JP6146821B2 - 修飾ユビキチンに基づく二量体型結合タンパク質 - Google Patents
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Description
抗体または他の代替足場と比較して、ユビキチンタンパク質に基づく人工結合タンパク質(Affilin(登録商標)(Scil Proteins GmbHの登録商標)としても参照される)は、多くの長所(すなわち、高い親和性および特異性、小さいサイズ、高い安定性、ならびに費用効果的な製造)を有する。しかしながら、高い親和性を有する新しい治療手段の観点からそのタンパク質をさらに開発する必要性が、依然として存在する。国際公開第05/05730号パンフレットには、人工結合タンパク質を得るためのユビキチン足場の使用が記載されているが、タンパク質標的への特異的なかつ高親和性の結合を得るための二量体型ユビキチンタンパク質に関する解決策は、提供されていない。代替ユビキチン足場を用いた新規な結合タンパク質を生成する強い必要性が、当技術分野に依然として存在する。そのような新規な結合タンパク質は、医学において効果的な治療剤としての可能性を有する。
頭−尾配置で結合一体化された2つのユビキチン単量体
を含む、ヒトユビキチンの非天然標的タンパク質への結合能を有するヘテロ二量体型修飾ユビキチンタンパク質において、
前記ヘテロ二量体型タンパク質の両方の単量体が、少なくとも配列番号1の位置2、4、6、8、62、63、64、65、66、および68に対応する少なくとも5、6、7、または8個のアミノ酸の置換により異なって修飾され、かつ
2〜15個のアミノ酸が、配列番号1の位置2、4、6、8、62、63、64、65、66、および68に対応する前記アミノ酸置換から0、1、2、または3アミノ酸離れて少なくとも一方のユビキチン単量体に挿入され、かつ
前記修飾ユビキチン単量体が、配列番号1に対して少なくとも75%または少なくとも85%のアミノ酸同一性を有し、かつ前記修飾ヘテロ二量体型ユビキチンが、Kd=10−7〜10−12Mの前記非天然標的タンパク質への特異的検出可能結合親和性を有する
ことを特徴とするヘテロ二量体型修飾ユビキチンタンパク質を提供する。
a)ユビキチンを提供するステップと、
b)潜在的標的としてユビキチンの非天然リガンドタンパク質を提供するステップと、
c)配列番号1で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも75%のアミノ酸配列同一性を有するユビキチン単量体が得られるように前記ユビキチンを修飾するステップであって、5、6、7、または8個のアミノ酸が、少なくとも位置2、4、6、8、62、63、64、65、66、および/または68に対応するかつそれらの位置から選択されるアミノ酸の置換により修飾され、2〜15個のアミノ酸が、配列番号1の位置2、4、6、8、62、63、64、65、66、および68に対応するかつそれらの位置から選択される前記アミノ酸置換から0、1、2、または3アミノ酸離れて挿入されるものとするステップと、任意選択で
d)前記異なって修飾されたユビキチン単量体の2つを結合するステップと、
e)前記ヘテロ二量体型修飾ユビキチンを前記標的タンパク質に接触させるステップと、
f)10−7〜10−12Mの特異的結合親和性を有して前記標的タンパク質に結合する修飾されたヘテロ二量体型修飾ユビキチンを同定するステップと、任意選択で
g)前記二量体型修飾ユビキチンタンパク質を単離するステップと、
を含む、第1の態様に係るヘテロ二量体型修飾ユビキチンタンパク質の生成方法に関する。
「ユビキチンタンパク質」という用語は、配列番号1に適合するユビキチンおよび以下の定義に適合するその修飾体を包含する。ユビキチンは、真核生物において高度に保存される。たとえば、現在までに研究されたすべての哺乳動物において、ユビキチンは、同一のアミノ酸配列を有する。とくに好ましいのは、ヒト、齧歯動物、ブタ、および霊長動物に由来するユビキチン分子である。そのほかに、任意の他の真核生物源に由来するユビキチンを使用することが可能である。たとえば、酵母のユビキチンは、野生型ヒトユビキチンと3個のアミノ酸のみ異なる。一般的には、「ユビキチンタンパク質」という前記用語に包含される非修飾単量体型ユビキチンタンパク質は、配列番号1に対して70%超、好ましくは75%超もしくは80%超、85%超、90%超、95%超、96%超のアミノ酸同一性、または97%までの配列同一性を示す。
前記単量体ユビキチンユニット(ユビキチン単量体)は、一方または両方のユビキチン単量体、好ましくは一方の単量体中に挿入を含有する。2つのユビキチン単量体は、それぞれ同一または異なる挿入を含有することも可能である。またさらなる実施形態では、一方または両方のユビキチン単量体中に2、3、または4つの挿入が組み込まれる。
本発明は、好ましく、非天然標的への結合を規定するユビキチン単量体の結合領域中に2〜15個のアミノ酸の挿入を包含する。特定的には、挿入されるアミノ酸の数は、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、または15個である。本発明の一実施形態は、第1のユビキチン単量体の8個のアミノ酸の挿入断片を示す(たとえば、配列番号12を参照されたい)。しかしながら、すべての挿入のアミノ酸の全数は、修飾ユビキチンの構造完全性および非天然標的タンパク質へのその結合能を維持することにより制限される。挿入は、一方もしくは両方の単量体型ユビキチンタンパク質中に6〜10個のアミノ酸もしくは7〜9個のアミノ酸もしくは8個のアミノ酸または2〜15個のアミノ酸の範囲に含まれる任意の他の数(2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15)のアミノ酸の挿入を含みうる。単量体型ユビキチンでは、多くとも15個のアミノ酸、好ましくは6〜10個のアミノ酸、最も好ましい8個のアミノ酸の挿入が許容されうる。配列番号1の残基61〜65の領域のアミノ酸位置61〜62もしくは位置62〜63もしくは位置63〜64もしくは位置64〜65に対応するアミノ酸間に、最も好ましくは配列番号1の位置61〜62に対応するアミノ酸間に、または前記置換アミノ酸にごく近接して(1〜3アミノ酸)、またはβシートから0、1、2、3、4、もしくは5アミノ酸離れて、8個のアミノ酸を挿入することが最も好ましい。6〜10個(6、7、8、9、または10個)のアミノ酸、好ましくは8個のアミノ酸の挿入は、天然ループ領域を伸長することにより、標的に対する結合部位を伸長するので、標的と修飾ユビキチンとの間の結合相互作用に有利である(Affilin(登録商標))。
アミノ酸の挿入は、βシートストランドにごく近接して、任意選択でβシートストランドから、好ましくは第4(C末端)または第1(N末端)のβストランドから0、1、2、3、4、または5アミノ酸離れて存在することがさらに好ましく、任意選択で、前記挿入は、N末端(第1)のユビキチン単量体中に位置する。挿入は、一般的には、βシート中に位置するのでなく、βシートに近接して、任意選択でβシートから0、1、2、3、4、または5アミノ酸離れて位置することにより、βシート中の置換アミノ酸の近くに伸長構造を形成する。挿入は、第4(C末端)または第1(N末端)のβストランドから0、1、2、3、4、または5アミノ酸離れていることが好ましい。
好ましくは、1つの単量体ユビキチンユニット中に1つの挿入のみが存在する。最も好ましいのは、二量体のN末端(第1)の単量体ユビキチンユニット中の挿入である。前記挿入は、非天然標的タンパク質たとえばVEGF−Aおよびそのアイソフォームへの修飾ユビキチンの新たに生成された結合に関与しうる。挿入のさらなる好影響は、置換されうるひいては標的への結合に関与しうるアミノ酸の数の増加である。挿入断片は、任意選択で、伸長構造たとえばループ構造を形成しうる。追加のアミノ酸を加えることによるユビキチン構造の伸長は、タンパク質の全コンフォメーションおよび安定性に有意な影響を及ぼさない。置換および挿入を有する修飾ヘテロ二量体型ユビキチン足場は、溶解状態を維持する。
本明細書では、「標的」、「リガンド」、および「結合パートナー」という用語は、同義的に用いられ、交換可能である。本発明を実施する場合、好ましい標的、リガンド、および結合パートナーは、タンパク質、より特定的にはタンパク質上に存在する抗原エピトープである。本発明で標的、リガンド、および結合パートナーとみなされるのは、本明細書に規定される親和性を有してヘテロ二量体型修飾ユビキチンタンパク質に結合可能な任意のタンパク質である。本発明に係る標的またはリガンドまたは結合パートナーは、ヒトユビキチンに対するまたはユビキチン二量体に対する非天然標的である。このことは、結合性がde novoで生成されてヘテロ二量体型修飾ユビキチン結合タンパク質の形成前には存在しなかったことを意味する。言い換えれば、本発明に係る標的は、非修飾野生型ユビキチンに結合することはできない。
「二量体」は、本発明では、2つの単量体型ユビキチンタンパク質(ユビキチン単量体)を含むタンパク質とみなされる。二量体が2つの異なって修飾された単量体を含む場合、それは、「ヘテロメリック二量体」または「ヘテロ二量体」と呼ばれる。本発明に係る「ヘテロ二量体型融合タンパク質」または「ヘテロ二量体型タンパク質」は、特異的結合パートナーとしての非天然標的に対する特異的結合性を一緒になって提供する結合領域を有する少なくとも2つの異なって修飾された単量体型ユビキチンタンパク質を含むタンパク質とみなされる。ヘテロ二量体は、2つの単量体型ユビキチン分子を融合することにより達成され、これらの分子は両方とも、本明細書に記載されるように異なって修飾される。本発明に係る「ホモ二量体型融合タンパク質」または「ホモ二量体型タンパク質」は、結合領域を有する2つの等しく修飾された単量体型ユビキチンタンパク質を含むタンパク質とみなされる。ホモ二量体は、2つの単量体型ユビキチン分子を融合することにより達成され、これらの分子は両方とも、本明細書に記載されるように等しく修飾される。好ましいのは、二量体型もしくは四量体型のタンパク質またはその多量体である。好ましい結合領域は、ユビキチン単量体のアミノ酸領域2〜8および62〜68中の置換および挿入により形成される。最も好ましいのは、配列番号1の領域2〜8中の置換、および置換と、ユビキチンの少なくとも一方の単量体の配列番号1のアミノ酸領域61〜68中への2〜15個のアミノ酸の挿入と、の組合せである。
したがって、本発明の目的は、所定のタンパク質標的に特異的にかつ高い親和性を有して結合可能なユビキチンに基づく新規な二量体型タンパク質を提供することである。−天然条件下で−ユビキチンには結合しないが新規な修飾二量体型ユビキチン系タンパク質には高親和性を有して結合可能な標的(「非天然標的」)が選択される。一実施形態では、非天然標的は、VEGF−Aまたはそのアイソフォームである。しかしながら、本発明は、VEGF−Aまたはそのアイソフォームに限定されない。置換と挿入との組合せにより二量体型ユビキチンの結合がde novoで生成されるかぎり、任意の他の標的を使用可能であることは、重要である。少なくとも一方の単量体中に置換と挿入との組合せを有する二量体型ユビキチンタンパク質は、標的またはリガンド(その発現は、本明細書では同義的に用いられる)に対する新規な結合親和性を有する工学操作された人工のタンパク質である。
Ala、Val、Leu、Ile、Met、Pro、Phe、Trp:脂肪族疎水性側鎖を有するアミノ酸
Ser、Tyr、Asn、Gln、Cys:非荷電ただし極性の側鎖を有するアミノ酸
Asp、Glu:酸性側鎖を有するアミノ酸
Lys、Arg、His:塩基性側鎖を有するアミノ酸
Gly:中性側鎖
により変更される(いわゆる「保存的置換」)。
それぞれの配列セグメントの突然変異誘発の出発点として、たとえば、当業者に公知の方法により調製、改変、および増幅が可能なユビキチンのcDNAを使用することが可能である。一次配列の比較的小さい領域内のユビキチンの部位特異的改変では(約1〜3アミノ酸)、市販の試薬および方法が利用可能である(“Quik Change”,Agilent;“Mutagene Phagemid in vitro Mutagenesis Kit”,Bio−Rad)。より大きい領域の部位指向突然変異誘発では、たとえば、当業者であればポリメラーゼ連鎖反応(PCR)の特定の実施形態を利用可能である。この目的では、たとえば、突然変異を導入するために、所望の位置に変性塩基対組成を有する合成オリゴデオキシヌクレオチドの混合物を使用することが可能である。これはまた、ゲノムDNA中に天然に存在しない塩基対アナログたとえばイノシンを用いることによっても達成可能である。ユビキチンの突然変異誘発の出発点は、たとえば、ユビキチンのcDNAさらにはゲノムDNAでありうる。さらに、ユビキチンタンパク質をコードする遺伝子はまた、合成的に調製することも可能である。
修飾領域は、基本的には、結合パートナーとしてのヒトユビキチンの前記非天然標的タンパク質、たとえばVEGF、特定的にはVEGF−Aまたはそのアイソフォームに到達可能であるかに関して、およびタンパク質の全体構造が修飾に対する耐容性を示すと推定されるかに関して、選択可能である。
標的に対する結合活性を呈してKd=10−7〜10−12Mで非天然タンパク質標的に結合する本発明に係るユビキチン二量体は、
(1)第1の単量体ユニット中に、位置2、4、6、8、62、63、64、65、66、68に対応するかつそれらの位置から選択される5、6、7、8、または9個のアミノ酸の置換、
(2)第2の単量体ユニット中に、アミノ酸位置2、4、6、8、62、63、64、65、66、68に対応するかつそれらの位置から選択される5、6、7、8、または9個の置換、および
(3)そのほかに、少なくとも一方の単量体ユビキチンユニット中に、前記置換にごく近接する2〜15個のアミノ酸の挿入
を示す。
(1)第1の単量体ユニット中の少なくとも位置6、8、62、63、64、65、66の置換、
(2)第1の単量体中への8個のアミノ酸の挿入、
(3)第2の単量体ユニット中の少なくとも位置6、8、62、63、64、65、66、
である。好ましいのは、単量体型ユビキチンのc末端領域内への8個までのアミノ酸の挿入である。より好ましいのは、第4のβシートにごく近接する位置への挿入である(アミノ酸位置65の前)。最も好ましいのは、前記置換にごく近接する、好ましくはアミノ酸61および62、62および63、63および64、64および65の間、最も好ましくはアミノ酸61および62の間への挿入である。
(4)第1の単量体ユニット中の少なくともK6Y、L8D、Q62S、K63W、E64M、S65P、およびT66Aの置換、
(5)第1の単量体中のアミノ酸61および62の間へのアミノ酸残基DVAEYLGIの8個のアミノ酸の挿入、
(6)第2の単量体ユニット中の少なくともK6A、L8D、Q62R、K63D、E64T、S65V、およびT66S
本発明に係るタンパク質の結合特異性は、非修飾タンパク質に対して以上に規定されたようにKdで与えられる。本発明によれば、「Kd」という用語は、本発明に従って10−7〜10−12Mの範囲内にある特異的結合親和性を規定する。10−5M以下の値は、定量可能な結合親和性とみなしうる。用途に依存して、10−7M〜10−11Mの値は、たとえば、クロマトグラフィー用途に好適であり、10−9〜10−12Mの値は、たとえば、診断用途または治療用途に好適である。さらに好ましい結合親和性は、10−7〜10−10M、好ましくは10−11Mまでの範囲内である。
他の好ましい実施形態では、本発明は、治療活性(医薬活性)成分または診断活性成分と融合されたまたはそれにコンジュゲートされた本発明に係る結合タンパク質を含む融合タンパク質またはコンジュゲートに関する。
a)ユビキチン中に存在するリシン残基を介するタンパク質のコンジュゲーション、
b)システイン残基を介するヘテロ二量体型ユビキチン系結合タンパク質のコンジュゲーション、
−C末端または任意の他の位置に位置しうる(たとえば、アミノ酸残基24または57)、マレイミド選択性成分とのコンジュゲーション、
c)ペプチド性またはタンパク質原性のコンジュゲーション−遺伝子融合(好ましいC末端またはN末端)、
d)「タグ」に基づく融合−標的タンパク質のC末端またはN末端のいずれかに位置するタンパク質またはペプチド。融合「タグ」、たとえば、ポリヒスチジン(とくに放射性標識に適合する)。
本発明に係る修飾ユビキチン結合タンパク質は、たとえば、in vitroまたはin vivoで使用するための診断手段さらには治療手段を作製するために使用されるものとする。本発明に係るタンパク質は、たとえば、直接的エフェクター分子(モジュレーター、アンタゴニスト、アゴニスト)または抗原認識ドメインとしての使用可能である。
本発明に係る結合タンパク質は、明快な有機合成戦略、固相支援合成技術などの多くの従来型の周知の技術のいずれかによりまたは市販の自動合成装置により、調製されうる。一方、従来型の組換え技術単独でまたは従来型の合成技術との組合せにより、調製することも可能である。
a)ユビキチンタンパク質を提供するステップと、
b)潜在的標的としてヒトユビキチンに対する非天然標的タンパク質を提供するステップと、
c)配列番号1で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも75%のアミノ酸配列同一性を有する単量体型タンパク質が得られるように前記ユビキチンタンパク質を修飾するステップであって、少なくとも5個かつ多くとも8個のアミノ酸が、位置2、4、6、8、62、63、64、65、66、および/または68に対応するかつそれらの位置から選択されるアミノ酸の置換により修飾され、かつ2〜15個のアミノ酸または6〜10個のアミノ酸または7〜9個のアミノ酸または8個のアミノ酸が、前記単量体の少なくともの1つに挿入され、前記挿入が、少なくとも1つの単量体ユビキチンユニット中の前記アミノ酸置換内またはそれにごく近接して、任意選択で前記位置から0、1、2、または3アミノ酸離れて、好ましくはアミノ酸61および62、62および63、63および64、64および65の間に、最も好ましくはアミノ酸61および62の間に存在するものとするステップと、
d)異なって修飾された前記単量体型タンパク質ユニットの2つを融合するステップと、
e)前記修飾ヘテロ二量体型ユビキチンタンパク質を前記標的タンパク質に接触させるステップと、
f)10−7〜10−12Mの特異的結合親和性を有して前記標的に結合する修飾ヘテロ二量体型ユビキチンタンパク質をスクリーニングするステップと、任意選択で
g)f)の条項を満たす前記修飾ヘテロ二量体型ユビキチンタンパク質を単離するステップと、
を含む。
a)単量体型ユビキチンタンパク質に由来する異なって修飾されたヘテロ二量体型ユビキチンタンパク質の集団を提供するステップであって、前記集団が、頭−尾配置で結合一体化された2つの異なって修飾されたユビキチン単量体を含むヘテロ二量体型ユビキチンタンパク質を含み、前記多量体タンパク質の各単量体が、配列番号1の位置2、4、6、8、62、63、64、65、66、および68に対応するかつそれらの位置から選択される5、6、7、または8個のアミノ酸の置換により修飾され、かつさらなる2〜15個のアミノ酸が、少なくとも1つの単量体ユビキチンユニット中の前記アミノ酸置換内またはそれにごく近接して、任意選択で配列番号1の位置2、4、6、8、62、63、64、65、66、および68に対応するかつそれらの位置から選択される前記置換アミノ酸から0、1、2、または3アミノ酸離れて、好ましくはアミノ酸61および62、62および63、63および64、64および65の間に、最も好ましくはアミノ酸61および62の間に挿入されるものとするステップと、
b)潜在的標的としてユビキチンの非天然リガンドタンパク質を提供するステップと、
c)前記ヘテロ二量体型修飾ユビキチンを前記標的タンパク質に接触させるステップと、
d)10−7〜10−12Mの特異的結合親和性を有して前記標的タンパク質に結合するヘテロ二量体型修飾ユビキチンを同定するステップと、任意選択で
e)前記結合親和性を有する前記ヘテロ二量体型修飾ユビキチンを単離するステップと、
を含む。
a)ヘテロ二量体型修飾ユビキチンを提供するステップと、
b)前記修飾されたヘテロ二量体型修飾ユビキチンタンパク質を医薬活性成分および/または診断活性成分に融合またはコンジュゲートするステップと、
を含む、ヘテロ二量体型融合タンパク質またはコンジュゲートの生成方法を包含する。
(a)第1の態様で規定されたタンパク質をコードする核酸を調製するステップと、
(b)前記核酸を発現ベクター中に導入するステップと、
(c)前記発現ベクターの宿主細胞内に導入するステップと、
(d)宿主細胞を培養するステップと、
(e)宿主細胞を融合タンパク質が前記ベクターから発現される培養条件下に付すことにより、第1の態様で規定されたタンパク質を生成するステップと、
(f)任意選択で、工程(e)で生成されたタンパク質を単離するステップと、
を含む。
たとえば、各単量体ユビキチンユニット(ユビキチン単量体)中の所定のアミノ酸を異なって修飾することにより、二量体型修飾ユビキチンタンパク質をコードする少なくとも2つの異なるDNAライブラリーを確立した後、これらのライブラリーは、ヘテロ二量体型修飾ユビキチンタンパク質をコードするDNA分子が得られるように、たとえばリンカー技術により、遺伝子的に融合される。これらのライブラリーのDNAは、タンパク質の形態に発現され、それにより得られた修飾二量体型タンパク質は、本発明に従ってリガンドVEGF−Aに接触させると、任意選択で、結合親和性が存在すれば、パートナーとの相互の結合が可能になる。
このようにして得られたユビキチン変異体のさらなる特性解析は、対応する遺伝子カセットを好適な発現ベクター中にクローニングした後、以上に詳述したように可溶性タンパク質の形態で実施可能である。適切な方法は、当業者に公知であるか、または文献に記載されている。二量体型結合タンパク質の例示的な特性解析法は、本発明の実施例の節で概説される。
ベクターは、1種以上の所定の宿主細胞内でベクターの複製を可能にする核酸配列を含有する発現ベクターおよびクローニングベクターでありうる。一般的には、クローニングベクターでは、この配列は、宿主染色体DNAとは独立してベクターの複製を可能にするものであり、複製起点または自己複製配列を含む。そのような配列は、さまざまな細菌、酵母、およびウイルスで周知である。プラスミドpBR322の複製起点は、ほとんどのグラム陰性細菌に好適であり、2μプラスミド起点は、酵母に好適であり、そして種々のウイルス起点(SV40、ポリオーマ、アデノウイルス、VSV、またはBPV)は、哺乳動物細胞内のクローニングベクターに有用である。一般的には、複製起点成分は、哺乳動物発現ベクターでは必要とされない(SV40起点は、典型的には、初期プロモーターを含有するという理由のみで、使用されることもある)。
挿入断片(伸長構造)を有する修飾ユビキチンタンパク質に基づくヘテロ二量体型結合タンパク質の同定
ライブラリーの構築およびクローニング
とくに指定がないかぎり、たとえばSambrookらにより記載されたような確立された組換え遺伝子的方法を使用した。少なくとも14個の所定のアミノ酸位置の協奏的突然変異誘発により、高い複雑性を有するヒトユビキチンヘテロ二量体のランダムライブラリーを作製した。NNKトリプレットにより置換された修飾アミノ酸は、近位/N末端(第1)のユビキチン単量体中の位置6、8、62、63、64、65、66から選択されるアミノ酸、および遠位/C末端(第2)のユビキチン単量体中の位置6、8、62、63、64、65、66から選択されるアミノ酸を含んでいた。少なくとも配列GIGまたは少なくとも配列SGGGG、たとえば、GIG、SGGGG、SGGGGIG、SGGGGSGGGGIG、またはSGGGGSGGGGを有するグリシン/セリンリンカーにより、両方のユビキチン単量体を遺伝子的に結合(頭−尾)したが、任意の他のリンカーが可能であり、またはリンカーなしが可能である。
VEGF−Aは、いくつかのアイソフォームで存在する。VEGF121およびVEGF165は、VEGF−A(受託番号p15692)の天然に豊富なアイソフォームである。VEGF121(受託番号p15692−9)およびVEGF165(受託番号p15692−9)は、Humanzyme(製造番号HZ−1206(VEGF121)およびHZ−1153(VEGF165))から購入した。データベース項目と比較して、アイソフォームVEGF165は、シグナルペプチドが含まれていないので26アミノ酸短い。適正グリコシル化が確保されるように、両方のアイソフォームをヒト細胞内で発現させた。
たとえばTATファージディスプレイを選択系として用いて、ヘテロ二量体型ユビキチンライブラリーをVEGF−Aに対して富化した。当技術分野で公知の他の選択方法を使用することが可能である。標的は、タンパク質結合表面上に非特異的に、またはタンパク質に共有結合されたビオチン化残基を介して固定することが可能である。ビオチンを介してストレプトアビジンビーズまたはニュートラビジンストリップ上に固定することが好ましい。標的結合ファージは、溶解状態でまたは固定標的上で選択されている。たとえば、ファージと共にビオチン化および固定化された標的をインキュベートし、続いて、マトリックスに結合されたファージを洗浄し、そしてマトリックス結合ファージを溶出させる。各サイクルで、標的インキュベーション後、ビーズを溶液から磁気的に分離して、数回洗浄した。第1の選択サイクルでは、ビオチン化標的をニュートラビジンストリップに固定し、一方、サイクル2〜4では、溶解状態で選択を行い、続いて、ストレプトアビジン被覆Dynabeads(登録商標)(Invitrogen)上に標的ファージ複合体を固定した。洗浄後、最初の2つの選択サイクルでは、酸性溶液を用いた溶出により標的結合修飾ユビキチン分子のファージを放出させた。選択サイクル3および4では、過剰の標的を用いた競合的溶出によりファージの溶出を行った。溶出されたファージを再増幅した。結合剤の特異性を誘導するために、標的に類似したタンパク質を選択時に組み込むことが可能である。
たとえばリボソームディスプレイを選択系として用いて、ユビキチンライブラリーを標的に対して富化した。当技術分野で公知の他の選択方法を使用することが可能である。標準的方法に従って標的をビオチン化し、ストレプトアビジン被覆Dynabeads(登録商標)(Invitrogen)上に固定した。PURExpress(商標)In Vitro Protein Synthesis Kit(NEB)を用いて、リボソームとmRNAと新生ユビキチンポリペプチドとを含む三元複合体を集合させた。最初に4ラウンドまでの選択を行って三元複合体をインキュベートし、続いて類似の2ラウンドの選択を行った。各サイクルで、標的インキュベーション後、ビーズを溶液から磁気的に分離して、およびストリンジェンシーの増大されたリボソームディスプレイ緩衝液で洗浄した。最初の2サイクルの選択で洗浄後、ビーズを再び溶液から磁気的に分離し、50mM EDTAの添加により標的結合修飾ユビキチン分子のmRNAをリボソームから放した。選択サイクル3および4では、過剰の標的を用いた競合的溶出によりmRNA複合体の溶出を行った(Lipovsek and Pluckthun,2004)。各サイクル後、RNeasy MinElute Cleanup Kit(Qiagen,Germany)、Turbo DNA−free Kit(Applied Biosystems,USA)、およびTranscriptor Reverse Transcriptase(Roche,Germany)を用いて、RNA精製およびcDNA合成を行った。
第4の選択サイクルの後、合成cDNAをPCRにより増幅し、好適な制限ヌクレアーゼを用いて切断し、そして適合付着末端を介して発現ベクター中にライゲートした。
NovaBlue(DE3)細胞(Merck, Germany)にトランスフォームした後、100μg/mlアンピシリンおよび20g/lグルコースを含有するSOB培地中でアンピシリン耐性単一コロニーを増殖させた。自動誘導培地ZYM−5052(Studier,2005)を用いて96ウェルディープウェルプレート中で培養することにより、VEGF−A結合修飾ユビキチンの発現を達成した。細胞を採取し、続いて溶解させた。遠心分離後、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(POD)とコンジュゲートされた4μg/mLのVEGF−Aおよびユビキチン特異的Fabフラグメントで被覆されたNunc MediSorpプレート(Thermo Fisher Scientific,USA)を用いて、得られた上清をELISAによりスクリーニングした。検出試薬としてTMB−Plus(KEM−EN−Tec)を使用し、0.2M H2SO4溶液を用いて黄色に発色さ、450nm対620nmでプレートリーダーにより測定した。
VEGF−Aに対して親和性ユビキチン系二量体型結合タンパク質を増強するために、所定の結合タンパク質の二量体のユビキチンビルディングユニット(単量体)をナイーブ単量体ユビキチンライブラリーに融合した。たとえば、二量体型ユビキチン結合ユニットのN末端またはC末端の単量体のいずれかを単量体ユビキチンライブラリーに融合した。数種、たとえば1〜10種、好ましくは3種のVEGF−A結合分子を選択し、そして位置6、8、62、63、64、65、および/または66に置換を有するかつ任意選択で位置61〜62に挿入を有するN末端ユビキチン単量体を、好適なアミノ酸リンカーたとえばGIGにより、ランダム化アミノ酸位置6、8、62、63、64、65、および/または66を有するナイーブ単量体ユビキチンライブラリーに融合した。併行して、位置6、8、62、63、64、65、および/または66に置換を有するヘテロ二量体型結合タンパク質のC末端領域のユビキチン単量体を、好適なアミノ酸リンカーたとえばGIGにより、ランダム化アミノ酸位置6、8、62、63、64、65、および/または66および/または42、44、68、70、および72〜74を有するナイーブ単量体ユビキチンライブラリーに融合した。7つまでのランダム化位置を有する得られた二量体型ユビキチンライブラリーは、プールされ、理論数約1,5×1010の異なる変異体を呈し、これらは、当業者に公知の方法を用いて、各変異体の10倍提示まで、リボソームディスプレイにより完全にディスプレイ可能であった。混合ライブラリーは、可溶性VEGF121を用いたVEGF−A結合分子の3ラウンドの競合的溶出を含めて4ラウンドのリボソームディスプレイに適用された。
実施例2A。濃度依存性ELISAによる修飾ユビキチン系VEGF結合変異体の結合分析。
ヒトVEGF−Aへのユビキチン系変異体の結合を濃度依存性ELISAによりアッセイした。ヒトVEGF−A121またはVEGF−A165および陰性対照としてNGFで被覆されたNUNC−medisorpプレートに漸増量の精製タンパク質を適用した。1ウェルあたり1〜2.5μg/mlで抗原被覆を4℃で一晩行った。PBS、0.1%Tween20 pH7.4(PBST)でプレートを洗浄した後、ブロッキング溶液(PBS pH7.4、3%BSA、0.5%Tween20)を用いて、ウェルを室温で2時間ブロックした。再びPBSTを用いてウェルを3回洗浄した。次いで、さまざまな濃度の修飾ユビキチン系VEGF−A結合タンパク質を、ウェル中、室温で1時間インキュベートした(図3参照)。PBSTを用いてウェルを洗浄した後、anti−Ubi fabフラグメント(a−Ubi−Fab)PODコンジュゲートを、PBST中の適切な稀釈液(たとえば1:6500)で適用した。300μl緩衝PBST/ウェルでプレートを3回洗浄した。50μlのTMB基質溶液(KEM−EN−Tec)を各ウェルに添加してインキュベートした。0.2M H2SO4/ウェルを添加することにより、反応を停止させた。TECAN Sunrise ELISA−Readerを用いて、ELISAプレートの読取りを行った。参照波長として620nmを用いて、450nmで吸光度測定を行った。図3aは、VEGF−Aへの40401(配列番号2)の非常に高い親和性結合を明確に示しており、見掛けのKD値は、2.2〜2.5nMである。さらなる例が図3に示される。したがって、ユビキチン野生型中にごくわずかな修飾を行うだけで(各単量体中の6までの置換)、VEGF−Aに対する高い親和性結合がもたらされる。図2は、VEGF−Aへの40401(配列番号2)の非常に高い親和性結合を明確に示しており、見掛けのKD値は、2.2〜2.5nMである。変異体は、対照(NGF)への結合を示さなかった。他のVEGF−A結合タンパク質のさらなる結果が表2に示される(前掲)。
当業者に公知の方法を用いて、CM5チップ(Biacore(登録商標))上に固定されたVEGFへの結合に関して、さまざまな濃度の変異体を分析した(たとえば、0〜450nMの変異体、好ましくは40401)。得られたデータをBIAevaluationソフトウェアおよび1:1ラングミュア当てはめにより処理した。図4に示されるように、VEGF165に対する40401のKDは、2.2×10−8Mであった。結合速度定数が図4および表2に示される。他のVEGF−A結合タンパク質のさらなる結果が表2に示される(前掲)。
VEGF刺激HUVEC細胞増殖の阻害を次のアッセイにより評価した。10%FCS、0.1mg/mlヘパリン、10ng/ml b−FGFを含むHams F−12 Nutrient Mixture(Kaighn’s Modification,Gibco)中でHUVEC細胞(Promocell)を増殖させ、第5および第6継代を使用した。1日目、6000個の細胞をコラーゲン被覆96ウェルプレート中の完全培地に接種した。その翌日、細胞を100%Hams F12 Nutrient Mixtureと共に6時間プレインキュベートした。この後、培地をプレインキュベーションミックスと交換して、追加された5%FCS、0.1mg/mlヘパリン、およびゲンタマイシンを含有する培地を調製し、VEGF特異的結合タンパク質の希釈系列を15ng/ml VEGF121(Biomol/Humanzyme)とプレミックスした。1:3ステップで希釈系列を作製し(指定どおり1.5μMから出発して)、室温で1時間インキュベートした。各濃度を三重試験方式で試験した。VEGF特異的治療用モノクロナール抗体Avastin(登録商標)(Roche)を対照として使用した(図示せず)。3日後、製造業者の説明書に従ってWST試薬(Roche)を用いて細胞の生存能を評価した。この阻害アッセイの結果が図4および表2に示される。他のVEGF−A結合タンパク質のさらなる結果が表2に示される(前掲)。本発明に係る結合タンパク質は、HUVEC細胞のVEGF−A誘発増殖の有意な阻害を明確に示す。
Claims (6)
- ヘテロ二量体型修飾ユビキチンタンパク質の生成方法において、以下のステップ:
a)ユビキチンタンパク質を提供するステップ;
b)潜在的標的としてユビキチンの非天然標的タンパク質を提供するステップ;
c)配列番号1で示されるユビキチンタンパク質を修飾するステップであって、
前記二量体型タンパク質の各単量体が、配列番号1の位置2、4、6、8、62、63、64、65、66、および/または68に対応する5、6、7、または8個のアミノ酸の置換により修飾され、かつ
少なくとも1つの前記単量体中において、さらなる6〜10個のアミノ酸、7〜9個のアミノ酸または8個のアミノ酸が、配列番号1のアミノ酸位置9および10、アミノ酸位置35および36、アミノ酸位置61および62、アミノ酸位置62および63、アミノ酸位置63および64、またはアミノ酸位置64および65に対応する位置の間に挿入されるステップ;
d)前記単量体型の異なって修飾されたユビキチン単量体の2つを結合するステップ;
e)前記ヘテロ二量体型修飾ユビキチンタンパク質を前記標的タンパク質に接触させるステップ;
f)10−7〜10−12Mの特異的結合親和性を有して前記標的タンパク質に結合する修飾されたヘテロ二量体型修飾ユビキチンタンパク質を同定するステップ;および
g)前記ヘテロ二量体型修飾ユビキチンタンパク質を単離するステップ;
を含むことを特徴とする方法。 - ヘテロ二量体型修飾ユビキチンタンパク質の生成方法において、以下のステップ:
a)頭−尾配置で結合一体化された2つの異なって修飾されたユビキチン単量体を含む二量体型修飾ユビキチンを提供するステップであって、
前記二量体型タンパク質の各単量体が、配列番号1の位置2、4、6、8、62、63、64、65、66、および68に対応する5、6、7、または8個のアミノ酸の置換により修飾され、かつ、
少なくとも1つの前記単量体中において、さらなる6〜10個のアミノ酸、7〜9個のアミノ酸または8個のアミノ酸が、配列番号1のアミノ酸位置9および10、アミノ酸位置35および36、アミノ酸位置61および62、アミノ酸位置62および63、アミノ酸位置63および64、またはアミノ酸位置64および65に対応する位置の間に挿入された二量体型修飾ユビキチンを提供するステップ;および
b)前記修飾された二量体型修飾ユビキチンタンパク質をサイトカイン、ケモカイン、細胞傷害性化合物または酵素から選択された医薬活性成分に融合またはコンジュゲートするステップ;
を含むことを特徴とする方法。 - ヘテロ二量体型修飾ユビキチンタンパク質の生成方法において、以下のステップ:
a)頭−尾配置で結合一体化された2つの異なって修飾されたユビキチン単量体を含む二量体型修飾ユビキチンを提供するステップであって、
前記二量体型タンパク質の各単量体が、配列番号1の位置2、4、6、8、62、63、64、65、66、および68に対応する5、6、7、または8個のアミノ酸の置換により修飾され、かつ、
少なくとも1つの前記単量体中において、さらなる6〜10個のアミノ酸、7〜9個のアミノ酸または8個のアミノ酸が、配列番号1のアミノ酸位置9および10、アミノ酸位置35および36、アミノ酸位置61および62、アミノ酸位置62および63、アミノ酸位置63および64、またはアミノ酸位置64および65に対応する位置の間に挿入された二量体型修飾ユビキチンを提供するステップ;および
b)前記修飾された二量体型修飾ユビキチンタンパク質を蛍光性化合物、光増感剤または放射性核種から選択された診断活性成分に融合またはコンジュゲートするステップ;
を含むことを特徴とする方法。 - 請求項1乃至3の何れか1項に記載のヘテロ二量体型修飾ユビキチンタンパク質の生成方法において、前記非天然標的タンパク質が、血管内皮成長因子(VEGF)、VEGF−A、ED−B、TNF−α、MIA−2、NGF、およびIgGから選択されることを特徴とする方法。
- 請求項1乃至4の何れか1項に記載のヘテロ二量体型修飾ユビキチンタンパク質の生成方法において、前記ヘテロ二量体型修飾ユビキチンタンパク質が多量体であることを特徴とする方法。
- ヘテロ二量体型修飾ユビキチンタンパク質の同定方法において、以下のステップ:
a)単量体型ユビキチンタンパク質に由来する異なって修飾されたヘテロ二量体型ユビキチンタンパク質の集団を提供するステップであって、
前記集団が、頭−尾配置で結合一体化された2つの異なって修飾されたユビキチン単量体を含むヘテロ二量体型ユビキチンタンパク質を含み、
前記二量体型タンパク質の各単量体が、配列番号1の位置2、4、6、8、62、63、64、65、66、および68に対応する5、6、7、または8個のアミノ酸の置換により修飾され、かつ
少なくとも1つの前記単量体中において、さらなる6〜10個のアミノ酸、7〜9個のアミノ酸または8個のアミノ酸が、配列番号1のアミノ酸位置9および10、アミノ酸位置35および36、アミノ酸位置61および62、アミノ酸位置62および63、アミノ酸位置63および64、またはアミノ酸位置64および65に対応する位置の間に挿入されるステップ;
b)潜在的標的としてユビキチンの非天然リガンドタンパク質を提供するステップ;
c)前記ヘテロ二量体型修飾ユビキチンを前記標的タンパク質に接触させるステップ;
d)10−7〜10−12Mの特異的結合親和性を有して前記標的タンパク質に結合するヘテロ二量体型修飾ユビキチンを同定するステップ;および
e)前記結合親和性を有する前記ヘテロ二量体型修飾ユビキチンを単離するステップ;
を含むことを特徴とする方法。
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