JP2019526526A - ペプチドリンカーを含む化学的部分の部位特異的カップリングのための標的化合物 - Google Patents

Abstract

本発明は、概して、化学的部分の部位特異的カップリングのための標的化合物に関する。本発明は、化学的部分の特異的カップリングのための標的化合物であって、標的に結合することができる少なくとも１の標的化ドメインと、最大８０個のアミノ酸からなる少なくとも１の連結部分、好ましくはアラニン、プロリンおよびセリンと、システインまたはシステインリッチなペプチドモチーフ（ＣＸＣ、ＣＸＸＣまたはＣＸＸＸＣ）からなる少なくとも１のカップリング部位とを含み、連結部分が標的化ドメインとカップリング部位とを連結し、かつ／または連結部分が２のカップリング部位を連結する、標的化合物を特徴とする。さらに、本発明は、標的化ドメインとしてのユビキチンムテイン（アフィリン（登録商標））を有する融合タンパク質を特徴とする。また、本発明は、疾患の治療または診断における医療用の標的化合物の使用に関する。【選択図】図１

Description

本発明は、二次構造または三次構造を持たない特定のアミノ酸に組み込まれた規定位置の規定数のカップリング部位に起因する化学的部分の部位特異的カップリングの能力を有する標的化合物に関する。標的化合物は、標的に結合することができる非免疫グロブリンタンパク質または抗体フラグメントから選択される少なくとも１の標的化ドメインを含む。さらに、標的化合物は、最大８０個のアミノ酸、好ましくはアラニン、プロリンおよびセリンからなる少なくとも１の連結部分を含む。さらに、標的化合物は、１のシステインまたはシステインリッチなペプチドモチーフからなる少なくとも１のカップリング部位を含む。上記連結部分は、標的化ドメインとカップリング部位とを連結し、かつ／または上記連結部分は２のカップリング部位を連結する。本発明は、特に、非Ｉｇ標的化ドメインとしてのユビキチンムテイン（アフィリン（登録商標））との融合タンパク質を特徴とする。また、本発明は、疾患の診断または治療における医療用の標的化合物の使用にも関する。

抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は、薬物を所望の位置に選択的に標的化するもので、モノクローナル抗体および細胞毒薬物（トキシン）からなる。抗体は、薬物を細胞の表面上の特定の標的に標的化して、そのコンジュゲートを細胞に結合させることにより、薬物が細胞を破壊することを可能にする。ＡＤＣの未解決の問題は、化学的部分のカップリングにある。何故なら、抗体は、例えばトキシンの部位特異的カップリングを可能にする規定された遊離システインを有さないためである。その代わりに、抗体への薬物のカップリングは、しばしばリシン残基を介して行われ、その結果、トキシンが結合する位置およびコンジュゲートに結合したトキシンの数に関して不均一な産物がもたらされる。モノクローナル抗体に対する薬物のコンジュゲーションの別の確立された手順は、抗体に存在するシステイン残基間のジスルフィド架橋の還元を利用して、薬物を還元システイン残基の遊離チオール基に結合させるというものである。しかしながら、そのような結合は、構造的に不安定であり、更なる治療または診断用途や製造において大きな問題となる。

抗体−化学的部分コンジュゲートのいくつかの制約のため、上述した問題を克服する改善された特性を有する新規な化合物を提供することが急務である。このため、この技術分野において、規定された数の化学的部分を標的化合物に特異的にカップリングさせて均質な標的産物をもたらすことを可能にするカップリング部位を有する新規化合物を提供する必要がある。本発明の目的は、標的化ドメインの構造的および機能的特徴を維持しながらも、規定数および規定位置のカップリング部位を有する新規な標的化キャリアタンパク質を提供することである。

本発明は、非Ｉｇタンパク質または抗体フラグメントに基づく標的化部分と、二次または三次構造を有さない特定のアミノ酸に組み込まれた規定位置の規定数のカップリング部位とを含む化合物を提供する。そのような化合物は、上記の欠点を克服する医療用途に特によく適している。

上記概要は、本発明によって解決されるすべての問題を必ずしも説明するものではない。

本発明は、化学的部分のカップリングのための標的化合物に関するものであり、この標的化合物が、５００ｎＭ以下の結合定数Ｋ_Ｄを有し、標的に結合することができる少なくとも１の標的化ドメインと、最大約８０個のアミノ酸からなる少なくとも１の連結部分であって、アラニン、プロリンおよびセリンを含むか、本質的にそれらからなる連結部分と、この連結部分のＣ末端またはＮ末端に位置する少なくとも１のカップリング部位とを含み、このカップリング部位が、１のシステインまたはシステインリッチなペプチドモチーフＣＸＣ、ＣＸＸＣまたはＣＸＸＸＣからなり、ここで、Ｘは非芳香族アミノ酸のなかから選択され、連結部分が標的化ドメインとカップリング部位とを連結し、かつ／または連結部分が２のカップリング部位を連結する。好ましくは、連結部分は、２０％〜６０％のアラニン残基、２０％〜４０％のプロリン残基、および１０％〜６０％のセリン残基から本質的になるか、またはそれらからなる。任意選択的には、標的化合物は、最も末端に位置するカップリング部位の後に、または最も末端に位置する標的化ドメインの後に、最大８０個のアミノ酸のアミノ酸配列（「キャップ」）をさらに含む。好ましくは、標的化合物はＴ_ｍＬ_ｎＳ_ｏを含み、ここで、ｍが１，２，３，４，５であり、ｎが１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９または２０であり、ｏ＝ｎ、またはｏ＝ｎ−１であり、任意選択的には標的化合物がＴ_ｍＬ_ｎＳ_ｏキャップを含む。したがって、標的化合物は、少なくとも１の標的化ドメインおよび１〜２０の連結部分およびカップリング部位を含む。

さらに、本発明は、カップリング部位中のＸが、非芳香族アミノ酸および非疎水性アミノ酸のなかから選択され、好ましくは、プロリン、アラニン、セリン、バリン、グリシン、スレオニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、リジン、ヒスチジンまたはアルギニンのような小アミノ酸または親水性アミノ酸のなかから選択される、標的化合物に関する。

また、本発明は、標的化ドメインが非免疫グロブリンタンパク質であり、この非免疫グロブリンタンパク質が、好ましくは、ユビキチンムテイン（アフィリン（登録商標））、ブドウ球菌プロテインＡのドメインのムテイン、アンキリンリピートタンパク質ムテイン、リポカリンムテイン、ヒトＦｙｎ ＳＨ３ドメインのムテイン、ヒトフィブロネクチンの第１０ドメインのムテイン、様々なプロテアーゼ阻害剤のＫｕｎｉｔｚドメインのムテイン、Ｓａｃ７ｄムテイン、シャガシンムテイン、または多量体化低密度リポタンパク質受容体−Ａのムテイン、ＦＮ３ドメインのムテイン、システインノットミニタンパク質ムテイン、アルマジロリピートタンパク質ムテイン、テトラネクチンムテイン、Ｃ型レクチンドメインのムテインまたはＣＴＬＡ４ムテイン、または抗体フラグメント若しくは抗体誘導体から選択されるが、それらに限定されるものではない、標的化合物に関する。

好ましくは、標的化合物の標的化ドメインは、非免疫グロブリンタンパク質、より好ましくは、親タンパク質に対して８０％〜９４％の同一性を示すムテイン、さらにより好ましくは、ユビキチン（配列番号１）に対して８０％〜９４％の同一性、またはビスユビキチン（配列番号２）に対して８０％〜９４％の同一性を示すユビキチンムテイン（アフィリン）である。

さらに、本発明は、融合タンパク質である標的化合物、または標的化ドメインと第１の連結部分との間に共有結合を含む標的化合物に関する。

本発明は、生物学的に活性な部分がカップリング部位に化学的にカップリングされている、標的化合物に関する。生物学的に活性な部分は、薬物、トキシン、小分子、キレート剤および色素などの化学的部分のなかから選択することができる。

本発明は、診断または治療用途、好ましくはインビトロ診断または治療用途における標的化合物の使用に関する。

本発明は、本明細書に記載の標的化合物を含む組成物、並びに、当該組成物を含むキットに関する。

本発明は、標的化合物の調製方法を対象とする。

この本発明の要約は、必ずしも本発明のすべての特徴を説明するものではない。

他の実施形態は、以下の詳細な説明の検討から明らかになるであろう。

図１は本発明の選択された標的化合物の概略図である。図示されているのは、抗体ではない標的化ドメイン（薄い灰色の楕円形で示し、Ｔと称する）と、ＣｙｓまたはＣｙｓリッチなペプチドモチーフからなる２〜４のカップリング部位（部位特異的カップリングのための濃い灰色の三角形で示す）を連結するアミノ酸Ａｌａ、ＰｒｏおよびＳｅｒからなる２〜４の連結部分（濃さが中間の灰色の長方形で示し、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３またはＬ４と称する）と、最も末端に位置するカップリング部位の後の１０〜８０個のアミノ酸のアミノ酸領域（長方形で示し、「キャップ」と称する）とを含む、化合物、すなわち融合タンパク質の例である。 図２は融合タンパク質の発現と精製を示している。図２Ａは融合タンパク質１４６４１４のＳＥＣプロフィールを示している。図２Ｂは融合タンパク質１４３２７６のＳＥＣプロフィールを示している。図２Ｃは融合タンパク質１４６４１４のＳＥＣ分画のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示している。ここで、レーン１は分子量マーカー、レーン２〜７は分画である。図２Ｄは融合タンパク質１４０３５３（カップリング部位：ＣＸＸＣ）のＳＥＣ分画のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示している。ここで、レーン１は分子量マーカー、レーン２は上清、レーン３はペレット、レーン４はフロースルー、レーン５〜１０は分画である。 図３は、標的に対する標識融合タンパク質の特異的結合親和性を確認するための融合タンパク質およびＥＤＡＮＳ標識融合タンパク質のＳＰＲ分析を示している。黒線は非修飾融合タンパク質を示し、灰色線はＥＤＡＮＳ標識融合タンパク質を示している。図３Ａは融合タンパク質１４６４１４および標識化された１４６４１４（２つのカップリング部位）、図３Ｂは融合タンパク質１４６４１６および標識化された１４６４１６（４つのカップリング部位）、図３Ｃは融合タンパク質１４６４１８および標識化された１４６４１８（４つのカップリング部位）、図３Ｄは融合タンパク質１４３２７６のＥＧＦＲ（２つのカップリング部位）に対する結合キネティクスを示し、様々な濃度（０，１．９，３．９，７．８，１５．６，３１．３，６２．５，１２５，２５０，５００ｎＭ）の融合タンパク質１４３２７６が分析されている。 図４は融合タンパク質の均一な標識化を確認するためのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析を示している。融合タンパク質およびＥＤＡＮＳ−Ｃ２−マレイミド標識融合タンパク質のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを示し、図４Ａは融合タンパク質１４６４１４（図の左側）およびＥＤＡＮＳ標識融合タンパク質１４６４１４（図の右側）を示している。図４Ｂは融合タンパク質１４６４１６（図の左側）およびＥＤＡＮＳ標識融合タンパク質１４６４１６（図の右側）を示している。図４Ｃは融合タンパク質１４６４１８（図の左側）およびＥＤＡＮＳ標識融合タンパク質１４６４１８（図の上部）、図４Ｄは融合タンパク質１４３２７６（図の下部）およびＥＤＡＮＳ標識融合タンパク質１４３２７６を示している。図４Ｅはカップリング部位（６つのカップリング部位）としてのペプチドモチーフ「ＣＰＡＣ」を有する融合タンパク質１４０３４３、図４Ｆはカップリング部位（６つのカップリング部位）としてのペプチドモチーフ「ＣＰＡＣ」を有する融合タンパク質１４０３５０を示している。

本発明を以下に詳細に説明する前に、本発明は、本明細書に記載の特定の方法論、プロトコルおよび試薬に限定されるものではなく、それらは変更し得るものであることを理解されたい。また、本明細書で使用する用語は、特定の実施形態を説明する目的のみのものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図したものではないことも理解されたい。他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。

好ましくは、本明細書で使用される用語は、“Ａ ｍｕｌｔｉｌｉｎｇｕａｌ ｇｌｏｓｓａｒｙ ｏｆ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｅｒｍｓ：（ＩＵＰＡＣ Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ）”，Ｌｅｕｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｈ．Ｇ．Ｗ，Ｎａｇｅｌ，Ｂ．ａｎｄ Ｋｏｌｂｌ，Ｈ．ｅｄｓ．（１９９５），Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ，ＣＨ−４０１０ Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に記載されているように定義される。

以下に続く本明細書及び特許請求の範囲を通じて、文脈上別途必要な場合を除き、「ｃｏｍｐｒｉｓｅ（備える）」という語および「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」および「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」などのその変化形は、記載した整数若しくはステップまたは整数若しくはステップの群を含むことを意味し、他の如何なる整数若しくはステップまたは整数若しくはステップの群を排除するものではないことが理解されよう。

本明細書の本文中には、いくつかの文書（例えば、特許、特許出願、科学刊行物、製造者の仕様書、指示書など）が引用されている。本明細書中の如何なるものも、本発明が先行発明によってそのような開示よりも先行する権利がないと認めるものとして解釈されるものではない。本明細書で引用される文書のいくつかは、「引用により援用される」ものとして特徴付けられる。そのように援用された文献の定義または教示と、本明細書に記載した定義または教示との間に矛盾がある場合、本明細書の記載が優先される。

本明細書中で言及されるすべての配列は、その全体的な内容および開示が本明細書の一部である添付の配列表に開示される。

本明細書で使用する「約」という用語は、明示的に記載された量と、そこからの±２０％までの偏差を包含する。より好ましくは±１５％までの偏差、より好ましくは±１０％までの偏差、最も好ましくは５％までの偏差が「約」という用語によって包含される。「少なくとも約１０，２０，３０，４０，５０，６０，７０，８０のアミノ酸残基」という用語は、簡潔な数のアミノ酸残基に限定されるものではなく、最大２０％の追加アミノ酸残基を含むアミノ酸ストレッチ、または最大２０％少ない残基を含むアミノ酸ストレッチも含む。例えば、「約７０のアミノ酸残基」は、本発明の外延を変えることなく、５６〜８４個のアミノ酸残基も含むことができる。

本明細書で使用する「化合物」は、少なくとも２つの成分を含む物質の組成物を指し、それらの少なくとも２つの成分は、任意の種類の相互作用、例えば、共有結合、イオン結合、水素結合、ファンデルワールス相互作用または疎水性相互作用によって互いに結び付けられている。

「成分」または「部分」または「ドメイン」または「部位」という用語は、本明細書では同じ意味で使用され、化合物の一部であるサブ構造を指す。

以下にさらに詳細に説明するように、本発明の「標的化合物」は、少なくとも３つの成分、すなわち（ｉ）少なくとも１つの標的化ドメインおよび（ｉｉ）少なくとも１つの連結部分および（ｉｉｉ）少なくとも１つのカップリング部位を含み、それぞれが１つの成分としてカウントされる。このため、本明細書で使用する「標的化合物」は、少なくとも３つの成分を含む物質の組成物を指す。本発明の化合物は、融合タンパク質またはコンジュゲートであることもある。

「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、ペプチド結合により連結された任意の２以上のアミノ酸鎖を指し、産物の特定の長さを意味するものではない。したがって、「ペプチド」、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、または２以上のアミノ酸鎖を指すのに用いられる任意の他の用語は「ポリペプチド」の定義内に含まれ、「ポリペプチド」という用語は、これらの用語の何れかに代わりまたは置き換えて用いることができる。「ポリペプチド」という用語は、ポリペプチドの翻訳後修飾産物を指すことも意図されており、それには、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、タンパク質分解的切断、非天然アミノ酸による修飾、および当技術分野で周知の同様の修飾が含まれるが、それらに限定されるものではない。したがって、２以上のタンパク質部分を具える融合タンパク質も、「タンパク質」または「ポリペプチド」の用語の定義に該当する。

「融合タンパク質」という用語は、少なくとも第２のアミノ酸鎖に遺伝子的に結合する少なくとも第１のアミノ酸鎖を含むタンパク質に関する。したがって、融合タンパク質は、単一の線状ポリペプチドとして発現するタンパク質／ペプチドのマルチマーを含むことができる。それは、１、２、３、４またはそれ以上のタンパク質／ペプチドを含むことができる。例えば、融合タンパク質は、もともと別個のタンパク質／ペプチドをコードする２以上の遺伝子の結合を通じて作られる。

「融合した」という語は、複数の成分がペプチド結合により直接またはペプチドリンカーを介して連結されることを意味する。

本明細書で使用する「コンジュゲート」という用語は、第２のタンパク質または非タンパク質性部分などの他の物質に化学的に結合した少なくとも第１のタンパク質を含むか、または本質的にそれからなるタンパク質に関する。コンジュゲーションは、有機合成により、または酵素的な翻訳後修飾の天然プロセスを含む酵素の使用により行うことができる。タンパク質コンジュゲートの例は、糖タンパク質（炭水化物成分とコンジュゲートしたタンパク質）またはリポタンパク質（脂質成分とコンジュゲートしたタンパク質）である。分子は、例えば任意の形態のリンカーを通して１または複数の部位に結合することができる。化学結合は、置換（例えば、Ｎ−スクシンイミジル化学）、付加または付加環化（例えば、マレイミド化学またはクリック化学）または酸化化学（例えば、ジスルフィド形成）を含む、当業者に周知の化学により行うことが可能である。本発明の化合物に化学的に結合し得る非タンパク質のポリマー分子のいくつかの例は、ヒドロキシエチルスターチ、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、樹枝状ポリマー、ポリオキシアルキレン、キレート剤、薬物、トキシン、小分子、色素などである。

融合タンパク質またはタンパク質コンジュゲートは、１または複数の反応基、またはリガンドのようなペプチド性または非ペプチド性成分、または放射性核種若しくはトキシンのような治療上或いは診断上関連する分子をさらに含むことができる。これは、例えば、糖、オリゴ糖、多糖、脂肪酸等の小さい有機または非アミノ酸ベースの物質も含むことができる。対象のタンパク質をそのような非タンパク質成分に結合させる方法は、当該技術分野で周知であるため、ここではさらに詳細には説明しない。

本明細書を通じて、「非免疫グロブリンタンパク質」という用語は、「非Ｉｇタンパク質」と略称されることもある。時には、「非免疫グロブリン（Ｉｇ）タンパク質」という表現のように、長い形式と略称形式の両方が同時に使用されることもある。

本明細書で使用する「天然に存在する」という用語は、対象物に適用される場合、対象物を自然界で見出すことができるという事実を指している。例えば、自然界の供給源から単離することができ、かつ実験室で人間によって意図的に改変されていない生物に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、天然に存在するものである。

これとは対照的に、本明細書で同じ意味で使用する「非天然」または「人工」という用語は、天然に存在しない対象物、すなわち人間によって生成、産生または改変された対象物を指している。例えば、実験室で人間により意図的に改変または生成されたポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、「非天然」である。本発明の非Ｉｇ結合タンパク質は、天然に存在しない人工タンパク質である。

本発明による「結合」という用語は、好ましくは特異的結合に関連する。

「解離定数」または「Ｋ_Ｄ」という用語は、特定の結合親和性を規定する。本明細書で使用する「Ｋ_Ｄ」という用語（通常は「ｍｏｌ／Ｌ」で測定され、「Ｍ」と略称されることもある）は、第１の化合物と第２の化合物との特定の相互作用の解離平衡定数を指すものとする。本発明の文脈において、Ｋ_Ｄという用語は特に、結合タンパク質と標的タンパク質（または標的化ドメイン）との間の結合親和性を説明するのに用いられる。

本明細書中で使用する「特異的に結合する」および「特異的な結合」は、本発明の標的化合物の標的化ドメインが、特定の標的に対する選択的結合親和性を有し、解離定数Ｋ_Ｄが、１μＭ（１０^−６Ｍ）以下、好ましくは１００ｎＭ（１０^−７Ｍ）以下、好ましくは１０ｎＭ（１０^−８Ｍ）以下、好ましくは１ｎＭ（１０^−９Ｍ）以下、好ましくは１００ｐＭ（１０^−１０Ｍ）、または好ましくは１０ｐＭ（１０^−１１Ｍ）以下であることを理解されたい。高親和性は、Ｋ_Ｄの低い値に対応する。「特異的結合」は、タンパク質が、特異的である標的に対して、別の分子への結合と比較した場合に、強く結合することを意味する。好ましくは、化合物が特異的に結合する標的についての解離定数（Ｋ_Ｄ）は、結合タンパク質が特異的に結合しない標的についての解離定数の、１０／１未満、好ましくは２０／１未満、より好ましくは５０／１未満、さらにより好ましくは１００／１、２００／１、５００／１または１０００／１未満である。

「特異的」結合と「非特異的」結合を区別するために、当業者に知られている適切な対照を使用することができる。

「結合することができるタンパク質」または「結合タンパク質」または「標的化ドメイン」という用語は、標的タンパク質（例えば、腫瘍特異的タンパク質、腫瘍細胞または循環腫瘍細胞またはマトリックスタンパク質などの表面上に発現するタンパク質）に結合することができるアミノ酸配列（タンパク質）を指している。任意のこのような結合タンパク質は、例えば、マルチマー化部分、ポリペプチドタグ、ポリペプチドリンカーおよび／または非タンパク質性ポリマー分子のような追加成分を含むことができる。

本明細書で使用する「アフィリン（Ａｆｆｉｌｉｎ）（登録商標）」（以前はＳｃｉｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ＧｍｂＨとして知られていたＮａｖｉｇｏ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ＧｍｂＨの登録商標）という用語は、ユビキチンムテインに基づく非免疫グロブリン由来の結合タンパク質を指す。「アフィリン」および「ユビキチンムテイン」および「修飾ユビキチン」という用語は、すべて同義語で使用され、置き換え可能である。アフィリンが、少なくとも１０／１未満であるか、非修飾ユビキチンまたはビスユビキチンに存在しない標的に対して特異的な結合親和性を有することを条件として、本明細書で使用されるそれら用語は、アミノ酸の置換、挿入、欠失またはそれらの任意の組合せにより、非修飾ユビキチン（例えば、配列番号１）またはビスユビキチン（例えば、配列番号２）とは異なるユビキチンの誘導体を指している。このアフィリンの機能特性は、ｄｅ ｎｏｖｏで作られた特性である。アフィリンは、自然界に存在するまたは自然界から分離された天然に存在するユビキチンではない。本発明に係るアフィリン分子は、ヘッドトゥーテール融合で互いに連結した２つの修飾されたユビキチン部分、または少なくとも１つの修飾されたユビキチン部分を含むか、または本質的にそれからなる。「ヘッドトゥーテール融合」は、例えば本明細書に引用により援用されるＥＰ２３７９５８１Ｂ１に記載のように、（ヘッド）Ｎ−Ｃ−Ｎ−Ｃ−（テール）の方向に２つのユビキチンを連結することによりそれらのユビキチンを互いに融合するものと理解すべきである。ユビキチン部分は、リンカーなしで直接、またはペプチドリンカーを介して連結される。

「ユビキチン」または「非修飾ユビキチン」という用語は、配列番号１によるユビキチン（野生型ユビキチン）、または配列番号１に対して少なくとも９５％のアミノ酸同一性（例えば、標的への結合に影響しない点変異Ｆ４５Ｗ、Ｇ７５Ａ、Ｇ７６Ａ）を有するタンパク質を指している。哺乳類、例えば、ヒト、霊長類、ブタおよびげっ歯類からのユビキチン分子が特に好ましい。一方、当技術分野では、すべての真核生物ユビキチンは高度に保存され、これまで研究された哺乳類のユビキチンはアミノ酸配列に関して全く同一であるため、ユビキチンの由来はそれ程重要ではないことに留意すべきである。この意味で、他の任意の真核生物源由来のユビキチンを、新規な結合能力をもたらすための更なる修飾に使用することができる。例えば、酵母のユビキチンは、野生型ヒトユビキチン（配列番号１）と３つのアミノ酸が異なるのみである。

「ビスユビキチン」という用語は、２つのユビキチン部分がヘッドトゥーテールの方向に互いに直接融合している、線状タンパク質を指している。「ビスユビキチン」という用語は、配列番号２、または配列番号２と少なくとも９５％のアミノ酸同一性（例えば、Ｆ４５Ｗ、Ｇ７５Ａ、Ｇ７６Ａ、Ｆ１２１Ｗ、Ｇ１５１Ａ、Ｇ１５２Ａのなかから選択される点変異）を有するタンパク質を指している。

本明細書中で使用する「置換」は、別のアミノ酸によるアミノ酸の置き換えとして定義される。既知の遺伝コード、および組換えおよび合成ＤＮＡ技術が与えられると、熟練した科学者はアミノ酸変異体をコードするＤＮＡを容易に構築することができる。「挿入」という用語は、元のアミノ酸が有意な構造変化なしに安定したままである、元のアミノ酸配列へのアミノ酸の付加を含む。「欠失」という用語は、元の配列から１または複数のアミノ酸が取り出され、元々は欠失したアミノ酸のＮ末端およびＣ末端であるアミノ酸が、直接連結されて連続的なアミノ酸配列を形成することを意味する。

「アミノ酸配列同一性」という用語は、２以上のタンパク質のアミノ酸配列の同一性（または差異）の定量的比較を指す。基準ポリペプチド配列に対する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、配列を並べて、必要に応じてギャップを導入して最大パーセント配列同一性を達成した後の、基準ポリペプチド配列におけるアミノ酸残基と同一である配列におけるアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。配列同一性を決定するために、クエリータンパク質の配列を基準タンパク質の配列に整列させる。整列方法は、当技術分野において周知である。例えば、自由に利用可能なＳＩＭ局所類似性プログラム（Ｘｉａｏｑｕｉｎ Ｈｕａｎｇ ａｎｄ Ｗｅｂｂ Ｍｉｌｌｅｒ（１９９１），Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ，ｖｏｌ．１２：３３７−３５７）が好ましくは使用される（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／ｓｉｍ−ｐｒｏｔ．ｈｔｍｌも参照されたい）。多重整列分析については、ＣｌｕｓｔａｌＷが好ましくは用いられる（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２２（２２）：４６７３−４６８０）。

所定の位置の基準アミノ酸配列と異なるクエリー配列の各アミノ酸は、１つの差異としてカウントされる。クエリー配列における挿入または欠失も１つの差異としてカウントされる。例えば、２つのユビキチン部分間のリンカー挿入は、基準配列と比較して１つの差異としてカウントされる。その後、差異の合計は、非同一性のパーセンテージを得るために、基準配列の長さに関連付けられる。同一性の定量的パーセンテージは、１００から非同一性のパーセンテージを差し引いて計算される。非修飾ユビキチンに対して並べられたユビキチンムテインの同一性を決定する特定の事例において、４５、７５および／または７６位における差異は、ユビキチンムテインの新規の結合能力に関係無く、特定の実験設定に関連する修飾に過ぎないため、カウントされない。

本明細書で使用する「リンカー」または「連結部分」という用語は、機能的要素を少なくとも第２の機能的要素と連結する部分を指す。例えば、本発明のリンカーは、２つのカップリング部位、または標的化ドメインとカップリング部位を連結する。他のリンカーは、２つの標的化ドメインを連結することができる。本発明の好ましい実施形態は、ペプチドリンカーを含む。例えば、ペプチドリンカーは、ペプチド結合を介して２つの機能的要素（例えば、ペプチド）を連結して、単一の線状ポリペプチド鎖を生成するアミノ酸配列である。

本明細書において、「標的」および「結合パートナー」という用語は同義語として使用されており、置き換えることが可能である。標的は、標的化ドメインに対して先に定義した親和性で結合することができる、任意のタンパク質、ペプチド、ペプチドのフラグメントまたはグリコシル構造のような他の分子である。好ましい標的分子は、タンパク質、グリコシル構造または他のエピトープなどの腫瘍抗原であって、腫瘍細胞の外側に存在するが、非腫瘍細胞上に存在しないか若しくは発現が少ない腫瘍抗原、または腫瘍組織中に存在するが、正常組織上に存在しないか若しくはまれにしか存在しない腫瘍抗原である。

「抗体フラグメント」という用語は、抗原に対する特異的結合親和性を有する抗体のフラグメントを指す。抗体フラグメントの例としては、一本鎖抗体、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、ｓｃＦｖ、ドメイン抗体、ミニボディー、一本鎖抗体および抗体定常領域の誘導体が挙げられる。

本明細書で使用する「カップリング部位」という用語は、他の化学基と反応して本発明の化合物を他の化学的部分に結合することができるシステインまたはシステインリッチなアミノ酸配列を意味する。

「薬物」という用語は、ウイルス、細菌、真菌、植物、動物およびヒトを含むがこれらに限定されない生物体に対して、物理的特性または生化学的特性に影響を与え得る任意の物質を意味する。特に、この用語は、生物、特にヒトまたは動物における疾患の診断、治療または予防を目的とする任意の物質を含む。

分子生物学、細胞生物学、タンパク質化学および抗体技術の分野で一般的に知られており、実施されている方法は、継続的に更新される刊行物“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．Ｅｄｓ．，Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｓ．Ｂｏｎｉｆａｃｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）に十分に記載されている。細胞培養および培地に関する既知の技術は、“Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｄ．Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：１４８−１５３，１９９７）；“Ｓｅｒｕｍ ｆｒｅｅ Ｍｅｄｉａ”（Ｋ．Ｋｉｔａｎｏ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：７３−１０６，１９９１）；および“Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ”（Ｊ．Ｒ．Ｂｉｒｃｈ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｔｅｃｈｎｏｌ．１０：２５１−２７０，１９９０）に記載されている。

［本発明の実施形態］
以下、本発明をさらに詳細に説明する。以下に定義される各実施形態は、明確に反対の表示がない限り、１または複数の他の実施態様と組み合わせることができる。特に、好ましいまたは有利であると示される任意の特徴は、好ましいまたは有利であると示される１または複数の他の任意の特徴と組み合わせることができる。

本発明は、化学的部分のカップリングのための標的化合物に関するものであり、この標的化合物が、５００ｎＭ以下の結合定数Ｋ_Ｄで標的に結合することができる非免疫グロブリンタンパク質または抗体フラグメントから選択される少なくとも１の標的化ドメインと、最大８０個のアミノ酸からなる少なくとも１の連結部分であって、アラニン、プロリンおよびセリンを含むか、本質的にそれらからなる連結部分と、連結部分のＣ末端またはＮ末端にある少なくとも１のカップリング部位とを含み、このカップリング部位が、Ｃｙｓ（Ｃ）、ＣＸＣ、ＣＸＸＣまたはＣＸＸＸＣからなり、ここで、Ｘは非芳香族アミノ酸のなかから選択され、連結部分が標的化ドメインとカップリング部位とを連結し、かつ／または連結部分が２のカップリング部位を連結する。化学的部分のカップリングのための１または複数の部位は、１、２または３の非芳香族アミノ酸残基が介在する１つのシステイン残基または２つのシステイン残基からなる。好ましい実施形態では、カップリング部位が連結部分のＣ末端に位置する。

Ｎ末端からＣ末端まで、またはＣ末端からＮ末端までの標的化合物の構造
好ましい実施形態は、Ｔ［ＬＳ］_ｎ、任意にはＴ［ＬＳ］_ｎキャップを含み、ここで、ｎ＝１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９または２０である。本発明のいくつかの実施形態において、標的化合物は、Ｔ_ｍＬ_ｎＳ_ｏからなり、ここで、ｍ＝１または２、ｎ＝１，２，３または４、ｏ＝１，２，３または４であり、任意にはキャップを有する。

化合物のＮ末端からＣ末端までの要素またはＣ末端からＮ末端までの要素の順序は、例えば、標的化ドメイン、連結部分１、カップリング部位１、連結部分２、カップリング部位２、連結部分３、カップリング部位３である。更なる実施形態は、Ｎ末端からＣ末端まで、
（ｉ）標的化ドメイン、連結部分１、カップリング部位１、連結部分２、カップリング部位２、任意には追加のキャップ、
（ｉｉ）標的化ドメイン、連結部分１、カップリング部位１、連結部分２、カップリング部位２、連結部分３、カップリング部位３、連結部分４、カップリング部位４、任意には追加のキャップ、
（ｉｉｉ）標的化ドメイン、連結部分１、カップリング部位１、連結部分２、カップリング部位２、連結部分３、カップリング部位３、任意には追加のキャップ、
（ｉｖ）カップリング部位１、連結部分１、標的化ドメイン、連結部分２、カップリング部位２、任意には追加のキャップ、
（ｖ）標的化ドメイン１、連結部分１、カップリング部位１、連結部分２、カップリング部位２、標的化ドメイン、連結部分３、カップリング部位３、任意には追加のキャップ、
（ｖｉ）標的化ドメイン１、標的化ドメイン２、連結部分１、カップリング部位１、連結部分２、カップリング部位２、任意には追加のキャップ、
（ｖｉｉ）標的化ドメイン１、連結部分１、カップリング部位１、連結部分２、カップリング部位２、標的化ドメイン２、任意には追加のキャップを含むことができる。

ｉ）、ｉｉ）およびｉｉｉ）の説明のために図１を参照されたい。例えば、上で（ｉｉｉ）として記載されている実施形態は、二次または三次構造を持つことなく、親水性アミノ酸（すなわち、連結部分およびキャップ）に組み込まれた所定位置における化学的部分をカップリングするための３つのカップリング部位を含む。

標的化部分、連結部分およびカップリング部位の他の順列も可能である。

末端「キャップ」アミノ酸
本発明の一実施形態では、本発明のカップリング部位は、化合物のＣ末端またはＮ末端に直接位置していない。そのような実施形態では、化合物は、「キャップ」、すなわち最も末端に位置するカップリング部位の後に１０〜８０個のアミノ酸のアミノ酸配列をさらに含む。例えば、標的化合物が融合タンパク質である実施形態では、少なくとも約５個、好ましくは約１０個のアミノ酸が、部位特異的カップリングのためにカップリング部位と末端アミノ酸との間に位置する。好ましくは、キャップは、芳香族アミノ酸またはシステインを除く任意のアミノ酸から本質的になるか、またはそのようなアミノ酸からなり、よって好ましくは、アラニン、プロリン、セリン、バリン、ロイシン、メチオニン、イソロイシン、リジン、アルギニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、スレオニン、グルタミン、グリシン、アスパラギンまたはヒスチジンのなかから選択される。アラニン、プロリンおよびセリンのなかから選択されるアミノ酸が好ましい。好ましい実施形態において、キャップは、アラニン、プロリンおよびセリンから本質的になるか、またはそれらからなる。

標的化合物の連結部分／カップリング部位（Ｌ _ｎ Ｓ _ｏ ）のサイズ
一実施形態において、標的化合物は、Ｔ_ｍＬ_ｎＳ_ｏキャップという化学式を有し、ｎまたはｏ＝１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９または２０である。したがって、Ｌ_ｎＳ_ｏは、最小約５個、好ましくは約１０個から、最大約１８００個のアミノ酸を含む。Ｌ_ｎＳ_ｏキャップのアミノ酸の総数は、約２０〜１８００個のアミノ酸、好ましくは２５〜１０００個のアミノ酸、好ましくは５０〜８００個のアミノ酸、好ましくは７０〜５００個のアミノ酸、好ましくは１００〜３００個のアミノ酸である。

連結部分の規定された数および位置
本発明の標的化合物は、標的化ドメインおよびカップリング部位を共有結合する少なくとも１つのペプチドリンカー、および／または２つのカップリング部位を連結する少なくとも１つのペプチドリンカーを含む。一実施形態では、化合物が、１０〜８０個のアミノ酸の２つのペプチドリンカー、すなわち、標的化ドメインと第１のカップリング部位とを連結する１つのペプチドリンカーと、第１および第２のカップリング部位間の第２のペプチドリンカーとを含む。別の実施形態では、化合物は、１０〜８０個のアミノ酸の３つのペプチドリンカー、すなわち、標的化ドメインと第１のカップリング部位とを連結する１つのペプチドリンカーと、第１および第２のカップリング部位間の第２のペプチドリンカーと、第２および第３のカップリング部位間の第３のペプチドリンカーとを含む。更なる実施形態では、化合物は、１０〜８０個のアミノ酸の４つのペプチドリンカー、すなわち、標的化ドメインと第１のカップリング部位とを連結する１つのペプチドリンカーと、第１および第２のカップリング部位間の第２のペプチドリンカーと、第２および第３のカップリング部位間の第３のペプチドリンカーと、第３および第４のカップリング部位間の第４のペプチドリンカーとを含む。それに応じて、最大２０個のリンカーを有する本発明の更なる実施形態が構成される。

カップリング部位の規定された数および位置
本発明に係るカップリング部位は、ＣｙｓまたはＣｙｓＸａａＣｙｓまたはＣｙｓＸａａＸａａＣｙｓまたはＣｙｓＸａａＸａａＸａａＣｙｓからなり、ここで、Ｘａａは芳香族アミノ酸ではない（すなわち、ＸａａはＰｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒではない）か、または好ましくはＣｙｓまたはＭｅｔまたはＩｌｅまたはＬｅｕからは選択されない。カップリング部位の規定された数および規定された位置は、標的化合物、すなわち標的融合タンパク質に対する、化学的部分の部位特異的結合を可能にする。本発明の化合物は、化学的部分を結合させるための多くのシステイン残基（少なくとも１〜最大４０まで）を含有する。したがって、必要な場合には、多数の化学的部分を本発明の化合物にカップリングさせることができ、カップリングさせた化学的部分を有する化合物を、標的に対して特異的に標的化することができる。化学的部分の量をそれに応じて調節するために、当業者は、カップリング部位（すなわち、システインまたはシステイン含有ペプチドモチーフ）の数を特定の用途に最適な数に調節することができる。一実施形態では、本発明の化合物は、連結部分のＮ末端およびＣ末端に位置する２つのカップリング部位（例えば、ＣｙｓまたはＣｙｓリッチモチーフ）を含む。本発明の特定の実施形態では、連結部分は、化合物の２つのカップリング部位の間の、約２０〜３０個のアミノ酸（Ｐｒｏ、ＳｅｒおよびＡｌａ）、例えば１８〜３３個のアミノ酸からなる。化合物中のカップリング部位は同一でも異なっていてもよい。好ましい実施形態において、化合物中のすべてのカップリング部位は同一である。

二次または三次構造を持たない連結部分
本発明はさらに、連結部分が２０〜６０％のアラニン、２０〜４０％のプロリンおよび１０〜６０％のセリンからなる標的化合物に関する。したがって、本発明の化合物のためのリンカーは、親水性であり、二次または三次構造を持たない。したがって、二次または三次構造を持たないリンカー部分によって、標的化ドメインの機能的および構造的特徴が、カップリング部位の規定された数および位置を有する標的化合物において維持される。

最大８０個のアミノ酸の連結部分の規定された長さ
ペプチドリンカーの長さは、少なくとも約１０個のアミノ酸から最大約８０個のアミノ酸まで変化する。より好ましくは、本発明のペプチドリンカーは、約１０〜約８０個のアミノ酸の長さを有する。好ましい化合物において、連結部分は、約１０〜約６０個のアミノ酸または約２０〜約６０個のアミノ酸または約４０〜約６０個のアミノ酸または約６０〜約８０個のアミノ酸からなる。リンカーは、約１０〜約８０個のアミノ酸から、独立して構成することができる。例えば、本発明の一実施形態では、第１のペプチドリンカーは約５０個のアミノ酸からなり、第２のペプチドリンカーは約２５個のアミノ酸からなる。例えば、本発明の一実施形態では、第１のペプチドリンカーは約１０個のアミノ酸からなり、第２ペプチドリンカーは約２５個のアミノ酸からなり、第３のペプチドリンカーは約３０個のアミノ酸からなる。例えば、本発明の別の実施形態では、第１のペプチドリンカーは約５０個のアミノ酸からなり、第２のペプチドリンカーは約６０個のアミノ酸からなり、第３のペプチドリンカーは約６０個のアミノ酸からなる。例えば、本発明の別の実施形態では、第１のペプチドリンカーは約５０個のアミノ酸からなり、第２のペプチドリンカーは約７５個のアミノ酸からなり、第３のペプチドリンカーは約７５個のアミノ酸からなり、第４のペプチドリンカーは約６０個のアミノ酸からなる。１つの構築物中のペプチドリンカーの長さは、異なっていても同一であってもよい。

連結部分のアミノ酸組成
１つの化合物中のペプチドリンカーの組成は、異なっていても同一であってもよい。本発明の好ましい実施形態では、化合物のペプチドリンカーは、Ａｌａ、ＰｒｏまたはＳｅｒから選択されるアミノ酸から、独立して構成される。ペプチドリンカーは、約３０％〜約６０％のアラニン、約２０％〜約４５％のプロリンおよび約１０％〜約６０％のセリンからなり、好ましくは約４０％〜約６０％のアラニン、約２０％〜約４０％のプロリンおよび約１０％〜約３０％のセリンからなる。一実施形態では、ペプチドリンカーは、約５０％のアラニン、約３０％のプロリンおよび約２０％のセリンからなる。さらに好ましくは、アミノ酸のアラニン、プロリンおよびセリンがリンカーアミノ酸配列全体に均一に分布し、最大で２，３，４または５個以下の同一アミノ酸残基、好ましくは最大で３個のアミノ酸が隣接する。本発明の好ましいリンカーは、タンパク質分解的に安定である。表１ａは、本発明の標的化合物のための適切な連結部分の例示的なアミノ酸組成を示している。

本発明の一実施形態では、カップリング部位は、連結部分のＣ末端に位置するシステインである。表１ｂに、Ｃ末端カップリング部位（システイン）を有する連結部分のための選択された例のアミノ酸組成を示す。

例えば、ＳＡＰＡＰＳＡＰＡＡＳＡＰＰＡＰＡＡＰＣＡＰＡＡＡＰＡＳＡＰＡＰＡＳＡＰＡＡＳＰＣ（配列番号７３）、ＳＡＰＡＰＳＡＰＡＡＳＡＰＰＡＰＡＡＰＣＡＰＡＡＰＡＳＡＰＡＰＡＳＡＰＡＡＳＰＣ（配列番号７５）のように、Ｃ末端カップリング部位をそれぞれ有する２つの連結部分を連結させることができる。

好ましい実施形態において、ＳＡＰＡＰＳＡＰＡＡＳＡＰＰＡＰＡＡＰＣＡＰＡＡＡＰＡＳＡＰＡＰＡＳＡＰＡＡＳＰＣＰＡＡＰＡＰＳＰＡＳＰＡＰＡＳＰＡＳＡＰ（配列番号７４）、ＳＡＰＡＰＳＡＰＡＡＳＡＰＰＡＰＡＡＰＣＡＰＡＡＰＡＳＡＰＡＰＡＳＡＰＡＡＳＰＣＰＡＡＰＡＰＳＰＡＳＰＡＰＡＳＰＡＳＡＰ (配列番号７６)のように、Ｃ末端「カップ」が最もＣ末端のカップリング部位の後に付加される。

好ましくは、連結部分のアミノ酸配列は、配列番号３−３４および配列番号５５−７６を含むか、本質的にそれらからなり、または配列番号３−３４および配列番号５５−７６と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列である。

例えば、化学的部分の特異的カップリングが与えられ、標的化ドメインの機能的および構造的特性が維持されるように、例示的な標的化合物は、二次または三次構造を有することなく連結部分に組み込まれた規定の位置における２つの規定されたカップリング部位を有する。

カップリング部位の規定された組成
本発明によるカップリング部位は、Ｃｙｓ（Ｃ）またはＣＸＣまたはＣＸＸＣまたはＣＸＸＸＣからなる。本発明はさらに、Ｘが非芳香族アミノ酸から選択される標的化合物に関する。２つのシステイン間のカップリング部位におけるＸとして排除されるアミノ酸は、芳香族アミノ酸（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）、好ましくは疎水性アミノ酸（Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｃｙｓ）である。好ましくは、２つのシステイン間のカップリング部位におけるアミノ酸は、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、ＡｒｇおよびＨｉｓのような小アミノ酸または親水性アミノ酸のなかから選択される。ＣＸＸＣモチーフ（配列番号３５）を有するカップリング部位の非限定的な例は、ＣＰＡＣ（配列番号３６）、ＣＳＳＣ（配列番号３７）、ＣＡＡＣ（配列番号３８）またはＣＡＳＣ（配列番号３９）である。本発明の化合物は、１，２，３，４，５，６またはそれ以上、最大２０個までのカップリング部位を含む。

標的化ドメイン
一実施形態では、本発明の標的化合物は、標的化ドメインとして非Ｉｇタンパク質または抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂフラグメント）を含む。本発明の標的化合物は、完全長抗体を含まない。完全長抗体の欠点は、抗体のＦｃ部分が、可変ドメインの標的特異性とは無関係に細胞受容体に結合し、それにより望ましくない反応を引き起こすことである。完全長モノクローナル抗体とは対照的に、非Ｉｇタンパク質または抗体フラグメントは、所望の標的に対して特異的に結合するが、他のタンパク質には特異的に結合しない。さらに、非Ｉｇタンパク質は、操作が容易な小タンパク質であり、微生物で産生することができ、よって技術的利点を提供する。

一実施形態では、標的化ドメインは、標的に対する解離定数Ｋ_Ｄが０．００１ｎＭ〜５００ｎＭ、好ましくは１００ｎＭ未満、好ましくは１０ｎＭ未満、より好ましくは１ｎＭ未満である非Ｉｇタンパク質である。本発明のいくつかの実施形態では、標的化合物、例えば標的化融合タンパク質は、１，２またはそれ以上の標的化ドメインを含む。いくつかの実施形態では、２つの同一の標的化ドメインがペプチドリンカーを介して連結される。他の実施形態では、２つの異なる標的化ドメインがペプチドリンカーを介して連結される。異なる標的化ドメインは、同じエピトープまたは同じ標的タンパク質に対して特異性を有するが、異なるエピトープに対しては有さない。別の実施形態において、異なる標的化ドメインは、異なる標的タンパク質に対して特異性を有してもよく、すなわち、化合物は二重特異性である。

一実施形態では、２つの標的化ドメインは、それらのＮ末端およびＣ末端の両方の連結部分に連結されるものであってもよい。他の実施形態では、１つの標的化ドメインが化合物のＮ末端またはＣ末端にあり、第２の標的化ドメインがそのＮ末端およびＣ末端の両方の連結ドメインに連結される。さらに別の実施形態では、両方の標的化ドメインは、それらのＮ末端またはＣ末端の一方でのみ連結ドメインに連結され、すなわち、融合タンパク質は、Ｎ末端に第１の標的化ドメインおよびＣ末端に第２の標的化ドメインを含む。

結合親和性標的化ドメインの決定
結合親和性を測定する方法、すなわち解離定数Ｋ_Ｄを測定する方法は、当業者に公知であり、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）に基づく技術、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、フローサイトメトリー、蛍光分光法、等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）、分析超遠心分離、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡまたはＩＲＭＡ）および増強化学発光（ＥＣＬ）など、当技術分野で知られている方法のなかから選択することができる。それら方法の一部は、以下の実施例でより詳細に説明する。典型的には、約２０℃〜約３７℃の温度で解離定数Ｋ_Ｄが測定される。特に断りのない限り、本明細書に記載するＫ_Ｄ値は、ＳＰＲ分析により２５℃で測定される。

標的化合物の更なる特性評価
本発明の標的化合物、例えば本発明の融合タンパク質または非Ｉｇタンパク質、例えばユビキチンムテインの更なる特性評価は、単離された可溶性タンパク質の形態で行うことができる。適切な方法は、当業者に知られており、または文献に記載されている。そのような方法には、タンパク質の物理的、生物物理学的および機能的特性評価の測定が含まれる。単離された変異体の親和性および特異性は、当業者に知られているような実施例における上述した生化学的な標準的な方法によって検出することができる。安定性分析のために、例えば、示差走査蛍光定量（ＤＳＦ）を含む、化学的または熱的アンフォールディングに関連する分光または蛍光に基づく方法が、当業者に知られている。

標的化ドメインとして適切な非Ｉｇタンパク質
適切な非Ｉｇタンパク質の例は、アフィリン（ユビキチンムテイン）、ＤＡＲＰｉｎ（アンキリンリピートタンパク質ムテイン）、アンチカリン（リポカリンムテイン）、Ａｆｆｉｂｏｄｙ（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌプロテインＡのＺドメインのムテイン）、Ｆｙｎｏｍｅｒ（ヒトＦｙｎ ＳＨ３ドメインのムテイン）、ＡｄＮｅｃｔｉｎ（ヒトフィブロネクチンの第１０ドメインのムテイン）、Ｋｕｎｉｔｚドメインペプチド（種々のプロテアーゼ阻害剤のＫｕｎｉｔｚドメインのムテイン）、Ｎａｎｏｆｉｔｉｎｓ（Ｓａｃ７ｄムテイン）、Ａｖｉｍｅｒｓ（多量体化低密度リポタンパク質受容体−Ａのムテイン）、シャガシン足場またはシャガシン様プロテアーゼ阻害剤タンパク質、アドネキシン足場、セントリリン（ＦＮ３ドメインのムテイン）、ノッティン（システインノットミニタンパク質ムテイン）、アルマジロリピートタンパク質ムテイン、アトリマー（テトラネクチンムテイン；Ｃ型レクチンドメインのムテイン）またはＣＴＬＡ４ベースのムテインのなかのタンパク質から選択されるが、それらに限定されるものではない。非Ｉｇタンパク質に基づく足場に関する更なる情報は、例えば、Ｖａｚｑｕｅｚ−Ｌｏｍｂａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ，２０１５ ２０：１２７１−１２８３またはＷｅｉｄｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ２０１３ １０：１５５−１６８に記載されている。

標的化ドメインとして適切な抗体フラグメント
抗体に由来する適切なフラグメントの選択された例は、一本鎖抗体、抗体定常領域の誘導体、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、ｓｃＦｖまたはドメイン抗体（例えば、ナノボディまたはアブドリン）である。

適切な標的の例
非Ｉｇタンパク質は、標的、例えば、特定の疾患（例えば、癌、自己免疫疾患または心臓血管疾患）に関連する標的に対して、検出可能な特異的結合親和性で結合する。標的化ドメインのための結合パートナーの例は、Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲ、ＥＤ−Ｂ、ＰＳＭＡまたはＶＥＧＦ−Ａから選択されるが、これらに限定されない細胞表面発現標的である。複数の可能性のある標的を使用できることに留意されたい。２以上の標的化ドメインを含む本発明の化合物は、同じ標的に結合することができるが、異なるエピトープにも結合することができる。例えば、Ｈｅｒ２に対する親和性をそれぞれ有する２つの同一でない標的化ドメインを有する化合物は、異なるＨｅｒ２エピトープに結合し得る。２または３の標的化ドメインを含む本発明の化合物は、二重特異性または三重特異性であり、２または３の異なる標的に結合することができる。例えば、Ｈｅｒ２に対して親和性を有する標的化ドメインおよびＥＧＦＲに対して親和性を有する第２の標的化ドメインを有する化合物は、Ｈｅｒ２およびＥＧＦＲの両方に結合する。

標的化ドメインの例としてのアフィリン
好ましくは、標的化合物の標的化ドメインは、アフィリンが標的に対して特異的結合親和性を有するならば、ユビキチン（配列番号１）に対して８０％〜９４％の同一性、またはビスユビキチン（配列番号２）に対して８０％〜９４％の同一性を示すユビキチンムテイン（アフィリン）である。換言すれば、ユビキチンムテインは、配列番号１と比較して５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５または１６のアミノ酸において修飾され、好ましくは配列番号１の６，７，８，９，１０または１１のアミノ酸の修飾であり、または配列番号２と比較して１０−３２のアミノ酸において修飾され、好ましくは配列番号２の１２−２２のアミノ酸の修飾であり、それにより、標的抗原に対して新たに生成された測定可能な結合特性を有する非天然タンパク質を産生する。

標的化ドメインの同定
非Ｉｇタンパク質、例えばユビキチンの誘導体化により、特定の標的抗原に特異的に結合するムテインを生成することは、当技術分野において知られている。例えば、配列番号１または配列番号２に示される配列が改変されたライブラリーを作成可能である。好ましくは、改変は、当技術分野において知られている、置換、挿入または欠失である。ユビキチンに由来する新規な結合タンパク質生成のためのアミノ酸残基の置換は、任意の所望のアミノ酸を用いて行うことができる。これは、ＥＰ１６２６９８５Ｂ１、ＥＰ２３７９５８１Ｂ１およびＥＰ２７２１１５２に詳細に記載されて記載されており、それらは引用により本明細書に援用される。

選択したアミノ酸の修飾のステップは、好ましくは、選択したアミノ酸のランダム突然変異誘発によって遺伝子レベルで、本発明に従って実施される。置換、挿入または欠失によって修飾されるアミノ酸の事前選択は、修飾されるユビキチンタンパク質について利用可能な構造情報に基づいて行うことができる。好ましくは、非Ｉｇタンパク質の修飾は、それぞれのタンパク質に属するＤＮＡの改変のための遺伝子工学的方法を用いて行われる。ランダム化されるアミノ酸の異なるセットの選択は、異なるライブラリーをもたらす。得られた遺伝子プールライブラリーは、表示方法のような選択方法のためのタンパク質の発現を可能にする適切な機能的遺伝子エレメントと組み合わせることができる。結合親和性が存在する場合には、発現されたタンパク質を標的分子と接触させて、パートナーどうしの結合を可能にする。このプロセスは、標的分子への結合活性を有するタンパク質の同定を可能にする。

本発明による接触は、好ましくは、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、ｍＲＮＡディスプレイまたは細胞表面ディスプレイ、酵母表面ディスプレイまたはバクテリア表面ディスプレイ法などの適切な提示および選択方法、好ましくは当業者に周知のファージディスプレイ法により行われる。次いで、所望の結合特性を有する同定されたクローンをシーケンシングして、ムテインのアミノ酸配列を明らかにする。同定した結合タンパク質は、例えば、上述した当業者に知られているような同定した配列の改変および繰り返されるファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、パニングおよびスクリーニングステップに基づいて追加のライブラリーを生成することにより、更なる成熟ステップの対象とするようにしてもよい。

本発明の一実施形態において、標的に対して少なくとも１０^−７ＭのＫ_Ｄの測定可能な結合親和性を生成するために、配列番号１の６２，６３，６４，６５，６６，６７または６８位から選択される５個のアミノ酸においてユビキチンが少なくとも置換される。さらに、１，２，３，４，５または６個のアミノ酸を、標的に対して測定可能な結合親和性を生じるように改変することができる。

一実施形態では、本発明の化合物の標的化部分は、配列番号１に基づくユビキチンムテインを含み、改変は、（ｉ）領域２−１１または（ｉｉ）領域６２−６８または（ｉｉｉ）両領域に同時に位置する、１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０または１１、好ましくは合計で５，６，７，８または９個のアミノ酸で行われる。それらの領域に含まれない更なる位置も同様に改変される場合がある。

標的化ドメインとしてのアフィリンタンパク質の具体例
本発明の一実施形態において、標的に対して少なくとも１０^−７ＭのＫ_Ｄの測定可能な結合親和性を生成するために、ユビキチン部分は、配列番号１の８−１１位、好ましくは配列番号１の９位と１０位との間に対応するループ領域における２〜１０個のアミノ酸の挿入と好ましくは組み合わせて、配列番号１の６２，６３，６４，６５，６６位に対応する５個のアミノ酸において少なくとも置換されている（例えば、ＥＧＦＲ特異的アフィリン−１３９８１９；配列番号４１）。

本発明の別の実施形態では、２つのユビキチン部分は、領域２−１１および６２−６８から選択されかつそれら領域に対応する、例えば配列番号１の２，４，６，８，６２，６３，６４，６５，６６，６８位から選択される、５，６，７，８または９個のアミノ酸において独立して少なくとも置換されており、２つのユビキチン部分は、直接またはペプチドリンカーを介して連結され、好ましくは直接結合されている。

さらに別の実施形態では、本発明の連結部分は、標的に対して５００ｎＭ未満の結合親和性（Ｋ_Ｄ）を有する結合タンパク質に関し、ここで、標的結合タンパク質は、２つのユビキチン部分が少なくとも７個のアミノ酸において独立して置換され、第１のユビキチン部分における置換が配列番号１の４２，４４，６８，７０，７２，７３，７４位から少なくとも選択され、第２のユビキチン部分における置換が配列番号１の６，８，６２，６３，６４，６５，６６位から少なくとも選択される、アミノ酸配列を含み、２つのユビキチン部分がリンカーなしで直接連結されている。さらに、結合タンパク質は、ビスユビキチン（配列番号２）と少なくとも８５％の配列同一性を有する。標的結合ユビキチンムテインは、１，２，３，４，５または６個の更なる置換を含み、それにより、標的に対して高い親和性を有する結合タンパク質、例えば、Ｈｅｒ２特異的結合タンパク質（アフィリン−１４２６２８；配列番号４０）を生成することができる。

さらに別の実施形態において、標的結合ユビキチンムテインは、配列番号１の６，８，６２，６３，６４，６５，６６位から少なくとも選択される第１のユビキチン部分の置換と、配列番号１の６，８，６２，６３，６４，６５，６６位から少なくとも選択される第２のユビキチン部分の置換とを含み、２つのユビキチン部分がショートペプチドリンカーで結合して、標的に対して高親和性の結合タンパク質、例えば、本明細書中に引用により援用されるＥＰ２５１３１３８Ｂ１に開示されるＥＤ−Ｂ特異的結合タンパク質を生成することができる。

ＶＥＧＦ−Ａ特異的アフィリンタンパク質の例は、ＷＯ２０１２／１７２０５４に開示されている。

さらに好ましい実施形態では、本発明の融合タンパク質は、配列番号４２−５１からなる群のなかから選択されるアミノ酸配列、または配列番号４２−５１と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列、またはその機能的変異体から本質的になるか、またはそれらからなる。

さらに、本発明は、融合タンパク質である標的化合物に関する。融合タンパク質の例は、配列番号４２−５１のアミノ酸配列に示されている。

化学的部分の具体例
本発明は、化合物のカップリング部位にカップリングされる化学的部分が色素、キレート剤、薬物、トキシンおよび小分子のなかから選択される、標的化合物に関する。小分子の例は、低分子量（約５０００ダルトン未満）の有機化合物である。適切な色素の例は、ＥＤＡＮＳ（５−［（２−アミノエチル）アミノ］ナフタレン−１−スルホン酸）である。キレート剤の例は、放射性同位元素を含む様々な構造を有する分子の錯化剤として使用できるＤＯＴＡである。得られた化合物は、特に医療用途で使用するために、数多くの、例えば、放射性同位体とともに使用することができる。トキシンの例は、オーリスタチン、チューブリシン、アマニチン、ドキソルビシン、メイタンシン、カリケアマイシン、ビンカアルカロイド、カンプトテシンおよびデュオカルマイシンのなかから選択されるが、それらに限定されるものではない。

標的化合物の使用
また、本発明は、診断または治療用途における標的化合物の使用に関する。結合したキレート剤、薬物、トキシンおよび小分子を有する標的化合物は、治療用途、例えば癌治療において特に有用な場合がある。例えば、カップリング部位にカップリングした色素を有する化合物は、診断用途、例えば癌診断において有用な場合がある。例えば、カップリング部位にカップリングしたキレート剤を有する化合物は、診断または治療用途に有用な場合があり、例えば、放射性同位体のような更なる物質をキレート剤に結合させることができる。

標的化合物の組成
また、本発明は、標的化合物の組成物、並びに、標的化合物の組成物を含むキットに関する。キットは、予め定められた量の標的化合物の組成物と、任意には、化合物を取り扱うのに適した、あるいは更なる使用のために標的化合物を調製するのに適した、溶液、緩衝液、ハンドリングデバイスなどの更なる構成要素とを含む。

標的化合物の調製方法
さらに、本発明は、上述したような本発明による標的化合物の調製方法に関するもので、当該方法が、先に規定した融合タンパク質をコードする核酸を調製するステップと、核酸を発現ベクターに導入するステップと、発現ベクターを宿主細胞に導入するステップと、宿主細胞を培養するステップと、融合タンパク質が発現される培養条件に宿主細胞を供して、上述したような融合タンパク質を産生するステップと、任意選択的に、ステップ（ｅ）で産生した融合タンパク質を単離するステップと、任意選択的に、融合タンパク質を上述したような更なる機能的部分とコンジュゲートするステップとを含む。タンパク質産生を目的とした細胞の培養およびタンパク質発現は、当業者に周知の技術を適用して、少容量の振とうフラスコから大型の発酵槽に至るまで任意の規模で行うことができる。

以下の実施例は、本発明の更なる説明のために提供されるものである。しかしながら、本発明はそれらに限定されるものではなく、以下の実施例は上記記載に基づく本発明の実行可能性を示すに過ぎない。本発明の完全な開示のために、本出願に引用される文献も参照される。それら文献は、引用により本出願に完全に組み込まれるものである。

実施例１．発現構築物の生成
本発明の好ましい化合物の概略を図１に示す。融合タンパク質は、標的化ドメイン−（リンカー−カップリング部位）_ｎ−キャップという、構造的特徴を有する。特異的融合タンパク質であって、（ｉ）標的化ドメインとして、Ｈｅｒ２特異的結合タンパク質またはＥＧＦＲ特異的結合タンパク質と、（ｉｉ）連結部分として、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ（表２で「ＡＰＳ」と称する）から選択される２２〜７４個のアミノ酸であって、融合タンパク質の２，３または４つの連結部分と、（ｉｉｉ）カップリング部位として、アミノ酸２２個の各カップリング間の最小距離からアミノ酸７４個の最大距離で連結部分間に規則的に間隔を置いて配置されるアミノ酸ＣｙｓまたはペプチドモチーフＣｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｃｙｓと、（ｉｖ）Ｃ末端のキャップとして、カップリング部位の末端位置を避けるための（Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒから選択される）１０〜３０アミノ酸とを有する特異的融合タンパク質を産生した。

標的化ドメインとして使用されるアフィリンタンパク質は、ＥＧＦＲに対する約２０ｎＭのＫ_Ｄおよび７３℃での熱安定性を有するＥＧＦＲ特異的アフィリン−１３９８１９（配列番号４１）と、Ｈｅｒ２に対する約０．４ｎＭのＫ_Ｄおよび６２℃での熱安定性を有するＨｅｒ２特異的アフィリン−１４２６２８（配列番号４０）である。これらのアフィリン結合タンパク質の任意の他の標的特異的機能的変異体または他の標的特異的非Ｉｇタンパク質または標的特異的抗体フラグメントを使用することができる。

当業者に公知の標準的な方法を用いて、遺伝子を合成し、大腸菌発現ベクターにクローニングした。標準的な精製プロトコルを可能にするために、Ｃ末端タグ（例えば、ＳｔｒｅｐＴａｇＩＩ、配列番号５４、または／およびＨｉｓＴａｇ、配列番号５３）を加えた。ＤＮＡシークエンシングを用いて、融合タンパク質の正しい配列を確認した。

実施例２．融合タンパク質の発現
ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）コンピテント細胞を発現プラスミドで形質転換した。細胞を選択寒天プレート（カナマイシン）上に分散させ、３７℃で一晩インキュベートした。前培養物を単一コロニーから１００ｍｌのスーパーリッチ培地（改変Ｈ１５培地２％グルコース、５％酵母エキス、１％カザミノ酸、０．７６％グリセロール、０．７％ラクトース、１％トルラ酵母ＲＮＡ、２５０ｍＭのＭＯＰＳ、２０２ｍＭのＴＲＩＳ、１０ｍｇ／ＬのＲＮａｓｅ Ａ、ｐＨ７．４、消泡剤ＳＥ１５）に接種し、ラクトースおよび消泡剤を含まない１５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを添加したバッフル付き１リットル三角フラスコ中に、従来のオービタルシェーカーを用いて１６０ｒｐｍ、３７℃で１６時間培養した。主培養物を、グリセロール、グルコース、ラクトース、消泡剤および１５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを補充した１リットル厚壁三角フラスコ中の４００ｍｌのスーパーリッチ培地中で、０．５の調整された開始ＯＤ_６００で前の一晩培養物から接種した。培養物を共鳴音響ミキサ（ＲＡＭｂｉｏ）に移し、３７℃で２０×ｇでインキュベートした。Ｏｘｙ−Ｐｕｍｐストッパによってエアレーションを促進した。グルコースを代謝させ、続いてラクトースを細胞に入れることにより、組み換えタンパク質発現を誘導した。予め設定された時点で、ＯＤ_６００を測定し、５／ＯＤ_６００に調整した試料を取り出し、ペレット化し、−２０℃で凍結させた。細胞を約２４時間一晩増殖させて、約４５−６０の最終的なＯＤ_６００に到達させた。バイオマスを回収するために、細胞を１６０００×ｇで１０分間、２０℃で遠心分離した。ペレットを秤量し（湿重量）、上清中のｐＨを測定した。処理前に細胞を−２０℃で保存した。

実施例３：融合タンパク質の発現および可溶性の分析
発酵中に採取した試料を３００μｌ抽出緩衝液（０．２ｍｇ／ｍｌのリゾチーム、０．５×のＢｕｇＢｕｓｔｅｒ、７．５ｍＭのＭｇＳＯ_４、４０ＵのＢｅｎｚｏｎａｓｅを添加したＰＢＳ）に再懸濁し、サーモミキサで７００ｒｐｍ、室温で１５分間攪拌して可溶化した。可溶性融合タンパク質を、遠心分離（１６０００×ｇ、２分、室温）によって不溶性融合タンパク質から分離した。上清を回収し（可溶性画分）、ペレット（不溶性画分）を等量の尿素緩衝液（８Ｍ尿素、０．２Ｍトリス、２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．５）に再懸濁した。可溶性画分および不溶性画分の両方から５０μｌを採取し、１２μｌの５×の試料緩衝液および５μｌの０．５ＭのＤＴＴを添加した。試料を９５℃で５分間沸騰させた。最後に、これらの試料８μｌを、製造者の推奨に従って作用させたＳＤＳゲルに加えた。

実施例４：融合タンパク質の精製
すべての融合タンパク質を、Ｃ末端ＳｔｒｅｐＴａｇＩＩを有する大腸菌の可溶性画分中で発現させた。細胞を超音波処理によって溶解させ（１ｇのバイオマス）、最初の精製工程を製造者の指示に従って、陽イオン交換クロマトグラフィーにより、ＨｉＴｒａｐ ＳＰ ＨＰカラム１ｍｌ、５０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４．０を使用して行った。溶出画分を、２０ｍＭのクエン酸ｐＨ６．０および１５０ｍＭのＮａＣｌで平衡化したサイズ排除クロマトグラフィーカラムＸＫ１６／６００ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｐｇ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に注入した。ピーク画分をプールし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。

実施例５．標的特異的融合タンパク質の熱安定性
本発明の融合タンパク質の熱安定性を示差走査蛍光定量法により測定した。各プローブを、０．１μｇ／μＬの濃度でＭｉｃｒｏＡｍｐ（登録商標）Ｏｐｔｉｃａｌ ３８４−ウェルプレート（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に移し、ＳＹＰＲＯオレンジ色素を適切な希釈で添加した。２５から９５℃の温度匂配を毎分１℃の加熱速度でプログラムした（ＶｉｉＡ−７、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）。蛍光は、５２０ｎｍの励起波長および６２３ｎｍの発光波長で常に測定した（ＶｉｉＡ−７、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）。同様の融点は、関連するタンパク質構造と相関する。

実施例６．ＥＬＩＳＡによる標的結合の分析
特異的標的（例えば、Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲ）に対する融合タンパク質の親和性を、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）を用いて測定した。標的を９６ウェルＮｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｂ ＥＬＩＳＡプレート（２μｇ／ｍｌ）に固定化した。４℃で１６時間インキュベートした後、ウェルをＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄し、ウェルをＰＢＳ中３％ＢＳＡでブロックした（室温で２時間）。ネガティブコントロールは、ＢＳＡのみでブロックされたウェルであった。ブロッキング後、ウェルをＰＢＳＴで３回洗浄し、室温で融合タンパク質（ＰＢＳＴ中）とともに１時間インキュベートした。インキュベーション後、ウェルをＰＢＳＴで３回洗浄し、続いてＩＢＡ社のＳｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ−ＨＲＰ（１：１００００）とともに室温で１時間インキュベートした。その後、ウェルをＰＢＳＴで３回、ＰＢＳで３回洗浄した。ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼの活性を、ＴＭＢ−Ｐｌｕｓ基質を添加することによって視覚化した。３０分後、０．２ＭのＨ_２ＳＯ_４を添加することによって反応を停止させ、吸光度を４５０ｎｍで測定した。

実施例７：表面プラズモン共鳴による標的結合の分析
ＣＭ５センサーチップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、ＳＰＲランニング緩衝液で平衡化した。ＥＤＣとＮＨＳの混合物を通過させることにより、表面に露出したカルボキシル基を活性化して反応性エステル基を得た。７００−１５００（１０２８）ＲＵオンリガンド（ｒプロテインＡ）をフローセルに固定化し、オフリガンドを別のフローセルに固定化した。リガンド固定化後のエタノールアミンの注入は、非共有結合リガンド（アフィリン−１４２６２８、融合タンパク質１４６４１４，１４６４１６および１４６４１８のｈＨＥＲ２−Ｆｃ、アフィリン−１３９８１９、融合タンパク質１４３２７６および１４０３５０のｈＥＧＦＲ−Ｆｃ）を除去する。リガンド結合の際に、タンパク質分析物が表面上に蓄積し、屈折率が増加した。この屈折率の変化をリアルタイムで測定し、時間に対する応答または共鳴単位（ＲＵ）としてプロットした。分析物を適切な流速（３０μｌ／分）で連続希釈してチップに適用した。各ランの後、チップの表面を、再生緩衝液で再生し、ランニング緩衝液で平衡化した。対照試料をマトリックスに適用した。前述のように再生および再平衡化を行った。結合試験は、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）３０００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて行い、データ評価は、Ｌａｎｇｍｕｉｒ １：１モデル（ＲＩ＝０）の使用により、製造業者によって提供されたＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ３．０ソフトウェアを介して行った。評価した解離定数（Ｋ_Ｄ）をオフターゲットに対して標準化した。結果を表４に示す（実施例９を参照されたい）。

実施例８．融合タンパク質の標識化
（Ａ）ＥＤＡＮＳ−Ｃ２−マレイミドによる融合タンパク質の標識化
３５μＭ融合タンパク質（Ｈｅｒ２特異的ＣＩＤ１４６４１４，１４６４１６および１４６４１８；ＥＧＦＲ特異的ＣＩＤ１４３２７６；アフィリン、ＣＩＤ１４０３５０のＣ末端またはアフィリン、ＣＩＤ１４０３５３のＮ末端の何れかに、３つの連結部分および３つのカップリング部位「ＣＰＡＣ」を有する）（それぞれ０．６３２ｍｇ／ｍｌ）を、２０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０中で、１０倍過剰のＥＤＡＮＳ（５−（（２−アミノエチル）アミノ）ナフタレン−１−スルホン酸）とともに室温で１時間インキュベートした。非反応マレイミドを１Ｍシステインで室温で１時間ブロッキングした後、試料をＨｉｔｒａｐカラム（５ｍｌ、ＧＥＨＣ）およびランニング緩衝液としてのＰＢＳを用いて脱塩した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析を用いて標識化の程度を判定した。

（Ｂ）ＤＯＴＡによる融合タンパク質の標識化
２つの連結ドメインと、各連結ドメインのＣ末端にカップリング部位としての２つのシステインと、融合タンパク質のＣ末端に「キャップ」とを有する融合タンパク質を、２０倍過剰のマレイミド−ＤＯＴＡ（２，２’，２”−（１０−（２−（（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチル）アミノ）−２−オキソエチル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７−トリイル）トリ酢酸，ＣｈｅＭａｔｅｃｈ）とともに、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭのＥＤＴＡ ｐＨ７．０中において、室温で３時間処理した。ＤＯＴＡ分子と相互作用する可能性のある金属イオンを減少させるために、すべてのカラムおよびＡＫＴＡ素子（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を０．１ＭのＥＤＴＡ溶液とともに３０分間インキュベートした。溶液を調製するために、無金属または金属還元成分のみを使用した。インキュベーション後、１００ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５．０〜５．８中でサイズ排除（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ Ｓ２００、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって、未結合のＤＯＴＡ分子から試料を分離した。標識化されたタンパク質の試料を室温で１時間５ｍＭ塩化鉄（ＩＩ）とともにインキュベートして、ＤＯＴＡ分子が放射性同位元素との結合に利用可能であることを実証した。インキュベーション後、未結合の鉄をＨｉＴｒａｐ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて除去した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析を用いて標識化の程度を判定した。

実施例９：マトリックス支援レーザー脱離／イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析による融合タンパク質の均一な標識化の確認
以下のようにして、マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ）を行った。先ず、融合タンパク質を精製し、Ｃ１８−Ｐ１０−ＺｉｐＴｉｐｓ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；カタログ番号ＺＴＣ１８Ｓ０９６）を用いて濃縮した。Ｔｉｐｓを水中０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で洗浄し、５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル／０．１％ＴＦＡで溶離した。試料を水中２％（ｖ／ｖ）ＴＦＡにより処理し、２，５−ジヒドロキシアセトフェノン（ＤＨＡＰ）マトリックス（Ｂｒｕｋｅｒ、カタログ番号８２３１８２９）に包埋した。融合タンパク質の質量を、ａｕｔｏｆｌｅｘ（商標）スピード質量分析計（Ｂｒｕｋｅｒ）で測定した。ａｕｔｏｆｌｅｘスピード質量分析計のチューニングには、Ｐｒｏｔｅｉｎ ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ ｓｔａｎｄａｒｄｓ（Ｂｒｕｋｅｒ、部品番号８２０６３５５および部品番号８２０７２３４）を使用した。

ＥＤＡＮＳ標識有りの融合タンパク質およびＥＤＡＮＳ標識無しの融合タンパク質をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルによって分析し、ピークを比較した。結果を図４に示す。融合タンパク質が２または４または６の色素分子で均一に標識化されていることが確認される。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析は、融合タンパク質１４０３５０および１４０３５３が、融合タンパク質中の６のシステインに対応する６の色素分子で標識化されていることを示している。

ＤＯＴＡ標識有りの融合タンパク質およびＤＯＴＡ標識無しの融合タンパク質をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルによって分析し、ピークを比較した。分析により、融合タンパク質が２つのマレイミド−ＤＯＴＡ分子で均一に標識化されていることが確認される。また、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析は、２つのカップリング部位を有する融合タンパク質に標識化されたＤＯＴＡ分子が、塩化鉄（ＩＩ）分子とのカップリングに利用可能であることを示している。Ｋ_Ｄは融合タンパク質の標識化後に僅かに変化したが、標識化は、標的に対する融合タンパク質の親和性に大きな影響を与えることはない。結果は表４に要約されている（ｎ．ｄ．は検出されず）。

Claims (23)

1. 化学的部分の特異的カップリングのための標的化合物であって、
   ａ）５００ｎＭ以下の結合定数Ｋ_Ｄで標的に結合することができる、非免疫グロブリンタンパク質または抗体フラグメントから選択される少なくとも１の標的化ドメイン（Ｔ）と、
   ｂ）５〜８０個のアミノ酸からなる少なくとも１の連結部分（Ｌ）であって、アラニン、プロリンおよびセリンを含むか、本質的にそれらからなる連結部分と、
   ｃ）前記連結部分のＣ末端またはＮ末端に位置する少なくとも１のカップリング部位（Ｓ）とを含み、このカップリング部位が、１のシステイン（Ｃ）またはシステインリッチなペプチドモチーフＣＸＣ、ＣＸＸＣまたはＣＸＸＸＣからなり、ここで、Ｘは非芳香族アミノ酸のなかから選択され、
   前記連結部分が前記標的化ドメインとカップリング部位とを連結し、かつ／または前記連結部分が２のカップリング部位を連結することを特徴とする標的化合物。
2. 請求項１に記載の標的化合物において、Ｔ_ｍＬ_ｎＳ_ｏを含み、ここで、ｍが１，２，３，４，５であり、ｎが１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９または２０であり、ｏ＝ｎ、またはｏ＝ｎ−１であることを特徴とする標的化合物。
3. 請求項１に記載の標的化合物において、連結部分が、２０〜６０％のアラニン、２０〜４０％のプロリン、および１０〜６０％のセリンから本質的になることを特徴とする標的化合物。
4. 請求項３に記載の標的化合物において、前記連結部分のアミノ酸配列が、配列番号３−３４および配列番号５５−７６を含むか、本質的にそれらからなり、または配列番号３−３４および配列番号５５−７６と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列であることを特徴とする標的化合物。
5. 請求項１に記載の標的化合物において、前記カップリング部位のＸが、プロリン、アラニン、セリン、バリン、グリシン、スレオニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、リジン、ヒスチジンまたはアルギニンのような小アミノ酸または親水性アミノ酸のなかから選択されることを特徴とする標的化合物。
6. 請求項１に記載の標的化合物において、前記標的化ドメインが非免疫グロブリンタンパク質であることを特徴とする標的化合物。
7. 請求項６に記載の標的化合物において、非免疫グロブリンタンパク質が、ユビキチンムテイン、プロテインＡのドメインのムテイン、アンキリンリピートタンパク質ムテイン、リポカリンムテイン、ヒトＦｙｎ ＳＨ３ドメインのムテイン、ヒトフィブロネクチンの第１０ドメインのムテイン、Ｆｎ３ドメインのムテイン、Ｋｕｎｉｔｚドメインのムテイン、Ｓａｃ７ｄムテイン、シャガシンムテイン、多量体化低密度リポタンパク質受容体−Ａのムテイン、システインノットミニタンパク質ムテイン、アルマジロリピートタンパク質ムテイン、テトラネクチンムテイン、Ｃ型レクチンドメインのムテインまたはＣＴＬＡ４ムテインのなかから選択されることを特徴とする標的化合物。
8. 請求項７に記載の標的化合物において、非免疫グロブリンタンパク質が、ユビキチン（配列番号１）に対して８０％〜９４％の同一性、またはビスユビキチン（配列番号２）に対して８０％〜９４％の同一性を示すユビキチンムテインであることを特徴とする標的化合物。
9. 請求項１に記載の標的化合物において、前記標的化ドメインが抗体フラグメントであることを特徴とする標的化合物。
10. 請求項１に記載の標的化合物において、最も末端に位置するカップリング部位の後に１０〜８０個のアミノ酸のアミノ酸配列を追加的に含むことを特徴とする標的化合物。
11. 請求項１０に記載の標的化合物において、Ｔ_ｍＬ_ｎＳ_ｏキャップを含み、ここで、「キャップ」が、前記最も末端に位置するカップリング部位の後の１０〜８０個のアミノ酸のアミノ酸配列であることを特徴とする標的化合物。
12. 請求項１０に記載の標的化合物において、前記最も末端に位置するカップリング部位の後のアミノ酸が、芳香族アミノ酸またはシステインを除く任意のアミノ酸のなかから選択されることを特徴とする標的化合物。
13. 請求項１２に記載の標的化合物において、アミノ酸が、アラニン、プロリン、セリン、バリン、ロイシン、メチオニン、イソロイシン、リジン、アルギニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、スレオニン、グルタミン、グリシン、アスパラギンまたはヒスチジンのなかから選択されることを特徴とする標的化合物。
14. 請求項１乃至１３の何れか一項に記載の標的化合物において、当該標的化合物が融合タンパク質であることを特徴とする標的化合物。
15. 請求項１乃至１４の何れか一項に記載の標的化合物において、カップリング部位が連結部分のＣ末端に位置することを特徴とする標的化合物。
16. 請求項１４に記載の標的化合物において、前記融合タンパク質が、配列番号４２−５１または少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなることを特徴とする標的化合物。
17. 請求項１乃至１６の何れか一項に記載の標的化合物において、標的化ドメインと連結部分との間の共有結合を含むことを特徴とする標的化合物。
18. 請求項１に記載の標的化合物において、前記化学的部分が、薬物、トキシン、色素、小分子およびキレート剤のなかから選択されることを特徴とする標的化合物。
19. 請求項１８に記載の標的化合物において、前記化学的部分が色素であることを特徴とする標的化合物。
20. 請求項１８に記載の標的化合物において、前記化学的部分が、更なる部分のカップリングのための錯化剤としてのキレート剤であることを特徴とする標的化合物。
21. 請求項２０に記載の標的化合物において、前記キレート剤が、放射性同位体のための錯化剤であることを特徴とする標的化合物。
22. 診断または治療用途、好ましくはインビトロ診断または治療用途における請求項１乃至２１の何れか一項に記載の標的化合物の使用。
23. 請求項１乃至２１の何れか一項に記載の標的化合物を含む組成物。

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