CN114761555A - 用于从治疗性组合物中去除材料的制造方法和装置 - Google Patents
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Abstract
用于制备和使用治疗剂的方法和装置，该治疗剂包括特别是mRNA治疗剂，该方法和装置分离双链RNA与单链RNA作为连续流动的一部分。这些方法和装置可以包括使用集成到微流体路径装置中的可渗透插入物来配制RNA治疗剂。特别地，这些方法和装置可以包括通过在包括纤维素材料的微流体路径装置内从RNA溶液中去除dsRNA来配制RNA治疗剂。
Description
相关申请的交叉引用
本专利申请要求2019年8月9日提交的标题为“MICROFLUIDIC APPARATUS ANDMETHODS OF USE THEREOF”的美国临时专利申请第62/885,159号,以及2019年8月9日提交的标题为“METHODS AND APPARATUSES FOR MANUFACTURING THERAPEUTIC COMPOSITIONS”的美国临时专利申请第62/885,170号，和2019年10月11日提交的标题为“METHODS ANDAPPARATUSES FOR MANUFACTURING FOR REMOVING MATERIAL FROM A THERAPEUTICCOMPOSITION”的美国临时专利申请第62/914,374号的优先权，其中的每个都通过引用整体并入本文。
通过引用并入
本说明书中提及的所有出版物和专利申请都以引用的方式整体并入本文，其程度与每个单独的出版物或专利申请被具体地和单独地提到以引用的方式并入的程度相同。
技术领域
本公开通常涉及用于快速、高产地制造基于多核苷酸的治疗剂的方法和系统。本公开可具体涉及自动化制造治疗性mRNA，包括疫苗，其可快速且有效地实施。此类治疗剂可以考虑患者的具体信息，并且可以按需、完全或部分地在护理点(例如，医院、诊所等)产生。
背景技术
目前用于制造和配制多核苷酸治疗剂，特别是mRNA治疗剂的可用技术经常使产物受到污染和降解。目前可用的集中生产成本太高、太慢并且容易受到污染，无法用于可能包括多种多核苷酸种类的治疗制剂。开发可扩展的多核苷酸制造、生产单个患者剂量、消除接触点以限制污染、满足临床制造要求的输入和过程跟踪以及在护理点操作中的使用，可以促进这些有前途的治疗方式的使用。微流体仪器和过程可以提供针对这些目标的主要优势。
本文描述的是用于制备可满足上述需求的多种治疗剂的方法和装置(例如，系统)。
发明内容
本文描述了可用于制备多种疫苗和治疗剂的装置和方法。例如，本文描述的是用于制备包括疫苗的个性化治疗剂的方法和装置(例如，系统、装置等)。在一个非限制性实例中，本文所述的方法和装置可用于生产针对在皮肤T细胞淋巴瘤中的癌症特异性抗原的治疗性mRNA疫苗。
因此，一般而言，本文描述的是用于mRNA治疗剂的自动化、高产的制造方法，可选地在护理点开展。
例如，本文描述的是使用包含多个流体贮库的系统形成(例如，制造、制备、合成等)治疗性多核苷酸的方法，该流体贮库配置为在与一个或多个微流体路径装置的密封流体连通中拴牢，该方法包括：在多个流体贮库中的一个或多个流体贮库与一个或多个微流体路径装置上的多个反应器之间在密封且封闭的流体路径中输送试剂，该流体路径受保护而免于大气接触，以实施以下步骤：形成合成模板，从模板实施体外转录以产生治疗性多核苷酸，并纯化治疗性多核苷酸。
使用包含多个流体贮库的系统制造治疗性mRNA的方法，该流体贮库配置为在与一个或多个微流体路径板装置的密封流体连通中拴牢，其中一个或多个微流体路径板装置包含多个反应器，所述方法可以包括：从一个或多个流体贮库递送模板前体材料到多个反应器的第一一个或多个反应器区域，并处理模板前体材料以从模板前体材料制备模板；转移模板到多个反应器的第二一个或多个反应器区域，并通过体外转录处理模板以形成治疗性mRNA；以及转移治疗性mRNA至多个反应器的第三一个或多个反应器区域，并通过在第三一个或多个反应器区域内的二维(2D)纯化来纯化治疗性mRNA；其中所有方法步骤都在不暴露模板和治疗性mRNA于大气接触的情况下实施。
使用包含与一个或多个微流体路径板装置的密封流体连通中拴牢的多个流体贮库的系统制造治疗性mRNA的方法，其中一个或多个微流体路径板装置包含多个反应器，该方法可以包括：使用流体动力递送模板前体材料从一个或多个流体贮库到多个反应器的第一一个或多个反应器区域，并处理模板前体材料以从模板前体材料制备模板；使用流体动力转移模板到多个反应器的第二一个或多个反应器区域，并通过体外转录处理模板以形成治疗性mRNA；使用流体动力转移治疗性mRNA到多个反应器的第三一个或多个反应器区域，并通过在第三一个或多个反应器区域内的二维(2D)纯化来纯化治疗性mRNA；使用流体动力转移治疗性mRNA到多个反应器的第四一个或多个反应器区域，并用递送媒介物包囊治疗性mRNA以形成治疗性mRNA组合物；以及使用流体动力在第五一个或多个流体贮库中浓缩治疗性mRNA组合物，其中所有方法步骤在不将模板和治疗性mRNA大气暴露接触的情况下实施。
纯化治疗性多核苷酸通常包括在多个反应器中的一个或多个内对治疗性多核苷酸实施二维(2D)纯化。2D纯化可以在本文所述的基本上平坦的微流体路径装置(例如，微流体路径板装置)内实施，并且可以包括使用材料从治疗性多核苷酸中去除材料(例如，双链RNA等)。与现有技术相比，微流体路径装置中多核苷酸的2D纯化可能特别有利，如本文所述现有技术可能需要使用柱并且可能涉及在封闭路径环境和/或小体积中难以或不可能实施的步骤。在一些变型中，纯化治疗性多核苷酸包括在一个或多个反应器内使用纤维素材料去除双链mRNA。
这些方法中的任一种可以包括在一个或多个微流体路径装置上的一个或多个反应器中用递送媒介物配制治疗性多核苷酸以形成治疗性多核苷酸组合物。治疗性多核苷酸(例如，mRNA)可以用如本文所述的递送媒介物包囊，并且在一些变型中，除了治疗性mRNA之外，还可以包括额外的mRNA，包括辅助mRNA(例如，增强免疫反应的mRNA包封蛋白)。递送媒介物可以包含两亲性纳米颗粒，例如氨基脂化拟肽。
在一些变型中，可以存储治疗性组合物以供以后与递送媒介物组合(例如，存储在4摄氏度，在密封的壳体、容器或小瓶中)。治疗性组合物可以从微流体路径装置移出到微流体控制装置中的流体贮库中并用于相同的微流体控制装置中或提供给另一个(例如，地理上分离的，包括靠近它待使用的医院或诊所)用于与递送媒介物组合的微流体控制装置。将治疗性多核苷酸(例如治疗性mRNA)与递送媒介物组合形成治疗性组合物。治疗性组合物可以在使用(例如，注射到患者体内)前进一步改变。
例如，这些方法中的任一种可以包括在一个或多个微流体路径装置中透析和/或浓缩治疗性多核苷酸组合物。如本文所用，透析可以指基于颗粒穿过膜(透析膜)的能力的差异在液体中颗粒的分离。在一些变型中，透析包括逆流交换。
该系统可以自动且连续地实施以下步骤：形成合成模板、从模板实施体外转录以及用来自系统的一个或多个传感器的光学反馈来纯化治疗性多核苷酸。
通常，治疗性多核苷酸可以是mRNA。例如，治疗性多核苷酸可以是mRNA、环状RNA或自我复制的RNA等。
通常，该系统可以通过流体动力在一个或多个流体贮库和多个反应器之间输送试剂，例如使用一个或多个流体回路。流体动力一般指气动和液压。流体动力回路可以包括多个元件(例如，流体线、阀等)，并且不同的流体动力回路(在本文中也称为流体回路)的组件可以由一个以上的流体动力回路共享，这些流体动力回路可以在控制器的控制下，经由一个或多个阀来切换。例如，该系统可以在一个或多个流体贮库和多个反应器之间气动地输送试剂。由控制器控制的流体动力的使用可以有利地允许对用于形成模板、治疗性mRNA和/或治疗性组合物的处理实施非接触控制。例如，该系统可以通过偏转一个或多个微流体路径装置内的一个或多个弹性层来在一个或多个流体贮库和多个反应器之间输送试剂。
如上所述，本文所述的方法可以完全或部分地在本地(例如，在护理位位)实施。有利地，本文所述的方法可以允许按需制造治疗性mRNA，而无需在治疗性mRNA中使用可能降低功效和/或风险并发症的防腐剂或添加剂。在本地用治疗性多核苷酸(例如，治疗性mRNA)配制递送媒介物可能是特别有益的，因为包括治疗性mRNA和递送媒介物的治疗性组合物可以随时间聚集和簇聚。进一步，与现有方法相比，这些方法可以快速实施。例如，本文所述的系统可以自动且连续地执行以下步骤：形成合成模板、实施从模板的体外转录以产生治疗性多核苷酸、以及在少于5天(例如少于4天、少于3天等)内纯化治疗性多核苷酸。
这些方法中的任一种可以包括密封流体贮库到一个或多个微流体路径装置，并在流体贮库和一个或多个微流体路径装置上的多个反应器之间输送试剂之前对流体贮库加压。控制器可以控制对流体贮库的加压。
通常，这些方法和装置可以部分或全部记录制造，并且该记录可以是光学的(例如，显示流体在微流体路径装置内的移动，包括影片、视频等)和/或非光学的传感器数据(压力读数、温度读数等)。可以保存、存储和/或传输该制造数据以供以后审查，包括用于质量控制和测试。因此，这些方法中的任一种可以包括在与所制造的治疗性多核苷酸相关的文件中记录实施的步骤期间一个或多个微流体路径装置内的流体移动。
本文所述的任一种方法可以通过包括计算机(例如处理器)的系统自动或半自动地实施，该系统执行软件配置以实施所有或一些这些方法(例如，编码这些指令的非暂时性计算机可读介质)。例如，包含(embody)用于制造治疗性多核苷酸的指令的非暂时性计算机可读介质，所述指令当由包括多个流体贮库的系统的控制器执行时导致控制器实施以下方法，所述流体贮库配置为在与一个或多个微流体路径装置的密封流体连通中拴牢：在与一个或多个微流体路径装置的流体连通中对多个流体贮库加压；在多个流体贮库的一个或多个流体贮库与一个或多个微流体路径装置上的多个反应器之间在密封且封闭的流体路径中输送试剂以实施以下步骤，该流体路径受保护而免于大气接触：形成合成模板，从模板实施体外转录以产生治疗性多核苷酸，并纯化治疗性多核苷酸(例如，全部在一个或多个微流体路径装置中)。
指令进一步可以使控制器自动且连续地实施以下步骤：形成合成模板、从模板实施体外转录、以及基于来自系统的一个或多个光学传感器的光学反馈纯化治疗性多核苷酸。指令可以进一步使控制器在多个反应器中的一个或多个反应器中通过二维(2D)纯化控制治疗性多核苷酸的纯化，和/或在一个或多个微流体路径装置上的一个或多个反应器中用递送媒介物配制治疗性多核苷酸以形成治疗性多核苷酸组合物，和/或透析和/或浓缩一个或多个微流体路径装置中的治疗性多核苷酸组合物等。
本文还描述了使用本文描述的封闭路径系统的任一种制备用于mRNA合成的合成双链DNA模板的自动化方法。例如，使用封闭路径系统制备用于mRNA合成的合成双链DNA模板的方法，该封闭路径包含配置为在与一个或多个微流体路径装置的密封流体连通中拴牢的多个流体贮库，该方法可以包括:在多个流体贮库中的一个或多个流体贮库和一个或多个微流体路径装置上的多个反应器之间在封闭的流体路径中输送试剂以组合该试剂，该流体路径受保护而免于大气接触；并形成合成的双链DNA模板，用于治疗性mRNA的体外转录。
形成的合成模板(合成双链DNA模板)可以不含细菌DNA且不含内毒素。
这些方法可以包括在用于封闭路径系统的控制器中接收来自封闭路径系统的一个或多个传感器的光学传感器数据，其中控制器基于光学传感器数据控制封闭路径系统的操作。
该方法可以包括对流体贮库加压，和/或输送试剂包括将感兴趣的合成基因和合成的体外转录促进子(facilitator)盒从多个流体贮库中的一个或多个流体贮库输送到微流体路径装置中的一个或多个反应器中，连接感兴趣的合成基因和合成的体外转录促进子盒以创建合成产物，从合成产物中去除未反应的材料，并扩增合成产物以生成合成的双链DNA模板。一个或多个微流体路径装置包含位于封闭路径系统中的微流体路径板装置。
有利地，与其他系统(通常仅产生飞摩尔量)相比，这些方法可以包括制备大量模板(mM量)。本文所述的方法和装置可以产生大量模板。
使用封闭路径系统制备用于体外转录的合成双链DNA模板的自动化方法，该封闭路径系统包含与微流体路径装置密封流体连通的多个流体贮库，该方法可以包括：在封闭流体路径中，从多个流体贮库中的一个或多个流体贮库到微流体路径装置中的第一一个或多个反应器输送试剂，该试剂包括感兴趣的合成基因和合成的体外转录促进子盒，该封闭流体路径被保护而免于大气接触；连接感兴趣的合成基因与合成的体外转录促进子盒以创建合成产物；输送微流体路径装置中的合成产物以从合成产物中去除未反应的感兴趣的合成基因和未反应的合成的体外转录促进子盒；以及在微流体路径装置中输送合成产物，扩增合成产物以生成双链DNA模板。如所述，扩增合成产物可以包括生成大于1mM的扩增DNA模板。
本文还描述了使用封闭路径系统制备用于体外转录的合成双链DNA模板的自动化方法，该封闭路径系统包含与微流体路径装置密封流体连通的多个流体贮库，该方法包括：在封闭流体路径中，从多个流体贮库中的一个或多个流体贮库到微流体路径装置中的第一一个或多个反应器输送试剂，试剂包括感兴趣的合成基因和合成体外转录(IVT)促进子盒，该封闭流体路径受保护而免于大气接触；连接感兴趣的合成基因与第一一个或多个反应器中的合成IVT促进子盒，以创建合成产物；输送合成产物到微流体路径装置中的第二一个或多个反应器以从合成产物中去除未反应的感兴趣的合成基因和未反应的合成IVT促进子盒；以及输送合成产物到微流体路径装置中的第三一个或多个反应器，并扩增合成产物以生成大于1mM的扩增DNA模板；以及在用于封闭路径系统的控制器中从封闭路径系统的一个或多个传感器接收光学传感器数据，其中控制器基于光学传感器数据控制封闭路径系统的操作。
例如，使用封闭路径系统制备用于体外转录的合成双链DNA模板的自动化方法，该封闭路径系统包含与微流体路径装置密封流体连通的多个流体贮库，该方法可以包括：使用第一流体动力回路在封闭流体路径中从多个流体贮库中的一个或多个流体贮库输送感兴趣的合成基因和合成体外转录(IVT)促进子盒进入微流体路径板装置的一个或多个连接反应器中，该封闭流体路径受保护而免于大气接触，连接感兴趣的合成基因与IVT促进子盒以创建合成产物；使用第二流体动力回路从微流体路径板装置中的合成产物中去除未反应的感兴趣的合成基因和未反应的合成外转录促进子盒；使用第三流体动力回路转移合成产物到微流体路径装置的一个或多个扩增反应器中并扩增合成产物以生成大于1mM的扩增DNA模板；以及在用于封闭路径系统的控制器中接收来自封闭路径系统的一个或多个光学传感器的光学传感器数据，其中控制器基于光学传感器数据控制第一、第二和第三流体动力电路并在封闭路径和密封环境中保持多个流体贮库和微流体路径装置。
在这些方法中的任一种中，合成的双链DNA模板不含细菌DNA且不含内毒素。
这些方法中的任一种可以包括在封闭路径系统的控制器中接收来自封闭路径系统的一个或多个传感器的光学传感器数据，其中控制器基于光学传感器数据控制封闭路径系统的操作。光学传感器数据可以是来自相机或其他成像传感器的数据。本文所述的方法可以使用一个或多个流体动力回路在多个流体贮库和微流体路径装置之间或在微流体路径装置内移动材料。控制器可以协调流体动力回路的操作，包括使用光学信息来协调。例如，控制器可以确定流体在封闭路径系统的一个或多个部分(例如，微流体路径传感器的贮库、流体线和/或区域)内。
这些方法中的任一种可以包括转移扩增的DNA模板到微流体路径装置的一个或多个消化反应器中并酶促修饰扩增的合成产物以生成双链DNA模板。
如本文所用，连接感兴趣的合成基因与合成的体外转录促进子盒以创建合成产物可以包括创建合成的线性或环状连接产物。连接可以经由连接和/或杂交和/或退火和/或引物延伸实施。在一些变型中，扩增合成产物包括产生线性、分支或环状扩增的DNA产物，进一步包括线性化扩增的DNA产物以产生双链DNA模板。连接可包括用DNA连接酶或通过引物延伸的连接。在一些变型中，扩增包括多重置换扩增(MDA)。或者，扩增可包括聚合酶链式反应(PCR)扩增。
在一些变型中，合成的体外转录促进子盒可以包含含有启动子的双链DNA模板；5’UTR；可切割的接头；3’UTR；以及编码包含至少连续200个腺嘌呤残基或200个胸苷残基的polyA区域的部分。双链DNA模板可以包括在感兴趣的合成基因的3'末端至少300bp长的polyA区域。通常，体外转录促进子盒的长度可小于1kb。在一些变型中，合成的体外转录促进子盒不编码抗生素抗性基因，和/或不具有复制起点(ORI)。
本文还描述了使用模板材料(包括但不限于上述模板材料)实施体外转录(IVT)以形成治疗性mRNA的自动化方法和装置。例如，本文描述的是使用系统自动实施体外转录(IVT)反应的方法和装置，该系统包含配置为在与一个或多个微流体路径装置的密封流体连通中拴牢的多个流体贮库，该方法包括：在受保护而免于大气接触的封闭流体路径中，在多个流体储库中的一个或多个流体储库和一个或多个微流体装置上的多个反应器之间输送试剂以在一个或多个微流体路径装置中实施治疗性mRNA从模板的体外转录，并纯化治疗性多核苷酸。
例如，使用包括配置为在与微流体路径装置的密封流体连通中拴牢的多个流体贮库的系统执行体外转录(IVT)反应的自动化方法，所述流体贮库配置为与微流体路径装置的密封流体连通中拴牢，该方法包括：自以下一项或多项的递送DNA模板、聚合酶和核苷酸到微流体路径装置的一个或多个IVT反应器中：多个流体贮库中的流体贮库和微流体路径装置上的位点；在一个或多个IVT反应器中处理DNA模板和核苷酸以形成治疗性mRNA；以及转移治疗性mRNA到微流体路径装置的一个或多个纯化反应器区域中，并通过一个或多个纯化反应器区域内的二维(2D)纯化来纯化治疗性mRNA，其中微流体路径装置和多个流体贮库形成封闭路径和密封环境，防止大气暴露。
通常，该系统可以包括控制器以实施这些方法，这些方法包括例如通过偏转微流体路径装置内的一个或多个弹性层来实施输送试剂的步骤。这些方法可以包括在系统的控制器中从系统的一个或多个传感器接收光学传感器数据，其中控制器基于光学传感器数据控制系统的操作。控制器还可以控制流体贮库的加压。在本文所述的方法中的任一种，该系统可以包括位于系统中的微流体路径装置。
通常，DNA模板可以包含感兴趣的合成基因的双链DNA模板和合成的体外转录促进子盒。
这些方法中的任一种可以包括使用由控制器控制的一个或多个流体动力回路来递送和输送，以在多个流体贮库和微流体路径装置之间或在微流体路径装置内移动DNA模板、聚合酶、核苷酸和治疗性mRNA材料。例如，可以在控制器的控制下通过偏转微流体路径装置内的一个或多个弹性层来实施递送和输送步骤，以避免在该方法期间的大气接触。
在一些变型中，使用IVT反应器；该IVT反应器可以包含一对连接的腔室，每个腔室具有液体接收部分和压力接收部分，其中液体接收部分通过弹性层与压力接收部分分离，该弹性层可以被压力接收部分偏转以调节液体接收部分的体积。DNA模板可以包含感兴趣的合成基因的双链DNA模板和合成的体外转录促进子盒。
这些方法中的任一种可以包括密封与微流体路径装置上的多个接收端口流体连通的多个流体贮库。
例如，使用包含多个流体贮库的系统实施体外转录(IVT)反应的自动化方法，该流体贮库配置为在与微流体路径装置的密封流体连通中拴牢，该方法可以包括：对多个流体贮库加压；使用一个或多个第一流体动力回路以亚微升精度计量的量自以下一项或多项中递送DNA模板、聚合酶和核苷酸到微流体路径装置的一个或多个IVT反应器中：多个流体贮库的流体贮库和微流体路径装置上的位点；在一个或多个IVT反应器中处理模板材料和核苷酸以形成治疗性mRNA；并且使用第二流体动力回路转移治疗性mRNA到微流体路径装置的一个或多个纯化反应器区域中，并通过一个或多个纯化反应器区域内的二维(2D)纯化来纯化治疗性mRNA，其中微流体路径装置和多个流体贮库形成防止大气暴露的封闭路径和密封环境。
如所述，本文还描述了配置为实施本文描述的这些方法中的任一种的软件和/或固件。例如，本文描述的是包含用于实施体外转录(IVT)反应的指令的非暂时性计算机可读介质，所述指令当由包含多个流体贮库的系统的控制器执行时导致控制器实施以下方法，该流体贮库配置为在与一个或多个微流体路径装置的密封流体连通中拴牢：在反应期间的任何时间以以亚微升精度计量的量从多个流体贮库气动输送模板材料、聚合酶和核苷酸到微流体路径装置的第一反应器中；在第一反应器中处理模板材料和核苷酸以形成治疗性mRNA；以及通过微流体路径装置气动转移治疗性mRNA离开第一反应器，其中第一微流体路径装置和多个流体贮库形成封闭路径和密封环境以防止大气暴露。
如上所述，在一些变型中本文所述的方法和装置可用来通过自动组合治疗性多核苷酸(例如治疗性mRNA)与递送媒介物配制(例如复合)治疗性组合物，例如以用递送媒介物包囊治疗性mRNA。这可以在如本文所述的装置内完成，并且在一些变型中可以包括形成模板和/或治疗性多核苷酸。例如，使用系统制造治疗性mRNA组合物的方法，该系统包含与一个或多个微流体路径板装置密封流体连通的多个流体贮库，该方法可以包括:从多个流体贮库中的一个或多个流体贮库递送模板前体材料到多个反应器中的第一反应器并处理模板前体材料以从模板前体材料形成DNA模板；转移DNA模板到多个反应器中的第二反应器，并通过体外转录处理DNA模板以形成治疗性mRNA；转移治疗性mRNA到多个反应器中的第三反应器并处理治疗性mRNA以组合其与递送媒介物以形成治疗性mRNA组合物；以及转移治疗性mRNA组合物到与第三反应器流体连通的浓缩器。转移治疗性mRNA到第三反应器可以包括用递送媒介物转移多种不同的治疗性mRNA以形成mRNA组合物。递送和转移步骤可以通过系统中的一个或多个流体动力回路实施，由控制器控制。例如，控制器可以通过偏转一个或多个微流体路径板装置内的一个或多个弹性层来控制流体动力回路。该方法可以在护理点实施。
这些方法(和实施它们的系统)中的任一种可以配置为自动地在相同的微流体路径装置中透析治疗性组合物(例如，用递送媒介物包囊的mRNA)以去除材料和/或浓缩治疗性组合物。例如，这些方法中的任一种可以包括透析一个或多个微流体路径板装置中的mRNA治疗性组合物以纯化mRNA治疗性组合物。可以使用任何合适的纳米颗粒(例如，两亲性纳米颗粒，如氨基脂化拟肽)。
此外，这些方法中的任一种可以包括在与第二反应器流体连通的多个反应器中的一个或多个反应器内的二维(2D)纯化。
制造治疗性mRNA组合物的方法可以是快速的，特别是与已知的技巧和技术相比。例如，本文所述的方法可能需要5天或更短时间(例如，4天或更短时间、72小时或更短时间等)来形成治疗性组合物(治疗性mRNA和递送媒介物)，其包括形成合成模板(例如，不使用细菌前体从头合成)。
例如，使用系统制备治疗性mRNA的方法，该系统包含与一个或多个微流体路径板装置密封流体连通的多个流体贮库，其中一个或多个微流体路径板装置包含多个反应器，该方法可以包括:对多个流体贮库加压；控制第一流体动力回路，从而以亚微升精度且不与大气接触地从多个流体贮库中的一个或多个流体贮库递送模板前体材料到多个反应器中的第一反应器；处理模板前体材料以从模板前体材料形成DNA模板；控制第二流体动力回路，从而以亚微升精度且不与大气接触地转移DNA模板至多个反应器中的第二反应器；通过体外转录处理DNA模板以形成治疗性mRNA；控制第三流体动力回路，从而以亚微升精度且不与大气接触地转移治疗性mRNA至多个反应器中的第三反应器；处理治疗性mRNA以组合其与递送媒介物以形成治疗性mRNA组合物；控制第三流体动力回路以转移治疗性mRNA组合物至与第三反应器流体连通的浓缩器；以及浓缩治疗性mRNA组合物。
本文所述的方法和装置可用于提供治疗性多核苷酸组合物的按需合成。在一些变型中，这些方法可以包括远程合成一些组分并使用该装置以本地合成治疗性多核苷酸组合物，随后可以将其递送给患者。例如，按需生产治疗性多核苷酸组合物的方法，该方法包括：在本地设施接收已在远程设施中合成的治疗性多核苷酸；通过在防止大气接触的自动化系统中实施以下步骤在本地设施配制治疗性多核苷酸组合物：组合治疗性多核苷酸和保持在系统中的微流体路径装置中递送媒介物以形成治疗性多核苷酸组合物，透析微流体路径装置中的治疗性多核苷酸组合物；以及提供治疗性多核苷酸组合物。
合成治疗性多核苷酸可以包括在远程设施处使用微流体系统合成治疗性多核苷酸，该合成通过在受保护而免受大气接触的封闭流体路径装置中实施以下步骤来完成：形成合成模板、从合成模板实施体外转录以形成治疗性多核苷酸；以及纯化治疗性多核苷酸。
例如，按需生产治疗性mRNA组合物的方法，该方法包括：在远程设施合成治疗性mRNA；输送治疗性mRNA到本地设施；通过在防止大气接触的自动化封闭流体路径装置中实施以下步骤在本地设施配制治疗性mRNA组合物：组合治疗性mRNA和微流体路径装置中的递送媒介物以形成治疗性mRNA组合物，透析微流体路径装置中的治疗性mRNA组合物；并提供治疗性mRNA组合物。如本文所述，本地设施是医院或诊所，并且通常包括一个或多个微流体控制系统。在一些变型中，远程设施可以是制造设施，其包括一个或多个(例如，如本文所述的多个微流体控制系统)。
本文所述的方法进一步可包括浓缩治疗性多核苷酸组合物。
这些方法中的任一种可以包括使用如本文所述的系统合成治疗性多核苷酸，然后将它们存储(例如，冷藏和/或冷冻)并在冷藏时将它们从远程设施转移(例如，运输它们)到本地设施，以及在本地设施接受治疗性多核苷酸(例如，mRNA)。例如，治疗性多核苷酸组合物可以包含mRNA疫苗。这些方法中的任一种可以包括使用该系统配制治疗性多核苷酸，其中该系统包含多个流体贮库，该贮库被配置为在与该微流体路径装置密封流体连通中拴牢。
第一流体动力回路可用于以亚微升精度且不与大气接触地从多个流体贮库递送治疗性多核苷酸和递送媒介物至微流体路径装置中的一个或多个反应器，以便组合治疗性多核苷酸与递送媒介物。
如所述，这些治疗性组合物中的任一种可以包括用相同(或不同)递送媒介物包囊的多种mRNA(包括但不限于多种治疗性mRNA)。例如，在本地设施形成治疗性多核苷酸组合物可以进一步包括将一种或多种额外的治疗性多核苷酸与治疗性多核苷酸和递送媒介物组合。可以使用任何合适的递送媒介物，其包括本文所述的那些。治疗性多核苷酸可以是mRNA，如线性mRNA、环状RNA或自我复制RNA等。
治疗性多核苷酸可以在冷(例如，4度、0度、-10度等)温度下稳定达方法月(例如，1个月或更长、2个月或更长、3个月或更长、6个月或更长或8个月或更长、9个月或更长、1年或更长等)并且可以远程或本地存储。例如，这些方法可以包括在配制治疗性组合物之前将治疗性多核苷酸存储在本地设施中。
例如，使用封闭路径系统制造mRNA治疗性组合物的方法，该封闭路径系统包括多个存储贮库，该存储贮库配置为与一个或多个微流体路径装置密封流体连通中拴牢，该方法包括：在封闭流体路径中，在多个存储贮库中的一个或多个存储贮库和一个或多个微流体装置上的多个反应器之间输送试剂，该封闭流体路径受保护而免于大气接触，以在一个或多个微流体路径装置中实施以下步骤中的每一步：形成DNA模板、从模板实施治疗性mRNA的体外转录、纯化治疗性mRNA并组合mRNA和递送媒介物。
使用封闭路径系统制造mRNA治疗性组合物的方法，该封闭路径系统包括多个存储贮库，该存储贮库配置为与一个或多个微流体路径装置(其中一个或多个微流体路径装置包含多个反应器)密封流体连通中拴牢，该方法可以包括：从一个或多个存储贮库递送模板前体材料到多个反应器的第一反应器区域并处理模板前体材料以从模板前体材料制备模板；转移模板到多个反应器的第二反应器区域并通过体外转录处理模板以形成治疗性mRNA；以及转移治疗性mRNA到多个反应器的第三反应器区域并处理治疗性mRNA以组合其与递送媒介物以形成mRNA治疗性组合物，其中包括模板前体材料和递送媒介物的材料在不与大气接触的情况下从存储贮库递送到多个反应器。
使用封闭路径系统制造mRNA治疗性组合物的方法，该封闭路径系统包括与一个或多个微流体路径装置(其中一个或多个微流体路径装置包含多个反应器)密封流体连通的多个存储贮库，该方法可以包括：诱导流体流动以从一个或多个存储贮库递送模板前体材料到多个反应器的第一反应器区域，并处理模板前体材料以从模板前体材料制备模板；转移模板至多个反应器的第二反应器区域，并通过体外转录处理模板以形成mRNA；转移mRNA至多个反应器的第三反应器区域并加工mRNA以组合其与递送媒介物以形成mRNA治疗性组合物；以及转移一个或多个存储贮库的mRNA产物贮库，其中以亚微升精度且不与大气接触地将材料从存储贮库递送到微流体路径装置的反应器中。在本文所述方法的任一种中，可以气动地实施任何步骤，例如，可以气动地诱导流体流动、可以气动地转移流体等。或者/另外，可以通过机械、液压等方式驱动流体。
在这些方法(和实施它们的装置)的任一种中，封闭路径系统可以自动且连续地实施以下步骤：形成模板、从模板实施治疗性mRNA的体外转录、纯化治疗性mRNA以及组合mRNA和递送媒介物。封闭路径系统可以气动控制以下步骤的实施：形成模板、从模板实施治疗性mRNA的体外转录、纯化治疗性mRNA以及组合mRNA和递送媒介物。在一些变型中，封闭路径系统气动控制以下步骤的实施：形成模板、从模板实施治疗性mRNA的体外转录、纯化治疗性mRNA以及通过偏转在一个或多个微流体路径装置内的一个或多个膜组合mRNA和递送媒介物。
本文所述的任何方法和装置都可以配置为在护理点，如医院、诊所等设置和操作。这可以允许为特定的患者定制制造即时/按需的患者特异性治疗剂。或者/另外，对特定患者没有特异性的治疗分子可以以“患者个体化”的方式与递送媒介物一起配制。由于本文描述的方法和装置，这些方法中的任一种都可以非常快速地实施。例如，封闭路径系统可以在不到5天的时间内自动并连续地实施以下步骤：形成模板、从模板实施治疗性mRNA的体外转录、纯化治疗性mRNA以及组合mRNA和递送媒介物。或者，系统可以使用预先制备的模板作为输入，并在更短的时间内实施剩余的步骤。
组合mRNA和递送媒介物(配制治疗剂)可以进一步包括在一个或多个微流体路径装置中透析mRNA治疗性组合物以纯化mRNA治疗性组合物。
这些方法中的任一种可以进一步包括在一个或多个微流体路径装置上浓缩mRNA治疗性组合物，和/或透析治疗剂。
可以使用任何合适的递送媒介物，包括例如两亲性纳米颗粒。例如，两亲性纳米颗粒可包含氨基脂化拟肽(peptoid)。
或者/另外，在本文所述的任何方法和装置中，mRNA可以预先制备并存储(例如，在10摄氏度、4摄氏度、0摄氏度、-10摄氏度等)一段时间。例如，用于实施它们的这些方法和装置中的任一种可以包括治疗性mRNA库，其可以是单独或共同地(例如，可以组合2、3、4、5、6等或更多个单独的治疗性mRNA，并且)复合以形成mRNA治疗性组合物。如本文所述，mRNA治疗性组合物因此可以按需制造，并且可以在单一或多种mRNA治疗性组合物“鸡尾酒”中即时配制。
本文还描述了用于形成模板(例如，DNA模板)的方法。例如，使用封闭路径系统制备用于体外转录的合成双链DNA模板的方法，该封闭路径系统包含与微流体路径装置密封流体连通的多个存储贮库，该方法可包括：连接感兴趣的合成基因和合成的体外转录促进子盒以创建合成线性或环状连接产物；从合成的线性或环状连接产物中去除未反应的感兴趣的合成基因和未反应的合成的体外转录促进子盒；扩增环状连接产物以产生线性、分支或环状扩增的DNA；以及线性化扩增的DNA连接产物以生成双链DNA模板，其中连接、去除、扩增和线性化步骤中的每一步都是通过封闭路径系统在微流体路径装置中实施的。
例如，用于体外转录的合成双链DNA模板的高效、自动化方法可包括：从与微流体路径装置流体连通的多个存储贮库的一个或多个存储贮库气动递送以下各项到微流体路径装置的连接反应器中：感兴趣的合成基因和合成的体外转录促进子盒，以通过连接感兴趣的合成基因和合成的体外转录促进子盒来创建合成的线性或环状连接产物；气动引入来自多个存储贮库中的一个或多个存储贮库的一种或多种核酸外切酶试剂到连接反应器中，以通过从合成的线性或环状连接物中去除未反应的感兴趣的合成基因和未反应的合成体外转录促进子盒来去除未反应的材料；气动递送合成的线性或环状连接产物到微流体路径装置的扩增反应器中，以与一种或多种扩增剂组合用于扩增线性或环状连接产物以生成线性、分支或环状扩增的DNA；以及气动转移扩增的DNA连接产物到微流体路径装置的消化反应器，以通过线性化扩增的DNA连接产物来生成不含任何未反应输入材料的完全合成的双链DNA模板，其中连接反应器、扩增反应器和消化反应器以及多个存储贮库形成封闭路径和密封环境。
制备用于mRNA治疗性组合物的合成的双链DNA模板的方法(使用包含多个存储贮库的封闭路径系统，该存储贮库配置为在与一个或多个微流体路径装置密封流体连通中拴牢)，该方法可以包括：在封闭流体路径中，在多个存储贮库中的一个或多个存储贮库和一个或多个微流体装置上的多个反应器之间输送试剂，该封闭流体路径被保护以防止与大气接触，以在一个或多个微流体路径装置中形成治疗性mRNA的体外转录模板。
一般而言，本文所述的方法和装置可产生可不含细菌DNA和/或不含内毒素的双链DNA模板。本文所述的模板生成方法和装置可以不涉及细菌培养。此外，如本文所述制造的治疗性mRNA可以从模板合成而不使用细菌多核苷酸。因此，本文所述的方法中的任一种可以是用于在不使用细菌DNA和/或从内毒素中分离的情况下产生治疗性mRNA的方法。具体而言，本文描述的是制造不含细菌DNA和/或内毒素的双链DNA模板的方法。本文所述的方法中的任一种可以是无菌制造方法。
这些方法中的任一种可以包括用IIS型限制酶和/或甲基化敏感限制酶消化合成的体外转录模板。连接可包括用DNA连接酶连接，或通过DNA合成连接或通过引物延伸连接。去除可包括用核酸外切酶或通过甲基化敏感性限制酶消化线性DNA。核酸外切酶可以包括核酸外切酶V。扩增可以包括多重置换扩增(MDA)。扩增可包括用Φ29DNA聚合酶扩增。扩增可以包括生成分支的扩增DNA。扩增可以包括聚合酶链扩增(PCR)。扩增可包括用热稳定DNA聚合酶扩增。
线性化可包括用IIs型限制酶消化。线性化可以包括用BsaI限制酶消化。合成的体外转录模板的消化可以包括用甲基化敏感性限制酶消化，如DpnI。感兴趣的合成基因可以是线性的。在一些变型中，合成的体外转录促进子盒包含包含启动子的双链DNA模板；5’UTR；可切割的接头；3’UTR；以及编码包含至少连续200个腺嘌呤残基或200个胸苷残基的polyA区域的部分。合成的体外转录促进子盒可以作为单个单元或作为两个或更多个单元递送。编码polyA区域的部分可以是至少300bp长。在一些变型中，编码polyA区域的部分可以是至少350bp长。
感兴趣的合成基因可以包含至少部分T细胞受体。感兴趣的合成基因可以包含互补决定区(CDR)。
体外转录促进子盒的长度可以小于2kb。体外转录促进子盒的长度可以小于1kb。体外转录促进子盒的长度可以小于700个碱基对。合成的体外转录促进子盒可以不编码抗生素抗性基因。
合成的线性或环状连接产物可以没有复制起点(ORI)。体外转录促进子盒可以没有复制起点(ORI)。
如所述，本文所述的方法中的任一种的步骤可以在封闭的微流体路径装置中实施。这些步骤可以在封闭的微流体路径装置中实施，并且连接步骤可以在与扩增步骤不同的模块(例如，不同的微流体路径装置)中实施，并且扩增步骤可以在与线性化步骤不同的模块中实施。
这些方法中的任一种可以包括在一个或多个微流体路径装置的封闭路径中纯化模板。
本文还描述了使用本文所述的封闭路径方法和装置实施体外转录的方法。例如，使用封闭路径系统(例如，包含配置为与一个或多个微流体路径装置的密封流体连通中拴牢的多个存储贮库)实施体外转录(IVT)反应的方法可以包括：在封闭流体路径中，在多个存储贮库中的一个或多个存储贮库和一个或多个微流体装置上的多个反应器之间的输送试剂，该流体路径受保护而免于大气接触，以在一个或多个微流体路径装置中从模板实施治疗性mRNA的体外转录。
实施体外转录(IVT)反应的方法可以包括：通过定向流体流动以亚微升精度计量从多个存储贮库自动递送DNA模板、聚合酶和核苷酸到微流体路径装置的第一反应器中；在第一反应器中处理模板材料和核苷酸以形成治疗性mRNA；以及通过微流体路径装置气动转移治疗性mRNA离开第一反应器，其中第一微流体路径装置和多个存储贮库形成封闭路径和密封环境以防止大气暴露。
封闭路径系统可以自动连续运行。封闭路径系统可以气动控制从模板体外转录治疗性mRNA的性能。
这些方法中的任一种还可以包括在一个或多个微流体装置中纯化治疗性mRNA。输送试剂可以包括从多个存储贮库输送试剂到微流体路径装置的第一反应器。
本文还描述了配制(例如，与递送媒介物组合)治疗性mRNA的方法。例如，制造mRNA治疗性组合物的方法(例如，使用包含多个存储贮库的封闭路径系统，该存储贮库配置为与一个或多个微流体路径装置密封流体连通中拴牢)可以包括：在封闭的流体路径中，在多个存储贮库中的一个或多个存储贮库和在一个或多个微流体路径装置上的多个反应器之间输送试剂，该流体路径受保护而免于大气接触，以在一个或多个微流体路径装置中通过组合治疗性mRNA与递送媒介物来配制mRNA治疗性组合物。封闭路径系统可以自动且连续地组合mRNA与递送媒介物。封闭路径系统可以气动控制组合mRNA与递送媒介物。例如，封闭路径系统可以通过偏转一个或多个微流体路径装置内的一个或多个膜来气动控制组合mRNA与递送媒介物。
组合mRNA与递送媒介物进一步可以包括透析在一个或多个微流体路径装置中的mRNA治疗性组合物以纯化mRNA治疗性组合物，和/或在一个或多个微流体路径装置上浓缩mRNA治疗性组合物。
例如，本文描述的是使用包括多个存储贮库的系统制造mRNA的方法，该存储贮库配置为在与一个或多个微流体路径装置密封流体连通中拴牢。这些方法中的任一种可以包括：在封闭的流体路径中，在多个存储贮库中的一个或多个存储贮库和一个或多个微流体装置上的多个反应器之间输送试剂，该流体路径受保护而免于大气接触，以在一个或多个微流体路径装置中实施一个或多个以下步骤：形成模板、从模板实施mRNA的体外转录、以及纯化mRNA。
使用包含多个存储贮库的系统制造治疗性mRNA组合物的方法，该存储贮库配置为在与一个或多个微流体路径装置密封流体连通中拴牢，该方法可包括：在封闭的流体路径中，在多个存储贮库中的一个或多个存储贮库和一个或多个微流体装置上的多个反应器之间输送试剂，该流体路径受保护而免于大气接触，以在一个或多个微流体路径装置中实施一个或多个以下步骤：形成模板、从模板实施治疗性mRNA的体外转录、纯化治疗mRNA、以及用递送媒介物配制mRNA。
使用包含多个存储贮库的系统制造治疗性mRNA组合物的方法，该存储贮库配置为在与一个或多个微流体路径装置密封流体连通中拴牢，该方法可包括：在封闭的流体路径中，在多个存储贮库中的一个或多个存储贮库和一个或多个微流体装置上的多个反应器之间输送试剂，该流体路径受保护而免于大气接触，以在一个或多个微流体路径装置中实施一个或多个以下步骤：形成模板、从模板实施治疗性mRNA的体外转录、化治疗mRNA、用递送媒介物配制mRNA、以及实施透析和浓缩配制的治疗性mRNA。
使用包含多个存储贮库的系统制造治疗性mRNA组合物的方法，该存储贮库配置为在与一个或多个微流体路径装置的密封流体连通中拴牢，该方法可包括：遵循编码在非暂时性计算机可读介质中的用于形成治疗性mRNA组合物的步骤顺序，其中该步骤包括：在封闭的流体路径中，在多个存储贮库中的一个或多个存储贮库和一个或多个微流体装置上的多个反应器之间输送试剂，该流体路径受保护而免于大气接触，以在一个或多个微流体路径装置中实施一个或多个以下步骤：形成模板、从模板实施治疗性mRNA的体外转录、纯化治疗性mRNA、以及组合mRNA和递送媒介物。
本文还描述了使用包含多个存储贮库的系统制造治疗性mRNA组合物的方法，该存储贮库配置为在与一个或多个微流体路径装置的密封流体连通中拴牢，该方法包括从微流体路径装置上的模板实施治疗性mRNA的体外转录，以及在微流体路径装置上的一个或多个流体连接的反应器中纯化治疗性mRNA。
本文还描述了通过这些方法中的任一种制造的治疗剂，尤其包括mRNA治疗剂。例如，本文描述的是使用包含多个存储贮库的系统制备的治疗性mRNA，所述存储贮库配置为在与一个或多个微流体路径装置密封流体的连通中拴牢，该mRNA通过以下方式制备：在封闭的流体路径中，在多个存储贮库中的一个或多个存储贮库和一个或多个微流体装置上的多个反应器之间输送试剂，该流体路径受保护而免于大气接触，以在一个或多个微流体路径装置中实施一个或多个以下步骤：形成模板、从模板实施治疗性mRNA的体外转录、以及纯化治疗性mRNA。
例如，本文描述的是使用包含多个存储贮库的系统制备的治疗性mRNA，所述存储贮库配置为在与一个或多个微流体路径装置密封流体的连通中拴牢，该mRNA通过以下方式制备：在封闭的流体路径中，在多个存储贮库中的一个或多个存储贮库和一个或多个微流体装置上的多个反应器之间输送试剂，该流体路径受保护而免于大气接触，以在一个或多个微流体路径装置中实施一个或多个以下步骤：形成模板、从模板实施治疗性mRNA的体外转录、纯化治疗性mRNA、以及用递送媒介物配制mRNA。
例如，本文描述的是使用包含多个存储贮库的系统制备的治疗性mRNA，所述存储贮库配置为在与一个或多个微流体路径装置密封流体的连通中拴牢，该mRNA通过以下方式制备：在封闭的流体路径中，在多个存储贮库中的一个或多个存储贮库和一个或多个微流体装置上的多个反应器之间输送试剂，该流体路径受保护而免于大气接触，以在一个或多个微流体路径装置中实施一个或多个以下步骤：形成模板、从模板实施治疗性mRNA的体外转录、纯化治疗性mRNA、用递送媒介物配制mRNA以及对配制的治疗性mRNA实施透析和浓缩。
本文描述的是使用包含多个存储贮库的系统形成的治疗性mRNA组合物，所述存储贮库配置为在与一个或多个微流体路径装置的密封流体连通中拴牢，该组合物通过以下形成：遵循编码在非暂时性计算机可读介质中的用于形成治疗性mRNA组合物的步骤顺序，其中该步骤包括：在封闭流体路径中，在多个存储贮库中的一个或多个存储贮库与一个或多个微流体装置上的多个反应器之间输送试剂，所述流体路径受保护而免受大气接触，以在一个或多个微流体路径装置中实施一个或多个以下步骤：形成模板、从模板实施治疗性mRNA的体外转录、纯化治疗性mRNA、以及结合mRNA和递送媒介物。例如，治疗性mRNA可以是使用包含多个存储贮库的系统形成的治疗mRNA组合物，该存储贮库配置为在与微流体路径装置的密封流体连通中拴牢，该方法包括从微流体路径装置上的模板实施治疗性mRNA的体外转录，以及在微流体路径装置上的一个或多个流体连接的反应器中纯化治疗性mRNA。
本文所述的任何系统可以包括配置为实施这些方法中的任一种的控制器。因此，本文还描述了配置为执行本文描述的任何方法的软件、固件或硬件。例如，本文描述的是包含用于制造mRNA的指令的非暂时性计算机可读介质，所述指令当由包含多个存储贮库的系统的控制器执行时导致控制器实施以下方法，该存储贮库配置为在与一个或多个微流体路径装置的密封流体连通中拴牢：在封闭的流体路径中，在多个存储贮库中的一个或多个存储贮库和一个或多个微流体装置上的多个反应器之间输送试剂，该流体路径受保护而免于大气接触，以在一个或多个微流体路径装置中实施一个或多个以下步骤：形成模板、从模板实施治疗性mRNA的体外转录、以及纯化治疗性mRNA。
例如，本文描述的是包含用于制造mRNA(包括治疗性mRNA组合物)的指令的非暂时性计算机可读介质，所述指令当由包含多个存储贮库的系统的控制器执行时导致控制器实施本文所述方法中的任一种，该存储贮库配置为在与一个或多个微流体路径装置的密封流体连通中拴牢。
本文还描述了使用封闭路径系统制备用于mRNA的合成双链DNA模板的方法，该封闭路径系统包含配置成在与一个或多个微流体路径装置的密封流体连通中拴牢的多个存储贮库，该方法可以包括：在封闭的流体路径中，在多个存储贮库中的一个或多个存储贮库和一个或多个微流体装置上的多个反应器之间输送试剂，该流体路径受保护而免于大气接触，以组合该试剂；并形成治疗性mRNA的体外转录的模板。
例如，使用封闭路径系统制备合成的双链DNA模板以用作mRNA体外转录反应的输入的方法，该系统可以包含多个存储贮库，这些存储贮库配置为在与一个或多个微流体路径装置的密封流体连通中拴牢，所述方法包括：在封闭的流体路径中，在多个存储贮库中的一个或多个存储贮库和一个或多个微流体装置上的多个反应器之间输送试剂，该流体路径受保护而免于大气接触；并形成治疗性mRNA的体外转录的模板。
使用包含多个存储贮库的系统制造mRNA组合物的方法，所述存储贮库配置为在与一个或多个微流体路径装置的密封流体连通中拴牢，其中一个或多个微流体路径装置包含多个反应器，该方法可以包括：从一个或多个存储贮库递送模板前体材料到多个反应器的第一反应器区域并处理模板前体材料以从模板前体材料制备模板；转移模板至多个反应器的第二反应器区域，并通过体外转录处理模板以形成mRNA；以及转移mRNA至多个反应器的第三反应器区域并处理mRNA以组合其与递送媒介物以形成mRNA组合物，其中在不与大气接触的情况下将包括模板材料和递送媒介物的材料从存储贮库递送到多个反应器中。
使用包含多个存储贮库的系统制造mRNA组合物的方法，所述存储贮库配置为在与一个或多个微流体路径装置的密封流体连通中拴牢，其中一个或多个微流体路径装置包含多个反应器，该方法可以包括：从一个或多个存储贮库气动输送模板前体材料到多个反应器的第一反应器区域，并处理模板前体材料以从模板前体材料制备模板；气动转移模板至多个反应器的第二反应器区域，并通过体外转录处理模板以形成mRNA；气动转移mRNA至多个反应器的第三反应器区域并处理mRNA以组合其与递送媒介物以形成治疗性mRNA组合物；以及将转移mRNA产物至一个或多个存储贮库，其中以亚微升精度且不与大气接触的情况下将材料从存储贮库递送至微流体路径装置的反应器中。
使用包含多个存储贮库的封闭路径系统制备用于体外转录的合成的双链DNA的模板的方法，该系统包含与微流体路径装置密封流体连通的多个存储贮库，该方法可以包括：连接感兴趣的合成基因与合成的体外转录促进子盒以创建合成线性或环状连接产物；从合成的线性或环状连接产物中去除未反应的感兴趣的合成基因和未反应的合成体外转录促进子盒；扩增线性或环状连接产物以生成线性、分支或环状扩增DNA；以及线性化扩增的DNA连接产物以生成双链DNA模板，其中连接、去除、扩增和线性化步骤中的每一步都是通过封闭路径系统在微流体路径装置中实施的。
这些方法中的任一种都可以是高效的自动化方法，其包括制备用于体外转录的合成双链DNA模板的高效自动化方法。例如，方法可以包括从与微流体路径装置流体连通的多个存储贮库中的一个或多个存储贮库中气动递送以下每个至微流体路径装置的连接反应器中：感兴趣的合成基因和合成的体外转录促进子盒，以通过连接感兴趣的合成基因和合成的体外转录促进子盒以创建合成的线性或环状连接产物；气动引入来自多个存储贮库中的一个或多个存储贮库的一种或多种核酸外切酶试剂到连接反应器中，以通过从合成的线性或环状连接物去除未反应的感兴趣的合成基因和未反应的合成的体外转录促进子盒来去除未反应的材料；气动递送合成的线性或环状连接产物到微流体路径装置的多重置换扩增(MDA)或聚合酶链式反应(PCR)反应器中，以与一种或多种扩增剂组合用来扩增线性或环状连接产物以生成线性，分支或环状扩增的DNA；气动转移扩增的DNA连接产物至微流路装置的消化反应器，以通过线性化扩增的DNA连接产物来生成双链DNA模板，其中连接反应器、MDA反应器或PCR反应器和消化反应器以及多个存储贮库形成封闭路径和密封环境。
制备体外转录的合成的双链DNA模板的方法，该方法包括遵循在非暂时性计算机可读介质中编码的步骤顺序，该方法可以包括：从与微流体路径装置流体连通的多个存储贮库中的一个或多个存储贮库中递送以下每个至微流体路径装置的连接反应器中：感兴趣的合成基因和合成的体外转录促进子盒，以通过连接感兴趣的合成基因和合成的体外转录促进子盒以创建合成的线性或环状连接产物；引入来自多个存储贮库中的一个或多个存储贮库的一种或多种核酸外切酶试剂到连接反应器中，以通过从合成的线性或环状连接物去除未反应的感兴趣的合成基因和未反应的合成的体外转录促进子盒来去除未反应的材料；递送合成的线性或环状连接产物到微流体路径装置的多重置换扩增(MDA)或聚合酶链式反应(PCR)反应器中，以与一种或多种扩增剂组合用来扩增线性或环状连接产物以生成线性，分支或环状扩增的DNA；转移扩增的DNA连接产物至微流路装置的消化反应器，以通过线性化扩增的DNA连接产物来生成双链DNA模板，其中连接反应器、MDA反应器或PCR反应器和消化反应器以及多个存储贮库形成封闭路径和密封环境。
使用包含多个存储贮库的系统实施体外转录(IVT)反应的方法，该存储贮库配置为在与一个或多个微流体路径装置的密封流体连通中拴牢，该方法可包括：在封闭的流体路径中，在多个存储贮库中的一个或多个存储贮库和一个或多个微流体装置上的多个反应器之间输送试剂，该流体路径受保护而免于大气接触，以在一个或多个微流体路径装置中实施治疗性mRNA从模板的体外转录。
本文还描述了实施体外转录(IVT)反应的方法，该方法包括遵循在非暂时性计算机可读介质中编码的步骤顺序，其中这些步骤包括：在反应期间的任何时间以亚微升精度计量的量从多个存储贮库气动递送模板材料，聚合酶和核苷酸到微流体路径装置的第一反应器；在第一反应器中处理模板材料和核苷酸以形成治疗性mRNA；以及通过微流体路径装置气动转移治疗性mRNA离开第一反应器，其中第一微流体路径装置和多个存储贮库形成封闭路径和密封环境以防止大气暴露。
本文还描述了实施体外转录(IVT)反应的方法，该方法包括遵循在非暂时性计算机可读介质中编码的步骤顺序，其中所述步骤包括：通过诱导的流体流动以由控制器控制的量遵循步骤顺序从多个存储贮库递送模板材料、聚合酶和核苷酸到微流体路径装置；在一个或多个反应器中处理模板材料和核苷酸以形成治疗性mRNA；并且通过微流体路径装置转移治疗性mRNA离开一个或多个反应器，其中第一微流体路径装置和多个存储贮库形成封闭路径和密封环境以防止大气暴露。
本文还描述了实施体外转录(IVT)反应的方法，该方法包括：通过诱导的流体流动以由预编程的软件命令控制的量从多个存储贮库递送模板材料、聚合酶和核苷酸到微流体路径装置；在微流体路径装置中的第一一个或多个反应器中处理模板材料和核苷酸以形成治疗性mRNA；并且通过微流体路径装置转移治疗性mRNA离开第一一个或多个反应器到适于纯化mRNA的第二一个或多个反应器中，其中微流体路径装置和多个存储贮库形成封闭路径和密封环境以防止大气暴露。
本文还描述了实施体外转录(IVT)反应的方法，该方法包括遵循在非暂时性计算机可读介质中编码的步骤顺序，其中所述步骤包括：通过诱导的流体流动以由步骤顺序控制的量从多个存储贮库递送模板材料、聚合酶和核苷酸到第一微流体路径装置的第一一个或多个反应器中；在第一一个或多个反应器中处理模板材料和核苷酸以形成治疗性mRNA；并且通过第一微流体路径装置转移治疗性mRNA离开一个或多个反应器到适于纯化mRNA的第二一个或多个反应器中；并且转移如此纯化的mRNA以完成mRNA治疗剂的配制，其中第一微流体路径装置和多个存储贮库形成封闭路径和密封环境以防止大气暴露。
本文还描述了实施体外转录(IVT)反应的方法，该方法包括遵循在非暂时性计算机可读介质中编码的步骤顺序，其中步骤包括：从多个存储贮库气动递送模板材料，聚合酶和核苷酸到第一微流体路径装置的第一一个或多个反应器；在第一一个或多个反应器中处理模板材料和核苷酸以形成治疗性mRNA；并且通过第一微流体路径装置转移治疗性mRNA离开第一一个或多个反应器到适用于mRNA纯化的第二一个或多个反应器中；以及转移纯化的mRNA到第三一个或多个反应器中，以组合纯化的mRNA和一个或多个递送媒介物以形成mRNA治疗剂，其中第一微流体路径装置和多个存储贮库形成封闭路径和密封环境以防止大气暴露。
例如，本文还描述了实施体外转录(IVT)反应的方法，该方法包括遵循在非暂时性计算机可读介质中编码的步骤顺序，其中所述步骤包括：从多个存储贮库气动递送模板材料，聚合酶和核苷酸到第一微流体路径装置的第一一个或多个反应器；在第一一个或多个反应器中处理模板材料和核苷酸以形成治疗性mRNA；并且通过第一微流体路径装置转移治疗性mRNA离开第一一个或多个反应器到包含纤维素并适于纯化mRNA的第二一个或多个反应器中；以及转移纯化的mRNA到第三一个或多个反应器中以组合纯化的mRNA和一个或多个递送媒介物来形成mRNA治疗剂，其中第一微流体路径装置和多个存储贮库形成封闭路径和密封环境以防止大气暴露。
本文还描述了使用包含多个存储贮库的系统制造治疗性mRNA组合物的方法，该存储贮库配置为在与一个或多个微流体路径装置的密封流体连通中拴牢，所述方法包括：在封闭的流体路径中，在多个存储贮库的一个或多个存储贮库和一个或多个微流体路径装置上的多个反应器之间运输试剂，该流体路径受保护而免于大气接触，以通过组合一个或多个治疗性mRNA与一个或多个微流体路径装置中的递送媒介物来配制治疗性mRNA组合物。
使用包含多个存储贮库的系统按需制造治疗性mRNA组合物的方法，所述存储贮库配置为在与一个或多个微流体路径装置的密封流体连通中拴牢，该方法可包括：在封闭的流体路径中，在多个存储贮库的一个或多个存储贮库和一个或多个微流体路径装置上的多个反应器之间运输试剂，该流体路径受保护而免于大气接触，以在一个或多个微流体路径装置中实施以下步骤中的一个或多个：形成模板、从模板实施治疗性mRNA的体外转录、纯化治疗性mRNA、以及用递送媒介物配制mRNA。
这些方法和装置中的任一种都可以在护理点进行实施(例如，制造治疗性mRNA)。这些方法和装置中的任一种都可以快速且连续地实施，例如，在少于72小时内制造治疗剂。
如所述，在这些方法和装置中的任一种中，形成的多核苷酸(例如，通过IVT)可以在与递送媒介物组合之前和之后在微流体路径装置内在微流体控制装置的自动控制下进行纯化。
特别地，本文描述了方法和装置，其可以包括一个或多个微流体路径装置，作为制造过程的一部分，该微流体路径装置适用于与可渗透插入材料一起使用，所述可渗透插入材料可去除一种或多种靶材料(例如，双链RNA等)和/或可以添加一种或多种额外的材料(例如，冻干材料)到治疗性材料中。可渗透插入材料可以配置保持在微流体路径装置的一个或多个流体接触腔室中，并且可以适配成使得正在形成的治疗性溶液通过可渗透插入材料。可渗透插入材料可以是可压缩的和/或可变形的和/或弹性的，从而它可以由腔室内的弹性膜操纵。可渗透插入物可包括可渗透并含有固体、粒状、凝胶等修饰材料的覆盖物(例如，外覆盖物)。在一些变型中，可渗透插入物材料是配置为从溶液中选择性去除dsRNA的纤维素材料。
可渗透材料可以是多孔的(例如，可以包括孔)。在一些变型中，可渗透材料可以是纤维状的或分层的。例如，可渗透材料可以是纤维状的，并且可以包括流体可以移动通过的通道。在一些变型中，通道可以通过可渗透材料形成以允许其对流体是可渗透的。例如，可渗透材料可以具有由激光形成的通道，或者可以使内部体积可被流体接近的任何其他手段。在一些变型中，可渗透材料可以从多个层形成，该层被布置成允许流体在层之间或层中通过的多个层。仅有表面可及性的材料的多个薄层可以堆叠在一起。例如，功能化的石墨烯可以是分层的(例如，在极端情况下，是单个原子层)。作为另一个实例，可以对气凝胶切片进行处理或以其他方式变得吸收性并堆叠以形成插入物的可渗透材料。
在本文所述的可渗透材料中的任一种中，该材料可以是预形成材料，其被配置为允许流体的通过，在一些情况下以预定的流速和/或流动阻力。当以本文所述的处理流速和流体压力保持在装置腔室或通道内时，可以选择材料的渗透性以允许流过可渗透插入物。如上所述，预成型的可渗透材料可以是多孔的、纤维状的，可以是层叠的；这些材料中的任何一种都可以被功能化以结合材料。如本文所用，功能化材料可包括通过添加特异性结合目标材料的化合物、试剂或官能团而对其材料表面进行修饰的任何材料。材料还可以或替代地通过表面处理来功能化，通过表面处理可以连接特定的原子分子基团以改变材料的特定特性。功能化可以通过各种表面改变技术实施，如湿化学，或蒸汽、气体和/或等离子体化学，和/或微波辅助化学技术等，包括利用表面化学将所需材料结合到表面的技术。类似的技术可用于修饰材料，例如“激活”材料。
可渗透材料可以配置使装置内的插入物的总表面积最大化，从而允许选择性结合不想要的杂质和/或靶产物。这些可渗透材料中的任一种都可以配置使溶液充分渗透到预成型材料的内部，以有效地结合溶液中的物质。在一些变型中，可渗透材料可以包含多于一个的预成型体(preform)，每个预成型体都大于微流体路径装置内的通道或腔室，并且这些预成型体中的每一个仍然可以允许内部的溶液渗透，以最大化溶液对功能活性材料的暴露。
如上所述，本文所述的可渗透植入物插入物可以配置以从溶液中去除杂质(例如，不需要的材料)；或者/另外，可渗透植入物可以配置为可释放地结合到所需材料上，从而它可以被洗脱(例如，在洗涤之后等)。
如上所述，本文所述的方法和装置可以包括使用微流体路径装置，该装置包括一个或多个可渗透插入物，该插入物配置为修饰形成治疗剂的溶液。可渗透插入物可适用于在本文所述的微流体路径装置内使用。
例如，本文描述的是可渗透插入物，其配置为装配在腔室的流体接触侧内。因此，可渗透插入物的大小和/或形状可以成与腔室的流体接触侧的全部或一部分(例如，横截面区域)内的体积基本一致。如上所述，可渗透材料可以是单个预成型植入物，或者它可以是形成可渗透植入物的多种预成型材料的组合。可渗透植入物通常可以允许溶液流入并通过材料。在一些变型中，可渗透植入物也可以是可压缩的(例如，“可挤压的”)以允许在微流体路径装置压缩插入可渗透植入物的腔室时从可渗透植入物内去除流体。在一些变型中，可渗透植入物有足够的弹性以在被压缩后恢复扩展的形状。
可渗透插入物和微流体路径装置可以配置为使得流体，特别是用于生成治疗性组合物的材料，在处理期间必须通过可渗透插入物。在一些变型中，可渗透插入物是可压缩材料和/或可弹性变形材料(例如，弹性的)，其当通过偏转将腔室的流体接触腔侧从腔室的压力接收侧分离的弹性材料(例如，弹性层)改变流体接触腔室的体积时可以变形。在一些变型中，可渗透插入物是可压缩的，但不一定是可弹性变形的。在一些变型中，可渗透插入物是可膨胀的材料，其当被激活时(例如，通过添加流体，如缓冲液、水等)可以在腔室的流体接触侧内扩展。可渗透插入物可以通过偏转在腔室的压力接收侧和腔室的流体接触侧之间的弹性材料(层)来压缩。在一些变型中，处理治疗剂可以包括在包括可渗透插入材料的多个(例如，2、3、4等)腔室之间传输用于配制治疗性材料的溶液。在一些变型中，该方法可以包括将溶液驱入和驱出包括可渗透插入材料的腔室。
在本文所述的方法和装置中的任一种中，可以压缩治疗性插入材料以将包括治疗性材料(或其中正在形成治疗性材料)的溶液驱出腔室的流体接触侧，例如通过调节腔室压力接受侧中的压力以使弹性膜偏转，分离腔室为流体接触侧和压力接受侧。
可渗透插入物可以是可用于修饰和进一步加工和/或修饰治疗性材料的任何适当材料。例如，在一些变型中，可渗透插入物可以包括配置为保留dsRNA的纤维素材料，以便在溶液通过可渗透材料时从溶液中去除dsRNA。或者/另外，可渗透插入物可以包括一种或多种材料，这些材料可以添加到来自可渗透插入物的溶液中。
例如，本文所述的任何可渗透插入物可包括一种或多种吸附在可渗透插入物中或上的额外材料。在这些变型的任一种中，可渗透插入物可以包括用于释放的材料。在一些变型中，例如，可渗透插入物可以包括纤维素插入物，其可以用DNA酶预处理以将DNA酶捕获在纤维素中。这可以允许插入物同时去除dsRNA(如本文所述)并消化DNA材料，如来自体外转录步骤的DNA模板。
本文所述的可渗透插入物的任一种可配置为表面功能化插入物，其包括附接、吸附或以其他方式包含在可渗透插入物上或中的一种或多种额外试剂。例如，在一些变型中，如包含在可渗透插入物内或上的额外材料可以包括共价栓系材料(例如，抗体或适体)、静电栓系材料、吸附酶(例如，在一些实例中，其可以选择性地降解杂质，如如上所述的DNA酶)、共价或非共价连接的传感器(例如，检测要去除的材料，如双链RNA、杂质等)。在一些变型中，额外的一种或多种材料可以包括多聚(dT)序列以捕获多聚腺苷酸化的RNA分子，例如，结合到可渗透植入物的表面/在可渗透植入物中结合(例如，可以在可渗透的植入物内使用多聚(dT)序列分离mRNA)。在一些变型中，一种或多种额外材料可以包括小分子以增强结合特性(例如，dsRNA嵌入剂如溴化乙啶可以选择性地结合dsRNA材料而不结合ssRNA)。在一些变型中，可渗透插入物可以至少部分地用材料包覆。例如，在一些变型中，涂层可以是羧酸酯/盐涂层。
在一些变型中，可渗透插入物可以包括可以立即或以定时释放方式释放到溶液中的冻干材料。例如，在一些变型中，当溶液接触可渗透插入物时，它可以溶解冻干材料到溶液中。冻干材料的实例可以包括一种或多种缓冲材料(例如，盐、螯合剂、洗涤剂、多核苷酸、酶、蛋白质等)。在一些变型中，可渗透插入物可以包括用于结合溶液中的一种或多种材料的试剂，如粘合剂。例如，可渗透插入物可以包括结合的免疫剂，例如抗体，或其部分，包括FAB片段等，其可以选择性地从溶液中去除材料。
一般而言，可渗透插入物可配置为跨越腔室的流体接触侧，使得流体经过和/或通过可渗透插入物。可渗透插入物可以是纸，例如材料片。可渗透插入物可以折叠以跨越和/或至少部分地填充腔室的流体接触侧。因此，折叠形状可以在配置用于偏转(包括弹性偏转)的情况下跨越腔室的流体接触部分。折叠可以包括简单的折叠(例如，扇形折叠)或更复杂的折叠；通常，折叠可以包括一个或多个弯曲区域，这些区域可以用作铰接(例如，活动铰接)区域运行和/或在通过弹性膜的移动压缩或以其他方式偏转之后可以偏置以返回展开的形状，所述弹性膜将腔室分为流体接触腔室和压力接收腔室。在一些变型中，可渗透插入物可以形成海绵。可渗透插入物可以形成为泡沫或膨化材料。
在本文所述的可渗透插入物的变型的任一种中，可渗透插入物内的通道(例如，孔、通道、腔室等)的大小可以配置为基于大小通过或排除材料。因此，本文所述的可渗透插入物可以配置为实施大小排阻(例如，大小排阻色谱法)。例如，可以传递具有未反应单核苷酸的大mRNA分子到含有纳米孔插入物的腔室中，未反应的dNTP可扩散到插入物中并被物理包埋在其中，而通道(例如，孔)的大小可以排除大分子。
例如，在可渗透插入物包括纤维素(例如，用于去除dsRNA)的变型中，纤维素可以是纸(例如，滤纸)的形式，其可以被折叠或分层，包括配置为保持在腔室的流体接触部分内。在一些变型中，纤维素可以是膨化的或泡沫的。在一些变型中，纤维素可以是海绵的形式。
可渗透插入物通常可以具有任何合适大小的孔。孔径可以是均匀的或不均匀的；在一些变型中，孔径可以分布在大小范围内。例如，孔径可以在约1μm和约200μm之间(例如，从1μm到3μm、从1μm到5μm、从2μm到4μm、从2μm到5μm、从3μm到6μm、从5μm到10μm、从6μm到8μm、从6μm到10μm、从7μm到10μm、从8μm到10μm、从9μm到11μm、从9μm到12μm、从10μm到12μm、从10μm到15μm、从12μm到15μm、从14μm到16μm、从15μm到18μm、从17μm到19μm、从较小大小1μm、2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm、11μm、12μm、13μm、14μm、15μm、16μm、17μm、18μm、19μm、20μm、22μm、25μm、27μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、110μm、120μm等，到较大大小2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm、11μm、12μm、13μm、14μm、15μm、16μm、17μm、18μm、19μm、20μm、22μm、25μm、27μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、110μm、120μm等，其中下孔径小于上孔径。大小范围可以是分布，例如，>90％的孔在该大小分布内(例如，>90％、>92％、>93％、>94％、>95％、>96％、>97％、>98％、>99％、>99.5％、>99.9％等)。
在本文所述的方法和装置中的任一种中，如本文所述，可以控制微流体路径装置的温度。特别地，可以控制含有可渗透插入物的腔室的温度。例如，当包括治疗性材料的溶液(或在其中正在形成治疗性材料的溶液)接触可渗透插入物时，微流体路径装置中含有可渗透插入物的腔室可以保持在靶温度。温度可以保持在例如2℃和20℃之间、2℃和5℃之间、2℃和10℃之间、2℃和15℃之间、5℃和10℃之间、5℃和15℃之间、5℃和20℃之间、10℃和15℃之间、10℃和20℃之间、10℃和30℃之间、10℃和25℃之间、15℃和20℃之间、15℃和25℃之间、15℃和30℃之间、20℃和25℃之间、20℃和30℃之间、25℃和30℃之间、25℃和40℃之间、25℃和35℃之间、30℃和35℃之间、30℃和40℃之间、35℃和40℃之间、30℃和50℃之间、30℃和45℃之间、35℃和40℃之间、35℃和45℃之间、35℃和50℃之间、40℃和45℃之间、40℃和50℃之间、45℃和50℃之间、40℃和60℃之间、40℃和55℃之间、45℃和55℃之间、45℃和60℃之间、50℃和55℃之间、50℃和60℃之间、55℃和60℃之间、50℃和70℃之间、50℃和65℃之间、55℃和65℃之间、55℃和70℃之间、60℃和70℃之间、60℃和75℃之间、65℃和70℃之间、65℃和75℃之间、65℃和80℃之间、70℃和80℃之间、75℃和80℃之间、60℃和80℃之间、65℃和75℃之间、65℃和80℃之间、75℃和80℃之间、70℃和90℃之间、75℃和90℃之间、80℃和90℃之间、85℃和85℃之间、85℃和90℃之间等。温度可以是恒定的，或者它可以在暴露于可渗透插入物之前、期间和/或之后改变(例如，增加、减少等)。
在一些变型中，可渗透插入物可以称为固体可渗透插入物；可渗透的(例如，固体可渗透的)插入物可以配置成使其保持完全含有在腔室的流体接触侧内。在一些变型中，如上所述，在一些变型中，可渗透插入物可配置为由容纳的外部(例如可渗透覆盖物)包封的可渗透包装，该外部包围材料并将材料限制在可渗透覆盖物内。例如，可渗透覆盖物可以包封粒状材料或凝胶(例如，水凝胶)等。可渗透覆盖物可由如膜材料的材料形成，该材料具有足够的渗透性以允许流体通过覆盖物并进入由覆盖物所含有的体积中。因此，可渗透插入物可以形成可压缩和/或可弹性变形的枕状形状。
通常，可渗透插入物可以插入微流体路径装置的流体接触腔室中，并且可以配置为安装在如上所述的流体接触腔室中。在一些变型中，可渗透插入物配置为紧贴安装在腔室的流体接触侧中；例如，可渗透插入物可以具有与腔室的流体接触侧的形状(例如，椭圆形、圆形、方形、圆角方形等)互补的形状。如所述，可渗透插入物可以配置为跨越和/或填充体积，并且具体地，在垂直于流过流体接触侧的体积的流动方向的方向上跨越体积，使得流体通过可渗透插入物。
例如，本文描述的是微流体路径装置，其可以包括：用于在微流体路径装置内诱导溶液的流体流动的方法；多个腔室；以及在多个腔室的第一腔室内的可渗透插入物，其中该插入物配置为被压缩。用于诱导溶液的流体流动的方法可以包括任何合适的手段，特别是微流体路径装置上的多个压力端口，其配置为接收正压或负压以偏转微流体路径装置内的膜。例如，本文描述的是微流体路径装置，其包含：夹在第一板和第二板之间的弹性材料；和形成在第一板和第二板之间的多个腔室，其中弹性材料的一部分将每个腔室划分为流体接触侧和压力接收侧。这些微流体路径装置中的任一个都可以包括在第一腔室的流体接触侧内的固体且可渗透的插入物。
例如，本文描述的是微流体路径装置，其包含：夹在第一板和第二板之间的弹性材料；形成在第一板和第二板之间的多个腔室，其中弹性材料的一部分将每个腔室划分为流体接触侧和压力接收侧；以及在多个腔室中的第一腔室的流体接触侧内的固体且可渗透的插入物，其中插入物配置为施加压力到第一腔室的压力接收侧时通过弹性材料的偏转而压缩。
在一些变型中，微流体路径装置包含：夹在第一板和第二板之间的弹性材料；形成在第一板和第二板之间的多个腔室，其中弹性材料的一部分将每个腔室划分为流体接触侧和压力接收侧；以及在多个腔室中的第一腔室的流体接触侧内的固体且可渗透的插入物，其中插入物包含配置为纯化RNA的纤维素材料，其中驱动第一腔室的弹性材料配置为通过向压力接收侧施加压力以将流体移入或移出第一腔室来偏转。
微流体路径装置可以包含：夹在第一板和第二板之间的弹性材料；形成在第一板和第二板之间的多个腔室，其中弹性材料的一部分将每个腔室划分为流体接触侧和压力接收侧；多个流体端口，其配置为与多个腔室的流体接触侧流体连通；多个压力端口，其与多个腔室的压力接收侧流体连通；以及在所述多个腔室中的第一腔室的流体接触侧内的固体且可渗透的插入物，其中该插入物配置为当从压力端口的一个或多个将压力施加到第一腔室的压力接收侧时通过弹性材料的偏转而压缩。
在一些变型中，特别是在可渗透插入物配置为从溶液中去除不需要的材料(例如，dsRNA)的变型中，如包括纤维素的变型，腔室可以称为分离腔室。
如所述，在这些装置(例如，系统、装置等)的任一种中，固体和可渗透插入物可以包含配置以纯化RNA的纤维素材料。例如，固体且可渗透的插入物可以包含纤维素材料片。或者/另外，固体和可渗透插入物可以包含冻干材料。
固体且可渗透的插入物可以具有与第一腔室的轮廓相匹配的轮廓。如上所述，实心且可渗透的插入物可以是弹性的。
实心且可渗透的插入物可包含含有颗粒材料的可渗透外部覆盖物。在一些变型中，实心且可渗透的插入物包含折叠结构。
在一些变型中，微流体路径装置可以包含流动连接到第一腔室的第二腔室。该装置可以配置为通过偏转材料而在第一腔室和第二腔室之间转移流体。在一些变型中，流体可以在第一腔室和第二腔室之间往复移动。
微流体路径装置可以包括多个可单独寻址的压力端口，其延伸穿过第一板并且配置成递送压力到多个腔室的压力接收侧以在流体接收侧移动流体。
本文还描述了使用本文描述的任一种装置的方法。例如，处理流体中的治疗性材料(例如，RNA样品)的方法可以包括：偶联微流体路径装置到压力源；施加压力以输送样品到微流体路径装置的分离腔室的流体接触侧；使样品通入分离腔室的流体接触侧内的固体和可渗透插入物中，其中样品被固体和可渗透插入物修饰；并且施加压力以将样品输送出分离腔室的流体接触侧。
例如，从含有dsRNA和单链RNA(ssRNA)两者的RNA样品中去除双链RNA(dsRNA)的方法可以包括：偶联微流体路径装置到压力源；施加压力以输送RNA样品到微流体路径装置的分离腔室的流体接触侧；使RNA样品通入分离腔室的流体接触侧内的固体和可渗透插入物中，其中固体和可渗透插入物包含纤维素，使得dsRNA被插入物保留；并施加压力以将RNA样品输送出分离腔室的流体接触侧。
从含有dsRNA和单链RNA(ssRNA)两者的RNA样品中去除双链RNA(dsRNA)的方法可以包括：将微流体路径装置偶联到压力源；施加压力以输送RNA样品到微流体路径装置的分离腔室的流体接触侧，使得RNA样品通过分离腔室的流体接触侧内的包含纤维素的固体且可渗透的插入物，使得dsRNA被插入物保留；并向分离腔室的压力接受侧施加压力以将RNA样品输送出分离腔室的流体接触侧。
该方法可以包括微流体路径装置中通过体外转录来合成RNA样品。在一些变型中，该方法可以包括偶联微流体路径装置到RNA样品的来源。
施加压力以将RNA样品输送出流体接触侧可以包括向分离腔室的压力接受侧施加压力以偏转弹性材料，其将分离腔室的压力接受侧与分离腔室的流体接触侧分离。向分离腔室的压力接受侧施加压力可以包括将RNA样品输送出分离腔室的流体接触侧并且进入混合室的流体接触侧，进一步包括向混合腔室的压力接受侧施加压力以输送RNA样品回到分离腔室的流体接触侧中。施加压力以将RNA样品输送出分离腔室的流体接触侧可以包括通过分离分离腔室的压力接收侧与分离腔室的流体接触侧的弹性材料压缩固体和可渗透插入物。
这些方法中的任一种都可以包括预润湿固体和可渗透插入物。
附图说明
专利或申请文件含有至少一幅彩色绘图。专利局将根据请求和在支付必要费用后提供本专利或专利申请出版物的彩色附图副本。
本发明的新颖特点在所附权利要求书中特别阐述。通过参考以下阐述说明性实施方式的详细描述(其中利用了本发明的原理)以及附图，获得对本发明的特征和优点的更好理解：
图1A示意性显示了制造mRNA治疗剂的方法的一种变型。
图1B示意性显示了用于制造患者特异性T细胞淋巴瘤疫苗药物产物的示例性过程的一种变型。
图2A显示了如本文所述的微流体路径装置控制系统的一个实例。
图2B示意性显示了可以如本文所述使用的微流体路径装置控制系统的一种变型。
图3A-3C显示了如本文所述的微流体路径装置的变型。
图4是穿过如本文所述的微流体路径装置的一种变型的一部分的截面。
图5是可用于如本文所述的方法中的任一种中的拟肽递送媒介物的一个实例。
图6显示了可用于制备双链DNA模板的体外转录促进子盒的实例。
图7显示了如本文所述生成的双链DNA模板的实例。
图8显示用于制备用于疫苗或治疗剂的双链DNA的T细胞受体的实例的一个区域。
图9显示了用于生成双链DNA的微流体路径装置反应器的构造的一种变型的概览。
图10示意性显示了可用于本文所述的方法和装置中任一种中的密码子优化过程的一个实例。
图11示意性显示了微流体路径装置的功能图的一个实例，该装置配置为实施本文所述的IVT。
图12示意性显示了配置为如本文所述的配制微流体路径装置的微流体路径装置的功能图的一个实例。
图13示意性显示了配置为如本文所述的配制微流体路径装置的微流体路径装置的功能图的另一个实例。
图14示意性阐述了用于如本文所述的配制微流体路径装置的功能图的另一个实例。
图15描述了使用如本文所述的mRNA治疗剂的示例性模型检查体内mRNA表达和生物分布的实验的一个实例。
图16A-16D是阐述如本文所述的示例性治疗性mRNA疫苗的治疗功效的图。
图17A阐述了注射如本文所述制造的存储的模型mRNA治疗剂后的全身萤光素酶表达。
图17B显示了来自图17A的模型mRNA治疗剂的表达的定量实例。
图18示意性显示了可以在本文所述的方法和装置中应用过滤的不同时间。
图19A是在腔室的流体接触侧内包括可渗透插入物的微流体路径装置的实例的俯视图。
图19B是通过微流体路径装置的实例的一个区域的截面的实例，该微流体路径装置包括在腔室的一侧中的可渗透插入物。
图19C显示了微流体路径装置的一部分的一个实例，其示意性地显示了用于去除泡的真空盖。
图20A示意性显示了使用包括如本文所述的可渗透插入物的微流体路径装置处理流体中的治疗性材料(例如，RNA样品)的一种方法
图20B示意性显示了使用包括如本文所述的可渗透插入物的微流体路径装置从治疗性材料中去除dsRNA的方法的方法。
图21A显示了系统的一个实例，该系统包括在7级空间(class 7space)内的5级隔离柜(class 5isolation cabinet)中的微流体装置。该系统可以配置为微型工厂。
图21B阐述了5级柜内的微流体装置。
具体实施方式
本文描述的是用于制造治疗剂的方法和装置，其可以包括使用全自动化、软件控制的微流体装置。这些方法和装置可用于个性化或个体化治疗。本文还描述了装置(例如，系统、装置等)和方法，其包括对本文描述的制造步骤的任一种的软件控制，该制造步骤包括形成模板、体外转录、治疗性mRNA的纯化、mRNA的浓度、以及将mRNA与一种或多种递送媒介物复合。软件控制可以允许这些方法自动化，从而可以准确和精确地快速实施制造一种或多种治疗性mRNA的任何、一些或所有这些步骤。软件控制和反应组成的微流体精确递送和转移提供了提高过程控制、效率和可重复性的机会，而大大减少或消除了手动操作，减少了设施需求并缩短了生产周期时间，如果需要，最终导致及时生产的成本更低的治疗。
在本文所述的一些装置(例如，系统、装置等)中，每批治疗性材料可以在专用的、一次性的、可丢弃的微流体路径装置(在本文中也称为生物芯片)中生产，该装置可以被容纳在微流体路径装置控制系统(本文也称为控制系统)内。整个生产过程可以按照设计无菌、封闭路径的过程进行，而不与大气接触。所有生产步骤都可以自动化，由控制系统控制以实现复制精确的过程，而无论容纳系统的设施的特质如何。生产参数、原材料和环境数据(包括完整的可视记录)可以成为在云中保护并与每次生产运行相关联的广泛加密电子文件的一部分。此外，纯化步骤以及许多QC测定可以在生产过程中以单一流体流动在线实施，通过在半导体产业中开发的过程控制概念，允许在早期阶段检测到异常情况。通过驾驭全自动化、软件控制的制造法，可以以成本有效的方式制造个性化和个体化的mRNA治疗剂，以造福于患者。
通常，这些方法和装置可以在人体外通过称为体外转录(IVT)的合成技术合成地产生mRNA治疗剂。通常，裸mRNA分子是大的聚阴离子分子，其不会穿过细胞膜，并且其在体内被细胞外核酸酶快速降解。本文所述的方法和装装置可以产生有一种或多种递送媒介物的mRNA分子制剂，其被设计用于输送mRNA至靶物(组织、身体、组织区域等)。例如，在一些变型中，递送媒介物可以是含有脂质的两亲性递送媒介物，其在循环期间提供mRNA货物的包装和保护，避免免疫识别，并且可以促进细胞摄取和释放。
通常，如本文中将更详细描述的，在一些变型中，所有或一些生产步骤，包括模板合成、IVT、纯化和用递送媒介物的配制，可以在一种或多种微流体的高度受控环境中实施，允许优化稳健、高质量和高度可重复的制造过程。
定义
如本文所用，递送媒介物可以指任何合适的纳米颗粒。此类纳米颗粒的实例可以包括但不限于两亲性纳米颗粒，如氨基脂化拟肽。
如本文所用，“扩增”可以指多核苷酸(例如，DNA)扩增。例如，可以完全在本文所述的微流体路径板装置内实施扩增。扩增可包括但不限于多重置换扩增(MDA)、聚合酶链式反应(PCR)扩增、环介导等温扩增。LAMP、基于核酸序列的扩增、链置换扩增、滚环扩增、连接酶链式反应等。
如本文所用，自动化和半自动化可以指在很大程度上无需人工干预而实施的方法和过程，并且可以在一个或多个计算机处理的控制下实施。自动化方法可以由人工输入来监督和/或引导。
如本文所用，术语“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”可以互换使用并且指脱氧核糖核苷酸(DNA)、核糖核苷酸(RNA)及其功能类似物，如线性或环形构象中的互补DNA(cDNA)。本文提供的核酸分子可以是单链或双链的。核酸分子包含核苷酸碱基腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)。在RNA分子中尿嘧啶(U)取代胸腺嘧啶。本文还提供了天然核苷酸碱基的类似物，以及在碱基、糖和/或磷酸盐部分中修饰的核苷酸碱基。符号“N”可用于表示任何核苷酸碱基(例如，A、G、C、T或U)。
如本文所用，“盒”(例如，合成的体外转录促进子盒)是指多核苷酸序列，其可以包括或可操作地连接到一个或多个表达元件，如增强子、启动子、前导、内含子、5'非翻译区(UTR)、3’UTR或转录终止序列。在一些实施方案中，盒至少包含能够启动可操作地连接的第二多核苷酸序列的转录的第一个多核苷酸序列和任选地与第二多核苷酸序列可操作地连接的转录终止序列。盒可以作为单个元件或作为两个或更多个未连接的元件提供。
如本文所用，“多核苷酸”是指含有多个核苷酸的核酸分子，并且通常指“寡核苷酸”(长度为18-25个核苷酸的多核苷酸分子)和26个或更多个核苷酸的多核苷酸。本公开的方面包括包括以下的组合物：长度为18-25个核苷酸(例如，18聚体、19聚体、20聚体、21聚体、22聚体、23聚体、24聚体或25聚体)的寡核苷酸，或长度为26个或更多个核苷酸(例如，26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、约65、约70、约75、约80、约85、约90、约95、约100、约110、约120、约130、约140、约150、约160、约170、约180、约190、约200、约210、约220、约230、约240、约250、约260、约270、约280、约290或约300个核苷酸)的中等长度的多核苷酸，或长度大于约300个核苷酸的(例如，有以下长度的多核苷酸：约300至约400个核苷酸之间、约400至约500个核苷酸之间、约500至约600个核苷酸之间、约600至约700个核苷酸之间、约700至约800个核苷酸之间、约800至约900个核苷酸之间、约900至约1000个核苷酸之间、约300至约500个核苷酸之间、约300至约600个核苷酸之间、约300至约700个核苷酸之间、约300至约800个核苷酸之间、约300至约900个核苷酸之间、或约1000个核苷酸长度、或甚至大于约1000个核苷酸的长度)的长多核苷酸。在多核苷酸是双链的情况下，其长度可以类似地用碱基对来描述。
如本文所用，“体外转录”或“IVT”是指转录在体外在非细胞系统中发生以产生用于各种应用的合成的RNA分子(合成mRNA)的过程，该应用包括用于治疗递送至受试者。生成的合成RNA分子(转录产物)可以与递送媒介物组合。合成的转录产物包括mRNA、反义RNA分子、shRNA、环状RNA分子、核酶等。IVT反应可以使用纯化的包含启动子序列和感兴趣的开放阅读框序列的线性DNA模板、三磷酸核糖核苷酸或修饰的三磷酸核糖核苷酸、包括DTT和镁离子的缓冲系统以及合适的噬菌体RNA聚合酶。
“模板”或“双链DNA模板”是指分离的核酸序列，其包含插入的感兴趣的开放阅读框的体外转录所需的最小组分序列。
如本文所用、“流体贮库”可以指用于容纳流体的存储空间、并且可以包括小瓶、瓶子、袋子、管等。流体贮库可以包括作为整体部分的流体线(例如，离开流体贮库内的主体或腔室的过道或通道)。
如本文所用，流体动力包括气动和液压。为方便起见，术语气动可以包括液压，且这些术语可以互换使用。
如本文所用，“治疗性多核苷酸”是指可以是用于递送至受试者以治疗、预防、改善或以其他方式改变受试者健康的治疗性多核苷酸组合物的一部分的多核苷酸(例如、治疗性mRNA)。
如本文所用，“治疗性多核苷酸组合物”可指包括由可施用于受试者的递送媒介物包囊的一种或多种多核苷酸(例如，mRNA)的组合物。mRNA疫苗只是治疗性多核苷酸组合物的一个实例。
如本文所用，“不含细菌DNA”或指不存在细菌DNA。基本上不含细菌DNA的材料可以包括小于细菌DNA的0.1％、0.01％、小于0.001％等。如本文所用，“不含内毒素”是指不存在内毒素。“基本不含内毒素”是指内毒素小于0.1％、小于0.01％、小于0.001％等。
如本文所用，“连接”是指用于将一种组分与另一种组分偶联的如连接、合成、引物延伸、退火、重组或杂交的方法。
如本文所用，微流体路径装置或微流体路径板装置可以等同地称为芯片、盒、生物芯片、微流体路径板等，并且可以包括多个流体互连的腔室。这些腔室可分为流体接触侧和压力接收侧。压力接收侧可以是流体动力回路的一部分，而流体接触侧可以与外部大气隔离并且可以用于处理微流体路径装置中的材料。本文所述的微流体板路径装置通常可以是平坦的(例如，具有小于约4cm、小于约2cm、小于约1.5cm、小于约1cm等的厚度)并且可以包括用于与一个或多个压力线接口的多个压力端口，以驱动和/或控制微流体路径板装置中的流体动力回路。
如本文所用，“按需”旨在定义何时实施方法或服务，并且与预先存储、计划、订购或准备相反使用。
如本文所用，光学传感器通常是指光感测装置并且可以包括一个或多个成像装置。光学传感器可以包括单镜头、相机、立体相机、多镜头相机、数码相机、热像仪、CCD、光纤等。
如本文所用，“纯化”是指组分(例如，颗粒)与其他不想要的组分(例如，污染物质、碎片等)的物理和/或化学分离。
如本文所用，“密封的流体连通”和“密封和封闭的流体路径”都可以指材料(例如，含有材料的流体，如但不限于模板溶液、治疗性多核苷酸和/或治疗性多核苷酸组合物)与周围大气的分离。
如本文所用，“模板前体材料”是指形成模板所必需的材料(例如，DNA双链模板)，并且可以包括感兴趣的合成基因，以及作为一种或多种独立元件提供的体外转录促进子盒。
如本文所用，2D纯化是指在如本文所述的基本上平坦的微流体路径装置(例如，微流体路径板装置)内实施的纯化，并且可以包括使用多于一种类型的吸收性材料来去除材料(例如，双链RNA、未反应的核苷酸、未反应的加帽试剂、缓冲液组分等)等。
如mRNA治疗剂的治疗可用于多种治疗方式，包括疫苗接种、免疫疗法、蛋白质替代治疗、组织重塑/再生和通过基因编辑的遗传疾病治疗。除了高效力之外，mRNA治疗剂还具有与其快速开发周期、标准化制造、瞬时表达和低基因组整合风险相关的重要优势。
在一些变型中，本文所述的mRNA治疗剂可以包括作为最终药物产物中的活性成分的mRNA，其编码感兴趣的抗原或蛋白质。mRNA的稳健翻译需要功能性的5′帽结构。5′帽(或7-甲基鸟苷帽)由末端7-甲基鸟苷残基组成，该残基通过5'-5'-三磷酸键与第一个转录核苷酸相连。它的存在对于核糖体识别mRNA和针对RNA酶提供的保护至关重要。poly(A)尾通过结合poly(A)结合蛋白(PABP)与m7G帽协同调节mRNA稳定性和翻译起始，PABP与真核翻译起始因子eIF4G相互作用，进而与eIF4E形成复合物。poly(A)尾的长度可能会影响mRNA到蛋白质翻译过程的效率。
mRNA治疗剂可大致分为至少5类，用于：(i)蛋白质替代，(ii)疫苗，(iii)效应蛋白的表达，(iv)通过显性阴性蛋白的表达诱导功能丧失和(v)基因/基因组编辑。本文所述的方法和装置可以为这些类别中的任一个(或多于一个)提供mRNA治疗剂。
本文所述的方法和装置可以配制mRNA治疗剂以在循环期间提供mRNA货物的包装和保护，避免免疫识别，将药物产物定位在所需组织中，并促进细胞摄取和释放，而避免可限制重复给药的毒性或免疫原性问题。
一般而言，制造mRNA治疗剂(包括但不限于患者特异性T细胞淋巴瘤疫苗药物产物)的方法可涉及图1中示意性表示的任何或所有步骤，并且包括靶蛋白的鉴定和mRNA序列101的设计，为靶序列103制备双链DNA模板。该序列可用于生成用于体外转录(IVT)反应105的mRNA，以合成mRNA。然后可以纯化该治疗性mRNA以去除工艺杂质并过滤以生成药物物质107。然后可以用递送媒介物109配制治疗性mRNA(包括在一些变型中与佐剂和递送媒介物组分形成两亲性纳米颗粒)。然后可以对制剂进行加工和纯化以生成可用于递送给患者的药物产物111。如上所述，在一些变型中，这些步骤中的一些可以远程实施(例如，101-107)，一些本地实施(例如，109、111)；在一些变型中，它们可以全部(例如，103、105、107、109、111)在本地实施。
作为一种变型的具体实例，图1B显示了用于制造患者特异性T细胞淋巴瘤疫苗药物产物的示例性过程。在图1B中，该过程可以包括鉴定由淋巴瘤细胞121表达的克隆扩增的TCR序列(独特型)。该过程还可以包括设计mRNA疫苗序列123，以及制备用于IVT反应的双链DNA模板。该模板可用于IVT反应以合成mRNA 127，并且该治疗性mRNA可被纯化以去除工艺杂质并过滤以制备作为药物物质129的治疗性mRNA。然后可将治疗性mRNA与佐剂和递送媒介物组分一起配制以形成两亲性纳米颗粒131。然后可以实施配制后处理133以生成药物产物，如治疗性mRNA疫苗135。
可以优化这些制造步骤中的任一个以使用如本文所述的自动化微流体路径装置控制系统来实施。例如，DNA模板的生产可以在一个或多个微流体路径装置中进行；在图1B所示的实例中，可以使用模板微流体路径装置(例如，模板生物芯片)。在该相同实例中，mRNA的体外转录和该材料的纯化以生成药物物质的步骤可以在IVT微流体路径装置(例如，IVT生物芯片)上实施，并且药物产物配制步骤可以是在配制微流体路径装置(例如，配制生物芯片)上完成。这些微流体路径装置可以含有在制造过程中实施每个步骤所需的输入端口、计量阀、反应腔室和纯化结构。
装置
本文所述的方法通常可以使用可以与一个或多个微流体路径装置(例如，生物芯片)一起使用和/或可以包括一个或多个微流体路径装置(例如，生物芯片)的装置和配置为控制微流体路径装置中操作的系统(例如，微流体控制系统)来实施。这些装置在本文中可以称为微流体装置、微流体控制装置、微流体路径装置控制系统、微流体控制系统或微流体系统。微流体路径装置(也称为微流体路径板装置)可以放置在微流体控制系统内，并且可以以封闭路径方式操作，所述方式防止某些或更优选地几乎所有或所有的系统内的制造组件的组件部分暴露于大气。特别地，防止与系统内的流体接触的装置的部分暴露于大气。图2A显示了微流体路径装置控制系统的一个实例，其包括：微流体路径装置管理系统203(包括用于容纳微流体路径装置的硬件、施加正/负压以在微流体路径装置中操作微流体操作、加热/冷却整个微流体路径装置或微流体路径装置的区域，检测来自微流体路径装置的一个或多个特点和/或记录在一个或多个微流体路径装置上实施的操作)、控制器(未显示)和冷冻容器205(例如，ISO 5级柜)。该系统可以进行使用或可包括一个或多个微流体路径装置201。
微流体装置可以是用于形成治疗性多核苷酸(例如，mRNA治疗剂)的微流体装置。该装置可以包括：用于可移除地容纳微流体路径板装置的座架(seating mount)、多个压力线；多个流体小瓶，其中每个流体小瓶包括流体线或配置为与流体线偶联，其中每个流体线和压力线的至少一个子集配置为相对于保持在座架中的微流体路径板装置偏置以形成封闭的流体路径；和控制器，配置为控制通过压力线施加压力，以当微流体路径板装置保持在座架时在微流体路径板装置中驱动流体移动，其中控制器被配置为引导合成模板的合成，使用模板引导体外转录(IVT)反应以形成治疗性多核苷酸，并在一个或多个保持在座架中的微流体路径板装置中引导治疗性多核苷酸的纯化。
微流体装置(例如，用于形成治疗性多核苷酸，例如治疗性mRNA的微流体装置)可以包括：用于可移除地容纳微流体路径板装置的座架；多条压力线；多个流体小瓶，其中每个流体小瓶包括流体线或配置为与流体线偶联，其中每个流体线和压力线的至少一个子集配置为相对于保持在座架中的微流体路径板装置偏置以形成封闭的流体路径；以及控制器，其配置为通过压力线控制施加压力，以当微流体路径板装置保持在座架时驱动微流体路径板装置中的流体移动，其中控制器配置为确定流体小瓶的内容物，从流体小瓶转移亚微升量的材料到保持在座架上的微流体路径板装置中的一个或多个反应器，引导合成模板的合成，引导使用模板的体外转录(IVT)反应以形成治疗性多核苷酸，并在一个或多个保持在座架中的微流体路径装置中引导治疗性多核苷酸的纯化。
控制器可以配置以实施本文所述的方法中的任一种，特别是可以配置以接收输入(例如，光输入、压力输入、温度/热输入等)并处理输入以控制流体在微流体路径装置中的移动、微流体路径装置的各个区域的温度(包括热循环)、冲洗/组合、微流体装置的阀的打开/关闭、微流体装置的检测等。控制器可以包括一个或多个微处理器、通信回路、存储器等。控制器可以包含固件、硬件和/或软件。
这些装置中的任何一个都可以包括一个或多个(例如，多个)布置在座架和试剂存储框周围的光学传感器，以在微流体路径装置位于座架中时监测试剂存储框内的流体水平和微流体路径装置中的流体移动。或者/另外，光学传感器可以存在于装置的底部(例如，在座架下方)并且可以向上引导以检测流体量、移动等)。
所描述的方法和装置通常包括一个或多个流体动力回路以在流体腔室(贮库、流体接触侧、反应器等)和微流体路径装置的通道之间或在微流体路径装置内，并且在某些情况下，在微流体路径装置和装置内的流体贮库(小瓶、瓶子、容器等)之间移动材料(液体材料)。流体动力回路可以是液压或气动回路，其可以包括微流体装置，和特别是一个或多个压力通道和微流体装置中的腔室的压力接收侧。流体动力回路也可以称为微流体动力回路。单个微流控芯片可以包括多个流体动力回路；流体动力回路还可以包括一个或多个压力线以及微流体控制装置的压力线与微流体路径装置内的一个或多个微流体芯片之间的接口。一个或多个流体动力回路可以与其他重叠的流体动力回路共享组件(阀、压力线、真空盖等)。此外，为了同样的方便，应当理解，在使用术语“气动”的情况下，可以替代或另外使用通用流体动力回路(例如，液压和/或气动)。由流体动力线驱动的流体材料可以是任何合适的流体(例如，气体或液体，如空气、水、油等)。
本文还描述了用于在封闭路径中处理治疗性多核苷酸的微流体路径装置(例如，封闭路径微流体路径装置)。如所述，这些微流体路径装置在本文中可以被称为微流体芯片、微流体路径板、过程芯片、生物芯片、过程板等。通常，微流体路径装置可以是微流体路径板装置，其可以是基本上平坦的板样结构；这些结构可以相对薄(例如，小于几mm厚，例如0.5-20mm厚、0.5-15mm厚、0.5-10mm厚等)。本文所述的微流体路径装置通常可以是至少部分透明的，并且具体地，可以在微流体路径装置的顶部上是透明的，从而一个或多个光学传感器(相机、CCD、光纤等)可以用来感测、检测、监控、记录等动作，包括流体移动和/或弹性层的移动，其中本文所述的微流体装置原样使用微流体路径装置。
图2B是可以如本文所述使用的微流体路径装置控制系统的一种变型的示意图。在该实例中，该装置包括壳233，其包围着可容纳一个或多个微流体路径装置211的座架215，该微流体路径装置可以是一次性使用的装置。壳可以是腔室、壳体等，其可以包括盖或开口；关闭时它可以被密封。壳可以封闭热调节器和/或可以配置为封闭在热调节环境(如冷冻单元等)中。壳可以形成无菌屏障。在一些变型中，壳可以形成加湿或湿度控制的环境。
座架215可以配置为使用一个或多个销钉或配置为将微流体路径装置容纳在固定和预定方向的其他组件来拴牢微流体路径装置。
在一些变型中，热控制器213可位于座架215附近，以调节一个或多个微流体路径装置211的温度。热控制可包括热电组件(例如Peltier装置)和/或一个或多个用于控制所有或部分微流体路径装置的温度的散热器。在一些变型中，可以包括多于一种的热控制，用于分别地调节微流体路径装置的一个或多个区域的温度。热控制可包括一个或多个热传感器(例如，热电偶等)，其可用于微流体路径装置的反馈控制和/或热控制。
在图2B中，流体接口组件209将液体体试剂和/或压力(例如，气体)与保持在座架215中的微流体路径装置211偶联，并且可以帮助递送流体材料以及正/负气体压力，从压力源217到微流体路径装置211的内部。如下文更详细描述的，流体接口组件可以可选地帮助栓系微流体路径装置。流体接口组件可以可除去地偶联到装置(并且可以被移除或一部分可以被移除)用于在使用之间进行消毒。
试剂存储框207可以配置为含有多个流体样品保持器(holder)，每个样品保持器可以容纳流体小瓶，该流体小瓶配置为容纳试剂(例如，核苷酸、溶剂、水等)以递送到微流体装置211或或者，流体小瓶可以配置为接收来自微流体路径装置211内部的产物。试剂存储框可以称为试剂架。在一些变型中，试剂架包括多条压力线和/或歧管，其配置为将一个或多个压力源217分成多个压力线，这些压力线可以应用于微流体路径装置，且独立地或共同地(在子组合)被控制。或者，流体贮库(小瓶等)可以配置为直接拴牢和相对于微流体路径装置密封。
流体接口组件可以包括多条流体线和/或压力线，并且可以包括偏置的(例如，弹簧加载的)保持器或尖端，并且当其保持在座架215中(或如所述，可替代地该装置可以直接是弹簧安装的)时，单独和独立地驱动每个流体和/或压力线到微流体路径装置中。管道，例如流体线和/或压力线，可以是流体接口组件的一部分并且/或者可以连接到流体接口组件。在一些变型中，流体线包含柔性管，该柔性管经由将小瓶与管以锁定连接(例如，套圈)偶联的连接器和微流体路径装置连接在试剂存储框之间。流体路径的末端，在一些变型中，流体线/压力线的末端，可以配置为相对于微流体路径装置密封，例如，在微流体路径装置中形成的密封端口处，如本文所述。例如，流体线的末端可以切割或形成为平坦的(在侧视图中垂直的)。可以经由连接器对小瓶加压(例如，>1atm压力，如2atm、3atm、5atm等)，该连接器还可以连接到压力源。例如，流体小瓶可以加压到1-20psig之间(例如，5psig/20psia、10psig等)。可施加负压或正压；例如，在过程结束时，可以施加真空(例如，-7psig或7psia)以将流体抽回小瓶(例如，贮库)中。通常，流体小瓶可以在比气动阀低的压力下驱动，这可以防止或减少泄漏。在一些变型中，流体阀和气动阀之间的压力差可以在大约5psi之间(例如，大约7psi、10psi、12psi、15psi、20psi等)。
可以编码每个小瓶(例如，可以通过一个或多个传感器读取的标识符，如下所述)。控制器可以监测流体水平并因此监测流体接口组件中每种材料的量。
该装置还可以包括磁场施加器219，其可以配置为在微流体路径装置211的区域处创建磁场。可以作为光学传感器的一个或多个传感器205，可以是该装置的一部分，并且可以感测条形码、保持在试剂存储框内的流体小瓶内的流体水平和当装置安装在座架215内时微流体路径装置211内的流体移动中的一个或多个。
传感器可以例如通过测量光学指标来测量装置上的过程。在一些变型中，视觉/光学标记物可用于估计产量。例如，荧光可用于通过用荧光团添加标签来检测过程产量或残留材料。或者/另外，动态光散射可用于测量微流体路径装置的一部分(例如，如混合部分)内的粒度分布。在一些变型中，可以使用一根或两根光纤来完成传感器测量，以将光(例如，激光)传送进来并检测出来的光信号。仪器包可以远离装置安装。此类非接触式感测可以是优选的。
在本文所述的方法和装置的任一种中，传感器(例如，视频传感器)可以记录微流体路径装置(例如，芯片或盒)上的所有活动。例如，用于合成和/或处理材料(如治疗性RNA)的整个运行可以由一个或多个视频传感器记录，其包括可以例如从上方可视化微流体路径装置的视频传感器。在微流体路径装置上的处理可以在视觉上跟踪，并且可以保留该记录以用于以后的质量控制和/或处理。因此，可以保存、存储和/或传输处理的视频记录以供后续查看和/或分析。
该装置的内部部分，例如在壳233内，可以进一步配置为可消毒的。特别地，装置的部分可以取出并且单独地消毒。可以例如通过UV照射或限制污染或满足法规要求可能需要的任何其他消毒方法来实施消毒。包括壳的装置可以容纳在高效微粒空气(HEPA)过滤环境中。包括壳的装置可以容纳在温度受控的壳体内。此外，装置本身可以包括一个或多个温度受控的区域。在本文所述的装置的任一种中，该装置可以包括(例如，在壳内)温度受控区域，其用于存储试剂和/或用于存储mRNA(例如，治疗性mRNA)，例如，在存储温度(例如，温度在-10℃和20℃之间，如10℃、4℃、-10℃等)。这些装置中的任何一种可以包括制造的mRNA库，其可以单独或与一个或多个额外的mRNA和递送媒介物组合复合。
如上所述，微流体路径装置控制器系统可以由控制器221控制，其包括通过微流体路径装置211施加压力以至少驱动流体移动。控制器可以完全或部分在壳之外。控制器可以配置为包括用户输入/输出。例如，系统的用户接口223可以允许装置和微流体路径装置的简单操作和引导。
本文所述装置的任一种可以包括图2B所示的所有或一些组件；并非所有组件都是必需的。在图2B中，仅显示了组件之间的一些连接；可以使用额外(或替代)的连接。
微流体路径装置控制系统可以支持微流体路径装置内的所有生产活动，如试剂供应、流体控制、温度控制、混合、纯化和过程监控。可以通过应用软件访问和控制微流体路径装置控制系统上的制造活动。
微流体路径装置可以配置为包括一个或多个反应器，其用于制造步骤，实施该制造步骤以精确地制备治疗性(例如治疗性mRNA)材料。相同的微流体路径装置可以在一个或多个微流体路径装置上以串联和/或并联方式运行，并且不会中断微流体路径装置控制系统的连续路径性质。例如，当使用在使用多个微流体路径装置的多个反应器中实施的多个处理步骤来制造治疗剂时，流体产物(包括来自一个微流体路径装置的部分产物)可以通过装置以封闭路径方式转移到一个或多个额外的微流体路径装置中，其包括通过移动含有流体的微流体路径装置产物到微流体路径装置控制装置的存储贮库部分中。
每个微流体路径装置可以配置为包括一个或多个用于在制造过程中进行处理的反应器。例如，图3A-3C显示了微流体路径装置的三个实例。这些实例阐述了三种不同类型的微流体路径装置：模板微流体路径装置(图3A)、体外转录(IVT)微流体路径装置(图3B)和配制微流体路径装置(图3C)。这些微流体路径装置实例中的每一个可以配置为包括以受控和高度可再现的方式实施一组单元操作的特点。
在一些变型中，微流体路径装置可以配置为由两个更刚性的层组成的多层结构，其中柔性膜夹在两个脊状层之间。图4显示了穿过具有多个层的微流体路径装置的一个实例的截面图(横向于微流体路径装置的平面)，所述多个层形成用于处理如本文所述的治疗剂的反应器。反应器可以包括密封件、通道、阀和腔室，该腔室包括由多个层形成的泵送室。例如，微流体路径装置可以由两个或更多个刚性或半刚性的板403、405和至少一个弹性层407形成。弹性层407可以是不透液体的弹性材料片。弹性层可以稍微透气，或者可以处理为或多或少透气，其包括在各个区域。尽管可以使用单个连续的弹性材料片，但在一些变型中可以使用多个弹性材料片，或者“片”可以由多个片的部分形成。这些层和弹性片可以层压在一起。通常，用于容纳、阀调和/或泵送流体的腔室可以在弹性层任一侧的板中形成，使得弹性层将腔室分开为液体容纳侧和压力(例如，气体)施加侧。腔室的总体积可以是恒定的，并且可以形成为第一(例如，上)板和第二(例如，下)板，但是该体积可以分为压力侧和液体侧。通过向压力侧施加正压或负压，弹性片可以变形以减少(降至零，关闭腔室)液体容纳侧的体积或增加液体容纳侧的体积(至预定的最大值)。腔室的压力施加侧可以连接，例如，经由连接到压力通道447的上板403中的压力端口443，用于向一个或多个腔室的压力接收侧419施加负压或正压。与每个腔室的压力施加侧相对的液体容纳侧417可以经由流体通道421连接到流体端口423。流体端口和压力端口都可以由通向上板403和弹性层407的开口形成，允许与大气隔离的密封连接，即便当有多个不同输入线时当将压力线推入弹性层407中时，该弹性层407由相对的刚性或半刚性层405、409在端口的下侧支撑。
图4中，微流体路径装置400包括第一(例如，上)板403，其具有第一(例如，顶或上)表面411和第二(底或下)表面429以及两者之间的厚度。第一表面411可以形成暴露的外表面。微流体路径装置还包括第二板405，第二板405具有第一(例如，上或顶部)表面431和第二(例如，下或底)表面433以及它们之间的厚度。弹性层407夹在第一板403的第二表面429和第二板405的第一表面431之间。第三板409在第二板的第二表面433上直接或间接地偶联到第二板。第三板409还具有第一(例如，上或顶)表面和第二(下或底)表面以及它们之间的厚度。第三板的第二表面可以形成微流体路径装置的底表面。板的任一种可以由多层形成，这些层可以层压或以其他方式连接在一起。例如，在图4中第三板409包括可选的第二弹性层413，其可以帮助将第三板连接到第二板；本实例中的第二弹性层413形成第三板409的第一表面435。图4中显示的层和板可以不是按比例的(例如，弹性层407可以相对于板更薄)。
图4中显示的微流体路径装置400还可以包括多个腔室415、416、418、420，每个腔室具有固定的体积。这些腔室由第一板403的第二(底)表面429和第二板405的第一(上)表面431中的切口区域(例如，圆形/弯曲切口)形成；弹性层407将这些腔室415分叉，使得每个都包括液体容纳侧417和压力(例如，气体容纳)侧419。微流体路径装置400还可以包括多个液体(例如，流体)通道。在图4中，显示单个流体通道421，从通过第一板403的厚度的流体端口423延伸到流体通道开口425，所述流体通道开口425通过弹性层407和通过第二板405的大部分厚度向下到第二板的底表面433，在那里与第三板的底表面平行运行的液体通道421长度形成在第二板的底表面433中，并以第三板409的上表面为界。
关于流体端口423，进入形成流体端口423(其延伸穿过第一板的厚度)的第一板403中的开口的直径可以大于流体通道开口425的直径，其延伸穿过弹性层407并进入液体(例如，流体)通道421。流体通道开口425可以相对于流体端口开口的底居中，并且可以从流体端口开口的壁至少偏移将连接到流体端口的流体线或流体线偶联接口的预期壁厚。
流体通道421连接到第一腔室415的液体容纳侧417。该第一腔室可以配置为阀，其具有相对低的保持体积(固定体积)，但可以通过移动弹性层407来完全打开或关闭。
微流体路径装置400还包括多个压力通道，这些压力通道可以被独立控制以施加正压和/或负压。在图4中，显示了连接到第四腔室420的单个压力端口443，尽管腔室415、416、418中的每一个都可以连接到单独的压力端口和压力通道以独立地操作和控制将这些腔室分叉的弹性层407的部分的移动，以独立地阀调和/或泵送每个腔室。在一些变型中，压力端口可以在多个腔室之间共享。在图4中，压力(例如，气体)端口443类似于流体(例如，流体)端口425，并且包括完全穿过第一板403的开口，向下到暴露的弹性层407，通过弹性层到开口，形成压力(例如，气体)通道开口445。压力通道开口445与压力(例如，气体)通道447连续，该通道447从压力端口443延伸，穿过第一板403的大部分厚度，并且在沿着第二板的底的切口通道(或替代地进入第三板的顶部的切口区域)并通过第二板和弹性层407返回到第一板内压力通道的区域，该区域连接到第四腔室420的压力(例如气体)容纳部分419的第一板内。如对于类似的流体(例如液体)端口所述，穿过第一板403的厚度的压力端口443的直径可能大于通过弹性层407的压力通道开口445的直径，并且可以以大于将连接到压力端口的压力线或压力线偶联接口的壁厚居中或偏移。
在通过图4中所示的微流体路径装置400的截面中，存在与未显示的其他流体(例如，液体)线、流体端口、压力线和压力端口的多个连接，因为它们可能在所示平面之外。例如，在图4中，第四腔室的液体容纳侧或部分417可以连接到额外的阀(腔室)和/或通道，其包括例如从液体容纳侧417延伸的出口通道。可以如上所述形成额外的腔室(例如配置为阀)，未显示。在一些变型中，出口通道可以从一个或多个腔室通过另一个流体端口(未示出)递送流体到流体接收贮库，例如小瓶、管等。该接收贮库可以保持在试剂存储框中。
通常，微流体路径装置和微流体装置的这种配置被配置为使得多个复杂步骤可以由微流体路径装置上的装置以完全封闭(密封和保护免受大气影响)的方式执行，而无需人工干预。流体可以使用固定体积的腔室来计量并且通过施加气动压力来移动、混合、过滤等以偏转弹性层的区域。
在一些变型中，微流体路径装置内的腔室可配置为混合腔室，用于混合微流体路径装置内的流体。在一些变型中，腔室可配置成透析腔室，其可包括透析材料和用于透析流体内的材料的一个或多个逆流通道。在一些变型中，一个或多个腔室可以配置为用于浓缩治疗性材料的浓缩器。
尽管各种微流体路径装置可能具有不同的通道、端口和腔室布置，但它们也可以共享相似的基本构造和许多可用于不同配置以执行不同协议的功能元件。如上所述，功能元件包括输入端口、计量阀、泵、反应腔室、混合结构和纯化结构。
这些微流体路径装置中的任一个可以包括一个或多个泡去除腔室，或者该腔室的流体接触侧的任何腔室可以配置为泡去除腔室，其中流体容纳侧的泡可以被除去。泡去除腔室可称为真空盖，并且通常可配置成在膜的对侧上施加负压，而将流体保持在腔室的流体接触侧内。如所述，该膜可以是至少部分透气的。图19显示了泡去除腔室的实例。划分腔室的膜的全部，或更优选地一部分1988(例如，仅仅盖区域)可以通过例如在装置的上表面或上板中的真空管线1987与真空接触，如图19C所示。在操作中，真空盖1938可以通过将流体容纳在腔室的流体接触侧内并在腔室的上(压力接收)侧施加负压来去除或减少管线内的泡。将腔室划分为流体接触侧和压力接收侧的膜可以是透气的，使得负压可以通过覆盖在流体路径上的膜吸入气体(例如，空气、氮气等)而从液体(流体)侧去除气体。例如，膜(或真空盖中的膜区域可以是，例如聚二甲基硅氧烷(PDMS)弹性体膜，其具有足够的透气性以允许从膜的液体侧去除气体。如本文所述，具有固定体积的流体腔室(例如，在第一板和第二板之间形成的)可以包括或偶联到一个或多个泡去除腔室(真空盖)和/或可以配置为泡去除腔室。在一些变型中，设置在形成腔室的第一和第二表面之间弹性层的部分可以仅最小地(或根本不)偏转，该部分分开流体接触侧，例如，在第二表面(和/或第二板)中和在第一表面(和/或第一板)中的压力接收侧。例如，上压力接收侧可以最小地间隔，和/或几乎与松弛的膜齐平(例如，平坦)，而流体接触侧是凹的并延伸到第二表面(第二板)。控制器可以将流体容纳在真空盖区域内，例如，通过在真空盖的任一侧或两侧(入口和出口)上阻塞阀，例如，通过向阀的压力接收侧施加正压，并且可以向真空盖的压力接收侧施加负压。施加的负压的绝对量(例如，负压的量值)可以小于施加以偏转膜的量(例如，小于施加以关闭阀和/或泵的正压的绝对值)。或者，在一些变型中，膜可配置为被偏转(例如，向上偏转)，相对于第一表面和/或板，例如，以将流体吸入腔室的扩大的流体接触侧。膜可以通过相对于第一上表面施加的负压保持，从而允许去除气体泡(gas bubbles)(例如，空气泡(airbubbles))。控制器可以将流体在真空腔室中保持足以去除所有或一些气体的时段(例如，1秒或更长、5秒或更长、10秒或更长、20秒或更长、30秒或更长、1分钟或更长、1.5分钟或更长、2分钟或更长、5分钟或更长、1秒至5分钟之间、2秒至5分钟之间、5秒至5分钟之间等)。在图9C中，压力可以通过与形成在装置的第一和第二表面(例如，第一和第二板)之间的腔室的压力接收侧连通的压力线987来施加。真空盖938可以由一个或多个阀992阀调。流体可以从真空盖的相对侧的流体线989离开流体接触侧。
压力盖的腔室的流体接触侧(如本文所述的阀和反应器一样)可以与流体端口流体连通，该流体端口经由一种或多种流体通道与每个腔室的流体接触侧流体连接，所述流体通道可以在第二表面和/或板中。如本文所述，真空盖的压力接收侧可以与延伸通过第一表面/板(例如，并进入表面/板中)的压力端口流体连通，以经由压力通道与压力接收端口或压力接收侧流体连接，该压力通道延伸通过第二板并沿着第一板延伸。
如上所述，本文所述的微流体路径装置中的任一个可以是微流体路径板装置，其中装置基本上是薄的。因此，板中/板上的处理可以基本上在二维(2D)中实施，其包括任何多核苷酸(例如，mRNA)的纯化。与现有技术相比，2D中多核苷酸的纯化是特别有利的，所述现有技术可能需要使用柱并且可能涉及在封闭路径环境和/或小体积中难以或不可能实施的步骤，如本文所述的。
此外，如图4所显示，每个腔室的流体接触侧(和/或压力接收侧)可以配置为使得在压力接收侧中的正压相对于流体接触侧驱动弹性层时，弹性层与第二表面中的流体接触侧齐平且无间隙地落座。在一些变型中，流体接触侧和/或压力接收侧可以是凹的。凹面可以具有稍微浅的、椭圆形横截面，以允许弹性层容易地相对于流体接触侧(和/或压力接收侧)的壁齐平坐落。弹性层可以推抵腔室的壁(例如，相对于该壁坐落)，使得不存在(例如，流体接触侧的)腔室的死保留部分。
微流体路径装置可以通过一组用于两种试剂的弹簧加载连接以及用于管理流体移动和阀控制的气动线与微流体路径装置控制系统形成接口。试剂和气体线可以通过相对于嵌入微流体路径装置中的弹性体层的压力来密封，所述弹性体层创建从试剂小瓶到微流体路径装置和从微流体路径装置到输出小瓶的完全密封的路径。密封路径可以通过在微流体路径装置内的所有反应来保持，有效地排除与大气的任何接触并最小化污染风险。
本文所述的微流体路径装置控制系统可以提供无菌受控环境，并且可以包括用于加载试剂和取回输出的接口。在本文所述的装置(例如，系统)的任一种中，该装置可以包括提供受控环境的壳体；该壳体也可以放置在受控环境内。例如，封闭装置可以是可以放置在7类环境内的5类环境。
微流体路径装置的微流体路径装置控制系统可以提供与所有致动器的单步连接。这些控制系统还可以扫描所有试剂和微流体路径装置标识符(例如，条形码)，并且可以监测流体水平。通常，这些微流体路径装置控制系统可以使所有或一些微流体路径装置功能自动化，并且可以生成所有可以被监控(如用于光学质量控制分析，例如中间过程输出的)、存储、传输或稍后查看的过程步骤的可视记录。
如上所述，微流体路径装置控制系统可以包括微流体路径装置管理系统，该系统包括硬件，如可以工程化改造为使得微流体路径装置正确对齐的嵌套(微流体路径装置保持器)只能以单个方向插入。这可以例如通过嵌套中的与微流体路径装置的形状匹配的两个销钉和/或凹槽来管理。微流体路径装置管理系统(控制系统)还包括用于容纳试剂和输出小瓶的小瓶架、记录所有液体和阀移动的下视相机以及产物输出。导轨上的侧面相机可捕获条形码并检测流体水平，以及带有磁铁的机械臂用于珠操作。微流体路径装置用真空吸盘保持就位，所述真空吸盘确保与Peltier装置良好接触以进行温度管理。一旦微流体路径装置就位，通过定位销引导系统降低微流体路径装置管理系统的顶部部分，以单步实现与所有连接器的配合。
如所述，微流体路径装置控制系统可以包括控制面板，该控制面板可以是所有电子装置(CPU、以太网RIO装置控制器等)以及用于气动控制的阀和歧管以及压力调节器的接口。这些系统中的任一个还可以包括冷冻柜或腔室(例如，ISO 5级安全柜)，其行为类似于生物安全罩，通过HEPA空气过滤和气流管理提供微生物安全壳体。此外，这可以确保所有试剂在整个制造过程中都保持在正确的温度下。柜还可以配备UV灯以对微流体路径装置和所有内部微流体路径装置管理系统组件消毒。微流体路径装置控制系统可以驻留在自身位于ISO 7级房间中的环境(例如，6ft x 6ft ISO 5级微环境)内。操作员和系统交互(其包括加载试剂小瓶和微流体路径装置)都可以按照无菌最佳实践实施。
递送媒介物
本文所述的方法和装置与一大批mRNA递送媒介物相容。例如，递送媒介物可与以下相容：电穿孔和基因枪、通过腺病毒(AV)或腺相关病毒(AAV)的病毒递送、外泌体和脂质体、阳离子聚合物包囊和用脂质纳米颗粒(LNP)配制。
治疗剂的制造
本文描述了用于制备治疗剂的方法和装置(例如，装置和系统)。这些方法和装置可用于在非常快的时间段内制造患者特异性治疗剂。特别地，这些方法和装置可用于制造基于多核苷酸的治疗剂，如mRNA，如上所述的。作为该过程的一部分，该方法和装置可以实施一些或所有上述步骤，包括产生IVT DNA模板、实施IVT反应以产生治疗性mRNA、纯化治疗性mRNA、用递送媒介物配制mRNA以形成治疗性组合物和最终药物产物的配制后加工。
产生IVT模板
本文所述的制备DNA模板，特别是制备合成的DNA模板的方法对于制备更好、更可扩展、更快和更安全的疫苗和治疗剂可能特别有用。通过IVT使用合成的模板合成mRNA在许多方面都是有益的，其包括防止潜在的微生物污染。含有合成DNA模板的溶液通常不含污染细胞、不含细胞提取物和来自细胞的内毒素。这些溶液可能特别适合作为疫苗的一部分，用于注射到患者体内，几乎不会因污染细胞、细胞提取物或内毒素而产生毒性风险。
在一些变型中，如本文所述的体外转录促进子盒(IFC)是能够体外转录的双链DNA。图6显示了用于制备双链DNA模板的体外转录促进子盒的实例。体外转录促进子盒包括配置为促进有效体外转录(例如，从插入的感兴趣基因)的功能元件，如启动子、编码5'非翻译区的部分、(5'UTR)、编码3'非翻译区(3'UTR)的部分和编码polyA尾的部分。体外转录促进子盒还包括一个或多个接头和确保模板线性化的限制性位点，所述接头可用于将感兴趣的基因克隆到体外转录促进子盒中以表达感兴趣的基因。
体外转录促进子盒可以合成或非合成地制造，但一般将合成地制造。在一些变型中，制造合成的体外转录促进子盒的方法包括使用可商购的DNA合成仪，如可从TwistBioscience(San Francisco,CA)或ThermoFisher Scientific(Waltham,MA)获得的那些。进一步，体外转录促进子盒可以由单独的DNA片段组装而成，或者其可以合成为一个片段。在一些实施方案中，体外转录促进子盒是线性的并且可以包括可以连接在一起的可相容末端。在一些实施方案中，体外转录促进子盒是环状的。在一些实施方案中，环状体外转录促进子盒包括在编码polyA区的部分和启动子之间的位点(例如，限制性核酸内切酶位点)，该启动子配置用于生成线性DNA，其依次含有启动子、5'UTR、接头区、3'UTR和在应用适当的限制性核酸内切酶时编码polyA区的部分。通常，体外转录促进子盒不编码抗生素抗性基因。例如，合成地合成的体外转录促进子盒不需要抗生素抗性基因，因为它不是在生物(例如细菌)细胞中生长并且不需要抗生素选择。通常，体外转录促进子盒不具有复制起点(ori)或用于促进DNA复制的相关控制元件。例如，合成地合成的体外转录促进子盒不需要ori，因为它不在生物(例如细菌)细胞中生长并且不需要用于复制的ori。体外转录促进子盒的总长度可以小于许多质粒。体外转录促进子盒的长度可以小于2kb、长度小于1.5kb、长度小于1.0kb、长度小于900bp、长度小于800bp、长度小于700bp或长度小于600bp。
如上所示，体外转录促进子盒包括启动子。酶RNA聚合酶与启动子结合并启动自感兴趣基因的RNA的转录(例如，在从盒和感兴趣基因组装双链DNA模板之后)。可用于盒中转录的启动子的实例包括天然或修饰的T7启动子、天然或修饰的T3启动子、或天然或修饰的SP6启动子。
体外转录促进子盒还包括编码可交换5'非翻译区(5'UTR)的部分和编码可交换3'非翻译区(3'UTR)的部分。这些区域(其自身不会被翻译成蛋白质或肽)帮助调节mRNA翻译成蛋白质或肽。体外转录促进子盒还包括编码polyA尾的部分。mRNA中的polyA尾是数十或数百个重复的腺嘌呤残基的长链。认为mRNA上的polyA尾发挥多种功能，如增加mRNA在细胞质中的稳定性和帮助将mRNA翻译成蛋白质。不同于由mRNA中的模板中的DNA直接编码的其余的mRNA序列，polyA尾通常不由DNA直接编码(例如，在自然界中)。相反，天然存在的DNA含有速记信号，称为多聚腺苷酸化信号(例如，AATAAA)，它与其他DNA序列一起向细胞中的转录机器发出信号，以向正在合成的mRNA添加polyA尾。换言之，天然存在的mRNA中polyA尾的长度由制备mRNA的细胞决定。如图6所见，如本文所述的体外转录促进子盒包括直接编码polyA尾(例如，整个尾)的DNA区域。polyA尾的长度由直接编码polyA尾的DNA区域中的长度(例如，腺嘌呤或polyA的数量或胸苷或polyT的数量)决定。直接编码polyA尾的DNA区域可以是至少100bp长、至少200bp长、至少300bp长、至少400bp长或至少500bp长，并且可以是介于这些之间的任何大小(如350个碱基对长)。可以使用与用于生成其余mRNA相同的过程将polyA尾添加到使用盒作为模板制备的mRNA中。这样的一个优点是大大简化了生成整个mRNA，包括polyA尾的过程。为了生成mRNA，不需要活细胞和来自含有细胞DNA、细胞RNA、细胞膜蛋白和其他组分的细胞的复合提取物。相反，明确定义的转录混合物可用于从本文所述的双链DNA模板生成整个mRNA，包括polyA尾，从而使转录混合物通常不含在使用细胞或细胞提取物制备的转录混合物中可能存在的毒性副产物。明确定义的混合物可以安全地递送给患者，只需进行最少的清理。当双链DNA模板也由基本不含毒性副产物的明确定义的混合物生成时，由双链DNA模板制备的转录产物适合直接注射到患者体内，其只需进行最少的清理。本文描述了双链DNA模板，它由基本不含毒性副产物的明确定义的混合物生成。
体外转录促进子盒还包括一个或多个接头区。接头区在5’UTR和3’UTR之间。接头区包括至少一个可切割位点和通常两个可切割位点。如果存在两个或更多个可切割位点，则它们可以具有相同的序列或不同的序列。一个或多个可切割的限制性位点可用于将感兴趣的基因(GOI)插入外转录促进子盒以生成合成的线性或环状连接产物。感兴趣的基因通常插入在外转录促进子盒中的5'UTR和3'UTR之间，尽管在一些情况下，可以包括5'UTR或3'UTR序列和感兴趣的基因，并与感兴趣的基因一起插入体外转录促进子盒。可切割位点可以是限制性内切酶位点，如II型(IIG型、IIS型)限制性内切酶，如BsaI、BbsI、AarI、HhaI、HindIII、NotI、BbvCI、EcoRI、BglII、FokI、AlwI、AcuI或BcgI，其可从New England BiolabsNew England Biolabs(NEB；Ipswich,MA))；Promega Corporation(Madison,WI)；或ThermoFisher Scientific(Waltham,MA)获得。
如本文所述，感兴趣的基因(GOI)是短的DNA段，其通常编码功能性产物分子(RNA或蛋白质)。感兴趣的基因可以编码特定的蛋白质、蛋白质的一部分或特定的功能。在一些情况下，它可以含有生成不编码特定蛋白质或蛋白质部分的RNA的指令(例如，它可以编码不被翻译的功能性RNA)。
可用于插入到体外转录促进子盒的感兴趣基因可以合成或非合成制造，但一般将合成地制造。制造感兴趣的合成基因的方法包括通过使用可商购的DNA合成仪和方法，如可从Twist Bioscience(San Francisco,CA)或ThermoFisher Scientific(Waltham,MA)获得的那些。进一步，虽然感兴趣的基因可以由单独的DNA片段组装而成，但通常它是作为一个片段合成的。感兴趣的基因可以制造为DNA的线性片段或环形片段。可以用限制性内切酶消化感兴趣的环状基因以形成感兴趣的线性化基因。可以纯化制造的感兴趣基因(例如，通过柱、电泳分离等)。
感兴趣的基因通常在将它与体外转录促进子盒组合之前进行切割。特别地，感兴趣的基因可以用与用于切割体外转录促进子盒相同的限制性核酸内切酶切割，但也可以通过酶促扩增生成。通常，感兴趣的基因不编码抗生素抗性基因。例如，合成地合成的感兴趣的基因不需要抗生素抗性基因，因为它不在生物(例如细菌)细胞中生长并且不需要抗生素选择。通常，感兴趣的基因不具有复制起点(ori)或用于促进DNA复制的相关控制元件。例如，合成地合成的感兴趣的基因不需要ori，因为它不在生物(例如细菌)细胞中生长，并且不需要用于复制的ori。在一些实施方案中，感兴趣基因的总长度可以小于许多质粒。感兴趣的基因长度可以小于2kb、长度小于1.5kb、长度小于1.0kb、长度小于900bp、长度小于800bp、长度小于700bp或长度小于600bp、长度小于500bp、长度小于400bp或长度小于300bp、长度小于200bp、长度小于100bp。
在一些实例中，感兴趣的基因是T细胞受体(TCR)或T细胞受体的一部分，如用于治疗由T细胞受体(TCR)或T细胞受体的一部分介导的CTCL或其他疾病或病况。例如，在T细胞发育中，细胞必须重排T细胞受体(TCR)基因以创建和表达新的TCR分子。因为TCR重排发生在T细胞发育早期并且在成熟T细胞淋巴瘤(如CTCL)发展之前，所以每个恶性CTCL细胞表达相同的克隆TCR，其由独特的TCR特和TCR特亚基组成。这种TCR对淋巴瘤细胞是独特的，使得它对免疫系统而言在其他方面是外来的，因此是治疗的优异靶物。
感兴趣的基因可以是互补决定区(CDR)区域的部分或全部。CDR是TCR序列的高度可变部分，并介导T细胞与抗原主要组织相容性复合体(MHC)的结合。图8显示用于制备用于疫苗或治疗剂的双链DNA的T细胞受体的一个区域。特别是，跨越V(D)J和C区域之间连接点的CDR3区域具有最高的可变性，并且代表了真正独特的蛋白质片段，该蛋白质片段应当只在淋巴瘤细胞中发现。因此，CDR3区域在C和N端都延长了10个氨基酸，构成疫苗肽片段。在一些方法中，基因的独特序列，如T细胞受体(TCR)或T细胞受体的一部分，是从个体中确定的，并且感兴趣的基因制造为与T细胞受体(TCR)或来自个体的T细胞受体的一部分。尽管在某些情况下，可以以特定的已知方式对序列进行可控改变，如为了密码子优化或优化RNA稳定性或表达，但感兴趣基因的序列仍然基于从个体获得的序列。在一些实施方案中，感兴趣基因的序列包含具有与来自患者的DNA序列相同的DNA序列或相对于来自患者的DNA序列以已知方式可控改变的T细胞受体。
本文描述了制备双链DNA模板的方法，特别是制备合成双链DNA模板的方法。双链DNA模板可特别用于实施体外转录以生成mRNA，如用于疫苗或其他治疗剂以用于注射或向患者递送的其他模式。
用于实施体外转录的现有DNA模板和用于实施体外转录的混合物通常包括粗或半纯化的细胞提取物(例如，细菌、其他微生物或其他提取物)，并且可能是复杂的和不确定的。此类提取物可以包括细菌、其他微生物或其他DNA、内毒素和/或其他不希望的组分。当用于生成DNA模板或作为疫苗或治疗用途过程的一部分实施体外转录时，不希望的组分会增加严重副作用的风险。例如，内毒素是革兰氏阴性菌外细胞壁中的大分子脂多糖，是生成用于体外转录反应的细胞提取物的常用来源。血液中的内毒素，如注射，会导致人类和其他动物中放入各种问题，如炎症和败血症，并带来严重的健康风险。本文所述的方法对于制备不含生物污染物(细菌、其他微生物或其他污染物)、不含细菌(或其他微生物或不需要的)DNA和/或不含内毒素的双链DNA模板可能特别有用。本文所述的方法可以包括使用定义的或合成的组分来制备感兴趣的基因、制备体外转录促进子盒和/或制备双链DNA模板(或制备用于制备这些材料的任何中间体)。定义的或合成的组分可以由定义的或合成的成分制成，如DNA合成器、纯化的核苷酸和纯化的酶。定义的或合成的组分可以基本上不含细菌、其他微生物或其他DNA、内毒素和/或其他不希望的组分。通过避免使用基于生物的组分、生物污染物，如DNA和内毒素，首先不会污染DNA模板(或其他组分)。双链DNA模板和下游材料更安全，无需困难或麻烦的纯化步骤。本文的这种方法和其他方法可以包括将感兴趣的合成基因与合成的体外转录促进子盒连接以生成合成的线性或环状连接产物的步骤；去除未反应的感兴趣的合成基因和未反应的合成的体外转录促进子盒；扩增环状连接产物以生成线性、环状或分支的扩增DNA；线性化扩增的DNA连接产物以生成双链DNA模板。
如上所述，连接感兴趣的基因与体外转录促进子盒以创建合成的线性或环状连接产物可以包括将感兴趣的基因插入到体外转录促进子盒中。图7显示了如本文所述生成的双链DNA模板。感兴趣的基因和体外转录促进子盒可以具有与本文别处描述的相同的限制性核酸内切酶位点，并且该方法可以包括用限制性核酸内切酶位点的限制性核酸内切酶消化感兴趣的基因和体外转录促进子盒，创建相容的末端，并将感兴趣的基因连接到盒中。该方法可以包括将感兴趣的基因、体外转录促进子盒、限制性核酸内切酶缓冲液、能量源、一种或多种限制性核酸内切酶、连接酶缓冲液和连接酶组合，并将混合物温育适当的时间量。缓冲液可以适用于或优化用于特定限制性核酸内切酶和/或连接酶，并且可以是一种缓冲液或可以是两种(或更多)缓冲液。核酸内切酶和/或连接酶缓冲液可以是商业可获得缓冲液(例如，NEB、Promega)和/或可以包括Tris、钾、镁、氯化钠和二硫苏糖醇，如Tris-乙酸盐(例如，6mM-90mM)、乙酸钾盐(50mM-100mM)、乙酸镁(5mM-10mM)、牛血清白蛋白(BSA；50ug/ml-200ug/ml)二硫苏糖醇(1mM)，pH约为7.4至约9.0。连接酶可以是可商购的(例如，NEB、Promega、Thermo Fisher Scientific)或其他连接酶，如T3 DNA连接酶、T4 DNA连接酶或T7DNA连接酶。消化可以发生在10分钟到4小时或之间的任何时间量(例如，30分钟、1小时、2小时等)。连接步骤可以发生在10分钟到4小时或之间的任何时间量(例如，30分钟、1小时、2小时等)。消化和连接步骤可以同时或依次实施。能量来源可以是腺苷5'-三磷酸(ATP)(例如，从0.1mM到5mM)。随着时间的推移，可以添加额外量的任何组分，如限制性核酸内切酶和连接酶，并且温育可以继续。在一些实施方案中，只有经证明无动物源(AOF)的材料将用于治疗性制造，以降低传播感染因子的风险。其中体外转录促进子盒不是环状的这些方法中的一些包括连接体外转录促进子盒的末端并生成环状体外转录促进子盒的步骤。或者，可以使用用于连接感兴趣的基因和体外转录促进子盒的其他方法，如回嚼方法(chew backmethod)。或者/另外，体外转录促进子盒和感兴趣的基因之间的连接可以使用引物延伸来实施以在指数扩增方法之前生成线性分子。
本文所述的这种或其他方法可以包括以下步骤：从合成的线性或环状连接产物中去除未反应的感兴趣的合成基因和未反应的合成的体外转录促进子盒或从未反应的感兴趣的合成基因中和未反应的合成的体外转录促进子中纯化双链DNA。可以在适当的核酸外切酶缓冲液(NEB；Promega,Thermo Fisher)中使用如核酸外切酶(如核酸外切酶V)的酶从合成的循环连接产物中去除未反应的感兴趣的合成基因和未反应的合成体外转录促进子盒。该方法可以包括消化感兴趣的合成基因和未反应的合成的体外转录促进子。该方法还包括使消化的混合物穿过树脂或柱，如离子交换树脂或大小排阻树脂，并且将未反应的感兴趣的合成基因和未反应的合成体外转录促进子盒容纳在柱中或将双链DNA模板容纳在柱种，并允许双链DNA模板或未反应的感兴趣的合成基因和未反应的合成的体外转录促进子盒穿过树脂或柱。一些实施方案还可包括将消化的核苷酸容纳在树脂或柱内或允许消化的核苷酸穿过树脂或柱。一些实施方案包括洗涤和/或洗脱树脂或柱。一些实施方案还可以包括将消化的核苷酸容纳在树脂或柱内。一些实施方案包括将未反应的感兴趣的合成基因和未反应的合成的体外转录促进子盒结合到珠上或将双链DNA结合到珠上，用磁铁固定珠并去除双链DNA或未反应的感兴趣的合成基因和来自双链DNA的未反应的合成的体外转录促进子盒。树脂、柱和磁珠可从Bangs Laboratories,Inc.(Fisher,IN)、Beckman Coulter(Brea,CA)、Millipore(Burlington MA)、Thermo Fisher,VWR(Radnor,PA)等获得。一些实施方案可以包括甲基化敏感性限制酶的用途。
本文所述的这种方法和其他方法可以包括扩增线性或环状连接产物以生成扩增的DNA。一些方法包括扩增线性或环状连接产物以生成线性扩增DNA。一些方法包括扩增线性或环状连接产物以生成线性、分支或环状扩增的DNA。扩增产物可使用以下进行扩增：解旋酶依赖性扩增(HAD)、环介导等温扩增(LAMP)、多重置换扩增(MDA)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、聚合酶链式反应(PCR)、滚环扩增(RCA)、自持序列复制(3SR)或链置换扩增(SDA)。根据需要添加适当的缓冲液、脱氧核糖核苷酸三磷酸(dNTP)、酶(DNA聚合酶)和用于反应的引物。扩增的温度和时间被控制。该方法可以包括加热线性或环状连接产物(例如，在或高于70℃至100℃)以使DNA变性然后冷却DNA的步骤。该方法可以包括将配置用于使DNA变性的变性缓冲液添加到线性或环状连接产物中以使DNA变性，然后将中和缓冲液添加到变性DNA混合物中以中和变性缓冲液并留下变性DNA的步骤。该方法可以包括添加用于扩增或延伸变性DNA的酶，如DNA聚合酶(例如，Bst DNA聚合酶、Φ29DNA(Phi29)聚合酶、Taq DNA聚合酶)和用该酶扩增或延伸DNA以生成扩增的DNA(例如，分支的、环状的或线性的扩增DNA)的步骤。
一些方法包括从缓冲液、酶、核苷酸和其他不需要的组分中纯化扩增或延伸的DNA的步骤。该方法可以包括使扩增或延伸的DNA穿过珠、树脂或柱，如离子交换树脂、磁珠或大小排阻树脂，并且容纳扩增或延伸的DNA或允许扩增或延伸的DNA穿过珠、树脂或柱并将不需要的酶和其他组分容纳在珠、树脂或柱中。一些实施方案包括洗涤和/或洗脱和/或干燥和/或再水合树脂或柱。一些实施方案包括重复这些步骤中的一个或多个。一些实施方案包括两个或多个(多个)珠、树脂或柱的贮库，并重复一个或多个洗涤/洗脱/干燥/和/或再水合步骤。一些实施方案包括将DNA结合到珠上，用磁体固定珠并从DNA和珠上去除(洗涤)不需要的组分和污染物。适用的树脂、柱和磁珠可从Bangs Laboratories,Inc.(Fisher,IN)、Beckman Coulter(Brea,CA)、Millipore(Burlington MA)、Thermo Fisher和VWR(Radnor,PA)获得。
在一些实施方案中，扩增的DNA不是线性的；它可以是分支的或环形的。一些方法包括线性化DNA和生成线性化模板DNA的步骤。一些方法可能包括以下步骤：将限制性核酸内切酶(在适当的缓冲液中)添加到纯化的扩增或延伸的DNA中、将DNA与限制性核酸内切酶一起温育以及将DNA线性化。限制性酶被选择来切割5'UTR、感兴趣的基因、3'UTR和编码polyA区域的部分的外面。在一些实施方案中，限制性内切酶在一个延伸或扩增的DNA的3'UTR和相邻的(和下游)延伸或扩增的DNA的5'UTR之间切割。如上文所示，关于限制性酶消化用于结合感兴趣的合成基因和结合的体外转录促进子盒以创建合成的线性或环状连接产物时，限制性酶可以是任何限制性酶，如IIs型限制性酶。在一些实例中，限制酶是BsaI、BbsI、AarI、HhaI、HindIII、NotI、BbvCI、EcoRI、BglII、FokI、AlwI、AcuI或BcgI中的至少一种，其可从New England Biolabs(NEB；Ipswich,MA)；Promega Corporation(Madison,WI)；或ThermoFisher Scientific(Waltham,MA)获得。在一些实施方案中，限制性核酸内切酶与用于将感兴趣的合成基因插入体外转录促进子盒中的限制性核酸内切酶相同。在一些实施方案中，限制性内切酶与用于将感兴趣的合成基因插入体外转录促进子盒中的限制性核酸内切酶不同。本文还描述了用于制备如本文所述的双链DNA的微流体路径装置反应器。
图9显示了用于生成双链DNA的微流体生物芯片反应器的构造的一种变型的实例。本文所述的这种方法和其他方法可以包括在无菌封闭的生物芯片中从感兴趣的基因和体外转录促进子盒生成双链DNA，其中所有组分在生成过程中都保持无菌。无菌、封闭的生物芯片对大气封闭。图9显示了具有4个互连反应器(例如，模块或腔室)的微流体生物芯片反应器，通过这些反应器，在不同阶段的DNA前体沿着成为双链DNA模板的途径移动。例如，在图9中，可以包括连接反应器(连接反应腔室901)、预混合腔室903、扩增反应器(扩增反应腔室905)和消化反应器(消化反应腔室)907(连接器和阀在该实例中未显示。本文所述方法的不同步骤在不同的模块或腔室中进行。感兴趣的基因和体外转录促进子盒在预混合腔室中混合在一起。感兴趣的基因和体外转录促进子盒连接在一起以在连接反应腔室中生成连接产物。在扩增室中扩增连接的产物以生成扩增的DNA。进一步处理扩增的DNA，如在消化反应腔室中消化以去除不需要的DNA或分离感兴趣的扩增的基因的不同拷贝。
IVT反应
该过程的下一步可以是产生mRNA的IVT反应。此过程可以在相同或不同的微流体路径装置(例如，在IVT微流体路径装置的一些变型中)内进行，所述微流体路径装置可以容纳在如前所述的微流体路径装置控制系统中。阐明IVT微流体路径装置内的主要步骤和子隔室的高水平mRNA制造过程在图11中进行了描述。
IVT反应可以涉及将DNA模板与T7聚合酶、核苷酸和加帽试剂组合，并在受控条件下温育该反应以产生加帽mRNA分子。IVT反应可以在微流体路径装置(例如，IVT微流体路径装置)的反应腔室内发生，并且处理参数(如温度)、混合和试剂添加(在反应开始时和整个反应过程中)可以控制到优化水平。如上所述，该过程可以由控制器驱动。缓冲液和溶液可以经由微阀阵列递送，并且可以使用预设程序控制体积，该程序可以对每种mRNA药物物质优化的方案是特定的。
在IVT反应之后，可以实施DNA酶处理以降解模板DNA。该步骤可以在IVT反应腔室(IVT反应器的一部分)内实施，并且参数(如稀释率、酶/缓冲液浓度、温度)和混合可以控制到优化水平。该过程可以自主执行并由监控相机记录。
IVT纯化
可以纯化DNA酶处理的mRNA以去除杂质和副产物。特别地，降解的模板、任何未反应的核苷酸、酶(T7聚合酶和DNA酶)和dsRNA影响药物物质的质量和免疫原性。对于纯化，可以使用两步固相可逆固定程序，使用有不同表面化学的支持物。第一步可以涉及使用纤维素膜在精确控制的结合条件下选择性地捕获dsRNA，并将未结合的部分洗脱到第二个纯化腔室中。第二纯化步骤可以使用1-2μm的羧基包被的顺磁珠，该磁珠选择性地捕获长度大于500bp的mRNA。然后可以实施多次洗涤以去除未结合的物质，该物质包括核苷酸、酶和降解的模板。然后可以在USP级水中洗脱纯mRNA。基于在线微流体的纯化可实现完全集成的工作流程，无需将材料暴露在大气中，避免使用基于传统HPLC的方法使用的有毒流动相，并显著减少人工干预。
如上所述，一般而言，这些方法和装置是无菌方法和装置，它们允许制造治疗性mRNA或用于制造治疗性mRNA的任何或所有组分，而不暴露于外部大气和/或可能的RNA酶来源和/或其他方面可能必需的污染组分。例如，如本文所述，这些方法可以在不添加多核苷酸的细菌来源(例如，在模板DNA中)和/或不添加在经由HPLC纯化或其他传统技术时可能存在的组分(例如增塑剂)。本文描述了用于在微流体路径装置内进行纯化的装置和方法(例如，使用纯纤维素)。
纯化的mRNA可使用A260nm UV吸收或使用mRNA特异性荧光染料的荧光定量。可以实施额外的mRNA QC步骤以确认纯度和身份。整个mRNA制造过程可以在微流体路径装置控制系统内进行，并且试剂添加和输出可以经由上述封闭路径微流体路径装置控制系统执行，例如，使用无菌技术。最后，可以实施过滤，例如通过0.22μm过滤器。如果最终产物符合以下接受标准，则可将其视为低生物负载药物物质并释放用于药物产物制剂：产量(例如，通过UV vis/荧光测定，>6.5ug mRNA每ul的起始IVT)、身份(例如，通过测序，与靶物100％一致同源性)、完整性(例如，测序，<1％突变率)、纯度(例如，CE，在单条带中>95％的产物)、加帽效率(HPLC，>95％加帽的mRNA)、残留dsRNA(例如,FRET/免疫印迹,<0.02％(1ng))、细菌组分(例如,HCP ELISA(用于DNA&蛋白质)、<X)、细菌组分(例如,HC-DNA,<X)、内毒素(例如，LAL测试，<0.2EU/ml)、生物负载(例如，微生物限度测试(MLT))等。
将mRNA配制成ANP
纯化的mRNA可以与递送组分组合以形成纳米颗粒制剂。该过程在图12中描述。例如，mRNA货物(治疗性mRNA，本文也称为药物物质)的水溶液可以在配制微流体路径装置内的微流体混合结构中与递送媒介物的乙醇溶液组合。然后，该材料可以经历两个配制后处理步骤，该步骤涉及首先进行芯片上透析过程以交换配制产物中的缓冲组分，然后进行浓缩步骤以减少药物产物的体积以匹配规格。在基于微流体路径装置的制造装置上实施这些过程可以导致对配制过程的高度控制，而无需人为干预并且人为错误的可能性很小。
通常，本文所述的制造方法的组分部分(其包括例如合成模板、实施IVT以生成mRNA、纯化mRNA、将mRNA与递送媒介物组合以形成治疗性组合物、透析治疗性组合物和/或浓缩治疗性组合物)可以在单个微流体路径装置和/或多个微流体路径装置上实施，如图3A-3C所示，如上所述。因此，流体路径可以是连续的或部分连续的(例如，在制造过程的组分部分上连续，如以下一项或多项：模板形成、IVT、纯化mRNA、将mRNA与递送媒介物组合以形成治疗性组合物、透析治疗性组合物和/或浓缩治疗性组合物)。在所有情况下，可以使用相同的控制器设施，或者可以使用不同的控制器设施。这些组分部分中的每一个的产物可以存储在控制器装置中的流体小瓶(例如，贮库)中并且转移到新的或后续的微流体路径装置。因此，在任何这些方法和装置中，可以保护产物免于大气暴露中。
如上所述，在一些变型中，基于拟肽的脂质制剂可以用作药物媒介物，其可以将阳离子基团和脂质部分结合到N-取代的肽(即拟肽)骨架上。递送媒介物组分可以是单分散的、完全可表征的化学实体，其可以通过常规方式获得。
受控和一致的配制过程对于保持mRNA ANP制剂中小而均匀的粒度可能至关重要。用本文所述的方法和装置，递送媒介物组分以受控比与mRNA快速混合。DV组分暴露于水溶液中以及阳离子(+)脂质和阴离子(-)mRNA之间的相互作用可引发颗粒形成。该过程可以通过使用本文所述的微流体路径装置来执行(以控制粒度和均匀性)。mRNA可以溶解在酸性缓冲液(pH 3-5)中，这可能有助于确保递送媒介物上负责其阳离子电荷的碱性官能团(如胺)的完全质子化。递送媒介物可以溶解在与水混溶的有机溶剂(通常是乙醇)中，这有助于在暴露于水性货物溶液时形成纳米大小的颗粒。混合后立即用中性缓冲液稳定溶液的pH。得到的制剂可以在4℃下存储数周，不会出现明显的功能损失。或者，配制过程可以在即时和护理点实施。
可以设计如本文所述的配制微流体路径装置以完成这些配制任务。图13显示了可以使用的此类微流体路径装置的常规结构的示意图。配制微流体路径装置的第一部分可以包括将mRNA和DV组分预稀释到单独的分级腔室中。输入材料可以从无菌的带条形码的小瓶中推进到这些预混合腔室中。mRNA材料可以在酸性配制缓冲液中预稀释，并且递送媒介物组分在乙醇中稀释。在这个阶段，可以调整两种材料的浓度以匹配靶DV/mRNA比的所需规格，以及匹配的体积比，例如，先前已显示可实现良好混合行为的3:1水：乙醇比。
包括混合结构的微流体路径装置可以精确地控制材料的混合速率。可以提供或控制更快或更慢的混合(例如，通过控制器)。例如，包括混合结构的微流体路径装置可以提供显著增加的DV/mRNA混合速率。在混合过程开始时，可以向两个混合腔室施加相等的压力，这迫使流体以例如0.5mL/min通过微流体结构。这种结构的几何形状可以通过大约3ms的快速混合时间来确定。在这些条件下，当拟肽分子上的水不溶性脂质结构域暴露于水性mRNA溶液时，可以形成两亲性纳米颗粒(ANP)。
混合后立即，可以通过在线添加1:1中性PBS来稀释ANP。这中和了酸性配制缓冲液并且可以制备用于透析和浓缩的配制剂。所有这些过程都可以通过微流体路径装置控制系统进行控制，以保持高度可再现的粒度和配制特性。
微流体装置允许在护理点配制个性化治疗。在一些实例中，治疗剂是T细胞受体(TCR)或T细胞受体的一部分，如用于治疗CTCL或由T细胞受体(TCR)或T细胞受体的一部分介导的其他疾病或病况。个性化治疗剂可以使治疗型组合物基于特定患者的遗传学(例如基因型)，其包括生成基于患者自身序列的特定的mRNA组合物)。本文所述的方法和装置还可以或可替代地允许个体化治疗剂。个体化治疗剂可以基于患者的表型，例如基于患者所属的类别，如风险因素类别。因此，个体化治疗剂可以根据患者的类别调整特定的治疗剂以适应患者。例如，微流体配制装置可以允许混合多个mRNA，例如，从来自较大文库的mRNA子集生成治疗组合物，该组合物对于患者是个体化的，其基于可以从患者的表型数据中确定的每个组分的组分和比率(量)。这些组合物中的任一种都可以在护理点混合以生成对个体的优化治疗。
配制后处理以生成药物产物
一旦在配制过程中形成ANP，就可以在配制微流体路径装置上完成若干处理后操作。这些可能包括用于缓冲液交换和乙醇去除的透析，然后是蒸发浓缩以减少给药体积。参见，例如图14。
可以在微流体路径装置上(例如，通过微流体路径装置控制系统)使用例如动态光散射(DLS)分析所得纳米颗粒的大小分布和使用荧光分析所得纳米颗粒的％mRNA包囊。分析可以在最终配制材料的小等份试样上完成，该等份试样从主流体路径转移到光学透明的采样腔室中。在该腔室内，光纤光源可用于光散射测量以确定粒度和分散度。接下来，在通过添加洗涤剂破坏颗粒之前和之后使用荧光mRNA特异性探针来确定RNA浓度。该测定可以阐明用于给药信息的mRNA浓度以及包囊在ANP中的mRNA相对于溶液中游离的mRNA的百分比。例如，可用于测试配制的mRNA药物产物的分析方法可包括：光学澄清度(例如，通过目测，无可见、聚集体、澄清溶液)、表征脂质组分(例如，通过HPLC)、大小(例如,DLS,80-300nm)、％包囊(例如,通过荧光测定法,>95％包囊)、分散性(例如,DLS,PDI<0.25)、内毒素(例如,LAL测试,<0.2EU/ml)、无菌(例如，培养物(USP)，<Xcfu)、pH(例如，USP，pH7.4+/-0.2)、效力(例如，生物测定/ELISA，X EC50)。
实施例
如上所述，本文所述的方法和装置可用于制造mRNA治疗，包括例如对皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)的治疗。成熟的T细胞表达独特的TCR，该TCR由两种蛋白质组合形成，αβT细胞中的α和β链或δγT细胞中的δ和γ链。每条TCR链由独特的重组事件形成，通过该重组事件，通过称为V(D)J重组的过程使编码基因的V、(D)和J区域的许多可能外显子中的任一个在一起。这些V(D)J重组事件是准随机的，并且可以产生大量组合，从而导致TCR的大量多样性。此外，在V(D)J重组过程期间，核苷酸的随机添加或缺失可发生在外显子连接处，导致生成额外的TCR多样性，其共同生成个体的TCR全集。据估计，通过下一代技术深度测序的健康个体在任何给定时间点时外周血中都含有大约1-5x106个不同的TCR，并且在没有感染的情况下，无单个TCR通常占超过5％的总群体。T细胞淋巴瘤源于单个恶性T细胞的克隆扩增，导致肿瘤在淋巴样组织(脾脏或淋巴结)或其他组织(如皮肤、肝脏或胃肠道)中发展。
已经开发了替代方法来对个体的TCR全集进行测序，所述TCR全集也用于诊断和鉴定T细胞淋巴瘤患者中的克隆扩增的TCR。一种常用的方法是使用精心开发的PCR引物组对TCRδ或γ基因组重排进行测序，其中扩增偏差得到控制。因此，可以实施多重PCR以进行靶物富集，然后进行下一代测序。此类方法(例如来自Adaptive biotechnologies的Immunoseq测定)已得到验证，并在临床中用作诊断工具和用于最小残留疾病量化。备选方法是直接对cDNA进行深度测序，无需靶物富集，以鉴定显著过度呈现的TCR链。淋巴瘤TCR的鉴定通常称为淋巴瘤独特型或克隆型。
为了确定独特型，可以收集生检并且可以对样品进行测序以确定淋巴瘤独特型的鉴定。有关患者特异性独特型的数字数据可用于患者特异性疫苗设计。
mRNA疫苗的设计
基于mRNA的患者特异性癌症疫苗的生产可以从设计与个性化靶肽相对应的DNA序列开始，该靶肽能够产生通过抗原呈递细胞(APC)的特异性和免疫学有效的表位呈递。为了实现这点，第一步可以包括从独特型TCR链(αβ或δγ)中提取互补决定区(CDR)。CDR3区域可以通过对典型TCR实施序列比对来提取。CDR是TCR序列的高度可变部分，它介导与抗原-MHC复合物的结合。特别是，跨越V(D)J和C区域之间连接点的CDR3区域具有最高的可变性，并且代表了真正独特的蛋白质片段，该蛋白质片段应只在淋巴瘤细胞中发现。因此，例如，在C和N末端均延伸10个氨基酸的CDR3区构成疫苗肽片段，如上文对图8所述的。
由于TCR具有两条链(α和β)，因此每位患者有2个CDR3，尽管在少数情况下只会鉴定出一个CDR3。在一个实例中，假设CDR3α和CDR3β可用，疫苗肽可以设计为具有以下结构：CDR3α-接头-CDR3β，其中接头是标准GSGGGSGGGSGGGS序列，其通常用于设计单链可变片段(ScFv)分子。
一旦鉴定出最终的疫苗肽氨基酸序列，设计过程可以包括密码子优化以衍生DNA序列，该序列可以：(i)高度转录和高度翻译，导致良好的蛋白质表达，(ii)适合于DNA合成，(iii)包括模板生成步骤所需的衔接子序列，和(iv)排除序列基序(如限制性酶)，其在其他情况下干扰模板生成过程。可以实施密码子优化，例如以平衡序列GC并去除序列重复、内部启动子序列、终止序列、剪接序列、重组序列和内部核糖体进入位点(IRES)。此外，密码子选择可以适应于在高表达的人类基因中观察到的密码子选择。可以使用的密码子优化过程的一个实例的示意图显示在图10中。
一旦序列设计过程完成，优化的序列可以合成为线性DNA分子。可以如上所述准备IVT的模板。例如，在经由IVT合成mRNA之前，可以生成具有IVT能力的双链DNA模板。DNA模板可以包含(i)蛋白质编码序列(或CDS)，定义为对应于要产生的靶患者特异性肽的一组密码子，(ii)包括5'非翻译区(5'UTR)和3'UTR的非编码序列，(iii)保护mRNA免受核酸外切酶活性影响的polyA序列和(iv)募集RNA聚合酶的启动子序列，所述RNA聚合酶将DNA模板转录成mRNA，如上文图6中所述。
因此，作为合成线性DNA的患者特异性肽编码序列(例如，来自DNA合成供应商)可以与IVT所需的通用功能元件配对，作为模板生成过程。
本文描述的基于微流体路径装置的方法可以包括模板生成，并且可以比目前实施的基于细菌培养的方法快得多和更有效，所述基于细菌培养的方法可以需要约4天或更长时间，可能导致可变长度的polyA尾(由于细菌重组过程)，并可能具有细菌蛋白质、细菌DNA和内毒素残留的风险。相比之下，本文所述的方法和装置可在单一日内(约12小时)实施，并可以导致一致的poly A尾(大于300bp)，并且可以不涉及与宿主核酸或宿主细胞蛋白质的任何接触。最终的双链DNA可以由化学产生的核苷酸制成，因此可以认为是合成来源的。
如上所述，这些方法可以包括四个步骤：(i)sGOI与TIFC的连接，以及通过核酸外切酶处理去除未连接的材料，(ii)经由称为多重置换扩增(MDA)的技术环状扩增连接的产物，(iii)使用IIs型限制酶消化来线性化扩增产物，(iv)芯片上纯化程序以去除杂质。作为最后一步，纯化的模板可以通过0.22μm过滤器进行过滤。为确保所得材料在用于IVT反应之前的质量，可以实施许多分析测试，其包括产量测试(例如，在1ug/ul时>50ug、260/280nm比>1.8)、身份测试(例如，与靶物100％一致同源性)、完整性测试(例如，<1％突变率)、纯度测试(例如，通过CE得到的单条带中>95％的产物)和内毒素测试(例如，<0.2EU/ml)。
因此，药物产物可以包括以1:1的比混合的编码患者特异性TCR肽的mRNA以及作为佐剂的CpG。核酸混合物可以包囊到200nm ANP中，其用于保护mRNA免受RNA酶的降解，并也作为促进子起作用，用于其细胞摄取和细胞质释放。活性成分的作用机制可能需要发生翻译过程的细胞质中完整的mRNA生物利用度。ANP由核酸组分、阳离子胺官能化拟肽NTX-DV-0024和2wt％PEG-脂质组成，mRNA:DV的总体比为5:1w/w。ANP的大小分布可以是单峰的，Z平均粒度约为200nm。ANP可以悬浮在靶pH7.4的磷酸盐缓冲盐水(0.144mg/mL磷酸二氢钾、9.0mg/mL氯化钠和0.795mg/mL磷酸氢二钠)中。所有制剂赋形剂通常都认为是安全的。最终产物可以是无菌的和生理等渗的，重量摩尔渗透压浓度(osmolality)为295±20mOsm/kg。
尽管mRNA本身具有吸引人的安全性概况，但是例如亚可见颗粒、宿主细胞蛋白(HCP)、宿主细胞DNA、处理相关杂质、生物负载、细菌内毒素水平、无菌性以及可浸出物和可提取物的水平主要是安全相关的，必须根据既定的安全概况和行业标准进行最小化和控制。此外，消除或最小化用于制造IVT mRNA的残留模板DNA、双链RNA和酶的存在可确保产物安全有效。
如所述，本文所述的方法和装置可以包括颗粒物质的定量分析，例如，通过一种或多种程序，如光遮蔽颗粒计数测试和/或微观颗粒计数测试。可能有必要通过遮光颗粒计数测试，接着进行微观颗粒计数测试来测试某些制剂，以得出符合要求的最终结论。由于纳米颗粒制剂由于存在于注射液中的液滴和/或颗粒集合体的光散射而本质上是不透明的，因此过滤器的过滤和随后的显微分析可用于颗粒物质分析。可以使用调整到100±10放大率的光学显微镜，它允许可视化小至大约1μm的颗粒，并且该方法中使用的过滤器的标称孔大小可以高达1.0μm，在100nm至250nm范围内的药物产物纳米颗粒不会干扰颗粒物检测。
本文所述的模板生成方法不涉及使用细菌或任何其他活微生物，而是依赖于使用酶促反应和化学制造的核苷酸，因此模板和mRNA产物是完全合成的。
关于成品药物产物中残留的宿主细胞DNA，本文所述的方法和装置在最终产物剂量中可具有少于10ng/剂和200个碱基对。除了最小化与过程相关的杂质的存在外，还可以通过制造过程、制剂开发和优化以及本文所述的适当存储条件的鉴定来控制与产物相关的杂质。尽管IVT mRNA产物旨在尽快生产和施用，但其稳定性概况可能满足定义的接受标准，至少直到施用。在冷冻条件下，维持本文所述治疗剂的足够稳定性的持续时间可以是至少30天。
一旦IVT mRNA进入细胞质，其药理学受调控天然mRNA稳定性和翻译的相同细胞机制控制。因此，IVT mRNA效力在很大程度上取决于细胞质的生物利用度，并且重点应放在开发产物上，以使细胞摄取最大化。
本文所述的存储容器(例如贮库)通常可以保护产物免受外部环境的影响(如果适用的话，包括氧气进入和防止光降解)、可消毒并确保在整个保质期内保持无菌性、与产物制剂相容，并且在存储过程中对产物的可浸出化学物质贡献极少甚至没有。例如，贮库可能包括有卤化丁基橡胶塞的I型硼硅酸盐玻璃小瓶，提供适当的产物保护，并确保在产物的整个保质期内保持无菌性、安全和功效。
实施了初步筛选，其最大化mRNA表达、最小化对细胞存活力的影响并实现有利的生物分布概况。对于这些实验，选择了基于萤火虫萤光素酶(Fluc)表达的生物发光测定。该测定允许以高通量方式定量测量每个递送媒介物候选物的源自mRNA摄取的基因表达。对于初步评估，通过固相拟肽合成，合成了36个氨基脂化拟肽用于初步评估，并通过冻干和/或沉淀进行分离。这些候选材料在其阳离子和脂质域中都含有结构变型。这36种材料以不同的比与Fluc mRNA以及2％(w/w)的脂质锚定PEG(1,2-二肉豆蔻酰基-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000)组合。用所得制剂处理几种细胞系，包括HeLa、HepG2和JAWSII树突细胞，导致6种先导候选物的向下选择。
通过静脉内(IV)、皮下(SC)和肌肉内(IM)注射后，通过Balb/c小鼠中的Fluc表达来量化递送媒介物候选物的体内mRNA表达和生物分布。基于表达(体外和体内)和生物分布(体内)，选择NTX-DV-0024作为候选物。合成了编码卵清蛋白的mRNA，并作为模型疫苗评估。卵清蛋白在疫苗接种的背景中得到了非常充分的研究，并且用于追踪表位呈递和T细胞反应的试剂是商业可获得的，这使其成为概念验证研究的理想候选物。使用JAWSII鼠(C57BL/6)树突细胞在体外模型上对如本文所述产生的OVA mRNA进行初步评估。简而言之，使用商业转染试剂(例如Lipofectamine2000TM)用OVA mRNA候选物转染JAWSII细胞24小时，在该时间后使用针对与SIINFEKL表位结合的MHC-I的荧光抗体对细胞进行染色。染色群体的平均荧光强度(MFI)代表总体抗原呈递的测量。这在图15中示意性地描述。
使用该测定法，针对商业购买的材料评估如本文所述产生的mRNA。在这种情况下，与商业对照相比，产生的mRNA导致在MHC-I上的SIINFEKL呈递水平高出42％。还展示了装置上mRNA合成的可重复性，5批OVA mRNA(NTX-RNA-0184)导致了相似水平的SIINFEKL+JAWSII细胞。
在鼠体内实验中，将mRNA候选物类似地作为疫苗候选物评估。将C57BL/6小鼠注射(IV)商业或生产的mRNA(由本文所述的微流体路径装置产生)和递送媒介物。注射后7天，分离外周血并使用对识别OVA表位的T细胞特异的荧光MHC-I四聚体染色。然后通过流式细胞术对OVA特异性CD8+T细胞的分数进行量化。在这个实验中，如前文，产生的mRNA导致外周血中OVA特异性T细胞的分数相对于商业对照增加了50％，表明这些分子作为疫苗候选物的强度。
基于mRNA的疫苗(如本文所述产生)的体内功效的首次展示是在鼠的、表达OVA、EG.7、同基因T细胞淋巴瘤的模型中。该模型是适应症淋巴瘤的生理相关动物模型，并且与NTX-0565的免疫治疗作用机制相关。同基因小鼠模型是来自相同近交背景株(同种移植物)的鼠宿主中的永生化小鼠癌细胞系的移植物。同基因宿主鼠背景使基于免疫疗法的药物能够从宿主募集功能性抗肿瘤免疫反应，这对于研究免疫疗法是必要的。同基因模型特点是完全有能力的小鼠免疫、免疫细胞浸润到肿瘤的多样性、全面的小鼠肿瘤、免疫细胞和基质界面，以及易于进行包括遗传和蛋白质表达历史在内的药理学研究的肿瘤同步。
使用鼠E.G7-OVA淋巴瘤肿瘤模型。E.G7-OVA肿瘤细胞系是EL-4淋巴瘤衍生系，其被工程化改造以携带1个基因组拷贝的OVA抗原，该OVA抗原持续且稳健地表达。这种方法实现对基于OVA外源抗原的高度特异性的免疫反应，使这些肿瘤细胞对研究癌症疫苗是理想的。文献中已经展示了使用DNA、基于细胞和siRNA疫苗的肿瘤生长抑制。对于第一个功效研究，疫苗组分是编码OVA抗原的mRNA，并且研究设计是在用基于mRNA的疫苗的先前在该动物模型上的文献后建模的。使用测试物品递送媒介物-磷酸盐缓冲盐水平行运行随机并发的阴性对照。动物是年龄和性别匹配的，并且分组随机分配以确保肿瘤大小和体重的平均分布。测试物品是盲的，以便对体内研究管理者消除偏见。样品分析再次是盲的以消除分析师的偏见。在开始之前，提案中预先定义了接受进入研究的纳入和排除标准。在研究开始之前，研究提案中预先定义了终点、观察频率和时间表。预定义安乐死标准和动物护理干预措施。
该初步研究展示了本文所述的mRNA疫苗具有统计学上高度显著的治疗功效(图16A-D)。当OVA mRNA疫苗静脉内递送至第2组时，该组在肿瘤植入后第14天开始显示出统计学上的极端显著性(***，p<0.0005，第14天，相对于阴性对照，经由多重Dunnett比较检验)。在第21天，第2组的肿瘤体积为797mm3，相对于第1组对照中的肿瘤体积2000mm3(**，p<0.005，如第21天通过多重Dunnett比较检验测量的)。当动物接受如本文所述制造的mRNA疫苗(IV)时，这转化为61.42％的肿瘤生长抑制。当阴性对照组(第1组)达到预定终点肿瘤体积(2,000mm3)时，在植入后第21天计算肿瘤生长抑制(TGI％)。肿瘤生长抑制(％)由以下公式定义：TGI(％)＝(TV对照组-TV治疗组)/TV对照x100并且是相对于肿瘤植入后第21天的阴性对照，此时所有对照动物都已达到终末肿瘤体积。这种肿瘤生长抑制转化为mRNA疫苗接种组的存活率的统计学上显著增加，第2组：mRNA接种疫苗的动物，具有到终点的时间为25天，相对于第1组：媒介物治疗的动物，具有到终点的中位时间为23天(**p<0.01，通过相对于对照的对数秩检验测量)。根据体重和实验室测试结果，在给定剂量下未观察到可观察到的毒性。在图16A-16C中，制造的基于mRNA的疫苗在鼠淋巴瘤E.G7同基因模型中显示出体内功效。如在个体动物曲线(图16A、16B)和每组的平均肿瘤体积(图16C)中所见，肿瘤生长被抑制了61.4％(*p<0.01)。这种肿瘤生长抑制转化为mRNA疫苗接种组的存活率的统计学显著增加(图16D)(**，p<0.01)。
补充上述物理测量的使用报告基因表达的存储的药物产物制剂的体内测试也在一周的时间段内实施。在该实验中，萤火虫萤光素酶mRNA和NTX-DV-0028的制剂是在1)注射前7天、2)注射前3天和3)注射前1小时配制的。配制后，产物在4时配下存储直至施用。然后经由尾静脉注射将所有三种材料以0.25mg/kg的剂量施用于Balb/c小鼠。注射后8小时，测量全身生物发光，得到的图像显示在图17A中，并在图17B(显示了注射存储的mRNA制剂后全身萤光素酶表达的量化光子通量)中量化。在此1周的存储实验过程中，测量的生物发光没有实质性损失。存储3天和7天的材料均在注射前立即配制的材料的误差内。此功能稳定性数据支持上述粒度稳定性数据，以强烈表明本文所述的mRNA制剂在4剂在下稳定存储至少1周。
通常，用递送媒介物分子配制到如本文所述的ANP中的mRNA药物物质可具有大约200nm的大小，排除在最终配制步骤结束时使用0.2微米无菌过滤器以防止损失。因此，可以在整个制造过程中加入多个有条理的过滤步骤，以减轻无菌风险，而避免破坏最终的ANP药物产物。图18示意性显示了可以应用过滤的不同时间。在IVT反应之前，纯化的模板和单独的IVT试剂(包括dNTP、酶等)都可以通过0.22um过滤器过滤(图18A、B)。在IVT微流体路径装置中完成mRNA生产后，所有输入材料将在最终配制过程(在其中形成ANP)之前过滤。这些包括药物物质(mRNA，例如图18，C)、佐剂(CpG)、两亲性拟肽递送媒介物组分和缓冲液(图，例如图18，D)、DMG-PEG2000递送媒介物组分(例如，图18，D)和透析缓冲液(例如，图18，E)。除了输入材料的0.22微米过滤之外，最终的两亲性纳米颗粒药物产物可以通过0.45微米过滤器过滤以去除任何微粒或聚集材料(图18，F)。这种更大的过滤步骤可能有助于防止ANP的破坏并保持最终药物产物的功效。
为了补充上述谨慎的过滤步骤，本文所述的微流体路径装置控制系统可以设计为使用密封的无菌流体路径操作，这将确保最终药物产物的安全性和无菌性，例如，如本文所述，使用一个或更多密封的微流体路径装置，这些装置执行药物产物制造所需的操作，包括模板制备、体外转录(IVT)、用递送媒介物配制成两亲性纳米颗粒(ANP)以及缓冲液交换和浓缩步骤。这些微流体路径装置可以驻留在温度受控的5级层流罩内，该罩进一步容纳在例如6x6的7级洁净室中。mRNA反应器可以是提供保护而不受人类和外部环境影响的装置的自动化段。可以使用一次性无菌无核酸酶管将试剂和产物流体路径从加压的无菌容器递送到反应器的核心。最终产物制剂和药物产物可以在如上所述的多层微流体路径装置中在完全封闭的系统中制造。
渗透性插入物
本文所述的任何微流体路径装置可包括一个或多个用于处理治疗性材料溶液(或其中形成治疗性材料的溶液)的可渗透插入物。可渗透插入物可插入微流体路径装置中的腔室的流体接触侧。并且可以配置成使得进入或通过腔室的流体接触侧的流体必须通过可渗透插入物，从而被可渗透插入物修饰。可以使用任何适当的可渗透插入物。例如，可渗透插入物可以包括被配置为去除不需要的材料的材料；在一些实例中，可渗透插入物包括纤维素材料，其被配置为从单链RNA(ssRNA)的治疗性溶液中去除双链RNA(dsRNA)。
图19A显示了微流体路径装置1900的一个实例，该装置包括在腔室1957的流体接触侧内的可渗透插入物1969。在图19A中，微流体路径装置1900可以包括至少一对腔室1953、1957、1957'，每个腔室可以包括流体接触侧1917、压力(例如，气体)侧1919、流体连接、压力连接和流体/压力线，其可以在微流体路径装置的厚度中形成。在一些变型中，腔室是成对的，并且这对腔室中的每个腔室可以通过流体连接器1955彼此连接。流体连接器1955可以与施加到腔室压力侧的正压和/或负压配合使用，以驱动两个腔室之间的液体侧中的液体，从而在每个腔室中混合该液体。腔室可以由弹性材料(例如，弹性层或膜)分叉，并且在腔室的固定体积内偏转弹性材料可以驱动液体内的任何液体进出腔室的流体接触侧(例如，在两个腔室之间)。
微流体路径装置1900可以包括多于一对的腔室，其中任何一个都可以包括可渗透的插入物。每对腔室可用于不同的过程。例如，第一对腔室1953可用于合成RNA。第二对腔室1957、1957'可用于纯化合成的多核苷酸。在向各个腔室的压力接收侧1919施加压力并打开第一对腔室1953和第二对腔室1957之间的阀1959时，来自第一对腔室1953的流体可以被驱动到第二对腔室。阀腔室1959可以由在两对腔室之间的连接通道内的弹性层1907形成。
如图19A和19B所示的微流体路径装置1900可以具有多个压力端口1843和流体端口1923。多个压力端口和流体端口可以邻近微流体路径装置的外围设置，并且配置为连接到流体接口组件109，如上所述。
端口(例如，密封阀)可以由弹性层沿连接通道1939(压力通道或流体通道)的长度形成，如图19A所示，对于阀1961，它可以控制从流体端口1923驱动的试剂的递送时间，但是当与一个或多个类似构造的阀串联放置时，也可以允许计量到装置的腔室。例如，在图19A中，显示了三个阀腔室(下面更详细地描述)；这三个阀中的第一个可以用作蠕动泵，而中间阀可以是计量较小的计量腔室(例如，具有计量体积约为10nL、20nL、25nL、50nL、75nL、100nL等)。通道的大小，特别是连接到通道的腔室的大小)可以计量出沿流体连接通道1939、1921分配并递送到连接到流体连接通道1939、1921的腔室1953中的体积。在一些变型中，计量体积可能低至50nL。可以引进约100nL、1微升、5微升或更多的计量体积。可以预先选择多种阀大小以结合到微流体路径装置1900中，并且可以通过用户选择将试剂连接到适当的计量大小。
另外，一个以上的阀体1961可以包括在沿着流体连接通道1939的一排中。一系列阀1961可以作为蠕动泵起作用来移动流体，其包括(但不限于)粘性流体。发挥流体的蠕动泵功能的能力通常对于移动流体可能具有特别的优势，流体可以是粘性的或含有悬浮颗粒(如纯化或捕获珠)的。
如所提到的，微流体路径装置1900还可以包括递送或输出库或贮库1963。在图19A中，可以与上述腔室构造类似地形成预选体积，或者根据需要可以仅含有计量侧。在任一种情况下，可以使用阀来计量进入库1963的所需体积。阀1965可以控制从库1963递送流体。如果需要更大的体积，则可以重复递送。或者，如果库1963被预先选择为输出库，则阀1965可以打开，并从腔室1957递送流体，而保持阀1967关闭，这仅允许将流体的测量体积输出到库1963。这种流体然后可以输出到试剂存储框上的流体小瓶中以进行进一步处理或测试。在一些变型中，腔室、库或贮库(例如，1963)可以配置为由例如三个阀结构(1967、1965、1967)形成的1μL泵的计量部分。腔室可配置用于例如从混合腔室1957输出废物。
微流体路径装置1900可以是密封路径构造。当连接流体小瓶、流体线和微流体路径装置时，可以在没有材料进或出系统的任何交换，特别是进/出用于处理的微流体路径装置的流体路径的情况下实施装置的操作，包括合成多核苷酸(RNA)并准备将其用于生物递送(作为治疗剂，如药物、疫苗等)。因此，整个系统可以作为封闭路径运行和/或单独的微流体路径装置可以在系统中作为封闭路径运行(免受大气影响)。
通常，这些微流体路径装置可以包括在腔室或通道的流体侧1917内结合一个或多个可渗透插入物1969。可渗透插入物可以配置为从腔室或通道中的流体混合物中吸收选定的部分(例如，选定的材料)。吸收的材料可以是从溶液中纯化出来的不想要的材料，或者它可能是从溶液中除去以稍后洗脱和进一步处理的所需材料。在一种变型中，插入物的可渗透材料可以包括纤维素材料，其可以选择性地从混合物中吸收双链mRNA。纤维素材料可以仅插入一对腔室中的一个腔室中，使得在混合流体或使流体穿过第一腔室中的可渗透插入物时，可以有效地从流体混合物中去除dsRNA，然后可以将其转移到进一步下游的另一对腔室中用于进一步处理或输出。
微流体装置1900的一些进一步可以包括腔室内的浓缩器，其可以设置在第二板的厚度内并且可以与如1949的出口通道流体连通。可以通过驱除多余的流体介质来浓缩多核苷酸，以及从微流体路径装置1900输出浓缩的多核苷酸混合物以供进一步处理或使用。在一些变型中，浓缩器可以是透析腔室。例如，透析膜可以存在于微流体路径装置的板内或板之间。
微流体路径装置1900可由对可见光和/或紫外光至少基本上透明的材料形成。基本上透明是指与透明材料相比，至少90％的光透过该材料。在一些变型中，微流体路径装置1900可以由对可见光和/或紫外光基本透明的材料形成。基本上透明是指与完全透明的材料相比，至少90％的光透过该材料。
微流体路径装置可以由两个或更多个彼此层叠的板形成，在板之间形成室和/或通道；弹性材料可以夹在第一板和第二板之间。第一板和/或第二板可以由刚性材料形成。板可以由相同的材料或不同的材料形成。例如，刚性材料可以是聚合物或玻璃。聚合物或玻璃可以是生物相容的，例如，不浸出对活细胞有毒的任何单体或可溶性小分子。可以使用任何合适的生物相容性聚合物，其包括医用级聚碳酸酯-氨基甲酸酯、有机硅聚碳酸酯氨基甲酸酯、聚醚氨基甲酸酯等。在一些变型中，聚合物可以是环烯烃共聚物。
图19B显示了通过微流体路径装置的一部分的截面，其显示了腔室1920的流体接触侧1917内的可渗透插入物1969，腔室1920被弹性材料1907分叉成流体接触侧和压力接收侧1919。因此，微流体路径装置可以配置为由两个更刚性层1903、1905组成的多层结构，柔性膜1907夹在两个脊状层之间。图19B显示了穿过具有形成用于处理如本文所述的治疗剂的反应器的多个层的微流体路径装置的一个实例的截面图的一部分(横向于微流体路径装置的平面)。反应器可以包括密封件、通道、阀和腔室，该腔室包括由多层形成的泵送腔室。例如，微流体路径装置可以由两个或更多个刚性或半刚性板1903、1905和至少一个弹性层1907形成。弹性层1907可以是不透液体的弹性材料片。弹性层可以稍微透气，或者可以被处理为或多或少透气，其包括在各个区域。尽管可以使用单个连续的弹性材料片，但在一些变型中可以使用多个弹性材料片，或者“片”可以由多个片的部分形成。层和弹性片可以层压在一起。通常，用于容纳、阀调和/或泵送流体的腔室可以在弹性层任一侧的板中形成，使得弹性层将腔室分开为液体容纳侧和压力(例如，气体)施加侧。腔室的总体积可以是恒定的，并且可以形成为第一(例如，上)板和第二(例如，下)板，但是该体积可以分为压力侧和液体侧。通过向压力侧施加正压或负压，弹性片可以变形以减少(降至零，关闭腔室)液体容纳侧的体积或增加液体容纳侧的体积(至预定的最大值)。腔室的压力施加侧可以连接，例如，经由连接到压力通道1947的上板1903中的压力端口1943，用于向一个或多个腔室的压力接收侧1919施加负压或正压。与每个腔室的压力施加侧相对的液体容纳侧1917可以经由流体通道1921连接到流体端口1923。流体端口和压力端口都可以由通向上板1903和弹性层1907的开口形成，允许与大气隔离的密封连接，即便当有多个不同输入线时当将压力线推入弹性层1907中时，该弹性层1907由相对的刚性或半刚性层1905、1909在端口的下侧支撑。
在图19B中，微流体路径装置1900包括第一(例如，上)板1903，其具有第一(例如，顶或上)表面1911和第二(底或下)表面1929以及两者之间的厚度。第一表面1911可以形成暴露的外表面。微流体路径装置还包括第二板1905，第二板1905具有第一(例如，上或顶部)表面1931和第二(例如，下或底)表面1933以及它们之间的厚度。弹性层1907夹在第一板1903的第二表面1929和第二板1905的第一表面1931之间。在这个实例中，第三板1909在第二板的第二表面1933上直接或间接地偶联到第二板。第三板1909还具有第一(例如，上或顶)表面和第二(下或底)表面以及它们之间的厚度。第三板的第二表面可以形成微流体路径装置的底表面。板的任一种可以由多层形成，这些层可以被层压或以其他方式连接在一起。例如，在图19B中第三板1909包括可选的第二弹性层1913，其可以帮助将第三板连接到第二板；本实例中的第二弹性层1913形成第三板1909的第一表面1935。图19B中显示的层和板可能不是按比例的(例如，弹性层1907可以相对于板更薄)。
图19B中显示的微流体路径装置1900还可以包括多个腔室1915、1916、1918、1920，每个腔室具有固定的体积。这些腔室由第一板1903的第二(底)表面1929和第二板1905的第一(上)表面1931中的切口区域(例如，圆形/弯曲切口)形成；弹性层1907将这些腔室1915分叉，使得每个腔室都包括液体容纳侧1917和压力(例如，容纳气体)侧1919。微流体路径装置1900还可以包括多个液体(例如，流体)通道。在图19B中，显示单个流体通道1921，其从流体端口1923延伸，穿过第一板1903的厚度，到流体通道开口1925，其穿过弹性层1907和穿过第二板1905的大部分厚度向下到第二板的底表面1933，其中液体通道1921的一段平行于第三板的底表面延伸的长度形成在第二板的底表面1933中，并以第三板1909的上表面为界。
关于流体端口1923，形成流体端口1923的进入第一板1903中的开口的直径(其延伸穿过第一板的厚度)可以大于流体通道开口1925的直径，其延伸穿过弹性层1907并进入液体(例如，流体)通道1921。流体通道开口1925可以相对于流体端口开口的底居中，并且可以从流体端口开口的壁偏移至少将连接到流体端口的流体线或流体线偶联接口的预期壁厚。
流体通道1921连接到第一腔室1915的液体容纳侧1917。该第一腔室可以配置为阀，其具有相对低的保持体积(固定体积)，但可以通过移动弹性层1907来完全打开或关闭。
微流体路径装置1900还包括多个压力通道，这些压力通道可以被独立控制以施加正压和/或负压。在图19B中，显示了连接到第四腔室1920的单个压力端口1943，尽管腔室1915、1916、1918中的每一个都可以连接到单独的压力端口和压力通道(用于独立地操作和控制将这些腔室分叉的弹性层1907的部分的移动)，以独立阀调和/或泵送每个腔室。在一些变型中，压力端口可以在多个腔室之间共享。在图19B中，压力(例如，气体)端口1943类似于流体(例如，流体)端口1925，并且包括完全穿过第一板1903的开口，向下到暴露的弹性层1907，通过弹性层到开口形成压力(例如，气体)通道开口1945。压力通道开口1945与压力(例如，气体)通道1947连续，该通道1947从压力端口1943延伸，穿过第一板1903的大部分厚度，并且在沿着第二板的底的切口通道(或替代地进入第三板的顶部的切口区域)并通过第二板和弹性层1907返回到第一板内压力通道内的区域，其连接到第四腔室1920的压力(例如气体)容纳部分1919。如对于类似的流体(例如液体)端口所述，穿过第一板1903的厚度的压力端口1943的直径可能大于通过弹性层1907压力通道开口1945的直径，并且可以以大于将连接到压力端口的压力线或压力线偶联接口的壁厚居中或偏移。
在通过图19B中所示的微流体路径装置1900的截面中，存在与未显示的其他流体(例如，液体)管线、流体端口、压力线和压力端口的多个连接，因为它们可能在所示平面之外。例如，在图19B中，第四腔室的液体容纳侧或部分1917可以连接到额外的阀(腔室)和/或通道，其包括例如从液体容纳侧1917延伸的出口通道。未显示的额外的腔室(例如配置为阀)可以如上所述形成。在一些变型中，出口通道可以从一个或多个腔室通过另一个流体端口(未示出)递送流体到流体接收库，例如小瓶、管等。该接收库可以保持在试剂存储框中。
如上所述，可渗透插入物1969可以插入分离腔室的流体接触侧，并且可以配置成被将流体接触腔室与腔室的压力接收侧分离的弹性材料压缩。在该实例中，施加到接收侧的正压或负压(例如，经由寻址到该腔室的压力端口)可以使弹性材料偏转以改变流体接触侧的体积。可以用可渗透插入物1969将流体驱入腔室1920，并且流体可以通过插入物以修饰溶液。在可渗透插入物是可压缩的变型中，它可以被压缩以从腔室中去除和喷射流体；在一些变型中，可渗透插入物然后可以扩展(或允许扩展)回到扩展构造，然后流体可以再次穿过它，或者可以实施进一步的处理。
本文所述的可渗透插入物通常可用于修饰包括治疗性材料(或其中正在形成治疗性材料)的溶液。图20A示意性地阐明了使用本文所述的任何装置处理流体中的治疗性材料(例如，RNA样品)的方法的一个实例。例如，该方法可以包括首先将微流体路径装置(或多于一个微流体路径装置)附接到微流体路径装置控制系统2001。该步骤可以包括将微流体路径装置偶联到压力源。在一些变型中，该步骤(或额外步骤)可以包括将微流体路径装置偶联到治疗性材料的来源，如RNA。任选地，在一些变型中，该方法可以包括在微流体路径装置中合成治疗性材料，如通过体外转录2003生成治疗性RNA。
该方法进一步可以包括将有治疗性材料(例如，RNA)的样品输送到含有可渗透插入物2005的处理腔室的流体接触部分。例如，这可以包括施加压力以输送样品到微流体路径装置的分离腔室的流体接触侧。在一些变型中，可以通过偏转微流体路径装置内的弹性材料(例如，弹性膜)来施加压力，以将包括治疗剂(或推定的治疗性材料)的流体驱动到腔室的流体接触侧。作为该步骤的一部分，流体(包括治疗剂/推定的治疗剂)样品可以传送到分离腔室的流体接触侧内的可渗透插入物，以修饰样品2007。例如，可以通过与可渗透插入物相互作用来添加或去除来自治疗剂/推定的治疗剂的材料。
最后，可施加压力以将样品输送出分离腔室的流体接触侧，例如通过使弹性材料如弹性膜偏转，从而分离腔室的流体接触侧与腔室2009的压力接收侧。
图20B显示了使用本文所述的任何装置处理流体中的治疗性材料(例如，RNA样品)的方法的具体实例。例如，在图20B中，该方法可以是从含有dsRNA和单链RNA(ssRNA)的RNA样品中去除双链RNA(dsRNA)的方法。在该变型中，该方法可以包括：将微流体路径装置偶联到压力源2011。如上所述，在一些变型中，这可以包括将微流体路径装置偶联到治疗性RNA源，和/或实施微流体路径装置中的治疗性RNA体外转录，如上文2013所述。然后，该方法可以包括施加压力以将RNA样品输送到微流体路径装置2015的分离腔室的流体接触侧。然后可以使RNA样品穿过/进入在分离腔室2017的流体接触侧内的包含胶原蛋白的固体且可渗透插入物，其中纤维素结合dsRNA，使得dsRNA被插入物保留。然后可以施加压力以将RNA样品输送出分离腔室的流体接触侧，将ssRNA留在治疗性溶液2019中。可以根据需要重复这些步骤以去除所有或基本上所有的dsRNA。
如上所述，然后可以实施进一步的处理(与递送媒介物、透析、浓缩等结合)。
本文所述的装置可以包括一个或多个隔离腔室和/或可以与一个或多个隔离腔室一起使用。例如，在一些变型中，本文所述的装置可以是可以生产治疗性多核苷酸(例如，用于递送给受试者)的治疗性多核苷酸制造“工厂”的一部分。治疗性多核苷酸可以是例如治疗性mRNA。图21A-21B显示了可以自身用作工厂装置或可以用作并行制造单元的一部分的装置的一个实例。在图21A中，装置2101、2101'可以包括5级隔离柜2103或可以保持在5级隔离柜2103中；隔离柜自身可以保持在7级隔离空间内。在图21A中，柜包括两个微流体控制装置2101、2101'。该装置可以是提供复制精确(copy-exact)GMP单元的组装工厂的一部分，该GMP单元可以自动快速地制造治疗性多核苷酸，例如治疗性mRNA，以供患者使用。这些装置可以高度重新配置并允许快速部署和低成本生产。在一些变型中，它们可以会根据制造“工厂”单元的需要布置。在一些变型中，这些装置可以设置为移动单元的一部分，该移动单元可以临时部署到远程位点或部署更长的时间段。
当一个特征或元件在本文中被称为“在”另一个特点或元件“上”时，它可以直接在另一个特点或元件上，或者也可以存在中间特点和/或元件。相反，当一个特点或元件被称为“直接在”另一个特点或元件“上”时，不存在中间特点或元件。还应理解的是，当一个特点或元件被称为“连接”、“附接”或“偶联”到另一个特点或元件时，它可以直接连接、附接或偶联到另一个特点或元件或可能存在中间特征或元素。相反，当一个特征或元件被称为“直接连接”、“直接附接”或“直接偶联”到另一个特点或元件时，不存在中间特点或元件。尽管关于一个实施方案进行了描述或显示，但如此描述或显示的特点和元件可以应用于其他实施方案。本领域技术人员还将理解，对布置为“相邻”另一特点的结构或特点的指代可以具有与相邻特点重叠或位于其下方的部分。
本文使用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，并不旨在限制本发明。例如，如本文所用，单数形式“一”“一”和“该”旨在也包括复数形式，除非上下文另有明确指示。将进一步理解，当在本说明书中使用时，术语“包含”和/或“包括”)指定了所述特点、步骤、操作、元件和/或组分的存在，但不排除存在或添加一个或多个其他特点、步骤、操作、元件、组分和/或其组。如本文所用，术语“和/或”包括一个或多个相关列出的项的任何和所有组合并且可以缩写为“/”。
为了便于描述，本文可以使用如“在……下(under)”、“低于(below)”、“比……低(lower)”、“高于(over)”、“在……上(upper)”等空间相关术语来描述一个元件或特点与另一个或多个元件或特点的关系，如图中所阐明的。应当理解，除了图中描绘的方向之外，空间相对术语旨在涵盖装置在使用或操作中的不同方向。例如，如果图中的装置倒置，则描述为“在”其他元件或特点“在……下”或“下方(beneath)”的元件将被定向为“在其他元件或特点上”。因此，示例性术语“在……下(under)”可以涵盖上和下的方向。该装置可以以其他方式定向(旋转90度或在其他方向)并且本文使用的空间相关描述符相应地被解释。类似地，除非另有明确说明，本文中使用的术语“向上”、“向下”、“垂直”、“水平”等仅出于解释的目的。
尽管本文中可以使用术语“第一”和“第二”来描述各种特点/元件(包括步骤)，但是这些特点/元件不应受这些术语的限制，除非上下文另有说明。这些术语可用于区分一个特点/元素与另一特点/元素。因此，下面讨论的第一个特点/元件可以被称为第二个特点/元件，并且类似地，下面讨论的第二个特点/元件可以被称为第一个特征/元件而不背离本发明的教导。
在整个本说明书和所附权利要求书中，除非上下文另有要求，否则“包含”一词表示可以在方法和制品中共同使用各种组分(例如，组合物以及包括装置和方法的装置)。例如，术语“包括”将被理解为暗示包括任何陈述的元件或步骤，而不是排除任何其他元件或步骤。
一般而言，本文所述的任何装置和方法应被理解为是包容性的，但组分和/或步骤的全部或子集可以替代地是排他的，并且可以表示为“由”各种组分、步骤、子组分或子步骤“组成”或可替代地是“本质上是由”各种组分、步骤、子组分或子步骤“组成”。
如本文在说明书和权利要求中使用的，包括在实施例中使用的，并且除非另有明确规定，所有数字可以被理解为就像以词“约”或“大约”开头，即使该术语没有明确出现。当描述幅度和/或位置时，可以使用短语“约”或“大约”以指示所描述的值和/或位置在值和/或位置的合理预期范围内。例如，数值可能具有规定值(或值范围)的+/-0.1％、规定值(或值范围)的+/-1％、规定值(或值范围)的+/-2％、规定值(或值范围)的+/-5％、规定值(或值范围)的+/-10％等。此处给出的任何数值也应理解为包括约或大约该值，除非上下文另有说明。例如，如果值“10”被公开，那么“约10”也被公开。本文所述的任何数值范围旨在包括其中包含的所有子范围。还应当理解，当公开“小于或等于”该值的值时，“大于或等于该值”以及值之间的可能范围也被公开，如本领域技术人员适当理解的那样。例如，如果公开了值“X”，则还公开了“小于或等于X”以及“大于或等于X”(例如，其中X是数值)。还应理解，在整个申请中，数据以多种不同格式提供，并且该数据表示端点和起点，以及数据点任意组合的范围。例如，如果公开了特定数据点“10”和特定数据点“15”，则可以理解为大于、大于或等于、小于、小于或等于以及等于10和15，且在10和15之间被认为是公开的。还应当理解，两个特定单元之间的每个单元也被公开。例如，如果公开了10和15，则还公开了11、12、13和14。
尽管上面描述了各种说明性实施方案，但是可以对各种实施方案做出多种改变中的任一种而不脱离如权利要求所描述的本发明的范围。例如，在替代实施方案中，实施各种所述的方法步骤的顺序通常可以改变，并且在其他替代实施方案中，可以完全跳过一个或多个方法步骤。各种装置和系统实施方案的可选特点可以包括在一些实施方案中而不包括在其他实施方案中。因此，如权利要求中所述，提供上述描述主要是为了示例性目的，不应解释为限制本发明的范围。
此处包括的实施例和阐释通过说明而非限制的方式显示了可以实践本主题的特定实施方案。如所述，可以利用其他实施方案并从中衍生出其他实施方案，从而可以在不脱离本公开的范围的情况下进行结构和逻辑替换和改变。如果事实上不止一个发明被披露，本发明主题的此类实施方案可以在本文中单独地或共同地通过术语“发明”来指代，仅是为了方便，并且无意将本申请的范围自愿限制到任何单个发明或发明概念。因此，尽管这里已经阐明和描述了特定实施方案，但是任何被计算以实现相同目的的布置都可以代替所示的特定实施方案。本公开旨在涵盖各种实施方案的任何和所有修改或变化。上述实施方案的组合，以及本文未具体描述的其他实施方案，对于本领域技术人员在阅读以上描述后将是显而易见的。
Claims (99)
1.使用包含多个流体贮库的系统制造治疗性多核苷酸的方法，所述多个流体贮库配置为在与一个或多个微流体路径装置的密封流体连通中拴牢，所述方法包括：在所述多个流体贮库的一个或多个流体贮库和所述一个或多个微流体路径装置上多个反应器之间在密封且封闭的流体路径中输送试剂以实施以下步骤，所述流体路径受保护而免于大气接触：形成合成模板、从所述模板实施体外转录以产生治疗性多核苷酸，以及纯化所述治疗性多核苷酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其中纯化所述治疗性多核苷酸包括在所述多个反应器中的一个或多个内对所述治疗性多核苷酸进行二维(2D)纯化。
3.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括在所述一个或多个微流体路径装置上的一个或多个反应器中用递送媒介物配制所述治疗性多核苷酸以形成治疗性多核苷酸组合物。
4.根据权利要求3所述的方法，其进一步包括在所述一个或多个微流体路径装置中浓缩所述治疗性多核苷酸组合物。
5.根据要求3所述的方法，其中所述递送媒介物包含两亲性纳米颗粒。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述两亲性纳米颗粒包含氨基脂化拟肽。
7.根据权利要求1所述的方法，其中纯化所述治疗性多核苷酸包括在所述一个或多个反应器内使用纤维素材料去除双链mRNA。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述系统自动且连续地实施以下步骤：形成所述合成模板、从所述模板实施体外转录、以及用来自系统的一个或多个传感器的光反馈来纯化所述治疗性多核苷酸。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述治疗性多核苷酸是mRNA。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述治疗性多核苷酸是mRNA、环状RNA或自我复制RNA。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述系统通过流体动力在所述一个或多个流体贮库和所述多个反应器之间输送所述试剂。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述系统在所述一个或多个流体贮库和所述多个反应器之间气动地输送所述试剂。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述系统通过偏转所述一个或多个微流体路径装置内的一个或多个弹性层来在所述一个或多个流体贮库和所述多个反应器之间输送所述试剂。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法在护理位点实施。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述系统自动且连续地实施以下步骤：形成合成模板、从所述模板实施体外转录以产生治疗性多核苷酸，以及在少于3天内纯化所述治疗性多核苷酸。
16.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括将所述流体贮库密封到所述一个或多个微流体路径装置并且在所述流体贮库与所述一个或多个微流体路径装置上的所述多个反应器之间输送所述试剂之前对所述流体贮库加压。
17.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括在与所制造的所述治疗性多核苷酸相关联的文件中记录在所述步骤的实施期间在所述一个或多个微流体路径装置内的流体移动。
18.使用根据权利要求1所述的方法制备的治疗性多核苷酸。
19.使用包含多个流体贮库的系统制造治疗性RNA的方法，所述流体贮库配置为在与一个或多个微流体路径板装置的密封流体连通中拴牢，其中所述一个或多个微流体路径板装置包含多个反应器，所述方法包括：
从一个或多个所述流体贮库递送模板前体材料到所述多个反应器的第一一个或多个反应器区域，并处理所述模板前体材料以从所述模板前体材料制备模板；
转移所述模板到所述多个反应器的第二一个或多个反应器区域并通过体外转录处理所述模板以形成治疗性mRNA；和
转移所述治疗性mRNA到所述多个反应器的第三一个或多个反应器区域，并通过在所述第三一个或多个反应器区域内的二维(2D)纯化来纯化所述治疗性mRNA；
其中所有所述方法步骤都在不将所述模板和治疗性mRNA暴露于大气接触的情况下实施。
20.使用包含与一个或多个微流体路径板装置密封流体连通的多个流体贮库的系统制造治疗性mRNA的方法，其中所述一个或多个微流体路径板装置包含多个反应器，所述方法包括：
使用流体动力递送模板前体材料从一个或多个流体贮库到所述多个反应器的第一一个或多个反应器区域，并处理所述模板前体材料以从所述模板前体材料制备模板；
使用流体动力转移所述模板到所述多个反应器的第二一个或多个反应器区域，并通过体外转录处理所述模板以形成治疗性mRNA；
使用流体动力转移所述治疗性mRNA到所述多个反应器的第三一个或多个反应器区域，并通过在所述第三一个或多个反应器区域内的二维(2D)纯化来纯化所述治疗性mRNA；
使用流体动力转移所述治疗性mRNA到所述多个反应器的第四一个或多个反应器区域，并用递送媒介物包囊所述治疗性mRNA以形成治疗性mRNA组合物；和
使用流体动力在第五一个或多个流体贮库中浓缩所述治疗性mRNA组合物，
其中所述所有方法步骤均在不将所述模板和所述治疗性mRNA暴露于大气接触的情况下实施。
21.包含用于制造治疗性多核苷酸的指令的非暂时性计算机可读介质，所述指令当由包含多个流体贮库的系统的控制器执行时使所述控制器实施以下方法，所述流体贮库配置为在与一个或多个微流体路径装置密封的流体连通中拴牢：
对与一个或多个微流体路径装置流体连通的所述多个流体贮库加压；
在所述多个流体贮库的一个或多个流体贮库与所述一个或多个微流体路径装置上的多个反应器之间在密封且封闭的流体路径中输送试剂以实施以下步骤，所述流体路径受保护而免于大气接触：
形成合成模板，
从所述模板实施体外转录以产生治疗性多核苷酸，以及
纯化所述治疗性多核苷酸。
22.根据权利要求21所述的计算机可读介质，其中所述指令进一步使所述控制器自动且连续地实施以下步骤：形成所述合成模板、从所述模板实施体外转录以及基于来自所述系统的一个或多个光学传感器的光反馈来纯化所述治疗性多核苷酸。
23.根据权利要求21所述的计算机可读介质，其中所述指令进一步使所述控制器控制在所述多个反应器中的一个或多个内通过二维(2D)纯化来纯化所述治疗性多核苷酸。
24.根据权利要求21所述的计算机可读介质，其中所述指令进一步使所述控制器在所述一个或多个微流体路径装置上的一个或多个反应器中用递送媒介物配制所述治疗性多核苷酸以形成治疗性多核苷酸组合物。
25.根据权利要求21所述的计算机可读介质，其中所述指令进一步使所述控制器在所述一个或多个微流体路径装置中浓缩所述治疗性多核苷酸组合物。
26.根据权利要求21所述的计算机可读介质，其中所述指令进一步使所述控制器通过流体动力在所述一个或多个流体贮库和所述多个反应器之间输送所述试剂。
27.根据权利要求21所述的计算机可读介质，其中所述指令进一步使所述控制器通过偏转所述一个或多个微流体路径装置内的一个或多个弹性层来在所述一个或多个流体贮库和所述多个反应器之间输送所述试剂。
28.根据权利要求21所述的计算机可读介质，其中所述指令进一步使所述控制器自动且连续地实施以下步骤：形成合成模板、从所述模板实施体外转录以产生治疗性多核苷酸，以及在少于5天内纯化所述治疗性多核苷酸。
29.根据权利要求21所述的计算机可读介质，其中所述指令进一步使所述控制器在与所制造的所述治疗性多核苷酸相关联的文件中记录在实施所述步骤期间所述一个或多个微流体路径装置内的流体移动。
30.使用封闭路径系统制备用于mRNA合成的合成双链DNA模板的自动化方法，所述封闭路径系统包含配置为与一个或多个微流体路径装置的密封流体连通中拴牢的多个流体贮库，所述方法包括：
在所述多个流体贮库的一个或多个流体贮库与所述一个或多个微流体路径装置上的多个反应器之间在封闭的流体路径中输送试剂以组合所述试剂，所述封闭流体路径受保护而免于大气接触；和
形成用于体外转录治疗性mRNA的所述合成双链DNA模板。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述合成双链DNA模板不含细菌DNA且不含内毒素。
32.根据权利要求30所述的方法，其进一步包括在用于所述封闭路径系统的控制器中接收来自所述封闭路径系统的一个或多个传感器的光学传感器数据，其中所述控制器基于所述光学传感器数据控制所述封闭路径系统的操作。
33.根据权利要求30所述的方法，其进一步包括对所述流体贮库加压。
34.根据权利要求30所述的方法，其中输送试剂包括将感兴趣的合成基因和合成的体外转录促进子盒从所述多个流体贮库中的一个或多个流体贮库输送至所述微流体路径装置中的第一一个或多个反应器，连接所述感兴趣的合成基因与所述合成的体外转录促进子盒以创建合成产物，从所述合成产物中去除未反应的材料，并扩增所述合成产物以生成所述合成的双链DNA模板。
35.根据权利要求30所述的方法，其中所述一个或多个微流体路径装置包含位于所述封闭路径系统中的微流体路径板装置。
36.使用封闭路径系统制备用于体外转录的合成双链DNA模板的自动化方法，所述封闭路径系统包含在与微流体路径装置的密封流体连通中的多个流体贮库，所述方法包括：
在封闭流体路径中从所述多个流体贮库中的一个或多个流体贮库输送包括感兴趣的合成基因和合成体外转录促进子盒的试剂到所述微流体路径装置中的第一一个或多个反应器，所述封闭流体路径受保护而免于大气接触；
连接所述感兴趣的合成基因与所述合成的体外转录促进子盒以创建合成产物；
输送所述微流体路径装置中的所述合成产物以从所述合成产物中去除未反应的感兴趣的合成基因和未反应的合成体外转录促进子盒；和
输送在所述微流体路径装置中的所述合成产物并扩增所述合成产物以生成所述双链DNA模板。
37.根据权利要求36所述的方法，其中扩增所述合成产物生成大于1mM的扩增的DNA模板。
38.根据权利要求36所述的方法，其中所述合成双链DNA模板不含细菌DNA且不含内毒素。
39.根据权利要求36所述的方法，其进一步包括在用于所述封闭路径系统的控制器中接收来自所述封闭路径系统的一个或多个传感器的光学传感器数据，其中所述控制器基于所述光学传感器数据控制所述封闭路径系统的操作。
40.根据权利要求36所述的方法，其进一步包括对所述流体贮库加压。
41.根据权利要求36所述的方法，其中所述输送步骤各自包括使用一个或多个流体动力回路在所述多个流体贮库与所述微流体路径装置之间或在所述微流体路径装置内移动材料。
42.根据权利要求36所述的方法，其进一步包括转移所述扩增的DNA模板到所述微流体路径装置的一个或多个消化反应器，并酶促修饰扩增的合成产物以生成所述双链DNA模板。
43.根据权利要求36所述的方法，其中连接所述感兴趣的合成基因与所述合成的体外转录促进子盒以创建合成产物包括创建合成的线性或环状连接产物。
44.根据权利要求36所述的方法，其中扩增所述合成产物包括生成线性、分支或环状扩增的DNA产物，进一步包括线性化所述扩增的DNA产物以生成所述双链DNA模板。
45.根据权利要求36所述的方法，其中连接包括用DNA连接酶连接。
46.根据权利要求36所述的方法，其中连接包括退火或引物延伸。
47.根据权利要求36所述的方法，其中扩增包括多重置换扩增(MDA)。
48.根据权利要求36所述的方法，其中扩增包括聚合酶链式反应(PCR)扩增。
49.根据权利要求36所述的方法，其中所述合成的体外转录促进子盒包含含有启动子的双链DNA模板；5'UTR；可切割的接头；3'UTR；以及编码包含连续的至少200个腺嘌呤残基或200个胸苷残基的polyA区域的部分。
50.根据权利要求36所述的方法，其中所述双链DNA模板包括所述感兴趣的合成基因的3'末端的至少300bp长的polyA区域。
51.根据权利要求36所述的方法，其中所述体外转录促进子盒的长度小于1kb。
52.根据权利要求36所述的方法，其中所述合成的体外转录促进子盒不编码抗生素抗性基因。
53.根据权利要求36所述的方法，其中所述体外转录促进子盒不具有复制起点(ORI)。
54.使用封闭路径系统制备用于体外转录的合成双链DNA模板的自动化方法，所述封闭路径系统包含在与微流体路径装置的密封流体连通中的多个流体贮库，所述方法包括：
在封闭的流体路径中从所述多个流体贮库的一个或多个流体贮库输送包括感兴趣的合成基因和合成的体外转录(IVT)促进子盒的试剂到所述微流体路径装置中的第一一个或多个反应器，所述封闭流体路径受保护而免于大气接触；
连接所述感兴趣的合成基因与所述第一一个或多个反应器中的所述合成IVT促进子盒以创建合成产物；
输送所述合成产物到所述微流体路径装置中的第二一个或多个反应器以从所述合成产物中去除未反应的感兴趣合成基因和未反应的合成IVT促进子盒；
输送所述合成产物到所述微流体路径装置中的第三一个或多个反应器，并扩增所述合成产物以生成大于1mM的扩增的DNA模板；和
在用于所述封闭路径系统的控制器中接收来自所述封闭路径系统的一个或多个传感器的光学传感器数据，其中所述控制器基于所述光学传感器数据控制所述封闭路径系统的操作。
55.使用封闭路径系统制备用于体外转录的合成双链DNA模板的自动化方法，所述封闭路径系统包含在与微流体路径装置的密封流体连通中的多个流体贮库，所述方法包括：：
使用第一流体动力回路在封闭流体路径中从所述多个流体贮库的一个或多个流体贮库输送感兴趣的合成基因和合成的体外转录(IVT)促进子盒到所述微流体路径板装置的一个或多个连接反应器中，所述封闭流体路径受保护而免于大气接触，并连接所述感兴趣的合成基因到所述IVT促进子盒以创建合成产物；
使用第二流体动力回路将未反应的感兴趣的合成基因和未反应的合成体外转录促进子盒从所述微流体路径板装置中的所述合成产物中去除；
使用第三流体动力回路转移所述合成产物到所述微流体路径装置的一个或多个扩增反应器中并扩增所述合成产物以生成大于1mM的扩增的DNA模板；和
在用于所述封闭路径系统的控制器中接收来自所述封闭路径系统的一个或多个光学传感器的光学传感器数据，其中所述控制器基于所述光学传感器数据控制所述第一、第二和第三流体动力回路并在封闭路径和密闭环境中保持多个流体贮库和所述微流体路径装置。
56.使用系统实施体外转录(IVT)反应的自动化方法，所述系统包含配置为在与一个或多个微流体路径装置的密封流体连通中拴牢的多个流体贮库，所述方法包括在所述多个流体贮库的一个或多个流体贮库和所述一个或多个微流体装置上的多个反应器之间在封闭流体路径中输送试剂，所述封闭流体路径受保护而免于大气接触，以从所述一个或多个微流体路径装置中的模板实施治疗性mRNA的体外转录，并且纯化所述治疗性多核苷酸。
57.根据权利要求56所述的方法，其中所述系统通过偏转所述微流体路径装置内的一个或多个弹性层来实施输送试剂的步骤。
58.根据权利要求56所述的方法，其进一步包括在所述系统的控制器中从所述系统的一个或多个传感器接收光学传感器数据，其中所述控制器基于所述光学传感器数据控制所述系统的操作。
59.根据权利要求56所述的方法，其进一步包括对所述流体贮库加压。
60.根据权利要求56所述的方法，其中所述微流体路径装置包含位于所述系统中的微流体路径板装置。
61.根据权利要求56所述的方法，其中所述方法在护理位点实施。
62.根据权利要求56所述的方法，其中所述DNA模板包含感兴趣的合成基因的双链DNA模板和合成的体外转录促进子盒。
63.使用系统实施体外转录(IVT)反应的自动化方法，所述系统包含配置为在与微流体路径装置的密封流体连通中拴牢的多个流体贮库，所述方法包括：
从以下一项或多项递送DNA模板、聚合酶和核苷酸到所述微流体路径装置的一个或多个IVT反应器中：所述多个流体贮库的流体贮库和所述微流体路径装置上的位点；
在所述一个或多个IVT反应器中处理所述DNA模板和核苷酸以形成治疗性mRNA；和
转移所述治疗性mRNA到所述微流体路径装置的一个或多个纯化反应器区域中，并通过所述一个或多个纯化反应器区域内的二维(2D)纯化来纯化所述治疗性mRNA，
其中所述微流体路径装置和所述多个流体贮库形成防止大气暴露的封闭路径和密封环境。
64.根据权利要求63所述的方法，其进一步包括在用于所述封闭路径系统的控制器中接收来自所述封闭路径系统的一个或多个传感器的光学传感器数据，其中所述控制器基于所述光学传感器数据控制所述封闭路径系统的操作。
65.根据权利要求63所述的方法，其进一步包括对所述流体贮库加压。
66.根据权利要求63所述的方法，其中所述递送和输送步骤各自包括使用由控制器控制的一个或多个流体动力回路，在所述多个流体贮库和所述微流体路径装置之间或在所述微流体路径装置内移动所述DNA模板、聚合酶、核苷酸和治疗性mRNA材料。
67.根据权利要求63所述的方法，其中在控制器的控制下，通过偏转所述微流体路径装置内的一个或多个弹性层以避免在所述方法期间的大气接触来实施所述递送和输送步骤。
68.根据权利要求56所述的方法，其中所述微流体路径装置包含位于所述系统中的微流体路径板装置。
69.根据权利要求63所述的方法，其中所述方法在护理位点实施。
70.根据权利要求63所述的方法，其中所述IVT反应器包含一对连接的腔室，每个腔室具有液体接收部分和压力接收部分，其中所述液体接收部分与所述压力接收部分通过弹性层分离，所述弹性层可以通过所述压力接收部分偏转以调节所述液体接收部分的体积。
71.根据权利要求63所述的方法，其中所述DNA模板包含感兴趣的合成基因的双链DNA模板和合成的体外转录促进子盒。
72.根据权利要求63所述的方法，其进一步包括密封与所述微流体路径装置上的多个接收端口的流体连通中的所述多个流体贮库。
73.使用系统实施体外转录(IVT)反应的自动化方法，所述系统包含配置为与微流体路径装置的密封流体连通中拴牢的多个流体贮库，所述方法包括：
对所述多个流体贮库加压；
使用一个或多个第一流体动力回路以亚微升精度计量的量从以下一项或多项递送DNA模板、聚合酶和核苷酸到所述微流体路径装置的一个或多个IVT反应器中：所述多个流体贮库的流体贮库和所述微流体路径装置上的位点；
在所述一个或多个IVT反应器中处理所述模板材料和核苷酸以形成治疗性mRNA；和
使用第二流体动力回路转移所述治疗性mRNA到所述微流体路径装置的一个或多个纯化反应器区域中，并通过所述一个或多个纯化反应器区域内的二维(2D)纯化来纯化所述治疗性mRNA，
其中所述微流体路径装置和所述多个流体贮库形成防止大气暴露的封闭路径和密封环境。
74.包含用于实施体外转录(IVT)反应的指令的非暂时性计算机可读介质，所述指令当由包含多个流体贮库的系统的控制器执行时使所述控制器实施以下方法，所述流体贮库配置为在与一个或多个微流体路径装置的密封流体连通中拴牢，
在所述反应期间的任何时间，从多个流体贮库以亚微升精度计量的量气动递送模板材料、聚合酶和核苷酸到微流体路径装置的第一反应器中；
在所述第一反应器中处理所述模板材料和核苷酸以形成治疗性mRNA；和
气动转移所述治疗性mRNA通过所述微流体路径装置离开所述第一反应器，
其中所述第一微流体路径装置和所述多个流体贮库形成封闭路径和密封环境以防止大气暴露。
75.使用系统制造治疗性mRNA组合物的方法，所述系统包含与一个或多个微流体路径板装置的密封流体连通中的多个流体贮库，其中所述一个或多个微流体路径板装置包含多个反应器，所述方法包括：
递送模板前体材料从所述多个流体贮库的一个或多个流体贮库到所述多个反应器的第一反应器并处理所述模板前体材料以从所述模板前体材料形成DNA模板；
转移所述DNA模板到所述多个反应器的第二反应器，并通过体外转录处理所述DNA模板以形成治疗性mRNA；
转移所述治疗性mRNA到所述多个反应器的第三反应器并处理所述治疗性mRNA以将其与递送媒介物组合以形成所述治疗性mRNA组合物；和
转移所述治疗性mRNA组合物到与所述第三反应器流体连通的浓缩器。
76.根据权利要求75所述的方法，其中转移所述治疗性mRNA到第三反应器包括用所述递送媒介物转移多种不同的治疗性mRNA以形成所述mRNA组合物。
77.根据权利要求75所述的方法，其中所述递送和转移步骤由所述系统中的一个或多个流体动力回路实施，由控制器控制。
78.根据权利要求77所述的方法，其中所述控制器通过偏转所述一个或多个微流体路径板装置内的一个或多个弹性层来控制所述流体动力回路。
79.根据权利要求75所述的方法，其中所述方法在护理位点实施。
80.根据权利要求75所述的方法，其中组合所述治疗性mRNA与所述递送媒介物进一步包括在所述一个或多个微流体路径板装置中透析所述mRNA治疗性组合物以纯化所述mRNA治疗性组合物。
81.根据权利要求75所述的方法，其中所述递送媒介物包含两亲性纳米颗粒。
82.根据权利要求81所述的方法，其中所述两亲性纳米颗粒包含氨基脂化拟肽。
83.根据权利要求75所述的方法，其进一步包括在与所述第二反应器流体连通的所述多个反应器的一个或多个内通过二维(2D)纯化来纯化所述治疗性mRNA。
84.根据权利要求75所述的方法，其中制造所述治疗性mRNA组合物的方法耗时72小时或更短。
85.根据权利要求75所述的方法，其中所述多个反应器的第一反应器在所述多个微流体路径板装置的第一微流体路径板装置上并且所述多个反应器的所述第三反应器在第二微流体路径板装置上。
86.根据权利要求75所述的方法，其进一步包括在用于所述系统的控制器中接收来自所述系统的一个或多个传感器的光学传感器数据，其中所述控制器至少部分地基于所述光学传感器数据来控制所述封闭路径系统的操作。
87.使用系统制造治疗性mRNA组合物的方法，所述系统包含与一个或多个微流体路径板装置密封流体连通的多个流体贮库，其中所述一个或多个微流体路径板装置包含多个反应器，所述方法包括：
对所述多个流体贮库加压；
控制第一流体动力回路，从而以亚微升精度且不与大气接触地从所述多个流体贮库的一个或多个流体贮库递送模板前体材料到所述多个反应器的第一反应器；
处理所述模板前体材料以从所述模板前体材料形成DNA模板；
控制第二流体动力回路，从而以亚微升精度且不与大气接触地转移所述DNA模板到所述多个反应器的第二反应器；
通过体外转录处理所述DNA模板以形成治疗性mRNA；
控制第三流体动力回路，从而以亚微升精度且不与大气接触地转移所述治疗性mRNA到所述多个反应器的第三反应器；
处理所述治疗性mRNA以将其与递送媒介物组合以形成所述治疗性mRNA组合物；
控制第三流体动力回路以将所述治疗性mRNA组合物转移到与所述第三反应器流体连通的浓缩器；和
浓缩所述治疗性mRNA组合物。
88.按需生产治疗性多核苷酸组合物的方法，所述方法包括：
在本地设施接收已在远程设施合成的治疗性多核苷酸；
通过在受保护而免于大气接触的自动化系统中实施以下步骤以在所述本地设施配制所述治疗性多核苷酸组合物：
组合所述治疗性多核苷酸与容纳在所述系统中的微流体路径装置中的递送媒介物以形成所述治疗性多核苷酸组合物，
透析所述微流体路径装置中的所述治疗性多核苷酸组合物；和
提供所述治疗性多核苷酸组合物。
89.根据权利要求88所述的方法，其中合成所述治疗性多核苷酸包括在所述远程设施通过在受保护而免于大气接触的封闭流体路径装置中实施以下步骤使用微流体系统合成所述治疗性多核苷酸：形成合成模板、自所述合成模板实施体外转录以形成所述治疗性多核苷酸；以及纯化所述治疗性多核苷酸。
90.根据权利要求88所述的方法，其中所述本地设施是医院或诊所。
91.根据权利要求88所述的方法，其进一步包括浓缩所述治疗性多核苷酸组合物。
92.根据权利要求88所述的方法，其进一步包括在本地设施接收所述递送。
93.根据权利要求88所述的方法，其中所述治疗性多核苷酸组合物包含mRNA疫苗。
94.根据权利要求88所述的方法，其中配制所述治疗性多核苷酸包括使用所述系统，其中所述系统包含多个流体贮库，所述流体贮库配置为在与所述微流体路径装置的密封流体连通中拴牢。
95.根据权利要求92所述的方法，其中将所述治疗性多核苷酸与所述递送媒介物组合的步骤包括使用第一流体动力回路以亚微升精度且不与大气接触地将所述治疗性多核苷酸和所述递送媒介物从所述多个流体贮库递送到所述微流体路径装置的一个或多个反应器。
96.根据权利要求88所述的方法，其中在所述本地设施配制所述治疗性多核苷酸组合物进一步包括将一种或多种另外的治疗性多核苷酸与所述治疗性多核苷酸和所述递送媒介物组合。
97.根据权利要求88所述的方法，其中所述治疗性多核苷酸是mRNA、环状RNA或自我复制RNA。
98.根据权利要求88所述的方法，其进一步包括在配制所述治疗性组合物之前将所述治疗性多核苷酸存储于所述本地设施。
99.按需生产治疗性mRNA组合物的方法，所述方法包括：
在远程设施合成治疗性mRNA；
输送所述治疗性mRNA到本地设施；
通过在受保护而免于大气接触的自动化封闭流体路径装置中实施以下步骤以在所述本地设施配制所述治疗性mRNA组合物：
在微流体路径装置中组合所述治疗性mRNA与递送媒介物以形成所述治疗性mRNA组合物，
透析所述微流体路径装置中的所述治疗性mRNA组合物；和
提供所述治疗性mRNA组合物。
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