KR20220041211A - 치료학적 조성물로부터 물질을 제거하기 위한 제조 방법 및 장치 - Google Patents

치료학적 조성물로부터 물질을 제거하기 위한 제조 방법 및 장치 Download PDF

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KR20220041211A
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사무엘 도이치
벤자민 엘드리지
콜린 맥킨레이
시미아오 웬
산기타 나스
이고르 칸드로스
로버트 에반스
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넛크래커 테라퓨틱스 인코포레이티드
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Abstract

특히 mRNA 치료제를 포함하는 치료제를 제조하고 사용하는 방법 및 장치로서, 이는 연속 흐름의 일부로서 단일 가닥 RNA로부터 이중 가닥 RNA를 분리한다. 이러한 방법 및 장치는 미세유체 경로 소자 내에 통합된 투과성 삽입물을 사용한 RNA 치료제의 제형화를 포함할 수 있다. 특히, 이러한 방법 및 장치는 셀룰로스 물질을 포함하는 미세유체 경로 소자 내에서 RNA 용액으로부터 dsRNA를 제거함에 의한 RNA 치료제의 제형화를 포함할 수 있다.

Description

치료학적 조성물로부터 물질을 제거하기 위한 제조 방법 및 장치
관련 출원에 대한 교차 참조
이 특허 출원은 2019년 8월 9일에 제출된 "미세유체 소자 및 이의 사용 방법"이라는 제목의 미국 특허 가출원 번호 62/885,159 및 2019년 8월 9일에 제출된 "치료학적 조성물을 제조하기 위한 방법 및 장치"라는 제목의 미국 특허 가출원 번호 62/885,170, 및 2019년 10월 11일에 제출된 "치료학적 조성물로부터 물질을 제거하기 위한 제조 방법 및 장치"라는 제목의 미국 특허 가출원 번호 62/914,374에 대한 우선권을 주장하며, 이들 각각은 그 전체가 참고로 본원에 포함된다.
참조에 의한 통합
본 명세서에 언급된 모든 간행물 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물 또는 특허 출원이 구체적이고 개별적으로 참조로 포함되는 것으로 나타난 것과 동일한 정도로 그 전체가 참조로 본원에 포함된다.
분야
본 개시내용은 일반적으로 폴리뉴클레오티드 기반 치료제의 신속한 고수율 제조를 위한 방법 및 시스템에 관한 것이다. 본 개시내용은 특히 신속하고 효율적으로 수행될 수 있는, 백신을 포함하는 치료학적 mRNA의 자동화된 제조에 관련될 수 있다. 이러한 치료제는 환자의 특정 정보를 고려할 수 있으며, 주문 방식으로 생산될 수 있으며, 전체적으로 또는 부분적으로 현장 진료(예를 들어, 병원, 클리닉 등)에서 생성될 수 있다.
배경
폴리뉴클레오티드 치료제, 특히 mRNA 치료제를 제조하고 제형화하기 위해 현재 이용 가능한 기술은 종종 제품을 오염 및 분해에 노출시킨다. 현재 이용 가능한 중앙 집중식 생산은 비용이 너무 많이 들고, 너무 느리며, 가능하게는 다중 폴리뉴클레오티드 종을 포함하는 치료학적 제형에 이용하기에는 오염에 민감하다. 확장 가능한 폴리뉴클레오티드 제조의 개발, 단일 환자 투여량의 생산, 오염을 제한하기 위한 점점 제거, 임상 제조 요구사항을 충족하기 위한 입력 및 프로세스 추적, 및 현장 진료 작업에서의 사용은 이러한 유망한 치료 양식의 사용을 발전시킬 수 있다. 미세유체 계측 및 과정은 이러한 목표에 대한 주요 이점을 제공할 수 있다.
본원에는 상기 언급된 요구를 다룰 수 있는 다양한 치료제를 제조하기 위한 방법 및 장치(예를 들어, 시스템)가 기술되어 있다.
발명의 개요
광범위한 백신 및 치료제를 제조하는데 유용한 장치 및 방법이 본원에 기술되어 있다. 예를 들어, 백신을 포함하는 개인화된 치료제를 제조하기 위한 방법 및 장치(예를 들어, 시스템, 소자 등)가 본원에 설명되어 있다. 한 비제한적인 예에서, 본원에 기술된 방법 및 장치는 피부 T-세포 림프종에서 활성인 암-특이적 항원에 대한 치료학적 mRNA 백신을 생성하는데 사용될 수 있다.
따라서, 일반적으로 현장 진료에 선택적으로 배치되는 mRNA 치료제를 위한 자동화된 고수율 제조 방법이 본원에 기술된다.
예를 들어, 하나 이상의 미세유체 경로 소자와 밀봉 유체 소통되어 고정되도록 구성된 복수의 유체 저장소를 포함하는 시스템을 사용하여 치료학적 폴리뉴클레오티드를 형성(예를 들어, 제작, 제조, 합성 등)하는 방법으로서, 대기 접촉으로부터 보호되는 밀봉 밀폐된 유체 경로에서 하나 이상의 미세유체 경로 소자 상의 복수의 반응기와 복수의 유체 저장소 중 하나 이상의 유체 저장소 사이에 시약을 수송하여 합성 주형을 형성하는 단계, 주형으로부터의 시험관내 전사를 수행하여 치료학적 폴리뉴클레오티드를 생성하는 단계 및 치료학적 폴리뉴클레오티드를 정제하는 단계를 수행하는 것을 포함하는, 방법이 본원에 기술된다.
하나 이상의 미세유체 경로 플레이트 소자와 밀봉 유체 소통하여 고정되도록 구성된 복수의 유체 저장소를 포함하는 시스템을 사용하여 치료학적 mRNA를 제조하는 방법으로서, 하나 이상의 미세유체 경로 플레이트 소자가 복수의 반응기를 포함하는 방법은 주형 전구체 물질을 하나 이상의 유체 저장소로부터 복수의 반응기의 제1의 하나 이상의 반응기 영역에 전달하고, 주형 전구체 물질을 처리하여 주형 전구체 물질로부터 주형을 제조하는 단계; 주형을 복수의 반응기의 제2의 하나 이상의 반응기 영역에 이송하고, 시험관내 전사에 의해 주형을 처리하여 치료학적 mRNA를 형성하는 단계; 및 치료학적 mRNA를 복수의 반응기의 제3의 하나 이상의 반응기 영역에 이송하고, 제3의 하나 이상의 반응기 영역 내에서 치료학적 mRNA를 2차원(2D) 정제에 의해 정제하는 단계를 포함하며; 여기서 방법의 모든 단계는 주형 및 치료학적 mRNA를 대기 접촉에 노출시키지 않으면서 수행된다.
하나 이상의 미세유체 경로 플레이트 소자와 밀봉 유체 소통되는 복수의 유체 저장소를 포함하는 시스템을 사용하여 치료학적 mRNA를 제조하는 방법으로서, 하나 이상의 미세유체 경로 플레이트 소자는 복수의 반응기를 포함하는 방법은, 주형 전구체 물질을 하나 이상의 유체 저장소로부터 복수의 반응기의 제1의 하나 이상의 반응기 영역에 유체 동력을 사용하여 전달하고, 주형 전구체 물질을 처리하여 주형 전구체 물질로부터 주형을 제조하는 단계; 주형을 복수의 반응기의 제2의 하나 이상의 반응기 영역에 유체 동력을 이용하여 이송하고, 시험관내 전사에 의해 주형을 처리하여 치료학적 mRNA를 형성하는 단계; 치료학적 mRNA를 복수의 반응기의 제3의 하나 이상의 반응기 영역에 유체 동력을 이용하여 이송하고, 제3의 하나 이상의 반응기 영역 내에서 2차원(2D) 정제에 의해 치료학적 mRNA를 정제하는 단계; 치료학적 mRNA를 복수의 반응기의 제4의 하나 이상의 반응기 영역에 유체 동력을 이용하여 이송하고, 치료학적 mRNA를 전달 비히클로 캡슐화하여 치료학적 mRNA 조성물을 형성하는 단계; 및 치료학적 mRNA 조성물을 제5의 하나 이상의 유체 저장소에서 유체 동력을 이용하여 농축시키는 단계를 포함하며, 여기서 방법의 모든 단계는 주형 및 치료학적 mRNA를 대기 접촉에 노출시키지 않으면서 수행된다.
치료학적 폴리뉴클레오티드를 정제하는 단계는 전형적으로 하나 이상의 복수의 반응기 내에서 치료학적 폴리뉴클레오티드의 2차원(2D) 정제를 포함한다. 2D 정제는 본원에 기술된 실질적으로 평평한 미세유체 경로 소자(예를 들어, 미세유체 경로 플레이트 소자) 내에서 수행될 수 있고, 치료학적 폴리뉴클레오티드로부터 물질(예를 들어, 이중 가닥 RNA 등)을 제거하기 위해 물질을 사용하는 것을 포함할 수 있다. 미세유체 경로 소자에서 폴리뉴클레오티드의 2D 정제는 컬럼의 사용을 필요로 할 수 있고 본원에 기술된 바와 같은 밀폐 경로 환경 및/또는 작은 부피에서 수행하기 어렵거나 불가능한 단계를 포함할 수 있는 종래 기술에 비해 특히 유리할 수 있다. 다양한 변형에서, 치료학적 폴리뉴클레오티드를 정제하는 단계는 하나 이상의 반응기 내에서 셀룰로스 물질을 사용하여 이중-가닥 mRNA를 제거하는 것을 포함한다.
이들 방법 중 임의의 방법은 치료학적 폴리뉴클레오티드를 하나 이상의 미세유체 경로 소자 상의 하나 이상의 반응기에서 전달 비히클과 제형화시켜 치료학적 폴리뉴클레오티드 조성물을 형성시키는 것을 추가로 포함할 수 있다. 치료학적 폴리뉴클레오티드(예를 들어, mRNA)는 본원에 기술된 바와 같은 전달 비히클로 캡슐화될 수 있으며, 일부 변형에서 치료학적 mRNA 이외에 애주번트 mRNA(예를 들어, 면역 반응을 향상시키는 단백질을 둘러싸는 mRNA)를 포함하는 추가적인 mRNA를 포함할 수 있다. 전달 비히클은 양친매성 나노입자, 예를 들어 아미노-지질화된 펩토이드를 포함할 수 있다.
일부 변형에서, 치료학적 조성물은 나중에 전달 비히클과 조합되기 위해 저장될 수 있다(예를 들어, 밀봉된 인클로저, 용기 또는 바이알에 4℃에서 저장됨). 치료학적 조성물은 미세유체 경로 소자를 떠나 미세유체 제어 장치에서 유체 저장소로 이동하여 동일한 미세유체 제어 장치에서 사용될 수 있거나 전달 비히클과 조합하기 위한 또 다른 (예를 들어, 사용하고자 하는 병원 또는 클리닉에 근접한 것을 포함하여, 지리적으로 분리됨) 미세유체 제어 장치에 제공될 수 있다. 치료학적 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 치료학적 mRNA)를 전달 비히클과 조합하여 치료학적 조성물을 형성한다. 치료학적 조성물은 사용 (예를 들어, 환자에 주사) 전에 추가로 변형될 수 있다.
예를 들어, 이들 방법 중 임의의 방법은 하나 이상의 미세유체 경로 소자에서 치료학적 폴리뉴클레오티드 조성물을 투석 및/또는 농축하는 것을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이 투석은 멤브레인(투석 멤브레인)을 통과하는 입자의 능력의 차이에 기초하여 액체에서 입자를 분리하는 것을 나타낼 수 있다. 일부 변형에서, 투석은 역류 교환을 포함한다.
시스템은 합성 주형을 형성하는 단계, 주형으로부터의 시험관내 전사를 수행하는 단계 및 시스템의 하나 이상의 센서로부터 광 피드백으로 치료학적 폴리뉴클레오티드를 정제하는 단계를 자동으로 연속적으로 수행할 수 있다.
일반적으로, 치료학적 폴리뉴클레오티드는 mRNA일 수 있다. 예를 들어, 치료학적 폴리뉴클레오티드는 mRNA, 원형 RNA 또는 자가-복제 RNA 등일 수 있다.
일반적으로, 시스템은 예를 들어, 하나 이상의 유체 회로를 사용하는 유체 동력에 의해 하나 이상의 유체 저장소와 복수의 반응기 사이에 시약을 수송할 수 있다. 유체 동력은 일반적으로 공압 및 유압 둘 모두를 나타낸다. 유체 동력 회로는 다중 요소(예를 들어, 유체 라인, 밸브 등)를 포함할 수 있으며, 다양한 유체 동력 회로(또한 본원에서 유체 회로로 언급됨)의 구성요소는 하나 초과의 유체 동력 회로에 의해 공유될 수 있으며, 이는 하나 이상의 밸브를 통해 제어기의 제어하에 전환될 수 있다. 예를 들어, 시스템은 시약을 하나 이상의 유체 저장소와 복수의 반응기 사이에 공압에 의해 수송할 수 있다. 제어기에 의해 제어된 유체 동력의 사용은 유리하게는 주형, 치료학적 mRNA 및/또는 치료학적 조성물을 형성하는데 사용되는 처리의 비접촉 제어를 허용할 수 있다. 예를 들어, 시스템은 하나 이상의 미세유체 경로 소자 내에서 하나 이상의 탄성 층을 편향시킴으로써 시약을 하나 이상의 유체 저장소와 복수의 반응기 사이에 수송할 수 있다.
본원에 기술된 방법은 위에서 언급한 바와 같이 완전히 또는 부분적으로 현장에서(예를 들어, 치료 현장에서) 수행될 수 있다. 유리하게는, 본원에 기술된 방법은 효능 및/또는 위험한 합병증을 감소시킬 수 있는, 치료학적 mRNA에의 보존제 또는 첨가제의 사용 부재하에 치료학적 mRNA의 주문형 제조를 허용할 수 있다. 치료학적 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 치료학적 mRNA)와 전달 비히클을 현장에서 제형화시키는 것이 특히 유익할 수 있는데, 치료학적 mRNA 및 전달 비히클을 포함하는 치료학적 조성물이 시간 경과에 따라 응집 및 클러스터링될 수 있기 때문이다. 또한, 이들 방법은 기존 방법에 비해 빠르게 수행될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기술된 시스템은 합성 주형을 형성하는 단계, 주형으로부터 시험관내 전사를 수행하여 치료학적 폴리뉴클레오티드를 형성하는 단계 및 5일 미만(예를 들어, 4일 미만, 3일 미만 등)에 치료학적 폴리뉴클레오티드를 정제하는 단계를 자동으로 연속적으로 수행할 수 있다.
이들 방법 중 임의의 방법은 하나 이상의 미세유체 경로 소자 상의 복수의 반응기와 유체 저장소 사이에 시약을 수송하기 전에 하나 이상의 미세유체 경로 소자에 대해 유체 저장소를 밀봉하고 유체 저장소를 가압하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 제어기는 유체 저장소를 가압하는 것을 제어할 수 있다.
일반적으로, 이들 방법 및 장치는 부분적으로 또는 전체적으로 제조를 기록할 수 있으며, 이러한 기록은 광학적(예를 들어, 미세유체 경로 소자 내의 유체의 움직임을 보여주며, 무비, 비디오 등을 포함함) 및/또는 비-광학적 센서 데이터(압력 판독값, 온도 판독값, 등)일 수 있다. 이러한 제조 데이터는 품질 관리 및 테스트를 포함하여 추후 검토를 위해 보관, 저장 및/또는 전송될 수 있다. 따라서, 이들 방법 중 임의의 방법은 제조할 치료학적 폴리뉴클레오티드와 관련된 파일에서 단계를 수행하는 동안 하나 이상의 미세유체 경로 소자 내에서 유체의 이동을 기록하는 것을 포함할 수 있다.
본원에 기술된 방법 중 임의의 방법은 이러한 방법의 전부 또는 일부를 수행하도록 구성된 소프트웨어를 실행하는 컴퓨터(예를 들어, 프로세서)를 포함하는 시스템(예를 들어, 이러한 명령을 인코딩하는 비일시적인 컴퓨터 판독가능 매체)에 의해 자동으로 또는 반자동으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 치료학적 폴리뉴클레오티드를 제조하기 위한 명령을 구현하는 비일시적 컴퓨터 판독가능 매체는 하나 이상의 미세유체 경로 소자와 밀봉 유체 소통하여 고정되도록 구성된 복수의 유체 저장소를 포함하는 시스템의 제어기에 의해 실행되는 경우, 제어기로 하여금 하나 이상의 미세유체 경로 소자와 유체 소통하는 복수의 유체 저장소를 가압하고; 대기 접촉으로부터 보호되는 밀봉 밀폐된 유체 경로에서 하나 이상의 미세유체 경로 소자 상의 복수의 반응기와 복수의 유체 저장소 중 하나 이상의 유체 저장소 사이에 시약을 수송하여 합성 주형을 형성하는 단계, 주형으로부터의 시험관내 전사를 수행하여 치료학적 폴리뉴클레오티드를 생성하는 단계 및 (예를 들어, 하나 이상의 미세유체 경로 소자에서 모두) 치료학적 폴리뉴클레오티드를 정제하는 단계를 수행하는 방법을 수행하게 한다.
명령은 추가로 제어기로 하여금 합성 주형을 형성하는 단계, 주형으로부터 시험관내 전사를 수행하는 단계 및 시스템의 하나 이상의 광 센서로부터의 광 피드백을 기반으로 하여 치료학적 폴리뉴클레오티드를 정제하는 단계를 자동으로 그리고 연속적으로 수행하게 할 수 있다. 명령은 추가로 제어기로 하여금 복수의 반응기 중 하나 이상의 반응기 내에서 2차원(2D) 정제에 의한 치료학적 폴리뉴클레오티드의 정제를 제어하고/거나 치료학적 폴리뉴클레오티드를 하나 이상의 미세유체 경로 소자 상의 하나 이상의 반응기에서 전달 비히클과 제형화시켜 치료학적 폴리뉴클레오티드 조성물을 형성시키고/거나 하나 이상의 미세유체 경로 소자 등에서 치료학적 폴리뉴클레오티드 조성물을 투석 및/또는 농축시키게 할 수 있다.
또한, 본원에 기술된 임의의 밀폐 경로 시스템을 사용하여 mRNA 합성을 위한 합성 이중 가닥 DNA 주형을 제조하는 자동화된 방법이 본원에 기술된다. 예를 들어, 하나 이상의 미세유체 경로 소자와 밀봉 유체 소통하여 고정되도록 구성된 복수의 유체 저장소를 포함하는 밀폐 경로 시스템을 사용하여 mRNA 합성을 위한 합성 이중 가닥 DNA 주형을 제조하는 방법은 대기 접촉으로부터 보호되는 밀폐된 유체 경로에서 하나 이상의 미세유체 경로 소자 상의 복수의 반응기와 복수의 유체 저장소 중 하나 이상의 유체 저장소 사이에 시약을 전달하여 시약을 조합하는 단계; 및 치료학적 mRNA의 시험관내 전사를 위한 합성 이중 가닥 DNA를 형성하는 단계를 포함할 수 있다.
형성된 합성 주형(합성 이중 가닥 DNA 주형)은 박테리아 DNA 비함유 및 내독소 비함유 주형일 수 있다.
이들 방법은 밀폐 경로 시스템의 하나 이상의 센서로부터 광 센서 데이터를 밀폐 경로 시스템을 위한 제어기에서 수신하는 단계로서, 여기서 제어기는 광 센서 데이터를 기반으로 하여 밀폐 경로 시스템의 작동을 제어하는 단계를 포함할 수 있다.
방법은 유체 저장소를 가압하는 단계를 포함할 수 있으며/거나 시약을 수송하는 단계는 복수의 유체 저장소 중 하나 이상의 유체 저장소로부터 합성 관심 유전자 및 합성 시험관내 전사 촉진제 카세트를 미세유체 경로 소자의 제1의 하나 이상의 반응기에 수송하는 단계, 합성 관심 유전자를 합성 시험관내 전사 촉진제 카세트와 결합시켜 합성 생성물을 생성하는 단계, 합성 생성물로부터 미반응 물질을 제거하는 단계 및 합성 생성물을 증폭하여 합성 이중 가닥 DNA 주형을 생성하는 단계를 포함한다. 하나 이상의 미세유체 경로 소자는 밀폐 경로 시스템에 안착된 미세유체 경로 플레이트 소자를 포함한다.
유리하게는, 이들 방법은 (전형적으로 단지 펨토몰량만을 생성하는) 다른 시스템과 비교하여 상당한 양의 주형(mM 양)을 제조하는 것을 포함할 수 있다. 본원에 기술된 방법 및 장치는 대량의 주형을 생성할 수 있다.
미세유체 경로 소자와 밀봉 유체 소통되는 복수의 유체 저장소를 포함하는 밀폐 경로 시스템을 사용하여 시험관내 전사를 위한 합성 이중 가닥 DNA 주형을 제조하는 자동화된 방법은 합성 관심 유전자 및 합성 시험관내 전사 촉진제 카세트를 포함하는 시약을 복수의 유체 저장소 중 하나 이상의 유체 저장소로부터 대기 접촉으로부터 보호되는 밀폐된 유체 경로의 미세유체 경로 소자에서 제1의 하나 이상의 반응기에 수송하는 단계; 합성 시험관내 전사 촉진제 카세트와 합성 관심 유전자를 결합시켜 합성 생성물을 생성시키는 단계; 미세유체 경로 소자의 합성 생성물을 수송하여 합성 생성물로부터 미반응된 합성 관심 유전자 및 미반응된 합성 시험관내 전사 촉진제 카세트를 제거하는 단계; 및 미세유체 경로 소자의 합성 생성물을 수송하고 합성 생성물을 증폭하여 이중 가닥 DNA 주형을 생성하는 단계를 포함할 수 있다. 언급된 바와 같이, 합성 생성물을 증폭하는 것은 1 mM 초과의 증폭된 DNA 주형을 생성하는 것을 포함할 수 있다.
또한, 미세유체 경로 소자와 밀봉 유체 소통되는 복수의 유체 저장소를 포함하는 밀폐 경로 시스템을 사용하여 시험관내 전사를 위한 합성 이중 가닥 DNA 주형을 제조하는 자동화된 방법으로서, 합성 관심 유전자 및 합성 시험관내 전사(IVT) 촉진제 카세트를 포함하는 시약을 복수의 유체 저장소 중 하나 이상의 유체 저장소로부터 대기 접촉으로부터 보호되는 밀폐 유체 경로에서 미세유체 경로 소자의 제1의 하나 이상의 반응기에 수송하는 단계; 합성 관심 유전자를 합성 IVT 촉진제 카세트와 제1의 하나 이상의 반응기에서 결합시켜 합성 생성물을 생성하는 단계; 합성 생성물을 미세유체 경로 소자의 제2의 하나 이상의 반응기에 수송하여 합성 생성물로부터 미반응된 합성 관심 유전자 및 미반응된 합성 IVT 촉진제 카세트를 제거하는 단계; 합성 생성물을 미세유체 경로 소자의 제3의 하나 이상의 반응기에 수송하고, 합성 생성물을 증폭시켜 1 mM 초과의 증폭된 DNA 주형을 생성하는 단계; 및 밀폐 경로 시스템을 위한 제어기에서 밀폐 경로 시스템의 하나 이상의 센서로부터의 광 센서 데이터를 수신하는 단계로서, 여기서 제어기는 광 센서 데이터를 기반으로 하여 밀폐 경로 시스템의 작동을 제어하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 기술된다.
예를 들어, 미세유체 경로 소자와 밀봉 유체 소통되는 복수의 유체 저장소를 포함하는 밀폐 경로 시스템을 사용하여 시험관내 전사를 위한 합성 이중 가닥 DNA 주형을 제조하는 자동화된 방법은 합성 관심 유전자 및 합성 시험관내 전사(IVT) 촉진제 카세트를 복수의 유체 저장소 중 하나 이상의 유체 저장소로부터 대기 접촉으로부터 보호되는 밀폐 유체 경로에서 미세유체 경로 플레이트 소자의 하나 이상의 결합 반응기에 제1 유체 동력 회로를 사용하여 수송하고, 합성 관심 유전자를 IVT 촉진제 카세트에 결합시켜 합성 생성물을 생성하는 단계; 제2 유체 동력 회로를 사용하여 미반응된 합성 관심 유전자 및 미반응된 합성 시험관내 전사 촉진제 카세트를 미세유체 경로 플레이트 소자에서 합성 생성물로부터 제거하는 단계; 제3 유체 동력 회로를 사용하여 합성 생성물을 미세유체 경로 소자의 하나 이상의 증폭 반응기에 이송하고, 합성 생성물을 증폭하여 1 mM 초과의 증폭된 DNA 주형을 생성하는 단계; 및 밀폐 경로 시스템의 하나 이상의 광 센서로부터 광 센서 데이터를 밀폐 경로 시스템을 위한 제어기에서 수신하는 단계로서, 여기서 제어기는 광 센서 데이터를 기반으로 하여 제1, 제2 및 제3 유체 동력 회로를 제어하고, 미세유체 경로 소자 및 복수의 유체 저장소를 밀폐 경로 및 밀봉 환경으로 유지하는 단계를 포함할 수 있다.
이러한 방법 중 임의의 방법에서, 합성 이중 가닥 DNA 주형은 박테리아 DNA 비함유 및 내독소 비함유 주형이다.
이들 방법 중 임의의 방법은 밀폐 경로 시스템의 하나 이상의 센서로부터 광 센서 데이터를 밀폐 경로 시스템을 위한 제어기에서 수신하는 것을 포함할 수 있으며, 여기서 제어기는 광 센서 데이터를 기반으로 하여 밀폐 경로 시스템의 작동을 제어한다. 광 센서 데이터는 카메라 또는 다른 이미징 센서의 데이터일 수 있다. 본원에 기술된 방법은 하나 이상의 유체 동력 회로를 사용하여 물질을 복수의 유체 저장소와 미세유체 경로 소자 사이에 또는 미세유체 경로 소자 내에 이동시킬 수 있다. 제어기는 조정을 위해 광학 정보를 사용하는 것을 포함하여 유체 동력 회로의 작동을 조정할 수 있다. 예를 들어, 제어기는 유체가 밀폐 경로 시스템의 하나 이상의 부분(예를 들어, 저장소, 유체 라인 및/또는 미세유체 경로 센서의 영역(들)) 내에 있음을 결정할 수 있다.
이들 방법 중 임의의 방법은 증폭된 DNA 주형을 미세유체 경로 소자의 하나 이상의 분해 반응기에 이송하여 증폭된 합성 생성물을 효소적으로 변형하여 이중 가닥 DNA 주형을 생성하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 합성 관심 유전자를 합성 시험관내 전사 촉진제 카세트와 결합시켜 합성 생성물을 생성하는 단계는 합성 선형 또는 원형 결찰 생성물을 생성하는 것을 포함할 수 있다. 결합은 결찰 및/또는 수소화 및/또는 어닐링 및/또는 프라이머 확장을 통해 이루어질 수 있다. 일부 변형에서, 합성 생성물을 증폭하는 단계는 선형, 분지형 또는 원형 증폭된 DNA 생성물을 생성하는 것을 포함하고, 증폭된 DNA 생성물을 선형화하여 이중 가닥 DNA 주형을 생성하는 것을 추가로 포함한다. 결찰은 DNA 리가제 또는 프라이머 확장에 의한 결찰을 포함할 수 있다. 일부 변형에서, 증폭은 다중 변위 증폭(MDA)을 포함한다. 대안적으로, 증폭은 중합효소 연쇄 반응(PCR) 증폭을 포함할 수 있다.
일부 변형에서, 합성 시험관내 전사 촉진제 카세트는 프로모터; 5' UTR; 절단 가능한 링커; 3' UTR; 및 연속적으로 적어도 200개의 아데닌 잔기 또는 200개의 티미딘 잔기를 포함하는 폴리A 영역을 인코딩하는 부분을 포함하는 이중 가닥 DNA 주형을 포함할 수 있다. 이중 가닥 DNA 주형은 합성 관심 유전자의 3' 말단에서 길이가 적어도 300 bp인 폴리A 영역을 포함할 수 있다. 일반적으로, 시험관내 전사 촉진제 카세트의 길이는 1 kb 미만일 수 있다. 일부 변형에서, 합성 시험관내 전사 촉진제 카세트는 항생제 내성 유전자를 인코딩하지 않고/하거나 복제 기점(ORI)을 갖지 않는다.
또한, 주형 물질(비제한적으로 상기 기술된 주형 물질을 포함)을 사용하여 시험관내 전사(IVT)를 수행하여 치료학적 mRNA를 형성하기 위한 자동화된 방법 및 장치가 본원에 기술된다. 예를 들어, 하나 이상의 미세유체 경로 소자와 밀봉 유체 소통하여 고정되도록 구성된 복수의 유체 저장소를 포함하는 시스템을 사용하여 시험관내 전사(IVT) 반응을 자동으로 수행하기 위한 방법 및 장치가 본원에 기술되며, 상기 방법은 대기 접촉으로부터 보호되는 밀폐 유체 경로에서 하나 이상의 미세유체 소자 상의 복수의 반응기와 복수의 유체 저장소 중 하나 이상의 유체 저장소 사이에 시약을 수송하여 하나 이상의 미세유체 경로 소자에서 주형으로부터의 치료학적 mRNA의 시험관내 전사를 수행하고, 치료학적 폴리뉴클레오티드를 정제하는 것을 포함한다.
예를 들어, 미세유체 경로 소자와 밀봉 유체 소통하여 고정되도록 구성된 복수의 유체 저장소를 포함하는 시스템을 사용하여 시험관내 전사(IVT) 반응을 수행하는 자동화된 방법으로서, 상기 방법은 DNA 주형, 중합효소 및 뉴클레오티드를 복수의 유체 저장소의 유체 저장소 및 미세유체 경로 소자 상의 부위 중 하나 이상으로부터 미세유체 경로 소자의 하나 이상의 IVT 반응기에 전달하는 단계; 하나 이상의 IVT 반응기에서 DNA 주형 및 뉴클레오티드를 처리하여 치료학적 mRNA를 형성하는 단계; 및 치료학적 mRNA를 미세유체 경로 소자의 하나 이상의 정제 반응기 영역에 이송하고, 하나 이상의 정제 반응기 영역 내에서 2차원(2D) 정제에 의해 치료학적 mRNA를 정제하는 단계를 포함하며, 여기서 미세유체 경로 소자 및 복수의 유체 저장소는 밀폐된 경로 및 밀봉된 환경을 형성하여 대기 노출을 방지한다.
일반적으로, 시스템은 예를 들어, 미세유체 경로 소자 내에서 하나 이상의 탄성 층을 편향시킴으로써 시약을 수송하는 단계를 수행하는 것을 포함하는 이들 방법을 수행하도록 제어기를 포함할 수 있다. 이들 방법은 시스템의 하나 이상의 센서로부터 광 센서 데이터를 시스템을 위한 제어기에서 수신하는 것을 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 제어기는 광 센서 데이터를 기반으로 하여 시스템의 작동을 제어한다. 제어기는 또한 유체 저장소의 가압을 제어할 수 있다. 본원에 기술된 임의의 방법에서, 시스템은 시스템에 안착되는 미세유체 경로 소자를 포함할 수 있다.
일반적으로, DNA 주형은 합성 관심 유전자 및 합성 시험관내 전사 촉진제 카세트의 이중 가닥 DNA 주형을 포함할 수 있다.
이들 방법 중 임의의 방법은 제어기에 의해 제어되는 하나 이상의 유체 동력 회로를 사용하여 전달 및 수송하여 DNA 주형, 중합효소, 뉴클레오티드 및 치료학적 mRNA 물질을 복수의 유체 저장소와 미세유체 저장소 사이에 또는 미세유체 경로 소자 내에 이동시키는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 전달 및 수송 단계는 방법 동안 대기 접촉을 피하기 위해 제어기의 제어 하에 미세유체 경로 소자 내의 하나 이상의 탄성 층을 편향시킴으로써 수행될 수 있다.
일부 변형에서, IVT 반응기가 사용되며; 이러한 IVT 반응기는 각각 액체 수용부 및 압력 수용부를 갖는 한 쌍의 연결된 챔버를 포함할 수 있으며, 여기서 액체 수용부는 압력 수용부에 의해 편향되어 액체 수용부의 부피를 조절할 수 있는 탄성 층에 의해 압력 수용부로부터 분리된다. DNA 주형은 합성 관심 유전자 및 합성 시험관내 전사 촉진제 카세트의 이중 가닥 DNA 주형을 포함할 수 있다.
이들 방법 중 임의의 방법은 미세유체 경로 소자 상의 복수의 수용 포트와 유체 소통하는 복수의 유체 저장소를 밀봉하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
예를 들어, 미세유체 경로 소자와 밀봉 유체 소통하여 고정되도록 구성된 복수의 유체 저장소를 포함하는 시스템을 사용하여 시험관내 전사(IVT) 반응을 수행하는 자동화된 방법은 복수의 유체 저장소를 가압하는 단계; 하나 이상의 제1 유체 동력 회로를 사용하여 DNA 주형, 중합효소 및 뉴클레오티드를 복수의 유체 저장소의 유체 저장소 및 미세유체 경로 소자 상의 부위 중 하나 이상으로부터 미세유체 경로 소자의 하나 이상의 IVT 반응기에 서브마이크로리터 정밀도로 계량된 양으로 전달하는 단계; 하나 이상의 IVT 반응기에서 주형 물질 및 뉴클레오티드를 처리하여 치료학적 mRNA를 형성하는 단계; 및 제2 유체 동력 회로를 사용하여 치료학적 mRNA를 미세유체 경로 소자의 하나 이상의 정제 반응기 영역에 이송하고, 하나 이상의 정제 반응기 영역 내에서 2차원(2D) 정제에 의해 치료학적 mRNA를 정제하는 단계를 포함하며, 여기서 미세유체 경로 소자 및 복수의 유체 저장소는 밀폐 경로 및 밀봉 환경을 형성하여 대기 노출을 방지한다.
언급된 바와 같이, 본원에 설명된 이러한 방법들 중 임의의 방법을 수행하도록 구성된 소프트웨어 및/또는 펌웨어 또한 본원에 기술된다. 예를 들어, 시험관내 전사(IVT) 반응을 수행하기 위한 명령을 구현하는 비일시적 컴퓨터 판독가능 매체로서, 하나 이상의 미세유체 경로 소자와 밀봉 유체 소통하여 고정되도록 구성된 복수의 유체 저장소를 포함하는 시스템의 제어기에 의해 실행되는 경우 제어기로 하여금 주형 물질, 중합효소 및 뉴클레오티드를 반응 동안 언제든지 서브마이크로리터 정밀도로 계량된 양으로 복수의 유체 저장소로부터 미세유체 경로 소자의 제1 반응기에 공압에 의해 전달하는 단계; 제1 반응기의 주형 물질 및 뉴클레오티드를 처리하여 치료학적 mRNA를 형성하는 단계; 및 치료학적 mRNA를 미세유체 경로 소자를 통해 제1 반응기로부터 공압에 의해 이송하는 단계의 방법을 수행하게 하며, 여기서 제1 미세유체 경로 소자 및 복수의 유체 저장소는 밀폐 경로 및 밀봉 환경을 형성하는 대기 노출을 방지한다.
상기 언급된 바와 같이, 일부 변형에서 본원에 기술된 방법 및 장치는 예를 들어 치료학적 mRNA를 전달 비히클로 캡슐화하기 위해 치료학적 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 치료학적 mRNA)를 전달 비히클과 자동으로 조합함으로써 치료학적 조성물을 제형화(예를 들어, 화합)하는데 사용될 수 있다. 이는 본원에 기술된 바와 같은 장치 내에서 수행될 수 있으며, 일부 변형에서 주형 및/또는 치료학적 폴리뉴클레오티드를 형성하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 미세유체 경로 플레이트 소자와 밀봉 유체 소통되는 복수의 유체 저장소를 포함하는 시스템을 사용하여 치료학적 mRNA 조성물을 제조하는 방법으로서, 하나 이상의 미세유체 경로 플레이트 소자는 복수의 반응기를 포함하며, 상기 방법은 복수의 유체 저장소 중 하나 이상의 유체 저장소로부터 복수의 반응기 중 제1 반응기에 주형 전구체 물질을 전달하고, 주형 전구체 물질을 처리하여 주형 전구체 물질로부터 DNA 주형을 형성하는 단계; DNA 주형을 복수의 반응기 중 제2 반응기에 이송하고, 시험관내 전사에 의해 DNA 주형을 처리하여 치료학적 mRNA를 형성하는 단계; 치료학적 mRNA를 복수의 반응기 중 제3 반응기에 이송하고, 치료학적 mRNA를 처리하여 이를 전달 비히클과 조합하여 치료학적 mRNA 조성물을 형성하는 단계; 및 치료학적 mRNA 조성물을 제3 반응기와 유체 소통하는 농축기에 이송하는 단계를 포함할 수 있다. 치료학적 mRNA를 제3 반응기에 이송하는 단계가 mRNA 조성물을 형성하기 위해 전달 비히클과 다수의 상이한 치료학적 mRNA를 이송하는 것을 포함할 수 있다. 전달 및 이송 단계는 제어기에 의해 제어되는 시스템의 하나 이상의 유체 동력 회로에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 제어기는 하나 이상의 미세유체 경로 플레이트 소자 내에서 하나 이상의 탄성 층을 편향시킴으로써 유체 동력 회로를 제어할 수 있다. 방법은 치료 현장에서 수행될 수 있다.
이들 방법 중 임의의 방법 (및 이를 수행하는 시스템)은 동일한 미세유체 경로 소자에서 자동으로 (예를 들어, 전달 비히클로 캡슐화된 mRNA의) 치료학적 조성물을 투석하여 물질을 제거하고/거나 치료학적 조성물을 농축하도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 이들 방법 중 임의의 방법은 하나 이상의 미세유체 경로 플레이트 소자에서 mRNA 치료학적 조성물을 투석하여 mRNA 치료학적 조성물을 정제하는 것을 포함할 수 있다. 임의의 적절한 나노입자가 사용될 수 있다(예를 들어, 아미노-지질화된 펩토이드와 같은 양친매성 나노입자).
또한, 이들 방법 중 임의의 방법은 제2 반응기와 유체 소통하는 복수의 반응기 중 하나 이상 내에서 2차원(2D) 정제를 포함할 수 있다.
치료학적 mRNA 조성물을 제조하는 방법은 특히 공지된 기술 및 기법과 비교하여 신속할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기술된 방법은 합성 주형(예를 들어, 박테리아 전구체의 사용 없는 신규 합성)을 형성하는 것을 포함하여 치료학적 조성물(치료학적 mRNA 및 전달 비히클)을 형성하는데 5일 또는 그 미만(예를 들어, 4일 또는 그 미만, 72시간 또는 그 미만, 등)이 소요될 수 있다.
예를 들어, 하나 이상의 미세유체 경로 플레이트 소자와 밀봉 유체 소통되는 복수의 유체 저장소를 포함하는 시스템을 사용하여 치료학적 mRNA 조성물을 제조하는 방법으로서, 하나 이상의 미세유체 경로 플레이트 소자는 복수의 반응기를 포함하며, 방법은 복수의 유체 저장소를 가압하는 단계; 복수의 유체 저장소 중 하나 이상의 유체 저장소로부터 복수의 반응기 중 제1 반응기에 대기 접촉 없이 서브마이크로리터 정밀도로 주형 전구체 물질을 전달하도록 제1 유체 동력 회로를 제어하는 단계; 주형 전구체 물질을 처리하여 주형 전구체 물질로부터 DNA 주형을 형성하는 단계; DNA 주형을 복수의 반응기 중 제2 반응기에 서브마이크로리터 정밀도로 대기 접촉 없이 이송하도록 제2 유체 동력 회로를 제어하는 단계; 시험관내 전사에 의해 DNA 주형을 처리하여 치료학적 mRNA를 형성하는 단계; 치료학적 mRNA를 복수의 반응기 중 제3 반응기에 서브마이크로리터 정밀도로 대기 접촉 없이 이송하도록 제3 유체 동력 회로를 제어하는 단계; 치료학적 mRNA를 처리하여 이를 전달 비히클과 조합하여 치료학적 mRNA 조성물을 형성하는 단계; 치료학적 mRNA 조성물을 제3 반응기와 유체 소통하는 농축기에 이송하도록 제3 유체 동력 회로를 제어하는 단계; 및 치료학적 mRNA 조성물을 농축하는 단계를 포함할 수 있다.
본원에 기술된 방법 및 장치는 치료학적 폴리뉴클레오티드 조성물의 주문형 합성법을 제공하는데 사용될 수 있다. 일부 변형에서, 이들 방법은 구성요소의 일부를 원격으로 합성하고, 환자에게 이후에 전달될 수 있는 치료학적 폴리뉴클레오티드 조성물을 현장에서 합성하기 위한 장치를 사용하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 주문형 치료학적 폴리뉴클레오티드 조성물을 생성하는 방법으로서, 방법은 원격 시설에서 합성된 치료학적 폴리뉴클레오티드를 현장 시설에서 받는 단계; 대기 접촉으로부터 보호되는 자동화 시스템에서 치료학적 폴리뉴클레오티드를 시스템에 고정된 미세유체 경로 소자에서 전달 비히클과 조합하여 치료학적 폴리뉴클레오티드 조성물을 형성하는 단계, 치료학적 폴리뉴클레오티드 조성물을 미세유체 경로 소자에서 투석하는 단계를 수행함으로써 현장 시설에서 치료학적 폴리뉴클레오티드 조성물을 제형화시키는 단계; 및 치료학적 폴리뉴클레오티드 조성물을 제공하는 단계를 포함한다.
치료학적 폴리뉴클레오티드를 합성하는 단계는 대기 접촉으로부터 보호되는 밀폐 유체 경로 소자에서 합성 주형을 형성하는 단계, 합성 주형으로부터 시험관내 전사를 수행하여 치료학적 폴리뉴클레오티드를 형성하는 단계; 및 치료학적 폴리뉴클레오티드를 정제하는 단계를 수행함으로써 원격 시설에서 미세유체 시스템을 사용하여 치료학적 폴리뉴클레오티드를 합성하는 것을 포함할 수 있다.
예를 들어, 주문형 치료학적 mRNA 조성물을 생성하는 방법으로서, 상기 방법은 원격 시설에서 치료학적 mRNA를 합성하는 단계; 치료학적 mRNA를 현장 시설로 수송하는 단계; 대기 접촉으로부터 보호되는 자동화 밀폐 유체 경로 소자에서 치료학적 mRNA를 미세유체 경로 소자에서 전달 비히클과 조합하여 치료학적 mRNA 조성물을 형성하는 단계, 치료학적 mRNA 조성물을 미세유체 경로 소자에서 투석하는 단계를 수행함으로써 현장 시설에서 치료학적 mRNA 조성물을 제형화시키는 단계; 및 치료학적 mRNA 조성물을 제공하는 단계를 포함한다. 현장 시설은 병원 또는 클리닉이며, 일반적으로 본원에 기술된 바와 같은 하나 이상의 미세유체 제어 시스템을 포함한다. 일부 변형에서, 원격 시설은 하나 이상의 제조 시설(예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은 다중 미세유체 제어 시스템)을 포함할 수 있다.
본원에 기술된 방법은 치료학적 폴리뉴클레오티드 조성물을 농축하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
이들 방법 중 임의의 방법은 본원에 기술된 바와 같은 시스템을 이용하여 치료학적 폴리뉴클레오티드를 합성하고, 그 후 원격 시설로부터 현장 시설로 냉장 보관하면서 이들을 저장(예를 들어, 냉장 및/또는 냉동)하고 이송(예를 들어, 배송)하고, 현장 시설에서 치료학적 폴리뉴클레오티드(예를 들어, mRNA)를 받는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 치료학적 폴리뉴클레오티드 조성물은 mRNA 백신을 포함할 수 있다. 이들 방법 중 임의의 방법은 시스템을 사용하여 치료학적 폴리뉴클레오티드를 제형화하는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 시스템은 미세유체 경로 소자와 밀봉된 유체 소통하여 고정되도록 구성된 복수의 유체 저장소를 포함한다.
제1 유체 동력 회로는 치료학적 폴리뉴클레오티드를 전달 비히클과 조합하기 위해 대기 접촉 없이 서브마이크로리터 정밀도로 복수의 유체 저장소로부터 마이크로리터 경로 소자의 하나 이상의 반응기에 치료학적 폴리뉴클레오티드 및 전달 비히클을 전달하는데 사용될 수 있다.
언급된 바와 같이, 임의의 이들 치료학적 조성물은 동일한 (또는 상이한) 전달 비히클로 캡슐화된 다중 mRNA(비제한적으로 다중 치료학적 mRNA를 포함)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 현장 시설에서 치료학적 폴리뉴클레오티드 조성물을 형성하는 단계는 하나 이상의 추가의 치료학적 폴리뉴클레오티드를 치료학적 폴리뉴클레오티드 및 전달 비히클과 조합하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 본원에 기술된 것들을 포함하는 임의의 적절한 전달 비히클이 사용될 수 있다. 치료학적 폴리뉴클레오티드는 선형 mRNA, 원형 RNA 또는 자가-복제 RNA 등과 같은 mRNA일 수 있다.
치료학적 폴리뉴클레오티드는 방법 개월(예를 들어, 1개월 이상, 2개월 이상, 3개월 이상, 6개월 이상, 8개월 이상, 9개월 이상, 1년 이상 등) 동안 저온(예를 들어, 4도, 0도, -10도 등)에서 안정적일 수 있으며, 원격 또는 현장 저장될 수 있다. 예를 들어, 이들 방법은 치료학적 조성물을 제형화하기 전에 현장 시설에서 치료학적 폴리뉴클레오티드를 저장하는 것을 포함할 수 있다.
예를 들어, 하나 이상의 미세유체 경로 소자와 밀봉 유체 소통하여 고정되도록 구성된 복수의 보관 저장소를 포함하는 밀폐 경로 시스템을 사용하여 mRNA 치료학적 조성물을 제조하는 방법으로서, 상기 방법은 대기 접촉으로부터 보호되는 밀폐된 유체 경로에서 하나 이상의 미세유체 소자 상의 복수의 반응기 및 복수의 보관 저장소 중 하나 이상의 보관 저장소 사이에 시약을 수송하여, 하나 이상의 미세유체 경로 소자에서 DNA 주형을 형성하는 단계, 주형으로부터의 치료학적 mRNA의 시험관내 전사를 수행하는 단계, 치료학적 mRNA를 정제하는 단계, mRNA를 전달 비히클과 조합하는 단계 각각을 수행하는 것을 포함한다.
하나 이상의 미세유체 경로 소자와 밀봉 유체 소통하여 고정되도록 구성된 복수의 보관 저장소를 포함하는 밀폐 경로 시스템을 사용하여 mRNA 치료학적 조성물을 제조하는 방법(여기서 하나 이상의 미세유체 경로 소자는 복수의 반응기를 포함함)은 주형 전구체 물질을 하나 이상의 보관 저장소로부터 복수의 반응기 중 제1 반응기에 전달하고, 주형 전구체 물질을 처리하여 주형 전구체 물질로부터 주형을 제조하는 단계; 주형을 복수의 반응기 중 제2 반응기 영역에 이송하고, 시험관내 전사에 의해 주형을 처리하여 치료학적 mRNA를 형성하는 단계; 및 치료학적 mRNA를 복수의 반응기 중 제3 반응기 영역에 이송하고, 치료학적 mRNA를 처리하여 이를 전달 비히클과 조합하여 mRNA 치료학적 조성물을 형성하는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 물질은 주형 전구체 물질을 포함하며, 전달 비히클은 대기 접촉 없이 보관 저장소로부터 복수의 반응기로 전달된다.
하나 이상의 미세유체 경로 소자와 밀봉 유체 소통하는 복수의 보관 저장소를 포함하는 밀폐 경로 시스템을 사용하여 mRNA 치료학적 조성물을 제조하는 방법(여기서 하나 이상의 미세유체 경로 소자는 복수의 반응기를 포함함)은 주형 전구체 물질을 하나 이상의 보관 저장소로부터 복수의 반응기 중 제1 반응기에 이송하도록 유체 흐름을 유도하고, 주형 전구체 물질을 처리하여 주형 전구체 물질로부터 주형을 제조하는 단계; 주형을 복수의 반응기 중 제2 반응기 영역에 이송하고, 시험관내 전사에 의해 주형을 처리하여 치료학적 mRNA를 형성하는 단계; mRNA를 복수의 반응기 중 제3 반응기 영역에 이송하고, mRNA를 처리하여 이를 전달 비히클과 조합하여 mRNA 치료학적 조성물을 형성하는 단계; 및 mRNA 생성물을 하나 이상의 보관 저장소의 저장소에 이송하는 단계로서, 여기서 물질은 보관 저장소로부터 미세유체 경로 소자의 반응기로 서브마이크로리터 정밀도로 대기 접촉 없이 전달되는 단계를 포함한다. 본원에 기술된 임의의 방법에서, 임의의 단계는 공압에 의해 수행될 수 있으며, 예를 들어 유체 흐름은 공압에 의해 유도될 수 있으며, 유체는 공압 등등에 의해 전달될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 유체는 기계식, 유압식 등에 의해 구동될 수 있다.
이들 방법 중 임의의 방법 (및 이를 수행하기 위한 장치)에서, 밀폐 경로 시스템은 주형을 형성하는 단계, 주형으로부터 치료학적 mRNA의 시험관내 전사를 수행하는 단계, 치료학적 mRNA를 정제하는 단계 및 mRNA와 전달 비히클을 조합하는 단계를 자동으로 연속적으로 수행할 수 있다. 밀폐 경로 시스템은 주형을 형성하는 단계, 주형으로부터 치료학적 mRNA의 시험관내 전사를 수행하는 단계, 치료학적 mRNA를 정제하는 단계 및 mRNA를 전달 비히클과 조합하는 단계의 수행을 공압에 의해 제어할 수 있다. 일부 변형에서, 밀페 경로 시스템은 주형을 형성하는 단계, 주형으로부터 치료학적 mRNA의 시험관내 전사를 수행하는 단계, 치료학적 mRNA를 정제하는 단계 및 하나 이상의 미세유체 경로 소자 내에서 하나 이상의 멤브레인을 편향시킴으로써 mRNA를 전달 비히클과 조합하는 단계의 수행을 공압에 의해 제어한다.
여기에 설명된 방법 및 장치 중 임의의 것은 병원, 클리닉 등과 같은 치료 현장에서 설정 및 작동하도록 구성될 수 있다. 이를 통해 즉각적인/주문형, 환자별 치료제가 특정 환자에 맞춤형으로 제조될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 특정 환자에 특정하지 않은 치료학적 분자는 "환자-개별화" 방식으로 전달 비히클과 제형화될 수 있다. 본원에 설명된 방법 및 장치로 인해 이러한 방법 중 임의의 방법이 매우 빠르게 수행될 수 있다. 예를 들어, 밀폐 경로 시스템은 주형을 형성하는 단계, 주형으로부터 치료학적 mRNA의 시험관내 전사를 수행하는 단계, 치료학적 mRNA를 정제하는 단계 및 mRNA와 전달 비히클을 5일 미만에 조합하는 단계를 자동으로 연속적으로 수행할 수 있다. 대안으로, 시스템은 미리 만들어진 주형을 투입물로서 사용하고, 더 짧은 시간에 나머지 단계를 수행할 수 있다.
mRNA를 전달 비히클과 조합하는 것(치료제를 제형화함)은 mRNA 치료학적 조성물을 정제하기 위해 하나 이상의 미세유체 경로 소자 상의 mRNA 치료학적 조성물을 투석하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
이들 방법 중 임의의 방법은 하나 이상의 미세유체 경로 소자에 mRNA 치료학적 조성물을 농축시키고/거나 치료제를 투석하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
예를 들어, 양친매성 나노입자를 포함하는 임의의 적절한 전달 비히클이 사용될 수 있다. 예를 들어, 양친매성 나노입자는 아미노-지질화된 펩토이드를 포함할 수 있다.
대안적으로 또는 추가적으로, 본원에 기술된 임의의 방법 및 장치에서, mRNA는 미리 만들어지고 일정 시간 동안 (예를 들어, 10℃, 4℃, 0℃, -10℃ 등에서) 저장될 수 있다. 예를 들어, 이를 수행하기 위한 이들 방법 및 장치 중 임의의 것은 개별적으로 또는 집합적으로 화합되어 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6개 등 또는 그 초과의 개별적 치료학적 mRNA가 조합되어) mRNA 치료학적 조성물을 형성할 수 있는 치료학적 mRNA의 라이브러리를 포함할 수 있다. 본원에 기술된 바와 같이, mRNA 치료학적 조성물은 따라서 요구에 따라 제조될 수 있고, 단일 또는 다중 mRNA 치료학적 조성물 "칵테일"로 적시에 제형화될 수 있다.
주형(예를 들어, DNA 주형)을 형성하는 방법이 본원에 또한 기술되어 있다. 예를 들어, 미세유체 경로 소자와 밀봉 유체 소통되어 복수의 보관 저장소를 포함하는 밀폐 경로 시스템을 사용하여 시험관내 전사를 위한 합성 이중 가닥 DNA 주형을 제조하는 방법은 합성 관심 유전자를 합성 시험관내 전사 촉진제 카세트와 결합시켜 합성 선형 또는 원형의 결찰된 생성물을 생성하는 단계; 미반응된 합성 관심 유전자 및 미반응된 합성 시험관내 전사 촉진제 카세트를 합성 선형 또는 원형의 결찰된 생성물로부터 제거하는 단계; 원형의 결찰된 생성물을 증폭하여 선형, 분지형 또는 원형의 증폭된 DNA를 생성하는 단계; 및 증폭된 DNA 결합된 생성물을 선형화시켜 이중 가닥 DNA 주형을 생성하는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 결합, 제거, 증폭 및 선형 단계 각각은 밀폐 경로 시스템에 의해 미세유체 경로 소자에서 수행된다.
예를 들어, 시험관내 전사를 위한 합성 이중 가닥 DNA 주형을 제조하는 고효율 자동화 방법은 합성 관심 유전자 및 합성 시험관내 전사 촉진제 카세트 각각을 미세유체 경로 소자와 유체 소통하는 복수의 보관 저장소의 하나 이상의 보관 저장소로부터 미세유체 경로 소자의 결찰 반응기에 공압에 의해 전달하여, 합성 관심 유전자를 합성 시험관내 전사 촉진제 카세트와 결합시킴으로써 합성 선형 또는 원형 결찰된 생성물을 생성시키는 단계; 하나 이상의 엑소뉴클레아제 제제를 복수의 보관 저장소의 하나 이상의 보관 저장소로부터 결찰 반응기에 공압에 의해 도입하여 합성 선형 또는 원형 결찰된 생성물로부터 미반응된 합성 관심 유전자 및 미반응된 합성 시험관내 전사 촉진제 카세트를 제거하는 단계; 합성 선형 또는 원형의 결찰된 생성물을 미세유체 경로 소자의 증폭 반응기에 공압에 의해 전달하여 선형 또는 원형의 결찰된 생성물을 증폭시키기 위한 하나 이상의 증폭제와 조합하여 선형, 분지형 또는 원형의 증폭된 DNA를 생성하는 단계; 및 증폭된 DNA 결찰된 생성물을 미세유체 경로 소자의 분해 반응기에 공압에 의해 이송하여 증폭된 DNA 결찰된 생성물을 선형화시킴으로써 임의의 미반응된 투입 물질을 비함유하는 완전한 합성의 이중 가닥 DNA 주형을 생성하는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 결찰 반응기, 증폭 반응기 및 분해 반응기 및 복수의 보관 저장소는 밀폐 경로 및 밀봉 환경을 형성한다.
(하나 이상의 미세유체 경로 소자와 밀봉 유체 소통하여 고정되도록 구성된 복수의 유체 저장소를 포함하는 밀폐 경로 시스템을 사용하여) mRNA 치료학적 조성물을 위한 합성 이중 가닥 DNA 주형을 제조하는 방법은 대기 접촉으로부터 보호되는 밀폐된 유체 경로에서 하나 이상의 미세유체 소자 상의 복수의 반응기와 복수의 보관 저장소 중 하나 이상의 보관 저장소 사이에 시약을 수송하여 하나 이상의 미세유체 경로 소자에서 치료학적 mRNA의 시험관내 전사를 위한 주형을 형성하는 것을 포함할 수 있다.
일반적으로, 본원에 기술된 방법 및 장치는 박테리아 DNA 비함유 및/또는 내독소 비함유일 수 있는 이중 가닥 DNA 주형을 생성할 수 있다. 본원에 설명된 주형 생성 방법 및 장치는 박테리아 배양물을 포함하지 않을 수 있다. 또한, 본원에 기술된 바와 같이 제조된 치료학적 mRNA는 박테리아 폴리뉴클레오티드를 사용하지 않고 주형으로부터 합성될 수 있다. 따라서, 본원에 기술된 임의의 방법은 박테리아 DNA 사용 없이 및/또는 내독소로부터 분리된 치료학적 mRNA를 생성하는 방법일 수 있다. 특히, 박테리아 DNA 및/또는 내독소 비함유 이중 가닥 DNA 주형을 제조하는 방법이 본원에 기술되어 있다. 본원에 기술된 임의의 방법은 무균 제조 방법일 수 있다.
이들 방법 중 임의의 방법은 합성 시험관내 전사 주형을 타입 IIS 제한 효소 및/또는 메틸화 민감성 제한 효소로 분해하는 것을 포함할 수 있다. 결합은 DNA 리가제로의 결찰 또는 DNA 합성에 의한 결찰 또는 프라이머 확장에 의한 결찰을 포함할 수 있다. 제거는 엑소뉴클레아제 또는 메틸화 민감성 제한 효소에 의한 선형 DNA 분해를 포함할 수 있다. 엑소뉴클레아제는 뉴클레아제 V를 포함할 수 있다. 증폭은 다중 변위 증폭(MDA)을 포함할 수 있다. 증폭은 Φ29 DNA 중합효소로의 증폭을 포함할 수 있다. 증폭은 분지된 증폭된 DNA를 생성하는 것을 포함할 수 있다. 증폭은 중합효소 연쇄 증폭(PCR)을 포함할 수 있다. 증폭은 열안정성 DNA 중합효소로 증폭하는 것을 포함할 수 있다.
선형화는 타입 II 제한 효소로의 분해를 포함할 수 있다. 선형화는 BsaI 제한 효소로의 분해를 포함할 수 있다. 합성 시험관내 전사 주형의 분해는 DpnI와 같은 메틸화 민감성 제한 효소로의 분해를 포함할 수 있다. 합성 관심 유전자는 선형일 수 있다. 일부 변형에서, 합성 시험관내 전사 촉진제 카세트는 프로모터; 5' UTR; 절단 가능한 링커; 3' UTR; 및 연속적으로 적어도 200개의 아데닌 잔기 또는 200개의 티미딘 잔기를 포함하는 폴리A 영역을 인코딩하는 부분을 포함하는 이중 가닥 DNA 주형을 포함한다. 합성 시험관내 전사 촉진제 카세트는 단일 단위체 또는 2개 이상의 단위체로서 전달될 수 있다. 폴리A 영역을 인코딩하는 부분은 길이가 적어도 300 bp일 수 있다. 일부 변형에서, 폴리A 영역을 인코딩하는 부분은 길이가 적어도 350 bp일 수 있다.
합성 관심 유전자는 T-세포 수용체의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 합성 관심 유전자는 상보성 결정 영역(CDR)을 포함할 수 있다.
시험관내 전사 촉진제 카세트의 길이는 2 kb 미만일 수 있다. 시험관내 전사 촉진제 카세트는 길이가 1 kb 미만일 수 있다. 시험관내 전사 촉진제 카세트의 길이는 700 염기쌍 미만일 수 있다. 합성 시험관내 전사 촉진제 카세트는 항생제 내성 유전자를 인코딩하지 않을 수 있다.
합성 선형 또는 원형 결찰 생성물은 복제 기점(ORI)을 가지지 않을 수 있다. 시험관내 전사 촉진제 카세트에는 복제 기점(ORI)을 가지지 않을 수 있다.
언급된 바와 같이, 본원에 기술된 임의의 방법의 단계는 밀폐된 미세유체 경로 소자에서 수행될 수 있다. 단계는 밀폐된 미세유체 경로 소자에서 수행될 수 있으며, 결합 단계는 증폭 단계와 상이한 모듈(예를 들어, 상이한 미세유체 경로 소자)로 수행될 수 있으며, 증폭 단계는 선형화 단계와 상이한 모듈에서 수행될 수 있다.
이들 방법 중 임의의 방법은 하나 이상의 미세유체 경로 소자의 밀폐된 경로에서 주형을 정제하는 단계를 포함할 수 있다.
본원에 기술된 밀폐 경로 방법 및 장치를 사용하는 시험관내 전사를 수행하는 방법이 또한 본원에 기술된다. 예를 들어, (예를 들어, 하나 이상의 미세유체 경로 소자와 밀봉 유체 소통하여 고정되도록 구성된 복수의 보관 저장소를 포함하는) 밀폐된 경로 시스템을 사용하여 시험관내 전사(IVT) 반응을 수행하는 방법은 대기 접촉으로부터 보호되는 밀폐 유체 경로에서 하나 이상의 미세유체 소자 상의 복수의 반응기와 복수의 보관 저장소 중 하나 이상의 보관 저장소 사이에 시약을 수송하여 하나 이상의 미세유체 경로 소자에서 주형으로부터의 치료학적 mRNA의 시험관내 전사를 수행하는 것을 포함할 수 있다.
시험관내 전사(IVT) 반응을 수행하는 방법은 복수의 보관 저장소로부터 미세유체 경로 소자의 제1 반응기에 안내된 유체 흐름을 통한 DNA 주형, 중합효소 및 뉴클레오티드를 서브마이크로리터 정밀도로 계량된 양으로 자동으로 전달하는 단계; 제1 반응기에서 주형 물질 및 뉴클레오티드를 처리하여 치료학적 mRNA를 형성하는 단계; 및 제1 반응기로부터 미세유체 경로 소자를 통해 치료학적 mRNA를 공압에 의해 이송하는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 제1 미세유체 경로 소자 및 복수의 보관 저장소는 밀폐 경로 및 밀봉 환경을 형성하여 대기 노출을 방지한다.
밀폐 경로 시스템은 자동으로 지속적으로 작동할 수 있다. 밀폐된 경로 시스템은 주형으로부터 치료학적 mRNA의 시험관내 전사의 성능을 공압에 의해 제어할 수 있다.
이들 방법 중 임의의 방법은 또한 하나 이상의 미세유체 소자에서 치료학적 mRNA를 정제하는 단계를 포함할 수 있다. 시약 수송은 복수의 보관 저장소로부터 미세유체 경로 소자의 제1 반응기에 시약을 수송하는 단계를 포함할 수 있다.
또한, 치료학적 mRNA를 제형화(예를 들어, 전달 비히클과 조합)하는 방법이 본원에 기술된다. 예를 들어, (예를 들어, 하나 이상의 미세유체 경로 소자와 밀봉 유체 소통하여 고정되도록 구성된 복수의 보관 저장소를 포함하는 밀폐된 경로 시스템을 사용하여) mRNA 치료학적 조성물을 제조하는 방법은 대기 접촉으로부터 보호되는 밀폐 유체 경로의 하나 이상의 미세유체 소자 상의 복수의 반응기와 복수의 보관 저장소 중 하나 이상의 보관 저장소 사이에 시약을 수송하여 하나 이상의 미세유체 경로 소자에서 전달 비히클과 치료학적 mRNA를 조합함으로써 mRNA 치료학적 조성물을 제형화하는 것을 포함할 수 있다. 밀폐 경로 시스템은 mRNA와 전달 비히클을 자동으로 연속적으로 조합할 수 있다. 밀폐 경로 시스템은 mRNA를 전달 비히클과 조합하는 것을 공압에 의해 제어할 수 있다. 예를 들어, 밀폐 경로 시스템은 하나 이상의 미세유체 경로 소자 내에서 하나 이상의 멤브레인을 편향시킴으로써 전달 비히클과 mRNA를 조합하는 것을 공압에 의해 제어할 수 있다.
mRNA를 전달 비히클과 조합하는 것은 하나 이상의 미세유체 경로 소자에서 mRNA 치료학적 조성물을 투석하여 mRNA 치료학적 조성물을 정제하고/거나 하나 이상의 미세유체 경로 소자 상의 mRNA 치료학적 조성물을 농축하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
예를 들어, 하나 이상의 미세유체 경로 소자와 밀봉 유체 소통하여 고정되도록 구성된 복수의 보관 저장소를 포함하는 시스템을 사용하여 mRNA를 제조하는 방법이 본원에 기술된다. 이들 방법 중 임의의 방법은 대기 접촉으로부터 보호되는 밀폐된 유체 경로에서 하나 이상의 미세유체 소자 상의 복수의 반응기와 복수의 보관 저장소 중 하나 이상의 보관 저장소 사이에 시약을 수송하여, 하나 이상의 미세유체 경로 소자에서 주형을 형성하는 단계, 주형으로부터 mRNA의 시험관내 전사를 수행하는 단계 및 mRNA를 정제하는 단계 중 하나 이상을 수행하는 것을 포함할 수 있다.
하나 이상의 미세유체 경로 소자와 밀봉 유체 소통하여 고정되도록 구성된 복수의 보관 저장소를 포함하는 시스템을 사용하여 치료학적 mRNA 조성물을 제조하는 방법은 대기 접촉으로부터 보호되는 밀폐된 유체 경로에서 하나 이상의 미세유체 소자 상의 복수의 반응기 및 복수의 보관 저장소 중 하나 이상의 보관 저장소 사이에 시약을 수송하여, 하나 이상의 미세유체 경로 소자에서 주형을 형성하는 단계, 주형으로부터 치료학적 mRNA의 시험관내 전사를 수행하는 단계, 치료학적 mRNA를 정제하는 단계 및 mRNA를 전달 비히클과 제형화시키는 단계 중 하나 이상을 수행하는 것을 포함할 수 있다.
하나 이상의 미세유체 경로 소자와 밀봉 유체 소통하여 고정되도록 구성된 복수의 보관 저장소를 포함하는 시스템을 사용하여 치료학적 mRNA 조성물을 제조하는 방법은 대기 접촉으로부터 보호되는 밀폐된 유체 경로에서 하나 이상의 미세유체 소자 상의 복수의 반응기와 복수의 보관 저장소 중 하나 이상의 보관 저장소 사이에 시약을 수송하여, 하나 이상의 미세유체 경로 소자에서 주형을 형성하는 단계, 주형으로부터 치료학적 mRNA의 시험관내 전사를 수행하는 단계, 치료학적 mRNA를 정제하는 단계, mRNA를 전달 비히클과 제형화시키는 단계 및 제형화된 치료학적 mRNA의 투석 및 농축을 수행하는 단계 중 하나 이상을 수행하는 것을 포함할 수 있다.
하나 이상의 미세유체 경로 소자와 밀봉 유체 소통하여 고정되도록 구성된 복수의 보관 저장소를 포함하는 시스템을 사용하여 치료학적 mRNA 조성물을 제조하는 방법은 비일시적 컴퓨터 판독가능 매체에 인코딩되는 치료학적 mRNA를 형성하는 일련의 단계를 따르는 것을 포함할 수 있으며, 여기서 단계는 대기 접촉으로부터 보호되는 밀폐된 유체 경로에서 하나 이상의 미세유체 소자 상의 복수의 반응기와 복수의 보관 저장소 중 하나 이상의 보관 저장소 사이에 시약을 수송하여, 하나 이상의 미세유체 경로 소자에서 주형을 형성하는 단계, 주형으로부터 치료학적 mRNA의 시험관내 전사를 수행하는 단계, 치료학적 mRNA를 정제하는 단계 및 mRNA를 전달 비히클과 조합시키는 단계 중 하나 이상을 수행하는 것을 포함한다.
또한, 미세유체 경로 소자와 밀봉 유체 소통하여 고정되도록 구성된 복수의 보관 저장소를 포함하는 시스템을 사용하여 치료학적 mRNA 조성물을 제조하는 방법이 본원에 기술되며, 방법은 미세유체 경로 소자 상의 주형으로부터 치료학적 mRNA의 시험관내 전사를 수행하는 단계 및 미세유체 경로 소자 상의 하나 이상의 유체 연결된 반응기에서 치료학적 mRNA를 정제하는 단계를 포함한다.
또한, 특히 mRNA 치료제를 포함하는 이들 방법 중 임의의 방법에 의해 제조된 치료제가 본원에 기술된다. 예를 들어, 하나 이상의 미세유체 경로 소자와 밀봉 유체 소통하여 고정되도록 구성된 복수의 보관 저장소를 포함하는 시스템을 사용하여 제조된 치료학적 mRNA가 본원에 기술되며, mRNA는 대기 접촉으로부터 보호되는 밀폐된 유체 경로에서 하나 이상의 미세유체 소자 상의 복수의 반응기와 복수의 보관 저장소 중 하나 이상의 보관 저장소 사이에 시약을 수송하여, 하나 이상의 미세유체 경로 소자에서 주형을 형성하는 단계, 주형으로부터 mRNA의 시험관내 전사를 수행하는 단계 및 mRNA를 정제하는 단계 중 하나 이상을 수행함으로써 제조된다.
예를 들어, 하나 이상의 미세유체 경로 소자와 밀봉 유체 소통하여 고정되도록 구성된 복수의 보관 저장소를 포함하는 시스템을 사용하여 제조된 치료학적 mRNA이 본원에 기술되며, mRNA는 대기 접촉으로부터 보호되는 밀폐된 유체 경로에서 하나 이상의 미세유체 소자 상의 복수의 반응기와 복수의 보관 저장소 중 하나 이상의 보관 저장소 사이에 시약을 수송하여, 하나 이상의 미세유체 경로 소자에서 주형을 형성하는 단계, 주형으로부터 치료학적 mRNA의 시험관내 전사를 수행하는 단계, 치료학적 mRNA를 정제하는 단계 및 mRNA를 전달 비히클과 제형화시키는 단계 중 하나 이상을 수행함으로써 제조된다.
예를 들어, 하나 이상의 미세유체 경로 소자와 밀봉 유체 소통하여 고정되도록 구성된 복수의 보관 저장소를 포함하는 시스템을 사용하여 제조된 치료학적 mRNA이 본원에 기술되며, mRNA는 대기 접촉으로부터 보호되는 밀폐된 유체 경로에서 하나 이상의 미세유체 소자 상의 복수의 반응기 및 복수의 보관 저장소 중 하나 이상의 보관 저장소 사이에 시약을 수송하여, 하나 이상의 미세유체 경로 소자에서 주형을 형성하는 단계, 주형으로부터 치료학적 mRNA의 시험관내 전사를 수행하는 단계, 치료학적 mRNA를 정제하는 단계, mRNA를 전달 비히클과 제형화시키는 단계 및 제형화된 치료학적 mRNA의 투석 및 농축을 수행하는 단계 중 하나 이상을 수행함으로써 제조된다.
비일시적 컴퓨터 판독가능 매체에 인코딩되는 치료학적 mRNA를 형성하는 일련의 단계에 따라 하나 이상의 미세유체 경로 소자와 밀봉 유체 소통하여 고정되도록 구성된 복수의 보관 저장소를 포함하는 시스템을 사용하여 형성된 치료학적 mRNA 조성물이 본원에 기술되며, 여기서 단계는 대기 접촉으로부터 보호되는 밀폐된 유체 경로에서 하나 이상의 미세유체 소자 상의 복수의 반응기와 복수의 보관 저장소 중 하나 이상의 보관 저장소 사이에 시약을 수송하여, 하나 이상의 미세유체 경로 소자에서 주형을 형성하는 단계, 주형으로부터 치료학적 mRNA의 시험관내 전사를 수행하는 단계, 치료학적 mRNA를 정제하는 단계 및 mRNA를 전달 비히클과 조합시키는 단계 중 하나 이상을 수행하는 것을 포함한다. 예를 들어, 치료학적 mRNA는 미세유체 경로 소자와 밀봉 유체 소통하여 고정되도록 구성된 복수의 보관 저장소를 포함하는 시스템을 사용하여 형성된 치료학적 mRNA 조성물일 수 있으며, 상기 방법은 미세유체 경로 소자 상의 주형으로부터 치료학적 mRNA의 시험관내 전사를 수행하는 단계 및 미세유체 경로 소자 상의 하나 이상의 유체 연결된 반응기에서 치료학적 mRNA를 정제하는 단계를 포함한다.
본원에 기술된 임의의 시스템은 임의의 이러한 방법을 수행하도록 구성된 제어기를 포함할 수 있다. 따라서, 본원에 기술된 임의의 방법을 수행하도록 구성된 소프트웨어, 펌웨어 또는 하드웨어가 또한 본원에 기술된다. 예를 들어, mRNA를 제조하기 위한 명령을 구현하는 비일시적 컴퓨터 판독가능 매체가 본원에 기술되며, 하나 이상의 미세유체 경로 소자와 밀봉 유체 소통하여 고정되도록 구성된 복수의 보관 저장소를 포함하는 시스템의 제어기에 의해 실행되는 경우, 제어기로 하여금 대기 접촉으로부터 보호되는 밀폐된 유체 경로에서 하나 이상의 미세유체 소자 상의 복수의 반응기와 복수의 보관 저장소 중 하나 이상의 보관 저장소 사이에 시약을 수송하여, 하나 이상의 미세유체 경로 소자에서 주형을 형성하는 단계, 주형으로부터 mRNA의 시험관내 전사를 수행하는 단계 및 mRNA를 정제하는 단계 중 하나 이상을 수행하는 방법을 수행하게 한다.
예를 들어, 치료학적 mRNA 조성물을 포함하는 mRNA를 제조하기 위한 명령을 구현하는 비일시적 컴퓨터 판독가능 매체가 본원에 설명되며, 하나 이상의 미세유체 경로 소자와 밀봉 유체 소통하여 고정되도록 구성된 복수의 보관 저장소를 포함하는 시스템의 제어기에 의해 실행되는 경우 제어기로 하여금 본원에 기술된 임의의 방법을 수행하게 한다.
하나 이상의 미세유체 경로 소자와 밀봉 유체 소통하여 고정되도록 구성된 복수의 보관 저장소를 포함하는 밀폐 경로 시스템을 사용하여 mRNA를 위한 합성 이중 가닥 DNA 주형을 제조하는 방법이 또한 본원에 기술되며, 이는 대기 접촉으로부터 보호되는 밀폐된 유체 경로에서 하나 이상의 미세유체 소자 상의 복수의 반응기와 복수의 보관 저장소 중 하나 이상의 보관 저장소 사이에 시약을 수송하여 시약을 조합하는 단계; 및 치료학적 mRNA의 시험관내 전사를 위한 주형을 형성하는 단계를 포함할 수 있다.
예를 들어, 밀폐 경로 시스템을 사용하여 mRNA 시험관내 전사 반응으로의 유입물로서 사용하기 위한 합성 이중 가닥 DNA 주형을 제조하는 방법은 하나 이상의 미세유체 경로 소자와 밀봉 유체 소통하여 고정되도록 구성된 복수의 보관 저장소를 포함할 수 있으며, 상기 방법은 대기 접촉으로부터 보호되는 밀폐된 유체 경로에서 하나 이상의 미세유체 소자 상의 복수의 반응기와 복수의 보관 저장소 중 하나 이상의 보관 저장소 사이에 시약을 수송하는 단계; 및 치료학적 mRNA의 시험관내 전사를 위한 주형을 형성하는 단계를 포함한다.
하나 이상의 미세유체 경로 소자와 밀봉 유체 소통하여 고정되도록 구성된 복수의 보관 저장소를 포함하는 시스템을 사용하여 mRNA 조성물을 제조하는 방법으로서, 여기서 하나 이상의 미세유체 경로 소자는 복수의 반응기를 포함하며, 상기 방법은 주형 전구체 물질을 하나 이상의 보관 저장소로부터 복수의 반응기 중 제1 반응기에 전달하고, 주형 전구체 물질을 처리하여 주형 전구체 물질로부터 주형을 제조하는 단계; 주형을 복수의 반응기 중 제2 반응기 영역에 이송하고, 주형을 시험관내 전사에 의해 처리하여 mRNA를 형성하는 단계; 및 mRNA를 복수의 반응기 중 제3 반응기 영역에 이송하고, mRNA를 처리하여 이를 전달 비히클과 조합하여 mRNA 조성물을 형성하는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 물질은 주형 물질을 포함하며, 전달 비히클은 대기 접촉 없이 보관 저장소로부터 복수의 반응기로 전달된다.
하나 이상의 미세유체 경로 소자와 밀봉 유체 소통하는 복수의 보관 저장소를 포함하는 시스템을 사용하여 mRNA 조성물을 제조하는 방법으로서, 여기서 하나 이상의 미세유체 경로 소자는 복수의 반응기를 포함하며, 상기 방법은 주형 전구체 물질을 하나 이상의 보관 저장소로부터 복수의 반응기 중 제1 반응기 영역에 공압에 의해 전달하고, 주형 전구체 물질을 처리하여 주형 전구체 물질로부터 주형을 제조하는 단계; 주형을 복수의 반응기 중 제2 반응기 영역에 공압에 의해 이송하고, 주형을 시험관내 전사에 의해 처리하여 mRNA를 형성하는 단계; mRNA를 복수의 반응기 중 제3 반응기 영역에 공압에 의해 이송하고, mRNA를 처리하여 이를 전달 비히클과 조합하여 치료학적 mRNA 조성물을 형성하는 단계; 및 mRNA 생성물을 하나 이상의 보관 저장소에 이송하는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 물질은 보관 저장소로부터 미세유체 경로 소자의 반응기로 서브마이크로리터 정밀도로 대기 접촉 없이 전달된다.
미세유체 경로 소자와 밀봉 유체 소통되어 복수의 보관 저장소를 포함하는 밀폐 경로 시스템을 사용하여 시험관내 전사를 위한 합성 이중 가닥 DNA 주형을 제조하는 방법은 합성 관심 유전자를 합성 시험관내 전사 촉진제 카세트와 결합시켜 합성 선형 또는 원형의 결찰된 생성물을 생성하는 단계; 미반응된 합성 관심 유전자 및 미반응된 합성 시험관내 전사 촉진제 카세트를 합성 선형 또는 원형의 결찰된 생성물로부터 제거하는 단계; 선형 또는 원형의 결찰된 생성물을 증폭하여 선형, 분지형 또는 원형의 증폭된 DNA를 생성하는 단계; 및 증폭된 DNA 결찰된 생성물을 선형화시켜 이중 가닥 DNA 주형을 생성하는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 결합, 제거, 증폭 및 선형 단계 각각은 밀폐 경로 시스템에 의해 미세유체 경로 소자에서 수행된다.
이들 방법 중 임의의 방법은 시험관내 전사를 위한 합성 이중 가닥 DNA 주형을 제조하는 고효율의 자동화된 방법을 포함하는 고효율의 자동화된 방법일 수 있다. 예를 들어, 방법은 합성 관심 유전자 및 합성 시험관내 전사 촉진제 카세트 각각을 미세유체 경로 소자와 유체 소통하는 복수의 보관 저장소 중 하나 이상의 보관 저장소로부터 미세유체 경로 소자의 결찰 반응기에 공압에 의해 전달하여 합성 관심 유전자를 합성 시험관내 전사 촉진제 카세트와 결합시킴으로써 합성 선형 또는 원형 결찰된 생성물을 생성하는 단계; 하나 이상의 엑소뉴클레아제 제제를 복수의 보관 저장소 중 하나 이상의 보관 저장소로부터 결찰 반응기에 공압에 의해 도입하여 합성 선형 또는 원형 결찰된 생성물로부터 미반응된 합성 관심 유전자 및 미반응된 합성 시험관내 전사 촉진제 카세트를 제거함으로써 미반응 물질을 제거하는 단계; 합성 선형 또는 원형의 결찰된 생성물을 미세유체 경로 소자의 다중 변위 증폭 (MDA) 또는 중합효소 연쇄 반응(PCR) 반응기에 공압에 의해 전달하여 선형 또는 원형의 결찰된 생성물을 증폭시키기 위한 하나 이상의 증폭 제제와 조합하여 선형, 분지형 또는 원형의 증폭된 DNA를 생성하는 단계; 및 증폭된 DNA 결찰된 생성물을 미세유체 경로 소자의 분해 반응기에 공압에 의해 이송하여 증폭된 DNA 결찰된 생성물을 선형화시킴으로써 이중 가닥 DNA 주형을 생성하는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 결찰 반응기, MDA 또는 PCR 반응기 및 분해 반응기 및 복수의 보관 저장소는 밀폐 경로 및 밀봉 환경을 형성한다.
시험관내 전사를 위한 합성 이중 가닥 DNA 주형을 제조하는 방법으로서, 방법은 비일시적 컴퓨터 판독가능 매체에서 인코딩되는 일련의 단계를 따르는 것을 포함하며, 합성 관심 유전자 및 합성 시험관내 전사 촉진제 카세트 각각을 미세유체 경로 소자와 유체 소통하는 복수의 보관 저장소 중 하나 이상의 보관 저장소로부터 미세유체 경로 소자의 결찰 반응기에 전달하여 합성 관심 유전자를 합성 시험관내 전사 촉진제 카세트와 결합시킴으로써 합성 선형 또는 원형 결찰된 생성물을 생성하는 단계; 하나 이상의 엑소뉴클레아제 제제를 복수의 보관 저장소 중 하나 이상의 보관 저장소로부터 결찰 반응기에 도입하여 합성 선형 또는 원형 결찰된 생성물로부터 미반응된 합성 관심 유전자 및 미반응된 합성 시험관내 전사 촉진제 카세트를 제거함으로써 미반응된 물질을 제거하는 단계; 합성 선형 또는 원형의 결찰된 생성물을 미세유체 경로 소자의 다중 변위 증폭 (MDA) 또는 중합효소 연쇄 반응(PCR) 반응기에 전달하여 선형 또는 원형의 결찰된 생성물을 증폭시키기 위한 하나 이상의 증폭 제제와 조합하여 선형, 분지형 또는 원형의 증폭된 DNA를 생성하는 단계; 및 증폭된 DNA 결찰된 생성물을 미세유체 경로 소자의 분해 반응기에 이송하여 증폭된 DNA 결찰된 생성물을 선형화시킴으로써 이중 가닥 DNA 주형을 생성하는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 결찰 반응기, MDA 반응기 및 분해 반응기 및 복수의 보관 저장소는 밀폐 경로 및 밀봉 환경을 형성한다.
하나 이상의 미세유체 경로 소자와 밀봉 유체 소통하여 고정되도록 구성된 복수의 보관 저장소를 포함하는 시스템을 사용하여 시험관내 전사(IVT) 반응을 수행하는 방법은 대기 접촉으로부터 보호되는 밀폐 유체 경로에서 하나 이상의 미세유체 소자 상의 복수의 반응기와 복수 보관 저장소 중 하나 이상의 보관 저장소 사이에 시약을 수송하여 하나 이상의 미세유체 경로 소자에서 주형으로부터의 치료학적 mRNA의 시험관내 전사를 수행하는 것을 포함할 수 있다.
또한, 시험관내 전사(IVT) 반응을 수행하는 방법으로서, 방법은 비일시적 컴퓨터 판독가능 매체에서 인코딩되는 일련의 단계를 따르는 것을 포함하는 방법이 본원에 기술되며, 여기서 단계는 주형 물질, 중합효소 및 뉴클레오티드를 반응 중 언제든지 서브마이크로리터 정밀도로 계량되는 양으로 복수의 보관 저장소로부터 미세유체 경로 소자의 제1 반응기에 공압에 의해 전달하는 단계; 제1 반응기에서 주형 물질 및 뉴클레오티드를 처리하여 치료학적 mRNA를 형성하는 단계; 및 제1 반응기로부터 미세유체 경로 소자를 통해 치료학적 mRNA를 공압에 의해 이송하는 단계를 포함하며, 여기서 제1 미세유체 경로 소자 및 복수의 보관 저장소는 밀폐 경로 및 밀봉 환경을 형성하여 대기 노출을 방지한다.
또한, 시험관내 전사(IVT) 반응을 수행하는 방법으로서, 방법은 비일시적 컴퓨터 판독가능 매체에서 인코딩되는 일련의 단계를 따르는 것을 포함하는 방법이 본원에 기술되며, 여기서 단계는 주형 물질, 중합효소 및 뉴클레오티드를 복수의 보관 저장소로부터 미세유체 경로 소자 내로 일련의 단계에 따라 제어기에 의해 제어된 양으로 유도된 유체 흐름에 의해 전달하는 단계; 주형 물질 및 뉴클레오티드를 하나 이상의 반응기에서 처리하여 치료학적 mRNA를 형성하는 단계; 및 치료학적 mRNA를 하나 이상의 반응기로부터 미세유체 경로 소자를 통해 전달하는 단계를 포함하며, 여기서 제1 미세유체 경로 소자 및 복수의 보관 저장소는 밀폐 경로 및 밀봉 환경을 형성하여 대기 노출을 방지한다.
또한, 시험관내 전사(IVT) 반응을 수행하는 방법이 본원에 기술되며, 방법은 사전 프로그래밍된 소프트웨어 명령에 의해 제어되는 양으로 복수의 보관 저장소로부터 미세유체 경로 소자 내로 주형 물질, 중합효소 및 뉴클레오티드를 유도된 유체 흐름에 의해 전달하는 단계; 미세유체 경로 소자의 제1의 하나 이상의 반응기에서 주형 물질 및 뉴클레오티드를 처리하여 치료학적 mRNA를 형성하는 단계; 및 치료학적 mRNA를 제1의 하나 이상의 반응기로부터 미세유체 경로 소자를 통해 mRNA의 정제에 적합화된 제2의 하나 이상의 반응기 내에 이송하는 단계를 포함하며, 여기서 미세유체 경로 소자 및 복수의 보관 저장소는 밀폐 통로 및 밀봉 환경을 형성하여 대기 노출을 방지한다.
또한, 시험관내 전사 (IVT) 반응을 수행하는 방법이 본원에 기술되며, 방법은 비일시적 컴퓨터 판독가능 매체에서 인코딩되는 일련의 단계를 따르는 것을 포함하며, 여기서 단계는 주형 물질, 중합효소 및 뉴클레오티드를 복수의 보관 저장소로부터 제1 미세유체 경로 소자의 제1의 하나 이상의 반응기에 일련의 단계에 의해 제어되는 양으로 유도된 유체 흐름에 의해 전달하는 단계; 주형 물질 및 뉴클레오티드를 제1의 하나 이상의 반응기에서 처리하여 치료학적 mRNA를 형성하는 단계; 및 치료학적 mRNA를 제1의 하나 이상의 반응기로부터 제1의 미세유체 경로 소자를 통해 mRNA의 정제에 적합한 제2의 하나 이상의 반응기에 이송하는 단계; 및 mRNA 치료제의 제형화를 완료하기 위해 이렇게 정제된 mRNA를 이송하는 단계를 포함하며, 여기서 제1 미세유체 경로 소자 및 복수의 보관 저장소는 밀폐 경로 및 밀봉 환경을 형성하여 대기 노출을 방지한다.
또한, 시험관내 전사 (IVT) 반응을 수행하는 방법이 본원에 기술되며, 방법은 비일시적 컴퓨터 판독가능 매체에 인코딩되는 일련의 단계를 따르는 것을 포함하며, 여기서 단계는 주형 물질, 중합효소 및 뉴클레오티드를 복수의 보관 저장소로부터 제1 미세유체 경로 소자의 제1의 하나 이상의 반응기에 공압에 의해 전달하는 단계; 주형 물질 및 뉴클레오티드를 제1의 하나 이상의 반응기에서 처리하여 치료학적 mRNA를 형성하는 단계; 및 치료학적 mRNA를 제1의 하나 이상의 반응기로부터 제1의 미세유체 경로 소자를 통해 mRNA의 정제에 적합한 제2의 하나 이상의 반응기에 이송하는 단계; 및 정제된 mRNA를 제3의 하나 이상의 반응기에 이송하여 정제된 mRNA를 하나 이상의 전달 비히클과 조합하여 mRNA 치료제를 형성하는 단계를 포함하며, 여기서 제1 미세유체 경로 소자 및 복수의 보관 저장소는 밀폐 경로 및 밀봉 환경을 형성하여 대기 노출을 방지한다.
예를 들어, 시험관내 전사 (IVT) 반응을 수행하는 방법이 또한 본원에 기술되며, 방법은 비일시적 컴퓨터 판독가능 매체에서 인코딩되는 일련의 단계를 따르는 것을 포함하며, 여기서 단계는 주형 물질, 중합효소 및 뉴클레오티드를 복수의 보관 저장소로부터 제1 미세유체 경로 소자의 제1의 하나 이상의 반응기에 공압에 의해 전달하는 단계; 주형 물질 및 뉴클레오티드를 제1의 하나 이상의 반응기에서 처리하여 치료학적 mRNA를 형성하는 단계; 및 치료학적 mRNA를 제1의 하나 이상의 반응기로부터 제1의 미세유체 경로 소자를 통해 셀룰로스를 포함하며, mRNA의 정제에 적합한 제2의 하나 이상의 반응기에 이송하는 단계; 및 정제된 mRNA를 제3의 하나 이상의 반응기에 이송하여 정제된 mRNA를 하나 이상의 전달 비히클과 조합하여 mRNA 치료제를 형성하는 단계를 포함하며, 여기서 제1 미세유체 경로 소자 및 복수의 보관 저장소는 밀폐 경로 및 밀봉 환경을 형성하여 대기 노출을 방지한다.
하나 이상의 미세유체 경로 소자와 밀봉 유체 소통하여 고정되도록 구성된 복수의 보관 저장소를 포함하는 시스템을 사용하여 치료학적 mRNA 조성물을 제조하는 방법이 또한 본원에 기술되며, 상기 방법은 대기 접촉으로부터 보호되는 밀폐 유체 경로에서 하나 이상의 미세유체 소자 상의 복수의 반응기와 복수의 보관 저장소 중 하나 이상의 보관 저장소 사이에 시약을 수송하여 하나 이상의 미세유체 경로 소자에서 하나 이상의 치료학적 mRNA를 전달 비히클과 조합함으로써 치료학적 mRNA 조성물을 제형화하는 것을 포함한다.
하나 이상의 미세유체 경로 소자와 밀봉 유체 소통하여 고정되도록 구성된 복수의 보관 저장소를 포함하는 시스템을 사용하여 주문시 치료학적 mRNA 조성물을 제조하는 방법은 대기 접촉으로부터 보호되는 밀폐된 유체 경로에서 하나 이상의 미세유체 소자 상의 복수의 반응기와 복수의 보관 저장소 중 하나 이상의 보관 저장소 사이에 시약을 수송하여, 하나 이상의 미세유체 경로 소자에서 주형을 형성하는 단계, 주형으로부터 치료학적 mRNA의 시험관내 전사를 수행하는 단계, 치료학적 mRNA를 정제하는 단, 및 mRNA를 전달 비히클과 제형화시키는 단계 중 하나 이상을 수행하는 것을 포함할 수 있다.
이들 방법 및 장치 중 임의의 것은 치료 현장에서 작동될 수 있다(예를 들어, 치료학적 mRNA가 제조된다). 이러한 방법 및 장치 중 임의의 것은 신속하고 연속적으로 수행될 수 있으며, 예를 들어 치료제는 72시간 미만에 제조된다.
언급된 바와 같이, 이들 방법 및 장치 중 임의의 것에서 (예를 들어, IVT에 의해) 형성된 폴리뉴클레오티드는 미세유체 제어 장치의 자동화된 제어 하에 미세유체 경로 소자 내에서 전달 비히클과 조합되기 전후에 정제될 수 있다.
특히, 하나 이상의 표적 물질(예를 들어, 이중 가닥 RNA 등)을 제거할 수 있고/있거나 제조 공정의 일부로서 치료학적 물질에 하나 이상의 추가 물질(예를 들어, 동결건조된 물질)을 추가할 수 있는 침투성 삽입 물질을 사용하기에 적합화된 하나 이상의 미세유체 경로 소자를 포함할 수 있는 방법 및 장치가 본원에 기술된다. 투과성 삽입 물질은 미세유체 경로 소자의 하나 이상의 유체 접촉 챔버 내에 유지되도록 구성될 수 있으며, 전개중인 치료학적 용액이 투과성 삽입 물질을 통과하도록 조정될 수 있다. 투과성 삽입 물질은 압축성 및/또는 변형성 및/또는 탄성일 수 있으며, 따라서 챔버 내의 탄성 멤브레인에 의해 조작될 수 있다. 투과성 삽입물은 투과성이며, 고체, 과립, 겔 등인 변형 물질을 함유하는 커버(예를 들어, 외부 커버)를 포함할 수 있다. 일부 변형에서, 투과성 삽입 물질은 용액으로부터 dsRNA를 선택적으로 제거하도록 구성된 셀룰로스 물질이다.
투과성 물질은 다공성일 수 있다(예를 들어, 기공을 포함할 수 있다). 일부 변형에서, 투과성 물질은 섬유성이거나 적층될 수 있다. 예를 들어, 투과성 물질은 섬유성일 수 있으며, 유체가 이동할 수 있는 채널을 포함할 수 있다. 일부 변형에서, 채널은 투과성 물질을 통과하여 형성되어 유체가 투과되도록 할 수 있다. 예를 들어, 투과성 물질은 레이저 또는 내부 부피에 유체가 접근할 수 있게 하는 임의의 다른 수단에 의해 형성된 채널을 가질 수 있다. 일부 변형에서, 투과성 물질은 유체가 층들 간 또는 층들 중으로 통과할 수 있도록 배열된 복수의 층으로부터 형성될 수 있다. 표면 접근성만 있는 여러 개의 얇은 물질 층이 함께 스택킹될 수 있다. 예를 들어, 작용기화된 그래핀이 적층될 수 있다(예를 들어, 극단적으로 단일 원자 층까지). 또 다른 예로서, 에어로겔 슬라이스는 처리될 수 있거나, 그렇지 않으면 흡수성을 띠게 되고, 스택킹되어 삽입물의 투과성 물질을 형성할 수 있다.
본원에 기술된 임의의 투과성 물질에서, 물질은 일부 경우에 소정의 유량 및/또는 흐름 저항성에서 유체의 통과를 허용하도록 구성된 미리 형성된 물질 수 있다. 물질의 투과성은 본원에 기술된 처리 유량 및 유체 압력으로 장치 챔버 또는 채널 내에 유지될 경우 투과성 삽입물을 통해 흐르도록 선택될 수 있다. 상기 언급된 바와 같이, 미리 형성된 투과성 물질은 다공성, 섬유성일 수 있으며, 층의 스택일 수 있다; 임의의 이들 물질은 물질에 결합하도록 작용기화될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 작용기화된 물질은 물질의 표면이 화합물, 제제, 또는 표적 물질에 특정하게 결합하는 작용기의 첨가에 의해 변형된 임의의 물질을 포함할 수 있다. 물질은 또한 또는 대안적으로 특정 원자 분자 기가 물질의 특정 특성을 변경하기 위해 부착될 수 있는 표면 처리에 의해 작용기화될 수 있다. 작용기화는 원하는 물질을 표면에 결합시키기 위해 표면 화학작용을 이용하는 기술을 포함하는, 습식 화학작용, 또는 증기, 기체 및/또는 플라즈마 화학작용 및/또는 마이크로파 보조된 화학 기술, 등과 같은 다양한 표면 변형 기술에 의해 수행될 수 있다. 유사한 기술이 물질을 변형시키기 위해 예를 들어, 물질을 "활성화"시키기 위해 사용될 수 있다.
투과성 물질은 장치 내에 삽입물을 위한 총 표면적을 최대화하여 원치않는 불순물 및/또는 표적 생성물의 선택적 결합을 허용하도록 구성될 수 있다. 이들 투과성 물질 중 임의의 것은 용액에서 물질에 대한 효과적인 결합을 위한 미리 형성된 물질의 내부로 용액의 충분한 침투를 제공하도록 구성될 수 있다. 일부 변형에서, 투과성 물질은 하나 초과의 예비성형체를 포함할 수 있으며, 각각의 예비성형체는 미세유체 경로 소자 내의 채널 또는 챔버보다 크고, 이들 예비성형제 각각은 작용기화된 활성 물질에 용액 노출을 최대화하기 위해 여전히 내부의 용액 침투를 허용할 수 있다.
상기 언급된 바와 같이, 본원에 기술된 투과성 이식 삽입물은 용액으로부터 불순물(예를 들어, 원치 않는 물질)을 제거하도록 구성될 수 있으며; 대안적으로 또는 추가적으로 투과성 이식물은 원하는 물질에 분리가능하게 결합하여 (예를 들어, 세척 후 등등) 용리될 수 있도록 구성될 수 있다.
상기 언급된 바와 같이, 본원에 기술된 방법 및 장치는 치료제를 형성하는 용액을 변형시키도록 구성된 하나 이상의 투과성 삽입물을 포함하는 미세유체 경로 소자의 사용을 포함할 수 있다. 투과성 삽입물은 본원에 기술된 미세유체 경로 소자 내에서 사용하기에 적합할 수 있다.
예를 들어, 챔버의 유체 접촉 측 내부에 맞춰지도록 구성된 투과성 삽입물이 본원에 기술된다. 따라서, 투과성 삽입물은 챔버의 유체 접촉 측의 전부 또는 일부(예를 들어, 단면 영역) 내의 부피와 실질적으로 일치하도록 크기 결정되고/거나 형상화될 수 있다. 상기 언급된 바와 같이, 투과성 물질은 단일의 사전형성된 이식물일 수 있거나, 이는 투과성 이식물을 형성하는 많은 사전형성된 물질의 조합물일 수 있다. 투과성 이식물은 일반적으로 물질을 내로 및 물질을 통과하여 용액이 흐르도록 허용할 수 있다. 일부 변형에서, 투과성 이식물은 또한 투과성 이식물이 삽입되는 챔버를 미세유체 경로 소자가 압축하는 경우 투과성 이식물 내부로부터 유체를 제거할 수 있도록 압축 가능(예를 들어, "짜내질 수 있는")할 수 있다. 일부 변형에서, 투과성 이식물은 압축된 후 팽창된 형상으로 되돌리기에 충분히 탄성이다.
투과성 삽입물 및 미세유체 경로 소자는 유체 및 특히, 치료학적 조성물을 생성하는데 사용되는 물질이 처리 동안 투과성 삽입물을 반드시 통과하도록 구성될 수 있다. 일부 변형에서, 투과성 삽입물은, 유체-접촉 챔버의 부피가 챔버의 압력 수용 측으로부터 챔버의 유체 접촉 측을 분리하는 탄성 물질(예를 들어, 탄성 층)을 편향시킴으로써 변화될 때 변형될 수 있는 압축성 물질 및/또는 탄성 변형 가능 물질(엘라스틱)이다. 일부 변형에서, 투과성 삽입물은 압축 가능하지만, 반드시 탄성적으로 변형 가능한 것은 아니다. 일부 변형에서, 투과성 삽입물은 (예를 들어, 유체, 예컨대 완충액, 물 등의 첨가에 의해) 활성화될 때 챔버의 유체 접촉 측 내부에서 팽창될 수 있는 팽창성 물질이다. 투과성 삽입물은 챔버의 압력 수용 측과 챔버의 유체 접촉 측 사이의 탄성 물질(층)을 편향시킴으로써 압축될 수 있다. 일부 변형에서, 치료제를 처리하는 것은 투과성 삽입 물질을 포함하는 다중 (예를 들어, 2, 3, 4 등) 챔버 사이에 치료학적 물질을 제형화시키는데 사용되는 용액을 전송하는 것을 포함할 수 있다. 일부 변형에서, 방법은 투과성 삽입 물질을 포함하는 챔버 안팎으로 용액을 구동하는 것을 포함할 수 있다.
본원에 기술된 임의의 방법 및 장치에서, 치료학적 삽입 물질은 예를 들어, 챔버의 압력 수용 측의 압력을 조절하여 챔버를 유체 접촉 측과 압력 수용 측으로 분리하는 탄성 멤브레인을 편향시킴으로써 치료학적 물질을 포함하는 (또는 치료학적 물질이 형성되는) 용액을 챔버의 유체 접촉 측 밖으로 구동시키도록 압축될 수 있다.
투과성 삽입물은 치료학적 물질을 변형시키고, 이를 추가로 처리하고/변형시키는데 사용될 수 있는 임의의 적합한 물질일 수 있다. 예를 들어, 일부 변형에서, 투과성 삽입물은 투과성 물질을 통과할 때 용액으로부터 dsRNA를 제거하기 위해 dsRNA를 보유하도록 구성되는 셀룰로스 물질을 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 투과성 삽입물은 투과성 삽입물로부터의 용액에 첨가될 수 있는 하나 이상의 물질을 포함할 수 있다.
예를 들어, 본원에 기술된 임의의 투과성 삽입물은 투과성 삽입물 내로 또는 상에 흡착된 하나 이상의 추가 물질을 포함할 수 있다. 이러한 변형 중 임의의 변형에서, 투과성 삽입물은 이형 물질을 포함할 수 있다. 일부 변형에서, 예를 들어 투과성 삽입물은 셀룰로스에서 DNAse를 포획하기 위해 DNAse로 사전 처리될 수 있는 셀룰로스 삽입물을 포함할 수 있다. 이는 삽입물이 (본원에 기술된 바와 같이) 동시에 dsRNA를 제거하고, 시험관내 전사 단계로부터로부터의 DNA 주형과 같은 DNA 물질을 분해할 수 있게 한다.
본원에 기술된 임의의 투과성 삽입물은 투과성 삽입물 상에 또는 그 안에 부착되거나, 흡착되거나 그렇지 않으면 포함되는 하나 이상의 추가적인 제제를 포함하는 표면-작용기화된 삽입물으로서 구성될 수 있다. 예를 들어, 일부 변형에서, 투과성 삽입물 상에 또는 내에 포함된 추가적인 물질은 공유적으로 연결된 물질(예를 들어, 항체 또는 앱타머), 정전기적으로 연결된 물질, 흡착된 효소(예를 들어, 일부 예에서 불순물을 선택적으로 분해할 수 있는 효소, 예컨대 상기 언급된 바와 같은 DNAse), 공유적으로 또는 비공유적으로 부착된 센서(예를 들어, 제거될 물질, 예컨대 이중 가닥 RNA, 불순물 등을 검출하기 위한)를 포함할 수 있다. 일부 변형에서, 추가적인 물질 또는 물질들은 폴리아데닐화된 RNA 분자를 포획하기 위해, 예를 들어 투과성 삽입물의/안의 표면(들)에 결합하기 위해 폴리(dT) 서열을 포함할 수 있다(예를 들어, 폴리(dT) 서열은 투과성 이식물 내부에 사용되어 mRNA를 분리할 수 있다). 일부 변형에서, 추가적인 물질 또는 물질들은 결합 특성을 향상시키기 위해 소분자를 포함할 수 있다(예를 들어, dsRNA 인터칼레이터, 예컨대 에티듐 브로마이드는 ssRNA에 결합하지 않고 dsRNA 물질에 선택적으로 결합할 수 있음). 일부 변형에서, 투과성 삽입물은 물질로 적어도 부분적으로 코팅될 수 있다. 예를 들어, 일부 변형에서, 코팅은 카르복실레이트 코팅일 수 있다.
일부 변형에서, 투과성 삽입물은 즉시 또는 시간 경과에 따른 방출 방식으로 용액 내로 방출될 수 있는 동결건조된 물질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 변형에서, 용액이 투과성 삽입물과 접촉하기 때문에, 이는 동결건조된 물질을 용액에 용해시킬 수 있다. 동결건조된 물질의 예는 하나 이상의 완충제 물질(예를 들어, 염, 킬레이트제, 세제, 폴리뉴클레오티드, 효소, 단백질 등)을 포함할 수 있다. 일부 변형에서, 투과성 삽입물은 용액 중의 하나 이상의 물질에 결합하기 위한 결합제와 같은 제제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 투과성 삽입물은 용액으로부터 물질을 선택적으로 제거할 수 있는 FAB 단편 등을 포함하는 결합된 면역제, 예를 들어 항체 또는 이의 일부를 포함할 수 있다.
일반적으로, 투과성 삽입물은 유체가 투과성 삽입물 위로 및/또는 이를 통해 통과하도록 챔버의 유체 접촉 측에 걸쳐 있도록 구성될 수 있다. 투과성 삽입물은 페이퍼 예를 들어, 물질의 시트일 수 있다. 투과성 삽입물은 챔버의 유체 접촉 측에 걸쳐 있고/거나 적어도 부분적으로 이를 충전시키도록 접힐 수 있다. 따라서, 접힌 형상은 챔버의 유체 접촉부에 걸쳐 있으면서, 편향(탄성적으로 편향되는 것 포함)되도록 구성될 수 있다. 접힘은 단순한 접힘(예를 들어, 팬 형상 접힘) 또는 더욱 복잡한 접힘을 포함할 수 있다; 일반적으로 챔버를 유체 접촉 챔버 및 압력 수용 챔버로 나누는 탄성 멤브레인의 움직임에 의해 압축되거나 그렇지 않으면 편향된 후에 접힘은 하나 이상의 구부러진 영역으로서, 힌지된 (예를 들어, 리빙 힌지) 영역으로서 작동할 수 있으며/거나 팽창된 형상으로 되돌아 가도록 편향될 수 있는 영역을 포함할 수 있다. 일부 변형에서, 투과성 삽입물은 스폰지를 형성할 수 있다. 투과성 삽입물은 발포된 물질 또는 퍼프 물질로서 형성될 수 있다.
본원에 기술된 투과성 삽입물의 임의의 변형에서, 투과성 삽입물 내부의 통로(예를 들어, 기공, 채널, 챔버 등)의 크기는 크기에 기초하여 물질을 통과하거나 배제하도록 구성될 수 있다. 따라서, 본원에 기술된 투과성 삽입물은 크기 배제(예를 들어, 크기 배제 크로마토그래피)를 수행하도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 미반응된 모노뉴클레오티드를 갖는 큰 mRNA 분자는 나노-다공성 삽입물을 함유하는 챔버 내로 전달될 수 있으며, 미반응된 dNTP는 삽입물 내로 확산되어 그 안에 물리적으로 포획될 수 있는 반면, 통로(예를 들어, 기공)의 크기는 큰 분자를 제외할 수 있다.
예를 들어, 투과성 삽입물이 (예를 들어, dsRNA를 제거하기 위한) 셀룰로스를 포함하는 변형에서, 셀룰로스는 페이퍼(예를 들어, 필터 페이퍼) 형태일 수 있으며, 이는 접힙거나 적층될 수 있으며, 챔버의 유체 접촉부 내부에 보유되도록 구성되는 접힘을 포함한다. 일부 변형에서, 셀룰로스는 부풀어 오르거나 발포될 수 있다. 일부 변형에서, 셀룰로스는 스폰지의 형태로 존재할 수 있다.
투과성 삽입물은 일반적으로 임의의 적절한 크기의 기공을 가질 수 있다. 기공 크기는 균일하거나 불균일할 수 있다; 일부 변형에서, 기공 크기는 크기 범위 내에서 분포될 수 있다. 예를 들어, 기공 크기는 약 1 μm 내지 약 200 μm (예를 들어, 1 μm 내지 3 μm, 1 μm 내지 5 μm, 2 μm 내지 4 μm, 2 μm 내지 5 μm, 3 μm 내지 6 μm , 5 μm 내지 10 μm, 6 μm 내지 8 μm, 6 μm 내지 10 μm, 7 μm 내지 10 μm, 8 μm 내지 10 μm, 9 μm 내지 11 μm, 9 μm 내지 12 μm, 10 μm 내지 12 μm, 10 μm 내지 15 μm, 12 μm 내지 15 μm, 14 μm 내지 16 μm, 15 μm 내지 18 μm, 17 μm 내지 19 μm, 1 μm, 2 μm, 3 μm, 4 μm, 5 μm, 6 μm, 7 μm, 8 μm, 9 μm, 10 μm, 11 μm, 12 μm, 13 μm, 14 μm, 15 μm, 16 μm, 17 μm, 18 μm, 19 μm, 20 μm, 22 μm, 25 μm, 27 μm, 30 μm, 40 μm, 50 μm, 60 μm, 70 μm, 80 μm, 90 μm, 100 μm, 110 μm, 120 μm, 등의 하부 크기 내지 2 μm, 3 μm, 4 μm, 5 μm, 6 μm, 7 μm, 8 μm, 9 μm, 10 μm, 11 μm, 12 μm, 13 μm, 14 μm, 15 μm, 16 μm, 17 μm, 18 μm, 19 μm, 20 μm, 22 μm, 25 μm, 27 μm, 30 μm, 40 μm, 50 μm, 60 μm, 70 μm, 80 μm, 90 μm, 100 μm, 110 μm, 120 μm, 등의 상부 크기)일 수 있으며, 여기서 하부 기공 크기는 상부 기공 크기보다 작다. 크기 범위는 예를 들어, 기공의 >90%가 크기 분포 내에 있는 분포일 수 있다(예를 들어, >90%, >92%, >93%, >94%, >95%, >96%, >97%, >98%, >99%, >99.5%, > 99.9%, 등).
본원에 기술된 임의의 방법 및 장치에서, 미세유체 경로 소자의 온도는 본원에 기술된 바와 같이 제어될 수 있다. 특히, 투과성 삽입물을 함유하는 챔버의 온도는 제어될 수 있다. 예를 들어, 미세유체 경로 소자에서 투과성 삽입물을 함유하는 챔버는 치료학적 물질을 포함하는 (또는 치료학적 물질이 형성되는) 용액이 투과성 삽입물과 접촉되는 경우 표적 온도에서 유지될 수 있다. 온도는 예를 들어, 2℃ 내지 20℃ , 2℃ 내지 5℃, 2℃ 내지 10℃, 2℃ 내지 15℃, 5℃ 내지 10℃, 5℃ 내지 15℃, 5℃ 내지 20℃, 10℃ 내지 15℃, 10℃ 내지 20℃, 10℃ 내지 30℃, 10℃ 내지 25℃, 15℃ 내지 20℃, 15℃ 내지 25℃, 15℃ 내지 30℃, 20℃ 내지 25℃, 20℃ 내지 30℃, 25℃ 내지 30℃, 25℃ 내지 40℃, 25℃ 내지 35℃, 30℃ 내지 35℃, 30℃ 내지 40℃, 35℃ 내지 40℃, 30℃ 내지 50℃, 30℃ 내지 45℃, 35℃ 내지 40℃, 35℃ 내지 45℃, 35℃ 내지 50℃, 40℃ 내지 45℃, 40℃ 내지 50℃, 45℃ 내지 50℃, 40℃ 내지 60℃, 40℃ 내지 55℃, 45℃ 내지 55℃, 45℃ 내지 60℃, 50℃ 내지 55℃, 50℃ 내지 60℃, 55℃ 내지 60℃, 50℃ 내지 70℃, 50℃ 내지 65℃, 55℃ 내지 65℃, 55℃ 내지 70℃, 60℃ 내지 70℃, 60℃ 내지 75℃, 65℃ 내지 70℃, 65℃ 내지 75℃, 65℃ 내지 80℃, 70℃ 내지 80℃, 75℃ 내지 80℃, 60℃ 내지 80℃, 65℃ 내지 75℃, 65℃ 내지 80℃ , 75℃ 내지 80℃, 70℃ 내지 90℃, 75 ℃ 내지 90℃, 80℃ 내지 90℃, 85℃ 내지 85℃, 85℃ 내지 90℃로 유지될 수 있다. 온도는 일정할 수 있거나, 투과성 삽입물에 노출되기 전, 노출 동안 및/또는 후에 변화(예를 들어, 증가, 감소 등)될 수 있다.
일부 변형에서, 투과성 삽입물은 고체 투과성 삽입물로서 지칭될 수 있다; 투과성 (예를 들어, 고체 투과성) 삽입물은 챔버의 유체 접촉 측 내부에 완전히 함유된 상태도록 유지되도록 구성될 수 있다. 일부 변형에서, 상기 언급된 바와 같이, 일부 변형에서 투과성 삽입물은 함유된 아웃터, 예를 들어 물질을 둘러싸고 투과성 커버 내부에 물질을 가두는 투과성 커버에 의해 밀봉되는 투과성 패키지로서 구성될 수 있다. 예를 들어, 투과성 커버는 과립 물질, 또는 겔(예를 들어, 하이드로겔) 등을 둘러쌀 수 있다. 투과성 커버는 유체가 커버를 통해 커버에 의해 보유되는 체적 내로 통과할 수 있도록 충분힌 투과성인 멤브레인 물질과 같은 물질로 형성될 수 있다. 따라서, 투과성 삽입물은 압축성 및/또는 탄성적으로 변형될 수 있는 필로우-유사 형상을 형성할 수 있다.
일반적으로, 투과성 삽입물은 미세유체 경로 소자의 유체 접촉 챔버에 삽입될 수 있으며, 상기 언급된 바와 같이 유체 접촉 챔버 내에 맞춰지도록 구성될 수 있다. 일부 변형에서, 투과성 삽입물은 챔버의 유체 접촉 측에서 꼭 맞게 맞춰지도록 구성된다; 예를 들어, 투과성 삽입물은 챔버의 유체 접촉 측의 형상(예를 들어, 타원형, 원형, 정사각형, 둥근 정사각형 등)에 상보적인 형상을 가질 수 있다. 언급된 바와 같이, 투과성 삽입물은 체적에 걸쳐 있고/거나 충전하고, 특히 유체 접촉 측의 체적을 통과하는 유동 방향에 수직인 방향으로 체적에 걸쳐 있도록 구성될 수 있어, 유체가 투과성 삽입물을 통하여 통과한다.
예를 들어, 미세유체 경로 소자 내에서 용액의 유체 흐름을 유도하기 위한 수단; 복수의 챔버; 및 복수의 챔버의 제1 챔버 내에서 투과성 삽입물을 포함할 수 있는 미세유체 경로 소자가 본원에 기술되며, 여기서 삽입물은 압축되도록 구성된다. 용액의 유체 흐름을 유도하기 위한 수단은 임의의 적절한 수단, 특히 미세유체 경로 소자 내에서 멤브레인을 편향시키기 위해 양압 또는 음압을 수용하도록 구성된 미세유체 경로 소자 상의 복수의 압력 포트를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에는 제1 플레이트와 제2 플레이트 사이에 끼워진 탄성 물질; 및 제1 플레이트와 제2 플레이트 사이에 형성된 복수의 챔버를 포함하는 미세유체 경로 소자가 기술되며, 여기서 탄성 물질 부분은 각 챔버를 유체 접촉 측 및 압력 수용 측으로 나눈다. 임의의 이들 미세유체 경로 장치는 제1 챔버의 유체 접촉 측 내에 고체의 투과성 삽입물을 포함할 수 있다.
예를 들어, 본원에는 제1 플레이트와 제2 플레이트 사이에 끼워진 탄성 물질; 제1 플레이트와 제2 플레이트 사이에 형성된 복수의 챔버로서, 탄성 물질 부분이 각 챔버를 유체 접촉 측과 압력 수용 측으로 나누는 복수의 챔버; 및 복수의 챔버 중 제1 챔버의 유체 접촉 측 내부의 고체의 투과성 삽입물로서, 압력이 제1 챔버의 압력 수용 측에 가해질 때 탄성 물질의 편향에 의해 삽입물이 압축되도록 구성되는 삽입물을 포함하는 미세유체 경로 소자가 기술된다.
일부 변형에서, 미세유체 경로 소자는 제1 플레이트와 제2 플레이트 사이에 끼워진 탄성 물질; 제1 플레이트와 제2 플레이트 사이에 형성된 복수의 챔버로서, 탄성 물질 부분은 각 챔버를 유체 접촉 측과 압력 수용 측으로 나누는 챔버; 및 복수의 챔버의 제1 챔버의 유체 접촉 측 내에 고체의 투과성 삽입물로서, 삽입물은 RNA를 정제하도록 구성된 셀룰로스 물질을 포함하며, 제1 챔버를 나누는 탄성 물질은 압력 수용 측에 압력을 가함으로써 편향되도록 구성되어 제1 챔버 내로 또는 밖으로 유체를 이동시키는, 투과성 삽입물을 포함한다.
미세유체 경로 소자는 제1 플레이트와 제2 플레이트 사이에 끼워진 탄성 물질; 제1 플레이트와 제2 플레이트 사이에 형성된 복수의 챔버로서, 탄성 물질 부분이 각 챔버를 유체 접촉 측과 압력 수용 측 사이로 나누는 챔버; 복수의 챔버의 유체 접촉 측과 유체 소통하도록 구성된 복수의 유체 포트; 복수의 챔버의 압력 수용 측과 유체 소통하는 복수의 압력 포트; 및 복수의 챔버의 제1 챔버의 유체 접촉 측 내부의 고체의 투과성 삽입물로서, 압력이 하나 이상의 압력 포트로부터 제1 챔버의 압력 수용 측으로 가해질 때 삽입물은 탄성 물질의 편향에 의해 압축되도록 구성되는 삽입물을 포함할 수 있다.
일부 변형 및 특히 투과성 삽입물이 용액으로부터 원치않는 물질(예를 들어, dsRNA)을 제거하도록 구성된 변형, 예컨대 셀룰로스를 포함하는 변형에서, 챔버는 분리 챔버로 지칭될 수 있다.
언급된 바와 같이, 임의의 이들 장치(예를 들어, 시스템, 장치 등)에서, 고체의 투과성 삽입물은 RNA를 정제하도록 구성된 셀룰로스 물질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 고체의 투과성 삽입물은 셀룰로스 물질의 시트를 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 고체의 투과성 삽입물은 동결건조된 물질을 포함할 수 있다.
고체의 투과성 삽입물은 제1 챔버의 프로파일과 매칭되는 프로파일을 가질 수 있다. 언급된 바와 같이, 고체의 투과성 삽입물은 탄성일 수 있다.
고체의 투과성 삽입물은 과립 물질을 함유하는 투과성 외부 커버링을 포함할 수 있다. 일부 변형에서, 고체의 투과성 삽입물은 접힌 구조를 포함한다.
일부 변형에서, 미세유체 경로 소자는 제1 챔버에 유체 연결되는 제2 챔버를 포함할 수 있다. 장치는 탄성 물질을 편향시킴으로써 제1 챔버와 제2 챔버 사이에 유체를 이송하도록 구성될 수 있다. 일부 변형에서, 유체는 제1 챔버와 제2 챔버 사이를 왕복할 수 있다.
미세유체 경로 소자는 유체 수용 측에서 유체를 이동시키기 위해 복수의 챔버의 압력 수용 측에 압력을 전달하도록 구성되고, 제1 플레이트를 통해 확장되는 복수의 개별적으로 처리가능한 압력 포트를 포함할 수 있다.
또한, 본원에 기술된 임의의 장치를 사용하는 방법이 본원에 기술된다. 예를 들어, 유체 중의 치료학적 물질(예를 들어, RNA 샘플)을 처리하는 방법은 미세유체 경로 소자를 압력 공급원을 결합시키는 단계; 압력을 가하여 샘플을 미세유체 경로 소자의 분리 챔버의 유체 접촉 측에 수송하는 단계; 분리 챔버의 유체 접촉 측 내에서 고체의 투과성 삽입물 내로 샘플을 통과시키는 단계로서, 샘플이 고체의 투과성 삽입물에 의해 변형되는 단계; 및 압력을 가하여 분리 챔버의 유체 접촉 측 밖으로 샘플을 수송하는 단계를 포함할 수 있다.
예를 들어, dsRNA 및 단일 가닥 RNA(ssRNA) 둘 모두를 함유하는 RNA 샘플로부터 이중 가닥 RNA(dsRNA)를 제거하는 방법은 미세유체 경로 소자를 압력 공급원에 결합시키는 단계; 압력을 가하여 RNA 샘플을 미세유체 경로 소자의 분리 챔버의 유체 접촉 측에 수송하는 단계; RNA 샘플을 분리 챔버의 유체 접촉 측 내부의 고체의 투과성 삽입물을 통해 통과시키는 단계로서, 고체의 투과성 삽입물이 셀룰로스를 포함하여 dsRNA가 삽입물에 의해 보유되는, 단계; 및 압력을 가하여 분리 챔버의 유체 접촉 측 밖으로 RNA 샘플을 수송하는 단계를 포함할 수 있다.
dsRNA 및 단일 가닥 RNA(ssRNA) 둘 모두를 함유하는 RNA 샘플로부터 이중 가닥 RNA(dsRNA)를 제거하는 방법은 미세유체 경로 소자를 압력 공급원에 결합시키는 단계; 압력을 가하여 RNA 샘플을 미세유체 경로 소자의 분리 챔버의 유체 접촉 측에 수송하여 RNA 샘플을 분리 챔버의 유체 접촉 측 내부의 셀룰로스를 포함하는 고체의 투과성 삽입물을 통해 통과시키고, dsRNA는 삽입물에 의해 보유되는 단계; 및 압력을 분리 챔버의 압력 수용 측에 가하여 RNA 샘플을 분리 챔버의 유체 접촉 측 밖으로 수송하는 단계를 포함할 수 있다.
방법은 미세유체 경로 소자에서 시험관내 전사에 의해 RNA 샘플을 합성하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 변형에서, 방법은 RNA 샘플의 공급원에 미세유체 경로 소자를 결합시키는 것을 포함할 수 있다.
압력을 가하여 유체 접촉 측 밖으로 RNA 샘플을 수송하는 단계는 분리 챔버의 압력 수용 측에 압력을 가하여 분리 챔버의 유체 접촉 측으로부터 분리 챔버의 압력 수용 측을 분리하는 탄성 물질을 편향시키는 것을 포함할 수 있다. 분리 챔버의 압력 수용 측에 압력을 가하는 것은 분리 챔버의 유체 접촉 측 밖으로 및 혼합 챔버의 유체 접촉 측에 RNA 샘플을 수송하는 것을 포함할 수 있으며, 압력을 혼합 챔버의 압력 수용 측에 가하여 RNA 샘플을 다시 분리 챔버의 유체 접촉 측 안으로 수송하는 것을 추가로 포함한다. 압력을 가하여 분리 챔버의 유체 접촉 측 밖으로 RNA 샘플을 수송하는 것은 탄성 물질에 의해 고체의 투과성 삽입물을 압축하여 분리 챔버의 유체 접촉 측으로부터 분리 챔버의 압력 수용 측을 분리하는 것을 포함할 수 있다.
임의의 이들 방법은 고체의 투과성 삽입물을 사전 가습시키는 것을 포함할 수 있다.
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본 발명의 신규한 특징은 하기 청구범위에서 구체적으로 설명되어 있다. 본 발명의 특징 및 이점은 본 발명의 원리가 활용되는 예시적인 구현예를 설명하는 다음의 상세한 설명 및 첨부 도면을 참조하여 더 잘 이해될 것이다.
도 1은 mRNA 치료제를 제조하는 방법의 한 변형을 개략적으로 예시한다.
도 1b는 환자-특이적 T-세포 림프종 백신 의약품을 제조하기 위한 예시적인 공정의 한 변형을 개략적으로 예시한다.
도 2a는 본원에 기술된 바와 같은 미세유체 경로 소자 제어 시스템의 한 예를 예시한다.
도 2b는 본원에 기술된 바와 같이 사용될 수 있는 미세유체 경로 소자 제어 시스템의 한 변형을 개략적으로 예시한다.
도 3a-3c는 본원에 기술된 바와 같은 미세유체 경로 소자의 변형을 예시한다.
도 4는 본원에 기술된 바와 같은 미세유체 경로 소자의 한 변형의 일부를 통한 단면도이다.
도 5는 본원에 기술된 바와 같은 임의의 방법에 사용될 수 있는 펩토이드 전달 비히클의 한 예이다.
도 6은 이중 가닥 DNA 주형을 제조하는데 유용한 시험관내 전사 촉진제 카세트의 예를 보여준다.
도 7은 본원에 기술된 바와 같이 생성된 이중 가닥 DNA 주형의 예를 보여준다.
도 8은 백신 또는 치료제에 사용하기 위한 이중 가닥 DNA를 제조하는데 유용한 T-세포 수용체의 예의 한 영역을 보여준다.
도 9는 이중 가닥 DNA를 생성하기 위한 미세유체 경로 소자 반응기의 구조의 한 변형에 대한 개요를 보여준다.
도 10은 본원에 기술된 임의의 방법 및 장치에 사용될 수 있는 코돈 최적화 과정의 한 예를 개략적으로 예시한다.
도 11은 본원에 기술된 바와 같이 IVT를 수행하도록 구성된 미세유체 경로 소자에 대한 기능성 다이어그램의 한 예를 개략적으로 예시한다.
도 12는 본원에 기술된 바와 같은 제형 미세유체 경로 소자로서 구성된 미세유체 경로 소자에 대한 기능성 다이어그램의 한 예를 개략적으로 예시한다.
도 13은 본원에 기술된 바와 같은 제형 미세유체 경로 소자로서 구성된 미세유체 경로 소자에 대한 기능성 다이어그램의 또 다른 예를 개략적으로 예시한다.
도 14는 본원에 기술된 바와 같은 제형 미세유체 경로 소자에 대한 기능 다이어그램의 다른 예를 개략적으로 예시한다.
도 15는 본원에 기술된 바와 같은 mRNA 치료제의 예시적인 모델을 사용하여 생체내 mRNA 발현 및 생체분포를 조사하는 실험의 한 예를 설명한다.
도 16a-16d는 본원에 기술된 바와 같은 예시적인 치료학적 mRNA 백신의 치료 효능을 예시하는 그래프이다.
도 17a는 본원에 기술된 바와 같이 제조된 저장된 모델 mRNA 치료제를 주사한 후 전신 루시페라제 발현을 예시한다.
도 17b는 도 17a의 모델 mRNA 치료제의 발현의 정량적 예를 보여준다.
도 18은 본원에 기술된 방법 및 장치에 여과가 적용될 수 있는 다양한 시간을 개략적으로 예시한다.
도 19a는 챔버의 유체 접촉 측 내부에 투과성 삽입물을 포함하는 미세유체 경로 소자의 예의 평면도이다.
도 19b는 챔버의 한 측에 투과성 삽입물을 포함하는 미세유체 경로 소자의 예의 한 영역을 통한 단면의 예이다.
도 19c는 기포 제거를 위한 진공 캡을 개략적으로 보여주는 미세유체 경로 소자의 일부의 한 예를 예시한다.
도 20a는 본원에 기술된 바와 같은 투과성 삽입물을 포함하는 미세유체 경로 소자를 사용하여 유체에서 치료학적 물질(예를 들어, RNA 샘플)을 처리하는 한 방법을 개략적으로 예시한다.
도 20b는 본원에 기술된 바와 같은 투과성 삽입물을 포함하는 미세유체 경로 소자를 사용하여 치료학적 물질로부터 dsRNA를 제거하는 방법을 개략적으로 예시한다.
도 21a는 클래스 7 스페이스 내의 클래스 5 격리 캐비닛에 미세유체 소자를 포함하는 시스템의 한 예를 보여준다. 시스템은 미니 팩토리로 구성될 수 있다.
도 21b는 클래스 5 캐비닛 내의 미세유체 소자를 예시한다.
상세한 설명
완전 자동화된 소프트웨어-제어된 미세유체 장치의 사용을 포함할 수 있는 치료제를 제조하기 위한 방법 및 장치가 본원에 기술된다. 이들 방법 및 장치는 개인화 또는 개별화된 치료에 사용될 수 있다. 또한, 주형을 형성하고, 시험관내 전사하고, 치료학적 mRNA를 정제하고, mRNA를 농축하고 mRNA(들)를 하나 이상의 전달 비히클과 화합하는 것을 포함하는 본원에 기술된 임의의 제조 단계를 소프트웨어 제어하는 것을 포함하는 장치(예를 들어, 시스템, 소자 등) 및 방법이 본원에 기술된다. 소프트웨어 제어는 이러한 방법을 자동화하여 하나 이상의 치료학적 mRNA를 제조하기 위한 이러한 단계 중 일부 또는 모두가 정확하고 정밀하게 신속히 수행될 수 있도록 할 수 있다. 소프트웨어 제어와 반응 성분의 미세 유체 정밀 전달 및 이송은 공정 제어, 효율성 및 재현성을 높이는 동시에 수동 조작을 크게 줄이거나 없애고, 시설 요구 사항을 줄이며 생산 주기 시간을 단축하여 궁극적으로 필요한 경우 제 시간에 생성된 치료제의 비용을 절감하는 기회를 제공한다.
본원에 기술된 일부 장치(예를 들어, 시스템, 소자 등)에서, 치료학적 물질의 각 배치는 미세유체 경로 소자 제어 시스템(또한 제어 시스템으로서 본원에서 지칭됨) 내부에 수용될 수 있는 전용, 단회용, 일회용 미세유체 경로 소자(또한 본원에 바이오칩으로 지칭됨)에서 생성될 수 있다. 전체 생산은 대기와 접촉하지 않고 설계에 따라 무균된 폐쇄 경로 공정으로 진행될 수 있다. 모든 생산 단계는 자동화될 수 있으며, 시스템을 수용하는 시설의 속성에 무관하게 완벽하게 복제된 공정을 달성하기 위해 제어 시스템에 의해 제어될 수 있다. 생산 파라미터, 원료 및 환경 데이터(완전 육안 기록 포함)는 클라우드에서 보호되고 각 생산 진행과 연결된 광범위하고 암호화된 전자 파일의 일부가 될 수 있다. 또한, 반도체 산업에서 개발된 공정 제어 개념을 통해 정제 단계 및 여러 QC 검정은 단일 유체 흐름에서 생산 공정 중 인라인으로 수행되어 초기 단계에서 이상 징후가 감지될 수 있게 한다. 제조에 완전히 자동화되고 소프트웨어로 제어되는 접근 방식을 활용함으로써 개인화되고 개별화된 mRNA 치료제가 환자의 이익을 위해 비용 효율적인 방식으로 제조될 수 있다.
특히, 이러한 방법 및 장치는 시험관내 전사(IVT)로 알려진 합성 기술을 통해 인체의 외부에서 합성적으로 mRNA 치료제를 생성할 수 있다. 전형적으로, 네이키드 mRNA 분자는 세포막을 통과하지 않는 큰 다중음이온성 분자이며, 생체내에서 세포외 뉴클레아제에 의해 빠르게 분해된다. 본원에 기술된 방법 및 장치는 mRNA를 표적(조직, 신체, 조직의 영역 등)에 수송하도록 설계된 하나 이상의 전달 비히클과의 mRNA 분자의 제형을 생성할 수 있다. 예를 들어, 일부 변형에서, 전달 비히클은 순환 동안 mRNA 카고의 패키징 및 보호를 제공하고, 면역 인식을 피하고, 세포 흡수 및 방출을 촉진할 수 있는 지질 함유 양친매성 전달 비히클일 수 있다.
일반적으로 본원에 더욱 상세히 기술되는 바와 같이, 일부 변형에서, 주형 합성, IVT, 정제 및 전달 비히클과의 제형화를 포함하는 생산 단계의 일부 또는 모두는 하나 이상의 미세유체 경로 소자의 고도로 제어된 환경에서 수행되어 견고하고 고품질의 고도로 재현성인 제조 공정을 최적화시킬 수 있다.
정의
본원에 사용된 바와 같은 전달 비히클은 임의의 적합한 나노입자를 지칭할 수 있다. 이러한 나노입자의 예는 비제한적으로 양친매성 나노입자, 예컨대 아미노 지질화된 펩토이드를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "증폭"은 폴리뉴클레오티드(예를 들어, DNA) 증폭을 지칭할 수 있다. 예를 들어, 증폭은 본원에 기술된 미세유체 경로 플레이트 소자 내에서 전체적으로 수행될 수 있다. 증폭은 비제한적으로 다중 변위 증폭(MDA), 중합효소 연쇄 반응(PCR) 증폭, 루프 매개된 등온 증폭, LAMP, 핵산 서열 기반 증폭, 가닥 변위 증폭, 롤링 서클 증폭, 리가제 사슬 반응 등을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 자동화된 및 반자동화는 인간 개입 없이 주로 수행되는 방법 및 공정을 지칭할 수 있으며, 하나 이상의 컴퓨터 공정의 제어 하에 있을 수 있다. 자동화된 방법은 인간 입력에 의해 감독되고/거나 안내될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "핵산", "폴리뉴클레오티드" 및 "올리고뉴클레오티드"는 상호교환적으로 사용될 수 있으며, 데옥시뉴클레오티드(DNA), 리보뉴클레오티드(RNA) 및 이의 기능적 유사체, 예컨대 선형 또는 원형 형태의 상보적 DNA(cDNA)를 지칭한다. 본원에 제공된 핵산 분자는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 핵산 분자는 뉴클레오티드 염기 아데닌(A), 구아닌(G), 티민(T), 시토신(C)을 포함한다. 우라실(U)은 RNA 분자에서 티민을 대체한다. 천연 뉴클레오티드 염기의 유사체는 물론 염기, 당 및/또는 포스페이트 모이어티에서 변형된 뉴클레오티드 염기가 또한 본원에 제공된다. 기호 "N"은 임의의 뉴클레오티드 염기(예를 들어, A, G, C, T 또는 U)를 나타내는데 사용될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "카세트"(예를 들어, 합성 시험관내 전사 촉진제 카세트)는 하나 이상의 발현 요소, 예컨대 인핸서, 프로모터, 리더, 인트론, 5' 비번역된 영역(UTR), 3' UTR 또는 전사 종결 서열을 포함할 수 있거나 이에 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 일부 구현예에서, 카세트는 작동가능하게 연결된 제2 폴리뉴클레오티드 서열의 전사를 개시할 수 있는 적어도 제1 폴리뉴클레오티드 서열 및 선택적으로 제2 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 전사 종결 서열을 포함한다. 카세트는 단일 요소 또는 2개 이상의 연결되지 않은 요소로 제공될 수 있다.
본원에 사용된 "폴리뉴클레오티드"는 다중 뉴클레오티드를 함유하는 핵산 분자를 지칭하며, "올리고뉴클레오티드"(18-25개 뉴클레오티드 길이의 폴리뉴클레오티드 분자) 및 26개 이상의 뉴클레오티드의 폴리뉴클레오티드 둘 모두를 일반적으로 지칭한다. 본 개시내용의 양태는 18-25개 뉴클레오티드의 길이를 갖는 올리고뉴클레오티드(예를 들어, 18-mer, 19-mer, 20-mer, 21-mer, 22-mer, 23-mer, 24-mer 또는 25-mer), 또는 26개 이상의 뉴클레오티드의 길이를 갖는 중간 길이 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 약 65, 약 70, 약 75, 약 80, 약 85, 약 90, 약 95, 약 100, 약 110, 약 120, 약 130, 약 140, 약 150, 약 160, 약 170, 약 180, 약 190, 약 200, 약 210, 약 220, 약 230, 약 240, 약 250, 약 260, 약 270, 약 280, 약 290, 또는 약 300 뉴클레오티드의 폴리뉴클레오티드), 또는 약 300개가 넘는 뉴클레오티드 길이를 갖는 긴 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 약 300 내지 약 400 뉴클레오티드, 약 400 내지 약 500 뉴클레오티드, 약 500 내지 약 600 뉴클레오티드, 약 600 내지 약 700 뉴클레오티드, 약 700 내지 약 800 뉴클레오티드, 약 800 내지 약 900 뉴클레오티드, 약 900 내지 약 1000 뉴클레오티드, 약 300 내지 약 500 뉴클레오티드, 약 300 내지 약 600 뉴클레오티드, 약 300 내지 약 700 뉴클레오티드, 약 300 내지 약 800 뉴클레오티드, 약 300 내지 약 900 뉴클레오티드, 또는 약 1000 뉴클레오티드 길이 또는 심지어 약 1000 뉴클레오티드 길이 초과의 폴리뉴클레오티드)를 포함하는 조성물을 포함한다. 폴리뉴클레오티드가 이중 가닥인 경우, 그 길이는 염기쌍으로 유사하게 기술될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "시험관내 전사" 또는 "IVT"는 대상체에 대한 치료학적 전달을 포함하는 다양한 적용에 사용하기 위한 합성 RNA 분자(합성 mRNA)를 생성하기 위해 전사가 비-세포 시스템에서 시험관내에서 일어나는 과정을 지칭한다. 생성된 합성 RNA 분자(전사 생성물)는 전달 비히클과 조합될 수 있다. 합성 전사 생성물은 mRNA, 안티센스 RNA 분자, shRNA, 원형 RNA 분자, 리보자임 등을 포함한다. IVT 반응은 프로모터 서열 및 관심 있는 오픈 리딩 프레임의 서열, 리보뉴클레오티드 트리포스페이트 또는 변형된 리보뉴클레오티드 트리포스페이트, DTT 및 마그네슘 이온을 포함하는 완충 시스템, 및 적절한 파아지 RNA 중합효소를 포함하는 정제된 선형 DNA 주형을 사용할 수 있다.
"주형" 또는 '이중 가닥 DNA 주형'은 삽입된 관심 있는 오픈 리딩 프레임의 시험관내 전사에 필요한 최소 구성요소 서열을 포함하는 분리된 핵산 서열을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 "유체 저장소"는 유체를 담기 위한 저장 공간을 의미하며, 바이알, 보틀, 백, 튜브 등을 포함할 수 있다. 유체 저장소는 유체 라인을 일체부(예를 들어, 유체 저장소 내부의 본체 또는 주요 챔버에 존재하는 통로 또는 채널)로서 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 유체 동력은 공압 및 유압 둘 모두를 포함한다. 편의상, 용어 공압은 유압을 포함할 수 있으며, 이들 용어는 상호교환적으로 사용될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "치료학적 폴리뉴클레오티드"는 대상체의 건강을 치료하거나, 예방하거나, 개선하거나 변경하기 위해 대상체에 전달하기 위한 치료학적 폴리뉴클레오티드 조성물의 일부일 수 있는 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 치료학적 mRNA)를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 "치료학적 폴리뉴클레오티드 조성물"은 대상체에 투여될 수 있는 전달 비히클에 의해 캡슐화된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드(예를 들어, mRNA)를 포함하는 조성물을 지칭할 수 있다. mRNA 백신은 치료학적 폴리뉴클레오티드 조성물의 단지 한 예이다.
본원에 사용된 바와 같은 "박테리아 DNA 비함유"는 박테리아 DNA의 부재를 나타낸다. 실질적으로 박테리아 DNA가 없는 물질은 0.1% 미만, 0.01%, 0.001% 미만 등의 박테리아 DNA를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이 "내독소 비함유"는 내독소의 부재를 나타낸다. "실질적으로 내독소를 비함유하는" 물질은 0.1% 미만, 0.01% 미만, 0.001% 미만 등의 내독소를 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같은 "결합"은 하나의 구성요소를 또 다른 구성요소에 결합시키기 위한 결찰, 합성, 프라이머 확장, 어닐링, 재조합 또는 혼성화와 같은 방법을 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같이 미세유체 경로 소자 또는 미세유체 경로 플레이트 소자는 칩, 카트리지, 바이오칩, 미세유체 경로 플레이트 등으로 동등하게 지칭될 수 있으며, 복수의 유체적으로 상호연결된 챔버를 포함할 수 있다. 이들 챔버는 유체 접촉 측과 압력 수용 측으로 나눠질 수 있다. 압력 수용 측은 유체 동력 회로의 일부일 수 있는 반면, 유체 접촉 측은 외부 대기로부터 격리될 수 있으며, 미세유체 경로 소자에서 물질을 처리하는데 사용될 수 있다. 본원에 기술된 미세유체 플레이트 경로 소자는 일반적으로 평평할 수 있으며(예를 들어, 약 4 cm 미만, 약 2 cm 미만, 약 1.5 cm 미만, 약 1 cm 미만 등의 두께를 가짐), 미세유체 경로 플레이트 소자에서 유체 동력 회로를 구동하고/거나 제어하기 위해 하나 이상의 압력 라인과 인터페이싱하기 위한 복수의 압력 포트를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "주문시"는 방법 또는 서비스가 수행되는 시기를 정의하기 위한 것이며, 미리 저장, 예약, 주문 또는 제조되는 것과 대조적으로 사용된다.
본원에 사용된 바와 같은 광 센서는 전형적으로 광 감지 소자를 지칭하며, 하나 이상의 이미징 소자를 포함할 수 있다. 광 센서는 단일 렌즈, 카메라, 스테레오 카메라, 다중 렌즈 카메라, 디지털 스틸 카메라, 열화상 카메라, CCD, 광섬유 등을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "정제"는 다른 원치 않는 구성요소(예를 들어, 오염 물질, 단편 등)의 구성요소(예를 들어, 입자)의 물리적 및/또는 화학적 분리를 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같은 "밀봉된 유체 소통" 및 "밀봉되고 폐쇄된 유체 경로"는 둘 모두 주변 대기로부터 물질(예를 들어, 물질 함유 유체, 예컨대 비제한적으로 주형, 치료학적 폴리뉴클레오티드 및/또는 치료학적 폴리뉴클레오티드 조성물의 용액)의 분리를 나타낼 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "주형 전구체 물질"은 주형(예를 들어, DNA 이중 가닥 주형)을 형성하는데 필요한 물질을 지칭하며, 합성 관심 유전자, 및 하나 이상의 독립적인 요소로서 제공된 시험관내 전사 촉진제 카세트를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 2D 정제는 본원에 기술된 바와 같은 실질적으로 평평한 미세유체 경로 소자(예를 들어, 미세유체 경로 플레이트 소자) 내부에서 수행된 정제를 나타내며, 물질(예를 들어, 이중 가닥 RNA, 미반응된 뉴클레오티드, 미반응된 캡핑 시약, 완충제 성분 등)을 제거하기 위해 하나 초과의 유형의 흡착제 물질을 사용하는 것 등을 포함할 수 있다.
치료제, 예컨대 mRNA 치료제는 백신접종, 면역요법, 단백질 대체 요법, 조직 리모델링/재생 및 유전자 편집에 의한 유전자 질환의 치료를 포함하는 많은 치료 양식에 사용될 수 있다. 높은 효능 외에도, mRNA 치료제는 또한 신속한 개발 주기, 표준화된 제조, 일시적 발현 및 게놈 통합의 낮은 위험과 관련된 중요한 이점을 가지고 있다.
일부 변형에서, 본원에 기술된 mRNA 치료제는 최종 의약품에서 활성 성분으로서 관심 항원 또는 단백질을 인코딩하는 mRNA를 포함할 수 있다. mRNA의 강력한 번역은 기능적 5' 캡 구조를 필요로 한다. 5' 캡 (또는 7-메틸구아노신 캡)은 제1 전사된 뉴클레오티드에 결합된 5'-5'-트리포스페이트 결합을 통해 연결된 말단 7-메틸구아노신 잔기로 구성된다. 이의 존재는 리보솜에 의한 mRNA의 인식 및 RNAse로부터의 보호에 중요하다. 폴리(A) 테일은 진핵생물 번역 개시 인자 eIF4G와 상호작용하고, 이어서 eIF4E와의 복합체를 형성하는, 폴리(A) 결합 단백질(PABP)을 결합시킴으로써 m7G 캡과 함께 mRNA 안정성 및 번역 개시를 상승작용적으로 조절한다. 폴리(A) 테일의 길이는 단백질 번역 과정에 대한 RNA의 효율성에 영향을 미칠 수 있다.
mRNA 치료제는 광범위하게 i) 단백질 대체, (ii) 백신, (iii) 이펙터 단백질의 발현, (iv) 우성 음성 단백질의 발현을 통한 기능 상실의 유도 및 (v) 유전자/게놈 편집에 사용되는 적어도 5가지 범주로 나눠질 수 있다. 본원에 기술된 방법 및 장치는 이들 범주 (또는 하나 초과) 중 임의의 범주에 대한 mRNA 치료제를 제공할 수 있다.
본원에 기술된 방법 및 장치는 순환 동안 mRNA 카고의 패키징 및 보호를 제공하고, 면역 인식을 피하고, 원하는 조직에서 의약품을 국소화시키고, 세포 흡수 및 방출을 촉진하면서 반복 투여를 제한할 수 있는 독성 또는 면역원성 문제를 회피할 수 있도록 mRNA 치료제를 제형화할 수 있다.
일반적으로, mRNA 치료제(비제한적으로, 환자 특이적 T-세포 림프종 백신 의약품 포함)를 제조하는 방법은 도 1a에 개략적으로 나타내며, 표적 단백질의 확인 및 mRNA 서열의 설계(101), 표적 서열에 대한 이중 가닥 DNA 주형 제조(103)를 포함하는 임의의 또는 모든 단계를 포함할 수 있다. 이 서열은 mRNA를 합성하기 위해 시험관내 전사(IVT) 반응(105)을 위한 mRNA를 생성하는데 사용될 수 있다. 그 후, 이러한 치료학적 mRNA는 정제되어 공정 불순물을 제거하고, 여과되어 약물을 생성할 수 있다(107). 그 후, 치료학적 mRNA는 전달 비히클과 제형화될 수 있다(109)(일부 변형에서 애주번트 및 전달 비히클 구성요소를 포함하여 양친매성 나노입자를 형성함). 그 후, 제형은 처리되고 정제되어 환자에게 전달하기 위해 사용될 수 있는 의약품을 생성할 수 있다(111). 상기 기술된 바와 같이, 일부 변형에서, 이러한 단계 중 일부는 원격으로(예를 들어, 101-107) 및 일부 현장에서(예를 들어, 109, 111) 수행될 수 있다; 일부 변형에서, 이들은 모두 (예를 들어, 103, 105, 107, 109, 111) 현장에서 수행될 수 있다.
한 변형의 특정 예로서, 도 1b는 환자 특이적 T-세포 림프종 백신 의약품을 제조하기 위한 예시적인 공정을 보여준다. 도 1b에서, 공정은 림프종 세포에 의해 발현된 클론 확장된 TCR 서열(아이디오타입)의 확인을 포함할 수 있다(121). 공정은 또한 mRNA 백신 서열을 설계하고(123), IVT 반응을 위한 이중 가닥 DNA 주형을 제조하는 것을 포함할 수 있다. 주형은 mRNA를 합성하기 위해 IVT 반응에 이용될 수 있으며(127), 이러한 치료학적 mRNA는 정제되어 공정 불순물을 제거하고, 여과되어 약물 물질로서 치료학적 mRNA를 제조할 수 있다(129). 그 후, 치료학적 mRNA는 애주번트 및 전달 비히클 구성요소와 제형화되어 양친매성 나노입자를 형성할 수 있다(131). 그 후, 제형화 후 처리(133)가 수행되어 의약품, 예컨대 치료학적 mRNA 백신을 생성할 수 있다(135).
이들 제조 단계 중 임의의 것은 본원에 기술된 바와 같이 자동화된 미세유체 경로 소자 제어 시스템을 사용하여 수행되도록 최적화될 수 있다. 예를 들어, DNA 주형 생성은 하나 이상의 미세유체 경로 소자에서 발생할 수 있다; 도 1b에 도시된 예에서, 주형 미세유체 경로 소자(예를 들어, 주형 바이오칩)가 사용될 수 있다. 이러한 동일한 예에서, mRNA의 시험관내 전사 및 약물 물질을 생성하기 위한 이러한 물질의 정제 단계는 IVT 미세유체 경로 소자(예를 들어, IVT 바이오칩)에서 수행될 수 있으며, 의약품 제형화 단계는 제형화 미세유체 경로 소자(예를 들어, 제형화 바이오칩)에서 수행될 수 있다. 이러한 미세유체 경로 소자는 제조 공정에서 각 단계를 수행하는데 필요한 투입 포트, 계량 밸브, 반응 챔버 및 정제 구조를 함유할 수 있다.
장치
본원에 기술된 방법은 일반적으로 하나 이상의 미세유체 경로 소자(예를 들어, 바이오칩) 및 미세유체 경로 소자에서 작업을 제어하도록 구성된 시스템(예를 들어, 미세유체 제어 시스템)과 사용될 수 있으며/거나 이를 포함할 수 있는 장치를 이용하여 수행될 수 있다. 이들 장치는 본원에서 미세유체 장치, 미세유체 제어 장치, 미세유체 경로 소자 제어 시스템, 미세유체 제어 시스템 또는 미세유체 시스템으로서 지칭될 수 있다. 미세유체 경로 소자(또한 미세유체 경로 플레이트 소자로서 지칭됨)는 미세유체 제어 시스템 내에 배치될 수 있으며, 시스템 내부의 제조 구성요소의 일부 또는 더욱 바람직하게는 거의 전부 또는 전부의 구성요소 부분이 대기에 노출되는 것을 방지하는 밀폐된 경로 방식으로 작동할 수 있다. 특히, 시스템 내부의 유체(들)와 접촉하는 장치 부분이 대기에 노출되는 것을 방지한다. 도 2a는 미세유체 경로 소자 관리 시스템(203)(미세유체 경로 소자를 고정하고/거나 양압/음압을 가하여 미세유체 경로 소자에서 미세유체 작동을 작동시키고/거나 미세유체 경로 소자의 전부 또는 영역을 가열/냉각하고/거나 미세유체 경로 소자로부터 하나 이상의 특징을 검출하고/거나 하나 이상의 미세유체 경로 소자 상에서 수행된 작업을 기록하기 위한 하드웨어를 포함), 제어기(미도시됨) 및 냉장 용기(205)(예를 들어, ISO 클래스 5 캐비넷)를 포함하는 미세유체 경로 소자 제어 시스템의 한 예를 보여준다. 이 시스템은 하나 이상의 미세유체 경로 소자(201)에 사용될 수 있거나 이를 포함할 수 있다.
미세유체 장치는 치료학적 폴리뉴클레오티드(예를 들어, mRNA 치료제)를 형성시키기 위한 미세유체 장치일 수 있다. 장치는 미세유체 경로 플레이트 소자를 제거 가능하게 보유하기 위한 안착 마운트; 복수의 압력 라인; 복수의 유체 바이알로서, 여기서 각각의 유체 바이알은 유체 라인을 포함하거나 유체 라인과 결합되도록 구성되고, 각각의 유체 라인 및 압력 라인의 적어도 서브셋이 안착 마운트에 보유된 미세유체 경로 플레이트 소자에 대해 편향되어 폐쇄된 유체 경로를 형성하도록 구성되는, 복수의 유체 바이알; 및 미세유체 경로 플레이트 소자가 안착 마운트에 보유되는 경우 미세유체 경로 플레이트 소자에서 유체 이동을 구동시키기 위해 압력 라인을 통한 압력의 적용을 제어하도록 구성된 제어기로서, 여기서 제어기는 합성 주형의 합성을 지시하고, 치료학적 폴리뉴클레오티드를 형성시키기 위해 주형을 사용하여 시험관내 전사(IVT) 반응을 지시하고, 안착 마운트에 보유된 하나 이상의 미세유체 경로 플레이트 소자에서 치료학적 폴리뉴클레오티드의 정제를 지시하도록 구성되는, 제어기를 포함할 수 있다.
미세유체 장치(예를 들어, 치료학적 폴리뉴클레오티드, 예컨대, 치료학적 mRNA를 형성시키기 위한 미세유체 장치)는 미세유체 경로 플레이트 소자를 제거 가능하게 보유하기 위한 안착 마운트; 복수의 압력 라인; 복수의 유체 바이알로서, 여기서 각각의 유체 바이알이 유체 라인을 포함하거나 유체 라인과 결합되도록 구성되고, 각각의 유체 라인 및 압력 라인의 적어도 서브셋이 안착 마운트에 보유된 미세유체 경로 플레이트 소자에 대해 편향되어 폐쇄된 유체 경로를 형성하도록 구성되는, 복수의 유체 바이알; 및 미세유체 경로 플레이트 소자가 안착 마운트에 보유되는 경우 미세유체 경로 플레이트 소자에서 유체 이동을 구동시키기 위해 압력 라인을 통한 압력의 적용을 제어하도록 구성된 제어기로서, 여기서 제어기는 유체 바이알의 내용물을 결정하고, 유체 바이알로부터의 마이크로리터 이하의 양의 물질을 안착 마운트에 보유된 미세유체 경로 플레이트 소자 내의 하나 이상의 반응기에 이송하고, 합성 주형의 합성을 지시하고, 주형을 사용하는 시험관내 전사(IVT) 반응을 지시하여 치료학적 폴리뉴클레오티드를 형성시키고, 안착 마운트에 보유된 하나 이상의 미세유체 경로 소자에서 치료학적 폴리뉴클레오티드의 정제를 지시하도록 구성되는, 제어기를 포함할 수 있다.
제어기는 본원에 기술된 임의의 방법을 수행하도록 구성될 수 있으며, 특히 입력(예를 들어, 광학 입력, 압력 입력, 온도/열 입력 등)을 수신하고 입력을 처리하여 미세유체 경로 소자 내의 유체의 이동, 미세유체 경로 소자의 다양한 영역의 온도(열순환 포함), 헹굼/조합, 미세유체 소자의 밸브의 개방/폐쇄, 미세유체 소자의 검출 등을 제어하도록 구성될 수 있다. 제어기는 하나 이상의 마이크로프로세서, 통신 회로, 메모리 등을 포함할 수 있다. 제어기는 펌웨어, 하드웨어 및/또는 소프트웨어를 포함할 수 있다.
이들 장치 중 임의의 것은 안착 마운트 및 시약 저장 프레임 주위에 배열된 하나 이상(예를 들어, 복수)의 광 센서를 포함하여 미세유체 경로 소자가 안착 마운트에 안착되는 경우 시약 저장 프레임 내의 유체 수준 및 미세유체 경로 소자에서의 유체 이동을 모니터링할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 광 센서(들)는 장치의 바닥(예를 들어, 안착 마운트 아래) 상에 존재할 수 있고, 유체 양, 이동 등을 검출하기 위해 위쪽으로 향할 수 있다.
기술된 방법 및 장치는 일반적으로 유체 챔버(저장소, 유체 접촉 측, 반응기 등)와 미세유체 경로 소자의 채널 사이 또는 미세유체 경로 소자 내로, 및 일부 경우에 장치 내의 유체 저장소(바이알, 보틀, 용기, 등)와 미세유체 경로 소자 사이에 물질(액체 물질)을 이동시키는 하나 이상의 유체 동력 회로를 포함한다. 유체 동력 회로는 미세유체 소자, 특히 미세유체 소자 내의 챔버의 하나 이상의 압력 채널 및 압력 수용 측을 포함할 수 있는 유압 또는 공압 회로일 수 있다. 유체 동력 회로는 또한 미세유체 동력 회로로 지칭될 수 있다. 단일 미세유체 칩은 다수의 유체 동력 회로를 포함할 수 있으며; 유체 동력 회로는 또한 하나 이상의 압력 라인 및 미세유체 제어 장치의 압력 라인과 미세유체 경로 소자 내의 하나 이상의 미세유체 칩 사이의 인터페이스를 포함할 수 있다. 하나 이상의 유체 동력 회로는 다른 중첩되는 유체 동력 회로와 구성요소(밸브, 압력 라인, 진공 캡 등)를 공유할 수 있다. 또한, 동일한 편의를 위해, 용어 "공압"이 사용되는 경우, 일반적인 유체 동력 회로(예를 들어, 유압 및/또는 공압)가 대신 또는 추가적으로 사용될 수 있음이 이해되어야 한다. 유체 동력 라인에 의해 구동되는 유체 물질은 임의의 적절한 유체(예를 들어, 기체 또는 액체, 예컨대, 공기, 물, 오일 등)일 수 있다.
또한, 폐쇄 경로(예를 들어, 폐쇄 경로 미세유체 경로 소자)에서 치료학적 폴리뉴클레오티드를 처리하기 위한 미세유체 경로 소자가 본원에 기술된다. 언급된 바와 같이, 이들 미세유체 경로 소자는 본원에서 미세유체 칩, 미세유체 경로 플레이트, 프로세스 칩, 바이오칩, 프로세스 플레이트 등으로 지칭될 수 있다. 일반적으로, 미세유체 경로 소자는 미세유체 경로 플레이트 소자일 수 있으며, 이는 실질적으로 평평한 플레이트-유사 구조일 수 있으며; 이들 구조는 비교적 얇을 수 있다(예를 들어, 수 mm 두께 미만, 예를 들어, 0.5-20 mm 두께, 0.5-15 mm 두께, 0.5-10 mm 두께 등). 본원에 기술된 미세유체 경로 소자는 일반적으로 적어도 부분적으로 투명할 수 있고, 특히, 미세유체 경로 소자의 상단에서 투명할 수 있어서, 하나 이상의 광 센서(카메라, CCD, 광섬유 등)가 본원에 기술된 미세유체 장치에 의해 사용될 때 미세유체 경로 소자와 함께 유체 이동 및/또는 탄성 층의 이동을 포함하는 작용을 감지하고, 검출하고, 모니터링하고, 기록하는 등에 사용될 수 있다.
도 2b는 본원에 기술된 바와 같이 사용될 수 있는 미세유체 경로 소자 제어 시스템의 한 변형의 개략적 예시이다. 이 예에서, 장치는 단일 용도 소자일 수 있는 하나 이상의 미세유체 경로 소자(211)를 보유할 수 있는 안착 마운트(215)를 둘러싸는 하우징(203)을 포함한다. 하우징은 덮개 또는 개구를 포함할 수 있는 챔버, 엔클로저 등일 수 있고; 폐쇄되는 경우 밀봉될 수 있다. 하우징은 열 조절기를 둘러쌀 수 있고/있거나 열 조절된 환경(예를 들어, 냉장 유닛 등)에 둘러싸이도록 구성될 수 있다. 하우징은 무균 장벽을 형성할 수 있다. 일부 변형에서, 하우징은 가습 또는 습도 제어 환경을 형성할 수 있다.
안착 마운트(215)는 고정되고 미리 정의된 배향으로 미세유체 경로 소자를 보유하도록 구성된 하나 이상의 핀 또는 다른 구성요소를 사용하여 미세유체 경로 소자를 고정하도록 구성될 수 있다.
일부 변형에서, 열 제어부(213)는 하나 이상의 미세유체 경로 소자(211)에 대한 온도를 조절하기 위해 안착 마운트(215)에 인접하게 위치될 수 있다. 열 제어부는 미세유체 경로 소자의 전부 또는 일부의 온도를 제어하기 위한 열전 구성요소(예를 들어, 펠티에 소자) 및/또는 하나 이상의 열 싱크를 포함할 수 있다. 일부 변형에서, 미세유체 경로 소자의 하나 이상의 영역의 온도를 개별적으로 조절하기 위해 하나 초과의 열 제어부가 포함될 수 있다. 열 제어부는 미세유체 경로 소자의 피드백 제어 및/또는 열 제어에 사용될 수 있는 하나 이상의 열 센서(예를 들어, 열전대 등)를 포함할 수 있다.
도 2b에서, 유체 인터페이스 조립체(209)는 액체 시약 및/또는 압력(예를 들어, 기체)을 안착 마운트(215)에 보유된 미세유체 경로 소자(211)와 결합시키고, 압력 공급원(217)으로부터 미세유체 경로 소자(211)의 내부로의 유체 물질뿐만 아니라 기체 양압/음압의 전달을 도울 수 있다. 유체 인터페이스 조립체는 하기에서 더 상세히 기술되는 바와 같이 미세유체 경로 소자(들)를 고정하는 것을 선택적으로 도울 수 있다. 유체 인터페이스 조립체는 사용 사이의 멸균을 위해 장치에 제거 가능하게 결합(및 제거될 수 있거나 일부 제거될 수 있음)될 수 있다.
시약 저장 프레임(207)은 복수의 유체 샘플 홀더를 함유하도록 구성되며, 이들 각각은 미세유체 소자(211)로의 전달을 위해 시약(예를 들어, 뉴클레오티드, 용매, 물 등)을 보유하도록 구성된 유체 바이알을 보유할 수 있거나, 대안적으로 유체 바이알은 미세유체 경로 소자(211)의 내부로부터 생성물을 수용하도록 구성될 수 있다. 시약 저장 프레임은 시약 랙(rack)으로 지칭될 수 있다. 일부 변형에서, 시약 랙은 하나 이상의 압력 공급원(217)을 독립적으로 또는 집합적으로(하위 조합으로) 제어될 수 있는 미세유체 경로 소자에 적용될 수 있는 복수의 압력 라인으로 나누도록 구성된 복수의 압력 라인 및/또는 매니폴드를 포함한다. 대안적으로, 유체 저장소(바이알 등)는 미세유체 경로 소자(들)에 대해 직접적으로 고정되고 밀봉되도록 구성될 수 있다.
유체 인터페이스 조립체는 복수의 유체 라인 및/또는 압력 라인을 포함할 수 있고, 안착 마운트(215)에 보유되는 경우 미세유체 경로 소자로 각각의 유체 및/또는 압력 라인을 개별적으로 그리고 독립적으로 구동시키는 편향된(예를 들어, 스프링 로딩된) 홀더 또는 팁을 포함할 수 있다 (또는 언급된 바와 같이, 대안적으로 소자는 직접적으로 스프링 탑재될 수 있다). 관류(예를 들어, 유체 라인 및/또는 압력 라인)는 유체 인터페이스 조립체의 일부일 수 있고/있거나 유체 인터페이스 조립체에 연결될 수 있다. 일부 변형에서, 유체 라인은 잠금 연동(예를 들어, 페룰) 및 미세유체 경로 소자에서 바이알을 관류에 결합시키는 커넥터를 통해 시약 저장 프레임 사이를 연결하는 가요성 관류를 포함한다. 유체 경로의 단부, 일부 변형에서, 유체 라인/압력 라인의 단부는, 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같이 미세유체 경로 소자에 형성된 예를 들어, 밀봉 포트에서 미세유체 경로 소자에 대해 밀봉되도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 유체 라인의 단부는 절단되거나, 평평하게(측면에서 수직)되도록 형성될 수 있다. 바이알은 압력 공급원에 또한 연결될 수 있는 커넥터를 통해 가압될 수 있다(예를 들어, > 1 atm 압력, 예를 들어, 2 atm, 3 atm, 5 atm 등). 예를 들어, 유체 바이알은 1-20 psig(예를 들어, 5 psig/20 psia, 10 psig 등)로 가압될 수 있다. 음압 또는 양압이 적용될 수 있고; 예를 들어, 진공(예를 들어, -7 psig 또는 7 psia)이 적용되어 공정의 종료시에 바이알(예를 들어, 저장소)로 유체를 다시 끌어들일 수 있다. 일반적으로, 유체 바이알은 공압 밸브보다 낮은 압력에서 구동될 수 있으며, 이는 누출을 방지하거나 감소시킬 수 있다. 일부 변형에서, 유체 및 공압 밸브 사이의 압력 차이는 약 5 psi(예를 들어, 약 7 psi, 10 psi, 12 psi, 15 psi, 20 psi 등)일 수 있다.
각각의 바이알은 코딩될 수 있다(예를 들어, 하기 기술되는 바와 같이 하나 이상의 센서에 의해 판독될 수 있는 식별자에 의함). 제어기는 유체 수준 및 따라서 유체 인터페이스 조립체에서의 각각의 물질의 양을 모니터링할 수 있다.
장치는 또한 미세유체 경로 소자(211)의 영역에서 자기장을 생성하도록 구성될 수 있는 자기장 어플리케이터(219)를 포함할 수 있다. 광 센서일 수 있는 하나 이상의 센서(205)는 장치의 일부일 수 있고, 바코드, 시약 저장 프레임 내에 보유된 유체 바이알 내의 유체 수준, 및 소자가 장착 시트(215) 내에 장착되는 경우 미세유체 경로 소자(211) 내의 유체 이동 중 하나 이상을 감지할 수 있다.
센서는, 예를 들어, 광학 지표를 측정함으로써 소자 상의 공정을 측정할 수 있다. 일부 변형에서, 수율을 추정하기 위해 시각/광학 마커가 사용될 수 있다. 예를 들어, 형광은 형광단으로 태깅함으로써 공정 수율 또는 잔류 물질을 검출하는 데 사용될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 동적 광 산란은 미세유체 경로 소자의 일부(예를 들어, 혼합 부분) 내의 입자 크기 분포를 측정하기 위해 사용될 수 있다. 일부 변형에서, 센서 측정은 광(예를 들어, 레이저 광)을 전달하고 나오는 광 신호를 검출하기 위해 1개 또는 2개의 광섬유를 사용하여 수행될 수 있다. 기기 패키지는 소자에서 원격으로 장착될 수 있다. 상기 비-접촉 감지가 바람직할 수 있다.
본원에 기술된 임의의 방법 및 장치에서, 센서(예를 들어, 비디오 센서)는 미세유체 경로 소자(예를 들어, 칩 또는 카트리지) 상에서의 모든 활동을 기록할 수 있다. 예를 들어, 물질(예를 들어, 치료학적 RNA)을 합성하고/하거나 처리하기 위한 전체 실행은, 예를 들어, 위에서부터 미세유체 경로 소자를 시각화할 수 있는 비디오 센서를 포함하는 하나 이상의 비디오 센서에 의해 기록될 수 있다. 미세유체 경로 소자 상에서의 처리는 시각적으로 추적될 수 있으며, 이러한 기록은 이후의 품질 관리 및/또는 처리를 위해 유지될 수 있다. 따라서, 처리의 비디오 기록은 후속 검토 및/또는 분석을 위해 저장되고/되거나, 보관되고/되거나, 전송될 수 있다.
예를 들어, 하우징(233) 내의 장치의 내부 부분은 살균 가능하도록 추가로 구성될 수 있다. 특히, 장치의 일부는 분리되어 개별적으로 살균될 수 있다. 살균은, 예를 들어, UV 조사, 또는 오염을 제한하거나 규제 요건을 충족시키기 위해 필요할 수 있는 임의의 다른 살균 방법에 의해 수행될 수 있다. 하우징을 포함하는 장치는 고효율 미립자 공기(HEPA) 여과된 환경 내에 수용될 수 있다. 하우징을 포함하는 장치는 온도 제어 인클로저 내에 수용될 수 있다. 또한, 장치 자체가 온도 제어되는 하나 이상의 영역을 포함할 수 있다. 본원에 기술된 임의의 장치에서, 장치는 예를 들어, 저장 온도(예를 들어, -10℃ 내지 20℃의 온도, 예컨대 10℃, 4℃, -10℃ 등)에서 시약을 저장하고/거나 mRNA(예를 들어, 치료학적 mRNA)를 저장하기 위한 온도 제어 영역을 (예를 들어, 하우징 내) 포함할 수 있다. 이들 장치 중 임의의 것은 개별적으로 또는 하나 이상의 추가적인 mRNA 및 전달 비히클과 조합되어 화합될 수 있는 제조된 mRNA의 라이브러리를 포함할 수 있다.
상기 언급된 바와 같이, 미세유체 경로 소자 제어기 시스템은 적어도 유체 이동을 구동시키기 위해 미세유체 경로 소자(211)를 통해 압력을 가하는 것을 포함하여 제어기(221)에 의해 제어될 수 있다. 제어기는 완전히 또는 부분적으로 하우징 외부에 있을 수 있다. 제어기는 사용자 입력/출력을 포함하도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 시스템의 사용자 인터페이스(223)는 장치 및 미세유체 경로 소자(들)의 용이한 작동 및 지시를 허용할 수 있다.
본원에 기술된 임의의 장치는 도 2b에 도시된 구성요소의 전부 또는 일부를 포함할 수 있으며; 모든 구성요소가 필요한 것은 아니다. 도 2b에서, 구성요소 사이의 연결 중 일부만 제시되며; 추가의(또는 대안적인) 연결이 사용될 수 있다.
미세유체 경로 소자 제어 시스템은 시약의 공급, 유체 제어, 온도 제어, 혼합, 정제 및 공정 모니터링과 같은 미세유체 경로 소자 내부의 생산 활동을 모두 지원할 수 있다. 미세유체 경로 소자 제어 시스템에 대한 제조 활동은 적용 소프트웨어를 통해 접근하고 제어될 수 있다.
미세유체 경로 소자는 치료학적 (예를 들어, 치료학적 mRNA) 물질을 정밀하게 제조하기 위해 수행되는 제조 단계를 위한 하나 이상의 반응기를 포함하도록 구성될 수 있다. 동일한 미세유체 경로 소자는 직렬 및/또는 병렬로 미세유체 경로 소자 제어 시스템의 연속 경로 특성을 방해하지 않으면서 하나 이상의 미세유체 경로 소자에서 작동할 수 있다. 예를 들어, 다중 미세유체 경로 소자를 사용하여 다중 반응기에서 수행된 다중 처리 단계를 사용하여 치료제를 제조할 경우, 하나의 미세유체 경로 소자로부터의 부분 생성물을 포함하는 유체 생성물(들)은 미세유체 경로 소자 제어 소자의 보관 저장소 부분으로 미세유체 경로 소자 생성물(들)을 함유하는 유체를 이동함에 의한 것을 포함하여, 장치에 의해 밀폐 경로 방식으로 하나 이상의 추가적인 미세유체 경로 소자에 전달될 수 있다.
각각의 미세유체 경로 소자는 제조 공정 동안 처리하기 위한 하나 이상의 반응기를 포함하도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 도 3a-3c는 미세유체 경로 소자의 3가지 예를 예시한다. 이들 예는 3가지 구별되는 유형의 미세유체 경로 소자를 예시한다: 주형 미세유체 경로 소자(도 3a), 시험관내 전사(IVT) 미세유체 경로 소자(도 3b) 및 제형화 미세유체 경로 소자(도 3c). 이들 미세유체 경로 소자 예 각각은 제어되고 고도로 재현가능한 방식으로 일련의 단위 작업을 수행하기 위한 특징을 포함하도록 구성될 수 있다.
일부 변형에서, 미세유체에 경로 소자는 2개의 융기된 층 사이에 끼워진 가요성 멤브레인과 2개 초과의 강성 층으로 구성된 다중층 구조로서 구성될 수 있다. 도 4는 본원에 기술된 바와 같은 치료제를 처리하기 위한 반응기를 형성하는 다중 층을 갖는 다중유체 경로 소자의 한 예를 통한 단면도(미세유체 경로 소자의 평면을 가로지름)를 예시한다. 반응기는 다중층으로부터 형성된 펌핑 챔버를 포함하는 밀봉부, 채널, 밸브 및 챔버를 포함할 수 있다. 예를 들어, 미세유체 경로 소자는 2개 이상의 강성 또는 반-강성 플레이트(403, 405) 및 적어도 하나의 탄성 층(407)으로 형성될 수 있다. 탄성 층(407)은 액체-투과성인 탄성 물질의 시트일 수 있다. 다양한 영역을 포함하는 탄성 층은 다소 기체 투과성일 수 있거나, 다소 기체 투과성으로 처리될 수 있다. 탄성 물질의 단일 연속 시트가 사용될 수 있지만, 일부 변형에서 다중 탄성 물질 시트가 사용되거나, '시트'는 다중 시트의 섹션으로 형성될 수 있다. 층 및 탄성 시트는 함께 적층될 수 있다. 일반적으로, 유체를 유지, 밸브 처리 및/또는 펌핑하기 위한 챔버는 탄성 층의 어느 한쪽 측 상의 플레이트에 형성되어 탄성 층이 챔버를 액체 함유 측 및 압력(예를 들어, 기체) 인가측으로 이등분할 수 있다. 챔버(들)의 전체 부피는 일정할 수 있으며, 제1(예를 들어, 상부) 플레이트와 제2(예를 들어, 하부) 플레이트 둘 모두 안으로 형성될 수 있지만, 이 부피는 압력측 및 액체측으로 분할될 수 있다. 압력 측으로 양압 또는 음압을 가함으로써 탄성 시트는 액체 함유 측의 부피를 감소시키거나(영으로 낮추고 챔버를 밀폐시킴) 액체 함유 측의 부피를 (소정의 최대 부피로) 증가시키기 위해 변형될 수 있다. 챔버의 압력 인가측은 예를 들어, 하나 이상의 챔버의 압력 수용 측(419)에 음압 또는 양압을 인가하기 위해, 예를 들어 압력 채널(447)에 연결되는 상부 플레이트(403)의 압력 포트(443)를 통해 연결될 수 있다. 각 챔버의 압력 인가측 반대편의 액체 함유 측(417)은 유체 채널(421)을 통해 유체 포트(423)에 연결될 수 있다. 유체 포트와 압력 포트 둘 모두는 상부 플레이트(403)와 탄성 층(407)으로의 개구에 의해 형성될 수 있으며, 이는 압력 라인이 반대쪽 강성 또는 반강성 층(들)(405, 409)에 의해 포트의 밑면 상에 지지되는 탄성 층(407) 내로 밀려가기 때문에 여러 개의 다른 입력 라인이 존재하는 경우 대기로부터 분리되는 밀봉된 연결을 허용한다.
도 4에서, 미세유체 경로 소자(400)는 제1(예를 들어, 상단 또는 상부) 표면(411) 및 제2 (하단 또는 하부) 표면(429), 및 둘 사이의 두께를 갖는 갖는 제1 (예를 들어, 상부) 플레이트를 포함한다. 제1 표면(411)은 노출된 외부 표면을 형성할 수 있다. 미세유체 경로 소자는 또한 제1(예를 들어, 상부 또는 상단) 표면(431) 및 제2(예를 들어, 하부 또는 바닥) 표면(433) 및 그 사이의 두께를 갖는 제2 플레이트(405)를 포함한다. 탄성 층(407)은 제1 플레이트(403)의 제2 표면(429)과 제2 플레이트(405)의 제1 표면(431) 사이에 끼워진다. 제3 플레이트(409)는 직접 또는 간접적으로 제2 플레이트의 제2 표면(433) 상의 제2 플레이트에 결합된다. 제3 플레이트(409)는 또한 제1 (예를 들어, 상부 또는 상단) 표면 및 제2 (하부 또는 하단) 표면 및 이들 사이의 두께를 갖는다. 제3 플레이트의 제2 표면은 미세유체 경로 소자의 하단 표면을 형성할 수 있다. 임의의 플레이트는 다중 층을 형성할 수 있으며, 이는 적층될 수 있거나 함께 연결될 수 있다. 예를 들어, 도 4에서, 제3 플레이트(409)는 제3 플레이트를 제2 플레이트에 결합시키는 것을 도울 수 있는 선택적인 제2 탄성 층(413)을 포함하며; 이러한 예에서 제2 탄성 층(413)은 제3 플레이트(409)의 제1 표면(435)을 형성한다. 도 4에 도시된 층 및 플레이트는 축척으로 작성되지 않을 수 있다(예를 들어, 탄성 층(407)은 플레이트에 비해 더 얇을 수 있다).
도 4에 도시된 미세유체 경로 소자(400)는 또한 각각 고정된 부피를 갖는 복수의 챔버(415, 416, 418, 420)를 포함할 수 있다. 이들 챔버는 제1 플레이트(403)의 제2(바닥) 표면(429) 및 제2 플레이트(405)의 제1(상부) 표면(431)으로의 절단 영역(예를 들어, 둥근/곡선 절단부)에 의해 형성되며; 탄성 층(407)은 각각이 액체 함유 측(417) 및 압력(예를 들어, 기체 함유) 측(419)을 포함하도록 이들 챔버(415)를 분기시킨다. 미세유체 경로 소자(400)는 또한 다수의 액체(예를 들어, 유체) 채널을 포함할 수 있다. 도 4에서, 단일 유체 채널(421)은 제1 플레이트(403)의 두께를 통해 통과하는 유체 포트(423)로부터 탄성 층(407)을 통과하여 유체 채널 개구(425)까지 그리고 제2 플레이트(405)의 두께의 대부분을 통해 통과하여 제2 플레이트의 바닥 표면까지 아래로 연장되는 것으로 도시되며, 여기서 제3 플레이트의 바닥 표면과 평행하게 연장되는 액체 채널(421)의 길이는 제2 플레이트의 바닥 표면(433)에 형성되며, 제3 플레이트(409)의 상부 표면에 의해 경계를 이룬다.
유체 포트(423)와 관련하여, 제1 플레이트의 두께를 통과하여 연장되는 유체 포트(423)를 형성하는 제1 플레이트(403)로의 개구의 직경은 탄성 층(407)을 통과하여 액체(예를 들어, 유체) 채널(421) 내로 연장되는 유체 채널 개구(425)의 직경보다 클 수 있다. 유체 채널 개구(425)는 유체 포트 개구의 바닥에 대해 중앙에 있을 수 있고, 유체 포트에 연결될 유체 라인 또는 유체 라인 결합 인터페이스의 적어도 예상 벽 두께만큼 유체 포트 개구의 벽으로부터 오프셋될 수 있다.
유체 채널(421)은 제1 챔버(415)의 액체 함유 측(417)에 연결된다. 이러한 제1 챔버는 상대적으로 낮은 보유 부피(고정 부피)를 갖지만, 탄성 층(407)의 움직임에 의해 완전히 개방되거나 폐쇄될 수 있는 밸브로서 구성될 수 있다.
미세유체 경로 소자(400)는 또한 양압 및/또는 음압을 가하도록 독립적으로 제어될 수 있는 복수의 압력 채널을 포함한다. 도 4에서, 제4 챔버(420)에 연결된 단일 압력 포트(443)가 도시되지만, 각각의 챔버(415, 416, 418)는 이들 챔버를 분기시키는 탄성 층(407)의 일부의 움직임을 독립적으로 작동 및 제어하기 위한 별도의 압력 포트 및 압력 채널에 연결되어 각 챔버를 독립적으로 밸브 조절 및/또는 펌핑시킬 수 있다. 일부 변형에서, 압력 포트는 다수의 챔버 사이에서 공유될 수 있다. 도 4에서, 압력(예를 들어, 기체) 포트(443)는 유체(예를 들어, 액체) 포트(425)와 유사하고, 제1 플레이트(403)를 완전히 관통하여 노출된 탄성 층(407)까지 아래로 압력(예를 들어, 기체) 채널 개구(445)를 형성하는 탄성 층을 통과하는 개구부까지의 개구를 포함한다. 압력 채널 개구(445)는 압력 포트(443)로부터 연장되는 압력(예를 들어, 기체) 채널(447)과 연속하고, 제1 플레이트(403)의 두께 대부분을 통과하고, 제2 플레이트의 바닥을 따라 컷-아웃 채널에서(또는 대안적으로 제3 플레이트의 상단의 컷-아웃 영역으로) 제2 플레이트 및 탄성 층(407)을 통해 제4 챔버(420)의 압력(예를 들어, 기체) 함유 부분(419)에 연결되는 제1 플레이트 내의 압력 채널의 영역으로 다시 올라간다. 유사한 유체(예를 들어, 액체) 포트에 대해 설명된 바와 같이, 제1 플레이트(403)의 두께를 통과하는 압력 포트(443)의 직경은 탄성 층(407)을 통한 압력 채널 개구(445)의 직경보다 클 수 있고, 압력 포트에 연결될 압력 라인 또는 압력 라인 결합 인터페이스의 벽 두께보다 더 크게 중앙에 놓이거나 오프셋될 수 있다.
도 4에 도시된 미세유체 경로 소자(400)를 통한 단면에서, 제시되지 않은 다른 유체(예를 들어, 액체) 라인, 유체 포트, 압력 라인 및 압력 포트에 대한 다수의 연결이 있으며, 이는 제시된 평면을 벗어날 수 있다. 예를 들어, 도 4에서, 제4 챔버의 액체 함유 측 또는 함유부(417)는, 예를 들어, 액체 함유 측(417)으로부터 연장되는 출구 채널을 포함하는 추가 밸브(챔버) 및/또는 채널에 연결될 수 있다. 도시되지 않은 추가 챔버(예를 들어, 밸브로서 구성됨)는 상기 기술된 바와 같이 형성될 수 있다. 일부 변형에서, 출구 채널은 유체를 또 다른 유체 포트(미도시됨)를 통해 하나 이상의 챔버로부터 유체 수용 저장소, 예를 들어, 바이알, 튜브 등에 전달할 수 있다. 이러한 수용 저장소는 시약 저장 프레임에 보유될 수 있다.
일반적으로, 미세유체 경로 소자 및 미세유체 장치의 이러한 구성은 임의의 수동 개입을 필요로 하지 않고 완전히 밀폐된(대기로부터 밀봉되고 보호된) 방식으로 미세유체 경로 소자 상의 장치에 의해 다수의 복잡한 단계가 실행될 수 있도록 구성된다. 유체는 고정 부피 챔버를 사용하여 계량될 수 있고, 탄성 층의 영역을 편향시키기 위해 공압을 적용시킴으로써 이동되고, 혼합되고, 여과되고, 그 밖의 작용이 이루어질 수 있다.
일부 변형에서, 미세유체 경로 소자 내의 챔버는 미세유체 경로 소자 내의 유체를 혼합하기 위한 혼합 챔버로서 구성될 수 있다. 일부 변형에서, 챔범(들)는 투석 챔버로서 구성될 수 있으며, 이는 유채 내부의 물질을 투석하기 위한 투석 물질 및 하나 이상의 역류 채널을 포함할 수 있다. 일부 변형에서, 하나 이상의 챔버는 치료학적 물질(들)을 농축하기 위한 농축기로서 구성될 수 있다.
다양한 미세유체 경로 소자는 채널, 포트 및 챔버의 다양한 배열을 가질 수 있지만, 이들은 또한 다양한 프로토콜을 수행하기 위해 상이한 구성으로 사용될 수 있는 유사한 기본 구조 및 여러 기능 요소를 또한 공유할 수 있다. 기능 요소는 상기 기술된 바와 같이 입력 포트, 계량 밸브, 펌프, 반응 챔버, 혼합 구조 및 정제 구조를 포함한다.
임의의 이러한 미세유체 경로 장치는 하나 이상의 기포 제거 챔버를 포함할 수 있거나, 챔버의 유체 접촉 측의 임의의 챔버는 기포 제거 챔버로서 구성될 수 있으며, 여기서 유체 함유 측의 유체 내의 기포가 제거될 수 있다. 기포 제거 챔버는 진공 캡으로서 지칭될 수 있으며, 챔버의 유체 접촉 측 내부에 유체가 보유되는 동안 멤브레인 반대측 상의 음압을 가하도록 일반적으로 구성될 수 있다. 멤브레인은 언급된 바와 같이 적어도 부분적으로 기체-투과성일 수 있다. 도 19는 기포 제거 챔버의 예를 보여준다. 챔버를 분할하는 멤브레인의 전체 또는 더욱 바람직하게는 일부(1988)(예를 들어, 단지 캡 영역)는 도 19c에 도시된 바와 같이 예를 들어, 소자의 상부 표면 또는 상부 플레이트에서 진공 라인(1987)을 통해 진공과 접촉될 수 있다. 작동 시, 진공 캡(1938)은 챔버의 유체 접촉 측 내부에 유체를 보유하고 챔버의 상부(압력 수용) 측에 음압을 가함으로써 라인 내에 기포를 제거하거나 감소할 수 있다. 챔버를 유체 접촉 측과 압력 수용 측으로 분할하는 멤브레인은 기체 투과성일 수 있어서 음압은 유체 경로 위에 놓인 막을 통해 기체(예를 들어, 공기, 질소 등)를 끌어당겨 액체(유체) 측으로부터 기체를 제거할 수 있다. 예를 들어, 멤브레인 또는 진공 캡의 멤브레인 영역은 예를 들어, 폴리디메틸실리콘(PDMS) 엘라스토머 필름일 수 있으며, 이는 멤브레인의 액체측으로부터 기체를 제거하기에 충분한 기체 투과성이다. 본원에 기술된 바와 같은 (예를 들어, 제1 플레이트와 제2 플레이트 사이에 형성된) 고정된 부피를 갖는 유체 챔버는 하나 이상의 기체 제거 챔버(진공 캡)를 포함하거나 이에 결합될 수 있으며/거나 기포 제거 챔버로서 구성될 수 있다. 일부 변형에서, 예를 들어, 제2 표면(및/또는 제2 플레이트)의 유체 접촉 측 및 제1 표면(및/또는 제1 플레이트)의 압력 수용 측으로 나누는, 챔버를 형성하는 제1 및 제2 표면 사이에 배치된 탄성 층 부분은 단지 최소한으로만 편향될 수 있다(또는 전혀 평향되지 않지 않을 수 있다). 예를 들어, 상부 압력 수용 측은 최소로 이격되고/거나 이완된 멤브레인과 거의 같은 높이(예를 들어, 평면)일 수 있는 반면, 유체 접촉 측은 오목하고, 제2 표면(제2 플레이트)으로 연장된다. 제어기는 예를 들어, 밸브의 압력 수용 측에 양압을 가함으로써 예를 들어, 진공 캡의 한쪽 측 또는 양쪽 측(입구 및 출구)에 있는 밸브를 차단함으로써 진공 캡 영역 내부에 유체를 보유할 수 있으며, 진공 캡의 압력 수용 측에 음압을 가할 수 있다. 가해진 음압의 절대량(예를 들어, 음압의 크기)은 멤브레인을 편향시키기 위해 적용되는 것보다 작을 수 있다(예를 들어, 밸브 및/또는 펌프를 닫기 위해 적용된 양압의 절대값보다 작음). 대안적으로, 일부 변형에서, 멤브레인은 예를 들어, 챔버의 확대된 유체 접촉 측으로 유체를 끌어들이도록 제1 표면 및/또는 플레이트에 대해 편향(예를 들어, 위로 편향)되도록 구성될 수 있다. 멤브레인은 제1의 상부 표면에 대해 가해진 음압에 의해 유지되어 기포(예를 들어, 공기 버블)가 제거되게 할 수 있다. 제어기는 전체 또는 일부 기체를 제거하기에 충분한 기간(예를 들어, 1초 이상, 5초 이상, 10초 이상, 20초 이상, 30초 이상, 1분 이상, 1.5분 이상, 2분 이상, 5분 이상, 1초 내지 5분, 2초 내지 5분, 5초 내지 5분 등) 동안 진공 챔버에 유체를 보유할 수 있다. 도 9c에서, 압력은 소자의 제1 표면과 제2 표면(예를 들어, 제1 및 제2 플레이트) 사이에 형성된 챔버의 압력 수용 측과 소통하는 압력 라인(987)을 통해 가해질 수 있다. 진공 캡(938)에는 하나 이상의 밸브(992)가 달릴 수 있다. 유체는 진공 캡의 반대 측면에서 유체 라인(989)으로부터 유체 접촉 측을 벗어날 수 있다.
압력 캡의 챔버의 유체 접촉 측(본원에 기술된 밸브 및 반응기에서와 같이)은 제2 표면 및/또는 플레이트에 있을 수 있는 하나 이상의 유체 채널을 통해 각각의 챔버의 유체 접촉 측과 유체 연결되는 유체 포트와 유체 소통할 수 있다. 진공 캡의 압력 수용 측은 본원에 기술된 바와 같이 제2 플레이트를 통해 그리고 제1 플레이트를 따라 연장되는 압력 채널을 통해 압력 수용 포트 또는 측과 유체 연결되는 제1 표면/플레이트를 통해(예를 들어, 표면/플레이트 내로) 연장되는 압력 포트와 유체 소통할 수 있다.
본원에 기술된 임의의 미세유체 경로 소자는 미세유체 경로 플레이트 소자일 수 있으며, 상기 소자는 상기 기술된 바와 같이 실질적으로 얇다. 따라서, 플레이트 내/상으로의 처리는 임의의 폴리뉴클레오티드(예를 들어, mRNA)의 정제를 포함하여 실질적으로 2차원(2D)으로 수행될 수 있다. 2D에서의 폴리뉴클레오티드의 정제는 컬럼의 사용을 필요로 할 수 있고, 본원에 기술된 바와 같이 폐쇄 경로 환경 및/또는 작은 부피로 수행하기 어렵거나 불가능한 단계를 포함할 수 있는 종래 기술에 비해 특히 유리하다.
또한, 도 4에 예시된 바와 같이, 각각의 챔버의 유체 접촉 측(및/또는 압력 수용 측)은 압력 수용 측 내의 양압이 유체 접촉 측에 대해 탄성 층을 구동하는 경우 탄성 층이 제2 표면의 유체 접촉 측에 갭 없이 같은 높이로 안착되도록 구성될 수 있다. 일부 변형에서, 유체 접촉 측 및/또는 압력 수용 측은 오목할 수 있다. 오목부는 탄성 층이 유체 접촉 측(및/또는 압력 수용 측)의 벽에 대해 같은 높이로 쉽게 안착되도록 허용하는 다소 얕은 타원형 단면을 가질 수 있다. 탄성 층은 (예를 들어, 유체 접측 측의) 챔버의 무용한 보유 부분이 없도록 챔버의 벽에 대해 밀어낼(예를 들어, 안착시킬) 수 있다.
미세유체 경로 소자는 유체 이동 및 밸브 제어를 관리하는데 사용되는 공압 라인뿐만 아니라 시약 둘 모두에 대해 스프링 로딩된 연결 세트를 통해 미세유체 경로 소자 제어 시스템과 접속될 수 있다. 시약 및 기체 라인은 시약 바이알로부터 미세유체 경로 소자 내로 및 미세유체 경로 소자로부터 이출 바이알로 완전하게 밀봉된 경로를 생성하는 미세유체 경로 소자에 내장된 엘라스토머 층에 대한 압력에 의해 밀봉될 수 있다. 밀봉된 경로는 미세유체 경로 소자(들) 내부의 모든 반응에 걸쳐 유지될 수 있어, 대기와의 모든 접촉을 효과적으로 방지하고 오염 위험을 최소화시킨다.
본원에 기술된 미세유체 경로 소자 제어 시스템은 무균 제어 환경을 제공할 수 있으며, 시약을 로딩하고 산출물을 검색하기 위한 인터페이스를 포함할 수 있다. 본원에 기술된 임의의 장치(예를 들어, 시스템)에서, 장치는 제어된 환경을 제공하는 인클로저를 포함할 수 있다; 이러한 인클로저는 또한 제어된 환경 내에 배치될 수 있다. 예를 들어, 밀봉된 장치는 클래스 7 환경 내에 배치될 수 있는 클래스 5 환경일 수 있다.
미세유체 경로 소자(들)의 미세유체 경로 소자 제어 시스템은 모든 작동기에 단일 단계 연결을 제공할 수 있다. 이들 제어 시스템은 또한 시약 및 미세유체 경로 소자 식별자(예를 들어, 바코드) 모두를 스캔할 수 있으며, 유체 수준을 모니터링할 수 있다. 일반적으로, 이러한 미세유체 경로 소자 제어 시스템은 미세유체 경로 소자 기능의 전부 또는 일부를 자동화할 수 있으며, (예컨대, 예를 들어, 중간 공정 산출물의 광학 품질 제어 분석을 위해) 모니터링되거나, 저장되거나, 전송되거나 나중에 검토될 수 있는 모든 공정 단계의 육안 기록을 생성할 수 있다.
상기 언급된 바와 같이, 미세유체 경로 소자 제어 시스템은 미세유체 경로 소자가 정확하게 정렬되어 단지 단일 방향으로 삽입될 수 있도록 엔지니어링될 수 있는 하드웨어 예컨대, 네스트(미세유체 경로 소자 홀더)를 포함하는 미세유체 경로 소자 관리 시스템을 포함할 수 있다. 이는 예를 들어, 미세유체 경로 소자의 형상과 일치하는 네스트에서 2개의 핀 및/또는 노치를 통해 관리될 수 있다(오류: 참조 소스를 찾을 수 없다). 미세유체 경로 소자 관리 시스템(제어 시스템)은 또한 시약을 유지하기 위한 바이알 랙 및 이출 바이알, 모든 액체 및 밸브 움직임 및 생성물 이출을 기록하는 하향 카메라, 및 생성물 이출부를 포함한다. 바코드를 캡쳐하고 유체 수준을 검출하는 레일 상의 측면 카메라와 비드 조작을 위한 자석이 있는 로봇 팔. 미세유체 경로 소자는 온도 관리를 위해 펠티어 장치와의 우수한 접촉을 보장하는 진공 척(vacuum chuck)으로 제자리에 고정된다. 일단 미세유체 경로 소자가 제자리에 있으면, 모든 커넥터와의 매칭이 다웰 핀 가이드 시스템(dowel pin guided system)을 통해 미세유체 경로 소자 관리 시스템의 상단 부분을 낮춤으로써 단일 단계로 달성된다.
언급한 바와 같이, 미세유체 경로 소자 제어 시스템은 모든 전자 소자(CPU, 이더넷 RIO 장치 제어기 등)에 대한 인터페이스일 수 있는 제어 패널은 물론 공압 제어용 밸브 및 매니폴드, 및 압력 조절기를 포함할 수 있다. 임의의 이러한 시스템은 또한 HEPA 공기 여과 및 공기 흐름 관리를 통한 미생물학적으로 안전한 인클로저를 제공하는 생물안전 후드처럼 작용하는 냉장 캐비넷 또는 챔버(예를 들어, ISO 클래스 5 안전 캐비넷)를 포함할 수 있다. 또한, 이는 모든 시약이 제조 공정에 걸쳐 올바른 온도로 유지되는 것을 보장할 수 있다. 캐비넷에는 또한 미세유체 경로 소자 및 모든 내부 미세유체 경로 소자 관리 시스템 구성요소의 멸균을 위한 UV 램프가 장착될 수 있다. 미세유체 경로 소자 제어 시스템은 ISO 클래스 7 룸에서 그 자체인 환경(예를 들어, 6 ft x 6 ft ISO 클래스 5 미니 환경) 내부에 있을 수 있다. 시약 바이알 및 미세유체 경로 소자(들) 로딩을 포함하는 작업자와 시스템의 상호작용은 모두 무균 모범 사례에 따라 수행될 수 있다.
전달 비히클
본원에 기술된 방법 및 장치는 광범위한 어레이 mRNA 전달 비히클과 양립가능하다. 예를 들어, 전달 비히클은 전기천공 및 유전자 총, 아데노바이러스(AV) 또는 아데노 관련 바이러스(AAV), 엑소좀 및 리포좀을 통한 바이러스 전달, 양이온성 폴리머에 의한 캡슐화 및 지질 나노입자(LNP)와의 제형화와 양립가능할 수 있다.
치료제 제조
치료제를 제조하기 위한 방법 및 장치(예를 들어, 소자 및 시스템)가 본원에 기술된다. 이들 방법 및 장치는 매우 빠른 기간에 환자-특이적 치료제를 제조하는데 사용될 수 있다. 특히, 이들 방법 및 장치는 상기 기술된 바와 같이 mRNA와 같은 폴리뉴클레오티드를 기반으로 하는 치료제를 제조하는데 사용될 수 있다. 이 과정의 일부로서, 방법 및 장치는 IVT DNA 주형을 생성하고, IVT 반응을 수행하여 치료학적 mRNA를 생성하고, 치료학적 mRNA를 정제하고, mRNA를 전달 비히클과 제형화하여 치료학적 조성물을 형성하고, 최종 의약품의 제형화 후 처리를 수행하는 것을 포함하는 상기 기술된 단계의 일부 또는 모두를 수행할 수 있다.
IVT 주형 생성
DNA 주형을 제조하기 위한 방법, 특히 본원에 기술된 합성 DNA 주형을 제조하기 위한 방법은 특히 보다 우수하고, 보다 확장 가능하고, 보다 빠르고 안전한 백신 및 치료제에 특히 유용할 수 있다. IVT에 의한 mRNA 합성을 위한 합성 주형의 사용은 잠재적인 미생물 오염 방지를 포함하여 다양한 방식으로 유익하다. 합성 DNA 주형을 함유하는 용액은 일반적으로 오염 세포가 없으며, 세포 추출물이 없고, 세포로부터의 내독소가 없다. 이러한 용액은 특히 오염 세포, 세포 추출물 또는 내독소로 인한 독성 위험이 거의 없이 환자에 주사하기 위한 백신의 일부로 특히 적합할 수 있다.
일부 변형에서, 본원에 기술된 시험관내 전사 촉진제 카세트(IFC)는 시험관내 전사 가능한 이중 가닥 DNA이다. 도 6은 이중 가닥 DNA 주형을 제조하는데 유용한 시험관내 전사 촉진제 카세트의 예를 보여준다. 시험관내 전사 촉진제 카세트는 (예를 들어, 관심 삽입 유전자로부터) 효과적인 시험관내 전사를 촉진하기 위해 구성된 기능적 요소, 예컨대 프로모터, 5' 비번역된 영역(5'UTR)을 인코딩하는 부분, 3' 비번역된 영역(3'UTR)을 인코딩하는 부분 및 폴리A 테일을 인코딩하는 부분을 포함한다. 시험관내 전사 촉진제 카세트는 또한 관심 유전자의 발현을 위한 시험관내 전사 촉진제 카세트 내로 관심 유전자를 클로닝하는데 유용한 하나 이상의 링커 및 제한 부위를 포함하여 주형 선형화를 보장한다.
시험관내 전사 촉진제 카세트는 합성 또는 비합성으로 제조될 수 있지만, 일반적으로 합성으로 제조될 것이다. 일부 변형에서, 합성 시험관내 전사 촉진제 카세트를 제조하는 방법은 시중에서 입수가능한 DNA 합성기, 예컨대 Twist Bioscience (San Francisco, CA) 또는 ThermoFisher Scientific (Waltham, MA)로부터 입수가능한 것들을 사용하는 것을 포함한다. 또한, 시험관내 전사 촉진제 카세트는 별도의 DNA 조각으로 조립될 수 있거나, 한 조각으로 합성될 수 있다. 일부 구현예에서, 시험관내 전사 촉진제 카세트는 선형이며, 함께 결찰될 수 있는 양립가능한 말단을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 시험관내 전사 촉진제 카세트는 원형이다. 일부 구현예에서, 원형 시험관내 전사 촉진제 카세트는 순서대로 프로모터, 5' UTR, 링커 영역, 3' UTR 및 적절한 제한 엔도뉴클레아제의 적용시 폴리A 영역을 인코딩하는 부분을 함유하는 선형 DNA를 생성하도록 구성된, 프로모터와 폴리A 영역을 인코딩하는 부분 사이의 부위(예를 들어, 제한 엔도뉴클레아제 부위)를 포함한다. 일반적으로, 시험관내 전사 촉진제 카세트는 항생제 내성 유전자를 인코딩하지 않는다. 예를 들어, 합성으로 합성된 시험관내 전사 촉진제 카세트는 생물학적(예를 들어, 박테리아) 세포에서 성장하지 않으며 항생제 선택을 필요로 하지 않기 때문에 항생제 내성 유전자를 필요로 하지 않는다. 일반적으로, 시험관내 전사 촉진제 카세트는 복제 기점(ori) 또는 DNA 복제를 촉진하기 위한 관련 제어 요소를 갖지 않는다. 예를 들어, 합성으로 합성된 시험관내 전사 촉진제 카세트는 생물학적(예를 들어, 박테리아) 세포에서 성장하지 않으며 복제를 위한 ori가 필요하지 않기 때문에 ori를 필요로 하지 않는다. 시험관내 전사 촉진제 카세트의 총 길이는 많은 플라스미드보다 작을 수 있다. 시험관내 전사 촉진제 카세트는 2kb 미만 길이, 1.5 kb 미만 길이, 1.0 kb 미만 길이, 900 bp 미만 길이, 800 bp 미만 길이, 700 bp 미만 길이, 또는 600 bp 미만 길이일 수 있다.
상기 나타낸 바와 같이, 시험관내 전사 촉진제 카세트는 프로모터를 포함한다. 효소 RNA 중합효소는 프로모터에 결합하고, 관심 유전자로부터 RNA의 전사를 개시한다(예를 들어, 이중 가닥 DNA 주형이 카세트 및 관심 유전자로부터 조립체된 후). 카세트에서 전사에 유용한 프로모터의 예는 천연 또는 변형된 T7 프로모터, 천연 또는 변형된 T3 프로모터 또는 천연 또는 변형된 SP6 프로모터를 포함한다.
시험관내 전사 촉진제 카세트는 또한 교환가능한 5' 비번역된 영역(5' UTR)을 인코딩하는 부분 및 교환가능한 3' 비번역된 영역(3' UTR)을 인코딩하는 부분을 포함한다. 이들 자체가 단백질 또는 펩티드로 번역되지 않는 이들 영역은 mRNA의 단백질 또는 펩티드로의 번역 조절을 돕는다. 시험관내 전사 촉진제 카세트는 또한 폴리A 테일을 인코딩하는 부분을 포함한다. mRNA의 폴리A 테일은 수십 또는 수백 개의 반복되는 아데닌 잔기의 긴 사슬이다. mRNA의 폴리A 테일은 세포의 세포질에서 mRNA의 안정성을 증가시키고, mRNA의 단백질로의 번역을 돕는 것과 같은 여러 기능을 수행하는 것으로 여겨진다. mRNA의 주형에 있는 DNA에 의해 직접 인코딩되는 mRNA의 나머지 서열과 달리, 폴리A 테일은 DNA(예를 들어, 자연적)에 의해 일반적으로 직접적으로 인코딩되지 않는다. 오히려, 자연 발생 DNA는 폴리아데닐화 신호(예를 들어, AATAAA)로 불리는 약식 신호를 함유하며, 이는 다른 DNA 서열과 함께 합성되는 mRNA에 폴리A 테일을 추가하기 위해 세포의 전사 기구에 신호를 보낸다. 즉, 자연적으로 발생하는 mRNA에서 폴리A 테일의 길이는 mRNA를 만드는 세포에 의해 결정된다. 도 6에 제시된 바와 같이, 본원에 기술된 바와 같은 시험관내 전사 촉진제 카세트는 폴리A 테일(예를 들어, 전체 테일)을 직접적으로 인코딩하는 DNA의 영역을 포함한다. 폴리A 테일의 길이는 폴리A 테일을 직접적으로 인코딩하는 DNA의 영역의 길이(예를 들어, 아데닌 또는 폴리A의 수 또는 티미딘 또는 폴리T의 수)에 의해 결정된다. 폴리A 테일을 직접 인코딩하는 DNA의 영역의 길이는 적어도 100 bp, 적어도 200 bp, 적어도 300 bp, 적어도 400 bp, 또는 적어도 500 bp일 수 있으며, 이들 크기 사이의 임의의 크기(예컨대, 350 염기쌍 길이)일 수 있다. 폴리A 테일은 나머지 mRNA를 생성하는데 사용된 것과 동일한 공정을 이용하여 주형으로서 카세트를 사용하여 제조된 mRNA에 추가될 수 있다. 이것의 한 가지 장점은 폴리A 테일을 포함하는 전체 mRNA를 생성하는 공정이 크게 단순화된다는 것이다. 살아있는 세포 및 세포 DNA, 세포 RNA, 세포 멤브레인 단백질 및 다른 구성요소를 함유하는 세포로부터의 복합 추출물은 mRNA를 생성하기 위해 필요하지 않다. 대신에 잘 정의된 전사 혼합물을은 본원에 기술된 바와 같인 이중 가닥 DNA 주형으로부터 폴리A 테일을 포함하는 전체 mRNA를 생성하는데 사용되어, 전사 혼합물에 일반적으로 독성 부산물이 함유되지 않게 하며, 그렇지 않으면 이러한 독성 부산물은 세포 또는 세포 추출물을 사용하여 제조되는 전사 혼합물에서 발견될 수 있다. 잘 정의된 혼합물은 단지 필요한 최소한의 세정만으로 환자에게 안전하게 전달될 수 있다. 이중 가닥 DNA 주형이 또한 독성 부산물을 실질적으로 비함유하는 잘 정의된 혼합물로부터 생성되는 경우, 이중 가닥 DNA 주형으로부터 제조된 전사 생성물은 단지 필요한 최소한의 세정만으로 환자에서 직접 주사하기에 적합하다. 독성 부산물을 실질적으로 함유하지 않는 잘 정의된 혼합물로부터 생성되는 이중 가닥 DNA 주형이 본원에 기술된다.
시험관내 전사 촉진제 카세트는 또한 하나 이상의 링커 영역을 포함한다. 링커 영역은 5' UTR 내지 3' UTR이다. 링커 영역은 적어도 하나의 절단 가능 부위 및 일반적으로 2개의 절단가능 부위를 포함한다. 2개 이상의 절단가능 부위가 존재하는 경우, 이들은 동일한 서열 또는 상이한 서열을 가질 수 있다. 하나 이상의 절단가능 제한 부위는 합성 선형 또는 원형 결찰된 생성물을 생성하기 위해 시험관내 전사 촉진제 카세트에 관심 유전자(GOI)를 삽입하는데 유용하다. 관심 유전자는 일반적으로 시험관내 전사 촉진제 카세트의 5'UTR과 3'UTR 사이에 삽입되지만, 일부 경우에는 5'UTR 또는 3'UTR 서열은 관심 유전자와 포함되어 관심 유전자와 함께 시험관내 전사 촉진제 카세트에 삽입될 수 있다. 절단가능 부위(들)는 제한 엔도뉴클레아제 부위, 예컨대 타입 II(타입 IIG, 타입 IIS) 제한 엔도뉴클레아제, 예컨대 New England Biolabs (NEB; Ipswich, MA); Promega Corporation (Madison, WI); 또는 ThermoFisher Scientific (Waltham, MA)로부터 입수가능한 BsaI, BbsI, AarI, HhaI, HindIII, NotI, BbvCI, EcoRI, BglII, FokI, AlwI, AcuI 또는 BcgI일 수 있다.
본원에 기술된 바와 같은 관심 유전자(GOI)는 기능적 생성물 분자(RNA 또는 단백질)를 일반적으로 인코딩하는 짧은 DNA 조각이다. 관심 유전자는 특정 단백질, 단백질의 일부 또는 특정 기능을 인코딩할 수 있다. 일부 경우에, 이는 특정 단백질 또는 단백질의 일부를 인코딩하지 않는 RNA를 생성하기 위한 명령을 함유할 수 있다(예를 들어, 이는 번역되지 않는 기능적 RNA를 인코딩할 수 있다).
시험관내 전사 촉진제 카세트에 삽입하기에 유용한 관심 유전자는 합성 또는 비합성으로 제조될 수 있지만, 일반적으로 합성으로 제조될 것이다. 관심 합성 유전자를 제조하는 방법은 Twist Bioscience (San Francisco, CA) 또는 ThermoFisher Scientific (Waltham, MA)로부터 입수가능한 것들과 같은 시중에서 입수가능한 DNA 합성기 및 방법을 이용하는 것을 포함한다. 또한, 관심 유전자는 별도의 DNA 조각으로부터 조립될 수 있지만, 이는 일반적으로 한 조각으로 합성된다. 관심 유전자는 DNA의 선형 조각 또는 원형 조각으로서 제조될 수 있다. 원형의 관심 유전자는 제한 효소로 분해되어 선형화된 관심 유전자를 형성할 수 있다. 제조된 관심 유전자는 정제될 수 있다(예를 들어, 컬럼, 전기영동 분리 등에 의해).
일반적으로 관심 유전자는 이를 시험관내 전사 촉진제 카세트와 조합하기 전에 절단될 것이다. 특히, 관심 유전자는 시험관내 전사 촉진제 카세트를 절단하는데 사용된 것과 동일한 제한 엔도뉴클레아제(들)로 절단될 수 있으나, 또한 효소 증폭을 통해 생성될 수 있다. 일반적으로, 관심 유전자는 항생제 내성 유전자를 인코딩하지 않는다. 예를 들어, 합성으로 합성된 관심 유전자는 생물학적(예를 들어, 박테리아) 세포에서 성장하지 않으며 항생제 선택을 필요로 하지 않기 때문에 항생제 내성 유전자를 필요로 하지 않는다. 일반적으로, 관심 유전자는 복제 기점(ori) 또는 DNA 복제를 촉진하기 위한 관련 제어 요소를 갖지 않는다. 예를 들어, 합성으로 합성된 관심 유전자는 생물학적(예를 들어, 박테리아) 세포에서 성장하지 않으며 복제를 위한 ori가 필요하지 않기 때문에 ori를 필요로 하지 않는다. 일부 구현예에서, 관심 유전자의 총 길이는 많은 플라스미드보다 작을 수 있다. 관심 유전자의 길이는 2 kb 미만, 1.5 kb 미만, 1.0 kb 미만, 900 bp 미만, 800 bp 미만, 700 bp 미만, 또는 600 bp 미만, 500 bp 미만, 400 bp 미만, 또는 300 bp 미만, 200 bp 미만, 100 bp 미만일 수 있다.
일부 예에서, 관심 유전자는 예컨대, CTCL 또는 T-세포 수용체(TCR) 또는 T-세포 수용체의 일부에 의해 매개되는 다른 질환 또는 질병을 치료하기 위한 T-세포 수용체(TCR) 또는 T-세포 수용체의 일부이다. 예를 들어, T-세포 발달에서 세포는 신규한 TCR 분자를 생성하고 발현하기 위해 T-세포 수용체(TCR) 유전자를 재배열해야 한다. TCR 재배열은 T-세포 발달 초기와 성숙한 T-세포 림프종, 예컨대 CTCL의 발단 전에 발생하기 때문에, 모든 악성 CTCL 세포는 고유한 TCR 알파 및 TCR 베타 서브유닛으로 구성된 동일한 클론 TCR을 발현한다. 이러한 TCR은 림프종 세포에 고유하며, 이는 다른 면역계에 대해 이종이 되게 하므로 치료를 위한 훌륭한 표적이 된다.
관심 유전자는 상보성 결정 영역(CDR) 영역의 일부 또는 전부일 수 있다. CDR은 TCR 서열의 고도로 가변적인 부분이며, 항원-주요 조직적합성 복합체(MHC)에 대한 T 세포의 결합을 매개한다. 도 8은 백신 또는 치료제에 사용하기 위한 이중 가닥 DNA를 제조하는데 유용한 T-세포 수용체의 한 영역을 보여준다. 특히, V(D)J와 C 영역 사이의 접합부에 걸쳐 있는 CDR3 영역은 가장 높은 가변성을 가지며, 림프종 세포에서만 발견되어야 하는 진정으로 고유한 단백질 단편을 나타낸다. 따라서, C 및 N 말단 모두에서 10개 아미노산으로 확장된 CDR3 영역은 백신 펩티드 단편을 구성한다. 일부 방법에서, T-세포 수용체(TCR) 또는 T-세포 수용체의 일부와 같은 유전자의 고유한 서열을 개체로부터 결정하고, 관심 유전자를 개체로부터의 T-세포 수용체(TCR) 또는 T-세포 수용체의 일부와 동일한 것으로 제조된다. 일부 경우에, 서열은 예컨대, 코돈 최적화 또는 최적화된 RNA 안정성 또는 발현을 위한 특정한 알려진 방식으로 제어 가능하게 변형될 수 있지만, 그럼에도 불구하고 관심 유전자의 서열은 개체로부터 얻은 서열을 기반으로 한다. 일부 구현예에서, 관심 유전자의 서열은 환자로부터의 DNA 서열과 동일한 DNA 서열을 갖거나 환자로부터의 DNA 서열에 대해 공지된 방식으로 제어가능하게 변형된 T-세포 수용체를 포함한다.
이중 가닥 DNA 주형을 만드는 방법, 특히 합성 이중 가닥 DNA 주형을 만드는 방법이 본원에 기술된다. 이중 가닥 DNA 주형은 예컨대, 백신 또는 주사용 다른 치료제 또는 환자에 대한 또 다른 전달 방식에 사용하기 위한 mRNA를 생성하기 위해 시험관내 전사를 수행하는 데 특히 유용할 수 있다.
시험관내 전사를 수행하기 위한 기존 DNA 주형 및 시험관내 전사를 수행하기 위한 혼합물은 일반적으로 미정제 또는 반정제된 세포 추출물(예를 들어, 박테리아, 기타 미생물 또는 기타 추출물)을 포함하며, 복잡하고 정의되지 않을 수 있다. 이러한 추출물은 박테리아, 기타 미생물 또는 기타 DNA, 내독소 및/또는 기타 바람직하지 않은 성분을 포함할 수 있다. DNA 주형을 생성하거나 백신 또는 치료학적 용도를 위한 공정의 일부로서 시험관내 전사를 수행하는데 사용되는 경우, 바람직하지 않은 구성요소는 심각한 부작용의 위험을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 내독소는 시험관내 전사 반응에 사용하기 위한 세포 추출물을 생성하기 위해 일반적으로 사용되는 공급원인 그람-음성 박테리아의 외부 세포벽에 있는 큰 분자의 리포폴리사카라이드이다. 예컨대, 주사에 의한 혈류의 내독소는 염증 및 패혈증과 같은 인간 및 다른 동물에서 다양한 문제를 일으킬 수 있으며 심각한 건강 위험을 초래한다. 본원에 기술된 방법은 생물학적 오염물(박테리아, 기타 미생물 또는 기타 오염물) 비함유, 박테리아(또는 기타 미생물 또는 원치 않는) DNA 비함유 및/또는 내독소 비함유의 이중 가닥 DNA 주형을 제조하는 데 특히 유용할 수 있다. 본원에 기술된 방법은 관심 유전자를 제조하기 위한 정의된 또는 합성 구성요소를 사용하고/거나 시험관내 전사 촉진제 카세트를 제조하고/거나 이중 가닥 DNA 주형을 제조하는 것 (또는 이들 물질을 제조하는데 사용된 임의의 중간체를 제조하는 것)을 포함할 수 있다. 정의된 또는 합성된 구성요소는 정의된 또는 합성된 성분, 예컨대 DNA 합성기, 정제된 뉴클레오티드 및 정제된 효소로부터 제조될 수 있다. 정의된 또는 합성 구성요소는 본질적으로 박테리아, 다른 미생물 또는 다른 DNA, 내독소 및/또는 다른 바람직하지 않은 구성요소를 함유하지 않을 수 있다. 생물학적 기반 구성요소의 사용을 피함으로써, 생물학적 오염물, 예컨대 DNA 및 내독소는 처음부터 DNA 주형(또는 기타 구성요소)을 오염시키지 않는다. 이중 가닥 DNA 주형 및 다운스트림 물질은 어렵거나 번거로운 정제 단계의 필요 없이 더 안전하다. 본원의 이러한 방법 및 기타 방법은 합성 관심 유전자를 합성 시험관내 전사 촉진제 카세트와 결합시켜 합성 선형 또는 원형 결찰된 생성물을 생성하는 단계; 미반응된 합성 관심 유전자 및 미반응된 합성 시험관내 전사 촉진제 카세트를 제거하는 단계; 원형 결찰된 생성물을 증폭시켜 선형, 원형 또는 분지형 증폭된 DNA를 생성하는 단계; 및 증폭된 DNA 결찰된 생성물을 선형화시켜 이중 가닥 DNA 주형을 생성하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 나타낸 바와 같이, 관심 유전자를 시험관내 전사 촉진제 카세트와 결합시켜 합성 선형 또는 원형의 결찰된 생성물을 생성하는 단계는 관심 유전자를 시험관내 전사 촉진제 카세트에 삽입하는 것을 포함할 수 있다. 도 7은 본원에 기술된 바와 같이 생성된 이중 가닥 DNA 주형을 보여준다. 관심 유전자 및 시험관내 전사 촉진제 카세트는 본원의 다른 곳에서 기술된 것과 동일한 제한 엔도뉴클레아제 부위(들)를 가질 수 있고, 방법은 관심 유전자 및 시험관내 전사 촉진제 카세트를 제한 엔도뉴클레아제 부위에 대한 제한 엔도뉴클레아제로 분해하고, 양립가능한 말단을 생성하고, 관심 유전자를 카세트에 결찰시키는 것을 포함할 수 있다. 이 방법은 관심 유전자, 시험관내 전사 촉진제 카세트, 제한 엔도뉴클레아제 완충액, 에너지 공급원, 하나 이상의 제한 엔도뉴클레아제 효소(들), 리가제 완충액 및 리가제를 조합하고, 혼합물을 적절한 시간 동안 인큐베이션하는 것을 포함할 수 있다. 완충액(들)은 특정 제한 엔도뉴클레아제 및/또는 리가아제에 적합하거나 최적화될 수 있으며, 하나의 완충액일 수 있거나 2개(또느 그 초과)의 완충액일 수 있다. 엔도뉴클레아제 및/또는 리가제 완충액은 시중에서 입수가능한 완충액(예를 들어, NEB, Promega)일 수 있으며/거나 약 7.4 내지 약 9.0의 pH의 Tris, 칼륨, 마그네슘, 염화나트륨 및 디티오트레이톨, 예컨대 Tris-아세테이트(예를 들어, 6 mM - 90 mM), 칼륨 아세테이트 (50 mM - 100 mM), 마그네슘 아세테이트(5 mM - 10 mM), 소 혈청 알부민(BSA; 50 ug/ml -200 ug/ml) 디티오트레이톨 (1 mM)을 포함할 수 있다. 리가제는 시중에서 입수가능할 수 있거나(예를 들어, NEB, Promega, Thermo Fisher Scientific), 다른 리가제, 예컨대 T3 DNA 리가제, T4 DNA 리가제 또는 T7 DNA 리가제일 수 있다. 분해는 10분 내지 4시간, 또는 그 사이의 임의의 시간(예를 들어, 30분, 1시간, 2시간 등)에서 발생할 수 있다. 결찰 단계는 10분 내지 4시간 또는 그 사이의 임의의 시간(예를 들어, 30분, 1시간, 2시간 등)에서 일어날 수 있다. 분해 및 결찰 단계는 동시에 또는 순차적으로 수행될 수 있다. 에너지 공급원은 아데노신 5'-트리포스페이트(ATP)(예를 들어, 0.1 mM 내지 5 mM)일 수 있다. 제한 엔도뉴클레아제 및 리가제와 같은 임의의 구성요소의 추가량은 시간이 지남에 따라 추가될 수 있으며, 인큐베이션은 계속될 수 있다. 일부 구현예에서, 무동물성(AOF)으로 인증된 물질만이 치료제 제조에 사용되어 감염원 전달의 위험을 감소시킬 것이다. 시험관내 전사 촉진제 카세트가 원형이 아닌 이들 방법 중 일부는 시험관내 전사 촉진제 카세트의 말단을 결찰시켜 원형의 시험관내 전사 촉진제 카세트를 생성시키는 단계를 포함한다. 대안적으로, 츄백(chew back) 방법과 같은 관심 유전자 및 시험관내 전사 촉진제 카세트를 결찰시키기 위한 다른 방법이 사용될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로 시험관내 전사 촉진제 카세트와 관심 유전자 사이의 결찰은 지수 증폭 방법 전에 선형 분자를 생성하기 위해 프라이머 확장을 사용하여 수행될 수 있다.
본원에 기술된 이러한 방법 또는 기타 방법은 합성 선형 또는 원형의 결찰된 생성물로부터 미반응된 합성 관심 유전자 및 미반응된 합성 시험관내 전사 촉진제 카세트를 제거하거나 미반응된 합성 관심 유전자 및 미반응된 합성 시험관내 전사 촉진인자로부터 이중 가닥 DNA를 정제하는 단계를 포함할 수 있다. 합성 원형의 결찰된 생성물로부터 미반응된 합성 관심 유전자 및 미반응된 합성 시험관내 전사 촉진제 카세트를 제거하는 단계는 적합한 엑소뉴클레아제 완충액(NEB; Promega, Thermo Fisher)에서 엑소뉴클레아제(예컨대, 엑소뉴클레아제 V)와 같은 효소를 사용하여 수행될 수 있다. 방법은 합성 관심 유전자 및 미반응된 합성 시험관내 전사 촉진인자를 분해하는 것을 포함할 수 있다. 방법은 수지 또는 컬럼, 예컨대 이온 교환 수지 또는 크기 배제 수지를 통해 분해된 혼합물을 통과시키는 단계, 및 컬럼에서 미반응된 합성 관심 유전자 및 미반응된 합성 시험관내 전사 촉진제 카세트를 보유시키거나 컬럼에서 이중 가닥 DNA 주형을 보유시키고, 이중 가닥 DNA 주형 또는 미반응된 합성 관심 유전자 및 미반응된 합성 시험관내 전사 촉진제 카세트를 수지 또는 컬럼을 통하여 통과시키는 단계를 포함할 수 있다. 일부 구현예는 또한 수지 또는 컬럼 내에 분해된 뉴클레오티드를 보유시키는 단계 또는 분해된 뉴클레오티드가 수지 또는 컬럼을 통하여 통과하게 하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 구현예는 수지 또는 컬럼을 세척하고/거나 용리시키는 것을 포함한다. 일부 구현예는 또한 수지 또는 컬럼 내에 분해된 뉴클레오티드를 보유하는 것을 포함할 수 있다. 일부 구현예는 미반응된 합성 관심 유전자 및 미반응된 합성 시험관내 전사 촉진제 카세트를 비드에 결합시키거나 이중 가닥 DNA를 비드에 결합시키는 단계, 비드를 자석으로 고정하는 단계, 및 이중 가닥 DNA 또는 이중 가닥 DNA로부터 미반응된 합성 관심 유전자 및 미반응된 합성 시험관내 전사 촉진제 카세트를 제거하는 단계를 포함한다. 수지, 컬럼 및 자석 비드는 Bangs Laboratories, Inc., (Fishers, IN), Beckman Coulter (Brea, CA), Millipore (Burlington MA), Thermo Fisher, VWR (Radnor, PA)와 같은 곳으로부터 입수가능하다. 일부 구현예는 메틸화 민감성 제한 효소의 사용을 포함할 수 있다.
본원에 기술된 이러한 방법 및 기타 방법은 선형 또는 원형의 결찰된 생성물을 증폭시켜 증폭된 DNA를 생성시키는 단계를 포함할 수 있다. 일부 방법은 선형 또는 원형의 결찰된 생성물을 증폭하여 선형의 증폭된 DNA를 생성하는 단계를 포함한다. 일부 방법은 선형 또는 원형의 결찰된 생성물을 증폭하여 선형, 분지형 또는 원형의 증폭된 DNA를 생성하는 단계를 포함한다. 증폭된 생성물은 헬리카제 의존적 증폭(HAD), 루프 매개된 등온 증폭(LAMP), 다중 변위 증폭(MDA), 핵산 서열 기반 증폭(NASBA), 중합효소 연쇄 반응(PCR), 롤링 원형 증폭(RCA), 자가 지속 서열 복제(3 SR) 또는 가닥 변위 증폭(SDA)을 사용하여 증폭될 수 있다. 반응을 위한 적절한 완충액, 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트(dNTP), 효소(DNA 중합효소) 및 프라이머가 필요에 따라 첨가된다. 증폭의 온도 및 시점은 제어된다. 방법은 선형 또는 원형의 결찰된 생성물(예를 들어, 70℃ 또는 그 초과 내지 100℃)을 가열하여 DNA를 변성시킨 후 DNA를 냉각시키는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 DNA를 변성시키기 위해 구성된 변성 완충액을 선형 또는 원형의 결찰된 생성물에 첨가하여 DNA를 변성시키는 단계, 및 그 후 중화 완충액을 변성된 DNA 혼합물에 첨가하여 중화 완충액을 중화하고 변성된 DNA를 남기는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 변성된 DNA를 증폭시키거나 확장시키기 위한 효소, 예컨대 DNA 중합효소(예를 들어, Bst DNA 중합효소, Φ29 DNA (Phi29) 중합효소, Taq DNA 중합효소)를 첨가하는 단계, 및 DNA를 효소로 증폭시키거나 확장시켜 증폭된 DNA(예를 들어, 분지형, 원형 또는 선형 증폭된 DNA)를 생성시키는 단계를 포함할 수 있다.
일부 방법은 완충액, 효소, 뉴클레오티드 및 기타 원치 않은 구성요소로부터 증폭된 또는 확장된 DNA를 정제하는 단계를 포함한다. 방법은 비드, 수지 또는 컬럼, 예컨대 이온 교환 수지, 자석 비드 또는 크기 배제 수지를 통하여 사용하는 증폭된 또는 확장된 DNA를 통과시키는 단계, 증폭된 또는 확장된 DNA를 유지하거나 증폭된 또는 확장된 DNA가 비드, 수지 또는 컬럼을 통과하게 하는 단계, 및 비드, 수지 또는 컬럼에서 원치 않은 효소 및 다른 구성요소를 유지하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 구현예는 수지 또는 컬럼을 세척 및/또는 용리 및/또는 건조 및/또는 재수화하는 단계를 포함한다. 일부 구현예는 이들 단계 중 하나 이상을 반복하는 것을 포함한다. 일부 구현예는 비드, 수지 또는 컬럼의 저장소 중 2개 이상(복수)을 포함하며, 세척/용리/건조 및/또는 재수화 단계 중 하나 이상을 반복하는 것을 포함한다. 일부 구현예는 DNA를 비드에 결합시키는 단계, 비드를 자석으로 고정하는 단계, 및 원치 않는 구성요소 및 오염물을 DNA 및 비드로부터 제거(세척)하는 단계를 포함한다. 사용에 적합한 수지, 컬럼 및 자석 비드는 Bangs Laboratories, Inc., (Fishers, IN), Beckman Coulter (Brea, CA), Millipore (Burlington MA), Thermo Fisher 및 VWR (Radnor, PA)로부터 입수가능하다.
일부 구현예에서, 증폭된 DNA는 선형이 아니다; 이는 분지형 또는 원형일 수 있다. 일부 방법은 DNA를 선형화하는 단계 및 선형화된 주형 DNA를 생성하는 단계를 포함한다. 일부 방법은 제한 엔도뉴클레아제(적절한 완충액 내)를 첨가하여 증폭된 또는 확장된 DNA를 정제하는 단계, DNA를 제한 엔도뉴클레아제와 인큐베이션하는 단계 및 DNA를 선형화시키는 단계를 포함할 수 있다. 제한 효소는 5'UTR, 관심 유전자, 3'UTR 및 폴리A 영역을 인코딩하는 부분의 외부를 절단하도록 선택된다. 일부 구현예에서, 제한 효소는 하나의 확장되거나 증폭된 DNA의 3'UTR과 인접한(및 다운스트림) 확장된 또는 증폭된 DNA의 5'UTR 사이를 절단한다. 제한 효소는 합성 선형 또는 원형 결찰된 생성물을 생성하기 위해 합성 관심 유전자를 합성 시험관내 전사 촉진제 카세트와 결합하기 위한 제한 효소 분해와 관련하여 상기 나타낸 바와 같은 임의의 제한 효소, 예컨대 타입 II 제한 효소일 수 있다. 일부 예에서, 제한 효소는 New England Biolabs (NEB; Ipswich, MA); Promega Corporation (Madison, WI); 또는 ThermoFisher Scientific (Waltham, MA)로부터 입수가능한 BsaI, BbsI, AarI, HhaI, HindIII, NotI, BbvCI, EcoRI, BglII, FokI, AlwI, AcuI 또는 BcgI 중 적어도 하나이다. 일부 구현예에서, 제한 엔도뉴클레아제는 합성 관심 유전자를 시험관내 전사 촉진제 카세트 내로 삽입하기 위해 사용되는 것과 동일한 제한 엔도뉴클레아제(들)이다. 일부 구현예에서, 제한 엔도뉴클레아제는 합성 관심 유전자를 시험관내 전사 촉진제 카세트 내로 삽입하기 위해 사용된 제한 엔도뉴클레아제(들)와 상이하다. 또한, 본원에 기술된 바와 같은 이중 가닥 DNA를 제조하기 위한 미세유체 경로 소자 반응기가 또한 본원에 기술된다.
도 9는 이중 가닥 DNA를 생성하기 위한 미세유체 바이오칩 반응기의 구조의 한 변형의 예를 보여준다. 본원에 기술된 이러한 방법 및 기타 방법은 모든 구성요소가 생성 동안 무균으로 유지되는 무균의 밀폐된 바이오칩에서 관심 유전자 및 시험관내 전사 촉진제 카세트로부터 이중 가닥 DNA를 생성하는 단계를 포함할 수 있다. 무균의 밀폐된 바이오칩은 대기에 대해 밀폐된다. 도 9는 이중 가닥 DNA 주형이 되기 위한 경로를 따라 상이한 단계에 있는 DNA 전구체가 이동하는 4개의 상호연결 반응기(예를 들어, 모듈 또는 챔버)를 갖는 미세유체 바이오칩 반응기를 보여준다. 예를 들어, 도 9에서, 결찰 반응기(결찰 반응 챔버(901)), 사전 혼합 챔버(903), 증폭 반응기(증폭 반응 챔버(905)) 및 분해 반응기(분해 반응 챔버)(907)가 포함될 수 있다(연결기 및 밸브는 본 예에서 미도시됨). 본원에 기술된 방법의 다른 단계는 다른 모듈 또는 챔버에서 수행된다. 관심 유전자 및 시험관내 전사 촉진제 카세트는 사전 혼합 챔버에서 함께 혼합된다. 관심 유전자 및 시험관내 전사 촉진제 카세트는 결찰 반응 챔버에서 함께 결합하여 결찰된 생성물을 생성한다. 결찰된 생성물은 증폭 챔버에서 증폭되어 증폭된 DNA를 생성한다. 증폭된 DNA는 추가로 처리되며, 예컨대 분해 반응 챔버에서 분해되어 원치않는 DNA를 제거하거나 증폭된 관심 유전자의 상이한 복사체를 분리한다.
IVT 반응
공정의 다음 단계는 mRNA를 생성하는 IVT 반응일 수 있다. 이 공정은 동일하거나 상이한 미세유체 경로 소자 내부에서 수행될 수 있으며(예를 들어, IVT 미세유체 경로 소자의 일부 변형에서), 종래 기술된 바와 같은 미세유체 경로 소자 대조군 시스템에 하우징될 수 있다. IVT 미세유체 경로 소자 내에서 주요 단계 및 하위 구획을 예시하는 고수준 mRNA 제조 공정이 도 11에 기술된다.
IVT 반응은 DNA 주형을 T7 중합효소 효소, 뉴클레오티드 및 캡핑 시약과 조합하고, 제어된 조건 하에 반응물을 인큐베이션하여 캡핑된 mRNA 분자를 생성하는 것을 포함할 수 있다. IVT 반응은 미세유체 경로 소자(예를 들어, IVT 미세유체 경로 소자)의 반응 챔버 내부에서 발생할 수 있으며, 온도, 혼합 및 시약 첨가(반응 시작시 및 전반에 걸쳐 둘 모두에서)와 같은 공정 매개변수는 수준을 최적화시키기 위해 제어될 수 있다. 공정은 상기 기술된 바와 같은 제어기에 의해 구동될 수 있다. 완충액 및 용액은 마이크로밸브의 어레이를 통해 전달될 수 있으며, 부피는 각 mRNA 약물 물질에 최적화된 프로토콜에 특이적일 수 있는 미리 설정된 프로그램을 사용하여 제어될 수 있다.
IVT 반응 후, DNAse 처리를 수행하여 주형 DNA를 분해할 수 있다. 이 단계는 IVT 반응 챔버(IVT 반응기의 일부) 내부에서 수행될 수 있으며, 희석율, 효소/완충액 농도, 온도 및 혼합과 같은 매개변수는 수준을 최적화하기 위해 제어될 수 있다. 이러한 절차는 자체적으로 실행되고 모니터링 카메라에 의해 기록될 수 있다.
IVT 정제
DNAse 처리된 mRNA는 정제되어 불순물 및 부산물을 제거할 수 있다. 특히, 분해된 주형, 임의의 미반응된 뉴클레오티드, 효소(T7 중합효소 및 DNAse) 및 dsRNA는 약물 물질의 품질과 면역원성에 영향을 미친다. 정제를 위해, 표면 화학작용이 상이한 지지체를 사용하는 2단계 고체상 가역 고정화 절차가 사용될 수 있다. 첫 번째 단계는 정확하게 제어된 결합 조건 하에서 dsRNA를 선택적으로 포획하기 위해 셀룰로스 멤브레인을 사용하고, 비결합된 분획을 제2 정제 챔버로 용리시키는 것을 포함할 수 있다. 제2 정제 단계는 500 bp 초과 길이의 mRNA를 선택적으로 포획하는 1-2 μm 카르복실-코팅된 상자성 비드를 사용할 수 있다. 그 후, 뉴클레오티드, 효소 및 분해된 주형을 포함하는 비결합된 물질을 제거하기 위해 여러 번의 세척이 수행될 수 있다. 그 후, 순수한 mRNA는 USP 등급 물에서 용리될 수 있다. 인-라인 미세유체 기반 정제는 물질을 대기에 노출시키지 않으면서 완전히 통합된 워크플로우를 가능하게 하고, 전통적인 HPLC-기반 방법에 사용되는 독성 이동상의 사용을 회피하고, 수동 개입을 현저하게 감소시킨다.
일반적으로, 상기 언급된 바와 같이, 이러한 방법 및 장치는 치료학적 mRNA, 또는 치료학적 mRNA를 제조하기 위한 구성요소의 일부 또는 전부의 제조를 외부 대기 및/또는 RNAse의 가능한 공급원 및/또는 달리 필요할 수 있는 오염 구성요소에의 노출 없이 허용하는 무균 방법 및 장치이다. 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같이, 이들 방법은 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 주형 DNA에서)의 박테리아 공급원의 첨가 없이 및/또는 HPLC 또는 기타 전통적인 기술을 통해 정제하는 경우 존재할 수 있는 구성요소, 예컨대 가소제의 첨가 없이 수행될 수 있다. (예를 들어, 순수한 셀룰로스를 사용하여) 미세유체 경로 소자 내에서 정제하기 위한 장치 및 방법이 본원에 기술된다.
정제된 mRNA는 mRNA 특이적 형광 염료를 사용하는 형광 또는 A260 nm UV 흡광도를 사용하여 정량화될 수 있다. 추가적인 mRNA QC 단계는 순도 및 동일성을 확인하기 위해 수행될 수 있다. 전체 mRNA 제조 공정은 미세유체 경로 소자 제어 시스템 내부에서 수행될 수 있으며, 시약 첨가 및 이출은 예를 들어, 무균 기술을 사용하여 상기 기술된 밀폐된 경로 미세유체 경로 소자 제어 시스템을 통해 수행될 수 있다. 마지막으로, 예를 들어 0.22 μm 필터를 통한 여과가 수행될 수 있다. 최종 제품은 낮은 바이오버든 약물 물질로 간주될 수 있으며, 하기에 대한 허용 기준을 충족하는 경우 의약품 제형화 용으로 출시될 수 있다: 수율 (예를 들어, UV vis/형광측정법, 출발 IVT의 ul 당 > 6.5 ug mRNA), 동일성 (예를 들어, 시퀀싱에 의해, 표적에 대해 100% 컨센서스 상동성), 무결성 (예를 들어, 시퀀싱, <1% 돌연변이율), 순도 (예를 들어, CE, 단일 밴드의 >95%의 생성물), 캡핑 효율 (HPLC, >95% 캡핑된 mRNA), 잔류 dsRNA (예를 들어, FRET/면역블롯, < 0.02% (1 ng)), 박테리아 구성요소 (예를 들어, HCP ELISA (DNA & 단백질에 있어서), < X), 박테리아 구성요소(예를 들어, HC-DNA, <X), 내독소 (예를 들어, LAL 테스트, <0.2 EU/ml), 바이오버든(예를 들어, 미생물 한계 테스트(MLT)), 등.
mRNA의 ANP로의 제형화
정제된 mRNA는 전달 구성요소와 조합하여 나노입자 제형을 형성할 수 있다. 이러한 공정은 도 12에 묘사되어 있다. 예를 들어, mRNA 카고(치료학적 mRNA, 또한 본원에서 약물 물질로서 지칭됨)의 수용액은 제형 미세유체 경로 소자 내의 미세유체 혼합 구조에서 전달 비히클의 에탄올성 용액과 조합될 수 있다. 그 후, 물질을 제형화된 생성물 중의 완충액 구성요소를 교환하기 위해 먼저 온-칩 투석 공정을 포함하는 두가지 제형화후 처리 단계를 거친 다음 규격에 맞게 의약품의 부피를 감소시키기 위한 농축 단계를 거칠 수 있다. 미세유체 경로 소자-기반 제조 장치에 대한 이러한 공정의 구현은 사람의 개입 필요성 없이 사람의 실수 가능성을 최소화하면서 제형 공정을 고도로 제어할 수 있다.
일반적으로, 예를 들어, 주형을 합성하고/거나, IVT를 수행하여 mRNA를 생성하고/거나, mRNA를 정제하고/거나, mRNA와 전달 비히클을 조합하여 치료학적 조성물을 형성하고/거나, 치료학적 조성물을 투석하고/거나 치료학적 조성물을 농축하는 것을 포함하는 본원에 기술된 제조 방법의 구성요소 부분은 상기 기술된 바와 같이 도 3a-3c에 도시된 바와 같이 단일 미세유체 경로 소자 및/또는 다중 미세유체 경로 소자에서 수행될 수 있다. 따라서, 유체 경로는 연속적이거나 부분적으로 연속적일 수 있다(예를 들어, 주형 형성, IVT, mRNA 정제, mRNA를 전달비히클과 조합하여 치료학적 조성물을 형성하기, 치료학적 조성물 투석 및/또는 치료학적 조성물 농축 중 하나 이상과 같은 제조 공정의 구성요소 부분에 걸쳐 연속적임). 모든 경우에, 동일한 제어기 장치가 사용될 수 있거나, 상이한 제어기 장치가 사용될 수 있다. 이러한 구성요소 부분 각각의 생성물은 제어기 장치의 유체 바이알(예를 들어, 저장소)에 저장될 수 있으며, 새로운 또는 후속 미세유체 경로 소자에 전달될 수 있다. 따라서, 임의의 이러한 방법 및 장치에서, 생성물은 대기로의 노출로부터 보호될 수 있다.
상기 언급된 바와 같이, 일부 변형에서, 펩토이드-기반 지질 제형은 N-치환된 펩티드(즉, 펩토이드) 골격 상에 양이온성 기 및 지질 모이어티 둘 모두를 혼입할 수 있는 약물 비히클로서 사용될 수 있다. 전달 비히클 구성요소는 통상적인 수단을 통해 공급될 수 있는 단분산의 완전히 특성화 가능한 화학 물질일 수 있다.
제어되고 일관된 제형 공정은 mRNA ANP 제형에서 작고 균일한 입자 크기를 유지하는데 중요할 수 있다. 전달 비히클 구성요소는 본원에 기술된 방법 및 장치에 의해 제어된 비율로 mRNA와 신속하게 혼합된다. 양이온성(+) 지질과 음이온성(-) mRNA 사이의 상호작용 및 수용액에 대한 DV 구성요소 노출은 입자 형성을 촉발시킬 수 있다. 이러한 공정은 본원에 기술된 미세유체 경로 소자를 사용하여 수행될 수 있다(입자 크기 및 균일성을 제어하기 위해). mRNA는 산성 완충액(pH 3-5)에 용해될 수 있으며, 이는 양이온 전하를 담당하는 전달 비히클의 염기성 작용기(예컨대, 아민)의 완전한 양성자화를 보장하는 것을 도울 수 있다. 전달 비히클은 수성 카고 용액에 노출 시 나노 크기 입자의 형성을 촉진하는 수성 혼화성 유기 용매(전형적으로, 에탄올)에 용해될 수 있다. 혼합 직 후, 용액 pH는 중성 완충액에 의해 안정화될 수 있다. 생성된 제형은 기능의 명백한 손실 없이 몇 주 동안 4℃에서 보관될 수 있다. 대안적으로, 제형화 공정은 적시에 그리고 현장에서 수행될 수 있다.
본원에 기술된 바와 같은 제형화 미세유체 경로 소자는 이러한 제형화 작업을 달성하도록 설계될 수 있다. 도 13은 사용될 수 있는 이러한 미세유체 경로 소자의 일반적인 구조의 개략도를 예시한다. 제형화 미세유체 경로 소자의 제1 부분은 mRNA와 DV 구성요소 둘 모두를 별도의 스테이징 챔버로 사전 희석시키는 것을 포함할 수 있다. 입력 물질은 무균 바코드 바이알로부터 이러한 사전 혼합 챔버로 이동될 수 있다. mRNA 물질(들)은 산성 제형화 완충액에서 사전 혼합될 수 있으며, 전달 비히클 구성요소는 에탄올에서 희석된다. 이 단계에서 두 물질 모두의 농도는 표적 DV/mRNA 비율 및 예를 들어, 이전에 양호한 혼합 거동을 달성하는 것으로 나타난 3:1 수성: 에탄올 비율과 일치하는 부피 비율에 대한 필수 사양과 일치하도록 조절될 수 있다.
혼합 구조를 포함하는 미세유체 경로 소자는 물질의 혼합 속도를 정밀하게 제어할 수 있다. 더 빠르거나 더 느린 혼합이 제공되고 제어될 수 있다(예를 들어, 제어기에 의해). 예를 들어, 혼합 구조를 포함하는 미세유체 경로 소자는 현저하게 증가된 DV/mRNA 혼합 속도로 제공될 수 있다. 혼합 공정의 시작 시, 예를 들어, 0.5 mL/min로 미세유체 구조를 통해 유체를 강제하는 혼합 챔버 둘 모두에 동일한 압력이 가해질 수 있다. 이 구조의 기하학은 대략 3 ms의 신속한 혼합 시간에 의해 결정될 수 있다. 이러한 조건 하에, 펩토이드 분자에 대한 수불용성 지질 도메인이 수성 mRNA 용액에 노출됨에 따라 양친매성 나노입자(ANP)가 형성될 수 있다.
혼합 직 후, ANP는 1:1 중성 PBS를 인라인 첨가하여 희석될 수 있다. 이는 산성 제형화 완충액을 중화시키고, 투석 및 농축을 위한 제형을 제조할 수 있다. 이러한 모든 공정은 미세유체 경로 소자 제어 시스템을 통해 제어되어 고도로 재현성인 입자 크기 및 제형 특성을 유지할 수 있다.
미세유체 소자는 진료 현장에서 개인 맞춤형 치료제의 제형화를 허용한다. 일부 예에서, 치료제는 예컨대, CTCL 또는 T-세포 수용체(TCR) 또는 T-세포 수용체의 일부에 의해 매개되는 다른 질환 또는 질병을 치료하기 위한 T-세포 수용체(TCR) 또는 T-세포 수용체의 일부이다. 개인 맞춤형 치료제는 환자 자신의 서열을 기반으로 하는 특정 mRNA 조성물을 생성하는 것을 포함하여 특정 환자 유전학(예를 들어, 유전자형)에 대한 치료학적 조성물을 기초로 할 수 있다. 또한 또는 대안적으로 본원에 기술된 방법 및 장치는 개별화된 치료제를 허용할 수 있다. 개별화된 치료제는 환자의 표현형, 예를 들어 위험 인자 범주와 같은 환자가 속하는 범주를 기반으로 할 수 있다. 따라서, 개별 치료제는 환자 범주에 기초하여 환자에게 특정 치료법을 적용할 수 있다. 예를 들어, 미세유체 제형 소자는 다중 mRNA가 혼합되게 하여, 예를 들어, 환자에 대한 표현형 데이터로부터 결정될 수 있는 구성요소 및 각 구성요소의 할당량(양)에 기초하여 환자에게 개별화되는 치료학적 조성물을 더 큰 라이브러리로부터의 mRNA의 하위 세트로부터 생성할 수 있다. 임의의 이들 조성물은 개인을 위한 최적화된 치료를 생성하기 위해 현장 진료에서 화합될 수 있다.
의약품을 생성하기 위한 제형화 후 처리
ANP가 제형화 공정 동안 형성되면, 제형화 미세유체 경로 소자에서 여러 후처리 작업이 완료될 수 있다. 여기에는 완충액 교환 및 에탄올 제거를 위한 투석에 이어서 투여용 부피를 감소시키기 위한 증발 농축이 포함될 수 있다. 예를 들어, 도 14 참조.
생성된 나노입자는 예를 들어, 형광을 사용한 동적 광 산란(DLS) 및 % mRNA 캡슐화를 사용하여 크기 분포에 대한 미세유체 경로 소자에서 (예를 들어, 미세유체 경로 소자 제어 시스템에 의해) 분석될 수 있다. 분석은 주요 유체 경로로부터 광학적으로 투명한 샘플링 챔버로 전환되는 최종 제형화된 물질의 소분취량에 대해 완료될 수 있다. 이 챔버 내에서 광섬유 광원은 입자 크기와 분산도를 결정하기 위해 광산란 측정에 사용될 수 있다. 다음으로, 세제를 첨가함으로써 입자 파괴 전후의 RNA 농도를 결정하기 위해 형광 mRNA-특이적 프로브가 사용된다. 이러한 검정은 투여 정보에 대한 mRNA 농도 및 ANP에서 캡슐화된 mRNA 대 용액 내 유리 비율을 설명할 수 있다. 예를 들어, 제형화된 mRNA 의약품을 테스트하는 데 사용할 수 있는 분석 방법은 다음을 포함할 수 있다: 광학적 선명도(예를 들어, 육안 검사에 의해 눈에 보이지 않음, 응집체, 투명한 용액), 지질 조성 특성 규명(예를 들어, HPLC에 의해), 크기(예를 들어, DLS, 80 - 300 nm), 캡슐화 %(예를 들어, 형광측정법에 의해, > 95% 캡슐화), 분산성 (예를 들어, DLS, PDI < 0.25), 내독소 (예를 들어, LAL 테스트, < 0.2 EU/ml), 무균성 (예를 들어, 배양(USP), < X cfu), pH (예를 들어, USP, pH 7.4 +/-0.2), 효능(예를 들어, 생물검정/ELISA, X EC50).
실시예
상기 언급된 바와 같이, 본원에 기술된 방법 및 장치는 예를 들어, 피부 T-세포 림프종(CTCL)에 대한 치료제를 포함하여 mRNA 치료제를 제조하는데 사용될 수 있다. 성숙한 T-세포는 αβ T-세포에서 알파 및 베타 사슬 또는 δγ T-세포에서 델타 및 감마 사슬, 두 단백질의 조합에 의해 형성되는 고유의 TCR을 발현한다. 각각의 TCR 사슬은 유전자의 V, (D) 및 J 영역을 인코딩하는 많은 가능한 엑손 중 어느 하나가 V(D)J 재조합이라는 공정에 의해 함께 결합되는 고유한 재조합 이벤트에 의해 형성된다. 이러한 V(D)J 재조합 이벤트는 준-무작위이며, 많은 수의 재조합을 생성하여 TCR의 큰 다양성을 생성할 수 있다. 또한, V(D)J 재조합 공정 동안, 뉴클레오티드의 무작위 추가 또는 결실이 엑손 접합부에서 발생하여, 개인의 TCR 레퍼토리를 함께 생성하는 추가의 TCR 다양성의 생성을 발생시킨다. 차세대 기술에 의해 심층적으로 시퀀싱된 건강한 개체는 임의의 주어진 시점에서 말초 혈액 중 1-5 x 106개의 상이한 TCR을 보유하는 것으로 추정되며, 감염의 부재하에 단일 TCR은 일반적으로 총 개체군의 5%를 초과하지 않는다. T-세포 림프종은 단일 악성 T-세포의 클론 확장으로 인해 발생하여 림프 조직(비장 또는 림프절) 또는 피부, 간 또는 위장관과 같은 다른 조직에서의 종양 발생으로 이어진다.
또한, T-세포 림프종 환자에서 클론 확장된 TCR을 진단하고 식별하는 역할을 하는 개체의 TCR 레퍼토리를 시퀀싱하기 위해 대체 방법이 개발되었다. 일반적으로 사용되는 한 방법은 신중하게 개발된 PCR 프라이머 패널을 사용하여 TCRβ 또는 γ 게놈 재배열을 시퀀싱하는 것이며, 여기서 증폭 바이어스가 제어된다. 따라서, 다중 PCR이 표적 농축 후 차세대 시퀀싱을 위해 수행될 수 있다. 이러한 방법, 예를 들어 Adaptive biotechnologies의 Immunoseq 검정은 검증되었으며, 클리닉에서 진단 도구로서 최소 잔여 질병 정량화에 사용된다. 대안적인 접근 방식은 표적 농축 없이 직접 cDNA를 심층적으로 시퀀싱하여 현저하게 부각된 TCR 사슬을 식별하는 것이다. 림프종 TCR의 식별은 일반적으로 림프종 아이디오타입 또는 클론형으로서 지칭된다.
아이디오타입의 결정을 위해, 생검체가 수집될 수 있으며, 샘플은 림프종 아이디오타입 식별을 결정하기 위해 시퀀싱될 수 있다. 환자-특이적 아이디오타입에 대한 디지털 데이터는 환자 특이적 백신 설계에 사용될 수 있다.
mRNA 백신의 설계
mRNA-기반 환자 특이적 암 백신의 생산은 항원 제시 세포(APC)에 의해 특이적이고 면역학적으로 효과적인 에피토프 제시를 유도할 수 있는 개인화된 표적 펩티드에 상응하는 DNA 서열의 설계로 시작할 수 있다. 이를 달성하기 위해, 첫 번째 단계는 아이디오타입 TCR 사슬(αβ 또는 γδ)에서 상보성 결정 영역(CDR)을 추출하는 것을 포함할 수 있다. CDR3 영역은 정준 TCR에 대한 서열 정렬을 수행함으로써 추출될 수 있다. CDR은 항원-MHC 복합체에 대한 결합을 매개하는 TCR 서열의 고도로 가변적인 부분이다. 특히, V(D)J와 C 영역 사이의 접합부에 걸쳐 있는 CDR3 영역은 가장 높은 가변성을 가지며, 림프종 세포에서만 발견되어야 하는 진정으로 고유한 단백질 단편을 나타낸다. 따라서, 예를 들어, C 및 N 말단 모두에서 10개 아미노산으로 확장된 CDR3 영역은 도 8에 대해 상기 기술된 바와 같이 백신 펩티드 단편을 구성한다.
TCR이 2개의 사슬(α & β)을 갖기 때문에, 환자당 2개의 CDR3이 있으나, 소수의 경우 단지 하나의 CDR3만 식별될 것이다. 한 예에서, CDR3α 및 CDR3β가 이용가능하다고 가정하면, 백신 펩티드는 하기 구조로 설계될 수 있다: CDR3α-링커-CDR3β (여기서 링커는 단일쇄 가변 단편(ScFv) 분자의 설계에 일반적으로 사용되는 표준 GSGGGSGGGSGGGS 서열임).
최종 백신 펩티드 아미노산 서열이 확인되면, 설계 공정은 (i) 고도로 전사되고 고도로 번역되어 우수한 단백질 발현으로 이어질 수 있으며, (ii) DNA 합성이 가능할 수 있으며, (iii) 주형 생성 단계에 필요한 어댑터 서열을 포함하며, (iv) 주형 생성 공정을 방해할 수 있는 제한 효소와 같은 서열 모티프는 제외될 수 있는 DNA 서열을 유도하기 위해 코돈 최적화를 포함할 수 있다. 코돈 최적화는 예를 들어, 서열 GC의 균형을 맞추고, 서열 반복부, 내부 프로모터 서열, 종결 서열, 스플라이스 서열, 재조합 서열 및 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 제거하기 위해 수행될 수 있다. 또한, 코돈 사용은 고도로 발현된 인간 유전자에서 관찰되는 것에 맞게 조정될 수 있다. 사용될 수 있는 코돈 최적화 공정의 한 예의 개략도가 도 10에 도시된다.
서열 설계 공정이 완료되면, 최적화된 서열은 선형 DNA 분자로서 합성될 수 있다. IVT에 대한 주형은 상기 기술된 바와 같이 제조될 수 있다. 예를 들어, IVT를 통한 mRNA 합성 전에, IVT-가능 이중 가닥 DNA 주형이 생성될 수 있다. DNA 주형은 상기 도 6에 기술된 바와 같이 (i) 생성될 표적 환자 특이적 펩티드에 상응하는 코돈 세트로서 정의된 단백질 코딩 서열(또는 CDS), (ii) 5' 비번역된 영역(5'UTR) 및 3'UTR을 포함하는 비코딩 서열, (iii) 엑소뉴클레아제 활성으로부터 mRNA을 보호하는 폴리A 서열 및 (iv) mRNA로 DNA 주형을 전사하는 RNA 중합효소 효소를 동원하는 프로모터 서열을 포함할 수 있다.
따라서, (예를 들어, DNA 합성 벤더로부터의) 합성 선형 DNA인 환자 특이적 펩티드 인코딩 서열은 주형 생성 공정으로서 IVT에 필요한 일반 기능 요소와 쌍을 이룰 수 있다.
본원에 기술된 미세유체 경로 소자 기반 방법은 주형 생성을 포함할 수 있으며, 현재 실시되는 박테리아 배양 기반 방법보다 훨씬 빠르고 더욱 효율적일 수 있는데, 이러한 현재 방법은 ~4일 이상 소요될 수 있으며, 가변 길이 폴리A 테일을 발생시킬 수 있으며(박테리아 재조합 공정으로 인해), 박테리아 단백질, 박테리아 DNA 및 내독소의 캐리오버 위험이 있을 수 있다. 대조적으로, 본원에 기술된 방법 및 장치는 하루(~12시간) 내에 수행될 수 있으며, 일관된 폴리 A 테일(300 bp 초과)을 발생시킬 수 있으며, 숙주 핵산 또는 숙주 세포 단백질과의 어떠한 접촉도 포함하지 않을 수 있다. 최종 이중 가닥 DNA는 화학적으로 생성된 뉴클레오티드로부터 제조될 수 있으며, 따라서 합성 기원으로 간주될 수 있다.
상기 기술된 바와 같이, 이러한 방법은 4개의 단계를 포함할 수 있다: (i) sGOI의 TIFC와의 결찰 및 엑소뉴클레아제 처리에 의한 비결찰된 물질의 제거, (ii) 다중 변위 증폭(MDA)으로 불리는 기술을 통한 결찰된 생성물의 원형 증폭, (iii) 타입 II 제한 효소로의 분해를 사용한 증폭된 생성물의 선형화, (iv) 불순물을 제거하기 위한 온-칩 정제 절차. 최종 단계로서, 정제된 주형은 0.22 μm 필터를 통해 여과될 수 있다. IVT 반응에서 사용하기 전에 생성된 물질의 품질을 보장하기 위해, 수율 (예를 들어, 1 ug/ml에서 >50 ug, 260/280 nm 비율 >1.8), 동일성 (예를 들어, 100% 표적에 대한 컨센서스 상동성), 완전성 (예를 들어, <1% 돌연변이율), 순도 (예를 들어, CE에 의한 단일 밴드에서 생성물의 >95%), 및 내독소 (예를 들어, <0.2 EU/ml)에 대한 테스트를 포함하는 많은 분석 테스트가 수행될 수 있다.
따라서, 의약품은 1:1 비율로 혼합된 애주번트로서 CpG와 함께 환자 특이적 TCR 펩티드를 인코딩하는 mRNA를 포함할 수 있다. 핵산 혼합물은 RN아제에 의한 분해로부터 mRNA를 보호하는 역할을 하는 200 nm ANP 내로 캡슐화될 수 있으며, 또한 세포 흡수 및 세포질 방출을 위한 촉진제로서 작용할 수 있다. 번역 과정이 발생하는 세포질에서 온전한 mRNA 생체이용률이 활성 성분의 작용 메카니즘에 필요할 수 있다. ANP는 핵산 구성요소, 5:1 w/w mRNA:DV 전체 비율의 양이온성 아민-작용기화된 펩토이드 NTX-DV-0024 및 2 wt% PEG-지질로 구성된다. ANP의 크기 분포는 Z-평균 입자 크기가 약 200 nm인 단봉일 수 있다. ANP는 7.4의 목표 pH에서 인산염 완충된 염수(0.144 mg/mL 일염기성 인산칼륨, 9.0 mg/mL 염화나트륨 및 0.795 mg/mL 이염기성 인산나트륨)에 현탁될 수 있다. 모든 제형 부형제는 일반적으로 안전한 것으로 인식될 수 있다. 최종 생성물은 295 ± 20 mOsm/kg의 삼투질 농도로 생리학적 등장성이고 무균일 수 있다.
mRNA 자체는 매력적인 안전성 프로파일을 갖지만, 예를 들어, 눈에 보이지 않는 입자의 수준, 숙주 세포 단백질(HCP), 숙주 세포 DNA, 공정 관련 불순물, 바이오버든, 박테리아 내독소 수준, 무균성 및 침출성 및 추출성은 주로 안전성과 관련이 있으며, 확립된 안전 프로파일 및 산업 표준에 따라 최소화되고 제어되어야 한다. 또한, 잔류 주형 DNA, 이중 가닥 RNA 및 IVT mRNA 제조에 사용되는 효소의 존재를 제거하거나 최소화하는 것은 안전하고 효과적인 생성물을 보장할 수 있다.
언급된 바와 같이, 본원에 설명된 방법 및 장치는 예를 들어, 하나 이상의 절차, 예컨대 광 차단 입자 계수 테스트 및/또는 현미경 입자 계수 테스트에 의한 미립자 물질의 정량적 분석을 포함할 수 있다. 요건에 대한 적합성의 최종 결론에 도달하기 위해 광 차단 입자 계수 테스트에 이어서 미시적 입자 계수 테스트에 의해 일부 제조물을 테스트해야 할 수 있다. 나노입자 제조물은 주입물에 존재하는 액적 및/또는 입자 조립체에 의한 광 산란으로 인해 본질적으로 불투명하기 때문에, 필터의 여과 및 후속 현미경 분석이 미립자 물질 분석에 사용될 수 있다. 100 ± 10 배율로 조정된 광학 현미경이 사용될 수 있으며, 이는 약 1 μm 만큼 작은 입자를 가시화할 수 있으며, 방법에 사용되는 필터의 공칭 기공 크기는 최대 1.0 μm가 될 수 있으며, 100 nm 내지 250 nm 범위의 의약품 나노입자는 미립자 물질 감지를 방해하지 않을 것이다.
본원에 기술된 주형 생성 방법은 박테리아 또는 임의의 다른 살아있는 미생물의 사용을 포함하지 않지만, 효소 반응 및 화학적으로 제조된 뉴클레오티드의 사용에 의존적이며, 따라서 주형 및 mRNA 생성물이 완전히 합성된다.
최종 의약품 중 잔류 숙주 세포 DNA와 관련하여, 본원에 기술된 방법 및 장치는 최종 생성물 용량에서 10 ng/용량 미만 및 200 염기쌍을 가질 수 있다. 공정 관련 불순물의 존재를 최소화하는 것 이외에, 생성물 관련 불순물은 본원에 기술된 제조 공정, 제형 개발 및 최적화, 및 적절한 저장 조건의 확인을 통해 제어될 수 있다. IVT mRNA 생성물은 가능한 한 빨리 제조되고 투여되도록 의도되었으나, 안정성 프로파일은 최소 투여시 정의된 허용 기준을 충족할 수 있다. 본원에 기술된 치료제에 대한 적절한 안정성을 유지하기 위한 기간은 냉장 조건 하에서 적어도 30일일 수 있다.
IVT mRNA가 세포질에 유입되면, 이의 약리는 고유 mRNA의 안정성과 번역을 조절하는 동일한 세포 메카니즘에 의해 지배된다. 따라서, IVT mRNA 효능은 세포질 생체이용률에 크기 좌우될 것이며, 세포 흡수가 최대화되는 생성물 개발에 중점을 두어야 한다.
본원에 기술된 저장 용기(예를 들어, 저장소)는 일반적으로 외부 환경(해당되는 경우, 산소 유입 및 광분해로부터의 보호를 포함)으로부터 생성물을 보호할 수 있고, 멸균 가능할 수 있으며, 보관 수명에 걸쳐 멸균성이 유지되는 것을 보장할 수 있으며, 생성물 제형과 양립가능할 수 있으며, 보관 동안 생성물에 화학물질이 최소한으로 거의 또는 전혀 누출되지 않게 하는 것에 기여할 수 있다. 예를 들어, 저장소는 타입 I 보로실리케이트 유리 바이알을 포함할 수 있으며, 할로부틸 고무 마개는 적절한 제품 보호를 제공하고, 제품 유통 기간에 걸쳐 무균, 안전성 및 효능이 유지되는 것을 보장한다.
mRNA 발현을 최대화하고, 세포 생존력에 대한 영향을 최소화하고, 유리한 생체분포 프로파일을 달성하는 예비 스크리닝을 수행하였다. 이들 실험에 있어서, 반딧불이 루시페라제(Fluc) 발현에 기초한 생물발광 검정을 선택하였다. 이 검정은 고처리량 방식으로 각 전달 비히클 후보에 의한 mRNA 흡수로부터 발생하는 유전자 발현의 정량적 측정을 허용한다. 초기 평가를 위해, 36개 아미노-지질화된 펩토이드를 초기 평가를 위해 고체상 펩토이드 합성에 의해 합성하고, 동결건조 및/또는 침전에 의해 단리하였다. 이러한 후보 물질은 양이온 및 지질 도메인 둘 모두에서 구조적 변형을 함유하였다. 이러한 36가지 물질을 2% (w/w)의 지질-고정된 PEG(1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌 글리콜-2000)와 함께 다양한 비율로 Fluc mRNA와 조합하였다. 여러 세포주를 HeLa, HepG2 및 JAWSII 수지상 세포를 포함하는 생성된 제형으로 처리하여, 6개의 주요 후보의 하향 선택을 유도하였다.
전달 비히클 후보의 생체내 mRNA 발현 및 생체분포는 정맥내(IV), 피하(SC) 및 근육내(IM) 주사 후 Balb/c 마우스에서 Fluc 발현에 의해 정량화하였다. 발현(시험관내 및 생체내) 및 생체내분포(생체내)에 기초하여 NTX-DV-0024를 후보로 선택하였다. 오브알부민을 코딩하는 mRNA를 합성하고, 모델 백신으로 평가하였다. 오브알부민은 백신접종의 맥락에서 매우 잘 연구되었으며, 시약은 에피토프 제시 및 T-세포 반응을 추적하기 위해 시중에서 입수가능할 수 있어 이를 개념 증명 연구에 이상적인 후보가 되게 한다. 본원에 기술된 바와 같이 생성된 OVA mRNA의 초기 평가는 JAWSII 뮤린(C57BL/6) 수지상 세포를 사용하는 시험관내 모델에서 수행하였다. 간략하게는, JAWSII 세포를 24시간 동안 시중의 형질감염 시약(예를 들어, Lipofectamine2000TM)을 사용하여 OVA mRNA 후보로 형질감염시키고, 그 시간 후 세포를 SIINFEKL 에피토프에 결합된 MHC-I에 대한 형광 항체를 사용하여 염색하였다. 염색된 집단의 평균 형광 강도(MFI)는 전체 항원 제시의 척도를 나타낸다. 이는 도 15에 개략적으로 설명된다.
이 검정을 사용하여, 본원에 기술된 바와 같이 생성된 mRNA를 시중에서 구입한 물질에 대해 평가하였다. 이 경우, 생성된 mRNA는 시중의 대조군과 비교하여 MHC-I 상의 42% 더 높은 수준의 SIINFEKL 제시를 발생시켰다. 온-소자 mRNA 합성의 재현성이 또한 입증되었으며, OVA mRNA(NTX-RNA-0184)의 5개 배치가 유사한 수준의 SIINFEKL+ JAWSII 세포를 발생시켰다.
mRNA 후보는 뮤린 시험관내 실험에서 백신 후보로서 유사하게 평가하였다. C57BL/6 마우스에 시중의 또는 생성된 mRNA(본원에 기술된 미세유체 경로 소자에 의해 생성됨) 및 전달 비히클을 주사하였다(IV). 주입 7일 후, 말초 혈액을 분리하고, OVA 에피토프를 인식하는 T-세포에 특이적인 형광 MHC-I 테트라머를 사용하여 염색하였다. 그 후, OVA-특이적 CD8+ T-세포의 분획은 유세포 분석에 의해 정량화하였다. 이 실험에서, 이전과 같이 생성된 mRNA는 시중의 대조군과 비교하여 말초 혈액에서 OVA-특이적 T-세포의 분획의 50% 증가를 발생시켰으며, 이는 백신 후보로서 이러한 분자의 강도를 나타낸다.
mRNA 기반 백신(본원에 기술된 바와 같이 생성됨)의 생체내 효능에 대한 첫 번째 입증은 뮤린, OVA-발현, EG.7, 동계 T-세포 림프종 모델에서 였다. 이러한 모델은 적응증 림프종 확인을 위하, NTX-0565의 면역치료학적 작용 메카니즘과 관련하여 생리학적으로 적절한 동물 모델이다. 동계 마우스 모델은 동일한 근친 배경 균주(동종이식편)의 뮤린 숙주에서 불멸화된 마우스 암 세포주의 이식편이다. 동계 숙주 뮤린 배경은 면역요법 기반 약물이 숙주로부터 기능적 항종양 면역 반응을 모집할 수 있게 하며, 이는 면역요법을 조사하는데 필요하다. 동계 모델은 완전 컴피턴트 뮤린 면역원성, 종양으로의 다양한 면역 세포 침투, 포괄적인 마우스 종양, 면역 세포 및 기질 인터페이스, 및 유전자 및 단백질 발현 기록을 포함하는 약리학적 연구를 위한 종양 동기화 용이성을 특징으로 한다.
뮤린 E.G7-OVA 림프종 종양 모델을 사용하였다. E.G7-OVA 종양 세포주는 일관되고 강력하게 발현된 OVA 항원의 게놈 복사체 1을 운반하도록 조작된 EL-4 림프종 유도체 라인이다. 이 방법은 외인성 OVA-기반 항원에 대한 고도로 특이적인 면역 반응을 가능하게 하여, 이러한 종양 세포를 암 백신 연구에 이상적이게 한다. 종양 성장 억제는 DNA, 세포-기반 및 siRNA 백신을 사용하여 문헌에서 입증되었다. 첫 번째 효능 연구에 있어서, 백신 구성요소는 OVA 항원을 인코딩하는 mRNA였으며, 연구 설계는 mRNA 기반 백신을 사용한 이 동물 모델에 대한 이전 문헌을 모델로 하였다. 무작위 동시 음성 대조군은 테스트 물품 전달 비히클 - 인산염 완충된 염수를 사용하여 병행하여 진행시켰다. 동물은 연령과 성별을 일치시켰으며, 군 할당은 종양 크기와 체중의 평균 분포를 보장하기 위해 무작위로 지정하였다. 생체내 연구 디렉터가 편견으로부터 벗어나도록 테스트 항목은 블라인드 처리하였다. 샘플 분석은 분석가 편향을 제거하기 위해 다시 블라인드 처리하였다. 연구에 허용되기 위한 포함 및 제외 기준은 시작 전에 제안서에 미리 정의되었다. 종료점, 관찰 빈도 및 스케줄은 연구 시작 전에 연구 제안서에 미리 정의되었다. 안락사 기준 및 동물 관리 개입은 사전 정의되었다.
이러한 초기 연구는 본원에 기술된 mRNA 백신이 통계적으로 매우 유의한 치료학적 효능을 갖는다는 것을 입증하였다(도 16a-d). OVA mRNA 백신이 군 2에 정맥내 전달되었을 경우, 군은 종양 이식 후 14일째에 통계적으로 극도의 유의성을 보이기 시작하였다(***, p<0.0005, 14일째의 다중 Dunnett 비교 테스트를 통한 음성 대조군과 비교). 21일째에 종양 부피는 군 2에서 797 mm3 대 군 1 대조군에서 2000 mm3였다(**, 21일째에 다중 Dunnett 비교 테스트에 의해 측정된 바와 같이 p<0.005). 이는 동물이 본원에 기술된 바와 같이 제조된 mRNA 백신접종을 받은 경우(IV) 61.42%의 종양 성장 억제로 해석되었다. 종양 성장 억제(TGI%)는 음성 대조군(군 1)이 소정의 종점 종양 부피(2,000 mm3)에 도달하였을 때 이식 후 21일에 계산하였다. 종양 성장 억제(%)는 다음 공식으로 정의되었다: TGI(%) = (TV대조군 - TV처리군)/TV대조군 x 100, 모든 대조군 동물이 말기 종양 부피에 도달했을 때 종양 이식 후 21일째의 음성 대조군과 비교한 것이다. 이 종양 성장 억제는 군 2: (25일의 종말점까지의 시간을 갖는 mRNA-백신접종 동물) 대 군 1: (23일의 종말점까지의 중앙값 시간을 갖는 비히클 처리된 동물)의 mRNA-백신접종된 군의 생존에서 통계적으로 매우 유의한 증가로 해석되었다(** p <0.01, 대조군에 대한 로그 순위 테스트로 측정). 체중 및 실험실 테스트 결과를 기반으로 주어진 용량에서 관찰 가능한 독성은 관찰되지 않았다. 도 16a-16c에서, 제조된 mRNA 기반 백신은 뮤린 림프종 E.G7 동계 모델에서 생체내 효능을 보여준다. 종양 성장은 개별 동물 곡선(도 16a, 16b) 및 각 군에 대한 평균 종양 부피(도 16c)에서 보여지는 바와 같이 61.4% 만큼 억제되었다(* p<0.01). 이러한 종양 성장 억제는 mRNA-백신접종된 군에 대한 생존의 통계적으로 유의한 증가로 해석되었다(도 16d)(**, p<0.01).
상기 물리적 측정을 보완하기 위해 리포터 유전자 발현을 사용하여 저장된 의약품 제형의 생체내 테스트가 또한 1주일에 걸쳐 수행하였다. 이 실험에서, 반딧불이 루시페라제 mRNA 및 NTX-DV-0028의 제형은 1) 주사 7일 전, 2) 주사 3일전 및 3) 주사 1시간 전 제조하였다. 제형화 후 생성물은 투여될 때까지 4℃에서 보관하였다. 그 후 모두 3가지 물질을 꼬리 정맥 주사를 통해 0.25 mg/kg의 용량으로 Balb/c 마우스에 투여하였다. 주사 후 8시간째에, 전신 생체발광을 측정하였으며, 생성 이미지는 도 17a에 도시되며, 도 17b에서 정량화된다(이는 저장된 mRNA 제형으로 주사한 후 전신 루시퍼라제 발현의 정량화된 광자 플럭스를 보여줌). 이러한 1주의 저장 실험 과정에 걸쳐, 측정된 생물발광에서 실질적인 손실은 없었다. 3일 및 7일 저장된 두 물질 모두는 주사 직전에 제형화된 물질의 오차 범위 내에 있다. 이러한 기능 안정성 데이터는 상기 입자 크기 안정성 데이터를 뒷받침하여 본원에 기술된 mRNA 제형이 적어도 1주 동안 4℃에서 저장되기에 안정적임을 강력하게 나타낸다.
일반적으로, 본원에 기술된 바와 같이 ANP 내로 전달 비히클 분자와 제형화된 mRNA 약물 물질은 약 200 nm 크기를 가질 수 있으며, 단 손실을 방지하기 위해 최종 제형 단계의 결론에서 0.2 미크론 멸균 필터의 사용은 제외한다. 따라서, 최종 ANP 의약품의 파괴를 피하면서 무균 위험을 완화하기 위해 제조 공정 전반에 걸쳐 여러가지 체계적인 여과 단계가 통합될 수 있다. 도 18은 여과가 적용될 수 있는 다양한 시간을 개략적으로 예시한다. IVT 반응 전에, 정제된 주형 및 개별 IVT 시약(dNTP, 효소 등을 포함) 둘 모두를 0.22 um 필터를 통해 여과될 수 있다(도 18a, b). mRNA 생성이 IVT 미세유체 경로 소자에서 완료된 후, 모든 투입 물질은 최종 제형화 공정(여기서 ANP가 형성됨) 전에 여과될 것이다. 여기에는 약물 물질(mRNA, 예를 들어, 도 18, C), 애주번트(CpG), 양친매성 펩토이드 전달 비히클 구성요소 및 완충액(예를 들어, 도 18, D), DMG-PEG2000 전달 비히클 구성요소(예를 들어, 도 18, D) 및 투석 완충액(예를 들어, 도 18, E)이 포함된다. 투입 물질의 0.22 미크론 여과에 추가하여, 최종 양친매성 나노입자 의약품은 0.45 미크론 필터를 통해 여과되어 임의의 미립자 또는 응집 물질을 제거할 수 있다(도 18, F). 이러한 더 큰 여과 단계는 ANP의 파괴를 방지하고, 최종 의약품의 효능을 유지하는 것을 도울 수 있다.
상기 기술된 신중한 여과 단계를 보완하기 위해, 본원에 기술된 미세유체 경로 소자 제어 시스템은 밀봉된 무균 유체 경로로 작동하도록 설계될 수 있으며, 이는 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같이 주형 제조, 시험관내 전사(IVT), 양친매성 나노입자(ANP)로의 전달 비히클을 사용한 제형화, 및 완충액 교환 및 농축 단계를 포함하는 의약품 제조에 필요한 작업을 수행하는 하나 이상의 밀봉된 미세유체 경로 소자를 사용하여, 최종 의약품의 안전성 및 멸균성을 보장할 것이다. 이러한 미세유체 경로 소자는 예를 들어, 6 x 6 클래스 7 청정실에 추가로 하우징되는 온도-제어된 클래스 5 층류 후드 내에 잔류할 수 있다. mRNA 반응기(들)는 인간 및 외부 환경으로부터 보호되는 자동화된 장비일 수 있다. 시약 및 생성물 유체 경로는 일회용 멸균 뉴클레아제 비함유 튜브를 사용하여 가압 멸균 용기로부터 반응기의 코어에 전달될 수 있다. 최종 생성물 제형 및 의약품은 완전히 폐쇄된 시스템에서 상기 기술된 바와 같은 다층 미세유체 경로 소자(들) 내에서 제조될 수 있다.
투과성 삽입물
본원에 기술된 임의의 미세유체 경로 소자는 치료학적 물질의 용액 (또는 치료학적 물질이 형성되는 용액)을 처리하기 위한 하나 이상의 투과성 삽입물을 포함할 수 있다. 투과성 삽입물은 미세유체 경로 소자에서 챔버의 유체 접촉 측 내에 삽입될 수 있다. 이는 챔버의 유체 접촉 측을 통해 유입되거나 통과하는 유체가 지나가야 하므로 투과성 삽입물에 의해 변형되도록 구성될 수 있다. 임의의 적절한 투과성 삽입물이 사용될 수 있다. 예를 들어, 투과성 삽입물은 바람직하지 않은 물질을 제거하도록 구성되는 물질을 포함할 수 있다; 일부 예에서, 투과성 삽입물은 단일 가닥 RNA(ssRNA)의 치료학적 용액으로부터 이중 가닥 RNA(dsRNA)를 제거하도록 구성된 셀룰로스 물질을 포함한다.
도 19a는 챔버(1957)의 유체 접촉 측 내부의 투과성 삽입물(1969)을 포함하는 미세유체 경로 소자(1900)의 한 예를 보여준다. 도 19a에서, 미세유체 경로 소자(1900)는 적어도 한 쌍의 챔버(1953, 1957, 1957')를 포함할 수 있으며, 이들 각각은 유체 접촉 측(1917), 압력(예를 들어, 기체) 측(1919), 유체 연결부, 압력 연결부 및 미세유체 경로 소자의 두께에서 형성될 수 있는 유체/압력 라인을 포함할 수 있다. 일부 변형에서, 챔버는 쌍을 이루고, 챔버 쌍의 각 챔버는 유체 커넥터(1955)에 의해 서로 연결될 수 있다. 유체 커넥터(1955)는 챔버(들)의 압력측에 인가된 양압 및/또는 음압에 협력하여 사용되어 두 챔버 사이에 액체측에서 액체를 구동시켜 각 챔버 내부에서 이러한 액체를 혼합할 수 있다. 챔버는 탄성 물질(예를 들어, 탄성 층 또는 멤브레인)에 의해 분기될 수 있으며, 챔버의 고정된 부피 내에서 탄성 물질을 편향시키는 것은 (예를 들어, 두 챔버 사이에) 챔버의 유체 접촉 측 안/밖으로 액체 측 내의 모든 액체를 구동할 수 있다.
미세유체 경로 소자(1900)는 한 쌍 초과의 챔버를 포함할 수 있으며, 그 중 임의의 챔버는 투과성 삽입물을 포함할 수 있다. 각 쌍의 챔버는 다른 공정에 사용될 수 있다. 예를 들어, 첫 번째 쌍의 챔버(1953)는 RNA 합성에 사용될 수 있다. 제2 쌍의 챔버(1957, 1957')는 합성된 폴리뉴클레오티드의 정제에 사용될 수 있다. 제1 쌍의 챔버(1953)로부터의 유체는 각 챔버의 압력 수용 측(1919)에 압력을 가하고, 제1 쌍의 챔버(1953)와 제2 쌍의 챔버(1957) 사이의 밸브(1959)를 개방하면 제2 쌍의 챔버로 구동될 수 있다. 밸브 챔버(1959)는 두 쌍의 챔버 사이의 커넥터 채널 내부의 탄성 층(1907)에 의해 형성될 수 있다.
도 19a 및 19b에 도시된 바와 같이 미세유체 경로 소자(1900)는 복수의 압력 포트(1943)와 유체 포트(1923)를 가질 수 있다. 복수의 압력 포트 및 유체 포트는 미세유체 경로 소자 주변에 인접하게 배치될 수 있으며, 전술한 바와 같이 유체 인터페이스 조립체(109)에 연결되도록 구성된다.
포트(예를 들어, 밀봉 밸브)는 밸브(1961)에 대해 도 19a에 도시된 바와 같은 연결 채널(1939)(압력 채널 또는 유체 채널)의 길이를 따라 탄성 층으로부터 형성될 수 있으며, 상기 밸브는 유체 포트(1923)로부터 구동된 시약의 전달 시점을 제어할 수 있으나, 하나 이상의 유사하게 구성된 밸브와 직렬로 배치되는 경우, 소자 챔버에 대한 계량을 또한 허용할 수 있다. 예를 들어, 도 19a에서 3개의 밸브 챔버가 도시된다(하기 더욱 상세히 설명됨); 이들 3개 밸브 중 첫 번째 밸브는 연동 펌프로서 작동할 수 있는 반면, 중간 밸브는 소량으로 계량되는 계량 챔버일 수 있다(예를 들어, 약 10 nL, 20 nL, 25 nL, 50 nL, 75 nL, 100 nL 등의 계량 부피를 가짐). 채널의 크기 및 특히 채널에 연결된 챔버의 크기는 유체 연결 채널(1939, 1921)을 따라 분배되고 유체 연결 채널(1939,1921)에 연결되는 챔버(1953)에 전달되는 부피를 계량할 수 있다. 일부 변형에서, 계량된 부피는 50 nL 만큼 작을 수 있다. 약 100 nL, 1 마이크로리터, 5 마이크로리터 이상의 계량된 부피가 유입될 수 있다. 다양한 밸브 크기는 미세유체 경로 소자(1900)에 통합하기 위해 사전 선택될 수 있으며, 시약은 사용자 선택에 의해 적절한 계량 크기에 연결될 수 있다.
추가로, 하나 초과의 밸브 본체(1961)는 유체 연결 채널(1939)을 따라 일렬로 포함될 수 있다. 일련의 밸브(1961)는 (비제한적으로) 점성 유체를 포함하는 유체를 이동시키기 위한 연동 펌프로 작용할 수 있다. 일반적으로 유체에 대한 연동 펌프로 기능하는 능력은 점성이 있거나 정제 또는 포획 비드와 같은 현탁 입자를 함유할 수 있는 유체를 이동시키는데 특히 유리할 수 있다.
언급된 바와 같이, 미세유체 경로 소자(1900)는 또한 전달 또는 이출 보관소 또는 저장소(1963)를 포함할 수 있다. 도 19a에서, 사전 선택된 부피는 상기 기술된 챔버 구성과 유사하게 형성될 수 있거나, 원하는 바와 같이 단지 계량측을 함유할 수 있다. 어느 한 경우에, 밸브는 저장소(1963)로 원하는 부피를 계량하는데 사용될 수 있다. 밸브(1965)는 저장소(1963)로부터의 유체의 전달을 제어할 수 있다. 더 큰 부피가 요망되는 경우, 전달이 반복될 수 있다. 대안적으로, 저장소(1963)가 이출 저장소로 사전 선택되는 경우, 밸브(1965)가 개방되고 챔버(1957)로부터 유체를 전달할 수 있으면서, 밸브(1967)는 닫힌 채 유지하는데, 이는 단지 계량된 부피의 유체가 저장소(1963)로 이출되게 허용한다. 그 후, 이 유체는 추가 처리 또는 테스트를 위해 시약 저장 프레임의 유체 바이알로 이출될 수 있다. 일부 변형에서, 챔버, 보관소 또는 저장소(예를 들어, 1963)는 예를 들어, 3개의 밸브 구조(1967, 1965, 1967)에 의해 형성된 1 μL 펌프의 계량 섹션으로 구성될 수 있다. 챔버는 예를 들어, 혼합 챔버(1957)로부터 폐기물을 이출하도록 구성될 수 있다.
미세유체 경로 소자(1900)는 밀봉된 경로 구조일 수 있다. 유체 바이알, 유체 라인 및 미세유체 경로 소자가 연결되는 경우, 장치의 작동은 시스템의 내부 또는 외부 및 특히, 폴리뉴클레오티드(RNA)를 합성하고, 이를 생물학적 전달(약물, 백신 등과 같은 치료제로서)을 위해 제조하는 것을 포함하는 처리를 위한 미세유체 경로 소자의 유체 경로의 내부/외부에서 물질의 임의의 교환 없이 수행될 수 있다. 따라서, 전체 시스템은 밀폐된 경로로서 작동할 수 있으며/거나 개별 미세유체 경로 소자는 (대기로부터 보호된) 밀폐된 경로로서 시스템에서 작동할 수 있다.
일반적으로, 이러한 미세유체 경로 소자는 챔버 또는 채널의 유체 측(1917) 내부에 하나 이상의 투과성 삽입물(1969)를 통합하는 것을 포함할 수 있다. 투과성 삽입물은 챔버 또는 채널의 유체 혼합물로부터 선택된 모이어티(예를 들어, 선택된 물질)을 흡수하도록 구성될 수 있다. 흡수된 물질은 용액으로부터 정제되는 원치 않는 물질일 수 있거나 용액으로부터 제거되어 후에 용리되고 추가로 처리되는 원하는 물질일 수 있다. 한 변형에서, 삽입물의 투과성 물질은 셀룰로스 물질을 포함할 수 있으며, 이는 혼합물로부터 이중 가닥 mRNA를 선택적으로 흡수할 수 있다. 셀룰로스 물질은 한 쌍의 챔버 중 단지 하나의 챔버에 삽입될 수 있으므로, 제1 챔버에서 투과성 삽입물을 통해 유체를 혼합하거나 통과시킬 때 dsRNA는 유체 혼합물로부터 효과적으로 제거될 수 있으며, 그 후 이는 추가의 처리 또는 이출을 위해 더 하류에 있는 또 다른 쌍의 챔버로 이송될 수 있다.
미세유체 소자(1900)의 일부 변형은 챔버 내의 농축기를 추가로 포함할 수 있으며, 이는 제2 플레이트의 두께 내에 배치될 수 있으며 (1949)와 같은 출구 채널과 유체 소통할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 과량의 유체 매질을 구동 제거함으로써 농축될 수 있으며, 농축된 폴리뉴클레오티드 혼합물은 추가의 취급 또는 사용을 위해 미세유체 경로 소자(1900) 밖으로 이출된다. 일부 변형에서, 농축기는 투석 챔버일 수 있다. 예를 들어, 투석 멤브레인은 미세유체 경로 소자의 플레이트 내부에 또는 이들 사이에 존재할 수 있다.
미세유체 경로 소자(1900)는 가시광선 및/또는 자외선에 대해 적어도 실질적으로 반투명한 물질로 형성될 수 있다. 실질적으로 반투명하다는 것은 반투명 물질과 비교하여 적어도 90%의 광이 물질을 통해 투과한다는 것을 의미한다. 일부 변형에서, 미세유체 경로 소자(1900)는 가시광선 및/또는 자외선에 실질적으로 투명한 물질로 형성될 수 있다. 실질적으로 반투명하다는 것은 완전히 투명한 물질과 비교하여 광의 적어도 90%가 물질을 통해 투과한다는 것을 의미한다.
미세유체 경로 소자는 플레이트 사이에 형성된 챔버 및/또는 채널과 서로 상단에 적층된 2개 이상의 플레이트로 형성될 수 있다; 탄성 물질은 제1 플레이트와 제2 플레이트 사이에 끼워있을 수 있다. 제1 플레이트 및/또는 제2 플레이트는 강성 물질로부터 형성될 수 있다. 플레이트는 동일한 물질 또는 상이한 물질(들)로 형성될 수 있다. 예를 들어, 강성 물질은 폴리머 또는 유리일 수 있다. 폴리머 또는 유리는 생체적합성일 수 있으며, 예를 들어 살아있는 세포에 대해 독성인 임의의 모노머 또는 가용성 소분자를 침출시키지 않는다. 특히 의료 등급 폴리카르보네이트-우레탄, 실리콘 폴리카르보네이트 우레탄, 폴리에테르 우레탄을 포함하는 임의의 적합한 생체적합성 폴리머가 사용될 수 있다. 일부 변형에서, 폴리머는 사이클로올레핀 코폴리머일 수 있다.
도 19b는 미세유체 경로 소자의 일부를 통한 단면을 보여주며, 이는 유체 접촉 측 및 압력 수용 측(1919)로 탄성 물질(1907)에 의해 분기되는 챔버(1920)의 유체 접촉 측(1917) 내부의 투과성 삽입물(1969)을 보여준다. 따라서, 미세유체에 경로 소자는 2개의 융기된 층 사이에 끼워진 가요성 멤브레인(1907)과 2개 초과의 강성 층(1903, 1905)으로 구성된 다중층 구조로서 구성될 수 있다. 도 19b는 본원에 기술된 바와 같은 치료제를 처리하기 위한 반응기를 형성하는 다중 층을 갖는 미세유체 경로 소자의 한 예를 통한 단면부(미세유체 경로 소자의 평면을 가로지름)의 일부를 보여준다. 반응기는 다중층으로부터 형성된 펌핑 챔버를 포함하는 밀봉부, 채널, 밸브 및 챔버를 포함할 수 있다. 예를 들어, 미세유체 경로 소자는 2개 이상의 강성 또는 반-강성 플레이트(1903, 1905) 및 적어도 하나의 탄성 층(1907)으로 형성될 수 있다. 탄성 층(1907)은 액체-불투과성인 탄성 물질의 시트일 수 있다. 다양한 영역을 포함하는 탄성 층은 다소 기체 투과성일 수 있거나, 다소 기체 투과성으로 처리될 수 있다. 탄성 물질의 단일 연속 시트가 사용될 수 있지만, 일부 변형에서 다중 탄성 물질 시트가 사용될 수 있거나, '시트'는 다중 시트의 섹션으로 형성될 수 있다. 층 및 탄성 시트는 함께 적층될 수 있다. 일반적으로, 유체를 보유, 밸브 처리 및/또는 펌핑하기 위한 챔버는 탄성 층의 어느 한쪽 측 상의 플레이트에 형성되어 탄성 층이 챔버를 액체 함유 측 및 압력(예를 들어, 기체) 인가 측으로 이등분할 수 있다. 챔버(들)의 전체 부피는 일정할 수 있으며, 제1(예를 들어, 상부) 플레이트와 제2(예를 들어, 하부) 플레이트 둘 모두 안에 형성될 수 있지만, 이 부피는 압력 측 및 액체 측으로 분할될 수 있다. 압력 측에 양압 또는 음압을 가함으로써 탄성 시트는 액체 함유 측의 부피를 감소시키거나(영으로 낮추고 챔버를 밀폐시킴) 액체 함유 측의 부피를 (소정의 최대 부피로) 증가시키기 위해 변형될 수 있다. 챔버의 압력 인가 측은 예를 들어, 하나 이상의 챔버의 압력 수용 측(1919)에 음압 또는 양압을 인가하기 위해, 예를 들어 압력 채널(1947)에 연결되는 상부 플레이트(41903)의 압력 포트(1943)를 통해 연결될 수 있다. 각 챔버의 압력 인가 측 반대편의 액체 함유 측(1917)은 유체 채널(1921)을 통해 유체 포트(1923)에 연결될 수 있다. 유체 포트와 압력 포트 둘 모두는 상부 플레이트(1903)와 탄성 층(1907)으로의 개구에 의해 형성될 수 있으며, 이는 압력 라인이 반대쪽 강성 또는 반강성 층(들)(1905, 1909)에 의해 포트의 밑면 상에 지지되는 탄성 층(1907) 내로 밀려 갈 때 여러 개의 상이한 입력 라인이 존재하는 경우에도 대기로부터 분리되는 밀봉된 연결을 허용한다.
도 19b에서 미세유체 경로 소자(1900)는 제1(예를 들어, 상단 또는 상부) 표면(1911) 및 제2(바닥 또는 하부) 표면(1929) 및 둘 사이의 두께를 갖는 제1(예를 들어, 상부) 플레이트(1903)를 포함한다. 제1 표면(1911)은 노출된 외면을 형성할 수 있다. 미세유체 경로 소자는 또한 제1(예를 들어, 상부 또는 상단) 표면(1931) 및 제2(예를 들어, 하부 또는 하단) 표면(1933) 및 그 사이의 두께를 갖는 제2 플레이트(1905)를 포함한다. 탄성 층(1907)은 제1 플레이트(1903)의 제2 표면(1929)과 제2 플레이트(1905)의 제1 표면(1931) 사이에 끼워진다. 이러한 예에서, 제3 플레이트(1909)는 제2 플레이트의 제2 표면(1933) 상의 제2 플레이트에 직접적으로 또는 간접적으로 결합된다. 제3 플레이트(1909)는 또한 제1 (예를 들어, 상부 또는 상단) 표면 및 제2 (하부 또는 하단) 표면 및 이들 사이의 두께를 갖는다. 제3 플레이트의 제2 표면은 미세유체 경로 소자의 하단 표면을 형성할 수 있다. 임의의 플레이트는 다중 층으로 형성될 수 있으며, 이는 적층될 수 있거나 함께 연결될 수 있다. 예를 들어, 도 19b에서, 제3 플레이트(1909)는 제3 플레이트를 제2 플레이트에 결합시키는 것을 도울 수 있는 선택적인 제2 탄성 층(1913)을 포함한다; 이러한 예에서 제2 탄성 층(1913)은 제3 플레이트(1909)의 제1 표면(1935)을 형성한다. 도 19b에 도시된 층 및 플레이트는 축적으로 작성되지 않을 수 있다(예를 들어, 탄성 층(1907)은 플레이트에 비해 더 얇을 수 있다).
도 19b에 도시된 미세유체 경로 소자(1900)는 또한 각각이 고정 부피를 갖는 복수의 챔버(1915, 1916, 1918, 1920)를 포함할 수 있다. 이들 챔버는 제1 플레이트(1903)의 제2(바닥) 표면(1929) 및 제2 플레이트(1905)의 제1(상부) 표면(1931)으로의 절단 영역(예를 들어, 둥근/곡선 절단부)에 의해 형성되며; 탄성 층(1907)은 각각이 액체 함유 측(1917) 및 압력 수용(예를 들어, 기체 함유) 측(1919)을 포함하도록 이들 챔버(1915)를 분기시킨다. 미세유체 경로 소자(1900)는 또한 다수의 액체(예를 들어, 유체) 채널을 포함할 수 있다. 도 19b에서, 단일 유체 채널(1921)은 제1플레이트(1903)의 두께를 통과하는 유체 포트(1923)로부터 탄성 층(1907)을 통과하여 유체 채널 개구(1925)까지 그리고 제2 플레이트(1905)의 두께의 대부분을 통과하여 제2 플레이트의 바닥 표면(1933) 까지 아래로 연장되는 것으로 도시되며, 여기서 제3 플레이트의 바닥 표면과 평행하게 연장되는 액체 채널(1921)의 길이는 제2플레이트의 바닥 표면(1933)에 형성되고 제3 플레이트(1909)의 상부 표면에 의해 경계가 형성된다.
유체 포트(1923)와 관련하여, 제1 플레이트의 두께를 통과하여 연장되는 유체 포트(1923)를 형성하는 제1 플레이트(1903)로의 개구의 직경은 탄성 층(1907)을 통과하여 액체(예를 들어, 유체) 채널(1921) 내로 연장되는 유체 채널 개구(1925)의 직경보다 클 수 있다. 유체 채널 개구(1925)는 유체 포트 개구의 바닥에 대해 중앙에 위치할 수 있고, 유체 포트에 연결될 유체 라인 또는 유체 라인 결합 인터페이스의 적어도 예상된 벽 두께만큼 유체 포트 개구의 벽으로부터 오프셋될 수 있다.
유체 채널(1921)은 제1 챔버(1915)의 액체 함유 측(1917)에 연결된다. 이러한 제1 챔버는 상대적으로 낮은 보유 부피(고정된 부피)를 갖지만, 탄성 층(1907)의 움직임에 의해 완전히 개방되거나 밀폐될 수 있는 밸브로서 구성될 수 있다.
미세유체 경로 소자(1900)는 또한 양압 및/또는 음압을 가하도록 독립적으로 제어될 수 있는 복수의 압력 채널을 포함한다. 도 19b에서, 제4 챔버(1920)에 연결된 단일 압력 포트(1943)가 도시되어 있지만, 각각의 챔버(1915, 1916, 1918)는 이들 챔버를 분기시키는 탄성 층(1907)의 일부의 움직임을 독립적으로 작동 및 제어하기 위한 별도의 압력 포트 및 압력 채널에 연결되어 각 챔버를 독립적으로 밸브 및/또는 펌핑시킬 수 있다. 일부 변형에서, 압력 포트는 다중 챔버 사이에 공유될 수 있다. 도 19b에서, 압력(예를 들어, 기체) 포트(1943)는 유체(예를 들어, 액체) 포트(1925)와 유사하고, 제1 플레이트(1903)를 완전히 관통하여 노출된 탄성 층(1907)까지 아래로, 압력(예를 들어, 기체) 채널 개구(1945)를 형성하는 탄성 층을 통과하눈 개구부까지의 개구를 포함한다. 압력 채널 개구(1945)는 압력 포트(1943)로부터 연장되는 압력(예를 들어, 기체) 채널(1947)과 연속하며, 제1 플레이트(1903)의 두께의 대부분을 통과하고 제2 플레이트의 바닥을 따라 컷-아웃 채널에서(또는 대안적으로 제3 플레이트의 상단에서 컷-아웃 영역 내로), 제2 플레이트 및 탄성 층(1907)을 통하여 제4 챔버(1920)의 압력(예를 들어, 기체) 함유 부분(1919)에 연결되는 제1 플레이트 내부의 압력 채널의 영역으로 다시 올라간다. 유사한 유체(예를 들어, 액체) 포트에 대해 설명된 바와 같이, 제1 플레이트(1903)의 두께를 통과하는 압력 포트(1943)의 직경은 탄성 층(1907)을 통과하는 압력 채널 개구(1945)의 직경보다 클 수 있으며, 압력 포트에 연결된 압력 라인 또는 압력 라인 결합 인터페이스의 벽 두께보다 더 크게 중앙에 놓이거나 오프셋될 수 있다.
도 19b에 도시된 미세유체 경로 소자(1900)을 통한 단면에서 제시되지 않은 다른 유체(예를 들어, 액체) 라인, 유체 포트, 압력 라인 및 압력 포트에 대한 다수의 연결이 있으며, 이는 제시된 평면에서 벗어날 수 있다. 예를 들어, 도 19b에서, 제4 챔버의 액체 함유 측 또는 함유부(1917)는 예를 들어, 액체 함유 측(1917)으로부터 연장되는 출구 채널을 포함하는 추가 밸브(챔버) 및/또는 채널에 연결될 수 있다. 도시되지 않은 추가 챔버(예를 들어, 밸브로서 구성됨)가 상기 기술된 바와 같이 형성될 수 있다. 일부 변형에서, 출구 채널은 유체를 또 다른 유체 포트(미도시됨)를 통해 하나 이상의 챔버로부터 유체 수용 저장소, 예를 들어, 바이알, 튜브 등에 전달할 수 있다. 이러한 수용 저장소는 시약 저장 프레임에 고정될 수 있다.
상기 언급된 바와 같이, 투과성 삽입물(1969)은 분리 챔버의 유체 접촉 측에 삽입될 수 있으며, 챔버의 압력 수용 측으로부터 유체 접촉 챔버를 분리하는 탄성 물질에 의해 압축되도록 구성될 수 있다. 이 예에서, (예를 들어, 이 챔버로 향하는 압력 포트를 통해) 수용 측에 가해진 양압 또는 음압은 탄성 물질을 편향시켜 유체 접촉 측의 부피를 변화시킬 수 있다. 유체는 투과성 삽입물(1969)로 챔버(1920) 내로 유입될 수 있으며, 유체는 삽입물을 통과하여 용액을 변형시킬 수 있다. 투과성 삽입물이 압축 가능한 변형에서, 이는 압축되어 챔버로부터 유체를 제거하고 배출할 수 있다; 그 후 일부 변형에서, 투과성 삽입물은 다시 팽창된 구성으로 다시 팽창될 수 있으며(또는 팽창되게 허용될 수 있으며), 그 후 유체는 이를 다시 통과하거나 추가 처리가 수행될 수 있다.
본원에 기술된 투과성 삽입물은 일반적으로 치료학적 물질을 포함하는 (또는 치료학적 물질이 형성되는) 용액을 변형시키는데 사용될 수 있다. 도 20a는 본원에 기술된 임의의 장치를 사용하여 유체 중의 치료학적 물질(예를 들어, RNA 샘플)을 처리하는 방법의 한 예를 개략적으로 예시한다. 예를 들어, 방법은 먼저 미세유체 경로 소자 (또는 하나 초과의 미세유체 경로 소자)를 미세유체 경로 소자 제어 시스테(2001)에 부착시키는 단계를 포함할 수 있다. 이 단계는 미세유체 경로 소자를 압력 공급원에 결합시키는 것을 포함할 수 있다. 일부 변형에서, 이 단계 (또는 추가 단계)는 치료학적 물질, 예컨대 RNA의 공급원에 미세유체 경로 소자를 결합시키는 것을 포함할 수 있다. 선택적으로, 일부 변형에서, 방법은 미세유체 경로 소자에서 치료학적 물질을 합성하는 단계, 예컨대 시험관내 전사에 의해 치료학적 RNA를 생성하는 단계(2003)를 포함할 수 있다.
방법은 치료학적 물질(예를 들어, RNA)을 갖는 샘플을 투과성 삽입물을 함유하는 처리 챔버의 유체 접촉부에 수송하는 단계(2005)를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 이는 압력을 가하여 샘플을 미세유체 경로 소자의 분리 챔버의 유체 접촉 측에 수송하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 변형에서, 압력을 미세유체 경로 소자 내부에서 탄성 물질(예를 들어, 탄성 멤브레인)을 편향시킴으로써 인가하여 치료제 (또는 추정 치료학적 물질)을 포함하는 유체를 챔버의 유채 접촉 측 내로 구동시킬 수 있다. 이 단계의 일부로서, (치료제/추정 치료제를 포함하는) 유체 샘플은 분리 챔버의 유체 접촉 측 내부의 투과성 삽입물을 통과하여 샘플을 변형시킬 수 있다(2007). 예를 들어, 치료제/추정 치료제로부터의 물질은 투과성 삽입물과의 상호작용에 의해 추가되거나 제거될 수 있다.
마지막으로, 예를 들어, 챔버의 압력 수용 측으로부터 챔버의 유체 접촉 측을 분리하는 탄성 물질, 예컨대 탄성 멤브레인을 편향시킴으로써 분리 챔버의 유체 접촉 측 밖으로 샘플을 수송하도록 압력이 가해질 수 있다(2009).
도 20b는 본원에 기술된 임의의 장치를 사용하여 유체 중의 치료학적 물질(예를 들어, RNA 샘플)을 처리하는 방법의 특정 예를 예시한다. 예를 들어, 도 20b에서, 상기 방법은 dsRNA 및 단일 가닥 RNA(ssRNA)를 모두 함유하는 RNA 샘플로부터 이중 가닥 RNA(dsRNA)를 제거하는 방법일 수 있다. 이러한 변형에서, 방법은 미세유체 경로 소자를 압력 공급원에 결합시키는 단계(2011)를 포함할 수 있다. 언급된 바와 같이, 일부 변형에서, 이는 미세유체 경로 소자를 치료학적 RNA의 공급원에 연결하고/거나 위에서 설명한 바와 같이 미세유체 경로 소자에서 치료학적 RNA의 시험관내 전사를 수행하는 단계(2013)를 포함할 수 있다. 그 후, 방법은 압력을 가하여 RNA 샘플을 미세유체 경로 소자의 분리 챔버의 유체 접촉 측에 수송하는 단계(2015)를 포함할 수 있다. 그 후, RNA 샘플은 분리 챔버의 유체 접촉 측 내에서 콜라겐을 포함하는 고체 및 투과성 삽입물을 통해/내로 통과될 수 있으며(2017), 여기서 셀룰로스는 dsRNA에 결합하여 dsRNA가 삽입물에 의해 보유된다. 그런 다음, 압력이 가해져 분리 챔버의 유체 접촉 측 밖으로 RNA 샘플을 수송할 수 있으며, 치료학적 용액 중에 ssRNA가 남게 된다(2019). 단계는 dsRNA를 모두 또는 실질적으로 모두 제거하기 위해 필요에 따라 반복될 수 있다.
위에서 언급한 바와 같이, 추가 처리(전달 비히클과의 조합, 투석, 농축 등)가 수행될 수 있다.
본원에 기술된 장치는 하나 이상의 분리 챔버를 포함하고/하거나 이와 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 변형에서, 본원에 기술된 장치는, 예를 들어, 대상체에게 전달하기 위한 치료학적 폴리뉴클레오티드를 생성할 수 있는 치료학적 폴리뉴클레오티드 제조 '팩토리'의 일부일 수 있다. 치료학적 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어, 치료학적 mRNA일 수 있다. 도 21a-21b는 자체적으로 팩토리 장치로서 사용될 수 있거나, 병렬 제조 유닛의 일부로서 사용될 수 있는 장치의 일 예를 예시한다. 도 21a에서, 장치(들)(2101, 2101')는 클래스 5 분리 캐비넷(2103)을 포함할 수 있거나 그 안에 보유될 수 있으며; 분리 캐비넷은 자체가 클래스 7 분리 공간 내에 보유될 수 있다. 도 21a에서, 캐비넷은 2개의 미세유체 제어 장치(2101, 2101')를 포함한다. 장치는 환자용으로 신속하게 치료학적 mRNA와 같은 치료학적 폴리뉴클레오티드를 자동으로 제조할 수 있는 정확한 카피의 GMP 유닛을 제공하는 조립체 팩토리의 일부일 수 있다. 이들 장치는 고도로 재구성 가능할 수 있고, 신속한 배치 및 저비용 생산을 허용한다. 일부 변형에서, 이들은 주문형 제조 "팩토리" 단위로 배치될 수 있다. 일부 변형에서, 이들 장치는 원격 부위에 일시적으로 또는 더 긴 기간 동안 배치될 수 있는 이동 유닛의 일부로서 설정될 수 있다.
특징 또는 요소가 본원에서 또 다른 특징 또는 요소 "상에" 존재하는 것으로 지칭되는 경우, 이는 다른 특징 또는 요소에 직접 존재할 수 있거나 사이에 존재하는 특징 및/또는 요소가 또한 존재할 수 있다. 대조적으로, 특징 또는 요소가 또 다른 특징 또는 요소 "바로 위에" 있는 것으로 지칭되는 경우, 사이에 존재하는 특징 또는 요소가 존재하지 않는다. 특징 또는 요소가 또 다른 특징 또는 요소에 "연결"되거나, "부착"되거나, "커플링"되는 것으로 지칭되는 경우, 이는 다른 특징 또는 요소에 직접 연결되거나, 부착되거나, 커플링될 수 있거나, 사이에 존재하는 특징 또는 요소가 존재할 수 있는 것이 또한 이해될 것이다. 대조적으로, 특징 또는 요소가 또 다른 특징 또는 요소에 "직접 연결"되거나, "직접 부착"되거나, "직접 커플링"되는 것으로 지칭되는 경우, 사이에 존재하는 특징 또는 요소가 존재하지 않는다. 일 구현예와 관련하여 기술되거나 제시되었지만, 그렇게 기술되거나 제시된 특징 및 요소는 다른 구현예에 적용될 수 있다. 또한, 또 다른 특징에 "인접하게" 배치된 구조 또는 특징에 대한 언급은 인접한 특징과 중첩되거나 밑에 놓이는 부분을 가질 수 있다는 것이 당업자에 의해 인식될 것이다.
본원에 사용된 용어는 단지 특정 구현예를 기술하기 위한 것이며, 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다. 예를 들어, 본원에서 사용되는 단수 형태는 문맥이 명백히 달리 나타내지 않는 한 복수의 형태를 또한 포함하고자 한다. 본 명세서에서 사용되는 경우 용어 "포함하다" 및/또는 "포함하는"은 언급된 특징, 단계, 작업, 요소 및/또는 성분의 존재를 명시하나, 하나 이상의 다른 특징, 단계, 작업, 요소, 성분 및/또는 이들의 그룹의 존재 또는 첨가를 배제하지는 않는 것이 추가로 이해될 것이다. 본원에서 사용되는 용어 "및/또는"은 하나 이상의 관련된 열거된 항목의 임의의 및 모든 조합을 포함하며, "/"로 약칭될 수 있다.
"밑에", "아래에", "하부에", "위에", "상부에" 등과 같은 공간적으로 상대적인 용어는 도면에 예시된 바와 같이 하나의 요소 또는 특징의 또 다른 요소(들) 또는 특징(들)에 대한 관계의 용이한 설명을 위해 본원에서 사용될 수 있다. 공간적으로 상대적인 용어는 도면에 도시된 배향에 더하여 사용 또는 작동시 소자의 상이한 배향을 포함하도록 의도된다는 것이 이해될 것이다. 예를 들어, 도면에서 소자가 반전된 경우, 다른 요소 또는 특징의 "아래" 또는 "밑에"로 설명된 요소는 이후 다른 요소 또는 특징의 "위에" 배향될 것이다. 따라서, 예시적인 용어 "아래"는 위 및 아래의 배향 둘 모두를 포함할 수 있다. 소자는 달리 배향될 수 있고(90도 회전되거나 다른 배향으로), 본원에 사용된 공간적으로 상대적인 설명자는 이에 따라 해석된다. 유사하게, 용어 "상향", "하향", "수직", "수평" 등은 달리 구체적으로 지시되지 않는 한 설명의 목적으로만 본원에서 사용된다.
용어 "제1" 및 "제2"는 본원에서 다양한 특징/요소(단계를 포함함)를 설명하기 위해 사용될 수 있지만, 문맥이 달리 지시하지 않는 한 이들 특징/요소는 이들 용어에 의해 제한되어서는 안 된다. 이들 용어는 하나의 특징/요소를 또 다른 특징/요소와 구별하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 하기에 논의되는 제1 특징/요소는 제2 특징/요소로 언급될 수 있고, 유사하게, 하기에 논의되는 제2 특징/요소는 본 발명의 교시로부터 벗어나지 않고 제1 특징/요소로 언급될 수 있다.
본 명세서 및 하기의 청구범위 전체에 걸쳐, 문맥이 달리 요구하지 않는 한, 용어 "-들을 포함하다" 및 "-을 포함하다" 및 "포함하는"과 같은 변형은 다양한 구성요소가 방법 및 물품(예를 들어, 조성물 및 소자를 포함하는 장치 및 방법)에서 공동으로 사용될 수 있음을 의미한다. 예를 들어, 용어 "포함하는"은 임의의 언급된 요소 또는 단계의 포함을 의미하지만 임의의 다른 요소 또는 단계의 배제를 의미하지 않는 것으로 이해될 것이다.
일반적으로, 본원에 기술된 임의의 장치 및 방법은 포괄적인 것으로 이해되어야 하지만, 구성요소 및/또는 단계의 전부 또는 하위 세트는 대안적으로 배타적일 수 있고, 다양한 구성요소, 단계, 하위-구성요소 또는 하위-단계로 "구성"되거나 대안적으로 "필수적 요소로 하여 구성(consisting essentially of)"되는 것으로 표현될 수 있다.
실시예에서 사용되는 것을 포함하는 명세서 및 청구범위에서 본원에서 사용되는 바와 같이, 달리 명시적으로 지정되지 않는 한, 용어가 명시적으로 나타내지 않더라도 모든 숫자는 용어 "약" 또는 "대략"이 앞에 있는 것처럼 판독될 수 있다. 어구 "약" 또는 "대략"은 설명된 값 및/또는 위치가 값 및/또는 위치의 합리적인 예상 범위 내에 있음을 나타내기 위해 크기 및/또는 위치를 설명하는 경우에 사용될 수 있다. 예를 들어, 숫자 값은 언급된 값(또는 값의 범위)의 +/- 0.1%, 언급된 값(또는 값의 범위)의 +/- 1%, 언급된 값(또는 값의 범위)의 +/- 2%, 언급된 값(또는 값의 범위)의 +/- 5%, 언급된 값(또는 값의 범위)의 +/- 10% 등인 값을 가질 수 있다. 본원에 제공된 임의의 숫자 값은 문맥이 달리 지시하지 않는 한 약 또는 대략적인 상기 값을 포함하는 것으로 또한 이해되어야 한다. 예를 들어, 값 "10"이 개시되면, "약 10"이 또한 개시된다. 본원에 언급된 임의의 숫자 범위는 그 안에 포함된 모든 하위-범위를 포함하도록 의도된다. 또한, 값보다 "작거나 같은" 값이 개시되는 경우, "값보다 크거나 같음" 및 값 사이의 가능한 범위가 또한 당업자에 의해 적절하게 이해되는 바와 같이 개시되는 것으로 이해된다. 예를 들어, 값 "X"가 개시되는 경우, "X보다 작거나 같음" 뿐만 아니라 "X보다 크거나 같음"(예를 들어, X가 숫자 값인 경우)이 또한 개시된다. 또한, 출원 전체에 걸쳐, 데이터는 상이한 형식의 숫자로 제공되며, 이러한 데이터는 종점 및 시작점 및 데이터 포인트의 임의의 조합에 대한 범위를 나타내는 것이 이해된다. 예를 들어, 특정 데이터 포인트 "10" 및 특정 데이터 포인트 "15"가 개시되는 경우, 10 및 15보다 크고, 이보다 크거나 같고, 이보다 작고, 이보다 작거나 같고, 이와 동일한 것뿐만 아니라 10 내지 15가 개시된 것으로 간주되는 것이 이해된다. 또한, 2개의 특정 단위 사이의 각각의 단위가 또한 개시되는 것이 이해된다. 예를 들어, 10 및 15가 개시되면, 11, 12, 13 및 14가 또한 개시된다.
다양한 예시적인 구현예가 위에서 설명되었지만, 청구범위에 의해 기술된 바와 같은 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 다양한 구현예에 대해 임의의 다수의 변경이 이루어질 수 있다. 예를 들어, 다양한 설명된 방법 단계가 수행되는 순서는 종종 대안적인 구현예에서 변경될 수 있고, 다른 대안적인 구현예에서 하나 이상의 방법 단계가 함께 생략될 수 있다. 다양한 소자 및 시스템 구현예의 선택적 특징은 일부 구현예에 포함될 수 있고, 다른 구현예에는 포함되지 않을 수 있다. 따라서, 전술한 설명은 주로 예시적인 목적으로 제공되며, 청구범위에 기술된 바와 같이 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
본원에 포함된 예 및 예시는 주제가 실시될 수 있는 특정 구현예를 제한이 아닌 예시로서 제시한다. 언급된 바와 같이, 다른 구현예가 이용되고 이로부터 유래될 수 있어서, 본 발명의 개시의 범위로부터 벗어나지 않고 구조적 및 논리적 치환 및 변경이 이루어질 수 있다. 본 발명의 주제의 상기 구현예는 하나 초과가 사실 개시된 경우 본 출원의 범위를 임의의 단일 발명 또는 발명적 개념으로 자발적으로 제한하려는 의도 없이 단지 편의상 용어 "발명"에 의해 본원에서 개별적으로 또는 집합적으로 언급될 수 있다. 따라서, 특정 구현예가 본원에 예시되고 설명되었지만, 동일한 목적을 달성하기 위해 계산된 임의의 배열이 제시된 특정 구현예를 대체할 수 있다. 본 발명의 개시는 다양한 구현예의 임의의 및 모든 적응 또는 변형을 포함하도록 의도된다. 상기 구현예의 조합, 및 본원에 구체적으로 설명되지 않은 다른 구현예는 상기 설명을 검토할 때 당업자에게 명백할 것이다.

Claims (99)

  1. 하나 이상의 미세유체 경로 소자와 밀봉 유체 소통하여 고정되도록 구성된 복수의 유체 저장소를 포함하는 시스템을 사용하여 치료학적 폴리뉴클레오티드를 제조하는 방법으로서, 방법은 대기 접촉으로부터 보호되는 밀봉 밀폐된 유체 경로에서 하나 이상의 미세유체 경로 소자 상의 복수의 반응기와 복수의 유체 저장소 중 하나 이상의 유체 저장소 사이에 시약을 수송하여 합성 주형을 형성하는 단계, 주형으로부터의 시험관내 전사를 수행하여 치료학적 폴리뉴클레오티드를 생성하는 단계 및 치료학적 폴리뉴클레오티드를 정제하는 단계를 수행하는 것을 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 치료학적 폴리뉴클레오티드를 정제하는 단계가 복수의 반응기 중 하나 이상 반응기의 내부에서의 치료학적 폴리뉴클레오티드의 2차원(2D) 정제를 포함하는, 방법.
  3. 제1항에 있어서, 치료학적 폴리뉴클레오티드를 전달 비히클과 하나 이상의 미세유체 경로 소자 상의 하나 이상의 반응기에서 제형화시켜 치료학적 폴리뉴클레오티드 조성물을 형성시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 하나 이상의 미세유체 경로 소자에서 치료학적 폴리뉴클레오티드 조성물을 농축시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  5. 제3항에 있어서, 전달 비히클이 양친매성 나노입자를 포함하는, 방법.
  6. 제5항에 있어서, 양친매성 나노입자가 아미노-지질화된 펩토이드(peptoid)를 포함하는, 방법.
  7. 제1항에 있어서, 치료학적 폴리뉴클레오티드를 정제하는 단계가 하나 이상의 반응기 내에서 셀룰로스 물질을 사용하여 이중-가닥 mRNA를 제거하는 것을 포함하는, 방법.
  8. 제1항에 있어서, 시스템이 합성 주형을 형성하는 단계, 주형으로부터의 시험관내 전사를 수행하는 단계 및 시스템의 하나 이상의 센서로부터의 광 피드백으로 치료학적 폴리뉴클레오티드를 정제하는 단계를 자동으로 연속적으로 수행하는, 방법.
  9. 제1항에 있어서, 치료학적 폴리뉴클레오티드가 mRNA인, 방법.
  10. 제1항에 있어서, 치료학적 폴리뉴클레오티드가 mRNA, 원형 RNA 또는 자가-복제 RNA인, 방법.
  11. 제1항에 있어서, 시스템이 하나 이상의 유체 저장소와 복수의 반응기 사이에 시약을 유체 동력에 의해 수송하는, 방법.
  12. 제11항에 있어서, 시스템이 하나 이상의 유체 저장소와 복수의 반응기 사이에 시약을 공압에 의해 수송하는, 방법.
  13. 제1항에 있어서, 시스템이 하나 이상의 미세유체 경로 소자 내에서 하나 이상의 탄성 층을 편향시킴으로써 하나 이상의 유체 저장소와 복수의 반응기 사이에 시약을 수송하는, 방법.
  14. 제1항에 있어서, 방법이 치료 현장에서 수행되는, 방법.
  15. 제1항에 있어서, 시스템이 합성 주형을 형성하는 단계, 주형으로부터의 시험관내 전사를 수행하여 치료학적 폴리뉴클레오티드를 생성하는 단계 및 3일 미만에 치료학적 폴리뉴클레오티드를 정제하는 단계를 자동으로 연속적으로 수행하는, 방법.
  16. 제1항에 있어서, 하나 이상의 미세유체 경로 소자 상의 복수의 반응기와 유체 저장소 사이에 시약을 수송하기 전에 하나 이상의 미세유체 경로 소자에 대해 유체 저장소를 밀봉하고 유체 저장소를 가압하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  17. 제1항에 있어서, 제조되는 치료학적 폴리뉴클레오티드와 관련된 파일에서 단계를 수행하는 동안 하나 이상의 미세유체 경로 소자 내에서 유체의 이동을 기록하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  18. 제1항의 방법을 이용하여 제조된 치료학적 폴리뉴클레오티드.
  19. 하나 이상의 미세유체 경로 플레이트 소자와 밀봉 유체 소통하여 고정되도록 구성된 복수의 유체 저장소를 포함하는 시스템을 사용하여 치료학적 mRNA를 제조하는 방법으로서, 하나 이상의 미세유체 경로 플레이트 소자가 복수의 반응기를 포함하며, 방법은
    주형 전구체 물질을 하나 이상의 유체 저장소로부터 복수의 반응기의 제1의 하나 이상의 반응기 영역에 전달하고, 주형 전구체 물질을 처리하여 주형 전구체 물질로부터 주형을 제조하는 단계;
    주형을 복수의 반응기의 제2의 하나 이상의 반응기 영역에 이송하고, 시험관내 전사에 의해 주형을 처리하여 치료학적 mRNA를 형성하는 단계; 및
    치료학적 mRNA를 복수의 반응기의 제3의 하나 이상의 반응기 영역에 이송하고, 제3의 하나 이상의 반응기 영역 내에서 2차원(2D) 정제에 의해 치료학적 mRNA를 정제하는 단계를 포함하며;
    여기서 방법의 모든 단계는 주형 및 치료학적 mRNA를 대기 접촉에 노출시키지 않으면서 수행되는, 방법.
  20. 하나 이상의 미세유체 경로 플레이트 소자와 밀봉 유체 소통되는 복수의 유체 저장소를 포함하는 시스템을 사용하여 치료학적 mRNA를 제조하는 방법으로서, 하나 이상의 미세유체 경로 플레이트 소자가 복수의 반응기를 포함하며, 방법은
    주형 전구체 물질을 하나 이상의 유체 저장소로부터 복수의 반응기의 제1의 하나 이상의 반응기 영역에 유체 동력을 사용하여 전달하고, 주형 전구체 물질을 처리하여 주형 전구체 물질로부터 주형을 제조하는 단계;
    주형을 복수의 반응기의 제2의 하나 이상의 반응기 영역에 유체 동력을 이용하여 이송하고, 시험관내 전사에 의해 주형을 처리하여 치료학적 mRNA를 형성하는 단계;
    치료학적 mRNA를 복수의 반응기의 제3의 하나 이상의 반응기 영역에 유체동력을 이용하여 이송하고, 제3의 하나 이상의 반응기 영역 내에서 2차원(2D) 정제에 의해 치료학적 mRNA를 정제하는 단계;
    치료학적 mRNA를 복수의 반응기의 제4의 하나 이상의 반응기 영역에 유체 동력을 이용하여 이송하고, 치료학적 mRNA를 전달 비히클로 캡슐화하여 치료학적 mRNA 조성물을 형성하는 단계; 및
    치료학적 mRNA 조성물을 제5의 하나 이상의 유체 저장소에서 유체 동력을 이용하여 농축하는 단계를 포함하며,
    여기서 방법의 모든 단계는 주형 및 치료학적 mRNA를 대기 접촉에 노출시키지 않으면서 수행되는, 방법.
  21. 치료학적 폴리뉴클레오티드를 제조하기 위한 명령을 구현하는 비일시적 컴퓨터 판독가능 매체로서, 하나 이상의 미세유체 경로 소자와 밀봉 유체 소통하여 고정되도록 구성된 복수의 유체 저장소를 포함하는 시스템의 제어기에 의해 실행되는 경우 제어기로 하여금
    하나 이상의 미세유체 경로 소자와 유체 소통하는 복수의 유체 저장소를 가압하고;
    대기 접촉으로부터 보호되는 밀봉 밀폐된 유체 경로에서 하나 이상의 미세유체 경로 소자 상의 복수의 반응기와 복수의 유체 저장소 중 하나 이상의 유체 저장소 사이에 시약을 수송하여
    합성 주형을 형성하는 단계,
    주형으로부터의 시험관내 전사를 수행하여 치료학적 폴리뉴클레오티드를 생성하는 단계 및
    치료학적 폴리뉴클레오티드를 정제하는 단계를
    수행하는 방법을 수행하게 하는, 컴퓨터 판독가능 매체.
  22. 제21항에 있어서, 명령이 추가로 제어기로 하여금 합성 주형을 형성하는 단계, 주형으로부터의 시험관내 전사를 수행하는 단계 및 시스템의 하나 이상의 광 센서로부터의 광 피드백을 기반으로 하여 치료학적 폴리뉴클레오티드를 정제하는 단계를 자동으로 연속적으로 수행하게 하는, 컴퓨터 판독가능 매체.
  23. 제21항에 있어서, 명령이 추가로 제어기로 하여금 복수의 반응기 중 하나 이상의 반응기 내에서 2차원(2D) 정제에 의한 치료학적 폴리뉴클레오티드의 정제를 제어하게 하는, 컴퓨터 판독가능 매체.
  24. 제21항에 있어서, 명령이 추가로 제어기로 하여금 치료학적 폴리뉴클레오티드를 하나 이상의 미세유체 경로 소자 상의 하나 이상의 반응기에서 전달 비히클과 제형화시켜 치료학적 폴리뉴클레오티드 조성물을 형성하게 하는, 컴퓨터 판독가능 매체.
  25. 제21항에 있어서, 명령이 추가로 제어기로 하여금 하나 이상의 미세유체 경로 소자에서 치료학적 폴리뉴클레오티드 조성물을 농축하게 하는, 컴퓨터 판독가능 매체.
  26. 제21항에 있어서, 명령이 추가로 제어기로 하여금 유체 동력에 의해 하나 이상의 유체 저장소와 복수의 반응기 사이에 시약을 수송하게 하는, 컴퓨터 판독가능 매체.
  27. 제21항에 있어서, 명령이 추가로 제어기로 하여금 하나 이상의 미세유체 경로 소자 내에서 하나 이상의 탄성 층을 편향시킴으로써 하나 이상의 유체 저장소와 복수의 반응기 사이에 시약을 수송하게 하는, 컴퓨터 판독가능 매체.
  28. 제21항에 있어서, 명령이 추가로 제어기로 하여금 합성 주형을 형성하는 단계, 주형으로부터의 시험관내 전사를 수행하여 치료학적 폴리뉴클레오티드를 생성하는 단계 및 5일 미만에 치료학적 폴리뉴클레오티드를 정제하는 단계를 자동으로 연속적으로 수행하게 하는, 컴퓨터 판독가능 매체.
  29. 제21항에 있어서, 명령이 추가로 제어기로 하여금 제조되는 치료학적 폴리뉴클레오티드와 관련된 파일에서 단계를 수행하는 동안 하나 이상의 미세유체 경로 소자 내에서 유체의 이동을 기록하게 하는, 컴퓨터 판독가능 매체.
  30. 하나 이상의 미세유체 경로 소자와 밀봉 유체 소통하여 고정되도록 구성된 복수의 유체 저장소를 포함하는 밀폐된 경로 시스템을 사용하여 mRNA 합성을 위한 합성 이중 가닥 DNA 주형을 제조하는 자동화된 방법으로서, 방법은
    대기 접촉으로부터 보호되는 밀폐된 유체 경로에서 하나 이상의 미세유체 경로 소자 상의 복수의 반응기와 복수의 유체 저장소 중 하나 이상의 유체 저장소 사이에 시약을 수송하여 시약을 조합하는 단계; 및
    치료학적 mRNA의 시험관내 전사를 위한 합성 이중 가닥 DNA 주형을 형성하는 단계를 포함하는 방법.
  31. 제30항에 있어서, 합성 이중 가닥 DNA 주형이 박테리아 DNA 비함유 및 내독소 비함유 DNA 주형인, 방법.
  32. 제30항에 있어서, 밀폐 경로 시스템의 하나 이상의 센서로부터 광 센서 데이터를 밀폐 경로 시스템을 위한 제어기에서 수신하는 단계로서, 여기서 제어기는 광 센서 데이터를 기반으로 하여 밀폐 경로 시스템의 작동을 제어하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  33. 제30항에 있어서, 유체 저장소를 가압하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  34. 제30항에 있어서, 시약을 수송하는 단계가 복수의 유체 저장소 중 하나 이상의 유체 저장소로부터 합성 관심 유전자 및 합성 시험관내 전사 촉진제 카세트를 미세유체 경로 소자의 제1의 하나 이상의 반응기에 수송하는 단계, 합성 관심 유전자를 합성 시험관내 전사 촉진제 카세트와 결합시켜 합성 생성물을 생성하는 단계, 합성 생성물로부터 미반응 물질을 제거하는 단계 및 합성 생성물을 증폭하여 합성 이중 가닥 DNA 주형을 생성하는 단계를 포함하는, 방법.
  35. 제30항에 있어서, 하나 이상의 미세유체 경로 소자가 밀폐 경로 시스템에 안착된 미세유체 경로 플레이트 소자를 포함하는, 방법.
  36. 미세유체 경로 소자와 밀봉 유체 소통되는 복수의 유체 저장소를 포함하는 밀폐 경로 시스템을 사용하여 시험관내 전사를 위한 합성 이중 가닥 DNA 주형을 제조하는 자동화된 방법으로서, 방법은
    합성 관심 유전자 및 합성 시험관내 전사 촉진제 카세트를 포함하는 시약을 복수의 유체 저장소 중 하나 이상의 유체 저장소로부터 대기 접촉으로부터 보호되는 밀폐된 유체 경로의 미세유체 경로 소자에서 제1의 하나 이상의 반응기에 수송하는 단계;
    합성 관심 유전자를 합성 시험관내 전사 촉진제 카세트와 결합시켜 합성 생성물을 생성하는 단계;
    미세유체 경로 소자의 합성 생성물을 수송하여 미반응된 합성 관심 유전자 및 미반응된 합성 시험관내 전사 촉진제 카세트를 합성 생성물로부터 제거하는 단계; 및
    미세유체 경로 소자의 합성 생성물을 수송하고, 합성 생성물을 증폭하여 이중 가닥 DNA 주형을 생성하는 단계를 포함하는, 방법.
  37. 제36항에 있어서, 합성 생성물을 증폭하여 1 mM 초과의 증폭된 DNA 주형을 생성하는, 방법.
  38. 제36항에 있어서, 합성 이중 가닥 DNA 주형이 박테리아 DNA 비함유 및 내독소 비함유 DNA 주형인, 방법.
  39. 제36항에 있어서, 밀폐 경로 시스템의 하나 이상의 센서로부터 광 센서 데이터를 밀폐 경로 시스템을 위한 제어기에서 수신하는 단계로서, 여기서 제어기는 광 센서 데이터를 기반으로 하여 밀폐 경로 시스템의 작동을 제어하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  40. 제36항에 있어서, 유체 저장소를 가압하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  41. 제36항에 있어서, 수송 단계가 각각 하나 이상의 유체 동력 회로를 사용하여 복수의 유체 저장소와 미세유체 경로 소자 사이에 또는 미세유체 경로 소자 내에 물질을 이동시키는 단계를 포함하는, 방법.
  42. 제36항에 있어서, 증폭된 DNA 주형을 미세유체 경로 소자의 하나 이상의 분해 반응기에 이송하고, 증폭된 합성 생성물을 효소적으로 변형시켜 이중 가닥 DNA 주형을 생성하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  43. 제36항에 있어서, 합성 관심 유전자를 합성 시험관내 전사 촉진제 카세트와 결합시켜 합성 생성물을 생성하는 단계가 합성 선형 또는 원형 결찰 생성물을 생성하는 단계를 포함하는, 방법.
  44. 제36항에 있어서, 합성 생성물을 증폭시키는 단계가 선형, 분지형 또는 원형 증폭된 DNA 생성물을 생성하는 단계를 포함하고, 증폭된 DNA 생성물을 선형화하여 이중 가닥 DNA 주형을 생성하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  45. 제36항에 있어서, 결합이 DNA 리가제로의 결찰을 포함하는, 방법.
  46. 제36항에 있어서, 결합이 어닐링 또는 프라이머 확장을 포함하는, 방법.
  47. 제36항에 있어서, 증폭이 다중 변위 증폭(MDA)을 포함하는, 방법.
  48. 제36항에 있어서, 증폭이 중합효소 연쇄 반응(PCR) 증폭을 포함하는, 방법.
  49. 제36항에 있어서, 합성 시험관내 전사 촉진제 카세트가 프로모터; 5' UTR; 절단 가능한 링커; 3' UTR; 및 연속적으로 적어도 200개의 아데닌 잔기 또는 200개의 티미딘 잔기를 포함하는 폴리A 영역을 인코딩하는 부분을 포함하는 이중 가닥 DNA 주형을 포함하는, 방법.
  50. 제36항에 있어서, 이중 가닥 DNA 주형이 합성 관심 유전자의 3' 말단에서 길이가 적어도 300 bp인 폴리A 영역을 포함하는, 방법.
  51. 제36항에 있어서, 시험관내 전사 촉진제 카세트의 길이가 1 kb 미만인, 방법.
  52. 제36항에 있어서, 합성 시험관내 전사 촉진제 카세트가 항생제 내성 유전자를 인코딩하지 않는, 방법.
  53. 제36항에 있어서, 시험관내 전사 촉진제 카세트가 복제 기점(ORI)을 갖지 않는, 방법.
  54. 미세유체 경로 소자와 밀봉 유체 소통되는 복수의 유체 저장소를 포함하는 밀폐 경로 시스템을 사용하여 시험관내 전사를 위한 합성 이중 가닥 DNA 주형을 제조하는 자동화된 방법으로서, 방법은
    합성 관심 유전자 및 합성 시험관내 전사(IVT) 촉진제 카세트를 포함하는 시약을 복수의 유체 저장소 중 하나 이상의 유체 저장소로부터 대기 접촉으로부터 보호되는 밀폐된 유체 경로에서 미세유체 경로 소자의 제1의 하나 이상의 반응기에 수송하는 단계;
    합성 관심 유전자를 합성 IVT 촉진제 카세트와 제1의 하나 이상의 반응기에서 결합시켜 합성 생성물을 생성하는 단계;
    합성 생성물을 미세유체 경로 소자의 제2의 하나 이상의 반응기에 수송하여 미반응된 합성 관심 유전자 및 미반응된 합성 IVT 촉진제 카세트를 합성 생성물로부터 제거하는 단계;
    합성 생성물을 미세유체 경로 소자의 제3의 하나 이상의 반응기에 수송하고, 합성 생성물을 증폭시켜 1 mM 초과의 증폭된 DNA 주형을 생성하는 단계; 및
    밀폐 경로 시스템의 하나 이상의 센서로부터의 광 센서 데이터를 밀폐 경로 시스템을 위한 제어기에서 수신하는 단계로서, 여기서 제어기는 광 센서 데이터를 기반으로 하여 밀폐 경로 시스템의 작동을 제어하는 단계를 포함하는, 방법.
  55. 미세유체 경로 소자와 밀봉 유체 소통되는 복수의 유체 저장소를 포함하는 밀폐 경로 시스템을 사용하여 시험관내 전사를 위한 합성 이중 가닥 DNA 주형을 제조하는 자동화된 방법으로서, 방법은
    합성 관심 유전자 및 합성 시험관내 전사(IVT) 촉진제 카세트를 복수의 유체 저장소 중 하나 이상의 유체 저장소로부터 대기 접촉으로부터 보호되는 밀폐 유체 경로에서 미세유체 경로 플레이트 소자의 하나 이상의 결합 반응기에 제1의 유체 동력 회로를 사용하여 수송하고, 합성 관심 유전자를 IVT 촉진제 카세트에 결합시켜 합성 생성물을 생성하는 단계;
    미반응된 합성 관심 유전자 및 미반응된 합성 시험관내 전사 촉진제 카세트를 미세유체 경로 플레이트 소자에서 합성 생성물로부터 제2의 유체 동력 회로를 사용하여 제거하는 단계;
    합성 생성물을 미세유체 경로 소자의 하나 이상의 증폭 반응기에 제3의 유체 동력 회로를 사용하여 이송하고, 합성 생성물을 증폭하여 1 mM 초과의 증폭된 DNA 주형을 생성하는 단계; 및
    밀폐 경로 시스템의 하나 이상의 광 센서로부터의 광 센서 데이터를 밀폐 경로 시스템을 위한 제어기에서 수신하는 단계로서, 여기서 제어기는 광 센서 데이터를 기반으로 하여 제1, 제2 및 제3 유체 동력 회로를 제어하고, 복수의 유체 저장소 및 미세유체 경로 소자를 밀폐 경로 및 밀봉 환경으로 유지하는 단계를 포함하는, 방법.
  56. 하나 이상의 미세유체 경로 소자와 밀봉 유체 소통하여 고정되도록 구성된 복수의 유체 저장소를 포함하는 시스템을 사용하여 시험관내 전사(IVT) 반응을 수행하는 자동화된 방법으로서, 방법은 대기 접촉으로부터 보호되는 밀폐 유체 경로에서 하나 이상의 미세유체 소자 상의 복수의 반응기와 복수 유체 저장소 중 하나 이상의 유체 저장소 사이에 시약을 수송하여 하나 이상의 미세유체 경로 소자에서 주형으로부터의 치료학적 mRNA의 시험관내 전사를 수행하고, 치료학적 폴리뉴클레오티드를 정제하는 것을 포함하는, 방법.
  57. 제56항에 있어서, 시스템이 미세유체 경로 소자 내에서 하나 이상의 탄성 층을 편향시킴으로써 시약을 수송하는 단계를 수행하는, 방법.
  58. 제56항에 있어서, 시스템의 하나 이상의 센서로부터의 광 센서 데이터를 시스템용 제어기에서 수신하는 단계로서, 여기서 제어기는 광 센서 데이터를 기반으로 하여 시스템의 작동을 제어하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  59. 제56항에 있어서, 유체 저장소를 가압하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  60. 제56항에 있어서, 미세유체 경로 소자가 시스템에 안착된 미세유체 경로 플레이트 소자를 포함하는, 방법.
  61. 제56항에 있어서, 방법이 치료 현장에서 수행되는, 방법.
  62. 제56항에 있어서, DNA 주형이 합성 관심 유전자 및 합성 시험관내 전사 촉진제 카세트의 이중 가닥 DNA 주형을 포함하는, 방법.
  63. 미세유체 경로 소자와 밀봉 유체 소통하여 고정되도록 구성된 복수의 유체 저장소를 포함하는 시스템을 사용하여 시험관내 전사(IVT) 반응을 수행하는 자동화된 방법으로서, 방법은
    복수의 유체 저장소의 유체 저장소 및 미세유체 경로 소자 상의 부위 중 하나 이상으로부터 미세유체 경로 소자의 하나 이상의 IVT 반응기에 DNA 주형, 중합효소 및 뉴클레오티드를 전달하는 단계;
    하나 이상의 IVT 반응기에서 DNA 주형 및 뉴클레오티드를 처리하여 치료학적 mRNA를 형성하는 단계; 및
    치료학적 mRNA를 미세유체 경로 소자의 하나 이상의 정제 반응기 영역에 이송하고, 하나 이상의 정제 반응기 영역 내에서 2차원(2D) 정제에 의해 치료학적 mRNA를 정제하는 단계를 포함하며,
    여기서 미세유체 경로 소자 및 복수의 유체 저장소는 밀폐 경로 및 밀봉 환경을 형성하여 대기 노출을 방지하는, 방법.
  64. 제63항에 있어서, 밀폐 경로 시스템의 하나 이상의 센서로부터 광 센서 데이터를 밀폐 경로 시스템을 위한 제어기에서 수신하는 단계로서, 여기서 제어기는 광 센서 데이터를 기반으로 하여 밀폐 경로 시스템의 작동을 제어하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  65. 제63항에 있어서, 유체 저장소를 가압하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  66. 제63항에 있어서, 전달 및 수송 단계 각각이 제어기에 의해 제어되는 하나 이상의 유체 동력 회로를 사용하여 DNA 주형, 중합효소, 뉴클레오티드 및 치료학적 mRNA 물질을 복수의 유체 저장소와 미세유체 경로 소자 사이에 또는 미세유체 경로 소자 내에 이동시키는 것을 포함하는, 방법.
  67. 제63항에 있어서, 전달 및 수송 단계가 방법 동안 대기 접촉을 피하도록 미세유체 경로 소자 내의 하나 이상의 탄성 층을 편향시킴으로써 제어기의 제어 하에 수행되는, 방법.
  68. 제56항에 있어서, 미세유체 경로 소자가 시스템에 안착된 미세유체 경로 플레이트 소자를 포함하는, 방법.
  69. 제63항에 있어서, 방법이 치료 현장에서 수행되는, 방법.
  70. 제63항에 있어서, IVT 반응기가 액체 수용부 및 압력 수용부를 각각 갖는 한 쌍의 연결된 챔버를 포함하고, 여기서 액체 수용부는 탄성 층에 의해 압력 수용부로부터 분리되며, 탄성 층은 압력 수용부에 의해 편향되어 액체 수용부의 부피를 조절할 수 있는, 방법.
  71. 제63항에 있어서, DNA 주형이 합성 관심 유전자 및 합성 시험관내 전사 촉진제 카세트의 이중 가닥 DNA 주형을 포함하는, 방법.
  72. 제63항에 있어서, 미세유체 경로 소자 상의 복수의 수용 포트와 유체 소통하는 복수의 유체 저장소를 밀봉하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  73. 미세유체 경로 소자와 밀봉 유체 소통하여 고정되도록 구성된 복수의 유체 저장소를 포함하는 시스템을 사용하여 시험관내 전사(IVT) 반응을 수행하는 자동화된 방법으로서, 방법은
    복수의 유체 저장소를 가압하는 단계;
    하나 이상의 제1 유체 동력 회로를 사용하여 DNA 주형, 중합효소 및 뉴클레오티드를 복수의 유체 저장소의 유체 저장소 및 미세유체 경로 소자 상의 부위 중 하나 이상으로부터 미세유체 경로 소자의 하나 이상의 IVT 반응기에 서브-마이크로리터 정밀도로 계량된 양으로 전달하는 단계;
    하나 이상의 IVT 반응기에서 주형 물질 및 뉴클레오티드를 처리하여 치료학적 mRNA를 형성하는 단계; 및
    제2 유체 동력 회로를 사용하여 치료학적 mRNA를 미세유체 경로 소자의 하나 이상의 정제 반응기 영역에 이송하고, 하나 이상의 정제 반응기 영역 내에서 2차원(2D) 정제에 의해 치료학적 mRNA를 정제하는 단계를 포함하며,
    여기서 미세유체 경로 소자 및 복수의 유체 저장소는 밀폐 경로 및 밀봉 환경을 형성하여 대기 노출을 방지하는, 방법.
  74. 시험관내 전사(IVT) 반응을 수행하기 위한 명령을 구현하는 비일시적 컴퓨터 판독가능 매체로서, 하나 이상의 미세유체 경로 소자와 밀봉 유체 소통하여 고정되도록 구성된 복수의 유체 저장소를 포함하는 시스템의 제어기에 의해 실행되는 경우 제어기로 하여금
    주형 물질, 중합효소 및 뉴클레오티드를 반응 동안 언제든지 서브마이크로리터 정밀도로 계량된 양으로 복수의 유체 저장소로부터 미세유체 경로 소자의 제1 반응기에 공압에 의해 전달하는 단계;
    제1 반응기의 주형 물질 및 뉴클레오티드를 처리하여 치료학적 mRNA를 형성하는 단계; 및
    치료학적 mRNA를 미세유체 경로 소자를 통해 제1 반응기로부터 공압에 의해 이송하는 단계의 방법을 수행하게 하며,
    여기서 제1 미세유체 경로 소자 및 복수의 유체 저장소는 밀폐 경로 및 밀봉 환경을 형성하여 대기 노출을 방지하는, 비일시적 컴퓨터 판독가능 매체.
  75. 하나 이상의 미세유체 경로 플레이트 소자와 밀봉 유체 소통되는 복수의 유체 저장소를 포함하는 시스템을 사용하여 치료학적 mRNA 조성물을 제조하는 방법으로서, 하나 이상의 미세유체 경로 플레이트 소자는 복수의 반응기를 포함하며, 방법은
    복수의 유체 저장소 중 하나 이상의 유체 저장소로부터 복수의 반응기 중 제1 반응기에 주형 전구체 물질을 전달하고, 주형 전구체 물질을 처리하여 주형 전구체 물질로부터 DNA 주형을 형성하는 단계;
    DNA 주형을 복수의 반응기 중 제2 반응기에 이송하고, 시험관내 전사에 의해 DNA 주형을 처리하여 치료학적 mRNA를 형성하는 단계;
    치료학적 mRNA를 복수의 반응기 중 제3 반응기에 이송하고, 치료학적 mRNA를 처리하여 이를 전달 비히클과 조합하여 치료학적 mRNA 조성물을 형성하는 단계; 및
    치료학적 mRNA 조성물을 제3 반응기와 유체 소통하는 농축기에 이송하는 단계를 포함하는, 방법.
  76. 제75항에 있어서, 치료학적 mRNA를 제3 반응기에 이송하는 단계가 mRNA 조성물을 형성하기 위해 전달 비히클과 다수의 상이한 치료학적 mRNA를 이송하는 것을 포함하는, 방법.
  77. 제75항에 있어서, 전달 및 이송 단계가 제어기에 의해 제어되는 시스템의 하나 이상의 유체 동력 회로에 의해 수행되는, 방법.
  78. 제77항에 있어서, 제어기가 하나 이상의 미세유체 경로 플레이트 소자 내에서 하나 이상의 탄성 층을 편향시킴으로써 유체 동력 회로를 제어하는, 방법.
  79. 제75항에 있어서, 방법이 치료 현장에서 수행되는, 방법.
  80. 제75항에 있어서, 치료학적 mRNA를 전달 비히클과 조합하는 단계가 mRNA 치료학적 조성물을 정제하기 위해 하나 이상의 미세유체 경로 플레이트 소자에서 mRNA 치료학적 조성물을 투석하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  81. 제75항에 있어서, 전달 비히클이 양친매성 나노입자를 포함하는, 방법.
  82. 제81항에 있어서, 양친매성 나노입자가 아미노-지질화된 펩토이드를 포함하는, 방법.
  83. 제75항에 있어서, 제2 반응기와 유체 소통하는 복수의 반응기 중 하나 이상의 반응기 내에서 2차원(2D) 정제에 의해 치료학적 mRNA를 정제하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  84. 제75항에 있어서, 치료학적 mRNA 조성물의 제조 방법이 72시간 이하로 소요되는, 방법.
  85. 제75항에 있어서, 복수의 반응기 중 제1 반응기가 복수의 미세유체 경로 플레이트 소자의 제1 미세유체 경로 플레이트 소자 상에 있고, 복수의 반응기 중 제3 반응기는 제2 미세유체 경로 플레이트 소자 상에 있는, 방법.
  86. 제75항에 있어서, 시스템의 하나 이상의 센서로부터 광 센서 데이터를 시스템을 위한 제어기에서 수신하는 단계로서, 여기서 제어기는 적어도 부분적으로 광 센서 데이터를 기반으로 하여 밀폐 경로 시스템의 작동을 제어하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  87. 하나 이상의 미세유체 경로 플레이트 소자와 밀봉 유체 소통되는 복수의 유체 저장소를 포함하는 시스템을 사용하여 치료학적 mRNA 조성물을 제조하는 방법으로서, 하나 이상의 미세유체 경로 플레이트 소자가 복수의 반응기를 포함하며, 방법은
    복수의 유체 저장소를 가압하는 단계;
    복수의 유체 저장소 중 하나 이상의 유체 저장소로부터 복수의 반응기 중 제1 반응기에 대기 접촉 없이 서브마이크로리터 정밀도로 주형 전구체 물질을 전달하도록 제1 유체 동력 회로를 제어하는 단계;
    주형 전구체 물질을 처리하여 주형 전구체 물질로부터 DNA 주형을 형성하는 단계;
    DNA 주형을 복수의 반응기 중 제2 반응기에 서브마이크로리터 정밀도로 대기 접촉 없이 이송하도록 제2 유체 동력 회로를 제어하는 단계;
    시험관내 전사에 의해 DNA 주형을 처리하여 치료학적 mRNA를 형성하는 단계;
    치료학적 mRNA를 복수의 반응기 중 제3 반응기에 서브마이크로리터 정밀도로 대기 접촉 없이 이송하도록 제3 유체 동력 회로를 제어하는 단계;
    치료학적 mRNA를 처리하여 이를 전달 비히클과 조합하여 치료학적 mRNA 조성물을 형성하는 단계;
    치료학적 mRNA 조성물을 제3 반응기와 유체 소통하는 농축기에 이송하도록 제3 유체 동력 회로를 제어하는 단계; 및
    치료학적 mRNA 조성물을 농축하는 단계를 포함하는, 방법.
  88. 주문형 치료학적 폴리뉴클레오티드 조성물을 생성하는 방법으로서, 방법은
    원격 시설에서 합성된 치료학적 폴리뉴클레오티드를 현장 시설에서 받는 단계;
    대기 접촉으로부터 보호되는 자동화 시스템에서
    치료학적 폴리뉴클레오티드를 시스템에 고정된 미세유체 경로 소자에서 전달 비히클과 조합하여 치료학적 폴리뉴클레오티드 조성물을 형성하는 단계,
    치료학적 폴리뉴클레오티드 조성물을 미세유체 경로 소자에서 투석하는 단계를 수행함으로써 현장 시설에서 치료학적 폴리뉴클레오티드 조성물을 제형화시키는 단계; 및
    치료학적 폴리뉴클레오티드 조성물을 제공하는 단계를 포함하는, 방법.
  89. 제88항에 있어서, 치료학적 폴리뉴클레오티드를 합성하는 단계가 대기 접촉으로부터 보호되는 밀폐 유체 경로 소자에서 합성 주형을 형성하는 단계, 합성 주형으로부터의 시험관내 전사를 수행하여 치료학적 폴리뉴클레오티드를 형성하는 단계; 및 치료학적 폴리뉴클레오티드를 정제하는 단계를 수행함으로써 원격 시설에서 미세유체 시스템을 사용하여 치료학적 폴리뉴클레오티드를 합성하는 것을 포함하는, 방법.
  90. 제88항에 있어서, 현장 시설이 병원 또는 클리닉인, 방법.
  91. 제88항에 있어서, 치료학적 폴리뉴클레오티드 조성물을 농축하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  92. 제88항에 있어서, 현장 시설에서 전달물을 수용하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  93. 제88항에 있어서, 치료학적 폴리뉴클레오티드 조성물이 mRNA 백신을 포함하는, 방법.
  94. 제88항에 있어서, 치료학적 폴리뉴클레오티드를 제형화하는 단계가 시스템을 사용하는 것을 포함하고, 여기서 시스템은 미세유체 경로 소자와 밀봉 유체 소통하여 고정되도록 구성된 복수의 유체 저장소를 포함하는, 방법.
  95. 제92항에 있어서, 치료학적 폴리뉴클레오티드를 전달 비히클과 조합하는 단계가 제1 유체 동력 회로를 사용하여 치료학적 폴리뉴클레오티드 및 전달 비히클을 복수의 유체 저장소로부터 미세유체 경로 소자의 하나 이상의 반응기에 서브마이크로리터 정밀도로 대기 접촉 없이 전달하는 것을 포함하는, 방법.
  96. 제88항에 있어서, 현장 시설에서 치료학적 폴리뉴클레오티드 조성물을 제형화하는 단계가 하나 이상의 추가의 치료학적 폴리뉴클레오티드를 치료학적 폴리뉴클레오티드 및 전달 비히클과 조합하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  97. 제88항에 있어서, 치료학적 폴리뉴클레오티드가 mRNA, 원형 RNA 또는 자가-복제 RNA인, 방법.
  98. 제88항에 있어서, 치료학적 조성물을 제형화하기 전에 치료학적 폴리뉴클레오티드를 현장 시설에서 저장하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  99. 주문형 치료학적 mRNA 조성물을 생성하는 방법으로서, 방법은
    원격 시설에서 치료학적 mRNA를 합성하는 단계;
    치료학적 mRNA를 현장 시설로 수송하는 단계;
    대기 접촉으로부터 보호되는 자동화 밀폐 유체 경로 소자에서
    치료학적 mRNA를 미세유체 경로 소자에서 전달 비히클과 조합하여 치료학적 mRNA 조성물을 형성하는 단계,
    치료학적 mRNA 조성물을 미세유체 경로 소자에서 투석하는 단계를 수행함으로써 현장 시설에서 치료학적 mRNA 조성물을 제형화시키는 단계; 및
    치료학적 mRNA 조성물을 제공하는 단계를 포함하는, 방법.
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