ES2209145T3 - Complejos de ribosomas como particulas de seleccion para el desarrollo in vitro y evolucion de proteinas. - Google Patents

Abstract

La invención suministra un procedimiento para visualizar péptidos o proteínas nacientes como complejos con ribosomas eucarióticos así como el ARNm que codifica la proteína o el péptido después de la transcripción y de la traslación in vitro, para seleccionar complejos que soportan un péptido o proteína naciente por medio de la fijación a un ligante, antígeno o anticuerpo, y para recuperar subsecuentemente la información genética que codifica el péptido o la proteína del complejo de ribosomas seleccionado mediante transcripción inversa y reacción de la cadena de polimerasa (RT-PCR). El paso de recuperación por RT-PCR se lleva a cabo directamente sobre el complejo de ribosomas intacto, sin la anterior disociación para liberar el ARNm, contribuyendo de esta forma a su máxima eficacia y sensibilidad. Los pasos de visualización, selección y recuperación pueden repetirse en ciclos consecutivos. El procedimiento se ejemplifica utilizando construcciones de anticuerpos de cadena simple como complejos de anticuerpos-ribosoma-ARNm (ARM).

Description

Complejos de ribosomas como partículas de selección para el desarrollo in vitro y evolución de proteínas.

Antecedentes de la invención

Un foco actual de interés en biología molecular y biotecnología está en la presentación de grandes bibliotecas de proteínas y péptidos y en los medios para buscar en las mismas mediante selección por afinidad. La clave para el aprovechamiento genético de un método de selección es un enlace físico entre las moléculas individuales de la biblioteca (fenotipo) y la información genética que las codifica (genotipo). Están disponibles varios métodos basados en células, tales como sobre las superficies de fagos (1), bacterias (2) y virus animales (3). De éstos, el más ampliamente utilizado es la presentación en fagos, en el cual proteínas o péptidos son expresados individualmente sobre la superficie del fago como fusiones con una proteína de revestimiento, mientras que la misma partícula del fago lleva el ADN que codifica la proteína o el péptido. La selección del fago se consigue mediante una reacción de unión específica que implica el reconocimiento de la proteína o del péptido, permitiendo que el fago particular sea aislado y clonado y que el ADN para la proteína o el péptido sea recuperado y propagado o expresado.

Una aplicación particularmente deseable de la tecnología de presentación es la selección de sitios de combinación de anticuerpos a partir de bibliotecas combinatorias (4). La selección de anticuerpos de alta afinidad hacia antígenos específicos ha sido llevada a cabo en muchas ocasiones mediante la presentación en fagos de fragmentos de anticuerpo (4). Combinaciones de las regiones variables (V) de las cadenas pesada (H) y ligera (L) son presentadas en la superficie del fago y los fagos recombinantes son seleccionados mediante la unión a un antígeno inmovilizado. Fragmentos Fv de una sola cadena (sc), en los que los dominios V_{H} y V_{L} están unidos por un péptido adaptador flexible, han sido muy utilizados para construir tales bibliotecas. Otro tipo de fragmento de anticuerpo de una sola cadena es denominado V_{H}/K, en el cual el dominio V_{H} está unido a la cadena ligera completa, esto es V_{H}-adaptador-V_{L}-C_{L} (10). Éste tiene varias ventajas, incluyendo la estabilidad de expresión en E. coli y la utilización del dominio C_{L} como separador y como marca en sistemas de detección tales como ELISA y transferencia Western. Los genes de las regiones V_{H} y V_{L} de los anticuerpos son fácilmente obtenibles por PCR y pueden ser recombinados aleatoriamente para producir grandes bibliotecas de fragmentos (21). Tales bibliotecas pueden ser obtenidas de linfocitos B normales o inmunes de cualquier especie de mamífero o pueden ser construidas artificialmente a partir de fragmentos génicos clonados con regiones H-CDR3 (tercera región determinante de la complementariedad de la cadena pesada) sintéticas generadas in vitro (22). Las bibliotecas de anticuerpos de una sola cadena son potencialmente de un tamaño de >10^{10} miembros. Pueden generarse también bibliotecas mediante mutagénesis de fragmentos de ADN clonados que codifiquen combinaciones específicas de V_{H}/V_{L} y someterse a cribado para seleccionar mutantes que tengan propiedades de afinidad o especificidad mejoradas. La mutagénesis se lleva a cabo preferiblemente en las regiones CDR, y particularmente en la H-CDR3 altamente variable, en las que el número potencial de variantes que podrían ser construidas a partir de una región de 10 aminoácidos es de 20^{10} o de 10^{13}.

Está claro que para una presentación de anticuerpos eficaz es necesario tener un medio para producir y seleccionar a partir de bibliotecas muy grandes. Sin embargo, el tamaño de las bibliotecas que pueden ser potencialmente producidas supera en varios órdenes de magnitud la capacidad de las tecnologías actuales para presentar todos los miembros. Por tanto, la generación de bibliotecas de presentación en fagos requiere la transformación bacteriana con ADN, pero la baja eficacia de la captación de ADN por las bacterias significa que un número típico de transformantes que puede ser obtenido es solamente de 10^{7}-10^{9} por transformación. Aunque pueden crearse grandes repertorios de presentación en fagos (17), requieren muchas electroporaciones repetidas ya que la transformación no puede ser ampliada a escala, haciendo el proceso tedioso o poco práctico. Además de las limitaciones de la transformación, existen factores adicionales que reducen la diversidad de la biblioteca generada con bacterias, por ejemplo puede que ciertos fragmentos de anticuerpo no sean secretados, puede que sean proteolisados o puede que formen cuerpos de inclusión, conduciendo a la ausencia de tales sitios de unión en la biblioteca final. Estas consideraciones afectan a todos los métodos basados en células. Así, para bibliotecas con 10^{10} o más miembros, puede presentarse y someterse a selección utilizando las metodologías actuales solamente una pequeña fracción de la biblioteca potencial. Según se indicó, el tamaño de una biblioteca de anticuerpos generada a partir de células B animales o humanas o construida artificialmente puede exceder fácilmente de los 10^{10} miembros, mientras que el número de secuencias peptídicas posibles que codifican una secuencia de 10 residuos es de 10^{13}.

Con el fin de evitar estas limitaciones, se han buscado sistemas de presentación alternativos, en particular métodos in vitro que eviten el problema de la transformación en la producción de bibliotecas. Uno de tales métodos es la presentación de proteínas o péptidos en forma naciente sobre la superficie de ribosomas, de tal manera que se forma también un complejo estable con el ARNm codificador; los complejos son seleccionados con un ligando para la proteína o el péptido y la información genética es obtenida mediante transcripción inversa del ARNm aislado. Esto se conoce como presentación en ribosomas o polisomas. Una descripción de tal método se encuentra en dos patentes de EE.UU., otorgadas a G. Kawasaki/Optein Inc. (16). En las mismas, secuencias de nucleótidos semialeatorias (igual que en una biblioteca) son unidas a una "unidad de expresión" y transcritas in vitro; los ARNms resultantes son traducidos in vitro de tal manera que se producen polisomas; los polisomas son seleccionados por unión a una sustancia de interés y posteriormente son sometidos a ruptura; el ARNm liberado es recuperado y utilizado para construir ADNc. Dos partes críticas del método son el bloqueo del ribosoma con el fin de producir complejos estables, para lo cual se utiliza cicloheximida, y la recuperación del ARNm, para lo cual se rompen los polisomas unidos para liberar el ARNm y el ARNm es posteriormente recuperado separadamente. Esta última es una parte integral del método según está descrito por Kawasaki y ha sido adoptada por todos los demás hasta ahora. Así, la sección VII de las patentes (16) se refiere a la ruptura de los polisomas mediante la eliminación de magnesio, etc.; no se sugiere ningún otro método para la recuperación del ARN o del ADNc distinto de la ruptura ribosómica. En la Patente de EE.UU. nº 5.643.768, la reivindicación 1 se refiere a la traducción del ARNm de tal manera que se mantengan los polisomas con cadenas polipeptídicas unidas, poniéndolos en contacto posteriormente con una sustancia de interés, y finalmente aislando el ARNm de los polisomas de interés. En la reivindicación 2, se construye ADNc después del aislamiento de ARNm de los polisomas que se unen específicamente a la sustancia de interés. Esto se reitera en la reivindicación 15, en la que la etapa (g) comprende la ruptura de dichos polisomas para liberar dicho ARNm y la etapa (h) comprende la recuperación de dicho ARNm, aislando de este modo una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de interés. De manera similar, esto se repite de nuevo en la reivindicación 29 (e) ... aislando el ARNm de los polisomas que reaccionan específicamente con la sustancia de interés. En la Patente de EE.UU. nº 5.658.754, la reivindicación 1 (g) requiere también la ruptura de dichos polisomas para liberar ARNm; (h) es la recuperación de dicho ARNm e (i) es la construcción de ADNc a partir de dicho ARNm recuperado. Sin embargo, Kawasaki no llevó el método a la práctica en estos registros y no proporcionó resultados. Por consiguiente, el método no fue optimizado y él desconocía la ineficacia del sistema según lo había descrito, en particular la debida al método de recuperación del ARNm mediante la ruptura de los polisomas.

Otra descripción de la presentación en polisomas procarióticos, esta vez llevada a la práctica, es la solicitud internacional publicada WO 95/11922 de Affymax Technologies (18) y la publicación asociada de Mattheakis y col. (14). Ambas se refieren a la selección por afinidad de polisomas que presentan péptidos nacientes, mientras que el registro de la patente reivindica también la selección de bibliotecas de anticuerpos presentadas de manera similar en polisomas. Hacen referencia a bibliotecas de polisomas, generadas específicamente en el sistema de E. coli S30 en el cual la transcripción y la traducción están acopladas. Para producir una población de polisomas bloqueados, se añaden agentes tales como rifampicina o cloranfenicol que bloquean la traducción procariótica. El medio de recuperación de la información genética después de la selección de ribosomas bloqueados es de nuevo por elución del ARNm. En el diagrama del método mostrado en la Figura 10 de la solicitud de patente (18), una parte integral es la Etapa 4, a saber la elución del ARNm de los complejos de ribosomas antes de la síntesis del ADNc. El ejemplo principal de la patente y de la publicación es el cribado de una biblioteca peptídica grande con 10^{12} miembros mediante la presentación en polisomas y la selección de epítopos por un anticuerpo específico. Los polisomas fueron seleccionados en pocillos de microplacas revestidos con anticuerpo. El ARNm unido fue liberado con un tampón de elución que contenía EDTA 20 mM y fue posteriormente extraído con fenol y precipitado con etanol en presencia de glucógeno y la pella fue resuspendida en H_{2}O.

Está claro que los procedimientos descritos por Mattheakis y col. son muy ineficaces para capturar y/o recuperar el ARNm; así, en la página 72 del registro de Affymax (18), se recuperó solamente el 1-2% del ARNm polisómico radiomarcado que codificaba el epítopo peptídico específico, recuperación que fue reconocida como baja (línea 5). La solicitud de patente (pero no la publicación) incluye también la selección de un fragmento de anticuerpo, pero con mucho menos detalle. En este caso, se utilizaron como matriz de afinidad esferas magnéticas Dynal revestidas con antígeno. En el ejemplo, ARNm marcado fue recuperado específicamente, pero no presentaban la recuperación de ADNc mediante RT-PCR. Por tanto, no había ningún cálculo de la eficacia ni de la sensibilidad, ni tampoco una demostración de la selección a partir de una biblioteca ni de enriquecimiento. Estas técnicas están revisadas también en un artículo posterior de Mattheakis y col. (26).

En una publicación más reciente (15), Hanes y Pluckthun modificaron el método de Mattheakis y col. para la presentación y selección de fragmentos de anticuerpos de una sola cadena. Aunque se mantenía el concepto, se introdujeron características adicionales con el fin de hacer el método más adecuado para la presentación de proteínas completas en el sistema procariótico de E. coli S30. Una innovación es el bloqueo del ribosoma mediante la ausencia de un codón de parada, que señaliza normalmente la liberación de la proteína naciente. Una vez más, la recuperación del material genético fue por disociación de los complejos ribosómicos con EDTA 10 mM y el aislamiento del ARNm mediante precipitación con etanol (o con el kit Rneasy) antes de la transcripción inversa. Se utilizaron etapas separadas de transcripción y traducción, y se manifestó que el procedimiento acoplado tenía una menor eficacia; sin embargo, no se proporcionaron datos sobre este efecto. Se utilizó en cada ciclo una entrada grande de ARNm (10 \mug).

Muchas adiciones fueron incorporadas por Hanes y Pluckthun con el fin de mejorar el rendimiento de ARNm después del ciclo de presentación en polisomas, que era inicialmente tan bajo como de un 0,001% (15). Éstas incluían estructuras de bucle troncal en los extremos 5' y 3' del ARNm, complejos de vanadil ribonucleósidos como inhibidores de nucleasas (que inhiben también parcialmente la traducción), la disulfuro isomerasa de proteínas PDI (que cataliza la formación de enlaces disulfuro) y un nucleótido antisentido (para inhibir el ARN ssrA que en el sistema procariótico causa de lo contrario la liberación y degradación de las proteínas sintetizadas sin un codón de parada). La combinación de anti-ssrA y PDI mejoró la eficacia global en 12 veces. Sin embargo, el rendimiento de ARNm al final del ciclo, con todas las adiciones, era todavía solamente del 0,2% del ARNm de entrada, expresando la eficacia combinada de todas las etapas, incluyendo la unión del ligando (en pocillos de microvaloración), la liberación y la amplificación del ARN. Affymax había descrito ya un rendimiento del 2%, esto es 10 veces mayor, como bajo (citado anteriormente).

Hanes y Pluckthun demostraron también la recuperación de un anticuerpo específico a partir de una mezcla (de dos) en la cual estaba presente inicialmente en una proporción de 1:10^{8}. Esto requería 5 repeticiones secuenciales del ciclo, esto es, la utilización del producto ADN de un ciclo como punto de partida del siguiente. En la Figura 4(A) de la referencia 15, hay un arrastre considerable de los polisomas no seleccionados, reflejando probablemente el método de selección o la recuperación del ARNm. Como consecuencia, el factor de enriquecimiento es relativamente bajo, alrededor de 100 veces por ciclo.

Un método reciente adicional de presentación en ribosomas fue descrito por Roberts y Szostak (23), en el cual se hace que la proteína naciente se una covalentemente a su ARNm mediante un enlace puromicina. En este sistema, la selección se lleva a cabo en estas fusiones proteína-ARNm después de la disociación del ribosoma. Difiere por tanto significativamente de los demás métodos aquí descritos, ya que no implica la selección de partículas proteína-ribosoma-ARNm. Su eficacia es solamente de 20-40 veces.

Breve descripción de la invención

Está claro que los métodos procarióticos de presentación en polisomas descritos dejan un cambio de acción considerable para una mejora metodológica con el fin de incrementar la eficacia de la recuperación del ARNm, la sensibilidad y la selección. En la invención aquí descrita, nosotros hemos desarrollado un nuevo método eucariótico de presentación en ribosomas y demostramos su aplicación para la selección y mutación (desarrollo) de anticuerpos y para la selección de otras proteínas a partir de bibliotecas de ARNm. Podría aplicarse igualmente al aislamiento de genes de bibliotecas de ADNc.

La invención proporciona un método para presentar proteínas o péptidos nacientes como complejos con ribosomas eucarióticos y el ARNm que codifica la proteína o el péptido después de la transcripción y la traducción in vitro, para seleccionar posteriormente los complejos que lleven una proteína o péptido naciente particular por medio de la unión a un ligando, antígeno o anticuerpo, y para la recuperación posterior de la información genética que codifica la proteína o el péptido a partir del complejo ribosómico seleccionado mediante transcripción inversa y reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR). La etapa de recuperación por RT-PCR se lleva a cabo directamente sobre el complejo ribosómico intacto, sin disociación previa para liberar el ARNm, contribuyendo así a una eficacia y sensibilidad máximas. Las etapas de presentación, selección y recuperación pueden ser repetidas en ciclos consecutivos. El método es ejemplificado utilizando construcciones de anticuerpos de una sola cadena como complejos anticuerpo-ribosoma-ARNm (ARMs). Es adecuado para la construcción de bibliotecas de presentación muy grandes, conteniendo por ejemplo más de 10^{12} complejos, y para la recuperación eficaz del ADN que codifica proteínas individuales después de selección por afinidad. Proporcionamos evidencia de un enriquecimiento altamente eficaz, por ejemplo de 10^{4}-10^{5} veces por ciclo, y ejemplos que demuestran su utilidad en la presentación y selección de fragmentos de anticuerpo de una sola cadena a partir de bibliotecas, en la manipulación de anticuerpos, en la selección de anticuerpos humanos y en la selección de proteínas a partir de bibliotecas de ARNm.

En su aplicación a fragmentos de anticuerpo, el método está mostrado en la Figura 1. En esta forma, el método es denominado también "presentación en ARM", ya que las partículas de selección constan de complejos anticuerpo-ribosoma-ARNm. El anticuerpo está en la forma del fragmento de una sola cadena V_{H}/K descrito anteriormente, pero el método es en principio aplicable igualmente a cualquier forma de una sola cadena, tal como scFv. El método difiere en varios particulares de los descritos anteriormente, conduciendo a mejoras mayores de lo esperado en eficacia, sensibilidad y enriquecimiento. En principio, está basado en dos resultados experimentales: (i) anticuerpos de una sola cadena son producidos funcionalmente in vitro en lisados de reticulocitos de conejo (7) y (ii) en ausencia de un codón de parada, las proteínas nacientes individuales permanecen asociadas con su ARNm correspondiente como complejos ternarios estables polipéptido-ribosoma-ARNm en sistemas libres de células (8, 9). Nosotros hemos aplicado estos hallazgos a una estrategia para generar bibliotecas de complejos ARM eucarióticos y hemos seleccionado eficazmente complejos que llevan sitios de combinación específicos utilizando partículas magnéticas con antígenos acoplados. La selección captura simultáneamente la información genética relevante como ARNm.

El sistema de transcripción/traducción acopladas utilizado en la presente es un extracto de reticulocitos de conejo (Promega) que proporciona una utilización eficaz del ADN. En particular, evita el aislamiento separado del ARNm según se describe en la referencia 15, el cual es costoso en materiales y tiempo. La eliminación del codón de parada del ADN codificador es más productiva como medio de bloqueo del ribosoma que la utilización de inhibidores, porque asegura que todos los ARNms sean leídos hasta el extremo 3', en lugar de pararse en puntos aleatorios durante el proceso de traducción. El efecto estabilizante de la eliminación del codón de parada puede ser explicado por el requerimiento de factores de liberación que reconozcan el codón de parada y finalicen normalmente la traducción causando la liberación de la cadena polipeptídica naciente (19). En ausencia del codón de parada, la cadena naciente permanece unida al ribosoma y al ARNm. Cuando es problemático producir la eliminación del codón de parada, como en bibliotecas de ADNc o ARNm, un método alternativo sería la utilización de ARNt supresor (cargado con un aminoácido) que reconoce y lee a través del codón de parada, impidiendo de este modo la acción de los factores de liberación (24). Una estrategia más de bloqueo de ribosomas sería la utilización de ARNt supresor no cargado con un aminoácido.

En una nueva etapa que introduce una diferencia significativa con los métodos precedentes, nosotros mostramos que puede producirse ADNc y amplificarse mediante transcripción inversa-reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) en una sola etapa sobre el ARNm unido al ribosoma, evitando así completamente el aislamiento y la recuperación posterior del ARNm mediante procedimientos que son costosos en términos de material y tiempo. El éxito y la eficacia de esta etapa son sorprendentes, ya que se asume generalmente que durante la traducción varios ribosomas se unen a la misma molécula de ARNm, creando un polisoma, y no se sabía qué efecto podría tener la presencia de varios ribosomas en tándem sobre una única molécula de ARNm sobre la transcripción inversa, en la que el enzima RT debe leer la longitud del ARNm. Por tanto, no se sabe si el enzima podría ser capaz de pasar a través de ribosomas adyacentes, o producir su separación del ARNm, o funcionar solamente en moléculas de ARNm a las que estuviera unido solamente un ribosoma. Cualquiera que sea la explicación, esta etapa contribuye enormemente a la eficacia demostrada del sistema, en el que puede recuperarse hasta el 60% del ARNm de entrada en un ciclo (Ejemplo 6, Figura 9), en comparación con solamente el 2% en los sistemas procarióticos descritos por Mattheakis y col. (14) y con el 0,2% de Hanes y Pluckthun (15). Además, hemos demostrado que, en el sistema eucariótico, la extracción del ARNm del complejo ribosómico es cinco veces menos eficaz como procedimiento de recuperación que la RT-PCR en el complejo sin romper y que gran parte del ARNm permanece unido al ribosoma incluso después de la extracción con EDTA (Ejemplo 8, Figura 11).

El enriquecimiento de fragmentos de anticuerpo individuales utilizando bibliotecas de presentación en ARM es también más eficaz que el descrito para la presentación procariótica (15). Nosotros hemos realizado experimentos que muestran que mezclas en las que el fragmento específico deseado está presente en una proporción de una parte en 10^{5} pueden producir un fragmento de unión después de un ciclo, con un factor de enriquecimiento eficaz de >10^{4} veces, y que los ciclos pueden ser realizados secuencialmente para aislar especies moleculares más raras a partir de bibliotecas muy grandes (Ejemplos 10 y 11). Esto es 2-3 órdenes de magnitud más eficaz por ciclo que los resultados descritos en el sistema procariótico (15).

Como las bibliotecas de ARM son generadas totalmente mediante técnicas in vitro (PCR) y no requieren transformación bacteriana, su tamaño está limitado principalmente por el número de ribosomas que pueden ser introducidos en la mezcla de reacción (\sim10^{4} por ml en el kit de reticulocitos de conejo, según la información del fabricante) y por la cantidad de ADN que puede ser manejada convenientemente por reacción. Por tanto, la producción de bibliotecas grandes resulta mucho más fácil que en el método de presentación en fagos, en el que el factor limitante es la transformación bacteriana. Una aplicación importante está en la selección de proteínas a partir de bibliotecas grandes de mutantes; la biblioteca puede ser generada mediante mutación por PCR ya sea aleatoriamente o de manera dirigida a un sitio, y los mutantes con la especificidad requerida pueden ser seleccionados por unión al antígeno. Demostramos la utilización del procedimiento de presentación en ARM para seleccionar fragmentos de anticuerpo (V_{H}/K) con especificidad alterada a partir de tales bibliotecas. Esta aplicación para la manipulación de anticuerpos está mostrada en el Ejemplo 12, en el cual la especificidad de un anticuerpo anti-progesterona es alterada para que se una a testosterona mediante una combinación de mutagénesis y selección. Tales procedimientos pueden ser también utilizados para producir anticuerpos catalíticos. El funcionamiento del propio ciclo de ARM introduce también un bajo nivel de mutación aleatoria a través de los errores de la PCR y nosotros mostramos que la frecuencia de tales errores es del 0,54% por ciclo (Ejemplo 9). Esto puede conducir a la selección de propiedades mejoradas de afinidad y especificidad, y se denomina "evolución proteica" para indicar el desarrollo de nuevas proteínas mediante una combinación de mutación y selección (15). El ciclo del ARM eucariótico es muy adecuado para llevar a cabo una evolución proteica eficaz in vitro.

La presente invención proporciona también un nuevo método para obtener anticuerpos a partir de bibliotecas construidas de ratones inmunizados, dejando a un lado la tecnología de hibridomas. En particular, nosotros demostramos que puede ser utilizado para construir anticuerpos humanos mediante el empleo de una combinación de la tecnología de ratones transgénicos y la presentación en ribosomas de ARM. Están disponibles ratones en los que loci transgénicos que codifican genes de la cadena pesada y de la cadena ligera de anticuerpos humanos están incorporados en los genomas, dando lugar tales ratones a anticuerpos humanos cuando son inmunizados (20). Proporcionamos en la presente un ejemplo en el que anticuerpos humanos son obtenidos in vitro mediante la presentación en ARM de una biblioteca preparada a partir de los linfocitos de tales ratones (Ejemplo 13). Esto proporciona una nueva ruta para la obtención de anticuerpos humanos para fines terapéuticos.

El método de presentación en ribosomas descrito en la presente es también aplicable a cualquier proteína o péptido que, habiendo sido traducido in vitro, permanezca unido al ribosoma y a su ARNm codificador. Además de los ejemplos que muestran la aplicabilidad de la presentación en ARM para anticuerpos, nosotros demostramos también esta aplicación más general a través de la traducción de una biblioteca de ARNm obtenida directamente de tejidos normales para la selección de cadenas polipeptídicas individuales (Ejemplo 14).

Esta versión de presentación en ribosomas satisface por tanto la necesidad de un sistema de presentación in vitro sencillo para proteínas o péptidos. Admite un tamaño muy grande de la biblioteca, combinado con la facilidad y eficacia de la selección y recuperación de la información genética; requiere también menos condiciones especiales, es más sensible y capaz de niveles mayores de enriquecimiento que los métodos descritos hasta ahora. La combinación de un sistema eucariótico con una recuperación eficaz del ARNm proporciona un sistema con una eficacia mucho mayor que la que podría haber sido pronosticada por las personas con práctica en la técnica.

Leyendas de las figuras

Figura 1. El ciclo de presentación en ARM (anticuerpo-ribosoma-ARNm), que muestra la producción de una biblioteca de ARM por mutagénesis de un molde de un fragmento de anticuerpo de una sola cadena (V_{H}/K), la selección de un complejo ARM específico mediante la unión a esferas magnéticas con el antígeno acoplado y la recuperación de la información genética mediante RT-PCR.

Figura 2A. [SEC ID 1]. Secuencia de la construcción para la expresión de V_{H}/K de DB3 utilizada en la producción de ARM. La posición de los cebadores está mostrada en cursiva negrita. Están indicados los puntos de inicio de los dominios V_{H}, V_{L}, C_{\kappa} y del adaptador. D1 - D4 son cuatro cebadores corriente abajo. D1 es utilizado para producir el ADN de V_{H}/K de DB3 de longitud completa como material de partida para el ciclo de presentación en ARM. D2, D3 y D4 son todos cebadores de recuperación para ser utilizados en el primer, segundo y tercer ciclo, respectivamente, junto con el cebador T7 (ver la Figura 3). Estos cebadores son adecuados para todos los anticuerpos de ratón con una cadena ligera \kappa.

Figura 2B. [SEC ID 2]. Cebadores utilizados en el ciclo de presentación en ARM modificado. El nuevo cebador T7 corriente arriba, que incluye el promotor de T7 y la señal de inicio de la proteína, proporciona un rendimiento mejorado. Esta figura muestra también la secuencia del cebador EVOU con el sitio de XbaI subrayado. En la fase de recuperación de la presentación en ARM, la combinación del cebador corriente arriba (T7) y los dos cebadores corriente abajo D2 y EVOU, conduce a la recuperación de ADNc de casi longitud completa en cada ciclo (ver la Figura 4). Estos cebadores son adecuados para todos los anticuerpos de ratón con una cadena ligera \kappa.

Figura 3. Demostración de que el extremo 3' del ARNm está ocultado por el ribosoma, y de que la recuperación requiere por tanto los cebadores corriente arriba D2 y D3 (Figura 2A) para las etapas de recuperación en los ciclos 1 y 2. En (A), V_{H}/K de DB3 de longitud completa fue transcrito y se utilizó el cebador D1 (1) o el cebador D2 (2) para la recuperación; lo que el gel muestra tuvo sólo éxito con D2. En (B), el producto de la PCR del ciclo A fue utilizado en un segundo ciclo con los cebadores D2 (2) o D3 (3); ahora, la recuperación por RT-PCR tuvo éxito solamente con el cebador D3.

Figura 4. Recuperación de ADN de V_{H}/K del mismo tamaño después de 5 ciclos utilizando el método de 3 cebadores. Cebador de RT = D2 de la Figura 2B; cebador de PCR = EVOU de la Figura 2B.

Figura 5. Selección específica de un fragmento de anticuerpo V_{H}/K en el ciclo de ARM.

A. Selección específica de complejos ARM DB3^{R} mediante esferas con progesterona-BSA acopladas. Calle 1, RT-PCR de ARNm de DB3^{R} no traducido seleccionado mediante esferas con progesterona-BSA; 2, RT-PCR de ARM DB3^{R} seleccionados mediante esferas con progesterona-BSA; 3, PCR de ARM DB3^{R} seleccionados mediante esferas con progesterona-BSA; 4, RT-PCR de ARM DB3^{R} seleccionados mediante esferas con testosterona-BSA; 5, PCR de ARM DB3^{R} seleccionados mediante esferas con testosterona-BSA; 6, RT-PCR de ARM DB3^{R} seleccionados mediante esferas con BSA; 7, PCR de ARMs DB3^{R} seleccionados mediante esferas con BSA; 8 = marcador de ADN de 1 kb.

B. No unión de una biblioteca de ARM DB3^{H35} a esferas con progesterona-BSA acopladas. Calle 1, marcador de ADN de 1 kb; 2, RT-PCR de la solución control; 3, RT-PCR de ARMs DB3^{H35} seleccionados mediante esferas con progesterona-BSA; 4, RT-PCR de ARMs DB3^{H35} seleccionados mediante esferas con anti-\kappa de rata acoplado.

C. Selección de DB3^{R} a partir de bibliotecas de ARM que contenían diferentes proporciones de los mutantes DB3^{R} y DB3^{H35}. La selección se realizó con esferas que tenían progesterona-BSA acopladas. Calle 1, proporción de DB3^{R}:DB3^{H35} de 1:10; 2, 1:10^{2}; 3, 1:10^{3}; 4, 1:10^{4}; 5, 1:10^{5}; 6 = biblioteca del mutante DB3^{H35} solo; 7, marcador de ADN de 1 kb.

Figura 6. Inhibición específica del fragmento V_{H}/K de DB3 soluble por esteroides libres en un ELISA (panel derecho), y de V_{H}/K de DB3 en el formato de ARM (centro), demostrando el mismo patrón de especificidad. El panel del centro muestra el resultado a 100 ng/ml de esteroide libre. Esto apoya el plegamiento correcto del fragmento de anticuerpo en el ribosoma.

Figura 6A. Efecto de la concentración de DTT (ditiotreitol) en la reacción de traducción sobre la producción de anticuerpos funcionales en la presentación en ARM.

El ARN mensajero que codifica V_{H}/K de DB3 fue generado en una reacción de transcripción in vitro y añadido al sistema de Lisado de Reticulocitos de Conejo flexi (Promega), que permite añadir separadamente el DTT. Calle 1.7: marcador, Calle 2: ARNm control no traducido, Calle 3: DTT 0, Calle 4: DTT 2 mM, Calle 5: DTT 5 mM, Calle 6: DTT 10 mM. El resultado muestra que DTT 0,2 mM y 5 mM producían una buena recuperación de ARM, mientras que había inhibición solamente a 10 mM.

Figura 7. Optimización de la concentración de Mg^{++} para la presentación en ARM.

Figura 8. Optimización del curso temporal de la presentación en ARM.

Figura 9. Eficacia de la recuperación del ARNm de entrada. El ADNc recuperado del ciclo de ARM (las cuatro calles de la izquierda) es comparado con el ADNc recuperado directamente del ARNm (calles de la derecha), en cada caso por RT-PCR.

Figura 10. Sensibilidad de entrada de la presentación en ARM, esto es, qué cantidad mínima de ADN puede utilizarse por ciclo. En este experimento, la combinación de cebadores para la recuperación fue T7 y D4 (Figura 2A). (Observar que la fotografía original muestra una banda débil pero claramente discernible a 10 pg).

Figura 11. Comparación del método (de acuerdo con la invención) de recuperación del ADNc sin ruptura de los ribosomas, con el de la tecnología de la técnica anterior que requiere la ruptura de los ribosomas. La calle marcada como "Intacto" muestra la recuperación de ADNc por la presente invención, esto es en el ribosoma intacto sin ruptura; "Roto" se refiere a la recuperación de ADNc por el método de la técnica anterior de ruptura de los ribosomas utilizando EDTA 20 mM y el aislamiento posterior del ARNm antes de la RT-PCR; y "Restante" es la recuperación del ADNc utilizando el método de la presenta invención a partir del ARNm restante asociado con el ribosoma después de la ruptura de acuerdo con el método de la técnica anterior. Los rendimientos relativos de las tres reacciones de recuperación se determinaron mediante densitometría.

Figura 12. Tasa de error por ciclo. La existencia de errores durante un único ciclo de selección de ARM V_{H}/K de DB3 se determinó mediante el clonaje del producto recuperado después de RT-PCR y la comparación de las secuencias de los clones con la del DB3 nativo. Las sustituciones están resaltadas en negrita.

Figura 13. Enriquecimiento de un fragmento de anticuerpo específico a partir de una biblioteca de mutantes: análisis mediante clonaje. Se construyó V_{H}/K de DB3^{H35} (que no se une a progesterona) de tal manera que se eliminó el único sitio de HincII; después de la selección de ARM, el tratamiento con HincII produjo una sola banda de \sim800 pb. En contraste, la digestión similar de DB3^{R} produce 2 fragmentos de \sim500 pb y 300 pb. Esto permite distinguir los clones que contienen DB3^{R} de los que contienen DB3^{H35} mediante digestión con HincII y análisis en gel, según se muestra. Los complejos ARM DB3^{R} fueron seleccionados a partir de mezclas con mutantes DB3^{H35} que no se unen en proporciones de 1:10 a 1:10^{5}. El ADNc resultante recuperado después de un ciclo de selección fue clonado; se preparó ADN de los clones individuales y se analizó después de la digestión con HincII y EcoRI. En cada calle, un doblete de bandas a 500 y 300 pb indica DB3^{R}, mientras que una única banda a \sim800 pb es DB3^{H35}. Se analizaron 10 clones en cada proporción después de la selección. El resultado demuestra un factor de enriquecimiento de \sim10^{4} veces en un ciclo. (Ver el Ejemplo 10).

Figura 14. Enriquecimiento de DB3^{R} a partir de una biblioteca con una proporción de 1:10^{6} (DB3^{R}:DB3^{H35}) mediante ciclos repetidos de presentación en ARM. La selección se realizó con esferas que tenían progesterona-BSA acopladas. Calle 1, marcador de ADN de 1 kb; 2, RT-PCR después del primer ciclo; 3, RT-PCR después del segundo ciclo; 4, RT-PCR después del tercer ciclo. El acortamiento de la banda entre los ciclos 2 y 3 es debido a la utilización de cebadores diferentes (D3, D4, respectivamente).

Figura 15. Cambio de la especificidad de los anticuerpos mediante mutagénesis y selección de ARM (1). Se cambió la especificidad de DB3 que se unía a progesterona para que se uniera a testosterona mediante mutagénesis del bucle H-CDR3, seguido por un único ciclo de selección de ARM. La especificidad de los clones individuales fue analizada mediante presentación en ARM, seleccionando con esferas que tenían testosterona-BSA acopladas. Panel superior: clones preselección; panel inferior, clones post-selección.

Figura 16. Cambio de la especificidad de anticuerpos mediante mutagénesis y selección de ARM (2): Selección de mutantes DB3 H3 mediante esferas con testosterona-BSA en presencia de progesterona libre como inhibidor. Calle 1: marcador; Calles 2, 3: unión de DB3^{R} a esferas con progesterona-BSA (P) o a esferas con testosterona-BSA (T); Calles 4, 5: unión de la biblioteca de mutantes DB3 H3 a esferas P o a esferas T en presencia de progesterona libre; Calles 6, 7: el producto ADN de la Calle 5 fue colocado en un ciclo adicional de presentación en ARM y se volvió a seleccionar sobre esferas P o T. (Observar que la fotografía del gel original muestra una banda clara en la Calle 7).

Figura 17. Cambio de la especificidad de anticuerpos mediante mutagénesis y selección de ARM (3). Se analizó la unión a esteroides de 5 clones individuales después de la selección mediante esferas con testosterona por presentación en ARM y unión a esferas con progesterona-BSA (P) y a esferas con testosterona-BSA (T).

Figura 18. Cambio de la especificidad de anticuerpos mediante mutagénesis y selección de ARM (4): Caracterización de un clon específico para testosterona derivado mediante presentación en ARM a partir de la biblioteca de mutantes DB3 H3. Calle 1: marcador; Calles 2, 3: unión del clon a esferas con progesterona-BSA (P) o a esferas con testosterona-BSA (T); Calles 4, 5: unión del clon a esferas T en presencia de progesterona libre o de testosterona libre. Se muestra la secuencia de la región H3 del clon mutado (mut).

Figura 19. Secuencias de anticuerpos anti-progesterona y anti-testosterona humanos aislados de un ratón transgénico inmunizado mediante presentación en ARM.

Figura 20. Selección de genes a partir de una biblioteca de ARNm total de células esplénicas de ratón mediante presentación en ribosomas.

Calle 1: Marcador.

Calle 2: RT-PCR de la cadena ligera \lambda en ARNm total procedente de células esplénicas de ratón.

Calle 3: RT-PCR de la cadena ligera \lambda después de la traducción in vitro del ARNm anterior y la selección de complejos ribosómicos mediante esferas revestidas con anti-\kappa.

Calle 4: RT-PCR de la cadena ligera \kappa en ARNm total procedente de células esplénicas de ratón.

Calle 5: RT-PCR de la cadena ligera \kappa después de la traducción in vitro del extracto de ARNm y de la selección de los complejos ribosómicos mediante esferas revestidas con anti-\kappa.

Calle 6: RT-PCR de la cadena pesada de Ig a partir de ARNm total de células B de ratón.

Calle 7: RT-PCR de la cadena pesada de Ig después de la traducción in vitro del extracto de ARNm y la selección de los complejos ribosómicos mediante esferas revestidas con anti-\kappa.

Materiales y métodos del ciclo de presentación en ribosomas de ARM (Figura 1) 1. Construcciones de anticuerpos de cadena sencilla utilizadas para generar los complejos ARM

Los sitios de combinación de los anticuerpos utilizados para analizar este método están en una forma que hemos descrito previamente, a saber, los fragmentos de cadena sencilla de tres dominios denominados V_{H}/K, en los que el dominio variable de la cadena pesada (V_{H}) está ligado a la cadena ligera completa (K) (10). Hemos descrito una construcción de ADN y un sistema de expresión bacteriano para producir un anticuerpo anti-progesterona (DB3) como un fragmento V_{H}/K (10) y se demostró la expresión periplásmica y citoplásmica (11). El fragmento V_{H}/K de DB3 tiene excelentes propiedades de unión al antígeno, que en nuestras manos son superiores a las de la forma Fv de cadena sencilla (scFv) comúnmente utilizada. Utilizando el método de PCR con "megacebadores" (12) en ADN plasmídico conteniendo V_{H}/K de DB3, se produjeron mutantes en las posiciones H100 y H35, residuos de contacto con progesterona en el sitio de unión (13) (resultados no publicados). DB3^{R} es un mutante en el que el triptófano H100 fue sustituido por arginina, una modificación que da lugar a una afinidad incrementada por progesterona. El DB3^{R} expresado por E. coli se unía potentemente a progesterona (Ka \sim 10^{9} M^{-1}) pero tenía una afinidad mucho más baja por testosterona y ninguna detectable por BSA. En contraste, una biblioteca de mutantes generados en la posición H35 (denominados DB3^{H35}) se unía a progesterona débilmente o no se unía. Hemos utilizado los mutante DB3^{R} y DB3^{H35} para analizar el principio de la selección de ARM.

2. Método para la producción de complejos ARM

Con el fin de generar fragmentos de ADN de V_{H}/K para la producción de ARMs, se realizó una PCR utilizando los moldes apropiados junto con (i) un cebador T7 corriente arriba, que contenía el promotor de T7, una secuencia de inicio de proteínas y una secuencia degenerada complementaria a secuencias 5' de anticuerpo de ratón y (ii) un cebador corriente abajo (D1), que carecía de un codón de parada (Figura 2A). La secuencia del cebador T7 era [SEC ID 3] 5'-gcgcgaatacgactcactatagagggacaaaccatgsaggtcmarctcgagsagtcwgg-3' (en la que s=c/g, m=a/c, r=a/g y w=a/t), y el cebador D1 era [SEC ID 4] 5'-tgcactggatccaccacactcattcctgttgaagct-3', que contiene un sitio de BamHI (subrayado) para fines de clonaje. Para preparar las construcciones de V_{H}/K, se llevó a cabo una PCR estándar en una solución que contenía tampón de reacción de PCR 1x (Boehringer Mannheim UK, Lewes, East Sussex), dNTPs (Sigma) 0,2 mM, 0,3 \muM de cada cebador, 0,05 U/\mul de polimerasa Taq (Boehringer Mannheim) con una o dos gotas de aceite mineral sin nucleasas dispuestas sobre la parte superior de la mezcla. Se utilizó el programa siguiente: 30 ciclos que consistían en 94ºC durante 1 minuto, 54ºC durante 1 minuto, 72ºC durante 1 minuto, posteriormente 72ºC durante 10 minutos seguido por 4ºC.

Las construcciones de PCR de V_{H}/K (1 ng - 1 \mug) purificadas mediante QIAquick (QIAGEN) o no purificadas, fueron añadidas a 20 \mul del sistema de transcripción/traducción acopladas rápido TNT T7 (Promega UK Ltd, Southampton. Hants SO16 7NS, R.U.) que contenía metionina 0,02 mM y la mezcla se incubó a 30ºC durante 60 minutos. El protocolo puede ser disminuido proporcionalmente hasta 10 \mul. Después de la traducción, la mezcla fue diluida con un volumen igual de solución salina tamponada con fosfato fría y enfriada sobre hielo durante 2 minutos. (Para optimización de las condiciones, ver la descripción en los Ejemplos 4 y 5 siguientes).

3. Modificación de los cebadores

El cebador T7 corriente arriba, que incluye el promotor y la señal de inicio de proteínas de T7, puede ser modificado con un rendimiento mejorado. La secuencia modificada es [SEC ID 5] 5'-gcagctaatacgactcactataggaacagacca ccatgsaggtcmarctcgagsagtcwgg, según se muestra en la Figura 2B.

4. Selección de los complejos ARM con antígeno

Esferas magnéticas (Dynal, R.U.) fueron acopladas a seroalbúmina bovina [BSA], progesterona-11\alpha-BSA, testosterona-3-BSA (Sigma-Aldrich Co. Ltd., Poole, Dorset, R.U.) o a anticuerpo anti-\kappa de ratón producido en rata purificado (donación del Dr. G. Butcher) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se añadieron 2-3 \mul de esferas magnéticas conjugadas al antígeno o a anti-\kappa a la mezcla de traducción y se transfirieron a 4ºC durante 60 minutos más, con vibración suave para prevenir la sedimentación. Las esferas fueron recuperadas mediante un concentrador de partículas magnéticas (Dynal, MPC), lavadas 3 veces con 50 \mul de solución salina tamponada con fosfato (PBS) estéril, fría, pH 7,4, que contenía un 0,1% de BSA y acetato de magnesio 5 mM, y una vez con PBS solo. Con el fin de eliminar la contaminación posible con ADN, las esferas fueron tratadas a 37ºC durante 25 minutos con ADNasa I (Promega o Boehringer Mannheim) en 50 \mul de tampón de ADNasa I (Tris-HCl 40 mM, pH 7,5, MgCl_{2} 6 mM, NaCl 10 mM, CaCl_{2} 10 mM) que contenía 10 unidades de enzima, seguido por tres lavados con 50 \mul de PBS que contenía un 1% de Tween-20, acetato de magnesio 5 mM, y resuspensión en 10 \mul de agua tratada con dietilpirocarbonato.

5. Recuperación y amplificación de la información genética a partir de los complejos ARM seleccionados con antígeno

Para producir y amplificar el ADNc a partir del ARNm de los ARMs seleccionados con antígeno, se llevó a cabo una RT-PCR mediante la adición de 2 \mul de la suspensión de esferas anterior a 23 \mul de la mezcla de RT-PCR (Sistema de RT-PCR en Un Tubo Titan, Boehringer Mannheim, o Sistema de RT-PCR Access, Promega UK Ltd.) que contenía 1 \muM de cada cebador. Los cebadores eran el cebador T7 corriente arriba descrito anteriormente y un nuevo cebador corriente abajo, D2, secuencia 5'-cgtgagggtgctgctcatg-3', diseñado para que hibride a al menos 60 nt corriente arriba del extremo 3' del ARNm unido al ribosoma (Figura 2A). La utilización de este cebador evita la necesidad de aislar el ARNm de los complejos ARM (Figura 1). La mezcla de reacción fue cubierta con una o dos gotas de aceite mineral sin nucleasas y colocada en un ciclador térmico (Techne Progene). El programa para la RT-PCR de una sola etapa fue: un ciclo a 48ºC durante 45 minutos, seguido por uno a 94ºC durante 2 minutos, posteriormente 30-40 ciclos consistentes en 94ºC durante 30 segundos, 54ºC durante 1 minuto y 68ºC durante 2 minutos; finalmente un ciclo a 68ºC durante 7 minutos fue seguido por 4ºC. Los productos de la PCR fueron analizados mediante electroforesis en gel de agarosa y eluidos del gel para su secuenciación.

6. Ciclos adicionales de producción y selección de complejos ARM, y combinaciones de cebadores para una recuperación eficaz en ciclos secuenciales

Para los ciclos adicionales, los productos de PCR producidos según se describió anteriormente fueron purificados en gel o bien añadidos directamente al sistema de transcripción/traducción TNT. En un segundo ciclo, el cebador corriente abajo D3 de la RT-PCR, de secuencia [SEC ID 11] 5'-ggggtagaagttgttcaagaag-3', fue diseñado para que hibridara corriente arriba de D2 (Figura 2A); de manera similar, en el tercer ciclo se utilizó el cebador D4, [SEC ID 12] 5'-ctggatggtgggaagatgg-3', que hibrida corriente arriba de D3 (Figura 2A). El ADN recuperado resulta progresivamente más corto en cada ciclo, pero puede regenerarse en cualquier ciclo un V_{H}/K de longitud completa mediante PCR recombinatoria. Además, el acortamiento afecta solamente al dominio constante de la cadena ligera, y no a la región de unión al antígeno.

En este protocolo, cada ciclo requería un nuevo cebador corriente abajo (D2, D3, D4) debido al hecho de que el extremo 3' del ARNm está cubierto por el ribosoma y está inaccesible para el cebador. Aunque esto evita la necesidad de separar el ARNm del ribosoma, produce también según se ha indicado un acortamiento del ADNc recuperado en cada ciclo. Nosotros hemos solucionado ahora este problema mediante el diseño de un nuevo cebador denominado EVOU, que incorpora D2 y se extiende corriente abajo, restaurando la mayoría de la secuencia de ADNc 3' y que puede ser utilizado en todos los ciclos.

Según se muestra en la Figura 2B, la secuencia del cebador EVOU, es: 5'-gctctagaggcctcacaggtatagctgttatgtcgttcat actcgtccttggtcaacgtgagggtgctgctcat-3' [SEC ID 13], negrita = sitio de XbaI.

El experimento muestra que la recuperación del ADNc tiene lugar cuando se utiliza una mezcla de D2 y EVOU juntos en la RT-PCR de recuperación (Ejemplo 1, Figura 4). La característica inesperada del resultado es que la utilización de la mezcla de cebadores produce solamente una banda de la longitud completa esperada, mientras que se esperaban dos bandas. Esto se explica probablemente por la eficacia del cebador EVOU bajo las condiciones de PCR utilizadas, dando lugar a un resultado limpio e ideal.

Por tanto, en el método preferido, los cebadores son el cebador T7 corriente arriba y el cebador D2 corriente abajo, secuencia [SEC ID 14] 5'-cgtgagggtgctgctcatg-3', diseñado para que hibride a al menos 60 nt corriente arriba del extremo 3' del ARNm unido al ribosoma, más el cebador EVOU que incorpora D2, como en la Figura 2B.

Para ciclos adicionales, los productos de PCR producidos igual que anteriormente fueron purificados en gel o bien añadidos directamente al sistema de transcripción/traducción TNT. Se utilizó la combinación de los cebadores D2 y EVOU en la RT-PCR en cada ciclo subsiguiente. El ADN recuperado tiene por tanto la misma longitud en cada ciclo (Figura 4).

7. Cebadores para los fragmentos de anticuerpo V_{H}/K humanos

Los cebadores anteriores y los mostrados en la Figura 2 son aplicables a los fragmentos V_{H}/K de todas las inmunoglobulinas de ratón. Para anticuerpos humanos los cebadores correspondientes son:

Cebador T7: 5'-gcagctaatacgactcactataggaacagaccaccatgsaggtmcasctcgagsagtctgg [SEC ID 6], y el cebador D1: gctctagaacactttcccctgttgaagct [SEC ID 7].

Cebador D2: gctctagagctcagcgtcagggtgctgct [SEC ID 8].

Cebador D4: gctctagagaagacagatggtgcagc [SEC ID 9].

Cebador EVOU: cggaattctctaga gtgatggtgatggtgatg gtagactttgtgtttctcgtagtctgctttgctcagcgtcagggtgctgct [SEC ID
10].

(los sitios de los enzimas están subrayados; la marca de hexahistidina está en cursiva).

Resultados Ejemplo 1 Recuperación de ADN por RT-PCR en el complejo ribosómico y utilización de combinaciones de 2 ó 3 cebadores

En el método de ARM (Figura 1), el ribosoma es bloqueado y se forma el complejo estable (proteína naciente-ribosoma-ARNm) debido a la ausencia de un codón de parada en el extremo 3' del mensaje. Como el ribosoma está bloqueado en el extremo 3' del ARNm, este último debería ser inaccesible a un cebador 3' y/o a la transcriptasa inversa, necesitando la utilización de un cebador corriente arriba para la recuperación del ADNc. Esto está confirmado por el experimento de la Figura 3. Cuando el ADN de DB3 de longitud completa, que carecía del codón de parada 3', fue transcrito y el ARNm traducido in vitro y seleccionado con esferas de progesterona-BSA, la recuperación del ADNc mostró que el extremo 3' del ARNm no estaba disponible para ser cebado en RT-PCR, mientras que un cebador corriente arriba (D2, Figura 2A) recuperaba con éxito el ADNc. De igual modo, en un segundo ciclo, D2 ya no era eficaz y se requería un cebador corriente arriba adicional (D3, Figura 2A). Por tanto, el concepto de un ribosoma unido al extremo 3' del ARNm en el complejo ARM parece ser correcto. Este experimento demuestra la recuperación de ADNc mediante RT-PCR en el complejo ribosoma-ARNm.

Claramente, la utilización repetida del ciclo de ARM de esta forma conduce al acortamiento del ADNc recuperado y eventualmente sería necesario restaurar la longitud completa mediante una reacción de PCR recombinatoria. Sin embargo, en el procedimiento modificado, la utilización del cebador D2 en combinación con el cebador EVOU (Figura 2B) restaura la longitud completa en cada ciclo. La Figura 4 muestra la recuperación del ADNc de V_{H}/K de longitud completa a lo largo de 5 ciclos. El ciclo de ARM fue realizado según se ha descrito y se utilizó la combinación del cebador D2 (marcado como cebador de RT) y el cebador EVOU (cebador de PCR) para la recuperación. El producto ADN recuperado fue aplicado posteriormente en 4 ciclos secuenciales adicionales de la misma forma y los productos analizados en cada caso. Según se muestra, se recupera en cada ciclo la longitud completa de V_{H}/K de 1 kb aproximadamente y el ADN fue confirmado mediante secuenciación.

La utilización de estas combinaciones de cebadores conduce a una recuperación eficaz del ADNc sin la necesidad de aislar el ARNm separadamente por disociación del polisoma, según está descrito por otros autores. Es una forma rápida y eficaz de recuperar la información genética como ADN (ver también el Ejemplo 8).

Ejemplo 2 Selección de ARM específicos de un antígeno

Para demostrar la selección de ARM específicos de un antígeno, V_{H}/K de DB3^{R} fue traducido in vitro y los ARMs expuestos a esferas magnéticas acopladas a progesterona-11\alpha-BSA, testosterona-3-BSA o a BSA sola. Después de la RT-PCR, se detectó un único fragmento de ADN solamente a partir de las esferas acopladas a progesterona-11\alpha-BSA (Figura 5A, Calles 2, 4, 6), consistente con la especificidad conocida del V_{H}/K de DB3^{R}. El fragmento recuperado fue confirmado posteriormente como de DB3^{R} mediante secuenciación. No se obtuvieron bandas cuando se llevó a cabo una PCR sola, en lugar de la RT-PCR, en las esferas con progesterona-11\alpha-BSA después de la selección (Figura 5A, Calles 3, 5, 7), o cuando el procedimiento fue realizado con ARNm de DB3^{R} no traducido (Figura 5A, Calle 1). Por tanto, la banda recuperada por RT-PCR procede del ARNm seleccionado a través del sitio de combinación del anticuerpo funcional de DB3^{R} y no de contaminación con ADN ni de un arrastre de ARNm.

Ejemplo 3 La inhibición por antígeno libre de la unión de ARM al antígeno inmovilizado demuestra el plegamiento correcto del V_{H}/K en el ribosoma

Puede utilizarse la inhibición por esteroides libres para demostrar el plegamiento correcto y la actividad funcional del complejo ARM (Figura 6). La inhibición de V_{H}/K de DB3 expresado como un ARM, utilizando diferentes inhibidores esteroideos, es indistinguible de la del DB3 nativo y de la del V_{H}/K recombinante. Además, la inhibición del 50% por progesterona-11\alpha-HMS a 1 ng (2,5 nM) indica una afinidad muy próxima a la de DB3 (datos no mostrados).

Los inhibidores esteroides libres fueron añadidos a la mezcla de ARM DB3 con el fin de bloquear la unión a las esferas revestidas con progesterona. Son progesterona-11\alpha-hemisuccinato (HMS) (P11), progesterona-3-carboximetiloxima (P3), progesterona-6-HMS (P6) y progesterona-21-HMS (P21). La inhibición de V_{H}/K de DB3 libre en una reacción de ELISA se muestra a la derecha, con la eficacia de los esteroides en el orden P11>P3>P6>P21. Se observa un orden muy similar de reacción y concentración para el V_{H}/K de DB3 naciente en el ribosoma como un ARM (el panel central muestra resultados representativos de la reacción de RT-PCR de recuperación).

Esta demostración de excelente especificidad confirma que el fragmento de anticuerpo V_{H}/K naciente está correctamente plegado en el complejo ARM. De manera similar, no se requiere la adición de chaperones en el sistema de reticulocitos de conejo, mientras que esto es también deseable en el sistema procariótico (15). Es posible que el propio ribosoma eucariótico desempeñe un papel contribuyente en el plegamiento de la cadena polipeptídica naciente (25).

Ejemplo 3A Concentraciones óptimas de DTT para la presentación en ARM

Se ha afirmado que los anticuerpos de cadena sencilla pueden no plegarse correctamente en presencia de ditiotreitol (DTT) 2 mM, que está presente en la mezcla de reacción de transcripción/traducción, pero éste no parece ser el caso según se muestra en la Figura 6A. Se llevó a cabo el ciclo de ARM en presencia de varias concentraciones de DTT de 0 a 10 mM, mediante la traducción del ARNm del V_{H}/K de DB3 producido en una transcripción separada in vitro. La reacción de traducción fue llevada a cabo en el sistema de Lisados de Reticulocitos de Conejo flexi (Promega), que permite añadir DTT. El resultado de la Figura 6A muestra que DTT 0,2 mM y 5 mM producían una buena recuperación de ARM (Calles 3-5), mientras que había inhibición solamente a 10 mM (Calle 6). Por tanto, DTT 2 mM no afecta de manera adversa al plegamiento ni a la recuperación. De este modo, no se requiere la disulfuro isomerasa de proteínas, PDI, que se ha indicado que es importante para el plegamiento de los dominios de anticuerpos en el sistema procariótico E. coli S30 (15), para la presentación en ribosomas eucarióticos en el sistema de reticulocitos de conejo.

Ejemplo 4 Optimización de la concentración de magnesio (Figura 7)

Se añadió acetato de magnesio en concentraciones variables al sistema de reacciones de transcripción/traducción TNT y se comparó la recuperación de ADN después del ciclo de ARM. El rendimiento óptimo se consiguió a una concentración 0,5 mM de acetato de Mg.

Ejemplo 5 Optimización del curso temporal (Figura 8)

En el ciclo de ARM, las reacciones detranscripción/traducción acopladas se llevaron a cabo varias veces con el fin de determinar el curso temporal óptimo de la reacción. Se demostró que éste era de 60 minutos de incubación, tiempo después del cual no había mejora en la recuperación.

Ejemplo 6 Eficacia de recuperación del ARNm de entrada (Figura 9)

Con el fin de determinar la eficacia de la recuperación de ARNm durante un único ciclo de ARM, se preparó ARNm de V_{H}/K de DB3 separadamente mediante transcripción in vitro. El ADNc recuperado después de los procesos de traducción, selección de los complejos ARM sobre esferas con progesterona y RT-PCR en los complejos, fue comparado con el recuperado directamente a partir del ARNm de entrada no manipulado. Las 4 calles de la izquierda muestran una valoración del ADNc obtenido después de la recuperación a partir del ciclo de ARM, mientras que las 4 calles de la derecha muestran la obtenida a partir del ARNm de entrada. La densitometría muestra que el 60% aproximadamente del ADNc posible es recuperado realmente después de la selección de los ARM. Para producir este resultado, el 60% del ARNm debe ser traducido a proteína que se une al antígeno totalmente funcional. Este rendimiento de la recuperación debe ser comparado con el 2% descrito por Mattheakis y col. (14) y con el 0,2% descrito por Hanes y Pluckthun (15) y demuestra la eficacia enormemente incrementada del presente método.

Ejemplo 7 Sensibilidad del ciclo de ARM al ADN de entrada (Figura 10)

Un parámetro esencial de la eficacia del sistema es la sensibilidad al ADN de entrada, esto es, qué cantidad mínima de ADN puede ser utilizada por ciclo. Este experimento, en el que se valoró el ADN de entrada, muestra que puede recuperarse una banda con una entrada inicial tan baja como de 10 pg. La cantidad utilizada rutinariamente en el proceso es de 1-10 ng (Calles 2 y 3). La sensibilidad de los métodos procarióticos mediante valoración no se ha informado, pero la cantidad utilizada en el método de Mattheakis (14) es de 440 ng y la utilizada por Hanes y Pluckthun (15) es de 10 \mug. Es bastante probable que las etapas adicionales empleadas por estos últimos, a saber, la recuperación de ARNm antes de la traducción y de nuevo antes de la transcripción inversa, contribuyan enormemente al requisito de ADN. Éste puede ser un elemento crítico en la utilización del método para buscar en bibliotecas grandes. Por ejemplo, con una entrada de 1 \mug de ADN y una sensibilidad de 10 pg, sería posible obtener un enriquecimiento de 10^{5} veces en un solo ciclo, que es lo que nosotros hemos encontrado (ver el Ejemplo 10). Con una menor sensibilidad a ADN, según parece ser el caso en los sistemas procarióticos, tendría que introducirse considerablemente más ADN, o bien llevarse a cabo más ciclos de selección y recuperación.

Ejemplo 8 Comparación del método (de acuerdo con la invención) de recuperación del ADNc sin la ruptura de los ribosomas con el de la tecnología de la técnica anterior que requiere la ruptura de los ribosomas (Figura 11)

Con el fin de determinar el grado al que nuestro procedimiento para recuperar el ADNc al final del ciclo de presentación, esto es mediante RT-PCR en el complejo intacto, es más eficaz que la técnica precedente de Kawasaki (16), Mattheakis (14) y Hanes y Pluckthun (15), nosotros hemos duplicado sus métodos mediante ruptura del complejo ribosómico y recuperación del ARN antes de la RT-PCR. El método de ruptura siguió al descrito por Hanes y Pluckthun (15): el tampón de elución fue Tris 50 mM/acetato pH 7,5, NaCl 150 mM, EDTA 20 mM; se añadieron 100 \mul a las esferas y se incubaron a 4ºC durante 10 minutos. El ARN liberado fue recuperado mediante precipitación con etanol (procedimiento estándar).

En el gel (Figura 11), la calle marcada como "Intacto" muestra nuestra recuperación después de un ciclo; la calle marcada como "Roto" es la recuperación mediante el método de ruptura; y la calle marcada como "Restante" es lo que queda en el ribosoma después de la ruptura. Los rendimientos relativos fueron comparados mediante densitometría y mostraron que la recuperación realizada con el ARNm unido al ribosoma es 5x más eficaz que con la ruptura de ribosomas cuando se aplicó al sistema eucariótico, y que con el procedimiento de ruptura una proporción considerable del ARNm permanece unida al ribosoma y por tanto realmente se pierde. Así, la recuperación de ADNc mediante RT-PCR en el complejo ribosómico es una contribución importante a la eficacia incrementada de la invención respecto a la técnica anterior.

Ejemplo 9 Precisión por ciclo (Figura 12)

Un aspecto importante de la invención es su capacidad para modificar gradualmente proteínas in vitro, aprovechando la introducción de mutaciones puntuales aleatorias por las diferentes reacciones de la polimerasa incluidas en el ciclo seguidas por una selección basada en el ligando, esto es, el desarrollo de las proteínas. Al mismo tiempo, una tasa de mutación muy elevada podría hacer que el sistema no fuera funcional por un daño a la estructura de la proteína o a la especificidad del sitio de combinación. Por tanto, determinamos los errores que son introducidos por ciclo mediante el clonaje de los productos de un ciclo de ARM en el que el DB3 fue seleccionado con esferas de progesterona-BSA. El resultado de la Figura 12 muestra una tasa de error del 0,54%, que es lo suficientemente baja para mantener la estructura, pero lo suficientemente elevada de manera constante para introducir mutaciones útiles para desarrollar capacidades mejoradas de las proteínas, tales como la afinidad del sitio de unión del anticuerpo.

Ejemplo 10 Selección de un sitio de combinación de un anticuerpo individual a partir de bibliotecas de presentación en ARM en un único ciclo (Figuras 5 y 13)

Otra aplicación importante de la presentación en ribosomas es la selección de anticuerpos, o de otras proteínas, a partir de bibliotecas de mutantes. Con el fin de investigar tal selección y determinar el enriquecimiento posible mediante la presentación en ribosomas eucarióticos, DB3^{R} fue mezclado con mutantes DB3^{H35} aleatorios que se unen a progesterona débilmente o no se unen (en los mutantes, el codón AAC de H35 estaba mutado a C/G T/A/G A). Cuando la biblioteca de mutantes DB3^{H35} sola fue presentada como complejos ARM, ninguna banda de ADN fue recuperable después de la selección con esferas de progesterona-11\alpha-BSA (Figura 5B, Calle 3; Figura 5C, Calle 6); la traducción de DB3^{H35} fue demostrada por la banda obtenida con esferas revestidas con anticuerpo anti-\kappa de rata (Figura 5B, Calle 4). Cuando mezclas de ADN que contenían los mutantes DB3^{R} y DB3^{H35} en proporciones que variaban desde 1:10 hasta 1:10^{5} fueron presentadas como ARMs, se recuperó en todos los casos una banda del tamaño de V_{H}/K después de un solo ciclo (Figura 5C, Calles 1-5). El ADN seleccionado fue secuenciado y, sobre la base de la detección de codones, se demostró que mientras que la selección anterior de DB3^{R} no fue detectable en las bibliotecas con proporciones 1:10^{3} - 1:10^{5}, era la molécula predominante seleccionada de la biblioteca con la proporción de 1:10^{3} y un componente principal del producto de la PCR de las bibliotecas con proporciones de 1:10^{4} y 1:10^{5}. Por tanto, es alcanzable un enriquecimiento en el rango de 10^{4} - 10^{5} veces en un único ciclo de selección de ARM.

Debido a que la secuenciación de un producto de PCR mixto puede no ser suficientemente sensible para proporcionar una información precisa sobre el enriquecimiento, en particular para definir la proporción de especies seleccionadas: no seleccionadas (fondo), se introdujo un medio adicional de discriminación entre las mutaciones DB3^{R} y DB3^{H35}. Un único sitio del enzima HincII fue eliminado de DB3^{H35} pero se dejó en DB3^{R}. Por tanto, la digestión con HincII producía una reducción del tamaño del V_{H}/K de DB3^{R} desde \sim800 pb hasta dos fragmentos de \sim500 pb y 300 pb, mientras que los mutantes DB3^{H35} no eran cortados y corrían como un fragmento de \sim800 pb. Después de la selección a partir de mezclas en las mismas proporciones que anteriormente, los productos de la RT-PCR fueron clonados y el ADN de los clones individuales mapeado por digestión con EcoRI y HincII, permitiendo la cuantificación de la proporción de los clones de DB3^{R} y DB3^{H35} recuperados. Según se muestra en la Figura 13, el 70% de los clones seleccionados a partir de una biblioteca 1:10^{4} y el 40% de los seleccionados a partir de una biblioteca 1:10^{5} eran de DB3^{R}. Esto proporciona factores de enriquecimiento calculados de \sim10^{4} veces, lo cual está en concordancia con los datos previos procedentes de la secuenciación directa de mezclas de PCR (ver anteriormente). Es posible que pueda obtenerse un enriquecimiento incluso mayor mediante la utilización de una mayor cantidad de ADN en el ciclo. Estos valores de enriquecimiento son considerablemente más elevados que los descritos para sistemas procarióticos de 100 veces (15) o de 40 veces (23).

Ejemplo 11 Selección de un sitio de combinación de un anticuerpo individual a partir de una biblioteca de presentación en ARM en dos o tres ciclos (Figura 14)

Aunque una biblioteca de DB3^{R}:DB3^{H35}, 1:10^{6}, no produjo una banda de RT-PCR detectable después de un ciclo (Figura 14, Calle 2), dos ciclos adicionales de producción y selección de ARM condujeron a la recuperación de una banda de V_{H}/K, con una intensidad incrementada en cada repetición (Figura 14, Calles 3, 4). La secuenciación confirmó de nuevo la selección de DB3^{R}.

Ejemplo 12 Cambio de la especificidad de un anticuerpo mediante mutagénesis y selección de ARM a partir de una biblioteca de mutantes (manipulación de anticuerpos) (Figuras 15-18)

La afinidad del anticuerpo DB3 por progesterona es \sim7.000 veces mayor que por testosterona. Nosotros intentamos invertir esta especificidad combinando la mutagénesis del bucle H3 (CDR3 de la cadena pesada) con la presentación en ARM. Se produjo una biblioteca de mutantes de H3, que constaba de 3 x 10^{7} miembros sin codones de parada, mediante mutagénesis aleatoria de los residuos 98, 99, 101, 102 y 103 de DB3^{R}. Los clones individuales de esta biblioteca, antes de la selección de ARM, fueron analizados mediante expresión in vitro en el formato de ARM según se ha descrito. En la Figura 15, la parte superior del gel (clones antes de la selección) muestra que hubo poca o ninguna recuperación de ADNc después de la unión a esferas que llevaban acoplada testosterona-3-BSA. La biblioteca de mutantes fue presentada posteriormente como complejos ARM y sometida a selección en un ciclo mediante unión a esferas con testosterona-3-BSA. El ADNc recuperado fue clonado; los clones individuales mostraban ahora mayoritariamente unión positiva a testosterona-BSA con una recuperación potente que reflejaba una buena unión (parte inferior del gel). Esto demuestra que el método de presentación en ARM es eficaz para el enriquecimiento selectivo de clones de mutantes con nuevas propiedades de unión al antígeno, y que puede utilizarse el sistema de ARM para el análisis rápido de la actividad de unión de clones de anticuerpo.

La biblioteca fue seleccionada posteriormente frente a esferas con progesterona-BSA y testosterona-BSA. Para estas últimas, estaba presente progesterona-11\alpha-hemisuccinato libre para bloquear toda la unión de progesterona; por tanto, el efecto debe ser el cambio de especificidad completamente hacia testosterona si tales agentes de unión están presentes en la biblioteca. En la Figura 16, las dos calles del centro muestran este resultado y demuestran que la biblioteca contiene mutantes capaces de unirse específicamente a testosterona. El ADNc recuperado después de la unión a esferas con testosterona-BSA en presencia de progesterona libre fue reciclado frente a esferas con progesterona y testosterona y mostró especificidad para testosterona (Calles 6, 7). Este resultado implica que la especificidad pudo ser cambiada de unirse a un ligando a unirse a otro ligando. (Observar que la banda de la Calle 7 es claramente visible en la fotografía original).

Con el fin de confirmar la especificidad del ADNc recuperado en la Calle 6 de la Figura 16, se examinó también su especificidad mediante clonaje. La Figura 17 muestra el análisis de clones individuales expresados como complejos ARM in vitro y ensayados para determinar la unión a esferas con progesterona-BSA y testosterona-BSA. De los 5 clones analizados, 3 se unían preferencialmente a testosterona, demostrando la conversión de la especificidad desde la unión únicamente a progesterona (DB3^{R}) hasta la unión preferencial a testosterona (clones 1-3).

Uno de los clones obtenidos mediante mutagénesis y selección frente a testosterona en presencia de progesterona libre fue analizado mediante presentación en ARM y secuenciación del ADN. En la Figura 18, se observa que el clon mutante que se une a testosterona se unía específicamente a esferas acopladas a testosterona-3-BSA (T) sin reacción cruzada con progesterona-11-BSA (P), y que podía inhibirse específicamente por testosterona-3-BSA (T) libre pero no por progesterona libre (P).

Estos resultados demuestran que la capacidad de la presentación en ARM para seleccionar a partir de bibliotecas grandes puede ser utilizada en conjunción con mutagénesis para llevar a cabo la manipulación de anticuerpos, en particular para provocar la alteración de la especificidad del anticuerpo mediante las etapas de mutación y selección.

Ejemplo 13 Selección de anticuerpos humanos de bibliotecas preparadas a partir de ratones transgénicos (Figura 19)

Un área de gran interés es la utilización de métodos de presentación para aislar anticuerpos humanos que pueden ser utilizados para diagnóstico o terapia in vivo en el hombre. El origen de tal biblioteca pueden ser linfocitos humanos procedentes de individuos naturalmente inmunes o inmunizados activamente. Sin embargo, para responder a antígenos humanos, muchos de los cuales son dianas terapéuticas importantes, los linfocitos humanos deben desarrollarse en un entorno no tolerante. Esto puede ser conseguido mediante la utilización de ratones transgénicos que hayan adquirido los genes que codifican las cadenas pesada y ligera humanas en sus genomas mediante manipulación de los embriones; la capacidad de estos ratones para producir anticuerpos de ratón endógenos ha sido eliminada mediante la introducción de deleciones eliminatorias (20). Tales ratones responden a la inmunización con antígenos humanos mediante la producción de anticuerpos humanos (20). Nosotros hemos inmunizado ratones portadores de un translocus de la cadena pesada humana que contiene 5 genes de V_{H}, la región D-J completa y los genes de C\mu y C\delta, junto con un translocus de la cadena ligera que lleva 8 genes de V_{L}, la región J completa y el gen de C\kappa. Los ratones fueron inmunizados con progesterona-11\alpha-HMS-BSA y después de 8 semanas se extrajeron los bazos. Se preparó una biblioteca de ADN de V_{H}/K mediante amplificación por RT-PCR de los genes de V_{H} y de la cadena ligera expresados, seguido por combinación aleatoria a través de la secuencia adaptadora estándar de V_{H}/K, utilizando PCR recombinatoria; el codón de parada fue eliminado del extremo 3' de la cadena ligera. La biblioteca fue expresada in vitro como complejos ARM y sometida a selección utilizando esferas magnéticas acopladas a progesterona-BSA o a testosterona-BSA. El ADNc recuperado fue clonado y secuenciado (Figura 19). Las secuencias permitieron identificar los genes de las V_{H} y V_{L} humanas y comparar las regiones CDR3 de la cadena pesada. Aunque hay una selección repetitiva de dos combinaciones V_{H}/V_{L} humanas (VH4/Vk1-12 y VH1-2/Vk4-01), hay una diversidad considerable en las secuencias de H3. Sin embargo, uno de los residuos de contacto con esteroides identificado a partir de cristalografía en la CDR2 de VH de anticuerpos anti-esteroide (W50, el primer residuo de la CDR2), está presente universalmente y un aromático relevante está también presente a menudo alrededor del residuo 100.

Ejemplo 14 Selección de genes de una biblioteca de ARNm mediante presentación en ribosomas eucarióticos (Figura 20)

Aunque los ejemplos citados hasta ahora están todos relacionados con la expresión y selección de fragmentos de anticuerpo, la presentación en ribosomas sería aplicable a cualquier proteína que conserve un grupo funcional seleccionable, tal como un sitio de unión o un epítopo, cuando está unida en forma naciente al ribosoma. Por tanto, debería ser posible aislar genes de bibliotecas de ADNc o de ARNm en el formato de presentación en ribosomas, por ejemplo seleccionando los complejos con partículas acopladas a anticuerpos o ligandos.

Este ejemplo demuestra la utilización de la presentación en ribosomas (1) para seleccionar un gen que codifica una proteína expresada partiendo de un extracto de ARNm obtenido de células de mamífero, (2) para seleccionar un ARNm específico como un complejo ribosómico utilizando un anticuerpo unido a esferas como agente de selección, y (3) para recuperar el gen relevante mediante RT-PCR llevada a cabo en el ARNm unido al ribosoma. Para la biblioteca, el ARNm fue extraído con el kit de purificación de ARNm de Pharmacia y expresado directamente in vitro utilizando el sistema de transcripción/traducción TNT de Promega. No se hizo ningún intento para eliminar el codón de parada, pero en su lugar la reacción fue parada después de 1 hora mediante enfriamiento sobre hielo. La mezcla de traducción fue expuesta a un anticuerpo monoclonal anti-\kappa de rata unido a esferas magnéticas. El ARNm unido fue convertido en ADNc y amplificado mediante RT-PCR utilizando cebadores específicos para la cadena \kappa y, como controles negativos, para la cadena ligera \lambda y para la cadena pesada de IgG. Los resultados están mostrados en la Figura 20. Las bandas de ADNc de las Calles 2, 4 y 6 fueron obtenidas directamente de la biblioteca de ARNm y muestran que estaban presentes ARNms de las cadenas ligeras \lambda y \kappa humanas y de la cadena pesada humana, respectivamente. Después de la expresión del ARNm en el formato de presentación en ribosomas y de la selección con esferas revestidas con anti-\kappa, se recuperó una potente banda de la cadena ligera \kappa después de la RT-PCR (Calle 4), ninguna banda de la cadena ligera \lambda (Calle 3) y una banda débil de la cadena pesada (Calle 7), demostrando así la selección específica y la recuperación del ADNc de la cadena \kappa. Hasta nuestro conocimiento, éste es el primer experimento que muestra la selección de una proteína de una biblioteca natural (esto es, derivada de un tejido normal) mediante la presentación en ribosomas.

Conclusiones

La mayor eficacia de este método de presentación sobre los previamente descritos puede ser considerada como derivada de varios factores, la utilización de un sistema de expresión eucariótico, la transcripción y traducción acopladas, el bloqueo del ribosoma mediante la eliminación del codón de parada y la eficaz recuperación mediante RT-PCR llevada a cabo en el complejo ribosómico. Por tanto, no se consume tiempo ni material para aislar ARNm en las diferentes etapas (después de la transcripción, después de la selección) como en la descripción de Hanes y Pluckthun. La nueva etapa es una de recuperación, que nosotros hemos demostrado que es superior a la disociación del ribosoma. Es también probable que sea mucho más económico debido al hecho de que permite manejar cantidades de ARNm mucho más pequeñas en el sistema, lo cual es claramente importante cuando se seleccionan especies moleculares poco frecuentes de bibliotecas grandes. Hemos demostrado que pueden recuperarse cantidades muy pequeñas del ADN de entrada, haciendo factible la utilización de bibliotecas grandes.

Referencias

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(26) Mattheakis, L.C., Dias, J.M. y Dower, W.J. (1994) Methods in Enzymology 267, 195-207.

Claims (29)

1. Un método para la presentación y selección de proteínas o péptidos y para la recuperación del material genético que los codifica, método que consta de

(a) la transcripción y traducción de ADN en un sistema libre de células de tal manera que se formen partículas complejas, comprendiendo cada una al menos una proteína o péptido naciente individual u otro producto de expresión de ADN asociado con uno o más ribosomas y con el ARNm específico que codifica la proteína o el péptido;

(b) la puesta en contacto de dichas partículas complejas con un ligando, antígeno, anticuerpo u otro agente con el fin de seleccionar las partículas por la unión al producto proteico o peptídico, y

(c) la recuperación de la información genética que codifica la proteína o el péptido como ADN por medio de transcripción inversa y reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) llevadas a cabo sobre el ARNm mientras que este último permanece unido a dicha partícula compleja.

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que los sistemas de transcripción/traducción son eucarióticos.

3. Un método de acuerdo con las reivindicaciones 1 y 2, en el que la transcripción y la traducción están acopladas.

4. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el sistema de transcripción/traducción es un sistema de lisados de reticulocitos de conejo.

5. Un método de acuerdo con las reivindicaciones 1 y 2, que implica la producción de complejos proteína (o péptido)-ribosoma-ARNm a partir de ADN y ARNm que carecen de un codón de parada.

6. Un método de acuerdo con la reivindicación 1(b), en el que el agente que selecciona las partículas complejas está inmovilizado y unido a esferas magnéticas, a placas de plástico o a otro soporte insoluble.

7. Un método en el que se produce ADN mediante transcripción inversa seguida por reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR), donde el método se lleva a cabo sobre ARNm unido físicamente a uno o más ribosomas después de la traducción del ARNm.

8. Un método para la presentación y selección de proteínas o péptidos y para la recuperación del material genético que los codifica, método que consta de

(a) la transcripción y traducción acopladas de ADN carente de un codón de parada en un sistema de reticulocitos de conejo sin células, de tal manera que se forman partículas complejas que contienen al menos una proteína o péptido naciente individual u otro producto de expresión del ADN asociado a uno o más ribosomas y al ARNm específico que codifica la proteína o el péptido;

(b) la puesta en contacto de dichas partículas complejas con un ligando, antígeno, anticuerpo u otro agente insolubilizado con el fin de seleccionar las partículas por la unión al producto proteico o peptídico, y

(c) la recuperación de la información genética que codifica la proteína o el péptido como ADN por medio de transcripción inversa y reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) llevadas a cabo sobre el ARNm mientras que este último permanece unido a dicha partícula compleja.

9. Un método de acuerdo con las reivindicaciones 1, 5 y 8, en el que la proteína es un fragmento de anticuerpo de cadena sencilla.

10. Un método de acuerdo con la reivindicación 9, en el que el fragmento de anticuerpo de cadena sencilla comprende la región variable de la cadena pesada (V_{H}) unida a la región variable de la cadena ligera (V_{L}) (fragmento scFv) o a la cadena ligera completa (K) (fragmento V_{H}/K).

11. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, método que incluye además las etapas de

(d) que implica la incorporación posterior del ADN producto de la RT-PCR obtenido por el método de las reivindicaciones 1 u 8 a un vector de expresión; y

(e) la producción de la proteína o del péptido por transformación de bacterias tales como E. coli.

12. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 u 8, en el que las partículas complejas formadas en la etapa (a) son una biblioteca de presentación que comprende proteínas, péptidos u otros productos de expresión de ADN que forman complejos con ribosomas eucarióticos y con los ARNms específicos que codifican esas proteínas, péptidos u otros productos.

13. Un método de acuerdo con la reivindicación 12, en el que las moléculas de ARNm de la biblioteca de presentación de la etapa (a) carecen de codones de parada.

14. Un método de acuerdo con la reivindicaciones 12 ó 13, en el que las proteínas individuales de la biblioteca de presentación de la etapa (a) comprenden proteínas capaces de unirse específicamente a ligandos, permitiendo la selección posterior de miembros individuales de la biblioteca mediante la unión al ligando inmovilizado.

15. Un método de acuerdo con la reivindicaciones 12 ó 13, en el que las proteínas presentadas en la biblioteca de presentación de la etapa (a) son anticuerpos o fragmentos de anticuerpo, incluyendo fragmentos de cadena sencilla que comprenden un número diferente de dominios, tales como V_{H}, V_{L}, scFv, V_{H}/K, Fab.

16. Un método de acuerdo con las reivindicaciones 12 ó 13, en el que los productos presentados en la biblioteca de presentación de la etapa (a) son receptores.

17. Un método de acuerdo con las reivindicaciones 12 ó 13, en el que los productos presentados en la biblioteca de presentación de la etapa (a) son péptidos.

18. Un método de acuerdo con las reivindicaciones 12 ó 13, en el que los productos presentados en la biblioteca de presentación de la etapa (a) son mutantes de proteínas.

19. Un método de acuerdo con la reivindicación 15, en el que los anticuerpos o los fragmentos de la biblioteca de presentación de la etapa (a) son obtenidos de linfocitos de animales o humanos inmunizados o no inmunizados.

20. Un método de acuerdo con las reivindicaciones 12 ó 13, en el que los productos de expresión de ADN de la biblioteca de presentación de la etapa (a) son producidos por medio de mutación del ADN clonado que codifica los anticuerpos, los receptores o los fragmentos de los mismos.

21. Un método de acuerdo con las reivindicaciones 18 ó 20, que implica la formación de una biblioteca de presentación en la etapa (a), y que implica la selección de mutantes individuales de la biblioteca de presentación en la etapa (b).

22. Un método de acuerdo con la reivindicación 17, en el que los péptidos de la biblioteca de presentación de la etapa (a) son utilizados en la etapa (b) para identificar y mapear epítopos reconocidos por anticuerpos o receptores específicos.

23. Un método para producir anticuerpos de ratón, rata o de otro mamífero no humano que consta de

(a) la puesta en contacto del animal con un antígeno,

(b) la producción de una biblioteca de ADN que comprende combinaciones de las regiones V_{H} y V_{L} de las inmunoglobulinas de dicho animal, ligadas como fragmentos Fv de cadena sencilla o V_{H}/K como en la reivindicación 10,

(c) la creación de una biblioteca de presentación en ribosomas eucariótica mediante transcripción y traducción in vitro de dicha biblioteca de ADN, de tal manera que se forman partículas complejas comprendiendo cada una al menos un fragmento de anticuerpo naciente individual asociado a uno o más ribosomas y al ARNm específico que codifica el fragmento de anticuerpo,

(d) la puesta en contacto de dichas partículas complejas con un antígeno o con otro agente con el fin de seleccionar las partículas por unión al antígeno o al otro agente,

(e) la recuperación de la información genética que codifica el fragmento de anticuerpo por medio de transcripción inversa y reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) llevadas a cabo sobre el ARNm mientras está unido a dicha partícula compleja,

(f) la expresión y recogida de dichos fragmentos de anticuerpo.

24. Un método para producir anticuerpo humanos que consta de

(a) la puesta en contacto con un antígeno de un ratón transgénico portador de loci humanos que codifiquen las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulinas como transgenes,

(b) la producción de una biblioteca de ADN que comprende combinaciones de las regiones V_{H} y V_{L} de las inmunoglobulinas humanas de dicho animal, ligadas como fragmentos Fv de cadena sencilla o V_{H}/K como en la reivindicación 10,

(c) la creación de una biblioteca de presentación en ribosomas eucariótica mediante transcripción y traducción in vitro de dicha biblioteca de ADN, de tal manera que se forman partículas complejas comprendiendo cada una al menos un fragmento de anticuerpo naciente individual asociado a uno o más ribosomas y al ARNm específico que codifica el fragmento de anticuerpo,

(d) la puesta en contacto de dichas partículas complejas con un antígeno o con otro agente con el fin de seleccionar las partículas por unión al antígeno o al otro agente,

(e) la recuperación de la información genética que codifica el fragmento de anticuerpo como ADN por medio de transcripción inversa y reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) llevadas a cabo sobre el ARNm mientras está unido a dicha partícula compleja,

(f) la expresión y recogida de dichos fragmentos de anticuerpo.

25. Un método para la presentación de proteínas o péptidos como partículas complejas y para la recuperación de la información genética que los codifica, que consta de

(a) la traducción de ARNm o de una biblioteca de ARNm en un sistema libre de células eucariótico de tal manera que se formen partículas complejas, comprendiendo cada una al menos una proteína o péptido naciente individual u otro producto de expresión asociado con uno o más ribosomas y con el ARNm específico que codifica la proteína o el péptido,

(b) la puesta en contacto de dichas partículas complejas con un ligando, anticuerpo u otro agente con el fin de obtener la selección de las partículas por medio de la unión al producto proteico o peptídico, y

(c) la recuperación de la información genética que codifica el péptido, la proteína o el producto de expresión de ADN como ADN por medio de transcripción inversa y reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) llevadas a cabo sobre el ARNm mientras está unido a dicha partícula compleja.

26. Un método para presentar proteínas o péptidos como partículas complejas y para la recuperación de la información genética que los codifica, que consta de

(a) la transcripción y traducción de ADNc o de una biblioteca de ADNc en un sistema libre de células eucariótico de tal manera que se formen partículas complejas, comprendiendo cada una al menos una proteína o péptido naciente individual u otro producto de expresión asociado con uno o más ribosomas y con el ARNm específico que codifica la proteína o el péptido;

(b) la puesta en contacto de dichas partículas complejas con un ligando, anticuerpo u otro agente con el fin de obtener la selección de las partículas por medio de la unión al producto proteico o peptídico, y

(c) la recuperación de la información genética que codifica el péptido, la proteína o el producto de expresión de ADN por medio de transcripción inversa y reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) llevadas a cabo sobre el ARNm mientras está unido a dicha partícula compleja.

27. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1, 8, 24, 25, 26, en el cual hay etapas de ciclos repetidos de presentación en ribosomas y selección antes de la etapa de recuperación de la información genética.

28. Un método de acuerdo con las reivindicaciones 12 ó 13, en el que la biblioteca de presentación en ribosomas eucarióticos es utilizada en la etapa (b) con el fin de seleccionar ligandos para sitios de combinación o receptores, teniendo tales ligandos utilizaciones potenciales como fármacos o agentes terapéuticos.

29. Un método de acuerdo con las reivindicaciones 12 ó 13, en el que se utiliza una biblioteca de presentación en ribosomas en la etapa (b) para aislar genes mediante la unión de los productos traducidos a un anticuerpo o ligando inmovilizado.