DE69818458T3

DE69818458T3 - Ribosom-komplexe als selektionspartikel für die in vitro anzeige und evolution von proteinen

Info

Publication number: DE69818458T3
Application number: DE69818458T
Authority: DE
Inventors: John Michael TAUSSIG; Mingyue He
Original assignee: Crescendo Biologics Ltd
Current assignee: Crescendo Biologics Ltd
Priority date: 1997-05-28
Filing date: 1998-05-28
Publication date: 2009-12-17
Anticipated expiration: 2018-05-29
Also published as: DE69818458T2; DE69818458D1; PT985032E; US6620587B1; ES2209145T5; ATE250668T1; EP0985032A1; AU725957B2; AU7666698A; JP2002500514A; WO1998054312A1; EP0985032B1; EP0985032B2; DK0985032T3; JP4060892B2; CA2291721C; DK0985032T4; ES2209145T3; CA2291721A1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
In der Molekularbiologie und Biotechnik liegt ein Schwerpunkt des aktuellen Interesses in der Darstellung großer Bibliotheken von Proteinen und Peptiden und in Mitteln für ihre Durchsuchung durch Affinitätsselektion. Der Schlüssel zur genetischen Ausnutzung eines Selektionsverfahrens ist eine physikalische Verbindung zwischen individuellen Molekülen der Bibliothek (Phänotyp) und der genetischen Information, die sie kodiert (Gentyp). Es steht eine Reihe von Verfahren auf Zellbasis zur Verfügung, wie z. B. auf den Oberflächen von Phagen (1), Bakterien (2) und Tierviren (3). Von diesen wird am häufigsten die Phagendarstellung angewendet, bei der Proteine oder Peptide individuell auf der Phagenoberfläche als Fusionen mit einem Hüllprotein exprimiert werden, während derselbe Phagenpartikel die DNA trägt, die das Protein oder Peptid kodiert. Die Selektion des Phagen wird durch eine spezifische Bindungsreaktion erreicht, die die Erkennung des Proteins oder Peptids einschließt, wodurch der spezielle Phage isoliert und kloniert und die DNA für das Protein oder Peptid wiedergewonnen und vermehrt oder exprimiert werden kann.
Eine besonders erwünschte Anwendung der Darstellungstechnik ist die Selektion von Antikörper-Bindungsstellen von kombinatorischen Bibliotheken (4). Das Screenen nach Antikörpern mit hoher Affinität zu spezifischen Antigenen erfolgt häufig durch Phagendarstellung von Antikörperfragmenten (4). Kombinationen der variablen (V) Regionen von schweren (H) und leichten (L) Ketten werden auf der Phagenoberfläche dargestellt, und rekombinante Phagen werden durch eine Bindung an immobilisiertes Antigen selektiert. Einkettige (sc) Fv-Fragmente, in denen die V_H und V_L Domänen durch ein flexibles Linker-Peptid verbunden sind, werden häufig zum Konstruieren solcher Bibliotheken verwendet. Ein weiterer einkettiger Antikörperfragmentetyp wird als V_H/K bezeichnet, bei dem die V_H Domäne mit der kompletten leichten Kette verbunden ist, d. h. V_H-Linker-V_L-C_L (10). Dies hat mehrere Vorteile, einschließlich einer Expressionsstabilität in E. coli und der Verwendung der C_L Domäne als Spacer und Markierung in Nachweissystemen wie Elisa und Western-Blotting. Antikörpergene der V_H und V_L Region werden ohne weiteres durch PCR erhalten und können zufällig rekombiniert werden, um große Bibliotheken von Fragmenten zu produzieren (21). Solche Bibliotheken können von normalen oder immunen B-Lymphozyten irgendeiner beliebigen Säugetierspezies erhalten oder künstlich von klonierten Genfragmenten mit synthetischen H-CDR3 Regionen konstruiert werden (dritte Complementary Determining Region der schweren Kette), die in vitro generiert werden (22). Einkettige Antikörperbibliotheken können eine Größe von > 10¹⁰ Elementen haben. Bibliotheken können auch durch Mutagenese klonierter DNA-Fragmente erzeugt werden, die spezifische V_H/V_L Kombinationen kodieren, und hinsichtlich Mutanten mit verbesserten Affinitäts- oder Spezifitätseigenschaften gescreent werden. Die Mutagenese findet vorzugsweise auf den CDR-Regionen statt und insbesondere auf der hochvariablen H-CDR3, wobei die potenzielle Anzahl von Varianten, die von einer Region von 10 Aminosäuren konstruiert werden könnte, 20¹⁰ oder 10¹³ beträgt.
Es ist klar, dass für eine effiziente Antikörperdarstellung ein Mittel zum Erzeugen und Selektieren von sehr großen Bibliotheken notwendig ist. Die Größe der Bibliotheken, die potenziell erzeugt werden können, übertrifft jedoch das Vermögen derzeitiger Technologien zur Darstellung aller Elemente um mehrere Größenordnungen. Folglich setzt die Erzeugung von Phagen-Display-Bibliotheken eine Bakterientransformation mit DNA voraus, allerdings bedeutet die wenig effiziente DNA-Aufnahme durch Bakterien, dass eine typische Anzahl von Transformatten, die erhalten werden kann, nur bei 10⁷–10⁹ je Transformation liegt. Es können zwar große Phagen-Display-Repertoires erzeugt werden (17), doch erfordern sie viele wiederholte Elektroporationen, da eine Transformation nicht im Maßstab vergrößert werden kann, so dass der Prozess langwierig bzw. impraktikabel wird. Neben den Beschränkungen der Transformation gibt es noch weitere Faktoren, die die Vielfältigkeit von Bibliotheken verringern, die mit Bakterien erzeugt werden; z. B. werden bestimmte Antikörperfragmente möglicherweise nicht sekretiert, möglicherweise proteolysiert oder sie bilden Einschlusskörper, so dass solche Bindungsstellen in der endgültigen Bibliothek fehlen. Diese Überlegungen treffen auf alle zellgestützten Verfahren zu. Für Bibliotheken mit 10¹⁰ oder mehr Elementen kann daher nur eine kleine Fraktion der potenziellen Bibliothek unter Anwendung derzeitiger Methodiken dargestellt und gescreent werden. Wie erwähnt wurde, kann die Größe einer Antikörperbibliothek, die entweder von tierischen oder humanen B-Zellen erzeugt oder künstlich konstruiert wird, ohne weiteres 10¹⁰ Elemente übertreffen, während die Anzahl möglicher Peptidsequenzen, die eine 10-Reste-Sequenz kodieren, 10¹³ beträgt.
Um diese Beschränkungen zu vermeiden, wurde nach alternativen Darstellungssystemen und insbesondere nach In-vitro-Verfahren gesucht, die das Problem der Transformation bei der Bibliothekenproduktion umgehen. Ein solches Verfahren beinhaltet die Darstellung von Proteinen oder Peptiden in naszierender Form auf der Oberfläche von Ribosomen, so dass auch ein stabiler Komplex mit der kodierenden mRNA gebildet wird; die Komplexe werden mit einem Liganden für das Protein oder Peptid selektiert und die genetische Information wird durch Umkehrtranskription der isolierten mRNA erhalten. Dies ist als Ribosomen- oder Polysomendarstellung bekannt. Eine Beschreibung eines solchen Verfahrens ist in zwei US-Patenten zu finden, die G. Kawasaki/Optein Inc. erteilt wurden (16). Darin werden halbzufällige Nucleotidsequenzen (wie in einer Bibliothek) an eine ”Expressionseinheit” angelagert und in vitro transkribiert; die resultierenden mRNAs werden in vitro translatiert, so dass Polysome produziert werden; Polysome werden durch Bindung an eine Substanz von Interesse selektiert und dann disruptiert; die freigegebene mRNA wird wiedergewonnen und zum Konstruieren einer cDNA verwendet. Zwei kritische Teile des Verfahrens sind das Unterbrechen des Ribosoms zur Produktion stabiler Komplexe, wozu Cycloheximid verwendet wird, und die Wiedergewinnung der mRNA, wozu die gebundenen Polysomen disruptiert werden, um mRNA freizugeben, und die mRNA wird dann separat wiedergewonnen. Letzteres ist ein integrierter Bestandteil des Verfahrens, das von Kawasaki beschrieben wird und bisher von allen anderen übernommen wurde. Der Abschnitt VII der Patente (16) befasst sich somit mit der Disruption der Polysomen durch die Beseitigung von Magnesium usw.; außer der ribosomalen Disruption wird kein anderes Verfahren zur Wiedergewinnung von RNA oder cDNA vorgeschlagen. Im US-Patent Nr. 5,643,768 betrifft Anspruch 1 das Translatieren von mRNA in einer solchen Weise, dass Polysomen mit angelagerten Polypeptidketten beibehalten werden, anschließend das Inkontaktbringen mit einer Substanz von Interesse und das Isolieren der mRNA von den Polysomen von Interesse. In Anspruch 2 wird cDNA nach der Isolierung von mRNA von den Polysomen, die sich spezifisch an die Substanz von Interesse binden, konstruiert. Dies wird in Anspruch 15 wiederholt, wobei Schritt (g) das Disruptieren der genannten Polysomen zur Freigabe der genannten mRNA und Schritt (h) das Wiedergewinnen der genannten mRNA umfasst, so dass eine Nucleotidsequenz isoliert wird, die ein Polypeptid von Interesse kodiert. Dies wird in ähnlicher Weise in Anspruch 29 (e): ... Isolieren von mRNA von den Polysomen, die spezifisch mit der Substanz von Interesse in Reaktion treten, wiederholt. Im US-Patent Nr. 5,658,754 setzt Anspruch 1 (g) auch das Disruptieren der genannten Polysomen zur Freigabe von mRNA voraus; (h) ist das Wiedergewinnen der genannten mRNA; und (i) ist das Konstruieren von cDNA von der genannten wiedergewonnenen mRNA. Kawasaki reduzierte das Verfahren in diesen Anmeldungen jedoch nicht praxisgerecht und lieferte keine Ergebnisse. Demzufolge wurde das Verfahren nicht optimiert und er war sich der Ineffizienz des von ihm beschriebenen Systems nicht bewusst, insbesondere hinsichtlich des Verfahrens zur Wiedergewinnung von mRNA durch Polysomdisruption.
Eine weitere Beschreibung der prokaryotischen Polysomendarstellung, dieses Mal praxisgerecht reduziert, ist die internationale veröffentlichte Anmeldung WO 95/11922 von Affymax Technologies (18) und die damit zusammenhängende Veröffentlichung von Mattheakis et al. (14). Beide betreffen das Affinitäts-Screening von Polysomen, die naszierende Peptide darstellen, wohingegen die Patentanmeldung auch das Screening von Antikörperbibliotheken beansprucht, die ebenso auf Polysomen dargestellt sind. Sie betreffen Bibliotheken von Polysomen, die spezifisch im E. coli S30 System erzeugt werden, in dem Transkription und Translation gekoppelt sind. Zur Erzeugung einer Population von unterbrochenen Polysomen werden Agenzien wie Rifampicin oder Chloramphenicol zugegeben, die eine prokaryotische Translation hemmen. Das Mittel zur Wiedergewinnung der genetischen Information nach der Selektion unterbrochener Ribosomen beinhaltet wieder die Elution der mRNA. In dem Fließdiagramm des Verfahrens, das in 10 der Patentanmeldung (18) dargestellt ist, ist ein integrierter Bestandteil Schritt 4, nämlich die Elution von mRNA von den Ribosomenkomplexen vor der cDNA-Synthese. Das Hauptbeispiel in dem Patent und der Veröffentlichung betrifft das Screenen einer großen Peptidbibliothek mit 10¹² Elementen durch Polysomendarstellung und Selektion von Epitopen durch einen spezifischen Antikörper. Die Polysomen wurden in mit Antikörper beschichteten Mikroplatten-Wells selektiert. Die gebundene mRNA wurde mit einem Elutionspuffer freigesetzt, der 20 mM EDTA enthielt, und wurde dann mit Phenol extrahiert und mit Ethanol präzipitiert in Anwesenheit von Glycogen, und das Pellet wurde in H₂O resuspendiert.
Es ist klar, dass die von Mattheakis et al. beschriebenen Verfahrensweisen beim Erfassen und/oder Wiedergewinnen von mRNA sehr ineffizient sind; folglich wurden gemäß S. 72 der Affymax-Anmeldung (18) nur 1–2% an radioaktiv markierter polysomaler mRNA wiedergewonnen, die das spezifische Peptidepitop kodierte, was anerkanntermaßen gering war (Zeile 5). Die Patentanmeldung (aber nicht die Veröffentlichung) beinhaltet außerdem die Selektion eines Antikörperfragments, jedoch weit weniger ausführlich. In diesem Fall wurden mit Antigen beschichtete magnetische Dynal-Kügelchen als Affinitätsmatrix verwendet. In dem Beispiel wurde markierte mRNA spezifisch wiedergewonnen, allerdings wurde keine Wiedergewinnung von cDNA durch RT-PCR erbracht. Somit gab es keine Schätzung hinsichtlich der Effizienz oder Empfindlichkeit und keine Demonstration einer Selektion von einer Bibliothek oder Anreicherung. Diese Techniken werden auch in einem späteren Dokument von Mattheakis et al. noch einmal betrachtet (26).
In einer jüngeren Veröffentlichung (15) modifizierten Hanes und Pluckthun das Verfahren von Mattheakis et al. zur Darstellung und Selektion einkettiger Antikörperfragmente. Während das Konzept beibehalten wurde, wurden zusätzliche Merkmale eingeführt, damit das Verfahren für die Darstellung von ganzen Proteinen in dem prokaryotischen E. coli S30 System geeigneter ist. Eine Innovation ist das Unterbrechen des Ribosoms durch die Abwesenheit eines Stoppcodons, das normalerweise die Freisetzung des naszierenden Proteins signalisiert. Wieder fand die Wiedergewinnung von genetischem Material durch eine Dissoziation der Ribosomenkomplexe mit 10 mM EDTA und Isolierung der mRNA durch Ethanolpräzipitation (oder Rneasy Kit) vor der Umkehrtranskription statt. Es wurden separate Transkriptions- und Translationsschritte angewendet, und es wurde angegeben, dass das gekoppelte Verfahren eine geringere Effizienz hat; Daten wurden diesbezüglich jedoch nicht geliefert. In jedem Zyklus wurde ein großer mRNA Input verwendet (10 μg).
Hanes und Pluckthun bauten viele Ergänzungen ein, um die mRNA-Ausbeute nach dem Polysomendarstellungszyklus zu verbessern, die anfänglich bei nur 0,001% lag (15). Dazu gehörten ”Bäumchen”-Strukturen am 5'- und 3'-Ende der mRNA, Vanadylribonucleosidkomplexe als Nucleaseinhibitor (die auch teilweise die Translation inhibieren), Proteindisulfidisomerase PDI (die die Bildung von Disulfidbindungen katalysiert) und ein Antisense-Nucleotid (um ssrA RNA zu inhibieren, die im prokaryotischen System ansonsten die Freisetzung und den Abbau von Proteinen verursacht, die ohne ein Stoppcodon synthetisiert werden). Die Kombination von Anti-ssrA und PDI erhöhte die Effizienz insgesamt um das 12fache. Die Ausbeute von mRNA am Ende des Zyklus lag mit allen Ergänzungen noch immer bei nur 0,2% des mRNA-Inputs, wodurch die kombinierte Effizienz aller Schritte gezeigt wurde, einschließlich Ligandenbindung (auf Mikrotiter-Wells), RNA-Freisetzung und -Amplifikation. Affymax haben bereits eine Ausbeute von 2%, d. h. das 10fache davon, als gering bezeichnet (s. oben).
Hanes und Pluckthun demonstrierten außerdem die Wiedergewinnung eines spezifischen Antikörpers von einem Gemisch (aus zwei), in dem er anfänglich in einem Verhältnis von 1:10⁸ vorlag. Hierzu waren 5 aufeinander folgende Wiederholungen des Zyklus erforderlich, d. h. unter Verwendung des DNA-Produkts aus einem Zyklus als Ausgangspunkt für den nächsten. In 4(A) der Quelle 15 gibt es einen erheblichen Übertrag der nicht selektierten Polysomen, wodurch wahrscheinlich das Verfahren zur Selektion oder mRNA-Wiedergewinnung reflektiert wird. Folglich ist der Anreicherungsfaktor relativ gering und liegt etwa beim 100fachen pro Zyklus.
Ein weiteres jüngeres Ribosomendarstellungsverfahren wurde von Roberts und Szostak (23) beschrieben, bei dem das naszierende Protein dazu gebracht wird, sich kovalent an seine mRNA durch ein Puromycin-Glied zu binden. In diesem System erfolgt die Selektion an diesen Protein-mRNA-Fusionen nach der Dissoziation des Ribosoms. Es unterscheidet sich daher wesentlich von den anderen hierin beschriebenen Verfahren, da es keine Selektion von Protein-Ribosomen-mRNA-Partikeln einschließt. Seine Effizienz liegt nur beim 20–40fachen.
KURZE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Es ist klar, dass die beschriebenen prokaryotischen Verfahren der Polysomendarstellung erheblichen Spielraum für methodische Verbesserungen lassen, um die Effizienz der mRNA-Wiedergewinnung, Empfindlichkeit und Selektion zu erhöhen. In der hierin beschriebenen Erfindung haben wir ein neuartiges eukaryotisches Verfahren zur Ribosomendarstellung entwickelt, und wir demonstrieren seine Anwendung für die Selektion und Mutation (Evolution) von Antikörpern sowie für die Selektion anderer Proteine von mRNA-Bibliotheken. Es könnte gleichermaßen für die Isolierung von Genen von cDNA-Bibliotheken angewendet werden.
Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Darstellung naszierender Proteine oder Peptide als Komplexe mit eukaryotischen Ribosomen und der mRNA, die das Protein oder Peptid kodiert, nach der In-vitro-Transkription und -Translation, zur weiteren Selektierung von Komplexen, die ein spezielles naszierendes Protein oder Peptid tragen, mit Hilfe einer Bindung an einen Liganden, ein Antigen oder einen Antikörper, und zur nachfolgenden Wiedergewinnung der genetischen Information, die das Protein oder Peptid kodiert, von dem selektierten Ribosomenkomplex durch Umkehrtranskription und Polymerasekettenreaktion (RT-PCR) bereit. Der RT-PCR-Wiedergewinnungsschritt wird direkt am intakten Ribosomenkomplex durchgeführt, ohne vorherige Dissoziation zur Freigabe der mRNA, was zu einer maximalen Effizienz und Empfindlichkeit beiträgt. Die Schritte zur Darstellung, Selektion und Wiedergewinnung können in aufeinander folgenden Zyklen wiederholt werden. Das Verfahren wird durch die Verwendung einkettiger Antikörperkonstrukte als Antikörper-Ribosomen-mRNA-Komplexe (ARMs) veranschaulicht. Es ist zur Konstruktion sehr großer Display-Bibliotheken, die z. B. mehr als 10¹² Komplexe umfassen, und zur effizienten Wiedergewinnung der DNA, die individuelle Proteine kodiert, nach der Affinitätsselektion geeignet. Wir liefern Hinweise für eine äußerst effiziente Anreicherung (z. B. 10⁴–10⁵ fach je Zyklus) und Beispiele, die seine Nützlichkeit bei der Darstellung und Selektion einkettiger Antikörperfragmente von Bibliotheken, Antikörper-Engineering, Selektion humaner Antikörper und Selektion von Proteinen von mRNA-Bibliotheken demonstrieren.
Das Verfahren ist in 1 mit Bezug auf seine Anwendung für Antikörperfragmente dargestellt. In dieser Form wird das Verfahren auch als ”ARM-Darstellung” bezeichnet, da die Selektionspartikel aus Antikörper-Ribosom-mRNA-Komplexen bestehen. Der Antikörper hat die Form des oben beschriebenen einkettigen Fragments V_H/K, das Verfahren ist jedoch im Prinzip für jede beliebige einkettige Form, wie scFv, gleichermaßen geeignet. Das Verfahren unterscheidet sich in einer Reihe von Details von den oben beschriebenen und führt zu unerwartet starken Verbesserungen im Hinblick auf Effizienz, Empfindlichkeit und Anreicherung. Im Prinzip basiert es auf zwei Versuchsergebnissen: (i) einkettige Antikörper werden in Kaninchen-Retikulozytenlysaten in vitro funktionell produziert (7), und (ii) in Abwesenheit eines Stoppcodons bleiben individuelle naszierende Proteine mit ihrer entsprechenden mRNA als stabile ternäre Polypeptid-Ribosomen-mRNA-Komplexe in zellfreien Systemen verbunden (8, 9). Wir haben diese Ergebnisse auf eine Strategie zur Erzeugung von Bibliotheken von eukaryotischen ARM-Komplexen angewendet und Komplexe, die spezifische Kombinationsorte trugen, unter Verwendung von antigengekoppelten Magnetpartikeln effizient selektiert. Bei der Selektion wird die relevante genetische Information als mRNA simultan erfasst.
Das hier verwendete gekoppelte Transkriptions-/Translationssystem ist ein Kaninchen-Retikulozytenextrakt (Promega), der eine effiziente DNA-Nutzung bietet. Insbesondere verhindert es die separate Isolierung von mRNA, wie in Quelle 15 beschrieben, die material- und zeitintensiv ist. Die Deletion des Stoppcodons von der kodierenden DNA ist als ein Mittel zum Unterbrechen des Ribosoms produktiver als die Verwendung von Inhibitoren, da sie gewährleistet, dass alle mRNAs bis zum 3' Ende gelesen werden und nicht an zufälligen Stellen im Translationsprozess unterbrochen werden. Der Stabilisierungseffekt der Deletion des Stoppcodons kann durch den Bedarf an Freisetzungsfaktoren erklärt werden, die das Stoppcodon erkennen und die Translation normalerweise beenden, indem sie die Freisetzung der naszierenden Polypeptidkette bewirken (19). Bei Abwesenheit des Stoppcodons bleibt die naszierende Kette an das Ribosom und die mRNA gebunden. Dort, wo das Bewirken einer Stoppcodon-Deletion problematisch ist, wie in cDNA oder mRNA Bibliotheken, wäre ein alternatives Verfahren die Verwendung von Suppressor-tRNA (mit einer Aminosäure beladen), die das Stoppcodon erkennt und überliest, so dass die Wirkung von Freisetzungsfaktoren (24) verhindert würde. Eine weitere Strategie der Ribosomenunterbrechung wäre die Verwendung von Suppressor-tRNA, die nicht durch eine Aminosäure beladen ist.
In einem neuen Schritt, der einen wesentlichen Unterschied zu vorherigen Verfahren darstellt, zeigen wir, dass cDNA erzeugt und amplifiziert werden kann durch eine Einstufen-Umkehrtranskription-Polymerasekettenreaktion (RT-PCR) an der ribosomgebundenen mRNA, so dass die Isolierung und nachfolgende Wiedergewinnung von mRNA mit Verfahren, die material- und zeitintensiv sind, völlig umgangen wird. Erfolg und Effizienz dieses Schritts sind erstaunlich, da allgemein angenommen wird, dass sich während der Translation mehrere Ribosomen an dasselbe mRNA-Molekül anlagern, wodurch ein Polysom gebildet wird, und es nicht bekannt war, welchen Effekt die Anwesenheit mehrerer hintereinander liegender Ribosomen auf einem einzigen mRNA-Molekül auf die Umkehrtranskription haben würde, bei der das RT-Enzym die Länge der mRNA lesen muss. Es ist daher nicht bekannt, ob das Enzym möglicherweise nebeneinanderliegende Ribosomen passieren kann oder ihre Beseitigung von der mRNA bewirkt oder nur auf mRNA-Molekülen wirkt, an die nur ein Ribosom angelagert ist: Welche Erklärung auch immer zutrifft, dieser Schritt trägt in hohem Maße zur demonstrierten Effizienz des Systems bei, in dem bis zu 60% des mRNA-Inputs in einem Zyklus wiedergewonnen werden können (6. Beispiel, 9), verglichen mit nur 2% in den prokaryotischen Systemen, die von Mattheakis et al. beschrieben werden (14), und 0,2% von Hanes und Pluckthun (15). Ferner haben wir gezeigt, dass im eukaryotischen System die Extraktion der mRNA vom Ribosomenkomplex als Wiedergewinnungsverfahren fünfmal weniger effektiv als die RT-PCR am nichtdisruptierten Komplex ist und dass selbst nach der EDTA-Extraktion ein großer Teil der mRNA am Ribosom gebunden bleibt (8. Beispiel 11).
Die Anreicherung individueller Antikörperfragmente unter Verwendung von ARM-Display-Bibliotheken ist ebenfalls effizienter als bei der beschriebenen prokaryotischen Darstellung (15). Wir haben Versuche durchgeführt, die zeigen, dass Gemische, in denen das gewünschte spezifische Fragment zu einem Teil in 10⁵ vorliegt, ein Bindungsfragment nach einem Zyklus hervorbringen können, mit einem effektiven Anreicherungsfaktor vom > 10⁴ fachen, und dass Zyklen hintereinander ablaufen können, um seltenere Molekülspezies von sehr großen Bibliotheken zu isolieren (Beispiele 10 und 11). Dies ist um 2–3 Größenordnungen je Zyklus effizienter als die in Verbindung mit dem prokaryotischen System erzielten Ergebnisse (15).
Da die ARM-Bibliotheken vollständig durch In-vitro-Techniken (PCR) erzeugt werden und keine bakterielle Transformation benötigen, ist ihre Größe in erster Linie durch die Anzahl von Ribosomen, die in das Reaktionsgemisch eingebracht werden können (–10¹⁴ je ml im Kaninchen-Retikulozyten-Kit, laut Herstelleranweisungen), und die DNA-Menge begrenzt, die pro Reaktion bequem zu handhaben ist. Somit wird die Produktion großer Bibliotheken weit einfacher als im Phagen-Darstellungsverfahren, bei dem der Begrenzungsfaktor die bakterielle Transformation ist. Ein bedeutender Anwendungsbereich ist die Selektion von Proteinen von großen Bibliotheken von Mutanten; die Bibliothek kann durch PCR-Mutation entweder zufällig oder in einer ortsspezifischen Weise erzeugt werden, und Mutanten mit erforderlicher Spezifität können durch Antigenbindung selektiert werden. Wir demonstrieren die Verwendung des ARM-Darstellungsverfahrens für die Selektion von Antikörper(V_H/K)-Fragmenten mit veränderter Spezifität von solchen Bibliotheken. Im 12. Beispiel wird diese Anwendung zum Antikörper-Engineering dargestellt, in dem die Spezifität eines Anti-Progesteron-Antikörpers in eine Testosteronbindung durch eine Kombination von Mutagenese und Selektion geändert wird. Solche Verfahren können auch zur Produktion katalytischer Antikörper angewendet werden. Die Funktionsweise des ARM-Zyklus selbst führt auch einen geringen Anteil einer zufälligen Mutation über Fehler der PCR ein; wir zeigen, dass die Rate solcher Fehler bei 0,54% je Zyklus liegt (9. Beispiel). Dies kann zur Selektion verbesserter Eigenschaften von Affinität und Spezifität führen und wird als ”Proteinevolution” bezeichnet, um auf die Entwicklung neuartiger Proteine durch eine Kombination von Mutation und Selektion hinzuweisen (15). Der eukaryotische ARM-Zyklus ist zur Durchführung einer effizienten In-vitro-Proteinevolution gut geeignet.
Die vorliegende Erfindung stellt außerdem ein neuartiges Verfahren zur Gewinnung von Antikörpern von Bibliotheken, die aus immunisierten Mäusen hergestellt sind, bereit, das die Hybridomtechnik umgeht. Wir liefern hierin ein Beispiel, bei dem humane Antikörper in vitro durch ARM-Darstellung einer Bibliothek abgeleitet werden, die von Lymphozyten solcher Mäuse präpariert wurde (13. Beispiel). Dadurch wird ein neuer Weg zur Ableitung humaner Antikörper für therapeutische Zwecke bereitgestellt.
Das hierin beschriebene Ribosomendarstellungsverfahren ist auch für jedes beliebige Protein oder Peptid anwendbar, das, nachdem es in vitro translatiert wurde, an das Ribosom und seine kodierende mRNA gebunden bleibt. Neben den Beispielen, die die Anwendbarkeit der ARM-Darstellung für Antikörper zeigen, demonstrieren wir auch die allgemeinere Anwendung über die Translation einer mRNA-Bibliothek, die direkt von normalem Gewebe erzeugt wurde, zur Selektion individueller Polypeptidketten (14. Beispiel).
Diese Version der Ribosomendarstellung erfüllt daher den Bedarf an einem einfachen In-vitro-Darstellungssystem für Proteine oder Peptide. Sie ist für sehr große Bibliotheken geeignet, in Kombination mit einer einfachen und effizienten Selektion und Wiedergewinnung genetischer Informationen; sie ist außerdem weniger anspruchsvoll in Bezug auf spezielle Bedingungen, empfindlicher und erzielt höhere Anreicherungsniveaus als bisher beschriebene Verfahren. Durch die Kombination eines eukaryotischen Systems mit effizienter mRNA-Wiedergewinnung wird ein System mit einer weit höheren Effizienz bereitgestellt als die, die von der fachkundigen Person vorhergesagt würde.
BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1. Der ARM-(Antikörper-Ribosomen-mRNA)-Darstellungszyklus, der die Erzeugung einer ARM-Bibliothek durch Mutagenese einer einkettigen Antikörperfragment-(V_H/K)-Matrize, die Selektion eines spezifischen ARM-Komplexes durch Binden an antigengekoppelte Magnetkügelchen und die Wiedergewinnung der genetischen Information durch RT-PCR darstellt.
2A. [SEQ ID 1]. Die Sequenz des DB3 V_H/K Expressionskonstrukts, das in der ARM-Erzeugung verwendet wird. Die Position der Primer ist in fett gedruckter Kursivschrift dargestellt. Die Startpunkte der V_H, V_L, Cκ Domänen und Linker werden angedeutet. D1–D4 sind vier stromabwärts gelegene Primer. D1 wird dazu verwendet, die DB3 V_H/K DNA voller Länge als Ausgangsmaterial für den ARM-Darstellungszyklus zu bilden. D2, D3 und D4 sind Wiedergewinnungs-Primer, die jeweils im ersten, zweiten und dritten Zyklus in Verbindung mit dem T7 Primer (s. 3) Primer sind für alle Maus-Antikörper mit einer leichten κ Kette geeignet.
2B. [SEG ID 2]. Primer, die in dem modifizierten ARM-Darstellungszyklus verwendet werden. Der neue stromaufwärts gelegene T7 Primer, einschließlich des T7 Promotors und Proteininitiationssignals, liefert eine verbesserte Ausbeute. Diese Figur zeigt auch die EVOU Primersequenz, bei der der XbaI Ort unterstrichen ist. In der Wiedergewinnungsphase der ARM-Darstellung führt die Kombination des stromaufwärts gelegenen (T7) Primers mit den stromabwärtigen Primern D2 und EVOU zur Wiedergewinnung von cDNA mit nahezu voller Länge in jedem Zyklus (s. 4). Diese Primer sind für alle Mausantikörper mit einer leichten κ Kette geeignet.
3. Es wird demonstriert, dass das 3' Ende der mRNA von dem Ribosom verdeckt ist und dass die Wiedergewinnung daher die stromaufwärts gelegenen Primer D2 und D3 (2A) für die Wiedergewinnungsstufen in den Zyklen 1 und 2 erfordert. In (A) wurde DB3 VH/K voller Länge transkribiert und entweder Primer D1 (1) oder D2 (2) zur Wiedergewinnung verwendet, die, wie das Gel zeigt, nur mit D2 erfolgreich war. In (B) wurde das PCR-Produkt aus Zyklus A in einem zweiten Zyklus mit dem Primer D2 (2) oder D3 (3) verwendet; hier war die RT-PCR-Wiedergewinnung nur mit dem Primer D3 erfolgreich.
4. Wiedergewinnung von V_H/K DNA derselben Größe über 5 Zyklen mit dem 3-Primer-Verfahren. RT Primer = D2 aus 2B; PCR Primer = EVOU aus 2B.
5. Spezifische Selektion eines Antikörper-V_H/K-Fragments im ARM-Zyklus.

A. Spezifische Selektion von DB3^R ARM-Komplexen durch Progesteron-BSA-gekoppelte Kügelchen. Bahn 1, RT-PCR von nichttranslatierter DB3^R mRNA, selektiert durch Progesteron-BSA-Kügelchen; 2, RT-PCR von DB3^R ARM, selektiert durch Progesteron-BSA-Kügelchen; 3, PCR von DB3^R ARM, selektiert durch Progesteron-BSA-Kügelchen; 4, RT-PCR von DB3^R ARM, selektiert durch Testosteron-BSA-Kügelchen; 5, PCR von DB3^R ARM, selektiert durch Testosteron-BSA-Kügelchen; 6, RT-PCR von DB3^R ARM, selektiert durch BSA-Kügelchen; 7, PCR von DB3^R ARMs, selektiert durch BSA-Kügelchen. 8 = 1 kb DNA-Marker.
B. Nichtbindung einer DB3^H35 ARM-Bibliothek an Progesteron-BSA-gekoppelte Kügelchen. Bahn 1, 1 kb DNA-Marker; 2, RT-PCR von Lösungskontrolle; 3, RT-PCR von DB3^H35 ARMs, selektiert durch Progesteron-BSA-Kügelchen; 4, RT-PCR von DB3^H35 ARMs, selektiert durch Ratten-Anti-κ-gekoppelte Kügelchen.
C. Selektion von DB3^R von ARM-Bibliotheken, die verschiedene Verhältnisse von DB3^R und DB3^H35 Mutanten enthalten. Die Selektion erfolgte mit Progesteron-BSA-gekoppelten Kügelchen. Bahn 1, Verhältnis zwischen DB3^R und DB3^H35 von 1:10; 2, 1:10²; 3, 1:10³; 4, 1:10⁴; 5, 1:10⁵; 6 = DB3^H35 Mutantenbibliothek alleine; 7, 1 kb DNA-Marker.

6. Spezifische Inhibition des löslichen DB3 V_H/K Fragments durch freie Steroide in Elisa (rechtes Feld) und von DB3 V_H/K in ARM-Format (Mitte), wobei das gleiche Spezifitätsmuster demonstriert wird. Das mittlere Feld zeigt das Ergebnis bei 100 ng/ml an freiem Steroid. Dies unterstützt die korrekte Faltung des Antikörperfragments auf dem Ribosom.
6A. Wirkung der DTT-(Dithiothreitol)-Konzentration in der Translationsreaktion auf die Erzeugung von funktionellem Antikörper in der ARM-Darstellung. Messenger-RNA, die DB3 VH/K kodiert, wurde in einer In-vitro-Transkriptionsreaktion erzeugt und zum Flexi-Kaninchen-Retikulozytenlysat-System (Promega) gegeben, wodurch DTT separat zugegeben werden kann. Bahn 1, 7: Marker, Bahn 2: nichttranslatierte mRNA-Kontrolle, Bahn 3: 0 DTT, Bahn 4: 2 mM DTT, Bahn 5: 5 mM DTT, Bahn 6: 10 mM DTT. Das Ergebnis zeigt, dass 0, 2 mM und 5 mM DTT eine gute ARM-Wiedergewinnung erbrachten, wobei nur bei 10 mM eine Inhibition auftrat.
7. Optimierung der Mg⁺⁺ Konzentration zur ARM-Darstellung.
8. Optimierung des zeitlichen Ablaufs der ARM-Darstellung.
9. Effizienz der Wiedergewinnung des mRNA-Inputs. cDNA, die vom ARM-Zyklus (vier Bahnen auf der linken Seite) wiedergewonnen wurde, wird mit cDNA verglichen, die direkt von der mRNA (Bahnen auf der rechten Seite) wiedergewonnen wurde; in jedem Fall durch RT-PCR.
10. Input-Empfindlichkeit der ARM-Darstellung; d. h. wie wenig DNA pro Zyklus verwendet werden kann. In diesem Experiment umfasste die Wiedergewinnungs-Primerkombination T7 und D4 (2A). (Es ist zu beachten, dass das Originalfoto eine schwache, aber deutlich erkennbare Bande bei 10 pg zeigt).
11. Ein Vergleich des Verfahrens (gemäß der Erfindung) zur Wiedergewinnung von cDNA ohne Ribosomendisruption, mit dem des Standes der Technik, das eine Ribosomendisruption voraussetzt. Die mit ”Intakt” gekennzeichnete Bahn zeigt die Wiedergewinnung von cDNA durch die vorliegende Erfindung, d. h. auf dem intakten Ribosom ohne Disruption. ”Disruptiert” bezieht sich auf die Wiedergewinnung von cDNA durch das Ribosomen-Disruptions-Verfahren des Standes der Technik unter Verwendung von 20 mM EDTA und eine nachfolgende Isolierung von mRNA vor der RT-PCR; ”Verbleibend” bezieht sich auf die Wiedergewinnung von cDNA mit dem erfindungsgemäßen Verfahren von mRNA, die mit dem Ribosom nach der Disruption gemäß dem Verfahren des Standes der Technik verbunden bleibt. Die relativen Ausbeuten von den 3 Wiedergewinnungsreaktionen wurden durch Densitometrie ermittelt.
12. Fehlerrate je Zyklus. Das Auftreten von Fehlern während eines einzigen Zyklus zur Selektion von DB3 VH/K ARM wurde durch Klonieren des wiedergewonnenen Produkts nach der RT-PCR und Vergleichen der Sequenzen der Klone mit denen von nativem DB3 bestimmt. Substitutionen sind im Fettdruck hervorgehoben.
13. Anreicherung eines spezifischen Antikörperfragments von einer Mutantenbibliothek: Analyse durch Klonieren. DB3^H35 (Nicht-Progesteron-Bindung) V_H/K wurde so konstruiert, dass der einmalig vorhandene HincII Ort entfernt war; nach der ARM-Selektion brachte die Behandlung mit HincII eine einzelne Bande von ~800 bp hervor. Im Gegensatz dazu bringt ein ähnlicher Verdau von DB3^R 2 Fragmente von ~500 bp und 300 bp hervor. Dadurch können Klone, die DB3^R Enthalten, von DB3^H35 durch HincII Verdau und Gelanalyse wie dargestellt unterschieden werden. DB3^R ARM-Komplexe wurden von Gemischen mit DB3^H35 nichtbindenden Mutanten im Verhältnis von 1:10 bis 1:10⁵. Die resultierende cDNA, die nach einem Selektionszyklus wiedergewonnen wurde, wurde kloniert; DNA wurde von individuellen Klonen präpariert und nach einem HincII und EcoRI Verdau analysiert. In jeder Bahn weist ein Dublett von Banden bei 500 und 300 bp auf DB3^R hin, wohingegen eine einzelne Bande bei ~800 bp DB3^H35 ist. Nach der Selektion wurden 10 Klone in jedem Verhältnis analysiert. Das Ergebnis zeigt einen Anreicherungsfaktor vom ~10⁴ fachen in einem Zyklus (siehe 10. Beispiel).
14. Anreicherung von DB3^R von einer Bibliothek mit einem Verhältnis von 1:10⁶ (DB3^R:DB3^H35) durch wiederholte ARM-Darstellungszyklen. Die Selektion erfolgte mit Progesteron-BSA-gekoppelten Kügelchen. Bahn 1, 1 kb DNA-Marker; 2, RT-PCR nach erstem Zyklus; 3, RT-PCR nach zweitem Zyklus; 4, RT-PCR nach drittem Zyklus. Die Verkürzung der Bande zwischen Zyklus 2 und 3 ist in der Verwendung verschiedener Primer (jeweils D3, D4) begründet.
15. Ändern der Antikörperspezifität durch Mutagenese und ARM-Selektion (1). Die DB3-Spezifität wurde von einer Progesteron-Bindung zu einer Testosteron-Bindung durch Mutagenese der H-CDR3-Schleife geändert, gefolgt von einem einzigen Zyklus der ARM-Selektion. Die Spezifität individueller Klone wurde durch ARM-Darstellung analysiert; die Selektion erfolgte mit Testosteron-BSA-gekoppelten Kügelchen. Oberes Feld: Klone vor Selektion; unteres Feld: Klone nach Selektion.
16. Ändern der Antikörperspezifität durch Mutagenese und ARM-Selektion (2): Selektion von DB3 H3 Mutanten durch Testosteron-BSA-Kügelchen in Anwesenheit von freiem Progesteron als Inhibitor. Bahn 1: Marker; Bahnen 2, 3: Bindung von DB3^R an Progesteron-BSA-(P)- oder Testosteron-BSA-(T)-Kügelchen; Bahnen 4, 5: Bindung der DB3 H3 Mutantenbibliothek an P-Kügelchen oder an T-Kügelchen in Anwesenheit von freiem Progesteron; Bahnen 6, 7: das DNA-Produkt von Bahn 5 wurde in einen weiteren ARM-Darstellungszyklus gegeben und mit P- oder T-Kügelchen erneut selektiert. (Es ist zu bemerken, dass das Originalfoto des Gels eine deutliche Bande in Bahn 7 zeigt).
17. Ändern der Antikörperspezifität durch Mutagenese und ARM-Selektion (3).
Die Steroidbindung von 5 individuellen Klonen nach der Selektion durch Testosteron-Kügelchen wurde durch ARM-Darstellung und Bindung an Progesteron-BSA-Kügelchen (P) und Testosteron-BSA-Kügelchen (T) analysiert.
18. Ändern der Antikörperspezifität durch Mutagenese und ARM-Selektion (4):
Charakterisierung eines testosteronspezifischen Klons, der durch ARM-Darstellung von der DB3 H3 Mutantenbibliothek abgeleitet wurde. Bahn 1: Marker; Bahnen 2, 3: Bindung des Klons an Progesteron-BSA-(P)- oder Testosteron-BSA-Kügelchen (T); Bahnen 4, 5: Bindung des Klons an T-Kügelchen in Anwesenheit von freiem Progesteron oder freiem Testosteron. Es wird die Sequenz der H3-Region des mutierten Klons (mut) dargestellt.
19. Sequenzen humaner Anti-Progesteron- und Anti-Testosteron-Antikörper, die von einer immunisierten transgenen Maus durch ARM-Darstellung isoliert wurden.
20. Selektion von Genen von einer mRNA-Gesamtbibliothek von Maus-Milzzellen durch Ribosomendarstellung.

Bahn 1: Marker
Bahn 2: RT-PCR der leichten λ Kette auf Gesamt-mRNA von Maus-Milzzellen.
Bahn 3: RT-PCR der leichten λ Kette nach In-vitro-Translation der obigen mRNA und Selektion von Ribosomenkomplexen durch Anti-κ-beschichtete Kügelchen.
Bahn 4: RT-PCR der leichten κ Kette auf Gesamt-mRNA von Maus-Milzzellen.
Bahn 5: RT-PCR der leichten κ Kette nach In-vitro-Translation des mRNA-Extrakts und Selektion von Ribosomenkomplexen durch Anti-κ-beschichtete Kügelchen.
Bahn 6: RT-PCR der schweren Immunglobulinkette von Gesamt-mRNA von Maus-B-Zellen.
Bahn 7: RT-PCR der schweren Immunglobulinkette nach In-vitro-Translation des mRNA-Extrakts und Selektion von Ribosomenkomplexen durch Anti-κ-beschichtete Kügelchen.

MATERIALIEN UND VERFAHREN DES ARM-RIBOSOMEN-DARSTELLUNGSZYKLUS (1.)
1. Einkettige Antikörperkonstrukte, die zur Erzeugung von ARM-Komplexen verwendet werden
Die Antikörper-Bindungsstellen, die zum Testen dieses Verfahrens verwendet werden, haben die von uns zuvor beschriebene Form, nämlich einkettige Drei-Domänen-Fragmente mit der Bezeichnung V_H/K, in denen die variable Domäne der schweren Kette (V_H) mit der kompletten leichten Kette (K) verbunden ist (10). Wir haben ein DNA-Konstrukt und bakterielles Expressionssystem zur Herstellung eines Anti-Progesteron-Antikörpers (DB3) als ein V_H/K Fragment (10) beschrieben, und es wurde sowohl eine periplasmatische als auch zytoplasmatische Expression demonstriert (11). Das DB3 V_H/K Fragment hat ausgezeichnete Antigenbindungseigenschaften, die in unseren Händen jenen der gewöhnlich verwendeten einkettigen Fv(scFv)-Form überlegen sind. Unter Anwendung des ”Megaprimer”-PCR-Verfahrens (12) an Plasmid-DNA, die DB3 V_H/K enthielt, wurden Mutanten an den Positionen H100 und H35, Bindungsstellen-Kontaktrückstände für Progesteron (13), produziert (nicht veröffentlichte Ergebnisse). DB3^R ist eine Mutante, bei der Tryptophan H100 durch Arginin substituiert wurde – eine Modifikation, die zu einer erhöhten Affinität zu Progesteron führt. Von E. coli exprimierte DB3^R band sich stark an Progesteron (Ka ~10⁹ M^–1), wies jedoch eine weit geringere Affinität zu Testosteron auf und war mit Bezug auf BSA nicht nachweisbar. Im Gegensatz dazu erbrachte eine Bibliothek von Mutanten, die an der Position H35 erzeugt wurden (mit der Bezeichnung DB3^H35), eine schwache oder gar keine Progesteronbindung. Wir haben die Mutanten DB3^R und DB3^H35 zum Testen des Prinzips der ARM-Selektion verwendet.
2. Verfahren zur Erzeugung von ARM-Komplexen
Zum Erzeugen von V_H/K DNA-Fragmenten zur Herstellung von ARMs wurde eine PCR mit geeigneten Matrizen zusammen mit (i) einem stromaufwärts gelegenen T7 Primer, der den T7 Promotor, die Proteininitiationssequenz und die degenerierte Sequenz komplementär zu Mausantikörper-5'-Sequenzen enthielt, und (ii) einem stromabwärts gelegenen Primer (D1) durchgeführt, dem ein Stoppcodon fehlte (2A). Die T7 Primersequenz war [SEG ID 3] 5'-gcgcgaatacgactcactatagagggacaaaccatgsaggtcmarctcgagsagtcwgg-3' (wobei s = c/g, m = a/c, r = a/g und w = a/t) und der D1 Primer war [SEQ ID 4] 5'-tgcactggatccaccacactcattcctgttgaagct-3', die einen BamHI Ort (unterstrichen) für Klonierungszwecke enthält. Zum Präparieren von V_H/K Konstrukten wurde eine standardmäßige PCR in einer Lösung durchgeführt, die 1 × PCR-Reaktionspuffer (Boehringer Mannheim UK, Lewes, East Sussex), 0,2 mM dNTPs (Sigma), 0,3 μM von jedem Primer, 0,05 U/μl Taq-Polymerase (Boehringer Mannheim) mit einem oder zwei Tröpfchen eines nucleasefreien Mineralöls enthielt, das die Oberfläche des Gemischs bedeckte. Es wurde das folgende Programm angewendet: 30 Zyklen, umfassend 94°, 1 min; 54°, 1 min; 72°, 1 min, anschließend 72°, 10 min; gefolgt von 4°.
V_H/K PCR Konstrukte (1 ng–1 μg), die entweder durch QIAquick (QIAGEN) gereinigt oder ungereinigt waren, wurden zu 20 μl des TNT T7 Quick Coupled Transcription/Translation Systems (Promega UK Ltd., Southampton, Hants SO16 7NS, UK) gegeben, das 0,02 mM Methionin enthielt, und das Gemisch wurde 60 Minuten lang bei 30° inkubiert. Das Protokoll kann auf 10 μl reduziert werden. Nach der Translation wurde das Gemisch mit einem gleichen Volumen kalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung verdünnt und 2 Minuten lang auf Eis gekühlt. (Die Optimierung der Bedingungen wird in den folgenden Beispielen 4 und 5 beschrieben.)
3. Modifikation von Primern
Der stromaufwärts gelegene T7 Primer, einschließlich des T7 Promotors und des Proteininitiationssignals, kann modifiziert werden, so dass eine bessere Ausbeute erzielt wird. Die modifizierte Sequenz ist [SEQ ID 5] 5'-gcagctaatacgactcactataggaacagaccaccatgsaggtcmarctcgagsagtcwgg, wie in 2B dargestellt ist.
4. Antigenselektion von ARM-Komplexen
Magnetkügelchen (Dynal, UK) wurden mit Rinderserumalbumin [BSA], Progesteron-11α-BSA, Testosteron-3-BSA (Sigma-Aldrich Co. Ltd., Poole, Dorset, UK) oder gereinigtem Ratten-Antimaus-κ-Antikörper (Spende von Dr. G. Butcher) gemäß Herstelleranweisungen gekoppelt. 2–3 μl antigen- oder anti-κ-konjugierte Magnetkügelchen wurden zum Translationsgemisch gegeben und für weitere 60 Minuten zu 4° übertragen, wobei durch leichtes Schütteln ein Absetzen verhindert wurde. Die Kügelchen wurden durch einen magnetischen Partikelkonzentrator (Dynal MPC) wiedergewonnen, dreimal mit 50 μl kalter, sterilisierter, phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), pH 7,4, die 0,1% BSA und 5 mM Magnesiumacetat enthielt, und einmal mit PBS alleine gewaschen. Zum Beseitigen eventuell vorhandener DNA-Kontaminierung wurden die Kügelchen 25 Minuten lang bei 37°C mit DNase I (Promega oder Boehringer Mannheim) in 50 μl DNase-I-Puffer (40 mM Tris-HCl, pH 7,5, 6 mM MgCl₂, 10 mM NaCl, 10 mM CaCl₂) behandelt, der 10 Enzymeinheiten enthielt, woraufhin drei Wäschen mit 50 μl PBS mit 1% Tween-20,5 mM Magnesiumacetat und eine Resuspension in 10 μl mit Diethylpyrocarbonat behandeltem Wasser folgten.
5 Wiedergewinnung und Amplifikation genetischer Information von antigenselektierten ARM-Komplexen
Zum Produzieren und Amplifizieren von cDNA von der mRNA von antigenselektierten ARMs wurde eine RT-PCR durch Zugabe von 2 μl der obigen Kügelchen-Suspension zu 23 μl des RT-PCR-Gemischs (Titan One-tube RT-PCR System, Boehringer Mannheim, oder Access RT-PCR System, Promega UK Ltd), das 1 μM von jedem Primer enthielt, durchgeführt. Die Primer umfassten den oben beschriebenen stromaufwärts gelegenen T7 Primer und einen neuen stromabwärts gelegenen Primer, D2, Sequenz 5'-cgtgagggtgctgctcatg-3', der dafür bestimmt ist, wenigstens 60 nt stromaufwärts des 3'-Endes von ribosomengebundener mRNA zu hybridisieren (2A). Durch die Verwendung dieses Primers braucht die mRNA nicht von ARM-Komplexen isoliert zu werden (1) und in einen Thermozykler (Techno Progene) gegeben. Das Programm für die Einstufen-RT-PCR umfasste: einen 45-Minuten-Zyklus bei 48°, gefolgt von einem 2-Minuten-Zyklus bei 94°, dann 30–40 30-Sekunden-Zyklen bei 94°, 1 min bei 54° und 2 min bei 68°; schließlich einen 7-Minuten-Zyklus bei 68°, gefolgt von 4°. PCR-Produkte wurden durch Agarosegelelektrophorese analysiert und von dem Gel zur Sequenzierung eluiert.
6. Weitere Zyklen der ARM-Komplexerzeugung und -selektion und Primer-Kombinationen für eine effiziente Wiedergewinnung in aufeinander folgenden Zyklen
Für weitere Zyklen wurden die oben produzierten PCR-Produkte entweder gelgereinigt oder direkt zum TNT-Transkriptions-/Translationssystem gegeben. In einem zweiten Zyklus war der stromabwärts gelegene RT-PCR Primer D3, Sequenz [SEQ ID 11] 5'-ggggtagaagttgttcaagaag-3', dazu bestimmt, stromaufwärts von D2 zu hybridisieren (2A); in ähnlicher Weise wurde im dritten Zyklus der Primer D4, [SEQ ID 12] 5'-ctggatggtgggaagatgg-3', der stromaufwärts von D3 hybridisierte, verwendet (2A). Die wiedergewonnene DNA wird in jedem Zyklus nach und nach kürzer, allerdings kann ein V_H/K voller Länge in jedem Zyklus durch Rekombinations-PCR regeneriert werden. Ferner beeinflusst die Verkürzung nur die konstante Domäne der leichten Kette und nicht die Antigen-Bindungsregion.
In diesem Protokoll erfordert jeder Zyklus einen neuen stromabwärts gelegenen Primer (D2, D3, D4), da das 3'-Ende der mRNA durch das Ribosom bedeckt und für den Primer unzugänglich ist. Dadurch braucht die mRNA zwar nicht von dem Ribosom getrennt zu werden, doch wird dadurch wie erwähnt auch eine Verkürzung der wiedergewonnenen cDNA in jedem Zyklus verursacht. Wir haben dieses Problem nun gelöst, indem wir einen neuen Primer mit der Bezeichnung EVOU entwickelt haben, in dem D2 eingebaut ist und der stromabwärts verläuft, wobei der größte Teil der 3'cDNA-Sequenz wiederhergestellt wird, und der in jedem Zyklus verwendbar ist.
Wie in 2B zu sehen ist, lautet die Sequenz des EVOU-Primers:
bold = XbaI site
Im Versuch wurde gezeigt, dass die Wiedergewinnung von cDNA auftritt, wenn ein Gemisch aus D2 und EVOU in der Wiedergewinnungs-RT-PCR verwendet wird (1. Beispiel, 4). Der unerwartete Aspekt des Ergebnisses besteht darin, dass durch die Verwendung des Primer-Gemischs nur eine Bande mit der erwarteten vollen Länge erzielt wird, wohingegen zwei Banden erwartet wurden. Dies ist wahrscheinlich in der Effizienz des EVOU-Primers unter den verwendeten PCR-Bedingungen begründet, die zu einem reinen und idealen Ergebnis führt.
In dem bevorzugten Verfahren sind die Primer daher der stromaufwärts gelegene T7 Primer und der stromabwärts gelegene Primer D2, Sequenz [SEQ ID 14] 5'-cgtgagggtgctgctcatg-3', der dafür bestimmt ist, wenigstens 60 nt stromaufwärts vom 3'-Ende der ribosomengebundenen mRNA zu hybridisieren, sowie der Primer EVOU, in dem D2 eingebaut ist (s. 2B).
Für weitere Zyklen wurden die oben produzierten PCR-Produkte entweder gelgereinigt oder direkt zum TNT-Transkriptions-/Translationssystem gegeben. Die Kombination von D2 und EVOU Primern wurde in der RT-PCR in jedem folgenden Zyklus verwendet. Die wiedergewonnene DNA hat daher in jedem Zyklus die gleiche Länge (4.)
7. Primer für humane VH/K-Antikörperfragmente
Die obigen Primer und die in 2 dargestellten sind für VH/K Fragmente von allen Maus-Immunglobulinen geeignet. Für humane Antikörper sind die entsprechenden Primer wie folgt

(Enzymorte sind unterstrichen; Hexahistidin-Markierung ist kursiv gedruckt).
ERGEBNISSE
1. BEISPIEL: WIEDERGEWINNUNG VON DNA DURCH RT-PCR AM RIBOSOMENKOMPLEX UND VERWENDUNG VON 2- ODER 3-PRIMER-KOMBINATIONEN
Im ARM-Verfahren (1) wird das Ribosom unterbrochen und der stabile Komplex (naszierendes Protein-Ribosom-mRNA) bildet sich aufgrund der Abwesenheit eines Stoppcodons am 3'-Ende der Botschaft aus. Da das Ribosom am 3'-Ende der mRNA unterbrochen wird, müsste Letztere für einen 3'-Primer und/oder Umkehrtranskriptase unzugänglich sein, wodurch ein stromaufwärts gelegener Primer zur Wiedergewinnung von cDNA notwendig würde. Dies wird durch das in 3 dargestellte Experiment bestätigt. Als DB3 DNA voller Länge, der das 3' Stoppcodon fehlte, transkribiert und die mRNA in vitro translatiert und mit Progesteron-BSA-Kügelchen selektiert wurde, zeigte die cDNA-Wiedergewinnung, dass das 3'-Ende der mRNA zum Priming in RT-PCR nicht verfügbar war, wohingegen ein stromaufwärts gelegener Primer (D2, 2A) die cDNA erfolgreich wiedergewann. In ähnlicher Weise war D2 in einem zweiten Zyklus nicht mehr wirksam, so dass ein Primer weiter stromaufwärts (D3, 2A) notwendig war. Folglich scheint das Konzept eines Ribosoms, das an das 3'-Ende der mRNA im ARM-Komplex gebunden ist, korrekt zu sein. Dieses Experiment demonstriert die Wiedergewinnung von cDNA durch RT-PCR am Ribosomen-mRNA-Komplex.
Zweifellos führt die wiederholte Verwendung des ARM-Zyklus in dieser Weise zu einer Verkürzung der wiedergewonnenen cDNA, so dass schließlich die Wiederherstellung der vollen Länge durch eine Rekombinations-PCR-Reaktion notwendig würde. In dem modifizierten Verfahren wird jedoch durch die Verwendung des D2 Primers in Kombination mit dem EVOU Primer (2B) in jedem Zyklus die volle Länge wiederhergestellt.
4 zeigt die Wiedergewinnung der VH/K cDNA voller Länge über 5 Zyklen. Der ARM-Zyklus wurde wie beschrieben durchgeführt, und es wurde die Kombination aus Primer D2 (als RT-Primer gekennzeichnet) und EVOU (PCR Primer) für die Wiedergewinnung verwendet. Die wiedergewonnene Produkt-DNA wurde dann in der gleichen Weise in 4 weiteren aufeinander folgenden Zyklen verwendet, und die Produkte wurden in jedem Fall analysiert. Wie dargestellt, wurde die volle Länge von VH/K von etwa 1 kb in jedem Zyklus wiedergewonnen, und die DNA wurde durch Sequenzierung bestätigt.
Die Verwendung dieser Primer-Kombinationen führt zu einer effizienten Wiedergewinnung von cDNA, ohne dass die mRNA durch Dissoziation des Polysoms separat isoliert werden muss, wie von anderen beschrieben wurde. Es ist eine schnelle und effiziente Möglichkeit zur Wiedergewinnung der genetischen Information als DNA (s. auch Beispiel 8).
2. BEISPIEL: ANTIGENSPEZIFISCHE ARM-SELEKTION
Zur Demonstration der antigenspezifischen ARM-Selektion wurde DB3^R V_H/K in vitro translatiert und ARMS wurden Magnetkügelchen ausgesetzt, die entweder mit Progesteron-11α-BSA, Testosteron-3-BSA oder nur BSA gekoppelt waren. Nach der RT-PCR wurde ein einzelnes DNA-Fragment nur von Progesteron-11α-BSA-gekoppelten Kügelchen nachgewiesen (5A, Bahnen 2, 4, 6), was mit der bekannten Spezifität von DB3^R V_H/K übereinstimmt. Das wiedergewonnene Fragment wurde durch Sequenzierung weiter als DB3^R bestätigt. Keine Banden wurden erhalten, wenn PCR alleine, anstelle von RT-PCR, an den Progesteron-11α-BSA-Kügelchen nach der Selektion durchgeführt wurde (5A, Bahnen 3, 5, 7) oder wenn das Verfahren mit nichttranslatierter DB3^R mRNA durchgeführt wurde (5A, Bahn 1). Folglich stammt die durch RT-PCR wiedergewonnene Bande von mRNA ab, die über die funktionelle Antikörper-Bindungsstelle von DB3^R selektiert wurde, und nicht von DNA-Kontaminierung oder mRNA-Übertragung.
3. BEISPIEL: INHIBITION DURCH FREIES ANTIGEN DER ARM-BINDUNG AN IMMOBILISIERTES ANTIGEN DEMONSTRIERT KORREKTE FALTUNG DES VH/K AUF DEM RIBOSOM
Die Inhibition durch freie Steroide kann zum Demonstrieren der korrekten Faltung und funktionellen Aktivität des ARM-Komplexes verwendet werden (6). Die Inhibition von als ARM exprimiertem DB3 V_H/K unter Verwendung verschiedener steroidischer Inhibitoren ist von der von nativem DB3 und rekombinantem V_H/K nicht unterscheidbar. Ferner deutet die 50%ige Inhibition durch Progesteron-11α-HMS bei 1 ng (2,5 nM) auf eine Affinität hin, die der von DB3 sehr ähnlich ist (Daten sind nicht dargestellt).
Die Inhibitoren aus freiem Steroid wurden zum DB3 ARM-Gemisch gegeben, um eine Bindung an die mit Progesteron beschichteten Kügelchen zu hemmen. Diese sind Progesteron-11α-Hemisuccinat (HMS) (P11), Progesteron-3-carboxymethyloxim (P3); Progesteron-6-HMS (P6) und Progesteron-21-HMS (P21). Die Inhibition von freiem DB3 V_H/K in einer Elisa-Reaktion ist auf der rechten Seite dargestellt, wobei die Effizienz der Steroide die folgende Reihenfolge hat: P11 > P3 > P6 > P21. Eine sehr ähnliche Reaktionsfolge und Konzentration ist für das naszierende DB3 V_H/K auf dem Ribosom als ARM erkennbar (das mittlere Feld zeigt repräsentative Ergebnisse der RT-PCR-Wiedergewinnungsreaktion).
Diese Demonstration ausgezeichneter Spezifität bestätigt, dass das naszierende Antikörper-V_H/K-Fragment im ARM-Komplex korrekt gefaltet ist. Ebenso brauchen keine Chaperone zum Kaninchen-Retikulozyten-System gegeben zu werden, wohingegen dies im prokaryotischen System auch erwünscht ist (15). Möglicherweise trägt das eukaryotische Ribosom an sich zur Faltung der naszierenden Polypeptidkette bei (25).
BEISPIEL 3A: OPTIMALE DTT-KONZENTRATIONEN ZUR ARM-DARSTELLUNG
Es wurde behauptet, dass einkettige Antikörper in Anwesenheit von 2 mM Dithiothreitol (DTT), das im Transkriptions-/Translation-Reaktionsgemisch vorliegt, keine korrekte Faltung aufweisen, dies scheint jedoch, wie in 6A. dargestellt, nicht der Fall zu sein. Der ARM-Zyklus wurde in Anwesenheit verschiedener DTT-Konzentrationen von 0–10 mM durch Translatieren von DB3 VH/K mRNA durchgeführt, die in einer separaten In-Vitro-Transkription produziert wurde; die Translationsreaktion fand im Flexi-Kaninchen-Retikulozyten lysat-System (Promega) statt, das die Zugabe von DTT zulässt. Das Ergebnis in 6A zeigt, dass 0, 2 mM und 5 mM DTT eine gute ARM-Wiedergewinnung erbrachten (Bahnen 3–5), wobei es nur bei 10 mM zu einer Inhibition kam (Bahn 6). Somit werden Faltung und Wiedergewinnung von 2 mM DTT nicht nachteilig beeinflusst. Proteindisulfidisomerase PDI, von der gesagt wird, dass sie für die Faltung von Antikörperdomänen im prokaryotischen E. coli S30 System wichtig ist (15), ist für die eukaryotische Ribosomendarstellung im Kaninchen-Retikulozyten-System folglich nicht erforderlich.
4. BEISPIEL: OPTIMIERUNG DER MAGNESIUMKONZENTRATION (7)
Magnesiumacetat wurde in unterschiedlichen Konzentrationen zum TNT-Transkriptions-/Translations-Reaktionssystem gegeben, wonach ein Vergleich der Wiedergewinnung von DNA nach dem ARM-Zyklus folgte. Eine optimale Ausbeute wurde mit 0,5 mM Mg-Acetat erzielt.
5. BEISPIEL: OPTIMIERUNG DES ZEITLICHEN ABLAUFS (8)
Im ARM-Zyklus wurde eine gekoppelte Transkription/Translation über verschiedene Zeitabschnitte durchgeführt, um den optimalen zeitlichen Ablauf der Reaktion zu bestimmen. Dieser liegt demnach bei einer Inkubation von 60 Minuten; danach gab es keine Verbesserung bei der Wiedergewinnung.
6. BEISPIEL: EFFIZIENZ DER WIEDERGEWINNUNG DES mRNA-INPUTS (9)
Zur Bewertung der Effizienz der mRNA-Wiedergewinnung während eines einzigen ARM-Zyklus wurde mRNA für DB3 VH/K separat durch In-vitro-Transkription präpariert. Die nach dem Translationsprozess, der ARM-Komplexselektion auf Progesteron-Kügelchen und RT-PCR an den Komplexen wiedergewonnene cDNA wurde mit der verglichen, die direkt vom nichtmanipulierten mRNA-Input wiedergewonnen wurde. Die 4 Bahnen auf der linken Seite zeigen eine Titration der cDNA, die nach der Wiedergewinnung vom ARM-Zyklus erhalten wurde, wohingegen die 4 Bahnen auf der rechten Seite jene zeigen, die vom mRNA-Input erhalten wurde. Gemäß einer Densitometrie werden tatsächlich etwa 60% der möglichen cDNA nach der ARM-Selektion wiedergewonnen. Um dieses Ergebnis zu erhalten, müssen 60% der mRNA in voll funktionelles Antigen-Bindungsprotein translatiert werden. Diese Wiedergewinnungsausbeute ist mit den von Mattheakis et al. berichteten 2% (14) und den 0,2% von Hanes und Pluckthun (15) zu vergleichen; sie demonstriert die stark erhöhte Effizienz des vorliegenden Verfahrens.
7. BEISPIEL: EMPFINDLICHKEIT DES ARM-ZYKLUS GEGENÜBER DNA-INPUT (10.)
Ein wesentlicher Parameter bei der Effizienz des Systems ist die Empfindlichkeit gegenüber dem DNA-Input, d. h. wie wenig DNA pro Zyklus verwendet werden kann. Dieses Experiment, bei dem der DNA-Input titriert wurde, zeigt, dass eine Bande mit einem Input von nur 10 pg wiedergewonnen werden kann. Die routinemäßig verwendete laufende Menge beträgt 1–10 ng (Bahnen 2 und 3). Über die Empfindlichkeit der prokaryotischen Verfahren durch Titration wird nicht berichtet, allerdings liegt die im Mattheakis-Verfahren (14) verwendete Menge bei 440 ng und die von Hanes und Pluckthun (15) bei 10 μg. Sehr wahrscheinlich tragen die von Letzteren verwendeten zusätzlichen Schritte, nämlich die Wiedergewinnung von mRNA vor der Translation und wieder vor der Umkehrtranskription, stark zum DNA-Bedarf bei. Dies kann ein kritisches Element bei der Anwendung des Verfahrens zur Durchsuchung großer Bibliotheken sein. Bei einem Input von 1 μg DNA und einer Empfindlichkeit von 10 pg müsste es zum Beispiel möglich sein, eine 10⁵ fache Anreicherung in einem einzigen Zyklus zu erreichen; und genau das haben wir gefunden (siehe 10. Beispiel). Bei einer geringeren DNA-Empfindlichkeit, die in den prokaryotischen Systemen vorzuliegen scheint, müsste entweder wesentlich mehr DNA eingegeben werden oder es müssten mehr Selektion- und Wiedergewinnungszyklen stattfinden.
8. BEISPIEL: VERGLEICH ZWISCHEN DEM VERFAHREN (GEMÄSS DER VORLIEGENDEN ERFINDUNG) ZUR WIEDERGEWINNUNG VON cDNA OHNE RIBOSOMENDISRUPTION UND DEM DES STANDES DER TECHNIK, DAS EINE RIBOSOMENDISRUPTION VORAUSSETZT (11)
Zur Bestimmung, in welchem Maße unser Verfahren zur Wiedergewinnung von cDNA am Ende des Darstellungszyklus, d. h. durch RT-PCR am intakten Komplex, effizienter ist als der Stand der Technik von Kawasaki (16), Mattheakis (14) und Hanes und Pluckthun (15), haben wir deren Verfahren durch Disruption des Ribosomenkomplexes und Wiedergewinnung von RNA vor der RT-PCR kopiert. Das Disruptionsverfahren folgte dem von Hanes und Pluckthun beschriebenen (15): Elutionspuffer war 50 mM Tris/Acetat, pH 7,5, 150 mM NaCl, 20 mM EDTA; 100 μl wurden zu Kügelchen gegeben und 10 Minuten lang bei 4°C inkubiert; freigesetzte RNA wurde durch Präzipitation mit Ethanol wiedergewonnen (Standardverfahren).
In dem Gel (11) zeigt die mit ”Intakt” gekennzeichnete Bahn unsere Wiedergewinnung nach einem Zyklus; die mit ”Disruptiert” gekennzeichnete Bahn ist die Wiedergewinnung durch das Disruptionsverfahren; und die mit ”Verbleibend” gekennzeichnete Bahn stellt das dar, was auf dem Ribosom nach der Disruption übrig bleibt. Die relativen Ausbeuten wurden durch Densitometrie verglichen und zeigten, dass die Wiedergewinnung, die mit am Ribosom angelagerter mRNA erreicht wurde, 5 Mal effizienter ist als die Ribosomendisruption, wenn sie beim eukaryotischen System angewendet wird, und dass beim Disruptionsverfahren ein erheblicher Teil der mRNA am Ribosom angelagert bleibt und somit effektiv verloren geht. Die Wiedergewinnung von cDNA durch RT-PCR am Ribosomenkomplex stellt daher einen bedeutenden Beitrag zur erhöhten Effizienz der Erfindung gegenüber dem Stand der Technik dar.
9. BEISPIEL: GENAUIGKEIT PRO ZYKLUS (12)
Ein wichtiger Aspekt der Erfindung ist ihr Potenzial für eine allmähliche In-vitro-Modifizierung von Proteinen, wobei man sich die Einführung von Zufallspunktmutationen durch die verschiedenen Polymerasereaktionen zunutze macht, die im Zyklus enthalten sind, gefolgt von einer Liganden-gestützten Selektion, d. h. Proteinevolution. Gleichzeitig macht eine sehr hohe Mutationsrate das System möglicherweise durch eine Beschädigung der Proteinstruktur oder Bindungsstellenspezifität funktionsunfähig. Wir haben daher die Fehler bewertet, die pro Zyklus eingeführt werden, indem wir die Produkte eines ARM-Zyklus kloniert haben, in dem DB3 durch Progesteron-BSA-Kügelchen selektiert wurde. Das Ergebnis in 12 zeigt eine Fehlerrate von 0,54%; diese ist niedrig genug, um die Struktur beizubehalten, aber hoch genug, um stetig nützliche Mutationen einzuführen, um ein verbessertes Proteinpotenzial wie Antikörper-Bindungsstellenaffinität zu entwickeln.
10. BEISPIEL: SELEKTION EINER INDIVIDUELLEN ANTIKÖRPER-BINDUNGSSTELLE VON ARM-DISPLAY-BIBLIOTHEKEN IN EINEM EINZIGEN ZYKLUS (5 und 13)
Ein weiterer wichtiger Anwendungsbereich der Ribosomendarstellung ist die Selektion von Antikörpern oder anderen Proteinen von Mutantenbibliotheken. Zur Untersuchung einer solchen Selektion und Bestimmung der durch die eukaryotische Ribosomendarstellung mögliche Anreicherung wurde DB3^R mit zufälligen DB3^H35 Mutanten vermischt, die Progesteron schwach oder gar nicht binden (in den Mutanten war das H35 Codon AAC zu C/G T/A/G A mutiert). Als die DB3^H35 Mutantenbibliothek allein als ARM-Komplexe dargestellt wurde, war keine DNA-Bande nach der Selektion mit Progesteron-11α-BSA-Kügelchen wiedergewinnbar (5B, Bahn 3; 5C, Bahn 6); die Translation von DB3^H35 wurde von der Bande demonstriert, die mit Kügelchen erhalten wurde, die mit Ratten-Anti-κ-Antikörper beschichtet waren (5B, Bahn 4). Als DNA-Gemische, die DB3^R und DB3^H35 Mutanten im Verhältnis von 1:10 bis 1:10⁵ enthielten, als ARMs dargestellt wurden, wurde in allen Fällen eine Bande von V_H/K-Größe nach einem einzigen Zyklus wiedergewonnen (5C, Bahnen 1–5). Selektierte DNA wurde sequenziert, und auf der Basis des Codon-Nachweises wurde gezeigt, dass, obwohl DB3^R vor der Selektion nicht in den 1:10³–1:10⁵ Bibliotheken nachweisbar war, es das dominierende Molekül war, das von der 1:10³ Bibliothek selektiert wurde, und eine Hauptkomponente des PCR-Produkts von den 1:10⁴ und 1:10⁵ Bibliotheken war. Somit ist eine Anreicherung vom 10⁴–10⁵ fachem in einem einzigen Zyklus der ARM-Selektion erreichbar.
Da die Sequenzierung eines gemischten PCR-Produkts möglicherweise nicht empfindlich genug ist, um genaue Informationen über die Anreicherung zu liefern, insbesondere, um das Verhältnis zwischen selektierten und nichtselektierten (Hintergrund)-Spezies zu definieren, wurde ein weiteres Mittel zur Unterscheidung zwischen DB3^R und DBH³⁵ Mutationen eingeführt. Ein einmalig vorhandener HincII Enzymort wurde von DB3^H35 entfernt, in DB3^R jedoch belassen. Somit verursachte der HincII Verdau eine V_H/K-Größenreduktion bei DB3^R von ~800 bp auf zwei Fragmente von 500 bp und 300 bp, wohingegen DB3^H35 Mutanten nicht gespalten wurden und als Fragment von ~800 bp liefen. Nach der Selektion von Gemischen in den gleichen Verhältnissen wie oben wurden die RT-PCR-Produkte kloniert und DNA von individuellen Klonen wurde durch einen Verdau mit EcoRI und HincII kartiert, wodurch eine quantitative Bestimmung des Anteils wiedergewonnener DB3^R und DB3^H35 Klone ermöglicht wurde. Wie in 13. dargestellt ist, waren 70% der von einer 1:10⁴ Bibliothek selektierten Klone und 40% von einer 1:10⁵ Bibliothek DB3^R.
Dadurch werden berechnete Anreichungsfaktoren vom ~10⁴ fachen erhalten, was mit den vorherigen Daten von der direkten Sequenzierung von PCR-Gemischen (oben) übereinstimmt. Durch die Verwendung einer größeren DNA-Menge im Zyklus könnte eine noch größere Anreicherung erhalten werden. Diese Anreicherungswerte sind erheblich höher als die für prokaryotische Systeme berichteten, die beim 100fachen (15) oder 40fachen (23) liegen.
11. BEISPIEL: SELEKTION EINER INDIVIDUELLEN ANTIKÖRPER-BINDUNGSSTELLE VON EINER ARM-DARSTELLUNGSBIBLIOTHEK IN ZWEI ODER DREI ZYKLEN (14)
Während eine DB3^R:DB3^H35 Bibliothek von 1:10⁶ keine nachweisbare RT-PCR Bande nach einem Zyklus hervorbrachte (14, Bahn 2) führten zwei weitere Zyklen der ARM-Erzeugung und Selektion zur Wiedergewinnung einer V_H/K Bande, wobei bei jeder Wiederholung eine erhöhte Intensität vorlag (14, Bahnen 3, 4). Die Sequenzierung bestätigte wieder die Selektion von DB3^R.
12. BEISPIEL: ÄNDERN DER ANTIKÖRPERSPEZIFITÄT DURCH MUTAGENESE UND ARM-SELEKTION VON EINER MUTANTEN-BIBLIOTHEK (ANTIKÖRPER-ENGINEERING) (15–18)
Die Affinität des DB3 Antikörpers zu Progesteron ist ~7000 mal größer als die zu Testosteron. Wir haben versucht, diese Spezifität durch eine Kombination der Mutagenese der H3-Schleife (CDR3 der schweren Kette) mit der ARM-Darstellung umzukehren. Eine H3-Mutantenbibliothek mit 3 × 10⁷ Elementen ohne Stoppcodone wurde durch Zufallsmutagenese der DB3^R Reste 98, 99, 101, 102 und 103 produziert. Individuelle Klone von dieser Bibliothek wurden vor der ARM-Selektion durch In-vitro-Expression im ARM-Format wie beschrieben analysiert. In 15. zeigt der obere Teil des Gels (Klone vor Selektion), dass es nach der Bindung an Testosteron-3-BSA-gekoppelte Kügelchen eine geringe oder keine Wiedergewinnung von cDNA gab. Die Mutantenbibliothek wurde dann als ARM-Komplexe dargestellt und in einem Zyklus durch eine Bindung an Testosteron-3-BSA-Kügelchen selektiert. Die wiedergewonnene cDNA wurde kloniert; individuelle Klone wiesen mm größtenteils eine positive Bindung an Testosteron-BSA auf, wobei eine starke Wiedergewinnung eine gute Bindung reflektierte (unterer Teil des Gels). Dies zeigt, dass das ARM-Darstellungsverfahren eine selektive Anreicherung von Mutantenklonen mit neuen Antigen-Bindungsgeigenschaften erbringt und dass das ARM-System für eine schnelle Analyse der Bindungsaktivität von Antikörperklonen verwendet werden kann.
Die Bibliothek wurde dann mit Progesteron-BSA- und Testosteron-BSA-Kügelchen selektiert. Für Letztere lag freies Progesteron-11α-Hemisuccinat vor, um die gesamte Progesteron-Bindung zu hemmen; der Effekt müsste somit eine komplette Umstellung der Spezifität auf Testosteron sein, wenn solche Binder in der Bibliothek vorliegen. In 16 stellen die beiden mittleren Bahnen dieses Ergebnis dar und demonstrieren, dass die Bibliothek Mutanten enthält, die sich spezifisch an Testosteron binden können. Die nach der Bindung an Testosteron-BSA-Kügelchen in Anwesenheit von freiem Progesteron wiedergewonnene cDNA wurde mit Progesteron- und Testosteron-Kügelchen rezirkuliert und wies Spezifität für Testosteron auf (Bahnen 6, 7). Dieses Ergebnis lässt darauf schließen, dass die Spezifität von der Bindung eines Liganden auf einen anderen umgestellt werden konnte. (Es ist zu beachten, dass die Bande in Bahn 7 auf dem Originalfoto deutlich erkennbar ist).
Zur Bestätigung der Spezifität der in Bahn 6 von 16. wiedergewonnenen cDNA wurde ihre Spezifität auch durch Klonierung untersucht. 17. stellt die Analyse individueller Klone dar, die als ARM-Komplexe in vitro exprimiert und hinsichtlich einer Bindung an Progesteron-BSA- und Testosteron-BSA-Kügelchen getestet wurden. Von 5 analysierten Klonen banden sich 3 bevorzugt an Testosteron, wodurch die Umwandlung der Spezifität von einer alleinigen Progesteron-Bindung (DB3^R) zu einer bevorzugten Testosteron-Bindung (Klone 1–3) demonstriert wird.
Einer der Klone, die durch Mutagenese und Selektion mit Testosteron in Anwesenheit von freiem Progesteron erhalten wurden, wurde durch ARM-Darstellung und DNA-Sequenzierung analysiert. In 18 ist erkennbar, dass sich der mutierte Testosteronbindungsklon spezifisch an Kügelchen band, die mit Testosteron-3-BSA (T) gekoppelt waren, ohne Kreuzreaktion mit Progesteron-11-BSA (P), und dass er spezifisch durch freies Testosteron-3-BSA (T), aber nicht durch freies Progesteron (P) inhibiert werden konnte.
Diese Ergebnisse demonstrieren, dass die Fähigkeit der ARM-Darstellung zur Selektion von großen Bibliotheken in Verbindung mit einer Mutagenese zur Durchführung eines Antikörper-Engineerings genutzt werden kann, insbesondere, um eine Veränderung der Antikörperspezifität durch die Schritte von Mutation und Selektion herbeizuführen.
13. BEISPIEL: SELEKTION HUMANER ANTIKÖRPER VON BIBLIOTHEKEN, DIE VON TRANSGENEN MÄUSEN PRÄPARIERT WURDEN (19)
Ein Bereich von großem Interesse ist die Verwendung von Darstellungsverfahren zur Isolierung humaner Antikörper, die zur In-vivo-Diagnose oder Therapie beim Menschen verwendet werden können. Die Quelle einer solchen Bibliothek können humane Lymphozyten von natürlich immunen oder aktiv immunisierten Personen sein. Um auf humane Antigene zu reagieren, von denen viele bedeutende therapeutische Ziele sind, müssen sich die humanen Lymphozyten in einer nichttolerierenden Umgebung entwickeln. Dies kann durch die Verwendung transgener Mäuse erreicht werden, die die Gene, die humane schwere und leichte Ketten in ihren Genomen kodieren, durch Embryomanipulation erworben haben; die Fähigkeit dieser Mäuse zur Bildung von endogenem Mausantikörper wurde durch die Einführung von Knockout-Deletionen eliminiert (20). Solche Mäuse reagieren auf eine Immunisierung mit humanen Antigenen mit der Produktion humaner Antikörper (20). Wir haben Mäuse immunisiert, die einen humanen Translocus der schweren Kette trugen, umfassend 5 V_H Gene, die komplette D–J Region und die Cμ und Cδ Gene, sowie einen Translocus der leichten Kette, der 8 V_L Gene, die gesamte J Region und das Cκ Gen trug. Die Mäuse wurden mit Progesteron-11α-HMS-BSA immunisiert und nach 8 Wochen wurde die Milz entfernt. Eine V_H/K DNA-Bibliothek wurde durch RT-PCR-Amplifikation der exprimierten V_H und Leichtketten-Gene präpariert, gefolgt von einer Zufallskombination durch die standardmäßige V_H/K Linkersequenz unter Anwendung von Rekombinations-PCR; das Stoppcodon wurde vom 3'-Ende der leichten Kette deletiert. Die Bibliothek wurde in vitro als ARM-Komplexe exprimiert und mit Progesteron-BSA- oder Testosteron-BSA-gekoppelten Magnetkügelchen selektiert. Wiedergewonnene cDNA wurde kloniert und sequenziert (19). Die Sequenzen ließen eine Identifizierung humaner VH und VL Gene und einen Vergleich der CDR3 Regionen der schweren Kette zu. Während eine repetitive Selektion von zwei humanen VH/VL Kombinationen vorliegt (VH4/Vk1-12 und VH1-2/Vk4-01), gibt es in den H3 Sequenzen eine beträchtliche Vielfalt. Einer der anhand einer Kristallografie im VH CDR2 von Anti-Steroid-Antikörpern (W50, der erste CDR2 Rest) identifizierten Steroid-Kontaktreste liegt allgemein vor, und ein relevanter Aromat liegt ebenfalls häufig um Rest 100 vor.
14. BEISPIEL: SELEKTION VON GENEN VON EINER mRNA-BIBLIOTHEK DURCH EUKARYOTISCHE RIBOSOMENDARSTELLUNG (20)
Zwar haben sich die bisher beschriebenen Beispiele alle auf die Expression und Selektion von Antikörperfragmenten bezogen, doch müsste die Ribosomendarstellung für jedes Protein geeignet sein, das eine selektierbare Funktionalität beibehält, wie z. B. eine Bindungsstelle oder ein Epitop, wenn es in naszierender Form an ein Ribosom gebunden ist. Es sollte daher möglich sein, Gene von cDNA oder mRNA Bibliotheken im Ribosomendarstellungsformat zu isolieren, z. B. Selektieren von Komplexen mit Antikörper- oder Ligandengekoppelten Partikeln.
Dieses Beispiel demonstriert die Verwendung der Ribosomendarstellung (1) zur Selektion eines Gens, das ein exprimiertes Protein kodiert, ausgehend von einem mRNA-Extrakt, der von Säugetierzellen erhalten wird, (2) zur Selektion einer spezifischen mRNA als Ribosomenkomplex unter Verwendung eines an Kügelchen angelagerten Antikörpers als Selektionsmittel, und (3) zur Wiedergewinnung des relevanten Gens durch RT-PCR, die an der ribosomengebundenen mRNA durchgeführt wird. Für die Bibliothek wurde mRNA mit dem Pharmacia mRNA-Reinigungskit extrahiert und mit dem Promega TNT Transkriptions-/Translationssystem direkt in vitro exprimiert. Es wurde kein Versuch unternommen, das Stoppcodon zu entfernen; stattdessen wurde die Reaktion nach 1 Stunde durch Kühlen auf Eis unterbrochen. Das Translationsgemisch wurde einem mit Magnetkügelchen verbundenen monoklonalen Ratten-Anti-κ-Antikörper ausgesetzt. Gebundene mRNA wurde in cDNA umgewandelt und durch RT-PCR mit spezifischen Primern für die κ-Kette und als negative Kontrollen für die leichte δ Kette und die schwere IgG Kette amplifiziert. Die Ergebnisse sind in 20. dargestellt. Die cDNA Banden in den Bahnen 2, 4 und 6 wurden direkt von der mRNA Bibliothek erhalten und zeigen, dass mRNA jeweils für humane δ und κ Leicht- und Schwerketten vorlag. Nach der Expression der mRNA im Ribosomendarstellungsformat und Selektion mit anti-κ-beschichteten Kügelchen wurde eine starke leichte κ Kette nach der RT-PCR wiedergewonnen (Bahn 4), ohne Bande für die leichte δ Kette (Bahn 3) und mit einer schwachen Bande für die schwere Kette (Bahn 7), wodurch die spezifische Selektion und Wiedergewinnung von κ Ketten-DNA demonstriert wurde. Soweit wir wissen, ist dies das erste Experiment, das die Selektion eines Proteins von einer natürlichen Bibliothek (d. h. von normalem Gewebe abstammend) durch Ribosomendarstellung darstellt.
SCHLUSSFOLGERUNGEN
Die höhere Effizienz dieses Darstellungsverfahrens gegenüber den zuvor beschriebenen ist demnach in einer Reihe von Faktoren begründet, Verwendung eines eukaryotischen Expressionssystems, gekoppelte Transkription und Translation, Unterbrechung des Ribosoms durch Eliminieren des Stoppcodons und effiziente Wiedergewinnung durch RT-PCR, die am Ribosomenkomplex stattfindet. Folglich wird zur Isolierung von mRNA in verschiedenen Stufen (nach Transkription, nach Selektion) keine Zeit und kein Material wie in der Beschreibung von Hanes und Pluckthun verbraucht. Der neue Schritt ist die Wiedergewinnung, die, wie wir gezeigt haben, der Ribosomendissoziation überlegen ist. Sie ist wahrscheinlich auch weit wirtschaftlicher, da sie die Handhabung von weit geringeren mRNA-Mengen in dem System zulässt, was zweifellos wichtig ist, wenn seltene Molekülspezies von großen Bibliotheken selektiert werden. Wir haben gezeigt, dass sehr kleine DNA-Einsatzmengen wiedergewonnen werden können, so dass die Verwendung von großen Bibliotheken praktikabel ist.
QUELLENANGABEN

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Claims

Verfahren zur Darstellung und Selektion von Proteinen oder Peptiden und zur Wiedergewinnung des genetischen Materials, das sie kodiert, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) Transkribieren und Translatieren von DNA in einem von eukaryotischen Zellen freien Transkriptions-/Translationssystem, so dass komplexierte Partikel gebildet werden, umfassend jeweils wenigstens ein individuelles naszierendes Protein oder Peptid oder ein anderes DNA-Expressionsprodukt in Verbindung mit einem oder mehreren Ribosomen und der spezifischen mRNA, die das Protein oder Peptid kodiert, (b) Inkontaktbringen der genannten komplexierten Partikel mit einem Ligand, Antigen, Antikörper oder einem anderen Agens, um die Partikel durch Binden an das Protein- oder Peptidprodukt auszuwählen, und (c) Wiedergewinnen der genetischen Information, die das Protein oder Peptid kodiert, als DNA mittels Umkehrtranskription und Polymerasekettenreaktion (RT-PCR), die an der mRNA durchgeführt wird, während Letztere am genannten komplexierten Partikel gebunden bleibt.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem Transkription und Translation gekoppelt sind.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Transkriptions-/Translationssystem ein Kaninchen-Retikulozytenlysatsystem ist.
Verfahren nach Anspruch 1, das die Herstellung von Protein-(oder Peptid)-Ribosom-mRNA-Komplexen von DNA und mRNA einschließt, der ein Stoppcodon fehlt.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Agens, das die komplexierten Partikel selektiert, immobilisiert und an Magnetkügelchen, Plastikschalen oder einen anderen unlöslichen Träger gebunden wird.
Verfahren, bei dem DNA durch Umkehrtranskription, gefolgt von einer Polymerasekettenreaktion (RT-PCR) erzeugt wird, wobei das Verfahren an mRNA angewendet wird, die mit einem oder mehreren eukaryotischen Ribosomen nach der Translation der mRNA physikalisch verbunden wird.
Verfahren zur Darstellung und Selektion von Proteinen oder Peptiden und zur Wiedergewinnung des genetischen Materials, das sie kodiert, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) gekoppeltes Transkribieren und Translatieren von DNA, der ein Stoppcodon fehlt, in einem zellfreien Kaninchen-Retikulozytensystem, so dass komplexierte Partikel gebildet werden, wobei jedes wenigstens ein individuelles naszierendes Protein oder Peptid oder ein anderes DNA-Expressionsprodukt in Verbindung mit einem oder mehreren Ribosomen und der spezifischen mRNA, die das Protein oder Peptid kodiert, umfasst; (b) Inkontaktbringen der genannten komplexierten Partikel mit einem insolubilisierten Ligand, Antigen, Antikörper oder einem anderen Agens, um die Partikel durch Binden an das Protein- oder Peptidprodukt auszuwählen, und (c) Wiedergewinnen der genetischen Information, die das Protein oder Peptid kodiert, als DNA mittels Umkehrtranskription und Polymerasekettenreaktion (RT-PCR), die an der mRNA durchgeführt wird, während Letztere am genannten komplexierten Partikel gebunden bleibt.
Verfahren nach den Ansprüchen 1, 4 oder 7, bei dem das Protein ein einkettiges Antikörperfragment ist.
Verfahren nach Anspruch 8, bei dem das einkettige Antikörperfragment die variable Region der schweren Kette (V_H) umfasst, die mit der variablen Region der leichten Kette (V_L) (scFv Fragment) oder der gesamten leichten Kette (K) (V_H/K Fragment) verbunden ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, das ferner die folgenden Schritte umfasst: (d) das den nachfolgenden Einbau der RT-PCR-Produkt-DNA, die durch das Verfahren aus Anspruch 1 oder 7 erhalten wird, in einen Expressionsvektor einschließt; und (e) Herstellen des Proteins oder Peptids durch Transformation von Bakterien wie E. coli.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 7, bei dem die in Schritt (a) gebildeten komplexierten Partikel eine Display-Bibliothek sind, die Proteine, Peptide oder andere DNA-Expressionsprodukte umfasst, die mit eukaryotischen Ribosomen und den spezifischen mRNAs, die diese Proteine, Peptide oder andere Produkte kodieren, komplexiert sind.
Verfahren nach Anspruch 11, bei dem den mRNA-Molekülen in der Display-Bibliothek aus Schritt (a) Stoppcodone fehlen.
Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, bei dem die individuellen Proteine in der Display-Bibliothek aus Schritt (a) Proteine umfassen, die sich spezifisch an Ligande binden können, wodurch die nachfolgende Selektion individueller Bestandteile der Bibliothek durch eine Bindung am immobilisierten Ligand ermöglicht wird.
Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, bei dem die in der Display-Bibliothek aus Schritt (a) dargestellten Proteine Antikörper oder Antikörperfragmente sind, einschließlich einkettiger Fragmente, die eine unterschiedliche Anzahl von Domänen umfassen, wie V_H, V_L, scFV, V_H/K, Fab.
Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, bei dem die in der Display-Bibliothek aus Schritt (a) dargestellten Produkte Rezeptoren sind.
Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, bei dem die in der Display-Bibliothek aus Schritt (a) dargestellten Produkte Peptide sind.
Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, bei dem die in der Display-Bibliothek aus Schritt (a) dargestellten Produkte Proteinmutanten sind.
Verfahren nach Anspruch 14, bei dem die Antikörper oder Fragmente in der Display-Bibliothek aus Schritt (a) von Lymphozyten immunisierter oder nichtimmunisierter Tiere oder Menschen erhalten werden.
Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, bei dem die DNA-Expressionsprodukte in der Display-Bibliothek aus Schritt (a) mit Hilfe einer Mutation klonierter DNA erzeugt werden, die Antikörper, Rezeptoren oder Fragmente davon kodiert.
Verfahren nach Anspruch 17 oder 19, das die Bildung einer Display-Bibliothek im Schritt (a) einschließt, und das die Selektion individueller Mutanten von der Display-Bibliothek im Schritt (b) einschließt.
Verfahren nach Anspruch 16, bei dem die Peptide in der Display-Bibliothek aus Schritt (a) in Schritt (b) verwendet werden, um Epitope zu identifizieren und kartieren, die von spezifischen Antikörpern oder Rezeptoren erkannt werden.
Verfahren zur Herstellung von Antikörpern einer Maus, Ratte oder eines anderen nicht menschlichen Säugetiers, das die folgenden Schritte umfasst: (a) Inkontaktbringen des Tieres mit Antigen, (b) Herstellen einer DNA-Bibliothek, die Kombinationen der V_H und V_L Regionen der Immunglobuline des genannten Tieres umfasst, die als einkettige Fv oder V_H/K Fragmente wie in Anspruch 9 verbunden sind, (c) Erzeugen einer eukaryotischen Ribosomen-Display-Bibliothek durch In-vitro-Transkription und Translation der genannten DNA-Bibliothek, so dass komplexierte Partikel gebildet werden, umfassend jeweils wenigstens ein individuelles naszierendes Antikörperfragment in Verbindung mit einem oder mehreren Ribosomen und der spezifischen mRNA, die das Antikörperfragment kodiert, (d) Inkontaktbringen der genannten komplexierten Partikel mit einem Antigen oder anderen Agens, um die Partikel durch Binden an ein Antigen oder anderes Agens zu selektieren, (e) Wiedergewinnen der genetischen Information, die das Antikörperfragment kodiert, mit Hilfe von Umkehrtranskription und Polymerasekettenreaktion (RT-PCR), die an der mRNA durchgeführt wird, während sie am genannten komplexierten Partikel gebunden ist; (f) Exprimieren und Auffangen der genannten Antikörperfragmente.
Verfahren zur Darstellung von Proteinen oder Peptiden als komplexierte Partikel und zur Wiedergewinnung der genetischen Information, die sie kodiert, umfassend die folgenden Schritte: (a) Translatieren von mRNA oder einer mRNA-Bibliothek in einem eukaryotischen zellfreien System, so dass komplexierte Partikel gebildet werden, umfassend jeweils wenigstens ein individuelles naszierendes Protein oder Peptid oder ein anderes Expressionsprodukt in Verbindung mit einem oder mehreren Ribosomen und der spezifischen mRNA, die das Protein oder Peptid kodiert, (b) Inkontaktbringen der Partikel mit einem Ligand, Antikörper oder einem anderen Agens, um eine Selektion der Partikel durch Binden an das Protein- oder Peptidprodukt zu erreichen, und (c) Wiedergewinnen der genetischen Information, die das Peptid, Protein oder DNA-Expressionsprodukt kodiert, als DNA mittels Umkehrtranskription und Polymerasekettenreaktion (RT-PCR), die an der mRNA durchgeführt wird, während sie an dem genannten komplexierten Partikel gebunden ist.
Verfahren zur Darstellung von Proteinen oder Peptiden als komplexierte Partikel und zur Wiedergewinnung der genetischen Information, die sie kodiert, umfassend die folgenden Schritte: (a) Transkribieren und Translatieren von cDNA oder einer cDNA-Bibliothek in einem eukaryotischen zellfreien System, so dass komplexierte Partikel gebildet werden, umfassend jeweils wenigstens ein individuelles naszierendes Protein oder Peptid oder ein anderes Expressionsprodukt in Verbindung mit einem oder mehreren Ribosomen und der spezifischen mRNA, die das Protein oder Peptid kodiert, (b) Inkontaktbringen der genannten komplexierten Partikel mit einem Ligand, Antikörper oder einem anderen Agens, um eine Selektion der Partikel durch Binden an das Protein- oder Peptidprodukt zu erreichen, und (c) Wiedergewinnen der genetischen Information, die das Peptid, Protein oder DNA-Expressionsprodukt kodiert, mittels Umkehrtranskription und Polymerasekettenreaktion (RT-PCR), die an der mRNA durchgeführt wird, während sie am genannten komplexierten Partikel gebunden ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 7, 22, 23 und 24, das die Schritte wiederholter Zyklen der Ribosomendarstellung und Selektion umfasst, bevor der Schritt der Wiedergewinnung genetischer Informationen erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, bei dem eine eukaryotische Ribosomen-Display-Bibliothek in Schritt (b) verwendet wird, um Liganden zur Kombination von Orten oder Rezeptoren zu selektieren, wobei solche Liganden als Arzneimittel oder Therapeutika Verwendung finden können.
Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, wobei eine Ribosomen-Display-Bibliothek in Schritt (b) verwendet wird, um Gene durch Binden translatierter Produkte am immobilisierten Antikörper oder Ligand zu isolieren.