を提供する。ＨＰＬＣ法と比較して、本発明の方法は、費用対効果が高く、簡単であり（複雑な装置を必要としない）、毒性物質（アセトニトリルなど）を避け、比較的高純度及び収率でｓｓＲＮＡを提供する。さらに、セルロースは天然産物であるため、セルロースをベースとし、ｓｓＲＮＡ（特にＩＶＴ ｓｓＲＮＡ）を精製するのに有効な本発明の方法は、ＧＭＰ調節環境に移した場合に複雑さが少なくなることが期待され得る。さらに、本出願において、本発明の方法は容易にスケールアップされ得、従来のＨＰＬＣ法より時間がかからないことが実証されている。これに関して、従来のＨＰＬＣ法（Ｗｅｉｓｓｍａｎ等（前出）に開示されているものなど）は、一般的に、カラムサイズ、及び大きなカラムの使用に伴う背圧の問題によって制限されることに留意されたい。これは、本発明の方法にはあてはまらない。例えば、本出願で示されているように（実施例５参照）、本発明の方法を使用する場合、５０－１００ｍｇのＩＶＴ ＲＮＡの精製を２時間未満で達成することができる。対照的に、実施例３で使用されるＨＰＬＣカラム（Ｓｅｍｉ－Ｐｒｅｐ ＲＮＡＳｅｐ １００×２１．１ｍｍ、Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ）は、３５ｍｌのカラム体積を有し、１ｍｇのＩＶＴ ＲＮＡの最大結合能を有する。このようなＨＰＬＣカラムを使用する標準的な精製操作は６０分を超えるため、５０ｍｇのＩＶＴ ＲＮＡの精製は、本発明の方法を用いた場合のたった２時間に比べて、約５０時間かかる。さらに、従来のＨＰＬＣベースの方法を用いた長いＩＶＴ ＲＮＡの精製は問題を引き起こし、しばしば、（ａ）ＩＶＴ ＲＮＡの高喪失（特に、ＩＶＴ ＲＮＡが少なくとも約２，７００ｎｔ（好ましくは少なくとも２，８００ｎｔ、少なくとも２，９００ｎｔ、少なくとも３，０００ｎｔ、少なくとも３，１００ｎｔ、少なくとも３，２００ｎｔ、少なくとも３，３００ｎｔ、少なくとも３，４００ｎｔ、より好ましくは少なくとも３，５００ｎｔ、少なくとも３，６００ｎｔ、少なくとも３，７００ｎｔ、少なくとも３，８００ｎｔ、少なくとも３，９００ｎｔ、少なくとも４，０００ｎｔ、少なくとも４，１００ｎｔ、少なくとも４，２００ｎｔ、少なくとも４，３００ｎｔ、少なくとも４，４００ｎｔ、より好ましくは少なくとも４，５００ｎｔ、少なくとも４，６００ｎｔ、少なくとも４，７００ｎｔ、少なくとも４，８００ｎｔ、少なくとも４，９００ｎｔ、少なくとも５，０００ｎｔ）の長さを有する場合、このような長さを有するＩＶＴ ＲＮＡは、従来のＨＰＬＣベースの方法では明確に鋭いピークとして溶出されず、広いピークとして溶出され、したがって、それにより、ｓｓＲＮＡの喪失を最小限にするために、長時間に渡って溶出液（ｓｓＲＮＡを含む）の回収を必要とするためである）、及び／又は、より重要なことには、（ｂ）ＩＶＴ ＲＮＡの分解（特に、長いＩＶＴ ＲＮＡ（例えば、少なくとも３，５００ｎｔ、例えば、少なくとも４，０００ｎｔ、少なくとも４，５００ｎｔ、少なくとも５，０００ｎｔ、少なくとも５，５００ｎｔ、少なくとも６，０００ｎｔ、少なくとも６，５００ｎｔ、少なくとも７，０００ｎｔ、少なくとも７，５００ｎｔ、少なくとも８，０００ｎｔ、少なくとも８，５００ｎｔ、少なくとも９，０００ｎｔ、又は少なくとも９，５００ｎｔのサイズを有する）がおそらく、緊密に充填されたカラム材料を通して長いＲＮＡの通過中のせん断に起因して精製されるべきである場合）をもたらす。対照的に、本出願で実証されているように、約１０，０００ｎｔ又はそれを超えるサイズを有するＩＶＴ ＲＮＡを精製するための本発明の方法の使用は、ＲＮＡの分解をもたらさない。さらに、本発明の方法を使用することにより、ＩＶＴ ｓｓＲＮＡｓ（特に、少なくとも約２，７００ｎｔ（好ましくは少なくとも２，８００ｎｔ、少なくとも２，９００ｎｔ、少なくとも少なくとも３，０００ｎｔ、少なくとも３，１００ｎｔ、少なくとも３，２００ｎｔ、少なくとも３，３００ｎｔ、少なくとも３，４００ｎｔ、より好ましくは少なくとも３，５００ｎｔ、少なくとも３，６００ｎｔ、少なくとも３，７００ｎｔ、少なくとも３，８００ｎｔ、少なくとも３，９００ｎｔ、少なくとも４，０００ｎｔ、少なくとも４，１００ｎｔ、少なくとも４，２００ｎｔ、少なくとも４，３００ｎｔ、少なくとも４，４００ｎｔ、より好ましくは少なくとも４，５００ｎｔ、少なくとも４，６００ｎｔ、少なくとも４，７００ｎｔ、少なくとも４，８００ｎｔ、少なくとも４，９００ｎｔ、少なくとも５，０００ｎｔ）の長さを有するＩＶＴ ｓｓＲＮＡ）を明確に鋭いピークでセルロース材料から溶出し、それにより最小限に回収されるべき溶出液（ｓｓＲＮＡを含む）の量（すなわち、体積）を低減させることができることが見出された。最後に、精製されたＲＮＡの完全性は、インキュベーション中に（おそらくｓｓＲＮＡに含有される二本鎖の二次構造のＲＮａｓｅＩＩＩ触媒の加水分解に起因して）、ｓｓＲＮＡ、特に長いｓｓＲＮＡの部分的な分解をしばしば生じさせる大腸菌ＲＮａｓｅＩＩＩを使用する従来の方法と比較して、本発明の方法を優れたものにする。
本明細書で使用される用語「振盪及び／又は撹拌すること」とは、混合物、例えば、固相（セルロース材料など）及び液相（培地（例えば、緩衝液）、洗浄溶液、又は培地（例えば、緩衝液）に溶解したＲＮＡ調製物など）を含む混合物を混合（好ましくは、完全に混合する）のに適した任意の作用を意味する。「振盪及び／又は撹拌すること」を達成するための例示的なデバイスは、当業者に公知であり、シェーカー、ミキサー（例えば、ボルテックスミキサー又は静的ミキサー）、磁気スターラー（スターラーバーを含む）、及び撹拌棒が含まれ、これらは、混合される混合物の体積に応じて異なるサイズで利用可能である。混合物の振盪及び／又は撹拌は、完全な混合を達成するのに十分な時間、例えば、少なくとも１分間（例えば、少なくとも２分間、少なくとも３分間、少なくとも４分間、少なくとも５分間、少なくとも８分間、少なくとも１０分間）行うことができる。混合物の振盪及び／又は撹拌の最長時間は、最大４０分（例えば、最大３５分、最大３０分、最大２８分、最大２６分、最大２４分、最大２２分、又は最大２０分）であり得る。したがって、混合物の振盪及び／又は撹拌の例示的な時間範囲は、５－４０分、５－３０分、５－２０分、１０－４０分、１０－３０分、１０－２０分、１５－４０分、１５－３０分、又は１５－２０分である。一般的に、振盪及び／又は撹拌の持続時間は、意図される使用（例えば、セルロース材料の洗浄又はＲＮＡのセルロース材料への結合）、及び混合される固体の量などの因子に依存する。例えば、セルロース材料の洗浄のためには、振盪及び／又は撹拌の持続時間は、１－１５分、例えば５－１０分の範囲であり得る。ＲＮＡのセルロース材料への結合のためには、振盪及び／又は撹拌の持続時間は、最大１ｇのセルロース材料を使用する場合は５－２０分間（１０－２０分間など）の範囲であり、又は１ｇを超えるセルロース材料を使用する場合は１０－３０分間（１５－３０分間など）の範囲であり得る。同様に、セルロース材料からセルロース材料に結合しているＲＮＡ（特にｓｓＲＮＡ）を放出するためには、振盪及び／又は撹拌の持続時間は、最大１ｇのセルロース材料を使用する場合には５－２０分間（１０－２０分間など）、又は１ｇを超えるセルロース材料を使用する場合には１０－３０分間（１５－３０分間など）の範囲であり得る。
第１及び第２の培地（例えば、第１及び第２の緩衝液）に関して使用される用語「塩」とは、酸及び塩基の中和反応から生じる任意のイオン性化合物を意味する。好ましくは、塩（ｉ）は緩衝物質ではなく、（ｉｉ）キレート剤ではない、又は（ｉｉｉ）緩衝物質及びキレート剤はない。例示的な酸には、無機酸（例えば、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、ホウ酸、及び過塩素酸）及び有機酸（例えば、モノカルボン酸、１－５個（１、２又は３個など）の炭素原子を有するモノカルボン酸、例えば、ギ酸、酢酸、及びプロピオン酸）が含まれ、好ましくは無機酸である。例示的な塩基には、無機塩基（ＮＨ３、水酸化アンモニウム（ＮＨ４ＯＨ）、並びに金属の酸化物及び水酸化物、好ましくはアルカリ金属、土類金属、及びアルカリ土類金属の酸化物及び水酸化物（例えばＬｉ、Ｎａ、Ｋ、Ｒｂ、Ｂｅ、Ｍｇ、Ｃａ、Ｓｒ、Ａｌ、及びＺｎ）の酸化物及び水酸化物）、及び有機塩基（アミン、例えばモノアルキル、ジアルキル又はトリアルキルアミンなど）が含まれ、好ましくは無機塩基、より好ましくはＬｉ、Ｎａ、Ｋ、Ｍｇ、Ｃａ、Ａｌ、及びＺｎの酸化物及び水酸化物、より好ましくはＬｉ、Ｎａ、Ｋ、及びＺｎの酸化物及び水酸化物、例えば、Ｌｉ、Ｎａ、及びＫの酸化物及び水酸化物である。第１及び第２の培地（例えば、第１及び第２の緩衝液）に関して使用することができる例示的な塩には、ＬｉＣｌ、ＮａＣｌ及びＫＣｌが含まれ、この点で１つの特に好ましい塩はＮａＣｌである。好ましくは、塩は、前記培地中のＲＮＡの沈殿をもたらさない濃度で、第１及び第２の培地（例えば、第１及び第２の緩衝液）中で使用される。一実施態様では、第１及び／又は第２の培地（例えば、第１及び／又は第２の緩衝液）中の塩の濃度は、１５－７０ｍＭ、例えば、２０－６０ｍＭ、２５－５０ｍＭ又は３０－５０ｍＭであり、特に緩衝物質がＴＲＩＳである場合である。一実施態様では、第１及び／又は第２の培地（例えば、第１及び／又は第２の緩衝液）中の塩の濃度は、１００－２００ｍＭ、例えば、１１０－１９０ｍＭ、１２０－１８０ｍＭ、１３０－１７０ｍＭ、１４０－１６０ｍＭ又は１４５－１５５ｍＭであり、特に緩衝物質がＨＥＰＥＳである場合である。
本明細書で使用する用語「緩衝物質」及び「緩衝剤」は、強酸又は塩基を液体に添加したとしても、溶液のｐＨをほぼ一定に保つことができる化合物の混合物を意味する。一実施態様では、緩衝物質又は緩衝剤は、弱酸及びその共役塩基の混合物である。別の実施態様では、緩衝物質又は緩衝剤は、弱塩基及びその共役酸の混合物である。好ましくは、緩衝物質はキレート剤ではない。第１及び第２の培地（例えば、第１及び第２の緩衝液）に適した緩衝物質の例としは、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）、４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、３－モルホリノ－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）－２－アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、２－［（２－ヒドロキシ－１，１－ビス（ヒドロキシメチル）エチル）アミノ］エタンスルホン酸（ＴＥＳ）、ピペラジン－Ｎ，Ｎ’－ビス（２－エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、及び３－（Ｎ，Ｎ－ビス［２－ヒドロキシエチル］アミノ）－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）が挙げられ、好ましくはＴＲＩＳ又はＨＥＰＥＳ、より好ましくはＴＲＩＳが挙げられる。所望のｐＨ値（例えば、ｐＨ６．５－８．０、好ましくはｐＨ６．６－７．８、例えば、ｐＨ６．８－７．６、ｐＨ６．８－７．２、ｐＨ６．９－７．５、ｐＨ６．９－７．３、ｐＨ７．０－７．７、ｐＨ７．０－７．５、ｐＨ７．０－７．３、ｐＨ７．３－７．８、ｐＨ７．３－７．７、又はｐＨ７．３－７．６）は、対応する塩基（例えば、ＴＲＩＳ）に十分な量の酸（例えば、塩酸などの無機酸）を添加することによって達成され、又は相当する酸（例えば、ＰＩＰＥＳ、６．７６のｐＫａを超えるｐＨ（７．０又は７．３－７．７のｐＨなど）が望まれる場合）に十分な量の塩基（例えば、水酸化ナトリウムなどの無機塩基）を添加することによって達成され得る。一実施態様では、第１及び／又は第２の培地（例えば、第１及び／又は第２の緩衝液）中の緩衝物質の濃度は、５－４０ｍＭ、例えば、６－３０ｍＭ、８－２０ｍＭ又は１０－１５ｍＭである。
第１及び第２の培地（例えば、第１及び第２の緩衝液）に関して本明細書で使用される用語「キレート剤」は、多座配位子（polydenate ligand）であり、単一の中心原子（好ましくはＣａ２＋又はＭｇ２＋などの単一の金属カチオン）に２つ以上（好ましくは３つ以上、例えば、４つ以上）配位結合を形成することができる化合物（好ましくは有機化合物）を意味する。この点において、「多座」とは、単一配位子分子中に１を超える（すなわち、２つ以上、好ましくは３つ以上、例えば４つ以上の）ドナー基を有する配位子を指し、ドナー基は、好ましくは自由電子対（例えば、Ｏ－、＝Ｏ、－ＮＨ２、－ＮＲＨ（ここで、Ｒは、アルキル、特にＣ１－３アルキルなどの有機部分である）、及びＮＲ２（ここで、各Ｒは、独立して、アルキル、特にＣ１－３アルキルなどの有機部分である））を有する原子を含む。好ましくは、キレート剤は緩衝物質ではない。キレート剤の例としては、ＥＤＴＡ、ニトリロ三酢酸、クエン酸塩（例えば、クエン酸ナトリウム）、１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０－四酢酸（ＤＯＴＡ）、１，４，７－トリアザシクロノナン－１，４，７－三酢酸（ＮＯＴＡ）、３，６，９，１５－テトラアザビシクロ［９．３．１］ペンタデカ－１（１５），１１，１３－トリエン－３，６，９－三酢酸（ＰＣＴＡ）、及び１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７－三酢酸（ＤＯ３Ａ）が挙げられ、好ましくはＥＤＴＡ又はニトリロ三酢酸、より好ましくはＥＤＴＡが挙げられる。一実施態様では、第１及び／又は第２の培地（例えば、第１及び／又は第２の緩衝液）中のキレート剤の濃度は、１０－５０ｍＭ、例えば、１５－４０ｍＭ又は２０－３０ｍＭである。
本明細書で使用される用語「セルロース材料」は、任意のセルロース繊維を指し、好ましくは分配クロマトグラフィー試薬としての使用に適したグレードを有するものを指す。本発明の方法に適したセルロース材料の特定の例としては、ＣＦ－１１セルロース粉末、及びＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈからのセルロース（例えば、カタログ番号Ｃ６２８８）及びＭａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌからのもの（例えば、ＭＮ １００又はＭＮ ２１００）などの市販のセルロースが含まれる。一実施態様では、セルロース材料は、本発明の方法において使用前に洗浄される。したがって、本発明の方法の１つの好ましい実施態様では、セルロース材料は、例えば、乾燥形態で又は洗浄溶液中の懸濁液として、洗浄セルロース材料として提供される（前記洗浄溶液は、本明細書で特定されるように第１又は第２の培地（例えば、第１又は第２の緩衝液）であり得る）。セルロース材料の洗浄は、（Ｉ）セルロース材料を、（好ましくは少なくとも５分間、より好ましくは少なくとも１０分間、例えば、５－１０分間）振盪及び／又は撹拌しながら、洗浄溶液と混合すること；並びに（ＩＩ）（例えば、ピペットを用いることによって）液体を除去すること又は（例えば、セルロース材料として、磁気ビーズに共有結合したセルロースを使用して、磁石を使用することによって）セルロース材料を回収すること；並びに、任意選択的に（ＩＩＩ）工程（Ｉ）及び（ＩＩ）を１回又は２回以上（例えば、１回、２回又は３回）反復することを含み得る。例えば、セルロース材料と洗浄液との混合物をチューブに入れる場合、好ましくは、重力又は遠心力（例えば、４０００×ｇ－１５，０００×ｇ、例えば、５，０００×ｇ－１０，０００×ｇで１－５分間）がチューブに適用され、それにより、液相及び固相は、分離され（好ましくは完全に分離され）、上清は、（例えば、ピペットを用いることによって）除去され、又はセルロース材料は、（例えば、セルロース材料として、磁性ビーズに共有結合したセルロースを使用して、磁石を使用することによって）回収される。あるいは、セルロース材料と洗浄液との混合物をスピンカラムやフィルターデバイスに入れる場合、好ましくは、重力、遠心力（例えば、４０００－１５０００×ｇ、例えば、５，０００－１０，０００×ｇで１－５分間）、圧力（例えば、１０００ｈＰａ－３０００ｈＰａ）、又は真空（例えば、１００ｈＰａ－９００ｈＰａ、例えば、２００ｈＰａ－８００ｈＰａ）がスピンカラム又はフィルターデバイスに適用され、それにより、液相及び固相は分離され（好ましくは完全に分離され）、フロースルーは廃棄される。洗浄緩衝液の組成は、好ましくは、ＲＮＡの洗浄セルロース材料への選択的結合の意図された様式に依存する：（１）ｄｓＲＮＡのみが洗浄セルロース材料に選択的に結合し、一方、ｓｓＲＮＡは結合しないままである場合、洗浄溶液は、ｄｓＲＮＡのセルロース材料への結合を可能にし、ｓｓＲＮＡのセルロース材料への結合を可能にしないようなものでなければならない。したがって、（１）の好ましい実施態様では、洗浄溶液は、上記で特定されるように第１の培地（例えば、第１の緩衝液）の組成を有する。（２）ｄｓＲＮＡとｓｓＲＮＡの両方を洗浄セルロース材料に結合させる場合、洗浄液は、ｄｓＲＮＡ及びｓｓＲＮＡのセルロース材料への結合を可能にするようにすべきである。したがって、（２）の好ましい実施態様では、洗浄溶液は、上記で特定されるように第２の培地（例えば、第２の緩衝液）の組成を有する。
洗浄後、洗浄セルロース材料は、乾燥製造物（すなわち、洗浄溶液が、本明細書において特定される洗浄セルロースから完全に除去された後）として又は洗浄溶液中の懸濁液として保存され得る（又は本発明の方法に使用され得る）。しかしながら、洗浄液中に保存された洗浄セルロース材料が本発明の方法において使用される場合、好ましくは、洗浄セルロース材料がＲＮＡ調製物と接触する前に、液相（すなわち、セルロース材料が保存のために懸濁されている洗浄液）は、（例えば、洗浄セルロースがチューブに入れられる場合、（セルロース材料の洗浄に関して上記で特定されるように）重力又は遠心力を適用することによって、又は洗浄セルロースがスピンカラム又はフィルターデバイスに入れられる場合、（セルロース材料の洗浄に関して上記で特定されるように）重力、遠心力、圧力、又は真空を適用することによって）洗浄セルロース材料から除去され、次に、このように（すなわち、乾燥形態で）得られた洗浄セルロースは、本発明の方法において使用されるか、又は洗浄溶液中に懸濁させ（ここで、前記洗浄溶液は、本明細書において特定されるように第１又は第２の培地（例えば、第１又は第２の緩衝液であり得る）、次に本発明の方法において使用される。
本明細書で使用される用語「新鮮なセルロース材料」とは、前記新鮮なセルロース材料がＲＮＡ調製物と接触していないことを意味する。このような新鮮なセルロース材料は、洗浄され得ないか又は洗浄され得る。好ましい実施態様では、新鮮なセルロース材料は、上記で特定されるように（例えば、乾燥形態で又は洗浄溶液中の懸濁液として）洗浄セルロース材料として提供される。したがって、（（１）ｓｓＲＮＡではなくｄｓＲＮＡ、又は（２）ｄｓＲＮＡ及びｓｓＲＮＡ、の何れかに選択的に結合するために）洗浄された新鮮なセルロース材料の意図された使用に依存して、洗浄された新鮮なセルロース材料は、（１）上記で特定される第１の培地（例えば、第１の緩衝液）、又は（２）上記で特定される第２の培地（例えば、第２の緩衝液）の何れかを用いることによって得られた。
本発明の方法の工程（ｉｉ）におけるＲＮＡ（ＲＮＡ調製物に含有される）対セルロース材料の比は、セルロース材料のＲＮＡ結合能を超えないようなものである。好ましい実施態様では、１００ｍｇのセルロース材料あたりのＲＮＡの量は、最大２５０μｇ、より好ましくは最大２００μｇ、例えば、最大１５０μｇである。したがって、一実施態様では、１００ｍｇのセルロース材料あたりのＲＮＡの量は、１０－２５０μｇ、例えば、２０－２２０μｇ、３０－２００μｇ、４０－１８０μｇ、５０－１６０μｇ、６０－１４０μｇ、７０－１２０μｇ、８０－１１０μｇ、又は９０－１００μｇの範囲である。したがって、一実施態様では、１μｇのＲＮＡあたりのセルロース材料の量は、少なくとも０．４ｍｇ、好ましくは少なくとも０．５ｍｇ、例えば、少なくとも０．６７ｍｇであり得る。例えば、１μｇのＲＮＡあたりのセルロース材料の量は、０．４－１０ｍｇ、例えば、０．４５－５ｍｇ、０．５－３．３ｍｇ、０．５６－２．５ｍｇ、０．６３－２ｍｇ、０．７１－１．６７ｍｇ、０．８３－１．４３ｍｇ、０．９１－１．２５ｍｇ、又は１－１．１１ｍｇの範囲であり得る。
本明細書で使用する用語「チューブ」とは、化合物及び／又は液体を容器に導入し及び／又は容器から除去ことができるように、１つの開口部のみを有する容器、特に細長い容器を指す。好ましい実施態様では、チューブの開口部は、開口部をしっかりと密封するような方法で、螺合可能なカバー蓋、又は開口部にフィットしているカバー蓋などの適切な手段によって閉じられ得るように構成される。一実施態様では、チューブは、重力又は遠心力が、内容物の何れもこぼさずに、チューブの完全性を損なうことなしに、（それらの比重に対してチューブの内容物を分離するために）チューブに適用され得るように構成される。
本明細書で使用する「スピンカラム」及び「フィルターデバイス」という用語は、反対側の２つの開口部及びフリット又はフィルターを有する容器、特に細長い容器を指し、第１の開口部は、化合物及び／又は液体が容器に導入され、及び／又は容器から除去され得るものであり、第２の開口部は、フリット又はフィルターによって第１の開口部から分離され、そのため、固体化合物（特にセルロース材料）はフリット又はフィルターによって容器内に保持されるが、液体は、フリット又はフィルター及び第２の開口部を通過できるようになる。フリット又はフィルターは、好ましくは、最大１μｍ、例えば、最大０．８μｍ、最大０．６μｍ、例えば、０．３０－０．６０μｍの範囲、例えば、０．３５－０．５５μｍの孔径を有する。好ましい実施態様では、スピンカラム又はフィルターデバイスの少なくとも第１の開口部（好ましくは、開口部の各々）は、開口部をしっかりと密封するような方法で、螺合可能なカバー蓋、又は第１又は第２の開口部にフィットしているカバー蓋などの適切な手段によって閉じることができるように構成される。一実施態様では、スピンカラム又はフィルターデバイスは、重力、遠心力、圧力、又は真空が、スピンカラム又はフィルターデバイスの完全性を損なうことなしに、スピンカラム又はフィルターデバイスに（スピンカラム又はフィルターデバイス内の内容物を分離するために）適用することができるように構成される。適切なスピンカラムの例としては、マイクロ遠心分離スピンカラム（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌから入手可能なもの、例えば、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｆｉｌｔｅｒｓ（カタログ番号７４０６０６））が挙げられ、適切なフィルターデバイスの例としては、使い捨ての真空駆動フィルターデバイス（Ｍｅｒｃｋ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ＧｍｂＨ／Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから入手可能なもの、例えば、Ｓｔｅｒｉｆｌｉｐ－ＨＶ、０．４５μｍ孔径、ＰＶＤＦ（カタログ番号ＳＥ１Ｍ００３Ｍ００））が挙げられる。
本明細書で使用される「液体」及び「液相」という用語は、標準状態の流体を指す。液体の特定の例には、培地（例えば、緩衝液）、洗浄溶液、及び培地（例えば、緩衝液）中に溶解されたＲＮＡ調製物が含まれる。本明細書で使用される「固体」及び「固相」という用語は、一定の形状及び体積を有するが、標準状態では非液体及び非気体である物質又は物質の混合物を指す。固体の特定の例は、セルロース材料を含む。
本明細書で使用される用語「標準状態」は、２０℃の温度及び１，０１３．２５ｈＰａの絶対圧を指す。
本明細書で使用される用語「上清」は、液相及び固相が混合され、混合物が（例えば、重力又は遠心力を適用することによって）分離されるときに発生される上相を指す。固相が液相と比較して高い比重を有する場合、液相が上清である。
本明細書で使用される用語「フロースルー」は、スピンカラム又はフィルターデバイスを通過する液相を指す。
本明細書で使用される用語「アリコート」とは、固体に添加されるべきであるか、又はカラムの固定相にロードされるべきある、一定体積の液体を意味し、アリコートの体積は、一般的に、０．１－１０倍（０．５－５倍、１－４倍、１－３倍、又は１－２倍など）の固体相又は固定相の体積である。一実施態様では、液体は、培地（例えば、緩衝液）（本明細書で特定される第１、第２又は第３の培地（例えば、第１、第２又は第３の緩衝液）又は洗浄溶液である。一実施態様では、固体は、洗浄セルロース材料などのセルロース材料である。
本明細書で使用される用語「重力を適用する」とは、チューブ、スピンカラム、又はフィルターデバイスなどの容器が、地球の「通常の」重力（約１×ｇ）のみに供され、すなわち、地球の「通常の」重力に加えて、容器に適用される重量がないことを意味する（例えば、培地は、カラムの固定相を通って受動的に流れることが可能であり、カラムは、カラムの縦軸（すなわち、カラムの両方の開口部を通る線）は、地心点を指すような様式で配置される）。一実施態様では、重力は、容器に含有される相（液相及び固相など）を分離する（好ましくは完全に分離する）のに十分な期間、容器に適用される。
本明細書で使用される「遠心力を適用する」という用語は、チューブ、スピンカラム、又はフィルターデバイスなどの容器が、地球の通常の重力の倍数（すなわち、１×を超えるｇ、少なくとも２×ｇ、少なくとも１０×ｇ、少なくとも１００×ｇ、及び最大２０，０００×ｇ、例えば、最大１５，０００×ｇ、最大１０，０００×ｇ、最大５，０００×ｇ、又は最大４，０００×ｇ）に供されることを意味する。このような遠心力を発生させることができる適切なデバイスには、遠心分離機が含まれる。一実施態様では、遠心力は、容器に含有される相（液相及び固相など）を分離する（好ましくは完全に分離する）のに十分な期間、容器に適用される。例示的な持続時間は、１分－３０分の範囲（例えば、１、２、３、４又は５分間－２５分間、５、６、７、８、９若しくは１０分間－２０分間又は１０－１５分間）である。一般的に、適用される遠心力のレベル及び持続時間は、意図される使用（例えば、セルロース材料の洗浄、ＲＮＡのセルロース材料への結合、又はセルロース材料からのＲＮＡの放出）、容器の体積及び重量（その内容物を含む）などの因子に依存する。例えば、短い持続時間（例えば、１－５分間）で適用される高い遠心力（１０，０００×ｇ－２０，０００×ｇなど）は、（完全な）分離には十分であり得るが、一方、低い遠心力（最大１００×ｇなど）は、（完全な）分離のためにより長い持続時間（２０－３０分間など）を必要とする場合がある。同様に、小さな体積及び重量（例えば、最大約２ｍｌの体積及び約２ｇの重量）については、短い持続時間（例えば、１－１０分間）で適用される高い遠心力（１０，０００×ｇ－２０，０００×ｇなど）は、（完全な）分離には十分であり得るが、一方、より大きな体積及び／又は重量については、より低い遠心力（２００×ｇ－１０，０００×ｇなど）のみが適用され得る場合、（完全な）分離を達成するためにより長い持続時間（例えば、２０－３０分間）を必要とする場合がある。
本明細書で使用される「圧力を適用する」という用語は、スピンカラム、フィルターデバイス又はカラムなどの容器が、容器の１つの開口部に適用される正の力（標準条件と比較して）に供されることを意味する。特に、容器がカラムである場合、圧力を適用することは、液体（培地又は緩衝液など）が、例えば、一又は複数のポンプを使用することによって、容器を通してポンプ輸送されることを意味する。本発明の方法で適用される圧力は、ＨＰＬＣ法で適用される圧力と比較してはるかに低く、好ましくは最大２ＭＰａ（例えば、最大１ＭＰａ、最大５０００ｈＰａ、最大４０００ｈＰａ、最大３０００ｈＰａ、最大２０００ｈＰａ）である。
本明細書で使用される「真空を適用する」という用語は、スピンカラム、フィルターデバイス、又はカラムなどの容器が陰圧（標準条件と比較して）に供されることを意味し、陰圧は、好ましくは、容器の開口部に適用される。好ましくは、陰圧は、最大９００ｈＰａ、例えば最大８００ｈＰａ、最大７００ｈＰａ、最大６００ｈＰａ、最大５００ｈＰａ、最大４００ｈＰａ、最大３００ｈＰａ、最大２００ｈＰａ、又は最大１００ｈＰａである。一実施態様では、真空は、容器に含有される相（液相及び固相など）を分離する（好ましくは完全に分離する）のに十分な持続時間、容器に適用される。陰圧を発生させるためのデバイスは、当業者に公知であり、ウォータージェット真空ポンプを含む。
本明細書で使用される「１回又は２回以上、反復される」という表現は、対応する工程（複数可）が、少なくとも１回、例えば、２回以上、３回以上、４回以上など、好ましくは１回、２回又は３回行われることを意味する。
本明細書で使用される「工程（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の１サイクル」という表現は、工程（ｉｉ）及び工程（ｉｉｉ）を各々１回だけ行うことを意味する。工程（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の１サイクルが完了した場合、工程（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の任意選択的にさらなるサイクル（本明細書では「次サイクル」とも呼ばれる）を行うことができる。例えば、工程（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）のこのような次サイクルの工程（ｉｉ）において、工程（ｉｉ）及び工程（ｉｉｉ）の先のサイクルの工程（ｉｉｉ）の後に得られたＲＮＡ調製物（すなわち、好ましくは、先のサイクルの工程（ｉｉ）で使用されたＲＮＡ調製物と比較してより少ない量でｄｓＲＮＡを含むＲＮＡ調製物）は、ＲＮＡ調製物として使用される。好ましくは、工程（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の各サイクルにおいて、新鮮なセルロース材料が（例えば、ｄｓＲＮＡによる混入を避けるために）使用される。したがって、工程（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）を実施し、任意選択的にこれらの工程を１回又は２回以上、反復することによって、最終的に得られるｓｓＲＮＡが、ｄｓＲＮＡを実質的に含まず、及び／又はＤＮＡを実質的に含まず、好ましくはｄｓＲＮＡ及びＤＮＡを実質的に含まないこのような程度までｓｓＲＮＡ調製物からｄｓＲＮＡを除去することが可能である。
「先のサイクルの工程（ｉｉ）で使用されたＲＮＡ調製物と比較してより少ない量でｄｓＲＮＡを含むＲＮＡ調製物」という表現は、工程（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の１サイクルを行うことがｄｓＲＮＡの除去に有効であり、そのため、１サイクルの工程（ｉｉｉ）の後に得られたＲＮＡ調製物中のｄｓＲＮＡの総量は、先のサイクルの工程（ｉｉ）で使用されたＲＮＡ調製物中のｄｓＲＮＡの総量よりも小さいことを意味する。好ましくは、工程（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の第１のサイクルは、工程（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の第１のサイクルの工程（ｉｉ）で使用されたＲＮＡ調製物に含有するｄｓＲＮＡの少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％）の除去に有効である。好ましい実施態様では、工程（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の合計２回、３回又は４回のサイクルを行うことは、工程（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の第１のサイクルの工程（ｉｉ）で使用されたＲＮＡ調製物に含有するｄｓＲＮＡの少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％（例えば、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％）の除去に有効である。
本明細書で使用される「溶離液」という用語は、固定相（例えば、セルロース材料）に対して化合物（ｄｓＲＮＡ又はｓｓＲＮＡなど）の結合特性を変更することができる液体を意味する。「結合特性を変更する」とは、化合物（例えば、ｄｓＲＮＡ又はｓｓＲＮＡ）が固定相（例えば、セルロース材料）に結合する能力を増加又は減少させることを意味する。好ましくは、溶離液は、化合物（例えばｄｓＲＮＡ又はｓｓＲＮＡ）が固定相（例えば、セルロース材料）に結合する能力を減少させることができる。したがって、この好ましい実施態様では、（１）化合物が固定相に結合する場合、固定相を溶離液と接触させる工程は、化合物の固定相から放出をもたらすか、又は（２）化合物が溶離液に溶解する場合、溶離液は、化合物の固定相への結合能を低下させ、好ましくは溶離液は化合物の固定相への結合を妨げる。本明細書で使用される「溶出すること」という用語は、化合物（例えば、ｓｓＲＮＡ）を結合させて、固定相から化合物を放出する、固定相（例えば、セルロース材料）を含有するカラム（スピンカラムを含む）に溶離液を適用又はロードすることを意味する。セルロース材料に結合させるｓｓＲＮＡに対して好ましい溶離液は、上記で特定される第１の培地（例えば、第１の緩衝液）であり、一方、セルロース材料に結合させるｄｓＲＮＡに対して好ましい溶離液は、第１又は第２の培地（例えば、第１又は第２の緩衝液）と同じ組成を有してもよいが、ＥｔＯＨを含有しない第３の培地（例えば第３の緩衝液）である（例えば、第３の培地は水であり得る）。セルロース材料に結合しているｄｓＲＮＡ又はｓｓＲＮＡを放出しない好ましい洗浄溶液は、上記で特定される第２の培地（例えば、第２の緩衝液）である。
本明細書で使用される用語「溶出液」とは、溶離液がカラム上に適用又はロードされたときに、カラムから出てくる液体を指す。
本明細書で使用される用語「カラム」とは、反対側の２つの開口部、少なくとも１つのフリット、及び固定相（セルロース材料など）を有する容器、特に円筒形容器を指し、第１の開口部は、容器内に液体（培地など、例えば、洗浄溶液又は培地、例えば、第１又は第２の緩衝液）の導入を可能にするように構成され、一方、第２の開口部は、（ｉ）固定相はフリットによってカラム内に保持されるが、（ｉｉ）液体はフリット及び第２の開口部を通過することができるように、フリットによって第１の開口部及び固定相から分離される。カラムは、ＨＰＬＣ法又はＦＰＬＣ法において使用できるように構成することができる。しかしながら、本発明の方法において使用されるカラムは、好ましくは、ＦＰＬＣ法において使用可能であるように構成される。
本明細書で使用される用語「ＨＰＬＣ」とは、高圧液体クロマトグラフィーを意味し、液相は、混合物中の少なくとも１つの成分を分離、同定、及び／又は定量化するために、カラムを通って高圧下（典型的には、少なくとも５ＭＰａ、例えば５－３５ＭＰａ）でポンプ輸送される。
本明細書で使用される用語「ＦＰＬＣ」とは、高速液体クロマトグラフィーを意味し、液相は、混合物中の少なくとも１つの成分を分離、同定、及び／又は定量化するために、カラムを通って流れるようする。ＦＰＬＣカラムを通る液体の流れは、重力又は圧力を適用することによって達成することができ、圧力は、好ましくは最大で２ＭＰａ（最大で１ＭＰａ、最大で５，０００ｈＰａ、最大で４，０００ｈＰａ、最大で３，０００ｈＰａ、最大で２，０００ｈＰａ、又は最大で１，０００ｈＰａなど）である。
ＲＮＡ調製物に関して本明細書中で使用される用語「予備精製処理」とは、ＲＮＡ調製物の混入物を部分的又は完全に除去するための手法を意味し、混入物は、好ましくはＲＮＡ以外のすべての化合物を含み、例えば、ＩＶＴ ＲＮＡ（任意選択的に修飾されている）を生成するために使用される出発材料及びそれらの分解産物、例えば、ＤＮＡ鋳型；ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７、Ｔ３又はＳＰ６）；未修飾形態のモノリボヌクレオチド（例えば、ｒＡＴＰ、ｒＧＴＰ、ｒＣＴＰ、ｒＵＴＰ、及び１つ又は２つのリン酸基のみを有するそれらの類似体）又は修飾形態（例えば、ｒ（１ｍΨ）ＴＰ又はｒΨＴＰ及び１つ又は２つのリン酸基のみを有するそれらの類似体）；ピロリン酸塩；キャップ試薬（すなわち、５’－キャップ又は５’－キャップ類似体を導入するための試薬）；及びＩＶＴ ＲＮＡを生成するために使用される添加剤（例えば、緩衝剤、塩、抗酸化剤、及びポリアミン（例えば、スペルミジン））が挙げられる。当業者に公知である適切な予備精製処理の例としては、核酸の沈殿（好ましくは塩化リチウムを使用する）；核酸（特にＲＮＡ）の磁気ビーズへの結合（例えば、磁気ビーズに結合しない混入物は、適切な媒体を用いて洗い流すことができる）；限外ろ過；及び好ましくは二重鎖特異的ヌクレアーゼ（ＤＳＮ）を使用した、ＤＮＡの分解が含まれる。例えば、ＲＮＡは、「酢酸ナトリウム／イソプロパノール」沈殿法又は「ＬｉＣｌ」沈殿法（好ましくは「ＬｉＣｌ」沈殿法による）を用いて沈殿させることができ、ともに乾燥形態のＲＮＡ調製物をもたらす。何れの場合においても、このようにして得られた、沈殿し、乾燥したＲＮＡは、適切な量の水又はＴＥ緩衝液（１０ｍＭ ＴＲＩＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解することができ、これらは両方とも、好ましくはＲＮａｓｅを含まない。
「酢酸ナトリウム／イソプロパノール」沈殿法は、以下の工程を含む：ＲＮＡ調製物に０．１容量の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）及び１容量のイソプロパノールを添加する工程、得られた混入物を混合する工程、混合物を－２０℃で１時間インキュベートする工程、遠心力（例えば、１４，０００×ｇで１０分間）を適用する工程、ＲＮＡペレットから上清を除去する工程、２００μｌの７０％（ｖ／ｖ）氷冷ＥｔＯＨでＲＮＡペレットを洗浄する（すなわち、２００μｌの７０％（ｖ／ｖ）氷冷ＥｔＯＨをＲＮＡペレットに添加し、遠心力（例えば、１４，０００×ｇで５分間）を適用し、及び上清をＲＮＡペレットから除去する）工程、並びにＲＮＡペレットを（好ましくはエタノールを除去するような様式で）乾燥（好ましくは空気乾燥）する工程。
「ＬｉＣｌ」沈殿法は、以下の工程を含む：最終的なＬｉＣｌ濃度が２．５Ｍになるように塩化リチウム（ＬｉＣｌ）をＲＮＡ調製物に添加する工程、混合物を－２０℃で３０分間インキュベートする工程、遠心力（例えば、１４，０００×ｇで１０分間）を適用する工程、ＲＮＡペレットから上清を除去する工程、２００μｌの７０％（ｖ／ｖ）氷冷ＥｔＯＨでＲＮＡペレットを洗浄する（すなわち、２００μｌの７０％（ｖ／ｖ）氷冷ＥｔＯＨをＲＮＡペレットに添加し、遠心力（例えば、１４，０００×ｇで５分間）を適用し、上清をＲＮＡペレットから除去する）工程、及びＲＮＡペレットを（好ましくはエタノールを除去するような様式で）乾燥（好ましくは空気乾燥）する工程。
本明細書で使用される用語「ＲＮＡポリメラーゼ」は、一次転写ＲＮＡを生成するＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを指す。本発明によるＩＶＴ ＲＮＡを生成するのに適したＲＮＡポリメラーゼの例としては、Ｔ７、Ｔ３及びＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼが含まれる。好ましいＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼである。
本発明の方法に供されているｓｓＲＮＡ又はｓｓＲＮＡを含むＲＮＡ調製物と併せて、本明細書で使用される用語「ｄｓＲＮＡを実質的に含まない」とは、ｓｓＲＮＡ又はｓｓＲＮＡを含むＲＮＡ調製物中のｄｓＲＮＡの量が、前記ｓｓＲＮＡ又はｓｓＲＮＡを含むＲＮＡ調製物が本発明の方法に供される前のｓｓＲＮＡ又はｓｓＲＮＡを含むＲＮＡ調製物に含有されるｄｓＲＮＡの量と比較して、少なくとも７０％（好ましくは少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８２％、少なくとも８４％、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％）減少していることを意味する。好ましくは、本発明の方法に供されているｓｓＲＮＡ又はｓｓＲＮＡを含むＲＮＡ調製物は、対象に投与された場合に、前記ｓｓＲＮＡ又はｓｓＲＮＡを含むＲＮＡ調製物が、前記対象において、望ましくない応答（例えば、炎症性サイトカイン（例えば、ＩＦＮ－α）の望ましくない誘導、及び／又は本発明のｓｓＲＮＡからのタンパク質合成の阻害をもたらすエフェクター酵素の望ましくない活性化）を実質的に誘導しないようなｄｓＲＮＡ含量を有する。例えば、「ｄｓＲＮＡを実質的に含まない」及び「望ましくない応答を実質的に誘導しない」という用語は、本発明の方法に供されているｓｓＲＮＡ又はｓｓＲＮＡを含むＲＮＡ調製物が、対象に投与された場合、コントロールｓｓＲＮＡ（すなわち、本発明の方法に供されていないｓｓＲＮＡ又はｓｓＲＮＡを含むＲＮＡ調製物）と比較して、少なくとも６０％（例えば、少なくとも６２％、少なくとも６４％、少なくとも６６％、少なくとも６８％、少なくとも７０％、少なくとも７２％、少なくとも７４％、少なくとも７６％、少なくとも７８％、少なくとも８０％）低減された量の炎症性サイトカイン（特にＩＦＮ－α）を誘導することを意味し得る。好ましくは、「ｄｓＲＮＡを実質的に含まない」及び「望ましくない応答を実質的に誘導しない」という用語は、本発明の方法に供されているｓｓＲＮＡ又はｓｓＲＮＡを含むＲＮＡ調製物であって、前記ｓｓＲＮＡがペプチド又はタンパク質をコードする、ｓｓＲＮＡ又はｓｓＲＮＡを含むＲＮＡ調製物が、対象に投与された場合、投与後の少なくとも１０時間（例えば、少なくとも１２時間、少なくとも１４時間、少なくとも１６時間、少なくとも１８時間、少なくとも２０時間、少なくとも２２時間、又は少なくとも２４時間）、ペプチド又はタンパク質へとｓｓＲＮＡの翻訳をもたらすことを意味する。例えば、本発明の方法に供されているｓｓＲＮＡ又はｓｓＲＮＡを含むＲＮＡ調製物の含量は、前記ｓｓＲＮＡ又はｓｓＲＮＡを含むＲＮＡ調製物の総重量に対して、最大５重量％（好ましくは最大４重量％、最大３重量％、最大２重量％、最大１重量％、最大０．５重量％、最大０．１重量％、最大０．０５重量％、最大０．０１重量％、最大０．００５重量％、最大０．００１重量％）であり得る。
本発明の方法に供されているｓｓＲＮＡ又はｓｓＲＮＡを含むＲＮＡ調製物と併せて、本明細書で使用される用語「ＤＮＡを実質的に含まない」とは、ｓｓＲＮＡ又はｓｓＲＮＡを含むＲＮＡ調製物中のｄｓＲＮＡの量が、前記ｓｓＲＮＡ又はｓｓＲＮＡを含むＲＮＡ調製物の総重量に対して、最大５重量％（好ましくは最大４重量％、最大３重量％、最大２重量％、最大１重量％、最大０．５重量％、最大０．１重量％、最大０．０５重量％、最大０．０１重量％、最大０．００５重量％、最大０．００１重量％）であり得ることを意味する。
本発明の方法に供されているｓｓＲＮＡ又はｓｓＲＮＡを含むＲＮＡ調製物と併せて、本明細書で使用される用語「ｄｓＲＮＡ及びＤＮＡを実質的に含まない」とは、前記ｓｓＲＮＡ又はｓｓＲＮＡを含むＲＮＡ調製物が、上記で特定されるｄｓＲＮＡを実質的に含まず（例えば、翻訳が投与後の少なくとも１０時間持続し、及び／又はｄｓＲＮＡ含量が最大５重量％である）、上記で特定されるＤＮＡを実質的に含まない（例えば、ＤＮＡ含量が最大５重量％である）ことを意味する。
本発明との関連において、用語「ＲＮＡ」は、リボヌクレオチド残基を含む分子、好ましくはリボヌクレオチド残基から全体的に又は実質的に構成される分子に関する。「リボヌクレオチド」は、β－Ｄ－リボフラノシル基の２’位にヒドロキシル基を有するヌクレオチドに関する。用語「ＲＮＡ」は、部分的に又は完全に精製されたＲＮＡ、本質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、及び組換え的に生成されたＲＮＡなどの単離されたＲＮＡを含み、一若しくは複数のヌクレオチドの付加、欠失、置換及び／又は変更によって、天然に存在するＲＮＡとは異なる修飾されたＲＮＡを含む。このような変更は、ＲＮＡの末端など（複数可）に、又は内部的に、例えば、ＲＮＡの一又は複数のヌクレオチドに、非ヌクレオチド物質の付加を含むことができる。ＲＮＡ分子中のヌクレオチドはまた、天然に存在しないヌクレオチド若しくは化学的に合成されたヌクレオチド又はデオキシヌクレオチドなどの非標準ヌクレオチドを含み得る。これらの変更／修飾されたヌクレオチドは、天然に存在するヌクレオチドの類似体と称され得、このような変更／修飾されたヌクレオチド（すなわち、変更／修飾されたＲＮＡ）を含有する対応するＲＮＡは、天然に存在するＲＮＡの類似体と称され得る。分子中のリボヌクレオチド残基の含量が、分子中のヌクレオチド残基の総数に対して、少なくとも４０％（例えば、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％）である場合、分子は「リボヌクレオチド残基から実施的に構成される」。分子中のヌクレオチド残基の総数は、すべてのヌクレオチド残基の合計である（ヌクレオチド残基が標準（すなわち、天然に存在する）ヌクレオチド残基であるか又はその類似体であるかにかかわらない）。
ＲＮＡは、細胞から単離することができ、ＤＮＡ鋳型から作製することができ、又は当該技術分野において公知である方法を用いて化学的に合成することができる。好ましい実施態様では、ＲＮＡは、インビトロでＤＮＡ鋳型から合成される。１つの特に好ましい実施態様では、ＲＮＡ、特にｍＲＮＡ又は阻害性ｓｓＲＮＡ（例えば、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ）などのｓｓＲＮＡは、ＤＮＡ鋳型からのインビトロ転写によって生成される。インビトロ転写法は、当業者に公知である；例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ等，編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ １９８９を参照されたい。さらに、様々なインビトロ転写キットが存在し、例えば、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ｓｕｃｈ ａｓ ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔＡｉｄ（商標）Ｔ７キット、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ（登録商標）Ｔ７キット、ＭＡＸＩｓｃｒｉｐｔ（登録商標）など）、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ Ｉｎｃ．（ＨｉＳｃｒｉｂｅ（商標）Ｔ７キット、ＨｉＳｃｒｉｂｅ（商標）Ｔ７ ＡＲＣＡ ｍＲＮＡキットなど）、Ｐｒｏｍｅｇａ（ＲｉｂｏＭＡＸ（商標）、ＨｅＬａＳｃｒｉｂｅ（登録商標）、Ｒｉｂｏｐｒｏｂｅ（登録商標）システムなど）、Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（ＳＰ６又はＴ７転写キットなど）、及びＥｐｉｃｅｎｔｒｅ（ＡｍｐｌｉＳｃｒｉｂｅ（商標）など）から市販されている。１つの特に好ましい態様では、ＲＮＡは、インビトロで転写されたＲＮＡ（ＩＶＴ ＲＮＡ）である。修飾されたＲＮＡを提供するために、修飾された天然に存在するヌクレオチド、天然に存在しないヌクレオチド及び／又は修飾された天然に存在しないヌクレオチドなどの対応する修飾されたヌクレオチドは、合成（好ましくはインビトロ転写）中に組み込むことができ、又は修飾は転写後にＲＮＡに影響を及ぼし及び／又はそれに付加され得る。
本発明によれば、ＲＮＡとして好ましいものは、６－１００、好ましくは１０－５０、特に１５－３０若しくは１５－２０ヌクレオチドの合成オリゴヌクレオチド、又は５０ヌクレオチドを超える、好ましくは１００－１５，０００、より好ましくは５０－１０，０００、より好ましくは１００－５，０００、特に２００－１，０００ヌクレオチドの長さの転写物である。
本発明によれば、「ＲＮＡ」は、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｓＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、及び阻害性ＲＮＡを含む。
本発明によれば、「ｓｓＲＮＡ」は、ｍＲＮＡ及び阻害性ｓｓＲＮＡ（アンチセンスｓｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、又はｍｉＲＮＡなど）を含む。
「ｓｓＲＮＡ」は、一本鎖ＲＮＡを意味する。ｓｓＲＮＡは、ＲＮＡの一部が折り畳まれ、それ自身で対になって二重らせんを形成することを可能にする自己相補性配列を含有し得る。ｓｓＲＮＡのサイズは、６ヌクレオチドから１５，０００、好ましくは１０－１２，０００、特に１００－１０，０００、１５０－８，０００、２００－７，０００、２５０－６，０００、又は３００－５，０００ヌクレオチドで変化し得る。一実施態様では、ｓｓＲＮＡは、長さが少なくとも２，７００ヌクレオチド（例えば、少なくとも２，８００、少なくとも２，９００、少なくとも３，０００、少なくとも３，１００、少なくとも３，２００、少なくとも３，３００、少なくとも３，４００、少なくとも３，５００、少なくとも３，６００、少なくとも３，７００、少なくとも３，８００、少なくとも３，９００、少なくとも４，０００、少なくとも４，１００、少なくとも４，２００、少なくとも４，３００、少なくとも４，４００、少なくとも４，５００、少なくとも４，６００、少なくとも４，７００、少なくとも４，８００、少なくとも４，９００、少なくとも５，０００ヌクレオチド）である。本明細書で使用される長いｓｓＲＮＡは、サイズが少なくとも３，５００ヌクレオチド（例えば、少なくとも３，６００、少なくとも３，７００、少なくとも３，８００、少なくとも３，９００、少なくとも４，０００、少なくとも４，１００、少なくとも４，２００、少なくとも４，３００、少なくとも４，４００、少なくとも４，５００、少なくとも４，６００、少なくとも４，７００、少なくとも４，８００、少なくとも４，９００、少なくとも５，０００、少なくとも５，５００、少なくとも６，０００、少なくとも６，５００、少なくとも７，０００、少なくとも７，５００、少なくとも８，０００、少なくとも８，５００、少なくとも９，０００、少なくとも９，５００ヌクレオチド）、好ましくは最大１５，０００、例えば、最大１４，０００、最大１３，０００又は最大１２，０００ヌクレオチドであるｓｓＲＮＡを意味する。
本発明によれば、「ｄｓＲＮＡ」は二本鎖ＲＮＡを意味し、２つの部分的に又は完全に相補的な鎖を有するＲＮＡである。鎖のサイズは、６ヌクレオチド－１０，０００、好ましくは１０－８，０００、特に２００－５，０００，２００－２，０００又は２００－１，０００ヌクレオチドで変化し得る。
本発明によれば、用語「ｍＲＮＡ」とは、「メッセンジャーＲＮＡ」を意味し、ＤＮＡ鋳型を用いて生成され、ペプチド又はタンパク質をコードし得る「転写物」を指す。典型的には、ｍＲＮＡは、５’－ＵＴＲ、タンパク質コード領域、及び３’－ＵＴＲを含む。本発明との関連において、ｍＲＮＡは、好ましくは、ＤＮＡ鋳型からのインビトロ転写によって生成される。上記されるように、インビトロ転写法は、当業者に公知であり、様々なインビトロ転写キットが市販されている。ｍＲＮＡのサイズは、約１，０００ヌクレオチド－１５，０００、好ましくは２，０００－１２，０００、特に２，７００－１１，０００、３，０００－１０，０００，３，５００－９，０００、４，０００－９，０００、４，５００－７，０００、又は５，０００－８，０００ヌクレオチドで変化し得る。一実施態様では、ｍＲＮＡは、少なくとも２，７００ヌクレオチド（例えば、少なくとも２，８００、少なくとも２，９００、少なくとも３，０００、少なくとも３，１００、少なくとも３，２００、少なくとも３，３００、少なくとも３，４００、少なくとも３，５００、少なくとも３，６００、少なくとも３，７００、少なくとも３，８００、少なくとも３，９００、少なくとも４，０００、少なくとも４，１００、少なくとも４，２００、少なくとも４，３００、少なくとも４，４００、少なくとも４，５００、少なくとも４，６００、少なくとも４，７００、少なくとも４，８００、少なくとも４，９００、少なくとも５，０００のヌクレオチド）の長さを有する。長いｍＲＮＡとは、少なくとも３，５００ヌクレオチド（例えば、少なくとも３，６００、少なくとも３，７００、少なくとも３，８００、少なくとも３，９００、少なくとも４，０００、少なくとも４，１００、少なくとも４，２００、少なくとも４，３００、少なくとも４，４００、少なくとも４，５００、少なくとも４，６００、少なくとも４，７００、少なくとも４，８００、少なくとも４，９００、少なくとも５，０００、少なくとも５，５００、少なくとも６，０００、少なくとも６，５００、少なくとも７，０００、少なくとも７，５００、少なくとも８，０００、少なくとも８，５００、少なくとも９，０００、少なくとも９，５００ヌクレオチド）、好ましくは最大１５，０００、例えば、最大１４，０００、最大１３，０００、最大１２，０００、最大１１，０００、又は最大１０，０００ヌクレオチドのサイズを有するｍＲＮＡを意味する。
ｍＲＮＡは、細胞において及びインビトロにおいて限られた半減期を有するだけである。したがって、本発明によれば、ＲＮＡの安定性及び翻訳効率は、必要に応じて修飾され得る。例えば、ｍＲＮＡは、安定化され得て、その翻訳は、ｍＲＮＡの安定化効果及び／又は転写効率の増加を有する一又は複数の修飾によって増加され得る。このような修飾は、例えば、国際公開第２００７／０３６３６６号に記載されていて、その全開示は出典明示により本明細書に援用される。本発明によるｍＲＮＡの発現を増加させるために、コード領域、すなわち、発現されるペプチド又はタンパク質をコードする配列内で、好ましくは発現されるペプチド又はタンパク質の配列を変更することなく修飾して、ＧＣ含量を増加させてｍＲＮＡ安定性を増加させ、コドンの最適化を行い、したがって細胞内の翻訳を増強し得る。
本発明によるＲＮＡ、好ましくはｓｓＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）との関連における「修飾」という用語は、ｍ前記ＲＮＡ中に天然には存在しないＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡなどのｓｓＲＮＡ）の任意の修飾を含む。
本発明の一実施態様では、本発明によるｓｓＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）は、キャップされていない５’－三リン酸を有さない。このようなキャップされていない５’－三リン酸の除去は、ｓｓＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）をホスファターゼで処理することによって達成され得る。
本発明によるｓｓＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）は、その安定性を増加させ、及び／又は細胞傷害性を減少させるために、修飾されたリボヌクレオチドを有し得る。例えば、一実施態様では、本発明によるｓｓＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）において、５－メチルシチジンは、シチジンで部分的に又は完全に、好ましくは完全に置換される。代替的に又は付加的に、一実施態様では、本発明によるｓｓＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）において、プソイドウリジン又はＮ（１）－メチルプソイドウリジンは、ウリジンで部分的に又は完全に、好ましくは完全に置換される。（部分的に又は完全に、好ましくは完全にウリジンで置換されている）プソイドウリジンによって修飾されたＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡなどのｓｓＲＮＡ）は、本明細書では「Ψ修飾された」と呼ばれ、一方、用語「１ｍΨ修飾された」とは、ＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡなどのｓｓＲＮＡ）が、Ｎ（１）－メチルプソイドウリジン（部分的に又は完全に、好ましくは完全にウリジンで置換されいる）を含有することを意味する。
一実施態様では、用語「修飾」は、５’キャップ又は５’キャップ類似体を有するＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡなどのｓｓＲＮＡ）を提供することに関する。用語「５’キャップ」は、ＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡなどのｓｓＲＮＡ）分子の５’末端に見出されるキャップ構造を指し、一般的に、通常でない５’－５’三リン酸連結を介して、ＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡなどのｓｓＲＮＡ）に接続されたグアノシンヌクレオチドからなる。一実施態様では、このグアノシンは７位でメチル化される。用語「従来の５’キャップ」は、天然に存在するＲＮＡの５’キャップ、好ましくは７－メチルグアノシンキャップ（ｍ７Ｇ）を指す。本発明との関連において、用語「５’キャップ」には、ＲＮＡキャップ構造に類似し、それに結合している場合、好ましくはインビボ及び／又は細胞中で、ＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡなどのｓｓＲＮＡ）を安定化する能力、及び／又はＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡなどのｓｓＲＮＡ）の翻訳を増強する能力を有するように修飾された５’キャップ類似体が含まれる。
好ましくは、ＲＮＡの５’末端（好ましくはｍＲＮＡなどのｓｓＲＮＡ）は、以下の一般式：
Figure 0007000343000001
（式中、Ｒ１及びＲ２は、独立してヒドロキシ又はメトキシであり、Ｗ、Ｘ及びＹは、独立して酸素、硫黄、セレン又はＢＨ３である）を有するキャップ構造を含む。好ましい実施態様では、Ｒ１及びＲ２はヒドロキシであり、Ｗ、Ｘ及びＹは酸素である。さらに好ましい実施態様では、Ｒ１及びＲ２の一方、好ましくはＲ１はヒドロキシであり、他方はメトキシであり、Ｗ、Ｘ及びＹは酸素である。さらに好ましい実施態様では、Ｒ１及びＲ２はヒドロキシであり、Ｗ、Ｘ及びＹの１つ、好ましくはＸは、硫黄、セレン、又はＢＨ３、好ましくは硫黄であり、他方は酸素である。さらに好ましい実施態様では、Ｒ１及びＲ２の一方、好ましくはＲ２はヒドロキシであり、他方はメトキシであり、Ｗ、Ｘ及びＹの１つ、好ましくはＸは、硫黄、セレン、又はＢＨ３、好ましくは硫黄であり、他方は酸素である。
上記の式において、右側のヌクレオチドは、その３’基を介してＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡなどのｓｓＲＮＡ）鎖に接続される。
Ｗ、Ｘ及びＹの少なくとも１つが硫黄である、すなわち、ホスホロチオエート部分を有するキャップ構造は、異なるジアステレオマー形態で存在し、それらのすべてが本明細書に包含される。さらに、本発明は、上記式のすべての互変異性体及び立体異性体を包含する。
例えば、Ｒ１がメトキシであり、Ｒ２がヒドロキシであり、Ｘが硫黄であり、Ｗ及びＹが酸素である上記構造を有するキャップ構造は、２つのジアステレオマー形態（Ｒｐ及びＳｐ）で存在する。これらは、逆相ＨＰＬＣによって分離することができ、逆相ＨＰＬＣカラムからのそれらの溶出順序に従ってＤ１及びＤ２と命名される。本発明によれば、ｍ２ ７，２’－ＯＧｐｐＳｐＧのＤ１異性体が特に好ましい。結果として、本明細書で使用される用語「Ｄ１キャップされた」は、上記で特定されるｍ２ ７，２’－ＯＧｐｐＳｐＧのＤ１異性体でキャップされたＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡなどのｓｓＲＮＡ）を指す。同様に、本明細書で使用される用語「Ｄ２キャップされた」は、上記で特定されるｍ２ ７，２’－ＯＧｐｐＳｐＧのＤ２異性体でキャップされたＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡなどのｓｓＲＮＡ）を指す。キャップ構造のさらなる例は、当業者に公知であり、国際公開第２００８／１５７６８８号に記載されているものを含み、その全開示は、出典明示により本明細書に援用される。
５’キャップ又は５’キャップ類似体を有するＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡのようなｓｓＲＮＡ）を提供することは、前記５’キャップ又は５’キャップ類似体の存在下でＤＮＡ鋳型のインビトロ転写によって達成され得、前記５’キャップは、生成されたＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡなどのｓｓＲＮＡ）鎖に同時転写的に組み込まれるか、又はＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡなどのｓｓＲＮＡ）は、例えば、インビトロ転写によって生成され得、５’キャップは、キャッピング酵素、例えば、ワクシニアウイルスのキャッピング酵素を用いて転写後にＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡなどのｓｓＲＮＡ）に結合され得る。
ＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡなどのｓｓＲＮＡ）はさらなる修飾を含み得る。例えば、本発明によるｓｓＲＮＡのさらなる修飾は、天然に存在するポリ（Ａ）尾部の伸長若しくは切断、又は５’－若しくは３’－非翻訳（「５’－又は３’－翻訳されない）領域（ＵＴＲ）の変更であり得る。
マスクされていないポリＡ配列を有するＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡなどのｓｓＲＮＡ）は、マスクされたポリＡ配列を有するＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡなどのｓｓＲＮＡ）よりも効率的に翻訳される。用語「ポリ（Ａ）尾部」又は「ポリＡ配列」は、典型的には、ＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡなどのｓｓＲＮＡ）分子の３’末端に位置するアデノシン（特にアデニリル）（Ａ）残基の配列に関し、「マスクされていないポリＡ配列」とは、ＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡなどのｓｓＲＮＡ）分子の３’末端でのポリＡ配列が、ポリＡ配列のＡで終わり、ポリＡ配列の３’末端、すなわち下流に位置するＡ以外のヌクレオチドが続かないことを意味する。さらに、約１２０ヌクレオチドの長さを有する長いポリＡ配列は、ＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡなどのｓｓＲＮＡ）の最適な転写物安定性及び翻訳効率をもたらす。
したがって、本発明によるＲＮＡ、好ましくはｓｓＲＮＡ（ｍＲＮＡなど）の安定性及び／又は発現を増加させるために、ポリＡ配列と併せて存在するように修飾され得、好ましくは、１０－５００、より好ましくは３０－３００、さらにより好ましくは６５－２００、特に１００－１５０のアデノシン（特にアデニリル）残基を有する。特に好ましい実施態様では、ポリＡ配列は、約１２０アデノシン（特にアデニリル）残基の長さを有する。本発明によるＲＮＡ、好ましくはｓｓＲＮＡ（ｍＲＮＡなど）の安定性及び／又は発現をさらに増加させるために、ポリＡ配列をマスクしないようにすることができる。
さらに、ＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡなどのｓｓＲＮＡ）分子の３’非翻訳領域への３’ＵＴＲの組み込みは、翻訳効率の向上をもたらすことができる。相乗効果は、このような２つ以上の３’－ＵＴＲを組み込むことによって達成され得る。３’－ＵＴＲは、それらが導入されるＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡなどのｓｓＲＮＡ）に対して自己又は異種であり得る。特定の一実施態様では、３’－ＵＴＲは、アルファ２－グロビン、アルファ１－グロビン、又はベータ－グロビン、好ましくはベータ－グロビン、より好ましくはヒトベータ－グロビンの遺伝子又はｍＲＮＡなどのグロビン遺伝子又はｍＲＮＡに由来する。
上記の修飾の組合せ、すなわち、ポリＡ配列の組み込み、ポリＡ配列のアンマスキング、一又は複数の３’－ＵＴＲの組み込み及び一又は複数の天然に存在するヌクレオチドの合成ヌクレオチド（例えば、シチジンに対して５－メチルシチジン、及び／又はウリジンに対してプロイドウリジン（Ψ）若しくはＮ（１）－メチルプロイドウリジン（１ｍΨ））による置き換えは、ＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡなどのｓｓＲＮＡ）の安定性及び翻訳効率の増加において相乗的に影響を及ぼす。
本明細書で使用される用語「阻害性ＲＮＡ」は、標的ｍＲＮＡに選択的にハイブリダイズし、及び／又はそれに特異的であるＲＮＡを意味し、それによりその転写及び／又は翻訳を阻害する（例えば低減させる）。阻害性ＲＮＡは、標的ｍＲＮＡに対してアンチセンス方向に配列を有するＲＮＡ分子を含む。適切な阻害性オリゴヌクレオチドは、典型的には長さが５－数百ヌクレオチド、より典型的には長さが約２０－７０ヌクレオチド又はそれより短く、さらにより典型的には長さが約１０－３０ヌクレオチドである。阻害性ＲＮＡの例としては、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、ｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡが挙げられる。
本明細書で使用される用語「アンチセンスＲＮＡ」は、特定の遺伝子を含むＤＮＡ又は前記遺伝子のｍＲＮＡに、生理学的条件下でハイブリダイズし、それにより前記遺伝子の転写及び／又は前記ｍＲＮＡの翻訳を阻害するＲＮＡを指す。核酸又はその一部のアンチセンス転写物は、天然に存在するｍＲＮＡと二重鎖を形成し、したがってｍＲＮＡの蓄積又は翻訳を阻止し得る。別の可能性は、核酸を不活性化するためのリボザイムの使用である。アンチセンスＲＮＡは、翻訳開始部位、転写開始部位若しくはプロモーター部位などのＮ末端又は５’上流部位とハイブリダイズし得る。さらなる実施態様では、アンチセンスＲＮＡは、３’－非翻訳領域又はｍＲＮＡスプライシング部位とハイブリダイズし得る。
アンチセンスＲＮＡのサイズは、１５ヌクレオチド１５，０００で変化し得、好ましくは２０－１２，０００、特に１００－１０，０００、１５０－８，０００、２００－７，０００、２５０－６，０００、３００－５，０００ヌクレオチド、例えば、１５－２，０００、２０－１，０００、２５－８００、３０－６００、３５－５００、４０－４００、４５－３００、５０－２５０、５５－２００、６０－１５０、又は６５－１００ヌクレオチドである。一実施態様では、アンチセンスＲＮＡは、少なくとも２，７００ヌクレオチドの長さ（例えば、少なくとも２，８００、少なくとも２，９００、少なくとも３，０００、少なくとも３，１００、少なくとも３，２００、少なくとも３，３００、少なくとも３，４００、少なくとも３，５００、少なくとも３，６００、少なくとも３，７００、少なくとも３，８００、少なくとも３，９００、少なくとも４，０００、少なくとも４，１００、少なくとも４，２００、少なくとも４，３００、少なくとも４，４００、少なくとも４，５００、少なくとも４，６００、少なくとも４，７００、少なくとも４，８００、少なくとも４，９００、少なくとも５，０００ヌクレオチド）を有する。本明細書で使用する長いアンチセンスＲＮＡは、サイズが少なくとも３，５００ヌクレオチド（例えば、少なくとも３，６００、少なくとも３，７００、少なくとも３，８００、少なくとも３，９００、少なくとも４，０００、少なくとも４，１００、少なくとも４，２００、少なくとも４，３００、少なくとも４，４００、少なくとも４，５００、少なくとも４，６００、少なくとも４，７００、少なくとも４，８００、少なくとも４，９００、少なくとも５，０００、少なくとも５，５００、少なくとも６，０００、少なくとも６，５００、少なくとも７，０００、少なくとも７，５００、少なくとも８，０００、少なくとも８，５００、少なくとも９，０００、少なくとも９，５００ヌクレオチド）、好ましくは最大１５，０００、例えば、最大１４，０００、最大１３，０００、最大１２，０００、最大１１，０００、又は最大１０，０００のヌクレオチドであるアンチセンスＲＮＡを意味する。
アンチセンスＲＮＡの安定性は、必要に応じて修飾され得る。例えば、アンチセンスＲＮＡは、安定化効果を有する一又は複数の修飾によって安定化され得る。このような修飾には、修飾ホスホジエステル連結（例えば、天然に存在するホスホジエステル連結の代わりに、メチルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート又はホスホロアミデート連結）及び２’－置換（例えば、２’－フルオロ、２’－Ｏ－アルキル（例えば、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－プロピル、又は２’－Ｏ－ペンチル）及び２’－Ｏ－アリル）含まれる。例えば、アンチセンスＲＮＡの一実施態様では、ホスホロチオエート連結は、ホスホジエステル連結について部分的に置換される。代替的又は追加的に、アンチセンスＲＮＡの一実施態様では、リボース部分は、２’位でＯ－アルキル（例えば、２’－Ｏ－メチル）で部分的に置換される。
アンチセンスＲＮＡは、標的ｍＲＮＡ配列（「標的配列」）の何れかにおいて約１９－２５個の連続したヌクレオチドの任意のストレッチを標的化することができる。一般的に、標的ｍＲＮＡ上の標的配列は、好ましくは開始コドンから５０－１００ｎｔ下流（すなわち、３’方向）で始まる、標的ｍＲＮＡに対応する所定のｃＤＮＡ配列から選択することができる。しかしながら、標的配列は、５’－若しくは３’－非翻訳領域、又は開始コドンの近くの領域に位置し得る。
アンチセンスＲＮＡは、当業者に公知である多数の技術を用いて得ることができる。例えば、アンチセンスＲＮＡは、当該技術分野において公知である方法を用いて化学的に合成され得るか又は組換え的に生成され得る。好ましくは、アンチセンスＲＮＡは、任意の適切なプロモーターを用いて、組換え環状又は線状ＤＮＡプラスミドから転写される。
アンチセンスＲＮＡの発現に適したプラスミドの選択、アンチセンスＲＮＡをプラスミドに発現させるための核酸配列を挿入する方法、及び前記アンチセンスＲＮＡのインビトロ転写のＩＶＴ法は、当業者の範囲内である。
「アンチセンスｓｓＲＮＡ」は、一本鎖である上記で特定されるアンチセンスＲＮＡを指す。
本明細書で使用する「低分子干渉ＲＮＡ」又は「ｓｉＲＮＡ」は、好ましくは長さが１０ヌクレオチドを超え、より好ましくは長さが１５ヌクレオチドを超え、最も好ましくは長さ１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０ヌクレオチドであり、標的ｍＲＮＡの一部分に特異的に結合することができるＲＮＡ分子を意味する。この結合は、標的ｍＲＮＡの前記部分が切断又は分解され、それによって前記標的ｍＲＮＡの遺伝子発現が阻害されるプロセスを誘導する。１９－２５ヌクレオチドの範囲がｓｉＲＮＡにとって最も好ましいサイズである。原理的には、ｓｉＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖は、２つの相補的な一本鎖ＲＮＡ分子を含むことができるが、本発明によるｓｉＲＮＡは、２つの相補的部分が塩基対形成し、一本鎖「ヘアピン」領域によって共有結合的に連結される単一分子を含む。すなわち、センス領域及びアンチセンス領域は、リンカー分子を介して共有結合的に接続させることができる。リンカー分子は、ポリヌクレオチド又は非ヌクレオチドリンカーであり得るが、好ましくはポリヌクレオチドリンカーである。いかなる理論にも束縛されることを望まないが、一本鎖ｓｉＲＮＡ分子のヘアピン領域は、「ダイサー（Dicer）」タンパク質（又はその等価物）によって細胞内で切断され、２つの個々の塩基対形成したＲＮＡ分子のｓｉＲＮＡを形成すると考えられている。
ｓｉＲＮＡはまた、３’－オーバーハングを含むことができる。本明細書で使用される場合、「３’－オーバーハング」は、ＲＮＡ鎖の３’末端から伸長する少なくとも１つの不対ヌクレオチドを指す。したがって、一実施態様では、ｓｉＲＮＡは、長さが１－約６ヌクレオチド（リボヌクレオチド又はデオキシヌクレオチドを含む）、好ましくは長さが１－約５ヌクレオチド、より好ましくは長さが１－約４ヌクレオチド、特に好ましくは長さ少なくとも約２－約４ヌクレオチドの少なくとも１つの３’－オーバーハングを含む。ｓｉＲＮＡ分子の両方の鎖（すなわち、一本鎖ｓｉＲＮＡ分子が「ダイサー」タンパク質によって細胞内で切断された後）が３’－オーバーハングを含む実施態様では、オーバーハングの長さは、各鎖について同じであるか又は異なることができる。最も好ましい実施態様では、３’－オーバーハングは、ｓｉＲＮＡの両方の鎖上に存在し、長さが２ヌクレオチドである。例えば、ｓｉＲＮＡの各鎖は、ジデオキシチミジル酸（「ＴＴ」）又はジウリジル酸（「ｕｕ」）の３’－オーバーハングを含み得る。
ｓｉＲＮＡの安定性を増強するために、３’－オーバーハングはまた、分解に対して安定化することができる。一実施態様では、オーバーハングは、プリンヌクレオチド、例えば、アデノシン又はグアノシンヌクレオチドを含むことによって安定化される。あるいは、修飾された類似体によるピリミジンヌクレオチドの置換、例えば、３’－オーバーハングにおけるウリジンヌクレオチドの２’－デオキシチミジンによる置換は許容され、ＲＮＡｉ分解の効率に影響を及ぼさない。特に、２’－デオキシチミジン中の２’－ヒドロキシルの不存在は、組織培地中の３’－オーバーハングのヌクレアーゼ耐性を有意に増強する。
本明細書で使用される場合、「標的ｍＲＮＡ」は、ダウンレギュレーションの標的であるＲＮＡ分子を指す。
本発明によるｓｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡ配列（「標的配列」）の何れかにおいて、約１９－２５個の連続したヌクレオチドの任意のストレッチを標的化することができる。ｓｉＲＮＡの標的配列を選択する技術は、例えば、その全開示が出典明示により本明細書に援用される、Ｔｕｓｃｈｌ Ｔ．等、「Ｔｈｅ ｓｉＲＮＡ Ｕｓｅｒ Ｇｕｉｄｅ」、改訂Ｏｃｔ．１１、２００２に記載されている。「ｓｉＲＮＡ Ｕｓｅｒ Ｇｕｉｄｅ」は、米国ニューヨーク州のロックフェラー大学のＲＮＡ分子生物学研究所のＴｈｏｍａｓ Ｔｕｓｃｈｌ博士によって管理されているウェブサイト、ワールド・ワイド・ウェブで入手でき、ロックフェラー大学のウェブサイトにアクセスし、キーワード「ｓｉＲＮＡ」で検索することによって見出すことができる。標的配列の選択及び／又はｓｉＲＮＡの設計に関するさらなるガイダンスは、Ｐｒｏｔｏｃｏｌ Ｏｎｌｉｎｅ（www.protocol-online.com）のウェブページ上でキーワード「ｓｉＲＮＡ」を用いて見出すことができる。したがって、一実施態様では、本発明のｓｉＲＮＡのセンス鎖は、標的ｍＲＮＡ中の約１９－約２５ヌクレオチドの任意の連続ストレッチと実質的に同一であるヌクレオチド配列を含む。
一般的に、標的ｍＲＮＡ上の標的配列は、好ましくは開始コドンから５０－１００ｎｔ下流（すなわち、３’方向）に開始する、標的ｍＲＮＡに対応する所定のｃＤＮＡ配列から選択することができる。しかしながら、標的配列は、５’－若しくは３’－非翻訳領域、又は開始コドンの近くの領域に位置し得る。
ｓｉＲＮＡは、当業者に公知である多数の技術を用いて得ることができる。例えば、ｓｉＲＮＡは、化学的に合成され得るか、又はその全開示が出典明示により本明細書に援用される、Ｔｕｓｃｈｌ等の米国特許出願第２００２／００８６３５６号に記載されているショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）のインビトロ系などの当該技術分野において公知である方法を用いて、組換え的に生成され得る。ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターからのＲＮＡの発現が、第１の転写されたヌクレオチドがプリンである場合にのみ効率的であると考えられるため、ｓｉＲＮＡは、標的部位の変化なしにｐｏｌ ＩＩＩ発現ベクターから発現され得る。
好ましくは、ｓｉＲＮＡは、任意の適切なプロモーターを用いて、組換え環状又は線状ＤＮＡプラスミドから転写される。プラスミドから本発明のｓｉＲＮＡを転写するのに適したプロモーターには、例えば、Ｕ６又はＨ１ ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター配列及びサイトメガロウイルスプロモーターが含まれる。他の適切なプロモーターの選択は、当業者の範囲内である。
ｓｉＲＮＡを転写するのに適したプラスミドの選択、ｓｉＲＮＡを発現するための核酸配列をプラスミドに挿入する方法、及び前記ｓｉＲＮＡのインビトロ転写のＩＶＴ方法は、当業者の範囲内である。
本明細書で使用される用語「ｍｉＲＮＡ」（マイクロＲＮＡ）は、長さが２１－２５（例えば、２１－２３、好ましくは２２）のヌクレオチドであり、標的ｍＲＮＡの分解を誘導し及び／又は翻訳を妨げる非コードＲＮＡに関する。ｍｉＲＮＡは、植物、動物及びいくつかのウイルスにおいて典型的に見出され、それらは、植物及び動物における真核細胞核ＤＮＡ並びに（ゲノムがＤＮＡに基づくウイルスにおける）ウイルスＤＮＡによってそれぞれコードされる。ｍｉＲＮＡは、標的メッセンジャーＲＮＡ転写物（ｍＲＮＡ）上の相補的配列に結合し、通常、翻訳抑制又は標的分解及び遺伝子サイレンシングを生じる転写後調節因子である。
ｍｉＲＮＡは、当業者に公知である多数の技術を用いて得ることができる。例えば、アンチセンスＲＮＡは、化学的に合成するか又は当該技術分野において公知である方法を用いて（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｉｎｃ．によって販売されているｍｉＲＮＡ ｃＤＮＡ合成キットなどの市販のキットを使用することにより）組換え的により生成することができる。好ましくは、アンチセンスＲＮＡは、任意の適切なプロモーターを用いて、組換え環状又は線状ＤＮＡプラスミドから転写される。ＲＮＡの二次構造を予測する技術は、例えば、Ｓａｔｏ等（Nucleic Acids Res. 37(2009):W277－W280）、Ｈａｍａｄａ等（Nucleic Acids Res. 39(2011):W100－W106 2011）、並びにＲｅｕｔｅｒ及びＭａｔｈｅｗｓ（BMC Bioinformatics 11(2010):129）に記載されている。
用語「ヌクレオシド」は、リン酸基を有さないヌクレオチドと考えることができる化合物を指す。ヌクレオシドは、糖（例えば、リボース又はデオキシリボース）に連結された核酸塩基であり、ヌクレオチドは、ヌクレオシド及び一又は複数のリン酸基から構成される。ヌクレオシドの例としては、シチジン、ウリジン、アデノシン、及びグアノシンが挙げられる。
核酸を構成する５つの標準的なヌクレオシドは、ウリジン、アデノシン、チミジン、シチジン及びグアノシンである。５つのヌクレオシドは、それぞれ、一般的には１文字コードとしてＵ、Ａ、Ｔ、Ｃ及びＧと略記される。しかしながら、チミジンは、ウリジンに見出されるリボフラノース環と比較して、２’－デオキシリボフラノース部分を含有するため、より一般的には「ｄＴ」（「ｄ」は「デオキシ」を表す）として記載される。これは、チミジンがリボ核酸（ＲＮＡ）ではなく、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）に見出されるためである。逆に、ウリジンは、ＲＮＡでは見出されるが、ＤＮＡでは見出されない。残りの３つのヌクレオシドは、ＲＮＡとＤＮＡの両方に見出され得る。ＲＮＡでは、それらはＡ、Ｃ及びＧとして表され、一方、ＤＮＡではｄＡ、ｄＣ及びｄＧとして表される。
ＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡなどのｓｓＲＮＡ）の「安定性」という用語は、ＲＮＡの「半減期」に関する。「半減期」は、分子の活性、量又は数の半分を除去するのに必要な時間を指す。本発明に関して、ＲＮＡ（好ましくはｓｓＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ又は阻害性ｓｓＲＮＡ）の半減期は、前記ＲＮＡの安定性を示す。
当然に、本発明によれば、ＲＮＡ（好ましくはｓｓＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ又は阻害性ｓｓＲＮＡ）の安定性を減少させることが望まれる場合、ＲＮＡ（好ましくｓｓＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ又は阻害性ｓｓＲＮＡ）の安定性を増加させる上述の要素の機能と干渉するように、ＲＮＡ（好ましくｓｓＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ又は阻害性ｓｓＲＮＡ）を修飾することができる。
一実施態様では、本発明によるｓｓＲＮＡは、ペプチド又はタンパク質をコードする（修飾された）ｓｓＲＮＡ、特に（修飾された）ｍＲＮＡである。本発明によれば、「ペプチド又はタンパク質をコードするｓｓＲＮＡ」という用語は、適切な環境、好ましくは細胞内に存在する場合、ｓｓＲＮＡが、翻訳のプロセスでペプチド又はタンパク質を生成する、すなわち発現するアミノ酸の集合を指向し得ることを意味する。好ましくは、本発明によるｓｓＲＮＡ（ｍＲＮＡなど）は、ペプチド又はタンパク質の翻訳を可能にする細胞翻訳機構と相互作用することができる。
用語「発現」は、その最も一般的な意味で本発明に従って使用され、例えば、転写及び／若しくは翻訳によるＲＮＡ並びに／又はペプチド若しくはタンパク質の生成を含む。ＲＮＡに関して、用語「発現」又は「翻訳」は、特に、ペプチド又はタンパク質の生成に関する。これはまた、核酸の部分発現を含む。さらに、発現は、一時的又は安定的であり得る。
本発明との関連において、用語「転写」は、ＤＮＡ配列中の遺伝子コードがＲＮＡに転写されるプロセスに関する。続いて、ＲＮＡはタンパク質に翻訳され得る。本発明によれば、用語「転写」は、「インビトロ転写」を含み、用語「インビトロ転写」は、ＲＮＡ、特にｍＲＮＡなどのｓｓＲＮＡが無細胞系において、好ましくは適切な細胞抽出物を用いて、インビトロで合成されるプロセスに関する。好ましくは、クローニングベクターが転写物の生成に適用される。これらのクローニングベクターは、一般的に、転写ベクターと呼ばれ、本発明によれば、用語「ベクター」に包含される。本発明によれば、ＲＮＡ調製物は、インビトロ転写、特に適切なＤＮＡ鋳型のインビトロ転写によって生成されるｓｓＲＮＡを含む。転写を制御するためのプロモーターは、任意のＲＮＡポリメラーゼのための任意のプロモーターであり得る。ＲＮＡポリメラーゼの特定の例は、Ｔ７、Ｔ３、及びＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼである。好ましくは、インビトロ転写は、Ｔ７、Ｔ３、又はＳＰ６プロモーターによって制御される。インビトロ転写のためのＤＮＡ鋳型は、核酸、特にｃＤＮＡのクローニング、及びインビトロ転写のための適切なベクターへの導入によって得ることができる。ｃＤＮＡは、ＲＮＡの逆転写によって得ることができる。
ｃＤＮＡを含有するベクター鋳型は、異なるｃＤＮＡ挿入物を有するベクターを含むことができ、転写後、任意選択的に異なるペプチド若しくはタンパク質を発現することができる異なるＲＮＡ分子の集団をもたらし、又は転写後、１つのペプチド又はタンパク質のみを発現することができる１つのＲＮＡ種の集団のみをもたらすただ１種のｃＤＮＡ挿入物を有するベクターを含むことができる。したがって、単一のペプチド若しくはタンパク質のみを発現することができるＲＮＡを生成することができ、又は１を超えるペプチド若しくはタンパク質を発現することができるＲＮＡライブラリー及び全細胞ＲＮＡなどの異なるＲＮＡの組成物、例えば、ペプチド若しくはタンパク質の組成物を生成することができる。本発明は、このようなＲＮＡのすべてを細胞に導入することを想定している。
本発明による用語「翻訳」は、ｍＲＮＡの鎖がアミノ酸の配列の集合を指向して、ペプチド又はタンパク質を作製する、細胞のリボソームにおけるプロセスに関する。
本明細書で使用される用語「ペプチド」は、オリゴペプチド及びポリペプチドを含み、ペプチド結合によって共有結合的に接続された、２個以上、好ましくは３個以上、好ましくは４個以上、好ましくは６個以上、好ましくは８個以上、好ましくは１０個以上、好ましくは１３個以上、好ましくは１６個以上、好ましくは２１個以上、最大好ましくは８個、１０個、２０個、３０個、４０個又は５０個、特に１００個のアミノ酸を含む物質を指す。用語「タンパク質」は、優先的に、大きなペプチドを指し、好ましくは１００個を超えるアミノ酸残基を有するペプチドを指すが、一般的に、「ペプチド」及び「タンパク質」という用語は同義語であり、本明細書において互換的に使用される。
本発明によれば、ｍＲＮＡなどのｓｓＲＮＡは、ペプチド又はタンパク質をコードし得る。したがって、ｓｓＲＮＡは、ペプチド又はタンパク質をコードするコード領域（オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ））を含有し得る。例えば、ｓｓＲＮＡは、免疫学的に活性な化合物（好ましくは抗原ではない）などの抗原又は薬学的に活性なペプチド若しくはタンパク質をコードし、発現し得る。この点において、「オープンリーディングフレーム」又は「ＯＲＦ」は、開始コドンで始まり終止コドンで終わるコドンの連続ストレッチである。
「薬学的に活性なペプチド又はタンパク質」という用語は、ペプチド又はタンパク質の発現が、例えば、疾患又は障害の症状を軽快させるのに有益である対象の治療に使用することができるペプチド又はタンパク質を含む。例えば、薬学的に活性なタンパク質は、通常、タンパク質を発現しないか、又はタンパク質を誤って発現する細胞においてタンパク質発現を置き換え又は増強することができ、例えば、薬学的に活性なタンパク質は、所望のタンパク質を供給することによって突然変異を補うことができる。さらに、「薬学的に活性なペプチド又はタンパク質」は、対象において有益な結果を生じさせ得、例えば、感染性疾患に対して、対象にワクチン接種するタンパク質を生成するために使用され得る。好ましくは、「薬学的に活性なペプチド又はタンパク質」は、治療有効量で対象に投与された場合、対象の状態又は疾患状態に対してプラス又は有利な効果を有する。好ましくは、薬学的に活性なペプチド又はタンパク質は、治癒的又は緩和的な特性を有し、疾患又は障害の一又は複数の症状の軽快、軽減、緩和、好転、発症の遅延又は重症度の低下のために投与され得る。薬学的に活性なペプチド又はタンパク質は、予防的特性を有してもよく、疾患の発症を遅延させるか、又はこのような疾患若しくは病理学的状態の重症度を低下するために使用され得る。用語「薬学的に活性なペプチド又はタンパク質」は、タンパク質又はポリペプチド全体を含み、また、それらの薬学的に活性な断片を指すことができる。それはまた、ペプチド又はタンパク質の薬学的に活性な類似体を含み得る。用語「薬学的に活性なペプチド又はタンパク質」は、抗原であるペプチド及びタンパク質を含み、すなわち、ペプチド又はタンパク質は、治療的又は部分的若しくは完全に防御的であり得る、対象において免疫応答を誘発する。
薬学的に活性なタンパク質の例としては、限定されないが、免疫学的に活性な化合物などのサイトカイン及び免疫系タンパク質（例えば、インターロイキン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、エリスロポエチン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターフェロン、インテグリン、アドレシン、セレクチン、ホーミング受容体、Ｔ細胞受容体、免疫グロブリン、可溶性主要組織適合複合体抗原、免疫学的に活性な抗原、例えば、細菌、寄生虫又はウイルスの抗原、アレルゲン、自己抗原、抗体）、ホルモン（インスリン、甲状腺ホルモン、カテコールアミン、ゴナドトロピン、刺激ホルモン、プロラクチン、オキシトシン、ドーパミン、ウシソマトトロピン、レプチンなど）、成長ホルモン（例えば、ヒト成長ホルモン）、増殖因子（例えば、上皮増殖因子、神経成長因子、インスリン様増殖因子など）、増殖因子受容体、酵素（組織プラスミノーゲンアクチベーター、ストレプトキナーゼ、コレステロール生合成酵素又は分解酵素、ステロイド産生酵素、キナーゼ、ホスホジエステラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、デヒドロゲナーゼ、セルラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、アロマターゼ、チトクロム、アデニル酸シクラーゼ又はグアニル酸シクラーゼ、ノイラミダーゼなど）、受容体（ステロイドホルモン受容体、ペプチド受容体）、結合タンパク質（成長ホルモン結合タンパク質又は増殖因子結合タンパク質など）、転写因子及び翻訳因子、腫瘍増殖抑制タンパク質（例えば、血管新生を阻害するタンパク質）、構造タンパク質（コラーゲン、フィブロイン、フィブリノーゲン、エラスチン、チューブリン、アクチン、及びミオシンなど）、並びに血液タンパク質（トロンビン、血清アルブミン、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、インスリン、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、組織プラスミノーゲンアクチベーター、プロテインＣ、フォンヴィレブランド因子、アンチトロンビンＩＩＩ、グルコセレブロシダーゼ、エリスロポエチン顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）又は修飾第ＶＩＩＩ因子、抗凝固因子など）が挙げられる。
一実施態様では、薬学的に活性なタンパク質は、リンパ球ホメオスタシスの調節に関与するサイトカイン、好ましくは、Ｔ細胞の発生、プライミング、増殖、分化及び／又は生存に関与し、好ましくは誘導又は増強するサイトカインである。一実施態様では、サイトカインは、インターロイキンである。一実施態様では、薬学的に活性なタンパク質は、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１からなる群から選択されるインターロイキンである。
「免疫学的に活性な化合物」という用語は、好ましくは、免疫細胞の成熟を誘導及び／若しくは抑制することによって、サイトカイン生合成を誘導及び／若しくは抑制することによって、並びに／又はＢ細胞による抗体生成を刺激することによって体液性免疫を変更させることによって、免疫応答を変化させる任意の化合物に関する。免疫学的に活性な化合物は、限定されないが、抗ウイルス活性及び抗腫瘍活性を含む強力な免疫刺激活性を有し、また、免疫応答の他の態様をダウンレギュレーションし、例えば、免疫応答をＴＨ２免疫応答からシフトさせることもでき、これは、広範囲のＴＨ２媒介性疾患の治療に有用である。免疫学的に活性な化合物は、ワクチンアジュバントとして有用であり得る。
一実施態様では、疾患関連抗原などの抗原をコードするｓＲＮＡ（ｍＲＮＡなど）は、特に抗原（疾患関連抗原）を伴い又はそれを発現する疾患を有する哺乳動物の治療が所望される場合、哺乳動物に投与される。ｓｓＲＮＡは、好ましくは、哺乳動物の抗原提示細胞（単球、マクロファージ、樹状細胞又は他の細胞）に取り込まれる。ｓｓＲＮＡの抗原の翻訳生成物が形成され、生成物は、Ｔ細胞による認識のために細胞の表面上に提示される。一実施態様では、抗原又はその任意選択的な処理によって生成された生成物は、活性化をもたらすＴ細胞受容体を介したＴ細胞による認識のためのＭＨＣ分子において細胞表面に提示される。
インターフェロンは、抗ウイルス活性、抗増殖活性及び免疫調節活性によって特徴付けられる重要なサイトカインである。インターフェロンは、調節された細胞の表面上のインターフェロン受容体に結合し、それにより細胞内のウイルス複製を妨げることによって、細胞内の遺伝子の転写を変更及び調節するタンパク質である。インターフェロンは、２つの型に分類することができる。ＩＦＮ－ガンマは、唯一のＩＩ型インターフェロンである；他はすべてＩ型インターフェロンである。Ｉ型及びＩＩ型インターフェロンは、遺伝子構造（ＩＩ型インターフェロン遺伝子は３つのエキソンを有する；Ｉ型では１つである）、染色体の位置（ヒトでは、ＩＩ型は第１２染色体に位置する；Ｉ型インターフェロン遺伝子は連鎖しており、第９染色体に位置する）、及びそれらが生成される組織のタイプ（Ｉ型インターフェロンは遍在的に合成され、ＩＩ型はリンパ球によって合成される）において相違する。Ｉ型インターフェロンは、細胞受容体への結合を互い競合的に阻害するが、一方、ＩＩ型インターフェロンは異なる受容体を有する。本発明によれば、用語「インターフェロン」又は「ＩＦＮ」は、好ましくはＩ型インターフェロンを指し、特にＩＦＮ－アルファ及びＩＦＮ－ベータに関する。
一実施態様では、ＲＮＡ、特に細胞内で発現されるべきＲＮＡは、一本鎖自己複製ＲＮＡである。一実施態様では、自己複製ＲＮＡは、プラス鎖の一本鎖ＲＮＡである。一実施態様では、自己複製ＲＮＡは、ウイルスＲＮＡ又はウイルスＲＮＡ由来のＲＮＡである。一実施態様では、自己複製ＲＮＡは、アルファウイルスゲノムＲＮＡであるか、又はアルファウイルスゲノムＲＮＡに由来する。一実施態様では、自己複製ＲＮＡはウイルス遺伝子発現ベクターである。一実施態様では、ウイルスはセムリキ森林熱ウイルスである。一実施態様では、自己複製ＲＮＡは、一又は複数の導入遺伝子を含有し、これは、一実施態様では、ＲＮＡがウイルスＲＮＡである場合、構造タンパク質をコードするウイルス配列などのウイルス配列を部分的に又は完全に置き換え得る。
本明細書で使用される用語「ＲＮＡ調製物」は、上記で特定される様々なＲＮＡ型の少なくとも１つの型（すなわち、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｓＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、及び阻害性ｓｓＲＮＡ（例えば、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、又はｍｉＲＮＡ））を含む任意の組成物を指す。本明細書で使用される用語「ｓｓＲＮＡを含むＲＮＡ調製物」は、少なくともｓｓＲＮＡを含む任意の組成物を指す（しかし、前記組成物はまたｄｓＲＮＡも含み得る）。用語「インビトロ転写によって生成されるｓｓＲＮＡを含むＲＮＡ調製物」は、少なくともｓｓＲＮＡを含む任意の組成物を指し、前記ｓｓＲＮＡは、インビトロ転写によって生成されている。
本明細書で使用される用語「インビトロ転写」又は「ＩＶＴ」は、転写（すなわち、ＲＮＡの生成）が無細胞様式で行われることを意味する。すなわち、ＩＶＴは、生存している／培養された細胞を使用せず、むしろ、細胞から抽出された転写機構（例えば、ＲＮＡポリメラーゼ（好ましくはＴ７、Ｔ３又はＳＰ６ポリメラーゼ）を含む、細胞溶解物又はその単離された成分）を使用する。
本明細書で使用される用語「任意選択的な」又は「任意選択的に」という用語は、その後に記載される事象、状況又は状態が起こってもよく又は起こらなくてもよいことを意味し、この記載は前記事象、状況又は状態が起こる場合及び起こらない場合を含むことを意味する。
「異性体」は、同じ分子式を有するが、構造（「構造異性体」）、又は官能基及び／若しくは原子（「立体異性体」）の幾何学的配置が異なる化合物である。「鏡像異性体」は、互いに重ね合わせることができない鏡像である一対の立体異性体である。「ラセミ混合物」又は「ラセミ体」は、等量の一対のエナンチオマーを含有し、接頭辞（±）で示される。「ジアステレオマー」は、互いに重ね合わせることができない鏡像である立体異性体である。「互変異性体」は、たとえ純粋であっても、互いに自然に相互変換する同じ化学物質の構造異性体である。
「減少すること」、「低減すること」又は「阻害すること」などの用語は、レベルにおいて全体的な減少、好ましくは５％以上、１０％以上、２０％以上、より好ましくは５０％以上、最も好ましくは７５％以上の減少を引き起こす能力に関する。これには、完全な又は本質的に完全な減少、すなわち、ゼロ又は本質的にゼロまでの減少を含む。
「増加すること」、「増強すること」、又は「延長すること」などの用語は、少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも１００％、好ましくは少なくとも２００％、及び特に少なくとも３００％の増加、増強又は延長に関する。これらの用語はまた、ゼロ又は測定不能若しくは検出不能レベルからゼロを超えるレベル又は測定可能若しくは検出可能なレベルまでの増加、増強、又は延長に関し得る。
本明細書で使用される用語「天然に存在する」は、物体が自然界に見出され得るという事実を指す。例えば、生物（ウイルスを含む）中に存在するタンパク質又は核酸は、自然界の供給源から単離され得、実験室でヒトによって意図的に修飾されていないが、天然に存在する。
本発明のｓｓＲＮＡは、同位体標識されていてもよく、すなわち、ｓｓＲＮＡの一又は複数の原子が、同じ数のプロトンを有するが、中性子の数が異なる対応する原子によって置き換えられる。例えば、水素原子は、重水素原子で置き換えられてもよい。本発明のｓｓＲＮＡに用いることができる例示的な同位体には、重水素、１１Ｃ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、１８Ｆ、３２Ｓ、３６Ｃｌ、及び１２５Ｉが含まれる。同位体標識されたｓｓＲＮＡは、インビトロ転写中に対応する同位体標識されたヌクレオチドを使用することにより、又は対応するそのような同位体標識されたヌクレオチドを転写後に付加することによって生成することができる。
一態様では、本発明は、本発明のｓｓＲＮＡ及び一又は複数の薬学的に許容される添加剤を含む薬学的組成物を提供する。一実施態様では、薬学的組成物は、本発明のｓｓＲＮＡ、一又は複数の薬学的に許容される添加剤、及び一又は複数の追加的／補足的な活性化合物を含む。
さらなる態様では、本出願は、治療に使用するための、上記で特定されたｓｓＲＮＡ又は本明細書に特定された薬学的組成物を提供する。
例えば、本発明のｓｓＲＮＡ及び薬学的組成物は、感染症（例えば、ウイルス、細菌、真菌又は他の微生物によって引き起こされる感染症）；望ましくない炎症（例えば、免疫障害）；及び癌からなる群から選択される状態、障害又は疾患の治療（予防的処置を含む）において使用され得る。
したがって、さらなる態様において、本発明は、（ｉ）本明細書で特定される状態、障害又は疾患、特に、感染症（例えば、ウイルス、細菌、真菌又は他の微生物によって引き起こされるもの）；望ましくない炎症；及び癌からなる群から選択される疾患を治療する方法において使用するための本発明のｓｓＲＮＡ（又は任意選択的に薬学的に許容される添加剤と一緒に、このようなｓｓＲＮＡを含む薬学的組成物）；及び（ｉｉ）それを必要とする個体を治療する方法であって、治療有効量の本発明のｓｓＲＮＡ（又は任意選択的に、薬学的に許容される添加剤と一緒に、このようなｓｓＲＮＡを含む薬学的組成物）を個体に投与することを含む、方法を提供する。一実施態様では、個体は、本明細書に開示されている状態、障害若しくは疾患の一又は複数に罹患しているか、又はそれに罹患し易いか、又はそのリスクがある。状態、障害又は疾患は、感染症（例えば、ウイルス、細菌、真菌又は他の微生物によって引き起こされるもの）；望ましくない炎症；及び癌からなる群から選択され得る。さらに、個体は、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。
癌（医学用語：悪性新生物）は、細胞群が、制御不可能な増殖（正常限界を超える分裂）、浸潤（隣接組織の侵入及び破壊）、及び時には転移（リンパや血液を介した生体の他の場所への拡散）を示す疾患のクラスである。癌のこれらの３つの悪性の特性は、自己限定的であり、浸潤又は転移しない良性腫瘍とそれらを区別する。大部分の癌は、腫瘍、すなわち、（新生細胞又は腫瘍細胞と呼ばれる）細胞の異常増殖によって形成される腫脹又は病変を形成するが、白血病のようなものはそうでない。本発明による用語「癌」とは、白血病、セミノーマ、黒色腫、奇形腫、リンパ腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、直腸癌、子宮内膜癌、腎癌、副腎癌、甲状腺癌、血液の癌、皮膚癌、脳の癌、子宮頸癌、腸癌（intestinal cancer）、肝癌、結腸癌、胃癌、腸癌（intestine cancer）、頭頸部癌、胃腸の癌、リンパ節癌、食道癌、結腸直腸癌、膵癌、耳、鼻及び咽喉（ＥＮＴ）癌、乳癌、前立腺癌、子宮の癌、卵巣癌及び肺癌並びにそれらの転移を含む。それらの例は、肺癌腫、乳癌腫、前立腺癌腫、結腸癌腫、腎細胞癌腫、子宮頸癌腫、又は上記した癌型のタイプ若しくは腫瘍の転移である。本発明による癌という用語はまた、癌転移を含む。
本発明のｓｓＲＮＡ及び薬学的組成物で治療可能な癌の例には、悪性黒色腫、すべてのタイプの癌腫（結腸、腎細胞、膀胱、前立腺、非小細胞肺及び小細胞肺癌腫など）、リンパ腫、肉腫、芽細胞腫、神経膠腫などが含まれる。
悪性黒色腫は、深刻なタイプの皮膚癌である。これは、メラノサイトと呼ばれる色素細胞の制御不可能な増殖によるものである。
本発明によれば、「癌腫」は、上皮細胞に由来する悪性腫瘍である。このグループは、最も一般的な癌を表し、乳癌、前立腺癌、肺癌及び結腸癌の一般的な形態が含まれる。
リンパ腫及び白血病は、造血（血液形成）細胞に由来する悪性腫瘍である。
肉腫は、胚性中胚葉から発生する多数の組織のうちの１つの形質転換細胞から生じる癌である。したがって、肉腫には、骨、軟骨、脂肪、筋肉、血管、及び造血組織の腫瘍が含まれる。
芽球性腫瘍又は芽細胞腫は、未熟又は胚組織に類似した腫瘍（通常は悪性）である。これらの腫瘍の多くは、小児において最も一般的である。
神経膠腫は、脳又は脊髄で始まる腫瘍の一種である。それはグリア細胞から生じるため、神経膠腫と呼ばれる。神経膠腫の最も一般的な部位は脳である。
「転移」とは、元の部位から身体の別の部分への癌細胞の伝播を意味する。転移の形成は、非常に複雑なプロセスであり、原発腫瘍からの悪性細胞の剥離、細胞外マトリックスの浸潤、体腔及び血管に入る内皮基底膜の浸透、続いて、血液による輸送後の標的臓器の浸潤に依存する。最後に、標的部位における新たな腫瘍、すなわち、二次腫瘍又は転移腫瘍の増殖は、血管新生に依存する。腫瘍転移は、原発腫瘍の除去後でさえもしばしば起こり、これは、腫瘍細胞又は成分が残存し、転移能を発現するためである。一実施態様では、本発明による用語「転移」は、原発腫瘍及び局所リンパ節系から離れた転移に関する「遠隔転移」に関する。
例示的な免疫障害には、限定されないが、自己免疫疾患（例えば、糖尿病、関節炎（関節リウマチ、若年性関節リウマチ、変形性関節症及び乾癬性関節炎を含む）、多発性硬化症、脳脊髄炎、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、自己免疫性甲状腺炎、皮膚炎（アトピー性皮膚炎及び湿疹性皮膚炎を含む）、乾癬、シェーグレン症候群、クローン病、アフタ性潰瘍、虹彩炎、結膜炎、角結膜炎、潰瘍性大腸炎、喘息、アレルギー性喘息、敗血症及び敗血症性ショック、炎症性腸障害、皮膚性エリテマトーデス、強皮症、膣炎、直腸炎、薬物発疹、らい病好転反応、紅斑性結節性紅斑、自己免疫性ブドウ膜炎、アレルギー性脳脊髄炎、急性壊死性出血性脳症、特発性両側進行性感音難聴、再生不良性貧血、純赤血球貧血、特発性血小板減少症、多発性軟骨炎、ウェゲナー肉芽腫症、慢性活動性肝炎、スティーブンスジョンソン症候群、糸球体腎炎、特発性スプルー、扁平苔癬、グレーブス病、サルコイドーシス、原発性胆汁性肝硬変、後部ブドウ膜炎、及び間質性肺線維症）、移植片対宿主病、移植症例、及びアトピー性アレルギーなどのアレルギーが含まれる。
例示的なウイルスには、限定されないが、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、エプスタイン－バーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（例えば、ＣＭＶ５）、ヒトヘルペスウイルス（ＨＨＶ）（例えば、ＨＨＶ６、７又は８）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ウシヘルペスウイルス（ＢＨＶ）（例えば、ＢＨＶ４）、ウマヘルペスウイルス（ＥＨＶ）（例えば、ＥＨＶ２）、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ）５、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、麻疹ウイルス、パポバウイルス（ＪＣ及びＢＫ）、肝炎ウイルス（例えば、ＨＢＶ又はＨＣＶ）、粘液腫ウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス、ポリオーマウイルス、インフルエンザウイルス、パピローマウイルス及びポックスウイルス、例えば、ワクシニアウイルス、及び伝染性軟属腫ウイルス（ＭＣＶ）、及びリッカウイルスが挙げられる。このようなウイルスは、アポトーシス阻害剤を発現してもよく又は発現しなくてもよい。ウイルス感染によって引き起こされる例示的な疾患には、限定されないが、水痘、サイトメガロウイルス感染、性器ヘルペス、Ｂ型肝炎及びＣ型肝炎、インフルエンザ及び帯状疱疹、並びに狂犬病が含まれる。
例示的な細菌には、限定されないが、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）、エンテロバクター属種（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｅｃｉｅｓ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（例えば、Ｆ．ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７）、Ａ群連鎖球菌（Ｇｒｏｕｐ Ａ ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）、リステリア菌（ｌｉｓｔｅｒｉａ）、ヒト結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、及び表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、並びにボレリア菌（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）及びリケッチア菌（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）が含まれる。細菌感染によって引き起こされる例示的な疾患としては、限定されないが、炭疽、コレラ、ジフテリア、食物疾病、らい病、髄膜炎、消化性潰瘍疾患、肺炎、敗血症、敗血症ショック、梅毒、破傷風、結核、腸チフス、及び尿路感染、並びにライム病及びロッキー山発疹熱が挙げられる。
本発明のｓｓＲＮＡ及び薬学的組成物で治療可能な感染性疾患の特定の例には、ウイルス感染病、例えば、ＡＩＤＳ（ＨＩＶ）、Ａ型肝炎、Ｂ型又はＣ型肝炎、ヘルペス、帯状疱疹（水痘）、ドイツ麻疹（風疹ウイルス）、黄熱病、デング熱；フラビウイルスによって引き起こされる感染症；インフルエンザ；出血性感染症（マールブルグ又はエボラウイルス）；細菌感染病（例えば、レジオネラ病（レジオネラ菌（Ｌｅｇｉｏｎｅｌａ））、胃潰瘍（ヘリコバクター菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、コレラ（ビブリオ菌（Ｖｉｂｒｉｏ））、大腸菌、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃ）、サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）又は連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）による感染症（破傷風）；マラリアなどの原虫病原体よる感染、睡眠病、リーシュマニア症、トキソプラズマ症、すなわち、プラスモディウム菌（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）、トリパノソーマ菌（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ）、リーシュマニア菌（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）及びトキソプラズマ菌（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ）による感染症；又は、例えば、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、ヒストプラスマ・カプシラタム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）、コクシジオイデス・インミティス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ）、ブラストミセス・デルマティティディス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ）若しくはカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）によって引き起こされる真菌感染が含まれる。
本発明のｓｓＲＮＡ及び薬学的組成物は、単独で、又は本発明のｓｓＲＮＡ若しくは薬学的組成物の投与の前に、投与と同時又は投与の後に投与することができる一又は複数の追加的／補足的な活性化合物と併せて用いることができる。このような一又は複数の追加的／補足的な活性化合物には、癌患者のための化学療法薬（例えば、ゲムシタビン、エトポホス、シスプラチン、カルボプラチン）、抗ウイルス剤、抗寄生虫剤、抗細菌剤、免疫療法剤（例えば、抗体又はその断片（特に、その免疫原性断片））、及びアジュバントが含まれ、本発明のｓｓＲＮＡと同時に投与される場合、本発明の薬学的組成物中に存在し得る。
特に、一又は複数の追加的／補足的な活性化合物は、免疫療法剤、好ましくは標的化された、すなわち特異的な免疫反応を誘導するか又は達成する免疫療法剤を含むことができる。したがって、一実施態様では、本発明のｓｓＲＮＡ及び薬学的組成物は、免疫療法剤、好ましくは標的化された、すなわち特異的な免疫反応を誘導するか又は達成する免疫療法剤と併せて用いることができる。このような免疫療法剤には、疾患関連抗原に対して指向される薬剤が含まれ、例えば、治療抗体、又は疾患関連抗原若しくは疾患関連抗原を発現する細胞に対して指向される免疫反応を誘導する薬剤が挙げられる。有用な免疫療法剤には、疾患関連抗原又は疾患関連抗原を発現する細胞に対するＢ細胞応答又はＴ細胞応答を誘導するタンパク質又はペプチドが挙げられる。これらのタンパク質又はペプチドは、疾患関連抗原又は一若しくは複数のそれらの断片の配列に本質的に対応するか又は同一である配列を含み得る。一実施態様では、タンパク質又はペプチドは、疾患関連抗原に由来するＭＨＣ提示ペプチドの配列を含む。タンパク質又はペプチドを投与する代わりに、タンパク質又はペプチドをコードする核酸、好ましくはｍＲＮＡを投与することも可能である。タンパク質又はペプチドをコードするＲＮＡは、本発明のｓｓＲＮＡであり得る。代替的に又は追加的に、タンパク質又はペプチドをコードするＲＮＡは、本発明によらない異なるＲＮＡであり得、このＲＮＡは、本発明の薬学的組成物の投与と同時に（この場合、ＲＮＡは本発明の薬学的組成物の一部を形成し得る）及び／又は投与前に及び／又は投与後に投与され得る。したがって、本発明の薬学的組成物は、遺伝子ワクチン接種に使用され得、免疫応答は、抗原又はその断片をコードする適切な核酸分子（ＤＮＡ又はｍＲＮＡ）を対象に導入することによって刺激される。
一実施態様では、疾患関連抗原は腫瘍関連抗原である。この実施態様では、本発明のｓｓＲＮＡ及び薬学的組成物は、癌又は癌転移の治療に有用であり得る。好ましくは、疾患臓器又は組織は、疾患関連抗原を発現する癌細胞などの疾患細胞によって特徴付けられ、及び／又は疾患関連抗原とそれらの細胞の表面との会合によって特徴付けられる。無傷又は実質的に無傷な腫瘍関連抗原又はその断片、例えば、ＭＨＣクラスＩ及びクラスＩＩペプチド、又は、特にこのような抗原又は断片をコードする核酸、特にｍＲＮＡを用いた免疫化は、ＭＨＣクラスＩ及び／又はクラスＩＩ型応答の誘発を可能にし、したがって、癌細胞及び／又はＣＤ４＋Ｔ細胞を溶解することができるＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球などのＴ細胞を刺激する。このような免疫化はまた、体液性免疫応答（Ｂ細胞応答）を誘発し得、腫瘍関連抗原に対する抗体の産生をもたらす。さらに、樹状細胞（ＤＣ）などの抗原提示細胞（ＡＰＣ）に、直接、又はインビトロで腫瘍抗原又は腫瘍抗原ペプチドをコードする核酸によるトランスフェクションによって、ＭＨＣクラスＩ提示ペプチドをロードし、患者に投与することができる。
本発明によれば、腫瘍関連抗原は、好ましくは、タイプ及び／又は発現レベルに関して、腫瘍又は癌並びに腫瘍細胞又は癌細胞に特徴的である任意の抗原を含む。一実施態様では、用語「腫瘍関連抗原」は、正常な状態下にある、すなわち、限定された数の臓器及び／若しくは組織において、又は特異的な発生段階において特異的に発現される健康な対象におけるタンパク質に関連し、例えば、腫瘍関連抗原は、胃組織、好ましくは胃粘膜、生殖器官、例えば精巣、栄養芽細胞、例えば胎盤、又は生殖系列細胞において特異的に発現される正常な条件下にあり得、一若しくは複数の腫瘍組織又は癌組織において発現若しくは異常に発現される。この文脈において、「限定された数」とは、好ましくは３以下、より好ましくは２又は１以下を意味する。本発明との関連における腫瘍関連抗原には、例えば、分化抗原、好ましくは細胞型特異的分化抗原、すなわち、特定の分化段階で特定の細胞型において特異的に発現する正常な状態下にあるタンパク質、すなわち、癌／精巣抗原、すなわち、精巣及び時には胎盤において特異的に発現する正常な状態下にあるタンパク質、並びに生殖系列特異的抗原が含まれる。本発明との関連において、腫瘍関連抗原は、好ましくは癌細胞の細胞表面に会合しており、好ましくは正常組織では発現しないか又は稀にしか発現しない。好ましくは、腫瘍関連抗原、又は腫瘍関連抗原の異常な発現は、癌細胞を同定する。本発明との関連において、対象、例えば癌疾患に罹患している患者において癌細胞によって発現される腫瘍関連抗原は、好ましくは前記対象の自己タンパク質である。好ましい実施態様では、本発明との関連における腫瘍関連抗原は、非必須である組織若しくは臓器、すなわち、免疫系によって損傷された場合、対象の死に至らない組織若しくは臓器、又は免疫系によって全く若しくはほとんどアクセスできない身体臓器又は構造体において特異的に、正常な状態下で発現される。一実施態様では、腫瘍関連抗原のアミノ酸配列は、正常組織で発現される腫瘍関連抗原と、癌組織で発現される腫瘍関連抗原の間で同一である。好ましくは、腫瘍関連抗原は、それが発現される癌細胞によってＭＨＣ分子において提示される。
腫瘍免疫療法において、特に腫瘍ワクチン接種において、標的構造として本発明により企図される腫瘍関連抗原の基準を理想的に満たす分化抗原の例は、ＣＬＤＮ６及びＣＬＤＮ１８．２などのクローディンファミリーの細胞表面タンパク質である。これらの分化抗原は、種々の起源の腫瘍に発現され、それらの選択的発現（毒性に関連する正常組織において発現しない）及び原形質膜への局在化に起因して、抗体媒介性癌免疫療法に関連する標的構造として特に適している。
本発明において有用であり得る抗原のさらなる例は、ｐ５３、ＡＲＴ－４、ＢＡＧＥ、ベータ－カテニン／ｍ、Ｂｃｒ－ａｂＬ ＣＡＭＥＬ、ＣＡＰ－１、ＣＡＳＰ－８、ＣＤＣ２７／ｍ、ＣＤＫ４／ｍ、ＣＥＡ、ＣＬＡＵＤＩＮ－１２、ｃ－ＭＹＣ、ＣＴ、Ｃｙｐ－Ｂ、ＤＡＭ、ＥＬＦ２Ｍ、ＥＴＶ６－ＡＭＬ１、Ｇ２５０、ＧＡＧＥ、ＧｎＴ－Ｖ、Ｇａｐ１００、ＨＡＧＥ、ＨＥＲ－２／ｎｅｕ、ＨＰＶ－Ｅ７、ＨＰＶ－Ｅ６、ＨＡＳＴ－２、ｈＴＥＲＴ（又はｈＴＲＴ）、ＬＡＧＥ、ＬＤＬＲ／ＦＵＴ、ＭＡＧＥ－Ａ、好ましくはＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ２、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＧＥ－Ａ５、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＭＡＧＥ－Ａ７、ＭＡＧＥ－Ａ８、ＭＡＧＥ－Ａ９、ＭＡＧＥ－Ａ１０、ＭＡＧＥ－Ａ１１、又はＭＡＧＥ－Ａ１２、ＭＡＧＥ－Ｂ、ＭＡＧＥ－Ｃ、ＭＡＲＴ－１／Ｍｅｌａｎ－Ａ、ＭＣ１Ｒ、Ｍｙｏｓｉｎ／ｍ、ＭＵＣ１、ＭＵＭ－１、－２、－３、ＮＡ８８－Ａ、ＮＦ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＮＹ－ＢＲ－１、ｐ１９０マイナーＢＣＲ－ａｂＬ、Ｐｍ１／ＲＡＲａ、ＰＲＡＭＥ、プロテイナーゼ３、ＰＳＡ、ＰＳＭ、ＲＡＧＥ、ＲＵ１又はＲＵ２、ＳＡＧＥ、ＳＡＲＴ－１又はＳＡＲＴ－３、ＳＣＧＢ３Ａ２、ＳＣＰ１、ＳＣＰ２、ＳＣＰ３、ＳＳＸ、ＳＵＲＶＩＶＩＮ、ＴＥＬ／ＡＭＬ１、ＴＰＩ／ｍ、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、ＴＲＰ－２／ＩＮＴ２、ＴＰＴＥ及びＷＴ、好ましくはＷＴ－１である。
「抗原」は、抗体の形成及び／又は細胞性免疫応答の活性化を引き起こし得る任意の構造を意味するものとして理解されるべきである。抗原の例は、ポリペプチド、タンパク質、細胞、細胞抽出物、炭水化物／多糖、多糖複合体、脂質及び糖脂質である。これらの抗原は、腫瘍抗原又はウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原及び原生生物抗原若しくはアレルゲンであり得る。用語「抗原」はまた、形質転換を介してのみ（例えば、分子の中間に、体タンパク質による完成によって）により抗原性及び感作となる二次物質として誘導体化された抗原、原子基（例えば、イソシアネート、ジアゾニウム塩）の人工的組み込みにより、新たな構成的特異性を示す、コンジュゲートされた抗原が含まれる。抗原は、適切な担体に結合されたハプテンの形態で、本発明のワクチン中に存在し得る。適切な担体は、当業者に公知であり、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。ハプテンは、先行技術において周知である方法、例えば、Ｌｙｓ残基に対するアミド結合を介したポリペプチド担体の場合において、担体に結合され得る。
用語「免疫原性」は、特定の物質、特にＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡなどのｓｓＲＮＡ）の、ヒトなどの対象の体内で免疫応答を引き起こす能力を指す。換言すると、免疫原性は、免疫応答を誘導する能力である。
「免疫応答を誘導する」とは、免疫応答を誘導する前に免疫応応答がなかったことを意味し得るが、免疫応答を誘導する前に、あるレベルの免疫応答があり、免疫応答を誘導した後に前記免疫応答が増強することも意味する。したがって、「免疫応答を誘導する」には、「免疫応答を増強する」ことが含まれる。好ましくは、対象において免疫応答を誘導した後、前記対象は、癌若しくは感染性疾患などの疾患を発症することから保護されるか、又は免疫応答を誘導することによって疾患状態が軽快する。
用語「免疫療法」は、好ましくは特異的免疫反応及び／又は免疫エフェクター機能（複数可）を伴う治療に関する。
用語「免疫化」又は「ワクチン接種」は、治療上又は予防上の理由で対象を治療するプロセスを記載する。
「対象」、「患者」、又は「個体」という用語は、脊椎動物に関連する。例えば、本発明との関連における脊椎動物は、哺乳動物、鳥類（例えば、家禽類）、爬虫類、両生類、骨魚類、及び軟骨魚類、特に上記の何れかの飼い馴らされた動物、並びに動物園の動物などの捕獲された動物であり、好ましくは哺乳動物である。本発明との関連における哺乳動物には、限定されないが、ヒト、非ヒト霊長類、飼い馴らされた動物、例えば、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、ヤギ、ブタ、ウマなど、実験哺乳動物、例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモットなど、並びに動物園の哺乳動物などの捕獲された哺乳動物が含まれる。本明細書で使用される用語「対象」には、ヒトも含まれる。
「移入する」、「トランスフェクトする」又は「細胞に導入する」などの用語は、本明細書において互換的に用いられ、核酸、特に外因性又は異種の核酸、特にｓｓＲＮＡを細胞に導入することに関する。本発明によれば、細胞は、臓器、組織及び／又は生物の一部を形成することができる。
本発明の薬学的組成物は、一般的に、「薬学的に許容される量」及び「薬学的に許容される製剤」に適用される。「薬学的に許容される」という用語は、薬学的組成物の活性物質（複数可）の作用と相互作用しない物質の非毒性を指す。
本発明によれば、核酸（例えばｓｓＲＮＡ）の投与は、裸の核酸として、及び／又は一若しくは複数の薬学的に許容される添加剤と組み合わせて達成される。好ましくは、核酸の投与は、裸の核酸の形態である。好ましくは、ＲＮＡは、ＲＮａｓｅ阻害剤などの安定化物質と組み合わせて投与される。本発明はまた、延長された期間の持続的な発現を可能にするための、細胞への核酸の反復導入も想定している。
細胞は、例えば、ｓｓＲＮＡと複合体を形成するか、又はｓｓＲＮＡが封入若しくはカプセル化されたビヒクルを形成することによって、ｓｓＲＮＡが会合することができる任意の添加剤（特に、担体）を用いてトランスフェクトすることができ、裸のｓｓＲＮＡとは比較して、ｓｓＲＮＡの安定性の増加をもたらす。本発明に有用な添加剤（特に、担体）には、例えば、カチオン性脂質、リポソーム、特にカチオン性リポソームなどの脂質含有担体、及びミセル、並びにナノ粒子が含まれる。カチオン性脂質は、負に帯電した核酸と複合体を形成し得る。何れのカチオン性脂質も本発明に従って使用することができる。さらに、細胞は対象から採取され得、細胞はｓｓＲＮＡ又は本発明の薬学的組成物でトランスフェクトされ得、及びトランスフェクトされた細胞を対象に挿入することができる。
好ましくは、ペプチド又はポリペプチドをコードするｓｓＲＮＡの、細胞、特にインビボで存在する細胞への導入は、細胞内で前記ペプチド又はポリペプチドの発現をもたらす。特定の実施態様では、特定の細胞への核酸の標的化が好ましい。このような実施態様では、細胞に核酸を投与するのに適用した担体（例えば、レトロウイルス又はリポソーム）は、標的分子を提示する。例えば、標的細胞上の表面膜タンパク質に特異的な抗体、又は標的細胞上の受容体に対するリガンドなどの分子を核酸担体に組み込んでもよく、それらに結合させてもよい。核酸がリポソームによって投与される場合、エンドサイトーシスに関連する表面膜タンパク質に結合するタンパク質は、標的化及び／又は取り込みを可能にするためにリポソーム製剤に組み込まれ得る。このようなタンパク質は、特定の細胞型に特異的なキャプシドタンパク質又はその断片、内在化されたタンパク質に対する抗体、細胞内の位置を標的化するタンパク質などを包含する。
用語「添加剤」は、本明細書で使用する場合、活性剤ではない（例えば、使用される量／濃度においていかなる治療効果も示さない治療的に不活性な成分である）薬学的組成物中のすべての物質を示すことを意図され、例えば、塩、担体、結合剤、滑沢剤、増粘剤、界面活性剤、分散剤、防腐剤、乳化剤、緩衝剤、湿潤剤、香味剤、着色剤、安定化剤（例えば、ＲＮａｓｅ阻害剤）又は抗酸化剤などを含み、これらのすべては、好ましくは薬学的に許容される。
「薬学的に許容される塩」は、例えば、塩酸、硫酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酢酸、安息香酸、クエン酸、酒石酸、炭酸又はリン酸などの薬学的に許容される酸を用いることによって形成され得る酸付加塩を含む。さらに、適切な薬学的に許容される塩には、アルカリ金属塩（例えば、ナトリウム塩又はカリウム塩）；アルカリ土類金属塩（例えば、カルシウム塩又はマグネシウム塩）；アンモニウム（ＮＨ４ ＋）；及び適切な有機配位子（例えば、ハロゲン化物、水酸化物、カルボン酸塩、硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、アルキルスルホン酸塩及びアリールスルホン酸塩などの対イオンを用いて形成された第４級アンモニウム及びアミンカチオン）で形成された塩が含まれ得る。薬学的に許容される塩の例示的な例としては、限定されないが、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アルギニン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸、重炭酸塩、重硫酸塩、酒石酸水素塩、ホウ酸塩、臭化物、酪酸塩、エデト酸カルシウム、ショウノウ酸塩、ショウノウスルホン酸塩、カンシル酸塩、炭酸塩、塩化物、クエン酸塩、クラブラン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、二塩酸塩、ドデシル硫酸塩、エデト酸塩、エジシル酸塩、エストレート（estolate）、エシル酸塩、エタンスルホン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、ガラクタン酸塩、ガラクツロン酸塩、グルセプト酸塩、グルコヘプトン酸塩、グルタミン酸塩、グリセロリン酸塩、グリコリルアニサニル酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、ヘキシルレゾルシン酸塩、ヒドラバミン、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化水素酸塩、２－ヒドロキシ－エタンスルホン酸塩、ヒドロキシナフトエ酸塩、ヨウ化物、イソ酪酸塩、イソチオン酸塩、乳酸塩、ラクトビオン酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、マンデル酸塩、メシル酸塩、メタンスルホン酸塩、メチル硫酸塩、ムコ酸塩、２－ナフタレンスルホン酸塩、ナプシル酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、Ｎ－メチルグルカミン・アンモニウム塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パモ酸塩（エンボン酸塩）、パルミチン酸塩、パントテン酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３－フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩／二リン酸塩、フタル酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、ポリガラクツロン酸塩、プロピオン酸塩、サリチル酸塩、ステアリン酸塩、硫酸塩、スベリン酸塩、コハク酸塩、タンニン酸塩、酒石酸塩、テオクル酸塩、トシル酸塩、トリエチオダイド、ウンデカン酸塩、吉草酸塩などが含まれる（例えば、S. M. Berge等, "Pharmaceutical Salts", J. Pharm. Sci., 66, p. 1-19 (1977)参照）。薬学的に許容されない塩は、薬学的に許容される塩を調製するために使用することができ、本発明に含まれる。
本発明による組成物は、薬学的に許容される担体を含み得る。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」には、生理学的に適合可能である、あらゆる溶媒、分散媒、コーティング剤、等張剤及び吸収遅延剤などが含まれる。「薬学的に許容される担体」は、固体、半固体、液体、又はそれらの組合せの形態であり得る。
薬学的に許容される担体には、滅菌水溶液又は分散液、滅菌非水性溶液又は分散液、及び滅菌注射溶液又は分散液の即時調製用の滅菌粉末剤が含まれる。薬学的に活性な薬剤のためのこのような媒体及び薬剤の使用は、当該技術分野において公知である。任意の従来の媒体又は薬剤が活性剤と不適合である場合を除いて、本発明の薬学的組成物におけるその使用が企図される。注射可能な製剤のための例示的な薬学的に許容される担体には、水、等張緩衝食塩水（例えば、リンゲル又はリンゲル乳酸塩）、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリアルキレングリコール（例えば、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコール）、水素化ナフタレン、特に、生体適合性のラクチドポリマー（例えば、ラクチド／グリコリドコポリマー又はポリオキシエチレン／ポリオキシ－プロピレンコポリマー）が挙げられる。
薬学的に許容される抗酸化剤の例としては、（１）水溶性抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸、システイン塩酸塩、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなど；（２）油溶性抗酸化剤、例えば、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、アルファ－トコフェロールなど；（３）金属キレート剤、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などが挙げられる。
本発明の薬学的組成物における使用に適した緩衝剤には、塩中の酢酸、塩中のクエン酸、塩中のホウ酸、及び塩中のリン酸が含まれる。
本発明の薬学的組成物における使用に適した防腐剤には、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、パラベン、ソルビン酸、及びチメロサールなどの様々な抗菌剤及び抗真菌剤が含まれる。微生物の存在の防止はまた、滅菌手法（例えば、滅菌濾過、特に滅菌精密濾過）によっても確実にされ得る。
本発明の薬学的組成物は、任意の経路、好ましくは非経口的に個体に投与され得る。本明細書で使用される「非経口投与」及び「非経口的に投与される」という表現は、腸内投与（本明細書で使用される「腸内投与」及び「腸内に投与される」とは、投与された薬物が胃及び／又は腸によって取り込まれることを意味する）以外の投与様式を意味する。非経口投与は、通常、注射及び／又は注入によるものであり、限定されないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、関節包内、骨内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、大脳内、脳室内、くも膜下、脊髄内、硬膜外胸骨内、及び局所の投与が含まれる。
本発明のｓｓＲＮＡ又は薬学的組成物は、当該技術分野において公知である様々な方法によって投与することができる。当業者によって理解されるように、投与の経路及び／又は様式は、所望の結果に依存して変化する。
活性剤（すなわち、本発明のｓｓＲＮＡ及び任意選択的に一又は複数の追加的／補足的な活性化合物）は、インプラント、経皮パッチ、及びマイクロカプセル化された送達システムを含む放出制御製剤など、急速放出に対して化合物を保護する担体とともに調製され得る。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸などの生分解性、生体適合性ポリマーを使用することができる。このような製剤の調製方法は、一般的に、当業者に公知である。例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ及びＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ編、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９７８を参照されたい。
特定の投与経路によって活性剤（すなわち、本発明のｓｓＲＮＡ、及び任意選択的に一又は複数の追加的／補足的な活性化合物）を投与するために、活性剤を、活性剤の不活性化を防止し、及び／又は翻訳されるべき活性剤（特に、本発明のｓｓＲＮＡ）の有効性を増加させる材料でコーティングするか、化合物をその材料と同時投与することが必要である場合がある。例えば、活性剤は、適切な担体、例えば、脂質含有担体（特にカチオン性脂質）、リポソーム（例えば、水中油中水型のＣＧＦエマルジョン、並びに従来のリポソーム（Strejan等、J. Neuroimmunol. 7: 27 (1984)）、特にカチオン性リポソーム）、ミセル、ｓｓＲＮＡが封入され若しくはカプセル化されたナノ粒子剤、又は希釈剤で、個体に投与され得る。薬学的に許容される希釈剤は、生理食塩水及び水性緩衝溶液を含む。
薬学的組成物は、典型的には、製造及び保存の条件下で無菌であり、安定でなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、又は高薬物濃度に適した他の秩序構造として製剤化することができる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物、植物油、例えば、オリーブ油、及び注射可能な有機エステル、例えば、オレイン酸エチルなどを含有する溶媒又は分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材料の使用によって、分散液の場合には必要とされる粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持することができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖、ポリアルコール、例えば、マンニトール、ソルビトール、又は塩化ナトリウムを薬学的組成物に含めることが好ましい。注射可能な組成物の持続的な吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸塩及びゼラチンを組成物中に含めることによってもたらすことができる。
一般的に、分散剤は、塩基性分散媒及び上記に列挙されるものから必要とされる他の成分を含有する滅菌ビヒクル中に活性剤を組み込むことによって調製される。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌粉末剤の場合、好ましい調製方法は、活性剤の粉末に加え任意の追加の所望の成分を予め滅菌濾過したその溶液から得る真空乾燥及び凍結乾燥（freeze-drying）（凍結乾燥（lyophilization））である。
投薬レジメンは、最適な所望の応答（例えば、治療応答）を提供するように調節される。例えば、単一のボーラスを投与することができ、いくつかの分割用量を経時的に投与することができ、又は治療状況の緊急性によって示されるように用量を比例して低減若しくは増加させることができる。投与の容易性及び投薬量の均一性のために、単位剤形の薬学的組成物を製剤化することが特に有利である。本明細書で使用される単位剤形は、治療される個体に単位投薬量として適した物理的に別個の単位を指す；各単位は、必要とされる薬学的な担体に関連して、所望の治療効果を生じるように計算された所定量の活性剤を含有する。本発明の単位剤形の仕様は、（ａ）活性剤の国有の特性及び達成すべき特定の治療効果、及び（ｂ）個体における感受性を治療するためにこのような活性剤を配合する当該技術分野に固有の制限によって決定し、それらに直接依存する。薬学的組成物（例えば、単一剤形）を製造するために担体材料と組み合わせることができる活性剤の量（特に、ｓｓＲＮＡの量）は、治療される個体、及び投与の特定の様式に依存して変化する。単一剤形を製造するために担体材料と組み合わせることができる活性剤の量は、一般的に、治療効果を生じる組成物のその量である。
一般的に、（医薬製剤／組成物の）１００％のうち、活性剤の量（特に、医薬製剤／組成物に存在する場合、任意選択的に一又は複数の追加的／補足的な活性化合物を伴う本発明のｓｓＲＮＡの量）は、約０．０１％－約９９％、好ましくは約０．１％－約７０％、最も好ましくは約１％－約３０％の範囲であり、残部は、好ましくは、一又は複数の薬学的に許容される添加剤から構成される。
単位剤形における、及び／又は個体に投与されるか若しくは治療において使用される場合、活性剤の量、例えば、本発明のｓｓＲＮＡの量は、単位、投与又は治療あたり約０．００１ｍｇ－約１０００ｍｇ（例えば、約０．０１ｍｇ－約５００ｍｇ、約０．１ｍｇ－約１００ｍｇ、例えば、約１ｍｇ－約５０ｍｇ）の範囲であり得る。ある特定の実施態様では、このような活性剤の適切な量は、個体の体重又は体表面積を用いて計算され得、約０．１ｍｇ／ｋｇ－１０ｍｇ／ｋｇの間（例えば、約０．２ｍｇ／ｋｇ－５ｍｇ／ｋｇの間）、又は約０．１ｍｇ／ｍ２－約４００ｍｇ／ｍ２の間（例えば、約０．３ｍｇ／ｍ２－約３５０ｍｇ／ｍ２の間、又は約１ｍｇ／ｍ２－約２００ｍｇ／ｍ２の間）の量が挙げられる。
選択された投与経路にかかわらず、適切な水和形態で使用され得る活性剤（すなわち、ｓｓＲＮＡ及び任意選択的に一又は複数の追加的／補足的な活性化合物）及び／又は本発明の薬学的組成物は、当業者に公知である従来の方法によって薬学的に許容される剤形に製剤化される（例えば、Remington、「The Science and Practice of Pharmacy」Allen、Loyd V., Jr.編、第22版、Pharmaceutical Sciences、September 2012; Ansel等、「Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems」、第7版、Lippincott Williams & Wilkins Publishers、1999参照）。
本発明の薬学的組成物中の活性剤の実際の投薬量レベルは、特定の患者、組成物、及び投与様式について所望の治療応答を達成するのに有効であり、患者に毒性でない量の活性剤を得るように変更することができる。選択された投薬量レベルは、用いられる本発明の特定の組成物の活性、投与経路、投与時間、用いられる特定の活性剤の排出速度、治療期間、用いられる特定の組成物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物及び／又は材料、治療される患者の年齢、性別、体重、状態、全般的な健康状態及び以前の病歴、並びに医学分野で周知の同様の因子などの様々な薬剤動態的因子に依存する。
当業者である医師又は獣医師は、必要とされる薬学的組成物の有効量を容易に決定し、及び処方することができる。例えば、医師又は獣医師は、所望の治療効果を達成するために必要とされるレベルよりも低いレベルで、薬学的組成物において用いられる活性剤の用量で開始し、所望の効果が達成されるまで用量を徐々に増加させることができる。一般的に、本発明の薬学的組成物の適切な１日用量は、治療効果を生じるのに有効な最も低い用量である活性剤の量である。このような有効用量は、一般的に、上記の因子に依存する。好ましくは、投与は、静脈内、筋肉内、腹腔内、又は皮下などの非経口であり、好ましくは標的部位の近くに投与される。投与はまた、腫瘍内でもあり得る。必要に応じて、薬学的組成物の有効１日の用量は、その日を通して適切な間隔で別々に、任意選択的に単位剤形で投与される２回、３回、４回、５回、６回又はそれを超える副用量として投与され得る。本発明の活性剤（特にｓｓＲＮＡ）を単独で投与することは可能であるが、活性剤を医薬製剤／組成物として投与することが好ましい。
一実施態様では、本発明のｓｓＲＮＡ又は薬学的組成物は、毒性の副作用を低減させるために、注入、好ましくは２４時間を超えるなどの長期間にわたるゆっくりとした連続注入によって投与され得る。投与はまた、２－２４時間、例えば２－１２時間にわたる連続注入によって行うこともできる。このようなレジメンは、例えば６カ月又は１２カ月後に、必要に応じて、一又は複数の回数、反復され得る。
本発明の薬学的組成物は、注射によって、例えば、ボーラス注射又は連続注入によって、非経口投与のために製剤化することができる。注射用の製剤は、単位剤形（例えば、小瓶、複数回用量容器）で、防腐剤を加えて提供することができる。本発明の薬学的組成物は、懸濁液剤、液剤、又は油性若しくは水性ビヒクル中のエマルジョン剤などの形態をとることができ、懸濁化剤、安定化剤又は分散剤などの処方剤（formulatory agent）を含有することができる。あるいは、薬剤は、使用前に適切なビヒクル（例えば、滅菌発熱物質不含水）で構成するための粉末形態であり得る。典型的には、静脈内投与用の薬学的組成物は、滅菌等張水性緩衝液の液剤である。必要に応じて、薬学的組成物はまた、注射部位での痛みを和らげるために、可溶化剤及びリグノカインなどの局所麻酔剤を含み得る。一般的に、成分は、例えば、活性剤の量を示すアンプル又はサシェなどの密閉容器中の乾燥凍結乾燥粉末又は水を含まない濃縮物として、単位剤形にいて、別々に又は一緒に混合して供給される。薬学的組成物が注入によって投与されるべきである場合、それは、無菌の医薬品グレードの水又は生理食塩水を含有する注入ボトルで分配することができる。組成物が注射によって投与される場合、注射用の滅菌水又は生理食塩水のアンプルを提供して、投与前に成分を混合することができる。
薬学的組成物は、当該技術分野において公知である医療デバイスとともに投与することができる。例えば、好ましい実施態様では、本発明の薬学的組成物は、ＵＳ５９９１６３；ＵＳ５３８３８５１；５３１２３３５；ＵＳ５０６４４１３；ＵＳ４９４１８８０；ＵＳ４７９０８２４；又はＵＳ４５９６５５６に開示されているデバイスなどの無針皮下注射デバイスで投与することができる。本発明において有用な周知のインプラント及びモジュールの例には、制御された速度で医薬を分配するための移植可能なマイクロ注入ポンプを開示しているＵＳ４４８７６０３；皮膚を介して医薬品を投与するための治療デバイスを開示しているＵＳ４４８６１９４；正確な注入速度で医薬品を送達するための医薬注入ポンプを開示しているＵＳ４４４７２３３；連続的な薬物送達のための可変流量の移植可能な注入装置を開示しているＵＳ４４４７２２４；マルチチャンバ区画を有する浸透圧薬物送達システムを開示しているＵＳ４４３９１９６；浸透圧薬物送達システムを開示しているＵＳ４４７５１９６に記載されているものが含まれる。
多くの他のこのようなインプラント、送達システム、及びモジュールは、当業者に公知である。ある特定の実施態様では、本発明のｓｓＲＮＡ又は薬学的組成物は、インビボでの適切な分布を確実にするように製剤化することができる。例えば、血液脳関門（ＢＢＢ）は、多数の高親水性化合物を排除する。本発明のｓｓＲＮＡ又は薬学的組成物が（所望される場合）ＢＢＢを確実に通過することを確実にするために、それらは、例えば、リポソーム中に製剤化され得る。リポソームを製造する方法について、例えば、ＵＳ４５２２８１１；ＵＳ５３７４５４８；及びＵＳ５３９９３３１を参照されたい。リポソームは、特定の細胞又は臓器に選択的に輸送され、したがって標的薬物送達を増強する一又は複数の部分を含み得る（例えば、V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29: 685参照）。例示的な標的化部分には、葉酸塩又はビオチン（例えば、Ｌｏｗ等のＵＳ５４１６０１６参照）；マンノシド（Umezawa等、(1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153: 1038）；抗体（P.G. Bloeman等 (1995) FEBS Lett. 357: 140; M. Owais等 (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39: 180）；及びサーファクタントプロテインＡ受容体（Briscoe等 (1995) Am. J. Physiol. 1233: 134）が挙げられる。
本発明の一実施態様では、本発明のｓｓＲＮＡは、リポソームに製剤化される。より好ましい実施態様では、リポソームは標的化部分を含む。最も好ましい実施態様では、リポソーム中のｓｓＲＮＡは、ボーラス注射によって、所望の領域に近い部位に送達される。このようなリポソームベースの組成物は、容易な注射可能性が存在する程度に流動性であるべきであり、製造及び保存の条件下で安定であるべきであり、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用に対して保存されるべきである。
治療のための「治療上有効な投薬量」は、完全であっても又は部分的であってもよい客観的な応答によって測定され得る。完全応答（ＣＲ）とは、状態、障害又は疾患の臨床的、放射線学的及び他の証拠がないものとして定義される。部分応答（ＰＲ）は、５０％を超える疾患の低減に起因する。進行までの時間の中央値は、客観的応答の耐久性を特徴付ける尺度である。
治療のための「治療上有効な投薬量」はまた、例えば、当業者に公知である適切な動物モデル系及び／又はインビトロアッセイを使用することによって、状態、障害又は疾患の進行を安定化するその能力によっても測定することができる。治療有効量の活性剤は、所望の反応又は所望の効果を単独で又はさらなる用量と一緒に達成する量を指す。特定の疾患又は特定の状態の治療の場合、所望の反応は、好ましくは、疾患の経過の阻害に関する。これは、疾患の進行を遅延させ、特に、疾患の進行を中断又は好転させることを含む。疾患又は状態の治療における所望の反応は、前記疾患又は前記状態の発症の遅延又は発症の予防であり得る。したがって、治療有効量の活性剤は、個体における、状態、障害若しくは疾患、又は状態、障害若しくは疾患の症状、又は状態、障害若しくは疾患になり易い傾向を治療、治癒、緩和、軽減、変更、是正、軽快、改善又は影響することができる。当業者は、治療すべき疾患、障害若しくは状態、疾患、障害若しくは状態の重症度、治療される個体のパラメータ（年齢、生理学的状態、大きさ及び体重など）、治療期間、付随する治療のタイプ（存在する場合）、特定の投与経路及び類似の因子として、このような因子に基づいてこのような量を決定することができる。したがって、本明細書に記載されている活性剤の用量は、このような様々なパラメータに依存し得る。個体／患者における反応が初期用量では不十分である場合、より高い用量（又は異なる、より局所的な投与経路によって達成される効果的により高い用量）を使用することができる。
本発明の薬学的組成物は、本発明のｓｓＲＮＡ、及び少なくとも１つの抗原、例えば、上記で検討した抗原若しくはその断片（特にその免疫原性断片）、又は前記抗原若しくは断片をコードする核酸、特にＲＮＡを含むワクチン調製物の形態を取り得る。
本発明の薬学的組成物はまた、必要に応じて、活性剤（すなわち、ｓｓＲＮＡ及び任意選択的に一又は複数の追加的／補足的な活性化合物）を含有する一又は複数の単位剤形を含有することができるパック、キット又はディスペンサーデバイスで存在し得る。パックは、例えば、ブリスターパックなどの金属又はプラスチックホイルを含むことができる。パック、キット又はディスペンサーデバイスは、投与のための指示書を添付することができる。
一又は複数の追加的／補足的な活性化合物は、免疫調節剤、例えば、抗ＣＴＬ－Ａ４又は抗ＰＤ１又は抗ＰＤＬ１又は抗制御性Ｔ細胞試薬、例えば、抗ＣＤ２５抗体又はシクロホスファミドを含み得る。
本発明の薬学的組成物は、一又は複数のアジュバントなどの補助的な免疫増強物質と一緒に投与され得、その有効性をさらに増大するために、好ましくは免疫刺激の相乗効果を達成するために、一又は複数の免疫増強物質を含み得る。
用語「アジュバント」は、免疫応答を延長又は増強若しくは促進する化合物を指す。種々のタイプのアジュバントに応じて、様々なメカニズムがこの点において可能である。例えば、ＤＣの成熟を可能にする化合物、例えば、リポ多糖又はＣＤ４０リガンドは、第１のクラスの適切なアジュバントを形成する。一般的に、「危険シグナル」（ＬＰＳ、ＧＰ９６、ｄｓＲＮＡなど）のタイプの免疫系に影響を及ぼす任意の薬剤、又はサイトカイン、例えば、ＧＭ－ＣＳＦは、免疫応答が制御された様式で強化及び／又は影響を受けることを可能にするアジュバントとして使用することができる。ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドはまた、任意選択的に、この文脈において使用することができるが、上記で説明したように、特定の状況下で生じるそれらの副作用を考慮するべきである。しかしながら、一実施態様における本発明のｓｓＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）が免疫刺激物質をコードし、前記ｓｓＲＮＡによってコードされる前記免疫促進物質が第１の免疫刺激剤として作用する場合、比較的少量のＣｐＧ ＤＮＡのみが（ＣｐＧ ＤＮＡのみによる免疫刺激と比較して）必要である。特に好ましいアジュバントは、モノカイン、リンホカイン、インターロイキン又はケモカインなどのサイトカイン、例えば、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－γ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＬＴ－α、又は増殖因子、例えば、ｈＧＨである。また、Ｐａｍ３Ｃｙｓなどのリポペプチドは、本発明の薬学的組成物中のアジュバントとしての使用に適している。
治療は、自宅、診療所、クリニック、病院の外来部門、又は病院で行うことができる。治療は、一般的に、医療監督下で開始されるため、医療従事者は治療の効果を注意深く観察し、必要な任意の調整を行うことができる。治療期間は、患者の年齢及び状態、並びに患者が治療にどのように応答するかに依存する。
状態、障害又は疾患を発症するリスクがより大きいヒトは、状態、障害又は疾患の症状を阻害又は遅延させるための予防的処置を受けることができる。
用語「治療」は、当業者に公知であり、状態、障害若しくは疾患、状態、障害若しくは疾患の症状、又は状態、障害若しくは疾患になり易い傾向を治療、治癒、緩和、軽減、変更、是正、軽快、改善、影響又は予防する目的で（例えば、対象における腫瘍のサイズ若しくは腫瘍の数を低減させることを含む疾患を予防若しくは排除するため；対象における疾患を停止又は遅延させるため；対象における新たな疾患の発症を阻害若しくは遅延させるため；現在疾患を有するか若しくは以前に疾患を有していた対象における症状及び／若しくは再発の頻度又は重症度を減少させるため；及び／又は延長させるため、すなわち、対象の寿命を延ばすために）、状態、障害若しくは疾患、状態、障害若しくは疾患の症状、又は状態、障害若しくは疾患になり易い傾向を有する個体／患者に活性剤（例えば、前記活性剤を含有する薬学的組成物）若しくは手法を適用又は投与すること、あるいはそれを有する対象から単離された細胞、細胞培養物、細胞株、サンプル、組織若しくは臓器に活性剤（例えば、前記活性剤を含有する薬学的組成物）若しくは手法を適用又は投与することを含む。特に、用語「疾患の治療」は、治療すること、持続時間を短縮すること、進行若しくは悪化を軽快させること、予防すること、減速又は抑制すること、あるいは疾患若しくはその症状の予防すること若しくはその発症の遅延することを含む。したがって、用語「治療」は、状態、障害若しくは疾患、又は状態、障害若しくは疾患の症状の予防的処置を含み得る。活性剤は、治療に使用される場合、本発明のｓｓＲＮＡ、並びに本明細書に記載されている一又は複数の追加的／補足的な活性化合物を含み、限定されないが、低分子、ペプチド、ペプチド模倣体、ポリペプチド／タンパク質、抗体、他のポリヌクレオチド、例えば、ＤＮＡ又はｄｓＲＮＡ、細胞、ウイルス、リボザイム、及びアンチセンスオリゴヌクレオチドであり得る他の治療的に活性な化合物が挙げられる。
本発明は、本発明の好ましい実施態様を説明する以下の実施例によって例証され、特許請求の範囲において定義される本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。添付の特許請求の範囲によって包含されていないこれらの実施例は、比較目的のためにのみ与えられている。
省略形
ＥｔＯＨ：エタノール
ｈ：時間（複数可）
ｈＰａ：ヘクトパスカル
ｍｉｎ：分（複数可）
ｍＭ：ミリモル濃度（１０－３ｍｏｌ／ｌ）
ＭＰａ：メガパスカル
ｎｔ：ヌクレオチド（複数可）
ｓｅｃ：秒（複数可）
ｖ／ｖ：体積％
実験手法
ＩＶＴ ＲＮＡのセルロース精製
他に指示がない限り、中程度サイズの繊維（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｃ６２８８）及び１×ＳＴＥ緩衝液（１０ｍＭ ＴＲＩＳ、ｐＨ７．０、５０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＥＤＴＡ）からなるセルロース粉末を精製手法に使用した。すべての実験は、室温で行われた。
「陰性」精製手法
「負の」の精製手法は、１６％ＥｔＯＨを含有する１×ＳＴＥ緩衝液中のＩＶＴ ＲＮＡを伴うセルロースのインキュベーションに基づく。この条件は、ｓｓＲＮＡが可溶性画分に残っている間に、セルロースへのｄｓＲＮＡの選択的結合を可能にする。
セルロースを最初に１６％（ｖ／ｖ）ＥｔＯＨを含有する１×ＳＴＥ緩衝液中に０．２ｇセルロース／ｍｌの濃度で懸濁させ、激しく振盪しながら１０分間インキュベートした。４，０００×ｇで５分間遠心分離した後、セルロースを０．２ｇセルロース／ｍｌ（洗浄セルロース）の濃度で１６％（ｖ／ｖ）ＥｔＯＨを含有する１×ＳＴＥ緩衝液に再懸濁した。
プルダウン実験のために、５００μｌの洗浄セルローススラリーを１．５ｍｌチューブに移し、５分間、１４，０００×ｇで遠心分離した。上清を除去した後、１６％（ｖ／ｖ）ＥｔＯＨを含有する、１００μｌの１×ＳＴＥ緩衝液中の５０μｇのＩＶＴ ＲＮＡをセルロースに添加し、激しく振盪しながら１５分間インキュベートした。５分間、１４，０００×ｇで遠心分離した後、上清を除去し、核酸を沈殿させた。次に、セルロースは、ＥｔＯＨを含有しない１００μｌの１×ＳＴＥ緩衝液と１５分間、激しく振盪しながらインキュベートして、結合した核酸を放出させた。５分間、１４，０００×ｇで遠心分離した後、上清を除去し、溶出した核酸を沈殿させた。
ミクロ遠心分離スピンカラム（ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｆｉｌｔｅｒｓ、Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ、カタログ番号７４０６０６）を用いたセルロース精製のために、６００μｌの予め洗浄したセルローススラリー（０．１２ｇのセルロース）をスピンカラムに移し、６０秒間、１４，０００×ｇで遠心分離した。フロースルーを廃棄し、１６％（ｖ／ｖ）ＥｔＯＨを含有する５００μｌの１×ＳＴＥ緩衝液をスピンカラムに添加し、激しく振盪しながら５分間インキュベートしてセルロースを再懸濁させた。６０秒間、１４，０００×ｇで遠心分離した後、フロースルーを廃棄し、１６％（ｖ／ｖ）ＥｔＯＨを含有する３００－５００μｌの１×ＳＴＥ緩衝液中のＩＶＴ ＲＮＡ（５０－５００μｇ）をスピンカラムに添加し、激しく振盪しながら２０分間インキュベートしてセルロースを再懸濁させた。次に、スピンカラムを６０秒間、１４，０００×ｇで遠心分離し、核酸沈殿のためにフロースルーを回収した。複数のサイクルのセルロース精製を行った場合、フロースルーは、新たに調製されたセルローススピンカラムに直接移され、手法を反復した。最後に、３００－５００μｌの１×ＳＴＥ緩衝液を添加することにより、セルロース結合核酸は、激しく振盪しながら２０分間のインキュベーション中に放出され、スピンカラムを６０秒間、１４，０００×ｇで遠心分離した。
精製プロセスのスケールアップは、１６％（ｖ／ｖ）ＥｔＯＨを含有する１５ｍｌの１×ＳＴＥ緩衝液中の１．５ｇのセルロース及び５ｍｇのＩＶＴ ＲＮＡを用いて、５０ｍｌチューブ中で行われた。ＲＮＡを乾燥セルロースに添加し、磁気撹拌下で３０分間インキュベートした。結合していない核酸は、使い捨ての真空駆動フィルターデバイス（Ｓｔｅｒｉｆｌｉｐ－ＨＶ、０．４５μｍ孔径、ＰＶＤＦ、Ｍｅｒｃｋ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ＧｍｂＨ／Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＳＥ１Ｍ００３Ｍ００）を用いた濾過によって回収された。指示されている場合、濾液は、１．５ｇの新鮮なセルロースを添加し、このプロセスを反復することによって、精製の第２のサイクルのために使用された。最後に、濾液中の核酸は、等量のイソプロパノールを添加することにより沈殿された。
「陽性」精製手法
「陽性」精製手法の原理は、４０％ＥｔＯＨを含有する１×ＳＴＥ緩衝液中でセルロースとともにＩＶＴ ＲＮＡをインキュベートすることにより、最初にすべてのＲＮＡをセルロースに結合させることである。第２の工程では、ｓｓＲＮＡは、これらの条件下でｄｓＲＮＡがセルロース繊維に結合したままである間に、１６％ＥｔＯＨを含有する１×ＳＴＥ緩衝液中でのインキュベーションにより選択的に放出される。
使用前に、セルロースは、０．２ｇセルロース／ｍｌの濃度で４０％（ｖ／ｖ）ＥｔＯＨを含有する１×ＳＴＥ緩衝液に懸濁させ、激しく振盪しながら１０分間インキュベートされた。５分間、４，０００×ｇで遠心分離した後、セルロースは、０．２ｇセルロース／ｍｌ（洗浄セルロース）の濃度で４０％（ｖ／ｖ）ＥｔＯＨを含有する１×ＳＴＥ緩衝液に再懸濁された。
マイクロ遠心分離スピンカラム（ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｆｉｌｔｅｒｓ、Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ、カタログ番号７４０６０６）を用いたセルロース精製のために、６００μｌの洗浄セルローススラリー（０．１２ｇセルロース）をスピンカラムに移し、６０秒間、１４，０００×ｇで遠心分離した。フロースルーを廃棄し、４０％（ｖ／ｖ）ＥｔＯＨを含有する５００μｌの１×ＳＴＥ緩衝液をスピンカラムに添加し、激しく振盪しながら５分間インキュベートしてセルロースを再懸濁した。１４，０００×ｇで６０秒間、遠心分離した後、フロースルーを廃棄し、４０％（ｖ／ｖ）ＥｔＯＨを含有する３００－５００μｌの１×ＳＴＥ緩衝液中のＩＶＴ ＲＮＡ（５０－５００μｇ）をスピンカラムに添加し、激しく振盪しながら、２０分間インキュベートしてセルロースを再懸濁した。次に、スピンカラムを１４，０００×ｇで６０秒間、遠心分離し、核酸沈殿のためにフロースルーを回収した。１６％（ｖ／ｖ）ＥｔＯＨを含有する３００－５００μｌの１×ＳＴＥ緩衝液を添加することによって、ｓｓＲＮＡは、激しく振盪しながら、２０分間のインキュベーション中にセルロースから放出され、スピンカラムを１４，０００×ｇで６０秒間、遠心分離した。複数サイクルのセルロース精製を行った場合、フロースルーは、新たに調製されたセルローススピンカラムに直接移され、手法を反復した。最後に、３００－５００μｌの１×ＳＴＥ緩衝液を添加することによって、セルロース結合核酸は、激しく振盪しながら、２０分間のインキュベーション中に放出され、スピンカラムを１４，０００×ｇで６０秒間、遠心分離した。
セルロースを固定相として使用するＦＰＬＣについて、最初に、４０％（ｖ／ｖ）ＥｔＯＨを含有する１×ＳＴＥ緩衝液中のセルローススラリー（０．２ｇ／ｍｌ）を調製し、３０分間撹拌した。２０ｍｌのこのスラリー（４ｇセルロース）を用いて、ＸＫ１６／２０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号２８－９８８９－３７）を充填した。カラム床の最終高さは約５ｃｍであった。クロマトグラフィーは、ＡＫＴＡ Ａｖａｎｔ ２５システム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用い、ＵＶ（２６０ｎｍ）吸光度をモニターして行われた。結合緩衝液として４０％（ｖ／ｖ）ＥｔＯＨを含有する１×ＳＴＥ緩衝液（緩衝液Ｂ）、及び溶出緩衝液として１×ＳＴＥ緩衝液（緩衝液Ａ）を使用した。カラムを１００％緩衝液Ｂで１５分間、２ｍｌ／分の流速で平衡化した。５００μｇのＲＮＡ（サンプル体積：５００μｌ）の注入後、流速を４０分間、１ｍｌ／分に低減させた。ｓｓＲＮＡを４０％緩衝液Ｂ（１６％（ｖ／ｖ）ＥｔＯＨ）を用いて、４０分間、流速２ｍｌ／分で溶出させた。最後に、緩衝液の組成を０％緩衝液Ｂ（０％ＥｔＯＨ）に変更することにより、ｄｓＲＮＡをカラムから溶出させた。クロマトグラフィーのピークを回収し、さらなる分析のために核酸を沈殿させた。
核酸のイソプロパノール沈殿
セルロース精製から得られたＲＮＡは、０．１容量の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）及び１容量のイソプロパノールを添加することによって沈殿させた。ボルテックス後、サンプルを１時間、－２０℃でインキュベートし、続いて、１０分間、１４，０００×ｇで間遠心分離した。ＲＮＡペレットを２００μｌの氷冷した７０％（ｖ／ｖ）ＥｔＯＨで洗浄し、風乾し、適切な体積のヌクレアーゼ不含Ｈ２Ｏに溶解した。ＲＮＡ濃度は、Ｎａｎｏｄｒｏｐシステム（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）を用いて分光光度的に測定された。
ドットブロット分析
ｄｓＲＮＡ及びＲＮＡ－ＤＮＡハイブリッド混入物の量を決定するために、異なる濃度のＲＮＡサンプルの連続希釈物を調製し、増加した量のＲＮＡ（通常４０ｎｇ、２００ｎｇ及び１，０００ｎｇ）をナイロンブロッティング膜（Ｎｙｔｒａｎ ＳｕＰｅｒＣｈａｒｇｅ（ＳＰＣ）ナイロンブロッティング膜（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号１０４１６２１６））上にスポット（０．５μｌ）した。次に、膜は、５％（ｗ／ｖ）スキムミルク粉末を含有するＴＢＳ－Ｔ緩衝液（２０ｍＭのＴＲＩＳ、ｐＨ７．４、１３７ｍＭのＮａＣｌ、０．１％（ｖ／ｖ）ＴＷＥＥＮ－２０）中で１時間遮断された。ｄｓＲＮＡの検出のために、膜は、１％（ｗ／ｖ）スキムミルク粉末を含有するＴＢＳ－Ｔ緩衝液中、１：１０，０００の比率で希釈したＪ２ ｄｓＲＮＡ特異的マウスｍＡｂ（Ｅｎｇｌｉｓｈ＆Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｎｓｕｌｔｉｎｇ、Ｓｚｉｒａｋ、Ｈｕｎｇａｒｙ）とともに１時間、インキュベートされた。指示されている場合、１：１０，０００の比で希釈したＳ９．６ ＲＮＡ－ＤＮＡハイブリッド特異的マウスｍＡｂ ＩｇＧ２ａ（ＫｅｒａＦＡＳＴ、カタログ番号ＥＮＨ００１）を用いて、ＲＮＡ－ＤＮＡハイブリッド混入物を検出した。ＴＢＳ－Ｔで洗浄した後、膜は、１％（ｗ／ｖ）スキムミルク粉末を含有するＴＢＳ－Ｔ緩衝液中、１：１０，０００の比で希釈された、ＨＲＰをコンジュゲートしたロバ抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号７１５－０３５－１５０）とともに１時間、インキュベートし、ＴＢＳ－Ｔで洗浄し、Ａｍｅｒｓｈａｍ ＥＣＬプライムウェスタンブロッティング検出試薬（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＲＰＮ２２３２）及びＣｈｅｍｉＤｏｃ ＭＰ画像化システム（ＢＩＯ－ＲＡＤ）を用いて発色させた。指示されている場合、ハイブリダイゼーションシグナル強度は、Ｉｍａｇｅ Ｌａｂ ５．１ソフトウェア（ＢＩＯ－ＲＡＤ）を用いたデンシトメトリーによって定量化された。
アガロースゲル電気泳動
精製ＲＮＡの完全性をモニターし、ドットブロットにロードされた量を検証するために、アガロースゲル電気泳動を使用した。ドットブロッティングのために調製した４０ｎｇ／μｌの連続ＲＮＡ希釈液の等量のＲＮＡ（例えば、２μｌ）を分析した。ＲＮＡサンプルは、Ｍａｓｅｋ等（Anal. Biochem. 336 (2005)、46-50）に従って、２μｌのＲＮＡ（８０ｎｇ）を６μｌのホルムアミドと混合し、５分間、６５℃でインキュベートすることによって変性し、その後、０．００５％（ｖ／ｖ）のＧｅｌＲｅｄ（商標）核酸ゲル染色剤（Ｂｉｏｔｉｕｍ Ｉｎｃ．、カタログ番号４１００３）を含有する１．４％（ｗ／ｖ）アガロース上にロードした。電気泳動は、泳動緩衝液としてＴＡＥ（４０ｍＭのＴＲＩＳ酢酸塩、１ｍＭのＥＤＴＡ）を用いて、１００Ｖで２０分間行われ、続いてＧｅｌ Ｄｏｃ（商標）ＥＺ Ｉｍａｇｅｒシステム（ＢＩＯ－ＲＡＤ）を用いてゲルを画像化した。
実施例１－ セルロースを用いたＩＶＴ ＲＮＡからのｄｓＲＮＡのプルダウン
最初にＩＶＴ ＲＮＡからｄｓＲＮＡ混入物を除去するためにセルロースを適用する実施可能性を試験するために、簡単なプルダウン実験を行った。ＩＶＴ反応からの塩化リチウム（ＬｉＣｌ）沈殿によって予備精製された、５０μｇの２，５００ｎｔ長のＮ１－メチル－プソイドウリジン（ｍ１Ψ）修飾されたＩＶＴ ＲＮＡを、１６％（ｖ／ｖ）ＥｔＯＨを含有する１×ＳＴＥ緩衝液の存在下で、０．１ｇのセルロースとともにインキュベートした。遠心分離後、上清中の未結合ＲＮＡを沈殿させた。ＥｔＯＨを含有しない１×ＳＴＥ中のセルロースの再懸濁、遠心分離及び上清の沈殿により、セルロース結合ＲＮＡを回収した。両方の画分からのＲＮＡ並びに出発ＲＮＡ材料のＲＮＡのｄｓＲＮＡ含量を、ｄｓＲＮＡ特異的Ｊ２抗体を用いたドットブロットによって分析した。ＲＮＡの完全性は、アガロースゲル電気泳動によってモニターされた。
ドットブロット分析は、未処理のインプットＩＶＴ ＲＮＡと比較して、セルロースとのインキュベーション後の未結合ＲＮＡ画分中のｄｓＲＮＡ含量が大きく低減することを示している（図１）。これは、１６％（ｖ／ｖ）ＥｔＯＨの存在下でのセルロース材料への混入ｄｓＲＮＡの選択的結合に起因し、これにより、セルロースの沈降によるｓｓＲＮＡからのｄｓＲＮＡの分離が可能になる。分離後、ｄｓＲＮＡ混入物は、ＥｔＯＨを含有しない緩衝液を用いてセルロースから放出させることができる。これは、結合したＲＮＡ画分中のＪ２反応性ＲＮＡの有意な量を実証することによって確認される（図１）。さらに、ＲＮＡの電気泳動は、ＲＮＡ完全性が、このセルロース精製手法中に保存されることを実証する。この実施例は、ＩＶＴ ＲＮＡからｄｓＲＮＡ混入物を除去するセルロースの首尾良い使用を実証する。
実施例２－ セルロースによるＩＶＴ ＲＮＡからのｄｓＲＮＡ除去の効率における様々な濃度のＥｔＯＨの影響
次のステップで、上記の精製方法（実施例１参照）を、ミクロ遠心分離スピンカラムを用いるために、セルロースから未結合ＲＮＡを分離するように適合させた。この技術の利点は、遠心分離によってセルロースから液体、及びしたがって未結合ＲＮＡを完全に除去することである。さらに、最大１８％（ｖ／ｖ）又は２０％（ｖ／ｖ）の、ＩＶＴ ＲＮＡのセルロースとのインキュベーション中のＥｔＯＨ濃度を増加させることがｄｓＲＮＡ除去の効率を増加させるかどうかを試験した。最初に、磁気ビーズによるＩＶＴ反応から予備精製された、５０μｇの１，５００ｎｔ長のシプソイドウリジン（Ψ）修飾及びＤ２キャップされたＩＶＴ ＲＮＡを、０．１ｇのセルロースを有するマイクロ遠心分離スピンカラムにおいて、１６％（ｖ／ｖ）、１８％（ｖ／ｖ）又は２０％（ｖ／ｖ）のＥｔＯＨを含有する１×ＳＴＥ緩衝液の存在下でインキュベートした。遠心分離後、カラムの遠心分離によって未結合ＲＮＡを回収し、沈殿させた。セルロース結合ＲＮＡは、ＥｔＯＨを含有しない１×ＳＴＥをカラムに添加し、激しく振盪してセルロースを再懸濁し、最後に遠心分離及び沈殿させることにより回収された。両方の画分並びに出発ＲＮＡ材料からのＲＮＡのｄｓＲＮＡ含量を、ｄｓＲＮＡ特異的Ｊ２抗体を用いたドットブロットによって分析した。第２の膜には、同量の異なるＲＮＡ画分をロードし、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド特異的Ｓ９．６抗体とハイブリダイズさせて、これらのＩＶＴ ＲＮＡ混入物がまたセルロース精製によって除去され得るかどうかを試験した。
未精製ＩＶＴ ＲＮＡと比較すると、すべての未結合ＲＮＡ画分（フロースルー）中のｄｓＲＮＡ含量は、セルロースとのインキュベーション後に大きく低減する（図２）。しかしながら、これらの画分中のＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドの量はほんのわずかに減少し、これは、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドが、試験された条件下でセルロースに効率的に結合せず、したがってセルロースを用いてＩＶＴ ＲＮＡから除去することができないことを実証している。ＥｔＯＨ濃度を１６％（ｖ／ｖ）－１８％（ｖ／ｖ）又は２０％（ｖ／ｖ）に増加させることは、ｄｓＲＮＡ除去の効率を有意に増大させない。結合ＲＮＡ画分中のＪ２反応性ＲＮＡの高量は、ｄｓＲＮＡの濃縮を示し（図２）、これは、この方法によるｄｓＲＮＡ混入物とｓｓＲＮＡの分離を確実にする。さらに、この結果は、マイクロ遠心分離スピンカラムフォーマットに対する「陰性」セルロース精製手法の成功した適合を示す。
実施例３－ ＲＮａｓｅＩＩＩ処理及びＨＰＬＣ精製に対するセルロース精製の比較
マイクロ遠心分離スピンカラムを用いた上記の方法（実施例２参照）によるセルロース精製の複数回のサイクルが、ｄｓＲＮＡ除去の効率を高めるかどうかを試験するために、ＩＶＴ反応からの塩化リチウム（ＬｉＣｌ）沈殿によって予備精製された、１００μｇの２，５００ｎｔ長のｍ１Ψ修飾されたＩＶＴ ＲＮＡは、１６％（ｖ／ｖ）ＥｔＯＨを含有する１×ＳＴＥ緩衝液を用いて上記のように１×、２×又は３×で精製された。さらに、セルロースによって精製されたＲＮＡは、大腸菌ＲＮａｓｅＩＩＩ（０．２Ｕ／１００μｇのＲＮＡ）で３０分間、３７℃で処理されたか、またＷｅｉｓｓｍａｎ等（上記）によって記載されたプロトコールに従ってＨＰＬＣで精製されたＩＶＴ ＲＮＡと比較された。すべてのＲＮＡのｄｓＲＮＡ含量は、ｄｓＲＮＡ特異的Ｊ２抗体を用いたドットブロットにより分析され、ハイブリダイゼーションシグナルの密度分析によって定量化された。ＲＮＡ完全性は、アガロースゲル電気泳動によってモニターされた。
セルロース精製サイクルの回数の増加は、ＩＶＴ ＲＮＡから除去されたｄｓＲＮＡの量を増加させる（図３）。１サイクルの精製は約９０％のｄｓＲＮＡ混入物を除去するが、この量は、それぞれ２回及び３回の精製サイクルを実施した場合、９５％及び９７％まで増加する。興味深いことに、セルロース精製の１サイクルは、ＲＮａｓｅＩＩＩを用いたＩＶＴ ＲＮＡの処理とほぼ同量のｄｓＲＮＡを排除する。さらに、３サイクルのセルロース精製を行うことは、ＨＰＬＣ精製の効率に非常に近くなる。したがって、セルロース精製の効率は、ＲＮａｓｅＩＩＩ処理とＨＰＬＣ精製との間の範囲である。
実施例４－ ＩＶＴ ＲＮＡからｄｓＲＮＡを除去する際の様々なブランドのセルロースの性能の比較
ｄｓＲＮＡ混入物の除去が、上記の実験（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｃ６２８８）において使用した特定のセルロースブランドに限定されるのかどうか、又は他の供給業者からのセルロースもまた使用することができるかどうかを試験するために、本発明者等は、Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌからの２つの他のセルロースタイプ（ＭＮ １００、ＭＮ ２１００）の性能を試験した。最初に、ＩＶＴ反応から塩化リチウム（ＬｉＣｌ）沈殿によって予備精製された、１００μｇの１，５００ｎｔ長のｍ１Ψ修飾されたＩＶＴ ＲＮＡは、マイクロ遠心分離スピンカラム中で、１６％（ｖ／ｖ）ＥｔＯＨを含有する１×ＳＴＥ緩衝液の存在下で、０．１５ｇの異なるタイプのセルロースとともにインキュベートされた。遠心分離後、未結合ＲＮＡは、カラムを遠心分離し、フロースルー中のＲＮＡを沈殿させることによって回収された。セルロース結合ＲＮＡは、カラムに１×ＳＴＥを添加し、続いて、激しく振盪してセルロースを再懸濁し、最後に遠心分離及び沈殿によって回収された。すべてのＲＮＡサンプルのｄｓＲＮＡ含量は、ｄｓＲＮＡ特異的Ｊ２抗体を用いたドットブロットにより分析され、ハイブリダイゼーションシグナルの密度分析によって定量化された。ＲＮＡ完全性は、アガロースゲル電気泳動によってモニターされた。
精製に使用されたセルロースとは無関係に、すべての未結合ＲＮＡ画分中のｄｓＲＮＡ含量は、未精製のインプットＲＮＡと比較して大幅に低減する（図４）。結合ＲＮＡ画分中のＪ２反応性ＲＮＡの量が多いことは、試験したすべてのセルロースタイプによるｄｓＲＮＡ混入物及びｓｓＲＮＡの分離を確認するｄｓＲＮＡの濃縮を示す。
実施例５－ セルロース精製法の拡張性
重要な点は、セルロース精製法が拡張性であるかどうかを試験することであった。したがって、実験は、磁気ビーズによるＩＶＴ反応により予備精製された、５ｍｇの１，９００ｎｔ長のＤ１キャップされたＩＶＴ ＲＮＡからｄｓＲＮＡ混入物を除去するために実施された。ＲＮＡは、１６％（ｖ／ｖ）ＥｔＯＨを含有する１５ｍｌの１×ＳＴＥ緩衝液中の１．５ｇのセルロース（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｃ６２８８）とともにインキュベートされた。未結合ＲＮＡは、真空駆動フィルターデバイス（孔径０．４５μＭ）によってセルロースから分離され、沈殿された。別の５ｍｇの同じＲＮＡを用いて、２精製サイクルを実施した。両方の精製ＲＮＡのｄｓＲＮＡ含量は、ｄｓＲＮＡ特異的Ｊ２抗体を用いたドットブロットにより分析され、ハイブリダイゼーションシグナルの強度の密度分析により定量化された。ＲＮＡ完全性は、アガロースゲル電気泳動によってモニターされた。
ドットブロット分析の結果は、１．５ｇのセルロースによる１サイクルの精製の後、ｄｓＲＮＡ混入物の７２％が５ｍｇのＩＶＴ ＲＮＡから除去されることを示す。精製効率は、１．５ｇの新鮮なセルロースを用いた第２の精製サイクルによって８３％までさらに増加させることができる。予期されるように、ＲＮＡ回収率は、１サイクルの精製後の６７％から２サイクル後の５３％に減少し、これは、なおも許容することができ、Ｗｅｉｓｍａｎｎ等（上記）によって記載されるＨＰＬＣ精製プロトコールによって達成される約５０％の回収率に匹敵する。この結果は、本発明のセルロース精製法が、１回の単一バッチ精製で数ｍｇのＩＶＴ ＲＮＡからｄｓＲＮＡ混入物を除去するためにスケールアップすることができることを明確に実証している。
実施例６－ 「陽性」精製手法を用いた様々な長さのＩＶＴ ＲＮＡの精製
次のステップで、ＥｔＯＨ濃度を１６％（ｖ／ｖ）に減少させることによってｓｓＲＮＡ画分を選択的に放出する前に、高ＥｔＯＨ濃度の存在下でＩＶＴ ＲＮＡ調製物の全ＲＮＡ成分をセルロースに最初に結合させることが実施可能かどうかを試験した。この条件下で、ｄｓＲＮＡ混入物はセルロース材料に結合したままであり、したがってｓｓＲＮＡから分離されるべきである（「陽性」精製）。この手法は、ＥｔＯＨの存在下でセルロースに結合しない非核酸混入物（例えば、タンパク質、遊離ヌクレオチド）の除去も可能にするため、「陰性」精製と比較して有利である。したがって、様々な長さ（１，３００ｎｔ、２，５００ｎｔ及び＞１０，０００ｎｔ）及びキャップ構造（Ｄ１、Ｄ２、キャップなし）を有する、４００μｇの３つのＩＶＴ ＲＮＡは、４０％（ｖ／ｖ）ＥｔＯＨを含有する１×ＳＴＥ緩衝液を用いて、マイクロ遠心分離スピンカラム中の０．１２ｇのセルロースに完全に結合させる実験を行った。ｓｓＲＮＡは、１６％（ｖ／ｖ）ＥｔＯＨを含有する１×ＳＴＥ緩衝液で溶出され、１．２ｍｇの新鮮なセルロースを含有する第２のスピンカラムに移された。激しく振盪しながらインキュベーション及び遠心分離後、フロースルー中のＲＮＡを沈殿させ、ｄｓＲＮＡ特異的Ｊ２抗体を用いたドットブロッティングによりｄｓＲＮＡ混入物を分析した。ＲＮＡ完全性は、アガロースゲル電気泳動によってモニターされた。
ＲＮＡの長さとは無関係に、すべてのＩＶＴ ＲＮＡのｄｓＲＮＡ含量は、セルロース精製後、ほとんど検出できないレベルまで有意に低減し（図６）、これは、上記の「陽性」精製手法の実施可能性を実証する。予想外に、＞１０，０００ｎｔ長のＩＶＴ ＲＮＡはまた、ｄｓＲＮＡ混入物から首尾良く精製され得た（図６Ａ）。これは、精製がより短いＲＮＡ（１，３００－２，５００ｎｔなど）に限定されず、ＲＮＡの長さが精製の成功に対する制限因子ではないことを示唆している。しかしながら、１，３００ｎｔと２，５００ｎｔ長のＲＮＡ（４５－５５％回収率）の両方の回収率と比較して、長いＩＶＴ ＲＮＡの回収率はより低い（３５％回収率）。＞１０，０００ｎｔ長のＩＶＴ ＲＮＡの完全性は、両方のより短いＩＶＴ ＲＮＡの完全性よりも低いが、本発明によるセルロース精製法によって負に影響されない。これらの実験に使用されたＲＮＡは、様々な５’キャップ構造（１０，０００ｎｔ：Ｄ１キャップ、１，３００ｎｔ：Ｄ２キャップ、２，５００ｎｔ：キャップなし）を有するため、本実施例は、この構造的特徴が、セルロースによるＩＶＴ ＲＮＡの精製の成功にとって重要な因子ではないことを実証する。
実施例７－ 様々なイオン強度を有する緩衝液を用いたＩＶＴ ＲＮＡの精製
二本鎖核酸の安定性は、環境のイオン強度によって影響される。高塩濃度は二本鎖構造の形成を促進するが、一本鎖核酸へのそれらの解離は低塩濃度下で増強される。セルロースによるｄｓＲＮＡ除去効率における緩衝液のイオン強度の影響を分析するために、ＩＶＴ反応から塩化リチウム（ＬｉＣｌ）沈殿によって予備精製された、１，３００ｎｔ長のｍ１Ψ修飾されたＩＶＴ ＲＮＡは、１．５ｍｌチューブにおいて、４０％（ｖ／ｖ）ＥｔＯＨ及び様々な濃度のＮａＣｌ（０－１５０ｍＭ）を含有する５００μｌの１×ＳＴＥ緩衝液中の０．１ｇのセルロースとともにインキュベートされた。遠心分離後、上清を除去し、セルロースを１６％（ｖ／ｖ）ＥｔＯＨを含有する、５００μｌの対応する１×ＳＴＥ緩衝液に再懸濁して、ｓｓＲＮＡを放出させた。遠心分離後、上清を集め、ＲＮＡを沈殿により回収した。最終工程で、セルロースは、ＥｔＯＨを含有しない、５００μｌの対応する１×ＳＴＥ緩衝液に再懸濁し、遠心分離し、上清の沈殿によってＲＮＡを回収した。両方の画分（１６％ＥｔＯＨ溶出液、０％ＥｔＯＨ溶出液）からのＲＮＡ、並びに出発ＲＮＡ材料（ＩＶＴ ＲＮＡ）からのＲＮＡのｄｓＲＮＡ含量は、ｄｓＲＮＡ特異的Ｊ２抗体を用いたドットブロットにより分析され、ハイブリダイゼーションシグナルの密度分析によって定量化された。ＲＮＡの完全性は、アガロースゲル電気泳動によってモニターされた。
セルロースによるｄｓＲＮＡ除去効率は、ＳＴＥ緩衝液中のＮａＣｌ濃度によって影響される。２５ｍＭ又は５０ｍＭのＮａＣｌの存在下で、９４％－９８％のｄｓＲＮＡ混入物が、１６％ＥｔＯＨ溶出液から除去される（図７Ａ、Ｂ）。ＮａＣｌ濃度を７５ｍＭまで増加させるか（図７Ａ）又は１０ｍＭまでそれを減少させること（図７Ｂ）は、精製効率を低減させる。１２５ｍＭを超えるＮａＣｌ濃度は、精製効率の有意な低下をもたらす（図７Ａ）。この結果は、使用されるＳＴＥ緩衝液のＮａＣｌ濃度が、２５－５０ｍＭのＮａＣｌの範囲で最も高い精製効率に影響し得ることを実証する。Ｊ２抗体を用いた、１５０ｍＭ ＮａＣｌサンプル（図７Ａ）以外の０％ＥｔＯＨ溶出液すべての強い反応性は、これらのサンプル中のｄｓＲＮＡ混入物の濃縮を反映する。
実施例８－ ＦＰＬＣによるＩＶＴ ＲＮＡのセルロース精製
「陽性」精製手法を用いたセルロースによるｄｓＲＮＡ混入物からのｓｓＲＮＡの分離は実現可能であるため（実施例６及び７参照）、ＦＰＬＣの精製プロトコールを適合させる試みがなされた。４ｇのセルロースは、ＸＫ１６／２０カラムを充填するために、固定相として使用された。４０％（ｖ／ｖ）ＥｔＯＨを含有する１×ＳＴＥ緩衝液で平衡化した後、ＩＶＴ反応から塩化リチウム（ＬｉＣｌ）沈殿によって予備精製された、５００μｇの１，３００ｎｔ長のｍ１Ψ修飾されたＩＶＴ ＲＮＡをカラムにロードした。結合ｓｓＲＮＡ及びｄｓＲＮＡは、緩衝液のＥｔＯＨ濃度をそれぞれ１６％（ｖ／ｖ）及び０％（ｖ／ｖ）に低減させることによって溶出され、画分を回収した。ＲＮＡを沈殿によって回収し、両画分（Ｆ１：１６％ＥｔＯＨ溶出液、Ｆ２：０％ＥｔＯＨ溶出液）からのＲＮＡ、並びに出発ＲＮＡ材料（インプットＲＮＡ）からのＲＮＡのｄｓＲＮＡ含量をｄｓＲＮＡ特異的Ｊ２抗体を用いたドットブロットによって分析された。ＲＮＡの完全性は、アガロースゲル電気泳動によってモニターされた。
クロマトグラムの溶出プロファイル（２６０ｎｍでの吸光度）は、高い割合のロードしたＩＶＴ ＲＮＡが、４０％（ｖ／ｖ）ＥｔＯＨの存在下で、セルロース材料に結合することを示す。わずかな量のＲＮＡだけが未結合のままであり、これらの条件下でカラムから結合せずに溶出される（図８Ａ）。ＥｔＯＨ濃度を１６％（ｖ／ｖ）まで低下させると、ＲＮＡの大部分がＵＶ吸光度の鋭い単一ピークで示されるように溶出する。このピークは回収され（画分Ｆ１）、精製されたｓｓＲＮＡを含有する。未精製のインプットＲＮＡと比較して、約８８％のｄｓＲＮＡ含量がこの画分から除去された（図８Ｂ）。緩衝液のＥｔＯＨ濃度をさらに０％（ｖ／ｖ）に低減させた後、少量のＲＮＡだけがカラムから溶出する（画分Ｆ２）。ドットブロット分析は、ｄｓＲＮＡがこのＲＮＡ画分に濃縮されていることを明らかにした（図８Ｂ）。これは、ｄｓＲＮＡからのｓｓＲＮＡの分離を確認し、ｄｓＲＮＡ混入物を除去するためのＩＶＴ ＲＮＡのＦＰＬＣ精製用の固定相としてのセルロースの首尾良い使用を実証する。
実施例９－ ｓｓＲＮＡ溶出のための様々なＥｔＯＨ濃度を用いたＩＶＴ ＲＮＡの精製
「陽性」セルロース精製手法のプロトコールを最適化するために、ｄｓＲＮＡ除去及びＲＮＡ回収の効率における様々なＥｔＯＨ濃度の影響を試験した。磁気ビーズによるＩＶＴ反応から予備精製された、２００μｇの１，５００ｎｔ長のＤ１キャップされたＩＶＴ ＲＮＡは、マイクロ遠心分離スピンカラムにおいて、４０％（ｖ／ｖ）ＥｔＯＨを含有する５００μｌの１×ＳＴＥ緩衝液中の０．１ｇの洗浄セルロースとともにインキュベートされた。セルロース結合ｓｓＲＮＡは、６、１０、１２、１４、１６、１８、２０又は２４％（ｖ／ｖ）のＥｔＯＨを含有する１×ＳＴＥ緩衝液で溶出され、沈殿により溶出液から回収された。様々な溶出液から得られたＲＮＡ並びに出発ＲＮＡ材料（インプットＲＮＡ）のＲＮＡのｄｓＲＮＡ含量は、ｄｓＲＮＡ特異的Ｊ２抗体を用いたドットブロットにより分析され、ハイブリダイゼーションシグナルの密度分析によって定量化された。ＲＮＡの完全性は、アガロースゲル電気泳動によって確認された。
「陽性」精製手法中にｓｓＲＮＡの溶出のためのＥｔＯＨ濃度の最適範囲は１４－１６％（ｖ／ｖ）である（図９Ａ、Ｂ）。これらのＥｔＯＨ濃度では、ｄｓＲＮＡの８３－８４％がセルロースに結合したままであり、ｓｓＲＮＡの５８－６４％が対応する溶出液から回収される。ＥｔＯＨを１８％（ｖ／ｖ）又は２０％（ｖ／ｖ）に増加させると、ｄｓＲＮＡ除去効率（それぞれ８５％又は９０％）がさらに改善されるが、ＲＮＡ回収率は有意に低減する（それぞれ４７％又は３６％）。対照的に、ＥｔＯＨ濃度を１２％（ｖ／ｖ）に減少させると、ＲＮＡ回収を有意に改善させることなく、精製効率が悪化する（除去されたｄｓＲＮＡの６３％）。この結果は、ｄｓＲＮＡ除去効率及び溶出液からのＲＮＡ回収率が逆相関することを実証している。さらに、ｄｓＲＮＡ混入物に対するｓｓＲＮＡの相対純度は、溶出に使用されるＥｔＯＨ濃度によって制御することができる。しかしながら、より高いＥｔＯＨ濃度は、ｓｓＲＮＡ回収の低減という代償を払って、ｄｓＲＮＡのより効率的な除去をもたらす。したがって、ｓｓＲＮＡの溶出のためのＥｔＯＨ濃度を調整することにより、ｄｓＲＮＡ混入物／ＲＮＡ回収率は、様々な用途のＩＶＴ ＲＮＡの純度／コスト要件を満たすように調整することができる。
実施例１０－ セルロースのＲＮＡ結合能力の測定
「陽性」セルロース精製手法をスケールアップするためには、過剰にロードすることによって引き起こされるＲＮＡ喪失を最小にする、セルロースのＲＮＡ結合能を知ることが重要である。ＲＮＡ結合能を決定するために、本発明者等は、マイクロ遠心分離スピンカラムにおいて４０％（ｖ／ｖ）ＥｔＯＨを含有する５００μｌの１×ＳＴＥ緩衝液中で、磁気ビーズによってＩＶＴ反応から予備精製された、２５μｇ、５０μｇ、１００μｇ、２５０μｇ、５００μｇ、７５０μｇ、１，０００μｇ又は１，５００μｇの１，５００ｎｔ長のＤ１キャップされたＩＶＴ ＲＮＡとともに固定量の洗浄セルロース（１００ｍｇ、Ｓｉｇｍａ、Ｃ６２８８）をインキュベートした。遠心分離後、ｓｓＲＮＡは、１６％（ｖ／ｖ）のＥｔＯＨを含有する５００μｌの１×ＳＴＥ緩衝液で溶出された。最後に、なおもセルロースに結合したＲＮＡをＨ２Ｏ（０％（ｖ／ｖ）ＥｔＯＨ）とのインキュベーションによって放出させた。フロースルー（４０％（ｖ／ｖ）ＥｔＯＨ）中、及び１６％（ｖ／ｖ）と０％（ｖ／ｖ）の両溶出液中のＲＮＡを沈殿により回収し、回収されたＲＮＡの量を分光光度法で決定した。さらに、１６％（ｖ／ｖ）ＥｔＯＨ溶出液並びに出発ＲＮＡ材料（インプットＲＮＡ）から得られたＲＮＡのｄｓＲＮＡ含量は、ｄｓＲＮＡ特異的Ｊ２抗体を用いたドットブロットにより分析され、個々のサンプル中におけるｄｓＲＮＡ除去効率をモニターした。これらのＲＮＡの完全性は、アガロースゲル電気泳動によってモニターされた。
試験したセルロース（Ｓｉｇｍａ、Ｃ６２８８）の最大ＲＮＡ結合能は、１ｇのセルロースあたり１－２．５ｍｇのＲＮＡに対応する、１００ｍｇのセルロースあたり１００μｇから２５０μｇの間の範囲である。これは、未結合ＲＮＡ画分を表す、４０％（ｖ／ｖ）ＥｔＯＨのフロースルーから回収されたＲＮＡ回収率（図１０Ａ）及びＲＮＡ収量（図１０Ｂ）が、２５０μｇ以上のＲＮＡを１００ｍｇのセルロースによる精製のために使用する場合に、着実に増加するという事実によって反映される。しかしながら、１６％（ｖ／ｖ）ＥｔＯＨ及び０％（ｖ／ｖ）ＥｔＯＨ溶出液中の結合ＲＮＡの量は、２５０μｇ以上ＲＮＡを精製のために使用する場合、それに応じて増加せず、これは、結果的に両方の画分からのＲＮＡ回収率の減少をもたらす（図１０Ａ、Ｂ）。１６％（ｖ／ｖ）ＥｔＯＨ溶出液からの最大ＲＮＡ回収率は、１００μｇのＲＮＡが１００ｍｇのセルロースを用いた精製のために使用される場合に達成される（６８％のＲＮＡ回収）。さらに、ＲＮＡ：セルロースのこの比で、８８％のｄｓＲＮＡ除去の最高の浄化効率が達成される（図１０Ｃ、Ｄ）。興味深いことに、ＩＶＴ ＲＮＡから除去されたｄｓＲＮＡの相対量は、セルロースの結合ＲＮＡ能を超えた場合、有意に減少しない。
実施例１１－ ＩＶＴ ＲＮＡのセルロース精製がその翻訳能力及び免疫原性に及ぼす影響
上記のように、ＩＶＴ ＲＮＡは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼの異常な活性に起因するｄｓＲＮＡ混入物を含有する。しかしながら、ｄｓＲＮＡは、ＲＩＧ－１、ＭＤＡ５及びＴＬＲ３を含む異なる細胞センサーを活性化させることによって炎症性サイトカイン（インターフェロンなど）を誘導し、さらに、プロテインキナーゼＲ（ＰＫＲ）及びオリゴアデニレートシンテターゼ（ＯＡＳ）を活性化することによって翻訳を直接に阻害する。本発明の方法に供されたＩＶＴ ＲＮＡがより少ない炎症性サイトカインを誘導するかどうか、及び／又は本発明の方法に供されていないＩＶＴ ＲＮＡと比較してより効率的に翻訳され得るかどうかを試験するために、マウスエリスロポエチン（ＥＰＯ）をコードするＩＶＴ ＲＮＡは、未精製のままとしたか、又はセルロース材料（０．１２ｇセルロース（Ｓｉｇｍａ、Ｃ６２８８））でそれぞれ充填された２つのスピンカラムを使用する２工程手法によって精製した。最初に、ＩＶＴ ＲＮＡは、第１のスピンカラムを用いて（すなわち、ｄｓＲＮＡ及びｓｓＲＡＮをセルロース材料に結合させるために、ＩＶＴ ＲＮＡを第１のスピンカラムにおいて、４０％（ｖ／ｖ）を含有する１×ＳＴＥ緩衝液の存在下でセルロース材料とともにインキュベートし；第１のスピンカラムに遠心力を適用し；フロースルーを廃棄し；１６％（ｖ／ｖ）ＥｔＯＨを含有する１×ＳＴＥ緩衝液を添加し、第１スピンカラムに遠心力を適用することによって、第１のスピンカラムからｓｓＲＮＡを溶出して）、上記される陽性精製手法に供された。次に、このようにして得られたｓｓＲＮＡを含有する溶出液は、第２のスピンカラムを用いて（すなわち、第２のスピンカラムにおいてｓｓＲＮＡを含有する溶出液をセルロース材料とともにインキュベートし；第２のスピンカラムに遠心力を適用し；フロースルーを回収して）、上記される陰性精製手法に供された。次に、第２のスピンカラムから得られたフロースルーは、イソプロパノール／酢酸ナトリウムを用いて沈殿させ、Ｈ２Ｏに再溶解させた。ＴｒａｎｓＩＴ（Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ）を用いて処方後、ＩＶＴ ＲＮＡは、３μｇのＲＮＡ／動物の用量でマウス（ｎ＝４）に腹腔内注射された。血液を注射後の２、６、及び２４時間に採取し、血漿サンプルを回収した。コントロールマウスは、ＴｒａｎｓＩＴのみを注射された。マウスインターフェロンアルファ（ＩＦＮ－α）及びマウスＥＰＯのレベルは、特異的ＥＬＩＳＡアッセイ（マウスインターフェロンアルファ特異的ＥＬＩＳＡ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、マウスＥＰＯ特異的ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡ発色キット（Ｒ＆Ｄ））を用いて、測定された。
図１１Ａに示すように、本発明の方法に供されたＩＶＴ ＲＮＡは、未精製ＩＶＴ ＲＮＡと比較して、有意に少ないＩＦＮ－αを誘導した。したがって、この実施例は、本発明の方法が、ＩＶＴ ＲＮＡから混入している二本鎖分子を効率的に除去することを実証する。おそらく、セルロース精製されたＩＶＴ ＲＮＡによって誘導された残留ＩＦＮ－αは、ウリジンを含有するｓｓＲＮＡによるＴＬＲ７の活性化によるものであった。
さらに、図１１Ｂは、ＥＰＯをコードするＩＶＴ ＲＮＡ調製物が、本発明の方法に供され、したがって、タンパク質合成阻害ｄｓＲＮＡを欠損し、非常に効率的に翻訳され、本発明に従って精製されたＩＶＴ ＲＮＡの投与から２４時間でさえ、血漿中で高いＥＰＯレベルを生じることを示す。対照的に、本発明の方法に供されていないが、未精製のままである、ＥＰＯをコードするＩＶＴ ＲＮＡ調製物は、ｄｓＲＮＡの直接的及びＩＦＮ－α媒介による効果によるタンパク質合成阻害のために、より低い効率で翻訳された。

Claims (20)

  1. 一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）を提供する方法であって、
    （ｉ）インビトロ転写によってｓｓＲＮＡを含むＲＮＡ調製物を生成すること；
    （ｉｉ）セルロース材料への二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の結合を可能にする条件下で、ＲＮＡ調製物をセルロース材料と接触させること；及び
    （ｉｉｉ）セルロース材料へのｄｓＲＮＡの結合を可能にする条件下で、セルロース材料からｓｓＲＮＡを分離すること、を含み、
    工程（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）がセルロース材料へのｄｓＲＮＡの結合を可能にし、セルロース材料へのｓｓＲＮＡの結合を可能にしない条件下で行われ、工程（ｉｉ）においてＲＮＡ調製物がｓｓＲＮＡ及び第１の緩衝液を含む液体として提供され、及び／又はセルロース材料が第１の緩衝液中の懸濁液として提供され、
    ここで第１の緩衝液が、セルロース材料へのｄｓＲＮＡの結合を可能にし、セルロース材料へのｓｓＲＮＡの結合を可能にしない濃度で、水、エタノール及び塩を含み、
    第１の緩衝液中のエタノール濃度が１４－２０％（ｖ／ｖ）であり、
    第１の緩衝液中の塩の濃度が１５－７０ｍＭであることを特徴とする、
    方法。
  2. 一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）を提供する方法であって、
    （ｉ）インビトロ転写によってｓｓＲＮＡを含むＲＮＡ調製物を生成すること；
    （ｉｉ）セルロース材料への二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の結合を可能にする条件下で、ＲＮＡ調製物をセルロース材料と接触させること；及び
    （ｉｉｉ）セルロース材料へのｄｓＲＮＡの結合を可能にする条件下で、セルロース材料からｓｓＲＮＡを分離すること、を含み、
    工程（ｉｉ）がセルロース材料へのｄｓＲＮＡ及びｓｓＲＮＡの結合を可能にする条件下で行われ、
    工程（ｉｉｉ）がセルロース材料へのｄｓＲＮＡの結合を可能にし、セルロース材料へのｓｓＲＮＡの結合を可能にしない条件下で行われ、
    工程（ｉｉｉ）が
    （１）ｄｓＲＮＡ及びｓｓＲＮＡが結合しているセルロース材料を、振盪及び／又は撹拌下で、セルロース材料へのｄｓＲＮＡの結合を可能にし、セルロース材料へのｓｓＲＮＡの結合を可能にしない濃度で水、エタノール及び塩を含む第１の緩衝液と、混合すること、
    （２）ｓｓＲＮＡを含む液相をセルロース材料から分離すること、を含み、
    第１の緩衝液中のエタノール濃度が１４－２０％（ｖ／ｖ）であり、
    第１の緩衝液中の塩の濃度が１５－７０ｍＭであることを特徴とする、
    方法。
  3. 工程（ｉｉ）が、ｓｓＲＮＡを含むＲＮＡ調製物を、振盪及び／又は撹拌下で、セルロース材料と混合することを含む、
    請求項１に記載の方法。
  4. 工程（ｉｉ）において、第１の緩衝液に含まれる塩が塩化ナトリウムである、請求項３に記載の方法。
  5. （ｉ）第１の緩衝液中のエタノール濃度が１４－１６％（ｖ／ｖ）である、かつ／又は
    （ｉｉ）第１の緩衝液中の塩の濃度が２０－６０ｍＭである、かつ／又は
    （ｉｉｉ）第１の緩衝液が、緩衝物質及び／又はキレート剤をさらに含む、かつ／又は
    （ｉｖ）工程（ｉｉｉ）において、ＲＮＡ調製物、セルロース材料、及び第１の緩衝液の混合物がチューブに入れられ、工程（ｉｉｉ）が、（１）液相及び固相が分離されるようにチューブに重力又は遠心力を適用すること；並びに（２）ｓｓＲＮＡを含む上清を回収するか又はセルロース材料を除去することを含む、又は工程（ｉｉｉ）において、ＲＮＡ調製物、セルロース材料、及び第１の緩衝液の混合物がスピンカラム又はフィルターデバイスに入れられ、工程（ｉｉｉ）が、（１’）液相及び固相が分離されるようにスピンカラム又はフィルターデバイスに重力、遠心力、圧力、又は真空を適用すること；並びに（２’）ｓｓＲＮＡを含むフロースルーを回収することを含む、
    請求項３又は４に記載の方法。
  6. 工程（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）が１回又は２回以上、反復され、工程（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の１サイクルのうち工程（ｉｉｉ）の後に得られたｓｓＲＮＡ調製物が、次サイクルの工程（ｉｉ）におけるＲＮＡ調製物として使用され、工程（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の各サイクルのうち工程（ｉｉ）において、新鮮なセルロース材料が使用される、
    請求項１、及び３から５の何れか一項に記載の方法。
  7. 工程（ｉｉ）が、（１）ｓｓＲＮＡを含むＲＮＡ調製物を、振盪及び／又は撹拌下で、セルロース材料と混合すること；並びに（２）ｄｓＲＮＡ及びｓｓＲＮＡが結合しているセルロース材料を残部から分離することを含む、
    請求項２に記載の方法。
  8. 工程（ｉｉ）において、ＲＮＡ調製物が、ｓｓＲＮＡ及び第２の緩衝液を含む液体として提供され、及び／又はセルロース材料が第２の緩衝液中の懸濁液として提供され、第２の緩衝液が、セルロース材料へのｄｓＲＮＡ及びｓｓＲＮＡの結合を可能にする濃度で、水、エタノール及び塩を含む、請求項７に記載の方法。
  9. （ｉ）第２の緩衝液中のエタノールの濃度が、少なくとも３５％（ｖ／ｖ）である、かつ／又は
    （ｉｉ）第２の緩衝液中の塩の濃度が、１５－７０ｎＭである、かつ／又は
    （ｉｉｉ）第２の緩衝液が、緩衝物質及び／又はキレート剤をさらに含む、かつ／又は
    （ｉｖ）工程（ｉｉ）（２）において、工程（ｉｉ）（１）で得られたＲＮＡ調製物とセルロース材料の混合物がチューブに入れられ、工程（ｉｉ）（２）が、（２ａ）液相及び固相が分離されるようにチューブに重力又は遠心力を適用すること；並びに（２ｂ）上清を除去するか、又はｄｓＲＮＡ及びｓｓＲＮＡが結合しているセルロース材料を回収することを含む、又は工程（ｉｉ）（２）において、工程（ｉｉ）（１）で得られたＲＮＡ調製物とセルロース材料の混合物がスピンカラム又はフィルターデバイスに入れられ、工程（ｉｉ）（２）が、（２ａ’）液相及び固相が分離されるようにスピンカラム又はフィルターデバイスに重力、遠心力、圧力、又は真空を適用すること；並びに（２ｂ’）フロースルーを廃棄することを含む、かつ／又は
    （ｖ）工程（ｉｉ）が、（３）ｄｓＲＮＡ及びｓｓＲＮＡが結合しているセルロース材料に第２の緩衝液のアリコートを添加すること；（４）得られた混合物を、振盪及び／又は撹拌下で、インキュベートすること；並びに（５）ｄｓＲＮＡ及びｓｓＲＮＡが結合しているセルロース材料を液相から分離すること；並びに、任意選択的に（６）工程（３）－（５）を１回又は２回以上、反復することをさらに含む、
    請求項８に記載の方法。
  10. 工程（ｉｉｉ）が、（１）ｄｓＲＮＡ及びｓｓＲＮＡが結合しているセルロース材料を、振盪及び／又は撹拌下で、少なくとも５分間、第１の緩衝液と混合することを含む、請求項２又は７から９に記載の方法。
  11. （ｉ）第１の緩衝液中のエタノールの濃度が１４－１６％（ｖ／ｖ）である、かつ／又は
    （ｉｉ）第１の緩衝液中の塩の濃度が２０－６０ｍＭである、かつ／又は
    （ｉｉｉ）第１の緩衝液が、緩衝物質及び／又はキレート剤をさらに含む、かつ／又は
    （ｉｖ）工程（ｉｉｉ）において、セルロース材料と第１の緩衝液の混合物がチューブに入れられ、工程（ｉｉｉ）（２）が、（２ａ）液相及び固相が分離されるようにチューブに重力又は遠心力を適用すること；並びに（２ｂ）ｓｓＲＮＡを含む上清を回収するか又はセルロース材料を除去することを含む、又は工程（ｉｉｉ）において、セルロース材料と第１の緩衝液の混合物がスピンカラム又はフィルターデバイスに入れられ、工程（ｉｉｉ）（２）が、（２ａ’）スピンカラム又はフィルターデバイスに重力、遠心力、圧力、又は真空を適用すること；及び（２ｂ’）ｓｓＲＮＡを含むフロースルーを回収することを含む、
    請求項１０に記載の方法。
  12. 工程（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）が１回又は２回以上、反復され、工程（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の１サイクルのうち工程（ｉｉｉ）の後に得られたｓｓＲＮＡ調製物が、次サイクルの工程（ｉｉ）におけるＲＮＡ調製物として使用され、工程（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の各サイクルのうち工程（ｉｉ）において、新鮮なセルロース材料が使用される、
    請求項２及び７から１１の何れか一項に記載の方法。
  13. 工程（ｉｉ）において、セルロース材料がカラムに入れられ、工程（ｉｉ）が、ｄｓＲＮＡ及びｓｓＲＮＡのセルロース材料への結合を可能にする条件下で、カラムにＲＮＡ調製物をロードすることを含み、工程（ｉｉｉ）が、ｄｓＲＮＡのセルロース材料への結合を可能にし、ｓｓＲＮＡのセルロース材料への結合を可能にしない条件下で、セルロース材料からｓｓＲＮＡを溶出することを含む、
    請求項２に記載の方法。
  14. 工程（ｉｉ）において、ＲＮＡ調製物が提供され、ｓｓＲＮＡ及び第２の緩衝液を含む液体としてカラムにロードされ、第２の緩衝液が、ｄｓＲＮＡ及びｓｓＲＮＡのセルロース材料への結合を可能にする濃度で、水、エタノール及び塩を含む、
    請求項１３に記載の方法。
  15. （ｉ）第２の緩衝液中のエタノール濃度が少なくとも３５％（ｖ／ｖ）である、かつ／又は
    （ｉｉ）第２の緩衝液中の塩の濃度が１５－７０ｍＭである、かつ／又は
    （ｉｉｉ）第２の緩衝液が、緩衝物質及び／又はキレート剤をさらに含む、かつ／又は
    （ｉｖ）工程（ｉｉｉ）が、溶離液として第１の緩衝液を使用して実施される、
    請求項１４に記載の方法。
  16. （ａ）第１の緩衝液中のエタノール濃度が１４－１６％（ｖ／ｖ）である、かつ／又は
    （ｂ）第１の緩衝液中の塩の濃度が２０－６０ｍＭである、かつ／又は
    （ｃ）第１の緩衝液が、緩衝物質及び／又はキレート剤をさらに含む、
    請求項１５に記載の方法。
  17. （ｉ）ＲＮＡ調製物が、Ｔ３、Ｔ７及びＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼからなる群から選択されるＲＮＡポリメラーゼを使用することによって生成される、かつ／又は
    （ｉｉ）工程（ｉｉ）の前に、ＲＮＡ調製物が、少なくとも１つの予備精製処理に供され、かつ／又は
    （ｉｉｉ）ｓｓＲＮＡが、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、又はｍｉＲＮＡなどのｍＲＮＡ又は阻害ＲＮＡである、かつ／又は
    （ｉｖ）ｓｓＲＮＡが、少なくとも２７００ｎｔの長さを有する、かつ／又は
    （ｖ）セルロース材料が、セルロース繊維を含む、
    請求項１から１６の何れか一項に記載の方法。
  18. 工程（ｉｉ）においてＲＮＡ調製物と接触させる前に、セルロース材料が洗浄セルロース材料として提供される、請求項１から１７の何れか一項に記載の方法。
  19. セルロース材料の洗浄が、（Ｉ）セルロース材料を、振盪及び／又は撹拌下で、洗浄溶液と混合すること；並びに（ＩＩ）液体を除去するか又はセルロース材料を回収すること；並びに任意選択的に（ＩＩＩ）工程（Ｉ）及び（ＩＩ）を１回又は２回以上、反復することを含む、請求項１８に記載の方法。
  20. 洗浄溶液が、（Ａ）工程（ｉｉ）がｄｓＲＮＡの洗浄セルロース材料への結合を可能にし、ｓｓＲＮＡの洗浄セルロース材料への結合を可能にしない条件下で行われる場合、請求項４、又は請求項５の（ｉ）、（ｉｉ）、又は（ｉｉｉ）の何れかに定義された第１の緩衝液の組成を有し、又は（Ｂ）工程（ｉｉ）がｄｓＲＮＡ及びｓｓＲＮＡの洗浄セルロース材料への結合を可能にする条件下で行われる場合、第２の緩衝液が、セルロース材料へのｄｓＲＮＡ及びｓｓＲＮＡの結合を可能にする濃度で、水、エタノール及び塩を含む、第２の緩衝液の組成を有し、任意選択的に、請求項９の（ｉ）、（ｉｉ）、又は（ｉｉｉ）の何れかに定義された第２の緩衝液の組成を有する、請求項１９に記載の方法。
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